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TW202144433A - 抗體或其抗原結合片段、其製備方法及醫藥用途 - Google Patents

抗體或其抗原結合片段、其製備方法及醫藥用途 Download PDF

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TW202144433A
TW202144433A TW110114174A TW110114174A TW202144433A TW 202144433 A TW202144433 A TW 202144433A TW 110114174 A TW110114174 A TW 110114174A TW 110114174 A TW110114174 A TW 110114174A TW 202144433 A TW202144433 A TW 202144433A
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TW
Taiwan
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seq
cancer
antigen
antibody
variable region
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TW110114174A
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花海清
余華星
何娟梅
如迪 包
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大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司
大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司
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Abstract

本發明涉及抗體或其抗原結合片段、其製備方法及其醫藥用途。具體地，本發明涉及包含抗GPC3抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含抗GPC3抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，及其作為抗癌藥物的用途。尤其地，本發明涉及一種人源化的抗GPC3抗體、及其在製備用於治療GPC3介導的疾病或病症的藥物中的用途，以及用於細胞生長抑制劑、用於腫瘤檢測和診斷中的用途。

Description

抗體或其抗原結合片段、其製備方法及醫藥用途
本發明涉及一種特異性地對人GPC3受體具有免疫反應性的抗GPC3抗體、或其抗原結合片段、包含所述抗GPC3抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗GPC3抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為細胞生長抑制劑和抗癌藥物用途和檢測或診斷腫瘤的用途。
磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3)是一種70kDa膜蛋白，屬於作為器官形成中的細胞外基質發揮細胞黏附作用、或作為細胞生長因子的受體起作用的Glypicans家族。GPC3表現之後會被furin酶切割產生N端40kd可溶性部分以及30kd部分藉由GPI分子錨定於細胞膜的C端。
GPC3在胚胎組織、特別是肝臟和腎臟中表現，是與器官形成相關的細胞外基質蛋白。在成人組織中，在胎盤以外觀察不到GPC3的表現，但是在肝細胞癌、黑色素瘤、卵巢透明細胞癌、肺鱗狀細胞癌等各種癌組織中觀察到表現。可見，GPC3與甲胎蛋白(α-fetoprotein；AFP)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen；CEA)等蛋白質同樣地是在胚胎組織中表現的蛋白質，因此被歸類為胚 胎性癌抗原。即，GPC3顯示出在正常組織細胞中不表現、但在癌細胞中特異性表現的特徵，因此作為癌症治療的靶分子、腫瘤標誌物。另外，基因組學和功能研究表明，GPC3對於維持Wnt通路，Hedgehogs通路的啟動中有重要作用，例如GPC3偶聯的硫酸乙醯肝素分子可以增強Wnts與其受體的結合從而對於維持Wnt通路有重要作用。GPC3表現於腦、消化道、膀胱，性腺和皮膚並高度表現於肝細胞癌表面；肝癌發生中Wnt通路起到了重要的作用，例如20%肝細胞癌β-Catenin通路突變以及Frizzled-7受體過度表現，因此GPC3在部分肝細胞癌發生過程中可能起到了促進作用。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含抗體重鏈可變區和抗體輕鏈可變區，其中該抗體重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR：SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15，
該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含：SEQ ID NO：7所示的HCDR1、SEQ ID NO：10所示的HCDR2和SEQ ID NO：13所示的HCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含：SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：11所示的HCDR2和SEQ ID NO：14所示的HCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含：SEQ ID NO：9所示的HCDR1、SEQ ID NO：12所示的HCDR2和SEQ ID NO：15所示的HCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：16所示的LCDR1、SEQ ID NO：21所示的LCDR2和SEQ ID NO：24所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：17所示的LCDR1、SEQ ID NO：22所示的LCDR2和SEQ ID NO：25所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：18所示的LCDR1、SEQ ID NO：23所示的LCDR2和SEQ ID NO：26所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：19所示的LCDR1、SEQ ID NO：21所示的LCDR2和SEQ ID NO：24所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：20所示的LCDR1、SEQ ID NO：23所示的LCDR2和SEQ ID NO：26所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含：SEQ ID NO：7所示的HCDR1、SEQ ID NO：10所示的HCDR2和SEQ ID NO：13所示的HCDR3；以及該抗體輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：16所示的LCDR1、SEQ ID NO：21所示的LCDR2和SEQ ID NO：24所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含：SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：11所示的HCDR2和SEQ ID NO：14所示的HCDR3；以及該抗體輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：17所示的LCDR1、SEQ ID NO：22所示的LCDR2和SEQ ID NO：25所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含：SEQ ID NO：9所示的HCDR1、SEQ ID NO：12所示的HCDR2和SEQ ID NO：15所示的HCDR3；以及該抗體輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：18所示的LCDR1、SEQ ID NO：23所示的LCDR2和SEQ ID NO：26所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含：該抗體重鏈可變區包含：SEQ ID NO：7所示的HCDR1、SEQ ID NO：10所示的HCDR2和SEQ ID NO：13所示的HCDR3；以及該抗體輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：19所示的LCDR1、SEQ ID NO：21所示的LCDR2和SEQ ID NO：24所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含：該抗體重鏈可變區包含：SEQ ID NO：9所示的HCDR1、SEQ ID NO：12所示的HCDR2和SEQ ID NO：15所示的HCDR3；以及該抗體輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：20所示的LCDR1、SEQ ID NO：23所示的LCDR2和SEQ ID NO：26所示的LCDR3。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段選自：鼠源抗體或其抗原結合片段、嵌合抗體或其抗原結合片段、人抗體或其抗原結合片段、人源化抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，所述抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體；
較佳為該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區；
更佳為該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：52所示的重鏈恆定區。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含經胺基酸突變後而具有增強的ADCC毒性的IgG1重鏈恆定區。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其變體；
較佳為該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈的輕鏈恆定區；
更佳為該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：53所示的輕鏈恆定區。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含選自如下序列所示的重鏈可變 區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：37。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含選自如下序列所示的輕鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38。
在較佳的實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含：
SEQ ID NO：27所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；
SEQ ID NO：29所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；
SEQ ID NO：30所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；
SEQ ID NO：31所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；
SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：33所示的輕鏈可變區；
SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：34所示的輕鏈可變區；
SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：35所示的輕鏈可變區；
SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：36所示的輕鏈可變區；或
SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：38所示的輕鏈可變區。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段含有選自如下序列所示的重鏈，或與 以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：49。
在一些實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段含有選自如下序列所示的輕鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性輕鏈：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50。
在一個具體的實施方案中，根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體包含：
SEQ ID NO：39所示的重鏈和SEQ ID NO：40所示的輕鏈；
SEQ ID NO：42所示的重鏈和SEQ ID NO：40所示的輕鏈；
SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：40所示的輕鏈；
SEQ ID NO：44所示的重鏈和SEQ ID NO：45所示的輕鏈；
SEQ ID NO：44所示的重鏈和SEQ ID NO：46所示的輕鏈；
SEQ ID NO：44所示的重鏈和SEQ ID NO：47所示的輕鏈；
SEQ ID NO：44所示的重鏈和SEQ ID NO：48所示的輕鏈；或，
SEQ ID NO：49所示的重鏈和SEQ ID NO：50所示的輕鏈。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種多核苷酸，其編碼本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種表現載體，其含有本發明的多核苷酸。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種宿主細胞，其導入或含有本發明的表現載體。在一個具體的實施方案中，該宿主細胞為細菌，以大腸桿菌較佳。
在另一個具體的實施方案中，該宿主細胞為酵母菌，以畢赤酵母較佳。
在另一個具體的實施方案中，該宿主細胞為哺乳動物細胞，以CHO細胞或HEK293細胞較佳。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種生產抗GPC3抗體的方法，包括步驟：培養本發明的宿主細胞、從培養物中分離抗體、以及對該抗體進行純化。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種醫藥組成物，其含有本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種檢測或診斷試劑盒，其含有本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段以及可用於檢測或診斷的賦形劑、稀釋劑或載體。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種檢測或診斷試劑盒，其含有本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，任選地，還包含一種或多種檢測該抗GPC3抗體或其抗原結合片段與GPC3或其表位結合的試劑。
根據本發明的一些實施方案，提供了本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，或上述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或預防GPC3介導的疾病或病症。
根據本發明的一些實施方案，提供了根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，或上述的醫藥組成物在製備試劑盒中的用途，其中該試劑盒用於檢測或診斷GPC3介導的疾病或病症。
在一些實施方案中，根據本發明上述的用途，該疾病或病症為癌症。
在較佳的實施方案中，該疾病或病症為表現GPC3的癌症。
在更佳的實施方案中，該癌症選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
在具體的實施方案中，該疾病或病症選自：肝細胞癌、黑素瘤、卵巢透明細胞癌、肺鱗狀細胞癌。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種治療或預防GPC3介導的疾病的方法，包括步驟：向受試者提供治療有效量或預防有效量的根據本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種治療或預防GPC3介導的疾病的方法，包括步驟：向受試者提供治療有效量或預防有效量的根據本發明的醫藥組成物。
在一些實施方案中，該受試者是疑似患有、已經患有、易感於GPC3介導的疾病，GPC3介導的疾病選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤，較佳為肝細胞癌、黑色素瘤、卵巢透明細胞癌、肺鱗狀細胞癌。
本發明的抗GPC3抗體或抗原結合片段，其能夠特異性的與GPC3抗原(或其表位)、表現GPC3的細胞結合，且具有顯著的CDC活性，ADCC活性，其對腫瘤的殺傷效果顯著。
另外，本發明的抗GPC3抗體或其抗原結合片段具有良好的內吞作用，適於和藥物偶聯，構建ADC。本發明的抗GPC3抗體或抗原結合片段在保持高特異性和殺傷活性的同時，免疫原性更低，穩定性更高，並顯著優於Codrituzumab(抗磷脂肌醇蛋白聚糖3的單株抗體)。本發明抗GPC3抗體或抗原結合片段具有更好的作為抗癌藥物的潛力，保證用藥安全。
發明詳述
一、術語
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本發明所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為 IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可變區可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可變區可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則和Kabat或ABM定義規則(http：//bioinf.org.uk/abs/)。
術語“抗原呈現細胞”或“APC”是在其表面上展示與MHC複合的外來抗原的細胞。T細胞利用T細胞受體(TCR)識別這種複合物。APC的實例包括但不限於樹突細胞(DC)、外用血單個核細胞(PBMC)、單核細胞、B淋巴母細胞和單核細胞衍生的樹突細胞。
術語“抗原呈現”是指APC捕獲抗原和使它們能夠被T細胞識別的過程，例如作為MHC-I/MHC-II偶聯物的組分。
術語“GPC3”包括由細胞天然表現的GPC3的任何變體或同種型。本發明的抗體可與得自非人物種的GPC3交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人GPC3特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。GPC3或其任何變體或同種型可從天然表現它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。較佳為抗GPC3抗體靶向具有正常糖基化模式的人源GPC3。
術語“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表現、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：
1.從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；
2.從經轉化以表現抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；
3.從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及
4.藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表現、創建或分離的抗體。
此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人GPC3的單株抗體。製備時用GPC3抗原注射試驗物件，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源GPC3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。人源化抗體可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應的缺點。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳為包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後增強ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1重鏈恆定區。
術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當 基於摩爾來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳為抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區含有包含抗體的CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或多個二硫鍵並藉由CH3結構域的疏水作用保持在一起。
“Fab’片段”含有一條輕鏈和包含VH結構域和CH1結構域以及CH1和CH2結構域之間區域的一條重鏈的部分，由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
“F(ab’)2片段”含有兩條輕鏈和兩條包含CH1和CH2結構域之間的恆定區的部分的重鏈，由此在兩條重鏈間形成鏈間二硫鍵。因此，F(ab’)2片段由藉由兩條重鏈間的二硫鍵保持在一起的兩個Fab’片段組成。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位元特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點 的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies)、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本發明的術語“與GPC3結合”，指能與人GPC3相互作用。
本發明的術語“抗原結合位點”指本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本發明所用的術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人GPC3作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10- 7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
術語“交叉反應”是指本發明的抗體與來自不同物種的GPC3結合的能力。例如，結合人GPC3的本發明的抗體也可以結合另一物種的GPC3。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表現GPC3的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷較佳為降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水準或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗GPC3抗體接觸時，與未與抗GPC3抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的剌激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本發明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表現Fc受體的細胞藉由 識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，增強或降低降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人GPC3或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表現與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化、收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本發明的抗體指單株抗體。本發明所述的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術(如CDR-grafting)、或其它現有技術進行重組得到。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種抗體，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。盡本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書和申請專利範圍中使用的術語“基本上由……組成”或其變形表示包括所有該元件或元件組，並且任選包括與該元件類似或不同性質的其它元件，該其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。
本發明所述的應用於某個物件的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該物件可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或預防醫治病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指要據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同源性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或其抗原結合片段，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
實施例1：抗原準備
蛋白抗原是人GPC3重組蛋白(UniProt #P51654,Gln 25-His 559)，C端帶His標籤，即人GPC3 His蛋白，購買自AcroBiosystems公司(Cat # GP3-H52H4)。
表1.人GPC3(Gln 25-His 559)胺基酸序列
Figure 110114174-A0101-12-0021-6
實施例2：鼠融合瘤及抗體序列的獲得
用人GPC3重組蛋白進行動物免疫，共5隻C57bl/6和5隻SJL小鼠，雌性，10週齡，小鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。使用Sigma完全弗氏佐劑(CFA)和Sigma不完全弗氏佐劑(IFA)，免疫原和免疫佐劑以1：1的比例充分混合乳化，製成穩定“油包水”液體；注射劑量25μg/200μL/小鼠。
免疫方案
Figure 110114174-A0101-12-0022-2
對免疫小鼠血清使用如實施例3(1)所述的間接ELISA法評估血清效價及結合細胞表面抗原的能力，對照效價檢測情況(大於10萬倍稀釋度)決定啟動細胞融合。選擇血清效價強的免疫小鼠進行一次終免疫後處死小鼠，取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合後鋪板獲得融合瘤，藉由間接ELISA篩選到目標融合瘤，並藉由有限稀釋法建株為單株細胞株。得到的陽性抗體株進一步使用間接ELISA進行篩選，從而選定結合重組蛋白的融合瘤。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA並反轉錄(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara #2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序，最終得到鼠源抗體M1、M2和M3的序列。
表2.鼠單抗的重鏈和輕鏈可變區序列
Figure 110114174-A0101-12-0023-8
註：底線表示鼠單抗CDR序列。
表3.鼠源抗體CDR區序列
Figure 110114174-A0101-12-0024-4
實施例3：抗體的體外結合活性檢測方法
(1)體外間接ELISA結合實驗：
用pH7.4的PBS將GPC3 His蛋白(AcroBiosystems，Cat # GP3-H52H4)稀釋至0.5μg/ml濃度，以100μL/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板3次後，加入用PBST稀釋的1%牛血清白蛋白(BSA)封閉液200μL/孔，37℃孵育0.5小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板1次。
用含1%BSA的PBST稀釋待測抗體，100nM起始，5倍梯度稀釋，11個劑量，以100μL/孔加到酶標板中，放於37℃孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入200μL/孔用含1%BSA的PBST稀釋的HRP標記羊抗鼠二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，cat#115-035-071)或HRP標記羊抗人二抗(Rockland，cat#609-103-123)，37℃孵育0.5小時。用PBST洗板5次後，加入100μL/孔TMB顯色受質(蘇州亞科化學試劑股份有限公司，cat# S0025)，於25℃避光孵育8-15分鐘，加入50μL/孔1M HCl終止反應，用酶標儀(Thermo,Ascent)在450nm處讀取吸收值，分析資料。
做濃度信號值曲線分析結果，如下表所示：
表4.鼠抗體對人GPC3抗原的親和力(EC50值)
Figure 110114174-A0101-12-0025-7
結果顯示：鼠抗體對人GPC3抗原的親和力良好。
(2)體外FACS結合實驗：
GPC3高表現腫瘤細胞HepG2(ATCC保藏號：HB-8065)，經胰酶消化後，離心收集細胞，用FACS buffer(含2% FBS的1×PBS)調節細胞密度後分鋪於96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。離心：1200g、5分鐘，棄上清液，加入100μL已用FACS buffer梯度稀釋的抗體溶液，4℃孵育1小時。離心：1200g、5分鐘，棄上清液，PBS洗細胞2次後，添加FACS buffer配製的螢光標記二抗工作液PE anti-human IgG Fc Antibody(Biolegend,Cat# 409304)或FITC anti-mouse IgG Antibody(Biolegend,Cat# 406001)，100μL每孔重新懸浮細胞，4℃孵育1小時。離心：1200g、5分鐘，棄上清液。PBS洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞儀DxFlex檢測螢光信號，並作曲線分析抗體結合細胞的EC50濃度。
表5.鼠抗體對人GPC3高表現細胞的親和力(EC50值)
Figure 110114174-A0101-12-0026-10
結果顯示：鼠抗體對人GPC3高表現細胞的親和力良好。
實施例4：小鼠抗體嵌合化實驗
將篩選得到的鼠源抗體進行嵌合化，鼠源抗體可變區選殖在人抗體的恆定區得到嵌合抗體，示例性嵌合抗體的恆定區可以是人IgG1重鏈恆定區和kappa輕鏈恆定區。
(1)體外蛋白結合實驗：
根據實施例3(1)的體外間接ELISA結合實驗和Biacore方法，測試嵌合抗體與人GPC3抗原的親和力。
Biacore測試方法如下：
a)晶片製備：
將鼠抗人IgG(Fc)抗體用固定試劑(10mM醋酸鈉，pH 5.0)稀釋到25μg/mL，晶片每個通道約使用100μL鼠抗人IgG(Fc)抗體，固定兩個通道約使用190μL固定試劑加入10μL鼠抗人IgG(Fc)抗體。首先，CM5晶片的表面用400mM EDC and 100mM NHS以10μL/min的流速進行420s的活化。其次，將25μg/mL的鼠抗人IgG(Fc)抗體以10μL/min的流速注入到實驗通道(FC4) 約420s，固定量約為9000至14000RU。最後，晶片用1M乙醇胺以10μL/min進行420s封閉。參比通道(FC3)與試驗通道(FC4)進行相同的操作。
b)捕獲配體：
將抗體原液用運行試劑分別稀釋至4μg/mL，並以10μL/min的流速注入到實驗通道(FC4)捕獲約200RU。參比通道(FC3)不需要進行配體的捕獲。
c)分析物多迴圈分析：
將人GPC 3蛋白用運行試劑進行2倍倍比稀釋，將稀釋後的樣品依次以30μL/min的流速按照相應結合時間和解離時間注入到實驗通道與參比通道。每一個濃度分析後，晶片需要用3M氯化鎂以20μL/min的流速再生30s，洗掉配體以及未解離的分析物。進行下一個濃度分析時，實驗通道需要重新捕獲相同量的配體。
d)資料分析：
使用Biacore T200分析軟體計算每個抗體的KD值。參比通道(FC3)用於背景的扣減。
表6.嵌合抗體對人GPC3抗原的親和力
Figure 110114174-A0101-12-0027-11
ELISA和Biacore結果見表6，顯示嵌合抗體與人GPC3抗原具有良好的親和力。
(2)體外細胞結合實驗：
GPC3高表現細胞(過表現人或猴GPC3的CHO-K1細胞，和表現GPC3的人肝癌細胞JHH-7)，經胰酶消化後，離心收集細胞，用FACS緩衝液(含2% FBS的1×PBS)調節細胞密度後分鋪於96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。離心：1200g、5分鐘，棄上清液，加入100μL已用FACS緩衝液梯度稀釋的抗體溶液，4℃孵育1小時。離心：1200g、5分鐘，棄上清液，PBS洗細胞2次後，添加FACS緩衝液配製的螢光標記二抗工作液PE anti-human IgG Fc Antibody(Biolegend,Cat# 409304)或FITC anti-mouse IgG Antibody(Biolegend,Cat# 406001)，100μL每孔重新懸浮細胞，4℃孵育1小時。離心：1200g、5分鐘，棄上清液。PBS洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞計數儀DxFlex檢測螢光信號，並作曲線分析抗體結合細胞的EC50濃度。
表7.嵌合抗體對表現GPC3細胞的親和力(EC50值)
Figure 110114174-A0101-12-0028-12
結果顯示：嵌合抗體與表現GPC3的細胞均具有很高的親和力。
實施例5：小鼠抗體人源化實驗
鼠源抗人GPC3單株抗體人源化如本領域許多文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列，本發明將鼠源抗體M1、M2和M3進行人源化。
在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系資料庫比較，獲得同源性高的人種系範本。
將鼠源抗體的CDR區移植到選擇好的相應人源化範本上。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，經表現測試和回復突變數量對比，選擇出人源化重鏈可變區HCVR和輕鏈可變區LCVR序列組合而成的抗體，序列如下：
表8.抗體重鏈和輕鏈可變區CDR序列
Figure 110114174-A0101-12-0030-13
表9.人源化抗體CDR區
Figure 110114174-A0101-12-0031-14
表10.人源化抗體的重鏈和輕鏈可變區序列
Figure 110114174-A0101-12-0032-15
Figure 110114174-A0101-12-0033-16
Figure 110114174-A0101-12-0034-17
註：底線表示單抗CDR序列。
將設計的重鏈和輕鏈可變區序列與IgG1重鏈恆定區和輕鏈恆定區序列連接，示例性的，抗體重鏈恆定區選自SEQ ID NO：52所示的人IgG1天然恆定區，輕鏈恆定區選自序列如SEQ ID NO：53所示的人κ鏈的恆定區，得到重鏈和輕鏈序列如下：
表11.人源化抗體的重鏈和輕鏈序列，及重鏈和輕鏈恆定區序列
Figure 110114174-A0101-12-0035-19
Figure 110114174-A0101-12-0036-20
Figure 110114174-A0101-12-0037-21
Figure 110114174-A0101-12-0038-22
Figure 110114174-A0101-12-0039-23
Figure 110114174-A0101-12-0040-24
表12.抗體及其重鏈、輕鏈、可變區的序列編號
Figure 110114174-A0101-12-0041-26
實施例6：人源化抗體的表現和純化
根據以上各人源化抗體輕鏈和重鏈的胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表現載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表現載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。收取細胞培養液，離心過濾後上樣到抗體純化親和管柱，經磷酸緩衝液洗管柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，得到本發明的人源化抗體蛋白，其濃度和純度如下表。
表13.人源化抗體的濃度和純度
Figure 110114174-A0101-12-0042-27
實施例7：人源化抗體的體外結合親和力實驗：
(1)體外間接ELISA結合實驗：
使用實施例3(1)體外間接ELISA結合實驗測定的各人源化抗體對人GPC3抗原的親和力(EC50)，結果見下表14：
表14.人源化抗體對人GPC3抗原的親和力(EC50)
Figure 110114174-A0101-12-0043-28
結果顯示：本發明人源化抗體與人GPC3抗原均有很高的親和力。
(2)體外FACS結合實驗：
使用實施例4(2)體外FACS結合實驗，測定各人源化抗體對GPC3抗原表現細胞的親和力(EC50)，結果如下表15所示：
表15.人源化抗體對人GPC3高表現細胞的親和力(EC50值)
Figure 110114174-A0101-12-0044-29
結果表明：人源化抗體與過表現人或猴GPC3抗原的穩定細胞株均有很高的親和力，並且可以結合人肝癌細胞JHH-7。
實施例8：人源化抗體的內吞作用
檢測本發明抗體結合GPC3後是否能和人GPC3共同內吞入細胞內，用穩轉細胞株CHO-K1-human GPC3以及人肝癌細胞JHH-7(CBP60204，購自南京科佰生物科技有限公司)和HepG2(SCSP-510，購自中國科學院細胞庫)進行評估。
細胞使用胰酶消化，收集細胞並用預冷的FACS緩衝液重新懸浮，調整細胞濃度為1×106/mL。取EP管，加入1mL細胞懸浮液，1500rpm離心5 分鐘後棄上清液，加入1mL已經配製好的待測抗體重新懸浮細胞，抗體的終濃度均為20μg/mL，4℃搖床孵育1小時，離心棄上清液(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清液。每管加入100μL螢光標記二抗工作液PE anti-human IgG Fc Antibody(Biolegend,Cat# 409304)或FITC anti-mouse IgG Antibody(Biolegend,Cat# 406001)，重新懸浮細胞，4℃搖床孵育30分鐘，離心棄上清液(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS buffer洗滌兩次，棄上清液。每管加入1mL預熱的細胞培養基重新懸浮細胞並混勻，分裝為4管，每管200μL，分別為0分鐘組，blank組，30分鐘組和2小時組，取出0分鐘及blank置於冰上，其餘放置於37℃培養箱，分別內吞30分鐘、2小時，在相應時間點取出EP管，置於冰上預冷5分鐘，所有處理組離心棄上清液(4℃、1500rpm×5分鐘)，用FACS緩衝液洗滌一次，棄上清液。0分鐘組外所有處理組EP管中加入250μL strip buffer，室溫孵育8分鐘，離心棄上清液(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS buffer洗滌兩次，棄上清液。所有處理組加入100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀DxFlex進行檢測。
抗體內吞百分比=(各個時間點螢光強度值-Blank組的平均螢光強度值)/(零點時的平均螢光輕度值-Blank組的平均螢光強度值)
表16.人源化抗體的內吞作用
Figure 110114174-A0101-12-0046-30
結果顯示：本發明人源化抗體在CHO-K1-human GPC3、JHH-7和HepG2細胞中均有良好的內吞作用。
實施例9：人源化抗體的CDC實驗
本實驗的靶細胞為人GPC3過表現穩定細胞株CHO-K1-hGPC3。實驗培養基為不含FBS的細胞培養基F12K(GibcoTM，Cat#21127022)，用於細胞和抗體重新懸浮或稀釋。CHO-K1-hGPC3細胞經胰酶消化，離心收集，用實驗培養基重新懸浮成1×105個/ml，50μL鋪於白色96孔板(Corning，3610)，加入25μL 4×工作濃度的抗體(抗體起始工作濃度為20nM，5倍稀釋，10個濃度點，並設立0nM點)，37℃孵育30分鐘，加入25μL 80%人血清(GemCellTM US,Cat#100-512)，37℃培養箱培養24小時。添加50μL CellTiter-Glo(Promega，Cat#G7573)，混勻室溫避光反應10分鐘，多功能酶標儀(Thermofisher，Lux)讀數。
抗體殺傷百分比(%)=(E-S)/(E-M)×100
E為不加抗體孔數值，即細胞+培養基+人血清；
S為樣品孔數值，即細胞+抗體+人血清；
M是培養基+人血清孔數值。
以抗體濃度為橫坐標，殺傷百分比為縱坐標，使用GraphPad Prism 8.3.0中的log(inhibitor)vs.response--Variable slope進行曲線擬合，分析得到抗體殺傷細胞的IC50濃度，結果見下表。
表17.人源化抗體的CDC作用
Figure 110114174-A0101-12-0047-31
結果顯示：人源化抗體H1-3、H2-3、H3-1均具有顯著的CDC作用。
實施例10：人源化抗體的電荷異質穩定性實驗
本實驗藉由全景式等電聚焦(iCIEF)的方法，檢測並比較了人源化抗體H3-1在起始0點、以及分別在25℃和40℃放置一個月的電荷異質體純度，以此考察抗體的穩定性。
將帶有兩性基團的樣品、兩性電解質、緩衝劑和輔助添加劑的混合物注入毛細管內，當在毛細管兩端加上直流電壓時，載體兩性電解質可以在管內形成一定範圍的pH梯度，樣品組分依據其所帶電性向陰極或陽極泳動，毛細管內pH值與該組分的等電點(pI)相同時，溶質分子的淨電荷為零，宏觀上該組分將聚集在該點不再進一步遷移，達到使複雜樣品中各組分分離的目的。採集圖譜後，根據marker pI值與色譜峰的遷移時間的線性關係，從而得到供試品的pI值、峰比值(主峰、酸峰、鹼峰)。主要步驟如下：
1)系統適應性樣品準備：將Maurice cIEF System Suitability Kit(Protein Simple，Cat#046-044)裡的適應性樣品管取出，加入40μl去離子水和160μl System Suitability Test Mix，混勻後轉移到1.5ml離心管中，渦旋震盪後離心，取160ul上清液轉移至96孔樣品板待用。
2)配製cIEF Master Mix solution：包含37μl超純水，35μl的1% MC(Protein Simple，Cat#101876)，4μl Pharmalyte pH 3-10(Protein Simple，Cat#17-0456-01)，2μl 500mM arginine(Protein Simple，Cat#042-691)，以及相應的兩個pI Marker6.14(protein simple,cat：046-031)和9.99(protein simple,cat：046-034))各1μl，總體積為80μl。
3)供試品製備：樣品設置3個條件：起始0點；在穩定性試驗箱(Memmer，型號HPP 1060)濕度為65%和溫度為25℃的條件下放置1個月；在穩定性試驗箱(Memmer，型號HPP 1060)濕度為65%和溫度為40℃的條件下放置1個月。取20μl相應樣品，加至步驟2)中含80μl cIEF Master Mix solution的EP管中，渦旋振盪混勻後離心，取80ul上清液轉移至96孔樣品板，離心待用。
4)上機檢測：打開毛細管電泳儀(Protein Simple，maurice)以及軟體，按照儀器操作步驟，進行儀器自檢，安裝毛細管卡盒(Protein Simple，Cat# PS-MC02-C)，將96孔樣品板放入儀器的相應位置，進行cIEF分析。
表18.人源化抗體H3-1的iCIEF檢測
Figure 110114174-A0101-12-0049-32
結果顯示：與起始0點相比，H3-1在25℃放置一個月後的主峰比例變化不大，穩定性良好，在強制降解條件40℃放置一個月，抗體出現了預期的降解現象，體現在主峰比例降為22.3%。
實施例11：人源化抗體的分子變異體穩定性實驗
本實驗藉由毛細管電泳(CE-SDS)的方法，檢測並比較了人源化抗體H3-1在起始0點、以及分別在25℃和40℃放置一個月的分子變異體的純度。CE-SDS是基於蛋白樣品在變性條件下凝膠電泳中的遷移，根據不同分子量的蛋白遷移時間的差異完成分離，從而得到非還原和還原處理後樣品純度的檢測結果。
主要步驟如下：
1)樣品準備：樣品在起始0點取樣；在穩定性試驗箱(Memmer，型號HPP 1060)濕度為65%和溫度為25℃的條件下放置1個月取樣；在穩定性試驗箱(Memmer，型號HPP 1060)濕度為65%和溫度為40℃的條件下放置1個月取樣。
2)非還原CE樣品處理：向EP管中加入樣品，每個樣品的蛋白取用量為50μg，加入1μL的10kD內標(Protein Simple，Cat#046-144)，加入 2.5μL的250mM IAM(Sigma，Cat# I1149-5G)，加入1×sample buffer(Protein Simple，Cat#046-567)至終體積為50μL。
3)還原CE樣品處理：向EP管中加入樣品，每個樣品的蛋白取用量為50μg，加入1μL的10kD內標(Protein Simple，Cat#046-144)，加入2.5μL的β-巰基乙醇(Sigma，Cat# M3148-25ML)，加入1×sample buffer(Protein Simple，Cat#046-567)至終體積為50μL。
4)振盪混勻後，在乾式恆溫器(杭州奧盛儀器有限公司，型號MK20001)中70℃加熱孵育10min，之後取出，冰上孵育5min，冷卻後12000rpm離心5min。離心後取35μL上清液轉移至儀器匹配的96孔中，之後於1000rpm離心5min。
5)樣品檢測：將96孔樣品板放入毛細管電泳儀(Protein Simple，Maurice)中，打開儀器以及軟體，按照儀器操作步驟，進行儀器自檢，安裝毛細管卡盒(Protein Simple，Cat#090-157)，準備相應的試劑放入儀器的相應位置。根據儀器操作步驟，設置相應的參數，進行還原或者非還原CE分析。
6)資料處理：樣品檢測完成後，設置相應的積分參數，藉由儀器自帶軟體進行計算分析，得到樣品純度。
表19.人源化抗體H3-1的CE-SDS檢測
Figure 110114174-A0101-12-0051-33
非還原CE結果顯示，人源化抗體H3-1在25℃放置一個月的主峰比例與0點的相近，40℃放置一個月主峰有所下降；在還原CE中，與0點相比，無論是25℃還是40℃放置一個月，抗體的重輕鏈比例之和均變化不大。綜上該，人源化抗體H3-1的穩定性良好。
<110> 大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司(SHANGHAI HANSOH BIOMEDICAL CO.,LTD) 大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司(JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP CO.,LTD.)
<120> 抗體或其抗原結合片段、其製備方法及醫藥用途
<130> 721040CPCT
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<151> 2020-09-08
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 人源化抗體輕鏈
<400> 45
Figure 110114174-A0101-12-0072-90
<210> 46
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 人源化抗體輕鏈
<400> 46
Figure 110114174-A0101-12-0072-91
Figure 110114174-A0101-12-0073-93
<210> 47
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 人源化抗體輕鏈
<400> 47
Figure 110114174-A0101-12-0073-92
Figure 110114174-A0101-12-0074-94
<210> 48
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 人源化抗體輕鏈
<400> 48
Figure 110114174-A0101-12-0074-95
<210> 49
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 人源化抗體重鏈
<400> 49
Figure 110114174-A0101-12-0074-96
Figure 110114174-A0101-12-0075-97
<210> 50
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<223> 人源化抗體輕鏈
<400> 50
Figure 110114174-A0101-12-0076-98
<210> 51
<211> 535
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 變體
<223> 人GPC3(Gln 25-His 559)抗原
<400> 51
Figure 110114174-A0101-12-0076-100
Figure 110114174-A0101-12-0077-101
Figure 110114174-A0101-12-0078-102
<210> 52
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
Figure 110114174-A0101-12-0078-103
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
Figure 110114174-A0101-12-0079-105

Claims (22)

  1. 一種抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區包含：
    SEQ ID NO：7所示的HCDR1、SEQ ID NO：10所示的HCDR2和SEQ ID NO：13所示的HCDR3，或，
    SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：11所示的HCDR2和SEQ ID NO：14所示的HCDR3，或，
    SEQ ID NO：9所示的HCDR1、SEQ ID NO：12所示的HCDR2和SEQ ID NO：15所示的HCDR3；
    該輕鏈可變區包含：
    SEQ ID NO：16所示的LCDR1、SEQ ID NO：21所示的LCDR2和SEQ ID NO：24所示的LCDR3，或，
    SEQ ID NO：17所示的LCDR1、SEQ ID NO：22所示的LCDR2和SEQ ID NO：25所示的LCDR3，或，
    SEQ ID NO：18所示的LCDR1、SEQ ID NO：23所示的LCDR2和SEQ ID NO：26所示的LCDR3，或，
    SEQ ID NO：19所示的LCDR1、SEQ ID NO：21所示的LCDR2和SEQ ID NO：24所示的LCDR3，或，
    SEQ ID NO：20所示的LCDR1、SEQ ID NO：23所示的LCDR2和SEQ ID NO：26所示的LCDR3。
  2. 如請求項1所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中，
    該重鏈可變區包含SEQ ID NO：7所示的HCDR1、SEQ ID NO：10所示的HCDR2和SEQ ID NO：13所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16所示的LCDR1、SEQ ID NO：21所示的LCDR2和SEQ ID NO：24所示的LCDR3；或，
    該重鏈可變區包含SEQ ID NO：8所示的HCDR1、SEQ ID NO：11所示的HCDR2和SEQ ID NO：14所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：17所示的LCDR1、SEQ ID NO：22所示的LCDR2和SEQ ID NO：25所示的LCDR3；或，
    該重鏈可變區包含SEQ ID NO：9所示的HCDR1、SEQ ID NO：12所示的HCDR2和SEQ ID NO：15所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：18所示的LCDR1、SEQ ID NO：23所示的LCDR2和SEQ ID NO：26所示的LCDR3，或，
    該重鏈可變區包含SEQ ID NO：7所示的HCDR1、SEQ ID NO：10所示的HCDR2和SEQ ID NO：13所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：19所示的LCDR1、SEQ ID NO：21所示的LCDR2和SEQ ID NO：24所示的LCDR3；或，
    該重鏈可變區包含SEQ ID NO：9所示的HCDR1、SEQ ID NO：12所示的HCDR2和SEQ ID NO：15所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：20所示的LCDR1、SEQ ID NO：23所示的LCDR2和SEQ ID NO：26所示的LCDR3。
  3. 如請求項1或2所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其選自鼠源抗體或其或其抗原結合片段，嵌合抗體或其或其抗原結合片段，人抗體或其抗原結合片段，或者人源化抗體或其或其抗原結合片段。
  4. 如請求項3所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體；
    較佳為該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區；
    更佳為該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：52所示的重鏈恆定區。
  5. 如請求項3所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其變體；
    較佳為該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈的輕鏈恆定區；
    更佳為該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：53所示的輕鏈恆定區。
  6. 如請求項3所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含選自如下序列所示的重鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：37；
    和/或，選自如下序列所示的輕鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：28、 SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：38。
  7. 如請求項6所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含：
    SEQ ID NO：27所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；
    SEQ ID NO：29所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；
    SEQ ID NO：30所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；
    SEQ ID NO：31所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：28所示的輕鏈可變區；
    SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：33所示的輕鏈可變區；
    SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：34所示的輕鏈可變區；
    SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：35所示的輕鏈可變區；
    SEQ ID NO：32所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：36所示的輕鏈可變區；或
    SEQ ID NO：37所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：38所示的輕鏈可變區。
  8. 如請求項6所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段含有選自如下序列所示的重鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：49；
    和/或，選自如下序列所示的輕鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：50。
  9. 如請求項8所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體包含：
    SEQ ID NO：39所示的重鏈和SEQ ID NO：40所示的輕鏈；
    SEQ ID NO：42所示的重鏈和SEQ ID NO：40所示的輕鏈；
    SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：40所示的輕鏈；
    SEQ ID NO：44所示的重鏈和SEQ ID NO：45所示的輕鏈；
    SEQ ID NO：44所示的重鏈和SEQ ID NO：46所示的輕鏈；
    SEQ ID NO：44所示的重鏈和SEQ ID NO：47所示的輕鏈；
    SEQ ID NO：44所示的重鏈和SEQ ID NO：48所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：49所示的重鏈和SEQ ID NO：50所示的輕鏈。
  10. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至9中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段。
  11. 一種表現載體，其含有如請求項10所述的多核苷酸。
  12. 一種宿主細胞，其導入或含有如請求項11所述的表現載體。
  13. 如請求項12所述的宿主細胞，其中該宿主細胞選自細菌、酵母菌或哺乳動物細胞；其中，細菌以大腸桿菌較佳；酵母菌以畢赤酵母較佳；哺乳動物細胞以CHO細胞或HEK293細胞較佳。
  14. 一種生產抗GPC3抗體的方法，包括步驟：
    1)培養如請求項12或13所述的宿主細胞；
    2)從培養物中分離抗體；以及
    3)對該抗體進行純化。
  15. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至9中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段、以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  16. 一種檢測或診斷試劑盒，其含有如請求項1至9中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，任選地，還包含一種或多種檢測該抗GPC3抗體或其抗原結合片段與GPC3或其表位結合的試劑。
  17. 一種如請求項1至9中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如請求項15所述的醫藥組成物在製備用於治療或預防GPC3介導的疾病或病症的藥物中的用途。
  18. 一種如請求項1至9中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如請求項15所述的醫藥組成物在製備試劑盒中的用途，其中，該試劑盒用於檢測、診斷、預後GPC3介導的疾病或病症。
  19. 如請求項17或18所述的用途，其中，
    該疾病或病症為癌症；
    該疾病或病症較佳為表現GPC3的癌症；
    該癌症更佳為選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
  20. 如請求項1至9中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如請求項15所述的醫藥組成物，其用於治療或預防GPC3介導的疾病；
    該疾病選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
  21. 如請求項1至9中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如請求項15所述的醫藥組成物，其用於檢測、診斷、預後GPC3介導的疾病；
    該疾病選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤，較佳為肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌、前列腺癌。
  22. 一種治療或預防GPC3介導的疾病的方法，包括步驟：
    向受試者提供治療有效量或預防有效量的如請求項1至9中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段；或者
    向受試者提供治療有效量或預防有效量的如請求項15所述的醫藥組成物；
    其中該GPC3介導的疾病選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
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