JP5662167B2 - Ｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Description
本発明は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、かつＬ−アミノ酸輸送活性が親株よりも高い微生物を用いた、Ｌ−アミノ酸の製造法に関する。より具体的には、Ｌ−アミノ酸を菌体内から菌体外へ輸送する活性が親株よりも高い微生物を構築してＬ−アミノ酸を生成させ、生成Ｌ−アミノ酸を該微生物菌体内から菌体外へ効率よく排出させることにより、アミノ酸生産性を高める製造法に関する。
微生物を利用したアミノ酸の製造は、アミノ酸発酵と呼ばれ、応用微生物学の分野において、従来広く行われている。アミノ酸発酵においては、その最終ステップにおいては、アミノ酸輸送活性、すなわち、生成アミノ酸をいかに細菌の菌体外へ排出させるかが、アミノ酸生産性を左右する重大なプロセスとなっており、菌体外への排出効率を上げるための様々な工夫が、これまでになされてきた。
微生物菌体内のアミノ酸を菌体外へ運ぶには、通常、生体エネルギーを用いた能動輸送が必要である。菌体内アミノ酸を菌体外へ排出する蛋白質（排出蛋白質）が同定され、該蛋白質の発現強化によってもアミノ酸の生産能を付与又は増強できる事が知られている。例えばＬ−リジン、Ｌ−アルギニン排出遺伝子(lysE)（非特許文献１参照）の発現を強化したコリネバクテリウム属微生物の菌株を用いたＬ−リジンの製造法（特許文献１参照）、Ｌ−スレオニン、Ｌ−ホモセリンの排出遺伝子（rhtA）（非特許文献２参照）、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリン又はチアゾリン誘導体の排出遺伝子（ydeD/eamA）（非特許文献３参照）の発現を強化したエシェリヒア属微生物の菌株を用いたＬ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリン又はチアゾリン誘導体の製造法(特許文献２)、又はＬ−リジンの耐性に関与するＬ−リジン排出遺伝子（ybjE）の発現を強化したエシェリヒア属微生物の菌株を用いたＬ−リジンを始めとするＬ−アミノ酸の製造法（特許文献３）などが知られている。
しかしながら、Ｌ−セリン及びＬ−グルタミンに関する排出蛋白質、及び該蛋白質の活性を強化したアミノ酸の製造法の報告は無い。
ところで、大腸菌のnorM遺伝子はキノロン（quinolone）耐性に関わる排出ポンプ遺伝子であることが知られている（非特許文献４）。emrD遺伝子はSDS輸送遺伝子と報告されている（非特許文献５）。rarDは薬剤輸送遺伝子と予測されているが、いずれもアミノ酸排出活性があることは知られていない（非特許文献６）。一方で、eamA(ydeD)遺伝子は、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｎ−アセチルセリン又はチアゾリン誘導体の排出活性を有する遺伝子であると報告されている（非特許文献３）。
Mol. Microbiol., 22, 815-826(1996)
Res. Microbiol., 154, 123-135(2003)
Mol. Microbiol., 36, 1101-1112(2000)
J. Antimicrob. Chemother., 51, 545-56 (2003)
J. Bacteriol., 183, 5803-5812 (2001)
Science, 308, 1321-1323 (2005)
本発明が解決しようとする課題は、Ｌ−アミノ酸輸送活性が親株よりも高い微生物にＬ−アミノ酸を生成させることによる、Ｌ−アミノ酸の効率のよい製造法を提供することにある。より具体的には、これまでＬ−アミノ酸輸送活性を強化することによる製造法の報告がなかったＬ−セリン及びＬ−グルタミンを含む、５つの中性アミノ酸について、排出蛋白質の強化による、生産性の高い新規の製造法を提供することである。
すなわち、本発明は、以下の〔１〕〜〔４〕に関する。
〔１〕Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する以下の［１］〜[３]のいずれかに記載の蛋白質の活性が親株より高い微生物を、培地に培養し、Ｌ−アミノ酸を生成させ、該Ｌ−アミノ酸を該培地中に蓄積せしめ、次いで該培地中から該Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
［１］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質
［３］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性があるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質
〔２〕微生物が以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換された微生物、又は該ＤＮＡの発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強された微生物である、〔１〕記載のＬ−アミノ酸の製造法。
［１］〔１〕の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
〔３〕微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属に属する微生物である、〔１〕又は〔２〕記載のＬ−アミノ酸の製造法。
〔４〕Ｌ−アミノ酸がＬ−セリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−スレオニンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
〔１〕Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する以下の［１］〜[３]のいずれかに記載の蛋白質の活性が親株より高い微生物を、培地に培養し、Ｌ−アミノ酸を生成させ、該Ｌ−アミノ酸を該培地中に蓄積せしめ、次いで該培地中から該Ｌ−アミノ酸を採取することを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造法。
［１］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質
［３］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性があるアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質
〔２〕微生物が以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換された微生物、又は該ＤＮＡの発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強された微生物である、〔１〕記載のＬ−アミノ酸の製造法。
［１］〔１〕の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
〔３〕微生物が、エシェリヒア属、コリネバクテリウム属、バチルス属、セラチア属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属に属する微生物である、〔１〕又は〔２〕記載のＬ−アミノ酸の製造法。
〔４〕Ｌ−アミノ酸がＬ−セリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−スレオニンからなる群より選ばれるＬ−アミノ酸である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＬ−アミノ酸の製造法。
本発明の製造法は、Ｌ−アミノ酸のうち、とりわけ、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン又はＬ−スレオニンの製造において、生産性の高い製造法である。
本発明の製造法は、微生物の菌体内のＬ−アミノ酸を菌体外に輸送する活性を有する蛋白質の活性を強化することにより、該微生物を用いて効率よくＬ−セリン及びＬ−グルタミンを製造する方法である。またＬ−システイン、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンについても、同様にＬ−アミノ酸輸送活性を高めることによる、新規の製造法を提供する。
本発明の製造法は、微生物の菌体内のＬ−アミノ酸を菌体外に輸送する活性を有する蛋白質の活性を強化することにより、該微生物を用いて効率よくＬ−セリン及びＬ−グルタミンを製造する方法である。またＬ−システイン、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンについても、同様にＬ−アミノ酸輸送活性を高めることによる、新規の製造法を提供する。
本発明の発明者は、大腸菌の公知の輸送遺伝子norM、emrD又はrarDが、アミノ酸を菌体外へ輸送する機能を有することを見出し、前記輸送遺伝子が、Ｌ−セリン若しくはＬ−グルタミン、又は、Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン、若しくはＬ−フェニルアラニンの製造に有利に利用可能であることを見出した。
また、Ｌ−アミノ酸輸送活性が知られていたeamAについても、Ｌ−セリンの輸送を担うことを新たに見出し、これを利用したＬ−セリンの製造法を考案した。
また、Ｌ−アミノ酸輸送活性が知られていたeamAについても、Ｌ−セリンの輸送を担うことを新たに見出し、これを利用したＬ−セリンの製造法を考案した。
本発明の方法によれば、前記アミノ酸輸送遺伝子の活性を高めると、生成Ｌ−アミノ酸の菌体外への選択的能動輸送により、Ｌ−アミノ酸の生産を顕著に向上させることができる。しかもＬ−アミノ酸製造に用いる微生物は、外膜の種類（細胞壁、莢膜又は粘液層などの有無）によらず、グラム陽性・グラム陰性を問わない。つまり本発明の製造法は、コリネバクテリウム属、バチルス属、及びストレプトマイセス属等のグラム陽性菌、並びに、エシュリヒア属、セラチア属、及びシュードモナス属等のグラム陰性菌のどちらにおいても使用することができる、汎用性の高い製造法である。
本発明の製造法により、Ｌ−セリン及びＬ−グルタミンの製造効率がこれまでより飛躍的に改善される。とりわけＬ−セリンは、非必須アミノ酸ながら、生体内において重要な役割を担うアミノ酸であり、医薬品分野や化粧品分野において、アミノ酸混合物の原料として、利用価値が高い。またＬ−グルタミンは、体内で胃腸や筋肉などの機能を正常に保つアミノ酸であり、抗アルコール症組成物などの原料となる。これらのＬ−アミノ酸の生産性の高い製造法が確立され、工業的な大量生産が可能になれば、産業上の利用可能性は非常に高い。
Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンについても、本発明の製造法により、より一層経済的な生産が可能となった。Ｌ−システインは、美白効果があるため化粧品の原料として、化粧品業界で非常に価値の高いアミノ酸である。Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンは、ともに必須アミノ酸であり、Ｌ−スレオニンはアミノ酸輸液及び健康食品の成分として、またＬ−フェニルアラニンは、低カロリー甘味料のアスパルテーム（アスパルチルフェニルアラニンのメチルエステル、砂糖の２００倍の甘みを有する）の原料として、各々有用なアミノ酸であり、本発明の製造法による生産性の向上が期待される。
Ｌ−システイン、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンについても、本発明の製造法により、より一層経済的な生産が可能となった。Ｌ−システインは、美白効果があるため化粧品の原料として、化粧品業界で非常に価値の高いアミノ酸である。Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンは、ともに必須アミノ酸であり、Ｌ−スレオニンはアミノ酸輸液及び健康食品の成分として、またＬ−フェニルアラニンは、低カロリー甘味料のアスパルテーム（アスパルチルフェニルアラニンのメチルエステル、砂糖の２００倍の甘みを有する）の原料として、各々有用なアミノ酸であり、本発明の製造法による生産性の向上が期待される。
１．本発明の製造法に用いられる微生物
Ｌ−アミノ酸輸送活性が親株より高い微生物
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物は、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上の、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの改変により得られる、ｉ）親株より該蛋白質の比活性が向上した微生物、及びｉｉ）親株よりＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物、並びに（ｂ）親株をＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物、である。なお、本明細書中における親株とは、野生株でも、変異株であってもよく、改変又は形質転換の対象である元株である。野生株とは、野生集団中で最も高頻度に観察される表現型をもつ株をいう。該親株としては例えば微生物がEscherichia coli である場合、E. coli K-12株、B株、B/r株、W株の野生株、又はその変異株をあげることができ、該変異株としてはE. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC12435、E. coli W1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coli ME8415、E. coli ATCC9637 等をあげることができる。
Ｌ−アミノ酸輸送活性が親株より高い微生物
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物は、（ａ）親株の染色体ＤＮＡ上の、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの改変により得られる、ｉ）親株より該蛋白質の比活性が向上した微生物、及びｉｉ）親株よりＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物、並びに（ｂ）親株をＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物、である。なお、本明細書中における親株とは、野生株でも、変異株であってもよく、改変又は形質転換の対象である元株である。野生株とは、野生集団中で最も高頻度に観察される表現型をもつ株をいう。該親株としては例えば微生物がEscherichia coli である場合、E. coli K-12株、B株、B/r株、W株の野生株、又はその変異株をあげることができ、該変異株としてはE. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC12435、E. coli W1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coli ME8415、E. coli ATCC9637 等をあげることができる。
Ｌ−アミノ輸送活性を有する蛋白質としては、以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質：
［１］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質；
［２］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質；並びに
［３］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性があるアミノ酸配列を有し、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質；
をあげることができる。
ここで、配列番号１、３、５、７の各ＤＮＡ配列は、各々、前記の大腸菌におけるnorM遺伝子、emrD遺伝子、rarD遺伝子及びeamA遺伝子をコードしており、配列２、４、６及び８で表されるアミノ酸配列は、各々、前記遺伝子がコードする、norM蛋白質、emrD蛋白質、rarD蛋白質及びeamA蛋白質を表している。
［１］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質；
［２］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質；並びに
［３］配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性があるアミノ酸配列を有し、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質；
をあげることができる。
ここで、配列番号１、３、５、７の各ＤＮＡ配列は、各々、前記の大腸菌におけるnorM遺伝子、emrD遺伝子、rarD遺伝子及びeamA遺伝子をコードしており、配列２、４、６及び８で表されるアミノ酸配列は、各々、前記遺伝子がコードする、norM蛋白質、emrD蛋白質、rarD蛋白質及びeamA蛋白質を表している。
上記において、１以上のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換又は付加されるアミノ酸残基の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換又は付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号２、４、６及び８で表されるアミノ酸配列において１個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１個又は複数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されていてもよい。
アミノ酸残基の欠失又は付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側の１０アミノ酸残基をあげることができる。
欠失、置換又は付加は同時に生じてもよく、置換又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質としては、配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をあげることができる。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質としては、配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列との相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質であり、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をあげることができる。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法はよく知られている。
配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、L-アミノ酸輸送活性を有する蛋白質であることは、例えばＤＮＡ組換え法を用いて活性を確認したい蛋白質を発現する形質転換体を作製し、ラベル化したL-アミノ酸、及び該形質転換体から調製できる反転膜小胞［J. Biol. Chem., 277, 49841 (2002)］を用いる方法[J. Biol. Chem., 280, 32254 (2005)]により確認することができる。
また、配列番号２、４、６及び８で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなる蛋白質が、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質であることは、例えば活性を確認したい蛋白質をコードするＤＮＡで親株を形質転換することにより該親株より該蛋白質の活性が高い形質転換体を作製し、該親株又は該形質転換体の培養液中に生成、蓄積したＬ−アミノ酸の量を比較することによっても確認できる。
上記（ａ）のｉ）の、親株の染色体ＤＮＡ上の、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの改変により得られる、親株より該蛋白質の比活性が向上した微生物としては、親株が有する該蛋白質のアミノ酸配列において１アミノ酸以上、好ましくは１〜１０アミノ酸、より好ましくは１〜５アミノ酸、さらに好ましくは１〜３アミノ酸が置換しているアミノ酸配列を有する蛋白質を有しているため、親株のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質と比較して、その活性が向上した変異型蛋白質を有する微生物をあげることができる。
上記（ａ）のｉｉ）の、親株の染色体ＤＮＡ上の、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの改変により得られる、親株よりＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物としては、親株の染色体ＤＮＡ上に存在する該蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域又はプロモーター領域の塩基配列において１塩基以上、好ましくは１〜１０塩基、より好ましくは１〜５塩基、さらに好ましくは１〜３塩基の塩基が置換しているプロモーター領域を有しているため、親株のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の生産量と比較して、該蛋白質の生産量が向上している微生物をあげることができる。
上記（ｂ）の親株をＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換して得られる微生物としては：
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ；
［５］配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ；又は
［６］配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
を用いて親株を形質転換して得られる微生物をあげることができる。
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ；
［５］配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列を有するＤＮＡ；又は
［６］配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ；
を用いて親株を形質転換して得られる微生物をあげることができる。
該微生物としては、外来のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをｉ）染色体ＤＮＡ上に有する微生物、及びｉｉ）染色体外に有する微生物をあげることができる。すなわち、ｉ）の微生物は、親株がＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを保有していない場合は、新たに導入された該ＤＮＡを１つ又は２つ以上、染色体ＤＮＡ上に有する微生物であり、親株がＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを元来保有する場合には、新たに導入された該ＤＮＡを含む２つ以上のＬ−アミノ輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡ上に有する微生物である。ｉｉ）の微生物は、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをプラスミドＤＮＡ上に有する微生物である。
本明細書において「Ｌ−アミノ酸輸送活性」とは、細胞内のＬ−アミノ酸を細胞外へ排出する活性をいう。
上記の「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又はその一部は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして用いることができ、またＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できるＤＮＡである。プローブとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡをあげることができる。
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Methods for General and Molecular Bacteriolgy, ASM Press（1994）、Immunology methods manual, Academic press(Molecular)に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。
上記の「ストリンジェントな条件」とは、ＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを50％ホルムアミド、5×SSC（750mmol/lの塩化ナトリウム、75mmol/lのクエン酸ナトリウム）、50mmol/lのリン酸ナトリウム（pH7.6）、5×デンハルト溶液、10％の硫酸デキストラン、及び20μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃にて一晩インキュベートした後、例えば約65℃の0.2×SSC溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェントな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度及び温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば6×SSCE（20×SSCEは、3mol/lの塩化ナトリウム、0.2mol/lのリン酸二水素ナトリウム、0.02mol/lのEDTA、pH7.4）、0.5％のSDS、30％のホルムアミド、100μg/lの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベートした後、50℃の1×SSC、0.1％SDS溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば5×SSC）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したBLASTやFASTA等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号１、３、５及び７のいずれかで表される塩基配列からなるＤＮＡと少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
２．本発明で用いられる微生物の調製
（１）Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物の調製
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物のうち、比活性が親株のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質より高い微生物は、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをin vitroにおける変異剤を用いた変異処理、又はエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、該変異ＤＮＡを親株の染色体ＤＮＡ上に存在する変異導入前のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡと公知の方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6640 (2000)］を用いて置換することにより該変異ＤＮＡを発現する改変体を作製し、上記した方法により親株と改変体のＬ−アミノ酸輸送活性を比較することにより取得することができる。
（１）Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物の調製
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物のうち、比活性が親株のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質より高い微生物は、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをin vitroにおける変異剤を用いた変異処理、又はエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、該変異ＤＮＡを親株の染色体ＤＮＡ上に存在する変異導入前のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡと公知の方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6640 (2000)］を用いて置換することにより該変異ＤＮＡを発現する改変体を作製し、上記した方法により親株と改変体のＬ−アミノ酸輸送活性を比較することにより取得することができる。
また、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物のうち、該蛋白質の生産量が親株の生産量より向上している微生物は、親株が有するＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域及びプロモーター領域、例えば該蛋白質の開始コドンの上流側200bp、好ましくは100bpの塩基配列を有するＤＮＡをin vitroにおける変異処理、又はエラープローンＰＣＲなどに供することにより該ＤＮＡに変異を導入した後、該変異ＤＮＡを親株の染色体ＤＮＡ上に存在する変異導入前のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写調節領域及びプロモーター領域と公知の方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6640 (2000)］を用いて置換することにより変異型の転写調節領域又はプロモーター領域を有する改変体を作製し、ＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンハイブリダイゼーションなどにより、親株と改変体のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の転写量を比較する方法、又はＳＤＳ−ＰＡＧＥなどにより親株と改変体のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の生産量を比較する方法により確認することができる。
また、親株のＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター領域を公知の強力なプロモーター配列と置換することによっても、親株よりＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の生産量が向上した微生物を取得することもできる。
そのようなプロモーターとしては、E. coliで機能するtrpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターなどの人為的に造成したプロモーターもあげることができる。
さらにバチルス（Bacillus）属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やCorynebacterium属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
以下に、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得法、及び親株を該ＤＮＡで形質転換して得られる微生物の調製法について詳細に説明する。
（ａ）Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡの取得
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、E. coliなどの微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはE. coliの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づき設計することができるプローブＤＮＡを用いた、E. coliなどの微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、又は該塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、微生物、好ましくはE. coliの染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ[PCR Protocols, Academic Press (1990)]により取得することができる。
また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する微生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法によりＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを取得することもできる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 (1977)]又は3700 ＤＮＡアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
上記のベクターとしては、pBluescriptII KS(+)（ストラタジーン社製）、pDIRECT[Nucleic Acids Res., 18, 6069 (1990)]、pCR-Script Amp SK(+)（ストラタジーン社製）、pT7Blue（ノバジェン社製）、pCR II（インビトロジェン社製）及びpCR-TRAP（ジーンハンター社製）などをあげることができる。
宿主細胞としては、Escherichia属に属する微生物などをあげることができる。Escherichia属に属する微生物としては、例えば、E. coli XL1-Blue、E. coli XL2-Blue、E. coli DH1、E. coli MC1000、E. coli ATCC 12435、E. coli W1485、E. coli JM109、E. coli HB101、E. coli No.49、E. coli W3110、E. coli NY49、E. coli MP347、E. coli NM522、E. coli BL21、E. coli ME8415等をあげることができる。
組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)]、プロトプラスト法（特開昭63-248394）、エレクトロポレーション法[Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)]等をあげることができる。
塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号２、４、６及び８のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、及び配列番号１、３、５及び７のいずかで表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
（ｂ）Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質を発現するプラスミドベクターで形質転換された微生物の取得
上記（ａ）の方法で得られるＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該蛋白質量が向上した形質転換体を取得することができる。
上記（ａ）の方法で得られるＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡをもとにして、必要に応じて、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主細胞での発現に最適なコドンとなるように塩基を置換することにより、該蛋白質量が向上した形質転換体を取得することができる。
該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が宿主細胞、すなわち親株より向上した形質転換体を得ることができる。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が宿主細胞、すなわち親株より向上した形質転換体を得ることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自律複製可能又は染色体中への組込みが可能で、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
原核生物を宿主細胞として用いる場合は、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、pColdI(タカラバイオ社製)、pCDF-1b、pRSF-1b（いずれもノバジェン社製）、pMAL-c2x（ニューイングランドバイオラブス社製）、pGEX-4T-1（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、pTrcHis（インビトロジェン社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200[Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)]、pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)]、pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)]、pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(-)（ストラタジーン社製）、pTrS30 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製]、pTrS32 [エシェリヒア・コリ JM109/pTrS32(FERM BP-5408)より調製]、pPAC31 (WO98/12343)、pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)]、pSTV28(タカラバイオ社製)、pUC118（タカラバイオ社製）、pPA1（特開昭63-233798）等を例示することができる。
プロモーターとしては、E. coli等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター、ＰSEプロモーター等の、E. coliやファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ直列させたプロモーター、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
さらにBacillus属に属する微生物中で発現させるためのxylAプロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 35, 594-599 (1991)］やCorynebacterium属に属する微生物中で発現させるためのP54-6プロモーター［Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 674-679 (2000)］なども用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えば後述するpSnorM、pSemrD、pSrarD及びpSeamAをあげることができる。
該組換え体ＤＮＡの宿主としては、原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アナベナ（Anabaena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アスロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum）、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.） ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等をあげることができ、好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラー又はストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）属、アナベナ（Anabaena）属、アナシスティス（Anacystis）属、アスロバクター（Arthrobacter）属、アゾトバクター（Azotobacter）属、クロマチウム（Chromatium）属、エルビニア（Erwinia）属、メチロバクテリウム（Methylobacterium）属、フォルミディウム（Phormidium）属、ロドバクター（Rhodobacter）属、ロドシュードモナス（Rhodopseudomonas）属、ロドスピリウム（Rhodospirillum）属、セネデスムス（Scenedesmus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シネコッカス（Synechoccus）属、ザイモモナス（Zymomonas）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリ、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Brevibacterium immariophilum）、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Brevibacterium saccharolyticum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Corynebacterium acetoacidophilum）、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Microbacterium ammoniaphilum）、セラチア・フィカリア（Serratia ficaria）、セラチア・フォンチコラ（Serratia fonticola）、セラチア・リケファシエンス（Serratia liquefaciens）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Agrobacterium rhizogenes）、アグロバクテリウム・ルビ（Agrobacterium rubi）、アナベナ・シリンドリカ（Anabaena cylindrica）、アナベナ・ドリオルム（Anabaena doliolum）、アナベナ・フロスアクア（Anabaena flos-aquae）、アースロバクター・オーレッセンス（Arthrobacter aurescens）、アースロバクター・シトレウス（Arthrobacter citreus）、アースロバクター・グロブフォルミス（Arthrobacter globformis）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）、アースロバクター・ミソレンス（Arthrobacter mysorens）、アースロバクター・ニコチアナ（Arthrobacter nicotianae）、アースロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Arthrobacter protophormiae）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Arthrobacter roseoparaffinus）、アースロバクター・スルフレウス（Arthrobacter sulfureus）、アースロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）、クロマチウム・ブデリ（Chromatium buderi）、クロマチウム・テピダム（Chromatium tepidum）、クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）、クロマチウム・ワーミンギ（Chromatium warmingii）、クロマチウム・フルビアタティレ（Chromatium fluviatile）、エルビニア・ウレドバラ（Erwinia uredovora）、エルビニア・カロトバラ（Erwinia carotovora）、エルビニア・アナス（Erwinia ananas）、エルビニア・ヘリコラ（Erwinia herbicola）、エルビニア・パンクタタ（Erwinia punctata）、エルビニア・テレウス（Erwinia terreus）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Methylobacterium rhodesianum）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Methylobacterium extorquens）、フォルミディウム・エスピー（Phormidium sp.） ATCC29409、ロドバクター・カプスラタス（Rhodobacter capsulatus）、ロドバクター・スフェロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Rhodopseudomonas blastica）、ロドシュードモナス・マリナ（Rhodopseudomonas marina）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドスピリウム・リブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Rhodospirillum salexigens）、ロドスピリウム・サリナラム（Rhodospirillum salinarum）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Streptomyces aureofaciens） 、ストレプトマイセス・アウレウス（Streptomyces aureus）、ストレプトマイセス・フンジシディカス（Streptomyces fungicidicus）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Streptomyces griseochromogenes）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Streptomyces olivogriseus）、ストレプトマイセス・ラメウス（Streptomyces rameus）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Streptomyces tanashiensis）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Streptomyces vinaceus）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）等をあげることができ、好ましい原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属等に属する細菌、例えば上記したエシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属又はストレプトマイセス属等に属する種をあげることができ、より好ましい細菌としてはエシェリヒア・コリ、コリネバクテリウム・グルタミクム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム、コリネバクテリウム・フラバム、コリネバクテリウム・エフィシェンス、バチルス・サチルス、バチルス・メガテリウム、セラチア・マルセッセンス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・エルギノーサ、ストレプトマイセス・セリカラー又はストレプトミセス・リビダンスをあげることができ、特に好ましくはエシェリヒア・コリをあげることができる。
（ｃ）Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれた微生物の取得
上記（ａ）の方法で得られるＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことにより、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物を取得することもできる。
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを微生物の染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込む方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができ、宿主、すなわち親株としてE. coliを用いる場合にはProc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6640 (2000)に記載の方法をあげることができる。
上記（ａ）の方法で得られるＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込むことにより、Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質の活性が親株より高い微生物を取得することもできる。
Ｌ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを微生物の染色体ＤＮＡの任意の位置に組み込む方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができ、宿主、すなわち親株としてE. coliを用いる場合にはProc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6640 (2000)に記載の方法をあげることができる。
（２）Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製
本発明のＬ−アミノ酸の製造法で用いられる、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、該能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよい。自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は、該株そのものであってよく、改変又は形質転換された変異株である場合は、公知の方法により所望のＬ−アミノ酸を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
本発明のＬ−アミノ酸の製造法で用いられる、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、該能力を有する微生物であればいずれの微生物であってもよい。自然界から分離された株自身が該能力を有する場合は、該株そのものであってよく、改変又は形質転換された変異株である場合は、公知の方法により所望のＬ−アミノ酸を生産する能力を人為的に付与した微生物などをあげることができる。
当該公知の方法としては、
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
（ａ）アミノ酸の生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和又は解除する方法、
（ｂ）アミノ酸の生合成に関与する酵素の少なくとも１つを発現強化する方法、
（ｃ）アミノ酸の生合成に関与する酵素遺伝子の少なくとも１つのコピー数を増加させる方法、
（ｄ）アミノ酸の生合成経路から該アミノ酸以外の代謝産物へ分岐する代謝経路の少なくとも１つを弱化又は遮断する方法、及び
（ｅ）野生型株に比べ、アミノ酸のアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択する方法、
などをあげることができ、上記公知の方法は単独又は組み合わせて用いることができる。
上記（ａ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)、J. Bacteriol., 110, 761-763(1972)及びAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)などに、上記（ｂ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 43, 105-111(1979)及びJ. Bacteriol., 110, 761-763(1972)などに、上記（ｃ）については、例えばAppl. Microbiol. Biotechnol., 39, 318-323(1993)及びAgric. Biol. Chem., 39, 371-377(1987)などに、上記（ｄ）については、例えばAppl. Environ. Micribiol., 38, 181-190(1979)及びAgric. Biol. Chem., 42, 1773-1778(1978)などに、上記（ｅ）については、例えばAgric. Biol. Chem., 36, 1675-1684(1972)、Agric. Biol. Chem., 41, 109-116(1977)、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)及びAgric. Biol. Chem., 51, 2089-2094(1987)などに記載されている。上記文献等を参考に各種アミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
さらに上記（ａ）〜（ｅ）のいずれか、又は組み合わせた方法によるアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法については、Biotechnology 2nd ed., Vol.6, Products of Primary Metabolism (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim, 1996) section 14a, 14bやAdvances in Biochemical Engineering/ Biotechnology, 79, 1-35 (2003)、アミノ酸発酵、学会出版センター、相田 浩ら（1986）に多くの例が記載されており、また上記以外にも具体的なアミノ酸を生産する能力を有する微生物の調製方法は、特開2003-164297、Agric. Biol. Chem., 39, 153-160 (1975)、Agric. Biol. Chem., 39, 1149-1153(1975)、特開昭58-13599、J. Gen. Appl. Microbiol., 4, 272-283(1958)、特開昭63-94985、Agric. Biol. Chem., 37, 2013-2023(1973)、国際公開97/15673号パンフレット、特開昭56-18596、特開昭56-144092及び特表2003-511086など数多くの報告があり、上記文献等を参照することにより１種以上のアミノ酸を生産する能力を有する微生物を調製することができる。
上記方法によって調製することができるアミノ酸を生産する能力を有する微生物としては、例えばＬ−セリン生産菌として、Ｌ−セリン分解と取り込み活性を有するsdaA遺伝子、sdaB遺伝子、sdaC遺伝子及びglyA遺伝子が欠損し、かつＬ−セリンに対する脱感作型serA遺伝子の発現が強化された微生物、Ｌ−グルタミン生産菌として、glnE遺伝子が欠損した微生物、Ｌ−システイン生産菌として、例えば、Ｌ−システインに対する脱感作型cysE遺伝子を保持する微生物、Ｌ−フェニルアラニン生産菌として、Ｌ−フェニルアラニンの脱感作型pheA遺伝子及び／又はチロシンの脱感作型aroF遺伝子を発現する微生物など、Ｌ−スレオニン生産菌として、α-アミノ-β-ヒドロキシ吉草酸(AHV)耐性並びにＬ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン及びＬ−プロリン要求性が付与された微生物をあげることができる。
上記したアミノ酸を生成、蓄積する微生物としては、上記（ａ）〜（ｅ）の方法が適用することができる微生物又は上記遺伝的形質を有する微生物であればいずれの微生物であってもよく、好ましくは原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。該組換え体ＤＮＡの宿主としては、原核生物、より好ましくは細菌をあげることができる。
アミノ酸を生産する微生物の具体例としては、Ｌ−セリン生産株として、Ｌ−セリン分解酵素（sdaA、sdaB、glyA）及び取り込み系（sdaC）を欠損し、かつＬ−セリン脱感作型serA遺伝子発現プラスミドを保有する、エシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2株、Ｌ−グルタミン生産株として、国際公開06/001379号パンフレットまたは米国公開公報2005-0287626号パンフレットに記載のエシェリヒア・コリ JGLE1及びエシェリヒア・コリ JGLBE1など、Ｌ−システイン生産株として、Ｌ−セリン分解酵素（sdaA、sdaB）及び取り込み系（sdaC）を欠損し、染色体ＤＮＡ上のcysE遺伝子がＬ−システイン脱感作型cysE遺伝子に置換され、かつL−システイン脱感作型cysE遺伝子発現プラスミドを保有するエシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCcysE256/pScysEfbr1株、Ｌ−フェニルアラニン生産株として、Ｌ−フェニルアラニン脱感作型pheA遺伝子及びＬ−チロシン脱感作型aroF遺伝子発現プラスミドを保有するエシェリヒア・コリ NM522/pBpheAfbraroFfbr株など、Ｌ−スレオニン生産株として、ATCC21148、ATCC21277及びATCC21650などをあげることができる。
さらに、アミノ酸を生産する能力を有する微生物の具体例としては、Ｌ−グルタミン酸生産株としてFERM BP-5807及びATCC13032など、Ｌ−グルタミン生産株としてFERM P-4806及びATCC14751など、Ｌ−リジン生産株としてFERM P-5084及びATCC13286など、Ｌ−メチオニン生産株としてFERM P-5479、VKPM B-2175及びATCC21608など、Ｌ−イソロイシン生産株としてFERM BP-3757及びATCC14310など、Ｌ−バリン生産株としてATCC13005及びATCC19561など、Ｌ−ロイシン生産株としてFERM BP-4704及びATCC21302など、Ｌ−アラニン生産株としてFERM BP-4121及びATCC15108など、Ｌ−セリン生産株としてATCC21523及びFERM BP-6576など、Ｌ−プロリン生産株としてFERM BP-2807及びATCC19224など、Ｌ−アルギニン生産株としてFERM P-5616及びATCC21831など、Ｌ−オルニチン生産株としてATCC13232など、Ｌ−ヒスチジン生産株としてFERM BP-6674及びATCC21607など、Ｌ−トリプトファン生産株としてDSM10118、DSM10121、DSM10123及びFERM BP-1777など、Ｌ−フェニルアラニン生産株としてATCC13281及びATCC21669など、Ｌ−チロシン生産株としてATCC21652など、Ｌ−システイン生産株としてW3110/pHC34(特表2003-511086記載)など、Ｌ−４−ヒドロキシプロリン生産株としてWO96/27669記載のエシェリヒア・コリSOLR/pRH71など、Ｌ−３−ヒドロキシプロリン生産株としてFERM BP-5026及びFERMBP-5409など、Ｌ−シトルリン生産株としてFERM P-5643及びFERM P-1645などをあげることができる。
なお、上記のFERM番号で表される菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本）、ATCC番号で表される菌株は、American Type Culture Collection（米国）、VKPM番号で表される菌株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms（ロシア）、DSM番号で表される菌株はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen（ドイツ）からそれぞれ入手することができる。
３．本発明のＬ−アミノ酸の製造法
上記２記載の方法で調製できる微生物の培養物は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える天然培地又は合成培地を用いて該微生物を培養することにより取得することができる。
上記２記載の方法で調製できる微生物の培養物は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える天然培地又は合成培地を用いて該微生物を培養することにより取得することができる。
炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フルクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は15〜40℃がよく、培養時間は、通常5時間〜7日間である。培養中pHは3.0〜9.0に保持する。pHの調整は、無機又は有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
上記のようにして構築された、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有し、かつＬ−アミノ酸輸送活性を有する蛋白質を発現した微生物の形質転換体を、培地に培養し、Ｌ−アミノを生成させる。生成されたＬ−アミノ酸は、上記の形質転換体が有するＬ−アミノ酸輸送活性により、菌体内から該培地中に効率よく輸送され、培地中に蓄積する。従って、該培養物中から該Ｌ−アミノを採取することにより、目的のＬ−アミノを効率よく製造することができる。
水性媒体中、又は培養物中に蓄積されたＬ−アミノの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に示す方法でアミノ酸生産菌を作製した。
［１］脱感作型serA遺伝子発現プラスミドの造成
エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８及び１９で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.3μmol/Lの各プライマー、1 unitsのKOD-plus- DNAポリメラーゼ(東洋紡製)、5μLのKOD-plus- DNAポリメラーゼ用×10緩衝液(東洋紡製)、100μmol/LのMgSO4、各200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTP及びdTTP）を含む反応液50μLを調製し、94℃で15秒間、55℃で30秒間、68℃で2分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１８及び１９で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.3μmol/Lの各プライマー、1 unitsのKOD-plus- DNAポリメラーゼ(東洋紡製)、5μLのKOD-plus- DNAポリメラーゼ用×10緩衝液(東洋紡製)、100μmol/LのMgSO4、各200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTP及びdTTP）を含む反応液50μLを調製し、94℃で15秒間、55℃で30秒間、68℃で2分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片をBglII及びHindIIIで、pTrs30をBamHI及びHindIIIで消化した後、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて両ＤＮＡを連結し、連結したＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を形質転換した。以上の方法でtrpプロモーター下流にserA遺伝子が連結されたプラスミドＤＮＡを取得し、これをpTrs30-serAと命名した。
pTrs30-serAを鋳型とし、配列番号２０及び２１で表される塩基配列からなる５’側末端をリン酸基で修飾した合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲ反応は、鋳型として0.01μgのpTrs30-serAのＤＮＡを用いるほか、上記と同様の条件及び反応液組成により行った。
ＰＣＲ反応後、約5.8kbのＤＮＡ断片が増幅したことを確認し、該増幅ＤＮＡ断片を常法に従って精製した。
上記で増幅した直鎖状のＤＮＡ断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）により連結して環状とし、該環状ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を形質転換した。アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出した。
以上により、pTrs30のtrpプロモーター下流に、配列番号１７で表されるアミノ酸配列の294番目のグリシンがＬ−バリンに置換された、Ｌ−セリン脱感作型serA遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製し、これをpSserAfbr1と命名した。
ＰＣＲ反応は、鋳型として0.01μgのpTrs30-serAのＤＮＡを用いるほか、上記と同様の条件及び反応液組成により行った。
ＰＣＲ反応後、約5.8kbのＤＮＡ断片が増幅したことを確認し、該増幅ＤＮＡ断片を常法に従って精製した。
上記で増幅した直鎖状のＤＮＡ断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）により連結して環状とし、該環状ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を形質転換した。アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択し、得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出した。
以上により、pTrs30のtrpプロモーター下流に、配列番号１７で表されるアミノ酸配列の294番目のグリシンがＬ−バリンに置換された、Ｌ−セリン脱感作型serA遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製し、これをpSserAfbr1と命名した。
さらに、pSserAfbr1を鋳型とし、配列番号２２及び２３で表される塩基配列からなる５’側末端をリン酸基で修飾した合成ＤＮＡをプライマーセットとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応液の組成及び反応条件は上記と同様である。
増幅した直鎖状のＤＮＡ断片を連結して環状とし、該環状ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出した。
以上により、pTrs30のtrpプロモーター下流に、配列番号１７で表されるアミノ酸配列の294番目のグリシンがＬ−バリンに、364番目のＬ−アスパラギンがＬ−アラニンに置換された、Ｌ−セリン脱感作型serA遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製し、これをpSserAfbr2と命名した。
ＰＣＲの反応液の組成及び反応条件は上記と同様である。
増幅した直鎖状のＤＮＡ断片を連結して環状とし、該環状ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出した。
以上により、pTrs30のtrpプロモーター下流に、配列番号１７で表されるアミノ酸配列の294番目のグリシンがＬ−バリンに、364番目のＬ−アスパラギンがＬ−アラニンに置換された、Ｌ−セリン脱感作型serA遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製し、これをpSserAfbr2と命名した。
［２］sdaA、sdaB、sdaC及びglyA遺伝子が欠損した微生物の作製
エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6641-6645(2000)］に従って行った。以下に記載のプラスミドpKD46、pKD3及びpCP20は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
エシェリヒア・コリの染色体ＤＮＡ上の特定遺伝子の欠損は、ラムダファージの相同組換え系を利用した方法［Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97, 6641-6645(2000)］に従って行った。以下に記載のプラスミドpKD46、pKD3及びpCP20は、エシェリヒア・コリ ジェネティック ストック センター（米国エール大学）から該プラスミドを保持するエシェリヒア・コリ株を入手し、当該株から公知の方法により抽出して用いた。
（１）遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片のクローニング
sdaA遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号２４及び２５、並びに２６及び２７で表される塩基配列からなるＤＮＡを、sdaC-sdaB遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号２８及び２９、並びに３０及び３１で表される塩基配列からなるＤＮＡを、glyA遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号３２及び３３、並びに３４及び３５で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ用い、エシェリヒア・コリATCC9637株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5units のPfu DNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×１０緩衝液、200μmol/L の各deoxyNTPを含む40μLの反応液を用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で1分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。
sdaA遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号２４及び２５、並びに２６及び２７で表される塩基配列からなるＤＮＡを、sdaC-sdaB遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号２８及び２９、並びに３０及び３１で表される塩基配列からなるＤＮＡを、glyA遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号３２及び３３、並びに３４及び３５で表される塩基配列からなるＤＮＡをそれぞれ用い、エシェリヒア・コリATCC9637株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5units のPfu DNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×１０緩衝液、200μmol/L の各deoxyNTPを含む40μLの反応液を用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で1分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。
該ＰＣＲにより、目的とするsdaA、sdaB、sdaC及びglyA各遺伝子欠損用の上流及び下流域の相同配列断片（それぞれ、上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片という）を取得した。
次に上記の各遺伝子の上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片、及びHindIIIで切断したpKD3を鋳型に、sdaA遺伝子欠損用ＤＮＡ断片では配列番号２４及び２７で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして、sdaC-sdaB遺伝子欠損用ＤＮＡ断片では配列番号２８及び３１で用いた表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして、glyA遺伝子欠損用ＤＮＡ断片では配列番号３２及び３５で用いた表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして、クロスオーバーＰＣＲ法 [J. Bacteriol., 179, 6228-6237 (1997)]により、中心部にpKD3のクロラムフェニコール耐性遺伝子部分が挿入し、３つのＤＮＡ断片が連結したＤＮＡ断片（sdaA、sdaB、sdaC及びglyA各遺伝子欠損用ＤＮＡ断片）を取得した。
（２）sdaA遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリの作製
エシェリヒア・コリATCC9637株をpKD46で形質転換し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリATCC9637/pKD46と命名した。
10mmol/LのL-アラビノースと50μg/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリATCC9637/pKD46に、エレクトロポレーション法により上記で取得したsdaA遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を導入し、クロラムフェニコール耐性を指標にしてエシェリヒア・コリATCC9637/pKD46の染色体ＤＮＡ上に該ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換体（該形質転換体をエシェリヒア・コリATCC9637/pKD46 sdaA::catと命名した）を選択した。
エシェリヒア・コリATCC9637株をpKD46で形質転換し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリATCC9637/pKD46と命名した。
10mmol/LのL-アラビノースと50μg/mlのアンピシリンの存在下で培養して得られたエシェリヒア・コリATCC9637/pKD46に、エレクトロポレーション法により上記で取得したsdaA遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を導入し、クロラムフェニコール耐性を指標にしてエシェリヒア・コリATCC9637/pKD46の染色体ＤＮＡ上に該ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換体（該形質転換体をエシェリヒア・コリATCC9637/pKD46 sdaA::catと命名した）を選択した。
エシェリヒア・コリATCC9637/pKD46 sdaA::catを、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地［LB培地[10g/l バクトトリプトン（ディフコ社製）、5g/l イーストエキス（ディフコ社製）、5g/l 塩化ナトリウム]に1.5%の寒天を加えたもの］に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地、及び100mg/lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして37℃で培養し、クロラムフェニコール耐性かつアンピシリン感受性を指標にしてpKD46が脱落した株（エシェリヒア・コリATCC9637 sdaA::cat）を選択した。
次にエシェリヒア・コリATCC9637 sdaA::catをpCP20を用いて形質転換し、pCP20を保持する株（エシェリヒア・コリATCC9637/pCP20 sdaA::cat）を取得した。
エシェリヒア・コリATCC9637/pCP20 sdaA::catを薬剤無添加のLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加LB寒天培地、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地及び100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして、30℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示す株を数株選択した。
エシェリヒア・コリATCC9637/pCP20 sdaA::catを薬剤無添加のLB寒天培地に植菌し、42℃で14時間培養した後、単コロニー分離した。得られた各コロニーを薬剤無添加LB寒天培地、25mg/Lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地及び100mg/Lのアンピシリンを含むLB寒天培地にレプリカして、30℃で培養し、クロラムフェニコール感受性かつアンピシリン感受性を示す株を数株選択した。
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを調製し、染色体ＤＮＡ上において、sdaA遺伝子の外側に位置するＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したＤＮＡをプライマーセットとして用い、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行った。ＰＣＲは、0.1gの染色体ＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5units のPfu DNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×１０緩衝液、200μmol/L の各deoxyNTPを含む40μLの反応液を用い、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。
上記ＰＣＲにより染色体ＤＮＡよりsdaA遺伝子が欠損したことが確認できた株を、エシェリヒア・コリATCC9637sdaA株と命名した。
上記ＰＣＲにより染色体ＤＮＡよりsdaA遺伝子が欠損したことが確認できた株を、エシェリヒア・コリATCC9637sdaA株と命名した。
（３）sdaA、sdaB、sdaC及びglyA各遺伝子が多重欠損したエシェリヒア・コリの作製
（２）で得られたATCC9637sdaA株について、（１）で取得したsdaC-sdaB又はglyA 遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて（２）で行った方法を繰り返すことにより、さらにsdaC、sdaB及びglyA遺伝子が欠損した株を作製した。
（２）で得られたATCC9637sdaA株について、（１）で取得したsdaC-sdaB又はglyA 遺伝子欠損用クロラムフェニコール耐性遺伝子断片を用いて（２）で行った方法を繰り返すことにより、さらにsdaC、sdaB及びglyA遺伝子が欠損した株を作製した。
上記方法により、各々の遺伝子欠損株が取得されたことは、上記（２）と同様、選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを調製し、染色体ＤＮＡ上において、sdaC-sdaB又はglyA遺伝子の外側に位置するＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したＤＮＡをプライマーセットとして用い、染色体ＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより確認した。
上記によりsdaA、sdaC-sdaB及びglyAの各遺伝子の多重遺伝子欠損株であると確認された株を、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCglyA株と名付けた。
上記によりsdaA、sdaC-sdaB及びglyAの各遺伝子の多重遺伝子欠損株であると確認された株を、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCglyA株と名付けた。
［３］エシェリヒア・コリ由来の脱感作型pheA遺伝子及び脱感作型aroF遺伝子発現プラスミドの構築
（１）脱感作型pheA遺伝子発現プラスミドの造成
フェニルアラニンアナログ耐性変異導入により得られたフェニルアラニンの脱感作型pheA遺伝子を発現するプラスミドpE pheA 22（特開昭61-260892）から脱感作型pheA遺伝子を、チロシン耐性変異導入により得られたチロシンの脱感作型aroF遺伝子を発現するプラスミドpE aroF 18（特開昭62-65691）から脱感作型aroF遺伝子を取得し、以下の方法により発現プラスミドを構築した。
（１）脱感作型pheA遺伝子発現プラスミドの造成
フェニルアラニンアナログ耐性変異導入により得られたフェニルアラニンの脱感作型pheA遺伝子を発現するプラスミドpE pheA 22（特開昭61-260892）から脱感作型pheA遺伝子を、チロシン耐性変異導入により得られたチロシンの脱感作型aroF遺伝子を発現するプラスミドpE aroF 18（特開昭62-65691）から脱感作型aroF遺伝子を取得し、以下の方法により発現プラスミドを構築した。
配列番号３６及び配列番号３７で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをプライマーセットとし、プラスミドpE pheA 22を鋳型として、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは、10ngのプラスミドＤＮＡ、0.5μmol/Lの各プライマー、2.5 unitsのPfu DNAポリメラーゼ、4μLのPfu DNAポリメラーゼ用×10緩衝液、200μmol/L の各dNTPを含む反応液40μLを調製し、94℃で1分間、55℃で2分間、72℃で3分間からなる工程を30回繰り返すことにより行った。
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、pheA遺伝子断片に相当する約1.1kbの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離し、得られたＤＮＡの沈殿を20μLのTEに溶解した。
該溶解液5μLを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ClaI及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキットにより、pheA遺伝子を含む1.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30 0.2μgを制限酵素ClaI及びBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により4.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、pheA遺伝子断片に相当する約1.1kbの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離し、得られたＤＮＡの沈殿を20μLのTEに溶解した。
該溶解液5μLを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ClaI及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキットにより、pheA遺伝子を含む1.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
trpプロモーターを含む発現ベクターpTrS30 0.2μgを制限酵素ClaI及びBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により4.6kbのＤＮＡ断片を回収した。
上記で得られたpheA遺伝子を含む1.1kbのＤＮＡ断片と4.6kbのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、16℃で16時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ NM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、該形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、脱感作型pheA遺伝子発現プラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをpPHEA1と命名した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ NM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、該形質転換体を50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出して、脱感作型pheA遺伝子発現プラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをpPHEA1と命名した。
（２）脱感作型pheA遺伝子及び脱感作型aroF遺伝子発現プラスミドの構築
配列番号３８及び配列番号３９で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、プラスミドpE aroF 18を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、上記（１）と同様の反応液組成及び反応条件により行った。
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、aroF遺伝子断片に相当する約1.1kbの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を20μLのTEに溶解した。
該溶解液5μLを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素BglII及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキットにより、脱感作型aroF遺伝子を含む1.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
次に上記（１）で取得した脱感作型pheA遺伝子発現プラスミドpPHEA1 0.2μgを制限酵素BamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により5.7kbのＤＮＡ断片を回収した。該5.7kbのＤＮＡ断片の末端脱リン酸化を、60℃で30分間、アルカリホスファターゼ処理することにより行った。反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルムを添加、混合して遠心分離した後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を20μLのTEに溶解した。
配列番号３８及び配列番号３９で表される塩基配列を有する合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、プラスミドpE aroF 18を鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、上記（１）と同様の反応液組成及び反応条件により行った。
該反応液の1/10量をアガロースゲル電気泳動し、aroF遺伝子断片に相当する約1.1kbの断片が増幅していることを確認後、残りの反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルムを添加し、混合した。該混合液を遠心分離後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を20μLのTEに溶解した。
該溶解液5μLを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素BglII及びBamHIで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンIIキットにより、脱感作型aroF遺伝子を含む1.1kbのＤＮＡ断片を回収した。
次に上記（１）で取得した脱感作型pheA遺伝子発現プラスミドpPHEA1 0.2μgを制限酵素BamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により5.7kbのＤＮＡ断片を回収した。該5.7kbのＤＮＡ断片の末端脱リン酸化を、60℃で30分間、アルカリホスファターゼ処理することにより行った。反応液と等量のTE飽和フェノール/クロロホルムを添加、混合して遠心分離した後、得られた上層に２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、-80℃に30分間放置した。該溶液を遠心分離して得られたＤＮＡの沈殿を20μLのTEに溶解した。
上記で得られた脱感作型aroF遺伝子を含む1.1kbのＤＮＡ断片とアルカリホスファターゼ処理した5.7kbのＤＮＡ断片とをライゲーションキットを用いて、16℃で16時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ NM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリ NM522株をカルシウムイオンを用いる方法によって形質転換した後、50μg/mLのアンピシリンを含むLB寒天培地に塗布して、30℃で一晩培養した。
生育してきた形質転換体のコロニーから公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、脱感作型aroF遺伝子が脱感作型pheA遺伝子と順向きに挿入された脱感作型aroF遺伝子及び脱感作型pheA 遺伝子発現プラスミドが取得されていることを制限酵素消化により確認し、該プラスミドをpBpheAfbraroFfbrと命名した。
［４］セリン分解及び取り込み系sdaA、sdaB、sdaC遺伝子が欠損し、染色体に脱感作型cysE遺伝子が置換された微生物の作製
（１）cysE遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片と脱感作型cysE遺伝子置換用遺伝子断片のクローニング
cysE遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４０及び４１、並びに配列番号４２及び４３で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれ用いて、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として［２］（１）と同条件でＰＣＲをそれぞれ行った。該ＰＣＲにより、目的とするcysE遺伝子欠損用の上流及び下流域の相同配列断片（それぞれ、上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片という）を取得した。
（１）cysE遺伝子欠損用薬剤耐性遺伝子断片と脱感作型cysE遺伝子置換用遺伝子断片のクローニング
cysE遺伝子欠損用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４０及び４１、並びに配列番号４２及び４３で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれ用いて、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として［２］（１）と同条件でＰＣＲをそれぞれ行った。該ＰＣＲにより、目的とするcysE遺伝子欠損用の上流及び下流域の相同配列断片（それぞれ、上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片という）を取得した。
また、脱感作型cysE遺伝子置換用ＤＮＡ断片増幅用プライマーセットとして配列番号４０及び４４で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡ、並びに配列番号４３及び４５で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型として上記と同様にでＰＣＲを行い、脱感作型cysE置換用の上流及び下流域の相同配列断片（それぞれ、置換上流ＤＮＡ断片、置換下流ＤＮＡ断片という）を取得した。
次にcysE遺伝子欠損用ＤＮＡ断片取得のために、上記で取得したcysE遺伝子欠損用の上流ＤＮＡ断片、下流ＤＮＡ断片、及びHindIIIで切断したpKD3を鋳型に、配列番号４０及び４３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットにクロスオーバーＰＣＲ法により、中心部にpKD3のクロラムフェニコール耐性遺伝子部分が挿入し、３つのＤＮＡ断片が連結したＤＮＡ断片を取得した。
また脱感作型cysE遺伝子置換用ＤＮＡ断片取得のために、上記の置換上流ＤＮＡ断片、置換下流ＤＮＡ断片を鋳型に、配列番号４０及び４３で表される塩基配列からなるＤＮＡをプライマーセットにクロスオーバーＰＣＲ法により、cysE遺伝子上に脱感作型の変異を含む2つのＤＮＡ断片が連結したＤＮＡ断片を取得した。
（２）脱感作型cysE遺伝子に置換されたエシェリヒア・コリの作製
［２］（３）で得られたsdaA、sdaB、sdaCの各遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリATCC9637sdaABC株をpKD46で形質転換し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリATCC9637sdaABC/pKD46と命名した。
［２］（２）と同様の方法で、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABC/pKD46の染色体ＤＮＡ上に上記（１）のcysE遺伝子欠損用ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換体（エシェリヒア・コリATCC9637sdaABC/pKD46 cysE::cat）を選択し、その後クロラムフェニコール耐性遺伝子の脱落した株を選択した。
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを調製し、染色体ＤＮＡ上において、cysE遺伝子の外側に位置するＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したＤＮＡをプライマーセットとして用い、［２］（２）同様のＰＣＲを行った。
上記ＰＣＲにおいて、cysE遺伝子を含まない、短い増幅断片を与えた株をcysE遺伝子欠損株とし、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE1株と命名した。
［２］（３）で得られたsdaA、sdaB、sdaCの各遺伝子が欠損したエシェリヒア・コリATCC9637sdaABC株をpKD46で形質転換し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリATCC9637sdaABC/pKD46と命名した。
［２］（２）と同様の方法で、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABC/pKD46の染色体ＤＮＡ上に上記（１）のcysE遺伝子欠損用ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換体（エシェリヒア・コリATCC9637sdaABC/pKD46 cysE::cat）を選択し、その後クロラムフェニコール耐性遺伝子の脱落した株を選択した。
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを調製し、染色体ＤＮＡ上において、cysE遺伝子の外側に位置するＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したＤＮＡをプライマーセットとして用い、［２］（２）同様のＰＣＲを行った。
上記ＰＣＲにおいて、cysE遺伝子を含まない、短い増幅断片を与えた株をcysE遺伝子欠損株とし、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE1株と命名した。
次に、脱感作型cysE遺伝子の染色体上での置換を行った。
上記のエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE1株をpKD46で形質転換し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE1/pKD46と命名した。
［２］（２）と同様の方法で、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE1/pKD46の染色体ＤＮＡ上に上記（１）の脱感作型cysE遺伝子置換用ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換体をM9＋グルコース最小寒天培地[6g/L リン酸水素二ナトリウム、3g/L リン酸二水素カリウム、0.5g/L 塩化ナトリウム、1g/L 塩化アンモニウム、2g/L グルコース、1mM硫酸マグネシウム・７水和物、0.1mM 塩化カルシウム・２水和物、10mg/l ビタミンB1、寒天15g/L、そのうちグルコース、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、ビタミンB1は個別滅菌し添加した]上での生育で選択した。
上記のエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE1株をpKD46で形質転換し、得られた形質転換体をエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE1/pKD46と命名した。
［２］（２）と同様の方法で、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE1/pKD46の染色体ＤＮＡ上に上記（１）の脱感作型cysE遺伝子置換用ＤＮＡ断片が相同組換えにより組込まれた形質転換体をM9＋グルコース最小寒天培地[6g/L リン酸水素二ナトリウム、3g/L リン酸二水素カリウム、0.5g/L 塩化ナトリウム、1g/L 塩化アンモニウム、2g/L グルコース、1mM硫酸マグネシウム・７水和物、0.1mM 塩化カルシウム・２水和物、10mg/l ビタミンB1、寒天15g/L、そのうちグルコース、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、ビタミンB1は個別滅菌し添加した]上での生育で選択した。
上記で選択した各株からそれぞれ染色体ＤＮＡを調製し、染色体ＤＮＡ上において、cysE遺伝子の外側に位置するＤＮＡの塩基配列に基づいて設計したＤＮＡをプライマーセットとして用い、［２］（２）と同様のＰＣＲを行った。
上記ＰＣＲにおいてcysE遺伝子を含むＤＮＡ断片が増幅されたことにより、脱感作型cysE遺伝子置換株が取得されたことを確認し、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256株と命名した。
上記ＰＣＲにおいてcysE遺伝子を含むＤＮＡ断片が増幅されたことにより、脱感作型cysE遺伝子置換株が取得されたことを確認し、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256株と命名した。
［５］ エシェリヒア・コリ由来の脱感作型cysE遺伝子発現プラスミドの構築
［４］で得られたエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256株をLB培地に植菌し30℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
配列番号４６及び４７で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、鋳型として上記の染色体ＤＮＡを用いて、［１］と同様の条件及び反応液組成でＰＣＲを行った。
上記ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片、及びpTrs30をそれぞれHindIII及びBamHIで消化した後、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて両ＤＮＡを連結し、連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出した。
以上の方法でtrpプロモーター下流に脱感作型cysE遺伝子が連結された発現ベクターを造成し、pScysEfbr1と命名した。
［４］で得られたエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256株をLB培地に植菌し30℃で一晩静置培養した。培養後、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の飽和フェノールを用いる方法により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
配列番号４６及び４７で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、鋳型として上記の染色体ＤＮＡを用いて、［１］と同様の条件及び反応液組成でＰＣＲを行った。
上記ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片、及びpTrs30をそれぞれHindIII及びBamHIで消化した後、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて両ＤＮＡを連結し、連結体ＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを抽出した。
以上の方法でtrpプロモーター下流に脱感作型cysE遺伝子が連結された発現ベクターを造成し、pScysEfbr1と命名した。
以下、本発明の実施例を示すが、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１）norM遺伝子発現プラスミドの造成
エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、鋳型として0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.3μmol/Lの各プライマー、1 unitsのKOD-plus- DNAポリメラーゼ(東洋紡製)、5μLのKOD-plus- DNAポリメラーゼ用×10緩衝液(東洋紡製)、100μmol/LのMgSO4、各200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTP及びdTTP）を含む反応液50μLを調製し、94℃で15秒間、55℃で30秒間、68℃で2分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
約1.4kbのＤＮＡ断片が増幅したことを確認し、該ＤＮＡ断片を常法に従って精製した。
該ＤＮＡ断片及び発現ベクターpTrs30〔大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製可能〕をそれぞれHindIII、BamHIで切断し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、GENECLEAN II kit（BIO 101 社製）を用いて、制限酵素消化ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
回収して得られた約1.4kbのＤＮＡ断片及びpTrs30の制限酵素消化断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
連結後のＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（東洋紡製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体より公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、得られたプラスミドが、発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター下流に、配列番号１で表される塩基配列からなるnorM遺伝子が挿入された構造を有していることを確認した。当該プラスミドをpTrs30-norMと命名した。
プラスミドpTrs30-norM及び発現ベクターpSTV29（タカラバイオ社製）をそれぞれEcoRI、BamHIで切断し、上記と同様の方法により連結し、pSTV29に、trpプロモーター及びnorM遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドをpSnorMと命名した。
（１）norM遺伝子発現プラスミドの造成
エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号９及び１０で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、鋳型として0.1μgの染色体ＤＮＡ、0.3μmol/Lの各プライマー、1 unitsのKOD-plus- DNAポリメラーゼ(東洋紡製)、5μLのKOD-plus- DNAポリメラーゼ用×10緩衝液(東洋紡製)、100μmol/LのMgSO4、各200μmol/LのdNTP（dATP、dGTP、dCTP及びdTTP）を含む反応液50μLを調製し、94℃で15秒間、55℃で30秒間、68℃で2分間の工程を30回繰り返すことにより行った。
約1.4kbのＤＮＡ断片が増幅したことを確認し、該ＤＮＡ断片を常法に従って精製した。
該ＤＮＡ断片及び発現ベクターpTrs30〔大腸菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)より調製可能〕をそれぞれHindIII、BamHIで切断し、アガロース電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、GENECLEAN II kit（BIO 101 社製）を用いて、制限酵素消化ＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
回収して得られた約1.4kbのＤＮＡ断片及びpTrs30の制限酵素消化断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。
連結後のＤＮＡを用いてエシェリヒア・コリ DH5α株（東洋紡製）を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。
選択した形質転換体より公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析し、得られたプラスミドが、発現ベクターpTrS30のtrpプロモーター下流に、配列番号１で表される塩基配列からなるnorM遺伝子が挿入された構造を有していることを確認した。当該プラスミドをpTrs30-norMと命名した。
プラスミドpTrs30-norM及び発現ベクターpSTV29（タカラバイオ社製）をそれぞれEcoRI、BamHIで切断し、上記と同様の方法により連結し、pSTV29に、trpプロモーター及びnorM遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドをpSnorMと命名した。
（２）emrD遺伝子発現プラスミドの造成
（１）と同様の反応液組成及び反応条件により、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片及びpTrs30をそれぞれHindIII及びSacIで消化した後、（１）と同様の方法でpTrs30のtrpプロモーター下流に配列番号３で表される塩基配列からなるemrD遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを取得した。この得られたプラスミドＤＮＡをpTrs30-emrDと命名した。
上記で得られたpTrs30-emrD及びpSTV29をそれぞれEcoRI及びSacIで消化した後、（１）と同様の方法でpSTV29に、trpプロモーター及びemrD遺伝子が連結されたプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡをpSemrDと命名した。
（１）と同様の反応液組成及び反応条件により、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１１及び１２で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片及びpTrs30をそれぞれHindIII及びSacIで消化した後、（１）と同様の方法でpTrs30のtrpプロモーター下流に配列番号３で表される塩基配列からなるemrD遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを取得した。この得られたプラスミドＤＮＡをpTrs30-emrDと命名した。
上記で得られたpTrs30-emrD及びpSTV29をそれぞれEcoRI及びSacIで消化した後、（１）と同様の方法でpSTV29に、trpプロモーター及びemrD遺伝子が連結されたプラスミドＤＮＡを調製した。得られたプラスミドＤＮＡをpSemrDと命名した。
（３）rarD遺伝子発現プラスミドの造成
（１）と同様の反応液組成及び反応条件により、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片、及びpTrs30をそれぞれHindIII及びBamHIで消化した後、（１）と同様の方法でpTrs30のtrpプロモーター下流に配列番号５で表される塩基配列からなるrarD遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製し、これをpTrs30-rarDと命名した。
上記で得られたpTrs30-rarD及びpSTV29をそれぞれEcoRI及びBamHIで消化した後、（１）と同様の方法でpSTV29に、trpプロモーター及びrarD遺伝子が連結されたプラスミドＤＮＡを造成し、これをpSrarDと命名した。
（１）と同様の反応液組成及び反応条件により、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１３及び１４で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片、及びpTrs30をそれぞれHindIII及びBamHIで消化した後、（１）と同様の方法でpTrs30のtrpプロモーター下流に配列番号５で表される塩基配列からなるrarD遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製し、これをpTrs30-rarDと命名した。
上記で得られたpTrs30-rarD及びpSTV29をそれぞれEcoRI及びBamHIで消化した後、（１）と同様の方法でpSTV29に、trpプロモーター及びrarD遺伝子が連結されたプラスミドＤＮＡを造成し、これをpSrarDと命名した。
（４）eamA遺伝子発現プラスミドの造成
（１）と同様の反応液組成及び反応条件により、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片及びpTrs30をそれぞれHindIII及びBamHIで消化した後、（１）と同様の方法でpTrs30のtrpプロモーター下流に配列番号７で表される塩基配列からなるeamA遺伝子が挿入された構造を有するプラスミド調製し、これをpTrs30-eamAと命名した。
上記で得られたpTrs30-eamA及びpSTV29をそれぞれEcoRI及びBamHIで消化した後、（１）と同様の方法で、pSTV29にtrpプロモーター及びeamA遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製し、これをpSeamAと命名した。
（１）と同様の反応液組成及び反応条件により、エシェリヒア・コリW3110株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１５及び１６で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＲで得られた増幅ＤＮＡ断片及びpTrs30をそれぞれHindIII及びBamHIで消化した後、（１）と同様の方法でpTrs30のtrpプロモーター下流に配列番号７で表される塩基配列からなるeamA遺伝子が挿入された構造を有するプラスミド調製し、これをpTrs30-eamAと命名した。
上記で得られたpTrs30-eamA及びpSTV29をそれぞれEcoRI及びBamHIで消化した後、（１）と同様の方法で、pSTV29にtrpプロモーター及びeamA遺伝子が挿入された構造を有するプラスミドＤＮＡを調製し、これをpSeamAと命名した。
実施例２．Ｌ−セリン（L-Ser）の生産
アミノ酸生産株の作製［２］で得られたATCC9637sdaABCglyA株に同［１］で得られたpSserAfbr2を形質転換し、Ｌ−セリン生合成中間体（3-phospho-hydroxy-pyruvate）合成酵素活性を有する蛋白質を生産する能力を有するエシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2を取得した。
次に同［１］で得られたpSnorM、pSemrD、pSrarD、pSeamA及びpSTV29を用いて、エシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2をそれぞれ形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれエシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSnorM、ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSemrD、ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSrarD、ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSeamA及びATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSTV29を取得した。
アミノ酸生産株の作製［２］で得られたATCC9637sdaABCglyA株に同［１］で得られたpSserAfbr2を形質転換し、Ｌ−セリン生合成中間体（3-phospho-hydroxy-pyruvate）合成酵素活性を有する蛋白質を生産する能力を有するエシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2を取得した。
次に同［１］で得られたpSnorM、pSemrD、pSrarD、pSeamA及びpSTV29を用いて、エシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2をそれぞれ形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれエシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSnorM、ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSemrD、ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSrarD、ATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSeamA及びATCC9637sdaABCglyA/pSserAfbr2/pSTV29を取得した。
上記で得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む培地A[10g/L トリプトン(ディフコ)、5g/L Yeast extract(ディフコ)、5g/L塩化ナトリウム、1g/L リン酸二水素カリウム、3g/L リン酸水素二カリウム]が5ml入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養した。
該培養液を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む培地B［0.72g/L Yeast extract、14.4g/L 硫酸アンモニウム、1.8g/L硫酸マグネシウム・７水和物、72mg/L 塩化カルシウム、100μg/L ビタミンB1、21.6mg/L 硫酸鉄・7水和物、7.2mg/L 硫酸マンガン、1.4mg/L 硫酸銅、3.6mg/L 硫酸亜鉛、1.4mg/L 塩化ニッケル、1.4mg/L 塩化コバルト、21.6mg/L パントテン酸カルシウム、14.4mg/L ニコチン酸、36mg/L チアミン、14.4mg/L ピリドキシン塩酸塩、72mg/L グリシン、21g/L 炭酸カルシウム、48g/L グルコース、0.56g/L リン酸二水素カリウム、2.88g/L リン酸水素二カリウム、0.6g/Lリン酸水素二ナトリウム、pH無調製、グルコース、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムは別個に蒸煮後添加した］が5ml入っている試験管に10％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表１に示す。
該培養液を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む培地B［0.72g/L Yeast extract、14.4g/L 硫酸アンモニウム、1.8g/L硫酸マグネシウム・７水和物、72mg/L 塩化カルシウム、100μg/L ビタミンB1、21.6mg/L 硫酸鉄・7水和物、7.2mg/L 硫酸マンガン、1.4mg/L 硫酸銅、3.6mg/L 硫酸亜鉛、1.4mg/L 塩化ニッケル、1.4mg/L 塩化コバルト、21.6mg/L パントテン酸カルシウム、14.4mg/L ニコチン酸、36mg/L チアミン、14.4mg/L ピリドキシン塩酸塩、72mg/L グリシン、21g/L 炭酸カルシウム、48g/L グルコース、0.56g/L リン酸二水素カリウム、2.88g/L リン酸水素二カリウム、0.6g/Lリン酸水素二ナトリウム、pH無調製、グルコース、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムは別個に蒸煮後添加した］が5ml入っている試験管に10％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表１に示す。
表１に示した通り、norM遺伝子（配列番号１で表される。以下、配列番号のみで記す）、emrD遺伝子（配列番号３）、rarD遺伝子（配列番号５）、又はeamA遺伝子（配列番号７）の各遺伝子配列をそれぞれ有する発現プラスミドを導入し、それぞれnorM蛋白質（配列番号２）、emerD蛋白質（配列番号４）、rarD蛋白質（配列番号６）又はeamA蛋白質（配列番号８）の発現量を増加させた結果、いずれの場合も、培地中のＬ−セリンの蓄積量が増加した。
実施例３．L-グルタミン（L-Gln）の生産
Ｌ−グルタミン生産株として公知のJGLE1株（国際公開06/001380号パンフレット、米国公開公報2008-0038786号パンフレット）を、アミノ酸生産菌の作製［１］で得られたpSnorM、pSrarD及びpSTV29でそれぞれ形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれエシェリヒア・コリ JGLE1/pSnorM、JGLE1/pSrarD及びJGLE1/pSTV29と命名した。
Ｌ−グルタミン生産株として公知のJGLE1株（国際公開06/001380号パンフレット、米国公開公報2008-0038786号パンフレット）を、アミノ酸生産菌の作製［１］で得られたpSnorM、pSrarD及びpSTV29でそれぞれ形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれエシェリヒア・コリ JGLE1/pSnorM、JGLE1/pSrarD及びJGLE1/pSTV29と命名した。
上記で得られた形質転換体を20μg/mlのクロラムフェニコールを含む8mlのＬＢ培地が入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養した。
該培養液を20μg/mlのクロラムフェニコールを含む培地C［16g/L リン酸水素二カリウム、14g/L リン酸二水素カリウム、2g/L 硫酸アンモニウム、1g/L クエン酸（無水）、1g/L カザミノ酸（ディフコ社製）、10g/L グルコース、10mg/L ビタミンB1、2g/L 硫酸マグネシウム・７水和物、10mg/L 硫酸マンガン・5水和物、50mg/L 硫酸鉄・7水和物、100mg/L L-プロリン、pH7.2に10mol/Lの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンB1、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸マンガン・5水和物、硫酸鉄・７水和物、L-プロリンは別個に蒸煮後添加した］が8ml入っている試験管に１％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表２に示す。
該培養液を20μg/mlのクロラムフェニコールを含む培地C［16g/L リン酸水素二カリウム、14g/L リン酸二水素カリウム、2g/L 硫酸アンモニウム、1g/L クエン酸（無水）、1g/L カザミノ酸（ディフコ社製）、10g/L グルコース、10mg/L ビタミンB1、2g/L 硫酸マグネシウム・７水和物、10mg/L 硫酸マンガン・5水和物、50mg/L 硫酸鉄・7水和物、100mg/L L-プロリン、pH7.2に10mol/Lの水酸化ナトリウムで調整、グルコース、ビタミンB1、硫酸マグネシウム・７水和物、硫酸マンガン・5水和物、硫酸鉄・７水和物、L-プロリンは別個に蒸煮後添加した］が8ml入っている試験管に１％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表２に示す。
表２に示した通り、norM遺伝子（配列番号１）、又はrarD遺伝子（配列番号５）の各遺伝子配列をそれぞれ有する発現プラスミドを導入し、それぞれnorM蛋白質（配列番号２）又はrarD蛋白質（配列番号６）の発現量を増加させた結果、いずれの場合も培地中のＬ−グルタミンの蓄積量が増加した。
実施例４．Ｌ−システイン（L-Cys）の生産
アミノ酸生産菌の作製［４］で得られた、Ｌ−セリン分解酵素（sdaA、sdaB）及び取り込み系（sdaC）を欠損し、かつ染色体ＤＮＡ上のcysE遺伝子が脱感作型cysE遺伝子に置換された、Ｌ−システイン脱感作型cysE遺伝子発現プラスミドを有するエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256株を、同［５］で得られたpScysEfbr1で形質転換し、Ｌ−システイン生合成中間体（O-acetyl-L-serine）の合成酵素を生産する能力を有する菌株、エシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCcysE256/pScysEfbr1を取得した。
アミノ酸生産菌の作製［４］で得られた、Ｌ−セリン分解酵素（sdaA、sdaB）及び取り込み系（sdaC）を欠損し、かつ染色体ＤＮＡ上のcysE遺伝子が脱感作型cysE遺伝子に置換された、Ｌ−システイン脱感作型cysE遺伝子発現プラスミドを有するエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256株を、同［５］で得られたpScysEfbr1で形質転換し、Ｌ−システイン生合成中間体（O-acetyl-L-serine）の合成酵素を生産する能力を有する菌株、エシェリヒア・コリ ATCC9637sdaABCcysE256/pScysEfbr1を取得した。
次に実施例１で得られたpSrarD、pSeamA及びpSTV29を用いて、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256/pScysEfbrを形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256/pScysEfbr1/pSrarD、エシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256/pScysEfbr1/pSeamA及びエシェリヒア・コリATCC9637sdaABCcysE256/pScysEfbr1/pSTV29と命名した。
上記で得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、実施例２と同じ培地Aが5ml入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養した。
該培養液を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、培地D［グリシンを含まず、2g/L チオ硫酸を含む以外は、実施例２で使用した培地Bの組成と同じ］が5ml入った試験管に10％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表３に示す。
上記で得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、実施例２と同じ培地Aが5ml入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養した。
該培養液を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、培地D［グリシンを含まず、2g/L チオ硫酸を含む以外は、実施例２で使用した培地Bの組成と同じ］が5ml入った試験管に10％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表３に示す。
表３に示した通り、rarD遺伝子（配列番号５）、又はeamA遺伝子（配列番号７）の各遺伝子配列をそれぞれ有する発現プラスミドを導入し、それぞれrarD蛋白質（配列番号６）又はeamA蛋白質（配列番号８）の発現量を増加させた結果、いずれの場合も培地中のＬ−システインの蓄積量が増加した。
実施例５．Ｌ−スレオニン（L-Thr）の生産
Ｌ−スレオニンを生産する大腸菌株として報告のあるATCC21277株[米国特許3,580,810号]を、実施例１で得られたpSeamA及びpSTV29で形質転換し、得られた形質転換体を、それぞれエシェリヒア・コリATCC21277/pSeamA及びエシェリヒア・コリATCC21277/pSTV29と命名した。
Ｌ−スレオニンを生産する大腸菌株として報告のあるATCC21277株[米国特許3,580,810号]を、実施例１で得られたpSeamA及びpSTV29で形質転換し、得られた形質転換体を、それぞれエシェリヒア・コリATCC21277/pSeamA及びエシェリヒア・コリATCC21277/pSTV29と命名した。
上記で得られた形質転換体を20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、実施例２と同じ培地Aが5ml入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養した。
該培養液を20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、培地E［グリシン、及びyeast extractを含まず、5g/L カザミノ酸を含む以外は、実施例２で使用した培地Bの組成と同じ］が5ml入った試験管に10％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表４に示す。
該培養液を20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、培地E［グリシン、及びyeast extractを含まず、5g/L カザミノ酸を含む以外は、実施例２で使用した培地Bの組成と同じ］が5ml入った試験管に10％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表４に示す。
表４に示した通り、norM遺伝子（配列番号１）の遺伝子配列を有する発現プラスミドを導入し、norM蛋白質（配列番号２）の発現量を強化させた結果、培地中のＬ−スレオニンの蓄積量が増加した。
実施例６．Ｌ−フェニルアラニン（L-Phe）の生産
［３］（２）で作製した、脱感作型aroF遺伝子及び脱感作型pheA遺伝子が順向きに挿入された発現プラスミドpBpheAfbraroFfbrにて、NM522株を形質転換し、Ｌ−フェニアルアラニン合成酵素を生産する形質転換体、エシェリヒア・コリ NM522/pBpheAfbraroFfbrを取得した。
［３］（２）で作製した、脱感作型aroF遺伝子及び脱感作型pheA遺伝子が順向きに挿入された発現プラスミドpBpheAfbraroFfbrにて、NM522株を形質転換し、Ｌ−フェニアルアラニン合成酵素を生産する形質転換体、エシェリヒア・コリ NM522/pBpheAfbraroFfbrを取得した。
次に実施例１で得られたpSemrD、pSrarD及びpTV29を用いて、エシェリヒア・コリNM522/pBpheAfbraroFfbrを形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれエシェリヒア・コリNM522/pBpheAfbraroFfbr/pSemrD、NM522/pBpheAfbraroFfbr/pSrarD及びNM522/pBpheAfbraroFfbr/pSTV29と命名した。
上記で得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、実施例２と同じ培地Aが5ml入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養した。
該培養液を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、培地F［グリシンを含まない事以外は、実施例２で使用した培地Bの組成と同じ］が5ml入った試験管に10％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表５に示す。
上記で得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、実施例２と同じ培地Aが5ml入った太型試験管に接種し、30℃で16時間培養した。
該培養液を100μg/mlのアンピシリン及び20μg/mlのクロラムフェニコールを含む、培地F［グリシンを含まない事以外は、実施例２で使用した培地Bの組成と同じ］が5ml入った試験管に10％接種し、30℃で24 時間培養した後、該培養液を遠心分離して培養上清を取得した。
HPLCを用いて該培養上清中の生成物を分析した。結果を表５に示す。
表５に示した通り、emrD遺伝子（配列番号３）、又はrarD遺伝子（配列番号５）の各遺伝子配列をそれぞれ有する発現プラスミドを導入し、それぞれemerD蛋白質（配列番号４）、又はrarD蛋白質（配列番号６）の発現量を増加させた結果、いずれの場合も培地中のＬ−フェニルアラニンの蓄積量が増加した。
本発明の製造法により、Ｌ−アミノ酸の生産性の高い製造法が確立され、工業的な大量生産が可能になれば、産業上の利用可能性は非常に高い。例えば、Ｌ−セリンは、医薬品分野や化粧品分野において、アミノ酸混合物の原料として、利用価値が高く、Ｌ−グルタミンは、抗アルコール症組成物などの原料となる。また、Ｌ−システインは、化粧品業界で非常に価値の高いアミノ酸であり、Ｌ−スレオニン及びＬ−フェニルアラニンは、それぞれアミノ酸輸液及び健康食品の成分および低カロリー甘味料のアスパルテームの原料として有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００９−０２７８８１（出願日：平成２１年２月９日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
本出願は、日本で出願された特願２００９−０２７８８１（出願日：平成２１年２月９日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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配列番号４４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
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Claims (2)
- Ｌ−セリンまたはＬ−グルタミン輸送活性を有する以下の［１］〜[３]のいずれかに記載の蛋白質の活性が親株より高いエシェリヒア属に属する微生物を、培地に培養し、Ｌ−セリンまたはＬ−グルタミンを生成させ、該Ｌ−セリンまたはＬ−グルタミンを該培地中に蓄積せしめ、次いで該培地中から該Ｌ−セリンまたはＬ−グルタミンを採取することを特徴とする、Ｌ−セリンまたはＬ−グルタミンの製造法。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつＬ−セリンまたはＬ−グルタミン輸送活性を有する蛋白質
［３］配列番号２で表されるアミノ酸配列と９５％以上の同一性があるアミノ酸配列からなり、かつＬ−セリンまたはＬ−グルタミン輸送活性を有する蛋白質 - エシェリヒア属に属する微生物が以下の［１］〜［２］のいずれかに記載のＤＮＡで形質転換されたエシェリヒア属に属する微生物、又は該ＤＮＡの発現調節配列を改変することにより該遺伝子の発現が増強されたエシェリヒア属に属する微生物である、請求項１記載のＬ−セリンまたはＬ−グルタミンの製造法。
［１］請求項１の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ
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