TWI227275B

TWI227275B - Processes for producing sugar nucleotides and complex carbohydrates

Info

Publication number: TWI227275B
Application number: TW087103820A
Authority: TW
Inventors: Satoshi Koizumi; Katsutoshi Sasaki; Tetsuo Endo; Kazuhiko Tabata; Akio Ozaki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1996-09-17
Filing date: 1998-03-16
Publication date: 2005-02-01
Also published as: CN1572879A; US20050019874A1; CN100436593C; CA2664150C; US8435763B2; CN100342025C; KR100555161B1; US6821756B2; CA2237849A1; US20020064836A1; CA2237849C; JP3403205B2; US6964858B2; AU4220397A; CA2664150A1; US20020025560A1; CN1550554A; WO1998012343A1; KR19990067658A; EP0870841A4

Description

1227275 Α7 Β7 i'發明説明（） l術領域本發明為關於作為防禦细菌、病毒等之感染、於心血管損害之適應及免疫治療有用之複合糖質的製造方法及作為該複合糖質之合成受質之重要的糖核苷酸之製造方法° 1景技術糖核苷酸之製造方法已知有1)化學合成法UdV ♦ Carbohydr* Chem* Biochefli*, 2 8 , 307(19 7 3)、Bull*

Chein, Soc* Japan, 4 6，3275 ( 1973)、Org· Chem·， II， 146(1992) 、 Carbohydr· Res·， 242, 69(1993)]、 2)使用酵素之製造方法[J, 〇rg· Chem,,旦互，1834 ( 1 9 9 0 ) ^ J· 0 r g ♦ C h e a * , ^5J7 , 152(1992) ^ J . Am. C h e in. Soe·, VV〇 , 7159(1988 )、特表平 7-508413、特表平 7- 5000248、¥096/ 27670] ^ 3 )使用酵母等之微生物菌體之方法（特公昭45-2073、特公昭46-407 56、特公昭47- 1 837、特公昭 47-26703、特公昭 49-8278、特開平 2-268692 )、4) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ---------! %- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁、17 由耐鹽性酵母之黴生物菌體之萃取法（特開平8-23993)等（於1)之方法中，需要昂貴的核苷-5 一磷酸（Μ下，簡稱Ν Μ Ρ)之嗎啭酸鹽衍生物和糖磷酸等，於2)之方法中，需要核苷-5 ’ -二磷酸（Μ下，簡稱NDP)、核苷-5 ^三磷酸（权下’簡稱Ν ΤΡ )、磷酸烯醇丙嗣酸、糖磷酸等之昂貴原料和丙酮酸激酶等多數酵素，於3)之方法中，需要菌體之乾燥處理等。包含4)方法之上述任何方法，均使用昂貴的核| 酸和糖磷酸等作為原料，因為操作上之大量生產困難，故 -至今Β ’並未確立出糖核苷酸Μ工業性規模之製造方法。本紙张尺i適用中國國家標準（CNS ) Α4^_ ( 210X 297公釐) ^ 1227275 五、發明説明（複合糖質之製造方法已知有1)化學合成法[Method in E n z y m ο 1 . 2 4 7，1 9 3 ( 1 99 4 ) Λ A n g e w . Chenu I n t , Ed*

Engl,呈1, 1 55 ( 1 982 ) ^ Car bohydr . Res. 211 , el (1991) ]、2 )使用水解酶[A n a 1 ♦ B ί o c h e in , 202 ,2 1 5 ( 1 992 )、

Trends B i o t e c h η o 1 ♦ 2 5 6 ( 1 9 8 8 )之方法、及 3 )利用糖轉移酶（特開平7-79792、特表平7-500248、特公平 5-82200 - W 0 9 4/2 5 6 1 4 > 特表平 9-503905 > USP5,583,042 ) 之方法。 1)之方法為了立體選擇性地合成，而必須導入保護基， 2)之方法為產率、選擇性不夠充分，3)之方法中則需要 NDP、NTP、磷酸烯醇丙嗣酸、糖磷酸、或糖核苷酸等昂貴原料和丙麵酸激酶等多種酵素，於任何方法中均未確立複合糖質的廉價工業性製造方法。又，僅K廉價的核苷酸之前驅物質及糖及複合糖質前驅物質作為原料，直接工業性製造複合糖質之方法仍為未知。已有經由在屬於棒狀辑菌屬之微生物中，添加乳清酸，生產 ϋΜΡ之報告[Amino Acid, Nucleic Acid, 2_3 , 1 07 ( 1 97 1 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ]。又，亦已知M乳清酸為原料生成胞苷二磷酸膽鹼之方遠i 知（特開平5 - 2 7 6 9 7 4 >。發明之揭示本發明之目的為提供於防禦细菌、病毒等之感染、於心血管損害之適應及免疫治療等中有用的複合糖質之製造方法及作為該複合糖質之合成受質之重要的糖核苷酸之廉價且有效率的製造方法。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 5 1227275 A7 B7 五、發明説明（經濟部中央標準局員工消費合作社印製為發生規黴複苷有 P 和 I 之理及質為前卩 ί 之生特合 Γ S _ 或作果地表之產核可NT糖ti力處糖介質之IrK 酸中其複質結率的酸生 Μ 即產由 Μ 能之、性糖酸gitw苷質為和 _ ，效因 f 質僅，生有 — 質液質水合苷核介酸酸驅討有基核物且料質具 U 糖養物該複核M 、性苷苷前檢可之糖驅，原物 b-gl合培驅於集由 _ Μ 源水核核之力則成該前胞為。驅及；複該前得採有 Θ U 素該糖糖亥奋1 酸致，生產質綑作明前物 π 產或之使中具tizi酵於集由努行料酸生糖蟲質發之理生液酸，質a)My 些得採有核進原苷可合毘物本酸處 U 質養苷中介用έ 此使中具 Μ 產為核現複或驅成苷之§^锪培核質性使*令，質用、生作糖發和胞前完核液 Μ 驅之、介水、§ f ，中介使物之糖與再酸綑質達由養 Μ 前胞源性該法Is源質性及生酸及參且苷物糖到有培 g 質綑素水由方素介水、 1生 _ 微苷質化並核動合並是該 f 糖蟲酵於並造 t I 酵性該法之徽產用核物強，糖或複，a)或合毘些在，製 h 為水由方使糖驅由性由物及質用液 tt 複或此存質的 1P 作於並造於及前經產有生糖糖使養 Ρ 和胞令質糖質 Ν 物在，製對質之且生具徼及合供培 ® 酸細，物合糖pi和理存酸的等糖酸‘^及用之質複提物^苷物源驅複合以糖處糖苷酸者合苷酸高利力物產為生核動素前積複產由之及核苷明複核苷提及能驅生明微i糖、酵質蓄之生有液質糖核發之M核可、質前地發之 ‘C)物為糖成黴質具養物積糖本料僅糖則物糖之率本力 p-^生作合生特物b)培驅蓄之原琨產，生合酸效能NT物黴物複中其驅及該前成徵 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X297公釐） 6 1227275 A7 B7 五、發明説明（）糖質前驅物質生產複合糖質能力之微生物、動物细胞或昆蟲细胞之培養液或該培養液之處理液作為酵素源，令該酵素源、複合糖質前驅物質及依據上逑記載之糖核穿酸的製造方法所得之糖核苷酸存在於水性介質中，使得於該水性介質中生成蓄積複合糖質，並由該水性介質中採集複合糖質為其特徵之複合糖質的製造方法。再者，提供使用半乳糖激酶活性強之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源，令該酵素源及N-乙醯葡萄糖胺存在於水性介質中，使得於該水性介質中生成蓄積N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸，並由該水性介質中採集H-乙醯葡萄糖胺-磷酸為其特黴之N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸的製造方法。 _面之簡單說明圖1為示出表琨質體PPA31及PPAC31的作成工程。圖2為示出ga 1U、ppa基因表現質體PNT12及PNT32的作成工程。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖3為示iii galT、galK基因表現質體PNT25的作成工程。圖4為示出ga ΓΓ、ga 1K基因於產氨棒狀桿菌中表現之質體PTK7的作成工程。圖5為示出g 1 in U、ρ p a基因表現質體ρ Ν Τ 1 4的作成工程。圖6為示出pg®基因表現質體PNT24的作成工程。圏7為示出glm基因表現質體PNT44的作成工程。圖8為示出g 1 k基因表琨質體PNT46的作成工程。圖9為示出pf kB基因表琨質體ι>ΝΤ47的作成工程。圏10為示出galK基因表現質體PNT54的作成工程。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210>:297公釐） n 1227275 A7 B7 五、發明説明（圖1 1為示出ntanB、HianC基因表現質體PNK7的作成工程。圖1 2為示出f> g m、p f k B基因表現質體p N T 5 5的作成工程。圆1 3為示出g ro d、w c a G基因表現質體p Μ K 8的作成工程。画14為示出neu Α基因表琨質體pT A 14的作成工程。圖15為示出IgtC基因表現質體pGT3的作成工程。画16為示出IgtB基因表現質體PNT60的作成工程。於第1 - (1)表及第1 - ( 2 )表中記述本發明所使用之縮寫及該縮寫之說明。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 8 1227275 A7 B7 五、發明説明（經濟部中央標準局員工消費合作社印製第1_ (1)表 Glc 1葡萄糖 G-6-P |葡萄糖-6-磷酸 G-1-P i葡萄糖-卜磷酸 Glc-1 ， 6-P2 Ι葡萄糖-1，6-二磷酸 Gal i半乳糖 Gal-l-P 半乳糖-卜磷酸 GlcN-6-P 葡萄糖胺-6-磷酸 GlcH-l-P 葡萄糖胺-卜磷酸 GlcUA 葡萄糖醛酸 GlcN 葡萄糖胺 GlcNAc H-乙醯葡萄糖胺 GlcNAc-1-P N-乙醯葡萄糖胺-1-磷酸 F-6-P 果糖-6-磷酸 F-l ， 6-P2 果糖-1,6-二磷酸 Man 甘露糖 Man-6-P 甘露糖-6-磷酸 Man-l-P 甘露糖-1-磷酸 GDP-4~ket〇-6-deoxyHan 鳥Π票呤核并-5-二碟酸-4- 酮基-6-脫氧甘露糖 Γ ManNAc N-乙醯甘露糖胺 ! NeuAc \ N-乙醯神經胺酸 | Z_C〇A ] 乙醯輔酶A ί NTP 丨核- 5 1 -三K酸：HDP 丨 L 二丨NMP j ；核芽-5’-二鱗酸核苷-5’-單磷酸 1 ATP 腺芽-5’-二鱗酸 [DTP 尿苷-5夂三磷酸 | GTP 鳥苷-5 f-三磷酸 f CTP 胞If -5 二鱗酸 ! GMP 鳥苷-5f-單磷酸 ---------I (讀先閲讀背面之注意事項再填寫本頁

'1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 9 1227275 A7 B7 五、發明説明（）經濟部中央標準局員工消費合作社印製

第1 - ( 2 )表 UDP-G 1 c t 尿苷-5 ’ -二磷酸葡萄糖 UDP-Ga 1 尿苷-5 ’ -二磷酸半乳糖 ί 卜- UDP-G1cHAc 1 尿苷-5 f -二磷酸N -乙醯葡萄糖胺 U D P - G a 1 N A c 尿苷-5 ’ -二磷酸N -乙醯半乳Μ里―— — UDP-G 1 cUA 尿苷-5 ’ -二磷酸葡萄糖醛酸 f 1 GDP-Man t 鳥苷-5 二磷酸甘露糖 GDP-Fuc ^苷-5 ’-二磷酸岩藻糖 C Μ P - N e υ A c 胞苷-5 單磷酸N-乙醯神 ί 經胺酸 g a 1 U 葡萄糖-卜磷酸尿苷醯轉移酶 p p a (Innoganic)焦鱗酸酶 g a 1 K ~半乳糖激酶 ga IT | Ϊ乳S -1-K—酸尿醯轉移酶 g 1 m U N -乙醯葡萄糖胺-1 -磷酸尿苷醯轉移酶葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶 p g in 磷酸葡萄糖變位酶 p f k B j__________ 磷酸果糖激酶 > g 1 niM 磷酸葡萄糖變位ΐ g 1 k L....,,-... 葡萄糖 m a η B \ — 磷酸甘露糖Ϊ位酶 < m a n C 甘露’ Ϊ :了:运ir鳥…^ ' j i_____________________________ 酶 g in d l................ 60?-甘露糖-4,6-脫水酶 w c a G GDP-4-酮ί -6-脫氧甘露ί— ί 卜 m酶/遷原酶 \ n e u A CMP-N-乙_神經胺酸合成 ! Ϊ L n e u B 酶 N -乙醯神經胺酸合成酶 ! n a n A ί _! —- ------------------------------------卞^«,师、,取肅. N -乙醯神經胺酸醛縮酶 j P y r G i ί j 胞苷-5 ^三K酸合成酶卜一. 1 g t B 召1，4 -半乳糖基轉移酶 μ_. 1 g t C j a 1，4-半乳糖藝聶W1I ! ί u g d 卜—一一 1 UDP-i萄i i氫酶 … _*J (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） 10 1227275 A7 B7 五、發明説明（）若依據本發明，則可提供具有1 )不需要NTP和糖磷酸等昂貴原料，且僅Μ乳清酸等之廉價核苷酸之前驅物質及糖作為原料，2)於ΝΜΡ或NDP轉換成ΝΤΡ中，不需要添加昂貴的磷酸烯醇丙嗣酸和丙酮酸激酶，並且，3 )不需要酵素之單離操作等特徵之糖核苷酸的新穎製造方法及利用該糖核苷酸製造方法之新穎複合糖質的製造方法。本發明之製造方法所製造之糖核苷酸可列擧具有核苷 -5 ^二磷酸殘基之末端磷基與糖殘基之遷原基以酯鍵所構成之一般構造的化合物，再者，核苷酸殘基為胞苷-5’-翬磷酸者、糖殘基為多元醇者亦被包含於依據本發明所製造之糖核苷酸。本發明之製造方法所製造之複合糖質可列擧簞糖、寡醣、結合至載體等之翬糖或寡醣、蛋白質、胜肽、脂質、糖蛋白質、糖脂質、糖胜肽或類固醇化合物等糖質所結合之化合物。 Μ下詳细說明本發明。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1) 本發明所使用之具有由核苷酸之前驅物質生產ΝΤΡ能力之黴生物，若為具有由核苷酸之前驅物質生產ΝΤΡ能力之黴生物則均可使用，可列舉例屬於埃希氐稈菌屬或棒狀稈菌屬之微生物。於屬於埃希氐桿菌屬之黴生物可列舉大腸稈菌。於屬於棒狀桿菌靨之微生物可列擧產氨棒狀桿菌等。 2) 本發明所使用之具有由糖和Ν ΤΡ生產糖核苷酸能力之徼生物，若為具有生成目的糖核苷酸活性之生物則均可使本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -11 - !227275 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，亦可使用（5)及（6 )所選出一個以上酵素之活性、或 (5 )及（6)ffr選出之一個K上酵素和（1 )至（4 )所選出之一個Μ 上酵素之活性經由基因重組技術而增強之轉形株。該轉形株之具體例可列擧具有含來自大腸稈菌之gal Τ及gal Κ基因之重組體DNA (PNT25)的大腸稈菌NM522株及具有含來自大腸桿菌之galT及galK基因之重組體DNA(PTK7)的產氨棒狀桿菌 ATCC 21170。 (5) (6) 半乳糖—Gal — 1 一P — UDP-Gal (式 2) (5) :半乳糖激酶（EC2,7· 1.6) (6) :半乳糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶（Ε〇2·7·7·12) 關於2)_③ UDP-G lcNAc之生產，則Μ使用下逑式3所示之 (7)至（12)及式1所示之（4)之酵素活性強的微生物、或式3 所示之（1 3 )及（1 0 )之酵素活性強的微生物為較佳。具體而言，可列舉屬於埃希氏桿菌屬及棒狀桿菌屬之微生物，較佳具體例可列舉大腸桿菌或產氨棒狀桿菌° 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

又，亦可使用（4)、（7)、（8)、（9)、（10)、及（13)所選出一個Μ上酵素之活性經由基因重組技術而增強之轉形株。該轉形株之具體例可列擧具有含來自大腸稈菌之g 121Μ基因之重組體DNA(pNT44)的大腸稈菌ΝΜ522株’具有含來自大腸桿菌之glmU及ppa基因之重組體dna(pNT14)的大腸桿菌K Y 8 4 1 5株、具有含來自大腸桿菌之g 1 k基因之重組體D N A (PNT46)的大腸桿菌NM522株、具有含來自大腸桿菌之gaiK 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規梏（210X 297公釐） -1 3 _ 1227275 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（）基因之重組體D N A ( p N T 5 4 )的大腸桿菌N Μ 5 2 2株等° 經由基因重組之（8 )磷酸葡萄糖胺變位酶活性之表現及增強上，雖必須添加 G 1 e — 1 ’ 6 - ρ 2 [ J β 丨 0 1 ♦ C h e 10 ♦，27—1， 3 2 ( 1 9 9 6 )]，但經由使用（1 1)及（1 2 )酵素之活性M基因重組技術而增強之轉形株，則可不添加Gle-Ι，6-P2而可由 G-6-P及 F-6-P供給 Glc-1， 6-P2。此類轉形體之具體例可列舉具有含來自大腸桿菌之p g m 基因之重組體DNA(pNT24)的大腸桿菌NM522株、具有含來自大腸桿菌之PfkB基因之重組體DNA(pNT47)的大腸桿菌 NM522株、具有含來自大腸桿菌之Pgm及pfkB基因之重組體 DNA(pNT55)的大腸桿菌NM522株。經由使用（11)及（12)之酵素活性，由G-6_P& F-6-P供給 Glc-1,6-P2，令（8)之磷酸葡萄糖胺變位酶活性之表琨增強之方法為本發明所首先揭示之方法。使用（13)之半乳糖激酶（EC2.7.1.6)由（He NAC製造 GlcNAe-1-P之方法為本發明所首先揭示之製造方法。使用該製造方法可製造G lc NAc-1-P。即，使用半乳糖激酶活性強之微生物，例如具有含編碼salk基因之DNA斷片和載體之重組體D N A的微生物之培養液或該培養液之處理物作為酵素源，並令該酵素源及G 1 e N Ac存在於水性介質中，令該水性介質中生成蓄積G lcNAc-1-P，並由該水性介質中採集 G]cNAe-l-P，即可製造 GlcNAc~l-P。由水性介質進行G 1 cNAc-1-P之採集，可使用活性炭和雛子交換樹脂等經由通常之方法而進行。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規栘（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·

、1T 14 1227275 A7 B7 五、發明説明（ (7) (8) (9) (10) 萄 _ _ — GlcN-6-P — GlcN-1-P — GlcNAc-1-P — UDP-GlcNAc (13) . (1〇) G1 cNAc — G1 cNAc — 1 —P — UDP — G1 cNAc (式3 )

(12) G —6 —P — G—1 一P (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (11) F — 6-P — F — 1, 6 — P2 (12) G— 1 一P + F - 1, 6 - P2 — G — 1, 6—P2 (7):己糖激酶（EC2.7.L1)或葡萄糖激酶（EC2.7.1.2) (8 ):磷酸葡萄糖胺變位酶 (9) :葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶 (10) : 乙醯葡萄糖胺_1-磷酸尿甘釀轉移酶 (EC2♦7 · 7 ♦ 23) (11) :磷酸果糖激酶（EC2· 1 ♦ 11) (1 2 ):磷酸葡萄糖變位酶（E C 2 , 7 *5,1) (1 3 ):半乳糖激酶（E C 2 ♦ 7 ♦ 1 . 6 ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製關於2)-④ UDP-Ga INAe之生產，則Μ使用下述式3所示之 (7 )至（1 2 )及式4所示之（1 4 )之酵素活性強的黴生物、或式 3所示之（10)、（13)及式4所示之（14)之酵素活性強的微生物為較佳。具體而言，可列擧屬於埃希氐桿菌屬及棒狀桿菌屬之徵生物，較佳具體例可列擧大腸稈菌或產氨棒狀桿菌。又，亦可使用（7 )至（1 4 )及（4 )所選出一個以上酵素之活本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 15 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）性經由基因重組技術而增強之轉形株。 — - UDP - GlcNAcOUDP - GalNAc (式 4) (14): UDP-GieNAc 4~表異構酶（EC5.1.3.7) 關於2 )-⑤U D P - G 1 c ϋ A之生產，則使用式1所示之（1)至（4 ) 及式5所示之（1 5 )之酵素活性強的微生物為較佳。具體而言，可列擧屬於埃希氏稈菌屬及棒狀稈菌屬之微生物，較佳具體例可列舉大腸稈菌或產氨棒狀稈菌。又，亦可使用（1)、（2)、（3)、（4)庚(15)所選出一僻从上酵素之活性經由基因重組技術而增強之轉形株。 — 05) UDP — Glc— UDP — GlcUA (式 5 ) (15) : UDP-Glc脫水酶（EC1,1,1,22) 關於2)_® GDP-Man之生產，則K使用下逑式6所示之（16) 至（18)及式3所示之（11)及（12)之酵素活性強的徼生物為較佳。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 具體而言，可列舉屬於埃希氏桿菌屬及棒狀稈菌屬之徼生物，較佳具體㈣可列擧大腸桿菌或產氨棒狀桿菌。又，亦可使用（1 6 )、（ 1 7 )及（1 8 )所選出一個以上酵素之活性經由基因重組技術而增強之轉形株。該轉形株之具體例可列舉具有含來自大腸稈菌之BianB及manC基因之重組 DHA(pHK7)的大腸稈菌NM522株、具有含來自大腸桿菌之 gik基因之重組體DNA(pNT46)的大腸稈菌NM522株等。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公H _ 1 Α ^ 1227275 kl B7 五、發明説明（）經由基因重組之（1 7)磷酸甘露糖胺變位酶活性之表現及增強上，雖必須添加G 1 c - 1，6 - P 2，但經由使用（1 1)及 (1 2)酵素之活性以基因重組技術而增強之轉形株，則可不添加 G lc-1，6-P2而可由 G-6-P及 F-6-P供給 G U-L6-P2。此類轉形體之具體例可列擧具有含來自大腸桿菌之Pgm基因之重組體D N A ( p N T 2 4 )的大腸桿菌N Μ 5 2 2株、具有含來自大腸桿菌之PfkB基因之重組體DNA(PNT47)的大腸桿菌ΝΜ522 株、具有含來自大腸桿菌之pgm及PfkB基因之重組體DNA (PNT55)的大腸稈菌NM522株。經由使用（11)及（12)之酵素活性，由G-6-P及F-6-P供給 GU-1,6_P2，令（17)之磷酸甘露糖變位酶活性之表規增強之方法乃為本發明所首先揭示之方法。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (16) (17) (18) ΐί 露讓—Man — 6—Ρ — Man — 1 一Ρ — GDP — Man (式6) (16) :己糖激酶（EC2*7*1 + 1)或葡萄糖激酶（EC2,7*l + 2) (17) :磷酸甘露糖變位酶（EC2.7U) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (18) :甘露糖-卜磷酸鳥苷醯轉移酶（EC2.7.7.13) 關於2)-⑦ GDP-Fuc之生產，則Μ使用下逑式7所示之（19) 及（2 0 )及式6所示之（1 6 )至（1 8 )及式3所示之（1 1)及（1 2 )之酵素活性強的微生物為較佳。具體而言，可列擧屬於埃希氐稈菌屬及棒狀稈菌屬之黴生物，較佳具體例5列擧大腸桿菌或產氨棒狀桿菌。又，亦可使用（1 6 )、（ 1 7 )、（ 1 8 )、（ 1 9 )及（2 0 )所選出一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X 297公釐） 17 1227275 A7 五、發明説明（該nc a o ffl 株及形ΠΒ 轉ma 之之強菌增桿而腸術大技自組來重含因有基具由擧經列性可活例之體素具酵之上株 Μ 形個轉 Ν/及 D k 組gl 重之之菌因桿基腸

菌體桿組腸重大之的因 7)基 K G 大自菌來桿含腸有大具的 ^11/ > 8 fcTV 株 Ν 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Η M5 22株、具有含來自大腸桿菌之slk基因之重組體DN A (PNT46)的大腸桿菌NM522株等。經由基因重組之（1 7)磷酸甘露糖胺變位酶活性之表規及增強上，雖必須添加Glc-1，6-P2，但經由使用（11)及（12) 酵素之活性Μ基因重組技術而增強之轉彩株，則可不添加 Glc-1，6 -Ρ2 而可由 G-6-P 及 F-6-P 供給 Glc-1,6-P2。此類轉形體之具體例可列擧具有含來自大腸桿菌之Mm 基因之重組體DNA(pNT24)的大腸桿菌NM522株、具有含來自大腸稈菌之WkB基因之重組體DNA(pNT47)的大腸桿菌 NM522株、具有含來自大腸桿菌之pgffl及pfkB基因之重組體 DNA(pNT55)的大腸桿菌NM522株。 (19) (20) GDP-Man — GDP - 4-keto-6-deoxyMan — GDP — Fuc (式 7) (19) : GDP-Man-4, 6-脫水酶 (20) : GDP-4 -酮基-6 -脫氧甘露糖表異構酶/選原酶關於2)-⑧CM P-Neu Ac之生產，則以、使用下述式8所示之（21 ) 、（2 2 )或（2 3 )、（ 2 4 )及（2 5 )之酵素活性強的微生物為較佳。具體而言’可列舉屬於埃希氐桿菌屬及棒狀桿菌屬之微生物’較佳之具體例可列擧大腸桿菌或產氨棒狀稈菌。又’亦可使用（21) ·、（22)、（23)、（24)及（25)所選出一冢紙張尺度適用中國國家標準（CNSTA4規格（210X 297公釐）~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227275 A7 B7 五、發明説明（個以上酵素之活性經由基因重組技術而增強之轉形株。該轉形株之具體例可列擧具有含來自大腸桿菌之n a n A基因之重組體 D N A ( p H A L 1)的大腸桿菌 C 6 Ο 0 株[A p p 1 . E η γ i r ο η *

Μ i c r ο 1 * , H, 562(1986)]、具有含來自大腸桿菌之neuA 基因之重組體DMA (pTA14)的大腸桿菌NM522株等。 ) (24) NeuAc — CMP-NeuAc (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (21) (22)或

GlcNAc — ManNAc —♦ (式8) (25)

UTP — CTP (21) : GlcNAe 2-表異構酶（EC5+1,3*8) (22) : MeuAe醛縮酶（EC4,1*3*3) (23) : NeuAc合成酶（EC4*1*3*19) (24) : CMP-HeuAc合成酶（EC2*7.7*43) (25) : CTP合成酶（EC6.3,4*2) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製於微生物為同時具有1)中記載之微生物性質及2 )中記載之微生物性質之情形中，則可利用該微生物，由核苷酸之前驅物質和糖生產糖核芽酸。於黴生樹為同時具有1)中記載之微生物性質及2 )-①中記載之性質之情形中，則可利用該徼生物，由乳清酸等之 UTP前驅物質和葡萄糖生產UDP-G 1c，於同時具有1)中記載之黴生物性質及2 )-②中記載之黴生物性質之情形中，則可利用該微生物，由乳清酸等之UTP前驅物質和半乳糖生產U D Ρ - G a 1，於同時具有1 )中記載之微生物性質及2 ) - @中 19 一本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227275 A7 137 五、發明説明（）記載之性質之情形中，則可利用該黴生物，由乳清酸等之 ϋΤΡ前驅物質和由葡萄糖胺或N-乙醯葡萄糖胺生產KDP-G lc N Ac，於同時具有1)中記載之黴生物性質及2 )-④中記載之性質之情形中，則可利用該徵生物，由乳清酸等之ϋ TP前驅物質和葡萄糖胺或N-乙_葡萄糖胺生產UDP-Ga INAc，於同時具有1 )中記載之黴生物性質及2 )-⑤中記載之黴生物性質之情形中，則可利用該黴生物，由乳清酸等之ϋΤΡ前驅物質和葡萄糖生產UDP-GlcUA，於同時具有1)中記載之黴生物性質及2)-⑧中記載之性質之情形中，則可利用該微生物，由GMP等之GTD前驅物質和甘露糖生產GDP-Man，於同時具有1)中記載之微生物性質及2)-⑦中記載之性質之情形中，則可利用該微生物，由GMP等之GTP前驅物質和甘露糖生產GDP-Fuc，於同時具有1)中記載之微生物性質及2)-⑧中記載之性質之情形中，則可利用該黴生物，由乳清酸等之CTP前驅物質和乙醯葡萄糖胺或乙薩甘露糖胺生產C Μ P - N e u A e。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此類微生物的具體例可列擧表現來自大腸桿菌之ga 1 T 及g a 1 Κ基因之產氨棒狀桿菌。又，與上逑之菌株不同，於1菌株中僅具有糖核苷酸之製造上所必須之部分活性之微生物之情形中，可適當組合具有各種活性的微生物，進行糖核苷酸之製造。具有1 )中記載性質之微生物亦不須為一種，Κ二種以上構成1)中記載性質時亦可利用作為具有1)中記載性質之微生物。具體而言，可例示表現來自大腸桿菌之P y r G基因之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）。Λ 1227275 A7 B7 五、發明説明（）大腸稈菌和產氨棒狀桿菌之組合（特開平5-27 697 4 )。同樣地，具有1)記載性質之黴生物亦不須為一種，且可 Μ二種Μ上所構成。經由適當組合該黴生物群，則可生產目的之糖核苷酸，經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 例如，使用具有1 )中記載性質之黴生物及具有2)-①中記載性質之一種Κ上之徼生物，則可由乳清酸等之U ΤΡ前驅物質和葡萄糖生產UDP-Glc，使用具有1)記載性質之微生物及具有2)-②記載性質之一種Μ上之微生物，則可由乳清酸等之UTP前驅物質和半乳糖生產UDP-Gal，使用具有 1)記載性質之黴生物及具有2)-③記載性質之一種Μ上之微生物，則可由乳清酸等之UTP前驅物質和葡萄糖胺或Ν-乙醢葡@糖胺生產UDP-Glc NAc，使用具有1)記載性質之黴生物及具有2)-④記載性質之一種以上之微生物，則可由乳清酸等之UTP前驅物質和葡萄糖胺或N-乙醢葡萄糖胺生產UDP-GalNAc，使用具有1)記載性質之黴生物及具有2) -⑤記載性質之一種K上之黴生物，則可由乳清酸等之UTP 前驅物質和葡萄糖生產U D Ρ - G U U A，使用具有1)記載性質之微生物及具有2 )-⑥記載性質之一種以上之微生物，則可由GMP等之GTP前驅物質和甘露糖生產GDP-Man，使用具有1)記載性質之徼生物及具有2)⑦記載性質之一種Μ上之微生物，則可由GMP等之GTP前驅物質和甘露糖生產GDP-F u e，使用具有1 )中記載性質之微生物及具有2)-⑧中記載性質之一種K上之微生物，則可由乳清酸等之C TP前驅物質和乙醯葡萄糖胺或N-乙醯甘露糖胺生產CMP-NeuAc。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（ _桿。 4腸p 冑U帛組由基重鹼目= 基g部用 g 全 _，物利^其 ^ ^ Λ 微： V i疋中i決浩i2*B M^TIfi 一二 Μ 酸 ’ 苷 2 化核第殖糖之選於造被 , 製體逑該色上與染如參之，菌 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規桔（210Χ 297公釐） 2 2 1227275 A7 B7 五、發明説明（ S因因因因因因因因园a__ 基因基基基因基基因基基因基基基基基因 U基KTU基BM 基 BC基 GABAG 基 II 3 —1 limmm^^nnTQauunr *a a p s 3 .—Igf.—- .—-3a^c6Gays gpbogboppgbjommgw nnnpu 第 2 表參考文獻 J. Biochem., Π5, 965 (1994) J. Bacteriol., 170, 5901 (1988)

Nucleic .Acids Res., 13, 1841 (1985) Nucleic Acids Res·, 14, 7705 (1986) J· Bacteriol·, 175, 6150 (1993) J. Bacteriol., 176, 5847 (1994)

Gene, 337 (1984) J. Biol. Chem·, 271, 32 (1996) J· Bacteriol·, 1Z9, 1298 (1997) J· Bacteriol·; 178, 4885 (1996) J· Bacteriol., 178, 4885 (1996) J. Bacteriol·, 178, 4885 (1996) J. Bacteriol., 178, 4885 (1996) J. Biol. Chem., 264, 14769 (1989) J· Bacteriol·, 177, 312 (1995)

Nucleic Acids Res., 13, 8843 (1985) J. Biol. Chem., 261, 5568 (1986) J. Bacteriol., 177? 4562 (1995) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 1227275 A7 五、發明説明（）關於由具有含有該基因之質體的大腸桿菌之質體D N A的翬離精製、質體DNAM限制酶之切斷、切斷之DNAj4段的翬離精製、D N A Μ泠的酵素性鍵結、使用重組體D N A之大腸桿菌的轉形等基因重組的各種操作，可依據公知的方法[例如 J.Sambrook等之著書；Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second edition冷泉港實驗室（1989) ]進行。又，聚合酶鐽反應（M下，簡稱PCR)可使用Perl c in Elmer Cytus公司製之 Thermal Cycler等進行 ϋ 為了令參與糖核苷酸製造之基因於宿主中表琨，可將含有該基因之DN Α片衿，以限制酶類或PCR，作成含有該基因的適當長度之DN A片餞後，插入表琨載體中啟動基因的下游，其次將插入上述D N A之表現載體，導入表琨載體所適合之宿主中，即可達成。宿主可使用能表琨目的基因之全部宿主。除了可列舉例妙屬於埃希氐桿菌屬、沙雷氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬、假單胞菌屬、桿菌屬等之黴生物Μ外，可列擧屬於酵母屬、念珠菌屬等之酵母等。經濟部中央標準局員工消費合作社印製表琨載體可使用於上逑宿主中能獨立複製或可嵌入染色體中，並且在可轉錄參與糖核苷酸製造之基因之位置中含有啟動基因之表琨載體。於使用上述微生物作為宿主之情形中，Κ參與糖核苷酸製造之基因的表現載體可在黴生物中獨立複製且同時由啟動基因、核糖體結合序列、參與糖核苷酸製造之基因、轉錄終止序列所構成為較佳。亦可包含控制啟動基因之基因。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -24 - 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（)

表琨載體可例示例如ρ Β Τ Γ P 2、P B T a e 1、p B T a C 2 (均為 Boehringer Mannheim公司製）、POP 1〇(特開昭 58- 1 1 0600 ) 、ρ Κ Υ Ρ 2 0 0 [ A g r i · Β i ο i ♦ C h e in · , £8 , 6 6 9 ( 1 984 )] - p L S A I

[A g r i c + B i o 1 ♦ C h e nu，, 277(1989)] Λ pGELl[Proc,

Natl, Acad+ Sci* USA? 8 2, 4306 ( 1985)] ^ pBluescript H Sk+ (STRATAGENE 公司製）、pT>S 30 [由大腸桿菌 JM 1 0 9 / p T r S 3 0 ( F E R M BP-5407 )所調製]及 pTrS 32[由大腸桿菌 JM109/i>TrS32 (FERM BP - 5408)所調製]、PUC19[Gene, 33，103(1985)]、pSTV28(寶酒造公司製）、PPA1(特開昭 ___ 9 6 3-233798)、pCG11(特公平 6-91827)等。啟動基因若為可在上逑宿主中表現，則任何物質均可。可列舉例如t r p啟動基因、1 a c啟動基因、Pb啟動基因、P R 啟動基因等之來自大腸桿菌和噬菌體等之啟動基因。又，亦可使用令二個t r p啟動基因直列之啟動基因、如t a c啟動基因般經人工地設計改變之啟動基因等。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 核糖體結合序列若為可在上述宿主中表琨，則任何物質均可，但K使用令核糖體結合序列與起始密碼子之間調節至適當距離（例如6〜1 8個鹼基）之質體為較佳。令參與糖核苷酸製造之基因表現上，並非必定需要轉錄終止序列，但較佳期望於構造基因之下游設置轉錄終結序列。宿主亦可使用重組體DN A可表琨、旦可利用於糖核苷酸生成反應之任何徼生物，具體而言可列舉大腸桿菌X L 1 - 811^、大腸桿菌¥1,2111^、大腸稈菌〇[{1、大腸桿菌卜丨(：1000 冢紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規栳（210χ297，ϋ ~ ] -2 5 - 1227275 kl B7 五、發明説明（）、大腸稈菌KY3276、大腸稈菌W 1 485、大腸稈菌JM109、大腸桿菌HB101、大腸桿菌No. 49、大腸桿菌W3110、大腸桿菌NY49、大腸桿菌KY8415、大腸桿菌NM522、祜草祜菌、短稈菌、澱粉液狀稈菌、B r e v i b a e t e r i u πι i m hi a r ί 〇 p h i 1 u hi ATCC 1 4068、溶釀短桿菌ATCC 1 4066、黃色短稈菌 ATCC 1 4067、乳酸醱酵短稈菌ATCC 1 3 869、產氨棒狀桿菌 ATCC21170、·麩胺醢胺棒狀桿菌ATCC13032、_乙_酸棒狀桿菌ATCC 1 3870、嗜氨綑桿菌ATCC 1 5354、惡臭假單胞菌、黏質沙雷氏菌等。於使用酵母菌株之情形中，其表琨載體可例示例如YEp 13 (ATCC37115) > YEp24 ( ATCC3705 1 ) > YCp 50 ( ATCC374 1 9) 等。啟動基因若為可在酵母菌株之宿主中表現，則任何物質均可。可列擧例如，己糖激酶等之解糖系基因的啟動基因、g a 1 1啟動基因、g a 1 1 0啟動基因、熱衝擊蛋白質啟動基因、M F〇< 1啟動基因、C ϋ P 1啟動基因等之啟動基因。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 宿主亦可使用重組體D Ν Α可表現、且可利用於糖核苷酸生成反應之任何酵母、具體而g可列擧 cerevisiae、 Candida utilis、 Candida parapsilosis> Candida krusei、 Candida versati 1 is、Candida lipolytka、Candida zeylanoides> Candida guil1iermondii、Candida albicans、Candida humicol a、Pi chi a farinosa、 Pichia ohmeru Torulopsis Candida、 Torulopsis sphaerica、 Torulopsis xylinus、 Torulopsis iamata、 Torulopsis versatilis、 Debaryomyces 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） _ 〇 a 26 1227275 A7 B7 五、發明説明（) subglobosus、 Debaryomyces cantarellii、 Debaryomyces globosus、 3ebaryomyces hansenii、 Debaryomyces japonicus、 Zygosaccharorayces rouxii、 Zygosaccharomyces bai 11 U Kluyveromyces 1 act is、Kluyveromyces marxianus、 Hansenula anomala、 Hansenula jadinii、 Brettanomyces larabicus、 Brettanomyces anomalus、 Schizosaccharomyces pombe 、Trichosporon pul 1 u 1 a n s .& Schwanniorsyees a 1 1 u v i u s (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製等。本發明所使用之黴生物之培養 9 可依通常之培養方法進行 0 培養該微生物之培養基若為含有該微生物可資化之碳源、氮源、無纖 m 鹽類等且可有效率進行該微生物培養之培養基則不論天然培養基合成培養基均可使用〇碳源若為各黴生物可資化之物質即可 > 且可使用葡萄糖、果搪、 m 糖 Λ 乳糖麥牙糖 Λ 甘露糖醇 Λ 山梨糖醇 Λ 糖蜜澱粉或澱粉水解物等之碳水化合物 Λ 丙嗣酸、乳酸 •V 檸檬酸 _、反丁烯二酸等之各種有機酸、麩胺酸 Λ 甲硫胺酸 > 離胺酸等之各種胺基酸 Z 醇 ·、丙醇、甘油等之醇類〇又 5 亦可使用白糖 Λ 木薯 Μ 渣玉米條浸液等之天有機營養源〇氮源可使用氨 Λ 氯化銨 \ 硫酸銨 Λ 碳酸銨 Λ 醋酸銨 Λ 磷酸銨等之各種無纖 m 及有纖機銨 azjjs W 類 > 麴胺酸 Ή 麩胺薩胺 V 甲硫胺酸等之胺基酸、蛋白腺 ΝΖ :胺、玉米條浸疲肉萃取 -27 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（）物、酵母萃取物、麥芽萃取物、駱蛋白水解物、大豆渣滓、大豆渣滓水解物、魚粉或其消化物等。無機物可使用磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鎂、氯化納、氯化鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、硫酸鋅、碳酸鈣等。亦可視需要添加維生素、胺基酸、核酸等。在振盪培養或通氣攪拌培養等之好氣性絛件下進行培養。培養溫度Μ 15〜45Ό為佳，培養時間通常為5〜96小時。培養中之ρ Η為保持於3.0〜9 + 0。視需要，可使用無機或有機酸、鹼性溶液、尿素、碳酸鈣、氨、ρ Η緩衝液等進行培養基pH之調整。又，於培養中，亦可視需要在培養基中添加安比西林和四環黴素等抗生素。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於培養使用誘導性啟動基因作為啟動基因之表現載體所轉形之微生物時，視需要，亦可於培養基中添加誘導物。例如，於培養使用1 a c啟動基因之表現載體所轉形之微生物時*亦可於培養基中添加異丙基/S -D-硫代半乳糖苷 (IPTG)等，於培養使用trp啟動基因之表規載體所轉形之徵生物時，亦可於培養基中添加吲哚-3-乙酸（IAA)等。於本發明之糖核苷酸之製造中，於使用二種K上微生物時，可將該徵生物分別個別培養，並且利用該培養液使用於糖核苷酸之製造，且亦在一個培養器中同時植菌，且於混合培養後，利用該培養液使用於糖核苷酸之製造。又，亦可在其一之徼生物培養中或培養終了時，植人剩餘的徵本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 28 1227275 A7 B7 五、發明説明（）生物1並於培養後，利用該培養液使用於糖核苷酸之製造。再者，亦可將具有上逑1 )中記載性質之微生物和具有2 ) 中記載性質之微生物分開培養，並利用各培養液使用於糖核苷酸之製造。經由該培養所得之微生物培養液及該培養液經各種處理之培養液處理物可使用作為酵素源，且可使用於水性介質中糖核苷酸之生成。培養液之處理物可列擧培養液之濃縮物、培養液之乾燥物、離心培養液所取得之培養上清液、該培養上清液之濃縮物、由培養上清液所得之酵素樣品、離心培養液所得之細胞（包含菌體）、該细胞之乾燥物、該细胞之冷凍乾燥物、該ffl胞之界面活性劑處理物、該细胞之超音波處理物、該綑胞之機械性磨碎處理物、該綑胞之溶劑處理物、該细胞之酵素處理物、該綑胞之蛋白質分級物、該ffl胞之固定化物或由該_胞萃取所得之酵素樣品等。糖核苷酸生成中所使用之酵素源份量，W濕菌體而言$ K 1〜5 0 0 g / 1，較佳為5〜3 0 0 g / 1。又，於同時使用二種Μ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 上之黴生物於水性介質中進行反應之情形中，水性介質中之該微生物的全濕菌體量為2〜500g/卜較佳為5〜400g/ i。糖核苷酸生成中所使用之水性介質可列舉水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、砸酸鹽、擰檬酸鹽、Tr i s等緩衝液、甲醇、乙醇等之醇類、醋酸乙酯等之酯類、丙酮等之画類、乙醯胺等之醯胺類等。又，使用作為酵素源之微生物的培養液，可使用作為水性介質。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X297公釐） 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）糖核苷酸生成中所使用之核苷酸之前驅物質可列擧乳清酸、尿嘧啶、乳清酸核苷、尿苷、胞嘧啶、胞苷、腺嘌呤、腺苷、鳥嘌呤、鳥苷、次黃嘌呤、肌苷、黃嘌呤、黃_ 呤核苷、肌苷-5 ^單磷酸、黃嘌呤核苷-5 ^翬磷酸、鳥苷 -5 ^單磷酸、尿苷-5 單磷酸及胞苷-5 單磷酸等，較佳可列擧乳清酸及鳥苷-5-單磷酸。該核苷酸之前驅物質為純品及該前驅物質之鹽且其夾雜物限於不阻礙反應，且可使用經由微生物醱酵生產之含有該前驅物質之培養液及該培養液之該前驅物質粗略精製物。核苷酸之前驅物質為使用（KlinM〜1.0M、較佳為0,01〜（K3M之濃度。糖核苷酸生成中所使用之糖可列擧葡萄糖、果糖、半乳糖、葡萄糖胺、Ν-乙醯葡萄糖胺、Ν-乙釀半乳糖胺、甘露糖、岩藻糖、Η -乙釀甘露糖胺、乙醯神經胺酸及其衍生物。該糖可使用純品，而若為含有其、且夾雜物不會阻礙反應者則均可使用。糖可在反應開始時一次添加，或於反應中分次、或連續添加亦可，且使用0 . 1 hi Μ〜2 . 0 Μ之濃度。經濟部中央標準局員工消費合作社印製於糖核苷酸之生成中，視需要，亦可添加ΑΤΡ再生所必須之能量供體，輔酶、磷酸離子、鎂離子、植酸等之嵌合劑、界面活性劑及有機溶劑。能量供體可列擧葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖醇、山梨糖醇等之碳水化合物、丙_酸、乳酸、醋酸等之有機酸、甘胺酸、丙胺酸、天冬醯胺酸、麩胺酸等之胺基酸、糖蜜、澱粉水解物等，且可使用0. 0 2〜2 . 0 Μ之濃度ϋ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規桔（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -3 0 一 1227275 A7 五、發明説明（）磷酸離子可列擧正磷酸、焦磷酸、三多磷酸、四多磷酸、多磷酸、多偏磷酸、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鈉、磷酸氫二鈉等之無機磷酸鹽等，且可使用1 + 0ιπΜ〜1.0M之濃度。鎂離子可列擧硫酸鎂、硝酸鎂、氯化鎂等之無機鎂鹽、擰檬酸鎂等之有機鎂鹽等，且通常為使用1〜100 mM之濃度界面活性劑若為聚氧乙烯十八烷基胺（例如N a i m i n S -2 1 5、日本油脂公司製）等之非離子界面活性劑、溴化鯨蠟基三甲基銨和氯化烷基二甲基苄基銨（例如Cat ion F2-40E 、日本油脂公司製）等之陽離子系界面活性劑、月桂醯替肌胺酸鹽等之陰離子系界面活性劑、烷基二甲基銨（例如三級胺F B、日本油脂公司製）等之三級胺類等之促進各種糖核苷酸生成者則均可，且可使用1種或混合數種亦可。界面活性劑通常為使用0 .1〜5 0 g / 1之濃度。有機溶劑可列舉二甲苯、甲苯、脂族醇、丙麵、醋酸乙酯等，且通常為使用0. 1〜5 0 in 1 / 1、較佳為1〜2 0 m 1 / i之濃度。經濟部中央標準局員工消費合作社印製糖核苷酸之生成反應為在水性介質中，p Η 5〜1 0、較佳為ΡΗ6〜9，20〜50它下2〜96小時之絛件下進行。經由該方法可生成糖核苷酸，且可列擧例如尿苷二磷酸化合物、鳥苷二磷酸及胞苷單磷酸化合物等。具體而言，可列擧 U D Ρ - G 1 c、U D Ρ - G a 1、U D P - G 1 c N A c、ϋ D P - G a 1 N A c、 UDP - GicliA、GDP-Man、GDP - Fue、C Μ P - N e u A c 及其衍生物所選出之糖核苷酸等。 3 1 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（）水性介質中生成之糖核苷酸之定量*可依公知之方法進行，例如，ϋ D P - G ] c和ϋ D P - G a丨之分離定量可依據i\ n a i + (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) B i o c h e m ,， 216，188-194 ( 1994)記載之高速液體層析（以下，簡稱Η P L C )之方法進行。又，ϋ D P - G 1 c N A e、G D P - M a η、 G D P - F u c、C Μ P - H e u A e之分離定量可依據M下條件之Η P L C進行。溶出液：0.1M KH2P〇4 (使用H3P04調整pH3*2) 流速：1毫升/分柱：Partisil-10 SAX(Watonian公司製）檢測：ϋ V 2 6 2 n m 定量：經由標準吸光度值之比較而算出反應液中所生成之糖核苷酸之精製可依據使用活性炭和離子交換樹脂等之通常方法予以進行，例如，於UDP-Gal 及 ϋ D P - G U 可依據 h 0 r g , C h e nu，互I，1 5 2 ( 1 9 9 2 )，於 ϋ D P -0 1〇!^(^可依據<1,0以 + (：}^1!1+，57，1 46 ( 1 992 )記載之方法經濟部中央標準局員工消費合作社印製毘合可隨糖藻或複。乙萄岩胞產用Ν-葡及 G 细生使.、、酶胞物體可酶酶移 ffl 動驅均移移轉蟲或前則轉轉基毘物質胞基基酸或生糖綑糖胺液胞黴合蟲乳糖唾細之複昆半乳、物用和或半酶動使酸胞酶基移或可苷细移 _ 轉物中核物轉乙基生造糖動基N-糖微製由或糖、露之之有物萄酶甘性質具生葡移、活糖為黴有轉酶等合若之具基移酶複，力如胺轉移。g 胞能例糖基轉行*?细質擧萄酸基進蟲糖列葡醛糖本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） 32 Α227275 Α7 Β7 五、發明説明（）又，與前逑糖核苷酸之製造情形同樣地，亦可利用經由基因重組技術所作成之黴生物或動物綑胞或毘蟲细胞。可列擧例如表現來自人類黑色素瘤綑胞s K - M e卜2 8細胞之神經醱胺葡萄糖基轉移酶基因之大腸桿菌[P r 〇 c . N a t 1 + Acad. Sci· USA…11, 4638(1996)]、產生 $ 1,3-半乳糖基轉移酶之人類-黑色素瘤细胞WM266 -4株（ATCC CRL1676 )、及含有來自人類-黑色素瘤细胞WM266-4之1 , 3-半乳糖基轉移酶基因之Namarva细胞KJM-1株等重組株（特開平 6 - 181 7 59)、表琨來自人類Hela细胞之卢1，4 -半乳糖基轉移酶基因之大腸桿菌（EMBOJ.，！，3171(1990))或醸酒酵母[Biochem* Biophys· Res· Cominun*，2 0 1 , 1 6 0 ( 1 994)] 、表現來自大鼠之/9 1 , 6-N~乙醯葡萄糖胺基轉移酶基因之 C0S-7细胞（ATCC，CRL1651)[J· Biol . Chem. , 268 , 1 5 381( 1 99 3 )]、表琨來自人類之N-乙醒半乳糖胺基轉移酶基因之 Sf9綑胞[J* Biochenu, 118, 568(1995)]、來自人經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 類之表現葡萄糖醛酸轉移酶之大腸桿菌[B i 〇 c h e in . Biophys. Res* Commun., Γ96，4 7 3 ( 1 9 9 3 )]、表現來自人類之α 1,3-岩藻糖基轉移酶之Hamam綑胞[J, Biol, C h e πι ♦ , 2£9 , 1 47 3 0 ( 1 9 9 4 )]、表現來自人類之 1 , 3 / 1 , 4 -岩藻糖基轉移酶之 C 0 S - 1 细胞[G e n e s D e v ,，土，1 2 8 8 ( 1 9 9 0 ) ]、表現來自人類之1，2 -岩藻糖基轉移酶之C 0 S-|綑胞 [P r 〇 c . Natl· AcacL Sei* USA♦，^2, 6674(1990 )]、表琨來自鶏之α 2,6-唾液酸基轉移酶之COS-7细胞[Eur* J* B i 〇 c h e m . , 2TQ , 3 75 ( 1994)]、表現來自人類之 a 2, 8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐)~ ~ -3 ό 一 1227275 A7 B7 五、發明説明（）唾液酸基轉移酶之C Η 0綑胞[P r 〇 c* N a t L A c a cK S c i , U S A ,，ϋ 7 9 5 2 ( 1 9 9 4 )]、表現來自奈瑟氏菌之1 , 3 - N -乙醯葡萄糖胺基轉移酶或冷1，4 -半乳糖基轉移酶或泠1，3 -N-乙薩半乳糖胺基轉移酶或α 1，4-半乳糖基轉移酶之大腸稈菌（¥096/10086)、表琨來自奈瑟氏菌之α 2,3-唾液酸基轉移酶之大腸桿菌[J , B i ο 1 , C h e m ,，2U ,2827 1 ( 1 9 9 6 )]、表現來自 H e 1 i c ο bacter iuin p y r o 1 1 i 之 a 1,3 -岩藻糖基轉移酶之大腸桿菌[J. Biol. Chenu, 272 , 21349及21357(1997)]、表現來自酵母a 1，2_甘露糖基轉移酶之大腸桿菌[J, 0rg+, Chem*，3985(1993)]等之黴生物或動物细胞或毘蟲细胞。於本發明複合糖質之製造上使用微生物之倩形中*該黴生物可依據上逑具有由核苷酸之前驅物質和糖生產糖核苷酸能力之黴生物培養同樣之培養基、培養條件進行培養。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 於本發明複合糖質之製造上使用動物細胞之情形中，培養該動物细胞之培養基可使用一般所用之RPMI 1 6 40培養基、衣格爾（Eagle)之ME Μ培養基或於此些培養基中添加胎牛血清等之培養基等。培養為在5 % C 0 2存在下等之條件下進行。培養溫度以2 0〜4 0 °C為佳，培養時間通常為3〜1 4 日。又，培養中視需要，亦可於培養基中添加抗生素。於本發明複合糖質之製造上使用毘蟲細胞之情形中，該毘蟲細胞之培養可依據公知的方法[J + Β ί ο 1 . C h e m .，268 ，1 2 6 0 9 U 9 9 3 )]進行。經由該培養所得之徵生物或動物綑胞或昆蟲細胞培養液本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） -34 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（）及該培養液經各種處理之培養液處理物可使用作為酵素源，且可使用於水性介質中糖核苷酸之生成。培養液之處理物可列擧培養液之濃縮物、培養液之乾燥物、離心培養液所取得之培養上清液、該培養上清液之濃縮物、由培養上清液所得之酵素樣品、離心培養液所得之綑胞（包含菌體）、該細胞之乾燥物、該细胞之冷凍乾燥物、該细胞之界面活性劑處理物、該细胞之超音波處理犓、該细胞之機槭性磨碎處理物、該细胞之溶劑處理物、該细胞之酵素處理物、該細胞之蛋白質分級物、該细胞之固定化物或由該细胞萃取所得之酵素樣品等。複合糖質生成中所使用之酵素源份量，於視酵素活性於 37aC、1分鐘可生成1 iu moU複合糖質之活性為1單位（11)下，以 0 . 1 πι u / 1 〜1 0 0 0 0 U / 1，較佳為 1 in U / 1 〜1 0 0 0 ϋ / 1。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 複合糖質生成中所使用之水性介質可列擧水、磷酸鹽、碳酸鹽、醋酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、Tr i s等緩衝液、甲醇、乙醇等之醇類、醋酸乙酯等之酯類、丙嗣等之酮類、乙薩胺等之酿胺類等。又，使用作為酵素源之微生物、動物细胞或毘蟲细胞的培養液，可使用作為水性介質。於複合糖質之生成中，視需要，可添加植酸等之嵌合劑、Mn C 1 2等之無機鹽、泠-氫硫基乙醇等。複合糖質生成中所使用之糖核苷酸，可使用上述糖核苷酸之生成中所得之反應液或由該反應液精製之糖核苷酸，且可使用0 + 0 1 in Μ〜2 + 0 Μ之濃度。又，於複合糖質之生成反應液中，亦可經由依據上逑方本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） 35 1227275 A 7 B7 五、發明説明（）法令糖核苷酸生成，而供給糖核苷酸。複合糖質之生成中所使用之複合糖質前驅物質，若為單糖、寡_、結合至載體等之單糖及寡薩、蛋白質、胜肽、脂質、糖蛋白質、糖脂質、糖胜肽或類固醇化合物等可作為糖轉移酶基質者則均可使用。具體而言，可例示葡萄糖、半乳糖、甘露糖、唾液酸、 N -乙醯葡萄糖胺、N -乙醯半乳糖胺、乳糖、N -乙薩乳糖胺、乳醯- 二碳 _、GlcNAe /91 - 3 Gal /31 - 4 Glc、經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

GlcNAc 冷 1-4 Gal 召 1-4 Glc、球形三碳醣、Gaia 1-4 Gal冷1-4 GlcNAe、2夂岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3 ^唾液酸基乳糖、6夂唾液酸基乳糖、3夂唾液酸基-N -乙薩乳糖胺、6 ^唾液酸基-N-乙醯乳糖胺、唾液酸基乳醢 -N-二碳_、路易士 X、路易士 a、乳醯-N-四碳醣、乳_ -N -新四碳釀、乳糖基岩藻四碳醣、3 ^唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基路易士 X、唾液酸基路易士 a、乳醯-N-岩藻五碳醣I、乳酿-N-岩藻五碳醣E 、乳醯岩藻五碳醣I 、乳醯-N-岩藻五碳醣V、LS-四醣a、LS-四釀b、LS-四_ c、（ α 2，3 )唾液酸基乳薩-N-新四碳醣及其衍生物、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺及含有該胺基酸之胜肽及其衍生物、神經隨胺及其衍生物等。該複合糖質前驅物質可使用（Κ 0 1 ffi〜2 + Ο Μ之濃度。本發明之複合糖質可列舉含有一種或Μ上之葡萄糖、半乳糖、Ν -乙釀葡萄糖胺、Ν -乙醯半乳糖胺、葡萄糖醛酸、甘露糖、Ν ~乙薩甘露糖胺、岩藻糖、唾液酸、乳糖、Ν -乙本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規桔（210X 297公釐） 36 1227275 A7 B7 五、發明説明（）醯乳糖胺、乳醯-N-二碳醣、G IcNAc泠1 -3 Ga 1 /? 1-4 G 1 、GlcNAc 召 1-4 Gal /31-4 Glc、球形三碳醣、Gala 1-4 Gal 1-4 GlcN Ac、2^ -岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、3夂唾液酸基乳糖、6 ’ -唾液酸基乳糖、3 ^唾液酸基-N-乙醢乳糖胺、6夂唾液酸基-N-乙醯乳糖胺、唾液酸基乳_ -N-二碳釀、路易士 X、路易士 a、乳薩-N-四碳釀、乳醯-N-新四碳醣、乳醯二岩藻四碳_、3 ’ -唾液酸基-3-岩藻糖基乳糖、唾液酸基路易士 X、唾液酸基路易士 a、乳醯-N-岩藻五碳醣I、乳隨-N-岩藻五碳醣S、乳醯-N-岩藻五碳醣I 、乳_ -N-岩藻五碳釀V、LS-四_ a、LS-四醣b、 LS-H_e、（α2,3)唾液酸基乳醯-N-新四碳醣、乳醯-N -二岩藻六碳_ I、乳醯-Ν-二岩藻六碳釀I 、乳醢-Ν-六碳釀、乳醯-Ν-新六碳醣、二唾液酸基乳釀-Ν-四碳釀及其衍生物所選出之糖之複合糖質或含有該複合糖質的複合糖質，可列擧例如G a 1 /3 1 - 3 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Glc、 Gal/?l—4Glc、 Gai 卢 1 二3GlcNAc、 Gal/?1 —4Glc NAc, Gal/?l-3GaU Gal/?l-4GaU Gal^l~3GalNAc Gal/? 1-4 GalNAc、Gala 1-3 Glc、Gala 1-4 Glc、Gal al-3GlcNAc, Gala 1-4 GlcNAc> Gala 1-3 GaU Gal a 1-4 G a 1、G a 1 or 1 -3 GalNAc、Galor 1-4 G a 1 N A c、G 1 c N A c /3 1-3 G a U G 1 c N A c /? 1-4 G a U GlcNAc/3 1-6Gal、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規祐（210X 297公釐） 37 1227275 A7 B7 五、發明説明（）

GlcNAc/?l-3Glc, GlcNAc/3 1-4Glc^ GlcNAc/?l-3G 1cNAcn G1cNAc/?1-4G1cNAcn GlcNAc^l-6GaINA c> GlcNAc/?l-2Man, GlcNAc^l-4Man, GlcNAc/?l-6Man, GalNAc/?l-3Gal^ GalNAc/9 1-4GaU GalNA c/3 1 —4GlcNAc、 GalNAcal —3GalNAc、Man/?l-4Glc N A c > M a η a 1-6 Man, M a η a 1-3 Man, M a n <7 1-2 Man, G 1 cUA/?l-4GlcN, GlcUAy9 1-3Gal, GlcUA/?l~3GlcNA c、G 1 c U A /? 1-3 Ga INAc、NeuAca 2-3 Gal、NeuAca2-6Gal、NeuAca2-3GlcNAc、NeuAca2-6GlcNAc、N euAca2-3GalNAc、NeuAca2-6GalNAc、NeuAca2-8NeuAc、Fuc〇rl-3Glc、Fucal-4Glc、Fucal-3Glc N A c、F u c a 1一4 G 1 c N A c、F u c a 1-2 G a 1 及 F u c a 1-6 G 1 c NA c 所選出之具有鐽結糖之複合糖質或含有該複合糖質之複合糖質。又，具有該糖之複合糖質中所含之糖數目可擧出1 〇個以下或6個Μ下者。具體的複合糖質製造方法可例擧 (1) 經由進行Μ表現來自奈瑟氐菌之/8 1 , 4 -半乳糖基轉移經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 酶（W096/ 10086)之黴生物、具有由UTP之前驅物質生產ΙΠΡ 能力之徼生物、具有由糖和1) Τ Ρ生產ϋ D P -G a 1能力之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和半乳糖和葡萄糖生成乳糖。 (2) 經由進行K表現來自奈瑟氐菌之/3 -1 , 4-半乳糖基轉移酶（W 0 9 6 / 1 0 0 8 6 )之微生物、具有由U T P之前驅物質生產 UTP能力之黴生物、具有由糖和UTP生產UDP-Ga 1能力之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和半乳糖和N -乙釀葡萄糖胺生成N -乙醯半本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） 38 1227275 A7 B7 五、發明説明（）乳糖胺。 (3) 經由進行K表琨來自奈瑟氏菌之α 2, 3-唾液酸基轉移酶[J . B i 〇 h C h e m …27J , 2 8 2 7 1 ( 1 9 9 6 )]之黴生物、具有由CTP之前驅物質生產CTP能力之徵生物、具有由糖和 C T P生產C Μ P - N e u A C能力之黴生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和H -乙醯甘露糖胺和丙顯酸和乳糖生成3 ^唾液酸基乳糖。 (4) 經由進行Μ表琨來自奈瑟氏菌之α 2,3-唾液酸基轉移酶[J* Biol, Cheia., 2χΐ , 28271(19 9 6)]之黴生物、具有由CTP之前驅物質生產CTP能力之微生物、具有由糖和 CTP生產CMP-Neu AC能力之黴生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和N -乙釀甘露糖胺和丙麵酸和N-乙醯乳糖胺生成3 f-唾液酸基-N-乙醢乳糖胺。 (5 )經由進行Μ表現來自鶏之α 2，6 -唾液酸基轉移酶之 C 0 S - 7 綑胞[E u r + J ♦ B i 〇 c h e in ♦ , 2_1_9 , 3 7 5 ( 1 9 9 4 )、具有經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由CTP之前驅物質生產CTP能力之黴生物、具有由糖和CTP 生產CMP-Neu Ac能力之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和N -乙醯甘露糖胺和丙麵酸和Μ -乙醢乳糖胺生成6 ’ -唾液酸基-N -乙釀乳糖胺。 (6 )經由進行Μ表琨來自奈瑟氏菌之泠1 , 3 -半乳糖基轉移酶096/ 1 00 86 )之黴生物、具有由UTP之前驅物質生產 U Τ Ρ能力之微生物、具有由糖和11 Τ Ρ生產ϋ D Ρ - G 1 c N A c能力之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（) 黴生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和N -乙醯葡萄糖胺和乳糖生成G 1 c N A c β 1-3 Gal β 1-4 Glc。 (7 )經由進行以、產生1，3 -半乳糖轉移酶之人類♦黑色素瘤细胞y Μ 2 6 6 - 4株（A T C C C R L 1 6 7 6 )、或表現來自人類+ 黑色素瘤细胞W Μ 2 6 6 - 4之/3 1 , 3 -半乳糖轉移酶基因之 N a m a r ν a细胞K J Μ - 1株等之轉形株〈特開平6 - 1 8 1 7 5 9 )、具有由UTP之前驅物質生產UTP能力之微生物、具有由糖和 UTP生產UDP-Ga i能力之黴生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和半乳糖和G 1 c NAe /3 1-3 Gai /3 1-4 Glc 生成乳醯-N-四碳釀。 (8)經由進行Μ表琨來自人類He laffl胞之1，4-半乳糖基轉移酶基因之大腸桿菌[EMBO J ,，！，3 1 7 1 ( 1 990 )]或釀酒酵母[Bioehem* Biophys* Res, CoiRmun,，2 01 , 16 0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ( 1 994 )，具有由UTP之前驅物質生產UTP能力之微生物、具有由糖和UTP生產UDP-Ga 1能力之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和牛乳糖和GleNAe 卜3 Gal 卜4 Gic生成乳醯-N-新四碳 (9 )經由進行Μ表現來自奈瑟氐菌之1 , 4 -半乳糖基轉移酶U0 96/ 1 0086 )之黴生物、具有由UTP之前驅物質生產 UTP能力之微生物、具有由糖和UTP生產UDP-Ga 1能力之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和半乳糖和G 1 c N A c /3 1 - 3 G a 1泠 1 - 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規祐（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -40 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（） G 1c生成乳_ -N-新四碳_。 (10) 經由進行Μ表琨來自奈瑟氐菌之/3 1，3 -乙醢葡萄糖胺基轉移酶（WO 96/ 1 0086 )之徼生物、表現來自奈瑟氏菌之卢 1 , 4 -半乳糖基轉移酶（W 0 9 6 / 1 0 8 6 )之黴生物、具有由UTP之前驅物質生產ϋΤΡ能力之黴生物、具有由糖和 ϋ Τ Ρ生產ϋ D Ρ - G 1 c N A c能力之微生物、具有由糖和ΙΠ Ρ生產 UDP-Gal能力之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和N -乙薩葡萄糖胺和半乳糖和乳糖生成乳醸-N-新四碳醣。 (11) 經由進行Μ表琨來自奈瑟氐菌之α 2, 3-唾液酸基轉移酶[J· Biol. Chem·, 2U，28271 ( 1996)]之微生物、具有由CTP之前驅物質生產CTP能力之微生物、具有由糖和 CTP生產CMP-Heu AC能力之徼生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和N -乙醢甘露糖胺和丙酮酸和乳_ -N-新四碳醣生成（oc 2, 3)唾液酸基乳_ - N -新四碳釀。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 C請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (1 2 )經由進行K表現來自人類之α 1，3-岩藻糖基轉移酶之 Namain细胞[J, Biol· Chenu 1§J ,14730 ( 1994)]、具有由G T P之前驅物質生產G T P能力之徵生物、具有由糖和 G 了 P生產G D P - F u c能力之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由G Μ P和甘露糖和乳醯-N -新四碳醣生成乳醯-Ν -岩藻五碳_ I 。 (1 3 )經由進行Μ表現來自H e 1 i c 〇 b a c t e r ρ y 1 ο r ί之 a 1,3 -岩藻糖基轉移酶[J, Biol. C hem,，272，2 1 349 及本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 41 1227275 A7 B7 五、發明説明（ 2 1 3 5 7 ( 1 9 9 7 )]之徵生物、具有由G 了 P之前驅物質生產G T P能力之徵生鞠、具有由糖和G ΤΓΡ生產G D P - F u e能力之黴生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由GMP和甘露糖和乳薩新四碳醣生成乳醢-N-岩藻五碳 II I 〇 (1 4 )經由進行>乂表現來自奈瑟氏菌之α 1，4-半乳糖基轉移酶（W 0 9 6 / 1 0 0 8 6 )之微生物、具有由U Τ Ρ之前驅物質生產 UTP能力之微生物、具有由糖和UTP生產UDP-Ga 1能力之微生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和半乳糖和乳糖生成球形三碳釀。 (15) 經由進行Μ表現來自奈瑟氏菌之泠1,4-半乳糖基轉移酶（W 0 9 6 / 1 0 0 8 6 )之黴生物、表現來自奈瑟氐菌之α 1，4-半乳糖基轉移酶U096/ 1 0086 )之徵生物、具有由liTP 之前驅物質生產ϋΤΡ能力之黴生物、具有由糖和11 TP生產 ϋ D P »G a 1能力之黴生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和半乳糖和葡萄糖生成球形三碳釀。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (16) 經由進行Μ表現來自奈瑟氐菌之α 1,4-半乳糖基轉移酶（W 0 9 6广i 0 0 8 6 )之徼生物、具有由U Τ Ρ之前驅物質生產[丨T P能力之徵生物、具有由糖和ϋ T P生產ϋ D P - G a 1能力之徵生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和半乳糖和N -乙醯乳糖胺生成G a i α

cN A 4 Ga 1 /3 1 ，3-半乳糖基轉移 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (17)經由進行M表現來自人類之泠本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 42 1227275 A7 B7 五、發明説明（）酶i特開平6-18175 W之動物細胞，具有由UTP之前驅物質生產C T P能力之徵生物、具有由糖和U T P生產ϋ D P - G a 1能力之黴生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和半乳糖和N -乙藤葡萄糖胺生成乳_ -N-二碳 _ 。 (1 8 )經由進行W表琨來自奈瑟氐菌之α 2 , 3-唾液酸基轉移酶 U* Biol* Chenu, 2TI , 2 8 2 7 1 ( 1 9 9 6 )]之黴生物、具有由CTP之前驅物質生產CTP能力之黴生物、具有由糖和 CTP生產CMP-Neu Ac能力之徵生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由乳清酸和N -乙醯甘露糖胺和丙酬酸和乳醯-N-二碳_生成唾液酸基乳醯-N-二碳醣。 (1 9 )經由進行Μ表琨來自人類之α 1 , 3 -岩藻糖基轉移酶[J, Biol* Chem.，26 9, 14730 (1994)]之微生物、具經濟部中央標準局員工消費合作社印製有由GTP之前驅物質生產GTP能力之微生物、具有由糖和 G T P生產G D P - F u c能力之黴生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由GMP和甘露糖和3 ^唾液酸基 H -乙藤乳糖胺生成唾液酸基路易士 X。 (20)經由進行Μ表現來自人類之α 1,3/1，4-岩藻糖基轉移酶[C a r b 〇 h y d r a t e R e s e a r e h， 1 90 , 1 ( 1 9 8 9 ) j 之黴生物、具有由G T P之前驅物質生產G T P能力之黴生物、具有由糖和GTP生產GDP-Fuc能力之徼生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由GMP和甘露糖和唾液酸基乳釀-N -二碳釀生成唾液酸基路易士 a。 4 3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） 1227275 Μ Β7 五、發明説明（） (21 )經由進行Μ表現來自酵母之σ 1 ,2-甘露糖基轉移 _ 之大腸桿菌[J, Org+ Chenu，H 3985( 1993)]、具有由G T P之前驅物質生產G T P能力之微生物、具有由糖和G T P 生產GDP-Man能力之徵生物的培養液或該培養液之處理物作為酵素源之酵素反應，則可由GMP和甘露糖生成Man (I 1-2 Man- 複合糖質之製造方法並不被限定於上逑所記載者，且在可與本專利所記載之糖核芽酸製造方法組合之糖轉移酶，及該酵素所容許之受質專一性之範圍中，則何種糖鏈，均可僅以核苷酸之前驅物質、糖、複合糖質前驅物質作為原料，予Μ工業性地製造。依據本發明之製造方法所製造之複合糖質可列舉例如， (1) 參與病原性黴生物和病毒感染之複合糖質類，例如，作為病原性微生物和病毒之受體而被辨識的複合糖質類、 (2) 作為病原性黴生物和病毒所產生毒素之受體而被辨識的複合糖質類、經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (3 )於生體內，參與细胞接合、異物辨識、各種淋巴细胞活素結合等之複合糖質類等之含有單獨或複數、以化學性所容許之鍵结形式之葡萄糖、半乳糖、Ν -乙_葡萄糖胺、Ν _乙醯半乳糖胺、葡萄糖醛酸、甘露糖、Ν -乙_甘露糖胺、岩藻糖、唾液酸等糖之複合糖質，更具體而言，可列舉 Π)人類和動物之乳中所含有之參輿嬰幼兒之黴生物感染防禦之複合糖質類，例如，乳醢-U-四碳醣、乳醯-Ν-新本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 4 4 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（四碳_等之複合糖' (2 )辨識 Escherichia c ο 1 i、Prop i ο n i b a c t e r i u m g r a η υ 1 o s i u nt ^ Mycobacterium tubercutosis 、 Η o r a x e 1 la c a t a r a h 1 is Λ Candida albicans ^ Staphylococcus s a p r o p h y t i c u s ^ Streptococcus pneumoniae

Streptococcus a g a i a c t i a e、Pseudomonas aeruginosa A c t i η ο ni y c e s π a e s i u n d i i 、 Neisseria g ο η o r r h o e a e el icobacter pylori ^ Haemophi lus influenzae等微生物之受體複合糖質◎ (3 )流行感冒病毒、日冕形病毒、千代病毒、新城病毒、呼腸病毒、轉狀病毒、愛滋病毒等之病毒的受體複合糖質》 (4)隱孢子蟲、錐蟲等之原蟲的受體複合糖質0 (5 )結合霍亂毒素、大腸桿菌易熱性毒素、肉毒桿菌毒素、梭狀芽胞桿菌δ毒素、梭狀芽胞桿菌A毒素、志賀毒素、舌毒素、志賀毒素類毒、腸炎弧菌耐熱性毒素、破傷風毒素等毒素之受體複合糖質。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (6 ) G D 3、G Μ 3等之神經節二脂和球形系糖脂質等之癌症關連性複合糖質。 (7) 唾液酸基路易士 X糖鏈等之參與白血球對於發炎部位之黏附和機能修飾之複合糖質類。 (8) 參與慢性風濕性關節炎和IgA腎病等之自體免疫疾病之複合糖質類、 (9 )參與異物辨識和癌細胞辨識之辨識各種類似外源凝本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -45 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）集素物質之複合糖質類。水性介質中所生成之複合糖質的定量5可依據公知之方法進行[Proe+ Natl* Acad* Sei, USA…^ 3289 (1988) .AhaL B i o c h e m . 1 7 4 , 4 5 9 (1 9 8 8 )]- 反應疲中所生成之複合糖質的採集，可依據使用活性炭和離子交換樹脂等之通常方法予Μ進行（特開平8 -2 3993 ) ，例如，於Ν -乙醢乳糖胺可依據J * 0 r g , C h e πκ , ±1_, 5416(1982)記載之方法進行。以下示出本發明之實施例，但本發明不被此些實施例所限定。實施發明之最佳形態實施例I表琨gal II、ppa之重組體質體之作成 Μ下敘逑關於表現g a 1 ϋ、p p a之重組體質體P N T 1 2的作成方法（圖1、圖2) ϋ 1) 含有P L啟動基因之表琨載體的作成依據Μ下所示之方法，作成含有pL啟動基因之表琨載體 PPA31 及 pPAC31(圖 1)。經濟部中央標準局員工消費合作社印製將具有含色胺酸啟動基因之質體j>TrS 30之大腸稈菌JM 109/pTrS30(FERM BP-5 7)及具有含Pl啟動基因之質體 f>PA1(特開昭63-233798)、含Pl啟動基因及cI857抑制子之質體pPAC1(FERM BP-6054)之大腸桿菌，分別於LB培養基[B a c t 〇 t r y p t ο n ( D i f c 〇公司製）1 0克/升、酵S萃取勸（ D i f c 〇公司製》5克/升' N a C i 5克/升、p Η為7 * 2 ]中植菌，旦於3 0它下培養1 8小時。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ~ 4 6 一 1227275 A7 B7 五、發明説明（）由該培養所得之菌體5依據前述之公知方法，將pTrS 30、pPAI及pPACI質體DN A予Μ單離精製。精製之ρ T r S 3 0 D N A (Κ 2黴克Μ限制酶I及ϋ I切斷後$ Μ瓊脂糖_電泳分離出DNA斷Η ，並MGene CleanI 套件（8丨〇1〇1公司製）回收3.41^之斷片。精製之0?/\1〇1^ (K 5黴克Μ限制酶I及I切if後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出D Ν Α斷片，且同樣地回收I 0 k b之斷片。將該3 , 4kb之斷Η及1，Okb之斷Η使用連結套件（TMARA 連結套件、寶酒造公司製），於1 6 °C下進行1 6小時連結反應0 使用該連結反應液依前述公知之方法，轉形大腸桿菌 NM5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0微克/毫升之LB 洋菜培養基上塗布後，於37t!下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得經由Pl啟動基因之表琨載體PPA31。該質體之構造 K限制酶切開予Μ確認（圖1)。經濟部中央標準局員工消費合作社印製精製之P P A 3 1 D N A 0 . 2微克Μ限制酶Pst I及Cla I切斷後，M瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，並MGene CleanI 套件，回收3,4!^之斷片。精製之#&(：10^0,5黴克以限制酶Pst I及C i a I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷 Η *且同樣地回收2, 3kb之斷Η 。將該3 + 4 k b之斷片及2 . 3 k b之斷片使用連結套件，於1 6 °C 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前逑公知之方法，轉形大腸桿菌本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -47 - 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（） NM 5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林50微克/毫升之LB 洋菜培養基上塗布後，於3 7它下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得含有c I 8 5 7抑制子之經由Pu啟動基因之表琨載體 P P A C 3 1。該質體之構造Μ限_酶切開予Μ確認（圖1 )。 2) g a i ϋ表現質體之作成將大腸桿菌W 3 1 1 0株之染色體D N A，依據公知之方法[ 例如，Current Protocols in Molecular Bioiogy， J o h n Wi 1 e y a n d S ο n s I n l ( 1 9 9 4 )予 K 翬離精製。將序列編號1記載之意義股D N A引子和序列編號2記載之反意義股SDNA引子，使用Applied Biosysteins公司製380 A . D N A合成機予Μ合成。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Μ該合成之D Ν Α作為引子、M W 3 11 0株之染色體D Ν Α作為模板進行PCR。PCR為經由使用含有W3100染色體DNA0 . 04微克、引子各0 + 5 α Μ、T M A R A E X T a q (寶酒造公司製）1 , 0單位、10x Ex Tag緩衝液（寶酒造公司製）4徵升、脫氧NTP各 2 0 0 y Μ之反應液4 0徵升，重覆3 0回9 4 °C - 1分、4 2 °C - 2分、 72它-3分之工程而進行。將該反應液之1 /1 0量付Μ瓊脂糖膠電泳，確認目的之斷 Η被放大後，剰餘的反應液添加、混合等量之TE[10mM Tris-HCl緩衝液（pH8,0)、ImM ED ΤΑ]飽和苯酚/氯仿（1體積/1體積）。將該混合液離心分離後，於所得之上層中加入2倍容量之冰酒精，並於-80 °C中放置30分鐘。將該放置液離心取得DHA之沈澱。該沈澱M70I冰酒精洗淨，並予Μ 48 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210Χ 297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（）真空乾燥取得沈澱。Μ後，將添加TE飽和苯酚/氯仿，至 Μ酒精洗淨取得DNA沈澱為止之搡作，稱為酒精沈澱法。將該DNA之沈澱溶於20徼升之ΤΕ中。使用該溶解液5黴升，Μ限制酶Jiiiid I及1且1 Η I切斷D N A，並Μ瓊脂糖膠電泳分離出D Ν Α斷片後，M G e n e C 1 e a η I套件回收（Κ 9 k b之斷片。將實旛例1-1)所取得之pPA31 DNA 0,2徵克M限制酶 Hind I及Bam Η Γ切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收42kb之斷片。將該0, 9kb之斷片及4 +2kb之斷片使用連結套件，於16°C 下進行1 6小時連結反應。使用該連结反應液依前逑公知之方法，轉形大腸桿菌 K Y 8 4 1 5株，並將該轉形體於含有安比西林5 0黴克/毫升之 LB洋菜培養基上塗布後，於30 Ό下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得g a 1 I)表現質體之p N T 9。該質體之搆造Μ限制酶切開予Κ確認（圖2 )。 3 ) g a I U、p p a同時表現質體之作成經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 合成序列編號3記載之意義股D N A引子、和序列編號4記載之反意義股DNA引子，並Μ該合成DNA作為引子，Μ W3 110株之染色體DN Α作為模板，並於前述之相同條件下進行 P C R。 PCR終了後，Μ酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該沈澱溶解於20微升之ΤΕ中。使用該溶解液5黴升，Μ限制ϋ Baffl HI及Sa 1 I切斷D N A，並Μ瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷片後本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） 49 1227275 A7 B7 五、發明説明（），M G e n e C 1 e a η E套件回收I 0 k b之斷片。將實施例1 - 2 ) 所取得之p fTT 9 D N A (K 2微克K限制» Bam Η I及Sal I切斷後，M瓊脂糖膠電泳分雛出DNA斷片，且同樣地回收4.9kb 之斷Η 。將該l.Okb之斷Η及4,9kb之斷Η使用連结套件，於161C 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前逑公知之方法，轉形大腸桿菌 Κ Υ 8 4 1 5株，並將該轉形體於含有安比西林5 0微克/毫升之 LB洋菜培養基上塗布後，於30 °C下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得g a 1 ϋ、p f> a同時表現質體p N T 1 2。該質體之構造K限制酶切開予Μ確認（圖2 )。將該f>NT12 DNA 0 . 5微克Μ限制酶E e 〇 R I及S a 1 1切斷經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，並MGene Clean I[套件，回收2,2kb之斷Η。另一方面，將pSTV 28 DNA (寶酒造公司製）0 . 2黴克Μ限制Μ Eco R I及ϋ I切斷後， Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷Η ，且同樣地回收3.Okb之斷片0 將該2,2kb之斷Η及3.0kb之斷片使用連結套件，於16υ 下進行16小時連結反應。使用該連結反應液依常法，轉形大腸桿菌ΝΜ522株，並將該轉形體於含有氨黴素10微克/毫升之LB洋菜培養基塗布後，於30t)下培養一晚。

由可生長之轉形體菌落，依常法萃取質體，取得ga 1 U 、PF>a基因表琨質體之PNT32。該質體之構造W限制酶切開本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）「Λ 1227275 A7 B7 五、發明説明（) 予Μ確認（圖2 )。實施例2 U D Ρ - G 1 c之生產將實施例1所得之大腸桿菌ΚΥ8415/ΡΝΤ12，接種至裝入含有安比西林5 0黴克/毫升之L Β培養基1 2 5毫升之1公升容積附有祈流板之三角燒瓶中，並於3 Ο υ下2 2 0 r ρ m之絛件下培養1 7小時。將該培養液1 2 5毫升，接種至裝入葡萄糖1 0 克/升、88<：1：〇1：!101：〇!1(〇丨{€〇公司製）12克/升、酵母萃取物（D i f e 0公司製）2 4克/升、Κ Η 2 P 0 4 2 * 3克/升（另外殺菌）、Κ 2 Η Ρ (Κ 1 2 , 5克/升（另外殺菌）、安比西林5 0黴克/毫升之組成所構成之液體培養基（pH無調整）2. 5公升之5公升容積培養槽中，並於30 °C下4小時，再於40 °C下3小時、 6 0 0 r p m ^通氣量2 . 5公升/分之條件下進行培養。該培養中5使用2 8 I氨水，將培養液之p Η維持於7 . 0。又，於培養途中視需要，添加葡萄糖。將該培養液離心分離，取得濕菌體。該濕菌體視需要可在-20 °C下保存，且可在使用前解凍供使用。經濟部中央標準局貞工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將產氨棒狀桿菌ATCC 21 170株。接種至裝人葡萄糖50克 /升、聚蛋白腺（日本製藥公司製）1 0克/升、酵母萃取物（ 0 r i e n t a 1酵母公司製）1 0克/升、尿素5克/升、（N Η 4 ) 2 S 0 4 5 克 /'升 > Κ Η 2 Ρ 0 4 1 克 / 升、Κ 2 Η Ρ 0 4 3 克 / 升、M g S 0 4 * 7 Η 2 0 1 克 / 升、C a C 1 2 * 2H 20 (Κ 1 克 / 升、F e S 0 r 7 Η 2 0 1 0 毫克 / 升、Z n S 0 4 * 7 Η 2 0 1 0 毫克 / 升、Μ n S 0 4 * 4 〜6 Η 2 0 2 0 毫克 /升、L-半胱胺酸20毫克/升、D-泛酸鈣10毫克/升、維生素Β1 5毫克/升、Μ鹼酸5毫克/升、及生物素30黴克/升（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -51 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（） M10N NaOH調整至pH7,2)之組成所構成之渡體培養基20毫升之300毫升·積附有衡流板之三角燒瓶中 5 並於28€、 2 2 0 r p m之條件 h 3 培着2 4 Φ時 ° 將該培養液2 0毫升 5 接種至裝入與上逑相聞組成之液體培養基2 5 0毫升之2公升容積附有折流板之三角燒瓶中，並 S> 2 8 t 、2 2 0 r P m之條泮下 j 培養2 4小時。所得之培養液使用作為一種培養液。將該培養液250毫升* 接種至裝入葡萄糖150克/升、肉萃取物（極東製藥公司製）5克/升、KHzPCUlO克/升、 jr ίί π η： ί y\ / -T| k 2 η P u 4 i u 兄 / 片、 MgS〇4 * 7 H 2 0 10克 /升、C a C I 2 ^ 2Η 2〇 (Κ 1 克 / 升、FeSO. r 7H2 0 2 0毫克/升、Z n S 0 4 * 7 Η 2 0 10毫克 / 升、Μ n S 0 4 + 4 〜 6H2u 20毫克/升（另夕F 殺菌）、召 -丙胺酸 15毫克/升（另外殺菌）、L-半胱胺酸20毫克/升、生物素 100徵克/升、尿素2克/升、及维生素B1 5毫克/升（另外殺菌）（M10NNa0H調整至pH7.2)之組成所構成之液體培養基 2 , 2 5公升之5公升容積培養權中，並於3 2 C 、6 0 0 r p m、通氣量2 , 5公升/分之條件下進行2 4小時培養。培養中，使用經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將該培養霞離心3取得濕菌體。該濕菌體視需要可在 - 2 0 下保存，μ可在使用前解凍供使用 ϋ 將大腸稈菌Κ Υ 8 4 1 5 / ρ Ν 了 1 2株濕菌體4 0克/升、產氨棒狀釋菌ATCC21170株濕菌髓150克/升、葡萄糖100克/升、 Κ Η 2 Ρ0 4 20克/升 ' M g S 0 4 ^ 7 Η 2 〇 5克/升、植酸5克/升、乳清酸（,鹽）2 1 , 2 克 / 升、N a i m ί n S - 2 1 5 4 克 / 升、::：ψ ίβ 10毫升/升之組成所構成之反應液30毫升，放人200毫升容本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -52 — 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）積燒杯中，該反應液K磁性攪拌器予Μ攪拌（900ΓΡΠΙ)，並於3 2 C下進行2 1小時反應。反應中，使用4Ν NaOH*將該反應液之pH維持於7.2，且視需要，添加葡萄糖、KH2P〇4。經由該反應，於反應液中生成43 + 9克/升之UDP-G lc (2Na 鹽）。實施例3 表現g a丨T、g a 1 K之重組體質體之作成 Μ下敘逑關於表現gaiT、gaiK之重組體質體PNT25的作成方法（圖3) ϋ 合成序列編號5記載之意義股D Ν Α引子、和序列編號6記載之反意義股D N A引子，並M g亥合成D N A作為引子，Μ W 3 1 1 0株之染色體D Ν Α作為模板，並於前逑之相同絛件下進行 P C R。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 PCR終了後，Μ酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該沈澱溶解於20黴升之ΤΕ中。使用該溶解液5微升，Μ限制酶 Hind II及Ihe K切斷D N A，並K瓊脂糖膠電泳分離出D N A 斷片後，M G e n e C 1 e a η I套件回收2 . 3 k b之斷片。將 P B i u e s c r i p t I S K + D Η /\ 0 , 2 微克，M 限制酶 d I 及_0切斷，並M瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收3 . 0 k b之斷Η 。將該2 . 3 k b之斷Η及3 + 0 k b之斷Η使用連结套件，於1 6 下進行1 6小時連結反應。

使用該連結反應液依前述公知之方法，轉形大腸桿菌 ΗΜ5 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0黴克/毫升之LB 5 3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X 297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（）洋菜培養基上塗布後，於301C下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前述公知之方法，萃取質體，取得含有galT、galK基因之質體ΡΝΤ19。該質體之構造 Μ限制酶切開予Μ確認（圖3)。將該ρ Ν Τ 19 D N A 0 + 5徵克Μ限制酶I及Bam Η I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出D Ν Α斷Η ，同樣地回收2 + 3 k b之斷片。將實施例1 - 1)所得之p P A C 3 1 D N A (K 2微克以限制酶 C la I及in Η I切斷後，K瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷片，且同樣地回收5.5kb之斷片。將該2 . 3 k b之斷片及5 , 5 k b之斷片使用連結套件，於1 6 °C 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前逑公知之方法，轉形大腸桿菌N Μ 5 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0黴克/毫升之L Β洋菜培養基塗布後，於3 0 °C下培養一晚0 由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得galT、galK同時表琨質體之PNT25。該質體之構造 Μ限制酶切開予Μ確認（圖3 )。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實施例4 UDP-Ga 1之生產 1 ) g a i T、g a 1 K、g a i U ·、p p a 表琨株之作成使用實施例1 - 3 )所得之p N T 3 2 D N A、依常法轉形大腸桿菌 NM522/pNT25株，該轉形體於含有安比西林50徵克/毫升及氨黴素10徵克/毫升之LB洋菜培養基塗布後，於301下培養一晚。經由選取可生長之轉形體，則可取得galT、gaiii 、gall!、ppa表現株之大腸桿菌關522/pNT25/pNT32株。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 54 1227275 A7 B7 五、發明説明（） 2) UDP-Ga 1之生產將實施例4-1)所得之大腸桿菌ΝΜ522/ρΝΤ25/ρΝΤ32株， Μ實_例2同樣之方法培養，並將所得之各培養物離心，取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌ATCC21 170株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之培養物離心，取得濕菌體。該濕菌體視需要可於-20 1C下保存，且可於使用前解凍供使用。將大腸稈菌ΝΜ522 /ρΗΤ25/ρΝΤ32株濕菌體50克/升、產氨棒狀稈菌ATCC2 1170株濕菌體150克/升、葡萄糖80克/升、半乳糖2 0克/升、Κ Η 2 Ρ 0 4 1 5克/升、M g S 0 4 * 7 Η 2 0 5克/升、植酸5克/升、乳清酸（鉀鹽）2 I 2克/升、Na ί in ί n S -2 1 5 4克/升、二甲苯1 〇毫升/升之組成所構成之反應液2公升，放入5公升容積培養槽，該反應液Μ 6 0 0 r Ρ m攪拌，且Μ 1公升/分通氣，並於32C下進行26小時反應。反應中，使用4 N N a 0 Η，將該反應液之ρ Η維持於7 + 2，且視需要，添加葡萄糖、Κ Η 2 Ρ 0 4。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經由該反應，於反應液中生成47 + 4克/升之UDP-Gal (2Na鹽）。實施例5 ga]T\ galK於產氨棒狀桿菌中表琨之重組體質體的作成 Μ下敘逑關於來自大腸桿菌之g a 1 了、g a 1 K於產氨维狀桿菌中表現之重組質體pTK7的作成方法（圓4)。 1 ) ρ C G 1 1 6之作成如下逑黎1可在產氨棒狀桿菌中複製之質體pCG 116。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） r r 1227275 A7 B7 五、發明説明（）質體p C G 1 1 (特公平6 - 9 1 8 2 7 ) D N A 0 + 5徵克，Μ限制酶 I及Hu. I切斷後，Μ瓊脂糖謬電泳分離出DNA斷片，並 MGene CleanE套件回收6,5kb之斷片。另一方面，將質體Ρ ϋ C 1 9 D N A 1 + 0徵克，Μ限制酶Eco R I切斷後，MDNA Blunting kit(寶酒造公司製）予Μ平滑末端化。將平滑末端化之該D N A Μ P s t I切斷後，M瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷H ，並MMERmaid kit(Bio 101公司製）回收4 3 b p之斷片。將該6 . 5 k b之斷Η及43 b p之斷Η使用連結套件，於1 6 °C 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液，依電穿孔法[FEMS Microbiol , Lett., ϋ 299 ( 1 989 )]轉形產氨棒狀桿菌ATCC21 170株，並將該轉形體於含有壯觀黴素（s p e c t i no m y c ί η ) 1 0 0微克/ 毫升之LB洋菜培養基上塗布後，於30t：下培養2日。由可生長之轉形體菌落，依公知之方法[J . B a c t e r ί ο 1 + , 1 59 3 06 ( 1 9 8 4 )]，萃取質體，取得質體pCG 116。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖4 )。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 2) 表琨g a 1 Τ、g a 1 Κ之質體ρ 了 Κ 7的作成將實施例3所作成之表現g a 1 T、g a丨K之質體p N T 2 5 D N A 1,0黴克，K限制酶I及Η I切斷後* M瓊脂糖膠電泳分離出D Ν Α斷Η ，並M G e n e C U a η I[套件回收3 . 5 k b之斷H 。另一方面，將實施例5 - 1 )所作成之質體p C G 1 1 6 D N A 0 . 5微克，M限制酶S a 1 I及_ Η I切斷後，以瓊脂糖膠電本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -5 6 一 1227275 A7 B7 五、發明説明（）泳分離出D N A斷片，並同樣地回收6 + 5 k b之斷片。將該3 + 5kb之斷Η及6,5kb之斷Η使用連結套件，於16Ό 下進行1 6小時連結反應。使用該連结反應液，依電穿孔法轉形產氨棒狀桿菌A TCC 21170株，並將該轉形體於含有壯觀黴素100徵克/毫升之 LB洋菜培養基上塗布後，於30Ό下培養2日。可生長之轉形體菌落，依公知之方法，萃取質體，取得 galT、galK同時表琨質體pTK7。該質體之構造K限制酶切開予Μ確認（圖4)。實施例6 UDP-Gal之生產將實施例5所得之產氨棒狀桿菌ATCC 21170/PTK7株，Μ 實施例2同樣之方法於32 1C培養20小時後，於4〇υ下培養4 小時，將所得之培養物離心，取得濕菌體。該濕菌體視需要可於-2〇υ下保存，且可於使用前解凍供使用。將產氨棒狀稈菌ATCC21170/PM7株濕菌體150克/升、果糖40克/升、半乳糖20克/升、ΚΗ2Ρ〇4 15克/升、MgS〇4 · 7 Η 2 0 5克/升、植酸5克/升、乳清酸（鉀鹽）1 (Κ 6克/升、經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) N a i m ί n S - 2 1 5 4克/升、二甲苯1 0毫升/升之組成所構成之反應液3 0毫升，放入2 0 0毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器予Κ攪拌（9 0 0 r ρ hi )，並於3 2 °C下進行2 2小時反應。反應中，使甩4N NaOH，將該反應液之pH維持於7.2，且視需要，添加果糖、半乳糖、KH2P〇4。經由該反應，於反應液中生成7 . 2克/升之UDP-Ga 1 (2Na 鹽）。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） _ 「7 — 1227275 A7 五、發明説明（）實施例 7 g 1 m ϋ、ρ p a、ρ g m、g 1 hi Μ、g i k、p f k B 表現質體之作成合成序列編號7記載之意義股D N A引子、和序列編號8記載之反意義股D N A引子，並Μ該合成D N A作為引子，Μ W 3 1 1 0株之染色體D Ν Α作為模板，並於前逑之相同條件下進行 P C R。 PCR終了後，Μ酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該DNA 沈澱溶解於20黴升之ΤΕ中。使用該溶解液5黴升，Μ限制酶d厭及iuH I切斷D N A，並以瓊脂糖膠電泳分離出D N A 斷片後，K G e n e C 1 e a η I[套件回收1 . 4 k b之斷片。將實施例1 - 1 )所取得之p P A 3 1 D N A 0 , 5黴克Μ限制酶d M及切斷後，M瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收4 , 2 k b之斷Η 。將該1 . 4 k b之斷片及4 , 2 k b之斷Η使用連結套件，於1 6 QC 下進行1 6小時連結反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用該連结反應液依前逑公知之方法，轉形大腸稈菌 KY8415株，並將該轉形體於含有安比西林50徵克/毫升之LB 洋菜培養基上塗布後，於3〇υ下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得 glniU表琨質體ρΝΤΙΟ。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圏5)。將實施…例1 - 3 )所取得之ρ Ν 了 1 2 D N A 0 , 5黴克Μ限制酶 Η I及Μ I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，同樣地回收I 0 k b之斷片。將上逑ρ Ν Τ 1 0 D N A (Κ 2微克，Μ限制本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210Χ 297公釐） 58 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）酶I及I切斷後* Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收5 + 3 k b之斷Η 。將該l.Okb之斷片及5.3kb之斷片使用連結套件，於16°C 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前述公知之方法，轉形大腸桿菌KY 8415株，並將該轉形體於含有安比西林50黴克/毫升之LB 洋菜培養基上塗布後，於3〇υ下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得gliflli、ppa同時表現質體ΡΝΤ14。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖5)。 2) pgm表琨質體之作成合成序列編號9記載之意義股D N A引子、和序列編號1 0記載之反意義股DN A引子，並Μ該合成DN A作為引子，K W 3 1 1 0株之染色體D N A作為模板，並於前逑之相同條件下進行 P C R。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 PCR終了後，Μ酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該沈澱溶解於20微升之ΤΕ中。使用該溶解液5黴升，Μ限制酶 Cla I及Η I切斷D N A，並Μ瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷 Η後，M G e n e C !. e a η I[套件回收1 , 8 k b之斷片。將實施洌 1 - 1 )所取得之P P A C D N A 0 , 2徵克以限制酶CU I及HI 切斷後，M瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷片，且同樣地回收 5 , 5kb之斷片。將該1.8kb之斷片及5.5kb之斷Η使用連结套件，於16Ό 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前逑公知之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規桔（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -59 - 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）方法，轉形大腸桿菌NM 52:〗株，並將該轉形體於含有安比西林50黴克/毫升之LB洋菜培養基上塗布後，於30°C下培養一 0免。由可生長之轉形體菌Μ，依前述公知之方法，萃取質體，取得pgm表琨質體ΡΝΤ24。該質體之構造減限制酶切開予 Μ確認（圖6 )。 3) glmM表琨質體之作成合成序列編號11記載之意義股D N A引子、和序列編號1 2 記載之反意義股DNA引子，並Μ該合成DNA作為引子，Μ大腸桿菌W3 110株之染色體DN Α作為模板，並於前述之相同條件下進行P C R。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) PCR終了後，Μ酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該沈澱溶解於20黴升之ΤΕ中。使用該溶解液5徵升，Μ限制酶 I及Η I切斷D N A，並Μ瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷Η後，以、G e n e C 1 e a η I套件回收I 6 k b之斷片。將實施例1 - 1 ) 所取得之p P A C D N A 0 . 2微克Μ限制酶I及Bam Η I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收5, 5kb 之斷Η。將該1 + 6 k b之斷Η及5 , 5 k b之斷片使用連結套件，於1 6 3C 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前述公知之方法，轉形大腸桿菌

NM5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林50微克/毫升之LB 洋菜培養基上塗布後，於30C下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前述公知之方法，萃取質體本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） r Λ 1227275 A7 B7 五、發明説明（），取得glinM表現質體PNT44。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖7 )。 4)glk表現質體之作成合成序列編號1 3記載之意義股D N A引子、和序列編號1 4 記載之反意義股DNA引子，並Μ該合成DNA作為引子，Μ大腸桿菌W31 10株之染色體DNA作為模板，並於前逑之相同條件下進行PCR。 P C R終了後，Μ酒精沈澱法，取得D Ν Α之沈澱。將該沈澱溶解於20黴升之TE中。使用該溶解液5黴升，K限制酶 Hind I R Bam Η I切斷D N A，並Μ瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷片後，M G e n e C 1 e a η I[套件回收0 + 5 k b之斷片。將實施例1 - 1 )所取得之p P A 3 1 D N A 0 , 2微克M限制酶jjjj d I及 BamH I切斷後，M瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷片，且同樣地回收4 . 2kb之斷片。將該0 . 5 k b之斷Η及4 , 2 k b之斷Η使用連結套件，於1 6 °C 下進行1 6小時連結反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用該連結反應液依前逑公知之方法，轉形大腸稈菌N Μ 522株，並將該轉形體於含有安比西林50微克/毫升之LB洋菜培養基上塗布後，於30Ό下培養一晩。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得具有glk之一部份之質體PNT45。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖8)。以、上逑相同條件下進行P C R，使用所得之D Ν Α溶解液5徵升，將D N A以限制酶H i n d I切斷後，並Μ瓊脂糖膠電咏分本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X 297公釐） -61 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（ JE 樣 _ R hlrl ii A Γ'·ϋ 山山〕π 斷 _· iiif 法 •方 /itj li 工得 ΙΓΧ 克徽制 Μ 後斷 _ _ 露 •菱騎 uj --1 £里 T-J 處 ,:::q r--L Sr 0 分泳電響糖 9 斷

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0 fsy t B 斷泳電 ¥ β:ΧΓ! Μη if 之 Η il 樣 ii fl Μη rbsr 麗 A c- 出離回於件套结連用使· Η 斷之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 62 1227275 A7 B7 五、發明説明（下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前述公知之方法$轉形大腸桿菌 N Μ 5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0微克/毫升之L B 洋菜培養基上塗布後，於30 °C下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得具有Pf kB基因之質體PNT43。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖9)。使用ΡΝΤ43 DNA (Κ 5微克，將D Ν Α以限制酶C 1 a I及S a c I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DN A斷片，且同樣地回收 1 t 3 k b之斷片。將實施例1_1)所取得之PPAC31 DNA 0,2黴克以限制酶 11!1及_^1切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DN A斷片，且同樣地回收5,7kb之斷片。將該1 , 3 k b之斷Η及5 + 7 k b之斷片使用連結套件，於1 6 °C 下進行1 6小時連結反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用該連结反應液依前逑公知之方法，轉形大腸桿菌N Μ 5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0微克/毫升之L Β洋菜培養基上塗布後，於30t!下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體，取得Pf kB表琨質體PNT43。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖9)。實施例8 UDP-GlcNAe之生產將實施例7所得之大腸桿菌KY8415/PNT14株、NM5 2 2 / N T 2 4 株、N Μ 5 2 2 / p N T 4 4 株、N Μ 5 2 2 / N T 4 7 株以實施例 2 同樣本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） 63 1227275 A7 B7 五、發明説明（）之方法培養，將所得之各培養物離心，取得濕菌體β該濕菌體視需要，於-2〇υ保存，且可於使用前解凍供使用。將大腸桿菌ΝΜ5 22/ρΝΤ24株濕菌體6克/升、ΝΜ 5 2 2 /ΡΝΤ47 株濕菌體6克/升、1 Ο Ο πι Μ T r i s - H C丨緩衝液（ρ Η 8 ♦ 0 )、6 m Μ MgC 1 2 - 6HzO、ΙΟπΓΜ葡萄糖-6-磷酸、2 JifiM果糖-6-磷酸、 2 , 5 πι M A T P、N a i ® i n S - 2 1 5 4克/升之組成所構成之反應液 (K 1毫升$於入1 * 5毫升容積之試管中，並於3 7 °C下進行1 小時反應。反應液於6 5 °C下處理5分鐘後，添加如大腸稈菌KY8415/PNT14株濕菌體0.3克/升、NM522/PNT44株濕菌體6克/升、5mM葡萄糖胺-6-磷酸、5mM乙醯CoA、5niM UTP 般之菌體及受質，再於3 7 °C下反應3 0分鐘，則於反應液中生成 2,5πιΜ(1,6克 / 升）之 UDP-GlcNAe (2Na 鹽）。此時，未添加大腸桿菌NM522/PNT24株濕菌體或NM522/PNT47株濕菌體時之ϋ D P - G 1 c N H c產量分別為（K 8 m Μ、0 , 1 6 m Μ。此顯示，經由pg®表琨株和pfkB表現株之組合，則可供給g 1 m Μ活性表琨上所必須之G1 e - 1 , 6 - P 2。實施UDP-GlcNAc之生產將實施例7所得之大腸稈菌K Y 8 4 1 5 / p N T 1 4株、N Μ 5 2 2 / p N 了 24株、ΝΜ522/ΡΝΤ44株、ΝΜ522/ρΝΤ46株、ΝΜ522/ρΝΤ47株 Μ實施例2同樣之方法培養’將所得之各培養物離心s取得濕菌體。該濕菌體視需要於-20 °C保存，且可於使用前解凍供使用。將大腸稈菌！(Y8415/PHT14株、NM5 2 2 /pNT24株、NM5 2 2 / PNT44株、NM522/PNT47株、NM522/pNT46株濕菌體各 10克本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227275 A7 B7 五、發明説明（） /升、產氨棒狀稈菌ATCC2 11 70株濕菌體150克/升、果糖50 克/升、葡萄糖胺鹽酸鹽8 0克/升、Κ Η 2 P 0 4 1 5克/升、

MgSCU * 7HzO 5克/升、植酸5克/升、乳清酸（鉀鹽）10克 /升、Naimin S-215 4克/升、二甲苯10毫升/升之組成所搆成之反應液30毫升，放入200毫升容積燒杯中，該反應液K磁性攪拌器予K攪拌（900ΓΡΙΠ)，並於321下進行10小時反應。反應中，使用4N NaOH，將該反應液之pH維持於7.2，且視需要，添加果糖、KH2P〇4。經由該反應，於反應液中生成6 , 2克/升之UDP-G k NAc (2Na鹽）。實施例1 0 galK表現質體之作成將實施例3 - 1 )所取得之p N T 2 5 D N A 0 . 5黴克Μ限制酶 Clal及切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DN A斷片，並 MGene Cleanll套件回收6,7kb之斷片。回收之DNAMDNA B 1 υ n t i n g k i t平滑末端化後，使用連結套件，於1 6 °C下進行1 6小時連結反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用該連結反應液依常法，轉形大腸桿菌N Μ 5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0黴克/毫升之L Β洋菜培養基上塗布後，於30 t〕下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依常法萃取質體，取得gaiK 表琨質體ΡΝΤ5 4。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖 10) 〇實施例1 1 UDP-GicNAc之生產本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X 297公釐） p c 1227275 A7 B7 五、發明説明（勝實施例10所得之大腸稈菌NM5 2 2 /PNT54株，Μ實_洌2 同樣之方法培養$並將所得之培養物離心取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌ATCC21 1 70株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之培養物離心取得濕菌體。該濕菌體視需要可於-2 ο υ下保存$並可於使用前解凍供使用。將大腸桿菌ΝΜ5 2 2 /ΡΗΤ54株菌體50克/升、產氨棒狀桿菌ATCC21170株濕菌體150克/升、果糖40克/升、Ν-乙薩葡萄糖 R 6 7 克 / 升、Κ Η 2 Ρ 0 4 1 5 克 / 升、M g S 0 4 * 7 Η 2 0 5 克 / 升、植酸5克/升、乳清酸（鉀鹽）10克/升、Na ίιπίη S-215 4 克/升、二甲苯1 〇毫升/升之組成所構成之反應液3 0毫升，放入200毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器予Μ攪拌（9 0 0 r ρ m )，並於3 2 °C下進行2 7小時反應。反應中，使用4 N N a 0 Η，將該反應液之p Η維持於7 , 2，且視需要，添加果糖、Κ Η 2 Ρ 0 4。經由該反應，於反應液中生成17, 1克/升之（JDP-Gfc NAe (2Ha鹽）。實施例1 2 U D P - G 1 c N A c和U D P _ G a 1之同時生產經濟部中央標準局員工消費合作社印製將實施例3所得之NM522/PNT25株Μ實施例2同樣之方法培養，將所得之培養珣離心分離取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌ATCC21170株Μ實施例2同樣之方法培養。將所得之培養液離心，取得濕菌體。該濕菌體視需要可在- 20¾下保存，且可在使用前解凍供使用。將大腸桿菌NM522/PNT25株濕菌體25克/升、產氨棒狀桿菌A T C C 2 1 1 7 0株濕菌體1 5 0克/升、果糖6 0克/升、N -乙_葡 6 6 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（）萄糖胺50克/升、半乳糖40克/升、KH2P〇4 15克/升、 M g S 0 4 - 7 Η 2 0 5克/升、植酸5克/升、乳清酸（鉀鹽）1 0克/ 升、Naiinin S - 2 1 5 4克/升、二甲苯1 0毫升/升之組成所構成之反應疲30毫升，放入200毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器予Μ攪拌（ 900rpm)，並於32它下進行24小時反應。反應中，使用4Ν NaOH，將該反應液之p Η維持於7 , 2，且視需要，添加Κ Η 2 Ρ 0 4。經由該反應，於反應液中生成1 1 . 4克/升之ϋ D P -G 1 c N A c (2 N a 鹽）及 1 8 克 / 升之 ϋ D P -G a 1 ( 2 N a 鹽）。實施例1 3 hi a η B、in a n C、p g ιικ p f k B表現質體之作成 1 ) hi a η B、si a n C表琨質體之作成合成序列編號1 7記載之意義股D N A引子、和序列編號1 8 記載之反意義股D N A引子，並Μ該合成D N A作為引子，Μ大腸桿菌W3110株之染色體DNA作為模板，並於前逑之相同條件下進行P C R。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 PCR終了後，Μ酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該沈澱溶解於2 0黴升之Τ Ε中。使用該溶解液5徵升，Μ限制酶 Hind I[及I切斷DNA，並Μ瓊脂糖膠電殊分離出DNA斷 Η後，MGene CleanI套件回收3.0kb之斷片。將ρ B hi e s c Γί p t I S k 4 D ΙΑ 0, 2 黴克 Μ 限制酶 J^d Μ 及 Η I 切斷後5 M瓊胞糖膠電泳分離出DNA· Η $且同樣地回收3 + 0 kb之斷Η 。將該3 , 0 k b之兩斷片使用連結套件，於1 6 t：下進行1 6小 6 7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（）時連結反應。使用該連结反應液依常法，轉形大腸稈菌 N Μ 5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0黴克/毫升之L B 洋菜培養基塗布後，於3 0 °C下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依常法萃取質體，取得含有 nianC及manB之質體pNK6。該質體之構造Μ限制酶ffl開予Μ 確認（圓1 1 )。將該ΡΝΚ6 DN Α0 , 5徵克限制» C 1 a I及B a m Η I切斷後， Μ瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷片，並回收3 . 0 k b之斷片。將實施例1-1 )所得之PPAC31 DNA 0,2黴克以限制酶I及 Bam Η I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收5 , 5 k b之斷片。將該3 , 0 k b之斷片及5 . 5 k b之斷片使用連结套件，於1 6 °C 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依常法轉形大腸桿菌NM5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林50微克/毫升之L B洋菜培養基上塗布後，於3 Ο T)下培養一晚。經濟部中央標準局員工消費合作社印製由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體 $取得inanC及inanB表現質體ρΝΚ7。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖11)。 2) pgm、pfkB同時表現質體之作成將實施例7所取得之pNT24 DNA 0 , 5徵克Μ限制酶^ I 及Bam HI切斷後，Μ瓊脂糖膨電泳分離出DNA斷片，並Μ 將

Gene CleanI套件，回收3,0kb之斷Η 。另一方面 pSTV 2 8 DNA (寶酒造公司製）（K 2徵克Μ限制酶^j_ I及 BamHI切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷Η ，且同樣地 -6 8 一 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）回收3 + 0 k b之斷Η 。將該3 , 0 k b之雨斷Η使用連結套件$於1 6 t〕下進行1 6小時連结反應。使用該連结反應液依常法$轉形大腸桿菌 N Μ 5 2 2株，並將該轉形體於含有氨黴素1 0黴克/毫升之L B洋菜培養基塗布後5於sot：下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依常法萃取質體9取得具有 pgffi基因之質體PNT53。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖1 2 )。合成序列編號1 9記載之意義股D Ν Α引子，使用該意義股 D N A及序列編號1 6記載之反意義股D N A引子，以實施例7所取得之質體PNT4.7 [)NA作為模板*並於前述之相同條件下進行P C R。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 PC R終了後，K酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該沈澱溶解於20微升之TE中。使用該溶解液5徼升，Μ限制m Eco RV及I切斷DNi\*並Μ瓊脂糖膠電泳分離出DN A斷片，且同樣地回收1. 3kb之斷片。將ΡΝΤΓ53 DNA 0. 2黴克Μ限制酶jjLil及B a m Η I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出D Ν Α斷片，且同樣地回收6,Okb之斷片。將該I 3 k b之斷Η及6 . 0 k b之斷Η使用連結套件，於1 6 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前逑公知之方法，轉形大腸稈菌 Ν Μ 5 2 2株$並將該轉形體於含有氨黴素1 0黴克/毫升之L Β洋菜培養基上塗布後，於3 0 t下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依前逑公知之方法，萃取質體本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規桔（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) —6 9 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（） 5取得Pgm及pf kB之表琨質體PNT55。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖1 2 )。實施例1 4 GDP-Man之生產 1 ) m a !ι B、m a n C、ρ g m、ρ f k B 表琨株之作成使用實施例13-2)所得之pNT55 DNA，依常法轉形大腸桿菌N Μ 5 2 2 / ρ N K 7株，將該轉形體於含有安比西林5 0黴克/毫升及氨黴素10黴克/毫升之LB洋菜培養基上塗布後，於30 °C下培養一晚。經由選取可生長之轉形體，則可取得m a η Β 、HianC、pgin、pf kB之表現株大腸桿菌 ΝΜ522/ΡΝΚ7/ΡΝΤ55 株。 2) GDP-Man之生產將上逑1 )所得之大腸桿菌Ν Μ 5 2 2 / ρ N K 7 / ρ Μ T 5 5株及實施例 7所得之大腸桿菌ΝΜ522/ρΝΤ46，Μ實施例2同樣之方法培養，且將所得之各培養物離心取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌A T C C 2 11 7 0株，W實施例2同樣之方法培養。且將所得之培養物離心，取得濕菌體。該濕菌體視需要可在 -2 0 °C下保存，且可在使用前解凍供使用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製將大腸桿菌NM522 /pHK7/pNT55株濕菌體、，5 2 2 /PNT46 株濕菌體25克/升、產氨棒狀桿菌ATCC21170株濕菌體150 克/升、果糖60克/升、甘露糖50克/升、KH2P〇4 15克/升、 MgSOr 7H20 5克 / 升、楦酸 5 克 / 丹、GMP(2Na，？H20 鹽） 60克/升、Naimin S-215 4克/升、二甲苯10毫升/升之組成所構成之反應液30毫升，放入200毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器予Μ攪拌（900ΓΡΠΙ)，並進行24小時反本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -70 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（）應。反應中，使用4N NaOH，勝該反應液之p Η維持於7 , 2，旦視需要，添加ΚΗ2Ρ(Κ。經由該反應，於反應液中生成43.9克/升之UDP-Man(2Na ，1H20鹽）。實施例1 5 g in d、w c a G表現質體之作成合成序列編號20記載之意義股DN A引子，和序列編號21 記載反意義股D N 引子，並Μ該合成D N A作為引子，以大腸桿菌W3 Η 0株之染色體DH A作為模板*並於前逑之相同條件下進行P C R。 PCR終了後* Μ酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該沈澱溶解於20黴升之ΤΕ中。使用該溶解液5黴升，以限制酶 •Hindi及Xho 1切斷DN A，並Μ瓊脂糖膠電泳分離出DN A斷片後，MGene CleanI[套件回收2*3kb之斷片。將實施例1 - 1 )所取得之p P A 3 1 D N A 0 + 2微克K限制酶 Hind I及St 1 I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收3.9kb之斷片。經濟部中央標準局員工消費合作社印製將該2,3kb之斷片及3.9kb之斷片使用連結套件，於161 下進行1 6小時連結反應。使用該連結反應液依前逑公知之方法，轉形大腸稈菌NM 522株，並將該轉形體於含有安比西林50微克/毫升之LB 洋菜培養基上塗布後，於3 0 t：下培養一晚。由可生長之轉形體菌落5依前逑公知之方法，萃取質體體，取得含有gmd及wcaG之質體ρΝΚ8。該質體之搆造Μ限 7 1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X297公釐） 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）制酶切開予Μ確認（画13)。實施例1 6 G D Ρ - F u C之生產將實施例14所得之大腸桿菌關522/ρΝΚ7/ρΝΤ55株、實施例15所得之ΝΜ522/ΡΝΚ8株及實施例7所得之ΝΜ522 /ΡΝΤ46株 5 Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之各培養物離心取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌ATCC21170株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之培養物離心取得濕菌體。該濕菌體視需要可在-20 °C下保存，並可於使用前解凍供使用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製將大腸桿菌NM5 2 2 /pNK7/pNT55株濕菌體25克/升、大腸稈菌N Μ 5 2 2 / p N K 8株濕菌體2 5克/升、大腸桿菌N Μ 5 2 2 / p N T 46株濕菌體25克/升、產氨棒狀稈菌ATCC21170株濕菌體 150克/升、果糖40克/升、甘露糖60克/升、ΚΗ2Ρ〇4 15克 / 升、MgSOr 7H 2 0 5 克 /升、植酸 5克 / 升、GHP (2Na / 7H2〇鹽）60克/升、Nainiin S-215 4克/升、二甲苯10毫升/升之組成所構成之反應液30毫升，放入200毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器予Μ攪拌（ 900 r pin)，並於32 t下進行2 4小時反應。反應中，使用4N NaOH，將該反應液之pH維持於7,2，且視需要，添加Κ Η 2 P 0 4。經由該反應，於反應液中生成0克/升之G D Ρ - F u C ( 2 . 5 N a，1 Η 2 0 鹽卜實施例1 7 n e u Α表現質體之作成 Μ實施例1同樣之方法，調製大腸稈菌K 2 3 5株本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 72 - 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（） i A T C C ] 3 0 2 7 )染色體 D N A。合成序列編號2 2記載之意義股D N A引子、和序列編號2 3 記載之反意義股DNA引子，並Μ該合成DNA作為引子，Μ大腸桿菌Κ235株（ATCC13027)染色體DNA作為模板，並於前述之梠同絛件下進行P C R。 PCR終了後，W酒精沈澱法，取得DNA之沈澱。將該沈澱溶解於20微升之ΤΕ中。使用該溶解液5黴升，Κ限制酶 1^2 RI及I切斷D N A ，並Μ瓊脂糖膠電泳分離出D N A斷片後，以〇6_(：163^1[套件回收13}(1>之斷片。將？> B 1 u e s e r i p t E S k 十 D N A 0. 2 黴克以限制酶 I 及 B a m Η I 切斷後，K瓊脂糖膠電泳分離出DN A斷片，且同樣地回收3. 0 k b之斷M c; 將該丨jkb之斷片及3.0kb之斷片使用連結套件，於161C 下進行16小時連结反應。使用該連结反應液依常法轉形大腸桿菌NM522株，並將該轉形體於含有安比西林50徵克/毫升之L B洋菜培養基上塗布後3於3 0 °C下培養一晚。經濟部中央標準局員工消費合作社印製由可生長之轉形體菌落，依常法萃取質體，取得含有 neu A基因之質體PTA12。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ 確認（圖i4)。將該ρΙΓΓ 12 DNA 0, 5黴克Μ限制酶I及BamH I切斷後 ;Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，同樣地回收1.3kb之斷片。將實施例1 - 1)所取得之p P AC 3 1 D H A (K 2黴克K限制酶 Cla I及I切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收5 , 5 k b之斷Η。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規桔（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 73 — 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（）將該1 . 3 k b之斷Η及5，5 k b之斷Η使用連结套件，於1 6 π 下進行1 6小時連结反應。使用該連結反應液依常法，轉形大腸桿菌ΝΜ522株，並將該轉形體於含有安比西林50微克/ 毫升之L Β洋菜培養基塗布後，於3 0 1C下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依常法萃取質體，取得neuA 表現質體pTAI 4。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖 14)。實施例1 8 C Μ Ρ - N e u A c之生產將實施例17所得之大腸稈菌NM 5 2 2/PTA14株、C600/pNA L 1 株[A p p 1 · E n v i r ο π * M i c r ί b ί ο I t , 562(1986)]及

JF646/PMW5 株[h B i o 1 , Chein, , 2 6 1 , 5 5 6 8 ( 1 9 8 6 )] ^ M 實施例2同樣之方法培養，並將所得之各培養物離心取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌ATCC 21170株，Μ實施例2 同樣之方法培養，並將所得之培養物離心取得濕菌體。該濕菌體視需要可在-2 〇υ下保存，並可於使用前解凍供使用0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製將大腸桿菌Ν Μ 5 2 2 / ρ T A 1 4株濕菌體5 0克/升、大腸桿菌C 600/pNAL 1株濕菌體 15克/升、大腸桿菌JF 646/PMW5 株濕菌體25克/升、產氨棒狀桿MATCC21170株濕菌體150 克/升、乳清酸（鉀鹽）10克/升、丙顯酸（Na鹽）20克/升、果糖 40克/升、N-乙醯甘露糖胺 10克/升、KH2P〇4 15克 / 升、M g S 0 4 - 7 Η 2 0 5 克 / 升、楦酸 5 克 / 升、N a i in ί n S -215 4克/升、二甲苯10毫升/升之組成所構成之反應液30 毫升，放入2 0 0毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -74 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（）予Μ攪拌（9 0 0 r p m )，並於3 2 °C下進行2 4小時反應。反應中，使用4 N N a Ο Η，將該反應液之p Η維持於7 + 2 3旦視需要，添加ΚΗ2Ρ〇4。經由該反應，於反應液中生成2 . 7克/升之CMP-NeuAe (

Na鹽）。實施例1 9 乳隨-N-四碳_之生產 1) 冷1 , 3-半乳糖基轉移酶之調製令Μ含有編碼蛋白質A之IgG結合區域與点 1，3-半乳糖基轉移酶融合蛋白質之基因之質體pAM。ERSM 1 (特開平 6-181759)所轉形之Namarva KJM-1株，於含有（K5毫克/毫升G418(Gibeo公司製）之RPMI &40, ITPSGF培養基30毫升中，M5X104细胞/毫升懸浮，並於C02培養箱中，3710 、培養8日d 由該培養液離心除去_胞》回收上清液。該上清液視需要，可在-δ0 T)下保存，並於使用前解凍則可使用。於生成該蛋白質Α之IgG結合區域與/3 1，3-半乳糖基轉經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 移酶融合蛋白質之培養上清液中，令疊氮化鈉Μ最終濃度 0.1¾添加後，添加50黴升依據製品說明書前處理之IgG 58口^「〇30(?^!13<^3公司製），並於41下緩慢攪拌一晚。攪拌後，經由離心回收/9 1,3 -半乳糖基轉移酶所結合之 IgG Sephwose，並 MRPMI640* ITPSGF 培養基 1 毫升洗淨3回後，將該I g G S e p h a r 〇 s e使用作為/3 i , 3 -半乳糖基轉移酶之酵素源。 2) 乳醯-N -四碳_之生產本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 75 1227275 A7 B7 五、發明説明（）將乳醯-N-新四碳ffi (Oxford Glycosystems公司製）依常法[A g r i c * Β ί ο K C h e πι , , _5£, 2169 ( 1990)]Μ 胺基吡啶予Μ螢光標_後，加入0 ϋ之/3 -半乳糖苷酶（生化學工業公司製）並於3 7 °C下令其反應1 6小時，除去非遷原終端之半乳糖。該反應液於100°C下加熱5分鐘，令/3 -半乳糖苷酶失活。經由該反應所得之G 1 c N A c泠1 - 3 G a ί冷1 - 4 G 1 e使用作為複合糖質前驅體。將該複合糖質前驅體（Κ5πιΜ，上逑1)所得之IgG S e p h a r 〇 s e結合之/3 1，3 -半乳糖基轉移酶0 + 5 U、含有實施例4所得之UDP-Gal之反應液6黴升（5inM)、Tris-HCl(pH7.9 )1 0 0 nt Μ、Μ η C 1 2 1 0 πι Μ、点-氫硫基乙醇2 in Μ之組成所構成之反應液36黴升，於32C下放置65小時，進行反應。反應終了後，該反應液中所蓄積之產物Μ下逑條件使用 Η P L C予Μ定量。柱：TSKgel 0DS-80TM 柱（4*6ffiffiX30eni，TOSOH 公司製）液相：（K02M醋酸銨緩衝液（pH4.0) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 溫度：501 流速：1毫升/分撿測；螢光檢測器（激發波長3 2 0ηπι、放射波長400nm) 產物之鑑定為經由比較胺基吡啶所標幟之乳薩-N -四碳 _和被標幟產物之溶出時間而進行。經由該反應，生成0, 17mM(0. 12克/升）之乳醢-N-四碳醣。實施例20乳醢-N-新四碳醣之生產本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公f ) -(8 - 1227275 A7 B7 五、發明説明（） Μ實施例19同樣之方法，由乳醯-N-新四碳_調製出Glc NAc召1-3 Gal /3 1-4 Glc，並旦使用作為複合糖質前驅體。將該複合糖質前驅體0.5ιπΜ、/3 1，4-半乳糖基轉移酶（

Sigma公司製）0 + 5U、含有實施例4所得之UDP-Ga丨之反應液 6黴升（5®M)、lOOmM Tris-HCl緩衝液（pH7,9) lOmM MnCi2、2mM召-氫硫基乙醇之組成所構成之反應液36黴升，於3 2 °C下放置6 5小時，進行反應。反應終了後，該反應液中所蓄積之產物，Μ實施例 1 9 - 2 )同樣之條件下，使用Η P L C予Μ定量。產物之鑑定為經由比較胺基吡啶所標幟之乳釀新四碳醣與產物之溶出時間而進行。經由該反應，生成0 . 15πιΜ (0 , 1 1克/升）之乳隨-Ν-新四碳醣。實施例2 1 乳薩-Ν -岩藻五碳_ i之生產經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) α 1 , 3 -岩藻糖基轉移酶之結合I g G S e p h a r 〇 s e 5為由含有碼蛋白質A之IgG結合區域與α 1，3 -岩藻糖基轉移酶融合蛋白質之基因之質體“M0A-FT6 [ J , Biol, C h e m + , 2 6 9， 14730 U994)]所轉形之！KJM-1株，以實_ 例19-1)_樣之方法所調製$並且使用作為a 153-岩藻糖基轉移酶之酵素源。將乳醯-N -新四碳ffi (Oxford afy ιο systems公司製) 0 , 2 5 nt Η · I g G S e p h a r o s e結合之a 1，3 -岩藻糖基轉移酶 1 0 U、含有實_例1 6所得之G D P - F u c之反應液6徵升（(K 2 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） n„ 1227275 A7 B7 五、發明説明（ in Μ )、1 0 0 m Μ T r i s - H C 丨緩衝液（p Η 7 . 9 )、1 0 m Μ Μ n C 1 2 之組成所搆成之反應液50徼升，於37 t)下放置24小時，進行反應反應終了後$該反應液中所蓄積之產物，MDaionex公司製之糖分析裝置（DX-500)予Μ定量。尚，產物之鑑定為經

由比較乳醯-Ν -岩藻五碳_1 (Oxford GiyC 公司製）與產物之溶出時間而進行。經由該反應，生成0.21ihM((K 18克/升）之乳醯岩藻五碳酵班。實施例22 α 1，4-半乳糖基轉移酶UgtC)表現質體之作 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 成 Μ實施例1同樣之方法調製淋病奈瑟氐菌（Neisseria 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

g ο η 〇 r r h 〇 e a e ) UTCC 33084株）染色體 DNA。合成序列編號2 4記載之意義股D O引子、和序列_號2 5 記載之反意義股DNA引子，並Μ該合成DNA作為引子，Μ淋病奈瑟氐菌（ATCC33084株）染色體DMA作為模板，並於前逑之相同條件下進行P C R。 P C R終了後，Μ酒精沈澱法，取得D Η A之沈澱。將該沈澱溶解於20緻升之TE中。使用該溶解液5黴升，K限制酶 H in d I及B_ain Η I切斷D N A，並K瓊脂糖膠電沣分離出D N A斷 ne CleanH套件回收]uOkb之斷片。將實施例 .2黴克Μ限制酶Hindll[及BamHI

Η後 5 Μ l~i)所取得之pPA31 DNA 切斷後，Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，且同樣地回收 4 + 2 k b 之斷 Η 。將該l + 0kb之斷Η及4,2kb之斷Η使用連結套件，於16υ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X297公釐） 7 8 1227275 A7 B7 五、發明説明（）下進行1 6 4、時連結反應。使用該連結反應液依前述公知之方法，轉形大腸稈菌 NM522株，並將該轉形體於含有安比西林50黴克/毫升之LB 洋菜培養基上塗布後，於30¾下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依常法萃取質體，取得Igt C 表琨質體PGT3。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖 15) ° 賨施例2 3 球形三碳隨之生產將實撫例4所得之大腸桿菌ΝΜ522/ρΝΤ25/ρΝΤ32株、實施例22所得之NM5 2 2 /PGT3株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之各培養物離心取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌A T C C 2 1 1 7 0株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之培養物離心取得濕菌體。該濕菌體視需要可在-2〇υ下保存，並可於使用前解凍供使用。將大腸桿菌ΝΜ522/ρΝΤ25/ρΝΤ32株濕菌體50克/升、大腸

桿菌NM52 2 /PGT3株濕菌讀 Λ克/升、產氨棒狀桿菌ATCC 21170株濕菌體150克/升、果糖100克/升、半乳糖100克/ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 升、乳糖 1 0 0 克 / 升、ΚΗ2Ρ〇4 1 5 克 / 升、MgS04 * 7 Η 2 0 5 克 / 升、植酸5克/升、乳清酸（鉀薩）10克/升、Nainiin S-215 4克/升、二甲苯10毫升/升之組成所搆成之反應液30毫升，放入200毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器予Μ 攪拌（9 0 0 r ρ m )，並於3 2 C下進行3 6小時反應。反應中，使用4Ν NaOH，將該反應液之pH維持於7.2，旦視需要，添加半乳糖、乳糖、果糖、KH2P〇4。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） n 〇 1227275 A7 B7 五、發明説明（）經由該反應，於反應液中生成188克/升之球形三碳_。將該反應液離心除去菌體，並由所得之上清液10毫升，經由使用活性炭之方法進行精製，取得球形三碳醣之白色粉末1 . 5克。實施例 24 G a +1 α 1 - 4 G a 1 /3 1 - 4 G 1 c N A c 之生產將實施例4所得之大腸稈菌NM5 5 2 /pNT25/pNT32株、實施例22所得之NM522/i>GT3株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之各培養物離心取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌A T C C 2 1 1 7 0株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之培養物離心取得濕菌體。該濕菌體視需要可在-2〇υ下保存，並可於使用前解凍供使用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 將大腸稈菌ΝΜ522/ρΝΤ25/ρΜΤ32株濕菌體50克/升、大腸桿菌NM5 22 /PGT3株濕菌H 50克/升、產氨棒狀桿菌ATCC 2 1170株濕菌體150克/升、果糖50克/升、半乳糖50克/升 N-乙醢乳糖胲96克/升、KH2P〇4 15克/升、MgSOc 7H20 5克/升、植酸（鉀鹽）1 0克/升、N a i in i n S -2 1 5 4克/升、二甲苯10毫升/升之組成所構成之反應液30毫升，放入200毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器予Μ攪拌（ 9 00 r pm) ，並於3 2 下進行3 6小時反應c 反應中，使用4H NaOH，將該反應液之pH維持於7 . 2，且視需要，添加半乳糖、果糖、KH2P〇4。經由該反應*於反應液中生成10克/升之Gal α 1-4 Gal β 1-4 G I c Ν A c - 將該反應液離心除去菌體，並由所得之上清液30毫升，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 80 1227275 A7 B7 五、發明説明（）經由使用活性炭之方法精製產物，取得Gal α 1-4 Gal 召 l-4GlcNAc之白色粉末0,2克。實施例2 5 1 , 4-半乳糖基轉移酶（Igt B)表琨質體之作成合成序列編號2 6記載之意義股D N A引子、和序列編號2 7 記載之反意義股DN A引子，並Μ該合成DN A作為引子，Μ淋病奈瑟氐菌（ATCC 330 84株)έ染色體DNA作為模板，並於前逑之相同條件下進行P C R。

PCR終了後，Μ酒精沈澱法，取得DN Α之沈澱。將該沈濃溶解於20黴升之TE中。使用該溶解液5徼升，K限制酶 Hind I及I切斷DNA，並Μ瓊脂糖膠電沣分離出DNA斷片後，M G e n e C 1 e a η Ε套件回收0, 8 k b之斷片。將ρ B 1 u e s c r i p t I S k ^ D N A 0 ♦ 2 黴克 M 限制酶 1[及 HI 切斷後$ M瓊脂糖膠電泳分離出PNA斷片，且同樣地回收 3 , Okb之斷片。將該0.8kb之斷Η及3,0kb之斷Η使用連结套件，於1 6 t 下進行1 6小時連結反應。經濟部中央標準局員工消費合作社印製使用該連結反應液依常法，轉形大腸桿菌N Μ 5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0徵克/毫升之L Β洋菜培養基上塗布後，於3 0 °C下培養一晚。由可生長之轉形體菌落，依常法萃取質體，取得含有 i g t B基因之質體P N T 6 0 P。該質體之構造Μ限制酶切開予 Μ確認（圖16)。將該ρ Ν Τ 6 0 P D N A 0 + 5黴克Μ限制酶C 1 a I及_^ιπ Η I切斷本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -81 - 1227275 Α7 Β7 五、發明説明（俊 Μ瓊脂糖膠電泳分離出DNA斷片，並回收0.8kb之斷片 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 。將實_例1-1 )所取得之PPAC31 DN A (K 2微克Μ限制酶 C 1 a I及B a in Η I切斷後，Μ瓊胞糖膠電泳分離出D N A斷片，且同樣地回收5.5kb之斷片。將該（K8kb之斷Η及5.5kb之斷片使用連结套件，於16T 下進行16小時連結反應。使用該連结反應液依常法，轉形大腸桿菌N Μ 5 2 2株，並將該轉形體於含有安比西林5 0徼克/ 毫升之LB洋菜培養基塗布後，於3〇υ下培養一晚。由可生長之轉形體，依常法萃取質體，取得Ut B表現質體PNT60。該質體之構造Μ限制酶切開予Μ確認（圖16)。實施例2 6 Ν -乙醯乳糖胺之生產將實施例25所得之大腸桿菌ΝΜ522/ΡΝΤ60株、實施例3所得之大腸桿菌ΝΜ522/ΡΝΤ25株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之各培養物離心取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌ATCC21 170株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之培養物離心取得菌體。該菌體視需要可在- 20t!下保存，並可於使用前解凍供使用。經濟部中央標準局員工消費合作社印製將大腸桿菌NM522/PNT25株濕菌體50克/升、大腸桿菌NM 522/PNT60株濕菌體50克/升、產氨棒狀桿菌ATCC 21170株濕菌體150克/升、乳清酸（鉀鹽）10克/升、果糖100克/升、N -乙麵葡萄糖胺1 0 0克/升、半乳糖1 0 0克/升、Κ Η z P 〇 4 1 5 克 / 升、M g S 0 4 ♦ 7 Η 2 0 5 克 / 升 ' 楦酸 5 克 / 升、N a i m i η S - 2 1 5 4克/升、二甲苯10毫升/升之組成所構成之反應液 30毫升，放入200毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 82 1227275 A7 B7 五、發明説明（）器予Μ攪拌（900ΓΡΗΙ)，並於32°C下進行34小時反應。反應中，使用4H NaOH，將該反應液之dH維持於7 . 2，且視需要，添加半乳糖、果糖、Κ Η 2 P 0 4。經由該反應，於反應液中生成1 1 4克/升之Ν -乙醯乳糖胺。實施例2 7 乳糖之生產將實施例25所得之大腸稈菌ΝΜ522/ΡΝΤ60株、實_例3所得之大腸桿菌_5 2 2 /|^了25株，以實施例2同樣之方法培養，並將所得之各培養物離心取得漏菌體。又，將產氨棒狀桿菌ATCC21 170株$以實施例2同樣之方法培養，並將所得之培養物離心取得濕菌體。該濕菌體視需要可在-2 0 10下保存$並可於使用前解凍供使用。將大腸桿菌NM522/dNT25株濕菌體50克/升、大腸桿菌ΝΜ 5 2 2 /ΡΝΤ60株濕菌體50克/升、產氨棒狀稈菌ATCC 21170株濕菌體1 5 0克/升、乳清酸（鉀鹽）1 0克/升、葡萄糖11 5克/ 升、乳糖 11 5 克 / 升、ΚΗ2Ρ〇4 15克 / 升、MgS04，7Η20 5克 / 升、檀酸5克/升、N a ί iB i n S - 2 1 5 4克/升、二甲苯1 0毫升經濟部中央標準局員工消費合作社印製 /升之組成所搆成之反應液30毫升$放入200毫升容積燒杯中，該反應液Μ磁性攪拌器予Μ攪拌（900γρβι)，並於32°C 下進行1 5小時反應。

反應中，使用4 N & 0 Η，將該反應液之p Η維持於7 , 2，且視需要5添加Κ Η 2 Ρ 0 4 Q 經由該反應，於反應液中生成49克/升之乳糖。實施例2 8 球形三碳_之生產將實施例25所得之大腸稈菌NM5 2 2 /PNT60株、實_例3所 8 3 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規桔（210X297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明Γ ) 得之大腸桿菌NM522 /pfiT25株，以實_例2同樣之方法培養，並將所得之各培養《離心取得濕菌體。又，將產氨棒狀桿菌ATCC21170株，Μ實施例2同樣之方法培養，並將所得之培養物離心取得濕菌體。該濕菌體視需要可在-20 υ下保存，並可於使用前解凍供使用。將大腸桿菌Ν Μ 5 2 2 / ρ Ν Τ 2 5株濕菌體5 0克/升、大腸桿菌Ν Μ 5 2 2 /ρΝΤ60株濕菌體50克/升、產氨棒狀桿菌ATCC 21170株濕菌體150克/升、乳清酸（鉀鹽）10克/升、葡萄糖115克/ 升、半乳糖 115克 / 升、ΚΗ2Ρ〇4 15克 / 升、MgS〇4 * 7Ηζ〇 5 克/升、楦酸5克/升、N a i m i n S - 2 1 5 4克/升、二甲苯1 0毫升/升之組成所構成之反應液3 0毫升，放入2 0 0毫升容積燒杯中$該反應液Μ磁性攪拌器予Μ攪拌（9 00r ，並於32 Ό下進行1 3小時反應。反應中，使用4 N N a 0 Η，將該反應液之f> Η維持於7 , 2，且視需要，添加Κ Η 2 Ρ 0 4。經由該反應，於反應液中生成5克/升之球形三碳酶。產業上之可利用性經濟部中央標準局員工消費合作社印製依據本發明，則可僅Μ核苷酸之前驅物質及糖作為原料，Μ工業上良好效率地製造糖核苷酸，且由該核苷酸及複合糖質前驅物質，可Κ工業上良好效率地製造複合糖質。序列表序列編號：1 序列長度：31 序列類型：核酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 一 8 4 - 1227275 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（）拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 GGAGAAAGCT TATGGCTGCC ATTAATACGA A- 序列編號：2 序列長度：30 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 AACACGGATC CGGATGTTAC TTCTTAATGC 30 序列編號：3 序列長度：28 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 ATGGAGGATC CTGCTCTGTA TACCGTCT 4 序列編號；4 序列長度：2 0 序列類型：核酸一 85 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規桔（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝_

、1T 1227275 A7 B7

五、發明説明（) 拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 TGCTGGTCGA CCTGCGCTTG 序列編號：5 序列長度：31 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸序列

合成D N A A A G G A A A CH： T T A T G A C G C A A TTTAATCCCG ΐ 31 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁 >裝_

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

序列編號：6 序列長度：20 序列類型：核酸拓撲學t單股序列種類：其他之核酸、序列 GCAAAGTTAA CAGTCGGTAC

合成D N A 20 序列編號：7 序列長度：31 序列類型：核酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X 297公釐） 8 6 1227275 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7五、發明説明（）拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成DN A 序列 TCAGGAAGCT TATGTTGAAT AATGCTATGA G 序列編號：8 序列長度：2 7 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 TCTCCGGATC CCATGTGACC GGGTTAG 序列編號：9 序列長度：2 8 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 TCTAAACGA TGCAGACAAA GGACAAAG 序列編號：10 序列長度：27 序列類型：核酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 31 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 8 1227275 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7五、發明説明（）拓撲學：翬殷序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 TTGCAGGATC CTCGTAGGCC TGATAAG 序列編號：1 1 序列長度：2 0 序列類型：核酸拓撲學；單序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 TGATATCCGC TCCCTTTCCG 序列編號：12 序列長度：26 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成DN A 序列 ACAGCGGATC CGATGTGTTC GCTGAG 序列編號：13 序列長度：29 序列類型：核酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 27 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 _裝·

、1T 88 1227275 ΑΊ B7 五、發明説明（

拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 ACAGCAAGCT TTTGACTTTA GCGGAGCAG 2ci

序列編號：1 4 序列長度：29 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 G A G T T G G A T C CCGATATAAA A G G A A G G A T (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 零裝-

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列編號：15 序列長度：2 5 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸序列

合成D N A

TTTTTAAGCT TCATTTATCA AGAGT 序到編號：16 序列長度：31 序列類型：核酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 8 9

Lf 1227275 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（）拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成DN A 序列 TTTTTGATAT CCCCAATGCT GGGGGTTTTT G 3.1 序列編號：17 序列長度：31 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 CGTCAAAGCT TAAATGATAT TCGGGGATAA T 序列編號：18 序列長度：2 5 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 AGGGAGGATC CGACATTACT CGTTC 25 序列編號：19 序列長度；33 序列類型：核酸 -90 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝·

、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規枱（210X 297公釐） 1227275 A7 B7 五、發明説明（

拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成DN A 序列 CCGCAAGATC TCGTAAAAAG GGTATCGATA AQC 33 序列編號：20 序列長度：2 7 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸序列

合成D N A

TTGGGAAGCT TCCGGCAAAT GTGGTTT 2Ί 請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 _裝·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

序列編號：21 序列長度：2 5 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 ATAAACTCGA GAGAGACAAG CGGAG 序列讓號：22 序列長度：27 序列類型：核酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規桔（210X 297公釐） 9 1

?S 1227275 A7 B7

五、發明説明（) 拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成[)N A 序列 TATTATCGAT GAATTAATAA TICATAG 序列編號：2 3 序列長度：2 5 序列類型：核酸拓撲學：翬股序列種類：其他之核酸、合成DNA 序列 CTCTfalATCC AGTTACGTAT A AT AT (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝· 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製序列I扁號：2 4 序列長度：3 Ο 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸

合成DNA 序列

CGGCAAGCTT ATTGTGCCTT TCCAATAAAA 序列編號；2 5 序列長度：序列類型：核酸本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規枱（210X 297公釐） 9 2 30 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 1227275 A7 B7 五、發明説明（' ) 拓撲學：單股序到種類：其他之核酸、合成DN A 序列

ACTTGGATCC CCGTCAATAA ATCTTGCG 2S 序列編號：26 序列長度：30 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 GGTAAA GCTT ATGCAAAACC ACGTTATCAG 30 序列編號：27 序列長度：2 9 序列類型：核酸拓撲學：單股序列種類：其他之核酸、合成D N A 序列 AAACGGATCC TTATTGGAAA GGCACAATA ^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝_

、1T 93

Claims

Αδ Β8 C8 D8 ㈣· 9·夏替換本、申請專利範圍 1 · 一種UDP -葡萄糖之製法，其特徵爲： a)使用屬於產氨棒狀桿菌（Corynebacterium a mm ο n i a g e n e s )之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該產氨棒狀桿菌具有從乳淸酸中生產尿苷-5 · · 三磷酸（以下簡稱UTP)之能力；以及 b )使用屬於大腸桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌爲從葡萄糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶以及焦磷酸酶中所選出之一個以上酵素活性強，且具有從葡萄糖和UTP生產尿苷二磷酸葡萄糖（以下簡稱UDP-葡萄糖）之能力，藉此俾使該酵素源、乳淸酸及葡萄糖存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積UDP -葡萄糖，以自該水性介質·中採集UDP-葡萄糖。 2.—種UDP-半乳糖之製法，其特徵爲： a )使用屬於產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該產氨棒狀桿菌具有從乳淸酸中生產UTP之能力；及 b )使用屬於大腸桿菌或產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌或產氨棒狀桿菌爲從半乳糖激酶、半乳糖-1 -磷酸尿苷醯轉移酶、葡萄糖-1 -磷酸尿苷醯轉移酶以及焦磷酸酶中所選出之一個以上酵素活性強，且具有從選自葡萄糖、巣糖及半乳糖所組成之群組中的糖與UTP生產尿苷二磷酸半乳糖（以下簡稱 UDP-半乳糖）之能力，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) --------------------訂----------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227275 Αδ Β8 C8 D8 、申請專利範圍藉此俾使選自該酵素源乳淸酸、及選自葡萄糖、半乳糖及果糖所組成之群組中的糖存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積UDP -半乳糖，以自該水性介質中採集 UDP-半乳糖。 3 ·—種UDP-N-乙醯葡萄糖胺之製法，其特徵爲： a )使用屬於產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該產氨棒狀桿菌具有從乳淸酸中生產DTP之能力；及 b )使用屬於大腸桿菌或產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌或產氨棒狀桿菌爲由葡萄糖激酶、磷酸葡萄糖胺變位酶、葡萄糖胺-1 -磷酸乙醯轉移酶、N -乙醯蔔萄糖胺-1-磷酸尿苷醯轉酶、焦磷酸酶、磷酸葡萄糖胺變位酶及磷酸果糖激酶中所選出之一種以上酵素活性強，且具有從選自果糖、葡萄糖胺· 6 -磷酸及葡萄糖胺所組成之群組中的糖與UTP生產尿苷二磷酸· N -乙醯葡萄糖胺（以下簡稱UDP - N -乙醯葡萄糖胺）之能力，藉此俾使該酵素源、乳淸酸及選自果糖、葡萄糖胺-6 -磷酸及葡萄糖胺所組成之群組中的糖存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積UDP - N -乙醯葡萄糖胺，以自該水性介質中採集UDP · N -乙醯葡萄糖胺·。 4. 一種UDP-N-乙醯葡萄糖胺之製法，其特徵爲： a )使用屬於產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該產氨棒狀桿菌具有從乳淸酸中生本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂i丨丨丨丨線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1227275 §8 C8 D8 六、申請專利範圍產ϋΤΡ之能力，·及 b )使用屬於大腸桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌爲由半乳糖激酶、N -乙醯葡萄糖胺-卜磷酸尿苷醯轉移酶及焦磷酸酶中所選出之一種以上酵素活性強，且具有從選自果糖及N ·乙醯葡萄糖胺所組成之群組中的糖與UTP生產UDP-N -乙醯葡萄糖胺之能力，藉此俾使該酵素源、乳淸酸及選自果糖及N -乙醯葡萄糖胺所組成之群組中的糖存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積UDP-N -乙醯葡萄糖胺，以自該水性介質中採集UDP-N-乙醯葡萄糖胺。 5. —種CMP-N-乙醯神經胺酸之製法，其特徵爲： a )使用屬於產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該產氨棒狀桿菌具有從乳淸酸中生產UTP之能力；及 b )使用屬於大腸桿菌之微生物的培養液或該培養液之邋理物作爲酵素源，該大腸桿菌爲由CMP-NeuAc合成酶、NeuAc 醛縮酶及CTP合成酶中所選出之一種以上酵素活性強，且具有從選自果糖、N -乙醯甘露糖胺及N -乙醯神經胺酸所組成之群組中的糖與UTP生產CMP-N-乙醯神經胺酸之能力，藉此俾使該酵素源、乳淸酸及選自果糖、N -乙醯甘露糖胺及N -乙醯神經胺酸所組成之群組中的糖存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積CMP - N -乙醯神經胺酸，以自該水性介質中採集CMP-N-乙醯神經胺酸。 6. —種GDP-甘露糖之製法，其特徵爲：本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------------------訂----------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 3 1227275 Α8 Β8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製六、申請專利範圍 a )使用屬於產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該產氨棒狀桿菌具有從鳥苷-5，_單磷酸（以下簡稱GMP)中生產鳥苷-5 ·-三磷酸（以下簡稱GTP) 之能力；及 b )使用屬於大腸桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌爲由磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1 -磷酸鳥苷醯轉移酶、磷酸葡萄糖變位酶及磷酸果糖激酶中所選出之一種以上酵素活性強，且具有從選自果糖及甘露糖所組成之群組中的糖與GTP生產鳥嘌呤核苷二磷酸甘露糖（以下簡稱GDP-甘露糖）之能力，藉此俾使該酵素源、GMP及選自果糖與甘露糖所組成之群組中的糖存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積GDP-甘露糖，以自該水性介質中採集（JDP-甘露糖。 7.—種GDP-海藻糖之製法，其特徵爲： a )使用屬於產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該產氨棒狀桿菌具有從GMP中生產 GTP之能力；及 b )使用屬於大腸桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌爲由磷酸甘露糖變位酶、甘露糖-1-磷酸鳥苷醯轉移酶、00?-甘露糖-4,6-脫水酶、00?-4-酮基-6-脫氧甘露糖表異構酶/還原酶、磷酸葡萄糖變位酶及磷酸果糖激酶中所選出之一種以上酵素活性強，且具有從選自果糖及甘露糖所組成之群組中的糖與GTP生產鳥嘌啥核苷二磷酸海藻糖（以下簡稱GDP-海藻糖）之能力，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(21^< 297公釐） --------------------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1227275 藍 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 藉此俾使該酵素源、GMP及選自果糖與甘露糖所組成之群組中的糖存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積GDP-海藻糖，以自該水性介質中採集GDP〃海藻糖。 8.—種複合糖質之製法，其特徵爲： a )使用屬於產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該產氨棒狀桿菌具有從乳淸酸中生產UTP之能力； b )使用屬於大腸桿菌或產氨棒狀桿菌之微生物的培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌或產氨棒狀桿菌具有從選自葡萄糖、果糖及半乳糖所組成之群組中的糖與UTP生產UDP-半乳糖之能力；以及經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 c )使用屬於大腸桿菌之微生物之培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌之培養液具有從選自UDP-半乳糖及、GlcNAcySUGalyS 1-4GU、乳糖、N-乙醯乳糖胺、 N -乙醯葡萄糖胺及葡萄糖所組成之群組中之複合糖質前驅體來生產選自乳醯-N -四碳糖、乳醯-N -新四碳糖、球形三碳糖、Gal a l-4Gal /3卜4GlcNAc、N-乙醯乳糖胺及乳糖所組成群組中的複合糖質之能力，藉此俾使選自該等酵素源、乳淸酸、葡萄糖、果糖、半乳糖及甘露糖所組成之群組中的糖，與選自GlcNAc点 l-3Gal冷1-4G1C '乳糖、N-乙醯乳糖胺、· N-乙醯葡萄糖胺及葡萄糖所組成之群組中選出之複合糖質前驅體存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積該複合糖質，以自該水性介質中採集複合糖質。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A8 B8 C8 D8 1227275 六、申請專利範圍 9.一種複合糖質之製法，其特徵爲： (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 使用屬於大腸桿菌之微生物之培養液或該培養液之處理物作爲酵素源，該大腸桿菌之微生物之培養液具有從UDP-半乳糖與選自G1 cNAc /5 1 -3Gal /3 1 - 4G1 c、乳糖、N -乙醯乳糖胺、N -乙醯葡萄糖胺及葡萄糖所組成之群組中的複合糖質前驅體來生產選自乳醯-N -四碳糖、乳醯-N -新四碳糖、球形三碳糖、Gal α卜4Gal々1 - 4G1 cNAc ' N -乙醯乳糖胺及乳糖所組成之群組中的複合糖質之能力，藉此使該酵素源、該複合糖質前驅體及藉申請專利範圍第2項之製法得到UDP -半乳糖存在於水性介質中，並於該水性介質中生成及蓄積該複合糖質，以自該水性介質中採集該複合糖質。 1 〇 .如申請專利範圍第1項之製法，其中，培養液之處理物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 1 ·如申請專利範圍第2項之製法，其中，培養液之處理物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。 1 2 ·如申請專利範圍第3項之製法，其中，培養液之處理本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) 1227275 Αδ Β8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製、申請專利範圍物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。 1 3 .如申請專利範圍第4項之製法，其中，培養液之處理物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。 1 4 ·如申請專利範圍第5項之製法，其中，培養液之處理物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。 1 5 .如申請專利範圍第6項之製法，其中，培養液之處理物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。 1 6 ·如申請專利範圍第7項之製法，其中，培養液之處理 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) t 訂-------- •線丨· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 7 1227275 Αδ Β8 C8 D8 六、申請專利範圍物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。 1 7 ·如申請專利範圍第8項之製法，其中，培養液之處理物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。 1 8 ·如申請專利範圍第9項之製法，其中，培養液之處理物爲：培養液之濃縮物、將培養液經離心所得之培養上淸液、該培養上淸液之濃縮物、從該培養上淸液得到之酵素樣品、將培養液經離心所得之細胞、或該細胞之界面活性劑處理物。 1 9 .如申請專利範圍第1項之製法，其中，屬於具有生產 UDP -葡萄糖之能力之大腸桿菌之微生物，係由一個以上的微生物所構成。 2 0 .如申請專利範圍第2項之製法，其中，屬於具有生產 UDP -半乳糖之能力之大腸桿菌或產氨棒狀桿菌之微生物，係由一個以上的微生物所構成。 2 1 ·如申請專利範圍第3項之製法，其中，屬於具有生產本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製一 · I n n H ·ϋ ·ϋ n I tmmm n n I n n ϋ n «ΙΟ n I an n in n i n n ϋ n i n 8 1227275 AS B8 C8 D8 六、申請專利範圍 UDP - N -乙醯葡萄糖胺之能力之大腸桿菌或產氨棒狀桿菌之微生物，係由一個以上的微生物所構成。 22 .如申請專利範圍第4項之製法，其中，屬於具有生產 UDP - N -乙醯葡萄糖胺之能力之大腸桿菌之微生物，係由一個以上的微生物所構成。 23 .如申請專利範圍第5項之製法，其中，屬於具有生產 CMP - N -乙醯神經胺酸之能力之大腸桿菌之微生物，係由一個以上的微生物所構成。 24 .如申請專利範圍第6項之製法，其中，屬於具有生產 GDP -甘露糖之能力之大腸桿菌之微生物，係由一個以上的微生物所構成。 2 5 .如申請專利範圍第7項之製法，其中，屬於具有生產 GDP-海藻糖之能力之大腸桿菌之微生物，係由一個以上的微生物所構成。 26 .如申請專利範圍第8項之製法，其中，屬於具有生產 UDP -半乳糖之能力之大腸桿菌或產氨棒狀桿菌之微生物，係由一個以上的微生物所構成。 27 .如申請專利範圍第3項之製法，其中，藉著供應葡萄糖-1，6 -二磷酸給屬於磷酸葡萄糖變位酶及磷酸果糖激酶活性強之大腸桿菌之微生物，以增強磷酸葡萄糖胺變位酶之活性。 28 .如申請專利範圍第6項之製法’其中’藉著供應葡萄糖-1，6 -二磷酸給屬於磷酸葡萄糖變位酶及磷酸果糖激酶活性強之大腸桿菌之微生物’以增強磷酸甘露糖變位酶之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公Μ ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣訂---------f #---------------------I 1227275 Αδ Β8 C8 D8 、申請專利範圍活性。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 29 .如申請專利範圍第7項之製法，其中’藉著供應蔔萄糖-1 , 6 -二磷酸給屬於磷酸葡萄糖變位酶及磷酸果糖激酶活性強之大腸桿菌之微生物，以增強磷酸甘露糖變位酶之活性。 30 .如申請專利範圍第8項之製法，其中，屬於具有生產 UDP -半乳糖之能力之大腸桿菌或產氨棒狀桿菌的微生物，係由半乳糖激酶、半乳糖-卜磷酸尿苷醯轉移酶、葡萄糖-1 -磷酸尿苷醯轉移酶以及焦磷酸酶中所選出之一個以上酵素活性強之微生物。 3 1 .如申請專利範圍第8項之製法，其中，屬於具有從 UDP -半乳糖及複合糖質前驅物質來生產複合糖質之能力之大腸桿菌的微生物，係半乳糖轉移酵素活性強之微生物。 3 2 .如申請專利範圍第9項之製法，其中，屬於具有從 UDP -半乳糖及複合糖質前驅物質來生產複合糖質之能力之大腸桿菌的微生物，係半乳糖轉移酵素活性強之微生物。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 3.如申請專利範圍第1項之製法，其中，葡萄糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶（以下簡稱爲galU)及焦磷酸酶（以下簡稱 ppa)中所選出之一個以上酵素活性強之微生物，係由一種以上具有由DNA片段與載體所組成之重組體DMA之微生物構成，且其中該DNA片段含有一種以上從編碼g a 1 U之基因及編碼ppa之基因中所選出之基因。 3 4.如申請專利範圍第33項之製法，其中，編碼gal U 之基因及編碼ppa之基因爲來自大腸桿菌之基因。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 10 1227275 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 3 5 .如申請專利範圍第2項之製法，其中，半乳糖激酶（以下簡稱g a 1 K )、半乳糖-1 -磷酸尿苷醯轉移酶（以下簡稱 g a 1 T )、葡萄糖-1 ·磷酸尿苷醯轉移酶（以下簡稱爲g a丨u )及焦磷酸酶（以下簡稱p p a )中所選出之一個以上酵素活性強之微生物’係由一種以上具有由DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該DNA片段含有一種以上從編碼g a 1 K之基因、編碼g a 1 T之基因、編碼g a 1 U之基因及編碼ppa之基因中所選出之基因。 36.如申請專利範圍第35項之製法，其中，編碼galK 之基因、編碼ga IT之基因、編碼galU之基因及編碼ppa 之基因爲來自大腸桿菌之基因。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 37 .如申請專利範圍第3項之製法，其中，由葡萄糖激酶 (以下簡稱g 1 k )、磷酸葡萄糖胺變位酶（以下簡稱g 1 mM )、葡萄糖胺-1-磷酸乙醯轉移酶及N-乙醯葡萄.糖胺-1-磷酸尿苷醯轉酶（以下兩者合倂簡稱glmU)、焦磷酸酶（以下簡稱ppa)、磷酸葡萄糖胺變位酶（以下簡稱Pgm)及磷酸果糖激酶（以下簡稱pfkB)中所選出之一種以上酵素活性強之微生物，係由一種以上具有由DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該DNA片段含有一種以上從編碼g 1 k之基因、編碼g 1 mM之基因、編碼g 1 mU之基因、編碼ppa之基因、編碼pgm之基因及編碼pfkB之基因中所選出之基因。 3 8 .如申請專利範圍第3 7項之製法，其中，編碼g 1 k之基因、編碼g 1 m Μ之基因、編碼g 1 m U之基因、編碼P P a之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227275 Αδ Β8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 t、申請專利範圍基因、編碼pgm之基因及編碼pfkB之基因爲來自大腸桿菌之基因。 3 9 .如申請專利範圍第4項之製法，其中，由半乳糖激酶 (以下簡稱g a 1 K )、N -乙醯葡萄糖胺-1 -磷酸尿苷醯轉移酶 (以下簡稱glmU)及焦磷酸酶（以下簡稱ppa)中所選出之一種以上酵素活性強之微生物，係由一種以上具有由DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該DNA 片段含有一種以上從編碼g a 1 K之基因、編碼g 1 mU之基因及編碼ppa之基因中所選出之基因。 40.如申請專利範圍第39項之製法，其中，編碼gal K 之基因、編碼glmU之基因及編碼ppa之基因爲來自大腸桿菌之基因。 41 .如申請專利範圍第5項之製法，其中，由CMP-NeuAc 合成酶（以下簡稱neuA)、NeuAc醛縮酶（以下.簡稱nanA)及 CTP合成酶（以下簡稱py r G )中所選出之一種以上酵素活.性強之微生物，係由一種以上具有由DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該DNA片段含有一種以上從編碼neuA之基因、編碼nanA之基因及編碼pyrG 之基因中所選出之基因。 42 ·如申請專利範圍第41項之製法，其中，編碼neuA 之基因、編碼nanA之基因及編碼pyrG之基因爲來自大腸桿菌之基因。. 4 3 .如申請專利範圍第6項之製法，其中，由磷酸甘露糖變位酶（以下簡稱manB)、甘露糖-1 -磷酸鳥苷醯轉移酶（以本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐〉 ------------曠--------訂 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

12 1227275 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 下簡稱manC)、磷酸葡萄糖變位酶（以下簡稱pgm)及磷酸果糖激酶（以下簡稱P fkB )中所選出之一種以上酵素活性強之微生物，係由一種以上具有由DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該DNA片段含有一種以上從編碼m a η B之基因、編碼in a n C之基因、編碼p g m之基因及編碼pfkB之基因中所選出之基因。 44 .如申請專利範圍第43項之製法，其中，編碼manB 之基因、編碼m a n C之基因、編碼p g m之基因及編碼p f k B 之基因爲來自大腸桿菌之基因。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 45 ·如申請專利範圍第7項之製法，其中，由磷酸甘露糖變位酶（以下簡稱manB)、甘露糖-1 -磷酸鳥苷醯轉移酶（以下簡稱11^11(：)、00?-甘露糖-4,6-脫水酶（以下簡稱2111(1)、 GDP - 4 -酮基-6 -脫氧甘露糖表異構酶/還原酶（以下簡稱 wcaG)、磷酸葡萄糖變位酶（以下簡稱pgm)及磷酸果糖激酶 (以下簡稱pfkB)中所選出之一種以上酵素活性強之微生物，係由一種以上具有由DNA片段與載體所組成之重組體 DNA之微生物構成，且其中該DNA片段含有一種以上從編碼m a η B之基因、編碼in a n C之基因、編碼g m d之基因、編碼w c a G之基因、編碼p g m之基因及編碼p f k B之基因中所選出之基因。 46 ·如申請專利範圍第45項之製法，其中，編碼manB 之基因、編碼m a n C之基因、編碼g m d之基因、編碼w c a G 之基因、編碼pgm之基因及編碼pfkB之基因爲來自大腸桿菌之基因。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS〉A4規格（210 X 297公釐） 13 1227275 AS B8 C8 D8 t、申請專利範圍 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 47·如申請專利範圍第27項之製法，其中，屬於磷酸葡萄糖變位酶（以下簡稱pgm )及磷酸果糖激酶（以下簡稱 P fkB )活性強之大腸桿菌之微生物，係由一種以上具有由 DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該DNA片段含有編碼pgm之基因或編碼pfkB之基因。 48.如申請專利範圍第47項之製法，其中，編碼pgm之基因及編碼pfkB之基因爲來自大腸桿菌之基因。 49 ·如申請專利範圍第28項之製法，其中，屬於磷酸葡萄糖變位酶（以下簡稱pgm)及磷酸果糖激酶（以下簡稱 P fkB )活性強之大腸桿菌之微生物，係由一種以上具有由 DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該D N A片段含有編碼p g m之基因或編碼p f k B之基因。 50 ·如申請專利範圍第49項之製法，其中，編碼pgm之基因及編碼pfkB之基因爲來自大腸桿菌之基.因。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 51 .如申請專利範圍第29項之製法，其中，屬於磷酸葡萄糖變位酶（以下簡稱pgm)及磷酸果糖激酶（以下簡稱 P fkB )活性強之大腸桿菌之微生物，係由一種以上具有由 DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該DNA片段含有編碼pgm之基因或編碼pfkB之基因。 5 2.如申請專利範圍第51項之製法，其中，編碼pgm之基因及編碼PfkB之基因爲來自大腸桿菌之基因。 5 3.如申請專利範圍第30項之製法，其中，由半乳糖激酶（以下簡稱g a 1 K )、半乳糖-1 -磷酸尿苷醯轉移酶（以下簡稱galT)、葡萄糖-1-磷酸尿苷醯轉移酶（以下簡稱galU) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1227275 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍及焦磷酸酶（以下簡稱ppa)中所選出之一個以上酵素活性強之微生物，係由一種以上具有由DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物構成，且其中該DNA片段含有一種以上從編碼g a 1 K之基因、編碼g a 1 T之基因、編碼g a 1 U 之基因及編碼ppa之基因中所選出之基因。 54 .如申請專利範圍第53項之製法，其中，編碼ga 1K 之基因、編碼ga IT之基因^編碼galU之基因及編碼ppa 之基因爲來自大腸桿菌之基因。 5 5 .如申請專利範圍第3 1項之製法，其中，半乳糖轉移酵素活性強之微生物，係爲具有由DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物，且其中該DNA片段含有半乳糖轉移酵素基因。 56 .如申請專利範圍第55項之製法，其中，半乳糖轉移酵素基因爲來自淋病奈瑟氏菌之基因。 5 7.如申請專利範圍第32項之製法，其中，半乳糖轉移酵素活性強之微生物，係爲具有由DNA片段與載體所組成之重組體DNA之微生物，且其中該DNA片段含有半乳糖轉移酵素基因。 58 .如申請專利範圍第57項之製法，其中，半乳糖轉移酵素基因爲來自淋病奈瑟氏菌之基因。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂· -•線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15