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CN120989038A - 一种用于合成功能聚糖的多酶催化系统及方法 - Google Patents

一种用于合成功能聚糖的多酶催化系统及方法

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CN120989038A
CN120989038A CN202511535838.5A CN202511535838A CN120989038A CN 120989038 A CN120989038 A CN 120989038A CN 202511535838 A CN202511535838 A CN 202511535838A CN 120989038 A CN120989038 A CN 120989038A
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CN
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cofactor
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CN202511535838.5A
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刘现伟
武小聪
吴吴东
高一达
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Shandong University
Original Assignee
Shandong University
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Publication date
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Abstract

本发明属于生物合成技术领域，涉及一种用于合成功能聚糖的多酶催化系统及方法。所述系统包括底物模块：包含核苷一磷酸、单糖、聚磷酸盐和受体分子；所述核苷一磷酸为尿苷一磷酸、腺苷一磷酸、鸟苷一磷酸或胞苷一磷酸中的一种或多种；酶模块：包含聚磷酸激酶、至少一种补救途径合成酶和至少一种糖基转移酶；辅因子模块：包含镁离子及可选的无机焦磷酸酶；所述系统能够实现以核苷一磷酸为起始辅因子的糖核苷酸原位再生和目标聚糖的一锅法合成。本发明首次系统性地提出了以廉价的NMP作为唯一的或主要的起始辅因子，替代昂贵的NTP或NDP，用于多种糖核苷酸的原位再生。辅因子成本可降低数十倍，为聚糖的规模化生产奠定了基础。

Description

一种用于合成功能聚糖的多酶催化系统及方法
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，涉及一种用于合成功能聚糖的多酶催化系统及方法。
背景技术
聚糖（包括寡糖和多糖）在生命体中扮演着至关重要的角色，它们广泛参与细胞识别、免疫应答、信号转导、病原体感染、胚胎发育以及肿瘤转移等诸多生物学过程。然而，这些结构复杂、序列均一的功能聚糖在自然界中含量极低，难以通过直接提取满足科研及临床需求，因此开发高效、可控、规模化的制备技术成为糖科学领域的核心任务之一。
Leloir型糖基转移酶（glycosyltransferases，简称GTs）是生物体内合成复杂聚糖的关键酶类，它们能够以活化的糖核苷酸（sugar nucleotides，简称SNs）为糖基供体，高效、区域和立体选择性地催化糖苷键的形成。常见的SNs包括尿嘧啶核苷二磷酸半乳糖（uridine 5'-diphosphate galactose，简称UDP-Gal）、UDP-N-乙酰半乳糖胺（UDP-N-acetylgalactosamine，简称UDP-GalNAc）、UDP-N-乙酰葡萄糖胺（UDP-N-acetylglucosamine，简称UDP-GlcNAc）、UDP-葡萄糖醛酸（UDP-glucuronic acid，简称UDP-GlcA）、鸟嘌呤核苷二磷酸岩藻糖（guanosine 5'-diphosphate L-fucose，简称GDP-Fuc）和、胞嘧啶核苷一磷酸唾液酸（Cytidine 5'-monophosphate sialic acids，简称CMP-Sia）等。利用GTs在体外重构多酶级联反应，可以模拟生物体内的聚糖合成途径，实现复杂糖链的精准组装。相较于传统化学合成法，这种酶法策略具有步骤简单、环境友好、选择性高、无需保护与脱保护等优点，尤其适用于制备结构明确、功能均一的寡糖或多糖。然而，GTs的广泛应用，尤其是在大规模制备中，受到两个主要因素的限制：一是商品化SNs价格极其昂贵。二是糖基化反应过程中释放的核苷二磷酸（nucleoside diphosphates，简称NDP）或核苷一磷酸（nucleoside monophosphate，简称NMP）会对GTs产生产物抑制效应，显著降低反应速率和产率。
为了克服上述限制，早期发展了以磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，简称PEP）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，简称PK）为核心的SNs原位再生系统。虽然该系统实现了多种重要聚糖的克级合成，但PEP本身不稳定、成本高，且其分解产物丙酮酸会抑制PK活性，以上固有缺陷严重限制了该体系的工业化应用。因此，开发一种能够直接利用最廉价的NMP为起始辅因子，高效、通用地再生多种SNs，并适用于规模化合成多种功能聚糖的酶催化平台，具有重要的科学意义和产业应用价值。
发明内容
针对现有技术中糖核苷酸成本高昂、辅因子再生系统效率不足或适用范围窄等问题，本发明提供了一种基于核苷一磷酸原位再生糖核苷酸合成功能聚糖的多酶催化系统及方法。本发明的核心在于，利用一种高效的、底物广谱的聚磷酸激酶与补救途径合成酶、糖基转移酶进行偶联，仅需添加廉价的核苷一磷酸和多聚磷酸盐，即可实现多种糖核苷酸的持续原位再生，从而驱动一系列重要功能聚糖的高效合成。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种用于合成功能聚糖的多酶催化系统，所述系统包括：
底物模块：包含核苷一磷酸、单糖、聚磷酸盐和受体分子；
酶模块：包含聚磷酸激酶、至少一种补救途径合成酶和至少一种糖基转移酶；
所述系统能够实现以所述核苷一磷酸为起始辅因子的糖核苷酸原位再生，并通过一锅法催化反应合成目标聚糖。
优选地，所述核苷一磷酸为腺苷一磷酸（AMP）、鸟苷一磷酸（GMP）、胞苷一磷酸（CMP）和尿苷一磷酸（UMP）中的一种或多种。
优选地，所述聚磷酸盐为聚合度≥3的线性多聚磷酸盐；所述聚磷酸盐在反应体系中的终浓度为10 mM至300 mM；更优选地，所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠。
优选地，所述聚磷酸激酶为III型聚磷酸激酶2（PPK2-III），能够催化AMP、GMP、CMP和UMP磷酸化生成相应的核苷三磷酸（NTP）；更优选地，所述聚磷酸激酶来源于Erysipelotrichaceae bacterium（EbPPK）。
优选地，所述补救途径合成酶包括单糖激酶和糖核苷酸焦磷酸化酶；所述单糖激酶选自半乳糖激酶（GalK）、N-乙酰己糖胺激酶（NahK）、岩藻糖激酶（FKP）、葡萄糖醛酸激酶（GlcAK）中的至少一种；所述糖核苷酸焦磷酸化酶选自UDP-糖焦磷酸化酶（USP）、UDP-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶（AGX1）、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶（FKP）、CMP-唾液酸合成酶（CSS）中的至少一种。
优选地，所述糖基转移酶为Leloir型糖基转移酶，能够催化由糖核苷酸供体的糖基转移反应；更优选地，所述糖基转移酶选自β1,4-半乳糖基转移酶（NmLgtB）、α1,4-半乳糖基转移酶（NmLgtC）、β1,3-N-乙酰半乳糖胺基转移酶（HiLgtD）、β1,3-半乳糖基转移酶（HiLgtD, Cvβ3GalT）、β1,3-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶（NmLgtA）、α1,2-岩藻糖基转移酶（GE2FT）、α2,3-唾液酸转移酶（PmST3）、透明质酸合酶（PmHAS）中的至少一种。
优选地，所述受体分子为含有游离羟基的糖或糖苷类化合物；更优选地，所述受体分子为酪醇葡萄糖苷（Salidroside）、乳糖（Lactose）或其糖基化衍生物（如Tyrosol-Lac,Tyrosol-Gb3, Tyrosol-Gb4, Tyrosol-Gb5, LNT II, LNT）。
优选地，所述系统还包含镁离子和/或无机焦磷酸酶；更优选地，所述无机焦磷酸酶来源于 Pasteurella multocida（PmPPA）。
本发明还提供一种合成功能聚糖的多酶催化方法，利用上述多酶催化系统进行一锅法催化反应。
优选地，所述反应在pH 5.5-9.0的缓冲体系中进行，反应温度为25-45℃，反应时间为1-72小时。
优选地，反应体系中各组分的浓度满足以下一项或多项：
a. 所述核苷一磷酸的浓度为0.01 mM至100 mM；
b. 所述单糖的浓度为10 mM至100 mM；
c. 所述受体分子的浓度为10 mM至100 mM；
d. 所述聚磷酸盐的浓度为10 mM至300 mM；
e. 镁离子的浓度为10 mM至300 mM。
更优选地，所述核苷一磷酸的浓度根据其种类进行选择：AMP浓度为0.01-1.5 mM，GMP浓度为4-30 mM，CMP浓度为8-60 mM，UMP浓度为0.5-20 mM。
优选地，所述方法合成的目标聚糖包括但不限于肿瘤相关糖抗原（如Tyrosol-Globo H, Tyrosol-SSEA4）、人乳寡糖（如LNT II, LNT, LNnT, LNFP I, 3'-SL）、糖胺聚糖等多糖（如透明质酸，HA）。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果至少体现在以下几个方面：
1. 成本显著降低：本发明首次系统性地提出了以廉价的NMP（如UMP, CMP）作为唯一的或主要的起始辅因子，替代昂贵的NTP或NDP，用于多种SNs（UDP-Gal, UDP-GlcNAc,UDP-GalNAc, CMP-Sia, GDP-Fuc等）的原位再生。辅因子成本可降低数十倍，为聚糖的规模化生产奠定了经济基础；
2. 简化反应体系：由于采用的PPK（如EbPPK）具有广谱的NMP磷酸化能力，尤其能有效处理嘧啶核苷酸（CMP, UMP），使得像CMP-Sia这类SNs的再生无需额外添加胞苷激酶，简化了酶的种类和反应流程；
3. 高效性与通用性：本发明构建的三模块（NTP再生模块、SNs合成模块、糖基化模块）偶联系统，实现了辅因子的高效循环，总转化数高。该系统被成功应用于三大类（肿瘤相关糖抗原、人乳寡糖、透明质酸）共计十余种重要功能聚糖的多克级高效合成，产率均达到71%以上，最高超过99%，证明了该平台的强大通用性和高效性；
4. 克服产物抑制：通过PPK/PolyPn系统持续将反应中产生的NDP/NMP重新磷酸化为NTP，维持了体系中高能磷酸供体的浓度，有效缓解了因NDP/NMP积累造成的GTs产物抑制，推动了反应向生成产物的方向进行；
5. 操作简便，易于放大：采用一锅法进行反应，减少了中间步骤的纯化和辅因子添加，操作简单，更易于进行工艺放大和规模化生产。
附图说明
图1是EbPPK磷酸化四种NMP合成相应NTP的薄层层析检测结果；其中，1为AMP标品，2为ADP标品，3为GMP标品，4为GDP标品，5为UMP标品，6为UDP标品，7为CMP标品，8为CDP标品，a为EbPPK催化的反应液；
图2是Tyrosol-Lac合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为Gal标品，2为Salidroside标品，3为UMP标品，4为Gal-1-P标品，5为UDP-Gal标品，6为Tyrosol-Lac标品，7为反应液；
图3是制备的Tyrosol-Lac的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图4是Tyrosol-Gb3合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为Gal标品，2为Tyrosol-Lac标品，3为UDP-Gal标品，4为对照组，5为反应液；
图5是制备的Tyrosol-Gb3的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图6是 Tyrosol-Gb4合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为Tyrosol-Gb3标品，2为UDP-GalNAc标品，3为对照组，4为反应液；
图7是制备的Tyrosol-Gb4的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图8是Tyrosol-Gb5合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为Gal-1-P标品，2为UDP-Gal标品，3为Tyrosol-Gb4标品，4为Tyrosol-Gb5标品，5为对照组，6为反应液；
图9是制备的Tyrosol-Gb5的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图10是 Tyrosol-Globo H合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为AMP标品，2为GMP标品，3为Fuc标品，4为GDP-Fuc标品，5为Tyrosol-Gb5标品，6为Tyrosol-Globo H标品，7为对照组，8为反应液；
图11是制备的Tyrosol-Globo H的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图12是Tyrosol-SSEA4合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为CMP标品，2为CTP标品，3为Sia标品，4为CMP-Sia标品，5为Tyrosol-Gb5 标品，6为反应液；
图13是制备的Tyrosol-SSEA4的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图14是LNT Ⅱ合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为UMP标品，2为UDP-GlcNAc标品，3为GlcNAc标品，4为Lactose标品，5为反应液；
图15是制备的LNT Ⅱ的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图16是LNnT合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为UMP标品，2为Gal标品，3为Gal-1-P标品，4为UDP-Gal标品，5为LNT Ⅱ标品，6为LNnT标品，7为对照组，8为反应液；
图17是制备的LNnT的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图18是LNT合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为UMP标品，2为Gal标品，3为Gal-1-P标品，4为UDP-Gal标品，5为LNT Ⅱ标品，6为对照组，7为反应液；
图19是制备的LNT的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图20是LNFP Ⅰ合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为AMP标品，2为ATP标品，3为GMP标品，4为GTP标品，5为Fuc标品，6为Fuc-1-P标品，7为GDP-Fuc标品，8为LNT标品，9为反应液；
图21是制备的LNFP Ⅰ的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图22是3'-SL合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为CMP标品，2为CTP标品，3为Sia标品，4为CMP-Sia标品，5为Lactose标品，6为反应液；
图23是制备的3'-SL的1H和13C核磁共振波谱图；其中，（a）1H核磁共振波谱图；（b）13C核磁共振波谱图；
图24是HA合成反应的薄层层析检测结果；其中，1为GlcNAc标品，2为UDP-GlcNAc标品，3为GlcA标品，4为UDP-GlcA标品，5为HA标品，6为反应液。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。以下实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂和材料均可从商业途径获得。
实施例1：酶的表达和纯化
依据文献方法获得酶NahK、GalK、USP、FKP、AGX1、CSS、GlcAK、PmPPA、EbPPK、NmLgtA、NmLgtB、NmLgtC、HiLgtD、PmST3、PmHAS以及Cvβ3GalT的重组表达载体。以上酶均为已公开核苷酸序列、氨基酸序列的已知酶。
α-1,2-岩藻糖基转移酶（GE2FT）的氨基酸序列如WP_143414822.1所示，编码核苷酸序列如NZ_CP041632.1所示。人工合成的GE2FT基因通过酶切连接插入pET30a载体的NdeI及XhoI酶切位点之间，获得α-1,2-岩藻糖基转移酶GE2FT的重组载体。
将上述重组表达载体转化至E. coliBL21（DE3）感受态细胞。挑取单菌落于含相应抗生素的LB培养基中培养至OD600约为0.6-0.8，加入0.2 mM IPTG，于16-25 ℃诱导表达20小时。使用立式离心机收集菌体（8000 rpm，10 min，4 ℃），将菌体重悬于缓冲液（20 mMTris-HCl，pH 7 .5，500 mM NaCl）中，将菌体重悬液置于冰水混合物中进行超声破碎（功率40 W，超声3 s，间隔2 s，破碎30 min）；离心破碎后的菌液（4 ℃，12000 rpm，30 min），收集上清。
上述酶编码基因表达蛋白均带有六个组氨酸，可以使用固定化金属离子亲和层析色谱纯化，因此将上述收集的上清采用镍离子亲和层析进行纯化，纯化步骤参照相关层析材料的说明书进行。主要步骤为将上清与层析介质混合或通过层析柱，用含有30 mM咪唑的缓冲液洗去杂蛋白，用含500mM咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白，超滤脱盐并浓缩，获得纯度超90%的重组蛋白溶液，分装后于-20 ℃保存备用。所有酶的活性通过其对应的底物转化实验进行验证。
实施例2：EbPPK的底物适应性研究
理想聚磷酸激酶应高效磷酸化所有四种常见核苷一磷酸(NMP)，催化相应核苷三磷酸(NTP)的生成。以10 mM的AMP、GMP、UMP或CMP为底物，20 mM六偏磷酸钠为磷酸供体，20mM MgCl2为二价金属离子，调节混合反应溶液pH为7.5，加入1 mg/mL的EbPPK并在37 ℃下过夜反应。薄层层析色谱（TLC）监测到四种核苷三磷酸的生成（图1）。
以上结果说明通过本发明选用的EbPPK能够高效识别四种常见NMP，并催化相应NTP生成。
实施例3：以UMP为唯一辅因子合成Tyrosol-Lac （酪醇乳糖苷）
反应体系（200 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 5.5），50 mM 红景天苷（受体糖），60 mM 半乳糖，2 mM UMP，96 mM MgCl2，96 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（220 mg），BiGalK（220mg），BiUSP（220 mg），PmPPA（110 mg），NmLgtB（220 mg）。体系在37 ℃、220 rpm下反应9小时。通过TLC监测显示受体被完全消耗（图2），反应液经乙醇终止、离心、C18柱层析和BioGelP-2凝胶过滤纯化，得到白色固体Tyrosol-Lac，产率96%。产物结构经核磁共振谱验证（图3）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了Tyrosol-Lac。
实施例4：以UMP为唯一辅因子合成Tyrosol-Gb3（酪醇-Gb3 或 酪醇-三已糖神经酰胺）
反应体系（180 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 7.5），50 mM Tyrosol-Lac，60 mM半乳糖，2 mM UMP，96 mM MgCl2，96 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（180 mg），BiGalK（180 mg），BiUSP（180 mg），PmPPA（90 mg），NmLgtC（180 mg）。37 ℃反应6小时。TLC监测反应完成（图4）。经C18柱层析纯化，得Tyrosol-Gb3粉末，产率98%。产物结构经核磁共振谱验证（图5）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了Tyrosol-Gb3。
实施例5：以UMP为唯一辅因子合成Tyrosol-Gb4（酪醇-Gb4 或 酪醇-四已糖神经酰胺）
反应体系（700 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 7.5），10 mM Tyrosol-Gb3，12 mMGalNAc，1.5 mM UMP，19.2 mM MgCl2，19.2 mM 六偏磷酸钠，1 mM DTT，EbPPK（700 mg），BiNahK（700 mg），AGX1（700 mg），PmPPA（350 mg），LgtD（700 mg）。37 ℃反应4.5小时。TLC监测显示底物耗尽（图6）。经C18柱层析纯化，得白色固体Tyrosol-Gb4，产率94%。产物结构经核磁共振谱验证（图7）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了Tyrosol-Gb4。
实施例6：以UMP为唯一辅因子合成Tyrosol-Gb5（酪醇-Gb5 或 酪醇-五已糖神经酰胺）
反应体系（250 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 7.0），20 mM Tyrosol-Gb4，40 mM半乳糖，20 mM UMP，64 mM MgCl2，64 mM 六偏磷酸钠，10 mM DTT，EbPPK（250 mg），BiGalK（250 mg），BiUSP（250 mg），PmPPA（125 mg），LgtD（250 mg）。30 ℃反应48小时。通过TLC确认反应进程（图8）。经C18柱和BioGel P-2纯化，得Tyrosol-Gb5，产率71%。产物结构经核磁共振谱验证（图9）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了Tyrosol-Gb5。
实施例7：以AMP和GMP为辅因子合成Tyrosol-Globo H（酪醇-Globo H）
反应体系（100 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 8.0），1.5 mM AMP，4 mM GMP，24mM MgCl2，24 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（150 mg），BiFKP（200 mg），PmPPA（50 mg），GE2FT（100mg），15 mM 岩藻糖，10 mM Tyrosol-Gb5。37 ℃反应至TLC显示底物耗尽（图10）。反应液经C18柱和BioGel P-2纯化，得Tyrosol-Globo H，产率99%。产物结构经核磁共振谱验证（图11）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了Tyrosol- Globo H。
实施例8：以CMP为辅因子合成Tyrosol-SSEA4（酪醇-SSEA4）
反应体系（100 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 8.5），10 mM Tyrosol-Gb5，20 mMN-乙酰神经氨酸，8 mM CMP，192 mM MgCl2，192 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（200 mg），NmCSS（100 mg），PmPPA（50 mg），PmST3（100 mg）。37 ℃反应24小时。TLC监测反应完成（图12）。经C-18柱和BioGel P-2纯化，得Tyrosol-SSEA4，产率87%。产物结构经核磁共振谱验证（图13）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了Tyrosol- SSEA4。
实施例9：以UMP为唯一辅因子合成LNT II（乳糖-N-新四糖 a）
反应体系（350 mL）包含：20 mM 乳糖，24 mM GlcNAc，2 mM UMP，38.4 mM MgCl2，38.4 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（350 mg），BiNahK（350 mg），AGX1（350 mg），PmPPA（175 mg），LgtA（700 mg），pH 7.5。37 ℃反应18小时。TLC监测反应完成（附图14）。反应液经活性炭柱和BioGel P-2纯化，得LNT II，产率77%。产物结构经核磁共振谱验证（图15）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了LNT II。
实施例10：以UMP为唯一辅因子合成LNnT（乳-N-新四糖）
反应体系（100 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 5.5），20 mM LNT II，24 mM 半乳糖，10 mM UMP，52.8 mM MgCl2，52.8 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（100 mg），BiGalK（100 mg），BiUSP（100 mg），PmPPA（50 mg），NmLgtB（100 mg）。37 ℃反应19小时。TLC监测反应完成（图16）。经活性炭柱和BioGel P-2纯化，得LNnT，产率86%。产物结构经核磁共振谱验证（图17）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了LNnT。
实施例11：以UMP为唯一辅因子合成LNT（乳糖-N-新四糖）
反应体系（100 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 7.5），20 mM LNT II，24 mM 半乳糖，0.5 mM UMP，96 mM MgCl2，96 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（100 mg），BiGalK（100 mg），BiUSP（100 mg），PmPPA（50 mg），Cvβ3GalT（100 mg）。37 ℃反应20小时。TLC监测显示LNT II完全转化（图18）。经活性炭柱和BioGel P-2纯化，得LNT，产率84%。产物结构经核磁共振谱验证（图19）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了LNT。
实施例12：以AMP和GMP为辅因子合成LNFP I（乳糖-N-岩藻五糖 I）
反应体系（30 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 8.0），6 mM AMP，30 mM GMP，96 mMMgCl2，96 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（45 mg），BiFKP（60 mg），PmPPA（15 mg），GE2FT（60 mg），60mM 岩藻糖，50 mM LNT。37 ℃反应约47小时。通过TLC确认LNT消耗完全（图20）。经活性炭柱和BioGel P-2纯化，得LNFP I，产率84%。产物结构经核磁共振谱验证（图21）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了LNFP I。
实施例13：以CMP为辅因子合成3'-SL（3'-唾液酸乳糖）
反应体系（40 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 8.0），50 mM 乳糖，60 mM N-乙酰神经氨酸，30 mM CMP，78 mM MgCl2，78 mM 六偏磷酸钠，EbPPK（80 mg），NmCSS（40 mg），PmPPA（20 mg），PmST3（40 mg）。37 ℃反应18小时。TLC监测反应进程（图22）。经活性炭柱和BioGelP-2纯化，得3'-SL，产率82%。产物结构经核磁共振谱验证（图23）。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了3'-SL。
实施例14：以UMP和AMP为辅因子合成透明质酸（HA）
反应体系（200 mL）包含：100 mM Tris-HCl（pH 8.0）， 20 mM 葡萄糖醛酸,，20mMN-乙酰葡萄糖胺，0.1 mM AMP，20 mM UMP，64 mM MgCl2，64 mM 六偏磷酸钠，10 mM KCl，1.5 mM MnCl2，EbPPK（200 mg），BiNahK（100 mg），AGX1（100 mg），AtGlcAK（100 mg），AtUSP（100 mg），PmPPA（50 mg）， PmHAS（800 mg）。30 ℃反应48小时。通过TLC监测HA生成（图24）。反应液经煮沸、离心、透析（7 kDa MWCO）和冷冻干燥，获得白色絮状HA。
以上结果说明通过本发明提供的方法成功制备了HA。
以上实施例表明，本发明提供的以NMP为起始辅因子的多酶催化方法，能够高效、经济地合成多种结构复杂、功能重要的聚糖，具有广阔的工业化应用前景。

Claims (10)

1.一种用于合成功能聚糖的多酶催化系统，其特征在于，所述系统包括：
底物模块：包含核苷一磷酸、单糖、聚磷酸盐和受体分子；
酶模块：包含聚磷酸激酶、至少一种补救途径合成酶和至少一种糖基转移酶；
其中，所述系统能够实现以所述核苷一磷酸为起始辅因子的糖核苷酸原位再生，并催化所述受体分子糖基化以合成目标聚糖。
2.根据权利要求1所述的多酶催化系统，其特征在于，所述核苷一磷酸为腺苷一磷酸、鸟苷一磷酸、胞苷一磷酸和尿苷一磷酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的多酶催化系统，其特征在于，所述聚磷酸激酶为III型聚磷酸激酶，能够催化腺苷一磷酸、鸟苷一磷酸、胞苷一磷酸和尿苷一磷酸中的至少一种磷酸化生成相应的核苷三磷酸。
4.根据权利要求1所述的多酶催化系统，其特征在于，所述补救途径合成酶包括单糖激酶和糖核苷酸焦磷酸化酶；所述单糖激酶选自半乳糖激酶、N-乙酰己糖胺激酶、岩藻糖激酶、葡萄糖醛酸激酶中的至少一种；所述糖核苷酸焦磷酸化酶选自UDP-糖焦磷酸化酶、UDP-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶、GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、CMP-唾液酸合成酶中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的多酶催化系统，其特征在于，所述糖基转移酶为Leloir型糖基转移酶，能够催化由UDP-半乳糖、UDP-N-乙酰半乳糖胺、UDP-N-乙酰葡萄糖胺、GDP-岩藻糖或CMP-唾液酸提供糖基的糖基化反应。
6.根据权利要求1所述的多酶催化系统，其特征在于，所述受体分子为含有游离羟基的糖或糖苷类化合物。
7.根据权利要求1所述的多酶催化系统，其特征在于，所述目标聚糖为包含由所述糖核苷酸和糖基转移酶决定的特定糖苷键结构的寡糖或多糖。
8.根据权利要求1所述的多酶催化系统，其特征在于，所述系统还包括无机焦磷酸酶，用于水解反应生成的焦磷酸。
9.一种合成功能聚糖的多酶催化方法，其特征在于，使用权利要求1-8中任一项所述的多酶催化系统，将所述底物模块与所述酶模块混合，进行一锅法催化反应，生成目标聚糖。
10.根据权利要求9所述的多酶催化方法，其特征在于，反应条件满足以下一项或多项：
a. 所述核苷一磷酸的初始浓度为0.01 mM至100 mM；
b. 所述单糖的初始浓度为10 mM至100 mM；
c. 所述受体分子的初始浓度为10 mM至100 mM；
d. 所述聚磷酸盐的初始浓度为10 mM至300 mM；
e. 所述反应体系中镁离子的浓度为10 mM至300 mM。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002335988A (ja) * 2001-05-22 2002-11-26 Yamasa Shoyu Co Ltd オリゴ糖の製造法
US20140051127A1 (en) * 2012-08-20 2014-02-20 Academia Sinica Large scale enzymatic synthesis of oligosaccharides
CN110396532A (zh) * 2019-08-23 2019-11-01 中国科学院合肥物质科学研究院 一种制备唾液酸乳糖的方法
CN115927507A (zh) * 2022-07-08 2023-04-07 山东大学 一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法
CN117683833A (zh) * 2023-11-28 2024-03-12 山东大学 一种由核苷一磷酸制备核苷酸糖的方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002335988A (ja) * 2001-05-22 2002-11-26 Yamasa Shoyu Co Ltd オリゴ糖の製造法
US20140051127A1 (en) * 2012-08-20 2014-02-20 Academia Sinica Large scale enzymatic synthesis of oligosaccharides
CN110396532A (zh) * 2019-08-23 2019-11-01 中国科学院合肥物质科学研究院 一种制备唾液酸乳糖的方法
CN115927507A (zh) * 2022-07-08 2023-04-07 山东大学 一种糖苷磷酸化酶联合单糖激酶及聚磷酸激酶制备寡糖的方法
CN117683833A (zh) * 2023-11-28 2024-03-12 山东大学 一种由核苷一磷酸制备核苷酸糖的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHANNESGOTTSCHALK ET AL.: ""Integration of a Nucleoside Triphosphate Regeneration System in the One-pot Synthesis of UDP-sugars and Hyaluronic Acid"", 《CHEMCATCHEM》, vol. 13, 31 December 2021 (2021-12-31), pages 3074 *
XIAOCONG WU ET AL.: ""ATP Regeneration by Polyphosphate Kinase Powers Efficient Oligosaccharide Synthesis Catalyzed by Glycoside Phosphorylases"", 《ACSCHEM.BIOL.》, vol. 20, 2 September 2025 (2025-09-02), pages 2343 *
李爽: ""均一透明质酸及其衍生物的化学酶法合成"", 《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》, no. 1, 15 January 2024 (2024-01-15), pages 9 - 10 *
邢爽: ""糖苷磷酸化酶联合辅因子再生合成寡糖及其固定化研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》, no. 1, 15 January 2024 (2024-01-15), pages 006 - 546 *

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