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TW202134286A - 抗ｇｐｃ３抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents

抗ｇｐｃ３抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 Download PDF

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TW202134286A
TW202134286A TW109142630A TW109142630A TW202134286A TW 202134286 A TW202134286 A TW 202134286A TW 109142630 A TW109142630 A TW 109142630A TW 109142630 A TW109142630 A TW 109142630A TW 202134286 A TW202134286 A TW 202134286A
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TW
Taiwan
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seq
heavy chain
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antibody
light chain
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TW109142630A
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花海清
余華星
何娟梅
包如迪
Original Assignee
大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司
大陸商江蘇豪森藥業集團有限公司
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Abstract

本申請涉及抗GPC3抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本申請涉及包含所述抗GPC3抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體；以及包含抗GPC3抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物；以及其作為抗癌藥物的用途。尤其地，本申請涉及一種人源化的抗GPC3抗體、及其在製備用於治療GPC3介導的疾病或病症的藥物中的用途、和用作細胞生長抑制劑的用途、用於腫瘤檢測和診斷中的用途。

Description

抗GPC3抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
本申請要求2019年12月05日提交的中國專利申請(申請號201911236102.2)和2020年09月02日提交的中國專利申請(申請號202010910640.1)的優先權。
本申請涉及一種特異性地對人GPC3具有免疫反應性的抗GPC3抗體、及其抗原結合片段、包含該抗GPC3抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及包含人抗GPC3抗體及其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為細胞生長抑制劑和抗癌藥物用途和檢測或診斷腫瘤的用途。
磷脂醯肌醇蛋白聚糖3(Glypican3，GPC3)是一種約70kd膜蛋白，屬於Glypicans家族，作為器官形成中的細胞外基質蛋白而發揮細胞粘附作用、或作為細胞生長因子的受體起作用。GPC3表達之後，會被furin酶切割產生N端約40kDa可溶性部分以及約30kDa部分，藉由GPI分子錨定於細胞膜的C端。
GPC3在胚胎組織(特別是肝臟和腎臟)中表達，是與器官形成相關的細胞外基質蛋白。在成人組織中，在胎盤以外觀察不到GPC3的表達，但 是在肝細胞癌、黑素瘤、卵巢透明細胞癌、肺鱗狀細胞癌等各種癌組織中觀察到表達。可見，與甲胎蛋白(α-fetoprotein；AFP)、癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen；CEA)等蛋白質一樣，GPC3也是在胚胎組織中表達的蛋白質，因此被歸類為胚胎性癌抗原。即，GPC3的特徵在於在正常組織細胞中不表達、但在癌細胞中特異性表達，因此可以作為癌症治療的靶分子、腫瘤標誌物。
另外，基因組學和功能研究表明，GPC3對於維持Wnt通路、Hedgehogs通路的激活有重要作用。例如，GPC3偶聯的硫酸乙醯肝素分子可以增強Wnts與其受體的結合，從而對於維持Wnt通路有重要作用。GPC3表達於腦、消化道、膀胱，性腺和皮膚，並高度表達於肝細胞癌表面；肝癌發生中Wnt通路發揮重要的作用，例如20%肝細胞癌β-Catenin通路突變以及Frizzled-7受體過度表達，因此GPC3在部分肝細胞癌發生過程中可能發揮促進作用。
目前進入臨床階段並公開臨床結果的的靶向GPC3大分子藥物是由羅氏研發的Codrituzumab(考曲妥珠單抗；別名GC33)，專利號：US20100248359，該抗體藥物靶向人GPC3的C端524-563胺基酸，屬於人IgG1、kappa亞型。GC33可誘導抗體依賴的細胞毒性作用(ADCC)和補體依賴的細胞毒性作用(CDC)，在HuH-7腫瘤藥效小鼠模型中，具有明顯抑制腫瘤生長的效果。GC33處於臨床II期(NCT01507168)，適應症有肝細胞癌(HCC)、轉移性肝細胞癌、肝癌、轉移性肝癌等。但由於臨床藥效結果不佳，羅氏停止了Codrituzumab的開發。
抗體的穩定性與其產生的藥物效果、在人體內的代謝和安全性都有很大關係，例如抗體的穩定性越好，就越少產生免疫原性。
本申請提供了一種抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區。
在一些實施方案中，本申請的抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含選自以下的重鏈可變區和/或輕鏈可變區：
該重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR1：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8，
且該抗體重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR2：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11，
且該抗體重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR3：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14；和
該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所述的LCDR1：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16，
且該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所述的LCDR2：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18，
且該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所述的LCDR3：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20。
在本申請的一些實施方案中，本申請抗體或其抗原結合片段的CDR序列可以存在1-3個胺基酸的突變，其中，1-3個胺基酸的突變是指，任意1-3個胺基酸的插入、缺失或替換；具體地，該1-3個胺基酸的突變是能夠優化抗體活性、抗體穩定性或降低免疫原性的1-3個胺基酸的插入、缺失或替換。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體重鏈可變區包含：
分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
或分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體輕鏈可變區包含：
分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
或分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：15 SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本申請還涉及一種具體方案，一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：
SEQ ID NO：7或與SEQ ID NO：7相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR1、
SEQ ID NO：9或與SEQ ID NO：9相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR2和
SEQ ID NO：12或與SEQ ID NO：12相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR3；
該輕鏈可變區包含：
SEQ ID NO：15或與SEQ ID NO：15相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR1、
SEQ ID NO：17或與SEQ ID NO：17相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR2和
SEQ ID NO：19或與SEQ ID NO：19相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：
SEQ ID NO：7或與SEQ ID NO：7相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR1、
SEQ ID NO：10或與SEQ ID NO：10相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR2和
SEQ ID NO：13或與SEQ ID NO：13相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR3；
該抗體輕鏈可變區包含：
SEQ ID NO：15或與SEQ ID NO：15相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR1、
SEQ ID NO：17或與SEQ ID NO：17相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR2和
SEQ ID NO：19或與SEQ ID NO：19相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上該的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：
分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：SEQ ID NO：8或與SEQ ID NO：8相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR1、SEQ ID NO：11或與SEQ ID NO：11相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR2和SEQ ID NO：14或與SEQ ID NO：14相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR3；
該輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：16或與SEQ ID NO：16相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR1、SEQ ID NO：18或與SEQ ID NO：18相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR2和SEQ ID NO：20或與SEQ ID NO：20相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：SEQ ID NO：7或與SEQ ID NO：7相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR1、SEQ ID NO：9或與SEQ ID NO：9相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR2和SEQ ID NO：12或與SEQ ID NO：12相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR3；該輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：16或與SEQ ID NO：16相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR1、SEQ ID NO：18或與SEQ ID NO：18相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR2和SEQ ID NO：20或與SEQ ID NO：20相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如 SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：SEQ ID NO：7或與SEQ ID NO：7相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR1、SEQ ID NO：10或與SEQ ID NO：10相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR2和SEQ ID NO：13或與SEQ ID NO：13相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR3；該輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：16或與SEQ ID NO：16相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR1、SEQ ID NO：18或與SEQ ID NO：18相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR2和SEQ ID NO：20或與SEQ ID NO：20相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含：SEQ ID NO：8或與SEQ ID NO：8相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR1、SEQ ID NO：11或與SEQ ID NO：11相比具有1-3個胺基酸突變的HCDR2和SEQ ID NO：14或與SEQ ID NO：14相比具有1-3個胺基酸 突變的HCDR3；該輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：15或與SEQ ID NO：15相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR1、SEQ ID NO：17或與SEQ ID NO：17相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR2和SEQ ID NO：19或與SEQ ID NO：19相比具有1-3個胺基酸突變的LCDR3。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為鼠源抗體或其片段，嵌合抗體或其片段，人抗體或其片段以及人源化抗體或其片段。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體。
在具體的實施方案中，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區。
在具體的實施方案中，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1的重鏈恆定區。
在具體的實施方案中，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：41所示的重鏈恆定區。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含突變的IgG1重鏈恆定區，其相較於親本胺基酸具有增強的ADCC毒性。在具體的實施方案中，該突變的IgG1重鏈恆定區如SEQ ID NO：40所示。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其突變體；
較佳地，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈的輕鏈恆定區；
更較佳地，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：42所示的輕鏈恆定區。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的重鏈可變區：SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26。
本申請還涉及一種較佳方案，一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26。
在本申請上下文中，提及“至少70%的同一性”是指，例如70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%的同一性，或任意兩個數值之間的範圍。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的輕鏈可變區：SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：25。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：25。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含：
SEQ ID NO：21所示的重鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：21所示的重鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：23所示的重鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：23所示的重鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：26所示的重鏈可變區、或與其具有至少70%、5%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：26所示的重鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區，和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區、或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含：
重鏈可變區為SEQ ID NO：21和輕鏈可變區為SEQ ID NO：22；
重鏈可變區為SEQ ID NO：21和輕鏈可變區為SEQ ID NO：25；
重鏈可變區為SEQ ID NO：23和輕鏈可變區為SEQ ID NO：22；
重鏈可變區為SEQ ID NO：23和輕鏈可變區為SEQ ID NO：25；
重鏈可變區為SEQ ID NO：24和輕鏈可變區為SEQ ID NO：22；
重鏈可變區為SEQ ID NO：24和輕鏈可變區為SEQ ID NO：25；
重鏈可變區為SEQ ID NO：26和輕鏈可變區為SEQ ID NO：22；或
重鏈可變區為SEQ ID NO：26和輕鏈可變區為SEQ ID NO：25。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%同一性的重鏈：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%、99%或100%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：31。
在本申請的另一些實施方案中，提供一種如上該抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含：
SEQ ID NO：27所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：27所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：29所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：29所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：30所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：30所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：32所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：32所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體包含：
重鏈為SEQ ID NO：27和輕鏈為SEQ ID NO：28；
重鏈為SEQ ID NO：27和輕鏈為SEQ ID NO：31；
重鏈為SEQ ID NO：29和輕鏈為SEQ ID NO：28；
重鏈為SEQ ID NO：29和輕鏈為SEQ ID NO：31；
重鏈為SEQ ID NO：30和輕鏈為SEQ ID NO：28；
重鏈為SEQ ID NO：30和輕鏈為SEQ ID NO：31：
重鏈為SEQ ID NO：32和輕鏈為SEQ ID NO：28；或
重鏈為SEQ ID NO：32和輕鏈為SEQ ID NO：31。
在本申請的一些實施方案中，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含：
SEQ ID NO：36所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：36所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：37所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：37所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：38所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：38所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：39所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈；或，
SEQ ID NO：39所示的重鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈、或與其具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈。
本申請還涉及一些實施方案，提供一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體包含：
重鏈為SEQ ID NO：36和輕鏈為SEQ ID NO：28；
重鏈為SEQ ID NO：36和輕鏈為SEQ ID NO：31：
重鏈為SEQ ID NO：37和輕鏈為SEQ ID NO：28；
重鏈為SEQ ID NO：37和輕鏈為SEQ ID NO：31；
重鏈為SEQ ID NO：38和輕鏈為SEQ ID NO：28；
重鏈為SEQ ID NO：38和輕鏈為SEQ ID NO：31；
重鏈為SEQ ID NO：39和輕鏈為SEQ ID NO：28；或
重鏈為SEQ ID NO：39和輕鏈為SEQ ID NO：31。
本申請進一步提供一種多核苷酸，其編碼如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段。
本申請進一步提供一種表達載體，其含有如上所述的多核苷酸。
本申請進一步提供一種宿主細胞，其導入或含有如上所述的表達載體。
在本申請一個具體的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為細菌，具體為大腸桿菌。
在本申請一個具體的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為酵母菌，具體為畢赤酵母。
在本申請一個具體的實施方案中，一種如上所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞，具體為CHO細胞或HEK293細胞。
本申請進一步提供一種生產抗GPC3抗體或其抗原結合片段的方法，包括：培養上述的宿主細胞(例如HEK293細胞)；從培養物中分離抗體(例如從細胞培養液中分離抗體)；以及對該抗體進行純化(例如以層析方法純化抗體)。
本申請進一步提供一種醫藥組成物，其含有上述所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段、以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
在本申請的進一個具體的實施方案中，提供了一種檢測或診斷試劑盒，其含有本申請所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，和一種或多種能檢測該抗GPC3抗體或其抗原結合片段與GPC3(或其表位)結合的試劑。
在本申請的一個具體的實施方案中，提供了一種檢測或診斷試劑盒，其含有本申請所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或其藥學上可接受的鹽、以及可用於檢測或診斷的標記的第二抗體、緩衝液和受質。
在本申請一個具體的實施方案中，提供了一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如前所述的組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於治療或預防GPC3介導的疾病或病症。
在本申請一個具體的實施方案中，一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如前該組成物在製備用於治療或預防GPC3介導的疾病或病症的藥物中的用途。
在本申請一個具體的實施方案中，一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如前該組成物在製備試劑或試劑盒中的用途，其中該試劑或試劑盒可用於檢測、診斷、預後GPC3介導的疾病或病症。
在本申請一個具體的實施方案中，一種如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如前該組成物，其用於檢測、診斷、預後GPC3介導的疾病。
本申請還進一步提供一種治療或預防GPC3介導的疾病的方法，包括步驟：向受試者提供治療有效量或預防有效量的如上所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段；或者向受試者提供治療有效量或預防有效量的如前所述的醫藥組成物。
本申請所述的疾病或病症為癌症；具體地，該疾病或病症為GPC3介導的癌症；進一步的，該癌症選自：乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤或黑色素瘤。
本申請提供了一種抗GPC3抗體或抗原結合片段，其能夠特異性的與GPC3抗原(或其表位)、表達GPC3的細胞結合，且具有顯著的CDC活性，其對腫瘤的殺傷效果顯著。
另外，本申請的抗GPC3抗體或其抗原結合片段具有良好的內吞作用，適於和藥物偶聯。本申請的抗GPC3抗體或抗原結合片段在高抗體活性基礎上，免疫原性更低，穩定性更高，並顯著優於Codrituzumab。本申請抗GPC3抗體或抗原結合片段具有更好的作為抗癌藥物的潛力，保證用藥安全。
圖1為人源化抗體Ab9重鏈可變區、GC33抗體重鏈可變區與其人種系模板序列對應關係圖(註：灰色底紋標出的為抗體與相應人種系模板不一致的胺基酸)。
圖2為人源化抗體Ab9輕鏈可變區、GC33抗體輕鏈可變區與其人種系模板序列對應關係圖(註：灰色底紋標出的為抗體與相應人種系模板不一致的胺基酸)。
術語
為了更容易理解本申請，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本申請所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本申請所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本申請所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本申請中，本申請所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區源自人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本申請中，本申請所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區源自人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的框架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順 序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本申請所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat或Chothia或ABM定義規則。
本申請中，除非另有說明，可變區的胺基酸編號採用Kabat編號系統。本領域技術人員可以根據常識確定某特定胺基酸位置在不同編號系統中的對應關係。
術語“GPC3”包括由細胞天然表達的GPC3的任何變體或同種型。本申請的抗體(或其抗原結合片段)可與非人物種的GPC3交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人GPC3特異性的，可不表現出與其他物種的交叉反應性。GPC3或其任何變體或同種型可從細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文該那些技術藉由重組技術產生。具體地，抗GPC3抗體靶向具有正常糖基化模式的人源GPC3(或其表位)。
術語“鼠源抗體”在本申請中為根據本領域知識和技能製備的針對人GPC3(或其表位)的單株抗體。製備時用GPC3抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本申請一個具體的實施方案中，該鼠源GPC3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本申請的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基 (如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括“人源化抗體”。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。人源化抗體有助於克服嵌合抗體由於攜帶非人蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應的缺點。為避免免疫原性的下降而引起活性的下降，可對該人源化抗體的可變區進行最少回復突變，以保持活性。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將第一物種抗體的可變區與第二物種抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕第一物種抗體誘發的免疫應答反應。作為非限制性示例，為建立嵌合抗體，現建立分泌第一物種單抗的融合瘤，然後從融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖第二物種抗體的恆定區基因，將可變區基因與恆定區基因連接成嵌合基因後插入載體中，最後在工業系統中表達嵌合抗體分子。恆定區可選自第二物種的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體；具體地，包含第二物種的IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者具有增強的ADCC毒性的IgG1重鏈恆定區。
術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合活性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗原結合片段保留至少10%的母體結合活性。具體地，抗原結合片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段的示例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、奈米抗 體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一條輕鏈、一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
“Fab’片段”含有一條輕鏈和一條重鏈的部分(包含VH結構域、CH1結構域、以及CH1和CH2結構域之間區域)；由此可在兩個Fab’片段的兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
“Fv區”包含來自重鏈和輕鏈二者的可變區，但缺少恆定區。
術語“多特異性抗體”按其最廣義使用，涵蓋具有多表位特異性的抗體。這些多特異性抗體包括但不限於：包含重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL的抗體，其中該VH-VL單元具有多表位特異性；具有兩個或多個VL和VH區的抗體，每個VH-VL單元與不同的靶點或同一個靶點的不同表位結合；具有兩個或更多個單可變區的抗體，每個單可變區與不同的靶點或同一個靶點的不同的表位結合；全長抗體、抗體片段、雙抗體(diabodies)、雙特異性雙抗體和三抗體(triabodies)、己共價或非共價連接在一起的抗體片段等。
術語“單鏈抗體”是由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。
術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。作為非限制性示例，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本申請的術語“與GPC3結合”，指能與人GPC3或其表位相互作用。
本申請的術語“抗原結合位點”指本申請抗體或抗原結合片段識別的線性或三維空間位點。
術語“表位”是指抗原上與抗體(或抗原結合片段)結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由肽鏈的三級折疊而靠近但不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位與給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本申請所用的術語“特異性結合”是指抗體(或抗原結合片段)與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人GPC3作為分析物並使用抗體作為配體時，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定，抗體(或抗原結合片段)以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合；並且，抗體(或抗原結合片段)與預定抗原結合的親和力是其與非特異性抗原(如BSA)結合的親和力的至少兩倍。
術語“交叉反應”是指本申請的抗體(或抗原結合片段)與來自不同物種的GPC3(或其表位)結合的能力。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與抗原的特異性反應性，或與生理表達GPC3的細胞的 結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷兩者。較佳地，對配體的抑制/阻斷能夠降低或改變無抑制或無阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水平或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗GPC3抗體接觸時，與未與抗GPC3抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力的降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括任何可測量的細胞生長的降低。
術語“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的剌激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指剌激特定的直接細胞殺傷機制。
本申請中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞，藉由識別抗體的Fc段，直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段進行修飾，而增強或降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人GPC3或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。本申請所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人FR種系序 列可以從數據庫ImMunoGeneTics(IMGT)得到，或者從The Immunoglobulin FactsBook雜誌(,Academic Press出版社，2001ISBN012441351)上獲得。
本申請工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。作為非限制性示例，抗體的cDNA序列可以選殖並重組至表達載體，該表達載體可以穩定地轉染宿主細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器中擴大培養以生產抗體。可以用常規技術純化、收集培養液。可用常規方法進行過濾濃縮。也可以用常規方法去除可溶的混合物和多聚體，，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍幹。
本申請的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的、原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術(如CDR-grafting)、或其它現有技術進行重組得到。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，諸如包含本申請的任一種抗體，該受試者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本申請的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書和權利要求書中使用的術語“基本上由……組成”或其變形表示包括所有該元件或元件組，並且任選包括與該元件類似或不同性質的其它元件，該其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病或其症狀的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的疾病、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指要據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在生物、細胞或人體內產生的物質。
“同源性”或“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮傳代數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或其抗原結合片段，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
以下結合實施例用於進一步描述本申請，但這些實施例並非限制著本申請的範圍。本申請實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例
實施例1：蛋白抗原和細胞株準備
(1)蛋白抗原準備
蛋白抗原是人GPC3重組蛋白(UniProt #P51654,Gln 25至His 559片段)，C端帶His標簽，即人GPC3 His蛋白，購買自AcroBiosystems公司(Cat # GP3-H52H4)。
表1. 人GPC3(Gln 25-His 559)胺基酸序列
Figure 109142630-A0101-12-0029-1
(2)細胞株構建
以CHO-K1為宿主細胞，構建穩定表達人或猴(Macaca mulatta)GPC3全長蛋白的單株穩定細胞株，分別命名為CHO-K1-hGPC3和CHO-K1-cynoGPC3。細胞株構建方法如下：將體外合成的人或猴GPC3全長DNA序列(見下表2)選殖到帶有嘌呤黴素抗性基因的慢病毒載體，轉染CHO-K1細胞，得到的細胞池用含8μg/ml嘌呤黴素、10%FBS的F12K培養基(三種試劑均購買自GIBCO)進行篩選培養，FACS檢測GPC3的表達量，然後梯度稀釋法獲得高表達單株細胞株。
表2. 人GPC3和猴GPC3的DNA序列
Figure 109142630-A0101-12-0030-2
Figure 109142630-A0101-12-0031-3
Figure 109142630-A0101-12-0032-4
實施例2：鼠融合瘤及抗體序列的獲得
免疫原分別為人GPC3-His抗原蛋白和/或CHO-K1-hGPC3細胞。10隻Balb/c和5隻SJL小鼠，以及5隻C57小鼠，雌性，10週齡。
兩種免疫佐劑：
(1)使用Sigma完全弗氏佐劑(CFA)和Sigma不完全弗氏佐劑(IFA)，免疫原和免疫佐劑以1：1的比例充分混合乳化，製成穩定“油包水”液體。
(2)使用Invivo Gen的鋁鹽佐劑(Alhydrogel® adjuvant 2%)，按照抗原和佐劑1：1混合，形成水溶性溶液後免疫。
免疫方案和免疫程序見下表3、表4和表5：
表3. 免疫方案
Figure 109142630-A0101-12-0033-5
表4. 免疫程序(蛋白免疫)
Figure 109142630-A0101-12-0033-6
表5. 免疫程序(蛋白和細胞組合免疫)
Figure 109142630-A0101-12-0033-7
對免疫小鼠血清使用如下實施例3該間接ELISA法評估血清效價及實施例4(2)FACS檢測結合細胞表面抗原的能力，對照效價檢測情況(大於10萬倍稀釋度)決定啟動細胞融合。
選擇血清效價、親和力及FACS結合強的免疫小鼠進行一次終免疫；處死小鼠，取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合後獲得融合瘤；藉由間接ELISA和FACS篩選到目標融合瘤；藉由有限稀釋法建株為單株細胞株。得到的陽性細胞株進一步使用間接ELISA和FACS進行篩選，從而選定結合重組蛋白的融合瘤。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(ThermoFisher，15596-026)提取RNA並反轉錄(PrimeScriptTM第一鏈cDNA合成試劑盒，Takara #6110A)。將反轉錄得到的cDNA採用小鼠Ig-引子組(Sigma #69831)進行PCR擴增後測序，藉由測序獲得鼠源抗體M1、M2、M3的序列。
表6. 鼠單抗的重鏈和輕鏈可變區序列
Figure 109142630-A0101-12-0034-8
藉由對M1、M2和M3的CDR區的分析，發現M1、M2和M3的LCDR1均含有“NGN”序列片段，推測會對抗體的穩定性產生影響。在後續的嵌合抗體和人源化抗體中，將LCDR1的“NGN”序列突變為“NRN”，因此後續研究中的CDR區序列如下表所示。
表7. 重鏈和輕鏈可變區的CDR序列
Figure 109142630-A0101-12-0035-9
實施例3：鼠抗的體外結合活性檢測方法
體外間接ELISA結合實驗：
用pH7.4的PBS將GPC3 His蛋白(AcroBiosystems，Cat # GP3-H52H4)稀釋至0.5μg/ml濃度，以100μL/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板3次後，加入用PBST稀釋的1%牛血清白蛋白(BSA)封閉液200μL/孔，37℃孵育0.5小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板1次。
用含1%BSA的PBST稀釋待測抗體，100nM起始，5倍梯度稀釋，11個劑量，以100μL/孔加到酶標板中，放於37℃孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板3次，加入200μL/孔用含1%BSA的PBST稀釋的HRP標記羊抗鼠二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories，cat#115-035-071)或HRP標記羊抗人二抗(Rockland，cat#609-103-123)，37℃孵育0.5小時。用PBST洗板5次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(蘇州亞科化學試劑股份有限公司，cat# S0025)，於25℃避光孵育8-15分鐘，加入50μl/孔1M HCl終止反應，用酶標儀(Thermo,Ascent)在450nm處讀取吸收值，分析數據。
做濃度-信號值曲線分析結果，如下表所示。結果顯示：鼠抗體對人GPC3抗原的親和力良好。
表8. 鼠抗體對人GPC3抗原的親和力(EC50值)
Figure 109142630-A0101-12-0036-10
實施例4：小鼠抗體嵌合化實驗
將篩選得到的陽性鼠源抗體進行嵌合化，鼠源抗體可變區選殖在人抗體的恆定區得到嵌合抗體，本申請嵌合抗體的恆定區選自人IgG1重鏈恆定區和人kappa鏈恆定區。
重鏈載體設計如下：信號肽+重鏈可變區序列+人的IgG1恆定區序列。
輕鏈載體設計如下：信號肽+輕鏈可變區序列+人的Kappa恆定區序列。
分別將上述序列插入pCEP4載體，按照上述設計合成表達載體。得到載體質粒後，提取質粒，將質粒送測序驗證。將驗證合格的質粒用TF1轉染至HEK293細胞(義翹神州)中，連續培養。將HEK293細胞用無血清CD培養液(義翹神州，Cat#SMM 293-TI)培養至對數生長期用於細胞轉染。將21.4μg輕鏈質粒和23.6μg重鏈質粒溶解在10mL Reduced Serum Medium(GIBCO，31985-070)中混勻，然後加入200ug TF1，混勻，RT孵育15min，加入50mL細胞中。細胞培養條件：5%CO2，37℃，125rpm/min。培養期間，第1、3、5天加補料(義翹神州，Cat# M293-SUPI-100)，直到細胞活率低於70%、收取細胞上清，離心過濾。將離心過濾後的細胞培養液上樣到Protein-A親和層析柱，經磷酸緩衝液洗柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、2M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，最終獲得純化的各嵌合抗體。
(1)體外蛋白結合實驗：
根據實施例3的體外間接ELISA結合實驗和如下所示的Biacore方法，測試嵌合抗體與人GPC3抗原的親和力：
芯片製備：將鼠抗人IgG(Fc)抗體用固定試劑(10mM醋酸鈉，pH 5.0)稀釋到25μg/mL，芯片每個通道約使用100μL鼠抗人IgG(Fc)抗體，固定兩個通道約使用190μL固定試劑加入10μL鼠抗人IgG(Fe)抗體。首先，CM5芯片的表面用400mM EDC和100mM NHS以10μL/min的流速進行420s的活化。其次，將25μg/mL的鼠抗人IgG(Fc)抗體以10μL/min的流速注入到實驗通道(FC4)約420s，固定量約為9000至14000RU。最後，芯片用1M乙醇胺以10μL/min進行420s封閉。參比通道(FC3)與試驗通道(FC4)進行相同的操作。
捕獲配體：將抗體原液用運行試劑分別稀釋至4μg/mL，並以10μL/min的流速注入到實驗通道(FC4)捕獲約200RU。參比通道(FC3)不需要進行配體的捕獲。
分析物多循環分析：將人GPC3蛋白用運行試劑進行2倍倍比稀釋，將稀釋後的樣品依次以30μL/min的流速按照相應結合時間和解離時間注入到實驗通道與參比通道。每一個濃度分析後，芯片需要用3M氯化鎂以20μL/min的流速再生30s，洗掉配體以及未解離的分析物。進行下一個濃度分析時，實驗通道需要重新捕獲相同量的配體。
數據分析：使用Biacore T200分析軟件計算每個抗體的KD值，參比通道(FC3)用於背景的扣減。
體外間接ELISA結合實驗和Biacore方法測定結果如表9所示：
表9. 嵌合抗體對人GPC3抗原的親和力。
Figure 109142630-A0101-12-0038-11
ELISA和Biacore結果顯示嵌合抗體與人GPC3抗原具有良好的親和力。
(2)體外細胞結合實驗：
GPC3高表達細胞，包括過表達人或猴GPC3的CHO-K1細胞(ATCC，Cat# CCL-61)，和表達GPC3的人肝癌細胞JHH-7(南京科佰，Cat# CBP60204)，HepG2(中國科學院細胞庫，Cat# SCSP-510)，經胰酶消化後， 離心收集細胞，用FACS緩衝液(含2% FBS的1×PBS)調節細胞密度後分鋪於96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。離心：1200g、5分鐘，棄上清，加入100μL已用FACS緩衝液梯度稀釋的抗體溶液(抗體起始工作濃度為100nM，5倍稀釋，7個濃度點，並設立0nM點)，4℃孵育1小時。離心：1200g、5分鐘，棄上清，PBS洗細胞2次後，添加FACS緩衝液配製的螢光標記二抗工作液PE抗人IgG Fc抗體(Biolegend,Cat# 409304)或FITC抗小鼠IgG抗體(Biolegend,Cat# 406001)，100μL每孔重新懸浮細胞，4℃孵育1小時。離心：1200g、5分鐘，棄上清。PBS洗細胞2次後，再重新懸浮於PBS，使用流式細胞計數儀DxFlex檢測螢光信號，並作曲線分析抗體結合細胞的EC50濃度。
表10. 嵌合抗體對表達GPC3細胞的親和力(EC50值)
Figure 109142630-A0101-12-0039-12
結果顯示：嵌合抗體與表達GPC3的細胞均具有很高的親和力。
實施例5：小鼠抗體人源化實驗
鼠源抗人GPC3單株抗體人源化如本領域文獻公示的方法進行。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列，本申請將鼠源抗體M1、M2和M3進行人源化。
在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系數據庫比較，獲得同源性高的人種系模板。
將鼠源抗體的CDR區移植到選擇好的相應人源化模板上。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基、以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變、並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，經表達測試和回復突變數量對比，選擇出設計了人源化重鏈可變區HCVR和輕鏈可變區LCVR序列組合而成的抗體，序列如下：
表11. 人源化抗體的CDR區
Figure 109142630-A0101-12-0040-13
表12. 人源化抗體的重鏈和輕鏈可變區序列
Figure 109142630-A0101-12-0041-14
其中，人源化抗體Ab9重鏈可變區與其人種系模板(種系1)序列相比，序列一致性為81.7%，序列相似性為87.0%。GC33重鏈可變區與其人種系模板(種系1)序列相比，序列相似性和一致性比例與Ab9相同。人源化抗體Ab9重鏈可變區、GC33抗體重鏈可變區與其人種系模板序列對應關係參見圖1。
Ab9輕鏈可變區與其人種系模板(種系2)相比，序列一致性為88.4%，相似性為97.3%。GC33輕鏈可變區與其人種系模板(種系3)相比，序列一致性為86.6%，相似性為89.3%。Ab9輕鏈可變區與其人種系模板(種系2)、GC33輕鏈可變區與其人種系模板(種系3)對應關係參見圖2。
將設計的重鏈和輕鏈可變區序列分別與人抗體的重鏈恆定區和輕鏈恆定區序列連接。示例性地，抗體重鏈恆定區選自：經胺基酸突變後具有ADCC增強的人IgG1重鏈恆定區、或天然的人IgG1重鏈恆定區，其序列分別如SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41所示；輕鏈恆定區選自序列如SEQ ID NO：42所示的人κ鏈的恆定區。得到的重鏈和輕鏈序列如表13所示，抗體恆定區序列如表14所示。
表13 人源化抗體的重鏈和輕鏈序列
Figure 109142630-A0101-12-0042-15
Figure 109142630-A0101-12-0043-17
Figure 109142630-A0101-12-0044-18
Figure 109142630-A0101-12-0045-19
Figure 109142630-A0101-12-0046-20
Figure 109142630-A0101-12-0047-21
Figure 109142630-A0101-12-0048-22
Figure 109142630-A0101-12-0049-23
表14. 恆定區序列編號
Figure 109142630-A0101-12-0049-24
表15. 抗體及其重鏈、輕鏈、可變區的序列編號
Figure 109142630-A0101-12-0050-25
實施例6：人源化抗體的體外結合活性實驗
使用實施例3該體外間接ELISA結合實驗和實施例4中(1)該Biacore方法，測定各人源化抗體對人GPC3抗原的親和力，結果見表16：
表16. 人源化抗體對人GPC3抗原的親和力
Figure 109142630-A0101-12-0050-26
結果顯示：人源化抗體與人GPC3抗原有良好的親和力。
使用實施例4中(2)該體外細胞結合實驗測定各人源化抗體對表達GPC3細胞的親和力(EC50)，結果見表17：
表17. 人源化抗體對表達GPC3細胞的親和力(EC50值)
Figure 109142630-A0101-12-0051-27
結果顯示：人源化抗體與表達GPC3的細胞有良好的親和力。
實施例7：人源化抗體的內吞作用
檢測本申請抗體結合GPC3後是否能和人GPC3共同內吞入細胞，用穩轉細胞株CHO-K1-人GPC3進行評估。
細胞使用胰酶消化，收集細胞並用預冷的FACS緩衝液重新懸浮，調整細胞濃度為1×106個/mL。取EP管，加入1mL細胞懸液，1500rpm離心5分鐘後棄上清，加入1mL已經配製好的待測抗體重新懸浮細胞，抗體的終濃度均為20μg/ml，4℃搖床孵育1小時，離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。每管加入100μL螢光標記二抗工作液PE抗入IgG Fc抗體(Biolegend,Cat# 409304)或FITC抗小鼠IgG抗體(Biolegend,Cat# 406001)，重新懸浮細胞，4℃搖床孵育30分鐘，離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。每管加入1mL預熱的細胞培養基重新懸浮細胞並混勻，分裝為4管，每管200μL，分別為0分鐘組，空白組，30分鐘組和2小時組，取出0分鐘組及空白組置於冰上，其餘放置於37℃培養箱，分別內吞30分鐘、2小時，在相應時間點取出EP管，置於冰上預冷5分鐘，所有處理組離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，用FACS緩衝液洗滌一次，棄 上清。除0分鐘組外，所有處理組EP管中加入250μL strip緩衝液，室溫孵育8分鐘，離心棄上清(4℃、1500rpm×5分鐘)，FACS緩衝液洗滌兩次，棄上清。所有處理組加入100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀DxFlex進行檢測。
抗體的內吞百分比(%)=(各個時間點螢光強度值-空白組的平均螢光強度值)/(零點時的平均螢光輕度值-空白組的平均螢光強度值)×100，結果見表18：
表18. 人源化抗體在細胞中的內吞作用
Figure 109142630-A0101-12-0052-28
從表18結果顯示：人源化抗體在穩轉細胞株CHO-K1-人GPC3中有良好的內吞作用。
實施例8：人源化抗體的ADCC實驗
本實驗的效應細胞為NK92MI(過表達IL-2基因的NK92細胞，購買自南京科佰)，靶細胞為人肝癌細胞HepG2。實驗培養基為含10%FBS的RPMI1640，用於細胞和抗體重新懸浮或稀釋。HepG2細胞經胰酶消化，離心收集，用實驗培養基重新懸浮成1×105個/ml，100μL鋪於白色96孔板(Corning，3610)，37℃培養箱培養2天后，加入50μL 4×工作濃度的抗體，4℃孵育15分鐘。收集NK92MI細胞，用實驗培養基重新懸浮成1×106個/ml，加入50μL至上述反應中，使得效應細胞和靶細胞的比例為5：1，37℃培養箱孵育3-4小時。最後 添加100μL Cell Titer-Glo(Promega，Cat#G7573)，混勻室溫避光反應10分鐘，多功能酶標儀(Thermofisher，Lux)讀數。
抗體殺傷百分比(%)=(E-S)/(E-M)×100
E為不加抗體的孔的數值，即效應細胞+腫瘤細胞；
S為樣品孔的數值，即效應細胞+腫瘤細胞+抗體；
M是培養基孔的數值。
結果顯示：人源化抗體有顯著的ADCC作用。
實施例9：人源化抗體的CDC實驗
本實驗的靶細胞為過表達人GPC3的穩定細胞株CHO-K1-hGPC3。實驗培養基為不含FBS的細胞培養基F12K(GIBCO)，用於細胞和抗體重新懸浮或稀釋。
CHO-K1-hGPC3細胞經胰酶消化，離心收集，用實驗培養基重新懸浮成1×105個/ml，50μL鋪於白色96孔板(Corning，3610)，加入25μL 4×工作濃度的抗體(抗體起始工作濃度為20nM，5倍稀釋，10個濃度點，並設立0nM點)，37℃孵育30分鐘，加入25μL 80%人血清(GemCellTM US，Cat#100-512)，37℃培養箱培養24小時。添加50μL CellTiter-Glo(Promega，Cat#G7573)，混勻室溫避光反應10分鐘，多功能酶標儀(Thermofisher，Lux)讀數。
抗體殺傷百分比(%)=(E-S)/(E-M)×100
E為不加抗體孔的數值，即細胞+培養基+人血清；
S為樣品孔的數值，即細胞+抗體+人血清；
M是培養基+人血清孔的數值。
表19. 人源化抗體的CDC作用
Figure 109142630-A0101-12-0054-29
結果顯示：人源化抗體Ab9具有顯著的CDC作用。
實施例10：人源化抗體的電荷異質穩定性實驗
本實驗藉由全景式等電聚焦(iCIEF)的方法，檢測並比較了人源化抗體在起始0點、以及分別在25℃和40℃放置一個月的電荷異質體純度，以此考察抗體的穩定性。
將帶有兩性基團的樣品、兩性電解質、緩衝劑和輔助添加劑的混合物注入毛細管內，當在毛細管兩端加上直流電壓時，載體兩性電解質可以在管內形成一定範圍的pH梯度，樣品組分依據其所帶電性向陰極或陽極泳動，毛細管內DH值與該組分的等電點(pI)相同時，溶質分子的淨電荷為零，宏觀上該組分將聚集在該點不再進一步遷移，達到使複雜樣品中各組分分離的目的。採集圖譜後，根據Marker pI值與色譜峰的遷移時間的線性關係，從而得到供試品的pI值、峰比值(主峰、酸峰、堿峰)。主要步驟如下：
系統適應性樣品準備：將Maurice cIEF System Suitability Kit(Protein Simple，Cat#046-044)裡的適應性樣品管取出，加入40μl去離子水和160μl System Suitability Test Mix，混勻後轉移到1.5ml離心管中，渦旋震盪後離心，取160ul上清轉移至96孔樣品板待用。
配製eIEF Master混合溶液：包含37μl超純水，35μl的1% MC(Protein Simple，Cat#101876)，4μl Pharmalyte pH 3-10(Protein Simple，Cat#17-0456-01)，2μl 500mM arginine(Protein Simple，Cat#042-691)，以及相應的兩個pI Marker 6.14(protein simple,cat：046-031)和9.99(protein simple,cat：046-034)各1μl，總體積為80μl。
供試品製備：樣品設置3個條件：起始0點；在穩定性試驗箱(Memmer，型號HPP 1060)濕度為65%和溫度為25℃的條件下放置1個月；在穩定性試驗箱(Memmer，型號HPP 1060)濕度為65%和溫度為40℃的條件下放置1個月。取20μl相應樣品，加至步驟2)中含80μl cIEF Master Mix solution的EP管中，渦旋振盪混勻後離心，取80ul上清轉移至96孔樣品板，離心待用。
上機檢測：打開毛細管電泳儀(Protein Simple，maurice)以及軟件，按照儀器操作步驟，進行儀器自檢，安裝毛細管卡盒(Protein Simple，Cat# PS-MC02-C)，將96孔樣品板放入儀器的相應位置，進行cIEF分析。
表20. 人源化抗體的iCIEF檢測
Figure 109142630-A0101-12-0055-30
結果顯示：與起始0點相比，Ab9在25℃放置一個月後的主峰比例變化不大，穩定性良好。在強制降解條件40℃放置一個月，抗體出現了預期的 降解現象，體現在主峰比例降為26.3%；而對照抗體GC33在40℃放置一個月後主峰比例降為2.5%。
實施例11：人源化抗體的分子變異體穩定性實驗
本實驗藉由毛細管電泳(CE-SDS)的方法，檢測並比較了人源化抗體在起始0點、以及分別在25℃和40℃放置一個月的分子變異體的純度。CE-SDS是基於蛋白樣品在變性條件下凝膠電泳中的遷移，根據不同分子量的蛋白遷移時間的差異完成分離，從而得到非還原和還原處理後樣品純度的檢測結果。
主要步驟如下：
樣品準備：樣品在起始0點取樣；在穩定性試驗箱(Memmer，型號HPP 1060)濕度為65%和溫度為25℃的條件下放置1個月取樣；在穩定性試驗箱(Memmer，型號HPP 1060)濕度為65%和溫度為40℃的條件下放置1個月取樣。
非還原CE樣品處理：向EP管中加入樣品，每個樣品的蛋白取用量為50μg，加入1μL的10kD內標(Protein Simple，Cat#046-144)，加入2.5μL的250mM IAM(Sigma，Cat# I1149-5G)，加入1×樣本緩衝液(Protein Simple，Cat#046-567)至終體積為50μL。
還原CE樣品處理：向EP管中加入樣品，每個樣品的蛋白取用量為50μg，加入1μL的10kD內標(Protein Simple，Cat#046-144)，加入2.5μL的β-巰基乙醇(Sigma，Cat# M3148-25ML)，加入1×樣本緩衝液(Protein Simple，Cat#046-567)至終體積為50μL。
振盪混勻後，在幹式恆溫器(杭州奧盛儀器有限公司，型號MK20001)中70℃加熱孵育10min，之後取出，冰上孵育5min，冷卻後12000 rpm離心5min。離心後取35μL上清轉移至儀器匹配的96孔中，之後於1000rpm離心5min。
樣品檢測：將96孔樣品板放入毛細管電泳儀(Protein Simple，Maurice)中，打開儀器以及軟件，按照儀器操作步驟，進行儀器自檢，安裝毛細管卡盒(Protein Simple，Cat#090-157)，準備相應的試劑放入儀器的相應位置。根據儀器操作步驟，設置相應的參數，進行還原或者非還原CE分析。
數據處理：樣品檢測完成後，設置相應的積分參數，藉由儀器自帶軟件進行計算分析，得到樣品純度。
表21. 人源化抗體的CE-SDS檢測
Figure 109142630-A0101-12-0057-31
非還原CE結果顯示，人源化抗體Ab9在25℃放置一個月的主峰比例和0點的相近，40℃放置一個月主峰有所下降。在還原CE中，與0點相比，無論是25℃還是40℃放置一個月，Ab9抗體的重輕鏈比例之和均變化不大，穩定性良好。
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<210> 1
<211> 115
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<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
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Figure 109142630-A0101-12-0058-32
<210> 2
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> LCVR
<400> 2
Figure 109142630-A0101-12-0059-33
<210> 3
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> HCVR
<400> 3
Figure 109142630-A0101-12-0059-34
<210> 4
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> LCVR
<400> 4
Figure 109142630-A0101-12-0060-35
<210> 5
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> HCVR
<400> 5
Figure 109142630-A0101-12-0060-36
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> LCVR
<400> 6
Figure 109142630-A0101-12-0060-37
Figure 109142630-A0101-12-0061-38
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR1
<400> 7
Figure 109142630-A0101-12-0061-39
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR1
<400> 8
Figure 109142630-A0101-12-0061-40
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR2
<400> 9
Figure 109142630-A0101-12-0061-41
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR2
<400> 10
Figure 109142630-A0101-12-0062-42
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR2
<400> 11
Figure 109142630-A0101-12-0062-43
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR3
<400> 12
Figure 109142630-A0101-12-0062-44
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR3
<400> 13
Figure 109142630-A0101-12-0063-45
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR3
<400> 14
Figure 109142630-A0101-12-0063-46
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR1
<400> 15
Figure 109142630-A0101-12-0063-47
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR1
<400> 16
Figure 109142630-A0101-12-0063-48
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR2
<400> 17
Figure 109142630-A0101-12-0063-49
Figure 109142630-A0101-12-0064-50
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR2
<400> 18
Figure 109142630-A0101-12-0064-51
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR3
<400> 19
Figure 109142630-A0101-12-0064-52
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> CDR3
<400> 20
Figure 109142630-A0101-12-0064-53
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> HCVR
<400> 21
Figure 109142630-A0101-12-0064-54
Figure 109142630-A0101-12-0065-55
<210> 22
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> LCVR
<400> 22
Figure 109142630-A0101-12-0065-56
<210> 23
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> HCVR
<400> 23
Figure 109142630-A0101-12-0065-57
Figure 109142630-A0101-12-0066-58
<210> 24
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> HCVR
<400> 24
Figure 109142630-A0101-12-0066-59
<210> 25
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> LCVR
<400> 25
Figure 109142630-A0101-12-0066-60
Figure 109142630-A0101-12-0067-61
<210> 26
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<222>
<223> HCVR
<400> 26
Figure 109142630-A0101-12-0067-62
<210> 27
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 重鏈
<400> 27
Figure 109142630-A0101-12-0067-63
Figure 109142630-A0101-12-0068-64
<210> 28
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 輕鏈
<400> 28
Figure 109142630-A0101-12-0069-65
<210> 29
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 重鏈
<400> 29
Figure 109142630-A0101-12-0069-66
Figure 109142630-A0101-12-0070-67
<210> 30
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 重鏈
<400> 30
Figure 109142630-A0101-12-0070-68
Figure 109142630-A0101-12-0071-69
<210> 31
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 輕鏈
<400> 31
Figure 109142630-A0101-12-0072-70
<210> 32
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 重鏈
<400> 32
Figure 109142630-A0101-12-0072-71
Figure 109142630-A0101-12-0073-72
<210> 33
<211> 535
<212> PRT
<213> 人(Homo Sapiens)
<400> 33
Figure 109142630-A0101-12-0073-73
Figure 109142630-A0101-12-0074-74
Figure 109142630-A0101-12-0075-75
<210> 34
<211> 1743
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 34
Figure 109142630-A0101-12-0075-76
<210> 35
<211> 1743
<212> DNA
<213> 獼猴(Macaca mulatta)
<400> 35
Figure 109142630-A0101-12-0075-77
Figure 109142630-A0101-12-0076-78
<210> 36
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 重鏈
<400> 36
Figure 109142630-A0101-12-0076-79
Figure 109142630-A0101-12-0077-80
<210> 37
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 重鏈
<400> 37
Figure 109142630-A0101-12-0077-81
Figure 109142630-A0101-12-0078-82
<210> 38
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 重鏈
<400> 38
Figure 109142630-A0101-12-0079-83
<210> 39
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 鏈
<222>
<223> 重鏈
<400> 39
Figure 109142630-A0101-12-0080-84
Figure 109142630-A0101-12-0081-85
<210> 40
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 變體
<222>
<223> IgG1重鏈恆定區變體
<400> 40
Figure 109142630-A0101-12-0081-86
Figure 109142630-A0101-12-0082-87
<210> 41
<211> 330
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 41
Figure 109142630-A0101-12-0082-88
Figure 109142630-A0101-12-0083-89
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 42
Figure 109142630-A0101-12-0083-90

Claims (23)

  1. 一種抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
    該重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR1：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8；至少1個選自以下序列所示的HCDR2：SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11；和至少1個選自以下序列所示的HCDR3：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14；且
    該輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的LCDR1：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16；至少1個選自以下序列所示的LCDR2：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18；和至少1個選自以下序列所示的LCDR3：SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20。
  2. 如請求項1所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變區包含：
    分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
    分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或，
    分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
  3. 如請求項1所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該輕鏈可變區包含：
    分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或，
    分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中：
    該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或，
    該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或，
    該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或，
    該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或，
    該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：20所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或，
    該重鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：14所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；該抗體輕鏈可變區包含：分別如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該的抗體為鼠源抗體或其片段，嵌合抗體或其片段，人抗體或其片段、以及人源化抗體或其片段。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體；
    較佳地，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1、IgG2或IgG4的重鏈恆定區；
    更佳地，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人IgG1的重鏈恆定區；
    進一步較佳地，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：41所示的重鏈恆定區、或如SEQ ID NO：40所示的重鏈恆定區變體。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其變體；
    較佳地，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人κ鏈的輕鏈恆定區；
    更佳地，該抗GPC3抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：42所示的輕鏈恆定區。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含：
    選自以下序列所示的重鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：26；
    和/或選自以下序列所示的輕鏈可變區、或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：25。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含：
    SEQ ID NO：21所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區；或，
    SEQ ID NO：21所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區；或，
    SEQ ID NO：23所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區；或，
    SEQ ID NO：23所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區；或，
    SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區；或，
    SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區；或，
    SEQ ID NO：26所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區；或，
    SEQ ID NO：26所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區。
  10. 如請求項8或9所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的重鏈，或包含與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39。
  11. 如請求項8或9所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其中該抗GPC3抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的輕鏈，或包含與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：31。
  12. 如請求項1至11中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，其包含：
    SEQ ID NO：27所示的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：27所示的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：29所示的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：29所示的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：30所示的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：30所示的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：32所示的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：32所示的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：36所示的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：36所示的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：37所示的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：37所示的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：38所示的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：38所示的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：39所示的重鏈，和SEQ ID NO：28所示的輕鏈；或，
    SEQ ID NO：39所示的重鏈，和SEQ ID NO：31所示的輕鏈。
  13. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至12中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段。
  14. 一種表達載體，其含有如請求項13所述的多核苷酸。
  15. 一種宿主細胞，其導入或含有如請求項14所述的表達載體；
    較佳地，該宿主細胞為細菌、酵母菌或哺乳動物細胞；較佳大腸桿菌、畢赤酵母、CHO細胞或HEK293細胞。
  16. 一種生產抗GPC3抗體或其抗原結合片段的方法，包括：
    培養如請求項15所述的宿主細胞，較佳HEK293細胞；
    從培養物中分離抗體，較佳從細胞培養液中分離抗體；以及
    對該抗體進行純化，較佳地，以層析方法純化該抗體。
  17. 一種醫藥組成物，其含有：
    如請求項1至12中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段、以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
  18. 一種檢測或診斷試劑盒，其含有：
    如請求項1至12中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段，
    任選地，還包含一種或多種能檢測該抗GPC3或其抗原結合片段與GPC3或其表位結合的試劑。
  19. 一種選自以下的任一項在製備用於治療或預防GPC3介導的疾病或病症的藥物中的用途：
    如請求項1至12中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段、如請求項17所述的醫藥組成物。
  20. 一種選自以下的任一項在製備試劑盒中的用途：
    如請求項1至12中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段、如請求項17所述的醫藥組成物；
    其中該試劑盒用於檢測、診斷、預後GPC3介導的疾病或病症。
  21. 如請求項19或20所述的用途，其中：
    該疾病或病症為癌症；
    較佳地，該疾病或病症為表達GPC3的癌症；
    更佳地，該癌症選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
  22. 如請求項1至12中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段或如請求項17所述的醫藥組成物，其用於檢測、診斷、預後GPC3介導的疾病；較佳地，該疾病選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
  23. 一種治療或預防GPC3介導的疾病的方法，包括如下步驟：
    向受試者提供治療有效量或預防有效量的如請求項1至12中任一項所述的抗GPC3抗體或其抗原結合片段；或者
    向受試者提供治療有效量或預防有效量的如請求項17所述的醫藥組成物；
    較佳地，該GPC3介導的疾病選自乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食管癌、宮頸癌、膽囊癌、膠質母細胞瘤和黑色素瘤。
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