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TW201831511A - 能夠結合cd137和腫瘤抗原的雙特異性結合分子及其用途 - Google Patents

能夠結合cd137和腫瘤抗原的雙特異性結合分子及其用途 Download PDF

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TW201831511A
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萊斯利 強生
保羅 摩爾
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Abstract

本發明涉及具有對於CD137的表位特異性的一個或多個表位結合位點和對於腫瘤抗原(“TA”)的表位特異性的一個或多個表位結合位點的結合分子(例如“CD137 x TA結合分子”)。本發明的CD137 x TA結合分子能夠同時結合CD137和TA 。本發明涉及包含任何這種CD137 x TA結合分子的藥物組合物。本發明另外涉及使用這種分子治療癌症和其他疾病和病症的方法。本發明也提供了新型的CD137結合分子和HER2/neu結合分子以及其衍生物和其用途。

Description

能夠結合CD137和腫瘤抗原的雙特異性結合分子及其用途
[相關申請的交叉引用]
本申請主張美國專利申請案號為62/463,353 (於2017年2月24日提申；申請中)和62/597,594 (於2017年12月12日提申；申請中)的優先權，這兩申請案通過引用以其整體併入本文。
[序列表的參考]
根據37 C.F.R. 1.821以及下面的條款，本申請案包括一個或多個序列表，其以電腦-可讀介質(檔案名：1301_0149PCT_ST25.txt，於2018年2月11日創建，並且具有309,094位元組的大小)公開，該檔通過引用以其整體併入本文。
本發明涉及具有對於CD137的表位特異性的一個或多個表位結合位點和對於腫瘤抗原(“TA ”)的表位特異性的一個或多個表位結合位點的結合分子(例如“CD137 x TA 結合分子 ”)。在一個實施方式中，這種CD137 x TA 結合分子將是雙特異性分子，尤其是雙特異性四價雙抗體，其包括兩條、三條、四條或多於四條的多肽鏈並且具有各自對於CD137的表位特異性的兩個表位結合位點和各自對於TA 的表位特異性的兩個表位結合位點。可替選地，這種CD137 x TA 結合分子將是雙特異性分子，尤其是雙特異性三價結合分子，其包括三條或更多條多肽鏈並且具有各自對於CD137的表位特異性的一個或兩個表位結合位點和各自對於TA的表位特異性的一個或兩個表位結合位點。本發明的CD137 x TA 結合分子能夠同時結合CD137和TA 。本發明涉及包括任何這種CD137 x TA 結合分子的藥物組合物。本發明另外涉及使用這種分子治療癌症和其他疾病和病症的方法。本發明還提供了CD137結合分子和HER2/neu結合分子以及其衍生物和其用途。
CD137(也稱為4-1BB和“TNF受體超家族成員9” (“TNFRSF9”))是介導依賴於CD28和獨立於CD28的T-細胞共刺激的腫瘤壞死因數受體超家族的共刺激受體成員(Vinay, D.S.和Kwon, B.S. (1998) “Role of 4-1BB in immune responses ,” Semin Immunol. 10:481-489; Bartkowiak, T.等人(2015) “4-1BB Agonists : Multi-Potent Potentiators Of Tumor Immunity ,” Frontiers Oncol. 5:117; pp. 1-16; So, T.,等人(2008) “Immune Regulation And Control Of Regulatory T Cells By OX40 And 4-1BB ,” Cytokine & Growth Factor Rev. 19:253-262; Croft, M. (2009) “The Role Of TNF Superfamily Members In T-Cell Function And Diseases ,” Nat. Rev. Immunol. 9:271-285; Yonezawa, A.等人(2015) “Boosting cancer immunotherapy with Anti-CD137 antibody therapy ,” Clin. Cancer Res. 21(14):3113-3120; Li, S.Y.等人(2013) “Immunotherapy Of Melanoma With The Immunecostimulatory Monoclonal Antibodies Targeting CD137 ,” Clin. Pharmacol. 5:47-53; Vinay, D.S.等人(2012) “Immunotherapy Of Cancer With 4-1BB ,” Mol. Cancer Ther. 11:1062-1070; Houot, R.等人(2012) “Boosting Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Against Tumor Cells With A CD137 Stimulatory Antibody ,” Oncoimmunology. 1:957-958; Kwon, B.S.等人(1989) “cDNA Sequences Of Two Inducible T-Cell Genes ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:1963-1967; Chen, L.等人(2013) “Molecular Mechanisms Of T Cell Co-Stimulation And Coinhibition ,” Nat. Rev. Immunol. 13:227-242; Yao S.等人“Advances In Targeting Cell Surface Signaling Molecules For Immune Modulation ,” Nat. Rev. Drug Discov. 12:130-146)。
CD137通過T細胞、天然殺傷(NK)細胞、樹突細胞(DC)、B細胞和其他免疫系統細胞誘導表達(Vinay, D.S.等人(2015) “Therapeutic Potential Of Anti-CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibodies , Expert Opinion On Therapeutic Targets ,” DOI:10.1517/14728222.2016.1091448; pp.1-14; Wang，C.等人(2009) “Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL : Complexities And Challenges ,” Immunol. Rev. 229:192-215; Sallin, M.A.等人(2014) “The Anti‑Lymphoma Activities Of Anti‑CD137 Monoclonal Antibodies Are Enhanced In FcγRIII−/− Mice ,” Cancer Immunol. Immunother. 63:947-958; Melero, I.等人(2008) “Multilayered Action Mechanisms Of CD137 (4-1BB)-Targeted Immunotherapies ,” Trends Pharmacol Sci. 29:383-390; Ramakrishna, V.等人(2015) “Characterization Of The Human T Cell Response To In Vitro CD27 Costimulation With Varlilumab ,” J. Immunother. Canc. 2:37; pp.1-13)。蛋白質包括具有短的N-末端細胞質部分、跨膜區域和胞外域的255-氨基酸蛋白質，所述胞外域具有3個富集半胱氨酸的基序(Schwarz, H.等人(1993) “A Receptor Induced By Lymphocyte Activation (ILA) : A New Member Of The Human Nerve-Growth-Factor/Tumor-Necrosis-Factor Receptor Family ,” Gene 134:295-298)。
主要地，但不是排他地，在抗原呈遞細胞(APC)上表達的CD137通過其配體CD137L(4-1BBL；TNFSF9)的連接引起各種T細胞回應，如細胞擴展、增加的細胞因數分泌和防止活化誘導的細胞死亡(Qian, Y.等人(2015) “CD137 Ligand-Mediated Reverse Signaling Inhibits Proliferation And Induces Apoptosis In Non-Small Cell Lung Cancer ,” Med. Oncol. 32:44; pp.1-10); Sallin, M.A.等人(2014) “The Anti‑Lymphoma Activities Of Anti‑CD137 Monoclonal Antibodies Are Enhanced In FcγRIII−/− Mice ,” Cancer Immunol. Immunother. 63:947-958; Lee, S.W.等人(2009) “4-1BB As A Therapeutic Target For Human Disease ,” Adv. Exp. Med. Biol. 647:120-129; Thum, E.等人(2009) “CD137 ， Implications In Immunity And Potential For Therapy ,” Front. Biosci. (Landmark Ed). 14:4173-4188; Wang, C.等人(2009) “Immune Regulation By 4-1BB And 4-1BBL : Complexities And Challenges ,” Immunol. Rev. 229(1):192-215; Long，A.H.等人(2015) “4-1BB Costimulation Ameliorates T Cell Exhaustion Induced By Tonic Signaling Of Chimeric Antigen Receptors ,” Nature Med. 21(6):581; pp. 1-13)。因此，這種連接用來活化免疫系統。但是，在CD137和CD137L之間的順式相互作用(cis-interaction)也有效地下調CD137L的表達(Kwon, B. (2015) “Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses? ,” Immune Network. 15(3)：121-124)。因此，CD137配體用來控制CD137-介導的免疫系統活化的程度和動力學(Kwon, B. (2015) “Is CD137 Ligand (CD137L) Signaling a Fine Tuner of Immune Responses? ,” Immune Network. 15(3): 121-124; Shuford WW等人(1997) “4-1BB Costimulatory Signals Preferentially Induce CD8+ T Cell Proliferation And Lead To The Amplification In Vivo Of Cytotoxic T Cell Responses ,” J. Exp. Med. 186:47-55)。
顯著地，人類NK細胞上表達的CD137在結合已經被結合至腫瘤細胞的抗腫瘤抗體(即，結合腫瘤抗原(“TA ”)的抗體)之後變得上調(Houot, R.等人(2012) “Boosting Antibody-Dependent Cellular CytotoxicityAgainst Tumor Cells With A CD137 Stimulatory Antibody ,” Oncoimmunology. 1:957-958; Kohrt, H.E.等人(2014) “Targeting CD137 Enhances The Efficacy Of Cetuximab ,” J. Clin. Invest. 124(4):2668-2682; Lin, W.等人(2008) “Fc-Dependent Expression Of CD137 On Human NK Cells : Insights Into “Agonistic” Effects Of Anti-CD137 Monoclonal Antibodies ,” Blood 112(3):699-707; Mittal, P.等人(2015) “Tumor-Unrelated CD4 T Cell Help Augments CD134 Plus CD137 Dual Costimulation Tumor Therapy ,” J. Immunol. Nov 11. pii: 1502032; pp.1-14; Sánchez-Paulete, A.R.等人(2015) “Cancer Immunotherapy With Immunomodulatory Anti-CD137 And Anti-PD-1 Monoclonal Antibodies Requires Batf3-Dependent Dendritic Cells ,” Cancer Discov. Oct 22. pii: CD-15-0510; pp. 1-28; Wei, H.等人(2014) “Dual Targeting Of CD137 Co-Stimulatory And PD-1 Co-Inhibitory Molecules For Ovarian Cancer Immunotherapy ,” OncoImmunology 3:e28248; pp. 1-3; Seo, S.K.等人(2004) “4-1BB-Mediated Immunotherapy Of Rheumatoid Arthritis ,” Nat. Med. 10:1088-1094)。
這種認識已經引起對於CD137免疫特異性的抗體可用於活化免疫系統並且從而提供對於癌症的治療的提議(Melero I.等人(1997) “Monoclonal Antibodies Against The 4-1BB T-Cell Activation Molecule Eradicate Established Tumors ,” Nat Med. 3:682-385; Sun, Y.等人(2002) “Costimulatory Molecule-Targeted Antibody Therapy Of A Spontaneous Autoimmune Disease ,” Nature Med. 8:1405-1413; Kammer, G.M.等人(2002) “Immunotherapy Tackles Lupus ,” Nat. Med. 8(12):1356-1358; Foell, J.等人(2003) “CD137 Costimulatory T Cell Receptor Engagement Reverses Acute Disease In Lupus-Prone NZBx NZW F1 Mice ,” J. Clin. Invest. 111(10):1505-1518; Mittler, R.S.等人(2004) “Anti-CD137 Antibodies In The Treatment Of Autoimmune Disease And Cancer ,” Immunol. Res. 29(1-3):197-208; Foell, J.L.等人(2004) “Engagement of The CD137 (4-1BB) Costimulatory Molecule Inhibits And Reverses The Autoimmune Process In Collagen-Induced Arthritis And Establishes Lasting Disease Resistance ,” Immunology 113(1):89-98; Sytwu, H.K.等人(2003) “Anti-4-1BB-Based Immunotherapy For Autoimmune Diabetes : Lessons From A Transgenic Non-Obese Diabetic (NOD) Model ,” J. Autoimmun. 21(3):247-254; Hernandez-Chacon JA等人(2011) “Costimulation Through The CD137/4-1BB Pathway Protects Human Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes From Activation Induced Cell Death And Enhances Antitumor Effector Function ,” J. Immunother. 34:236-250; Morales-Kastresana, A.等人(2014) “Combinations Of Immunostimulatory Antibodies With Synergistic Effects Against Spontaneous Cancer ,” OncoImmunology 3:2，e27812，pp.1-4; Sanmamed, M.F.等人(2015) “Agonists of Co-stimulation in Cancer Immunotherapy Directed Against CD137 , OX40 , GITR , CD27 , CD28 , and ICOS ,” Seminars Oncol. 42(4):640-655; Tongu, M.等人(2015) “Intermittent Chemotherapy Can Retain The Therapeutic Potential Of Anti-CD137 Antibody During The Late Tumor-Bearing State ,” Cancer Sci. 106(1):9-17; Takeda, K.等人(2007) “Combination Antibody-Based Cancer Immunotherapy ,” Cancer Sci. 98(9):1297-1302)。抗CD137抗體公開於美國專利號2014/0274909、2013/0280265、2013/0273078、2013/0071403、2012/0058047、2011/0104049、2011/0097313、2008/0166336、2008/0019905、2006/0188439、2006/0182744、2006/0121030和2003/0223989中。
但是，儘管所有這種先前的進步，仍然需要能夠更有力地指引身體的免疫系統攻擊癌細胞或病原體感染的細胞的改善的組合物，尤其是以更低的治療濃度。雖然適應性免疫系統可以是有效的對抗癌症和疾病的防禦系統，但是其常常被通過降低/缺失的CD137的共刺激活性介導的腫瘤微環境中的免疫壓抑/逃避機制(evasion mechanism)所阻礙。而且，通過腫瘤環境中的腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞表達的共抑制分子可主要地減弱對癌細胞的T細胞回應。
如以下詳細描述的，本發明通過提供CD137 x TA 結合分子解決了該需求。這種雙特異性分子能夠結合表達在腫瘤細胞表面上的腫瘤抗原，並且能夠將表達CD137的NK細胞共定位至這種腫瘤細胞。這種共定位上調NK細胞，以促進免疫系統的活化或持續活化(例如刺激對抗腫瘤細胞的細胞毒素T細胞回應)。這些特徵允許這種雙特異性分子在刺激免疫系統中並且特別是在治療癌症和病原體相關疾病和病症中具有效用。本發明涉及這些和其他目標。
本發明涉及具有對於CD137的表位特異性的一個或多個表位結合位點和對於腫瘤抗原(“TA ”)的表位特異性的一個或多個表位結合位點的結合分子(例如“CD137 x TA 結合分子 ”)。在一個實施方式中，這種CD137 x TA 結合分子將是雙特異性分子，尤其是雙特異性四價雙抗體，其包括兩條、三條或四條或多於四條的多肽鏈並且具有各自對於CD137的表位特異性的兩個表位結合位點和各自對於TA 的表位特異性的兩個表位結合位點。可替選地，這種CD137 x TA 結合分子將是雙特異性分子，尤其是雙特異性三價結合分子，其包括三條或更多條多肽鏈並且具有各自對於CD137的表位特異性的一個或兩個表位結合位點和各自對於TA 的表位特異性的一個或兩個表位結合位點。本發明的CD137 x TA 結合分子能夠同時結合CD137和TA 。本發明涉及包含任何這種CD137 x TA 結合分子的藥物組合物。本發明另外地涉及使用這種分子治療癌症和其他疾病和病症的方法。本發明還提供新型CD137結合分子和HER2/neu結合分子以及其衍生物和其用途。
本發明提供了CD137 x TA 結合分子，其是單價的，因為它們能夠僅結合CD137的表位元的一個拷貝和僅結合TA 的表位元的一個拷貝，但是是雙特異性的，因為單一這種雙抗體能夠同時結合CD137的表位和結合TA 的表位。但是，本發明特別涉及這種CD137 x TA 結合分子，其包括以異源二聚體方式彼此締合的多肽鏈，以形成各自對於CD137的表位特異性的兩個結合位點和各自對於TA 的表位特異性的兩個結合位點。本發明的這種優選的CD137 x TA結合分子被稱為是“雙特異性四價的 ”。本發明還特別涉及這樣的CD137 x TA結合分子，其包括以異源二聚體方式彼此締合的多肽鏈，以形成各自對於CD137的表位特異性的兩個結合位點和各自對於TA 的表位特異性的一個結合位點。本發明的這種優選的CD137 x TA結合分子被稱為是“雙特異性三價的 ”。
本發明提供了包括三條多肽鏈(“第一”、“第二”和“第三”多肽鏈)的CD137 x TA 結合分子，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合並且第一和第三多肽鏈彼此共價結合。本發明優選的CD137 x TA 結合分子包括四條多肽鏈(“第一”、“第二”、“第三”和“第四”多肽鏈)，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合，第三和第四多肽鏈彼此共價結合，並且第一和第三多肽鏈彼此共價結合。還優選的是本發明的包括五條多肽鏈(“第一”、“第二”、“第三”、“第四”和“第五”多肽鏈)的CD137 x TA 結合分子，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合，第三和第四多肽鏈彼此共價結合，第三和第五多肽鏈彼此共價結合，並且第一和第三多肽鏈彼此共價結合。
詳細地，本發明提供了CD137 x TA 結合分子，其中所述結合分子能夠特異性結合至CD137的表位和腫瘤抗原(TA )的表位，並且其中所述CD137 x TA 結合分子包括第一輕鏈可變結構域，所述第一輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和第一重鏈可變結構域，所述第一重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中： (A) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (B) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (C) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (D) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (E) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (F) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (G) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 )的重鏈CDR； (H) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90 )的重鏈CDR； (I) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96 )的重鏈CDR； (J) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )的重鏈CDR； (K) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137MAB-3 VH1B 的 (SEQ ID NO:84 )重鏈CDR； (L) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )的重鏈CDR； 或 (M) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中第一重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77 )；或 (B)hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:92 )； 和/或其中第一輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82 )；或 (B)hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:93 )。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中第一重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208 )； (B)hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )； (C)hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )； (D)hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 )； (E)hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )； (F)hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )； (G)hCD137 MAB-3 VH1F (SEQ ID NO:209 )； (H)hCD137 MAB-3 VH1G (SEQ ID NO:210 )；或 (I)hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92 )。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中第一輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )； (B)hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )； (C)hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87 )； (D)hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88 )； (E)hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 )； (F)hCD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )； (G)hCD137 MAB-3 VL5 (SEQ ID NO:212 )； (H)hCD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )； (I)hCD137 MAB-3 VL7 (SEQ ID NO:214 )； (J)hCD137 MAB-3 VL8 (SEQ ID NO:215 )； (K)hCD137 MAB-3 VL9 (SEQ ID NO:216 )； (L)hCD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )； (M)hCD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )； (N)hCD137 MAB-3 VL12 (SEQ ID NO:219 )； (O)hCD137 MAB-3 VL13 (SEQ ID NO:220 )； (P)hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94 )；或 (Q)hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95 )。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )選自由以下組成的腫瘤抗原組：19.9；癌胚蛋白5T4；抗原4.2；A33；AFP；ALCAM；BAGE；β-聯蛋白；CA125；羧肽酶M；B1；CD5；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD30；CD33；CD36；CD46；CD52；CD79a/CD79b；CD123；CD317；CEA；CEACAM5；CEACAM6；CO-43；CO-514；CTLA-1；CTLA-4；細胞角蛋白8；E1系列；EGF-R；肝配蛋白受體；Erb；F3；FC10.2；GAGE GD2；GD3；GD49；GM2；GM3；GICA 19-9；gp37；gp75；gp100；HER-2/neu；人B-淋巴瘤抗原-CD20；人乳脂小球抗原；人乳頭狀瘤病毒-E6/人乳頭狀瘤病毒-E7；HMW-MAA；I抗原；ITGB6；IL13Rα2；JAM-3；KID3；KID31；KS 1/4泛癌抗原；KS 1/4；KSA；L6；L20；LEA；LUCA-2；M1:22:25:8；M18；M39；MAGE；MART；Myl；MUC-1；MUM-1；N-乙醯葡糖氨基轉移酶；擬糖蛋白；NS-10；OFA-1；OFA-2；制癌蛋白M；p15；PSA；PSMA；PEMA；PIPA；前列腺酸性磷酸酶；R24；ROR1；SSEA-1；SSEA-3；SSEA-4；sTn；T細胞受體衍生的肽；TAG-72；TL5；TNF-α受體；TNF-ß受體；TNF-γ受體；TRA-1-85；鐵轉蛋白受體；TSTA；和VEGF-R。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )選自表 1 的腫瘤抗原，並且特別地，其中腫瘤抗原(TA )是：HER2/neu、EphA2或5T4。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )是HER2/neu，並且其中CD137 x TA 結合分子包括第二輕鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和第二重鏈可變結構域，所述第二重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中 (A) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63 )的輕鏈CDR；和 (B) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62) 的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中： (A) (1) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )的輕鏈CDR； (2) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )的輕鏈CDR；或 (3) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )的輕鏈CDR； 和 (B) (1) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )的重鏈CDR； (2) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )的重鏈CDR；或 (3) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中第二重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )； (B)hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中第二輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )； (B)hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA)是5T4並且其中CD137 x TA結合分子包括第二輕鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDRL1、CDRL2和CDRL3；和第二重鏈可變結構域，所述第二重鏈可變結構域包括CDRH1、CDRH2和CDRH3；並且其中： (I) (A) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-1 VL (SEQ ID NO:135 )的輕鏈CDR；和 (B) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-1 VH (SEQ ID NO:134 )的重鏈CDR；或 (II) (A) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-2 VL (SEQ ID NO:137 )的輕鏈CDR；和 (B) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-2 VH (SEQ ID NO:136 )的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中第二重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列：MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:135 )。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中第二輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列：MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:136 )。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中所述分子是雙特異性四價的具有Fc的雙抗體，其包括第一、第二、第三和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )是HER2/neu，並且其中： (I) (A) 第一和第三多肽鏈具有SEQ ID NO:100 的氨基酸序列；和 (B) 第二和第四多肽鏈具有SEQ ID NO:101 的氨基酸序列； 或 (II) (A) 第一和第三多肽鏈具有SEQ ID NO:102 的氨基酸序列；和 (B) 第二和第四多肽鏈具有SEQ ID NO:103 的氨基酸序列。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中所述分子是雙特異性的並且是四價的，並且包括第一、第二、第三、第四和第五多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )是HER2/neu，並且其中： (I) (A) 第一多肽鏈具有SEQ ID NO:104 的氨基酸序列； (B) 第二和第五多肽鏈具有SEQ ID NO:105 的氨基酸序列； (C) 第三多肽鏈具有SEQ ID NO:106 的氨基酸序列；和 (D) 第四多肽鏈具有SEQ ID NO:107 的氨基酸序列； 或 (II) (A) 第一多肽鏈具有SEQ ID NO:104 的氨基酸序列； (B) 第二和第五多肽鏈具有SEQ ID NO:105 的氨基酸序列； (C) 第三多肽鏈具有SEQ ID NO:114 、SEQ ID NO:115 、SEQ ID NO:116 、SEQ ID NO:117 或SEQ ID NO:118 的氨基酸序列；和 (D) 第四多肽鏈具有SEQ ID NO:119 、SEQ ID NO:120 、SEQ ID NO:121 、SEQ ID NO:122 或SEQ ID NO:123 的氨基酸序列。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中所述分子是雙特異性的並且是三價的，並且包括第一、第二、第三和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA)是HER2/neu，並且其中： (A) 所述第一多肽鏈具有SEQ ID NO:192 、SEQ ID NO:193 、SEQ ID NO:194 、SEQ ID NO:195 或SEQ ID NO:196 的氨基酸序列； (B) 所述第二多肽鏈具有SEQ ID NO:197 、SEQ ID NO:198 、SEQ ID NO:199 、SEQ ID NO:200 或SEQ ID NO:201 的氨基酸序列； (C) 所述第三多肽鏈具有SEQ ID NO:104 的氨基酸序列；和 (D) 所述第四多肽鏈具有SEQ ID NO:105 的氨基酸序列。
本發明進一步涉及這種CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA )是5T4，並且其中： (A) 所述第一多肽鏈具有SEQ ID NO:192 、SEQ ID NO:193 、SEQ ID NO:194 、SEQ ID NO:195 、SEQ ID NO:196 或SEQ ID NO:229 的氨基酸序列； (B) 所述第二多肽鏈具有SEQ ID NO:197 、SEQ ID NO:198 、SEQ ID NO:199 、SEQ ID NO:200 、SEQ ID NO:201 或SEQ ID NO:230 的氨基酸序列； (C) 所述第三多肽鏈具有SEQ ID NO:231 的氨基酸序列；和 (D) 所述第四多肽鏈具有SEQ ID NO:232 的氨基酸序列。
本發明進一步涉及藥物組合物，其包括任意上述CD137 x TA 結合分子和生理學上可接受的載體。
本發明進一步涉及任一種上述CD137 x TA 結合分子或這種藥物組合物在治療與腫瘤抗原(TA)的表達相關或特徵在於腫瘤抗原(TA )的表達的疾病或病症中的用途，並且特別地，其中與腫瘤抗原(TA)的表達相關或特徵在於腫瘤抗原(TA )的表達的疾病或病症是癌症。
本發明進一步涉及CD137結合分子，其包括輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；其中： (A) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (B) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (C) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是的CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (D) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (E) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (F) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (G) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 )的重鏈CDR； (H) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91 )的輕鏈CDR；和 (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90 )的重鏈CDR； (I) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97 )的輕鏈CDR；和 (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96 )的重鏈CDR； (J) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )的重鏈CDR； (K) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO: 75)的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137MAB-3 VH1B (SEQ ID NO: 84)的重鏈CDR； (L) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO: 75)的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO: 85)的重鏈CDR； 或 (M) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO: 75)的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO: 86)的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137結合分子的實施方式，其中重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77 )；或 (B)hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:92 )。
本發明進一步涉及這種CD137結合分子的實施方式，其中輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82 )；或 (B)hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:93 )。
本發明進一步涉及這種CD137結合分子的實施方式，其中重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 )； (B)hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )； (C)hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )； (D)hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )； (E)hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )； (F)hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208 )； (G)hCD137 MAB-3 VH1F (SEQ ID NO:209 )； (H)hCD137 MAB-3 VH1G (SEQ ID NO:210 )；或 (I)hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92 )。
本發明進一步涉及這種CD137結合分子的實施方式，其中輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )； (B)hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )； (C)hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87 )； (D)hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88 )； (E)hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 )； (F)hCD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )； (G)hCD137 MAB-3 VL5 (SEQ ID NO:212 )； (H)hCD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )； (I)hCD137 MAB-3 VL7 (SEQ ID NO:214 )； (J)hCD137 MAB-3 VL8 (SEQ ID NO:215 )； (K)hCD137 MAB-3 VL9 (SEQ ID NO:216 )； (L)hCD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )； (M)hCD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )； (N)hCD137 MAB-3 VL12 (SEQ ID NO:219 )； (O)hCD137 MAB-3 VL13 (SEQ ID NO:220 )； (P)hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94 )；或 (Q)hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95 )。
本發明進一步涉及這種CD137結合分子的實施方式，其中所述分子是抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步涉及藥物組合物，其包括任意上述CD137結合分子和生理學上可接受的載體。
本發明進一步涉及任意上述CD137結合分子或這種藥物組合物在治療與壓制的免疫系統有關或特徵在於腫瘤抗原(TA )的表達的疾病或病症中的用途。
本發明進一步涉及這種用途，其中與壓制的免疫系統有關或特徵在於腫瘤抗原(TA )的表達病症是癌症。
本發明進一步涉及HER2/neu結合分子，其包括輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；其中： (A) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63 )的輕鏈CDR；和 (B) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62 )的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種HER2/neu結合分子的實施方式，其中： (A) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )的輕鏈CDR； (2) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )的輕鏈CDR；或 (3) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )的輕鏈CDR； 和 (B) (1) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )的重鏈CDR； (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )的重鏈CDR；或 (3) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種HER2/neu結合分子的實施方式，其中重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )； (B)hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )。
本發明進一步涉及這種HER2/neu結合分子的實施方式，其中輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )； (B)hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )。
本發明進一步涉及這種HER2/neu結合分子的實施方式，其中所述分子是抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步涉及藥物組合物，其包括任意上述HER2/neu結合分子和生理學上可接受的載體。
本發明進一步涉及任意上述HER2/neu結合分子或這種藥物組合物在治療與HER2/neu的表達有關或特徵在於HER2/neu的表達的疾病或病症中的用途，並且特別地，其中與HER2/neu的表達有關或特徵在於HER2/neu的表達的病症是癌症。
本發明進一步涉及增強腫瘤靶向劑的活性的方法，其包括與任意上述CD137 x TA 結合分子或包括其的藥物組合物結合施用這種腫瘤靶向劑。本發明進一步涉及還包括施用PD-1/PD-L1檢查點抑制劑的這種方法，並且特別地其中這種檢查點抑制劑是抗-PD-1抗體或抗-PD-L1抗體。本發明特別涉及其中腫瘤靶向劑是抗體、抗體的表位結合片段或介導靶細胞的T-細胞重導向殺傷的試劑的這種方法。
本發明進一步涉及治療與抑制的免疫系統有關或特徵在於腫瘤抗原(TA )的表達的疾病或病症的方法，其包括向需要其的受試者施用任意上述CD137 x TA 結合分子或包括其的藥物組合物。本發明特別涉及其中與抑制的免疫系統有關或特徵在於腫瘤抗原(TA )的表達的病症是癌症的這種方法。本發明還涉及進一步包括施用腫瘤靶向劑的這種方法，並且特別是其中腫瘤靶向劑是抗體、抗體的表位結合片段或介導靶細胞的T-細胞重導向殺傷的試劑的這種方法。本發明進一步涉及進一步包括施用PD-1/PD-L1檢查點抑制劑的這種方法，並且特別地，其中這種檢查點抑制劑是抗-PD-1抗體或抗-PD-L1抗體的這種方法。
本發明進一步涉及以上用途和方法，其中所述癌症選自由以下構成的組：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索癌、嫌色性腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生性小圓細胞瘤、室管膜瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨成纖維發生不全、骨纖維性發育異常、膽囊或膽管癌、胃癌(gastric cancer)、妊娠滋養細胞病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、肝細胞癌、膠質母細胞瘤、胰島細胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂質肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤病、多發性骨髓瘤、脊髓發育不良綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、乳頭狀甲狀腺癌、副甲狀腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤(posterious uveal melanoma)、罕見血液疾病、腎細胞癌、轉移性腎癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、扁平細胞癌、胃癌症(stomach cancer)、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、轉移性甲狀腺癌和子宮癌。
本發明特別涉及上述用途和方法，其中所述癌症選自由以下構成的組：膀胱癌、乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、膠質母細胞瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸扁平細胞癌(SCCHN)。
本發明涉及具有對於CD137的表位特異性的一個或多個表位結合位點和對於腫瘤抗原(“TA ”)的表位特異性的一個或多個表位結合位點的結合分子(例如“CD137 x TA 結合分子 ”)。在一個實施方式中，這種CD137 x TA 結合分子將是雙特異性分子，尤其是雙特異性四價雙抗體，其包括兩條、三條、四條或多於四條的多肽鏈並且具有各自對於CD137的表位特異性的兩個表位結合位點和各自對於TA 的表位特異性的兩個表位結合位點。可替選地，這種CD137 x TA 結合分子將是雙特異性分子，尤其是雙特異性三價結合分子，其包括三條或更多條多肽鏈並且具有各自對於CD137的表位特異性的一個或兩個表位結合位點和各自對於TA 的表位特異性的一個或兩個表位結合位點。本發明的CD137 x TA 結合分子能夠同時結合CD137和TA 。本發明涉及包含任意這種CD137 x TA 結合分子的藥物組合物。本發明另外涉及使用這種分子治療癌症和其他疾病和病症的方法。本發明還提供了新的CD137結合分子和HER2/neu結合分子以及其衍生物和其用途。 I.抗體和其他結合分子
抗體 是通過位於免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個“表位結合位點 ”能夠特異性結合分子的靶區(“表位”)的免疫球蛋白分子，如碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等(“抗原”)。如本文使用的，術語“抗體(antibody )”和“抗體(antibodies )”指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝化抗體(camelized antibody)、單鏈Fvs (scFv)、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)片段、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)、胞內抗體和任意上述的表位結合片段。特別地，術語“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫學活性片段，即，包含表位結合位點的分子。免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 和IgA2 )或亞類。由於在這種分子上存在特定的結構域或部分或構造(“表位 ”)，故抗體能夠“免疫特異性結合 ”至多肽或蛋白或非蛋白分子。如本文使用的，“抗體 的表位結合片段 ”意欲表示抗體的能夠免疫特異性結合表位的一部分。如本文使用的，這種術語涵蓋片段(如Fab、Fab'、F(ab')2 Fv)和單鏈(scFv)以及雙抗體的表位元結合結構域。如本文使用的，如果抗體或其表位結合片段相對於可替選的表位與該表位更頻繁、更迅速、以更長的持續時間和/或以更大的親和力或抗體親抗原性反應或締合，則認為抗體或其表位結合片段“免疫特異性 ”結合另一分子的區域(即，表位)。通過閱讀該定義同樣理解，例如，免疫特異性結合第一靶標的抗體或其表位結合片段可以特異性地或優先地結合至第二靶標或可以不特異性地或不優先地結合第二靶標。包含表位的分子可具有免疫原性活性，以使得其在動物中引起抗體產生響應；這種分子被命名為“抗原 ”。天然抗體能夠結合僅一個表位種類(即，它們是“單特異性的”)，雖然它們可結合那個種類的多個拷貝(即，呈現出“二價 ”或“多價 ”)。
術語“單克隆抗體 ”指同源性抗體群體，其中單克隆抗體包括參與抗原的選擇性結合的氨基酸(天然產生的或非天然產生的)。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個表位(或抗原位點)。術語“單克隆抗體”不僅僅涵蓋完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，而且也涵蓋其片段(比如Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包括抗體部分的融合蛋白、人源化的單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有結合抗原的必要的特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型。就抗體的來源或製備其的方式(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等)而言，該術語不旨在是限制性的。術語包括完整的免疫球蛋白以及上面根據“抗體”的定義描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可採用的一種方法是Kohler, G.等人(1975) “Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497的方法或其改良。典型地，單克隆抗體在小鼠、大鼠或兔子中開發。通過用免疫原性量的細胞、細胞提取物或包含期望的表位的蛋白質製品免疫動物而產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。用於免疫的細胞可被培養一段時間(例如，至少24小時)，然後將它們用作免疫原。細胞本身或聯合非變性佐劑(比如Ribi)可用作免疫原(參見，例如Jennings, V.M. (1995) “Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production ,” ILAR J. 37(3):119-125)。一般而言，在用作免疫原時，細胞應保持完整並且優選地是活細胞。相比於破裂的細胞，完整的細胞可允許抗原被免疫的動物更好地檢測。變性佐劑或烈性佐劑，例如，弗氏佐劑的使用，可使細胞破裂，因此其應用受阻。免疫原可以週期性間隔被多次施用，諸如兩週一次或一週一次，或者可以以維持在動物(例如，在組織重組體中)中的生存力這樣的方式被施用。可替選地，對於期望的致病表位是免疫特異性的現有單克隆抗體和任意其他等效的抗體可被測序，並通過本領域中已知的任意手段重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆到載體中用於表達或增殖。編碼感興趣的抗體的序列可在宿主細胞內保持在載體中，然後可擴增和冷凍宿主細胞，用於將來的使用。這樣的抗體的多核苷酸序列可用於基因操作，以產生本發明的單特異性或多特異性(例如，雙特異性、三特異性和四特異性)分子以及親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體和/或犬源化(caninized)抗體，以改善抗體的親和力或其他特徵。使抗體人源化的一般原則涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列，同時使抗體的非人剩餘部分與人抗體序列交換。存在四個人源化單克隆抗體的一般步驟。這些步驟為：(1)確定起始抗體的輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和/或預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化過程中使用哪一個或多個抗體框架區；(3)應用實際的人源化或犬源化方法/技術；和(4)人源化或犬源化抗體的轉染和表達(參見，例如，美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692；和6,331,415)。
最近幾十年已經看出對抗體的治療潛力的關注的復蘇，並且抗體已經變成生物技術衍生的藥物的先導類別之一(Chan, C.E.等人(2009) “The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases ,” Singapore Med. J. 50(7):663-666)。超過200種的基於抗體的藥物已經批准使用或在開發中。A. 抗體的一般結構特徵
天然產生的免疫球蛋白(例如IgG)的基本結構單元是四聚體，其包括與兩條較長的“重鏈 ”複合的兩條較短的“輕鏈 ”，通常被表達為約150,000 Da的糖蛋白。每條鏈包括含“可變結構域 ”的氨基-末端(“N- 末端 ”)部分和含至少一個“恆定結構域 ”的羧基-末端(“C- 末端 ”)部分。IgG輕鏈包括單“輕鏈可變結構域 ”(“VL ”)和單“輕鏈恆定結構域 ”(“CL ”)。因此，IgG分子的輕鏈結構是n-VL-CL-c (其中n和c分別代表多肽的N-末端和C-末端)。IgG重鏈包括單“重鏈可變結構域 ” (“VH ”)、三個“重鏈恆定結構域 ” (“CH1 ”、“CH2 ”和“CH3 ”)和位於CH1 和CH2 結構域之間的“鉸鏈”區(“H ”)。因此，IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c (其中n和c分別代表多肽的N-末端和C-末端)。完整的、未修飾的抗體(例如IgG抗體)結合抗原表位元的能力取決於可變結構域的存在和序列。1. 恆定結構域 （ a ）輕鏈恆定結構域
優選的CL結構域是人IgG CLκ結構域。示例性的人CLκ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:1 )： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
可替選地，示例性的CL結構域是人IgG CLλ結構域。示例性的人CLλ結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:2 )： QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS（ b ）重鏈 CH1 結構域
示例性的CH1結構域是人IgG1 CH1結構域。示例性的人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:3 )： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
示例性的CH1結構域是人IgG2 CH1結構域。示例性的人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:4 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
示例性的CH1結構域是人IgG3 CH1結構域。示例性的人IgG3 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:5 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
示例性的CH1結構域是人IgG4 CH1結構域。示例性的人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:6 )： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV（ c ）重鏈鉸鏈區
示例性的鉸鏈區是人IgG1鉸鏈區。示例性的人IgG1鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:7 )： EPKSCDKTHT CPPCP
另一示例性的鉸鏈區是人IgG2鉸鏈區。示例性的人IgG2鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8 )： ERKCCVECPP CP
另一示例性的鉸鏈區是人IgG3鉸鏈區。示例性的人IgG3鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9 )： ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP
另一示例性的鉸鏈區是人IgG4鉸鏈區。示例性的人IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10 )： ESKYGPPCPS CP
如本文所述的，IgG4鉸鏈區可包括穩定化突變，如S228P替換(如通過Kabat中闡述的EU索引所編號的)。示例性的穩定化的IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11 )： ESKYGPPCPP CP（ d ）重鏈 CH2 結構域和 CH3 結構域
兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用以形成IgG抗體的由細胞Fc 受體 識別的“Fc 區 ”， 細胞Fc 受體 包括但不限於Fcγ受體(Fc γ Rs )。如本文使用的，術語“Fc 區 ”用來限定IgG重鏈的C-末端區。一部分Fc區(包括含全部Fc區的部分)在本文中稱為“Fc 結構域 ”。如果Fc區的氨基酸序列相對於其他IgG同種型與該同種型最同源，那麼認為Fc區具有特定的IgG同種型、類或亞類。除了抗體已知的在診斷中的用途，已經顯示抗體可用作治療劑。
示例性的人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:12 )： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如Kabat中闡釋的EU索引所編號的，其中X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13 )： 231 240 250 260 270 280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 如Kabat中闡釋的EU索引所編號的，其中X是賴氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:14 )： 231 240 250 260 270 280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340 350 360 370 380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440 447 ALHNRFTQKS LSLSPG X 如Kabat中闡釋的EU索引所編號的，其中X 是賴氨酸(K)或不存在。
示例性的人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:15 )： 231 240 250 260 270 280 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290 300 310 320 330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340 350 360 370 380 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390 400 410 420 430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440 447 ALHNHYTQKS LSLSLG X 如Kabat中闡釋的EU索引所編號的，其中X是賴氨酸(K)或不存在。
貫穿本申請說明書，IgG重鏈的恆定區中的殘基的編號是Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，NH1，MD (1991) (“Kabat ”)中EU索引的編號，其通過引用清楚地併入本文。術語“如 Kabat 中的 EU 索引 ”指人IgG1 EU抗體的恆定結構域的編號。
在抗體恆定區內在許多不同位置(例如Fc位置，包括但不限於通過Kabat中闡釋的EU索引所編號的位置270、272、312、315、356和358)已經觀察到多態現象，並且因此在所呈現的序列和現有技術中的序列之間可存在輕微差異。已經很好地表徵了人免疫球蛋白的多態形式。目前，18個Gm同種異型是已知的：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x 、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc等人，“The Human IgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure ， Function And Regulation. ” Pergamon，Oxford，pp. 43-78 (1990)；Lefranc, G.等人，1979，Hum. Genet.：50，199-211)。具體考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型、異同種異型(isoallotype)或單倍型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異同種異型或單倍型。而且，在一些表達系統中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(以上粗體的)可被翻譯後去除。因此，在本發明CD137 x TA 結合分子中，CH3結構域的C-末端殘基是任選的氨基酸殘基。具體地，通過本發明涵蓋的是沒有CH3結構域的C-末端殘基的CD137 x TA 結合分子。同樣具體地，本發明涵蓋的是包括CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這種構建體。2. 可變結構域
IgG分子的可變結構域由三個“互補決定區 ” (“CDR ”) 組成，其包含抗體的將與表位接觸的氨基酸殘基；以及稱為“框架區 ”(“FR ”)的間插非-CDR區段，其大體上保持CDR環的結構並且確定CDR環的定位以允許這種接觸(儘管某些框架殘基也可接觸表位)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c 。CDR的氨基酸序列確定抗體是否將能夠結合具體的表位。抗體輕鏈與抗體重鏈的相互作用，以及特別地，它們的VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位結合位點。
來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸通過鏈中的氨基酸位置命名。Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，NH1，MD (1991))描述了抗體的許多氨基酸序列，對於每個亞組鑒定了氨基酸共有序列，並且對每個氨基酸指定了殘基數目，並且如通過Kabat限定的，CDR和FRs被鑒定(將理解，如通過Chothia, C. & Lesk, A. M. ((1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins ,” J. Mol. Biol. 196:901-917所限定的)限定的CDRH 1較早地開始五個殘基)。Kabat的編號方案可通過參照保守氨基酸比對考慮中的抗體與Kabat中的共有序列之一擴展至不包括在其手冊中的抗體。用於指定殘基數目的該方法在本領域中已經成為標準，並且易於鑒定在不同抗體中在等同位置處的氨基酸，包括嵌合或人源化變體。例如，在人抗體輕鏈的位置50處的氨基酸佔據與小鼠抗體輕鏈的位置50處的氨基酸的等同位置。
本文中作為(或可以用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽分別命名為：CDRL 1 結構域 、CDRL 2 結構域 和CDRL 3 結構域 。類似地，本文中作為(或可以用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽分別命名為：CDRH 1 結構域 、CDRH 2 結構域 和CDRH 3 結構域 。因此，術語CDRL 1結構域、CDRL 2結構域、CDRL 3結構域、CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域涉及這樣的多肽，當其併入蛋白時引起蛋白能夠結合至特定表位，而無論這種蛋白是具有輕鏈和重鏈的抗體還是雙抗體或單鏈結合分子(例如scFv、BiTe等)，或是另一類型蛋白。因此，如本文使用的，術語“表位結合片段 ”表示分子的能夠免疫特異性結合至表位的片段。表位結合片段可包含抗體的任意1、2、3、4或5個CDR結構域，或可包含抗體的全部6個CDR結構域，並且雖然能夠免疫特異性結合這種表位，但是可具有不同於這種抗體的對這種表位的免疫特異性、親和力或選擇性。但是，優選地，表位結合片段將包含這種抗體的全部6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單多肽鏈(例如scFv)，或可以包括兩條或更多條多肽鏈，每條多肽鏈具有氨基末端和羧基末端(例如雙抗體、Fab片段、Fab2 片段等)。除非具體指出，否則本文所述的蛋白分子的結構域的順序是以“N- 末端至 C- 末端 ”方向。
表位元結合位元點可包括融合至恆定結構域上的完整可變結構域或僅僅這種可變結構域的移植至合適框架區的互補決定區(CDR)。表位結合位點可以是野生型或通過一個或多個氨基酸替換修飾。這消除了恆定區作為人個體中的免疫原，但是對於外源可變結構域的免疫回應的可能性保持(LoBuglio, A.F.等人(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man ： Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224)。另一方法不僅僅聚焦於提供人源恆定區，而且修飾可變結構域以及以便盡可能與人形式接近地重塑它們。已知，重鏈和輕鏈二者的可變結構域皆包含三個互補決定區(CDR)，其回應於考慮中的抗原變化並且確定結合能力，所述互補決定區側面為四個框架區(FRs)，其在給定的物種中相對保守並且其公認地為CDR提供支架。當非人抗體相對於具體的抗原製備時，可變結構域可通過將衍生自非人抗體的CDR移植在待被修飾的人抗體中存在的FRs上被“重塑”或“人源化”。將該方法應用於各種抗體已經由Sato, K.等人(1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann, L.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen，M.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；Kettleborough, C. A.等人(1991) “Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation ,” Protein Engineering 4:773-3783；Maeda, H.等人(1991) “Construction Of Reshaped Human Antibodies With HIV-Neutralizing Activity ,” Human Antibodies Hybridoma 2:124-134；Gorman, S. D.等人(1991) “Reshaping A Therapeutic CD4 Antibody ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:4181-4185；Tempest, P.R.等人(1991) “Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit Human Respiratory Syncytial Virus Infection in vivo ,” Bio/Technology 9:266-271；Co, M. S.等人(1991) “Humanized Antibodies For Antiviral Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873；Carter, P.等人(1992) “Humanization Of An Anti-p185her2 Antibody For Human Cancer Therapy ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289；和Co, M.S.等人(1992) “Chimeric And Humanized Antibodies With Specificity For The CD33 Antigen ,” J. Immunol. 148:1149-1154報導。在一些實施方式中，人源化抗體保留所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗體，其包含來自小鼠抗體的所有六個CDR)。在其他實施方式中，人源化抗體具有一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)，其相對於原始抗體在序列上不同。B. 抗體的人源化
本發明特別涵蓋結合分子(包括抗體和雙抗體)，其包括人源化抗體的VL結構域和/或VH結構域。術語“人源化 ”抗體指通常使用重組技術製備的嵌合分子，其具有來自非人物種的免疫球蛋白的表位結合位點和該分子的基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的剩餘免疫球蛋白結構。這種抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於基因操縱以產生這種衍生物並且改善這種抗體的親和力或其他特徵。使抗體人源化的一般原則涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列，同時以人抗體序列交換非人剩餘部分。存在使單克隆抗體人源化的四個步驟。這些步驟是：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列；(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即，決定在人源化或犬源化過程中使用哪個抗體框架區；(3)實際的人源化或犬源化方法/技術；和(4)人源化抗體的轉染和表達。參見，例如，美國專利號4,816,567；5,807,715；5,866,692；和6,331,415。
已經描述了包含源自非人免疫球蛋白的表位結合位點的許多人源化抗體分子，包括具有齧齒動物可變結構域或修飾的齧齒動物可變結構域和它們與人恆定結構域融合的相關的互補決定區(CDR)的嵌合抗體(參見，例如Winter等人(1991) “Man-made Antibodies ,” Nature 349:293-299; Lobuglio等人(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man ： Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989)；Shaw等人(1987) “Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-Associated Antigen ,” J. Immunol. 138:4534-4538；和Brown等人(1987) “Tumor-Specific Genetically Engineered Murine/Human Chimeric Monoclonal Antibody ,” Cancer Res. 47:3577-3583)。其他參考文獻描述了移植至人支撐框架區(FR)的齧齒動物CDR，其然後與適當的人抗體恆定結構域融合(參見，例如Riechmann, L.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327；Verhoeyen, M.等人(1988) “Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity ,” Science 239:1534-1536；和Jones等人(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另一參考文獻描述了由重組修飾的齧齒動物框架區支撐的齧齒動物CDR (參見，例如，歐洲專利公開號519,596)。這些“人源化的”分子被設計為使得對齧齒動物抗人抗體分子的不利免疫應答最小化，所述不利免疫應答限制了這些部分在人接受者中治療應用的持續時間和效力。也可使用人源化抗體的其他方法，其公開在以下文獻中：Daugherty等人(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning ， CDR-Grafting ， And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297、5,997,867和5,866,692。
儘管這種成功，優化用於治療用途的穩定的、功能的異源二聚體的、非單特異性雙抗體的產生可通過多肽鏈中採用的結構域的認真考慮和替換被進一步改進。因此，本發明涉及提供特異性多肽，其被特別設計以通過共價結合形成穩定和治療有用的異源二聚體雙抗體和能夠同時結合CD137和TA 的異源二聚體Fc雙抗體。C. 雙特異性抗體 、 多特異性雙抗體 和 DART® 雙抗體
如以上指出的，天然抗體能夠結合至僅一個表位種類，雖然它們可結合該種類的多個拷貝。現有技術已經認可產生雙特異性抗體的需求，並且已經開發了廣泛種類的重組雙特異性抗體形式以產生這種雙特異性抗體(參見，例如PCT公開號WO 2008/003116、WO 2009/132876、WO 2008/003103、WO 2007/146968、WO 2009/018386、WO 2012/009544、WO 2013/070565)。大多數這樣的方法使用接頭肽以將另外的結合結構域(例如scFv、VL、VH等)融合至抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或融合在抗體核心(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)內，或將多個抗體結合部分彼此融合(例如，兩個Fab片段或scFv)。可替選的形式使用接頭肽以將結合蛋白(例如scFv、VL、VH等)融合至二聚結構域(如CH2-CH3結構域)或可替選的多肽(WO 2005/070966、WO 2006/107786A、WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。典型地，這種方法涉及折中(compromises)和權衡(trade-offs)。例如，PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了接頭的使用可引起治療設置中的問題，並且教導了這種三特異性抗體，其中CL和CH1結構域從其各自的天然位置轉換並且已經使得VL和VH結構域多樣化(WO 2008/027236；WO 2010/108127)，以使得它們結合多於一個抗原。因此，這些檔中公開的分子權衡(trade)對於結合另外的抗原種類的能力的結合特異性。PCT公開號WO 2013/163427和WO 2013/119903公開了修飾CH2結構域以包含包括結合結構域的融合蛋白加合物。檔指出CH2結構域可能在介導效應子功能中僅起到微小作用。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了重組抗體，其Fc區已經以另外的VL和VH結構域替換，以形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003012069公開了重組雙抗體，其單獨的鏈包含scFv結構域。PCT公開號WO 2013/006544公開了多價Fab分子，其被合成為單多肽鏈並且然後經歷蛋白水解以產生異源二聚體結構。因此，這些檔中公開的分子對於結合另外的抗原種類的能力權衡介導效應子功能的全部或一些能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了將另外的結合結構域或官能團添加至抗體或抗體部分(例如將雙抗體添加至抗體的輕鏈，或將另外的VL和VH結構域添加至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或將多個Fab結構域彼此連結)。因此，這些檔中公開的分子對於結合另外的抗原種類權衡天然的抗體結構。
現有技術已經另外地指出在能夠結合兩個或更多個不同表位種類方面(即，除了雙價或多價外，還表現出雙特異性或多特異性)產生不同於天然抗體的雙抗體 的能力 (參見，例如Holliger等人(1993) “’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448；US 2004/0058400 (Hollinger等人)；US 2004/0220388 (Mertens等人)；Alt等人(1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94；Lu, D.等人(2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672；WO 02/02781 (Mertens等人)；Olafsen, T.等人(2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27；Wu, A.等人(2001) “Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange ,” Protein Engineering 14(2):1025-1033；Asano等人(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683，J. Biochem. 76(8):992；Takemura, S.等人(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Baeuerle, P.A.等人(2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
提供非單特異性“雙抗體 ”相對於抗體帶來了顯著的優勢：共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。因此，雙特異性雙抗體具有廣泛範圍的應用，包括治療和免疫診斷。雙特異性允許在各種應用中在雙抗體的設計和改造上具有很大的靈活性，提供對多聚體抗原的增強的親和力、不同抗原的交聯、並且依賴於兩個靶抗原的存在定向靶向特定的細胞類型。由於它們的雙價、低解離率和從迴圈中快速清除(對於小尺寸的雙抗體，處於約50 kDa或低於約50 kDa)，本領域中已知的雙抗體分子還在腫瘤造影領域中顯示出特定用途(Fitzgerald等人(1997)“Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris,” Protein Eng. 10:1221)。特別重要的是，不同細胞的共連接，例如細胞毒性T細胞交聯至腫瘤細胞(Staerz等人(1985)“Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells,” Nature 314:628-631；和Holliger等人(1996)“Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305)，從而將T細胞共定位至腫瘤細胞的位點。
作為將這種雙抗體靶向結合至T細胞的替選方案，雙抗體表位元結合結構域可定向於B細胞的表面決定子，如CD19、CD20、CD22、CD30、CD37、CD40和CD74 (Moore, P.A.等人(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；Cheson, B.D.等人(2008) “Monoclonal Antibody Therapy For B-Cell Non-Hodgkin’s Lymphoma ,” N. Engl. J. Med. 359(6):613-626；Castillo, J.等人(2008) “Newer Monoclonal Antibodies For Hematological Malignancies ,” Exp. Hematol. 36(7):755-768)。在許多研究中，結合效應細胞決定子的雙抗體，例如Fcγ受體(FcγR)，也發現活化效應細胞(Holliger等人(1996)“Specific KillingOf Lymphoma Cells By Cytotoxic T cells Mediated By A Bispecific Diabody,” Protein Eng. 9:299-305；Holliger等人(1999)“Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins,” Cancer Res. 59:2909-2916；WO 2006/113665；WO 2008/157379；WO 2010/080538；WO 2012/018687；WO 2012/162068)。正常地，效應細胞活化經由Fc結構域-FcγR相互作用通過將結合抗原的抗體結合效應細胞被觸發；因此，在這點上，雙抗體分子可呈現出像Ig一樣的功能性，無論它們是否包括Fc結構域(例如，如本領域已知的或本文例證的任何效應子功能試驗所測試的(例如ADCC試驗))。通過交聯腫瘤和效應細胞，雙抗體不僅將效應細胞帶入靠近腫瘤細胞的位置內，而且引起有效的腫瘤殺傷(見例如Cao等人(2003)“Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics,” Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197)。
但是，上述優勢以顯著的成本為代價。這類非單特異性雙抗體的形成需要成功組裝兩個或更多個獨特且不同的多肽(即，這樣的形成需要通過不同多肽鏈種類的異源二聚化而形成雙抗體)。該事實與單特異性雙抗體不同，其通過相同的多肽鏈的同源二聚化而形成。由於至少兩個不同的多肽(即，兩個多肽種類)必須被提供以形成非單特異性雙抗體並且由於這樣的多肽的同源二聚化導致分子失活(Takemura，S.等人(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)，因此這樣的多肽的產生必須以處理相同種類的多肽之間的共價結合的方式完成(即，以最小化它們的同源二聚化) (Takemura，S.等人(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588)。因此，現有技術已經教導了這類多肽的非共價締合(參見，例如Olafsen等人(2004)“Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications,” Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27；Asano等人(2004) “A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain ,” Abstract 3P-683，J. Biochem. 76(8):992；Takemura，S.等人(2000) “Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System, ” Protein Eng. 13(8):583-588；Lu，D.等人( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
但是，現有技術已經認識到包括非共價締合的多肽的雙特異性雙抗體是不穩定的並且容易解離為非功能單多肽鏈單體(參見，例如Lu，D.等人( 2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672)。
在面對該挑戰時，現有技術已經成功開發出穩定的、共價結合的異源二聚體非單特異性雙抗體，命名為DART® 雙抗體，參見例如Chichili, G.R.等人(2015) “A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia : Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates ,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82；Johnson, S.等人(2010) “Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion ,” J. Molec. Biol. 399(3):436-449；Veri, M.C.等人(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943；Moore, P.A.等人(2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551；美國專利號8,044,180、8,133,982、8,187,593、8,193,318、8,530,627、8,669,349、8,778,339、8,784,808、8,795,667、8,802,091、8,802,093、8,946,387、8,968,730和8,993,730；美國專利公開號2009/0060910、2010/0174053、2011/0081347、2011/0097323、2011/0117089、2012/0009186、2012/0034221、2012/0141476、2012/0294796、2013/0149236、2013/0295121、2014/0017237以及2014/0099318；歐洲專利文獻號EP 1868650、EP 2158221、EP 2247304、EP 2252631、EP 2282770、EP 2328934、EP 2376109、EP 2542256、EP 2601216、EP 2714079、EP 2714733、EP 2786762、EP 2839842、EP 2840091；以及PCT公開號WO 2006/113665、WO 2008/157379、WO 2010/027797、WO 2010/033279、WO 2010/080538、WO 2011/109400、WO 2012/018687、WO 2012/162067、WO 2012/162068、WO 2014/159940、WO 2015/021089、WO 2015/026892和WO 2015/026894)。這種雙抗體包括兩個或更多個共價複合的多肽，並且涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化進入每個採用的多肽種類。例如，已將顯示將半胱氨酸殘基添加至這種構建體的C-末端以允許在多肽鏈之間二硫鍵鍵合，從而穩定化所得的異源二聚體，而不干擾二價分子的結合特徵。
最簡單的DART® 雙抗體包括兩條多肽鏈，每條多肽鏈包括三個結構域(圖 1 )。第一多肽鏈包括：(i)包括第一免疫球蛋白的輕鏈可變結構域的結合區的第一結構域(VL1)，(ii)包括第二免疫球蛋白的重鏈可變結構域的結合區的第二結構域(VH2)，和(iii)用來促進與第二多肽鏈的異源二聚化(“異源二聚體促進結構域 ”)並且將雙抗體的第一多肽鏈共價結合第二多肽鏈的第三結構域。第二多肽鏈包含互補第一結構域(VL2結構域)、互補第二結構域(VH1結構域)和與第一多肽鏈的第三結構域複合的第三結構域，以促進異源二聚化(“異源二聚體促進結構域 ”)和與第一多肽鏈的共價結合。這種分子是穩定的、有力的並且具有同時結合兩個或更多個抗原的能力。在一個實施方式中，第一和第二多肽鏈的第三結構域各自包含半胱氨酸(“© ”)殘基，其用來通過二硫鍵將多肽結合在一起。一條或兩條多肽鏈的第三結構域可另外地具有CH2-CH3結構域的序列，以使雙抗體多肽的複合形成能夠結合細胞(如B淋巴細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞和肥大細胞)的Fc受體的Fc結構域。已經描述了這種分子的許多變型(參見，例如美國專利公開號2013-0295121、2010-0174053、2007-0004909、2009-0060910；歐洲專利公開號EP 2714079、EP 2601216、EP 2376109、EP 2158221和PCT公開號WO 2012/162068、WO 2012/018687、WO 2010/080538、WO 2006/113665)並且在本文中提供。II. 本發明優選的 CD137 x TA 結合分子 的組成
本發明CD137 x TA 結合分子包括多肽，並且可包括兩條、三條、四條或多於四條的多肽鏈。如本文使用的，術語“包括(composed of )”意欲是開放式，以使本發明包括兩條多肽鏈的CD137 x TA 結合分子可具有另外的多肽鏈。這種鏈可具有與結合分子的另一多肽鏈相同的序列，或可以與結合分子的任意其他多肽鏈在序列上是不同的。A. 優選的 “ 接頭 ” 肽
本發明CD137 x TA 結合分子的多肽包括這樣的結構域：其在“接頭”肽如接頭 1 、接頭 2 、接頭 3 等之後，在“接頭”肽如接頭 1 、接頭 2 、接頭 3 等之前，和/或通過“接頭”肽如接頭 1 、接頭 2 、接頭 3 等彼此連接。雖然本發明利用某些優選的“接頭”肽，但是鑒於本文提供的教導，可替選的接頭可容易地被鑒定並且被採用來實現CD137 x TA 結合分子。
最優選地，分離多肽鏈的這種VL和VH結構域的接頭 1 的長度被選擇以基本上或完全防止這種VL和VH結構域彼此結合(例如長度上12個或更少的氨基酸殘基)。因此，第一多肽鏈的VL1 和VH2 結構域基本上或完全不能彼此結合，並且不形成能夠基本上結合第一或第二抗原的表位結合位點。同樣地，第二多肽鏈的VL2 和VH1 結構域基本上或完全不能彼此結合，並且不形成能夠基本上結合第一或第二抗原的表位結合位點。優選的間插間隔肽(接頭 1 )具有序列(SEQ ID NO:16 )：GGGSGGGG，其太短不允許同一多肽鏈的VL和VH結構域一起複合(與被採用以產生scFv分子的較長的間插間隔肽(例如GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:17 ))相反。
接頭 2 的目的是將多肽鏈的VH結構域與該多肽鏈的任選存在的異源二聚體促進結構域分開。任意多種接頭可用於接頭 2 的目的。這種接頭 2 的優選序列具有氨基酸序列：GGCGGG (SEQ ID NO:18 )，其具有可用於通過二硫鍵將第一和第二多肽鏈彼此共價結合的半胱氨酸殘基，或衍生自IgG CH1結構域的ASTKG (SEQ ID NO:19 )。由於接頭 2 ，ASTKG (SEQ ID NO:19 )不具有這種半胱氨酸，因此這種接頭 2 的使用優選地與含半胱氨酸的異源二聚體促進結構域如SEQ ID NO:38 的E-螺旋或SEQ ID NO:39 的K-螺旋的使用結合(見下文)。
接頭 3 的一個目的是將多肽鏈的異源二聚體促進結構域與該多肽鏈的Fc結構域分開。第二個目的是提供含半胱氨酸的多肽結構域。任意多種接頭可用於接頭 3 的目的。這種接頭 3 的優選序列具有氨基酸序列：DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20 )。對於接頭 3 的另一優選序列具有氨基酸序列：GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21 )。
接頭 4 的目的是將Fc區的CH2-CH3結構域(“Fc 結構域 ”)的C-末端與VL結構域的N-末端分開。任意多種接頭可用於接頭 4 的目的。這種接頭 4 的優選序列具有氨基酸序列：APSSS (SEQ ID NO:22 )或氨基酸序列APSSSPME (SEQ ID NO:23 )或氨基酸序列GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24 )。
本發明的含Fc區的分子可包括另外的間插間隔肽(接頭)，通常這種接頭將在異源二聚體促進結構域(例如E-螺旋或K-螺旋)和CH2-CH3結構域之間併入和/或在CH2-CH3結構域和可變結構域(即，VH或VL)之間併入。典型地，另外的接頭將包括3-20個氨基酸殘基並且可以任選地包含IgG鉸鏈區的全部或一部分(優選地，IgG鉸鏈區的含半胱氨酸部分)。在本發明的雙特異性含Fc區的雙抗體分子中可以採用的接頭包括：GGC，GGG，ASTKG (SEQ ID NO:19 )，DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20 )，APSSS (SEQ ID NO:22 )，APSSSPME (SEQ ID NO:23 )，GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24 )，LGGGSG (SEQ ID NO:25 )，GGGS (SEQ ID NO:26 )，LEPKSS (SEQ ID NO:27 )，VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:28 )，LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:29 )。LEPKSS (SEQ ID NO:27 )可代替GGG或GGC使用，以方便克隆。另外地，氨基酸GGG，或LEPKSS (SEQ ID NO:27 )可後面緊跟著DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:20 )，以形成可替選的接頭：GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21 )；和LEPKSSDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30 )。本發明的雙特異性含Fc區的分子可併入IgG鉸鏈區，如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的IgG鉸鏈區或其一部分。B. 優選的異源二聚體促進結構域
如以上指出的，本發明的CD137 x TA 結合分子的形成涉及兩條或更多條不同多肽鏈的組裝(即，異源二聚化)。第一和第二多肽鏈的異源二聚體的形成可通過包含“異源二聚體促進結構域 ”驅動。異源二聚體促進結構域可以是在一條多肽鏈上的IgG的鉸鏈區的結構域(或衍生自鉸鏈區的多肽，例如GVEPKSC (SEQ ID NO:31 )，VEPKSC (SEQ ID NO:32 ))或AEPKSC (SEQ ID NO:33 ))，和在另一多肽鏈上的CL結構域(或衍生自CL結構域的多肽，例如GFNRGEC (SEQ ID NO:34 )或FNRGEC (SEQ ID NO:35 )) (US2007/0004909)。
但是，更優選地，本發明的異源二聚體促進結構域將包括相反電荷的串聯重複螺旋結構域，例如“E-螺旋”螺旋結構域(SEQ ID NO:36 ： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K)，其谷氨酸殘基將在pH 7時形成負電荷，而另一異源二聚體促進結構域將包括四個串聯“K-螺旋”結構域(SEQ ID NO:37 ： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)，其賴氨酸殘基將在pH 7時形成正電荷。這種帶電結構域的存在促進第一和第二多肽之間的締合，並且因而促進異源二聚化。在另一優選的實施方式中，利用其中SEQ ID NO:36 的四個串聯“E-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾以包含半胱氨酸殘基： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:38 )的異源二聚體促進結構域。同樣地，在另一優選的實施方式中，利用其中SEQ ID NO:37 的四個串聯“K-螺旋”螺旋結構域之一已經被修飾以包含半胱氨酸殘基： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:39 )的異源二聚體促進結構域。C. 多肽鏈的共價結合
將本發明的CD137 x TA 結合分子工程化，以使它們的多肽鏈對通過沿著其長度定位的一個或多個半胱氨酸殘基彼此共價結合，以產生共價締合的分子複合物。這種半胱氨酸殘基可引入到間插接頭中，所述間插接頭分開多肽的VL和VH結構域。可替選地，接頭 2 或接頭 3 ，或可替選的接頭可包含半胱氨酸殘基。最優選地，含螺旋的異源二聚體促進結構域的一個或多個螺旋結構域將包括氨基酸替換，其在SEQ ID NO:38 或SEQ ID NO:39 中併入半胱氨酸殘基。D. 優選的 Fc 結構域
本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子的Fc結構域可包括完整Fc區(例如完整IgG Fc區)或僅完整Fc區的片段。因此，本發明具有Fc的CD137 x TA 結合分子的Fc結構域可包括完整Fc區的CH2結構域的一些或全部和/或CH3結構域的一些或全部，或可包括變體CH2和/或變體CH3序列(其可包括例如關於完整Fc區的CH2或CH3結構域的一個或多個插入和/或一個或多個缺失)。本發明的雙特異性Fc雙抗體的Fc結構域可包括非-Fc多肽部分，或可包括非天然完整Fc區的部分，或可包括CH2和/或CH3結構域(例如兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或在N-末端至C-末端方向，連接至CH2結構域的CH3結構域等)的非天然發生定向。
雖然本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子的Fc結構域可包括天然發生的FC結構域的氨基酸序列，優選地形成這種Fc結構域的CH2-CH3結構域包括一個或多個替換，使得所得FC結構域具有減少的(例如，如果具有含天然發生的Fc區的氨基酸序列的Fc結構域，則通過這種分子所呈現出的結合小於50%、小於40%、小於30%、小於20%或小於10%)，或基本上沒有可檢測到的至FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)的結合(相對於由野生型Fc區所呈現出的結合)。能夠介導這種可變的結合的Fc變體和突變體形式是本領域已知的，並且包括在選自由：234、235、265和297組成的組中的一個或多個位置處的氨基酸替換，其中所述編號是Kabat中EU索引的那些(參見，例如美國專利號5,624,821，其通過引用併入本文)。在一個實施方式中，本發明的具有Fc的分子的第一和/或第三多肽鏈的CH2-CH3結構域包括任意1、2、3或4個替換：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G。可替選地，利用天然發生的Fc區的CH2-CH3結構域，其內在地呈現出減少的(或基本沒有)與FcγRIIIA (CD16a)的結合和/或降低的效應子功能(相對於由野生型IgG1 Fc區(SEQ ID NO:12 )所呈現出的結合和效應子功能)。在具體實施方式中，本發明的具有Fc的分子包括IgG2 Fc區(SEQ ID NO:13 )或IgG4 Fc區(SEQ ID:NO:15 )。當利用IgG4 Fc區時，本發明還包括引入穩定化突變，如以上所述鉸鏈區S228P替換(參見，例如SEQ ID NO:11 )。
在優選的實施方式中，本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子的採用的CH2-CH3結構域包括在位置234以丙氨酸和在位置235以丙氨酸的替換，其中所述編號是如Kabat中EU索引的編號(SEQ ID NO:40 )： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸(K)或不存在。
可通過增加Fc區域對於FcRn的結合親和力而增加包含Fc區域的蛋白質的血清半衰期。如本文使用的術語“半衰期”意思是分子的藥物代謝動力學特性，是施用之後分子的平均生存時間的度量。半衰期可表示為從受試者(例如，人患者或其他哺乳動物)的身體或其特定區室消除已知量的百分之五十(50%)的分子需要的時間，例如，如在血清中測量的，即迴圈半衰期，或在其他組織中測量的。一般而言，半衰期的增加導致施用的分子在迴圈中的平均停留時間(MRT)的增加。
在一些實施方式中，本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子包括變體Fc區，其中所述變體Fc區相對於野生型Fc區包括至少一個氨基酸修飾，使得所述分子具有增加的半衰期(相對於包括野生型Fc區的分子)。在一些實施方式中，本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子包括變體IgG Fc區，其中所述變體Fc區包括延長半衰期的氨基酸替換。能夠增加具有Fc的分子的半衰期的許多氨基酸替換是本領域已知的，參見例如在以下描述的氨基酸替換：美國專利號6,277,375、7,083,784；7,217,797、8,088,376；美國公開號2002/0147311、2007/0148164；和PCT公開號WO 98/23289、WO 2009/058492；和WO 2010/033279，這些文獻通過引用以其全部內容併入本文。具有增加的半衰期的具有Fc的CD137 x TA 結合分子可包括兩個或更多個替換，其選自：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I，其中所述編號是如Kabat中EU索引的。
特別地，所採用的CH2-CH3結構域可包括替換： (A) M252Y、S254T和T256E； (B) M252Y和S254T； (C) M252Y和T256E； (D) T250Q和M428L； (E) T307Q和N434A； (F) A378V和N434A； (G) N434A和Y436I； (H) V308P和N434A；或 (I) K288D和H435K， 其中所述編號是如Kabat中EU索引的編號。
CH2和CH3結構域的優選序列包括三氨基酸替換：M252Y/S254T/T256E (YTE)，其顯著增強了血清半衰期(Dall’Acqua，W.F.等人(2006) “Properties of Human IgGs Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn) ,” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524)，如在SEQ ID NO:41 或SEQ ID NO:42 中，其是IgG1 CH2-CH3結構域的變體，或如在SEQ ID NO:43 中，其是IgG4 CH2-CH3結構域的變體：SEQ ID NO:41 ： APELLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在。SEQ ID NO:42 ： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在。SEQ ID NO:43 ： APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在。
本發明還涵蓋具有Fc的CD137 x TA 結合分子，所述分子包括變體Fc結構域，該變體Fc結構域呈現出改變的效應子功能、改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶的敏感性或改變的效應子功能(如NK依賴性或巨噬細胞依賴性試驗中測試的)等。被確定為變化的效應子功能的Fc結構域修飾是本領域已知的，包括增加對活化受體(例如FcγRIIA (CD16A)的結合的修飾並且減少對抑制受體(例如FcγRIIB (CD32B)的結合(參見，例如Stavenhagen, J.B.等人(2007) “Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors ,” Cancer Res. 57(18):8882-8890)。具有降低的對CD32B的結合和/或增加的對CD16A的結合的人IgG1 Fc結構域的示例性變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L替換。這些氨基酸替換可以任何組合存在於人IgG1 Fc結構域中。在一個實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P和Y300L替換，其中所述編號如Kabat中EU索引的編號。在另一實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L替換，其中所述編號如Kabat中EU索引的編號。
本發明的CD137 x TA 結合分子的CH2和/或CH3結構域不需要在序列上一致，並且有利地被修飾以促進兩條具有CH2-CH3的多肽鏈之間的異源二聚化。例如，氨基酸替換(優選地，以包含形成“杵 (knob) ”的大側基的氨基酸，例如色氨酸進行替換)可被引入CH2或CH3結構域中，使得空間干擾將防止與類似的突變結構域的相互作用，並且將迫使突變的結構域與其中互補或適應性突變已經被工程化的結構域、即“臼 (hole) ”(例如，用甘氨酸替換)配對。這樣的突變組可被工程化進入任意對的多肽，其包括雙特異性具有Fc的雙抗體分子，並且進一步地被工程化進入所述對的多肽鏈的任意部分。相對於同源二聚化，支持異源二聚化的蛋白質工程化方法是本領域眾所周知的，特別是關於像免疫球蛋白樣的分子的工程化，並且該方法涵蓋在本文中(參見，例如Ridgway等人(1996)“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621；Atwell等人(1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270：26-35；和Xie等人(2005)“A New Format Of Bispecific Antibody ： Highly Efficient Heterodimerization ， Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；每一篇文獻在此通過引用以其整體併入本文中)。在一個實施方式中，杵被工程化進入第一多肽鏈的CH2-CH3結構域並且臼被工程化進入第三多肽鏈的CH2-CH3結構域。因此，杵將有助於防止第一多肽鏈的兩個分子經由其CH2和/或CH3結構域同源二聚化。因為該實施方式的第三多肽鏈優選地包含臼替換，故其將具有以第一多肽鏈異源二聚化以及以其自身同源二聚化的能力(但是，這種同源二聚化不形成具有表位結合位點的分子)。優選的杵通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366W形成。優選的臼通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V形成。為了有助於從最終的包括第一和第三多肽鏈的異源二聚體的雙特異性具有Fc的雙抗體中純化第三多肽鏈同源二聚體，第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點優選地通過在位置435處的氨基酸替換(H435R)突變。因此，第三多肽鏈同源二聚體將不會結合蛋白A，而適當組裝的雙特異性具有Fc的雙抗體將保留其通過在第一多肽鏈上的蛋白A結合位點結合蛋白A的能力。
SEQ ID NO:44 、SEQ ID NO:45 和SEQ ID NO:46 提供可用於本發明的CD137 x TA 結合分子中的“具有杵的 ”CH2和CH3結構域的示例性的優選序列：SEQ ID NO:44 ： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL Y SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H YTQKS LSLSPGX 其中X是賴氨酸(K)或不存在，SEQ ID NO:45 ： APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LY IT RE PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLW C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGX 其中X是賴氨酸(K)或不存在，SEQ ID NO:46 ： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在。
SEQ ID NO:47 、SEQ ID NO:48 和SEQ ID NO:49 提供可用於本發明的CD137 x TA 結合分子中的“具有臼的” CH2和CH3結構域的示例性的優選序列：SEQ ID NO:47 ： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在，SEQ ID NO:48 ： APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSL S CA V K GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSLG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在，SEQ ID NO:49 ： APEAA GGPSV FLFPPKPKDT LY IT RE PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLS CA VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLV SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNR YTQKS LSLSPG X 其中X是賴氨酸(K)或不存在。
如將指出的，SEQ ID NO:45 和SEQ ID NO:48 的CH2-CH3結構域是IgG4結構域，而SEQ ID NO:44 、 46 、 47 和49 的CH2-CH3結構域是IgG1結構域。SEQ ID NO:44 、 46 、 47 和49 包括在位置234處以丙氨酸的替換和在位置235處以丙氨酸的替換，因而形成呈現出減少(或基本上沒有)的對FcγRIA (CD64)、FcγRIIA (CD32A)、FcγRIIB (CD32B)、FcγRIIIA (CD16a)或FcγRIIIB (CD16b)的結合(相對於由野生型Fc區(SEQ ID NO:12 )呈現出的結合)的Fc結構域。此外，本發明具體涵蓋的是沒有以上指出的C-末端賴氨酸殘基的CD137 x TA 結合分子構建體。
在上述的實施方式中，第一多肽鏈將具有“具有杵的” CH2-CH3序列，如SEQ ID NO:44 的序列。但是，如將認識到的，“具有臼的”CH2-CH3結構域(例如SEQ ID NO:47 )可用在第一多肽鏈中，在該情況中，“具有杵的”CH2-CH3結構域(例如SEQ ID NO:44 )將用在第三多肽鏈中。E. 白蛋白結合結構域
如WO 2012/018687中公開的，為了改善雙抗體的體內藥物動力學性能，雙抗體可被修飾以在雙抗體的一個或多個末端包含血清結合蛋白的多肽部分。這種考慮同樣適用於本發明的三特異性結合分子。最優選地，當期望血清結合蛋白的多肽部分被併入到本發明的三特異性結合分子中時，這種多肽部分將在三特異性結合分子的一個多肽鏈的C-末端裝配。
白蛋白是血漿中最豐富的蛋白並且在人體中具有19天的半衰期。白蛋白具有幾個小分子結合位點，這允許白蛋白非共價結合其他蛋白並且從而延長它們的血清半衰期。鏈球菌屬(Streptococcus)菌株G148的蛋白G的白蛋白結合結構域3(ABD3)由46個氨基酸殘基組成，形成穩定的三螺旋束並且具有廣泛的白蛋白結合特異性(Johansson, M.U.等人(2002) “Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Module s,” J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120)。因此，特別優選的用於改善雙抗體的體內藥物動力學性能的血清結合蛋白的多肽部分是來自鏈球菌蛋白G的白蛋白結合結構域(ABD)，並且更優選地，鏈球菌屬菌株G148的蛋白G的白蛋白結合結構域3(ABD3) (SEQ ID NO:50 )：LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP。
如WO 2012/162068(通過引用併入本文)中公開的，SEQ ID NO:50 的“去免疫 ”變體具有減弱或消除MHC II類結合的能力。基於組合的突變結果，下述的替換組合被認為是用於形成這種去免疫的白蛋白結合結構域的優選替換：66S/70S +71A；66S/70S +79A；64A/65A/71A+66S；64A/65A/71A+66D；64A/65A/71A+66E；64A/65A/79A+66S；64A/65A/79A+66D；64A/65A/79A+66E。變體ABDs具有修飾L64A、I65A和D79A或修飾N66S、T70S和D79A。具有SEQ ID NO:51 、 52 或 53 的氨基酸序列的變體去免疫的ABD是特別優選的，因為這種去免疫的白蛋白結合結構域呈現出基本上野生型的結合，同時提供減弱的MHC II類結合：SEQ ID NO ： NO:51 ： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66 NAK S 70 A 71 EGVKALIDE ILAALPSEQ ID NO ： NO:52 ： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65 NNAKT VEGVKALI A 79 E ILAALPSEQ ID NO ： NO:53 ： LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66 NAK S 70 VEGVKALI A 79 E ILAALP
雖然這種白蛋白結合結構域可併入到本發明的三特異性結合分子的任何多肽鏈中，但優選地將這種結構域C-末端地定位至第一或第三多肽鏈的E-螺旋(或K-螺旋)結構域(經由在E-螺旋(或K-螺旋)結構域和白蛋白結合結構域(其優選地是去免疫的白蛋白結合結構域)之間插入的接頭)。對於這種接頭的優選序列是SEQ ID NO:26 ：GGGS。F. 優選的腫瘤抗原 (TA) 和示例性的可變結構域
本發明的CD137 x TA 結合分子包括對於腫瘤抗原的表位特異性的至少一個表位結合位點。可通過本發明的CD137 x TA 結合分子結合的示例性的腫瘤抗原(“TA ”)包括但不限於：結腸癌抗原19.9 ；癌胚蛋白5T4 ；胃癌黏蛋白抗原 4.2 ；結直腸癌抗原A33 (Almqvist, Y. 2006，Nucl Med Biol . Nov;33(8):991-998)；ADAM-9 (美國專利公開號2006/0172350；PCT公開號WO 06/084075；AFP 癌胚抗原-α-胎蛋白(Malaguarnera, G.等人(2010) “Serum markers of hepatocellular carcinoma ,” Dig. Dis. Sci. 55(10):2744-2755)；ALCAM (PCT公開號WO 03/093443)；BAGE (Bodey，B. 2002Expert Opin Biol Ther . 2(6):577-84)；β- 聯蛋白 (Prange W.等人2003J Pathol. 201(2):250-9)；CA125 (Bast, R.C. Jr.等人2005Int J Gynecol Cancer 15 Suppl 3:274-81)；羧肽酶 M (美國專利公開號2006/0166291)；B1 (Egloff, A.M.等人2006，Cancer Res . 66(1):6-9)；CD5 (Calin, G.A.等人2006Semin Oncol . 33(2):167-73；CD19 (Troussard, X.等人1998Hematol Cell Ther . 40(4):139-48)；CD20 (Thomas, D.A.等人2006 Hematol Oncol Clin North Am. 20(5):1125-36)；CD20 (Cang, S.等人(2012) “Novel CD20 Monoclonal Antibodies For Lymphoma Therapy ,” J. Hematol. 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識別這種腫瘤抗原的抗體是本領域中已知的或可使用已知方法產生，包括WO 2002/014870中描述的那些。包括能夠結合腫瘤抗原的VL和VH結構域並且因此其序列或多肽鏈可用在本發明CD137 x TA 結合分子的構建中的示例性抗體列於表 1 中。結合幾種腫瘤抗原的抗體的示例性VH和VL結構域如下呈現： 1. 結合 HER2/neu 的抗體
HER2/neu是185 kDa受體蛋白，其最初鑒定為來自化學處理的大鼠的成神經細胞瘤的轉化基因的產物。HER2/neu由於其在幾種人類癌症中和在哺乳動物發展中的作用已經被廣泛研究(Hynes等人(1994) “The Biology of erbB-2/neu/HER-2 and its Role in Cancer ,” Biochim. Biophys. Acta 1198:165-184；Dougall等人(1994) “The neu-Oncogene ： Signal Transduction Pathways ， Transformation Mechanisms and Evolving Therapies ,” Oncogene 9:2109-2123；Lee等人(1995) “Requirement for Neuregulin Receptor erbB2 in Neural and Cardiac Development ,” Nature 378:394-398)。
根據本發明可使用任意抗-HER2/neu抗體的表位結合位點，並且本發明的原則關於HER2/neu腫瘤抗原闡述。結合人HER2/neu的示例性抗體包括“瑪格妥昔單抗 ”、“曲妥珠單抗 ”和“帕妥株單抗 ”。瑪格妥昔單抗(也稱為MGAH22；CAS登錄號1350624-75-7，參見，例如美國專利號8,802,093)是Fc優化的單克隆抗體，其結合HER2/neu並且介導增強的ADCC活性。曲妥珠單抗(也稱為rhuMAB4D5，並且作為Herceptin®銷售；CAS登錄號180288-69-1；參見，美國專利號5,821,337)是具有IgG1/κ恆定區的抗體4D5的人源化形式。帕妥株單抗(也稱為rhuMAB2C4，並且作為Perjeta™銷售；CAS登錄號380610-27-5；參見例如，WO2001/000245)是具有IgG1/κ恆定區的抗體2C4的人源化形式。也提供另外的抗-HER2/neu抗體。(a) 瑪格妥昔單抗
瑪格妥昔單抗的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:54 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQSGPE LVKPGASLKL SCTASGFNIK DTYIH WVKQR PEQGLEWIG R IYPTNGYTRY DPKFQD KATI TADTSSNTAY LQVSRLTSED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGASVTVSS
瑪格妥昔單抗的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:55 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITC KASQDVN TA VA WYQQKP GHSPKLLIY S ASFRYT GVPD RFTGSRSGTD FTFTISSVQA EDLAVYYC QQ HYTTPPT FGG GTKVEIK
瑪格妥昔單抗的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列是本領域已知的(參見，例如WHO Drug Information，2014，Recommended INN：List 71，28(1):93-94)。(b) 曲妥珠單抗
曲妥珠單抗 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:56 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIH WVRQA PGKGLEWVA R IYPTNGYTRY ADSVKG RFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSR WG GDGFYAMDY W GQGTLVTVSS
曲妥珠單抗 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:57 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDVN TA VA WYQQKP GKAPKLLIY S ASFLY SGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYTTPPT FGQ GTKVEIK(c) 帕妥株單抗
帕妥株單抗 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:58 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMD WVRQA PGKGLEWVA D VNPNSGGSIY NQRFKG RFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAR NL GPSFYFDY WG QGTLVTVSS
帕妥株單抗 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:59 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVS IGVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRYT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YYIYPYT FGQ GTKVEIK(d) HER2-MAB-1
抗體HER2-MAB-1 是小鼠抗-HER2/neu單克隆抗體，其結合與瑪格妥昔單抗、曲妥珠單抗和帕妥株單抗識別的表位不同的HER2/neu的表位。HER2-MAB-1 的VH結構域(本文稱為HER2 MAB-1 VH )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:60 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLQESGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMN WVKQA PGKGLKWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RFAF SLGTSASTAF LQINNLKNED TATYFCAR DD GYGNRVSY WG QGTLVTVSA
HER2 MAB-1 VH 的CDRH 的氨基酸序列是 CDRH 1 (SEQ ID NO:177 )：NYGMN CDRH 2 (SEQ ID NO:178 )：WINTNIGEPTYTEEFKG CDRH 3 (SEQ ID NO:179 )：DDGYGNRVSY
HER2-MAB-1 的VL結構域(本文稱為HER2 MAB-1 VL )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:61 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DILMTQSPLS MYTSLGERVT ITC KASQDIN SYLS WFQQKP GKSPKTLIY R ANRLVD GVPS RFSGSGSGQD YSLTISSLEY EDMGIYYC LQ HDEFPWT FGG GTKLEIK
HER2 MAB-1 VL 的CDRL 的氨基酸序列是： CDRL 1 (SEQ ID NO:180 )：KASQDINSYLS CDRL 2 (SEQ ID NO:181 )：RANRLVD CDRL 3 (SEQ ID NO:182 )：LQHDEFPWT(e) 人源化 HER2-MAB-1
將抗體HER2-MAB-1 人源化以形成抗體hHER2-MAB-1 。這種人源化抗體的VH結構域(hHER2-MAB-1 VH )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:62 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR DX1 X2 YGNRVSY WG QGTLVTVSS 其中：X1 是D或E，和X2 是G或I。
這種人源化抗體的VL結構域(hHER2 MAB-1 VL )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:63 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDIX3 X4 YLS WFQQKP GKAPKTLIY R ANRLX5 X6 GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC LQ HDEFPWT FGQ GTKLEIK 其中：X3 是N或S；X4 是S、T或N；X5 是V或Q；和X6 是D、E或S。
分離三個變體hHER2-MAB-1 VH 結構域：hHER2 MAB-1 VH1 、hHER2 MAB-1 VH2 和hHER2 MAB-1 VH3 。以下示出這種變體hHER2 MAB-1 VH 結構域的氨基酸序列。
hHER2 MAB-1 VH1 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:64 ) (CDRH 殘基以底線顯示；注意CDRH 3 的第二和第三殘基分別是D和G)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR DD GYGNRVSY WG QGTLVTVSS
hHER2 MAB-1 VH2 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:65 ) (CDRH 殘基以底線顯示；注意CDRH 3 的第二和第三殘基分別是E和G)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR DE GYGNRVSY WG QGTLVTVSS
hHER2 MAB-1 VH3 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:66 ) (CDRH 殘基以底線顯示；注意CDRH 3 的第二和第三殘基分別是D和I)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR DD IYGNRVSY WG QGTLVTVSS
因此，hHER2 MAB-1 VH1 、hHER2 MAB-1 VH2 和hHER2 MAB-1 VH3 的CDRH 1的氨基酸序列是相同的(NYGMN；SEQ ID NO:177 )並且hHER2 MAB-1 VH1 、hHER2 MAB-1 VH2 和hHER2 MAB-1 VH3 的CDRH 2的氨基酸序列是相同的(SEQ ID NO:178 )。但是，hHER2 MAB-1 VH1 、hHER2 MAB-1 VH2 和hHER2 MAB-1 VH3 的CDRH 3的氨基酸序列不同：hHER2 MAB-1 VH1 CDRH 3 (SEQ ID NO:183 )：DDGYGNRVSYhHER2 MAB-1 VH2 CDRH 3 (SEQ ID NO:184 )：DEGYGNRVSYhHER2 MAB-1 VH3 CDRH 3 (SEQ ID NO:185 )：DDIYGNRVSY
分離三個變體hHER2-MAB-1 VL 結構域：hHER2 MAB-1 VL1 、hHER2 MAB-1 VL2 和hHER2 MAB-1 VL3 。以下示出這種變體hHER2 MAB-1 VH 結構域的氨基酸序列。
hHER2 MAB-1 VL1 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:67 ) (CDRL 殘基以底線顯示；注意CDRL 1 的第七和第八殘基分別是N和S，並且CDRL 2 的第六和第七殘基分別是V和D)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDIN SYLS WFQQKP GKAPKTLIY R ANRLVD GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC LQ HDEFPWT FGQ GTKLEIK
hHER2 MAB-1 VL2 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:68 ) (CDRL 殘基以底線顯示；注意CDRL 1 的第七和第八殘基分別是N和T，並且CDRL 2 的第六和第七殘基分別是V和E)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDIN TYLS WFQQKP GKAPKTLIY R ANRLVE GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC LQ HDEFPWT FGQ GTKLEIK
hHER2 MAB-1 VL3 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:69 ) (CDRL 殘基以底線顯示；注意CDRL 1 的第七和第八殘基分別是S和N，並且CDRL 2 的第六和第七殘基分別是Q和S)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDIS NYLS WFQQKP GKAPKTLIY R ANRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC LQ HDEFPWT FGQ GTKLEIK
因此，hHER2 MAB-1 VL1 、hHER2 MAB-1 VL2 和hHER2 MAB-1 VL3 的CDRL 3的氨基酸序列是相同的(LQHDEFPWT； SEQ ID NO:182 )。但是，hHER2 MAB-1 VL1 、hHER2 MAB-1 VL2 和hHER2 MAB-1 VL3 的CDRL 1和CDRL 2的氨基酸序列不同：hHER2 MAB-1 VL1 CDRL 1 (SEQ ID NO:186 )：KASQDINSYLShHER2 MAB-1 VL2 CDRL 1 (SEQ ID NO:187 )：KASQDINTYLShHER2 MAB-1 VL3 CDRL 1 (SEQ ID NO:188 )：KASQDISNYLShHER2 MAB-1 VL1 CDRL 2 (SEQ ID NO:189 )：RANRLVDhHER2 MAB-1 VL2 CDRL 2 (SEQ ID NO:190 )：RANRLVEhHER2 MAB-1 VL3 CDRL 2 (SEQ ID NO:191 )：RANRLQS
任意這種人源化的hHER2-MAB-1 的VH和VL結構域，包括任意包括在以上示出的hHER2-MAB-1 VH和/或VL結構域的基因序列內的結構域，可用於形成能夠結合Her2/neu的抗體、雙抗體或結合分子。(f )其他抗 -HER2/neu 抗體
除了上述鑒定的優選的抗-HER2/neu結合分子，本發明考慮使用任意下述抗-Her-2結合分子：1.44.1 ； 1.140 ； 1.43 ； 1.14.1 ； 1.100.1 ； 1.96 ； 1.18.1 ； 1.20 ； 1.39 ； 1.24 ； 和1.71.3 (美國專利號8,350,011；8,858,942；和PCT專利公開WO 2008/019290)；F5 和C1 (美國專利號7,892,554；8,173,424；8,974,792；和PCT專利公開WO 99/55367)；和也使用美國專利公開2011/0097323、2013/017114、2014/0328836、2016/0130360和2016/0257761以及PCT專利公開WO2011/147986的抗-Her-2結合分子，所有公開通過引用以其抗-HER2/neu結合分子的公開內容併入本文。
本發明尤其包括和涵蓋這樣的CD137 x HER2/neu 結合分子，其包括瑪格妥昔單抗、曲妥珠單抗、帕妥株單抗、hHER2-MAB-1和本文提供的任意其他抗-HER2/neu抗體中的任一種的VL和/或VH結構域，和/或VL區的1、2或全部3個CDRL和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH；並且更優選地，具有這種抗-HER2/neu單克隆抗體的VL區的1、2或全部3個CDRL和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH。2. 結合 EphA2 的抗體
受體酪氨酸激酶，肝配蛋白A型受體2 (EphA2 )通常在成人上皮組織中細胞與細胞接觸的位點處表達，但是，最近的研究已經顯示其也在各種類型的上皮癌(epithelial carcinomas)中過表達，其中在轉移性病變中觀察到的EphA2表達水準最高。已經在很大範圍的癌症和許多腫瘤細胞系，包括前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和黑色素瘤中發現了高表達水準的EphA2 (Xu, J.等人(2014) “High EphA2 Protein Expression In Renal Cell Carcinoma Is Associated With A Poor Disease Outcome ,” Oncol. Lett. Aug 2014; 8(2)：687-692；Miao, B.等人(2014) “EphA2 is a Mediator of Vemurafenib Resistance and a Novel Therapeutic Target in Melanoma ,” Cancer Discov. pii：CD-14-0295)。EphA2似乎不僅僅是癌症的標記物，而似乎在許多人類癌症中持續地過表達並且功能上改變(Chen, P.等人(2014) “EphA2 Enhances The Proliferation And Invasion Ability Of LnCap Prostate Cancer Cells ,” Oncol. Lett. 8(1):41-46)。根據本發明可使用任意抗-EphA2抗體的表位結合位點。以下呈現的是幾個示例性的小鼠抗-EphA2抗體，特別優選地是這種抗體的人源化衍生物。(a) EphA2 MAB-1
抗體EphA2 MAB-1 是小鼠抗-EphA2單克隆抗體。EphA2 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:128 ) (CDR殘基以底線顯示)： QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVH WVRQP PGKGLEWLG M IWGGGSTDYN SALKS RLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCAR KHG NYYTMDY WGQ GTSVTVSS
EphA2 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:129 ) (CDR殘基以底線顯示)： DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GYTLYT FGGG TKLEIK(b )EphA2 MAB-2
抗體EphA2 MAB-2 是小鼠抗-EphA2單克隆抗體。EphA2 MAB-2 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:130 ) (CDR殘基以底線顯示)： QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMN WVKQA PGKGLKWMG W INTYIGEPTY ADDFKG RFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAR EL GPYYFDY WGQ GTTLTVSS
EphA2 MAB-2 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:131 ) (CDR殘基以底線顯示)： DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSSGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP T FGSGTKLEI K(c )EphA2 MAB-3
抗體EphA2 MAB-3 是小鼠抗-EphA2單克隆抗體。EphA2 MAB-3 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:132 ) (CDR殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMY WVRQT PEKRLEWVA T ISDGGSFTSY PDSVKG RFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTR DE SDRPFPY WGQ GTLVTVSS
EphA2 MAB-3 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:133 ) (CDR殘基以底線顯示)： DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITC KASQDVT TAVA WYQQKP GQSPKLLIF W ASTRHA GVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYC QQ HYSTPYT FGG GTKLEIK(d )其他 EphA2 抗體
除了上述鑒定的抗-EphA2抗體，本發明考慮使用任意下述抗-EphA2抗體：SPL1 、LUCA19 、SG5 或LUCA40 (參見，PCT專利公開WO 2006/084226)；B13 (參見，美國專利號7,101,976)；D7 (參見，美國專利號7,192,698)；B-233 和EA2 (參見，PCT專利公開WO 2003/094859)。
本發明具體包括和涵蓋這樣的CD137 x EphA2 結合分子，其包括抗-EphA2單克隆抗體EphA2 MAB-1、EphA2 MAB-2和EphA2 MAB-3的VL和/或VH結構域，和/或VL區的1個、2個或全部3個CDRL和/或VH結構域的1個、2個或全部3個CDRH。3. 結合 5T4 的抗體
癌胚蛋白5T4 是腫瘤相關的蛋白質，其在許多癌症(包括腎癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌)的細胞膜上展示並在急性成淋巴細胞性白血病中展示(參見，Boghaert, E.R.等人(2008) “The Oncofetal Protein , 5T4 , Is A Suitable Target For Antibody-Guided Anti-Cancer Chemotherapy With Calicheamicin ,” Int. J. Oncol. 32(1):221-234；Eisen, T.等人(2014) “Naptumomab Estafenatox : Targeted Immunotherapy with a Novel Immunotoxin ,” Curr. Oncol. Rep. 16:370，pp. 1-6)。根據本發明可使用任意抗-5T4抗體的表位結合位點。以下呈現的是兩個示例性的抗-5T4抗體，“5T4 MAB-1 ”和“5T4 MAB-2 ”。在現有技術中描述了另外的抗-5T4抗體(參見，例如美國專利號：8,084,249、8,409,577、8,759,495、8,409,577；PCT公開號：WO 2013/041687、WO 2014/137931、WO 2016/022939)。(a )5T4 MAB-1
5T4 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:134 ) (CDR殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMH WVRQA PGQGLEWMG R IDPNRGGTEY NEKAKS RVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAG GN PYYPMDY WGQ GTTVTVSS
5T4 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:135 ) (CDR殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQGIS NYLA WFQQKP GKAPKSLIY R ANRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC LQ YDDFPWT FGQ GTKLEIK(b )5T4 MAB-2
5T4 MAB-2 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:136 ) (CDR殘基以底線顯示)： QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWIT WVKQR PGQGLEWIG D IYPGSGRANY NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCAR YG PLFTTVVDPN SYAMDY WGQG TSVTVSS
5T4 MAB-2 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:137 ) (CDR殘基以底線顯示)： DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSIV YSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP FT FGSGTKLE IK
本發明具體包括和涵蓋這樣的CD137 x 5T4 結合分子，其包括抗-5T4單克隆抗體5T4 MAB-1或5T4 MAB-2，或WO 2007/106744、WO 2013/041687或WO 2015/184203中提供的任意抗-5T4抗體的VL和/或VH結構域和/或VL區的1個、2個或所有3個CDRL和/或VH結構域的1個、2個或所有3個CDRH。4. 結合 B7-H3 的抗體
B7-H3是在很多實體腫瘤類型上過表達的腫瘤抗原，並且是參與免疫調節的B7家族分子的成員(參見，美國專利號8,802,091、US 2014/0328750、US 2013/0149236；Loo, D.等人(2012) “Development Of An Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody With Potent Antitumor Activity,” Clin. Cancer Res. 18(14):3834-3845)。特別地，幾項獨立的研究已經證明人惡性腫瘤細胞(例如，成神經細胞瘤和胃癌、卵巢癌和非小細胞肺癌的腫瘤細胞)呈現顯著增加的B7-H3蛋白質的表達，並且該增加的表達與增加的疾病嚴重性有關(Zang, X.等人(2007) “The B7 Family And Cancer Therapy ： Costimulation And Coinhibition ,” Clin. Cancer Res. 13:5271-5279)，這表明B7-H3被腫瘤用作免疫逃避路徑(Hofmeyer, K.等人，(2008) “The Contrasting Role Of B7-H3 ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278)。
根據本發明可使用任意抗-B7-H3抗體的表位結合位點。結合人B7-H3的一個示例性抗體是“Enoblituzumab ”。Enoblituzumab(也稱為MGA271、CAS登錄號1353485-38-7；參見，例如美國專利號8,802,091)是Fc-優化的單克隆抗體，其結合B7-H3並且介導增強的ADCC活性。也呈現另外的示例性抗-B7-H3抗體。(a) Enoblituzumab
Enoblituzumab 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:138 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SFGMH WVRQA PGKGLEWVA Y ISSDSSAIYY ADTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRDED TAVYYCGR GR ENIYYGSRLD Y WGQGTTVTV SS
Enoblituzumab 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:139 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC KASQNVD TNVA WYQQKP GKAPKALIY S ASYRYS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ YNNYPFT FGQ GTKLEIK(b )BRCA69D
抗體BRCA69D 是小鼠抗-B7-H3單克隆抗體。以下顯示BRCA69D 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:140 )(CDRH 殘基以底線顯示)。 QVQLQQSGAE LARPGASVKL SCKASGYTFT SYWMQ WVKQR PGQGLEWIG T IYPGDGDTRY TQKFKG KATL TADKSSSTAY MQLSSLASED SAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GAGTTVTVSS
以下顯示BRCA69D的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:141 ) (CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTIDNLEQ EDIATYFC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK(c )人源化 BRCA69D
將抗體BRCA69D 人源化，產生兩個變體VH結構域，hBRCA69D VH1 和hBRCA69D VH2 ；和兩個變體VL結構域hBRCA69D VL1 和hBRCA69D VL2 ，其可用於VH/VL的任意組合中，以產生功能人源化結合結構域。以下提供這種人源化變體的氨基酸序列。
hBRCA69D VH1 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:142 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGDGDTRY TQKFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
hBRCA69D VH2 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:143 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGGGDTRY TQKFQG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
hBRCA69D VL1 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:144 ) (CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK
hBRCA69D VL2 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:145 ) (CDRL 殘基以底線顯示)。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQSIS SYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK(d )PRCA157
抗體PRCA157 是小鼠抗-B7-H3單克隆抗體。PRCA157 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:146 ) (CDRH 殘基以底線顯示)。 EVQQVESGGD LVKPGGSLKL SCAASGFTFS SYGMS WVRQT PDKRLEW VAT INSGGSNTYY PDSLKG RFTI SRDNAKNTLY LQMRSLKSED TAMYYCAR HD GGAMDY WGQG TSVTVSS
PRCA157 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:147 ) (CDRH 殘基以底線顯示)。 DIQMTQSPAS LSVSVGETVT ITC RASESIY SYLA WYQQKQ GKSPQLLVY N TKTLPE GVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGRYYC QH HYGTPPWT FG GGTNLEIK(e )人源化 PRCA157
將抗體PRCA157 人源化，產生一個人源化VH結構域hPRCA157 VH1 和一個人源化VL結構域hPRCA157 VL1 ，以產生功能人源化結合結構域。以下提供人源化PRCA157 的氨基酸序列。
hPRCA157 VH1 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:202 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMS WVRQA PGKGLEWVA T INSGGSNTYY PDSLKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR HD GGAMDY WGQG TTVTVSS
hPRCA157 VL1 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:203 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASESIY SYLA WYQQKP GKAPKLLVY N TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYGTPPWT FG QGTRLEIK(f )其他抗 -B7-H3 抗體
除了以上鑒定的優選的抗-B7-H3結合分子外，本發明考慮使用任意下述抗-B7-H3結合分子：LUCA1 ； BLA8 ； PA20 ；或 SKN2 (參見，美國專利號7,527,969、8,779,098和PCT專利公開WO 2004/001381)；M30 ； cM30 ； M30-H1-L1 ； M30-H1-L2 ； M30-H1-L3 ； M30-H1-L4 ； M30-H1-L5 ； M30-H1-L6 ； M30-H1-L7 ； M30-H4-L1 ； M30-H4-L2 ； M30-H4-L3 ；和 M30-H4-L4 (參見，美國專利公開2013/0078234和PCT專利公開WO 2012/147713)；和8H9 (參見，美國專利號7,666,424、7,737,258、7,740,845、8,148,154、8,414,892、8,501,471、9,062,110；美國專利公開2010/0143245和PCT專利公開WO 2008/116219)。
本發明具體包括和涵蓋這樣的CD137 x B7-H3 結合分子，其包括任意BRCA69D 、人源化BRCA69D 、PRCA157 、 人源化PRCA157 或Enoblituzumab或任意本文提供的其他抗-B7-H3抗體的VL和/或VH結構域，和/或VL區的1個、2個或所有3個CDRL 和/或VH結構域的1個、2個或所有3個CDRH ；並且更優選地具有這種抗-B7-H3單克隆抗體的VL區的1個、2個或所有3個CDRL 和/或VH結構域的1個、2個或所有3個CDRH 。5. 結合 GpA33 的抗體
43kD跨膜糖蛋白A33 (gpA33 )在＞95%的所有結直腸癌中表達(Heath, J.K.等人(1997) “The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474；Ritter, G.等人(1997) “Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen , A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium ,” Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686；Wong, N.A.等人(2006) “EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia ,” J. Clin. Pathol. 59(3):260-263)。可根據本發明使用任意抗-gpA33抗體的表位結合位點。以下呈現示例性的抗-gpA33抗體(“gpA33 MAB-1 ”)。
gpA33 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:148 ) (CDR殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMN WVRQA PGQGLEWIG R IYPGDGETNY NGKFKD RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR IY GNNVYFDV WG QGTTVTVSS
gpA33 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:149 ) (CDR殘基以底線顯示)： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIK
本發明具體包括和涵蓋這樣的CD137 x gpA33 結合分子，其包括抗-gpA33單克隆抗體gpA33 MAB-1，或WO 2015/026894中提供的任意抗-gpA33單克隆抗體的VL和/或VH結構域和/或VL區的1個、2個或所有3個CDRL和/或VH結構域的1個、2個或所有3個CDRH。6. 結合 CEACAM5 和 CEACAM6 的抗體
已經發現癌胚抗原-相關的細胞黏附分子5 (CEACAM5)和癌胚抗原-相關的細胞黏附分子6 (CEACAM6)與各種類型的癌症有關，所述各種類型的癌症包括甲狀腺髓質癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血系統癌症(hematopoietic cancer)、白血病和卵巢癌(PCT公開號WO 2011/034660)，尤其是結直腸癌、胃腸癌、胰腺癌、非小細胞肺癌(NSCL)、乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌、卵巢癌和子宮癌(Zheng, C.等人(2011) “A Novel Anti-CEACAM5 Monoclonal Antibody , CC4 , Suppresses Colorectal Tumor Growth and Enhances NK Cells-Mediated Tumor Immunity ,” PLoS One 6(6):e21146，pp. 1-11)。已經發現CEACAM5在90%的胃腸癌、結直腸癌和胰腺癌、70%的非小細胞肺癌細胞和50%的乳腺癌中過表達(Thompson, J.A.等人，(1991) “Carcinoembryonic Antigen Gene Family : Molecular Biology And Clinical Perspectives ,” J. Clin. Lab. Anal. 5:344-366)。過表達的癌胚抗原相關的細胞黏附分子6 (CEACAM6)在各種人癌症的侵入和轉移中起到重要作用，所述各種人癌症包括甲狀腺髓質癌、結腸直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、頭頸癌、膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血系統癌症、白血病和卵巢癌(PCT公開號WO 2011/034660；Deng, X.,等人(2014) “Expression Profiling Of CEACAM6 Associated With The Tumorigenesis And Progression In Gastric Adenocarcinoma ,” Genet. Mol. Res. 13(3):7686-7697；Cameron, S.等人(2012) “Focal Overexpression Of CEACAM6 Contributes To Enhanced Tumourigenesis In Head And Neck Cancer Via Suppression Of Apoptosis ,” Mol. Cancer 11:74，pp. 1-11；Chapin, C.等人(2012) “Distribution And Surfactant Association Of Carcinoembryonic Cell Adhesion Molecule 6 In Human Lung ,” Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 302(2):L216-L25；Riley, C.J.等人(2009) “Design And Activity Of A Murine And Humanized Anti-CEACAM6 Single-Chain Variable Fragment In The Treatment Of Pancreatic Cancer ,” Cancer Res. 69(5):1933-1940；Lewis-Wambi, J.S.等人(2008) “Overexpression Of CEACAM6 Promotes Migration And Invasion Of Oestrogen-Deprived Breast Cancer Cells ,” Eur. J. Cancer 44(12):1770-1779；Blumenthal, R.D.等人(2007) “Expression Patterns Of CEACAM5 And CEACAM6 In Primary And Metastatic Cancers ,” BMC Cancer. 7:2，pp. 1-15)。根據本發明可使用任意抗-CEACAM5 / CEACAM6抗體的表位結合位點。以下提供示例性的抗-CEACAM5/CEACAM6抗體。(a) 16C3
人源化抗-CEACAM5/CEACAM6抗體16C3 的VH結構域的氨基酸序列(EP 2585476)是(SEQ ID NO:150 ) (CDR殘基以底線顯示)： QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGS GYTFT DYAMH WVKQS HAKSLEWIG L ISTYSGDTKY NQNFKG KATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAR GD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
人源化抗-CEACAM5 / CEACAM6抗體16C3 的VL結構域的氨基酸序列(EP 2585476)是(SEQ ID NO:151 ) (CDR殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC GASENIY GALN WYQRKP GKSPKLLIW G ASNLAD GMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYY CQN VLSSPYT FGG GTKLEIK(b )hMN15
人源化抗-CEACAM5 / CEACAM6抗體hMN15 的VH結構域的氨基酸序列(WO 2011/034660)是(SEQ ID NO:152 ) (CDR殘基以底線顯示)： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSG FALT DYYMS WVRQA PGKGLEWLG F IANKANGHTT DYSPSVKG RF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
人源化抗-CEACAM5 / CEACAM6抗體hMN15 的VL結構域的氨基酸序列(WO 2011/034660)是(SEQ ID NO:153 ) (CDR殘基以底線顯示)： DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTC SASSRVS YIH WYQQKPG KAPKRWIY GT STLAS GVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYC QQW SYNPPT FGQG TKVEIKR
本發明具體包括和涵蓋這樣的CD137 x CEACAM5/CEACAM6 結合分子，其包括抗-CEACAM5/CEACAM6單克隆抗體16C3 或hMN15 的VL和/或VH結構域、和/或VL區的1個、2個或所有3個CDRL 和/或VH結構域的1個、2個或所有3個CDRH 。7. 結合 CD19 的抗體
CD19 (B淋巴細胞表面抗原B4，Genbank登記號M28170)是B細胞受體(BCR)複合物的組分，並且是B細胞信號傳導的正調節物，其調節B細胞活化和體液免疫的閾值。CD19是在B細胞譜系中最普遍存在表達的抗原之一並且在＞95%的B細胞惡化上表達，包括急性成淋巴細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。顯著地，CD19表達維持在對抗-CD20療法變得抗性的B細胞淋巴瘤上(Davis等人(1999) “Therapy of B-cell Lymphoma With Anti-CD20 Antibodies Can Result In The Loss Of CD20 Antigen Expression.” Clin Cancer Res，5:611-615，1999)。同樣建議CD19作為靶標治療自體免疫疾病(Tedder (2009) “CD19 ： A Promising B Cell Target For Rheumatoid Arthritis ,” Nat. Rev. Rheumatol. 5:572-577)。
結合人CD19並且可用於本發明中的示例性的抗體是在WO 2016/048938中公開的抗-CD19抗體(本文稱為“CD19 MAB-1 ”)。
以下顯示CD19 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:204 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVG WIR QPPGKALEWL A HIWWDDDKR YNPALKS RLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCAR M ELWSYYFDY W GQGTTVTVSS
以下顯示CD19 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:205 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITC RASQSVS YMH WYQQKPG QAPRLLIY DA SNRAS GVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYC FQG SVYPF T FGQG TKLEIK
本發明具體包括和涵蓋這樣的CD137 x CD19 結合分子，其包括抗-CD19單克隆抗體CD19 MAB-1 或公開於美國專利7,112,324中的任意抗-CD19抗體，或存在於博納吐單抗(BLINCYTO®；WHO Drug Information，2009，推薦的INN：列表62，23(3):240-241中發現的氨基酸序列)和duvortuxizumab (aka MGD011；WHO Drug Information，2016，提出的INN：列表116，30(4):627-629中發現的氨基酸序列)中的VL和/或VH結構域，和/或VL區的1個、2個或所有3個CDRL 和/或VH結構域的1個、2個或所有3個CDRH 。8. 結合 CD123 的抗體
CD123 (白介素3受體α，IL-3Ra)是40 kDa分子，其是白介素3受體複合物的一部分(Stomski, F.C.等人(1996) “Human Interleukin-3 (IL-3) Induces Disulfide-Linked IL-3 Receptor Alpha- And Beta-Chain Heterodimerization ， Which Is Required For Receptor Activation But Not High-Affinity Binding ,” Mol. Cell. Biol. 16(6):3035-3046)。白介素3 (IL-3)驅動多能幹細胞早期分化為類紅細胞、髓系細胞和淋巴樣祖細胞。已經報導CD123在很大範圍的血液學惡性腫瘤(包括急性髓細胞樣白血病(AML)和脊髓增生異常綜合征(MDS))中的惡性細胞上過表達(Muñoz, L.等人(2001) “Interleukin-3 Receptor Alpha Chain (CD123) Is Widely Expressed In Hematologic Malignancies ,” Haematologica 86(12):1261-1269)。CD123的過表達與AML中的較差的預後有關(Tettamanti, M.S.等人(2013) “Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor ,” Br. J. Haematol. 161:389-401)。
結合人CD123並且可在本發明中採用的示例性的抗體是“CD123 MAB-1”(參見，例如PCT專利公開WO 2015/026892)。
以下顯示CD123 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:206 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMK WVRQA PGQGLEWIG D IIPSNGATFY NQKFKG RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SH LLRASWFAY W GQGTLVTVSS
以下顯示CD123 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:207 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSC KSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIY WASTR ES GVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC QNDYSY PYT FGQGTKL EIK
本發明具體包括和涵蓋這樣的CD137 x CD123 結合分子，其包括抗-CD123單克隆抗體CD123 MAB-1 或US 2017/081424和WO 2016/036937中公開的任意抗-CD123抗體或存在於JNJ-63709178 (Johnson & Johnson，同樣參見，WO 2016/036937)和XmAb14045 (Xencor，同樣參見，US 2017/081424)中的VL和/或VH結構域，和/或VL區的1個、2個或所有3個CDRL 和/或VH結構域的1個、2個或所有3個CDRH 。G. 優選的 CD137 可變結構域
根據本發明可使用任意抗-CD137抗體的表位結合位點。結合人CD137的示例性抗體包括目前在人臨床試驗中評估的“烏瑞魯單抗 ”和“utomilumab ”。烏瑞魯單抗(也稱為BMS-663513，本文指定為“CD137 MAB-1 ”)是具有IgG4/κ恆定區的全人單克隆抗體(參見，美國專利號8,137,667)。Utomilumab (也稱為PF-05082566，本文指定為“CD137 MAB-2 ”)是具有IgG2/λ恆定區的全人單克隆抗體(參見，美國專利號8,337,850)。以下提供對於人CD137免疫特異性的另外的示例性抗體(指定為“CD137 MAB-3 ”、“CD137 MAB-4 ”和“CD137 MAB-5 ”)。1.CD137 MAB-1
CD137 MAB-1 的VH結構域(CD137 MAB-1 VH )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:70 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQWGAG LLKPSETLSL TCAVYGGSFS GYYWS WIRQS PEKGLEWIG E INHGGYVTYN PSLES RVTIS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCAR DYG PGNYDWYFDL WGRGTLVTVS S
CD137 MAB-1 的VL結構域(CD137 MAB-1 VL )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:71 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SYLA WYQQKP GQAPRLLIY D ASNRAT GIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYC QQ RSNWPPALT F GGGTKVEIK2.CD137 MAB-2
CD137 MAB-2 的VH結構域(CD137 MAB-2 VH )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:72 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： EVQLVQSGAE VKKPGESLRI SCKGSGYSFS TYWIS WVRQM PGKGLEWMG K IYPGDSYTNY SPSFQG QVTI SADKSISTAY LQWSSLKASD TAMYYCAR GY GIFDY WGQGT LVTVSS
CD137 MAB-2 的VL結構域(CD137 MAB-2 VL )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:73 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： SYELTQPPSV SVSPGQTASI TC SGDNIGDQ YAH WYQQKPG QSPVLVIY QD KNRPS GIPER FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYC ATY TGFGSLAV FG GGTKLTVL3.CD137 MAB-3
CD137 MAB-3 是新的小鼠單克隆抗體。CD137 MAB-3 的VH結構域(CD137 MAB-3 VH )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:74 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWIN WVKQR PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD KATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTR DY GSSYSFDY WG QGTTLTVSS
CD137 MAB-3 VH 的CDRH 的氨基酸序列是： CDRH 1 (SEQ ID NO:154 )：SYWIN CDRH 2 (SEQ ID NO:155 )：NIYPSDSYTNYNQKFKD CDRH 3 (SEQ ID NO:156 )：DYGSSYSFDY
CD137 MAB-3 的VL結構域(CD137 MAB-3 VL )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:75 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RPSQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLRS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GDTLPYT FGG GTKLEIK
CD137 MAB-3 VL 的CDRL 的氨基酸序列是： CDRL 1 (SEQ ID NO:157 )：RPSQDISNYLN CDRL 2 (SEQ ID NO:158 )：YTSRLRS CDRL 3 (SEQ ID NO:159 )：QQGDTLPYT4.hCD137 MAB-3
將抗體CD137 MAB-3 人源化以形成抗體hCD137 MAB-3 。這種人源化抗體的VH結構域(hCD137 MAB-3 VH1 )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:76 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSSYSFDY WG QGTTVTVSS
將人源化抗體hCD137 MAB-3 的VH結構域(hCD137 MAB-3 VH1 )優化以產生具有SEQ ID NO:77 的氨基酸序列的VH結構域： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSX10 X11 X12 X13 X14 X15 WG QGTTVTVSS 其中：X10 X11 X12 X13 X14 X15 是 AYSFHP (1A；SEQ ID NO:78 )，或 AYSMST (1B；SEQ ID NO:79 )，或 AYSYSL (1C；SEQ ID NO:80 )，或 SYSYNV (1D；SEQ ID NO:81 )。
如以上指出的，相應的親本序列(存在於SEQ ID NO:74 中)是SYSFDY (SEQ ID NO:160 )。
將人源化抗體hCD137 MAB-3 的VL結構域(hCD137 MAB-3 VL )優化以產生具有SEQ ID NO:82 的氨基酸序列的VL結構域： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP X7 X8 TVKLLIY Y TSRLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK 其中：X7 是D或G；X8 是G或K。
將四個變體hCD137 MAB-3 VH1 結構域分離：hCD137 MAB-3 VH1A 、hCD137 MAB-3 VH1B 、hCD137 MAB-3 VH1C 和hCD137 MAB-3 VH1D 。以下呈現這種變體hCD137 MAB-3 VH1 結構域的氨基酸序列。
hCD137 MAB-3 VH1A 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:83 ) (CDRH 殘基以底線顯示；注意，CDR3 H的殘基5-10是AYSFHP (SEQ ID NO:78 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSFHP WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-3 VH1B 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:84 ) (CDRH 殘基以底線顯示；注意，CDR3 H的殘基5-10是AYSMST (SEQ ID NO:79 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSMST WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-3 VH1C 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:85 ) (CDRH 殘基以底線顯示；注意，CDR3 H的殘基5-10是AYSYSL(SEQ ID NO:80 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSYSL WG QGTTVTVSS
hCD137 MAB-3 VH1D 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:86 ) (CDRH 殘基以底線顯示；注意，CDR3 H的殘基5-10是SYSYNV (1D；SEQ ID NO:81 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WVKQA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSSYSYNV WG QGTTVTVSS
因此，hCD137 MAB-3 VH1A 、 hCD137 MAB-3 VH1B 、hCD137 MAB-3 VH1C 和hCD137 MAB-3 VH1D 的CDRH 1的氨基酸序列是相同的(SEQ ID NO:154 )，並且hCD137 MAB-3 VH1A 、hCD137 MAB-3 VH1B 、hCD137 MAB-3 VH1C 和hCD137 MAB-3 VH1D 的CDRH 2的氨基酸序列是相同的(SEQ ID NO:155 )。但是，hCD137 MAB-3 VH1A 、 hCD137 MAB-3 VH1B 、hCD137 MAB-3 VH1C 和hCD137 MAB-3 VH1D 的CDRH 3的氨基酸序列不同：hCD137 MAB-3 VH1A CDRH 3 (SEQ ID NO:161 )：DYGSAYSFHPhCD137 MAB-3 VH1B CDRH 3 (SEQ ID NO:162 )：DYGSAYSMSThCD137 MAB-3 VH1C CDRH 3 (SEQ ID NO:163 )：DYGSAYSYSLhCD137 MAB-3 VH1D CDRH 3 (SEQ ID NO:164 )：DYGSSYSYNV
將三個變體hCD137 MAB-3 VL 結構域分離：hCD137 MAB-3 VL1 、hCD137 MAB-3 VL2 和hCD137 MAB-3 VL3 。以下呈現這種變體hCD137 MAB-3 VL 結構域的氨基酸序列。
hCD137 MAB-3 VL1 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:87 ) (CDRL 殘基以底線顯示；注意，殘基41和殘基42分別是D和G)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-3 VL2 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:88 ) (CDRL 殘基以底線顯示；注意殘基41和殘基42皆是G)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP GGTVKLLIY Y TSRLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-3 VL3 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:89 ) (CDRL 殘基以底線顯示；注意，殘基41和殘基42分別是D和K)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
VH結構域hCD137 MAB-3 VH1B 被去免疫，如以下實施例中所描述的。以下提供命名為hCD137 MAB-3 VH1E 、hCD137 MAB-3 VH1F 和hCD137 MAB-3 VH1G 的三個所得去免疫的VH結構域的氨基酸序列，其在Kabat殘基38和/或Kabat殘基48處具有氨基酸替換。具體考慮的，識別的替換R38K和/或I48A可被併入任意公開的hCD137 MAB-3 VH結構域中。在具體實施方式中，將K38R氨基酸替換併入SEQ ID NO:76 、SEQ ID NO:77 、SEQ ID NO:83 、SEQ ID NO:84 、SEQ ID NO:85 或SEQ ID NO:86 中。
包括K38R的hCD137 MAB-3 VH1E 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:208 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WV R QA PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSMST WG QGTTVTVSS
包括I48A的hCD137 MAB-3 VH1F 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:209 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線))： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WVKQA PGQGLEW A G N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSMST WG QGTTVTVSS
包括K38R/I48A的hCD137 MAB-3 VH1G 的氨基酸序列(SEQ ID NO:210 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線))： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WV R QA PGQGLEW A G N IYPSDSYTNY NQKFKD KATI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCTR DY GSAYSMST WG QGTTVTVSS
將VL結構域hCD137 MAB-3 VL3 去免疫，如以下實施例中描述的。以下提供十二個命名為hCD137 MAB-3 VL4 -VL15 的所得去免疫的VL結構域的氨基酸序列，其在Kabat殘基24、25、44、48、52和/或54處具有氨基酸替換。具體考慮的，識別的替換R24Q、P25A、V44A、I48A、S52T、S52G和/或L54A可併入任意以上提供的所公開的hCD137 MAB-3 VL結構域中，以產生去免疫的VL結構域。在具體實施方式中，將R24Q、P25A、I48A、S52G和L54A氨基酸替換併入SEQ ID NO ： 82 、SEQ ID NO ： 87 、SEQ ID NO ： 88 或SEQ ID NO ： 89 中。在另一具體實施方式中，R24Q、P25A、I48A、S52T和L54A氨基酸替換併入SEQ ID NO ： 82 、SEQ ID NO ： 87 、SEQ ID NO ： 88 或SEQ ID NO ： 89 中。
包括R24Q/P25A的hCD137 MAB-3 VL4 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:211 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QA SQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括V44A的hCD137 MAB-3 VL5 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:212 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP DKT A KLLIY Y TSRLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括L54A的hCD137 MAB-3 VL6 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:213 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y TSR A RS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括R24Q/P25A/V44A的hCD137 MAB-3 VL7 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:214 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QA SQDIS NYLN WYQQKP DKT A KLLIY Y TSRLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括R24Q/P25A/V44A/L54A的hCD137 MAB-3 VL8 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:215 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QA SQDIS NYLN WYQQKP DKT A KLLIY Y TSR A RS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括R24Q/P25A/L54A的hCD137 MAB-3 VL9 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:216 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QA SQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y TSR A RS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括S52T的hCD137 MAB-3 VL10 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:217 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y T T RLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括S52G的hCD137 MAB-3 VL11 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:218 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y T G RLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括I48A/S52T的hCD137 MAB-3 VL12 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:219 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLL A Y Y T T RLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括I48A/S52G的hCD137 MAB-3 VL13 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:220 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RPSQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLL A Y Y T G RLRS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括R24Q/P25A/S52T/L54A的hCD137 MAB-3 VL14 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:221 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QA SQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y T T R A RS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
包括R24Q/P25A/S52G/L54A的hCD137 MAB-3 VL15 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:222 ) (CDRH 殘基以底線顯示；替換是雙底線)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QA SQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y T G R A RS GVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFC QQ GDTLPYT FGQ GTKLEIK
因此，hCD137 MAB-3 VL3-VL15 的CDRL 3的氨基酸序列是相同的(QQGDTLPYT；SEQ ID NO:159 )。但是，hCD137 MAB-3 VL4 和hCD137 MAB-3 VL6-VL15 的CDRL 1和/或CDRL 2的氨基酸序列不同：
hCD137 MAB-3 VL4 、VL7 、VL8 、VL9 、VL14 和VL15 CDRL 1 (SEQ ID NO:223 )： QA SQDISNYLNhCD137 MAB-3 VL6 、VL8 和VL9 CDRL 2 (SEQ ID NO:224 )：YTSRA RShCD137 MAB-3 VL10 和VL12 CDRL 2 (SEQ ID NO:225 )：YTT RLRShCD137 MAB-3 VL11 和VL13 CDRL 2 (SEQ ID NO:226 )：YTG RLRShCD137 MAB-3 VL14 CDRL 2 (SEQ ID NO:227 )：YTT RA RShCD137 MAB-3 VL15 CDRL 2 (SEQ ID NO:228 )：YTG RA RS
任何這種人源化、優化的、和/或去免疫的VH和VLhCD137 MAB-3 結構域的CDR、VL結構域、和/或VH結構域，包括任意上面提供的hCD137 MAB-3 VH和/或VL結構域的基因序列中所包括的，可用於形成能夠結合CD137的抗體、雙抗體或結合分子。5.CD137 MAB-4
CD137 MAB-4 是新的小鼠單克隆抗體。CD137 MAB-4 的VH結構域(CD137 MAB-4 VH )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:90 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWIN WVKQR PGQGLEWIG N IYPSDSYTNY DQKFKD KATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTK SG EYGKIGYYAM DY WGQGTSVT VSS
CD137 MAB-4 VH 的CDRH 的氨基酸序列是： CDRH 1 (SEQ ID NO:165 )：SYWIN CDRH 2 (SEQ ID NO:166 )：NIYPSDSYTNYDQKFKD CDRH 3 (SEQ ID NO:167 )：SGEYGKIGYYAMDY
CD137 MAB-4 的VL結構域(CD137 MAB-4 VL )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:91 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GNTLPYT FGG GTKLEIK
CD137 MAB-4 VL 的CDRL 的氨基酸序列是： CDRL 1 (SEQ ID NO:168 )：RASQDISNYLN CDRL 2 (SEQ ID NO:169 )：YTSRLHS CDRL 3 (SEQ ID NO:170 )：QQGNTLPYT6.hCD137 MAB-4
將抗體CD137 MAB-4 人源化，以形成抗體hCD137 MAB-4 。人源化抗體hCD137 MAB-4 的VH結構域(hCD137 MAB-4 VH1 )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:92 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWIN WVRQA PGQGLEWMG N IYPSDSYTNY DQKFKD RVTM TRDTSTSTVY MELSSLRSED TAVYYCTK SG EYGKIGYYAM DY WGQGTTVT VSS
將人源化抗體hCD137 MAB-4 的VL結構域人源化並優化，以產生VL結構域(hCD137 MAB-3 VL )，其具有SEQ ID NO:93 的氨基酸序列(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYX9 C QQ GNTLPYT FGQ GTKLEIK 其中X9 是F或Y。
將兩個變體hCD137 MAB-4 VL 結構域分離：hCD137 MAB-4 VL1 和hCD137 MAB-4 VL2 。以下呈現這種變體hCD137 MAB-4 VL 結構域的氨基酸序列。
hCD137 MAB-4 VL1 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:94 ) (CDRL 殘基以底線顯示；注意，殘基87是F)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYFC QQ GNTLPYT FGQ GTKLEIK
hCD137 MAB-4 VL2 的氨基酸序列是(SEQ ID NO:95 ) (CDRL 殘基以底線顯示；注意，殘基87是Y)： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP DKTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPYT FGQ GTKLEIK7.CD137 MAB-5
CD137 MAB-5 是新的小鼠單克隆抗體。CD137 MAB-5 的VH結構域(CD137 MAB-5 VH )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:96 ) (CDRH 殘基以底線顯示)： QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLT SYDIS WIRQP PGKGLEWLG V VWTGGGTNYN SAFMS RLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AIYYCER VDY WGQGTSVTVS S
CD137 MAB-5 VH 的CDRH S 的氨基酸序列是： CDRH 1 (SEQ ID NO:171 )：SYDIS CDRH 2 (SEQ ID NO:172 )：VVWTGGGTNYNSAFMS CDRH 3 (SEQ ID NO:173 )：VDY
CD137 MAB-5 的VL結構域(CD137 MAB-5 VL )的氨基酸序列是(SEQ ID NO:97 ) (CDRL 殘基以底線顯示)： DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP WT FGGGTKLE IK
CD137 MAB-5 VL 的CDRL S 的氨基酸序列是： CDRL 1 (SEQ ID NO:174 )：RSSQSLVHSNGNTYLH CDRL 2 (SEQ ID NO:175 )：KVSNRFS CDRL 3 (SEQ ID NO:176 )：SQSTHVPWTIII. 本發明的 CD137 x TA 結合分子
本發明特別涉及包括Fc結構域的三價 CD137 x TA 結合分子，能夠同時結合CD137和TA 的具有Fc的CD137 x TA DART®雙抗體，和能夠同時結合CD137和TA 的其他具有Fc的CD137 x TA 結合分子。本發明還涉及這種分子在治療癌症以及其他疾病和病症中的用途。雖然非優化的CD137 x TA 結合分子是完全功能化的，類似於通過密碼子優化的基因表達中獲得的改進(參見，例如Grosjean, H.等人(1982) “Preferential Codon Usage In Prokaryotic Genes: The Optimal Codon-Anticodon Interaction Energy And The Selective Codon Usage In Efficiently Expressed Genes ” Gene 18(3):199-209)，但可通過修飾或精製它們的序列進一步增強本發明的CD137 x TA 結合分子的穩定性和/或功能。A ． 具有 Fc 的CD137 x TA DART® 雙抗體
本發明特別涉及廣泛種類的能夠同時結合CD137和TA 的具有Fc的DART®雙抗體。以下描述示例性的具有Fc的CD137 x TA DART®雙抗體。
在一個實施方式中，這種具有Fc的雙抗體將包括兩條多肽鏈。如圖 2 中顯示的，這種多肽鏈中的第一多肽鏈可以在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、能夠結合“第一”抗原(CD137或TA )的表位元的輕鏈可變結構域(VL )(VL1 )、能夠結合“第二”抗原(TA ，如果選擇VL1 結合CD137的表位；CD137，如果選擇VL1 結合TA 的表位)的表位元的重鏈可變結構域(VH ) (VH2 )、含半胱氨酸的接頭、CH2-CH3結構域和C-末端。這種多肽鏈中的第二多肽鏈可以在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、能夠結合“第二”抗原(TA ，如果第一抗原是CD137；CD137，如果第一抗原是TA )的表位元的輕鏈可變結構域(VL ) (VL2 )、能夠結合“第二”抗原(TA ，如果選擇VL2 結合CD137的表位；CD137，如果選擇VL2 結合TA 的表位)的表位元的重鏈可變結構域(VH ) (VH2 )、含半胱氨酸的接頭、CH2-CH3結構域和C-末端。間插接頭肽(接頭 1 )將輕鏈可變結構域(VL1 或VL2 )與重鏈可變結構域(VH1 或VH2 )分開。
在另一實施方式中，本發明的具有Fc的雙抗體包括三條多肽鏈，並且在圖 4A-4B 中描述。這種雙抗體的第一多肽鏈包含四個結構域：(i)含VL1的結構域，(ii)含VH2的結構域，(iii)促進異源二聚化和與雙抗體的第二多肽鏈的共價結合的結構域(“異源二聚體促進結構域 ”)、和(iv)包含CH2-CH3序列的結構域。這種具有Fc的雙抗體的第二多肽鏈包含：(i)含VL2的結構域，(ii)含VH1的結構域和(iii)促進異源二聚化和與雙抗體的第一多肽鏈的共價結合的結構域(“異源二聚體促進結構域 ”)。這種具有Fc的雙抗體的第三多肽鏈包括CH2-CH3序列。因此，這種具有Fc的雙抗體的第一和第二多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第一表位(1)的VL1/VH1結合位點以及能夠結合第二表位(2)的VL2/VH2結合位點。本發明的優選的具有Fc的雙抗體是這樣的CD137 x TA 雙特異性雙抗體，其能夠結合可以是CD137或TA 的“第一表位”，和“第二表位”，當第一表位是CD137時“第二表位”是TA ，並且當第一表位是TA 時“第二表位”是CD137。將第一和第二多肽通過一個或多個包括半胱氨酸殘基的二硫鍵在其各自的接頭和/或第三結構域中彼此結合。值得注意地，第一和第三多肽鏈彼此複合以形成經由二硫鍵穩定化的Fc結構域。這種雙抗體具有增強的效力。本發明的優選的具有Fc的雙抗體可具有兩個取向中的任一個取向(表 2 )： ( – © –表示含有半胱氨酸的多肽結構域，其具有一個、兩個或多於兩個的半胱氨酸殘基。該表示意欲是例證性和非限制性的。半胱氨酸殘基可出現在另外的或可替選的結構域中，如在異源二聚體促進結構域(HPD)中)
如圖 4A 中顯示，在第一實施方式中，這種三條多肽鏈的第一多肽鏈可在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合“第一”抗原 (CD137或TA )的表位元的輕鏈可變結構域(VL ) (VL1 )，能夠結合“第二”抗原 (如果第二抗原是CD137 ，TA 作為第一抗原；如果第二抗原是TA ，CD137作為第一抗原)的表位元的重鏈可變結構域(VH ) (VH2 )、含半胱氨酸的結構域、異源二聚體促進結構域、第二含半胱氨酸的結構域、CH2-CH3結構域和C-末端。間插接頭肽(接頭 1 )將輕鏈可變結構域(VL1 )與重鏈可變結構域(VH2 )分開。優選地，重鏈可變結構域(VH1 )通過間插接頭肽(接頭 2 )連接至異源二聚體促進結構域。在優選的CD137 x TA 雙特異性具有Fc的雙抗體實施方式中，異源二聚體促進結構域的C-末端通過間插接頭肽(接頭 3 )或通過間插間隔肽(接頭 3 )連接至Fc區的CH2-CH3結構域(“Fc 結構域 ”)。最優選地，三條多肽鏈的第一多肽鏈將因而在N-末端至C-末端方向包含：VL1-接頭1-VH2-接頭2-異源二聚體促進結構域-接頭3- Fc結構域。
這種三條多肽鏈的第二多肽鏈將沿著N-末端至C-末端方向包含：N-末端、能夠結合“第二”抗原的表位元的輕鏈可變結構域(VL ) (VL2 )、能夠結合“第一”抗原的表位元的重鏈可變結構域(VH ) (VH1 )、含半胱氨酸的結構域、異源二聚體促進結構域和C-末端。間插接頭肽(接頭 1 )將輕鏈可變結構域(VL2 )與重鏈可變結構域(VH1 )分開。優選地，重鏈可變結構域(VH1 )通過間插接頭肽(接頭 2 )連接至異源二聚體促進結構域。最優選地，三條多肽鏈的第二多肽鏈將因而在N-末端至C-末端方向包含：VL2-接頭1-VH1-接頭2-異源二聚體促進結構域。
這種三條多肽鏈的第三多肽鏈將在N-末端至C-末端方向包含：含半胱氨酸的肽(如接頭 3 )、和Fc區的CH2-CH3結構域(“Fc結構域”)。因為第三多肽鏈不包括VL結構域或VH結構域，故第三多肽鏈在本發明的兩種或更多種不同的CD137 x TA 雙特異性Fc雙抗體之間可以是相同的。
可替選地，如圖 4B 中顯示，在第二實施方式中，這種三條多肽鏈的第一多肽鏈將在N-末端至C-末端方向包含：N-末端、含半胱氨酸的肽(如接頭 3 )、Fc區的CH2-CH3結構域(“Fc 結構域 ”)、間插間隔肽(接頭 4 )、能夠結合“第一”抗原(CD137或TA )的表位元的輕鏈可變結構域(VL ) (VL1 )、能夠結合“第二”抗原的表位(TA ，如果第一抗原是CD137；CD137，如果第一抗原是TA )的重鏈可變結構域(VH ) (VH2 )、含半胱氨酸的接頭、異源二聚體促進結構域和C-末端。間插接頭肽(接頭 1 )將輕鏈可變結構域(VL1 )與重鏈可變結構域(VH2 )分開。優選地，重鏈可變結構域(VH1 )通過間插接頭肽(接頭 2 )連接至異源二聚體促進結構域。最優選地，在這種可替選的取向中，三條多肽鏈的第一多肽鏈將因而在N-末端至C-末端方向包含：接頭3-Fc結構域-接頭4-VL1-接頭1-VH2-接頭2-異源二聚體促進結構域。這種可替選的雙抗體的第二和第三多肽鏈可以與第一實施方式的第二和第三多肽鏈相同。
在每個上述實施方式中，配合選擇第一多肽鏈的輕鏈可變結構域(VL1 )，以允許其與第二多肽鏈的重鏈可變結構域(VH1 )相互作用，從而形成能夠免疫特異性結合第一抗原(即，TA 或CD137)的表位的功能性表位結合位點。同樣地，配合選擇第二多肽鏈的輕鏈可變結構域(VL2 )，以允許其與第一多肽鏈的重鏈可變結構域(VH2 )相互作用，從而形成能夠免疫特異性結合第二抗原(即，TA 或CD137)的表位的功能性表位結合位點。因而，輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的選擇是配合的，以使該兩條多肽鏈共同包括能夠結合CD137和TA 的表位結合位點。
本發明優選的具有Fc的雙抗體共價結合具有四個表位結合位點的四價雙抗體，其包括四條多肽鏈，並且描述在圖 3A-3C 中。這種雙抗體的第一和第三多肽鏈包含：(i)含VL1的結構域、(ii)含VH2的結構域、(iii)異源二聚體促進結構域和(iv)含CH2-CH3序列的結構域。第二和第四多肽鏈包含：(i)含VL2的結構域，(ii)含VH1的結構域和(iii)異源二聚體促進結構域，其中異源二聚體促進結構域促進第一/第三多肽鏈與第二/第四多肽鏈的二聚化和共價結合。優選地，VH結構域通過間插接頭肽(接頭 2 )連接至異源二聚體促進結構域。在優選的CD137 x TA 雙特異性具有Fc的雙抗體實施方式中，第一多肽鏈的異源二聚體促進結構域的C-末端通過間插接頭肽(接頭 3 )或通過間插間隔肽(接頭 3 )連接至CH2-CH3結構域。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域，與第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以是相同的或不同的，以允許是單特異性、雙特異性或三特異性的四價結合。標注“VL3 ”和“VH3 ”分別表示結合這種雙抗體的“第三”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。類似地，標注“VL4 ”和“VH4 ”分別表示結合這種雙抗體的“第四”表位元的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域。本發明的代表性四鏈雙特異性含Fc區的雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表 3 中： ( – © –表示含半胱氨酸的多肽結構域，其具有一個、兩個或多於兩個的半胱氨酸殘基。該表示意欲是例證性和非限制性的。半胱氨酸殘基可出現在另外的或可替選的結構域中，如異源二聚體促進結構域(HPD)中)
在優選的實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子是雙特異性的、四價(即，具有四個表位結合位點)、具有Fc的雙抗體，其包括總共四條多肽鏈(圖 3A-3C )。本發明的CD137 x TA 結合分子是雙特異性的、四價、具有Fc的雙抗體，其包括對於CD137免疫特異性的兩個表位結合位點(其能夠結合CD137的相同表位或CD137的不同表位)，和對於腫瘤抗原免疫特異性的兩個表位結合位點(其能夠結合TA的相同表位或TA的不同表位或不同TA的不同表位)。
本發明另外優選的具有Fc的雙抗體包括五條多肽鏈，並且描述在圖 5A-5D 中。這種雙抗體的第一多肽鏈含有：(i)含VH1的結構域，(ii)含CH1的結構域，和(iii)含CH2-CH3序列的結構域。第一多肽鏈可以是含有VH1和重鏈恆定區的抗體的重鏈。這種雙抗體的第二和第五多肽鏈含有：(i)含VL1的結構域，和(ii)含有CL的結構域。這種雙抗體的第二和/或第五多肽鏈可以是含有與第一/第三多肽鏈的VH1互補的VL1的抗體的輕鏈。第一、第二和/或第五多肽鏈可從天然發生的抗體中分離。可替選地，它們可被重組構建。在優選的實施方式中，第二和第五多肽鏈具有相同的氨基酸序列。這種雙抗體的第三多肽鏈含有：(i)含VH1的結構域，(ii)含CH1的結構域，(iii)含CH2-CH3序列的結構域，(iv)含VL2的結構域，(v)含VH3的結構域和(vi)異源二聚體促進結構域，其中異源二聚體促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這種雙抗體的第四多肽含有：(i)含有VL3的結構域，(ii)含VH2的結構域和(iii)促進異源二聚化並且共價結合雙抗體的第三多肽鏈的結構域。優選地，第三和第四多肽鏈的含VH3的結構域和含VH2的結構域的C-末端通過間插接頭肽(接頭 2 )連接至異源二聚體促進結構域，並且第三多肽鏈的CH2-CH3結構域的C-末端通過間插接頭肽(接頭 4 )連接至含VL2的結構域。
因此，這種雙抗體的第一和第二多肽鏈以及第三和第五多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第一表位的兩個VL1/VH1結合位點。這種雙抗體的第三和第四多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第二表位的VL2/VH2結合位點，以及能夠結合第三表位的VL3/VH3結合位點。第一和第三多肽通過它們各自恆定區中的涉及半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。注意，第一和第三多肽鏈彼此複合，以形成Fc區。這種雙特異性雙抗體具有增強的效力。圖 5A-5D 闡釋了這種雙抗體的結構。應理解，VL1/VH1、VL2/VH2以及VL3/VH3結構域可以相同或不同，從而允許單特異性、雙特異性或三特異性的結合。但是，如本文提供的，優選地選擇這些結構域以便結合CD137和TA 。
選擇多肽鏈的VL和VH結構域，以形成對於期望的表位特異性的VL/VH結合位點。通過締合多肽鏈形成的VL/VH結合位點可以相同或不同，從而允許是單特異性、雙特異性、三特異性或四特異性的四價結合。特別地，可選擇VL和VH結構域，使得雙特異性雙抗體可包括用於第一表位的兩個結合位點和用於第二表位的兩個結合位點，或用於第一表位的三個結合位點和用於第二表位的一個結合位點，或用於第一表位的兩個結合位點、用於第二表位的一個結合位點和用於第三表位的一個結合位點(如圖 5A-5D 中描繪)。本發明的代表性五鏈含Fc區的雙抗體的多肽鏈的一般結構提供在表 4 中： ( – © –表示含有半胱氨酸的多肽結構域，其具有一個、兩個或多於兩個的半胱氨酸殘基。該表示意欲是例證性和非限制性的。半胱氨酸殘基可出現在另外的或可替選的結構域中，如異源二聚體促進結構域(HPD)中)
在優選的實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子是雙特異性的、四價(即，具有四個表位結合位點)、具有Fc的雙抗體，其包括總共五條多肽鏈，所述多肽鏈具有對於CD137免疫特異性的兩個表位結合位點(其可以能夠結合CD137的相同表位或CD137的不同表位)，和對於TA 免疫特異性的兩個表位結合位點(其可以能夠結合TA 的相同表位或TA 的不同表位或不同TA 的不同表位)。在另一實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子是雙特異性的、四價、具有Fc的雙抗體，其包括對於CD137免疫特異性的三個表位結合位點(其能夠結合CD137的相同表位或CD137的兩個或三個不同的表位)，以及對於TA 特異性的一個表位結合位點。B . 三價 CD137 x TA 結合分子
在一個實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子是三價的並且包括第一表位結合位點(例如VL1和VH1)、第二表位結合位點(例如VL2和VH2)，和第三表位結合位點(例如VL3和VH3)，並且因此能夠結合TA 的表位、CD137的表位和第三表位，該第三表位可以是： (a)TA 的相同的或不同的表位； (b) CD137的相同的或不同的表位；或 (c) 不同TA 的表位。
優選地，本發明的這種“三價 CD137 x TA 結合分子 ”包括對於CD137的表位(該表位可以相同或不同)的兩個表位結合位點，和對於TA 的表位的一個表位結合位點。
通常，本發明的這種三價 CD137 x TA 結合分子包括三條、四條、五條或多於五條的多肽鏈，其通過這種多肽對之間的一個或多個二硫鍵，形成包括“ 雙抗體型結合結構域 ” 和“ 非雙抗體型結合結構域 ” 的共價鍵合的分子複合物。
“ 雙抗體型結合結構域 ”是雙抗體，並且尤其是DART®雙抗體的表位-結合結構域。上面已經討論了術語“雙抗體 ”和“DART® 雙抗體 ”。“非雙抗體型 ” 結合結構域 意欲表示不具有雙抗體型結合結構域的結構的結合結構域。優選地，非雙抗體型結合結構域是Fab 型結合結構域 或ScFv 型結合結構域 。如本文使用的，術語“Fab 型結合結構域 ”指通過免疫球蛋白輕鏈的VL結構域和免疫球蛋白重鏈的互補VH結構域相互作用而形成的表位-結合結構域。Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域的不同在於形成Fab型結合結構域的兩條多肽鏈僅僅包括單個表位-結合結構域，而形成雙抗體型結合結構域的兩條多肽鏈包括至少兩個表位-結合結構域。ScFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域的不同在於相同多肽鏈的VL和VH結構域相互作用而形成表位-結合結構域。因此，如本文所使用，Fab型結合結構域和ScFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域不同。
因此，本發明的三價 CD137 x TA 結合分子優選地包括： (I) 能夠免疫特異性結合“第一”表位的“第一”表位元-結合結構域； (II) 能夠免疫特異性結合“第二”表位的“第二”表位元-結合結構域； (III) 能夠免疫特異性結合“第三”表位的“第三”表位元-結合結構域；和 (IV) 通過使兩個CH2-CH3結構域彼此締合而形成的Fc結構域； 其中： (A) “第一”表位元-結合結構域和“第二”表位元-結合結構域都是雙抗體型結合結構域； (B) “第三”表位元-結合結構域是非雙抗體型結合結構域；並且 (C) 這種“第一”、“第二”或“第三”表位元-結合結構域之一結合TA 的表位，並且這種“第一”、“第二”或“第三”表位元-結合結構域的另一個結合CD137的表位；
被剩餘的表位-結合結構域結合的表位元可以是任何期望的表位，優選CD137的表位。這種表位可以與被分子的其他表位-結合結構域結合的CD137表位相同或不同。
圖 6A-6H 提供了優選的三價 CD137 x TA 結合分子的結構域的圖形表示。圖 6A-6D 示意性說明了優選的三價 CD137 x TA 結合分子的結構域，其包括共價複合的四條多肽鏈，並且具有一個非雙抗體型結合位點(VL3/VH3並且因此對於這種表位是單價的)，和兩個雙抗體型結合位點(VL1/VH1和VL2/VH2，並且因此對於這種表位中的每一個表位是單價的)。圖 6E-6H 示意性說明了優選的三價 CD137 x TA 結合分子的結構域，其包括共價複合的三個多肽鏈，並且具有一個非雙抗體型結合位點(VL3/VH3並且因此對於這種表位是單價的)，和兩個雙抗體型結合位點(VL1/VH1和VL2/VH2，並且因此對於這種表位中的每一個表位是單價的)。圖 6A-6H 中顯示的非雙抗體型結合位點在圖 6A-6D 中是Fab 型結合結構域 並且在圖 6E-6H 中是scFv 型結合結構域 。如下面提供的，通過締合多肽鏈形成的VL/VH結合位點可以是相同的或不同的，從而允許單特異性、雙特異性或三特異性的三價結合。IV. 示例性 的 CD137 x TA 結合分子
本發明提供了CD137 x TA 結合分子，其是能夠同時和特異性結合CD137和TA 的雙特異性四價Fc雙抗體。如上所指示，本發明的CD137 x TA 結合分子可包括四條或五條多肽鏈。下面提供了能夠結合CD137和TA ，HER2/neu的七個示例性的CD137 x TA 結合分子的多肽鏈(分別命名為“DART-A ”、“DART-B ”、“DART-C ”、“DART-D” 、 “DART-E ”、“DART-F ”、“DART-G ”、“DART-G1 ”、“DART-G2 ”、“DART-G3 ”和“DART-G4 ”)。本發明進一步提供了CD137 x TA 結合分子，其是能夠同時和特異性結合CD137和TA 的雙特異性三價結合分子。如上所指示，本發明的三價 CD137 x TA 結合分子可包括四條多肽鏈。下面提供了能夠結合CD137和TA ，HER2/neu的示例的CD137 xTA 三特異性結合分子，和其優化的變體的多肽鏈(分別命名為“TRIDENT-A ”、“TRIDENT-A1 ”、“TRIDENT-A2 ”、“TRIDENT-A3 ”、“TRIDENT-A5 ”、“TRIDENT-B ”、“TRIDENT-B2 ”和“TRIDENT-B5 ”)。A .DART-A
DART-A 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同並且第二和第四多肽鏈相同(參見圖 3B )。
DART-A 的第一和第三多肽鏈沿著N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VL結構域(VLHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:38 ))、接頭(LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30 ))、基本上缺少效應子功能的示例性的人IgG1的CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:40 )和C-末端：
DART-A 的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:98 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIN TYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLVEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKLE PKSADKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
因此，DART-A 的第一和第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:40 。
DART-A 的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 (hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu (hHER2 MAB-1 VH1 ，SEQ ID NO:64 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:39 )和C-末端。
因此，DART-A 的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:87 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 。
DART-A 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:99 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGL EWMGWINTNI GEPTYTEEFK GRVTMTRDTS ISTAYMELSR LRSDDTAVYY CARDDGYGNR VSYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKEB .DART-B
DART-B 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同並且第二和第四多肽鏈相同(參見圖 3B )。
DART-B 的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VL結構域(VLHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:38 ))、接頭(LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30 ))、基本上缺少效應子功能的示例性的人IgG1的CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:40 )和C-末端。
因此，DART-B 的第一和第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:40 。
DART-B 的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:100 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKLE PKSADKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
DART-B 的第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu (hHER2 MAB-1 VH1 ，SEQ ID NO:64 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:39 )和C-末端。
因此，DART-B 的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 。
DART-B 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:101 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGL EWMGWINTNI GEPTYTEEFK GRVTMTRDTS ISTAYMELSR LRSDDTAVYY CARDDGYGNR VSYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKEC.DART-C
DART-C 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同並且第二和第四多肽鏈相同(見圖 3B )。
DART-C 的第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:38 ))、接頭(LEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:30 ))、基本上缺少效應子功能的示例性的人IgG1的CH2-CH3結構域(SEQ ID NO:40 )和C-末端。
因此，DART-C 的第一和第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:40 。
DART-C 的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:102 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGL EWMGWINTNI GEPTYTEEFK GRVTMTRDTS ISTAYMELSR LRSDDTAVYY CARDDGYGNR VSYWGQGTLV TVSSGGCGGG EVAACEKEVA ALEKEVAALE KEVAALEKLE PKSADKTHTC PPCPAPEAAG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG
DART-C 的第二和第四多肽鏈在以N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VL結構域(VLHER2/neu (hHER2 MAB-1 VL3 ，SEQ ID NO:69 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:39 )和C-末端。
因此，DART-C 的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 。
DART-C 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:103 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKED .DART-D
DART-D 包括五條多肽鏈，其中第二條鏈和第五條鏈相同(參見，圖 5A ，其中VL2/VH2與VL3/VH3相同，和圖 5B )。
DART-D 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 ))、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )、人IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO:7 )，和“具有臼的” CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:47 )。
因此，DART-D 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:47 。
DART-D 的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:104 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
DART-D 的第二和第五多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VL結構域(VLHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 ))、人IgG CLκ結構域(SEQ ID NO:1 )和C-末端。
因此，DART-D 的第二和第五多肽鏈包括：SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:1 。
DART-D 的第二和第五多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:105 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
DART-D 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VH1 ，SEQ ID NO:64 ))、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )、人IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO:7 )、“具有杵的”CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:44 )、間插接頭肽(GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:36 )和C-末端。
因此，DART-D 的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:44─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:75 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:74─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:36 。
DART-D 的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:106 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQTTSSL SASLGDRVTI SCRPSQDISN YLNWYQQKPD GTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDY SLTISNLEQE DIATYFCQQG DTLPYTFGGG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ PGAELVRPGA SVKLSCKASG YTFTSYWINW VKQRPGQGLE WIGNIYPSDS YTNYNQKFKD KATLTVDKSS STAYMQLSSP TSEDSAVYYC TRDYGSSYSF DYWGQGTTLT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK
DART-D 的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E) (SEQ ID NO:37 )和C-末端。
因此，DART-D 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:75 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:74 ─ SEQ ID NO:18─ SEQ ID NO:37 。
DART-D 的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:107 )： DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRPSQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWIN WVKQRPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS PTSEDSAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTL TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKEE .DART-E
DART-E 包括五條多肽鏈，其中第二條鏈和第五條鏈相同(參見，圖 5A ，其中VL2/VH2與VL3/VH3相同，和圖 5C )。
DART-E 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 ))、IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )、IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7 )、“具有臼的”CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:47 )和C-末端。
因此，DART-E 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:74 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:47 。
DART-E 的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:108 )： QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTRDY GSSYSFDYWG QGTTLTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
DART-E 的第二和第五多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137u ) (CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 ))、人IgG CLκ結構域(SEQ ID NO:1 )和C-末端。
因此，DART-E 的第二和第五多肽鏈包括：SEQ ID NO:75 ─ SEQ ID NO:1 。
DART-E 的第二和第五多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:109 )： DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRPSQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
DART-E 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (CD137 MAB-3 VH ，SEQ ID NO:74 ))、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )、人IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO:7 )、“具有杵的”CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:44 )、間插接頭肽(GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24 ))、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VL結構域(VLHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:36 )和C-末端。
因此，DART-E 的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:74 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:44─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:36 。
DART-E 的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:110 )： QVQLQQPGAE LVRPGASVKL SCKASGYTFT SYWINWVKQR PGQGLEWIGN IYPSDSYTNY NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCTRDY GSSYSFDYWG QGTTLTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCKASQDISN YLSWFQQKPG KAPKTLIYRA NRLQSGVPSR FSGSGSGTDF TLTISSLQPE DFATYYCLQH DEFPWTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLVQ SGAEVKKPGA SVKVSCKASG YTFTNYGMNW VRQAPGQGLE WMGWINTNIG EPTYTEEFKG RVTMTRDTSI STAYMELSRL RSDDTAVYYC ARDDGYGNRV SYWGQGTLVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK
DART-E 的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VL結構域(VLHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E) (SEQ ID NO:37 )和C-末端。
因此，DART-E 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:18─ SEQ ID NO:37 。
DART-E 的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:111 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTNYGMN WVRQAPGQGL EWMGWINTNI GEPTYTEEFK GRVTMTRDTS ISTAYMELSR LRSDDTAVYY CARDDGYGNR VSYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKEF .DART-F
DART-F 包括五條多肽鏈，其中第二條鏈和第五條鏈相同(參見，圖 5A ，其中VL2/VH2與VL3/VH3相同，和圖 5B )。
DART-F 的第一多肽鏈與DART-D 的第一多肽鏈相同(SEQ ID NO:104 )。
DART-F 的第二和第五多肽鏈與DART-D 的第二和第五多肽鏈相同(SEQ ID NO:105 )。
DART-F 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 ))、IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )、IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7 )、“具有杵的”CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:44 )、間插接頭肽(GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:36 )和C-末端。
因此，DART-F 的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:44 ─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:91 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:90 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:36 。
DART-F 的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:112 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQTTSSL SASLGDRVTI SCRASQDISN YLNWYQQKPD GTVKLLIYYT SRLHSGVPSR FSGSGSGTDY SLTISNLEQE DIATYFCQQG NTLPYTFGGG TKLEIKGGGS GGGGQVQLQQ PGAELVRPGA SVKLSCKASG YTFTSYWINW VKQRPGQGLE WIGNIYPSDS YTNYDQKFKD KATLTVDKSS STAYMQLSSP TSEDSAVYYC TKSGEYGKIG YYAMDYWGQG TSVTVSSGGC GGGEVAALEK EVAALEKEVA ALEKEVAALE K
DART-F 的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E) (SEQ ID NO:37 )和C-末端。
因此，DART-F 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:91 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:90─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 。
DART-F 的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:113 )： DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPYTFGG GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ QPGAELVRPG ASVKLSCKAS GYTFTSYWIN WVKQRPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYDQKFK DKATLTVDKS SSTAYMQLSS PTSEDSAVYY CTKSGEYGKI GYYAMDYWGQ GTSVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KEG .DART-G
DART-G 包括五條多肽鏈，其中第二條鏈和第五條鏈相同(參見，圖 5A ，其中VL2/VH2與VL3/VH3相同，和圖 5B )。
DART-G 的第一多肽鏈與DART-D 的第一多肽鏈相同(SEQ ID NO:104 )。
DART-G 的第二和第五多肽鏈與DART-D 的第二和第五多肽鏈相同(SEQ ID NO:105 )。
DART-G 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 ))、IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )、IgG1鉸鏈結構域(SEQ ID NO:7 )、“具有杵的”CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:44 )、間插接頭肽(GGGSGGGSGGG (SEQ ID NO:24 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:36 )和C-末端。
因此，DART-G 的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:44 ─ SEQ ID NO:24 ─ SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:36 。
DART-G 的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:114 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQLVQ SGAEVKKPGA SVKVSCKASG YTFTSYWINW VKQAPGQGLE WIGNIYPSDS YTNYNQKFKD KATITADKST STAYMELSSL RSEDTAVYYC TRDYGSSYSF DYWGQGTTVT VSSGGCGGGE VAALEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK
可採用可替選的DART-G 第三多肽鏈，其中SEQ ID NO:76 (能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ))的氨基酸殘基被SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A)、SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B)、SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C)或SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D)的氨基酸殘基替換。下面描述包括這種多肽鏈的優化的分子。DART-G 的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；GGCGGG (SEQ ID NO:18 ))、異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E) (SEQ ID NO:37 )和C-末端。
因此，DART-G 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 。
DART-G 的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:119 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSSYS FDYWGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
可採用可替選的DART-G 第四多肽鏈，其中SEQ ID NO:76 (能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ))的氨基酸殘基被SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A)、SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B)、SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C)或SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D)的氨基酸殘基替換。下面描述包括這種多肽鏈的優化的分子。H . 優化的 DART-G
命名為“DART-G1 ”、“DART-G2 ”、“DART-G3 ”和“DART-G4 ”的DART-G的優化的變體包括五條多肽鏈，並且含有抗體hHER2 MAB-1 (1.3 )的HER2/neu結合結構域和任意抗體hCD137 MAB-3 (1A.3 )-(1D.3 )的CD137結合結構域。
DART-G 的這種優化的變體的第一多肽鏈具有與DART-G 的第一多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )。
DART-G 的這種優化的變體的第二和第五多肽鏈具有與DART-G 的第二和第五多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:105 )。
DART-G 的這種優化的變體的第三和第四多肽鏈具有SEQ ID NO:115 和SEQ ID NO:120 的氨基酸序列(DART-G1 )；SEQ ID NO:116 和SEQ ID NO:121 的氨基酸序列(DART-G2 )；SEQ ID NO:117 和SEQ ID NO:122 的氨基酸序列(DART-G3 )；或SEQ ID NO:118 和SEQ ID NO:123 (DART-G4 )的氨基酸序列，如下面所提供。
包括SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A)的優化的DART-G1 的第三多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:115 ： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTSYWI NWVKQAPGQG LEWIGNIYPS DSYTNYNQKF KDKATITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCTRDYGS AY SFHP WGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
包括SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B)的優化的DART-G2 的第三多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:116 ： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTSYWI NWVKQAPGQG LEWIGNIYPS DSYTNYNQKF KDKATITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCTRDYGS AY SMST WGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
包括SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C)的優化的DART-G3 的第三多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:117 ： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTSYWI NWVKQAPGQG LEWIGNIYPS DSYTNYNQKF KDKATITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCTRDYGS AY SYSL WGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
包括SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D)的優化的DART-G4 的第三多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:118 ： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGGG GSGGGSGGGD IQMTQSPSSL SASVGDRVTI TCRPSQDISN YLNWYQQKPD KTVKLLIYYT SRLRSGVPSR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYFCQQG DTLPYTFGQG TKLEIKGGGS GGGGQVQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTSYWI NWVKQAPGQG LEWIGNIYPS DSYTNYNQKF KDKATITADK STSTAYMELS SLRSEDTAVY YCTRDYGS SY SYNV WGQGTT VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEK
包括SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A)優化的DART-G1 的第四多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:120 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS FHP WGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
包括SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B)的優化的DART-G2 的第四多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:121 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS MST WGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
包括SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C)的優化的DART-G3 的第四多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:122 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS YSL WGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
包括SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D)的優化的DART-G4 的第四多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:123 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS SYS YNV WGQGTTV TVSSGGCGGG KVAALKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKEI .TRIDENT-A
TRIDENT-A 是三價CD137 x CD137 x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和一個用於示例性的TA ，HER2/neu的結合位點。TRIDENT-A 包括四條多肽鏈(參見，圖 6A ，其中VL1/VH1 (位點A)與VL2/VH2 (位點B)相同並且結合CD137，並且VL3/VH3 (位點C)結合HER2/neu)。
TRIDENT-A 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；ASTKG (SEQ ID NO:19 ))、含半胱氨酸的異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:38 ))、間插接頭肽(GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21 ))、“具有杵的”CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:44 )和C-末端。
因此，TRIDENT-A 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:19 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:44 。
TRIDENT-A 的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:192 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS SYS FDY WGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
TRIDENT-A 的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；ASTKG (SEQ ID NO:19 ))、含半胱氨酸的異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:39 ))和C-末端。
因此，TRIDENT-A 的第二多肽鏈包括：SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:19 ─ SEQ ID NO:39 。
TRIDENT-A 的第二多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:197 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS SYS FDY WGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
可採用可替選的TRIDENT-A 第一和第二多肽鏈，其中SEQ ID NO:76 (能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ))的氨基酸殘基被SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A)、SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B)、SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C)、SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D)、SEQ ID NO:208 (hCD137 MAB-3 VH1E)、SEQ ID NO:209 (hCD137 MAB-3 VH1F)或SEQ ID NO:210 (hCD137 MAB-3 VH1G)的氨基酸殘基替換和/或SEQ ID NO:89 (能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VHCD137 ))的氨基酸殘基被SEQ ID NO:211 (hCD137 MAB-3 VL4)、SEQ ID NO:212 (hCD137 MAB-3 VL5)、SEQ ID NO:213 (hCD137 MAB-3 VL6)、SEQ ID NO:214 (hCD137 MAB-3 VL7)、SEQ ID NO:215 (hCD137 MAB-3 VL8)、SEQ ID NO:216 (hCD137 MAB-3 VL9)、SEQ ID NO:217 (hCD137 MAB-3 VL10)、SEQ ID NO:218 (hCD137 MAB-3 VL11)、SEQ ID NO:219 (hCD137 MAB-3 VL12)、SEQ ID NO:220 (hCD137 MAB-3 VL13)、SEQ ID NO:221 (hCD137 MAB-3 VL14)或SEQ ID NO:222 (hCD137 MAB-3 VL15)的氨基酸殘基替換。下面描述了包括許多這種多肽鏈的優化的/去免疫的分子。
TRIDENT-A 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VH結構域(VHHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 ))、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )、人IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO:7 )，和“具有臼的” CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:47 )。因此，TRIDENT-A 的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO:64 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:47 ，並且具有與上面提供的DART-D 的第一多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:104 )。
TRIDENT-A 的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合HER2/neu的單克隆抗體的VL結構域(VLHER2/neu ) (hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 ))、人IgG CLκ結構域(SEQ ID NO:1 )和C-末端。因此，TRIDENT-A 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:1 ，並且具有與上面提供的DART-D 的第二和第五多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO ： 105 )。1. 優化的 TRIDENT-A 變體
命名為“TRIDENT-A1 ”、“TRIDENT-A2 ”、“TRIDENT-A3 ”和“TRIDENT-A4 ”的TRIDENT-A 的優化變體包括四條多肽鏈，並且含有抗體hHER2 MAB-1 (1.3 )的HER2/neu結合結構域和任意抗體hCD137 MAB-3 (1A.3 )-(1D.3 )的CD137結合結構域。
這種優化的TRIDENT-A 的第三多肽鏈具有與TRIDENT-A 的第三多肽鏈相同的氨基酸序列，其如上所述與DART-D 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:104 )相同。
這種優化的TRIDENT-A 的第四多肽鏈具有與TRIDENT-A 的 第四多肽鏈相同的氨基酸序列，其如上所述與DART-D 的第二和第五多肽鏈(SEQ ID NO:105 )相同。
這種優化的TRIDENT-A 變體的第一和第二多肽鏈具有SEQ ID NO:193 和SEQ ID NO:198 (TRIDENT-A1 )；SEQ ID NO:194 和SEQ ID NO:199 (TRIDENT-A2 )；SEQ ID NO:195 和SEQ ID NO:200 (TRIDENT-A3 )；或SEQ ID NO:196 和SEQ ID NO:201 (TRIDENT-A4 )的氨基酸序列，如下面所提供。
包括SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A)的TRIDENT-A1 的第一多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:193 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS FHP WGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
包括SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B)的TRIDENT-A2 的第一多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:194 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS MST WGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
包括SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C)的TRIDENT-A3 的第一多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:195 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS YSL WGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
包括SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D)的TRIDENT-A4 的第一多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:196 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS SYS YNV WGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
包括SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A)的TRIDENT-A1 的第二多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:198 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS FHP WGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
包括SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B)的TRIDENT-A2 的第二多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:199 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS MST WGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
包括SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C)的TRIDENT-A3 的第二多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:200 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS AYS YSL WGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
包括SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D)的TRIDENT-A4 的第二多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:201 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRPSQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WVKQAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGS SYS YNV WGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE 2. 去免疫的 TRIDENT-A 變體
去免疫的TRIDENT-A 變體包括四條多肽鏈，並且含有抗體hHER2 MAB-1 (1.3 )的HER2/neu結合結構域和任意hCD137 MAB-3 VH1E-VH1G 的CD137 VH結構域以及任意hCD137 MAB-3 VL4-VL15 的CD137 VL結構域。
命名為“TRIDENT-A5 ”的TRIDENT-A 的示例性的去免疫變體包括四條多肽鏈，並且含有抗體hHER2 MAB-1 (1.3 )的HER2/neu結合結構域和任意抗體hCD137 MAB-3 (1E.15 )的CD137結合結構域。
TRIDENT-A5 (包括hCD137 MAB-3 VH1E 和hCD137 MAB-3 VL15 )的第一多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:229 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QA SQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIY YT G R A RSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WV R QAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSSASTKGE VAACEKEVAA LEKEVAALEK EVAALEK GGG DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLWCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK
TRIDENT-A5 (包括hCD137 MAB-3 VH1E 和hCD137 MAB-3 VL15 )的第二多肽鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO:230 ： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC QA SQDIS NYLNWYQQKP DKTVKLLIY YT G R A RSGVPS RFSGSGSGTD FTFTISSLQP EDIATYFCQQ GDTLPYTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLV QSGAEVKKPG ASVKVSCKAS GYTFTSYWIN WV R QAPGQGL EWIGNIYPSD SYTNYNQKFK DKATITADKS TSTAYMELSS LRSEDTAVYY CTRDYGSAYS MSTWGQGTTV TVSSASTKGK VAACKEKVAA LKEKVAALKE KVAALKE
這種去免疫的TRIDENT-A5 的第三多肽鏈具有與TRIDENT-A 的第三多肽鏈相同的氨基酸序列，其如上所述與DART-D 的第一多肽鏈(SEQ ID NO:104 )相同。
這種去免疫的TRIDENT-A5 的第四多肽鏈具有與TRIDENT-A 的第四多肽鏈相同的氨基酸序列，其如上所述與DART-D 的第二和第五多肽鏈(SEQ ID NO:105 )相同。J .TRIDENT-B
TRIDENT-B 是三價CD137 x CD137 x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和對於示例性TA ，5T4的一個結合位點。TRIDENT-B 包括四條多肽鏈(參見，圖 6A ，其中VL1/VH1 (位點A)與VL2/VH2 (位點B)相同並且結合CD137，並且VL3/VH3 (位點C)結合5T4)。
TRIDENT-B 的第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；ASTKG (SEQ ID NO:19 ))、含半胱氨酸的異源二聚體促進(E-螺旋)結構域( E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:38 ))、間插接頭肽(GGGDKTHTCPPCP (SEQ ID NO:21 ))、“具有杵的”CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:44 )和C-末端。因此，TRIDENT-B 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:19 ─ SEQ ID NO:38 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:44 ，並且具有與如上所提供的TRIDENT-A 的第一多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO ： 192 )。
TRIDENT-B 的第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VLCD137 ) (hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 ))、間插接頭肽(接頭 1 ；GGGSGGGG (SEQ ID NO:16 ))、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ) (hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 ))、間插接頭肽(接頭 2 ；ASTKG (SEQ ID NO:19 ))、含半胱氨酸的異源二聚體促進(K-螺旋)結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:39 ))和C-末端。因此，TRIDENT-B 的第二多肽鏈包括：SEQ ID NO:89 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:76 ─ SEQ ID NO:19 ─ SEQ ID NO:39 ，並且具有與如上所提供的TRIDENT-A 的第二多肽鏈相同的氨基酸序列 (SEQ ID NO ： 197 )。
可採用可替選的TRIDENT-B 第一和第二多肽鏈，其中SEQ ID NO:76 (能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域(VHCD137 ))的氨基酸殘基被SEQ ID NO:83 (hCD137 MAB-3 VH1A)、SEQ ID NO:84 (hCD137 MAB-3 VH1B)、SEQ ID NO:85 (hCD137 MAB-3 VH1C)、SEQ ID NO:86 (hCD137 MAB-3 VH1D)、SEQ ID NO:208 (hCD137 MAB-3 VH1E)、SEQ ID NO:209 (hCD137 MAB-3 VH1F)或SEQ ID NO:210 (hCD137 MAB-3 VH1G)的氨基酸殘基替換和/或SEQ ID NO:89 (能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域(VHCD137 ))的氨基酸殘基被SEQ ID NO:211 (hCD137 MAB-3 VL4)、SEQ ID NO:212 (hCD137 MAB-3 VL5)、SEQ ID NO:213 (hCD137 MAB-3 VL6)、SEQ ID NO:214 (hCD137 MAB-3 VL7)、SEQ ID NO:215 (hCD137 MAB-3 VL8)、SEQ ID NO:216 (hCD137 MAB-3 VL9)、SEQ ID NO:217 (hCD137 MAB-3 VL10)、SEQ ID NO:218 (hCD137 MAB-3 VL11)、SEQ ID NO:219 (hCD137 MAB-3 VL12)、SEQ ID NO:220 (hCD137 MAB-3 VL13)、SEQ ID NO:221 (hCD137 MAB-3 VL14)、或SEQ ID NO:222 (hCD137 MAB-3 VL15)的氨基酸殘基替換。本文描述了包括許多這種多肽鏈的優化的/去免疫的分子並且具有與優化的/去免疫的TRIDENT-A 分子(例如TRIDENT-A1 –TRIDENT-A5 )的第一和第二多肽鏈相同的氨基酸序列。
TRIDENT-B 的第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合5T4的單克隆抗體的VH結構域(VH5T4 ) (h5T4 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:134 ))、人IgG1 CH1結構域(SEQ ID NO:3 )、人IgG1鉸鏈區(SEQ ID NO:7 )，和“具有臼的” CH2和CH3結構域(SEQ ID NO:47 )。因此，TRIDENT-B 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO:134 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:47 。
TRIDENT-B 的第三多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:231 )： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMHWVRQA PGQGLEWMGR IDPNRGGTEY NEKAKSRVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAGGN PYYPMDYWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
TRIDENT-B 的第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向包括：N-末端、能夠結合5T4的單克隆抗體的VL結構域(VL5T4 ) (h5T4 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:135 ))、人IgG CLκ結構域(SEQ ID NO:1 )和C-末端。因此，TRIDENT-B 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO:135 ─ SEQ ID NO:1 。
TRIDENT-B 的第四多肽鏈的氨基酸序列是(SEQ ID NO:232 )： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC1. 優化的和去免疫的變體 TRIDENT-B
優化的和去免疫的TRIDENT-B 變體包括四條多肽鏈，並且含有抗體h5T4 MAB-1 的5T4結合結構域和任意hCD137 MAB-3 VH1A-VH1G 的CD137 VH結構域和任何hCD137 MAB-3 VL3-VL15 的CD137 VL結構域。
命名為“TRIDENT-B2 ”和“TRIDENT-B5 ”的TRIDENT-B 的示例性優化的和去免疫的變體包括四條多肽鏈，並且分別含有抗體h5T4 MAB-1 的5T4結合結構域和抗體hCD137 MAB-3 (1B.3 )和 hCD137 MAB-3 (1E.15 )的CD137結合結構域。
TRIDENT-B2 的第一多肽鏈具有與TRIDENT-A2 的第一多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:194 )，如上所提供。
TRIDENT-B2 的第二多肽鏈具有與TRIDENT-A2 的第二多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:199 )，如上所提供。
TRIDENT-B5 的第一多肽鏈具有與TRIDENT-A5 的第一多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:229 )，如上所提供。
TRIDENT-B5 的第二多肽鏈具有與TRIDENT-A5 的第二多肽相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:230 )，如上所提供。
TRIDENT-B 的示例性的優化的和去免疫的變體兩者的第三多肽鏈具有與TRIDENT-B 的第三多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:231 )。
TRIDENT-B 的示例性的優化的和去免疫的變體兩者的第四多肽鏈具有與TRIDENT-B 的第四多肽鏈相同的氨基酸序列(SEQ ID NO:232 )。K . 可 替 選 的 CD137 x TA 結合分子
鑒於本公開將認識到，可通過採用可替選的腫瘤抗原抗體的VL和VH結構域代替本文公開的抗-HER2/neu或抗-5T4抗體的VL和VH結構域，和/或任何優化的/去免疫的CD137抗體的VL和VH結構域來構建具有任何上述示例性分子的一般結構並且包括用於可替選的腫瘤抗原的結合位點和/或具有優化的/去免疫的CD137結合位點的另外的CD137 x TA 結合分子。類似地，如本文提供的，可類似地構建併入可替選的接頭和/或異源二聚體促進結構域的可替選的CD137 x TA 結合分子。V. 對照分子
為了更有意義地說明本發明的CD137 x TA 結合分子的特性，下文給出了其VL和VH結構域可用於產生具有Fc的對照雙抗體和其他對照結合分子的對照抗體。
抗-螢光素抗體4-4-20 (Gruber, M.等人(1994) “Efficient Tumor CellLysis Mediated By A Bispecific Single Chain Antibody Expressed In Escherichia coli ,” J. Immunol. 152(11):5368-5374；Bedzyk, W.D.等人(1989) “Comparison Of Variable Region Primary Structures Within An Anti-Fluorescein Idiotype Family ,” J. Biol. Chem. 264(3)：1565-1569)是合適的對照抗體、雙抗體。抗-螢光素抗體4-4-20的輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的氨基酸序列如下：
抗-螢光素抗體4-4-20的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:124 )如下顯示(CDRH 殘基以底線顯示)： EVKLDETGGG LVQPGRPMKL SCVASGFTFS DYWM NWVRQS PEKGLEWVA Q IRNKPYNYET YYSDSVKG RF TISRDDSKSS VYLQMNNLRV EDMGIYYCTG SYYGMDY WGQ GTSVTVSS
抗-螢光素抗體4-4-20的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:125 )如下顯示(CDRL 殘基以底線顯示)： DVVMTQTPFS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSNGNTYLR W YLQKPGQSPK VLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP W TFGGGTKLE IK
帕裡珠單抗(參見，例如Protein Data Bank (PDB) ID No. 2HWZ)是針對RSV的F蛋白的A抗原位點中的表位的人源化單克隆抗體(IgG)，並且是VL和VH結構域可用於產生對照雙抗體和其他對照結合分子的合適的對照抗體。可替選的抗-RSV糖蛋白F抗體包括莫維珠單抗(參見，例如PDB ID No. 3IXT)和工程化為從輕鏈的CDR 1去除半胱氨酸殘基的帕利珠單抗的變體。帕利珠單抗的變體用於產生下面的對照分子。
帕利珠單抗的變體的VH結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:126 )顯示在下面(CDRH 殘基以底線顯示)： QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVG WIR QPPGKALEWL ADIWWDDKKD YNPSLKS RLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCAR S MITNWYFDV W GAGTTVTVSS
帕利珠單抗的變體的VL結構域的氨基酸序列(SEQ ID NO:127 )顯示在下面(CDRL 殘基以底線顯示)： DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITC RASQSVG YMH WYQQKPG KAPKLLIY DT SKLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYC FQG SGYPFT FGGG TKLEIKVI.CD137 x TA 結合和對照分子 的匯總
表 5 匯總了DART-A –DART-G 、TRIDENT-A-A5 的結構域屬性：
表 6 顯示了製備的另外DART和TRIDENT分子的屬性： VII. 藥物組合物
本發明的組合物包括用於製備藥物組合物(例如不純的或非滅菌的組合物)和藥物組合物(即，適於施用至受試者或患者的組合物)的原料藥(bulk drug)組合物，其可用於製備單位劑量形式。這種組合物包括本發明的CD137 x TA 結合分子，或這種試劑和藥學上可接受的載體的組合。優選地，本發明的組合物包括預防或治療有效量的本發明的CD137 x TA 雙特異性具有Fc的雙抗體和藥學上可接受的載體。
本發明也涵蓋這樣的藥物組合物，其包括本發明的CD137 x TA 結合分子和有效刺激免疫應答的一個或多個另外的分子(例如免疫檢查點抑制劑)和/或結合特異性結合腫瘤抗原的一個或多個另外分子(例如腫瘤特異性單克隆抗體或雙抗體)—其對於至少一個特定腫瘤抗原(TA ，如上述)是特異性的，和藥學上可接受的載體。
在具體實施方式中，術語“藥學上可接受的”表示獲得聯邦政府或州政府管理機構的許可或列於美國藥典或其他通常獲得認可的藥典中，用於動物，特別是用於人類。術語“載體”指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑(例如弗氏佐劑(完全和不完全)、賦形劑或媒介。這類藥學載體可以是無菌液體。當靜脈內施用藥物組合物時，優選水性載體，如鹽溶液、葡萄糖水溶液和甘油溶液。
通常，本發明組合物的成分被單獨提供或以單位劑型的形式混合在一起，例如作為標明活性劑量的密封容器中的凍乾粉或無水濃縮物，所述容器如安瓿或袋(sachette)。當通過輸注施用組合物時，其可以用含有無菌的藥物級水或生理鹽水(saline)的輸注瓶分配。當通過注射施用所述組合物時，則可以提供注射用無菌水或生理鹽水的安瓿，以便可以在施用前混合所述成分。
本發明也提供了藥物包(pack)或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器含有單獨的本發明的CD137 x TA 結合分子或結合其他試劑，優選結合藥學上可接受的載體。另外，用於治療疾病的一個或多個其他預防或治療試劑也可包括在藥物包或試劑盒中。本發明也提供了這樣的藥物包或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器填充有本發明藥物組合物的一種或多種成分。任選地與這類容器關聯的可以是以由管理藥物或生物製品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的告示(notice)，所述告示反映了管理機構許可製造、使用或銷售，供施用於人類。
試劑盒可包括本發明的CD137 x TA 結合分子。試劑盒還可在一個或多個容器中包括用於治療癌症的一種或多種其他預防和/或治療試劑；和/或試劑盒還可包括結合一種或多種腫瘤抗原(TA)的一種或多種毒性抗體。在某些實施方式中，其他預防或治療試劑是化療劑。在其他實施方式中，預防或治療試劑是生物或激素治療劑。VIII. 施用方法
本發明的組合物可提供為通過向受試者施用有效量的本發明分子或包括本發明分子的藥物組合物，用於治療、預防和改善與癌症或其他疾病或不適相關的一個或多個症狀。在優選的方面中，這類組合物基本上是純的(即基本上不含限制其效果或產生不期望的副作用的物質)。在具體實施方式中，受試者是動物，優選哺乳動物，如非靈長類(例如牛、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等)或靈長類(例如，猴子， 如食蟹猴、人等)。在優選的實施方式中，受試者是人。
各種送遞系統是已知的，並且可以用於施用本發明的分子和組合物，例如封裝於脂質體、微粒、微膠囊中、能表達抗體或融合蛋白的重組細胞、受體介導的內吞作用(參見，例如，Wu等(1987)“Receptor- 介導 In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System” J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、構建核酸作為逆轉錄病毒或其他載體的一部分等。
施用本發明分子的方法包括但不限於，腸胃外施用(例如皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下)、硬膜外和黏膜(例如鼻內和口服路徑)。在具體實施方式中，肌內、靜脈內或皮下施用本發明的CD137 x TA 結合分子。可通過任何方便的路徑，例如，通過輸注或彈丸注射，通過經上皮或黏膜與皮膚膜(例如，口腔黏膜、直腸和腸道黏膜等)吸收施用組合物並且可與其他生物活性試劑一起施用。施用可以是全身的或局部的。
本發明也提供了本發明的CD137 x TA 結合分子被包裝在指示分子的數量的氣密密封的容器，如安瓿或袋中。在一個實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子作為乾燥滅菌的凍幹粉末或無水濃縮物提供在氣密密封的容器中並且可以例如用水或生理鹽水重構至適當的濃度，以施用至受試者。優選地，本發明的CD137 x TA 結合分子作為乾燥無菌的凍幹粉末提供在氣密密封容器中。
本發明凍幹的CD137 x TA 結合分子應在它們的初始容器中儲存在2℃和8℃之間並且該分子應在重構之後的12小時內、優選地6小時內、5小時內、3小時內、或1小時內施用。在可替選的實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的數量和濃度的氣密密封的容器中。優選地，液體形式的本發明的CD137 x TA 結合分子提供在氣密密封的容器中。
可通過標準臨床技術確定本發明的組合物有效治療、預防或改善與不適相關的一個或多個症狀的量。製劑中採用的精確劑量也取決於施用的路徑和病症的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況決定。有效的劑量可從源自體外或動物模型測試系統的劑量回應曲線推斷。
如本文使用的，在一個實施方式中，藥物組合物的“有效量 ”是足夠實現有益的或期望的結果的量，包括但不限於臨床結果，如減輕疾病引起的症狀、緩解疾病的症狀(例如癌症細胞的增殖、腫瘤存在、腫瘤轉移等)的量，從而提高患有該疾病的那些人的生活品質、減少治療該疾病需要的其他藥物的劑量、增強另一藥物治療的效果(例如經靶向和/或內化)、延遲疾病的進展、和/或延長個體的存活。
這種有效量可在一次或多次施用中施用。為了本發明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是足夠直接或間接降低病毒存在的增殖(或效果)和降低和/或延遲疾病(例如癌症)的發展的量。在一些實施方式中，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以結合或不結合另一藥物、化合物或藥物組合物而實現。因此，“有效量”可在施用一種或多種化學治療劑的背景下考慮，並且如果結合一個或多個其他試劑，期望的結果可以實現或被實現，可以考慮以有效量給予單個試劑。儘管個體需求不同，但是確定每個組分的有效量的最佳範圍是本領域技術人員熟知的。
對於本發明涵蓋的CD137 x TA 結合分子，優選基於接收受試者的體重(kg)確定施用至患者的劑量。施用的劑量通常是約0.01 μg/kg至約150 mg/kg受試者的體重，或更高。
可通過修飾比如，例如脂質化增強CD137 x TA 結合分子的吸收和組織滲透而降低或改變施用本發明的CD137 x TA 結合分子的劑量和頻率。
可計算用作單個試劑療法的施用至患者的本發明的CD137 x TA 結合分子的劑量。可替選地，本發明的CD137 x TA 結合分子結合其他治療性組合物使用，使得施用至患者的劑量小於當所述分子用作單個試劑療法時使用的劑量。
利用治療或預防有效量的本發明的CD137 x TA 結合分子治療受試者可包括單次治療，或優選地可包括一系列治療。在優選的實例中，用這種雙抗體治療受試者每週一次、兩週一次(即，每隔一週一次)，或每三週一次，持續約1周至52周。可以施用本發明的藥物組合物每天一次、每天兩次、或每天三次。可替選地，可以施用藥物組合物每週一次、每週兩次、每兩週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次。也將認識到用於治療的分子的有效劑量可隨著特定治療過程的推移而增加或減少。IX. 本發明的組合物的用途
本發明的CD137 x TA 結合分子具有結合T細胞(APC) (例如，通過結合在這種T細胞的表面上表達的CD137)並且結合表達TA 的腫瘤細胞(例如，通過結合在這種腫瘤細胞的表面上表達的TA )的能力。因此，本發明的CD137 x TA 結合分子具有將T細胞共定位至表達TA 的腫瘤細胞的能力，並且因此可用於治療與TA 的表達相關或特徵在於TA表達的任何疾病或病症。因此，不是限制性的，包括這種分子的藥物組合物可用於診斷或治療表達TA 的癌症，包括特徵在於存在癌症細胞的這種癌症，包括但不限於下述的癌症細胞：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索癌、嫌色性腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨成纖維發生不全、骨纖維性發育異常、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養細胞病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、肝細胞癌、膠質母細胞瘤、胰島細胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂質肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤病、多發性骨髓瘤、脊髓發育不良綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌瘤，非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、乳頭狀甲狀腺癌、副甲狀腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤、罕見血液疾病、腎細胞癌、轉移性腎癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、扁平細胞癌、胃癌症、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、轉移性甲狀腺癌或子宮癌。
尤其，本發明的CD137 x TA 結合分子用於治療頭頸的扁平細胞癌(SCCHN)、膀胱癌、乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、膠質母細胞瘤、腎癌、包括非小細胞肺癌(NSCLC)的肺癌、黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌和兒童的小圓藍細胞腫瘤，包括成神經細胞瘤和橫紋肌肉瘤，其中每種都高度表達TA。
本發明的CD137 x TA 結合分子可另外用於製備用於治療上述病症的藥物。
如本文所表明，本發明的CD137 x TA 結合分子增強了腫瘤靶向劑的活性。因此，本發明的CD137 x TA 結合分子可另外結合能夠結合期望的TA 的其他腫瘤靶向劑使用，其他腫瘤靶向劑包括但不限於抗體、抗體的抗原結合片段(例如scFv、Fab、F(ab)2等、TandAb等)、多特異性結合分子(例如雙抗體、雙特異性抗體、三價結合分子等)。尤其考慮，腫瘤靶向劑可結合與在這種組合中使用的CD137 x TA 結合分子相同的或不同的TA 。在特定的實施方式中，腫瘤靶向劑是多特異性分子，其結合TA 和在包括例如CD3 和/或CD8 的T-細胞上表達的表位。示例性腫瘤靶向劑包括但不限於，結合TA 和CD3 (“TA x CD3 ”)的分子。可在這種組合中使用的示例性TA x CD3 結合分子(例如，雙特異性抗體，DART®分子、BiTe®分子、TandAbs等)和製備其的方法是本領域熟知的(參見例如WO2013026835、WO2013158856、WO2014047231、WO2014110601、WO2014131711、WO 2015/026894、WO2015026892、 WO 2015/184203、WO 2016/036937、WO2016182751、WO2017091656、WO2017/142928、WO2017118675)。
如本文提供的，本發明的CD137 x TA 結合分子結合腫瘤靶向劑(例如TA x CD3 結合分子)使用能夠引起上調抑制免疫調節劑，程式化死亡-1 (“PD-1 ”，也稱為“CD279”)。通過結合PD-L1 和PD-L2 (也稱為B7-H1和B7-DC)，PD-1介導其免疫系統的抑制(Flies, D.B.等人(2007) “The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity ,” J. Immunother. 30(3):251-260；美國專利號6,803,192、7,794,710；美國專利申請公開號2005/0059051、2009/0055944、2009/0274666、2009/0313687；PCT公開號WO 01/39722、WO 02/086083)。但是，如本文所表明的，進一步添加抑制PD-1活性的試劑(“PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑 ”)下調了PD-1的表達並且進一步增強了CD137 x TA 和腫瘤靶向劑如TA x CD3 結合分子的活性。本發明尤其涵蓋PD-1/PD-L1檢查點抑制劑，該抑制劑包括結合PD-1的抗體的表位結合位點。
因此，本發明的CD137 x TA 結合分子可另外結合其他腫瘤靶向劑使用，進一步結合PD-1/PD-L1檢查點抑制劑。PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑 包括但不限於，能夠結合PD-1和/或PD-L1的抗體、抗體的抗原結合片段(例如scFv、Fab、F(ab)2等、TandAb等)、多特異性結合分子(例如雙抗體、雙特異性抗體、三價結合分子等)。可在這種結合中使用的示例性PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑 和製備其的方法是本領域熟知的(參見例如美國專利號9,617,338、9,273,135，9,062,112，8,981,063，8,779,108，8,609,089、8,552,154、8,460,927、8,008,449；美國專利公開號：2015/0197571、2016/0075782、2016/0159905、2016/0319019、2017/0044259；PCT專利公開號WO 2004/056875、WO 2006/121168、WO 2008/156712、WO 2012/135408、WO 2012/145549、WO 2013/014668、WO 2014/055897、WO 2013/079174、WO 2014/179664、WO 2014/194302、WO 2015/109124、WO 2015/112800、WO 2015/112805、WO 2016/000619、WO 2016007235、WO 2016/061142、WO 2016/111645、WO 2016/210262、WO 2016/014688、WO 2016/077397、WO 2017/019846、WO 2017/079112、WO 2017/087547和WO 2017/106656)。
在採用這種組合的情況下，尤其考慮，一種或多種分子可“同時”施用至受試者(例如在施用CD137 x TA 結合分子的同時，可施用TA x CD3 結合分子和/或PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑 )和/或一種或多種分子可被“按序”施用(例如施用CD137 x TA 結合分子，並且稍後施用TA x CD3 結合分子和/或PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑 ，或反之亦然)。X. 本 發明的 特定 實施方式
現已經大體上描述了本發明，其通過參考下述編號的實施方式(“E”)將更容易瞭解，除非明確說明，否則所述實施方式作為舉例且非意欲限制本發明的方式來提供：E1 . 一種CD137 x TA 結合分子，其中這種結合分子能夠特異性結合CD137的表位和腫瘤抗原(TA )的表位，並且其中這種CD137 x TA 結合分子包括第一輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和第一重鏈可變結構域，所述第一重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中， (A) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (B) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (C) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (D) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (E) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (F) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (G) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 )的重鏈CDR； (H) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90 )的重鏈CDR； (I) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96 )的重鏈CDR； (J) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )的重鏈CDR； (K) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (L) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )的重鏈CDR； 或 (M) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )的重鏈CDR。E2 .E1 的CD137 x TA 結合分子，其中第一重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77 )；或 (B)hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:92 )。E3 .E1 或E2 的CD137 x TA 結合分子，其中第一輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82 )；或 (B)hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:93 )。E4 .E1-E3 中任一項的CD137 x TA 結合分子，其中第一重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208 )； (B)hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )； (C)hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )； (D)hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 )； (E)hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )； (F)hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )； (G)hCD137 MAB-3 VH1F (SEQ ID NO:209 )； (H)hCD137 MAB-3 VH1G (SEQ ID NO:210 )；或 (I)hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92 )。E5 .E1-E4 中任一項的CD137 x TA 結合分子，其中第一輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )； (B)hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )； (C)hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87 )； (D)hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88 )； (E)hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 )； (F)hCD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )； (G)hCD137 MAB-3 VL5 (SEQ ID NO:212 )； (H)hCD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )； (I)hCD137 MAB-3 VL7 (SEQ ID NO:214 )； (J)hCD137 MAB-3 VL8 (SEQ ID NO:215 )； (K)hCD137 MAB-3 VL9 (SEQ ID NO:216 )； (L)hCD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )； (M)hCD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )； (N)hCD137 MAB-3 VL12 (SEQ ID NO:219 )； (O)hCD137 MAB-3 VL13 (SEQ ID NO:220 )； (P)hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94 )；或 (Q)hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95 )。E6 .E1-E5 中任一項的CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )選自由下述組成的腫瘤抗原的組：19.9；癌胚蛋白5T4；抗原4.2；A33；AFP；ALCAM；BAGE；β-聯蛋白；CA125；羧肽酶M；B1；CD5；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD30；CD33；CD36；CD46；CD52；CD79a/CD79b；CD123；CD317；CEA；CEACAM5；CEACAM6；CO-43；CO-514；CTLA-1；CTLA-4；細胞角蛋白8；E1系列；EGF-R；肝配蛋白受體；Erb；F3；FC10.2；GAGE GD2；GD3；GD49；GM2；GM3；GICA 19-9；gp37；gp75；gp100；HER-2/neu；人B-淋巴瘤抗原-CD20；人乳脂小球抗原；人乳頭狀瘤病毒-E6/人乳頭狀瘤病毒-E7；HMW-MAA；I抗原；ITGB6；IL13Rα2；JAM-3；KID3；KID31；KS 1/4泛癌抗原；KS 1/4；KSA；L6；L20；LEA；LUCA-2；M1:22:25:8；M18；M39；MAGE；MART；Myl；MUC-1；MUM-1；N-乙醯葡糖氨基轉移酶；擬糖蛋白；NS-10；OFA-1；OFA-2；制癌蛋白M；p15；PSA；PSMA；PEMA；PIPA；前列腺酸性磷酸酶；R24；ROR1；SSEA-1；SSEA-3；SSEA-4；sTn；源自T細胞受體的肽；TAG-72；TL5；TNF-α受體；TNF-ß受體；TNF-γ受體；TRA-1-85；鐵轉蛋白受體；TSTA；和VEGF-R。E7 .E1 -E5 中任一項的CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )選自表 1 的腫瘤抗原。E8 .E1 -E7 中任一項的CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )是：HER2/neu、EphA2或5T4。E9 .E8 的CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA )是HER2/neu並且其中CD137 x TA 結合分子包括第二輕鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和第二重鏈可變結構域，所述第二重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中： (A) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63 )的輕鏈CDR；和 (B) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62 )的重鏈CDR。E10 .E9 的CD137 x TA 結合分子，其中： (A) (1) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )的輕鏈CDR； (2) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )的輕鏈CDR；或 (3) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )的輕鏈CDR； 和 (B) (1) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )的重鏈CDR； (2) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )的重鏈CDR；或 (3) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )的重鏈CDR。 E11 .E10 的CD137 x TA 結合分子，其中第二重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )； (B)hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )。E12 .E10 或E11 的CD137 x TA 結合分子，其中第二輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )； (B)hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )。E13 .E8 的CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA)是5T4並且其中CD137 x TA 結合分子包括第二輕鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和第二重鏈可變結構域，所述第二重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中： (I) (A) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-1 VL (SEQ ID NO:135 )的輕鏈CDR；和 (B) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-1 VH (SEQ ID NO:134 )的重鏈CDR；或 (II) (A) 第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-2 VL (SEQ ID NO:137 )的輕鏈CDR；和 (B) 第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-2 VH (SEQ ID NO:136 )的重鏈CDR。E14. E13 的CD137 x TA 結合分子，其中第二重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列：MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:135 )。E15. E13 或E14 的CD137 x TA 結合分子，其中第二輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列：MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:136 )。E16 .E1-E15 中任一項的CD137 x TA 結合分子，其中分子是雙特異性四價具有Fc的雙抗體，其包括第一、第二、第三和第四多肽鏈，其中多肽鏈形成共價鍵合的複合物。E17 .E16 的CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA)是HER2/neu並且其中： (I) (A) 第一和第三多肽鏈具有SEQ ID NO:100 的氨基酸序列；和 (B) 第二和第四多肽鏈具有SEQ ID NO:101 的氨基酸序列； 或 (II) (A) 第一和第三多肽鏈具有SEQ ID NO:102 的氨基酸序列；和 (B) 第二和第四多肽鏈具有SEQ ID NO:103 的氨基酸序列。E18 .E1-E15 中任一項的CD137 x TA 結合分子，其中分子是雙特異性和四價的，並且包括第一、第二、第三、第四和第五多肽鏈，其中多肽鏈形成共價鍵合的複合物。E19 .E15 的CD137 x TA 結合分子，其中腫瘤抗原(TA)是HER2/neu並且其中： (I) (A) 第一多肽鏈具有SEQ ID NO:104 的氨基酸序列； (B) 第二和第五多肽鏈具有SEQ ID NO:105 的氨基酸序列； (C) 第三多肽鏈具有SEQ ID NO:106 的氨基酸序列；和 (D) 第四多肽鏈具有SEQ ID NO:107 的氨基酸序列； 或 (II) (A) 第一多肽鏈具有SEQ ID NO:104 的氨基酸序列； (B) 第二和第五多肽鏈具有SEQ ID NO:105 的氨基酸序列； (C) 第三多肽鏈具有SEQ ID NO:114 、SEQ ID NO:115 、SEQ ID NO:116 、SEQ ID NO:117 或SEQ ID NO:118 的氨基酸序列；和 (D) 第四多肽鏈具有SEQ ID NO:119 、SEQ ID NO:120 、SEQ ID NO:121 、SEQ ID NO:122 或SEQ ID NO:123 的氨基酸序列。E20. E1-15 中任一項的CD137 x TA 結合分子，其中所述分子是雙特異性和三價的，並且包括第一、第二、第三和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價鍵合的複合物。E21. E20 的CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA)是HER2/neu並且其中： (A) 所述第一多肽鏈具有SEQ ID NO:192 、SEQ ID NO:193 、SEQ ID NO:194 、SEQ ID NO:195 、SEQ ID NO:196 或SEQ ID NO:229 的氨基酸序列； (B) 所述第二多肽鏈具有SEQ ID NO:197 、SEQ ID NO:198 、SEQ ID NO:199 、SEQ ID NO:200 、SEQ ID NO:201 或SEQ ID NO:230 的氨基酸序列； (C) 所述第三多肽鏈具有SEQ ID NO:104 的氨基酸序列；和 (D) 所述第四多肽鏈具有SEQ ID NO:105 的氨基酸序列。E23. E20 的CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA)是5T4並且其中： (A) 所述第一多肽鏈具有SEQ ID NO:192 、SEQ ID NO:193 、SEQ ID NO:194 、SEQ ID NO:195 、SEQ ID NO:196 或SEQ ID NO:229 的氨基酸序列； (B) 所述第二多肽鏈具有SEQ ID NO:197 、SEQ ID NO:198 、SEQ ID NO:199 、SEQ ID NO:200 、SEQ ID NO:201 或SEQ ID NO:230 的氨基酸序列； (C) 所述第三多肽鏈具有SEQ ID NO:231 的氨基酸序列；和 (D) 所述第四多肽鏈具有SEQ ID NO:232 的氨基酸序列。E24 . 一種藥物組合物，其包括E1-E23 中任一項的CD137 x TA 結合分子和生理學上可接受的載體。E25 .E1-E23 中任一項的CD137 x TA 結合分子或E24 的藥物組合物在治療與表達腫瘤抗原(TA)相關的疾病或病症或特徵在於表達腫瘤抗原(TA)的疾病或病症中的用途。E26 .E25 的用途，其中與表達腫瘤抗原(TA)相關的疾病或病症或特徵在於表達腫瘤抗原(TA)的疾病或病症是癌症。E27 . 一種CD137結合分子，其包括輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；其中： (A) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (B) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (C) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (D) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (E) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (F) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (G) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 )的重鏈CDR； (H) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91 )的輕鏈CDR；和 (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90 )的重鏈CDR； (I) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97 )的輕鏈CDR；和 (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96 )的重鏈CDR； (J) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )的重鏈CDR； (K) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (L) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )的重鏈CDR； 或 (M) (1) 第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )的重鏈CDR。E28 .E27 的CD137結合分子，其中重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77 )；或 (B)hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:92 )。E29 .E27 或E28 的CD137結合分子，其中輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82 )；或 (B)hCD137 MAB-4 (SEQ ID NO:93 )。E30 .E27-E29 中任一項的CD137結合分子，其中重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 )； (B)hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )； (C)hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )； (D)hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )； (E)hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )； (F)hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208 )； (G)hCD137 MAB-3 VH1F (SEQ ID NO:209 )； (H)hCD137 MAB-3 VH1G (SEQ ID NO: 210 )；或 (I)hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92 )。E31 .E27-E30 中任一項的CD137結合分子，其中輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )； (B)hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )； (C)hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87 )； (D)hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88 )； (E)hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 )； (F)hCD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )； (G)hCD137 MAB-3 VL5 (SEQ ID NO:212 )； (H)hCD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )； (I)hCD137 MAB-3 VL7 (SEQ ID NO:214 )； (J)hCD137 MAB-3 VL8 (SEQ ID NO:215 )； (K)hCD137 MAB-3 VL9 (SEQ ID NO:216 )； (L)hCD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )； (M)hCD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )； (N)hCD137 MAB-3 VL12 (SEQ ID NO:219 )； (O)hCD137 MAB-3 VL13 (SEQ ID NO:220 )； (P)hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94 )；或 (Q)hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95 )。E32 .E27-31 中任一項的CD137結合分子，其中分子是抗體或其抗原結合片段。E33 . 一種藥物組合物，其包括E27-E32 中任一項的CD137結合分子和生理學上可接受的載體。E34 .E27-E31 中任一項的CD137結合分子，或E33 的藥物組合物在治療與抑制的免疫系統相關或特徵在於表達腫瘤抗原(TA)的疾病或病症中的用途。E35 .E34 的用途，其中與抑制的免疫系統相關或特徵在於表達腫瘤抗原(TA)的病症是癌症。E36 . 一種抗-HER2/neu結合分子，其包括輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；其中： (A) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63 )的輕鏈CDR；和 (B) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62 )的重鏈CDR。E37 .E36 的抗-HER2/neu結合分子，其中： (A) (1) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )的輕鏈CDR； (2) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )的輕鏈CDR；或 (3) 輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )的輕鏈CDR； 和 (B) (1) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )的重鏈CDR； (2) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )的重鏈CDR；或 (3) 重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )的重鏈CDR。 E38 .E337 的抗-HER2/neu結合分子，其中重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )； (B)hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )。E39 .E37-E38 的抗-HER2/neu結合分子，其中輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )； (B)hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )。E40 .E36-E39 中任一項的抗-HER2/neu結合分子，其中分子是抗體或其抗原結合片段。E41 . 一種藥物組合物，其包括E36-E40 中任一項的抗-HER2/neu結合分子和生理學上可接受的載體。E42 .E33-E37 中任一項的抗-HER2/neu結合分子、或E41 的藥物組合物在治療與表達HER2/neu相關或特徵在於表達HER2/neu的疾病或病症中的用途。E43 .E42 的用途，其中與表達HER2/neu相關或特徵在於表達HER2/neu的病症是癌症。E44. 一種增強腫瘤靶向劑的活性的方法，其包括結合E1 -E23 中任一項的CD137 x TA 結合分子，或實施方式E24 的藥物組合物施用所述腫瘤靶向劑。E45. 一種治療與抑制的免疫系統相關或特徵在於表達腫瘤抗原(TA )的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用E1-E23 中任一項的CD137 x TA結合分子或E24 的藥物組合物。E46 .E45 的方法，其中與抑制的免疫系統相關或特徵在於表達腫瘤抗原(TA )的病症是癌症。E47 .E45 或 E46 的方法，進一步包括施用腫瘤靶向劑。E48. E44-E47 中任一項的方法，進一步包括施用PD-1/PD-L1檢查點抑制劑。E49. E44 或 E47 的方法，其中所述腫瘤靶向劑是抗體，抗體的表位結合片段，或介導靶細胞的T-細胞重導向殺傷的試劑。E50 .E48 或 E49 的方法，其中所述PD-1/PD-L1檢查點抑制劑是抗-PD-1抗體或抗-PD-L1抗體。E51 .E48-E50 中任一項的方法，其中所述PD-1/PD-L1檢查點抑制劑包括選自表 7 中列舉的那些抗體中的抗體的VH和VL結構域： E52 .E26 、 E35 、 E42 的用途或 E46-E51 中任一項的方法，其中癌症選自由下述組成的組：急性髓細胞樣白血病、腎上腺腫瘤、AIDS相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、轉移性腦瘤、乳腺癌、頸動脈體瘤、宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索癌、嫌色性腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細胞瘤、促結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、尤文腫瘤、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨成纖維發生不全、骨纖維性發育異常、膽囊或膽管癌、胃癌、妊娠滋養細胞病、生殖細胞腫瘤、頭頸癌、肝細胞癌、膠質母細胞瘤、胰島細胞瘤、卡波西肉瘤、腎癌、白血病、脂瘤/良性脂肪瘤、脂質肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌、淋巴瘤、肺癌、成神經管細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、惡性間皮瘤、多發性內分泌瘤病、多發性骨髓瘤、脊髓發育不良綜合征、成神經細胞瘤、神經內分泌瘤，非小細胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、乳頭狀甲狀腺癌、副甲狀腺瘤、兒科癌症、周圍神經鞘瘤、嗜鉻細胞瘤、垂體腫瘤、前列腺癌、後眼色素層黑素瘤、罕見血液疾病、腎細胞癌、轉移性腎癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、扁平細胞癌、胃癌症、滑膜肉瘤、睾丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、轉移性甲狀腺癌和子宮癌。E53 .E26 、 E35 、 E42 的用途或 E46-E51 中任一項的方法，其中癌症選自由下述組成的組：膀胱癌、乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、膠質母細胞瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸扁平細胞癌(SCCHN)。實施例
下述實施例闡釋了用於本發明的診斷或治療方法的組合物的各種方法。所述實施例意欲是說明性的而不以任何方式限制本發明的範圍。實施例 1 HER2 MAB-1 的人源化
PCT公開WO 2001/036005公開了抗-HER2/neu抗體，其中命名為“8H11”，但是，其中提供的VL和VH結構域的序列不準確。8H11抗體結合HER2/neu表位，其與曲妥珠單抗、瑪格妥昔單抗和帕妥株單抗結合的表位不同。
推導抗-HER2/neu抗體8H11的VH和VL結構域的正確序列(由此提供HER2-MAB-1 VH (SEQ ID NO:60 )和HER2-MAB-1 VL (SEQ ID NO:61 ))，並且進行多輪人源化，以便獲得上述人源化VH結構域“hHER2 MAB-1 VH1 ”(SEQ ID NO:64 )和人源化VL結構域“hHER2 MAB-1 VL1 ” (SEQ ID NO:67 )。在這種努力過程中，在hHER2 MAB-1 VH1 和hHER2 MAB-1 VL1 結構域中鑒定數個潛在的序列傾向(sequence liability)，並且進行去除這些負債同時保持結合親和力的替換。尤其： (1) 在hHER2 MAB-1 VH1 結構域的Kabat 位置96鑒定了天冬氨酸異構化位點，並且分別如在hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )和hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )中通過替換D96E或通過替換G97I糾正； (2) 在hHER2 MAB-1 VL1 結構域的Kabat位置30鑒定了潛在的天冬醯胺脫醯胺位點並且分別如在hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )和hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )中通過替換N30S或通過替換S31T糾正； (3) 在hHER2 MAB-1 VL1 結構域的Kabat位置D56鑒定了潛在的天冬氨酸異構化位點並且如在hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )和hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )中通過替換：V55Q、D56E或D56S糾正。
hHER2 MAB-1 的人源化重鏈可變結構域和輕鏈可變結構域可以以任何組合使用並且參考具體的VH/VL結構域指出人源化鏈的具體組合。例如，包括hHER2 MAB-1 VH1 和hHER2 MAB-1 VL3 的人源化抗體在本文稱為“hHER2 MAB-1 (1.3 )”。
選擇人源化變體以與親本鼠抗體相比具有改善的結合親和力並且如所描述的，可被進一步工程化以消除如上述的序列傾向(例如異構化、脫醯胺位點)。通過BIACORE®檢查人源化VH和VL結構域的數個組合的結合親和力。因此，與含有組氨酸的肽融合的人HER2(“huHER2 ”)的細胞外部分經過包被有固定的抗體的表面。簡言之，每個測試分子被捕獲在F(ab)2 山羊-抗-人Fc-包被的表面上，並且接著在存在不同濃度(6.25 nM - 50 nM)的huHER2的情況下孵育。經BIACORE®分析結合確定結合的動力學(歸一化的1:1朗繆爾結合模型)。來自這些研究的計算的ka 、kd 和KD 呈現在表 8 中。
在獨立的研究中，基本上如上述確定CD137 x TA 雙特異性雙抗體，DART-B (上述)對於結合人HER2和食蟹猴HER2的結合動力學。來自這些研究的計算的ka、kd和KD呈現在表 9 中。 實施例 2 鼠抗 -CD137 mAb 的分離和表徵
篩選一組對於人CD137特異性的鼠單克隆抗體，用於展示高親和力結合的抗體。選擇了三個抗體用於進一步的研究。對於這種評估，純化的泛T-細胞(見上文)用抗-CD3/CD28珠(細胞：珠=1:1)在存在IL-2 (100 U/mL)的情況下刺激72小時。將100 μL活化的T細胞(1.0 x 106 細胞/mL)和100 μL連續稀釋的(5倍或10倍稀釋)測試品(抗體或雙特異性雙抗體)添加至微量滴定試驗板的每個孔，混合並且在室溫下孵育45分鐘。用FACS Buffer沖洗細胞並且接著將二級抗體(抗-人-Fc區-APC)添加至每個孔；混合並且在室溫下孵育30分鐘。接著用FACS Buffer沖洗細胞並且接著將T細胞表面標記抗體(V510標記的抗-CD4，和FITC標記的抗-CD8)添加至每個孔；混合並且在室溫下孵育30分鐘。沖洗細胞並且再懸浮在100 μL FACS Buffer中以及通過流式細胞術(BD LSR Fortessa或FACSCanto ll)分析，用於細胞事件收集。經FloJo v10進行資料分析。
發現這種選擇的抗體中的兩個，CD137 MAB-3 和CD137 MAB-4 ， 展示強的結合人CD137並且能夠阻斷CD137和其天然配體之間的結合。這種選擇的抗體中的第三個，CD137 MAB-5 ，展示較低的至人CD137的結合並且不能阻斷CD137和其天然配體之間的結合。
產生具有人IgG1 Fc區和鼠VH/VL結構域的嵌合抗體(分別命名為：chCD137 MAB-1 、chCD137 MAB-2 、chCD137 MAB-3 、chCD137 MAB-4 和chCD137 MAB-5 )，並且測試它們結合活化的CD8+ T細胞的能力。如圖 7 中顯示的，選擇的抗體展示出一系列結合親和力。
通過交叉競爭研究進行表位結合。這些和配體結合競爭研究的結果顯示： (1)CD137 MAB-2 、CD137 MAB-3 和CD137 MAB-4 與CD137L競爭結合CD137，但是CD137 MAB-2 識別的CD137的表位與CD137 MAB-1 、CD137 MAB-3 、CD137 MAB-4 和CD137 MAB-5 識別的表位不同； (2)CD137 MAB-1 和CD137 MAB-5 不與CD137L競爭結合CD137； (3)CD137 MAB-3 和CD137 MAB-4 展示與CD137 MAB-1 的競爭，但是結合不同的表位，如由它們競爭配體結合的能力所顯示的； (4)CD137 MAB-5 識別的表位與CD137 MAB-1 、CD137 MAB-2 、CD137 MAB-3 或CD137 MAB-4 識別的表位不同。
也測試嵌合抗體在沒有配體的情況下誘導來自T細胞的細胞因數(例如IFN-γ、TNF-α)釋放的能力(即，它們的激動活性)。對於這種評估，將純化的泛T細胞(見上文)再懸浮在試驗介質中並且放置在組織培養孵化器中過夜。從培養物中獲得腫瘤靶細胞(包括JIMT-1、N87)。沖洗之後，將細胞小球以1.0 x 105 細胞/mL的細胞密度再懸浮在培養介質中。然後，將104 個細胞添加至白色平底試驗板的每個孔中，所述試驗板放置在組織培養孵化器過夜。第二天，使用Beckman Coulter Vi-細胞計數器通過台酚藍排除測量靜息的人泛T細胞的密度和活力，並且調整至2 x 106 細胞/mL的密度。用試驗介質沖洗預接種在平板上的腫瘤靶細胞一次。
對於細胞因數釋放試驗：將50 µL連續稀釋的測試品(抗體(+/-與抗-人Fc (Fab)’2 交聯)、雙抗體、三價分子等)、50 µL預沖洗的Dynabead αCD3 (REF 11151D；Invitrogen by Thermo Fisher Scientific) (2 x 106 珠/mL)，50 µL/孔的人泛T細胞(2 x 106 細胞/mL)，和50 µL單獨的試驗介質或含有1.6 µg/mL αCD28 (Cat：555725；BD Pharmigen)的試驗介質添加至試驗板的每個孔。平板上每個孔的終體積是200 µL。對於不含有測試品或αCD3珠的那些對照孔，添加試驗介質，以達到200 µL總體積並且將平板在組織培養孵化器中孵育72小時。接著，從每個孔收集上清液並且使用來自R&D System的細胞因數ELISA試劑盒(人IL-2 DuoSet ELISA (Cat：DY202)、人IFN-γ DuoSet ELISA (Cat：DY285)和人TNF-α DuoSet ELISA (Cat：DY210)或類似的商用反應試劑來測量釋放的細胞因數IFN-γ、TNF-α和IL-2R。以試劑盒提供了ELISA方法。微軟Excel和SoftMax Pro用於資料分析，以外推細胞因數水準，其用Prism繪製。
如圖 8 中顯示的，在缺少配體的情況下，CD137 MAB-1 、chCD137 MAB-3 和chCD137 MAB-4 各自展示強的激動活性，CD137 MAB-2 展示較小的激動活性並且CD137 MAB-5 不展示激動活性。
也測試嵌合抗體chCD137 MAB-3 和chCD137 MAB-4 它們在沒有和存在配體和/或靶細胞的情況下，從泛T細胞誘導細胞因數(例如IFN-γ、TNF-α)釋放的能力。使用Dynabeads Untouched人T細胞試劑盒(Invitrogen Cat# 11344D)根據製造商的方案從供體PBMC純化人泛T細胞。IFN-γ釋放的結果顯示在圖 9 中。圖 9 顯示了在存在或沒有1 µg/mL嵌合抗-CD137抗體(chCD137 MAB-3 或chCD137 MAB-5 )的情況下，並且在存在或沒有1 µg/mL CD-137L-His和4 µg/mL hFc F(ab)’2 的情況下，在用CD3包被的珠刺激後72小時通過泛T細胞的的IFN-γ誘導。圖顯示在存在或沒有CD137-His的情況下誘導了IFN-γ，並且相對於用單獨泛T細胞的觀察，用JIMT-1/泛T細胞觀察到了更大的誘導。對於TNF-α也看到了類似的結果。
在存在T-細胞和靶細胞兩者，或單獨T-細胞的情況下，chCD137 MAB-3 展示強的激動活性，其在存在或沒有配體的情況下類似。相反，在沒有配體的情況下，chCD137 MAB-5 展示最小的激動活性並且在存在配體的情況下展示大大增加的激動活性。實施例 3 鼠抗 -CD137 mAb 的人源化
選擇抗體CD137 MAB-3 和CD137 MAB-4 用於人源化。對CD137 MAB-3 進行四輪人源化，其產生一個人源化VH結構域，命名為“hCD137 MAB-3 VH1 ” (SEQ ID NO:76 )，和三個人源化VL結構域，命名為“hCD137 MAB-3 VL1 ” (SEQ ID NO:87 )、“hCD137 MAB-3 VL2 ” (SEQ ID NO:88 )和“hCD137 MAB-3 VL3 ” (SEQ ID NO:89 )。
對CD137 MAB-4 進行三輪人源化，其產生一個人源化VH結構域，命名為“hCD137 MAB-4 VH1 ” (SEQ ID NO:92 )，和兩個人源化VL結構域，命名為“hCD137 MAB-4 VL1 ”(SEQ ID NO:94 )和“hCD137 MAB-4 VL2 ”(SEQ ID NO:95 )。
可以以任何組合使用具有特定的抗-CD137抗體(例如CD137 MAB-3 )的人源化重鏈和輕鏈可變結構域並且通過參考具體VH/VL結構域來提及人源化鏈的具體組合，例如包括hCD137 MAB-3 VH1 和hCD137 MAB-3 VL3 的人源化抗體在本文稱為“hCD137 MAB-3 (1.3 )” 。
通過Biacore檢查具有鼠可變結構域的嵌合抗體和全人源化抗體的結合親和力。
因此，與含有組氨酸的肽融合的人CD137 (“huCD137 ”)的細胞外部分經過包被有固定的抗體的表面。簡言之，每個測試分子被捕獲在F(ab)2 山羊-抗-人Fc-包被的表面上並且接著在存在不同濃度(25 nM和100 nM)的huCD137的情況下孵育。經BIACORE®分析結合確定結合動力學(歸一化的1:1朗繆爾結合模型)。來自這些研究計算的ka 、kd 和KD 呈現在表 10 中並且顯示相對於鼠抗體，人源化mAbs展示結合親和力的約2倍下降。 實施例 4 CD137 x TA 結合分子的表徵
如上所述，產生了能夠結合CD137和示例性的TA ，HER2/neu的許多示例性的CD137 x TA 結合分子。尤其，產生了包括CD137 MAB-3 或hCD137 MAB-3 結構域的六個雙特異性雙抗體(命名為“DART-A ”、“DART-B ”和“DART-C ”、“DART-D” 、 “DART-E ”和“DART-G ”)、包括CD137 MAB-4 結構域的一個雙特異性雙抗體(命名為“DART-F ”)、包括CD137 MAB-1 結構域的兩個雙特異性雙抗體(命名為“DART-1 ”和“DART-4 ”)，和包括CD137 MAB-2 結構域的兩個雙特異性雙抗體(命名為“DART-2 ”和“DART-5 ”)，每個包括hHER2 MAB-1 結構域。DART-A 、DART-B 、DART-C 、DART-1 和DART-2 具有圖 3B 中顯示的一般結構(DART-A 、DART-B 、DART-1 和DART-2 具有圖 3E 中顯示的結構；DART-C 具有圖 3D 中顯示的結構)。DART-D 、DART-E 、DART-F 、DART-G 、DART-4 和DART-5 具有圖 5A 中顯示的一般結構(DART-D 、DART-F 、DART-G 、DART-4 和DART-5 具有圖 5B 中顯示的結構；DART-E 具有圖 5C 中顯示的結構)。
產生了能夠結合CD137和示例性的TA ， EphA2的另一示例性的CD137 x TA 結合分子(命名為“DART-7 ”)。DART-7 是具有圖 3B 中呈現的結構的雙特異性雙抗體，包括CD137 MAB-1 人源化EphA2 MAB-3 結構域。
另外，產生了三個對照分子，包括hHER2 MAB-1 和變體帕利珠單抗結構域(HER2 x RSV )的“DART-3 ”，包括變體帕利珠單抗和CD137 MAB-3 結構域(RSV x CD137 )的“DART-6 ”，和包括人源化EphA2 MAB-3 和變體帕利珠單抗結構域(EphA2 x RSV )的“DART-8 ”。
具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的2個結合位點的CD137 x TA 結合分子，以及結合活化的T細胞表面上存在的CD137的CD137 x RSV 對照分子(DART-6 )。相反，HER2/neu x RSV 對照分子(DART-3 )不展示任何結合。在該試驗中，DART-1 展示最高結合並且DART-5 展示最低結合，剩餘測試的分子(DART-B 、DART-C 、DART-D 、DART-E 、DART-F 、DART-2 、DART-4 和DART-6 )展示相當的結合(圖 10 )。對於具有圖 3B 中存在的結構的分子(比較DART-B /DART-C )或圖 5B-5C 中存在的結構的分子(比較DART-D /DART-E )，在該試驗中，HER2/neu和CD137結合結構域的相對位置對於CD137結合具有最小至沒有影響。
類似地，評估CD137 x TA 結合分子它們結合靶N87胃癌細胞的表面上存在的HER2/neu的能力(圖 11A-11B )。RSV x CD137 對照分子(DART-6 )不展示任何結合。對於具有圖 3B 中存在的結構的分子，在該試驗中，HER2/neu和CD137結合結構域的相對位置對HER2/neu結合具有最小至沒有影響(比較DART-B /DART-C )。相反，與DART-D 相比，DART-E 展示降低的HER2/neu結合，這表明對於具有圖 5B-5C 中存在的結構的分子，對於HER2/neu結合可能存在位置效應，或尤其hHER2 MAB-1 (1.3 )的HER2/neu結合結構域介導的結合展示位置效應。
另外評估CD137 x TA結合分子，DART-B 、DART-D 、DART-G 和對照分子DART-3 和DART-6 它們結合由CHO細胞(圖 12A )和活化的T細胞(圖 12B )表達的CD137的能力。
另外評估CD137 x TA 結合分子DART-B 、DART-D 、DART-G 和對照分子DART-3 和DART-6 它們結合N87細胞( 圖 13A )和JIMT-1細胞( 圖 13B )上表達的HER2/neu的能力。對於這種評估，將100 μL表達HER2/neu的靶細胞(1.0 x 106 細胞/mL)和100 μL連續稀釋的(5倍或10倍稀釋)測試品(雙特異性雙抗體)添加至微量滴定試驗板的每個孔，混合並且在室溫下孵育45分鐘。用FACS Buffer沖洗細胞並且接著將二級抗體(抗-人-Fc區-APC)添加至每個孔；混合並且在室溫下孵育30分鐘。沖洗細胞並且再懸浮在100 μL FACS Buffer中並且通過流式細胞術(BD LSR Fortessa或FACSCanto ll)分析，用於細胞事件收集。經FloJo v10進行資料分析。具有圖 3B 中存在的結構的HER2 x CD137 結合分子展示比具有圖 5A-5C 中存在的結構的那些稍微更好地結合HER2/neu (比較DART-B/DART-D )。RSV x CD137 對照分子(DART-6 )不展示任何結合。具有鼠或人源化CD137結合位點的CD137 x TA 雙特異性雙抗體展示類似的至HER2/neu的結合 (比較DART-D/DART-G )。
圖 14A-14B 提供了在存在或沒有表達示例性的TA，HER2/neu的靶細胞的情況下，CD137 x TA 結合分子在T細胞細胞因數釋放試驗(基本上如上面實施例2中描述的進行，並且通過IFN-γ的釋放例證)仲介導共刺激活性的能力的第一個代表性試驗的結果。圖顯示了在存在表達HER2/neu的N87 (3+ ) (圖 14A )或JIMT-1 (2+ )靶細胞(圖 14B )，HER2/neu陰性Hs700T靶細胞，或沒有靶細胞的情況下，(使用上述方案)測試的DART-1 、DART-2 、DART-3 、DART-4 、DART-5 、DART-6 、DART-A 、DART-D 、DART-E 和DART-F 的結果。結果顯示對照分子，DART-3 和DART-6 不展示共刺激活性。在沒有靶細胞的情況下或用HER2/neu陰性靶細胞，CD137 x TA 結合分子不展示任何可觀察到的共刺激活性。DART-D 和DART-F ，包括新的抗-CD137抗體(分別為CD137 MAB-3和CD137 MAB-4)在存在任一靶細胞系的情況下，展示最高的共刺激活性。DART-E (包括交換的HER2/neu和CD137結構域)展示較低的共刺激活性，尤其在存在N87靶細胞的情況下。類似的模式見IL-2和TNF-α。
圖 15A-15B 提供了在T細胞細胞因數釋放試驗(基本上如上面實施例2中描述的進行，並且通過IFN-γ的釋放例證)中，CD137 x TA 結合分子介導共刺激活性的能力的第二個代表性試驗的結果。圖顯示了在存在表達HER2/neu的N87 (圖 15A )或JIMT-1靶細胞(圖 15B )，HER2/neu陰性Hs700T靶細胞，或沒有靶細胞的情況下，(使用上述方案)測試的DART-1 、DART-2 、DART-3 、DART-4 、DART-5 、DART-6 、DART-B 、DART-D 和DART-G 的結果。
結果顯示了對照分子DART-3 和DART-6 不展示共刺激活性。在沒有靶細胞的情況下或用HER2/neu陰性靶細胞，CD137 x TA 結合分子不展示任何可觀察到的共刺激活性。在存在任一靶細胞系的情況下，DART-D 和DART-G ，包括新的抗-CD137抗體，CD137 MAB-3 (分別鼠和人源化)展示最高的共刺激活性。DART-G 儘管展示稍微較低的至細胞表面表達的CD137的結合，但是展示最高的共刺激活性。如上詳述，DART-B 和DART-G 包括相同的HER2和CD137結合位點，但是分別具有圖 3B 和圖 5B 中顯示的結構。在存在每個靶細胞系的情況下，DART-G 展示比DART-B 更高的共刺激活性。
另外評估CD137 x TA 結合分子，DART-G 和對照分子，DART-3 和DART-6 它們在存在對於示例的TA，HER2/neu陽性或陰性的靶細胞的情況下，介導表達CD137的報導基因細胞系(Jurkat-NF-κB-Luc)中NF/κB通路的劑量依賴性T-細胞信號轉導。簡言之，過表達CD137的Jurkat-NF-κB-Luc報導基因細胞與表達HER2/neu的JIMT-1細胞(圖 16A )或HER2/neu陰性KG-1細胞(圖 16B )在存在增加濃度的DART-G 、DART-3 或DART-6 的情況下共孵育。孵育之後，通過螢光測量信號轉導，螢光相對光單位(RLU)作為讀數。結果顯示CD137 x TA 結合分子如DART-G ，介導劑量依賴性T-細胞信號轉導，其依賴於表達TA的靶細胞的存在。
另外評估CD137 x TA 結合分子、DART-A 和對照分子，DART-3 和DART-6 它們在存在表達不同水準示例性的TA ，HER2/neu的細胞的情況下，介導增強的T-細胞增殖的能力。簡言之，在存在DART-A (圖 17 ，圖塊 A 、 D 和G )，DART-3 (圖 17 ， B 、 E 和H )，DART-6 (圖 17 ，圖塊 C 、 F 和I )，或沒有分子(圖 17 ，圖塊 J 、 L 和N )的情況下，CFSE標記的人T細胞±亞優化αCD3/αCD28刺激與高HER2/neu的N87靶細胞(圖 17 ，圖塊 A-C 和J-K )、低HER2/neu的MCF-7靶細胞(圖 17 ，圖塊 D-F 和L-M )共同培養，或單獨培養(圖 17 ，圖塊 G-I 和N-O )並且監測T細胞增殖。結果顯示CD137 x TA 結合分子，如DART-A ，增強T-細胞信號增殖。這種增強的T細胞增殖是TA表達依賴性的並且與TA表達水準相關。
瑪格妥昔單抗是Fc-優化的抗-HER2/neu單克隆抗體，其在結合靶腫瘤細胞之後，可誘導增強的抗體依賴性細胞介導的細胞毒性。如上所述，HER2 MAB-1 結合的HER2/neu表位與瑪格妥昔單抗結合的不同。結合CD137 x TA 結合分子DART-1 或對照分子DART-3 (HER2 x RSV )，檢查抗-TA 抗體瑪格妥昔單抗的靶細胞殺傷活性。簡言之，已經被工程化為表達螢光素酶(luc)報導基因的靶N87細胞(N87/GFP/Luc細胞)與純化的NK效應細胞一起孵育(以2:1的效應子:靶(E:T)比例，增加濃度的瑪格妥昔單抗結合固定濃度(0.1 μg/mL)的DART-1 或 DART-3 72小時，並且通過螢光(LUM)試驗確定細胞毒性，所述試驗測量靶細胞的細胞螢光素酶活性，螢光相對光單位(RLU)作為讀數(圖 18A )。另外，評估來自該試驗的NK細胞(CD3- /CD56+ )用於表達啟動標記CD69 (圖 18B )。該研究的結果表明與具有僅僅HER2/neu結合的對照分子相比，CD137 x TA 結合分子DART-1 增強margituximab-介導的針對N87/Luc靶細胞的ADCC活性，和在NK細胞上margituximab-介導的CD69上調。
在T細胞細胞因數釋放試驗(基本上如上面實施例2中描述的進行，並且通過IFN-γ的釋放例證)中檢查命名為“DART-7 ”的結合例證性TA EphA2的CD137 x TA 結合分子介導共刺激活性的能力。在存在表達EphA2的Hs700T靶細胞(圖 19A )或EphA2陰性Hs700T (EphA2.KO)靶細胞(圖 19B )，或沒有靶細胞的情況下，(使用上述方案)測試CD137 x TA 結合分子DART-7 和對照分子DART-8 。結果顯示CD137 x TA 結合分子DART-7 在存在表達EphA2的細胞的情況下，展示共刺激活性，但是在沒有靶細胞的情況下或用EphA2陰性靶細胞，不展示任何可觀察到的共刺激活性。對照分子DART-8 不展示共刺激活性。
通過評估中心記憶T細胞(Tcm)和效應子記憶T細胞(Tem)的分數，來檢查CD137 x TA 結合分子對於T細胞群體的共刺激活性。簡言之，在存在CD137 x TA 結合分子DART-7 或對照分子DART-8 或DART-6 的情況下，在亞優化刺激條件下，將人T細胞與EphA2陽性克隆腺癌Colo205靶細胞共培養5天。共培養之後，在設門的CD4+ 和設門的CD8+ 子集中確定Tcm (CCR7+ CD45RA- )和Tem (CCR7- CD45RA- )細胞的百分數。表 11 中匯總的結果顯示CD8+ Tcm和Tem細胞類型的分數顯著增加並且該增加需要結合CD137和TA (例如EphA2)兩者。這些結果指示在存在適當腫瘤抗原表達細胞的情況下，CD137 x TA 結合分子誘導CD8+ Tcm和Tem細胞分數的顯著增加。CD137 x TA 結合分子展示的靶向T-細胞激動可為誘導腫瘤-細胞固定的CD137活化提供機會，限制系統免疫細胞活化和相關的副作用。
另外，也構建和測試了具有對於CD137的一個結合位點和對於HER2/neu的一個或多個結合位點的CD137 x TA 結合分子(參見，例如圖 4A 、5A 和6A )。這種分子對於CD137是單價的，並且展示對於活化的T細胞降低的結合，如鑒於它們降低的抗體親抗原性所預期的。這種分子展示一系列對靶N87細胞的結合。但是，在T細胞細胞因數釋放試驗中，對於CD137單價的分子都不展示任何共刺激活性。該觀察表明在這些試驗中，對於共刺激活性可能需要至少兩個CD137結合位點。實施例 5 人源化 CD137 MAB-3 的優化
如上所述，CD137 MAB-3 的人源化使得結合親和力丟失約2倍(參見，例如上面的表 9 )。優化用於鑒定具有與親本鼠抗體類似或更好的結合親和力的人源化CD137 MAB-3 克隆。簡言之，隨機突變用於在hCD137 MAB-3 (1.3 )的重鏈CDRH 3 (Kabat位置99-102)結構域中引入替換。使用增加嚴格性的三輪選擇篩選鑒定具有至CD137增強結合的克隆。從2輪和3輪選擇了48個克隆，並且如雙抗體(具有圖 5B 中顯示的結構)評估親和力。表 12 提供了來自選擇的用於至hCD137的增強結合的四個克隆的CDRH 3 Kabat殘基99-102的氨基酸序列的比對。
將這些克隆的氨基酸序列併入5鏈雙抗體DART-G中，以產生優化的DART-G 分子(命名為DART-G1 、DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 )。經BIAcore評估DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 的結合親和力(表 11 )。對於這種評估，His標記的可溶性人CD137 (huCD137)或食蟹猴CD137 (cynoCD137) (含有與含組氨酸的肽融合的人或食蟹猴CD137的細胞外部分)經過包被有固定的抗體的表面。簡言之，每個測試分子捕獲在F(ab)2 山羊-抗-人Fc-包被的表面上並且接著在存在不同濃度(6.25-100 nM)的huCD137或cynoCD137的情況下孵育。經BIACORE®分析結合確定結合的動力學(歸一化的1:1朗繆爾結合模型)。從這些研究計算的ka 、kd 和KD 呈現在表 13 中。
以如上述相同的方式，評估雙抗體結合CD137的能力。該研究的結果顯示在圖 20A-20B 中。如上所述，具有對於CD137的hCD137 MAB-3 (1.3 )結合位點的DART-G 與具有相同結構但是包括鼠CD137 MAB-3 的CD137結合位點的構建體(DART-6 )相比示出稍微較低的結合。包括優化的hCD137 MAB-3 VH 結構域的HER2 x CD137 雙抗體展示更高的結合，該分子與人CD137的相對結合活性是：DART-G4 ＞ DART-G3 ＞ DART-G2 ≈ DART-6 ＞ DART-G。DART-G和優化的變體都展示幾乎同樣至多個靶細胞類型(包括N87、JIMT-1和MDA-MB231細胞)的表面上的HER2的結合。
圖 21A-21C 顯示了在T細胞細胞因數釋放試驗(基本上如上面實施例2中描述的進行，並且通過IFN-γ的釋放例證)中，DART-3 、DART-6 、DART-B 、DART-D 、DART-G 、DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 介導共刺激活性的能力的代表性試驗的結果。在存在表達HER2/neu的N87靶細胞(圖 21A )、JIMT-1靶細胞(圖 21B )或MDA-231 (圖 21C )靶細胞，或沒有靶細胞存在的情況下，如上述測量細胞因數釋放。
結果顯示對照雙抗體DART-3 和DART-6 不展示共刺激活性。在沒有靶細胞的情況下或用HER2/neu陰性靶細胞，CD137 x TA 結合分子不展示任何可觀察到的共刺激活性。在存在任一靶細胞系的情況下，包括新的抗-CD137人源化抗體hCD137 MAB-3 的DART-G 展示最高的共刺激活性。TNF-α和IL-2顯示了類似的釋放模式。
發現優化的變體DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 的共刺激活性與增加的與細胞表面表達的CD137的結合負相關，指示在試驗中，較高的結合親和力似乎不與共刺激活性直接相關。但是，如下所顯示，優化的變體的表現與在其他功能試驗中相當。這些屬性使得親和力優化的變體除了它們用作共刺激試劑外，尤其用於檢測CD137表達和測量CD137的表達的診斷試驗。
檢查CD137 x TA 結合分子介導重導向細胞殺傷腫瘤靶細胞的能力。簡言之，基本上如上對共刺激試驗所述，在缺少或存在DART-B 、DART-G 、DART-G1 、DART-G2 、DART-G3 、 DART-G4 或對照分子DART-3 或DART-6 (各自為0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL和1 μg/mL)的情況下，將N87/GFP/Luc靶細胞(工程化為表達螢光素酶(luc)報導基因)與泛T細胞在亞優化刺激條件下孵育72小時。在孵育結束時，通過螢光(LUM)試驗測量靶細胞的細胞螢光素酶活性來確定細胞毒性，螢光相對光單位(RLU)作為讀數(圖 22 )。每種檢查的CD137 x TA 結合分子展示一些重導向細胞殺傷活性，DART-G 展示最高的活性並且DART-B 展示最低的活性。相反，對照分子未展示可檢測到的重導向細胞殺傷活性。該研究的結果表明CD137 x TA 結合分子能夠介導腫瘤細胞的重導向細胞殺傷。實施例 6 三價 CD137 x TA 結合分子的表徵
如上所述，具有對於CD137的一個結合位點和對於HER2/neu的一個或多個結合位點的CD137 x TA 結合分子在T細胞細胞因數釋放試驗中不展示任何共刺激活性。該觀察暗示對於共刺激活性，可能需要至少兩個CD137結合位點。為了解決該疑問，產生了能夠結合CD137和示例性的TA ，HER2/neu的一組示例性的三價CD137 x TA 結合分子。這些分子包括四個雙特異性三價結合分子“TRIDENT-A ”、“TRIDENT-A2 ”、“TRIDENT-A3 ”和“TRIDENT-A4 ”，其中每個包括兩個hCD137 MAB-3 結構域和一個hHER2 MAB-1 結構域(CD137 x CD137 x HER2 )。上面詳細提供了這些示例性的CD137 x TA 結合分子的結構和序列。另外，產生了各自包括一個變體帕利珠單抗結構域和兩個優化的hCD137 MAB-3 結構域(CD137 x CD137 x RSV )的兩個對照分子“TRIDENT-1 ”，和包括一個hHER2 MAB-1 結構域、一個4-4-20 結構域、和一個變體帕利珠單抗結構域(RSV x FITC x HER2 )的“TRIDENT-2 ”。三價分子具有圖 6A 中顯示的一般結構，並且如下詳述來產生和通過FACS分析表徵它們結合靶N87(3+ )、JIMT-1(2+ )和MCF-7(1+ )表面上存在的HER2/neu的能力，基本上如上所述。也評估具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的兩個結合位點的CD137 x TA 結合分子(DART-G 、DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 )。
如圖 23A-23C 中顯示的，分子包括與所有三個靶細胞類型結合的一個或兩個HER2/neu結合結構域。將注意到，具有兩個HER2/neu結合位點的分子(DART-G 、DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 )的結合曲線尤其在它們的細胞表面具有高水準HER2/neu的細胞上很快達到飽和。這指示一些分子展示二價結合(即，結合表面上的兩個HER2/neu分子)。在存在高濃度的靶配體的情況下，二價結合是更可能的。
也基本上如上面實施例2中所述，通過FACS分析評估具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的一個結合位點的CD137 x TA 結合分子(TRIDENT-A 、TRIDENT-A2 、TRIDENT-A3 和TRIDENT-A4 )、CD137 x CD137 x RSV 和TA x FITC x RSV 對照分子(TRIDENT-1 和TRIDENT-2 )，和具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的兩個結合位點的CD137 x TA 結合分子(DART-G 、DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 )的結合活化的CD4+ (圖 24A )和CD8+ (圖 24B ) T細胞的表面上存在的CD137的能力。包括兩個CD137結合結構域的分子展示強的對活化的T-細胞的結合。對於上述包括優化的hCD137 MAB-3 VH 結構域的示例性的HER2 x CD137 雙抗體，觀察到改善的結合。如預期的，TA x FITC x RSV 對照分子(TRIDENT-2 )不展示任何對活化的T-細胞的結合。
在另一研究中，評估具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的一個結合位點的CD137 x TA 結合分子(TRIDENT-A 、TRIDENT-A2 、TRIDENT-A3 和TRIDENT-A4 )、具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的兩個結合位點的CD137 x TA 結合分子(DART-G4 )和TA x FITC x RSV 對照分子(TRIDENT-2 )介導表達CD137的細胞和表達HER2/neu的靶細胞之間細胞-細胞接合的能力。對於這種評估，1.5 x 104 個以PKH26標記的表達CD137的CHO細胞與1.5 x 104 個以CFSE標記的表達HER2/neu的靶細胞(N87(HER2表達水準：3+ )、JIMT-1 (HER2表達水準：2+ )或MCF-7(HER2表達水準：1+ )以1:1的比例在存在連續稀釋(10倍稀釋)的測試品的情況下，在室溫下共孵育30 min。然後，通過流式細胞術分析樣品，以確定接合細胞(CFSE+/PKH26+)的百分數作為用於細胞-細胞接合的讀數。如圖 25A-25C 中顯示的，包括至少一個HER2/neu結合結構域和兩個CD137結合結構域的分子能夠介導細胞-細胞接合，而對照分子是無活性的。對於所有活性分子，細胞-細胞接合活性與HER2/neu表達水準相關。
在另一研究中，在T細胞細胞因數釋放試驗中，評估具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的一個結合位點的CD137 x TA 結合分子(TRIDENT-A 、TRIDENT-A2 、TRIDENT-A3 和TRIDENT-A4 )，CD137 x RSV 和TA x FITC x RSV 對照分子(TRIDENT-1 和TRIDENT-2 )，和具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的兩個結合位點的CD137 x TA 結合分子(DART-G 、DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 )在存在或不存在表達示例性的TA，HER2/neu的靶細胞的情況下，介導共刺激活性的能力(基本上如上面實施例2中描述的進行，並且通過IFN-γ的釋放例證)。如上述在存在表達HER2/neu的N87靶細胞(圖 26A )、JIMT-1靶細胞(圖 26B )，或沒有靶細胞(圖 26C )的情況下，測量細胞因數釋放。
結果顯示示例性的CD137 x TA結合分子在存在任一靶細胞系的情況下展示共刺激活性，活性與HER2/neu表達的水準相關。TRIDENT-A 、 TRIDENT-A2 、 TRIDENT-A3 和TRIDENT-A4 (各自具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的一個結合位點)比DART-G 、 DART-G2 、 DART-G3 或DART-G4 (具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu的2個結合位點)，展示對於JIMT-1 (HER2++ )細胞更高的共刺激活性。在沒有靶細胞的情況下或用HER2/neu陰性靶細胞，CD137 x TA結合分子不展示任何可觀察到的共刺激活性。對照分子TRIDENT-1 和TRIDENT-2 ，不展示共刺激活性。實施例 7 CD137 x TA 結合分子增強 T- 細胞活化
如上述，本發明的CD137 x TA 結合分子可增強T-細胞擴展和活化(參見，例如圖 17A-17O )和腫瘤靶向劑-介導的NK效應子功能(ADCC) (參見，例如瑪格妥昔單抗-介導的ADCC的增強，圖 18A-18B )。已知，結合TA 和CD3的TA x CD3 雙特異性分子(例如DART雙抗體，BiTE®分子等)介導T-細胞重導向殺傷表達TA 的靶細胞，並且刺激T-細胞擴展和活化(參見，例如PCT公開號WO 2017/030926、WO 2016/048938和WO 2015/026892)。在使用示例性的TA x CD3 雙特異性分子的數個研究中，評估本發明的CD137 x TA 結合分子增強這種腫瘤靶向劑介導的T-細胞活化和T-細胞重導向殺傷的能力。
在一個這種研究中，使用基於螢光素酶的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)試驗，評估示例性的CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A4 增強由結合例證性的TA gpA33的TA x CD3 雙抗體介導的T-細胞重導向細胞殺傷的能力。簡言之，在存在TRIDENT-A4 或對照TRIDENT-1 的情況下結合TA x CD3 雙抗體或對照Irrel x CD3 雙特異性雙抗體(包括代替gpA33的不相關的結合結構域(4-4-20至螢光素))，將泛T細胞與工程化為表達螢光素酶(luc)報告基因(Colo205/luc)靶細胞的Colo205細胞以3:1的效應子:靶(E:T)比例一起孵育。在孵育結束時，通過測量靶細胞的細胞螢光素酶活性的螢光(LUM)試驗確定細胞毒性，螢光相對光單位(RLU)作為讀數(圖 27 )。該研究的結果表明，本發明的CD137 x TA結合分子能夠增強TA x CD3 雙特異性分子介導的T-細胞重導向殺傷。
在另一研究中，在SK-OV3卵巢癌模型(表達TA sHER2/neu和5T4)中評估示例性的CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A2 體內增強T-細胞擴展和抗-腫瘤活性的組合的能力。在該研究中，檢查單獨的或與結合例證性TA 5T4的TA x CD3 雙抗體(5T4 x CD3 )、和任選的進一步與抗 -PD-1 mAb (hPD-1 mAb 7(1.2) IgG4 (Ρ)組合時的TRIDENT-A2 的活性(參見，例如PCT公開WO 2017/019846的SEQ ID NOs:264 和266 )。
簡言之，在研究的第0天，將新鮮分離的PBMC眶後注入NSG.MHCI-/- 小鼠(對於腫瘤監測，每組7只雌性小鼠；對於T-細胞和腫瘤分析，每組3只雌性小鼠)。將SK-OV3細胞(5 x 106 )與人工基底膜1:1混合並且在研究的第0天皮下注射。在研究的第7天，用抗-CD4抗體OKT4治療小鼠(初始劑量皮下10 mg/kg，其後腹腔注射一周兩次5 mg/kg)，以消除CD4+ T-細胞。從第22天開始，通過以下述靜脈內(IV)注射治療小鼠：媒介對照；TRIDENT-A2 (2.5 mg/kg，每週一次)；TA x CD3 雙抗體(0.01 mg/kg，每週兩次)；TRIDENT-A2 (2.5 mg/kg，每週一次)和TA x CD3 雙抗體(0.01 mg/kg，每週兩次)的組合；抗-PD-1 mAb (5 mg/kg，每週一次)；或TRIDENT-A2 (2.5 mg/kg；每週一次)、TA x CD3 雙抗體(0.01 mg/kg，每週兩次)和抗 -PD-1 mAb (5 mg/kg，每週一次)的組合。
施用測試品後7天，通過FACS分析評估T-細胞標記，並且在研究期間監測腫瘤生長。在治療後第7天取樣的1 mg腫瘤中存在的T-細胞標記CD4、CD8、CD69和PD-1的表達分別繪製在圖 28A 、圖 28B 、圖 28C 和圖 28D 中。這些資料顯示CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A2 增強了TA x CD3 雙抗體介導的T-細胞活化和擴增(如增加的CD4、CD8和CD69的表達所例證)。當單獨用TA x CD3 雙抗體處理時，上調了免疫檢查點分子PD-1的表達。用CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A2 和TA x CD3 雙抗體的組合處理，進一步增強了當用TA x CD3 雙抗體單獨處理時的檢查點分子PD-1的表達並且暗示該組合的活性可通過添加檢查點抑制劑來增強。的確，添加示例性的PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑， 抗-PD-1 mAb至TRIDENT-A2 /TA x CD3 雙抗體組合抑制了PD-1表達的上調，並且進一步增強了T-細胞活化和增殖。
該研究期間的腫瘤生長繪製在圖 29 中，其顯示CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A2 增強了TA x CD3 雙抗體的抗-腫瘤活性。另外，添加PD-1/PD-L1檢查點抑制劑抗-PD-1 mAb至該組合進一步增強了該組合的抗-腫瘤活性。該研究的結果表明，本發明的CD137 x TA 結合分子，尤其是具有對於CD137的兩個結合位點和對於TA的一個結合位點的那些，結合腫瘤靶向劑，增強了T-細胞活化、增殖和靶細胞殺傷。因此，本發明的CD137 x TA 結合分子可有利地結合腫瘤靶向劑使用，尤其結合在這種細胞仲介導T細胞活化、NK細胞活化和/或刺激CD137表達的那些使用。此外，這些研究表明添加PD-1/PD-L1檢查點抑制劑，如抗-PD-1或抗-PD-L1抗體，可進一步增強T-細胞的活化、增殖和靶細胞殺傷。實施例 8 穩定性研究
評估示例性的三價CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A (包括hCD137 MAB-3 (1.3 ))和優化的變體TRIDENT-A1 (包括hCD137 MAB-3 (1A.3 ))、TRIDENT-A2 (包括hCD137 MAB-3 (1B.3 ))、TRIDENT-A3 (包括hCD137 MAB-3 (1C.3 ))以及TRIDENT-A4 (包括hCD137 MAB-3 (1D.3 ))的解鏈溫度(Tm)和其他穩定性參數。通過差示掃描量熱法(DSC)，評估純化材料(＞95%，如通過高壓尺寸排阻色譜(HP-SEC)測定)的Tm。簡言之，使用連接至Waters Acquity UPLC BEH柱(200Å 1.7 µm 4.6 x 150 mm)的Agilent 1260 Infinity II HPLC(HPLC-SEC)測量純度水準。實驗緩衝液是20 mM磷酸鈉、0.5 M NaCl、0.02%疊氮化鈉，pH 7.2。流速是0.4 ml/分鐘，持續5分鐘。從在單峰280 nm下跟蹤的吸收度的面積%確定純度%。在MicroCal VP-Capillary DSC (Malvern Instruments，Inc.)上在15-95℃之間並且以1℃/分鐘攀升進行熱穩定性測量。
為了評估其他穩定性參數，給純化的CD137 x TA 結合分子(PBS中1 mg/mL，pH7.2，除非另外指出)施壓，並且通過HP-SEC重新評估，以及將值與從未施壓的分子獲得的那些進行比較。使用下述施壓條件：三輪冷凍(在-80℃下1小時)隨後融化；在25℃或40℃下，2天和7天儲存之後；在25℃下，pH 5.5的20 mM醋酸鈉中儲存的第0天、第2天、第7天之後；在25℃下，pH 6.5的10 mM組氨酸HCL中儲存第0天、第2天、第7天之後。這些研究的結果匯總在表 14 中。
對於TRIDENT-A 和TRIDENT-A2 ，CD137結合區的Tm出現和Tm (Tm1)在最佳範圍內。但是，對於TRIDENT-A3 和TRIDENT-A4 二者，Tm出現和Tm1都較低。僅僅TRIDENT-A2 在40℃下在PBS中是穩定的(第2天和第7天)，剩餘的分子對於該存儲條件敏感。TRIDENT-A 和TRIDENT-A2 二者在pH 5.5醋酸鹽中都穩定，而TRIDENT-A3 和TRIDENT-A4 二者對於pH 5.5醋酸鹽孵育都敏感。所有測試的分子在pH 6.5的組氨酸中是穩定的。基於來自這些研究的結果，在測試緩衝液中穩定性的排序如下：TRIDENT-A2 ＞TRIDENT-A ＞TRIDENT-A3 ＞TRIDENT-A4 。實施例 9 用食蟹猴 T 細胞的共刺激活性
如上所述，包括CD137 MAB-3 (或其人源化、優化變體)的結合結構域的分子結合人CD137和食蟹猴CD137。在食蟹猴T細胞細胞因數釋放試驗中，評估具有對於CD137的兩個結合位點和對於HER2/neu或5T4的一個結合位點的代表性CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A2 和TRIDENT-B2 介導共刺激活性的能力。上面詳細提供了這些示例性的CD137 x TA 結合分子的結構和序列。也包括對照分子TRIDENT-1 和TRIDENT-2 。在存在或沒有靶細胞的情況下，細胞因數釋放試驗基本上如上面實施例2中描述的進行，並且通過IFN-γ的釋放例證，不同之處是使用食蟹猴泛T細胞。對於這些研究，使用表達HER2/neu和5T4兩者的JIMT-1靶細胞。
結果繪製在圖 30 中，並且顯示對照分子TRIDENT-1 和TRIDENT-2 不展示共刺激活性。而CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A2 和TRIDENT-B2 (包括人源化/優化的抗-CD137抗體hCD137 MAB-3 (1B.3 ))都展示劑量依賴性的共刺激活性。實施例 10 CD137 去免疫化
hCD137 MAB-3 (1B.3 )的電腦分析鑒定了VH結構域中的兩個潛在的MHC II類結合肽(T-細胞表位)和VL結構域中的三個潛在的MHC II類結合肽。檢查對於hCD137 MAB-3 (1B.3 )的一系列氨基酸替換，以鑒定消除/降低鑒定的T-細胞表位潛在的免疫原性的替換(其可以是單個氨基酸替換或一組替換)。具體而言，對於去免疫hCD137 MAB-3 VH1B ，在至多兩個位置(Kabat殘基38和48)和對於去免疫hCD137 MAB-3 VL3 ，在至多六個位置(Kabat殘基24、25、44、48、52和54)引入氨基酸替換。在圖 31A 和31B 中，VH和VL結構域中替換的氨基酸殘基在方框中並且分別由箭頭指示Kabat編號。產生包括在這些位置單獨地和/或組合地具有各種替換的hCD137 MAB-3 (1B.3 )的VH和/或VL變體的IgG1抗體(具有234A/235A Fc結構域(SEQ ID NO:40 ))並且通過Attana細胞A200 QCM表徵它們結合CD137的能力。簡言之，hCD137 MAB-3 (1B.3 )和去免疫的變體獨立地被捕獲在包被有兔抗-人IgG Fc多克隆抗體的Attana感測器晶片上並且可溶性人CD137-His標記的融合蛋白以11.1、33.3、100和300 mM經過晶片。將去免疫的變體的感應圖(sensograms)與hCD137 MAB-3 (1B.3 )的感應圖進行比較並且打分。基本上如上面在實施例8中描述所進行的，也通過DSC表徵抗體的熱穩定性。許多這種變體的結果匯總在表 15 中，這些變體的氨基酸序列如上所提供。
鑒定了保持CD137結合活性和熱穩定性兩者的大量去免疫的變體。包括VH結構域I48A替換的大部分去免疫的變體展示在CD137結合和Tm出現兩者中的一些降低。
基本上如上述測試去免疫的hCD137 MAB-3 (1E.15 )和hCD137 MAB-3 (1G.15 )和親本人源化hCD137 MAB-3 (1B.3 )結合活化的CD4+ 和CD8+ T細胞的能力。如圖 32A-32B 中顯示的，去免疫的抗體hCD137 MAB-3 (1E.15 )的結合曲線不變，而hCD137 MAB-3 (1G.15 )展示稍微降低的對CD4+ 和CD8+ T細胞兩者的結合。
在T-細胞細胞因數釋放試驗中，在沒有交聯或有交聯的情況下，評估hCD137 MAB-3 (1E.15 )和hCD137 MAB-3 (1G.15 )的體外激動活性(基本上如上面實施例2中描述的進行，並且通過IFN-γ的釋放例證)。在沒有交聯的情況下，沒有觀察到展示活性的基於hCD137 MAB-3 的抗體(圖 33A )，在交聯的情況下，hCD137 MAB-3 (1E.15 )展示與hCD137 MAB-3 (1B.3 )類似的激動活性，而hCD137 MAB-3 (1G.15 )展示稍微降低的激動活性，可能是由於對於CD137降低的結合(圖 33B )。如上所記錄的，在有交聯或沒有交聯的情況下，CD137 MAB-1 展示激動活性。實施例 11 具有去免疫的 CD137 結合結構域的三價 CD137 x TA 結合分子
如上述，將hCD137 MAB-3 的VH和VL結構域人源化、優化和去免疫。通過併入這種VH和VL結構域，產生示例性雙特異性四價和/或三價CD137 x TA 結合分子。產生包括hCD137 MAB-3 (1E.15 )的CD137結合結構域的一個這種雙特異性三價結合分子“TRIDENT-B5 ”，並且在許多試驗中評估。上面詳細提供了該示例性的CD137 x TA 結合分子的結構和序列。在這些研究中包括TRIDENT-B2 和一個或多個對照分子：TRIDENT-1 、TRIDENT-2 、TRIDENT-3 、TRIDENT-4 。
基本上如上述評估TRIDENT-B2 、TRIDENT-B5 和對照分子TRIDENT-1 、TRIDENT-3 以及TRIDENT-4 結合活化的CD8+ T細胞和/或在靶細胞(高表達JIMT-1的乳癌細胞和低表達SKOV-3的卵巢癌細胞)的表面上存在的5T4的能力。如圖 34A 中顯示的，包括兩個CD137結合結構域的所有分子(TRIDENT-B2 、TRIDENT-B5 和對照分子TRIDENT-1 和TRIDENT-4 )都展示類似的對活化的CD8+ T細胞的結合，而缺少任何CD137結合結構域的對照分子(TRIDENT-3 )不結合。類似地，具有5T4結合結構域的所有分子(TRIDENT-B2 、TRIDENT-B5 和對照TRIDENT-3 )展示類似的對表達高水準5T4的靶細胞強的結合(JIMT-1，圖 34B )，以及對表達低水準5T4的靶細胞較弱的結合(SKOV-3，圖 34C )，而沒有5T4結合結構域的對照分子(TRIDENT-1 和TRIDENT-4 )不結合任一表達5T4的靶細胞。
在存在或不存在表達不同水準的示例性的TA、5T4的靶細胞(JIMT-1 (5T4hi )細胞，或SKOV-3 (5T4lo )細胞)的情況下，在T-細胞細胞因數釋放試驗中，評估TRIDENT-B2 、TRIDENT-B5 以及對照分子TRIDENT-1 、TRIDENT-3 和TRIDENT-4 的體外激動活性(基本上如上面實施例2中描述的進行，並且通過IFN-γ的釋放例證)。
如圖 35A-35C 中顯示的，TRIDENT-1 、TRIDENT-4 (沒有5T4結合結構域)不展示共刺激活性。也發現TRIDENT-3 (沒有CD137結合結構域)缺少任何共刺激活性。在存在高表達5T4的JIMT-1靶細胞(圖 35A )的情況下，TRIDENT-B2 和TRIDENT-B5 展示類似的劑量依賴性的共刺激活性，但是在存在低表達5T4的SKOV-3靶細胞(圖 35B )或沒有靶細胞(圖 35C )的情況下，很少或沒有共刺激活性。
這些研究的結果表明包括hCD137 MAB-3 (1E.15 )的去免疫的VH和VL結構域的CD137 x TA 結合分子展示與包括hCD137 MAB-3 (1B.3 )的優化VH和VL結構域的CD137 x TA 結合分子相當的結合和共刺激活性特徵。
在本說明書中提到的所有出版物和專利通過引用併入本文，就如同每個單獨的出版物或專利申請被特定和單獨指出通過引用以其整體併入本文的相同程度。儘管已經結合其具體的實施方式描述了本發明，但是，應理解，其能夠進一步修改並且本申請期望覆蓋大體上符合本發明的原理的本發明的任何變型、用途或改變，並且包括與本公開的這種偏離，如同是本發明所屬的領域已知的或常規實踐，並且如同可應用於前文敘述的基本特徵。
無
圖 1A-1B 提供了代表性共價結合雙抗體的簡圖，所述雙抗體具有兩個表位結合位點，其包括兩條多肽鏈，各自具有E-螺旋或K-螺旋異源二聚體促進結構域(以下提供可替選的異源二聚體促進結構域)。半胱氨酸殘基可存在於接頭中(圖 1A )和/或異源二聚體促進結構域中(圖 1B )。使用相同的網底或填充圖案顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。提供結合分子結構域的圖解展示的該圖和所有圖中的波形線(WWW)表示一個或多個任選的異源二聚體促進結構域，其優選地存在。
圖 2 提供了代表性共價結合雙抗體分子的簡圖，所述分子具有兩個表位結合位點，其包括兩條多肽鏈，各自具有CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成Fc區的全部或部分。使用相同的網底或填充圖案顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。
圖 3A-3E 提供顯示代表性共價結合四價雙抗體的簡圖，所述雙抗體具有四個表位結合位點，其包括兩對多肽鏈(即，總計四條多肽鏈)。每對多肽鏈中的一條多肽鏈具有CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成Fc區的全部或部分。使用相同的網底或填充圖案顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。兩對多肽鏈可以相同。在這種實施方式中，其中兩對多肽鏈是相同的並且VL和VH結構域識別不同的表位(如圖 3A-3B 中顯示的)，所得分子具有四個表位結合位點並且關於每個結合表位是雙特異性和二價的。在這種實施方式中，其中VL和VH結構域識別相同表位元(例如在兩條鏈上使用相同的VL結構域的CDR和相同的VH結構域的CDR)，所得分子具有四個表位結合位點並且就單個表位而言是單特異性的和四價的。可替選地，兩對多肽鏈可以不同。在這種實施方式中，其中兩對多肽鏈是不同的並且每對多肽鏈的VL和VH結構域識別不同的表位(如圖 3C 中的不同網底和圖案顯示的)，所得分子具有四個表位結合位點並且就每個結合表位而言是四特異性的和單價的。圖 3A 顯示了含Fc區的雙抗體，其包含包括半胱氨酸殘基的肽異源二聚體促進結構域。圖 3B 顯示了含Fc區的雙抗體，其包含包括半胱氨酸殘基和接頭(具有任選的半胱氨酸殘基)的E-螺旋和K-螺旋異源二聚體促進結構域。圖 3C 顯示了含Fc區的雙抗體，其包含抗體CH1和CL結構域。圖 3D-3E 圖解了圖 3B 中顯示的結合結構域的選擇可怎樣引起具有對於CD137的表位特異性的兩個結合位點和對於TA的表位特異性的兩個結合位點的CD137 x TA 結合分子。圖 3D-3E 圖解了可怎樣選擇結構域以產生具有不同定向的CD137 x TA 結合分子(即，圖 3D 採用VL CD137結構域作為結合分子的VL1結構域，VH CD137結構域作為結合分子的VH1結構域，VLTA 結構域作為結合分子的VL2結構域，和VHTA 結構域作為結合分子的VH2結構域。而圖 3E 採用VLTA 結構域作為結合分子的VL1結構域，VHTA 結構域作為結合分子的VH1結構域，VL CD137結構域作為結合分子的VL2結構域，和VH CD137結構域作為結合分子的VH2結構域)。如以下提供的，通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以相同或不同，以允許是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或四特異性的四價結合。
圖 4A 和圖 4B 提供了代表性共價結合雙抗體分子的簡圖，所述分子具有兩個表位結合位點，其包括三條多肽鏈。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成Fc區的全部或部分。包括VL和VH結構域的多肽鏈進一步包括異源二聚體促進結構域。使用相同的網底或填充圖案顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。
圖 5A-5D 提供了代表性共價結合的結合分子的簡圖，所述分子具有四個表位結合位點，其包括五條多肽鏈。圖 5A 顯示了這種CD137 x TA 結合分子的一般結構。多肽鏈中的兩條具有CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成包括Fc區的全部或部分的Fc區。包括連接的VL和VH結構域的多肽鏈進一步包括異源二聚體促進結構域。使用相同的網底或填充圖案顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。圖 5B 顯示了可替選的優選的CD137 x TA 結合分子的結構，其中已經選擇圖 5A 中顯示的可變結構域以產生所得的CD137 x TA 結合分子，其具有對於例證的TA ，HER2/neu特異性的兩個非雙抗體型結合結構域和對於CD137特異性的兩個雙抗體型結合結構域。圖 5C 顯示了可替選的優選的CD137 x TA 結合分子的結構，其中已經選擇圖 5A 中顯示的可變結構域以產生所得的CD137 x TA 結合分子，其具有對於CD137特異性的兩個非雙抗體型結合結構域和對於HER2/neu特異性的兩個雙抗體型結合結構域。圖 5D 顯示了可替選的優選的CD137 x TA結合分子的結構，其中已經選擇圖 5A 中顯示的可變結構域以產生所得的CD137 x TA結合分子，其具有對於CD137的表位特異性的兩個非雙抗體型結合結構域、對於HER2/neu的表位特異性的一個雙抗體型結合結構域和對於CD137的表位特異性的第二雙抗體型結合結構域。這種CD137表位可以是相同的或不同的。如將理解的，通過適當選擇圖 5A 中顯示的結合結構域，已經選擇結合結構域中的任意三個以結合CD137的表位。同樣地，可選擇結合結構域中的任意三個以結合HER2/neu的表位。如以下提供的，通過多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以是相同的或不同的，以允許是單特異性的、雙特異性的、三特異性的或四特異性的四價結合。
圖 6A-6F 提供了代表性的具有三個表位結合位點的含Fc區的三價結合分子的簡圖。圖 6A 示意性圖解了三價結合分子的結構域，其包括兩個雙抗體型結合結構域和具有不同結構域定向的Fab型結合結構域，其中所述雙抗體型結構域是C-末端至Fc區。圖 6B-6C 顯示了例證性優選的CD137 x TA 結合分子的結構，其中已經選擇顯示在圖 6A 中的可變結構域，以產生所得的CD137 x TA 結合分子，其具有對於CD137特異性的非雙抗體型結合結構域，對於例證性TA ，HER2/neu特異性的雙抗體型結合結構域、和對於CD137特異性的第二雙抗體型結合結構域。圖6D 示意性圖解了三價結合分子的結構域，其包括兩個雙抗體型結合結構域和具有不同結構域定向的Fab型結合結構域，其中雙抗體型結合結構域是C-末端至Fc區。圖 6A-6D 中的分子包括四條多肽鏈。圖 6E 和6F 分別示意性地圖解了三價結合分子的結構域，其包括兩個雙抗體型結合結構域N-末端至Fc區和Fab型結合結構域（其中輕鏈和重鏈經由多肽間隔區連接），或scFv型結合結構域。圖 6G 和6H 中的三價結合分子分別示意性地圖解了三價結合分子的結構域，其包括兩個雙抗體型結合結構域C-末端至Fc區和Fab型結合結構域（其中輕鏈和重鏈經由多肽間隔區連接），或scFv型結合結構域。圖 6E -6H 中的三價結合分子包括三條鏈。使用相同的網底或填充圖案顯示識別相同表位元的VL和VH結構域。
圖 7 顯示抗-CD137抗體烏瑞魯單抗(urelumab)和烏土米魯單抗(utomilumab)(分別為CD137 MAB-1 和CD137 MAB-2 )和幾個對活化的CD8+ T細胞的新型嵌合CD137 mAbs (chCD137 MAB-3 ；chCD137 MAB-4 和chCD137 MAB-5 )的結合曲線。
圖 8 顯示在已經以4x hFc F(ab)’2 交聯的抗-CD137抗體烏瑞魯單抗或烏土米魯單抗(分別為CD137 MAB-1 或CD137 MAB-2 )或新嵌合抗-CD137抗體(chCD137 MAB-3 、chCD137 MAB-4 或chCD137 MAB-5 )的存在下，在以乾燥包被的抗-CD3抗體(3 µg/mL-50 µg/mL)刺激後在72小時後由泛T細胞引起的IL-2分泌的誘導。交聯的抗體(Ab + αhFc)在0.1 μg/mL、1.0 μg/mL或10 μg/mL下使用。同樣繪製下述對照：以同種型對照抗體處理的刺激的泛T細胞、僅hFc F(ab)’2或未處理的細胞。
圖 9 顯示在存在或不存在配體(1 µg/mL CD-137L-His)的情況下，在存在交聯的嵌合抗-CD137抗體(chCD137 MAB-3 或chCD137 MAB-5 ) (1 µg/mL CD-137抗體+ 4 µg/mL hFc F(ab)’2 ) ± JIMT-1(HER2/neu++ )靶細胞的情況下，在以抗-CD3珠刺激後在72小時後由泛T細胞引起的IFN-γ分泌的誘導。同樣繪製下述對照樣品：刺激的泛T細胞± JIMT‑1細胞、刺激的泛T細胞± hFc F(ab)’2 和未處理的/未刺激的泛T細胞和JIMT-1細胞。
圖 10A-10B 顯示CD137 x TA 結合分子結合活化的CD8+ T細胞的CD137的能力，如使用FITC-標記的CD8和αhFc APC通過FACS測量的。圖 10A ：DART-B 和DART-C (包括hCD137 MAB-3 和hHER2 MAB-1 結構域)，DART-D 和DART-E (包括CD137 MAB-3 和hHER2 MAB-1 結構域)，和對照分子DART-3 (包括hHER2 MAB-1 和變體帕利珠單抗結構域)和DART-6 (包括變體帕利珠單抗和CD137 MAB-3 結構域)。圖 10B ：DART-D (包括CD137 MAB-3 和hHER2 MAB-1 結構域)、DART-F (包括CD137 MAB-4 和hHER2 MAB-1 結構域)、DART-1 和DART-4 (包括CD137 MAB-1 和hHER2 MAB-1 結構域)、DART-2 和DART-5 (包括CD137 MAB-2 和hHER2 MAB-1 結構域)和對照結合分子DART-6 (包括CD137 MAB-3 和變體帕利珠單抗結構域)。
圖 11A-11B 顯示CD137 x TA 結合分子在靶N87 (HER2+++ )胃癌細胞的表面上結合例證性TA ，HER2/neu的能力，如通過平均螢光強度(MFI)測量的。圖 11A ：DART-B 、DART-C 、DART-D 、DART-E ，和對照結合分子DART-3 和DART-6 。圖 11B ：DART-D 、DART-F 、DART-1 、DART-2 、DART-4 、DART-5 和DART-6 。
圖 12A-12B 顯示CD137 x TA 結合分子DART-B 、DART-D 和DART-G 以及對照分子DART-3 和DART-6 結合通過工程化的CHO細胞表達的CD137 (圖 12A )和通過活化的CD8+ T細胞表達的CD137(圖 12B )的能力。
圖 13A-13B 顯示CD137 x TA結合分子DART-B 、DART-D 和DART-G 以及對照分子DART-3 和DART-6 結合通過靶N87 (HER2+++ )胃癌細胞(圖 13A )和靶JIMT-1 (HER2++ )細胞(圖 13B )表達的例證性TA ，HER2/neu的能力。
圖 14A-14B 提供了在T細胞細胞因數釋放試驗中CD137 x TA 結合分子介導共刺激活性的能力的第一代表性試驗的結果(通過IFN-γ的釋放例證)。這些圖顯示了在存在表達HER2/neu的N87(HER2+++ )(圖 14A )或JIMT-1 (HER2++ )靶細胞(圖 14B )的情況下測試的DART-1 、DART-2 、DART-4 、DART-5 、DART-A 、DART-D 、DART-E 和DART-F 以及對照分子DART-3 和DART-6 的結果，使用HER2/neu陰性Hs700T靶細胞或無靶細胞時看不到共刺激活性。
圖 15A-15B 提供了在T細胞細胞因數釋放試驗中CD137 x TA 結合分子介導共刺激活性的能力的第二代表性試驗的結果(通過IFN-γ的釋放例證)。這些圖顯示了在存在表達HER2/neu的N87(HER2+++ )(圖 15A )或JIMT-1(HER2++ )靶細胞(圖 15B )的情況下測試的DART-1 、DART-2 、DART-4 、DART-5 、DART-B 、DART-D 和DART-G 以及對照分子DART-3 和DART-6 的結果，使用HER2/neu陰性Hs700T靶細胞或在不存在靶細胞的情況下看不到共刺激活性。
圖 16A 和16B 顯示CD137 x TA 結合分子介導表達CD137的報導基因細胞系(Jurkat-NF-κB-Luc)中NF/kB路徑的劑量和靶依賴性信號轉導的能力，如通過增加的螢光素酶表達所示。這些圖顯示DART-G 和對照結合分子DART-3 和DART-6 對與表達HER2/neu的JIMT-1細胞(圖 16A )或HER2/neu陰性KG-1細胞(圖 16B )共培養的表達CD137的Jurkat-NF-κB-Luc細胞的結果。
圖 17 ，圖塊 A-O 顯示CD137 x TA 結合分子在與表達TA 的靶細胞的共培養中增強T細胞增殖的能力。在DART-A (圖 17 ，圖塊 A 、 D 和 G )、DART-3 (圖 17 、圖塊 B 、 E 和 H )、DART-6 (圖 17 ，圖塊 C 、 F 和 I )或無分子(圖 17 ，圖塊 J 、 L 和 N )的存在下，CFSE-標記的人T細胞（±次最優的αCD3/αCD28刺激）與高HER2/neu的N87靶細胞(圖 17 ，圖塊 A-C 和 J-K )、低HER2/neu的MCF-7靶細胞(圖 17 ，圖塊 D-F 和 L-M )或無靶細胞(圖 17 ，圖塊 G-I 和 N-O )共培養，並且監測T細胞增殖。
圖 18A-18B 顯示CD137 x TA 結合分子DART-1 增強抗-TA抗體瑪格妥昔單抗(Margetuximab)介導的ADCC殺傷N87靶細胞(如通過細胞締合的螢光素酶活性測量的)(圖 18A )和增強瑪格妥昔單抗介導的NK細胞活化(如通過CD69表達測量的)(圖 18B )的能力。
圖 19A-19B 顯示CD137 x TA 結合分子DART-7 和對照分子DART-8 在T細胞細胞因數釋放試驗仲介導共刺激活性的能力的代表性試驗的結果(通過IFN-γ的釋放例證)。細胞因數釋放在表達EphA2的Hs700T靶細胞(圖 19A )或EphA2陰性的Hs700T (EphA2.KO)靶細胞(圖 19B )的存在下或無靶細胞存在下測量。同樣繪製以下對照樣品：刺激的泛T細胞+靶細胞，和未處理的/未刺激的泛T細胞。
圖 20A-20B 顯示具有優化的CDRH 3的DART-G 衍生物結合至在工程化的CHO細胞(圖 20A )或CD8+ T細胞(圖 20B )的表面上表達的CD137的能力。
圖 21A-21C 顯示了CD137 x TA 結合分子DART-B 、DART-D 、DART-G 、DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 和對照分子DART-3 、DART-6 在T細胞細胞因數釋放試驗仲介導共刺激活性的能力的代表性試驗的結果(通過IFN-γ的釋放例證)。細胞因數釋放在存在表達HER2/neu的N87靶細胞(圖 21A )、JIMT-1靶細胞(圖 21B )或MDA-231靶細胞(圖 21C )的情況下或沒有靶細胞的情況下測量。
圖 22 顯示CD137 x TA 結合分子DART-B 、DART-G 、DART-G1 、DART-G2 、DART-G3 和DART-G4 以及對照分子DART-3 、DART-6 介導N87 (HER2+++ )靶細胞的重導向細胞殺傷的能力的代表性試驗的結果，如通過細胞締合的螢光素酶活性測量的。
圖 23A-23C 顯示CD137 x TA 結合分子結合表達例證性TA ，HER2/neu的不同細胞的能力，如通過平均螢光強度(MFI)測量的。圖 23A ：結合至N87 (HER2+++ )胃癌細胞。圖 23B ：結合至JIMT-1 (HER2++)乳癌細胞。圖 23C ：結合至MCF-7 (HER2+)乳腺癌細胞。對於TRIDENT-A 、 TRIDENT-A2 、 TRIDENT-A3 、 TRIDENT-A4 、 DART-G 、DART-G2 、DART-G3 、DART-G4 以及對照結合分子TRIDENT-1 和TRIDENT-2 的結合顯示在兩個圖塊中。
圖 24A-24B 顯示CD137 x TA 結合分子結合至通過活化的CD8+ T細胞表達的CD137的能力。圖 24A ：TRIDENT-A 、TRIDENT-A2 、TRIDENT-A3 、TRIDENT-A4 以及對照結合分子TRIDENT-1 和TRIDENT-2 。圖 24B ：DART-G 、DART-G2 、DART-G3 、DART-G4 以及對照結合分子TRIDENT-1 和TRIDENT-2 。
圖 25A-25C 顯示CD137 x TA 結合分子介導表達CD137的CHO細胞和表達例證性TA ，HER2/neu的細胞之間的細胞-細胞接合的能力，FACS。圖 25A ：與N87 (HER2+++ )胃癌細胞的細胞-細胞接合。圖 25B ：與JIMT-1 (HER2++)乳癌細胞的細胞-細胞接合。圖 25C ：與MCF-7 (HER2+)乳腺癌細胞的細胞-細胞接合。TRIDENT-A 、TRIDENT-A2 、TRIDENT-A3 、TRIDENT-A4 、DART-G4 和TRIDENT-2 對照結合分子的活性顯示在兩個圖塊中。
圖 26A-26C 顯示CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A 、 TRIDENT-A2 、 TRIDENT-A3 、 TRIDENT-A4 、 DART-G 、DART-G2 、DART-G3 、DART-G4 以及對照結合分子TRIDENT-1 和TRIDENT-2 在T細胞細胞因數釋放試驗仲介導共刺激活性的能力的代表性試驗的結果(通過IFN-γ的釋放例證)。細胞因數釋放在表達HER2/neu的N87靶細胞(圖 26A )、JIMT-1靶細胞(圖 26B )的存在下或在沒有靶細胞存在下(圖 26C )測量。
圖 27 顯示，與對照分子(TRIDENT-1 )比較，示例性的CD137 x TA 結合分子(TRIDENT-A2 )增強TA x CD3 雙抗體-介導的Colo205/Luc靶細胞的重導向T-細胞殺傷的能力，如通過細胞締合的螢光素酶測量的。
圖 28A-28C 顯示存在於1 mg以下述處理後取樣的腫瘤中的T-細胞標記的表達：媒介對照(●)；TRIDENT-A2 (▼)；TA x CD3 雙抗體(■)；TRIDENT-A2 和TA x CD3 雙抗體的組合(♦)；抗-PD-1 mAb (▼)；或TRIDENT-A2 、TA x CD3 雙抗體和抗 -PD-1 mAb 的組合。圖 28A ：CD4表達，圖 28B ：CD8表達，圖 28C ：CD69表達，圖 28D ：PD-1表達。
圖 29 顯示下述在PBMC-重建的小鼠異種移植模型中抑制卵巢癌細胞的腫瘤生長或發展的能力：媒介對照(●)；TRIDENT-A2 (▼)；TA x CD3 雙抗體(■)；TRIDENT-A2 和TA x CD3 雙抗體的組合(♦)；抗-PD-1 mAb (▼)；和TRIDENT-A2 、TA x CD3 雙抗體和抗 -PD-1 mAb 的組合。
圖 30 顯示CD137 x TA 結合分子TRIDENT-A2 、 TRIDENT-B2 以及對照結合分子TRIDENT-1 和TRIDENT-2 在食蟹猴T細胞細胞因數釋放試驗仲介導共刺激活性的能力(通過IFN-γ的釋放例證)。細胞因數釋放在存在表達5T4和HER2/neu的JIMT-1靶細胞的情況下進行測量。
圖 31A-31B 描述了hCD137 MAB-3 VH1B (圖 30A ， SEQ ID NO:84 )和hCD137 MAB-3 VL3 (圖 30B ， SEQ ID NO:89 )的氨基酸序列。底線指示CDR殘基。替換的位置被框起並且Kabat數以箭頭指示；連續的氨基酸殘基編號在序列上方指示。
圖 32A-32B 顯示包括去免疫的VH和VL結構域的抗-CD137抗體結合至活化的CD4+ T細胞或CD8+ T細胞的CD137的能力，如使用V510-標記的CD4+ 和αhFc APC(圖 32A )或FITC-標記的CD8和αhFc APC(圖 32B )通過FACS測量的。
圖 33A-33B 顯示在優化的/去免疫的抗-CD137抗體CD137 MAB-3 (1b.3 )、CD137 MAB-3 (1E.15 )和CD137 MAB-3 (1G.15 )的存在下，在不存在交聯(圖 33A )或與4x hFc F(ab)’2 交聯(圖 33B )的情況下，在以乾燥包被的抗-CD3抗體(3 µg/mL-50 µg/mL)刺激72小時後，通過泛T細胞的IFN-γ的誘導。
圖 34A-34C 顯示CD137 x TA 結合分子TRIDENT-B2 、TRIDENT-B5 和對照分子TRIDENT-1 、TRIDENT-3 和TRIDENT-4 結合至在活化的CD8+ T細胞表面上的CD137的能力(如使用FITC-標記的CD8和αhFc APC通過FACS測量的)(圖 34A )，以及結合至在JIMT-1的表面上的例證性TA ，5T4 (5T4hi ) (圖 34B )或SKOV-3(5T4lo )靶細胞(圖 34C )的能力。
圖 35A-35C 顯示在T細胞細胞因數釋放試驗中CD137 x TA 結合分子介導共刺激活性的能力(通過IFN-γ的釋放例證)。這些圖 顯示在存在表達5T4的JIMT-1 (5T4hi ) (圖 35A )或SKOV-3 (5T4lo ) (圖 35B )靶細胞的情況下測試的TRIDENT-B2 、TRIDENT-B5 和對照分子TRIDENT-1 、TRIDENT-3 和TRIDENT-4 的結果，在沒有靶細胞的情況下看不到共刺激活性(圖 35C )。

Claims (41)

  1. 一種CD137 x TA 結合分子，其中所述結合分子能夠特異性結合CD137的表位和腫瘤抗原(TA )的表位，並且其中所述CD137 x TA 結合分子包括第一輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3，和第一重鏈可變結構域，所述第一重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中， (A) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (B) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (C) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (D) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (E) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (F) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (G) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 )的重鏈CDR； (H) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90 )的重鏈CDR； (I) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96 )的重鏈CDR； (J) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )的重鏈CDR； (K) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (L) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )的重鏈CDR； 或 (M) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )的重鏈CDR。
  2. 根據請求項1所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述第一重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208 )； (B)hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )； (C)hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )； (D)hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 )； (E)hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )； (F)hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )； (G)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77 )；或 (H)hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92 )。
  3. 根據請求項1至2中任一項所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述第一輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )； (B)hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )； (C)hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87 )； (D)hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88 )； (E)hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 )； (F)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82 )； (G)hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94 )；或 (H)hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95 )。
  4. 根據請求項1至3中任一項所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA )選自由下述組成的腫瘤抗原的組：19.9；癌胚蛋白5T4；抗原4.2；A33；AFP；ALCAM；BAGE；β-聯蛋白；CA125；羧肽酶M；B1；CD5；CD19；CD20；CD22；CD23；CD25；CD27；CD30；CD33；CD36；CD46；CD52；CD79a/CD79b；CD123；CD317；CEA；CEACAM5；CEACAM6；CO-43；CO-514；CTLA-1；CTLA-4；細胞角蛋白8；E1系列；EGF-R；肝配蛋白受體；Erb；F3；FC10.2；GAGE GD2；GD3；GD49；GM2；GM3；GICA 19-9；gp37；gp75；gp100；HER-2/neu；人B-淋巴瘤抗原-CD20；人乳脂小球抗原；人乳頭狀瘤病毒-E6/人乳頭狀瘤病毒-E7；HMW-MAA；I抗原；ITGB6；IL13Rα2；JAM-3；KID3；KID31；KS 1/4泛癌抗原；KS 1/4；KSA；L6；L20；LEA；LUCA-2；M1:22:25:8；M18；M39；MAGE；MART；Myl；MUC-1；MUM-1；N-乙醯葡糖氨基轉移酶；擬糖蛋白；NS-10；OFA-1；OFA-2；制癌蛋白M；p15；PSA；PSMA；PEMA；PIPA；前列腺酸性磷酸酶；R24；ROR1；SSEA-1；SSEA-3；SSEA-4；sTn；T細胞受體衍生肽；TAG-72；TL5；TNF-α受體；TNF-ß受體；TNF-γ受體；TRA-1-85；鐵轉蛋白受體；TSTA；和VEGF-R。
  5. 根據請求項4所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA )是HER2/neu並且其中所述CD137 x TA 結合分子包括第二輕鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和第二重鏈可變結構域，所述第二重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中 (A) 所述第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63 )的輕鏈CDR；和 (B) 所述第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62 )的重鏈CDR。
  6. 根據請求項5所述的CD137 x TA 結合分子，其中： (A) (1) 所述第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )的輕鏈CDR； (2) 所述第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )的輕鏈CDR；或 (3) 所述第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )的輕鏈CDR； 和 (B) (1) 所述第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )的重鏈CDR； (2) 所述第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )的重鏈CDR；或 (3) 所述第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )的重鏈CDR。
  7. 根據請求項6所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述第二重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )； (B)hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )。
  8. 根據請求項6或7所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述第二輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )； (B)hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )；或 (C)hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )。
  9. 根據請求項4所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA )是5T4，並且其中所述CD137 x TA 結合分子包括第二輕鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和第二重鏈可變結構域，所述第二重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中： (I) (A) 所述第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-1 VL (SEQ ID NO:135 )的輕鏈CDR；和 (B) 所述第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-1 VH (SEQ ID NO:134 )的重鏈CDR；或 (II) (A) 所述第二輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-2 VL (SEQ ID NO:137 )的輕鏈CDR；和 (B) 所述第二重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-2 VH (SEQ ID NO:136 )的重鏈CDR。
  10. 根據請求項9所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述第二重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列：MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:135 )。
  11. 根據請求項9或10所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述第二輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列：MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:136 )。
  12. 根據請求項1至11中任一項所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述分子是包括第一、第二、第三和第四多肽鏈的雙特異性四價具有Fc的雙抗體，其中所述多肽鏈形成共價鍵合的複合物。
  13. 根據請求項1至11中任一項所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述分子是雙特異性和四價的，並且包括第一、第二、第三、第四和第五多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價鍵合的複合物。
  14. 根據請求項1至11中任一項所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述分子是雙特異性和三價的，並且包括第一、第二、第三和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價鍵合的複合物。
  15. 根據請求項14所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA )是HER2/neu，並且其中： (A) 所述第一多肽鏈具有SEQ ID NO:192 、SEQ ID NO:193 、SEQ ID NO:194 、SEQ ID NO:195 、SEQ ID NO:196 或SEQ ID NO:229 的氨基酸序列； (B) 所述第二多肽鏈具有SEQ ID NO:197 、SEQ ID NO:198 、SEQ ID NO:199 、SEQ ID NO:200 、SEQ ID NO:163 或SEQ ID NO:230 的氨基酸序列； (C) 所述第三多肽鏈具有SEQ ID NO:104 的氨基酸序列；和 (D) 所述第四多肽鏈具有SEQ ID NO: 105 的氨基酸序列。
  16. 根據請求項14所述的CD137 x TA 結合分子，其中所述腫瘤抗原(TA )是5T4，並且其中： (A) 所述第一多肽鏈具有SEQ ID NO:192 、SEQ ID NO:193 、SEQ ID NO:194 、SEQ ID NO:195 、SEQ ID NO:196 或SEQ ID NO:229 的氨基酸序列； (B) 所述第二多肽鏈具有SEQ ID NO:197 、SEQ ID NO:198 、SEQ ID NO:199 、SEQ ID NO:200 、SEQ ID NO:201 、或SEQ ID NO:230 的氨基酸序列； (C) 所述第三多肽鏈具有SEQ ID NO:231 的氨基酸序列；和 (D) 所述第四多肽鏈具有SEQ ID NO:232 的氨基酸序列。
  17. 一種藥物組合物，其包括根據請求項1至16中任一項所述的CD137 x TA 結合分子，和生理學上可接受的載體。
  18. 根據請求項1至16中任一項所述的CD137 x TA 結合分子、或根據請求項17所述的藥物組合物在治療與表達所述腫瘤抗原(TA )相關或特徵在於表達所述腫瘤抗原(TA )的疾病或病症中的用途。
  19. 根據請求項18所述的用途，其中所述與表達所述腫瘤抗原(TA )相關或特徵在於表達所述腫瘤抗原(TA )的疾病或病症是癌症。
  20. 一種CD137結合分子，其包括輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；其中： (A) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (B) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (C) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL11 (SEQ ID NO:218 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (D) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL10 (SEQ ID NO:217 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (E) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL6 (SEQ ID NO:213 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (F) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL4 (SEQ ID NO:211 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (G) (1) 所述輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH (SEQ ID NO:74 )的重鏈CDR； (H) (1) 所述輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-4 VL (SEQ ID NO:91 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-4 VH (SEQ ID NO:90 )的重鏈CDR； (I) (1) 所述輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-5 VL (SEQ ID NO:97 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-5 VH (SEQ ID NO:96 )的重鏈CDR； (J) (1) 所述輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )的重鏈CDR； (K) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )的重鏈CDR； (L) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )的重鏈CDR；或 (M) (1) 所述第一輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-3 VL (SEQ ID NO:75 )的輕鏈CDR；和 (2) 所述第一重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )的重鏈CDR。
  21. 根據請求項20所述的CD137結合分子，其中所述重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VH1E (SEQ ID NO:208 )； (B)hCD137 MAB-3 VH1B (SEQ ID NO:84 )； (C)hCD137 MAB-3 VH1A (SEQ ID NO:83 )； (D)hCD137 MAB-3 VH1 (SEQ ID NO:76 )； (E)hCD137 MAB-3 VH1C (SEQ ID NO:85 )； (F)hCD137 MAB-3 VH1D (SEQ ID NO:86 )； (G)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:77 )；或 (H)hCD137 MAB-4 VH1 (SEQ ID NO:92 )。
  22. 根據請求項20至21中任一項所述的CD137結合分子，其中所述輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-3 VL15 (SEQ ID NO:222 )； (B)hCD137 MAB-3 VL14 (SEQ ID NO:221 )； (C)hCD137 MAB-3 VL1 (SEQ ID NO:87 )； (D)hCD137 MAB-3 VL2 (SEQ ID NO:88 )； (E)hCD137 MAB-3 VL3 (SEQ ID NO:89 )； (F)hCD137 MAB-3 (SEQ ID NO:82 )； (G)hCD137 MAB-4 VL1 (SEQ ID NO:94 )；或 (H)hCD137 MAB-4 VL2 (SEQ ID NO:95 )。
  23. 根據請求項20至22中任一項所述的CD137結合分子，其中所述分子是抗體或其抗原結合片段。
  24. 一種藥物組合物，其包括根據請求項20至23中任一項所述的CD137結合分子，和生理學上可接受的載體。
  25. 根據請求項20至23中任一項所述的CD137結合分子、或根據請求項24所述的藥物組合物在治療與抑制的免疫系統相關或特徵在於表達腫瘤抗原(TA )的疾病或病症中的用途。
  26. 根據請求項25所述的用途，其中所述與抑制的免疫系統相關或特徵在於表達所述腫瘤抗原(TA )的病症是癌症。
  27. 一種HER2/neu結合分子，其包括輕鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3；和重鏈可變結構域，所述重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；其中： (A) (1) 所述輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63 )的輕鏈CDR； (2) 所述輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )的輕鏈CDR； (3) 所述輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )的輕鏈CDR；或 (4) 所述輕鏈可變結構域的CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )的輕鏈CDR； 和 (B) (1) 所述重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62 )的重鏈CDR； (2) 所述重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )的重鏈CDR； (3) 所述重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )的重鏈CDR；或 (4) 所述重鏈可變結構域的CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )的重鏈CDR。
  28. 根據請求項27所述的HER2/neu結合分子，其中所述重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)HER2 MAB-1 VH (SEQ ID NO:62 ) (B)hHER2 MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:64 )； (C)hHER2 MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:65 )；或 (D)hHER2 MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:66 )。
  29. 根據請求項27或28所述的HER2/neu結合分子，其中所述輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： (A)HER2 MAB-1 VL (SEQ ID NO:63 )； (B)hHER2 MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:67 )； (C)hHER2 MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:68 )；或 (D)hHER2 MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:69 )。
  30. 根據請求項27至29中任一項所述的HER2/neu結合分子，其中所述分子是抗體或其抗原結合片段。
  31. 一種藥物組合物，其包括根據請求項27至30中任一項所述的HER2/neu結合分子，和生理學上可接受的載體。
  32. 根據請求項27至30中任一項所述的HER2/neu結合分子、或根據請求項31所述的藥物組合物在治療與表達HER2/neu相關或特徵在於表達HER2/neu的疾病或病症中的用途。
  33. 根據請求項32所述的用途，其中所述與表達HER2/neu相關或特徵在於表達HER2/neu的病症是癌症。
  34. 根據請求項19、26或33中任一項所述的用途，其中所述癌症選自由下述組成的組：膀胱癌、乳腺癌、結腸直腸癌、胃癌、膠質母細胞瘤、腎癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤和頭頸扁平細胞癌(SCCHN)。
  35. 一種增強腫瘤靶向劑的活性的方法，其包括結合根據請求項1至16中任一項所述的CD137 x TA 結合分子或根據請求項17所述的藥物組合物施用所述腫瘤靶向劑。
  36. 一種治療與抑制的免疫系統相關或特徵在於表達腫瘤抗原(TA)的疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受試者施用根據請求項1至16中任一項所述的CD137 x TA 結合分子或根據請求項17所述的藥物組合物。
  37. 根據請求項36所述的方法，其中所述與抑制的免疫系統相關或特徵在於表達腫瘤抗原(TA)的病症是癌症。
  38. 根據請求項36或37所述的方法，進一步包括施用腫瘤靶向劑。
  39. 根據請求項36至38中任一項所述的方法，進一步包括施用PD-1/PD-L1檢查點抑制劑。
  40. 根據請求項35或38所述的方法，其中所述腫瘤靶向劑是抗體、抗體的表位結合片段、或介導靶細胞的T-細胞重導向殺傷的試劑。
  41. 根據請求項39或40中任一項所述的方法，其中所述PD-1/PD-L1檢查點抑制劑是抗-PD-1抗體或抗-PD-L1抗體。
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