TWI902681B

TWI902681B - 抗ｃｄ７９ｂ抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

Info

Publication number: TWI902681B
Application number: TW109102573A
Authority: TW
Inventors: 楊翠青; 唐任宏
Original assignee: 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司
Priority date: 2019-01-28
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2025-11-01

Abstract

本公開涉及抗CD79B抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本公開涉及包含該抗CD79B抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗CD79B抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物的用途。尤其地，本公開涉及一種人源化的抗CD79B抗體，在製備治療淋巴瘤(如DLBCL)的藥物中的用途。

Description

抗CD79B抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

本申請要求2019年1月28日提交的中國專利申請《抗CD79B抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途》(申請號201910083330.4)的優先權，藉由引用併入此處。

本申請涉及一種抗人CD79B抗體及抗原結合片段，包含所述抗CD79B抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗CD79B抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物，特別是治療淋巴瘤(DLBCL)藥物的用途。

惡性腫瘤(癌症)是全球第二位死因，僅排在心臟病之後。淋巴瘤是起源於淋巴造血系統的惡性腫瘤，是全世界最常見的血液腫瘤。近年來中國淋巴瘤發病率呈上升趨勢，目前發病率約為每10萬人6.68例。

淋巴瘤分為非何杰金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)和何杰金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma，HL)兩類。非何杰金淋巴瘤是一組具有較強異質性的淋巴細胞異常增殖性疾病的總稱，其發病率遠高於何杰金淋巴瘤，約占淋巴瘤的80%以上。其中彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是成人最常見的淋巴瘤類型，約占所有非何杰金淋巴瘤的32.5%；在亞洲人群中，這一比例更高，接近40%。好發於老年患者，中位發病年齡為60-64歲，男性患者略多於女性患者。

目前，彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)的一線標準方案為利妥昔單抗聯合化療方案(R-CHOP)。在利妥昔單抗上市之前，以蒽環類為基礎的CHOP(環磷醯胺、多柔比星、長春新堿、潑尼松)方案是DLBCL的一線標準治療方案。R-CHOP治療方案使得DLBCL患者的長期存活率得到明顯改善，臨床試驗結果顯示：相比於傳統的CHOP方案，R-CHOP方案治療DLBCL能顯著延長患者的中位總生存時間達4.9年，中位無病生存時間超過6.6年，5年無疾病進展生存率從30%提高至54%。但仍有10%至15%的難治患者沒有反應，並有20%至30%的患者出現復發。而且不是所有DLBCL患者都適合R-CHOP方案，如80歲以上的高齡患者，他們的體能不允許進行標準的R-CHOP治療；又如，對於侵襲性更高的淋巴瘤類型以及復發性淋巴瘤，R-CHOP方案可能無效。因此，開發新一代副作用更小的免疫療法對於DLBCL的治療是極其必要的。

根據淋巴細胞的起源分類，彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)屬於B細胞淋巴瘤。B細胞抗原受體(B cell receptor，BCR)複合物是B細胞表面最主要的分子。BCR複合物由識別和結合抗原的膜免疫球蛋白(mIg)和傳遞抗原刺激信號的Ig α(CD79a)和Ig β(CD79B)異源二聚體組成。Ig α和Ig β分別為47kDa和37kDa糖蛋白，屬於免疫球蛋白超家族成員，編碼Ig α和Ig β的基因分別稱為mb-1和B29。Ig α和Ig β胞膜外區胺基端處均有一個Ig樣結構域。Ig α和 Ig β均可作為蛋白酪胺酸激酶的受質，參與BCR信號轉導。BCR廣泛表達於B細胞淋巴瘤以及正常B細胞上。鑒於靶向CD20的利妥昔單抗在臨床上所取得的成功以及可靠的安全性，開發靶向BCR的治療方法也應該具有良好的療效和安全性。

針對仍未被滿足的與CD79B相關的醫療需求，目前已有包括羅氏製藥的多家國際製藥公司在積極研發針對CD79B抗體和相關產品。相關專利如US9085630、WO2009012256、WO2009012268、WO2009099728、WO2014011519、WO2014011521、WO2016090210、WO2016205176、WO2016040856、WO2016021621、WO2017009474、WO2014177615等。

基於CD79B的表達，生成針對CD79B抗原的治療性抗體是有益的。本領域對於開發有效的抗人CD79B抗體，用於造血系統腫瘤治療或延緩進展，仍有未滿足的需求。

本公開提供一種抗CD79B抗體或其抗原結合片段，其編碼核酸、載體、宿主細胞、抗體藥物偶聯物、醫藥組成物，及其用於治療或延緩癌症(特別是造血系統腫瘤)的方法。

第一方面，本公開提供一種抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區，其中：

抗體重鏈可變區，其包含至少1個選自如以下序列所示的決定簇互補區(HCDR)：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25；和/或

抗體輕鏈可變區，其包含至少1個選自如以下序列所示的決定簇互補區(LCDR)：SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：26。

一些實施方案中，提供一種抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其中：

抗體重鏈可變區，包含：

(I)分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(II)分别如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(III)分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

和/或抗體輕鏈可變區，包含：

(I)分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(II)分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(III)分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

一些具體實施方案中，提供抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其包含選自以下(I)至(II)中的任一項：

(I)重鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(II)重鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(III)重鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

一些具體的實施方案中，提供抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其中：

重鏈可變區，包含：

(I)如SEQ ID NO：3所示的序列或與SEQ ID NO：3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：5所示的序列或與SEQ ID NO：5具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

(III)如SEQ ID NO：17所示的序列或與SEQ ID NO：17具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；

和/或輕鏈可變區，包含：

(I)如SEQ ID NO：4所示的序列或與SEQ ID NO：4具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：6所示的序列或與SEQ ID NO：6具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

(III)如SEQ ID NO：18所示的序列或與SEQ ID NO：18具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列。

一些具體的實施方案中，該抗人CD79B抗體或抗原結合片段的重鏈可變區如序列SEQ ID NO：3所示，輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：4所示。

在另一些具體的實施方案中，該抗人CD79B抗體或抗原結合片段的重鏈可變區如序列SEQ ID NO：5所示，輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：6所示。

在另一些具體的實施方案中，該抗人CD79B抗體或抗原結合片段的重鏈可變區如序列SEQ ID NO：17所示，輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：18所示。

在一些具體的實施方案中，抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其中：

重鏈，包含：

(I)如SEQ ID NO：19所示的序列或與SEQ ID NO：19具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：21所示的序列或與SEQ ID NO：21具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；

和/或輕鏈，包含：

(I)如SEQ ID NO：20所示的序列或與SEQ ID NO：20具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：22所示的序列或與SEQ ID NO：22具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；

一些具體的實施方案中，該抗人CD79B抗體或抗原結合片段的重鏈如序列SEQ ID NO：19所示，輕鏈如序列SEQ ID NO：20所示。

在另一些具體的實施方案中，該抗人CD79B抗體或抗原結合片段的重鏈如序列SEQ ID NO：21所示，輕鏈如序列SEQ ID NO：22所示。

一些實施方案中，提供如上該的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其為鼠源抗體或其片段。

一些具體實施方案中，該鼠源抗CD79B抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈FR區和/或輕鏈恆定區。

一些具體實施方案中，該鼠源抗CD79B抗體或其抗原結合片段包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈FR區和/或重鏈恆定區。

一些實施方案中，提供如上所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其為嵌合抗體或其片段。一些具體實施方案中，該嵌合抗CD79B抗體或其抗原結合片段包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈FR區和/或輕鏈恆定區，和/或人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區和/或重鏈恆定區。

一些實施方案中，提供一種如上所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其為人源化抗體或其片段、人抗體或其片段。

一些實施方案中，提供一種如上所述的抗人CD79B人源化抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈序列為SEQ ID NO：20或其變體序列所示；該變體序列在輕鏈包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸變化，或與SEQ ID NO：20具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%或99%同一性。重鏈序列為SEQ ID NO：19或其變體序列所示；該變體序列在重鏈包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸變化，或與SEQ ID NO：19具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

一些實施方案中，提供一種如上所述的抗人CD79B的人源化抗體或其抗原結合片段，其中輕鏈序列為SEQ ID NO：22或其變體序列所示，或與SEQ ID NO：22具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性；該的變體序列在輕鏈包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸變化。重鏈序列為SEQ ID NO：21或其變體序列所示；該變體序列在重鏈包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸變化，或與SEQ ID NO：21具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。

一些實施方案中，一種如上所述的抗CD79B的人抗體或其片段，其進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的恆定區。一些具體實施方案中，包含人IgG1或IgG2恆定區。

一些實施方案中，一種如上所述的抗人CD79B的人源化抗體或其片段，其進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈FR區，更佳包含人源IgG1或IgG2重鏈FR區。

一些實施方案中，一種如上所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自Fab、Fv、sFv、F(ab’)₂、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體(peptibody)、結構域抗體和多特異性抗體(雙特異性抗體、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)和四鏈抗體(tetrabody)、串聯二-scFv、串聯三-scFv)。

一些實施方案中，提供一種分離的單株抗體或其抗原結合片段，能與上述的單株抗體或其抗原結合片段競爭結合人CD79B或其表位。

本公開中抗人CD79B抗體的VH/VL CDR的胺基酸残基由Chothia編號系统確定並注釋。

第二方面，本公開提供一種編碼如上所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段的多核苷酸，多核苷酸可以是DNA或RNA。

第三方面，本公開提供一種含有如上所述的多核苷酸的表達載體，表達載體可以是真核表達載體、原核表達載體、病毒載體。

第四方面，本公開提供一種用如上所述的表達載體轉化的宿主細胞，其可以是真核細胞、原核細胞。

一些實施方案中，該宿主細胞為細菌、酵母菌、哺乳動物細胞。一些具體實施方案中，該宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞。

第五方面，本公開提供一種抗體藥物偶聯物。

根據本公開的抗體藥物偶聯物包含或由以下組成：抗體、接頭、藥物。

在具體的實施方案中，根據本公開的抗體藥物偶聯物是藉由接頭共價偶聯至藥物的抗體。

一些實施方案中，該抗體藥物偶聯物含有細胞毒劑。一些具體實施方案中，該細胞毒劑選自毒素、化療劑、抗生素、放射性同位素和溶核酶。

第六方面，本公開提供一種用於製備抗人CD79B抗體或其抗原結合片段的方法包括：在如前所述的宿主細胞中表達该抗體或其抗原結合片段，並自该宿主細胞中分離该抗體或其抗原結合片段。

第七方面，本公開提供一種組合物，例如醫藥組成物，其含有治療有效量的如上所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段和可藥用的賦形劑、稀釋或載體。

在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物單位劑量中含抗CD79B抗體或其抗原結合片段的量為0.1mg至2000mg，在一些具體實施方式中為1mg至1000mg。

第八方面，本公開進一步提供選自以下的任一項或組合在製備藥物中的用途：根據本公開的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段、根據本公開的醫藥組成物、根據本公開的抗體藥物偶聯物；其中，該藥物用於該藥物或醫藥組成物用於治療增殖性疾病或延緩增殖性疾病進展；該增殖性疾病可以是癌症或腫瘤。在一些實施方案中，該癌症或腫瘤是淋巴瘤或白血病。在具體的實施方案中，該淋巴瘤選自：瀰漫大B細胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤。在具體的實施方案中，該非何杰金氏淋巴瘤選自：攻擊性NHL、復發性攻擊性NHL、復發性無痛性NHL、頑固性NHL、頑固性無痛性NHL。在具體的實施方案中，該白血病選自：慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、急性淋巴細胞性白血病。

第九方面，本公開提供一種治療或預防增殖性疾病或延緩增殖性疾病進展的方法，該方法包括给予受试者治療或延緩疾病有效量的根據本公開的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段、或根據本公開的醫藥組成物、或根據本公開的抗體-藥物偶聯物；其中，該增殖性疾病可以是癌症或腫瘤。在一些實施方案中，該癌症或腫瘤是淋巴瘤或白血病。在具體的實施方案中，該淋巴瘤選自：瀰漫大B細胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤。在具體的實施方案中，該非何杰金氏淋巴瘤選自：攻擊性NHL、復發性攻擊性NHL、復發性無痛性NHL、頑固性NHL、頑固性無痛性NHL。在具體的實施方案中，該白血病選自：慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、急性淋巴細胞性白血病。

第1圖為用人CD79B ECD-hFc蛋白免疫Balb/c小鼠的血清效價ELISA檢測結果。

第2圖為用人CD79B ECD-hFc蛋白免疫Balb/c小鼠的血清效價FACS檢測結果。

第3圖為用人CD79B ECD-hFc蛋白免疫SJL小鼠的血清效價ELISA檢測結果。

第4圖為用人CD79B ECD-hFc蛋白免疫SJL小鼠的血清效價FACS檢測結果。

第5圖為用人CD79B ECD-his蛋白免疫SJL小鼠的血清效價ELISA檢測結果。

第6圖為用人CD79B ECD-his蛋白免疫SJL小鼠的血清效價FACS檢測結果。

第7圖為抗人CD79B小鼠單株抗體ELISA的檢測結果，其中hIgG1為陰性對照抗體，SN8為陽性對照抗體。

第8圖為抗人CD79B小鼠單株抗體FACS的檢測結果，其中hIgG1為陰性對照抗體，SN8為陽性對照抗體。

第9圖為抗人CD79B小鼠單株抗體交叉反應性的FACS檢測結果，其中mIgG為陰性對照抗體；抗cyno HR008為抗猴CD79B小鼠單株抗體，其抗體序列來源於專利WO2009012268A1中的抗猴CD79B小鼠單株抗體(純株號10D10)，作為陽性對照抗體。

發明詳述 術語

為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。

本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。

“CD79B”指任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類(例如人、獼猴(cyno))和齧齒類(例如小鼠和大鼠))的任何CD79B。術語“CD79B”涵蓋“全長”、未加工的CD79B以及自細胞中加工得到的任何形式的CD79B。該術語還涵蓋天然存在的CD79B變體，例如剪接變體、等位變體和同種型(isoform)。本文所述CD79B多肽可以從多種來源分離，諸如人組織類型或其它來源，或者藉由重組或合成方法製備。

本公開所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1，LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1，HCDR2和HCDR3。該抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Chothia(ABM)編號規則。

術語“人抗體”或“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表達、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：

(1)從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；

(2)從經轉化以表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；

(3)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及

(4)藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。

此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。

術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的對人CD79B或其表位的單株抗體。製備時用CD79B抗原(或其表位)注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本公開一個具體的實施方案中，該鼠源CD79B抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。

術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本公開的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸残基(如通過體外隨機或位點特異性誘變或通過體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人物種的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜带大量非人物種蛋白成分，從而誘導的强烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該的人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將第一物種抗體的可變區與第二物種抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕第一物種抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌第一物種特異性單抗的融合瘤，然後從第一物種(例如小鼠)融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖第二物種(如人)抗體的恆定區基因，將第一物種可變區基因與第二物種恆定區基因連接成嵌合基因後插入載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。第二物種(例如人)抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。

“抗原結合片段”，指保留了完整抗體的抗原結合活性的任何片段。具體而言，可以提及但不限於Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，以及與人CD79B結合的Fv片段sFv片段。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。

本公開的術語“與CD79B結合”，指能與CD79B或其表位相互作用。該CD79B或其表位可以是人源的。本公開的術語“抗原結合位點”指抗原上線性的或不連續的，由本公開抗體或抗原結合片段識別的線性位點或三維空間位點。

術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文該的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。

“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用重組人CD79B或其表位作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10^-7M或甚至更小的平衡解離常數(K_D)與預定的抗原或其表位結合，並且其與預定抗原或其表位結合的親和力(affinity)是其與預定抗原(或其表位)或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。

“交叉反應”是指本公開的抗體與來自不同物種的CD79B結合的能力。例如，結合人CD79B的本公開的抗體也可以結合另一物種的CD79B。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達CD79B的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振分析，或流式細胞術。

“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。對CD79B的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生CD79B結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗CD79B抗體接觸時，與未與抗CD79B抗體接觸的CD79B相比，任何可測量的CD79B結合親和力降低。

“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。

生產和純化抗體或抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南(5-8章和15章)。如，可以用人CD79B或其片段免疫小鼠，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈(SEQ ID NO：20)和輕鏈(SEQ ID NO：21)的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

本公開的抗體指單株抗體。本公開所述的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術(如CDR-嫁接)，或其它現有技術進行重組得到。

可使用本領域技術人員已知的常規技術，就與相同表位的結合競爭性篩選抗體。例如，可進行競爭和交叉競爭研究，以獲得彼此競爭或交叉競爭與抗原結合的抗體。基於它們的交叉競爭來獲得結合相同表位的抗體的高通量方法描述於國際專利公開WO03/48731中。因此，可使用本領域技術人員已知的常規技術，獲得與本公開的抗體分子競爭結合CD79B上的相同表位的抗體及其抗原結合片段。

“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑、組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”、“施用”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防性處理、或預防性措施、研究和診斷應用。

“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，諸如包含本公開的任一種抗體或其抗原結合片段或其偶聯物的組合物，該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種疾病或其症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。

“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。

“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同一性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同一性百分率時進行比較。

本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，術語“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。

“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或抗原結合片段或偶聯物、或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

實施例

以下結合實施例用於進一步描述，但這些實施例並非限制的範圍。

實施例或測試例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

實施例1. 蛋白抗原的選殖表達

用本領域公知的重疊延伸PCR方法構建抗體(包含輕、重鏈)和抗原，將重疊延伸PCR得到的DNA片段用HindIII/BstBI這兩個酶切位點插入到表達載體pEE6.4((Lonza Biologics)中，在293F細胞(Invitrogen，Cat# R790-07)中表達得到。所得重組蛋白用於免疫或篩選。人CD79B基因序列來源於NCBI(NP_000617.1)，其細胞外區域(ECD)包含159個胺基酸(Met1-Asp159)。

>人CD79B細胞外區域(ECD)和人Fc區域融合蛋白(人CD79B ECD-hFc)的胺基酸序列： (SEQ ID NO：1)。

>人CD79B細胞外區域(ECD)和His標簽的融合蛋白(人CD79B ECD-His)的胺基酸序列： (SEQ ID NO：2)。

實施例2. 小鼠單株抗體的製備

1、小鼠免疫和血清效價檢測

以人CD79B細胞外區域(ECD)和人Fc區域融合蛋白(人CD79B ECD-hFc)以及人CD79B細胞外區域(ECD)和His標簽的融合蛋白(人CD79B ECD-His)分別作為免疫原，藉由腹腔注射法對Balb/c和SJL小鼠進行免疫，刺激小鼠體內產生針對人CD79B細胞外區域(ECD)的抗體。

實驗步驟如下：

1)腹腔注射免疫法。根據免疫程序計算出該次免疫所需的抗原量。蛋白抗原按照要求用PBS稀釋抗原到相應濃度，隨後進行抗原的乳化。將乳化好的抗原和佐劑混合物轉移到2.0mL無菌注射器中，注意排空氣泡。右手抓住小鼠尾巴，左手的大拇指和食指輕輕抓住小鼠的頭頸部皮膚，腹腔向上，用75%酒精棉球擦拭小鼠右側腹部注射部位。將事先吸好抗原藥物的注射器針尖斜面向上，小鼠頭部向下，平行刺入皮內後，注射器與腹腔呈45度角刺入小鼠腹腔，緩慢注入抗原和佐劑混合物，免疫完成後進行至少2h觀察。

2)小鼠血清的收集。將每只小鼠對應的血清管號做好標記，檢查小鼠耳釘號，單手抓取小鼠，藉由小鼠面部頜下靜脈採取大約100μl全血，將收集的全血樣品室溫靜置大約2h後離心收集離心管上部血清。一周內可將血清存放於4℃冰箱，用於抗體效價等相關實驗檢測。若長期保存血清可置於-80℃冰箱，避免重複凍融。

3)免疫小鼠ELISA血清效價測定。實驗開始前將96孔板做好相應的標記，以1μg/mL抗原濃度，每孔50μl，4℃冰箱過夜包被。次日，將前天包被好的抗原板取出，洗板機清洗一次(清洗液：1× PBST)。清洗後以1×PBST配置的1% BSA封閉液37℃封閉1小時。1×PBST清洗液洗板3次後，加入不同稀釋濃度的待檢血清37℃溫箱，孵育1小時。1×PBST清洗液洗板3次後，加入100μl 1：5000稀釋的羊抗鼠二抗，37℃溫箱孵育0.5小時洗板後，取TMB顯色液A液和B液1：1比例混合後顯色。15分鐘用1N鹽酸終止顯色反應。在Spectra Max M5多功能讀板機上，檢測450nm的螢光值。

4)免疫小鼠FACS血清效價測定。DoHH2細胞或猴外周血單核細胞懸液離心後以含0.1%BSA的PBS重新懸浮細胞後計數，加入各組免疫小鼠的待測血清，室溫孵育60分鐘後清洗細胞三次後加入抗小鼠IgG Fc-FITC二抗，避光室溫孵育30分鐘後清洗細胞三次，用含0.1%BSA的PBS輕輕重新懸浮細胞，上機檢測。

各組小鼠血清效價ELISA和FACS檢測結果見第1圖至第7圖。

人CD79b ECD-hFc蛋白共免疫5隻Balb/c小鼠，編號為5491、5492、5493、5494、5495。血清效價ELISA檢測結果見第1圖。結果表明，小鼠免疫血清效價達到1：100K以上。小鼠血清FACS檢測結果見第2圖，可見小鼠血清中產生的抗體可特異性識別DoHH2細胞表面的CD79B蛋白。

人CD79b ECD-hFc蛋白共免疫5隻SJL小鼠，編號為5496、5497、5498、5499、5500。血清效價ELISA檢測結果見第3圖。結果表明，小鼠免疫血清效價達到1：100K以上。小鼠血清FACS檢測結果見第4圖，可見小鼠血清中產生的抗體可特異性識別DoHH2細胞表面的CD79B蛋白。

人CD79b ECD-his蛋白共免疫5隻SJL小鼠，編號為5726、5727、5728、5729、5730。血清效價ELISA檢測結果見第5圖。結果表明，小鼠免疫血清效價達到1：10K以上。小鼠血清FACS檢測結果見第6圖，可見小鼠血清中產生的抗體可特異性識別DoHH2細胞表面的CD79B蛋白。

藉由以上結果可知，免疫的小鼠中產生了針對CD79B的特異性抗體，以上小鼠可用於細胞融合以產生能夠分泌針對CD79B的特異性抗體的融合瘤細胞系。

2、融合瘤製備和抗體篩選

細胞融合是在自發或人工誘導下，促使小鼠的淋巴細胞與骨髓瘤細胞SP2/0(ATCC，CCL-121^TM)融合成融合瘤細胞，融合瘤細胞既具有抗體分泌功能又能無限增殖。利用電融合方法對免疫組小鼠的淋巴細胞和骨髓瘤細胞進行融合，用於後續抗體篩選。

1)電融合實驗。融合前一週將SP2/0細胞於10%DMEM培養基中進行擴大培養。將已處死的小鼠於生物安全櫃中摘取脾臟和淋巴結於培養皿中進行沖洗研磨，收集淋巴細胞。將SP2/0和淋巴細胞按比例混合，啟動電融合儀，設置程序，進行融合。融合後細胞鋪於96孔板中，37℃，5% CO₂培養箱中培養，每天觀察細胞狀態，融合後5天統計細胞融合率。融合後9-14天對融合的融合瘤細胞進行篩選，挑選陽性孔細胞於24孔板中擴大培養。

2)有限稀釋法進行亞選殖。將需要亞選殖的細胞株自24孔培養孔中重新懸浮起來，進行計數。稀釋每株細胞株的細胞濃度至5-10個/mL，將稀釋好的細胞懸液加入15cm一次性培養皿中，於96孔培養板中每孔加0.2mL，每孔含細胞為1-2個。將鋪好細胞的96孔板放進 37℃，5%CO₂培養箱中培養。7-10天後根據細胞的生長情況對亞選殖板進行檢測篩選，並挑選陽性純株至24孔進行進一步陽性確認。

3)ELISA篩選。實驗開始前將96孔板做好相應的標記，以1μg/mL抗原濃度，每孔50μl，4℃冰箱過夜包被。次日，將前天包被好的抗原板取出，洗板機清洗一次(清洗液：1x PBST)。清洗後以1×PBST配置的1% BSA封閉液37℃封閉1小時。1×PBST清洗液洗板3次後，加入50μl待檢細胞上清37℃溫箱，孵育1小時。1×PBST清洗液洗板3次後，加入100μl 1：5000稀釋的羊抗鼠二抗，37℃溫箱孵育0.5小時洗板後，取TMB顯色液A液和B液1：1比例混合後顯色。15分鐘用1N鹽酸終止顯色反應。在Spectra Max M5多功能讀板機上，檢測450nm的螢光值。

4)FACS篩選。DOHH2細胞懸液離心後以含0.1%BSA的PBS重新懸浮細胞後計數，加入待測細胞上清，室溫孵育60分鐘後清洗細胞三次後加入抗小鼠IgG Fc-FITC二抗，避光室溫孵育30分鐘後清洗細胞三次，用含0.1%BSA的PBS輕輕重新懸浮細胞，上機檢測。

5)融合瘤陽性純株鑒定。藉由對小鼠脾細胞的融合和亞選殖篩選後，我們獲得多個針對人CD79B抗原的特異性抗體，對其中ELISA和FACS結合力最好的17株融合瘤進行抗體生產純化。抗人CD79B融合瘤陽性純株細胞培養上清ELISA檢測結果見表1。抗人CD79B融合瘤陽性純株細胞培養上清FACS檢測結果見表2。均使用mIgG作為陰性對照。

表1. 抗人CD79B融合瘤陽性純株的ELISA檢測結果

表2. 抗人CD79B融合瘤陽性純株的FACS檢測結果

3、小鼠單株抗體的生產、純化及鑒定

1)小鼠單株抗體生產和純化。顯微鏡下觀察需要抗體生產的融合瘤細胞，長至70%以上且細胞狀態良好，收集細胞並用Countstar IC1000型細胞計數儀進行計數。用配製好的培養基將細胞濃度調至1×10⁵至5×10⁵個/mL，轉移至Roller Bottle。將轉好細胞的Roller Bottle送到滾瓶培養箱中37℃培養10-15天，每天觀察細胞生長狀況，待培養液變橙黃且透明，取出待純化。細胞上清藉由Protein A柱子進行抗體純化，按照常規方法操作。

2)抗人CD79B小鼠單株抗體ELISA檢測。實驗開始前將96孔板做好相應的標記，以1μg/mL抗原濃度，每孔50μl，4℃冰箱過夜包被。次日，將前天包被好的抗原板取出，洗板機清洗一次(清洗液：1×PBST)。清洗後以1×PBST配置的1% BSA封閉液37℃封閉1小時。1×PBST清洗液洗板3次後，加入50μl按照100nM，1：10稀釋過的抗體，放入37℃溫箱，孵育1小時。×PBST清洗液洗板3次後，加入100μl 1：5000稀釋的羊抗鼠二抗，37℃溫箱孵育0.5小時。洗板後，取TMB顯色液A液和B液1：1比例混合後顯色。15分鐘用1N鹽酸終止顯色反應。在Spectra Max M5多功能讀板機上，檢測450nm的螢光值。其中，有三株抗人CD79B小鼠單株抗體的ELISA結合力最強，包括mAb015、mAb016和mAb017(具體數據見第7圖)。其中hIgG1為陰性對照抗體，SN8為陽性對照抗體。SN8是羅氏製藥開發的抗體偶聯藥物波妥珠單抗維多丁(polatuzumab vedotin)中所使用的抗體(序列參考序列來源：US20170362318A)。目前波妥珠單抗維多丁已被FDA批准上市。從結果可以看出，在ELISA實驗中，本公開較佳出的三株抗人CD79B小鼠單株抗體mAb015、mAb016和mAb017的結合力與SN8類似。

3)抗人CD79B小鼠單株抗體FACS檢測。DOHH2細胞懸液離心後以含0.1%BSA的PBS重新懸浮細胞後計數，加入100μl按照100nM，1：10稀釋過的抗體，室溫孵育1小時。清洗細胞三次後加入抗小鼠IgG Fc-FITC二抗，避光室溫孵育30分鐘後清洗細胞三次，用含0.1%BSA的PBS輕輕重新懸浮細胞，上機檢測。其中，有3個抗人CD79B小鼠單株抗體的FACS結合力最強，包括mAb015、mAb016和mAb017(具體數據見第8圖)。其中hIgG1為陰性對照抗體，SN8為陽性對照抗體。從結果可知，在FACS實驗中，本公開較佳出的三株抗人CD79B小鼠單株抗體mAb015、mAb016和mAb017的結合力均優於SN8。

4)抗人CD79B小鼠單株抗體交叉反應性FACS檢測。採用瞬時轉染的方法得到293F-cynoCD79B細胞，細胞懸液離心後以含0.1%BSA的PBS重新懸浮細胞後計數，加入100μl抗體，濃度分別為10μg/mL和1μg/mL。室溫孵育1小時。清洗細胞三次後加入抗小鼠IgG Fc-FITC二抗，避光室溫孵育30分鐘後清洗細胞三次，用含0.1%BSA的PBS輕輕重新懸浮細胞，上機檢測。抗人CD79B小鼠單株抗體交叉反應性FACS檢測結果見第9圖。其中mIgG為陰性對照抗體，抗-cyno HR008為抗猴CD79B小鼠單株抗體，其抗體序列來源於專利WO2009012268A1中的抗猴CD79B小鼠單株抗體(純株號10D10)。由結果可知，本公開所篩選到的所有抗人CD79B小鼠單株抗體均不識別猴CD79B。

5)抗人CD79B小鼠單株抗體SPR檢測。採用表面等離子共振技術(surface plasmon resonance，SPR)檢測抗人CD79B抗體與其抗原人CD79B-His之間的親和力。將抗原人CD79B-His蛋白固定化至 CM5芯片。偶聯水平設定在100RU。運行緩衝液為HBS-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05%表面活性劑P20)。將稀釋好的抗體在30μl/min的流速下流過實驗通道和對比通道3分鐘，解離5分鐘。然後再生緩衝液(10mM甘胺酸緩衝液。pH1.5)在30μl/min的流速下運行30秒。數據用Biacore 8K evaluation software軟件進行分析。

實施例3. 小鼠單株抗體可變區胺基酸序列的測定

將實施例2中得到的高親和力的融合瘤單株細胞株進行可變區胺基酸序列測定，然後重組表達出人鼠嵌合抗體(chimeric antibody，cAb)，再進行進一步的抗體鑒定。用逆轉錄PCR擴增抗體基因的重鏈和輕鏈可變區，連接到載體測序得到單株抗體輕重鏈序列。首先採用RNA純化試劑盒(Qiagen公司，貨號74134，步驟見此說明書)提取實施例2中活性好的單細胞株的細胞總RNA。然後使用Invitrogen公司的貨號為18080-051 cDNA合成試劑盒製備cDNA單鏈，即Oligo-dT引物cDNA反轉錄。以此為模版，採用PCR方法合成抗體輕重鏈可變區序列，PCR產物選殖到TA載體pMD-18T，然後送去測序。將得到的抗體輕重鏈序列分別選殖到表達載體(方法見實施例1)，表達重組單株抗體，驗證活性(方法見實施例2)後，進行人源化工作。

本公開中抗人CD79B抗體的VH/VL CDR的胺基酸殘基由Chothia編號系統確定並註釋。

>小鼠融合瘤細胞單株抗體mAb015重鏈可變區： (SEQ ID NO：3)。

>小鼠融合瘤細胞單株抗體mAb015輕鏈可變區： (SEQ ID NO：4)。

>小鼠融合瘤細胞單株抗體mAb017的重鏈可變區： (SEQ ID NO：5)。

>小鼠融合瘤細胞單株抗體mAb017的輕鏈可變區： (SEQ ID NO：6)。

>小鼠融合瘤細胞單株抗體mAb016的重鏈可變區： (SEQ ID NO：17)。

>小鼠融合瘤細胞單株抗體mAb016的輕鏈可變區： (SEQ ID NO：18)。

依據Chothia編號規則的鼠源的CDR序列如表3所示：

表3. 鼠源抗人CD79B抗體的CDR序列

實施例4. 抗人CD79B抗體的人源化

將實施例3得到的鼠源抗CD79B單株抗體輕重鏈序列在抗體數據庫裡進行同源性比較後，建立人源化抗體模型。根據模型選擇回復突變篩選最優的人源化抗CD79B單株抗體為較佳分子。該方法從已經發表的小鼠Fab晶體結構模型數據庫(比如PDB數據庫)中查找與所得鼠源候選分子同源性相似的晶體結構開始，挑取高分辨率(比如<2.5Å)的Fab晶體結構，建立小鼠Fab模型。將鼠源抗體輕重鏈序列和模型中的序列比對，保留和模型中和鼠源抗體序列一致的序列，得到鼠抗體的結構模型；其中不一致的胺基酸為可能的回復突變位點。用Swiss-pdb viewer軟件運行鼠抗體結構模型，優化能量(最小化)。將模型中除CDR外的不同胺基酸位點進行回復突變，將所得的突變抗體(人源化)和人源化之前抗體對比進行活性檢測。保留活性好的人源化抗體。之後，對CDR區域優化，包括避免糖基化、脫醯胺化、氧化位點等。用基因選殖、重組表達的方法分別選殖、表達、純化上述抗體，經SPR等檢測，最終選出活性保持最好的人源化抗體hAb015和hAb017，具體數據見表4。人源化抗體hAb015和hAb017保持了跟小鼠單株抗體相似的親和力和相關功能。

表4. 人源化抗CD79B抗體的鑒定結果

人源化抗體hAb015和hAb017的序列見下。

>hAb015人源化抗體的重鏈序列： (SEQ ID NO：19)。

>hAb015人源化抗體的輕鏈序列： (SEQ ID NO：20)。

>hAb017人源化抗體的重鏈序列： (SEQ ID NO：21)。

>hAb017人源化抗體的輕鏈序列： (SEQ ID NO：22)。

實施例5. 抗CD79B抗體的內吞作用

為了檢測本公開中的CD79B抗體結合人CD79B後，是否能夠和人CD79B一起內吞到細胞內，用高表達人CD79B蛋白的DOHH-2細胞(DSMZ，ACC 47)進行細胞內吞實驗以評估抗體的內吞能力。

DOHH-2細胞按照常規懸浮細胞的方法進行培養，完全培養基的成分為：RPMI 1640培養基(GIBCO，Cat No.：11835-030)，加10%(v/v)胎牛血清(FBS)(GIBCO，Cat No.：10099-141)和青黴素/鏈黴素(GIBCO，Cat No.：15070-063)。

實驗時4℃低溫離心收集細胞，1000rpm，5分鐘。將細胞重新懸浮到10-15ml在冰上預冷的FACS緩衝液中。FACS緩衝液的成分為：磷酸鹽緩衝液(PBS)，pH7.4，加2%胎牛血清(FBS)。整個實驗過程中，FACS緩衝液放在冰上預冷。細胞計數離心後以300,000細胞/孔加入96孔板中，離心棄去上清後加入Fc封閉液，12.5μg/ml(BD，Cat No.：564220)，100μl/孔。在室溫下封閉10分鐘。然後加入20μg/ml的待測CD79B抗體至對應的孔中，4℃避光孵育1小時。用預冷的PBS緩衝液洗2遍以除去未結合的抗體。加入細胞完全培養基(具有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基)，在37℃，5% CO₂下孵育0小時、1小時、2小時、4小時。離心棄去上清後加入100μl/孔2% PFA緩衝液，重新懸浮細胞後放置10分鐘。然後用FACS緩衝液清洗3遍，然後加入100μl二抗溶液(螢光標記羊抗人二抗：1：250稀釋，濃度為2μg/ml，Biolegend，Cat#409304)，在4℃避光孵育半小時。加入預冷的PBS緩衝液，4℃離心棄上清，重複三次。細胞重新懸浮在FACS緩衝液中，200μl/孔，使用流式細胞儀(BD FACS Calibur)檢測。

結果表明，在4℃孵育時，SN8、hAb015和hAb017這3個抗體均不能被DOHH-2細胞內吞。而在37℃孵育時，1小時後大部分抗體已經被DOHH-2細胞內吞，4小時後抗體內吞達到最大值。3個抗體均具有較好的內吞作用。

<110> 上海拓界生物醫藥科技有限公司

<120> 抗CD79B抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途

<130> 702007CPCT

<150> 201910083330.4

<151> 2019-01-28

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 433

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (0)..(433)

<223> 人CD79B ECD-hFc

<400> 1

<210> 2

<211> 207

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 肽

<222> (0)..(207)

<223> 人CD79B ECD-His

<400> 2

<210> 3

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(117)

<223> 小鼠融合瘤细胞單株抗體mAb015重鏈可變區

<400> 3

<210> 4

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(112)

<223> 小鼠融合瘤细胞單株抗體mAb015輕鏈可變區

<400> 4

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(119)

<223> 小鼠融合瘤细胞單株抗體mAb017的重鏈可變區

<400> 5

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(112)

<223> 小鼠融合瘤细胞單株抗體mAb017的輕鏈可變區

<400> 6

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(7)

<223> mAb015重鏈CDR1

<400> 7

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(6)

<223> mAb015重鏈CDR2

<400> 8

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(8)

<223> mAb015重鏈CDR3

<400> 9

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(16)

<223> mAb015輕鏈CDR1

<400> 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(7)

<223> mAb015 mAb016 mAb017輕鏈CDR2

<400> 11

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(9)

<223> mAb015 mAb016 mAb017輕鏈CDR3

<400> 12

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(7)

<223> mAb017重鏈CDR1

<400> 13

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(6)

<223> mAb017重鏈CDR2

<400> 14

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(10)

<223> mAb017重鏈CDR3

<400> 15

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(16)

<223> mAb017輕鏈CDR1

<400> 16

<210> 17

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(117)

<223> mAb016的重鏈可變區

<400> 17

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(112)

<223> mAb016的輕鏈可變區

<400> 18

<210> 19

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(447)

<223> hAb015人源化抗體的重鏈序列

<400> 19

<210> 20

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(219)

<223> hAb015人源化抗體的輕鏈序列

<400> 20

<210> 21

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(449)

<223> hAb017人源化抗體的重鏈序列

<400> 21

<210> 22

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 鏈

<222> (0)..(219)

<223> hAb017人源化抗體的輕鏈序列

<400> 22

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> 結構域

<222> (0)..(7)

<223> mAb016重鏈CDR1

<400> 23

<210> 24

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

Claims

一種抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其包含：(I)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：27所示的HCDR1，分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含分别如SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如申請專利範圍第1項所述的抗人CD79B抗體或抗原結合片段，其中：重鏈可變區，包含：如SEQ ID NO：3所示的序列或與SEQ ID NO：3具有至少90%、95%、98%、99%同一性的序列；和輕鏈可變區，包含：如SEQ ID NO：4所示的序列或與SEQ ID NO：4具有至少90%、95%、98%、99%同一性的序列。
如申請專利範圍第2項所述的抗人CD79B抗體或抗原結合片段，其中，該抗人CD79B抗體或抗原結合片段的重鏈可變區如序列SEQ ID NO：3所示，且輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：4所示。
如申請專利範圍第1項所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其為鼠源抗體、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體或其片段。
如申請專利範圍第4項所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其是人源化抗體，其重鏈包含：如SEQ ID NO：19所示的序列或與SEQ ID NO：19具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列和/或輕鏈包含：如SEQ ID NO：20所示的序列或與SEQ ID NO：20具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列。
如申請專利範圍第5項所述的抗人CD79B抗體或抗原結合片段，其中，該抗CD79B抗體或抗原結合片段的重鏈如序列SEQ ID NO：19所示，且輕鏈如序列SEQ ID NO：20所示。
如申請專利範圍第4至6項中任一項所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段，其中：該人源化抗體的重鏈可變區包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈框架區；該抗原結合片段選自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和/或(Fab’)₂片段。
如申請專利範圍第7項所述的抗人CD79B抗體或抗原結合片段，其中，該人源化抗體的重鏈可變區包含人源IgG1、IgG2或IgG4的重鏈框架區。
如申請專利範圍第8項所述的抗人CD79B抗體或抗原結合片段，其中，該人源化抗體的重鏈可變區包含人源IgG1或IgG2的重鏈框架區。
一種抗體藥物偶聯物，其中該抗體含有申請專利範圍第1至9項中任一項所限定的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段。
如申請專利範圍第10項所述的藥物偶聯物，其中，該抗體藥物偶聯物含有細胞毒劑。
如申請專利範圍第11項所述的藥物偶聯物，其中，該細胞毒劑選自毒素、化療劑、抗生素、放射性同位素和溶核酶。
一種多核苷酸，其編碼申請專利範圍第1至9項中任一項所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段。
一種載體，其含有如申請專利範圍第13項所述的多核苷酸，其為真核表達載體、原核表達載體或病毒載體。
一種宿主細胞，其包含申請專利範圍第14項所述的載體。
如申請專利範圍第15項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為細菌、酵母、哺乳動物細胞。
如申請專利範圍第16項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢細胞或人胚腎293細胞。
一種製備抗人CD79B抗體或其抗原結合片段的方法，包括：在申請專利範圍第15至17項中任一項所述的宿主細胞中表達抗人CD76B抗體或其抗原結合片段，以及從培養物中分離該抗人CD79B抗體或其抗原結合片段。
一種醫藥組成物，其含有：選自以下的任一項或其任意組合：申請專利範圍第1至9項任一項中所述的抗CD79B抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第10至12項中任一項所述的抗體藥物偶聯物、申請專利範圍第13項所述的多核苷酸、申請專利範圍第14項所述的載體；以及，視需要地，可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
一種申請專利範圍第1至9項中任一項中所述的抗人CD79B抗體或其抗原結合片段、申請專利範圍第10至12項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物、申請專利範圍第13項所述的多核苷酸、申請專利範圍第14項所述的載體的用途，其用在製備用於治療增殖性疾病或用於延緩增殖性疾病進展的藥物或醫藥組成物。
如申請專利範圍第20項所述的用途，其中，該增殖性疾病是癌症或腫瘤。
如申請專利範圍第21項所述的用途，其中，該癌症或腫瘤是淋巴瘤或白血病。
如申請專利範圍第22項所述的用途，其中，該淋巴瘤選自：瀰漫大B細胞淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤。
如申請專利範圍第23項所述的用途，其中，該非何杰金氏淋巴瘤選自：攻擊性NHL、復發性攻擊性NHL、復發性無痛性NHL、頑固性NHL、頑固性無痛性NHL。
如申請專利範圍第22項所述的用途，其中，該白血病選自：慢性淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、急性淋巴細胞性白血病。