DE10034586A1 - Verfahren zur Herstellung von N-Acetylneuraminsäure-Synthese - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit N-Acetylneuraminsäure-Synthase-Aktivität, insbesondere eines Enzyms der Klassifizierung EC 4.1.3.19 mit N-Acetylneuraminsäure-Synthase-Aktivität aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B, sowie seine Verwendung zur Herstellung von modifizierten Sialinsäuren und deren Strukturanaloga.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit N- Acetylneuraminsäure-Synthase-Aktivität, insbesondere eines Enzyms der Klassifizierung EC 4.1.3.19 mit N-Acetylneuraminsäure-Synthase-Aktivität aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B, sowie seine Verwendung zur Herstellung von modifizierten Sialinsäuren und deren Strukturanaloga.

Sialinsäuren wie z. B. die N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) spielen als Bestand­ teile von Glycoproteinen und Glycolipiden auf Zelloberflächen eine wichtige Rolle bei physiologisch und pathologisch relevanten Erkennungsprozessen, wie u. a. bei Entzündungsvorgängen, bei der Regulation des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung, bei maligner Zellentartung und Metastasierung oder auch als Erkennungsdomäne pathogener Viren und Bakterien, die damit das Immunsystem des Wirtsorganismus unterlaufen (Rosenberg: Biology of the Sialic Acids, Plenum Press: New York 1995; Holzer et al., Glycoconjugate J. 1993, 10, 40-44; Paulson et al., Pure Appl. Chem. 1984, 56, 797-805). Zwei in Bakterien vorkommende Enzymtypen sind bekannt, welche N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) als wichtigste Sialinsäure aus N-Acetylmannosamin (ManNAc) synthetisieren können: die N-Acetylneuraminsäure-Aldolase (NeuA, EC 4.1.3.3) und die N-Acetylneuraminsäure-Synthase (NeuS, EC 4.1.3.19).

Die NeuA, die in vivo für den abbauenden Neu5Ac-Stoffwechsel verantwortlich ist, äquilibriert Neu5Ac mit ManNAc und Pyruvat. NeuA-Enzympräparationen aus Clostridium perfringens und Escherichia coli sind kommerziell erhältlich. Das Enzym wird zur Synthese von Neu5Ac als Vorstufe für antivirale Therapeutika, und von nicht-natürlichen Sialinsäuren verwendet. Um hohen Umsatz zum Produkt zu erzielen, wird in der Regel ein bis zu zehnfacher Überschuß an Pyruvat eingesetzt, der dann allerdings die Produktisolierung mittels Ionenaustauscher erschwert. Die Substratspezifität der Aldolase ist gut untersucht worden, wonach zwar nur Pyruvat als Donor akzeptiert wird, hinsichtlich der Akzeptorsubstrate ist das Enzym allerdings wesentlich flexibler für abweichende Substitution, Konfiguration oder Kettenlänge (zum SdT: Gijsen et al., Chem. Rev. 1996, 96, 443-473; Fessner et al., Top. Curr. Chem. 1996, 184, 97- 194).

Die NeuS verwendet dagegen Phosphoenolpyruvat (PEP) als Methylenkompo­ nente für die Synthesereaktion, weshalb diese Addition durch Freisetzung von anorganischem Phosphat praktisch irreversibel wird und zu vollständigem Umsatz getrieben werden kann. Wegen dieser im Vergleich zur einfachen Aldoladdition mit der NeuA thermodynamisch und kinetisch begünstigten Reaktion ist man an der Gewinnung der N-Acetylneuraminsäure-Synthase stark interessiert. Der Zugang zu größeren Mengen dieses Enzyms verspricht große Vorteile bei der Synthese von N-Acetylneuraminsäure, da sich deren Abtrennung von den nicht verbrauchten Ausgangsstoffen als weitaus einfacher erweisen sollte als bei der Aldolase-Reaktion. Die N-Acetylneuraminsäure- Synthase, die in den humanpathogenen Bakterien E. coli K1 und Neisseria meningitidis vorkommt, ist im Vergleich zur NeuA weitaus weniger gut untersucht. Obwohl ein Enzym bereits 1962 aus Neisserien der Serogruppe C isoliert und zum Teil charakterisiert wurde (Blacklow et al., J. Biol. Chem. 1962, 237, 3520-3526), ist es bis heute nicht gelungen, die Synthase in so großen Mengen zu produzieren, daß sie für präparative Zwecke genutzt werden könnte. Versuche, das Enzym aus E. coli K1 oder dasjenige aus Neisseria meningitidis Serogruppe B auf rekombinantem Weg zu erhalten, lieferten letztlich keine signifikant höheren Expressionsraten als die natürlichen Bakterienstämme (Vann et al., Glycobiology 1997, 7, 697-701; Frosch et al., Polysialic Acid, Birkhäuser Verlag: Basel 1993, 49-57; Edwards et al., Mol. Microbiol. 1994, 14, 141-149; Edwards, Dissertation: Universität Hannover 1993). Eine Übersicht über die verschiedenen Enzymquellen und Expressionssysteme zusammen mit den Werten für die spezifische Aktivität des Rohextrakts und die Aktivität pro Liter Kultur gibt Tabelle 1.

Tabelle 1

Expression bakterieller N-Acetylneuraminsäure-Synthasen (NeuS)

Untersuchungen zur Substratspezifität der Synthase mit bisherigen Enzympräpa­ rationen ergaben, daß außer ManNAc und PEP keine anderen Komponenten als Substrate umgesetzt werden können. Der Austausch von N-Acetyl-D-mannos­ amin gegen N-Acetyl-D-glucosamin, N-Acetyl-D-galactosamin, N-Acetyl-D-man­ nosamin-6-phosphat, D-Mannosamin, D-Glucosamin, D-Mannose, D-Galactose oder D-Glucose, D-Glucose-6-phosphat, D-Ribose, D-Ribose-5-phosphat, D-Erythro­ se, D-Rhamnose, D-Arabinose sowie der von Phosphoenolpyruvat gegen Analoga wie Lactat, 3-Brompyruvat, Oxalacetat, Phosphoglycolat oder Phosphoglycerat führten sowohl bei dem Enzym aus E. coli- als auch bei dem Neisserien-Enzym der Serogruppe C zu negativen Resultaten im Assay (Blacklow et al., J. Biol. Chem. 1962, 237, 3520-3526; Vann et al., Glycobiology 1997, 7, 697-701; Komaki et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997, 61, 2046-2050). Lediglich von N-Acetyl-6- azido-D-mannosamin ist bekannt, daß es von einer aus Neisseria meningitidis Strain 60E (Serogruppe C) isolierten Synthase sowie dem rekombinanten E. coli- Enzym zu der entsprechenden, an C9 Azid-modifizierten Neuraminsäure umgesetzt wird (Brossmer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980, 96, 1282- 1289; Vann et al., Glycobiology 1997, 7, 697-701).

Ziel der Erfindung ist daher ein Produktionsverfahren für eine N-Acetyl­ neuraminsäure-Synthase mit im Vergleich zu den bisher bekannten Enzymen erheblich verbesserter Zugänglichkeit, sowie im Hinblick auf enzymkatalysierte Synthesereaktionen einer signifikant höheren spezifischen Aktivität, deutlich breiteren Substrattoleranz und befriedigender Stabilität. Überraschenderweise wurde gefunden, daß mit Hilfe des erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektors die N-Acetylneuraminsäure-Synthase effizi­ ent produziert werden kann. So ist insbesondere der Expressionsvektor pKKNeuAc_3 nachstehender Sequenz zur Herstellung der N-Acetylneuramin­ säure-Synthase aus Neisseria meningitidis Serogruppe B geeignet.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit

• 1. ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit N-Acetylneuraminsäure- Synthase-(nachfolgend "Synthase" genannt)Aktivität umfassend das Kultivieren eines prokaryotischen Wirtsorganismus, der mit einem Expressionsvektor, der ein die Synthase codierendes Strukturgen enthält, transformiert ist, wobei in dem Expressionsvektor sich das Startcodon des die Synthase codierenden Strukturgens 6 bis 10 Basen stromabwärts einer ribosomalen Bindungsstelle befindet;
• 2. den in (1) definierten Vektor zur Expression eines Proteins mit Synthase- Aktivität;
• 3. Verwendung der durch das Verfahren gemäß (1) erhältlichen Synthase zur Herstellung von strukturanalogen Derivaten der N-Acetylneuraminsäure, wobei strukturanaloge Derivate von N-Acetylmannosamin in Gegenwart der Synthase und Phosphoenolpyruvat zur Reaktion gebracht werden; und
• 4. Derivate der N-Acetylneuraminsäure der Formeln (I)-(IV) wie nachfolgend definiert.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren (1) ist der rekombinante Expressions­ vektor und das für die Synthase kodierende DNA-Fragment so mit der Ribo­ somenbindungssequenz bzw. mit der Promotor- und Ribosomenbindungs­ sequenz kombiniert, daß in einem geeigneten Wirtsorganismus hohe Ausbeuten an Synthase-Aktivität im Zellextrakt (z. B. 3100 U/L Kultur; 520 U/g Zellen) erreicht werden. Die so erzeugte Synthase kann für Anwendungszwecke leicht aufgereinigt werden durch ein zweistufiges Reinigungsverfahren, welches das Enzym in hohr Ausbeute, frei von störenden Nebenaktivitäten und mit hoher spezifischer Aktivität liefert (z. B. 20 U/mg Protein).

In dem erfindungsgemäßen Vektor beträgt der Abstand zwischen der ribosoma­ len Bindungsstelle und dem Startcodon vorzugsweise 8 Basen. Die bevorzugte Sequenz dieser 8 Basen ist vorzugsweise die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Sequenz 5'- GTCAATAA, jedoch auch in 1- bis 3-Positionen modifizierte Analoga dieser Sequenz sind einsetzbar.

Der erfindungsgemäße Vektor kann weiterhin andere funktionelle Sequenzab­ schnitte wie z. B. Promotorsequenzen, Terminatorsequenzen, Resistenzgene und für Sekretionsproteine codierende Sequenzen umfassen. Ein bevorzugter Promotor ist der tac-Promotor.

Das die Synthase kodierende Strukturgen stammt vorzugsweise aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B und codiert besonders bevorzugt das in SEQ ID NO: 4 gezeigte Enzym der Klassifizierung EC 4.1.3.19 mit Synthase-Aktivität bzw. ein Mutein dieses Enzyms. Als "Mutein" im Sinne der vorliegenden Erfindung sind dabei Enzyme zu verstehen, die vergleichbare Aktivität wie der in SEQ ID NO: 4 gezeigte Wildtyp aufweisen, insbesondere Muteine in denen ausgehend vom Wildtyp homologe Aminosäurenaustausche vorgenommen wurden.

Besonders bevorzugt ist, daß der Vektor die in SEQ ID NO: 3 gezeigte Sequenz aufweist.

Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Vektor, der durch

• - Modifizieren des kodierenden Strukturgens siaC mit der SEQ ID NO: 3 aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B mittels PCR-Primern entsprechend der SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2,
• - XmaI- und PstI-Restriktionsverdau des modifizierten Strukturgens und
• - Einfügen des verdauten Strukturgens in die XmaI- und PstI-Schnittstellen des kommerziellen cyclischen Vektors pKK223-3

erhältlich ist. Hierdurch entsteht der besonders bevorzugte Expressionsvektor pKKNeuAc 3 (

Abb.

1). Als Wirtsorganismen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Prokaryoten, insbesondere E. coli besonders bevorzugt.

Der Aspekt (3) der Erfindung betrifft die Verwendung der Synthase für die Herstellung von Neu5Ac aus ManAc und PEP, sowie für die Herstellung von entsprechenden strukturell breit modifizierten Derivaten und Analoga der Neu5Ac. Besonders vorteilhaft kann dieses Verfahren für die Synthese von Sialinsäure-haltigen Glycokonjugaten genutzt werden durch Herstellung der entsprechenden Sialinsäuren, ihre anschließende enzymatische CMP-Aktivie­ rung mit einer CMP-Sialat-Synthetase (EC 2.7.7.43) und ihre Übertragung auf eine geeignete Sialyl-Akzeptorverbindung in Gegenwart einer Sialyltransferase. Daraus resultierende Oligosaccharide und Glycokonjugate, die nicht-natürliche Derivate und Analoga der Sialinsäure enthalten, sind von therapeutischem Interesse wegen ihrer metabolischen Stabilität gegen den Abbau durch Sialidasen, sowie beim Einsatz von fluoreszenzmarkierten Vorstufen für analytisch- diagnostische Zwecke.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Synthase zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) verwendet:

sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon, worin
R¹ für Alkenyl, Alkinyl, Arylmethyl, Arylalkenyl, Halogenmethyl, Alkenyloxy, oder Alkenylamino stehen.

Die Verbindungen der Formel (I) enthalten mehrere Stereozentren. Sie können daher in stereoisomeren Formen existieren, die sich wie Diastereomere verhal­ ten. Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Diastereomere als auch deren jeweilige Mischungen.

Verfahrenstechnisch akzeptable Salze sind solche, die als Gegenion einwertige Kationen wie Alkali- oder Tetraalkylammoniumionen, oder protonierte Stick­ stoffbasen enthalten.

"Alkenyl" als eigener Substituent oder als Teil anderer Reste wie Arylalkenyl, Alkenyloxy oder Alkenylamino bedeutet einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alken- oder Alkadienrest mit bis zu 8, bevorzugt bis zu 4 und besonders bevorzugt bis zu 2 Kohlenstoffatomen, bei Alkenyloxy oder Alkenylamino besonders bevorzugt bis zu 3 Kohlenstoffatomen.

"Alkinyl" steht für einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkinrest mit bis zu 8, bevorzugt bis zu 6 und besonders bevorzugt bis zu 4 Kohlenstoffatomen. "Aryl" als Teil anderer Reste wie Arylmethyl oder Arylalkenyl steht für einen Arylrest mit bis zu 10, bevorzugt bis zu 6 Kohlenstoffatomen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Synthase zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (II) verwendet:

sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon, worin
R¹ bis R³ gleich oder verschieden sein können und für Wasserstoff, Hydroxy, Hydroxymethyl, Alkenyloxymethyl, Alkenyl, Alkanoyloxy, Alkenoyloxy, für ein Alkanoyl-, Alkenoyl-, Benzylcarbonyl-, Carbobenzoxy(Cbz)-, tert-Butyloxy­ carbonyl(Boc)- oder Allyloxycarbonyl(Alloc)-modifiziertes Amin, oder für einen Glycosyloxy- oder Glycosyloxymethylrest stehen.

Die Verbindungen der Formel (II) enthalten mehrere Stereozentren. Sie können daher in stereoisomeren Formen existieren, die sich wie Diastereomere verhal­ ten. Die Erfindung betrifft sowohl die reinen Diastereomere als auch deren jeweilige Mischungen.

Verfahrenstechnisch akzeptable Salze sind solche, die als Gegenion einwertige Kationen wie Alkali- oder Tetraalkylammoniumionen, oder protonierte Stick­ stoffbasen enthalten.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel (II), worin
R¹ und R² für Wasserstoff oder ein Alkanoyl-, Alkenoyl-, Benzylcarbonyl-, Carbo­ benzoxy-, tert-Butyloxycarbonyl- oder Allyloxycarbonyl-modifiziertes Amin stehen, und
R³ für Wasserstoff, Hydroxymethyl, Alkenyl oder für einen Glycosyloxy- oder Glycosyloxymethylrest steht;
sowie Verbindungen der Formel (II), worin
R³ für Hydroxymethyl, Alkenyloxymethyl, Alkenyl, ein Alkanoyl-, Alkenoyl-, Benzylcarbonyl-, Carbobenzoxy-, tert-Butyloxycarbonyl- oder Allyloxycarbonyl­ modifiziertes Amin steht und
R¹ und R² für Wasserstoff oder Hydroxy steht.

"Alkyl" als Teil anderer Reste wie Alkanoyl bedeutet einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alkanrest mit bis zu 8, bevorzugt bis zu 4 und besonders bevorzugt bis zu 2 Kohlenstoffatomen, als Teil von R¹ mit mindestens 3 Kohlenstoffatomen.

"Alkenyl" als eigener Substituent oder als Teil anderer Reste wie Alkenyloxymethyl oder Alkenoyl bedeutet einen geradkettigen oder verzweigtkettigen Alken- oder Alkadienrest mit bis zu 8, bevorzugt bis zu 5 und besonders bevorzugt bis zu 3 Kohlenstoffatomen.

"Glycosyl" als eigener Substituent oder als Teil anderer Reste wie Glycosyloxymethyl steht für einen fünfgliedrigen oder sechsgliedrigen Zuckerrest mit bis zu 9 und besonders bevorzugt bis zu 6 Kohlenstoffatomen, beispielsweise für Glucopyranosyl, Mannopyranosyl, Galactopyranosyl. Einzelne oder mehrere Hydroxygruppen in den Glycosylresten können ausgetauscht sein gegen Wasserstoff, Carboxy oder Alkanoylamino, wie in Rhamnopyranosyl, Fucopyranosyl, 2-Acetylamino-2-desoxyglucopyranosyl, 2-Acetylamino-2- desoxygalactopyranosyl oder Glucuronopyranosyl.

Weiterhin wird die erfindungsgemäße Synthase zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formeln (III) oder (IV) verwendet:

sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon, worin
R¹ für eine fluoreszierende Gruppe steht,
R² für Alkanoylamino, Hydroxy oder Wasserstoff steht,
X für einen Sauerstoff oder eine NH-Gruppe steht und
Sp für eine Valenz oder einen divalenten Rest wie Alkyl, Alkylcarbonyl, Carbamoylalkyl, Carbamoylalkylcarbonyl, (Alkyloxy)_n-alkyl oder (Alkyloxy)_n- alkylcarbonyl steht, wobei n Zahlenwerte von 0 bis 5 annehmen kann.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (III) oder (IV), worin
R¹ für Acridonyl, Dansylamino, Fluoresceinylamino oder Fluoresceinylcarbox­ amido steht,
R² für Wasserstoff, Hydroxy oder Alkanoylamino steht,
X für eine NH-Gruppe steht und
Sp für einen divalenten Rest wie Alkylcarbonyl, Carbamoylalkylcarbonyl oder (Alkyloxy)_n-alkylcarbonyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 1 oder 2 steht,
sowie Verbindungen der Formeln (III) oder (IV), worin
R¹ für Acridonyl, Dansylamino, Fluoresceinylamino oder Fluoresceinylcarbox­ amido steht,
R² für Wasserstoff, Hydroxy oder Alkanoylamino steht,
X für ein Sauerstoffatom steht und
Sp für einen divalenten Rest wie Alkyl, Carbamoylalkyl oder (Alkyloxy)_n-alkyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 1 oder 2 steht.

Die fluoreszierenden Gruppen Acridonyl, Dansylamino, Fluoresceinylamino und Fluoresceinylcarboxamido weisen die folgenden Strukturen (A) bis (D) auf:

Figurenbeschreibung

Abb. 1. Zusammenfassung der Klonierungsstrategie

Abb. 2. Schematische Darstellung der Konstruktion des Expressionsvektors zur Produktion der Synthase durch gerichtete Insertion des mit den Primern NeuAc5/NeuAc3 vervielfältigten DNA-Fragments siaC (Kasten, ATG Startsignal bis TAA Stopcodon; SEQ ID NO: 3) in den Vektor pKK223-3 durch Ligation zwischen die Restriktionsschnittstellen XmaI und PstI stromabwärts vom tac- Promotor (p_tac) und der ribosomalen Bindungsstelle (SD, unterstrichen).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung A. Produktion der Synthase

Die Klonierung der N-Acetylneuraminsäure-Synthase erfolgt nach molekular- biologischen Standardverfahren, die in der Fachliteratur gut dokumentiert sind (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York 1989; Gassen et al., PCR: Grundlagen und Anwendungen der Polymerase-Kettenreaktion, Gustav Fischer Verlag: Stuttgart, Jena, New York 1994; Mullis et al., U. S. Patent 4 683 202, 1987) und problemlos von einschlägig ausgebildeten Fachleuten nachgearbeitet werden können.

Mit Kenntnis der Sequenz (GenBank Accession Number NMM95053; SEQ ID NO: 3) kann das für die erfindungsgemäße N-Acetylneuraminsäure-Synthase kodierende Gen siaC direkt aus der genomischen DNA von Neisseria meningitidis Serogruppe B oder aus einem das siaC-Gen enthaltenden Plasmid (z. B. pMF32.35, Frosch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 1669-1673) vervielfältigt und gezielt in einen geeigneten Expressionsvektor eingebracht werden. Der kommerziell erhältliche Vektor pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Freiburg; GenBank Accession Number M77749) erlaubt die Regelung der Proteinexpression über den tac-Promotor (Brosius et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984, 81, 6929-6933). Dieser Promotor wird über den wirtszelleignen lac- Repressor reguliert und kann durch externe Zugabe von 0.1-5 mM Isopropyl-β-D­ thiogalactopyranosid (IPTG) zum Medium induziert werden. Die Transkription der Fremd-DNA wird durch den starken ribosomalen Terminator rrnB beendet. Darüber hinaus enthält der pKK223-3 ein Ampicillin-Resistenzgen als Selektionsmarker zugunsten plasmidhaltiger Zellen, die auf einem Ampicillin­ haltigen Nährmedium wachsen können. Als Wirtsstämme sind vorzugsweise E. coli-Stämme mit der lac I^q-Mutation wie z. B. E. coli JM105 (Pharmacia Biotech, Freiburg) oder E. coli Sure (Stratagene GmbH, Heidelberg) geeignet, da diese den lac-Repressor im Übermaß produzieren. Zur Expression wird das entsprechende Gen in die unmittelbar dem tac-Promotor und der Ribosomenbindungsstelle benachbarten "multiple cloning site" (MCS) eingebaut, die zuvor mit Hilfe von ortsspezifischen Restriktionsendonucleasen aufgeschnitten wird. Der Abstand des Startcodons des zu exprimierenden Bakterien-Gens von der ribosomalen Bindungsstelle und die Sequenz der Basen sind dabei besonders kritisch (Kozak et al., Microbiol. Rev. 1983, 47, 1; Gold et al., Ann. Rev. Biochem. 1988, 57, 199). Im Falle des erfindungsgemäßen Expressionsvektors pKKNeu5Ac_3 wurden zur Genamplifikation die PCR-Primer NeuAc5 (SEQ ID NO: 1) und NeuAc3 (SEQ ID NO: 2) nachstehender Basensequenz verwendet (Tabelle 2), mit deren Hilfe das siaC-Gen (SEQ ID NO: 3) durch ortsspezifische Mutagenese an den Enden mit einer künstlichen Basensequenz so ergänzt wird, daß in gezielter Position neue Schnittstellen für zwei verschiedene Restriktionsendonucleasen eingeführt werden. Nach PCR-Vervielfältigung der Zielsequenz und enzymatischer Verkürzung der Enden durch XmaI- und PstI-Verdau wird das modifizierte Gen gerichtet zwischen die XmaI und PstI-Schnittstellen der Vektor-MCS eingesetzt (Abb. 1 und 2).

Tabelle 2

Sequenzen der PCR-Primer

Nach Einbringen des Expressionsvektors in eine geeignete Wirtszelle und deren Vermehrung muß die im Zellinnern befindliche N-Acetylneuraminsäure- Synthase durch Zellaufschluß freigesetzt werden. Die Zerstörung der Zellwand kann mit unterschiedlichen Methoden erfolgen, wobei für größere Zellmengen mechanische Methoden wie z. B. Ultraschall, Druckentspannung oder die Naßvermahlung in einer Kugelmühle mit Glasperlen bevorzugt sind. Die resultierenden Enzymmengen bzw. -aktivitäten werden in Unit pro mg Protein angegeben. Ein Unit an N-Acetylneuraminsäure-Synthase-Aktivität katalysiert die Bildung von 1 µmol Neu5Ac aus Phosphoenolpyruvat (PEP) und ManNAc pro Minute bei einer Temperatur von 37°C und einem pH-Wert von 8.0. Die Abtrennung unerwünschter Begleitproteine zur Reinigung des gewünschten Proteins kann nach den verschiedenen physikalischen Eigenschaften wie Ladung, Größe, Hydrophobizität etc. mittels Standardverfahren (Scopes: Protein Purification - Principles and Practice, Springer-Verlag: New York 1994) erfolgen. Mit dem Expressionsvektor pKKNeuAc_3 transformierte Zellen des Wirts­ stamms E. coli JM105 produzieren bei Anwesenheit von 0.5 mM IPTG im Nähr­ medium die erfindungsgemäße N-Acetylneuraminsäure-Synthase in Mengen von ca. 3100 U/L Kultur (520 U/g Zellen).

Nach Zellaufschluß durch Naßvermahlung enthält der Rohextrakt ca. 2.3 U/mg Protein, das durch Anionenaustauschchromatographie an DEAE-Sepharose (Pharmacia Biotech, Freiburg) und selektive Fällung mit Ammoniumsulfat (50- 80% Sättigung) mit einer Gesamtausbeute von 29% leicht auf eine spezifische Aktivität von 20 U/mg Protein gereinigt werden kann.

B. Herstellung von modifizierten Sialinsäuren

N-Acetylneuraminsäure-Synthasen katalysieren die Umsetzung von N-Acetyl­ mannosamin und PEP zu N-Acetylneuraminsäure (5-Acetamido-3,5-didesoxy-β- D-glycero-D-galacto-2-nonulosonsäure) unter Freisetzung von anorganischem Phosphat. Gemäß der Erfindung können bei Verwendung der hier beschriebenen rekombinanten N-Acetylneuraminsäure-Synthase als Substrate ManNAc (N- Acetylmannosamin) und davon abgeleitete Strukturanaloga mit gleicher, größerer oder kleinerer Kettenlänge und mit unterschiedlichen Substituenten an den Kohlenstoffatomen C-2, C-4, C-5 und C-6 eingesetzt werden. Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren können hierzu wahlweise einzelne oder mehrere Positionen durch gleichartige oder verschiedene Substituenten wie beispielsweise OH, Halogen, Azid, OR (R gleich Acyl-, niederkettige Alkyl-, Alkenyl- oder Arylreste), NHR oder NRR' (R gleich Acyl-, niederkettige Alkyl-, Alkenyl- oder Arylreste) ersetzt sein uns sowohl in der natürlichen als auch einer epimeren, nicht der ManNAc entsprechenden natürlichen Konfiguration auftreten. Besonders vorteilhaft sind solche Verbindungen, bei denen an C-2 oder C-4 über O- oder N-Atome kovalent Reste mit Fluoreszenz-Chromophoren oder mit selektiv reaktiven funktionellen Gruppen wie beispielsweise C=C- Doppelbindungen oder Carbonylgruppen angeknüpft sind.

Die Reaktionstemperatur kann zwischen 10°C und 45°C variiert werden. Um hohe Umsatzgeschwindigkeiten bei hinreichender Enzym- und Substratstabilität zu gewährleisten, wird im allgemeinen bei 20°C bis 35°C gearbeitet, besonders vorteilhaft bei 25°C. Der pH-Wert der Reaktionslösung sollte für eine optimale Enzymaktivität bei pH 7.0 bis 9.0, vorzugsweise bei pH 8.0 liegen. Durch Zusatz eines Puffers (z. B. Tris-HCl) kann der gewählte pH-Wert für die Dauer der Reaktion annähernd konstant gehalten werden.

Für die Enzymaktivität der Synthase ist der Zusatz von zweiwertigen Metall­ salzen wie Mn²⁺ oder Mg²⁺ entscheidend. Vorzugsweise wird Manganchlorid in einer Konzentration von 5 bis 10 mM verwendet. Um der Enzyminaktivierung durch Oxidation vorzubeugen, wird unter Zusatz von Thiolen gearbeitet (z. B. Mercaptoethanol, Cystein, Glutathion; vorzugsweise 2.5 mM Dithiothreitol). Neu5Ac und entsprechende strukturanaloge Reaktionsprodukte können vorteil­ haft durch Chromatographie an Formiat-Anionentauscher (AG 1-X8; Bio-Rad Laboratories GmbH, München) aufgereinigt und beispielsweise als freie Säuren oder als Lithiumsalze in fester Form isoliert werden.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Experimente und Beispiele näher erläutert.

Experimente Klonierung der N-Acetylneuraminsäure-Synthase aus N meningitidis

Zur Expressions-Klonierung der N-Acetylneuraminsäure-Synthase wurde das siaC- Gen von Neisseria meningitidis Serogruppe B (B1940) aus dem Plasmid pMF32.35 (Frosch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 1669-1673) als Templat-DNA mit Hilfe der mutagenen PCR-Primer NeuAc3 und NeuAc5 (Tabelle 2) vom Start- bis zum Stopcodon amplifiziert. Für die PCR-Reaktion wurden folgende Reaktionsbedingungen gewählt: 120 sec 95°C, dann Zugabe der Taq-DNA- Polymerase (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim); Denaturierung 60 sec bei 94°C, Annealing 120 sec bei 60°C, Extension 120 sec bei 72°C (+3 sec pro weiterem Zyklus). Nach insgesamt 25 Zyklen wurde noch 5 min bei 72°C inkubiert. Das PCR-Produkt hatte laut Analyse durch DNA-Elektrophorese die erwartete Länge von ca. 1100 bp. Zur Übersicht der Klonierungsstrategie siehe Abb. 1.

Gleichzeitig wurden damit die für den Restriktionsverdau und die anschließende Ligation mit dem Expressionsvektor notwendigen Restriktionsschnittstellen eingeführt. Nach Behandlung mit Proteinase K (Sigma, Deisenhofen; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) zur Zerstörung restlicher Polymerase wurden zur Erzeugung überlappender Enden für die Ligation sowohl das PCR-Produkt als auch der Vektor pKK223-3 (Pharmacia Biotech, Freiburg) mit den Restriktions­ endonucleasen XmaI und PstI (Sigma, Deisenhofen; Promega Corp., USA; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) während einer Inkubationszeit von 2-3 h geschnitten. Für die Ligation wurde der geschnittene Vektor pKK223-3 zuerst mit alkalischer Phosphatase (Promega Corp., USA; Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim) am 5'-Ende dephosphoryliert und ein molares Verhältnis von Vektor zu Insert von ~1 : 3 gewählt. Die Transformation des Ligations­ produkts in den E. coli-Stamm JM105 (Pharmacia Biotech, Freiburg) wurde nach gängigen Standardprotokollen durchgeführt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press: New York 1989). Um eine Selektion zugunsten Plasmid-transformierter Zellen, die das Antibiotikumresistenzgen tragen, zu erreichen, wurden die Zellen zunächst in Vollmedium vorkultiviert und anschließend auf Ampicillinhaltigen LB-Agar­ platten ausgestrichen. Nach etwa 12-16 h wurden 4 zufällig gewählte Einzelklone (∅ = 2-3 mm) isoliert, jeweils in 200 mL LBA-Schüttelkulturen hochgezogen und nach Induktion mit IPTG auf die gewünschte Enzymaktivität hin untersucht. Im Rohextrakt eines der Klone war Synthase-Aktivität im Assay nachweisbar, dieser positive Klon zeigte in der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese auch die erwartete Bande bei ca. 38 kDa. Als Blindprobe wurde der gentechnisch unveränderte Wirtsstamm JM105 herangezogen.

Fermentation

Die Anzucht des Expressionsstammes E. coli JM105/pKKNeuAc_3 erfolgte in 1-L-Erlenmeyerkolben mit 200 mL Medium bei 110 rpm. Das Kultur­ medium hatte folgende Zusammensetzung:
LBA (1 Liter):
10 g Pepton
5 g Hefeextrakt
5 g Natriumchlorid
100 mg Ampicillin

Bei Erreichen einer optischen Dichte OD₆₀₀ von 0.8 wurden die heranwachsenden Zellen durch Zugabe von IPTG (Endkonzentration 0.5 mM) induziert.

Sofern nicht anders angegeben, wurden während der Fermentation folgende Parameter eingehalten:
Drehzahl: 110 rpm
Temperatur: 37°C
Kulturdauer: 8-12 h

Die Zellen wurden am Ende der logarithmischen Wachstumsphase durch 10 min Zentrifugieren bei 8,000 rpm geerntet. Das Feuchtgewicht der Biomasse aus 800 mL Fermentationsvolumen betrug 4.8 g. Der Zellaufschluß erfolgte in einem Zentrifugengefäß durch Ultraschall (Sonopuls GM 70; Fa. Bandelin; 3 × 2 min bei maximaler Geräteleistung).

Die nachfolgend angegebenen Reinigungsschritte wurden bei 4°C mit einem Präparationspuffer folgender Zusammensetzung durchgeführt:
Tris-HCl (pH 7.8): 20 mM
Manganchlorid: 2 mM
Dithiothreitol: 0.02 mM

Zur Aufreinigung des Enzyms wurden eine Ionenaustauschchromatographie und eine fraktionierende Ammoniumsulfatfällung vorgenommen.

Ionenaustauschchromatographie

Der zellfreie Rohextrakt (40 mL) wurde ohne weitere Reinigung direkt mittels einer peristaltischen Pumpe auf eine Säule (14 × 2.5 cm) gepackt mit DEAE-Sepharose Cl-6-B (Pharmacia Biotech, Freiburg) aufgebracht, die zuvor mit Präparationspuffer äquilibriert worden war. Nachdem ein Teil des Fremdproteins durch Spülen mit 0.05 M NaCl-haltigem Präpara­ tionspuffer abgetrennt war, wurde die N-Acetylneuraminsäure-Synthase durch einen linearen NaCl-Salzgradienten von 0.05-0.3 M in Präparationspuffer bei einer Flußrate von 15-20 mL/h eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt und direkt für die Ammoniumsulfatfällung eingesetzt.

Fraktionierende Ammoniumsulfatfällung

54 mL der vorgereinigten Enzym­ lösung wurden bei 4°C unter Rühren mit 16.9 g festem, feingemahlenem Ammoniumsulfat bis zu einer Sättigung der Lösung von 50% versetzt. Nachdem sich alles Salz gelöst hatte, wurde weitere 15 Minuten bei 4°C vorsichtig gerührt, der entstandene Niederschlag 30 Minuten bei 20,000 g und 4°C abzentrifugiert und der Überstand (65 ml) durch Zugabe weiterer 14 g Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 80% eingestellt. Nach erneutem Rühren und Abzentrifugieren wurde der Überstand verworfen und das Proteinpellet in 5 mL Präparationspuffer resuspendiert. Tabelle 3 zeigt eine Übersicht über die Ergebnisse der Aufreinigung.

Tabelle 3

Reinigung der N-Acetylneuraminsäure-Synthase

Molekulargewichtsbestimmung

Eine GPC-Säule (2.5 × 90 cm) wurde mit Sephadex G-150 (Pharmacia Biotech, Freiburg) in 0.1 M NaCl enthaltendem Präparationspuffer gepackt und durch Elution von Dextranblau (2 MDa), Aldolase (161 kDa), BSA (66 kDa) und ATP (605 Da) geeicht. Die Größe der N-Acetyl­ neuraminsäure-Synthase wurde durch einen separaten Elutionslauf einer annähernd homogenen Enzymfraktion bestimmt. Das auf diesem Weg ermittelte Molekulargewicht beträgt ca. 74 kDa und belegt eindeutig, daß das im SDS-Gel mit einer Bande von ca. 38 kDa erscheinende Enzym in aktiver Form als Dimer vorliegt. Der im SDS-Gel bestimmte Wert wiederum entspricht dem Erwar­ tungswert von 38,353 Da, der sich aus der Aminosäuresequenz der Synthase errechnen läßt.

Enzymaktivität und Substrataffinität (K_m-Werte)

Die Aktivität der N-Acetyl­ neuraminsäure-Synthase wurde anhand des stöchiometrisch entstehenden Äquivalents an N-Acetylneuraminsäure bestimmt, die sich über den Thiobar­ bitursäure-Assay quantifizieren läßt (Warren, J. Biol. Chem. 1959, 234, 1971-1975;

Aminoff, Biochem. J. 1961, 81, 384-392). Identische Aktivitätswerte wurden über das bei der Reaktion äquimolar entstehende Phosphat mit Hilfe von Malachitgrün nach der Methode von Lanzetta bestimmt (Lanzetta et al, Anal. Biochem. 1979, 100, 95-97). In diesem Fall wurde durch Kontrollversuche sichergestellt, daß das gemessene Phosphat ausschließlich durch die Synthase- katalysierte Reaktion und nicht durch unspezifische, enzymatische Hydrolyse von Phosphoenolpyruvat gebildet oder durch Phosphathaltige Chemikalien eingeschleppt wurde. Solche systematischen Fehler lassen sich durch Vermessen einer Blindprobe, bei der entweder ManNAc-Lösung durch ein entsprechendes Puffervolumen oder aber die Enzymlösung durch den Rohextrakt des Wirts­ stammes JM105 ersetzt werden, kompensieren. Bei zu hohem Phosphat­ aufkommen ist der TBA-Assay vorzuziehen, um reproduzierbare Werte zu erhalten.

Die kinetischen Konstanten wurden über die Enzymaktivitäten bei verschie­ denen Substratkonzentrationen bestimmt. Die K_m-Werte für die natürlichen Substrate wurden für ManNAc zu 5.5 mM und für PEP zu 0.03 mM ermittelt.

pH-Optimum und Enzemstabilität

Zur Ermittlung des pH-Optimums wurde die Enzymaktivität der Synthase bei 37°C zwischen pH 6.0 und pH 9.5 gemessen. Der präparativ nutzbare pH-Bereich mit einer Restaktivität von ca. 50% umfaßt den Bereich von 7.0-9.0 mit einem Maximum bei pH 8.0.

Die Lagerstabilität der Synthase wurde an einer aufgereinigten Probe über einen Zeitraum von mehreren Wochen stichprobenartig mit dem Standardassay überprüft. Danach hatte die Synthase nach Aufbewahrung bei 4°C während 2 Monaten eine Restaktivität von 70%.

Substratspektrum

Zur Ermittlung des Substratspektrums wurden exemplarisch eine Anzahl von strukturanalogen Derivaten des natürlichen Substrats N- Acetylmannosamin getestet. Dazu wurden 50 µl einer aufgereinigten Synthase- Fraktion mit 5 mM PEP und 250-500 mM Substratanalogon in einem Mn²⁺- haltigen Puffer in einem Gesamtvolumen von 200 µl bei 37°C inkubiert. Nach 1- 2 h wurden jeweils 30 µl des Ansatzes dem von Lanzetta beschriebenen Phosphat-Assay unterzogen. Um die Anwesenheit von Phosphatasen auszu­ schließen, wurde parallel zu den Ansätzen eine 5 mM konzentrierte PEP-Lösung mit der gleichen Menge an aufgereinigter Synthase inkubiert und über mehrere Stunden auf ihren Phosphatgehalt hin untersucht. Der Reaktionsverlauf wurde zudem dünnschichtchromatografisch auf Produktbildung kontrolliert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Tabelle 4

Substrattoleranz der N-Acetylneuraminsäure-Synthase (NeuS)

Präparative Synthesen von modifizierten Sialinsäuren

Eine Anzahl dieser Strukturanaloga wurde zusätzlich im präparativen Maßstab bei 25°C umgesetzt und die isolierten Reaktionsprodukte charakterisiert. Alle enzymatischen Synthesen mit der Synthase wurden in 50 mM Tris-Puffer (pH 8.0) durchgeführt, dem 5 mM MnCl₂ und 2.5 mM Dithiothreitol zugesetzt wurden. Zu dem Puffer wurden PEP und eine äquimolare Menge des entsprechenden Substratanalogons gegeben. Der pH-Wert wurde nochmals überprüft und bei Bedarf erneut auf pH 8.0 eingestellt. Anschließend wurde die Synthase zugesetzt und der Ansatz für mehrere Stunden bzw. Tage auf einem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Bei langsamer reagierenden Substraten wurde die Gesamtmenge an PEP in 2-3 Portionen über einen längeren Zeitraum zugegeben.

Der pH-Wert der Reaktionslösung wurde bei Bedarf durch Zugabe von 2 M NaOH auf pH 8.0 gehalten und der Verlauf der Reaktion dünnschichtchroma­ tographisch verfolgt. Mn²⁺-Ionen, die durch entstehendes Phosphat gefällt und somit dem Reaktionsgemisch entzogen wurden, wurden mehrmals nachdosiert (1.7 M MnCl₂ Stammlösung), um die Enzymaktivität aufrecht zu erhalten. War auch durch die Zugabe weiteren Enzyms kein vollständiger Umsatz zu erreichen, wurde die Reaktion spätestens nach einer Woche abgebrochen.

Zur Aufarbeitung des Ansatzes wurden Enzym und ausgefallenes Phosphat durch Membranfiltration (Porengröße: 0.2 µm) abgetrennt, die Neuraminsäure an Anionentauscher (AG 1-X8, Formiat-Form) gebunden, Puffersalze und nicht umgesetzter Zucker durch Spülen mit Wasser entfernt und anschließend die Neuraminsäure mit 1-2 M Ameisensäure eluiert. Die Produktfraktionen wurden dünnschichtchromatographisch detektiert, vereinigt und durch mehrmaliges Einengen im Vakuum und Wiederaufnehmen in Wasser von überschüssiger Ameisensäure befreit.

Beispiel 1 N-Acetyl-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonsäure (Neu5Ac)

Ansatz (5.0 mL):
412 mg (2 mmol) PEP, K₁

-Salz
478 mg (2 mmol) ManNAc (1 mol H₂

O/mol)
50 U Synthase
Reaktionszeit: 3 h
isolierte Ausbeute: 551 mg (89% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.76 [konz. Ammoniak-Ethanol 1 : 1 (v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 4.06 (ddd, 1H, H-4), 4.05 (dd, 1H, H-6), 3.92 (dd, 1H, J = 10.2, 10.2 Hz, H-5), 3.83 (dd, 1H, J = 11.7, 2.5 Hz, H-9a), 3.74 (ddd, 1H, J = 9.2, 6.3, 2.5 Hz, H-8), 3.61 (dd, 1H, J = 11.7, 6.3 Hz, H-9b), 3.55 (dd, 1H, J = 9.2, 0.8 Hz, H-7), 2.70 (dd, 0.05H, J = 13.1, 4.7 Hz, H-3eq α), 2.31 (dd, 0.95H, J = 13.1, 4.7 Hz, H-3eq β), 2.04/2.03 (25, 3H, CH₃

), 1.88 (dd, 0.95H, J = 13.1, 11.5 Hz, H-3ax β), 1.70 (dd, 0.05H, J = 13.1, 11.5 Hz, H-3ax α)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 177.68 (N-C=O), 176.11 (C-1), 98.09 (C-2), 73.22, 72.94, 71.04 (C-8, C-6, C-7), 69.51 (C-4), 65.98 (C-9), 54.86 (C-5), 41.62 (C-3), 24.86 (CH₃

)
C₁₁

H₁₉

O₉

N₁

(freie Säure): 309.27 g/mol

Beispiel 2 N-Propionyl-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2- nonulosonsäure (Neu5Prop)

Ansatz (6.0 mL):
371 mg (1.8 mmol) PEP, K₁

-Salz
504 mg (1.8 mmol) 84% ManNProp
50 U Synthase
Reaktionszeit: 3 h
isolierte Ausbeute: 406 mg (70% d. Th.)
K_f

-Wert: 0.69 [konz. Ammoniak-Ethanol 1 : 1 (v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 4.15-4.00 (2H, H-4, H-6), 3.93 (dd, 1H, J = 10.1, 10.1 Hz, H-5), 3.84 (dd, 1H, J = 11.7, 2.4 Hz, H-9a), 3.75 (ddd, 1H, J = 9.1, 6.2, 2.4 Hz, H-8), 3.62 (dd, 1H, J = 11.7, 6.2 Hz, H-9b), 3.54 (dd, 1H, J = 9.1 Hz, H-7), 2.74 (dd, 0.05H, J = 12.3, 4.4 Hz, H-3eq α), 2.32 (q, 2H, J = 7.7 Hz, H-11 Prop), 2.30 (dd, 0.95H, J = 12.3, 4.4 Hz, H-3eq β), 1.88 (dd, 0.95H, J = 12.3, 11.8 Hz, H-3ax β), 1.72 (dd, 0.05H, J = 12.3, 11.8 Hz, H-3ax α), 1.12 (t, 3H, J = 7.7 Hz, H-12 Prop)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 181.71 (N-C=O), 175.94 (C-1), 98.10 (C-2), 73.33, 72.99, 71.12 (C-8, C-6, C-7), 69.42 (C-4), 66.04 (C-9), 54.79 (C-5), 41.75 (C-3), 32.17 (C-11 Prop), 12.47 (C-12 Prop)
C₁₂

H₂₁

O₉

N₁

(freie Säure): 323.30 g/mol

Beispiel 3 N-Acryloyl-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2- nonulosonsäure (Neu5Acryl)

Ansatz (4.0 mL):
103 mg (0.5 mmol) PEP, K₁

-Salz
117 mg (0.5 mmol) ManNAcryl
25 U Synthase
Reaktionszeit: 3 h
isolierte Ausbeute: 126 mg (78% d. Th.)
R_f

-Werte:
0.74 [konz. Ammoniak-Ethanol 1 : 1 (v/v)]
0.2 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 6.32 (dd, 1H, J = 17.0, 9.3 Hz, H-11 Acryl), 6.23 (dd, 1 H, J = 17.0, 2.2 Hz, H-12a Acryl), 5.81 (dd, 1H, J = 9.3, 2.2 Hz, H-12b Acryl), 4.14-3.96 (3H, H-4, H-6, H-5), 3.84 (dd, 1H, J = 11.5, 2.8 Hz, H-9a), 3.76 (ddd, 1H, J = 9.3, 6.3, 2.2 Hz, H-8), 3.60 (dd, 1H, J = 11.5, 6.3 Hz, H-9b), 3.50 (dd, 1H, J = 9.1 Hz, H-7), 2.76 (dd, 0.05H, J = 12.8, 4.1 Hz, H-3eq α), 2.24 (dd, 0.95H, J = 12.8, 4.1 Hz, H-3eq β), 1.85 (dd, 0.95H, J = 12.8, 10.7 Hz, H-3ax β), 1.66 (dd ,0.05H, J = 12.8, 10.7 Hz, H-3ax α)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 179.56 (C-1), 172.04 (N-C=O), 132.67 (C-11 Acryl), 130.75 (C-12 Acryl), 99.26 (C-2), 73.18, 73.05, 71.44 (C-8, C-6, C-7), 70.08 (C-4), 66.15 (C- 9), 55.21 ( C-5), 42.21 (C-3)
C₁₂

H₁₉

O₉

N₁

(freie Säure): 321.28 g/mol

Beispiel 4 N-Benzyloxycarbonyl-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2- nonulosonsäure (Neu5Cbz)

Ansatz (3.0 mL):
103 mg (0.5 mmol) PEP, K₁

-Salz
157 mg (0.5 mmol) ManNCbz
100 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
isolierte Ausbeute: 128 mg (64% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.58 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 7.48-7.39 (m, 5H, H_ar

Cbz), 5.16 (d, 1H, J = 12.4 Hz, H- 11a Cbz), 5.09 (d, 1H, J = 12.4 Hz, H-11b Cbz), 4.08-3.95 (2H, H-4, H-6), 3.83 (dd, 1H, J = 11.8, 2.4 Hz, H-9a), 3.76 (ddd, 1H, J = 9.1, 6.4, 2.4 Hz, H-8), 3.67 (dd, 1H, J = 10.1, 10.1 Hz, H-5), 3.58 (dd, 1H, J = 11.8, 6.4 Hz, H-9b), 3.55 (dd, 1H, H-7), 2.74 (dd, 0.05 H, J = 12.9, 4.7 Hz, H-3eq α), 2.23 (dd, 0.95H, J = 12.9, 4.7 Hz, H-3eq β), 1.84 (dd, 0.95 H, J = 12.9, 12.0 Hz, H-3ax β), 1.65 (dd, 0.05H, J = 12.9, 12.0 Hz, H-3ax α)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 179.60 (C-1), 161.18 (N-C=O), 139.30 (C-1_ar

Cbz), 131.62 /130.48 (2C-2_ar

, 2C-3_ar

Cbz), 131.19 (C-4_ar

Cbz), 99.18 (C-2), 73.32, 73.23, 71.37 (C-8, C- 6, C-7), 70.14 (C-4), 69.81 (C-11Cbz), 66.20 (C-9), 56.50 (C-5), 42.25 (C-3)
C₁₇

H₂₃

O₁₀

N₁

(freie Säure): 401.37 g/mol

Beispiel 5 N-Allyloxycarbonyl-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2- nonulosonsäure (Neu5Alloc)

Ansatz (3.0 mL):
206 mg (1 mmol) PEP, K₁

-Salz
263 mg (1 mmol) ManNAlloc
100 U Synthase
Reaktionszeit: 3 d
isolierte Ausbeute: 230 mg (65% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.43 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 5.99 (dddd, 1H, J = 17.5, 10.7, 5.4, 1.3 Hz, H-12 Alloc), 5.35 (dd, 1H, J = 17.5, 1.3 Hz, H-13a Alloc), 5.27 (dd, 1H, J = 10.7, 1.3 Hz, H-13b Alloc), 4.68-4.52 (2H, H-11 Alloc), 4.06-3.96 (2H, H-4, H-6), 3.86 (dd, 1H, J = 11.8, 2.4 Hz, H-9a), 3.77 (ddd, 1H, J = 9.1, 6.4, 2.4 Hz, H-8), 3.70-3.50 (3H, H-5, H-9b, H-7), 2.73 (dd, 0.05H, J = 12.1, 4.4 Hz, H-3eq α), 2.23 (dd, 0.95H, J = 12.1, 4.4 Hz, H-3eq β), 1.84 (dd, 0.95H, J = 12.1, 11.8 Hz, H-3ax β)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 179.50 (C-1), 161.06 (N-C=O), 135.54 (C-12 Alloc), 120.09 (C-13 Alloc), 99.07 (C-2), 73.22, 73.13, 71.20 (C-8, C-6, C-7), 70.00 (C-4), 68.63 (C- 11 Alloc), 66.05 (C-9), 56.36 (C-5), 41.80 (C-3)
C₁₃

H₂₁

O₁₀

N₁

(freie Säure): 351.31 g/mol

Beispiel 6 N-Butyloxycarbonyl-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2- nonulosonsäure (Neu5Boc)

Ansatz (3.0 mL):
206 mg (1 mmol) PEP, K₁

-Salz
279 mg (1 mmol) ManNBoc
100 U Synthase
Reaktionszeit: 6 d
isolierte Ausbeute: 65 mg (18% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.53 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]
1H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 4.06-3.96 (2H, H-4, H-6), 3.86 (dd, 1H, J = 11.8, 2.4 Hz, H-9a), 3.77 (ddd, 1H, J = 9.1, 6.4, 2.4 Hz, H-8), 3.70-3.50 (3H, H-5, H-9b, H-7), 2.73 (dd, 0.05H, J = 12.1, 4.4 Hz, H-3eq α), 2.21 (dd, 0.95H, J = 12.1, 4.4 Hz, H-3eq β), 1.82 (dd, 0.95H, J = 12.1, 12.1 Hz, H-3ax β), 1.63 (dd, 0.05H, H-3ax α), 145 (s, 9H, CH₃

Boc)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 179.70 (C-1), 160.83 (N-C=O), 99.18 (C-2), 83.85 (C_q

Boc), 73.34, 71.37 (C-8, C-6, C-7), 70.14 (C-4), 66.13 (C-9), 56.01 (C-5), 42.25 (C-3), 30.49 (CH₃

Boc)
C₁₄

H₂₅

O₁₀

N₁

(freie Säure) 367.35 g/mol

Beispiel 7 3-Desoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulosonsäure (KDN)

Ansatz (5.0 mL):
412 mg (2 mmol) PEP, K₁

-Salz
360 mg (2 mmol) D-Mannose
50 U Synthase
Reaktionszeit: 5 h
isolierte Ausbeute: 330 mg (62% d. Th.)
K_f

-Wert: 0.65 [konz. Ammoniak-Ethanol 1 : 1 (v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 3.99 (m, 1H, H-4), 3.98 (dd, 1H, J = 9.6, 1.1 Hz, H-6), 3.87 (dd, 1H, J = 9.1 Hz, H-7), 3.87 (dd, 1H, J = 11.5, 2.5 Hz, H-9a), 3.75 (ddd, 1H, J = 9.1, 6.3, 2.5 Hz, H-8), 3.66 (dd, 1H, J = 11.5, 6.3 Hz, H-9b), 3.59 (dd, 1H, J = 9.6, 9.6 Hz, H-5), 2.66 (dd, 0.05H, J = 13.1, 4.9 Hz, H-3eq α), 2.25 (dd, 0.95H, J = 13.1, 4.9 Hz, H- 3eq β), 1.82 (dd, 0.95H, J = 13.1, 11.5 Hz, H-3ax β), 1.66 (dd, 0.05H, J = 13.1, 11.5 Hz, H-3ax α)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): 8 = 176.73 (C-1), 98.36 (C-2), 74.60, 73.40, 73.02, 71.63 (C-8, C-6, C-5, C-7), 70.87 (C-4), 66.20 (C-9), 41.57 (C-3)
C₉

H₁₆

O₉

(freie Säure): 268.22 g/mol

Beispiel 8 3-Desoxy-D-galacto-2-octulosonsäure (4,6-bisepi-KDO)

Ansatz (5.0 mL):
412 mg (2 mmol) PEP, K₁

-Salz
300 mg (2 mmol) D-Lyxose
50 U Synthase
Reaktionszeit: 8 h
isolierte Ausbeute: 230 mg (48% d. Th.)
R_f

-Werte:
0.67 [konz. Ammoniak-Ethanol 1 : 1 (v/v)]
0.31 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 4.08-3.91 (2H, H-4, H-7), 3.76 (dd, 1H, J = 10.1, 1.1 Hz, H-6), 3.70-3.62 (2H, H-8a, H-8b), 3.58 (dd, 1H, J = 9.5, 9.5 Hz, H-5), 2.64 (dd, 0.05H, J = 13.1, 5.0 Hz, H-3eq α), 2.24 (dd, 0.95H, J = 13.1, 5.0 Hz, H-3eq β), 1.82 (dd, 0.95H, J = 13.1, 11.8 Hz, H-3ax β), 1.65 (dd, 0.05H, J = 13.1, 11.8 Hz, H-3ax α)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 176.44 (C-1), 97.97 (C-2), 76.16, 73.75, 72.13, 70.28, 65.56, 42.95
C₈

H₁₄

O₈

(freie Säure): 238.19 g/mol

Beispiel 9 3,5-Didesoxy-D-gluco-2-nonulosonsäure (5-desoxy-KDN)

Ansatz (5.0 mL):
412 mg (2 mmol) PEP, K₁

-Salz
328 mg (2 mmol) 2-Desoxy-D-glucose
50 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
isolierte Ausbeute: 322 mg (64% d. Th.)
R_f

-Werte:
0.54 [konz. Ammoniak-Ethanol 1 : 1 (v/v)]
0.26 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 4.35-4.15 (2H, H-4, H-6), 3.89-3.72 (2H, H-8, H-9a), 3.64 (dd, 1H, J = 11.4, 6.0 Hz, H-9b), 3.52 (dd, 1H, J = 8.4 Hz, H-7), 2.63 (dd, 0.05H, J = 12.6, 4.4 Hz, H-3eq α), 2.20 (dd, 0.95H, J = 12.6, 4.4 Hz, H-3eq β), 1.92 (m, 1H, H- 5eq), 1.65 (m, 1H, H-5ax), 1.61 (dd, 0.95H, J = 12.6, 11.8 Hz, H-3ax β), 1.43 (dd, 0.05 H, J = 12.6, 11.8 Hz, H-3ax α)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 176.37 (C-1), 98.50 (C-2), 75.10, 73.39, 71.53 (C-8, C-6, C- 7), 66.30 (C-4), 65.74 (C-9), 41.93 (C-3), 37.77 (C-5)
C₉

H₁₆

O₈

(freie Säure): 252.22 g/mol

Beispiel 10 3,5-Didesoxy-D-galacto-2-nonulosonsäure (5-desoxy-7-epi KDN)

Ansatz (5.0 mL):
412 mg (2 mmol) PEP, K₁

-Salz
328 mg (2 mmol) 2-Desoxy-D-galactose
50 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
isolierte Ausbeute: 234 mg (46% d. Th.)
R_f

-Wert: 0.55 [konz. Ammoniak-Ethanol 1 : 1 (v/v)]
¹

H-NMR (300 MHz; D₂

O): δ = 4.23-4.10 (1 H), 4.10-3.99 (1 H), 3.92-3.83 (1 H), 3.72- 3.58 (3 H), 2.65 (m, H-3eq α), 2.20 (m, 2H, H-Seq, H-3eq β), 1.65 (dd, 1H, J = 11.4 Hz, H-3ax β), 1.38 (q, 1H, J = 11.1 Hz, H-5ax)
¹³

C-NMR (75 MHz; D₂

O): δ = 176.23 (C-1), 98.36 (C-2), 74.87, 72.96, 72.36 (C-8, C-6, C- 7), 66.08 (C-4), 65.44 (C-9), 41.93 (C-3), 37.57 (C-5)
C₉

H₁₆

O₈

(freie Säure): 252.22 g/mol

Beispiel 11 N-Phenylacetyl-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2-nonulos­ onsäure (Neu5PhAc)

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM ManNPhAc
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.52 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 12 N-[2-(9-oxo-10-hydroacridin-10-yl)ethoxyacetyl]-5-amino-3,5-didesoxy- D-glycero-D-galacto-2-nonulosonsäure (Neu5Acrid)

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM ManNAcrid
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.75 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 13 N-Allylaminocarbonyl-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2- nonulosonsäure (Neu5Alur)

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM ManNAlur
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.24 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 14 N-(E-3-Phenylacryl)-5-amino-3,5-didesoxy-D-glycero-D-galacto-2- nonulosonsäure (Neu5Cin)

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM ManNCin
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.55 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 15 3,5-Didesoxy-L-threo-2-heptulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 3,4-Dihydroxybutanal
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.36 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 16 7-O-Allyl-3,5-didesoxy-L-threo-2-heptulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 4-Allyloxy-3-hydroxybutanal
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.45 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 17 7-O-Acetyl-3,5-didesoxy-L-threo-2-heptulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 4-Acetoxy-3-hydroxybutanal
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.40 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 18 7-O-Acryl-3,5-didesoxy-L-threo-2-heptulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 4-Acryloxy-3-hydroxybutanal
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.33 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 19 7-O-β-Glucopyranosyl-3,5-didesoxy-L-threo-2-heptulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 4-β-Glucopyranosyloxy-3-hydroxybutanal
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.17 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 20 3,5,7,8,9-Pentadesoxy-L-threo-8-en-2-nonulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 3-Hydroxyhex-5-enal
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.47 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 21 5-[2-(9-oxo-10-hydroacridin-10-yl)ethoxyacetyl]-3-desoxy-L-lyxo-2- heptulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 2-Acrid-L-erythrose
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.33 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 22 7-[2-(9-oxo-10-hydroacridin-10-yl)ethoxyacetyl]-3-desoxy-L-lyxo-2- heptulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 4-Acrid-L-erythrose
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.33 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

Beispiel 23 7-Dansylamino-3,5,7-tridesoxy-L-threo-2-heptulosonsäure

Ansatz (0.2 mL):
5 mM PEP
250 mM 4-Dans-3-hydroxybutanal
1 U Synthase
Reaktionszeit: 2 d
R_f

-Wert: 0.33 [1-Butanol-Aceton-Eisessig-Wasser 35 : 35 : 7 : 23 (v/v/v/v)]

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit N-Acetylneuraminsäure- Synthase-("Synthase")Aktivität, umfassend das Kultivieren eines prokaryotischen Wirtsorganismus, der mit einem Expressionsvektor, der ein die Synthase codierendes Strukturgen enthält, transformiert ist, wobei in dem Expressionsvektor sich das Startcodon des die Synthase codierenden Strukturgens 6 bis 10 Basen stromabwärts einer ribosomalen Bindungsstelle befindet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Abstand zwischen der ribosomalen Bindungsstelle und dem Startcodon 8 Basen beträgt, wobei die 8 Basen insbesondere die Sequenz 5'-GTCAATAA aufweisen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Vektor weiterhin eine Promotorsequenz, insbesondere eine tac-Promotorsequenz enthält.

4. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Strukturgen aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B stammt und insbesondere die in der SEQ ID NO: 4 gezeigte Proteinsequenz oder ein Mutein derselben kodiert.

5. Verfahren gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Vektor erhältlich ist durch

• - Modifizieren des kodierenden Strukturgens siaC mit der SEQ ID NO: 3 aus Neisseria meningitidis der Serogruppe B mittels PCR-Primern entsprechend der SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2,
• - XmaI- und PstI-Restriktionsverdau des modifizierten Strukturgens und
• - Einfügen des verdauten Strukturgens in die XmaI- und PstI-Schnittstellen des kommerziellen cyclischen Vektors pKK223-3.

6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Wirtsorganismus in einem Fermenter in Gegenwart eines geeigneten Induktors angezüchtet, die Zellmasse von der Kulturflüssigkeit abgetrennt und das Enzym nach Zellaufschluß gewonnen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Enzym nach Zellaufschluß durch Chromatografie an DEAE-Ionenaustauscher und fraktionierende Ammonium­ sulfatfällung isoliert wird.

8. Vektor zur Expression eines Proteins mit Synthaseaktivität, wie in Ansprüchen 1 bis 5 definiert.

9. Verwendung der durch das Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 8 erhältlichen Synthase zur Herstellung von N-Acetylneuraminsäure und strukturanalogen Derivaten der N-Acetylneuraminsäure, wobei N-Acetylmannosamin oder strukturanaloge Derivate von N-Acetylmannosamin in Gegenwart der Synthase und Phosphoenolpyruvat zur Reaktion gebracht werden.

10. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Derivate der N-Acetyl­ neuraminsäure die allgemeine Formel (I) aufweisen
sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon,
in welcher R¹ für Alkenyl, Alkinyl, Arylmethyl, Arylalkenyl, Halogenmethyl, Alkenyloxy, oder Alkenylamino stehen.

11. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Derivate der N-Acetyl­ neuraminsäure die allgemeine Formel (II) aufweisen
sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon, in welcher R¹ bis R³ gleich oder verschieden sein können und für Wasserstoff, Hydroxy, Hydroxymethyl, Alkenyloxymethyl, Alkenyl, Alkanoyloxy, Alkenoyl­ oxy, für ein Alkanoyl-, Alkenoyl-, Benzylcarbonyl-, Carbobenzoxy(Cbz)-, tert- Butyloxycarbonyl(Boc)- oder Allyloxycarbonyl(Alloc)-modifiziertes Amin, oder für einen Glycosyloxy- oder Glycosyloxymethylrest stehen.

12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei in der Verbindung gemäß Formel (II)
R¹ und R² für Wasserstoff oder ein Alkanoyl-, Alkenoyl-, Benzylcarbonyl-, Carbo­ benzoxy-, tert-Butyloxycarbonyl- oder Allyloxycarbonyl-modifiziertes Amin stehen, und
R³ für Wasserstoff, Hydroxymethyl, Alkenyl oder für einen Glycosyloxy- oder Glycosyloxymethylrest steht.

13. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei in der Verbindung gemäß Formel (II)
R³ für Hydroxymethyl, Alkenyloxymethyl, Alkenyl, ein Alkanoyl-, Alkenoyl-, Benzylcarbonyl-, Carbobenzoxy-, tert-Butyloxycarbonyl- oder Allyloxycarbonyl­ modifiziertes Amin steht und
R¹ und R² für Wasserstoff oder Hydroxy steht.

14. Verwendung gemäß Anspruch 9, wobei die Derivate der N- Acetylneuraminsäure die allgemeinen Formeln (III) oder (IV) aufweisen
sowie verfahrenstechnisch akzeptable Salze davon, worin
R¹ für eine fluoreszierende Gruppe steht,
R² für Alkanoylamino, Hydroxy oder Wasserstoff steht,
X für einen Sauerstoff oder eine NH-Gruppe steht und
Sp für eine Valenz oder einen divalenten Rest wie Alkyl, Alkylcarbonyl, Carbamoylalkyl, Carbamoylalkylcarbonyl, (Alkyloxy)_n-alkyl oder (Alkyloxy)_n- alkylcarbonyl steht, wobei n Zahlenwerte von 0 bis 5 annehmen kann.

15. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (III) oder (IV)
R¹ für Acridonyl, Dansylamino, Fluoresceinylamino oder Fluoresceinylcarbox­ amido steht,
R² für Wasserstoff, Hydroxy oder Alkanoylamino steht,
X für eine NH-Gruppe steht und
Sp für einen divalenten Rest wie Alkylcarbonyl, Carbamoylalkylcarbonyl oder (Alkyloxy)_n-alkylcarbonyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 1 oder 2 steht.

16. Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei in den Verbindungen der allgemeinen Formeln (III) oder (IV)
R¹ für Acridonyl, Dansylamino, Fluoresceinylamino oder Fluoresceinylcarbox­ arnido steht,
R² für Wasserstoff, Hydroxy oder Alkanoylamino steht,
X für ein Sauerstoffatom steht und
Sp für einen divalenten Rest wie Alkyl, Carbamoylalkyl oder (Alkyloxy)_n-alkyl steht, wobei n für Zahlenwerte von 1 oder 2 steht.

17. Strukturanaloge Derivate der N-Acetylneuraminsäure der Formeln (I) bis (IV), wie in den Ansprüchen 10 bis 16 definiert.