TW201934581A

TW201934581A - 抗ｂ７－ｈ４抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

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Publication number: TW201934581A
Application number: TW108104453A
Authority: TW
Inventors: 包如迪; 花海清; 劉素霞; 張福軍; 王婷
Original assignee: 大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司; 大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2019-02-11
Publication date: 2019-09-01
Also published as: RU2020124155A; MX2020008181A; AU2019218319A1; CN110366560A; CN116693686A; TWI823895B; JP2021513331A; EP3753951A1; CN110366560B; JP2024026132A; KR20200119846A; US11472882B2; EP3753951A4; AU2019218319B2; BR112020015736A2; CA3089246A1; ZA202004701B; JP7393337B2; US20210032347A1; WO2019154315A1

Abstract

本發明涉及抗B7-H4的抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本發明涉及包含該抗B7-H4抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含抗B7-H4抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。尤其地，本發明涉及一種人源化的抗B7-H4抗體，及其在製備用於治療B7-H4介導的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

抗B7-H4抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

本發明涉及一種對人B7-H4受體具有免疫反應性的抗B7-H4抗體，以及其抗原結合片段，包含該抗B7-H4抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗B7-H4抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。

腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域長期持續的研究和開發熱點，而其中T細胞腫瘤免疫治療又處於核心位置。腫瘤逃逸是腫瘤免疫治療面臨的一個巨大障礙，大部分腫瘤表達可不同程度地被宿主免疫系統識別，但在許多情況下，由於效應T細胞低效活化而引發不充分的免疫反應，因此腫瘤細胞利用其自身對免疫系統的抑制作用促進了腫瘤的生長。腫瘤免疫治療即是充分利用並調動了腫瘤患者體內的殺傷性T細胞和/或其它免疫細胞，對腫瘤進行殺傷作用。

對CD28受體及其配體的研究己促成對稱為B7超家族的相關分子的表徵。B7家族成員是一類具有免疫球蛋白V樣結構域(IgV)和免疫球蛋白C樣結構域(IgC)的免疫球蛋白，其成員包括協同刺激因子B7.1 (CD80)與B7.2(CD86)、可誘導的共刺激因子的配體(ICOS-L/B7-H2)、程序性死亡-1配體(PD-L1/B7-H1)、程序性死亡-2配體(PD-L2/B7-DC)、B7-H4和B7-H4等。

人B7-H4是由282個胺基酸組成的I型跨膜蛋白，其編碼基因位於1號染色體的p11.1區(Choi IH等，J Immunol.2003 Nov 1；171(9)：4650-4)。B7-H4對T細胞免疫應答發揮負性調節的作用，B7-H4在CD4⁺、CD8⁺ T細胞的分化發育、細胞週期進展以及細胞因子的產生方面發揮著廣泛的抑制作用(Sica GL等，Immunity.2003 Jun；18(6)：849-61)。在B7-H4基因剔除的小鼠中沒有發現免疫細胞紊亂和自身免疫現象(Zhu G等，Blood.2009 Feb 19；113(8)：1759-67；Suh WK等，Blood.Mol Cell Biol.2006 Sep；26(17)：6403-11)。目前對於B7-H4的受體及其信號轉導途徑尚不明確。

近來研究發現B7-H4蛋白在多種腫瘤組織中大量表達，使腫瘤細胞逃避機體免疫系統的攻擊。以B7-H4分子為腫瘤治療靶標，為腫瘤免疫治療提供了一種新方法。

目前已知人B7-H4表達在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、宮頸癌、腎癌、膀胱癌和肝癌等多種癌症細胞上。在脾臟、肺、胸腺、肝、骨骼肌、腎、胰腺、睾丸和卵巢中發現B7-H4 mRNA的表達，蛋白質水平上，在乳房(導管和小葉)、輸卵管上皮、子宮內膜腺等組織有低水平B7-H4表達。相關研究也己顯示B7-H4在腫瘤相關巨噬細胞(TAM)中過表達(Kryczek,I.等，J.Exp.Med.2006,203(4)：871-881)，而巨噬細胞構成了腫瘤微環境的一個重要成分並且可代表多達50%的腫瘤質量。

目前有多家跨國製藥公司在研發針對B7-H4的單株抗體和/或其與藥物偶聯物，提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應，並達到對腫瘤細胞進行直接殺傷的目的。相關專利如WO2013025779、US20140322129等。Medimmune、FivePrime等公司的抗B7-H4單株抗體目前尚在臨床前開發；基因泰克公司的抗B7-H4抗體-藥物偶聯物也已處在臨床前開發階段。

本發明提供有著高親和力，高選擇性，高生物活性的抗B7-H4抗體，用於腫瘤的單株抗體免疫療法及其相關應用。用於B7-H4陽性腫瘤治療的藥物、組合物以及方法。

本發明提供一種B7-H4抗體或其抗原結合片段，其包含：抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：56；SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64；SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72；和抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所述的HCDR：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53；SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61；SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3； SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3

或SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

特別佳的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段可選自下述任一種，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：

(1)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(2)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(3)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(4)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(5)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(6)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(7)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(8)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(9)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

(10)、該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其片段。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其片段。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人抗體或其片段。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其片段。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區選自含有如下序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區選自含有如下序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：81。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈FR區；更佳使用胺基酸突變後增強ADCC毒性的IgG1。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的輕鏈選自含有如下序列的輕鏈：SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：90。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈選自含有如下序列的重鏈：SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：89。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區選自含有如下序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：80。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區選自含有如下序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：79

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的輕鏈選自含有如下序列的輕鏈：SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈選自含有如下序列的重鏈：SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：87。

在本發明更佳的實施方案中，人源化抗體選自以下任一種：(1)SEQ ID NO：76的輕鏈可變區和SEQ ID NO：75的重鏈可變區；(2)SEQ ID NO：78的輕鏈可變區和SEQ ID NO：77的重鏈可變區；(3)SEQ ID NO：80的輕鏈可變區和SEQ ID NO：79的重鏈可變區；或(4)SEQ ID NO：82的輕鏈可變區和SEQ ID NO：81的重鏈可變區。

在本發明進一步較佳的實施方案中，人源化抗體選自以下任一種：(1)SEQ ID NO：84的輕鏈和SEQ ID NO：83的重鏈；(2)SEQ ID NO：86的輕鏈和SEQ ID NO：85的重鏈；(3)SEQ ID NO：88的輕鏈和SEQ ID NO：87的重鏈；或(4)SEQ ID NO：90的輕鏈和SEQ ID NO：89的重鏈。

一種抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其具有至少一項下述特徵：(1)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸41-60的表位；(2)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸53-59的表位。

一種抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其具有至少一項下述特徵：(1)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸53的表位；(2)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸54的表位；(3)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸56的表位；(4)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸57的表位；(5)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸58的表位；(2)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸59的表位。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab、Fv、sFv、F(ab’)₂、線性抗體、單鏈抗體、納米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。

本發明進一步提供一種編碼如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段的DNA序列。

本發明進一步提供一種含有如上所述的DNA序列的表達載體。

本發明進一步提供一種導入或含有如上該該表達載體的宿主細胞。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞，其特徵在於，該宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞為酵母菌，較佳為畢赤酵母。

在本發明一個較佳的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞為哺乳動物細胞，較佳為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞。

在本發明還提供了一種生產B7-H4抗體的方法，包括：培養上述的宿主細胞，從培養物分離抗體以及對抗體進行純化。

本發明還提供了一種多特異性抗體，含有如前所述的輕鏈可變區和重鏈可變區。

本發明還提供了一種單鏈抗體，含有如前所述的輕鏈可變區和重鏈可變區。

本發明還提供了一種檢測試劑或診斷劑，含有如前所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段。

本發明還提供了一種用於免疫檢測或測定B7-H4的方法，該方法包括使用本發明所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段。

本發明還提供一種用於診斷與B7-H4陽性細胞相關的疾病的方法，該方法包括使用本發明所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段檢測或測定B7-H4或B7-H4陽性細胞。

本發明進一步提供一種醫藥組成物，其含有如上所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段和可藥用的賦形劑、稀釋或載體。

本發明進一步提供一種如上所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段在製備用於治療B7-H4介導的疾病或病症的藥物中的用途；其中該疾病較佳為癌症；更佳為表達B7-H4的癌症；該癌症最佳為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。

本發明進一步提供一種治療和預防B7-H4介導的疾病或病症的方法，該方法包括給予所需患者治療有效量的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，或其醫藥組成物，其中該疾病較佳為癌症；更佳為表達B7-H4的癌症；該癌症最佳為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、膽囊癌、宮頸癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。

第1圖為抗體的ELISA體外結合實驗圖，顯示7種嵌合抗體均對純化人B7-H4抗原的結合活性，其中嵌合抗體2F7和2F8的EC₅₀約在0.1nM。

第2圖為間接ELISA結合實驗圖，顯示抗B7-H4抗體hu2F7結合的抗原表位。

第3圖為小鼠體內藥效實驗圖，顯示抗B7-H4抗體hu1C9的抗腫瘤效果。

第4圖為免疫功能實驗圖，顯示抗B7-H4抗體hu1C9和hu2G6的增強免疫(T細胞增殖)的效果。

發明詳述一、術語

為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem,243,p3558(1968)中所述。

本發明所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈，δ鏈，γ鏈，α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。

在本發明中，本發明該該抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1，2，3，4或其變體。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1，HCDR2和HCDR3。發明所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則和Kabat或AbM定義規則(http：//bioinf.org.uk/abs/)。

術語“抗原呈遞細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外用血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞(DC)。術語“抗原呈遞”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。

術語“B7-H4”指人B7蛋白質家族的成員，也稱為CD276，是具有四個Ig樣胞外結構域的I型跨膜蛋白。B7-H4是抗原呈遞細胞或癌細胞表面表達的免疫檢查點蛋白之一，對T細胞的功能激活有抑制作用。術語“B7-H4”包括由細胞天然表達的B7-H4的任何變體或同種型。本發明的抗體可與得自非人物種的B7-H4交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人B7-H4特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。B7-H4或其任何變體或同種型可從天然表達它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。較佳地，抗B7-H4抗體靶向具有正常糖基化模式的人源B7-H4。

術語“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如(1)從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；(2)從經轉化以表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；(3)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及(4)藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。

術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人B7-H4的單株抗體。製備時用B7-H4抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源B7-H4抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。

術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再要據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後增強ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。

術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於摩爾來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、納米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。

“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。

“Fc”區含有包含抗體的CH1和CH2結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並藉由CH3結構域的疏水作用保持在一起。

“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。

“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由藉由兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。

“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。

術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies)、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。

術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。

術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。

本發明的術語“與B7-H4結合”，指能與人B7-H4相互作用。本發明的術語“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。

術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。

本發明所用的術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用重組人B7-H4作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10^-7M或甚至更小的平衡解離常數(K_D)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。

術語“交叉反應”是指本發明的抗體與來自不同物種的B7-H4結合的能力。例如，結合人B7-H4的本發明的抗體也可以結合另一物種的B7-H4。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達B7-H4的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。

術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗B7-H4抗體接觸時，與未與抗B7-H4抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。

術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。

術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的剌激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。

本發明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，增強或降低降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。

生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人B7-H4或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性，純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

本發明的抗體指單株抗體。本發明所述的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的選殖細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術(如CDR-grafting)，或其它現有技術進行重組得到。

“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。

“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、 Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。

整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“基本上由......組成”或其變形表示包括所有所述元件或元件組，並且視需要包括與該元件類似或不同性質的其它元件，該其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。作為非限制性例子，基本上由所提及的胺基酸序列組成的結合化合物還可以包括一種或多種胺基酸，其不顯著影響結合化合物的性質。

本發明所述的應用於某個對象的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。

“有效量”包含足以改善或預防醫字病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“外源性”指要據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。

“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。

本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1：抗原準備及穩定細胞株的構建

編碼帶HisFlag標簽的人B7-H4(huB7-H4-HF)序列、編碼帶huFc標簽的人B7-H4(h-B7-H4-Fc)序列由CRO公司Integrated DNA Technology(IDT)合成(以上B7-H4重組蛋白均由本發明設計模版序列)，分別選殖到pTT5載體上(Biovector)。重組的B7-H4蛋白在293T細胞表達後，藉由實施例2進行純化。

純化的蛋白可用於下述各實施例實驗中。

huB7-H4-Fc序列： SEQ ID NO：99

huB7-H4-his序列： SEQ ID NO：100

huB7-H4-his純化步驟：將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液換置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將置換後的上清樣品上管柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱，至A₂₈₀讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。收集的沖提液用離子交換(SP管柱)進一步純化。配置A液：0.01M PB，pH8.0。配置B液：A液+1M NaCl。先將咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白置換到A液，並使用A液平衡SP管柱，上樣，B液濃度梯度0-100%，10倍管柱體積沖提，收集各沖提峰。所得到的蛋白經電泳，鑒定為正確後分裝備用。得到帶HisFlag標簽的人B7-H4(hu-B7-H4 his)。

huB7-H4-Fc純化步驟：將HEK293細胞表達的上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液換置換為PBS。用含有10mM磷酸緩衝液平衡Protein A親和力管柱，沖洗2-5 倍管柱體積。將置換後的上清樣品上管柱。用含有25倍管柱體積緩衝液沖洗管柱，至A₂₈₀讀數降至基線。再用pH 3.5的0.8%醋酸緩衝液沖提目的蛋白，並收集沖提峰，分裝後立刻加入1M Tris-Cl pH8.0緩衝液中和，然後使用Millipore’s Amico-15濾管柱置換溶液為PBS。所得到的蛋白經電泳，肽圖，LC-MS鑒定後分裝備用。

穩定CHO-S細胞池構建：編碼人或食蟹猴B7-H4蛋白(huB7-H4或cyB7-H4)的全長序列由Integrated DNA Technology(IDT)公司合成(以上B7-H3重組蛋白均由本發明設計模版序列)，分別選殖到改造過的pcDNA3.1載體上，pcDNA3.1/puro(Invitrogen #V79020)。CHO-S(ATCC)細胞於CD-CHO培養基(Life Technologies,#10743029)內培養至0.5x10⁶/ml。將10ug編碼huB7H3或cyB7H3基因的載體與50ul LF-LTX(Life Technologies,#A12621)在1ml Opti-MEM培養基(Life Technologies,#31985088)中混合，室溫孵育20分鐘後，加入CHO細胞培養液中並放入二氧化碳培養箱培養。24小時後更換新培養基並加入10ug/ml嘌呤黴素。之後每2-3天更換一次新培養液，經過10-12天篩選後得到穩定CHO-S細胞池。

實施例2：鼠融合瘤及抗體序列的獲得

用人抗原huB7-H4-Fc進行動物免疫，共5隻Balb/c和5隻A/J小鼠，雌性，10週齡，使用Sigma完全弗氏佐劑(CFA)和Sigma不完全弗氏佐劑(IFA)，免疫原和免疫佐劑以1：1的比例充分混合乳化，製成穩定“油包水”液體；注射劑量25μg/200μL/小鼠。

對免疫小鼠血清使用如實施例3該該間接ELISA、捕獲ELISA法評估血清效價及結合細胞表面抗原的能力，對照效價檢測情況(大於10萬倍稀釋度)決定啟動細胞融合。選擇血清效價、親和力和FACS結合強的免疫小鼠進行一次終免疫後處死小鼠，取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合後鋪板獲得融合瘤，藉由間接ELISA和捕獲ELISA篩選到目標融合瘤，並藉由有限稀釋法建株為單純株細胞株。得到的陽性抗體株進一步使用穩轉表達B7-H4的CHO-S細胞，對比空白CHO-S細胞以排除非特異性結合抗體融合瘤株，用流式分選方法進行篩選，從而選定8株結合重組蛋白且也結合細胞表達抗原的融合瘤。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA並反轉錄(PrimeScript^TM Reverse Transcriptase，Takara #2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序，最終得到8株鼠源抗體的序列。

鼠單抗2F7的重鏈和輕鏈可變區序列如下：2F7 HCVR SEQ ID NO：1

2F7 LCVR SEQ ID NO：2

其含有下列CDR序列：

M1的重鏈和輕鏈可變區序列如下：M1 HCVR SEQ ID NO：9

M1 LCVR SEQ ID NO：10

其含有下列CDR序列：

鼠單抗2F8的重鏈和輕鏈可變區序列如下：2F8 HCVR SEQ ID NO：17

2F8 LCVR SEQ ID NO：18

其含有下列CDR序列：

鼠單抗2F4的重鏈和輕鏈可變區序列如下：2F4 HCVR SEQ ID NO：25

2F4 LCVR

其含有下列CDR序列：

鼠單抗2A10的重鏈和輕鏈可變區序列如下：2A10 HCVR SEQ ID NO：33

2A10 LCVR SEQ ID NO：34

其含有下列CDR序列：

鼠單抗2E4的重鏈和輕鏈可變區序列如下：2E4 HCVR SEQ ID NO：41

2E4 LCVR SEQ ID NO：42

其含有下列CDR序列：

鼠單抗1E4的重鏈和輕鏈可變區序列如下：1E4 HCVR SEQ ID NO：49

1E4 LCVR SEQ ID NO：50

其含有下列CDR序列：

鼠單抗2G6的重鏈和輕鏈可變區序列如下：2G6 HCVR SEQ ID NO：57

2G6 LCVR SEQ ID NO：58

其含有下列CDR序列：

鼠單抗1C9的重鏈和輕鏈可變區序列如下：1C9 HCVR SEQ ID NO：65

1C9 LCVR SEQ ID NO：66

其含有下列CDR序列：

使用每株鼠抗的重鏈和輕鏈可變區分別選殖進入含人IgG1重鏈恆定區和κ輕鏈恆定區，按實施例4所描述的方法純化、鑒定，並進行相關活性檢測。

實施例3：抗體的體外結合活性檢測方法

(1)體外間接ELISA結合實驗：用pH7.4的PBS將huB7-H4 His蛋白(Sino Biological Inc.，cat#10738-H08H)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。

用含3%BSA的PBST稀釋待測抗體，1μM起始，10倍梯度，10個劑量，以100μl/孔加到酶標板中，放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3%BSA的PBST稀釋的HRP 標記羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔Stop Solution(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止反應，用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析數據。做濃度信號值曲線分析結果，如下表所示：

(2)競爭性ELISA實驗：用pH7.4的PBS將huB7-H4 His蛋白(Sino Biological Inc.，cat#10738-H08H)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)，用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。

用含3%BSA的PBST配製0.1nM的對照嵌合抗體，用該抗體作為稀釋液將待測鼠源抗體稀釋為100nM起始，10倍梯度，10個劑量，將稀釋好的抗體以100μl/孔加到酶標板中，放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3%BSA的PBST稀釋的HRP標記羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔Stop Solution(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止反應，用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析數據。競爭性抑制率=((對照抗體吸光值-競爭抗體吸光值)/Abv抗體吸光值)*100。

(3)體外捕獲ELISA結合實驗：用pH7.4的PBS緩衝液將山羊抗小鼠IgG二抗(Jackson Immuno Research，cat#115-006-071)稀釋至2ug/ml濃度，以100ul/孔的體積加入96孔酶標板中，於37℃孵育箱中放置2小時。用PBST洗板一次後，加入用PBST稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液200ul/孔，37℃孵育箱孵育2小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST洗板4次。

用含5%NHS的樣品稀釋液(2.5%脫脂牛奶的PBST)稀釋待測小鼠血清或純化重組抗體成不同濃度，室溫孵育40分鐘後，100ul/孔加到酶標板中，放於37℃孵育箱孵育40分鐘。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100ul/孔用樣品稀釋液稀釋的生物素化huB7-H4-his(義翹神州#10738-H08H)蛋白溶液，37℃孵育40分鐘。孵育結束後用PBST洗板4 次，加入100ul/孔用PBST稀釋的HRP標記鏈黴親和素(Jackson Immuno Research,cat#016-030-084)，37℃孵育40分鐘。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(湖州英創生物科技公司)，於室溫避光孵育10-15min，加入50μl/孔1M H₂SO₄終止反應，用酶標儀(北京普朗新技術有限公司，型號DNM-9602)在450nm處讀取吸收值，分析數據。

(4)體外細胞結合實驗：收集培養好的CHO-huB7-H4穩定轉染細胞或SK-BR3細胞，調節細胞密度後分鋪於96孔U底板，每孔1~2x105個細胞。1200g,5min離心，去上清，添加100ul已梯度稀釋的抗體溶液或小鼠免疫血清，4℃度孵育60min；1200g,5min離心，去上清，PBS洗細胞2次後，添加熒光標記二抗(PE-GAM或PE-GAH)100ul每孔，4℃度孵育60min。1200g,5min離心去上清。PBS洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞計數儀檢測信號，並作濃度曲線分析結果。

實施例4：抗B7-H4重組嵌合抗體構建表達

將本發明中的各鼠源抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)分別做FR(framework region)區域的定點胺基酸突變，根據不同的胺基酸突變組合，設計不同的人源化抗體重鏈和輕鏈，將不同的輕重鏈組合質粒轉染細胞可以生產出人源化抗體。

重鏈載體設計如下：信號肽+突變的重鏈可變區序列+人的IgG1恆定區序列。輕鏈載體設計如下：信號肽+突變的輕鏈可變區序列+人的Kappa恆定區序列。

分別將上述序列插入pCEP4載體。按照上述設計合成表達載體，得到載體質粒後，大抽質粒，將質粒送測序驗證。將驗證合格的質粒用PEI轉染至人293F細胞中，連續培養，將293F細胞用無血清培養液(上海奧浦邁生物，OPM-293 CD03)培養至對數生長期用於細胞轉染。將21.4μg人源化抗體輕鏈質粒和23.6μg人源化抗體重鏈質粒溶解在10ml Opti-MEM® I Reduced Serum Medium(GIBCO，31985-070)中混勻，然後加入200ug PEI，混勻，RT孵育15min，加入50mL細胞中。細胞培養條件：5% CO₂，37℃，125rpm/min。培養期間，第1天和第3天加補料，直到細胞活率低於70%，收取細胞上清，離心過濾。將離心過濾後的細胞培養液上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，最終獲得純化的各嵌合抗體。

實施例5：體外結合親和力和動力學實驗：Biacore方法是公認的客觀檢測蛋白相互間親和力和動力學的檢測方法。藉由Biacore T200(GE)分析本發明待測B7-H4抗體表徵親和力及結合動力學。

利用由Biacore提供的試劑盒，採用NHS標準胺基偶聯法將本發明待測抗B7-H4抗體共價連接至CM5(GE)芯片上。然後：

a).將稀釋於同樣緩衝液中的50nM人huB7-H4-his蛋白(義翹神州#10738-H08H)進樣，流速10uL/min，進樣後均以試劑盒內配再生試劑再生。追蹤抗原-抗體結合動力學3分鐘並追蹤解離動力學10分鐘。使用GE的 BIAevaluation軟件以1：1(Langmuir)結合模型分析所得數據，以此法估測的各鼠源抗體單點kd(koff)數據如下表所示。

b).稀釋於同樣緩衝液中的一系列濃度梯度的人huB7-H4-his蛋白於前後各個循環進樣，流速10uL/min，進樣後均以試劑盒內配再生試劑再生。追蹤抗原-抗體結合動力學3分鐘並追蹤解離動力學10分鐘。使用GE的BIAevaluation軟件以1：1(Langmuir)結合模型分析所得數據，以此法測定的嵌合抗體ka(kon)、kd(koff)和K_D值顯示於下表所示。

實施例6：小鼠抗體人源化實驗

鼠源抗人B7-H4單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列，本發明將鼠源候選分子2F7、2F8、2G6和1C9進行人源化。

在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。

將鼠源抗體2F7、2F8、2G6和1C9的CDR區移植到選擇好的相應人源化模板上。其中，2F8的HCDR1區(GYTFTNSWMN，SEQ ID NO：19)和HCDR2區(GIYPNSGNIEYNEKFKG，SEQ ID NO：20)分別突變為GYTFTSSWMN(SEQ ID NO：73)和GIYPNRGNIEYNEKFKG(SEQ ID NO：74)以去除潛在的脫醯胺不穩定位點。替換人源化可變區，再與IgG恆定區(較佳重鏈為IgG1，輕鏈為κ)重組。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對 VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，設計並檢測人源化輕重鏈可變區序列組合而成的抗體。

經表達測試和回復突變數量對比，選擇出最終的人源化hu2F7、hu2F8、hu2G6和hu1C9抗體分子，其各自重鏈和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：75-82所示，其各自重鏈和輕鏈序列如SEQ ID NO：83-90所示。

hu2F7 HCVR SEQ ID NO：75

SEQ ID NO：91

hu2F7 LCVR SEQ ID NO：76

SEQ ID NO：92

SEQ ID NO：93

SEQ ID NO：94

hu2F8 HCVR SEQ ID NO：77

SEQ ID NO：95

SEQ ID NO：96

hu2F8 LCVR SEQ ID NO：78

SEQ ID NO：97

SEQ ID NO：98

hu2G6 HCVR SEQ ID NO：79

hu2G6 LCVR SEQ ID NO：80

hu1C9 HCVR SEQ ID NO：81

hu1C9 LCVR SEQ ID NO：82

hu2F7 HC SEQ ID NO：83

hu2F7 LC SEQ ID NO：84

hu2F8 HC SEQ ID NO：85

hu2F8 LC SEQ ID NO：86

hu2G6 HC SEQ ID NO：87

hu2G6 LC SEQ ID NO：88

hu1C9 HC SEQ ID NO：89

hu1C9 LC SEQ ID NO：90

根據以上各人源化抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表達載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表達載體和轉染試劑PEI(Polysciences,Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於 CO₂孵育箱中孵育4-5天。表達的抗體藉由離心回收後，按實施例4方法進行抗體純化，得到本發明的人源化抗體蛋白hu2F7和hu2F8。

實施例7：人源化抗體活性測定

對hu2F7和hu2F8人源化抗體在體外進行了以下實驗測定：

1.體外細胞結合實驗：收集培養好的MX-1細胞，用pH為7.4的PBS調節細胞密度後分鋪於96孔V型底板，每孔1x105個細胞。2000rpm離心5分鐘，去上清，每孔加入100μl已梯度稀釋的嵌合抗體溶液(用含0.5%BSA的PBS稀釋，1μM起始，3倍梯度，10個劑量)，混勻，4℃搖床孵育1個小時；2000rpm離心5分鐘，去上清，PBS洗細胞2次後，每孔加入100μl用0.5%BSA的PBS稀釋的FITC標記羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97224)，混勻，4℃搖床孵育30分鐘。2000rpm離心5分鐘，去上清。PBS洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞計數儀(BECKMAN COULTER，型號DxFLEX)檢測信號，並作濃度曲線分析結果。結果如表所示，人源化抗體2F7、2F8、2G6和1C9均與高表達B7-H4的MX-1細胞陽性結合。

2.親和力動力學實驗(方法步驟同實施例5)，結果如下表所示，人源化抗體hu2F7、hu2F8、hu2G6和hu1C9均對人B7-H4抗原蛋白顯出很強的親和力。

實施例8：人源化抗體結合表位測定

方法步驟同實施3(1)體外間接ELISA結合實驗。將SEQ ID NO：92的B7-H4分解為長度為20個胺基酸的抗原片段，藉由體外間接ELISA結合實驗發現抗原片段P12(胺基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP)與人源化抗B7-H4抗體hu2F7有特異性結合，結果如第2圖所示。為進一步確證抗體結合表位，在抗原片段P12中做丙胺酸掃描，即將P12中的單個胺基酸分別突變為丙胺酸。藉由體外間接ELISA結合實驗發現胺基酸序列：ILSCTFE 部分的突變顯著減弱了抗體與抗原片段的結合，顯示抗體結合表位位於胺基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP中的胺基酸序列：ILSCTFE(SEQ ID NO：109)部分。結果如下表所示：

藉由體外間接ELISA結合實驗發現抗原片段P12(胺基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP)與人源化抗B7-H4抗體hu1C9有特異性結合，結果如下表所示。為進一步確證抗體結合表位，在抗原片段P12中做丙胺酸掃描，即將P12中的單個胺基酸分別突變為丙胺酸。藉由體外間接ELISA結合實驗發現胺基酸序列：LSCTF部分的突變顯著減弱了抗體與抗原片段的結合，顯示抗體結合表位位於胺基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP中的胺基酸序列：LSCTF(SEQ ID NO：110)部分。結果如下表所示：

藉由體外間接ELISA結合實驗發現抗原片段P12(胺基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP)與人源化抗B7-H4抗體hu2G6有特異性結合，結果如下表所示。為進一步確證抗體結合表位，在抗原片段P12中做丙胺酸掃描，即將P12中的單個胺基酸分別突變為丙胺酸。藉由體外間接ELISA結合實驗發現胺基酸序列：ILSCTFEP部分的突變顯著減弱了抗體與抗原片段的結合，顯示抗體結合表位位於胺基酸序列：TVASAGNIGEDGILSCTFEP中的胺基酸序列：ILSCTFEP(SEQ ID NO：111)部分。結果如下表所示：

實施例9：人源化抗體抗腫瘤效果

在藉由基因編輯技術導入人B7-H4基因的小鼠中植入MC38腫瘤細胞，待腫瘤生長到平均100mm³後，開始給小鼠每3天注射一次對照或人源化B7-H4抗體hu1C9(10mg/kg或30mg/kg)。藉由對腫瘤大小的觀察發現，hu1C9具有顯著的抑制腫瘤生長的功能，具有抗腫瘤效果。具體結果如第3圖及下表所示：

實施例10：人源化抗體增強免疫的效果

抗B7-H4的抗腫瘤效果可能是藉由增強腫瘤免疫效果所介導的。為驗證該機理，從人外周血中提取CD4陽性的T細胞後，在培養的T細胞中加入不同濃度的抗B7-H4抗體，包括人源化抗體hu2G6和人源化抗體hu1C9。具體結果如第4圖及下表所示，人源化抗體hu2G6和人源化抗體hu1C9具有提高T細胞增殖的作用，可藉由增強腫瘤免疫達到抗腫瘤的效果。

<110> 江蘇豪森藥業集團有限公司上海翰森生物醫藥科技有限公司

<120> 抗B7-H4抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

<130> 719011CPCT

<160> 111

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

<210> 9

<211> 123

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 9

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 10

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 12

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 13

<210> 14

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 14

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 15

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 16

<210> 17

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 17

<210> 18

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 18

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 19

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 20

<210> 21

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 21

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 22

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 24

<210> 25

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 25

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 26

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 27

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 28

<210> 29

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 29

<210> 30

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 30

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 31

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 32

<210> 33

<211> 113

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 33

<210> 34

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 34

<210> 35

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 35

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 36

<210> 37

<211> 4

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 37

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 38

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 39

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 40

<210> 41

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 41

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 42

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 43

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 44

<210> 45

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 45

<210> 46

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 46

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 47

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(10)

<223> 突變的2F8的HCDR1區

<400> 48

<210> 49

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 49

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 50

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 51

<210> 52

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 52

<210> 53

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 53

<210> 54

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 54

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 55

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 56

<210> 57

<211> 118

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 57

<210> 58

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 58

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 59

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 60

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 61

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 62

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 63

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 64

<210> 65

<211> 115

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 65

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 66

<210> 67

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 67

<210> 68

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 68

<210> 69

<211> 6

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 69

<210> 70

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 70

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 71

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 72

<210> 73

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(10)

<223> 人源化2F8的HCDR1

<400> 73

<210> 74

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(17)

<223> 人源化2F8的HCDR2

<400> 74

<210> 75

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(120)

<223> hu2F7 HCVR

<400> 75

<210> 76

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu2F7 LCVR

<400> 76

<210> 77

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(115)

<223> hu2F8 HCVR

<400> 77

<210> 78

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu2F8 LCVR

<400> 78

<210> 79

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(118)

<223> hu2G6 HCVR

<400> 79

<210> 80

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu2G6 LCVR

<400> 80

<210> 81

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(115)

<223> hu1C9 HCVR

<400> 81

<210> 82

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu1C9 LCVR

<400> 82

<210> 83

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(450)

<223> hu2F7 HC

<400> 83

<210> 84

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(214)

<223> hu2F7 LC

<400> 84

<210> 85

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(445)

<223> hu2F8 HC

<400> 85

<210> 86

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(214)

<223> hu2F8 LC

<400> 86

<210> 87

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(448)

<223> hu2G6 HC

<400> 87

<210> 88

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(214)

<223> hu2G6 LC

<400> 88

<210> 89

<211> 445

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(445)

<223> hu1C9 HC

<400> 89

<210> 90

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(214)

<223> hu1C9 LC

<400> 90

<210> 91

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(120)

<223> hu2F7 HCVR

<400> 91

<210> 92

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu2F7 LCVR

<400> 92

<210> 93

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu2F7 LCVR

<400> 93

<210> 94

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu2F7 LCVR

<400> 94

<210> 95

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(115)

<223> hu2F8 HCVR

<400> 95

<210> 96

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(115)

<223> hu2F8 HCVR

<400> 96

<210> 97

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu2F8 LCVR

<400> 97

<210> 98

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (1)..(107)

<223> hu2F8 LCVR

<400> 98

<210> 99

<211> 463

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(463)

<223> huB7-H4-Fc

<400> 99

<210> 100

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (1)..(276)

<223> huB7-H4-his

<400> 100

<210> 101

<211> 20

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 101

<210> 102

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(20)

<223> 抗原片段P12的變體

<400> 102

<210> 103

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(20)

<223> 抗原片段P12的變體

<400> 103

<210> 104

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(20)

<223> 抗原片段P12的變體

<400> 104

<210> 105

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(20)

<223> 抗原片段P12的變體

<400> 105

<210> 106

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(20)

<223> 抗原片段P12的變體

<400> 106

<210> 107

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(20)

<223> 抗原片段P12的變體

<400> 107

<210> 108

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 變體

<222> (1)..(20)

<223> 抗原片段P12的變體

<400> 108

<210> 109

<211> 7

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 109

<210> 110

<211> 5

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 110

<210> 111

<211> 8

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 111

Claims

一種抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其包含：抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40；SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48；SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：56；SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：64；SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：72；和抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所述的HCDR：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5；SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：45；SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：53； SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：61；SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：69；SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：74。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3； SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中所述的抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：61所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗體重鏈可變區包含分別如：SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段選自鼠源抗體或其片段、嵌合抗體或其片段、人抗體或其片段以及人源化抗體或其片段。
如申請專利範圍第14項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈可變區進一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區。
如申請專利範圍第15項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈可變區包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈FR區。
如申請專利範圍第16項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈可變區使用胺基酸突變後增強ADCC毒性的IgG1。
如申請專利範圍第14項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區選自含有如下序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：82。
如申請專利範圍第18項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體輕鏈可變區選自含有如下序列的輕鏈可變區：SEQ ID NO：76或SEQ ID NO：80。
如申請專利範圍第14項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區選自含有如下序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：81。
如申請專利範圍第20項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體重鏈可變區選自含有如下序列的重鏈可變區：SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：79。
如申請專利範圍第14項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的輕鏈選自含有如下序列的輕鏈：SEQ ID NO：84，SEQ ID NO：86，SEQ ID NO：88或SEQ ID NO：908。
如申請專利範圍第22項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中所述人源化抗體的輕鏈選自含有如下序列的輕鏈：SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：88。
如申請專利範圍第14項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈選自含有如下序列的重鏈：SEQ ID NO：83，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：87或SEQ ID NO：89。
如申請專利範圍第24項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體的重鏈選自含有如下序列的重鏈：SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：87。
如申請專利範圍第14項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含：(1)SEQ ID NO：76的輕鏈可變區和SEQ ID NO：75的重鏈可變區；(2)SEQ ID NO：78的輕鏈可變區和SEQ ID NO：77的重鏈可變區；(3)SEQ ID NO：80的輕鏈可變區和SEQ ID NO：79的重鏈可變區；或(4)SEQ ID NO：82的輕鏈可變區和SEQ ID NO：81的重鏈可變區。
如申請專利範圍第14項所述的B7-H4抗體或其抗原結合片段，其中該人源化抗體包含：(1)SEQ ID NO：84的輕鏈和SEQ ID NO：83的重鏈；(2)SEQ ID NO：86的輕鏈和SEQ ID NO：85的重鏈； (3)SEQ ID NO：88的輕鏈和SEQ ID NO：87的重鏈；或(4)SEQ ID NO：90的輕鏈和SEQ ID NO：89的重鏈。
一種抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其具有至少一項下述特徵：(1)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸41至60的表位；(2)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸53至59的表位。
一種抗B7-H4抗體或其抗原結合片段，其具有至少一項下述特徵：(1)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸53的表位；(2)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸54的表位；(3)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸56的表位；(4)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸57的表位；(5)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸58的表位；(6)結合B7-H4中含有SEQ ID NO：92中胺基酸59的表位。
一種DNA序列，其編碼如申請專利範圍第1至29項中任一項所述的抗體或抗原結合片段。
一種表達載體，含有如申請專利範圍第30項所述的DNA序列。
一種宿主細胞，導入或含有如申請專利範圍第31項所述的表達載體。
如申請專利範圍第32項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為細菌。
如申請專利範圍第33項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為大腸桿菌。
如申請專利範圍第32項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為酵母菌。
如申請專利範圍第35項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為畢赤酵母。
如申請專利範圍第32項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第37項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞。
一種生產抗體的方法，包括：培養申請專利範圍第32至38項中任一項所述的宿主細胞，從培養物分離抗體以及對抗體進行純化。
一種醫藥組成物，其含有如申請專利範圍第1至29項中任一項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種檢測試劑，其包含申請專利範圍第1至29項中任一項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段。
一種診斷劑，其包含申請專利範圍第1至29項中任一項的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段。
一種申請專利範圍第1至29項中任一項所述的抗B7-H4抗體或其抗原結合片段或申請專利範圍第40項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療或預防B7-H4介導的疾病或病症的藥物。
如申請專利範圍第43項所述的用途，其中，該疾病為癌症。
如申請專利範圍第44項所述的用途，其中，該疾病為表達B7-H4的癌症。
如申請專利範圍第45項所述的用途，其中，該癌症為乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。