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TWI889761B - Ｃｄ１３７結合分子及其用途 - Google Patents

Ｃｄ１３７結合分子及其用途

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TWI889761B
TWI889761B TW110106005A TW110106005A TWI889761B TW I889761 B TWI889761 B TW I889761B TW 110106005 A TW110106005 A TW 110106005A TW 110106005 A TW110106005 A TW 110106005A TW I889761 B TWI889761 B TW I889761B
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君朵 迪瑞希
保羅 摩爾
愛利歐 波維尼
坎帕納 尚
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Abstract

本發明涉及具有對CD137的表位特異性的一個或多個表位結合位點的結合分子，包括抗體、以及包括其表位結合片段的分子。本發明進一步涉及包括對CD137的表位特異性的一個或多個表位-結合位點和對腫瘤抗原（“TA ”）的表位特異性的一個或多個表位-結合位點的多特異性結合分子（例如“CD137 x TA 結合分子 ”）。在一個實施方式中，這種CD137 x TA 結合分子 將是雙特異性分子，特別是雙特異性四價雙抗體，其具有各自對CD137的表位特異性的兩個表位-結合位點和各自對TA 的表位特異性的兩個表位結合位點。可選地，此類CD137 x TA 結合分子 將是雙特異性分子，其具有各自對CD137的表位特異性的兩個表位結合位點和各自對TA 的表位特異性的一個表位結合位點。本發明還提供了新穎的結合分子 ，及其衍生物和其用途。本發明涉及含有這種CD137 分子的藥物組合物。本發明還涉及用於在癌症以及其他疾病和病況的治療中使用此類分子的方法。

Description

CD137結合分子及其用途
[相關申請的交叉引用]
本申請案主張美國專利申請號62/980,000 (在2020年2月21日提交；申請中)、63/104,685 (2020年10月23日提交；申請中)、和63/147,565 (2021年2月9日提交)的優先權，出於所有目的，其每一篇通過引用以其整體併入本文。 [序列表的引用]
本申請案包含序列表，該序列表已經以ASCII格式電子提交，並且通過引用以其全部內容合併於此。所述ASCII副本創建於2021年2月12日，名為MAC-0111-PC_SL.txt，大小為224,061位元組，該檔以其整體通過引用併入本文。
本技術涉及CD137 結合分子 ，例如單特異性抗體，以及包含其表位結合片段的分子，其能夠結合CD137的表位。該技術進一步涉及能夠與CD137的表位和第二抗原的表位兩者結合的多特異性CD137 結合分子 （例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、BiTE、三價結合分子等），第二抗原尤其是腫瘤抗原（“TA ”）（例如“CD137 x TA 結合分子 ”）。該技術也提供了能夠與PD-L1的表位結合的新穎的PD-L1 結合分子 例如單特異性抗體，以及包括其表位結合片段的分子，及其衍生物和其用途。本技術還涉及包含這種分子的藥物組合物。該技術也包括在疾病的治療中這種分子的用途，特別是癌症或與存在免疫系統抑制有關或以存在免疫系統抑制為特徵的疾病或病症。
CD137（也稱為4-1BB和“TNF受體超家族成員9”（“TNFRSF9”））是腫瘤壞死因數受體超家族的共刺激受體成員，介導CD28依賴性和獨立的T細胞共刺激（Vinay, D.S.和Kwon, B.S. (1998) “Role of 4-1BB in immune responses ,” Semin Immunol. 10:481–489; Croft, M. (2009) “The Role Of TNF Superfamily members In T-Cell Function And Diseases ,” Nat. Rev. Immunol. 9:271-285）。CD137由T細胞、自然殺傷（NK）細胞、樹突狀細胞（DC）、B細胞和免疫系統的其他細胞誘導表達。CD137與其配體CD137L（4-1BBL; TNFSF9）或激動劑抗體的連接會誘發各種T細胞應答，例如細胞擴增、細胞因數分泌增加以及啟動誘導的細胞死亡的預防。因此，刺激CD137的抗體可以誘導T細胞的存活和增殖，從而增強抗腫瘤免疫應答。這種認識導致了這樣的建議，即可以使用對CD137是免疫特異性的抗體來啟動免疫系統，從而為癌症提供治療(Li, S.Y.等人，(2013) “Immunotherapy Of Melanoma With The Immunecostimulatory Monoclonal Antibodies Targeting CD137 ,” Clin. Pharmacol. 5:47-53; Bartkowiak, T.等人，(2015) “4-1BB Agonists: Multi-Potent Potentiators Of Tumor Immunity ,” Frontiers Oncol. 5:117)。已經描述了抗CD137抗體utomilumab和烏瑞魯單抗，但是它們的臨床發展因療效低（utomilumab）或嚴重的肝毒性（烏瑞魯單抗）而受阻。
提供了改進的組合物，其能夠更加有力地刺激和引導人體的免疫系統攻擊癌細胞，同時避免與在沒有交聯的情況下展示出高活性的抗體相關的毒性。因為儘管適應性免疫系統可以是針對癌症和疾病的有效防禦機制，但由CD137的共刺激活性降低/不存在，它常常受到腫瘤微環境中免疫抑制/逃避機制的阻礙。此外，腫瘤環境中腫瘤細胞、免疫細胞和基質細胞表達的共抑制分子可以顯著減弱針對癌細胞的T細胞應答。
提供了CD137結合分子，特別是能夠與CD137的表位和腫瘤抗原的表位二者結合的CD137 x TA結合分子。這樣的雙特異性分子能夠結合在腫瘤細胞表面上表達的腫瘤抗原，並且能夠將表達CD137的免疫細胞共定位於這樣的腫瘤細胞。這種共定位上調免疫細胞，從而促進免疫系統的啟動或持續啟動（例如，刺激針對腫瘤細胞的細胞毒性T細胞應答）。這些特性使得這種雙特異性分子在刺激免疫系統，特別是在癌症的治療中具有效用。本技術針對這些和其他目標。
因此，在某些方面，提供了能夠與CD137的表位結合的CD137 結合分子 ，例如單特異性抗體，以及包含其表位結合片段的分子。本發明進一步涉及能夠與CD137的表位和第二抗原的表位兩者結合的多特異性CD137 結合分子 （例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、BiTE、三價結合分子等），第二抗原尤其是腫瘤抗原（“TA ”）（例如“CD137 x TA 結合分子 ”）。本發明還提供了能夠與PD-L1的表位結合的新穎的PD-L1 結合分子 ，例如單特異性抗體，以及包含其表位結合片段的分子，及其衍生物和其用途。本發明還涉及包含這種分子的藥物組合物。本發明還包括在疾病的治療中這種分子的用途，特別是在癌症或與存在免疫系統抑制有關或以存在免疫系統抑制為特徵的疾病或病症中。
本發明提供了新穎的CD137 結合分子 ，其展示出期望的特點，特別是當併入多特異性分子中時。本發明還涉及多特異性CD137 x TA 結合分子 ，其包括彼此締合以形成兩個結合位點的多肽鏈，每個結合位點對於CD137的表位是特異性的，並且兩個結合位點各自對於TA 的表位是特異性的。本發明的這種CD137 x TA 結合分子 被稱為“雙特異性四價 ”。本發明還涉及CD137 x TA 結合分子 ，其包括彼此締合以形成兩個結合位點的多肽鏈，每個結合位點對CD137的表位是特異的並且一個結合位點對TA 的表位是特異的。本發明的這種CD137 x TA 結合分子 被稱為“雙特異性三價 ”。本發明的結合分子（例如，CD137 結合分子 ）有時包括第一結合位點，而不包括免疫特異性結合與第一結合位點所結合的抗原不同的抗原的第二結合位點。因此，本發明的結合分子有時僅包含第一結合位點和第一輕鏈可變結構域和第一重鏈可變結構域，而不包括結合與第一結合位點不同的抗原的第二結合位點、第二輕鏈可變結構域或第二重鏈可變結構域，並且這種結合分子的非限制性示例包括scFv、抗體和Fab結合分子。
本發明提供了包含四條多肽鏈（“第一”、“第二”、“第三”和“第四”多肽鏈）的CD137 x TA 結合分子 ，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合，第三和第四多肽鏈彼此共價結合，並且第一和第三多肽鏈彼此共價結合。還提供了包括五條多肽鏈（“第一”、“第二”、“第三”、“第四”和“第五”多肽鏈）的本發明的CD137 x TA 結合分子 ，其中第一和第二多肽鏈彼此共價結合，第三和第四多肽鏈彼此共價結合，第三和第五多肽鏈彼此共價結合，第一和第三條肽鏈彼此共價結合。
詳細地，本發明提供了CD137 結合分子 ，其包括與CD137的表位免疫特異性結合的第一結合位點，其中所述第一結合位點包括第一輕鏈可變結構域和第一重鏈可變結構域，所述第一輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3，所述第一重鏈可變結構域包含CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中 (A)第一輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） 的輕鏈CDR；和 (B)第一重鏈可變結構域CDRH 1，CDRH 2和CDRH 3是CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） 的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中第一重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hCD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） 。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中第一輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hCD137 MAB-6 VLx (SEQ ID NO:54 )； (B)hCD137 MAB-6 VL1 (SEQ ID NO:50 )； (B)hCD137 MAB-6 VL2 (SEQ ID NO:55 )；或 (C)hCD137 MAB-6 VL3 (SEQ ID NO:56 )。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中： （A）第一重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hCD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ；和 （B）第一輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hCD137 MAB-6 VL3 （ SEQ ID NO ： 56 ） 。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的所有以上實施方式，其中所述分子是雙特異性分子，其包括免疫特異性結合TA 的第二結合位點，並且其中所述第二結合位點包括第二輕鏈可變結構域和第二重鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3，以及所述第二重鏈可變結構域包括CDRH 1，CDRH 2和CDRH 3。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中TA 選自表 1-2 中所示的腫瘤抗原。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中TA 是PD-L1，並且其中： （A）第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hPD-L1 MAB-2 VLx （ SEQ ID NO ： 63 ） 的輕鏈CDR；和 （B）第二重鏈可變結構域CDRH 1，CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VHx （ SEQ ID NO ： 59 ） 的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中： (A)     (1)       第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hPD-L1 MAB-2 VL1 （ SEQ ID NO ： 58 ） 的輕鏈CDR；或者 (2)       第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hPD-L1 MAB-2 VL2 （ SEQ ID NO ： 72 ） 的輕鏈CDR；和 (B)       (1)       第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH1 （ SEQ ID NO ： 57 ） 的重鏈CDR； (2)       第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 （ SEQ ID NO ： 67 ） 的重鏈CDR； (3)       第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH3 （ SEQ ID NO ： 68 ） 的重鏈CDR； (4)       第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 （ SEQ ID NO ： 69 ） 的重鏈CDR； (5)       第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 （ SEQ ID NO ： 70 ） 的重鏈CDR；或 (6)       第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 （ SEQ ID NO ： 71 ） 的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：（ A ） hPD-L1 MAB-2 VH1 （ SEQ ID NO ： 57 ） ; （ B ） hPD-L1 MAB-2 VH2 （ SEQ ID NO ： 67 ） ; （ C ） hPD-L1 MAB-2 VH3 （ SEQ ID NO ： 68 ） ; （ D ） hPD-L1 MAB-2 VH4 （ SEQ ID NO ： 69 ） ; （ E ） hPD-L1 MAB-2 VH5 （ SEQ ID NO ： 70 ） ;或（ F ） hPD-L1 MAB-2 VH6 （ SEQ ID NO ： 71 ） 。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：（ A ） hPD-L1 MAB-2 VL1 （ SEQ ID NO ： 58 ） ；或（ B ） hPD-L1 MAB-2 VL2 （ SEQ ID NO ： 72 ）。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中TA為5T4，並且其中： (A)     (1)     第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-1 VL （ SEQ ID NO ： 93 ） 的輕鏈CDR；和 (2)     第二重鏈可變結構域CDRH 1，CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-1 VH （ SEQ ID NO ： 92 ） 的重鏈CDR；或 (B)    (1)    第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-2 VL （ SEQ ID NO ： 95 ） 的輕鏈CDR；和 (2)    第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4MAB-2VH （ SEQ ID NO ： 96 ） 的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：5T4MAB-1VH （ SEQ ID NO ： 92 ） 。
本發明還涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：5T4 MAB-1 VL （ SEQ ID NO ： 93 ） 。
本發明進一步涉及這樣的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是HER2，並且其中： (A)     第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2-MAB-1 VLx (SEQ ID NO:79) 的輕鏈CDR；和 (B)    第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2-MAB-1 VHx (SEQ ID NO:78 )的重鏈CDR；
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中： (A)     (1)     第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2-MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:83 )的輕鏈CDR； (2)     第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2-MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:84 )的輕鏈CDR；或 (3)     第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2-MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:85 )的輕鏈CDR； 和 (B)     (1)     第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2-MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:80 )的重鏈CDR； (2)     第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2-MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:81 )的重鏈CDR；或 (3)    第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2-MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:82 )的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hHER2-MAB-1 VHx (SEQ ID NO:78 )； (B)hHER2-MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:80 )； (C)hHER2-MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:81 )；或 (D)hHER2-MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:82 )。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hHER2-MAB-1 VLx (SEQ ID NO:79 )； (B)hHER2-MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:83 )； (C)hHER2-MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:84 )；或 (D)hHER2-MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:85 )。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的所有以上實施方式，其中所述分子是抗體、具有雙特異性四價Fc的雙抗體或雙特異性三價分子。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中所述分子是雙特異性和四價的，並且包括第一、第二、第三、第四和任選地第五多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中所述分子是雙特異性和三價的，並且包括第一、第二、第三和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
本發明另外涉及所有這種CD137 結合分子 的實施方式，其中所述分子包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同種型的Fc區，並且任選地，其中所述分子還包含鉸鏈結構域。
本發明另外涉及所有這種CD137 結合分子 的實施方式，其中Fc區為變體Fc區，其包括一個或多個氨基酸修飾，所述氨基酸修飾降低了變體Fc區對FcγR的親和力和/或增強了血清半衰期，並且更特別地，其中所述修飾包括選自由下述組成的組中的至少一種氨基酸置換： (A)     L234A；L235A； (B)     L234A和L235A； (C)     M252Y；M252Y和S254T； (D)     M252Y和T256E； (E)     M252Y，S254T和T256E；或 (F)     K288D和H435K； 其中編號是Kabat中EU索引的編號。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中TA 是PD-L1，並且其中： (A)     第一和第三多肽鏈包括氨基酸序列SEQ ID NO:116 、SEQ ID NO:118 、SEQ ID NO:120 ；和 (B)     第二和第四多肽鏈包括氨基酸序列SEQ ID NO:117 、SEQ ID NO:119 、SEQ ID NO:121 、SEQ ID NO:122 、SEQ ID NO:123 、SEQ ID NO:124 、SEQ ID NO:125 、SEQ ID NO:126 、或EQ ID NO:139 。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中所述分子包括： (A)SEQ ID NO:116 和SEQ ID NO:117 ； (B)SEQ ID NO:118 和SEQ ID NO:119 ； (C)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:119 ； (D)SEQ ID NO:118 和SEQ ID NO:121 ； (E)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:121 ； (F)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:122 ； (G)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:123 ； (H)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:124 ； (I)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:125 ； (J)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:126 ；或 (K)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:139 。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中TA 是PD-L1，並且其中： (A)     第一多肽鏈包括氨基酸序列SEQ ID NO:127 、SEQ ID NO:133 或SEQ ID NO:135 ； (B)     第二多肽鏈包括氨基酸序列SEQ ID NO:128 、SEQ ID NO:134 或SEQ ID NO:136 ； (C)     第三多肽鏈包括氨基酸序列SEQ ID NO:129 或SEQ ID NO:131 ；和 (D)     第四多肽鏈包括氨基酸序列SEQ ID NO:130 、SEQ ID NO:132 。
本發明進一步涉及這種CD137 結合分子 的實施方式，其中所述分子包括： (A)SEQ ID NO:127 、SEQ ID NO:128 、SEQ ID NO:129 和SEQ ID NO:130 ； (B)SEQ ID NO:127 、SEQ ID NO:128 、SEQ ID NO:131 和SEQ ID NO:132 ； (C)SEQ ID NO:133 、SEQ ID NO:134 、SEQ ID NO:131 和SEQ ID NO:132 ；或 (D)SEQ ID NO:135 、SEQ ID NO:136 、SEQ ID NO:131 和SEQ ID NO:132 。
本發明另外涉及一種藥物組合物，其包含任意上述CD137 結合分子 和生理學上可接受的載體。
本發明另外涉及這樣的CD137 結合分子 或這樣的藥物組合物在治療以TA 表達為特徵的癌症中的用途。
本發明另外涉及一種PD-L1 結合分子 ，其包括包含CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3的輕鏈可變結構域以及包含CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3的重鏈可變結構域；其中： (A)     輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2、和  CDRL 3是hPD-L1 MAB-2 VL2 (SEQ ID NO:72 )的輕鏈CDR； 和 (B)     (1)     重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2、和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:67 )的重鏈CDR； (2)     重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2、和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH3 (SEQ ID NO:68 )的重鏈CDR； (3)    第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH4 (SEQ ID NO:69 )的重鏈CDR； (4)     第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH5 (SEQ ID NO:70 )的重鏈CDR；或 (5)     第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH6 (SEQ ID NO:71 )的重鏈CDR。
本發明進一步涉及這種PD-L1 結合分子 的實施方式，其中重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:67 )； (B)hPD-L1 MAB-2 VH3 (SEQ ID NO:68 )； (C)hPD-L1 MAB-2 VH4 (SEQ ID NO:69 )； (D)hPD-L1 MAB-2 VH5 (SEQ ID NO:70 )；或 (E)hPD-L1 MAB-2 VH6 (SEQ ID NO:71 )。
本發明進一步涉及這種PD-L1 結合分子 的實施方式，其中輕鏈可變結構域包括hPD-L1 MAB-2 VL2 （ SEQ ID NO ： 72 ） 的氨基酸序列。
本發明進一步涉及這種PD-L1 結合分子 的實施方式，其中所述分子為抗體或其抗原結合片段。
本發明另外涉及藥物組合物，其包括任意上述PD-L1 結合分子 和生理學上可接受的載體。
本發明另外涉及這種PD-L1 結合分子 或這種藥物組合物在治療與免疫系統抑制有關或以PD-L1的表達為特徵的疾病或病症中的用途。
本發明進一步涉及這樣的用途，其中與免疫系統抑制有關或以PD-L1的表達為特徵的病症是癌症。
本發明另外涉及所有這種用途的實施方式，其中所述癌症選自：膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、膽囊或膽管癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、胃癌、睾丸癌、胸腺癌和子宮癌。
本發明進一步涉及增強腫瘤靶向劑活性的方法，該方法包括與任何上述CD137 結合分子 、任何上述PD-L1 結合分子 、或任何上述藥物組合物聯合施用腫瘤靶向劑。
本發明另外涉及一種治療與免疫系統抑制有關或以TA 的表達為特徵的疾病或病症的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用上述CD137 結合分子 、任何上述PD-L1 結合分子 或任何上述藥物組合物。
本發明進一步涉及這樣的方法，其進一步包括施用腫瘤靶向劑。
本發明進一步涉及這樣的方法，其中與免疫系統抑制有關或以腫瘤TA的表達為特徵的病症為癌症。
本發明進一步涉及這種方法的所有上述實施方式，其中所述腫瘤靶向劑是抗體、抗體的表位結合片段或介導T細胞重定向殺傷靶標細胞的試劑。
本發明還涉及這樣的方法的實施方式，其中所述癌症選自：膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、膽囊或膽管癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、非小細胞肺癌（NSCLC），卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、胃癌、睾丸癌、胸腺癌和子宮癌。
本發明另外涉及編碼任何以上實施方式的CD137 結合分子 或任何以上實施方式的PD-L1 結合分子 的核酸。
本發明進一步涉及包含此類核酸的表達載體。
本發明另外涉及一種細胞，其包括根據任何以上實施方式的核酸或任何以上實施方式的表達載體。
本發明進一步涉及這樣的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。
本發明涉及能夠結合CD137的表位的CD137 結合分子 ，例如單特異性抗體以及包括其表位結合片段的分子。本發明進一步涉及能夠與CD137的表位和第二抗原的表位兩者結合的多特異性CD137 結合分子 （例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、BiTE、三價結合分子等），第二抗原特別是腫瘤抗原（“TA ”）（例如“CD137 x TA 結合分子 ”）。本發明還提供了能夠與PD-L1的表位結合的新穎的PD-L1 結合分子 ，例如單特異性抗體以及包括其表位結合片段的分子，及其衍生物和用途。本發明還涉及包含這種分子的藥物組合物。本發明也包括這種分子在疾病的治療中的用途，特別是在癌症或與存在免疫系統抑制有關或以存在免疫系統抑制為特徵的疾病或疾病中的用途。 I.               抗體和其他結合分子
本發明的CD137 x TA 結合分子 可以是抗體或者可以衍生自抗體（例如，通過抗體多肽的片段化、切割等，或者通過使用抗體分子的氨基酸序列或編碼此類多核苷酸的多核苷酸（或其序列）的氨基酸序列等）。A. 抗體
抗體 是能夠通過至少一個位於免疫球蛋白分子的可變區的“表位 - 結合位點 ”特異性結合至分子(例如是碳水化合物、多核苷酸、脂質、多肽等（“抗原”）)的靶區域（“表位元”）的免疫球蛋白分子。如本文使用的，術語“ 抗體 ” (“antibody”) 和“ 多種抗體 ”(“antibodies”) 是指單克隆抗體、多特異性抗體、人抗體、人源化抗體、合成抗體、嵌合抗體、多克隆抗體、駱駝源化抗體、單鏈Fv（scFv）、單鏈抗體、Fab片段、F（ab'）片段、二硫鍵連接的雙特異性Fvs（sdFv）、胞內抗體和任何上述的表位結合片段。特別地，術語“抗體”包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即含有表位結合位點的分子)的免疫活性片段。免疫球蛋白分子可以是任何類型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY）、類別（例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 和IgA2 ）或子類。由於在這樣的分子上存在特別的結構域或部分或構象（“表位 ”），抗體能夠與多肽或蛋白質或非蛋白質分子“免疫特異性結合 ”。如本文使用的，“抗體的表位結合片段”旨在表示能夠與表位免疫特異性結合的抗體的一部分。如本文使用的，該術語涵蓋片段（例如Fab、Fab'、F（ab'）2 Fv）和單鏈（scFv）以及雙抗體的表位元-結合結構域。如本文使用的，抗體或其表位結合片段被認為“免疫特異性 ”結合另一個分子的區域（即表位元 ），條件是相對於可選的表位該抗體或其表位結合片段以更頻繁、更快速、更長持續時間和/或以更高的親和力或親合力與該表位反應或締合。通過閱讀該定義還應理解，例如，免疫特異性結合第一靶標的抗體或其表位結合片段 可以或可以不特異性結合或優先結合第二靶標。含有表位的分子可具有免疫原活性，從而在動物中引發抗體生成應答。這樣的分子被稱為“抗原 ”。天然抗體僅能結合一個表位種類（即它們是“單特異性的 ”），儘管它們可以結合該種類的多個拷貝（即顯示“ 二價 ” 或 “ 多價 ” ）。
術語“單克隆抗體 ”是指均質抗體群體，其中單克隆抗體包括參與抗原的選擇性結合的氨基酸（天然存在或非天然存在）。單克隆抗體針對單個表位（或抗原性位點）具有高度特異性。術語“單克隆抗體”不僅涵蓋完整的單克隆抗體和全長單克隆抗體，還包括其片段（例如Fab、Fab'、F（ab'）2 Fv）、單鏈（scFv）、其突變體，包含抗體部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體和包括具有結合抗原的所需特異性和能力的抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其他修飾構型。關於抗體的來源或製備方式（例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達、轉基因動物等），不旨在受到限制。該術語包括完整的免疫球蛋白以及上文在“抗體”的定義下描述的片段等。製備單克隆抗體的方法是本領域已知的。可以採用的一種方法是Kohler，G.等人的方法（1975）“Continuous Cultures Of Fused Cells Secreting Antibody Of Predefined Specificity ,” Nature 256:495-497或其修改。典型地，在小鼠、大鼠或兔子中產生單克隆抗體。通過用免疫原量的含有所需表位的細胞、細胞提取物或蛋白質製劑對動物進行免疫來產生抗體。免疫原可以是但不限於原代細胞、培養的細胞系、癌細胞、蛋白質、肽、核酸或組織。可選地，可以通過本領域已知的任何方法對現有的單克隆抗體和對所需病原性表位具有免疫特異性的任何其他等效抗體進行測序和重組產生。在一個實施方式中，對這樣的抗體測序，然後將多核苷酸序列克隆到載體中以表達或增殖。可以將編碼感興趣的抗體的序列保持在宿主細胞的載體中，然後可以將該宿主細胞擴增並冷凍以備將來使用。此類抗體的多核苷酸序列可用於基因操縱以產生本發明的單特異性或多特異性（例如雙特異性、三特異性和四特異性）分子以及親和力優化的嵌合抗體、人源化抗體和/或駱駝化抗體以改善抗體的親和力或其他特點。人源化抗體的一般原理涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換抗體的非人剩餘部分。
在過去的幾十年中，人們對抗體的治療潛力重新產生了興趣，並且抗體已成為生物技術衍生藥物的主要類別之一。超過200種基於抗體的藥物已被批准使用或正在開發中。 1.抗體的一般結構特性
天然存在的免疫球蛋白（例如，IgG）的基本結構單元是包括與兩條較長的“重鏈 ”複合的兩條較短的“輕鏈 ”的四聚體，通常表示為約150,000Da的糖蛋白。每條鏈包括含有“可變結構域 ”的氨基末端（“N 末端 ”）部分和含有至少一個“恆定結構域 ”的羧基末端（“C 末端 ”）部分。IgG輕鏈包括單個“輕鏈可變結構域 ”（“VL ”）和單個“輕鏈恆定結構域 ”（“CL ”）。因此，IgG分子的輕鏈的結構是n-VL-CL-c （其中n和c分別表示多肽的N-末端和C-末端）。IgG重鏈包括單個“重鏈可變結構域 ”（“VH ”）、三個“重鏈恆定結構域 ”（“CH1 ”、“CH2 ”和“CH3 ”）和位於CH1 和CH2 結構域之間的“鉸鏈 ”區域（“H ”）。因此，IgG重鏈的結構是n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c （其中n和c分別代表多肽的N-末端和C-末端）。完整的、未修飾的抗體（例如IgG抗體）結合抗原的表位元的能力取決於可變結構域的存在和序列。a) 恆定結構域 （ 1 ）輕鏈恆定結構域
代表性的CL結構域是人IgG CLκ結構域。代表性人CLκ結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 1 ）： RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC
可選地，代表性的CL結構域是人IgG CLλ結構域。代表性的人CLλ結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 2 ）： QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS（ 2 ）重鏈 CH1 結構域
代表性的CH1結構域是人IgG1 CH1結構域。代表性的人IgG1 CH1結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 3 ）： ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKRV
代表性的CH1結構域是人IgG2 CH1結構域。代表性的人IgG2 CH1結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 4 ）： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTV
代表性的CH1結構域是人IgG3 CH1結構域。代表性的人IgG3 CH1結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 5 ）： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVNHKPS NTKVDKRV
代表性的CH1結構域是人IgG4 CH1結構域。代表性的人IgG4 CH1結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 6 ）： ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRV （3）重鏈鉸鏈區
代表性鉸鏈區是人IgG1鉸鏈區。代表性人IgG1鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:7 )： EPKSCDKTHT CPPCP
另一代表性鉸鏈區是人IgG2鉸鏈區。代表性人IgG2鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:8 )： ERKCCVECPP CP
另一代表性鉸鏈區是人IgG3鉸鏈區。代表性人IgG3鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:9 )： ELKTPLGDTT HTCPRCPEPK SCDTPPPCPR CPEPKSCDTP PPCPRCPEPK SCDTPPPCPR CP
另一代表性鉸鏈區是人IgG4鉸鏈區。代表性人IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:10 )： ESKYGPPCPS CP
如本文描述的，IgG4鉸鏈區可包括穩定化突變比如S228P替換(如通過Kabat中的EU索引所編號)。代表性的穩定化的IgG4鉸鏈區的氨基酸序列是(SEQ ID NO:11 )： ESKYGPPCP P CP 1.              重鏈CH2和CH3結構域
兩條重鏈的CH2和CH3結構域相互作用以形成由細胞Fc 受體 識別的IgG抗體的“Fc 區 ”，Fc 受體 包括但不限於Fc γ受體(Fc γ R )。如本文使用的，術語“Fc 區 ”用於限定IgG重鏈的C-末端區。Fc區的一部分(包括涵蓋完整的Fc區的部分)在本文中稱為“Fc 結構域 ”。如果Fc區的氨基酸序列相對於其他IgG同種型與該同種型最同源，則認為Fc結構域是特定的IgG同種型、類別或亞類的。除了其在診斷中的已知用途外，已顯示抗體可用作治療劑。
代表性人IgG1的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:12 )： 231      240        250        260        270        280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 290        300        310        320        330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340        350        360        370        380 PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390        400        410        420        430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440     447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 由Kabat中列出的EU索引編號，其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。
代表性人IgG2的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:13 )： 231      240        250        260        270        280 APPVA-GPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD 290        300        310        320        330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA 340        350        360        370        380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE 390        400        410        420        430 WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE 440     447 ALHNHYTQKS LSLSPG X 由Kabat中列出的EU索引編號，其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。
代表性人IgG3的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:14 )： 231      240        250        260        270        280 APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD 290        300        310        320        330 GVEVHNAKTK PREEQYNSTF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA 340        350        360        370        380 PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390        400        410        420        430 WESSGQPENN YNTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE 440     447 ALHNRFTQKS LSLSPG X 由Kabat中列出的EU索引編號，其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。
代表性人IgG4的CH2-CH3結構域的氨基酸序列是(SEQ ID NO:15 )： 231      240        250        260        270        280 APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD 290        300        310        320        330 GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS 340        350        360        370        380 SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE 390        400        410        420        430 WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE 440     447 ALHNHYTQKS LSLSLG X 由Kabat中列出的EU索引編號，其中，X 是賴氨酸(K)或不存在。
遍及本說明書，IgG重鏈的恆定區中的殘基的編號是如Kabat等的Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生署，NH1，MD (1991) (“Kabat ”)中的EU索引的編號，其通過引用明確地併入本文。術語“Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗體的恆定結構域的編號。
在抗體恆定區內在許多不同位置(例如，Fc位置，包括但不限於通過Kabat列出的EU索引所編號的位置270、272、312、315、356和358)已經觀察到多態性，並且因此在所展示出的序列和現有技術中的序列之間可存在輕微差異。已經很好地表徵了人免疫球蛋白的多態性形式。目前，18 Gm同種異型是已知的：G1m (1、2、3、17)或G1m (a、x 、f、z)、G2m (23)或G2m (n)、G3m (5、6、10、11、13、14、15、16、21、24、26、27、28)或G3m (b1、c3、b3、b0、b3、b4、s、t、g1、c5、u、v、g5) (Lefranc等，“The Human IgG Subclasses ： Molecular Analysis Of Structure ， Function And Regulation. ” Pergamon，Oxford，pp. 43-78 (1990)；Lefranc，G.等1979，Hum. Genet.：50，199-211)。具體地，考慮本發明的抗體可併入任何免疫球蛋白基因的任何同種異型(allotype)、異種型(isoallotype)或單體型(haplotype)，並且不限於本文提供的序列的同種異型、異種型或單體型。而且，在一些表達系統中，CH3結構域的C-末端氨基酸殘基(上文粗體)可在翻譯後去除。相應地，本發明的分子中，CH3結構域的C-末端殘基是任選的氨基酸殘基。具體地，本發明涵蓋的是缺少CH3結構域的C-末端殘基的本發明分子。同樣具體地，本發明涵蓋的是包括CH3結構域的C-末端賴氨酸殘基的這種分子。 b）可變結構域
IgG分子的可變結構域由三個“互補決定區 ”(“CDR ”)以及稱為“框架區 ”(“FR ”)的間插非CDR區段組成，CDR含有抗體的將與表位接觸的氨基酸殘基，FR大體上維持CDR環的結構和確定CDR環的定位，以允許這種接觸(儘管某些框架殘基也可接觸表位)。因此，VL和VH結構域具有結構n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c 。CDR的氨基酸序列確定抗體是否將能夠結合特定的表位。抗體輕鏈與抗體重鏈的相互作用，並且具體地，它們的VL和VH結構域的相互作用形成抗體的表位結合位點。
來自免疫球蛋白的成熟重鏈和輕鏈的可變結構域的氨基酸是通過鏈中氨基酸的位置命名。Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，公共衛生署，NH1，MD (1991))描述了抗體的許多氨基酸序列、鑒定了每個亞組的氨基酸共有序列並且為每個氨基酸指定了殘基編碼，並且鑒定CDR和FR，如通過Kabat定義(應理解，通過Chothia, C. & Lesk, A. M.((1987) “Canonical Structures For The Hypervariable Regions Of Immunoglobulins ,” J. Mol. Biol. 196:901-917)定義的CDRH 1以較早的五個殘基開始)。Kabat的編號方案可通過參照保守氨基酸將考慮的抗體與Kabat中的共有序列之一比對而擴展至不包括在其綱要中的抗體。用於指定殘基編號的該方法在本領域中已經變成了標準，並且易於鑒定在包括嵌合或人源化變體的不同抗體中在等同位置處的氨基酸。例如，在人抗體輕鏈的位置50處的氨基酸佔據與小鼠抗體輕鏈的位置50處的氨基酸等同的位置。因此，很好地定義了其CDR開始和結束處的VL和VH結構域內的位置並且可通過VL和VH結構域的序列檢查確定(參見，例如，Martin，C.R. (2010) “Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains ,” In: ANTIBODY ENGINEERING VOL. 2 (Kontermann，R. and Dübel，S. (eds.)，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，第3章 (第33-51頁))。
是(或可用作)抗體輕鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分別命名為：CDRL 1 結構域 、CDRL 2 結構域 和CDRL 3 結構域 。類似地，是(或可用作)抗體重鏈的第一、第二和第三CDR的多肽在本文中分別命名為：CDRH 1 結構域 、CDRH 2 結構域 和CDRH 3 結構域 。因此，術語CDRL 1結構域、CDRL 2結構域、CDRL 3結構域、CDRH 1結構域、CDRH 2結構域和CDRH 3結構域涉及這種多肽，當併入到蛋白質中時，引起該蛋白質能夠結合特定表位，而無論是否這種蛋白質是具有輕鏈和重鏈的抗體或者是雙抗體或單鏈結合分子(例如，scFv、BiTe等)，或者是另一類型蛋白質。因此，如本文使用的，術語“表位結合片段 ”表示能夠與表位免疫特異性結合的分子的片段。表位結合片段可含有抗體的任何1個、2個、3個、4個或5個CDR結構域，或可含有抗體的全部6個CDR結構域，並且，儘管能夠免疫特異性結合至這種表位，但對不同於這種抗體的表位的這種表位可展示出免疫特異性、親和力或選擇性。典型地，然而，表位結合片段將含有這種抗體的全部6個CDR結構域。抗體的表位結合片段可以是單條多肽鏈（例如，scFv），或者可以包含兩條或更多條多肽鏈，每條多肽鏈具有氨基末端和羧基末端（例如，雙抗體、Fab片段、Fab2片段等）。除非特別指出，否則本文描述的蛋白質分子的結構域的順序是在“N - 末端至 C - 末端 ”方向上。
表位元結合位元點可包括融合至恆定結構域的完全的可變結構域或僅接枝至合適的框架區的這種可變結構域的互補決定區(CDR)。表位結合位點可以是野生型或通過一個或多個氨基酸替換來修飾。 c)抗體的人源化
本發明特別地涵蓋包括人源化抗體的VL和/或VH結構域的結合分子（包括抗體和雙抗體）。術語“人源化 ”抗體指通常使用重組體技術製備的嵌合分子，其具有來自非人物種的免疫球蛋白的表位結合位點和基於人免疫球蛋白的結構和/或序列的分子的剩餘免疫球蛋白結構。這種抗體的可變結構域的多核苷酸序列可用於遺傳操縱以產生這種衍生物並且改善這種抗體的親和力或其他特徵。已知重鏈和輕鏈二者的可變結構域含有三個CDR，其根據討論的抗原而變化並且確定結合能力，兩側為四個FR，其在給定物種中相對保守並且其假定為CDR提供了支架。當針對特定抗原製備非人抗體時，可變結構域可“重塑”或“人源化”。使抗體人源化的一般原則涉及保留抗體的表位元結合部分的基本序列，同時用人抗體序列交換該抗體的非人剩餘部分。使單克隆抗體人源化有四個常規步驟。這些是：(1)確定起始抗體輕鏈和重鏈可變結構域的核苷酸和預測的氨基酸序列，(2)設計人源化抗體或犬源化抗體，即決定在人源化或犬源化過程期間使用哪個抗體框架區，(3)實際的人源化或犬源化方法/技術和(4)人源化抗體的轉染和表達。參見，例如，美國專利號4,816,567; 5,807,715; 5,866,692;以及6,331,415。
已經描述了許多包含源自非人免疫球蛋白的表位-結合位點的人源化抗體分子，其包括具有齧齒動物或修飾的齧齒動物可變結構域的嵌合抗體及其與人恆定結構域融合的締合的CDR（參見，例如，Lobuglio等，(1989) “Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response ,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989))。其他參考文獻描述了在與合適的人抗體恆定結構域融合之前接枝至人支援框架區(FR)的齧齒動物CDR (參見，例如，Riechmann, L.等(1988) “Reshaping Human Antibodies for Therapy ,” Nature 332:323-327;和Jones等(1986) “Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse ,” Nature 321:522-525)。另一參考文獻描述了由重組修飾的齧齒動物框架區域支援的齧齒動物CDR。參見，例如，歐洲專利公開號519,596。這些“人源化”分子被設計為將對齧齒動物抗人抗體分子的不想要的免疫應答降至最低，這限制了這些部分在人類受體中治療性應用的持續時間和有效性。也可以使用的人源化抗體的其他方法公開在Daugherty等的(1991) “Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning ， CDR-Grafting ， And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins ,” Nucl. Acids Res. 19:2471-2476和美國專利號6,180,377、6,054,297和5,997,867)中。在一些實施方式中，人源化抗體保留全部CDR序列(例如，包含來自小鼠抗體的全部六個CDR的人源化小鼠抗體)。在其他實施方式中，人源化抗體相對於原始抗體具有序列不同的一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個或六個)。 2. CD137結合結構域
本發明涉及能夠與CD137的表位結合的CD137 結合分子 ，例如單特異性抗體，以及包含其表位結合片段的分子。下文提供了新穎的人單克隆抗體“CD137 MAB-6 ”的CD137結合結構域。本發明具體包括並涵蓋CD137 結合分子 和多特異性CD137 結合分子 （例如，雙特異性抗體、雙特異性雙抗體、BiTE、三價結合分子等），例如包括VL和/或VH結構域和/或CD137 MAB-6 的VL區域CDRL 的1、2或全部3個和/或CD137 MAB-6 的VH結構域的CDRH 的1、2或全部3個的CD137 x TA 結合分子 ，或以下提供的其任何變體。a) 人 CD137 MAB-6
CD137MAB-6 是新型的人類單克隆抗體。CD137 MAB-6 （ CD137 MAB-6 VH1 ） 的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 46 ）（CDRH 殘基用底線顯示）。 QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS SYYWS WIRQP PGKGLEWIG R IYTSGSTNYN PSLKS RVTMS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCAR DGW YDEDYNYYGM DV WGQGTTVT VSS
CD137 MAB-6VH1 的CDRH 的氨基酸序列為： CDRH 1 (SEQ ID NO:47 ):  SYYWS CDRH 2 (SEQ ID NO:48 ):  RIYTSGSTNYNPSLKS CDRH 3 (SEQ ID NO:49 ):  DGWYDEDYNYYGMDV
CD137MAB-6 （ CD137MAB-6VL1 ） 的VL結構域的氨基酸序列是（ SEQ ID NO ： 50 ） （CDRL 殘基用底線顯示）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSC RASQSVS SNYLS WFQQI PGQAPRLLIY GASTRAT GIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYC Q QDYDLPWT FG QGTKVEIK
CD137 MAB-6 VL1 的CDRL 的氨基酸序列為： CDRL 1 (SEQ ID NO:51 ):  RASQSVSSNYLS CDRL 2 (SEQ ID NO:52 ):  GASTRAT CDRL 3 (SEQ ID NO:53 ):  QQDYDLPWTb) 去免疫化的 CD137 MAB-6
如以下示例中所述，將CD137 MAB-6 的VL結構域去免疫化以產生具有氨基酸序列SEQ ID NO ： 54 的VL結構域，命名為“CD137 MAB-6 VLx ”（CDRL 殘基用底線顯示）： EIVMTQSPAT LSLX1 PGERAT LSC RASQSVS SNYLS WX2 QQX3 PGQAPRLLIY GASTRAT GIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYC Q QDYDLPWT FG QGTKVEIK 其中：X1 、X2 和X3 被獨立選擇，並且 其中：X1 為S或T；X2 是F或Y；X3 是I或K。
在特定實施方式中 a）X1 是S；X2 是Y；X3 是K；或者 b）X1 是S；X2 是F；X3 是K。
下文給出了命名為CD137 MAB-6 VL2 和CD137 MAB-6 VL3 的CD137 MAB-6 VL 結構域變體的氨基酸序列。任何變體VL結構域都可以與VH結構域配對。包括CD137 MAB-6 VH/VL結構域的特定組合的分子是通過參考具體的VH/VL結構域來提及的，例如，包括結合結構域CD137 MAB-6 VH1 和CD137 MAB-6 VL3 的分子具體稱為“CD137 MAB-6 （ 1.3 ） ”。
變體CD137 MAB-6 VL2 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 55 ）（CDRL 殘基顯示為底線）： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SNYLS WYQQK PGQAPRLLIY GASTRAT GIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYC Q QDYDLPWT FG QGTKVEIK
變體CD137 MAB-6 VL3 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 56 ）（CDRL 殘基顯示為底線）： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSC RASQSVS SNYLS WFQQK PGQAPRLLIY GASTRAT GIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYC Q QDYDLPWT FG QGTKVEIK
任何這樣的完全人的和/或變體VH和VLCD137 MAB-6 結構域的CDR、VL結構域和/或VH結構域，包括在以上呈現的CD137 MAB-6 VL結構域的通用序列內包含的任何結構域，可以用於形成能夠結合CD137的抗體、雙抗體或結合分子。在某些實施方式中，本發明的CD137 結合分子， 包括CD137 x TA 結合分子 ，包含CD137 MAB-6 VH1 和CD137 MAB-6 VL3 。 B.雙特異性抗體、多特異性雙抗體和三價分子
如上所述，天然抗體僅能夠結合一個表位種類，儘管它們可以結合該種類的多個拷貝。抗體結合抗原的表位的能力取決於抗體VL和VH結構域的存在和氨基酸序列。抗體的輕鏈和重鏈的相互作用，特別地，其VL和VH結構域的相互作用形成了天然抗體（例如IgG）的兩個表位元結合結構域之一。天然抗體僅能結合一個表位種類（即它們是單特異性的），儘管它們可以結合該種類的多個拷貝（即展示二價或多價）。
抗體的官能度可以通過產生可同時結合兩個分開且不同的抗原（或相同抗原的不同表位）的多特異性基於抗體的分子和/或通過產生對相同表位和/或抗原具有更高價態（即，多於兩個結合結構域）的基於抗體的分子來增強。
為了提供比天然抗體具有更大能力的分子，已經開發了多種重組雙特異性抗體形式以產生這種雙特異性抗體。
大多數此類方法使用連接體肽來將進一步結合結構域(例如，scFv、VL、VH等)融合至抗體核(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或抗體核內，或將多個抗體結合部分(例如，兩個Fab片段或scFv)融合。可替選的形式使用連接體肽來將結合蛋白(例如，scFv、VL、VH等)融合至二聚化結構域比如CH2-CH3結構域或可替選的多肽(WO 2005/070966、WO 2006/107786A、WO 2006/107617A、WO 2007/046893)。PCT公開號WO 2013/174873、WO 2011/133886和WO 2010/136172公開了其中CL和CH1結構域從它們各自的天然位置轉換的多特異性抗體，WO 2008/027236和WO 2010/108127公開了其中VL和VH結構域已經被多樣化以允許它們結合一種以上的抗原的抗體。PCT公開號WO 2010/028797、WO2010028796和WO 2010/028795公開了已經用另外VL和VH結構域取代其Fc區的重組抗體，以便形成三價結合分子。PCT公開號WO 2003/025018和WO2003/012069公開了單個鏈含有scFv結構域的重組雙抗體。PCT公開號WO 2013/006544公開了作為單條多肽鏈合成的並且然後進行蛋白水解以產生異源二聚化結構的多價Fab分子。因此，這些檔中公開的分子將介導效應子功能的全部或部分能力換成結合另外抗原種類的能力。PCT公開號WO 2014/022540、WO 2013/003652、WO 2012/162583、WO 2012/156430、WO 2011/086091、WO 2008/024188、WO 2007/024715、WO 2007/075270、WO 1998/002463、WO 1992/022583和WO 1991/003493公開了將另外結合結構域或官能團添加至抗體或抗體部分(例如，將雙抗體添加至抗體的輕鏈，或將另外VL和VH結構域添加至抗體的輕鏈和重鏈，或添加異源融合蛋白或彼此連結多個Fab結構域)。
本領域還已注意到產生在能夠結合兩種或更多種不同的表位種類方面與天然抗體不同的雙抗體 的能力（即，除了二價或多價外，還展示出雙特異性或多特異性）（參見，例如，Holliger等人，（1993）“’Diabodies’: Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments, ” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger等人); US 2004/0220388 (Mertens等人); Alt等人， (1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu，D.等人 (2005) “A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity ,” J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672; Olafsen，T.等人 (2004) “Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications ,” Protein Eng Des Sel. 17(1):21-27; Baeuerle，P.A.等人，(2009) “Bispecific T cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy ,” Cancer Res. 69(12):4941-4944)。
供應非單特異性“雙抗體 ”提供了優於抗體的顯著優勢：共連接和共定位表達不同表位的細胞的能力。因此，雙特異性雙抗體具有廣泛的應用，包括治療和免疫診斷。雙特異性使雙抗體在各種應用中的設計和工程化具有極大的靈活性，從而提供了對多聚抗原的增強親合力、不同抗原的交聯，並依賴於兩種靶抗原的存在定向靶向特定的細胞類型。
這樣的非單特異性雙抗體的形成需要兩個或更多個獨特且不同多肽的成功組裝（即，這種形成需要通過不同多肽鏈種類的異質二聚化來形成雙抗體）。面對這一挑戰，本領域已成功開發出穩定的、共價結合的異質二聚體非單特異性雙抗體，（參見，例如Chichili, GR等人（2015）“A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelogenous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates ,” Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Veri，M.C.等人(2010) “Therapeutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIB (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold ,” Arthritis Rheum. 62(7):1933-1943; Moore，P.A.等人 (2011) “Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T cell Killing Of B-Cell Lymphoma ,” Blood 117(17):4542-4551; US專利公開好2007/0004909；2009/0060910；2010/0174053；20130295121；2014/0099318；2015/0175697；2016/0017038；2016/0194396；2016/0200827；和2017/0247452)。這樣的雙抗體包括兩個或更多個共價複合的多肽，並且涉及將一個或多個半胱氨酸殘基工程化至每個所採用的多肽種類。例如，已經顯示在這樣的構建體的C末端添加半胱氨酸殘基允許多肽鏈之間的二硫鍵結合，穩定所得的異質二聚體而不會干擾二價分子的結合特點。C. 本發明的代表性 CD137 x TA 結合分子的組分
本發明的CD137 x TA 結合分子 包括多肽，並且可以包括兩條、三條、四條或多於四條的多肽鏈。如本文所用，術語“包括 ”旨在是開放式的，使得包括兩條多肽鏈的本發明的CD137 x TA 結合分子 可以具有另外的多肽鏈。這樣的鏈可以具有與結合分子的另一多肽鏈相同的序列，或者可以與結合分子的任何其他多肽鏈在序列上是不同的。1. 代表性的“接頭”肽
本發明的CD137 x TA 結合分子 的多肽包括結構域，所述結構域在另一結構域之後、之前和/或通過“接頭”肽例如接頭 1 、接頭 2 、接頭 3 等彼此連接。儘管本發明利用某些特定的“接頭”肽，但根據本文提供的教導，可以容易地鑒定和採用可選的接頭以實現CD137 x TA 結合分子 。
選擇分開多肽鏈的VL和VH結構域的接頭 1 的長度以基本上或完全防止這樣的VL和VH結構域彼此結合（例如，長度為12個或更少的氨基酸殘基）。因此，第一多肽鏈的VL1 和VH2 結構域基本上或完全不能彼此結合，並且不形成能夠基本上結合第一或第二抗原的表位結合位點。同樣地，第二多肽鏈的VL2 和VH1 結構域基本上或完全不能彼此結合，並且不形成能夠基本上結合第一或第二抗原的表位結合位點。代表性的間插接頭肽（接頭 1 ）具有氨基酸序列（SEQ ID NO ： 16 ）：GGGSGGGG，其太短以至於不能使同一多肽鏈的VL和VH結構域複合在一起（與用於產生scFv分子的較長的間插接頭肽（例如GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO ： 17 ）不同）。
接頭 2 的一個目的是將多肽鏈的VH結構域與該多肽鏈的任選存在的異質二聚體-促進結構域分開。可以將各種接頭中的任一種用於接頭 2 的目的。此類接頭 2 的代表性序列包含氨基酸序列：GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ），其具有半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基可用於經由源自IgG CH1結構域的二硫鍵或ASTKG（SEQ ID NO ： 19 ）將第一和第二多肽鏈彼此共價地結合。由於接頭 2 ，ASTKG（SEQ ID NO ： 19 ）不具有這樣的半胱氨酸，因此此類接頭 2 的使用通常與含半胱氨酸的異質二聚體促進結構域（例如SEQ ID NO ： 39 的E螺旋或SEQ ID NO ： 40 的K螺旋）的使用相關聯（見下文）。
接頭 3 的一個目的是將多肽鏈的異質二聚體-促進結構域與該多肽鏈的Fc結構域分開。第二個目的是提供含半胱氨酸的多肽結構域。可以將多種接頭中的任一種用於接頭 3 。此類接頭 3 的代表性序列包含氨基酸序列：DKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 20 ）。接頭 3 的另一個代表性序列包括氨基酸序列：GGGGDKHTCPPCP（SEQ ID NO ： 21 ）。接頭 3 的其他代表性序列包括氨基酸序列：LEPKSADKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 30 ）或LEPKSSDKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 31 ）。
接頭 4 的一個目的是將Fc區（“Fc 結構域 ”）的CH2-CH3結構域的C末端與VL結構域的N末端分開。可以將多種接頭中的任一種用於接頭 4 。此類接頭 4 的代表性序列包括氨基酸序列：APSSS（SEQ ID NO ： 22 ）或氨基酸序列APSSSPME（SEQ ID NO ： 23 ）、氨基酸序列GGGSGGGSGGG（SEQ ID NO ： 24 ）或氨基酸序列GGGGSGGGSGGG（SEQ ID NO ： 25 ）。
本發明的含有Fc區的分子可以包括另外的間插接頭肽（接頭），通常這樣的接頭將被併入異質二聚體-促進結構域（例如E-螺旋或K-螺旋）和CH2-CH3結構域和/或CH2-CH3結構域和可變結構域（即VH或VL）之間。典型地，另外的接頭將包括3-20個氨基酸殘基，並且可以任選地包含全部或部分的IgG鉸鏈區（優選地，IgG鉸鏈區的含有半胱氨酸的部分）。可以在本發明的雙特異性含Fc區的雙抗體分子中採用的接頭包括：GGC、GGG、ASTKG（SEQ ID NO ： 19 ），DKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 20 ），APSSS（SEQ ID NO ： 22 ），APSSSPME（SEQ ID NO ： 23 ），GGGSGGGSGGGGG（SEQ ID NO ： 24 ），GGGGSGGGSGGG（SEQ ID NO ： 25 ），LGGGSG（SEQ ID NO ： 26 ），GGGS（SEQ ID NO ： 27 ），LEPKSS（SEQ ID NO ： 28 ），VEPKSADKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 29 ），LEPKSADKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 30 ）和LEPKSSDKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 31 ）。為了易於克隆，可以使用LEPKSS（SEQ ID NO ： 28 ）代替GGG或GGC。另外，氨基酸GGG或LEPKSS（SEQ ID NO ： 28 ）可以緊隨其後的是DKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 20 ），以形成可替代的接頭：GGGGKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 21 ）；和LEPKSSDKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 31 ）。本發明的雙特異性含Fc區的分子可以併入IgG鉸鏈區，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體的IgG鉸鏈區或其一部分。2. 代表性的異質二聚體促進結構域
如上所述，本發明的CD137 x TA 結合分子 的形成涉及兩個或更多個不同多肽鏈的組裝（即，異質二聚化）。第一和第二多肽鏈的異質二聚體的形成可以通過包含“異質二聚體-促進結構域”來驅動。異質二聚體促進結構域可以是一條多肽鏈上的IgG的鉸鏈區的結構域（或衍生自鉸鏈區的多肽，例如，GVEPKSC（SEQ ID NO ： 32 ）、VEPKSC（SEQ ID NO ： 33 ））或AEPKSC（SEQ ID NO ： 34 ））和另一條多肽鏈上的CL結構域（或衍生自CL結構域的多肽，例如GFNRGEC（SEQ ID NO ： 35 ）或FNRGEC（SEQ ID NO ： 36 ））（US2007 / 0004909）。
可選地，本發明的異質二聚體-促進結構域將包括串聯重複的相反電荷的螺旋結構域，例如“E-螺旋”螺旋結構域（SEQ ID NO ： 37 ： E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K），其谷氨酸殘基將在pH 7時形成負電荷，而另一個異質二聚體促進結構域將包括四個串聯的“K-螺旋”結構域（SEQ ID NO ： 38 ： K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E），其賴氨酸殘基將在pH 7時形成正電荷。此類帶電結構域的存在促進了第一多肽和第二多肽之間的締合，從而促進了異質二聚化。在另一個實施方式中，利用了異質二聚體-促進結構域，其中SEQ ID NO ： 37 的四個串聯“E-螺旋”螺旋結構域之一已被修飾為包含半胱氨酸殘基： E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:39)。相似地，在另一個實施方式中，利用了異質二聚體-促進結構域，其中SEQ ID NO ： 38 的四個串聯“K-螺旋”螺旋結構域之一已被修飾為包含半胱氨酸殘基： K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40)。3. 多肽鏈的共價結合
對本發明的CD137 x TA 結合分子 進行工程化，以使其多肽鏈對通過沿其長度定位的一個或多個半胱氨酸殘基彼此共價結合，以產生共價締合的分子複合物。可以將此類半胱氨酸殘基引入將多肽的VL和VH結構域分開的間插接頭中。任選地或可選地，接頭 2 或接頭 3 ，或可選的接頭可含有半胱氨酸殘基。任選地或可選地，含螺旋的異質二聚體-促進結構域的一個或多個螺旋結構域將包括氨基酸置換，該氨基酸置換併入了如SEQ ID NO ： 39 或SEQ ID NO ： 40 中的半胱氨酸殘基。4. 代表性的 Fc 結構域
本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子的Fc結構域可以包括完整的Fc區（例如，完整的IgG Fc區）或僅完整的Fc區的片段。因此，本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子 的Fc結構域可包括完整Fc區的一些或全部CH2結構域和/或一些或全部CH3結構域，或可包括變體CH 2和/或變體CH3序列（其可包括例如相對於完整Fc區的CH2或CH3結構域的一個或多個插入和/或一個或多個缺失）。本發明的雙特異性Fc雙抗體的Fc結構域可包括非Fc多肽部分，或可包括非天然完整Fc區的部分，或可包括CH2和/或CH3結構域的非天然存在的定向（比如，例如，兩個CH2結構域或兩個CH3結構域，或在N末端至C末端的方向上，CH3結構域連接到CH2結構域等）。
儘管本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子的Fc結構域可以包括天然存在的Fc結構域的氨基酸序列，可期望形成此類Fc結構域的CH2-CH3結構域包含一個或多個置換，從而使所得的Fc結構域展示減少（例如，如果具有含有天然存在的Fc區的氨基酸序列的Fc結構域，則為該分子展示的結合的小於50％、小於40％、小於30％、小於20％或小於10％）或基本上無法檢測到與FcγRIA（CD64）、FcγRIIA（CD32A）、FcγRIIB（CD32B）、FcγRIIIA（CD16a）或FcγRIIIB（CD16b）結合（相對於野生型Fc區展示的結合）。能夠介導這種改變的結合的Fc變體和突變體形式是本領域眾所周知的，並且包括在選自以下的一個或多個位置處的氨基酸置換：234、235、265和297，其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號（例如，參見美國專利號5,624,821）。在一個實施方式中，本發明的具有Fc的分子的第一和/或第三多肽鏈的CH2 -CH結構域包括置換：L234A、L235A、D265A、N297Q和N297G中的任何1、2、3或4個。可選地，利用這樣的天然存在的Fc區的CH2-CH3結構域，其固有地展示與FcγRIIIA（CD16a）的結合降低（或基本沒有）和/或效應子功能降低（相對於野生型IgG1 Fc區（SEQ ID NO ： 12 ）展示的結合和效應子功能）。在一個具體的實施方式中，本發明具有Fc的分子包括IgG2 Fc區（SEQ ID NO ： 13 ）或IgG4 Fc區（SEQ ID NO ： 15 ）。當使用IgG4 Fc區時，本發明還涵蓋穩定突變的引入，例如上述的鉸鏈區S228P置換（參見，例如，SEQ ID NO：11）。
在代表性的實施方式中，本發明的所採用的具有Fc的CD137 x TA 結合分子 的IgG1 CH2-CH3結構域包括在位置234處被丙氨酸置換和在位置235處被丙氨酸置換，其中所述編號是在Kabat中的EU索引的編號（SEQ ID NO ： 41 ）： APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在。
可以通過增加Fc區對FcRn的結合親和力來增加包括Fc區的蛋白質的血清半衰期。如本文使用的，術語“半衰期”是指分子的藥代動力學性質，其是施用分子後分子的平均存活時間的量度。半衰期可以表達為從受試者的身體（例如，人患者或其他哺乳動物）或其具體的隔室中消除分子的已知量的百分之五十（50％）所需的時間，例如，在血清中測量的，即迴圈半衰期，或在其他組織中測量的。一般而言，半衰期的增加導致所施用分子在迴圈中平均停留時間（MRT）的增加。
在一些實施方式中，本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子 包括變體Fc區，其中所述變體Fc區包括相對於野生型Fc區的至少一種氨基酸修飾，使得所述分子具有增加的半衰期（相對於包括野生型Fc區的分子）。在一些實施方式中，本發明的具有Fc的CD137 x TA 結合分子 包括變體IgG Fc區，其中所述變體Fc區包括半衰期延長的氨基酸置換。能夠增加具有Fc的分子的半衰期的許多氨基酸置換在本領域中是已知的，例如參見美國專利號6,277,375、7,083,784、7,217,797、8,088,376；美國公開號2002/0147311、2007/0148164和2011/0081347中所描述的氨基酸置換。具有增強的半衰期的具有Fc的CD137 x TA 結合分子可以包括選自以下的兩個或更多個置換：T250Q、M252Y、S254T、T256E、K288D、T307Q、V308P、A378V、M428L、N434A、H435K和Y436I，其中所述編號與Kabat中的EU索引的編號相同。
特別地，所採用的CH 2 -CH 3結構域可以包含置換： (A) M252Y，S254T和T256E； (B)  M252Y和S254T； (C)  M252Y和T256E； (D) T250Q和M428L； (E)  T307Q和N434A； (F)  A378V和N434A； (G) N434A和Y436I； (H) V308P和N434A； (I)   K288D和H435K；或 (J)   M428L和N434S， 其中所述編號是Kabat中的EU索引的編號。
CH2和CH3結構域的代表性序列包含三重氨基酸置換：M252Y / S254T / T256E（YTE），其明顯增強了血清半衰期（Dall'Acqua，WF等人，（2006）Properties of Human IgGs Engineered for Enhanced Binding to the Neonatal Fc Receptor (FcRn) ,” J. Biol. Chem. 281(33):23514-23524)，如SEQ ID NO ： 42 或SEQ ID NO ： 43 （ 其是IgG1 CH2-CH3結構域的變體） 中，或如SEQ ID NO ： 44 （ 其是IgG4 CH2-CH3結構域的變體） 中：SEQ ID NO:42: APELLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在。SEQ ID NO:43: APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在。SEQ ID NO:44: APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在。
本發明也涵蓋具有Fc的CD137 x TA 結合分子 ，其包括展示出改變的效應子功能、改變的血清半衰期、改變的穩定性、改變的對細胞酶敏感性或改變的效應子功能的Fc結構域，如在NK依賴性或巨噬細胞依賴性測定中測定的。被鑒定為改變效應子功能的Fc結構域修飾是本領域已知的，包括增加與啟動受體（例如FcγRIIA（CD16A））的結合並減少與抑制性受體（例如FcγRIIB（CD32B））的結合的修飾（參見，例如Stavenhagen，JB等人（2007）“Fc Optimization Of Therapeutic Antibodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors ,” Cancer Res. 57(18):8882-8890)。具有減少的與CD32B的結合和/或增加的與CD16A的結合的人IgG1 Fc結構域的代表性變體包含L235V、F243L、R292P、Y300L、V305I或P296L置換。這些氨基酸置換可以以任何組合存在於人IgG1 Fc結構域中。在一個實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P和Y300L置換，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。在另一個實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含F243L、R292P、Y300L、V305I和P296L置換，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。在另一個實施方式中，人IgG1 Fc結構域變體包含L235V、F243L、R292P、Y300L和P396L置換，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。
本發明的CD137 x TA 結合分子 的CH2和/或CH3結構域不必在序列上相同，並且有利地被修飾以促進兩個具有CH2-CH3的多肽鏈之間的異質二聚化。例如，可以將氨基酸置換（優選地，用包含形成“杵 (knob) ”的龐大側基的氨基酸例如色氨酸的取代）引入CH2或CH3結構域，使得空間干擾將防止與類似突變的結構域的相互作用，並將使突變的結構域與已經設計了互補或適應性突變的結構域配對，即“臼 (hole) ”（例如，用甘氨酸的置換）。可以將這樣的突變組工程化成任何對的包括雙特異性具有Fc雙抗體分子的多肽，並且進一步工程化成所述對的多肽鏈的任何部分。蛋白質工程化以相對於同源二聚化支持異質二聚化的方法在本領域是眾所周知的，尤其是在免疫球蛋白樣分子的工程化方面，並且包括在本文中（參見，例如，Ridgway等人（1996）“‘Knobs-Into-Holes’ Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization,” Protein Engr. 9:617-621，Atwell等人 (1997)“Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library,” J. Mol. Biol. 270: 26-35，and Xie等人 (2005)“A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization ， Expression And Tumor Cell Lysis,” J. Immunol. Methods 296:95-101；在此通過引用將每個文獻的全部內容併入本文。在一個實施方式中，把杵工程化到第一多肽鏈的CH2-CH3結構域中，而臼被工程化到第三多肽鏈的CH2-CH3結構域中。因此，杵將有助於防止第一多肽鏈的兩個分子通過其CH2和/或CH3結構域同源二聚化。由於該實施方式的第三多肽鏈包含臼置換，它將具有與第一多肽鏈異質二聚化以及與自身同源二聚化的能力（但是，這種同源二聚化不形成具有表位結合位點的分子）。通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366W來形成代表性杵，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。通過修飾天然IgG Fc結構域以包含修飾T366S、L368A和Y407V來產生代表性臼，其中所述編號是如Kabat中的EU索引的編號。為了幫助從包括第一和第三多肽鏈的異質二聚體的最終雙特異性具有Fc的雙抗體中純化第三條肽鏈同源二聚體，第三多肽鏈的CH2和CH3結構域的蛋白A結合位點優選通過位置435處的氨基酸置換（H435R）被突變，其中所述編號是與Kabat中相同的EU索引的編號。因此，第三多肽鏈同源二聚體將不結合蛋白A，而適當裝配的雙特異性具有Fc的雙抗體將保持其通過第一多肽鏈上的蛋白A結合位點結合蛋白A的能力。
SEQ ID NO ： 45 、 SEQ ID NO ： 146 和SEQ ID NO ： 147 提供了可在本發明的CD137 x TA 結合分子 中使用的“具有杵的 ”CH2和CH3結構域的代表性序列：SEQ ID NO:45 : APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL Y SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN H YTQKS LSLSPGX 其中，X是賴氨酸（K）或不存在，SEQ ID NO:146: APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在，SEQ ID NO:147: APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSL W C L VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在，
SEQ ID NO ： 148 、 SEQ ID NO ： 149 和 SEQ ID NO ： 150 提供了可用於本發明的CD137 x TA 結合分子 的“具有臼的 ” CH2和CH3結構域的代表性序列：SEQ ID NO:148 : APE AA GGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在。SEQ ID NO:149: APE AA GGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSL S C A VK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSPG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在。SEQ ID NO:150: APEFLGGPSV FLFPPKPKDT L Y I T R E PEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSL S CA V K GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFL V SRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHN R YTQKS LSLSLG X 其中，X是賴氨酸（K）或不存在。
如將注意到的，SEQ ID NO ： 47 和50 的CH2-CH3結構域是IgG4結構域，而SEQ ID NO ： 45 、 146 、 148 和 149 的CH2-CH3結構域是IgG1結構域。SEQ ID NOs ： 45 、 146 、 148 和 149 包括在位置234處以丙氨酸的置換和在位置235處以丙氨酸的置換，因此形成Fc結構域，該結構域展示出與FcγRIA（CD64）、FcγRIIA（CD32A）、FcγRIIB（CD32B）、FcγRIIIA（CD16a）或FcγRIIIB（CD16b）結合的減少（或基本上沒有）（相對於野生型Fc區（SEQ ID NO ： 12 ）展示的結合）。本發明具體地涵蓋CD137 x TA 結合分子 ，其包括來自包括本文所述的置換（例如，M252Y / S254T / T256E； T366W； T366S / L368A / Y407V；和/或H435R）的任何類別的人IgG的CH2-CH3結構域。此外，本發明具體包括的是缺少上述C末端賴氨酸殘基的CD137 x TA 結合分子構建體。
在上述實施方式中，第一多肽鏈將具有“具有杵的”CH2-CH3序列，比如SEQ ID NO ： 45 、 146 和 147 的CH2-CH3序列，而第三條肽鏈將具有“具有臼的”CH2-CH3序列，例如SEQ ID NO ： 148 、 149 和 150 的CH2-CH3序列。但是，如將認識到的，可以在第一多肽鏈中使用“具有臼的”CH2 -CH3結構域（例如，SEQ ID NO ： 48 ），在這種情況下，在第三多肽鏈中將採用“具有杵的”CH2-CH3結構域（例如，SEQ ID NO ： 45 ）。5 、代表性腫瘤抗原（ TA ）和代表性可變結構域
本發明的CD137 x TA 結合分子 包括至少一種對腫瘤抗原的表位具有特異性的表位-結合位點。可以被本發明的CD137 x TA 結合分子 結合的代表性腫瘤抗原（“TA”）包括但不限於表 1 中給出的那些，並且在本文中可以用通用名稱、簡稱和/或基因名稱來提及。
表 1. 代表性腫瘤抗原
蛋白質腫瘤抗原 基因 名稱 (s) 詳見， 例如， UniProtKB ID 號
α-N-乙醯半乳糖胺α-2,6-唾液酸轉移酶6 ST6GALNAC6; CA19-9 Q969X2
5,6-二羥基吲哚-2-羧酸氧化酶 TYRP1; gp75 P17643
啟動的白細胞黏附分子 ALCAM; CD166 Q13740
α-1,4-N-乙醯葡糖氨基轉移酶 A4GNT Q9UNA3
B黑素瘤抗原1 BAGE; CT2.1 Q13072
Basigin BSG; CD147 P35613
B細胞抗原受體複合物-相關的蛋白α鏈 CD79A P11912
B細胞抗原受體複合物-相關的蛋白β鏈 CD79B P40259
B-細胞受體CD22 BL-CAM; CD22 P20273
B-淋巴細胞抗原CD19 CD19 P15391
B-淋巴細胞抗原CD20 MS4A1; CD20 P11836
骨髓基質抗原2 BST2; CD317 Q10589
坎帕斯(campath)-1抗原 CD52 P31358
碳酸酐酶14 CA14 Q9ULX7
羧肽酶M CPM P14384
癌胚抗原-相關的細胞黏附分子5 CEACAM5; CD66e P06731
癌胚抗原-相關的細胞黏附分子6 CEACAM6; CD66c P40199
連環蛋白β-1 CTNNB1；β-連環蛋白 P35222
CD27抗原 CD27 P26842
CD276抗原 CD276; B7-H3 Q5ZPR3 
CD40配體 CD40LG; CD154 P29965
細胞表面A33抗原 GPA33 Q99795
硫酸軟骨素蛋白聚糖4 CSPG4 Q6UVK1
C型凝集素結構域家族成員4C CLEC4C; BDCA2; CD303 Q8WTT0
細胞週期蛋白依賴性激酶4 CDK4 P11802 
細胞毒性T淋巴細胞蛋白4 CTLA4 P16410
含有解聚素和金屬蛋白酶結構域的蛋白質9 ADAM-9 Q13443
肝配蛋白A型受體2 EPHA2 P29317
表皮生長因數受體 EGFR; ERBB1; HER1 P00533
上皮細胞黏附分子 EPCAM; CD326 P16422
G抗原1 GAGE1; CT4.1 Q13065
G抗原2A GAGE2A Q6NT46
G抗原2B/C GAGE2B Q13066
G抗原2D GAGE2D Q9UEU5
G抗原2E GAGE2E Q4V326
G2 /有絲分裂特異性細胞週期蛋白B1 CCNB1 P14635
GDP-L-岩藻糖合酶 TSTA3 Q13630
谷氨酸羧肽酶2 FOLH1; PSMA Q04609
透明質酸酶-2 HYLA2; LUCA2 Q12891
非活性酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體ROR1 ROR1，NTRKR1 Q01973
整聯蛋白α-E ITGAE; CD103 P38570
整聯蛋白β-6 ITGB6 P18564
白細胞介素-13受體亞基α-2 (CD123的亞基，白細胞介素-3受體) IL13RA2; CD213a2 Q14627 
白細胞介素-2受體亞基α  IL2RA：CD25 P01589
連接黏附分子C JAM3 Q9BX67
角蛋白，II型細胞骨架8 CK-8; KRT8 P05787
乳凝集素 MFGE8 Q08431
低親和力免疫球蛋白ε Fc受體 FCER2; CD23 P06734 
黑素細胞蛋白PMEL PMEL; gp100 P40967
T細胞識別的黑素瘤抗原1 MLANA; MART1 Q16655
黑素瘤相關抗原1 MAGEA1; MAGE1 P43355
黑素瘤相關抗原  3 MAGEA3; MAGE3 P43357
黑素轉鐵蛋白 MELTF; MAAp97; CD228 P08582
膜輔助因數蛋白 CD46 P15529
間皮素 MSLN Q13421
黏蛋白-1 MUC1; PEM P15941 
黏蛋白-16 MUC16; CA-125 Q8WXI7
骨髓細胞表面抗原CD33 CD33 P20138
神經細胞黏附分子1 NCAM1; CD56 P13591
制癌蛋白-M OSM P13725
制癌蛋白-M-特異性受體亞基β OSMR; IL31RB Q99650
血小板糖蛋白4 CD36 P16671
程式性細胞死亡1配體1 CD274 Q9NZQ7
前列腺素受體GPR37 GPR37 O15354 
前列腺特異性抗原 KLK3; PSA P07288
前列腺酸磷酸酶 ACPP P15309
蛋白質PML PML; TRIM19; Myl P29590
包含PWWP結構域的DNA修復因數3A PWWP3A; MUM1 Q2TAK8
受體酪氨酸-蛋白激酶erbB-2 ERBB2; HER2; CD340 P04626
受體酪氨酸-蛋白激酶erbB-3 ERBB3; HER3 P21860
受體酪氨酸-蛋白激酶erbB-4 ERBB4; HER4 Q15303
受體型酪氨酸-蛋白磷酸酶  C PTPRC; CD45 P08575
T-細胞表面糖蛋白CD5 CD5 P06127
T-細胞特異性表面糖蛋白CD28 CD28 P10747 
轉鐵蛋白受體蛋白1 TFRC; CD71 P02786
跨膜4 L6家族成員1 TM4SF1; TAAL6 P30408
滋養層糖蛋白 TPBG; 5T4 Q13641
腫瘤壞死因數受體超家族成員10B TNFRSF10B; DR5; CD262 O14763
腫瘤壞死因數受體超家族成員1A TNFRSF1A; TNFR1; CD120a P19438
腫瘤壞死因數受體超家族成員1B TNFRSF1B; TNFR2; CD120b P20333
腫瘤壞死因數受體超家族成員3 LTBR; TNFR3 P36941
腫瘤壞死因數受體超家族成員5 CD40 P25942
腫瘤壞死因數受體超家族成員6 TNFR6; Apo-1; Fas; CD95 P25445
泛素結合酶E2 K UBE2K P61086
泛素蛋白連接酶E3A UBE3A Q05086
血管內皮生長因數A VEGFA P15692
血管內皮生長因數B VEGFB P49765
血管內皮生長因數受體1 FLT1; VEGFR1 P17948
血管內皮生長因數受體2 KDR; VEGFR2; CD309 P35968
血管內皮生長因數受體3 FLT4; VEGFR3 P35916
鋅指蛋白354C ZNF354C; KID3 Q86Y25
其他腫瘤抗原 詳見 例如， 引文
3-岩藻糖基-N-乙醯氨基乳糖 Gooi，H.C. (1983)，"Marker of peripheral blood granulocytes and monocytes of man recognized by two monoclonal antibodies VEP8 and VEP9 involves the trisaccharide 3-fucosyl-N-acetyllactosamine," Eur. J. Immuno. 13(4):306-12.
血型A抗原 Gooi，H.C.等人, (1983)，"Monoclonal antibody reactive with the human epidermal-growth-factor receptor recognizes the blood-group-A antigen," Biosci. Rep. 3(11):1045-52.
雙岩藻糖基1型鏈(Aleb) 雙岩藻糖基2型鏈(ALey) Dohi，T. 等人, (1989)，"Immunohistochemical Study of carbohydrate antigen expression in gastric carcinoma," Gastroenterol Jpn. 24(3): 239-45; Yazawa，S.等人 (1993)，"Aberrant alpha1--＞2Fucosyltransferases Found in Human Colorectal Carcinoma Involved in the Accumulation of Leb and Y Antigens in Colorectal Tumors," Jpn. J. Cancer Res. 84:989-995
神經節苷脂抗原4.2 Nudelman，E. 等人, (1982)，"Characterization of a human melanoma-associated ganglioside antigen defined by monoclonal antibody，4.2," J. Biol. Chem. 257(21): 12752-6
神經節苷脂抗原D1.1 Levine，J.M.，等人, (1984)，"The D1.1 antigen: a cell surface marker for germinal cells of the central nervous system," J. Neurosci. 4(3):820-31
神經節苷脂GD2/GD3/GM2/GM3 Krengel，U. and Bousquet P.A. (2014)，"Molecular Recognition of Gangliosides and Their Potential for Cancer Immunotherapies," Front. Immuno. 5(325):1-11
乳糖神經醯胺 Symington，F.W. (1984)，"Monoclonal Antibody Specific for Lactosylceramide," J. Biol. Chem. 259(9):6008-6012
Rh抗原 (D、C、c、E或e) Avent，N.D.和Reid，M.E. (2000)，"The Rh blood group system: a review," Blood 95:375-387
唾液酸-Tn Holmberg，L.A. (2001) “Theratope疫苗  (STn-KLH),” Expert Opin. Biol. Ther. 1(5):881-91
識別TA的抗體是本領域已知的，或者可以使用包括本文所述的那些眾所周知的方法來產生。表2中列出了代表性抗體，其包含能夠結合TA的VL和VH結構域，因此其序列或多肽鏈可用於構建本發明的CD137 x TA 結合分子 。結合幾種腫瘤抗原的抗體的代表性VH和VL結構域如下所示。
表 2
抗體名稱 腫瘤抗原 治療性靶向應用
阿巴伏單抗 CA-125 卵巢癌
Adecatumumab Epcam 前列腺癌和乳腺癌
阿托珠單抗 CD20 淋巴瘤
阿珠單抗 VEGFR2 癌症
阿妥莫單抗 CEA 結直腸癌
阿麥妥昔單抗 間皮蛋白 癌症
麻安莫單抗 TAG-72 非小細胞肺癌
Anifrolumab 干擾素  Α/Β受體 系統性紅斑狼瘡
Anrukinzumab IL-13 癌症
Apolizumab HLA-DR 血液癌症
阿西莫單抗 CEA 胃腸癌
阿替奴單抗 RTN4 癌症
貝妥莫單抗 CD22 非霍奇金淋巴瘤 (檢測)
貝利木單抗 BAFF 非霍奇金淋巴瘤
貝伐單抗 VEGF-A 轉移癌症，早產兒視網膜病
比伐單抗  CD44 V6 鱗狀細胞癌
蘭妥莫單抗 CD19 癌症
本妥昔單抗 CD30 (TNFRSF8) 血液系統癌症
坎妥珠單抗 MUC1 癌症
莫坎妥珠單抗 黏蛋白Canag 結直腸癌 
卡普塞珠單抗 VWF 癌症
卡羅單抗 前列腺癌細胞 前列腺癌(檢測)
卡魯單抗 MCP-1 腫瘤學/免疫指標
卡妥索單抗 Epcam，CD3 卵巢癌，惡性腹水，胃癌
西妥昔單抗 EGFR 轉移性結直腸癌和頭頸癌
西他妥珠單抗 Epcam 卵巢癌和其他實體瘤
西妥木單抗 IGF-1受體 實體瘤
克立瓦妥珠單抗  MUC1 胰腺癌
可那妥木單抗 TRAIL-R2 癌症
達西妥珠單抗 CD40 血液學癌症
達洛妥珠單抗 胰島素樣生長因數I受體 癌症
達拉妥木單抗 CD38 癌症
德美西珠單抗 DLL4 癌症
Denintuzumab CD19 急性淋巴細胞白血病和B細胞非霍奇金淋巴瘤
地莫單抗 B-淋巴瘤細胞 淋巴瘤
卓齊妥單抗 DR5 癌症
度利戈妥單抗 HER3 癌症
杜斯吉妥單抗 ILGF2 癌症
依美昔單抗 GD3神經節苷脂 惡性黑素瘤
依決洛單抗 上皮細胞黏附分子 結直腸癌
依洛妥珠單抗 SLAMF7 多發性骨髓瘤
艾西莫單抗 IL-6 癌症
依納伐妥珠單抗 TWEAK受體 癌症
恩莫單抗 ICAM-1 (CD54) 癌症
依諾妥珠單抗 B7-H3 癌症
依諾替庫單抗 DLL4 癌症
恩西妥昔西單抗 5AC 癌症
西-依匹妥莫單抗 上皮唾液蛋白(Episialin) 癌症
依帕珠單抗 CD22 癌症，SLE
厄馬索單抗 HER2，CD3 乳腺癌 
艾達珠單抗 整聯蛋白Αv β3 黑素瘤、前列腺癌、卵巢癌 
Faralimomab 干擾素受體 癌症
法勒珠單抗 葉酸受體1 卵巢癌
法西奴單抗 HNGF 癌症
Fbta05 (Bi20) CD20 慢性淋巴細胞白血病
芬克拉妥珠單抗 HGF 癌症 
芬妥木單抗 IGF-1受體 腎上腺皮質癌、非小細胞肺癌
弗拉伏妥單抗 TYRP1 (糖蛋白75) 黑素瘤
Flotetuzumab CD123 急性髓系白血病
夫蘇木單抗 TGF-Β 癌症
弗妥昔單抗 EGFR 癌症
加利昔單抗 CD80 B細胞淋巴瘤
甘尼妥單抗 IGF-I 癌症
吉姆單抗奧佐米星 CD33 急性骨髓性白血病
吉瑞妥昔單抗 碳酸酐酶9 (CA-IX) 透明細胞腎細胞癌
格列姆巴妥木單抗維多汀 GPNMB 黑素瘤，乳腺癌
替伊莫單抗 CD20 非霍奇金 淋巴瘤
伊克蘆庫單抗 VEGFR-1 癌症 
英加妥珠單抗 EGFR 癌症
英克勒庫單抗 Selectin P 癌症
英達妥昔單抗拉夫坦辛 SDC1 癌症
伊諾妥珠單抗奧佐米星 CD22 癌症
英特妥木單抗 CD51 實體瘤(前列腺癌、黑素瘤 )
伊匹單抗 CD152 黑素瘤
伊拉妥木單抗 CD30 (TNFRSF8) 霍奇金淋巴瘤
伊托珠單抗 CD6 癌症
拉貝妥珠單抗 CEA 結直腸癌
蘭帕珠單抗 CFD 癌症
來金珠單抗  Il-13 霍奇金淋巴瘤
來沙妥木單抗 TRAIL-R2 癌症
利格珠單抗 IGHE 癌症
林妥株單抗 CD33 癌症
利瑞魯單抗 KIR2D 癌症
Lorvotuzumab CD56 癌症
魯卡妥木單抗 CD40 多發性骨髓瘤，非霍奇金淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤
魯米昔單抗 CD23 慢性淋巴細胞白血病
馬帕妥木單抗 TRAIL-R1 癌症
馬格妥昔單抗 HER2 HER2陽性癌症
馬妥珠單抗 EGFR 結直腸、肺和胃癌
米拉珠單抗 CD74 多發性骨髓瘤和其他血液學惡性腫瘤
Minretumomab TAG-72 癌症
Mitumomab GD3神經節苷脂 小細胞肺癌
莫加木珠單抗 CCR4 癌症
Morolimumab 恆河因數 癌症
莫西妥莫單抗假單胞菌外毒素 CD22 癌症
他那可單抗 C242抗原 結直腸癌
那米魯單抗 CSF2 癌症
他那莫單抗  Estafenatox 5T4 非小細胞肺癌，腎細胞癌
納那妥單抗 RON 癌症
Naxitamab GD2 成神經細胞瘤，骨肉瘤
奈昔妥木單抗 EGFR 非小細胞肺癌
Nerelimomab TNF-Α 癌症
耐斯伐庫單抗 血管生成素2 癌症
尼妥珠單抗 EGFR 鱗狀細胞癌、頭頸癌、鼻咽癌、神經膠質瘤
尼伏魯單抗 PD-1 癌症
巰諾莫單抗 待定 癌症
奧卡拉妥珠單抗 CD20 癌症
奧法妥木單抗 CD20 慢性淋巴細胞白血病
奧拉妥單抗 PDGF-R Α 癌症
奧洛珠單抗 IL6 癌症
Omburtamab B7-H3 成神經細胞瘤、肉瘤、轉移性腦癌
奧納妥珠單抗 人類散射因數受體激酶 癌症
Ontuxizumab TEM1 癌症
奧珠單抗  Monatox Epcam 癌症
奧戈伏單抗 CA-125 卵巢癌
奧替庫單抗 Oxldl 癌症
Otlertuzumab CD37 癌症
帕尼單抗 EGFR 結直腸癌
Pankomab MUC1的腫瘤特異性糖基化 卵巢癌
巴薩妥珠單抗 EGFL7 癌症
帕曲妥單抗 HER3 癌症
培布利珠單抗 PD-1 癌症
培妥莫單抗 MUC1 癌症
培拉珠單抗 IL17A 關節炎
帕妥珠單抗 HER2 癌症
皮地珠單抗 PD-1 癌症
皮那妥珠單抗 維多汀 CD22 癌症
平妥莫單抗 腺癌抗原 腺癌
普拉庫魯單抗 人TNF 癌症
泊拉妥珠單抗 維多汀 CD79B 癌症
普立托昔單抗 大腸桿菌志賀毒素1型 癌症
普立妥木單抗 波形蛋白 腦癌
奎利珠單抗 IGHE 癌症
雷妥莫單抗 N-羥乙酸神經氨酸 癌症
雷得妥單抗 纖連蛋白額外結構域-B 癌症
雷莫蘆單抗 VEGFR2 實體瘤
利妥木單抗 HGF 實體瘤
利妥昔單抗 CD20 淋巴瘤，白血病，一些自身性免疫失調
羅妥木單抗 IGF-1受體 癌症
羅度單抗 RHD 癌症
沙馬珠單抗 CD200 癌症
沙妥莫單抗 噴地肽 TAG-72 癌症
司裡班妥單抗 ERBB3 癌症
Sibrotuzumab FAP 癌症
司妥昔單抗 IL-6 癌症
索利托單抗 Epcam 癌症
松妥珠單抗 上皮唾蛋白 癌症
他巴魯單抗 BAFF B細胞癌症
他卡妥珠單抗Tetraxetan α-胎蛋白 癌症
他莫單抗Paptox CD19 癌症
Telimomab 待定 癌症
替妥莫單抗 腱生蛋白C 癌症
替奈昔單抗 CD40 癌症
替妥木單抗 CD221 血液學腫瘤
替昔木單抗 CTLA-4 癌症
替加珠單抗 TRAIL-R2 癌症
托西莫單抗 CD20 濾泡性淋巴瘤
Tovetumab CD140a 癌症
曲妥珠單抗 HER2 乳腺癌
Trbs07 (Ektomab) Gd2 黑素瘤
曲美木單抗 CTLA-4 癌症
妥可妥珠單抗 西莫白介素 Epcam 癌症
優利妥昔單抗 MS4A1 癌症
烏瑞魯單抗 4-1BB 癌症
Vadastuximab CD33 急性髓系白血病
Vantictumab 捲曲(Frizzled)受體 癌症
伐利昔單抗 AOC3 (VAP-1) 癌症
伐特珠單抗 ITGA2 癌症
維妥珠單抗 CD20 非霍奇金淋巴瘤
維森庫單抗 NRP1 癌症
伏洛昔單抗 整聯蛋白Α5β1 實體瘤
伏司妥珠單抗  CD70 癌症
伏妥莫單抗 腫瘤抗原CTAA16.88 結直腸腫瘤
紮魯妥木單抗 EGFR 頭頸部鱗狀細胞癌
紮妥昔單抗 HER1 癌症
齊拉木單抗 CD147 癌症
Zolbetuximab Cldn18.2 胃腸道腺癌和胰腺腫瘤
a)PD-L1 結合結構域
PD-L1（也稱為CD274和B7-H1）是一種40kDa的跨膜蛋白，通常在T淋巴細胞、B淋巴細胞、DC、巨噬細胞的表面上和非血液細胞中表達。另外，PD-L1在腫瘤細胞中也顯示異常高表達，這被認為是促進腫瘤免疫逃逸能力的主要因素。PD-L1與其受體PD-1在T細胞上的接合啟動了遞送抑制T細胞增殖、細胞因數生成和釋放以及細胞毒性的信號的PD-1受體的下游信號傳導。阻斷PD-L1 / PD-1的抗體會破壞PD-1軸，從而逆轉T細胞抑制並增強內源性抗腫瘤免疫力。結合PD-L1的CD137 x TA 結合分子 可以將表達PD-L1的腫瘤細胞與表達CD137的免疫細胞共連接。不限於任何特定方法，這樣的共定位可以刺激免疫細胞，同時還減弱或阻斷在PD-L1-PD-1結合時發生的免疫系統抑制。
根據本發明可以使用任何抗PD-L1抗體的表位-結合位點，並且相對於PD-L1腫瘤抗原闡明了本發明的原理。結合人PD-L1的代表性抗體包括阿替利珠單抗、阿利庫單抗和德瓦魯單抗，每種抗體最近都被批准用於人類。阿替利珠單抗（銷售為TECENTRIQ®； CAS登記號1380723-44-3；參見美國專利號9,873,740）是具有修飾的IgG1和κ恆定區的人源化單克隆抗體。阿利庫單抗（銷售為BAVENCIO®；CAS登記號1537032-82-8；參見美國專利號9,873,740）是具有IgG1 /λ恆定區的完全人單克隆抗體。德瓦魯單抗（銷售為IMFINZI®； CAS登記號1428935-60-7；參見美國專利號8,779,108）是具有修飾的IgG1和κ恆定區的完全人單克隆抗體。阿替利珠單抗的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列（WHO藥物資訊，2015，推薦的INN：清單74，29（3）：387），德瓦魯單抗（WHO藥物資訊，2015，推薦的INN：清單74，29（ 3）：393-394）和阿利庫單抗（WHO藥物資訊，2016，推薦的INN：List 74，30（1）：100-101）是本領域已知的。本文還提供了另外的抗PD-L1抗體，包括人源化的抗PD-L1抗體“hPD-L1 MAB-2 ”及其優化的變體。 (1)            hPD-L1 MAB-2
hPD-L1 MAB-2 （ hPD-L1 MAB-2 VH1 ） 的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 57 ）（CDRH 殘基用底線顯示）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMS WVRQA PGKGLEWVA Y ISIGGGTTYY PDTVKG RFTI SRDNAKNTLY LQMNSLKTED TAVYYCAR QG LPYYFDY WGQ GTLVTVSS
hPD-L1 MAB-2 （ hPD-L1 MAB-2 VL1 ） 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO：58）（CDRL 殘基用底線顯示）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVN TAVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYNTPLT FGQ GTKVEIK(2) 去免疫化和優化的 hPD-L1 MAB-2
如以下示例中所述，將hPD-L1 MAB-2 去免疫化並優化結合和表達以產生命名為“hPD-L1 MAB-2 VHx ”的變體VH結構域和命名為“hPD-L1 MAB-2 VLx ”的VL結構域。下文給出了特定的去免疫化和優化的變體VH和VL結構域的氨基酸序列，在示例中提供了其他變體。
hPD-L1 MAB-2 VHx 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 59 ）（CDRH 殘基用底線顯示）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMS WVRQA PGKGLEWVA Y ISIX4 GGTTYY PDTVKG RFTI SRDNAKNX5 LY LQMNSLX6 X7 ED TAVYYCAR X8 G LPYYX9 DY WGQ GTLVTVSS 其中：X4 、X5 、X6 、X7 、X8 和X9 被獨立地選擇，和 其中：X4 為G或K；X5 為S或T；X6 為K或R；X7 為A或T；X8 為A或Q；和X9 為F或G。
在具體的實施方式中： a)X4 為G； X5 為S；X6 為R； X7 為A；X8 為Q；和X9 為F； b)X4 為K；X5 為S；X6 為R；X7 為A；X8 為Q；和X9 為G； c)X4 為G；X5 為S；X6 為R；X7 為A； X8 為A；和  X9 為F； d)X4 為K；X5 為S；X6 為R； X7 為A； X8 為A；和X9 為F； e)X4 為G；X5 為S；X6 為R；X7 為A； X8 為A；和  X9 為G；或 f)X4 為K；X5 為S；X6 為R； X7 為A； X8 為Q；和X9 為F。
hPD-L1 MAB-2 VHx 的CDRH 的氨基酸序列是： CDRH 1 (SEQ ID NO:60 ):  SYTMS CDRH 2 (SEQ ID NO:61 ):  YISIX4 GGTTYYPDTVKG CDRH 3 (SEQ ID NO:62 ):  X8 GLPYYX9 DY 其中：X4 為G或K；X8 為A或Q；和X9 為F或G。
hPD-L1 MAB-2 VLx 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 63 ）（CDRL 殘基用底線顯示）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVN X10 AVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYNTPLT FGQ GTKVEIK 其中：X10 為E或T。
在一個具體的實施方式中，X10 為E。
PD-L1 MAB-2 VLx的CDRL 的氨基酸序列為： CDRL 1 (SEQ ID NO:64 ):  KASQDVNX10 AVA CDRL 2 (SEQ ID NO:65 ):  WASTRHT CDRL 3 (SEQ ID NO:66 ):  QQHYNTPLT 其中：X10 為E或T。
下面給出了在本文中命名為“hPD-L1 MAB-2 VH2 ”、“hPD-L1 MAB-2 VH3 ”、“hPD-L1 MAB-2 VH4 ”、“hPD-L1 MAB-2 VH5 ”、“h PD-L1 MAB-2 VH6 ”的五個變體VH結構域和命名為“hPD-L1 MAB-2 VL2 ”的一個變體VL結構域的氨基酸序列。本文公開的任何變體hPD-L1 MAB-2 VH 結構域可以與任何hPD-L1 MAB-2 VL 結構域配對。包括PD-L1 MAB-2 VH/VL結構域的特定組合的分子是通過參考特定的VH / VL結構域來提及的，例如，包括結合結構域PD-L1 MAB-2 VH3 和hPD-L1 MAB-2 VL2 的分子具體稱為“PD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） ”。下文提供了變體VH和VL結構域的氨基酸序列，在CDR中相對於VH1或VL1的置換用雙底線標出。
hPD-L1 MAB-2 VH2 的氨基酸序列是（SEQ ID NO：67）（CDRH 殘基用底線顯示）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMS WVRQA PGKGLEWVA Y ISIGGGTTYY PDTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QG LPYYFDY WGQ GTLVTVSS
hPD-L1 MAB-2 VH3 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 68 ）（CDRH 殘基用底線表示；置換用雙底線表示）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMS WVRQA PGKGLEWVA Y ISI K GGTTYY PDTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QG LPYY G DY WGQ GTLVTVSS
hPD-L1 MAB-2 VH4 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 69 ）（CDRH 殘基用底線表示；置換用雙底線表示）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMS WVRQA PGKGLEWVA Y ISIGGGTTYY PDTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR A G LPYYFDY WGQ GTLVTVSS
hPD-L1 MAB-2 VH5 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 70 ）（CDRH 殘基用底線表示）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMS WVRQA PGKGLEWVA Y ISI K GGTTYY PDTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR A G LPYYFDY WGQ GTLVTVSS
hPD-L1 MAB-2 VH6 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 71 ）（CDRH 殘基用底線表示）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMS WVRQA PGKGLEWVA Y ISIGGGTTYY PDTVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR A G LPYY G DY WGQ GTLVTVSS
hPD-L1 MAB-2 VL2 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 72 ）（CDRL 殘基用底線表示）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVN E AVA WYQQKP GKAPKLLIY W ASTRHT GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QQ HYNTPLT FGQ GTKVEIK
應注意，優化的hPD-L1 MAB-2變體的CDRH 2、CDRH 3和CDRL 1的氨基酸序列不同於親本分子中存在的氨基酸序列。下面總結了不同的CDR，VH1和VL1的區別以雙底線示出：
CDR 氨基酸序列 hPD-L1 MAB-2 變 體
CDRH 2 YISI K GGTTYYPDTVKG (SEQ ID NO:73 ) VH3/VH4
CDRH 3 QGLPYY G DY (SEQ ID NO:74 ) VH3
CDRH 3   A GLPYYFDY (SEQ ID NO:75 ) VH4/VH5
CDRH 3   A GLPYY G DY (SEQ ID NO:76 ) VH6
CDRL 1 KASQDVN E AVA (SEQ ID NO:77 ) VL2
本發明具體包括並涵蓋CD137 x PD-L1 結合分子 ，其包括任何阿替利珠單抗、阿利庫單抗、德瓦魯單抗、hPD-L1 MAB-2 和其變體或本文提供的任何其他抗PD-L1抗體的VL和/或VH結構域和/或VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH ；並且更典型地具有這種抗PD-L1單克隆抗體的VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2個或全部3個CDRH 。b ） HER2 結合結構域
HER2是185kDa的受體蛋白，其最初被鑒定為來自化學治療大鼠的成神經細胞瘤的轉化基因的產物。由於HER2在許多人類癌症（包括乳腺癌和胃癌）中的作用，因此已被廣泛研究。
根據本發明可以使用任何抗-HER2抗體的表位-結合位點，並且關於HER2腫瘤抗原闡述本發明的原理。結合人HER2的代表性抗體包括馬格妥昔單抗（margetuximab）、曲妥珠單抗和帕妥珠單抗。馬格妥昔單抗（也稱為MGAH22；CAS登記號1350624-75-7，參見，例如，美國專利號8,802,093）是與HER2結合並介導增強的ADCC活性的Fc優化的單克隆抗體。曲妥珠單抗（也稱為rhuMAB4D5，並且以赫賽汀@出售；CAS登記號180288-69-1；參見美國專利號5,821,337）是抗體4D5的人源化形式，具有IgG1 /κ恆定區。帕妥珠單抗（也稱為rhuMAB2C4，並且以PERJET@出售； CAS 登記號380610-27-5；參見例如WO2001/000245）是具有IgG1 /κ恆定區的抗體2C4的人源化形式。 馬格妥昔單抗（WHO藥物資訊，2014，推薦的INN：清單70，28（1）：93-94）的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列和曲妥珠單抗（參見WHO藥物資訊，2011，推薦的INN：清單 65, 25（1）：89-90，對於曲妥珠單抗emtanisne）和帕妥珠單抗（蛋白質資料庫登錄號1171i）的Fab結構域是本領域已知的。本文還提供了另外的抗HER2抗體，包括HER2 MAB-1及其人源化變體。(1) hHER2 MAB-1
抗體hHER2 MAB-1 是一種人源化抗HER2單克隆抗體，其結合HER2的表位，該表位不同於馬格妥昔單抗、曲妥珠單抗和帕妥珠單抗所識別的表位（參見，例如，WO 2018/156740）。
人源化抗體（hHER2 MAB-1 VHx ）的VH結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 78 ）（CDRH 殘基顯示為底線）： QVQLVQSGAE  VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR DX1 X2 YGNRVSY WG QGTLVTVSS 其中，所述X1 為D或E，並且X2 為G或I。
這種人源化抗體（hHER2 MAB-1 VLx ）的VL結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 79 ）（CDRL 殘基顯示為底線）： DIQMTQSPSS   LSASVGDRVT ITC KASQDIX3 X4 YLS WFQQKP GKAPKTLIY R ANRLX5 X6 GVPS  RFSGSGSGTD FTLTISSLQP  EDFATYYC LQ HDEFPWT FGQ GTKLEIK 其中，X3 為N或S；X4 為S、T或N；X5 為V或Q並且X6 為D、E或S。
分離了三個種變體hHER2 MAB-1 VH 結構域：hHER2 MAB-1 VH1 、hHER2 MAB-1 VH2 和hHER2 MAB-1 VH3 。此類變體hHER2 MAB-1 VH 結構域的氨基酸序列如下所示。
hHER2 MAB-1 VH1 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 80 ）（CDRH 殘基用底線顯示；請注意，CDRH 3的第二和第三殘基分別為D和G）： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR DD GYGNRVSY WG QGTLVTVSS
hHER2 MAB-1 VH2 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 81 ）（CDRH 殘基用底線顯示；請注意，CDRH 3的第二和第三殘基分別為E和G）： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR DE GYGNRVSY WG QGTLVTVSS
hHER2 MAB-1 VH3 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 82 ）（CDRH 殘基用底線顯示；請注意，CDRH 3 的第二和第三殘基分別為D和I）： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMN WVRQA PGQGLEWMG W INTNIGEPTY TEEFKG RVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCAR DD IYGNRVSY WG QGTLVTVSS
分離了三種變體hHER2 MAB-1 VL 結構域：hHER2 MAB-1 VL1 、hHER2 MAB-1 VL2 和hHER2 MAB-1 VL3 。此類變體hHER2 MAB-1 VL 結構域的氨基酸序列如下所示。
hHER2 MAB-1 VL1 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 83 ）（CDRL 殘基用底線顯示；請注意，CDRL 1 的第七和第八殘基分別為N和S，CDRL 2 的第六和第七殘基的殘基分別為V和D）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDIN SYLS WFQQKP GKAPKTLIY R ANRLVD GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC LQ HDEFPWT FGQ GTKLEIK
hHER2 MAB-1 VL2 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 84 ）（CDRL 殘基用底線顯示；請注意，CDRL 1 的第七和第八殘基分別為N和T，CDRL 2 的第六和第七殘基的殘基分別為V和E）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDIN TYLS WFQQKP GKAPKTLIY R ANRLVE GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC LQ HDEFPWT FGQ GTKLEIK
hHER2 MAB-1 VL3 的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 85 ）（CDRL 殘基用底線顯示；請注意，CDRL 1 的第七和第八殘基分別為S和N，CDRL 2 的第六和第七殘基的殘基分別為Q和S）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDIS NYLS WFQQKP GKAPKTLIY R ANRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC LQ HDEFPWT FGQ GTKLEIK
任何此類人源化的VH和VLhHER2 MAB-1 結構域，包括上述hHER2 MAB-1 VH和/或VL結構域通用序列中包含的任何結構域，均可用於形成抗體、雙抗體或能夠結合Her2的結合分子。（ 2 ）其他 HER2 結合結構域
除了以上確定的HER2結合結構域之外，本發明還考慮使用任何以下抗-Her-2結合結構域的任何表位元-結合位點：1.44.1；1.140；1.43； 1.14.1；1.100.1；1.96；1.18.1；1.20；1.39；1.24；以及1.71.3（美國專利號8,350,011； 8,858,942；和PCT專利公開WO 2008/019290）； F5和C1（美國專利號7,892,554； 8,173,424； 8,974,792；和PCT專利公開WO 99/55367）；以及美國專利公開2011 / 0097323、2013 / 017114、2014 / 0328836、2016 / 0130360和2016/0257761以及PCT專利公開WO2011 / 147986的抗HER2抗體的結合結構域）。
本發明具體包括並涵蓋CD137 x HER2 結合分子 ，其包括任何馬格妥昔單抗、曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、hHER2 MAB-1或任何本文提供的其他抗HER2抗體的VL和/或VH結構域、和/或VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH ；並且更典型地具有這種抗HER2單克隆抗體的VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2個或全部3個CDRH 。c ） EphA2 結合結構域
受體酪氨酸激酶、肝配蛋白A型受體2（EphA2 ）通常在成人上皮組織的細胞間接觸位點處表達，然而，最近的研究表明，它在各種類型的上皮癌中也過表達，在轉移病灶中觀察到EphA2表達水準最高。EphA2的高表達水準已在廣泛的癌症和許多腫瘤細胞系中被發現，包括前列腺癌、乳腺癌、非小細胞肺癌和黑素瘤。EphA2似乎不僅是癌症的標誌物，而且在許多人類癌症中似乎持續存在被過表達和功能改變。根據本發明，可以使用任何抗EphA2抗體的表位-結合位點。以下呈現的是幾種可用於產生本發明分子的代表性抗EphA2抗體。(1) EphA2 MAB-1
抗體EphA2 MAB-1 是鼠抗EphA2單克隆抗體。EphA2 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 86 ）（CDR殘基用底線顯示）： QVQLKESGPG LVAPSQSLSI TCTVSGFSLS RYSVH WVRQP PGKGLEWLG M IWGGGSTDYN SALKS RLSIS KDNSKSQVFL KMNSLQTDDT AMYYCAR KHG NYYTMDY WGQ GTSVTVSS
EphA2 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 87 ）（CDR殘基用底線顯示）： DIQMTQTTSS LSASLGDRIT ISC RASQDIS NYLN WYQQKP DGTVKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFC QQ GYTLYT FGGG TKLEIK(2) EphA2 MAB-2
抗體EphA2 MAB-2 是鼠抗EphA2單克隆抗體。EphA2 MAB-2 的VH結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 88 ）（CDR殘基用底線顯示）： QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGFTFT NYGMN WVKQA PGKGLKWMG W INTYIGEPTY ADDFKG RFVF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAR EL GPYYFDY WGQ GTTLTVSS
EphA2 MAB-2 的VL結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 89 ）（CDR殘基用底線顯示）： DVVMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSLV HSSGNTYLH W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YFC SQSTHVP T FGSGTKLEI K(3) EphA2 MAB-3
抗體EphA2 MAB-3 是鼠抗EphA2單克隆抗體。EphA2 MAB-3 的VH結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 90 ）（CDR殘基用底線顯示）： EVQLVESGGG SVKPGGSLKL SCAASGFTFT DHYMY WVRQT PEKRLEWVA T ISDGGSFTSY PDSVKG RFTI SRDIAKNNLY LQMSSLKSED TAMYYCTR DE SDRPFPY WGQ GTLVTVSS
EphA2 MAB-3 的VL結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 91 ）（CDR殘基用底線顯示）： DIVLTQSHRS MSTSVGDRVN ITC KASQDVT TAVA WYQQKP GQSPKLLIF W ASTRHA GVPD RFTGSGSGTD FTLTISSVQA GDLALYYC QQ HYSTPYT FGG GTKLEIK(4) 其他 EphA2 結合結構域
除了以上確定的EphA2結合結構域外，本發明還考慮使用任何以下抗EphA2抗體的任何表位結合位點：SPL1 、 LUCA19 、 SG5 或LUCA40 （參見，PCT專利公開號WO 2006/084226）；B13 （參見美國專利號7,101,976）；D7（參見美國專利號7,192,698）；B-233 和EA2 （參見PCT專利公開號WO 2003/094859）。
本發明具體包括並涵蓋CD137 x EphA2 結合分子 ，其包括抗EphA2 單克隆抗體EphA2 MAB-1、EphA2 MAB-2 或EphA2 MAB-3的VL和/或VH結構域，和/或VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH 。d ） 5T4 結合結構域
癌胚蛋白5T4 是顯示在許多癌的細胞膜上的腫瘤相關蛋白，所述癌包括腎癌、結腸癌、前列腺癌、肺癌和急性淋巴細胞白血病。根據本發明，可以使用任何抗5T4抗體的表位-結合位點。下面呈現的是兩種代表性抗5T4抗體，人源化的“5T4 MAB-1 ”和鼠“5T4 MAB-2 ”。另外的ant-5T4抗體在本領域中有描述（參見，例如，美國專利號：8,084,249； 8,409,577； 8,759,495； 8,409,577； PCT公開號：WO 2013/041687；WO 2014/137931；WO 2016/022939）。(1)5T4 MAB-1
5T4 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 92 ）（CDR殘基用底線顯示）： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SFWMH WVRQA PGQGLEWMG R IDPNRGGTEY NEKAKS RVTM TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAG GN PYYPMDY WGQ GTTVTVSS
5T4 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 93 ）（CDR殘基用底線顯示）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQGIS NYLA WFQQKP GKAPKSLIY R ANRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYC LQ YDDFPWT FGQ GTKLEIK (2)            5T4 MAB-2
5T4 MAB-2 的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 94 ）（CDR殘基用底線顯示）： QVQLQQPGAE LVKPGASVKM SCKASGYTFT SYWIT WVKQR PGQGLEWIG D IYPGSGRANY NEKFKS KATL TVDTSSSTAY MQLSSLTSED SAVYNCAR YG PLFTTVVDPN SYAMDY WGQG TSVTVSS
5T4 MAB-2 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 95 ）（CDR殘基用底線顯示）： DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISC RSSQSIV YSNGNTYLE W YLQKPGQSPK LLIY KVSNRF S GVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYC FQGSHVP FT FGSGTKLE IK
本發明具體包括並涵蓋CD137 x 5T4 結合分子 ，其包括抗5T4 單克隆抗體5T4 MAB-1 或5T4 MAB-2或WO 2007/106744、WO 2013/041687 或WO 2015/184203提供的任何抗5T4抗體的VL和/或VH結構域，和/或VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH 。e) B7-H3 結合結構域
B7-H3是在多種實體瘤類型上過表達的腫瘤抗原，並且是涉及免疫調節的B7家族分子的成員。特別地，幾項獨立研究表明，人類惡性腫瘤細胞（例如，成神經細胞瘤和胃癌、卵巢癌和非小細胞肺癌的腫瘤細胞）展示B7-H3蛋白表達顯著增加，並且這種增加的表達與疾病嚴重程度增加相關，表明B7-H3被腫瘤用作免疫逃逸途徑。
根據本發明，可以使用任何抗B7-H3抗體的表位-結合位點。結合人B7-H3的一種代表性人源化抗體是“依諾妥珠單抗 ”。 依諾妥珠單抗（也稱為MGA271； CAS登記號1353485-38-7；參見，例如，美國專利號8,802,091）是與B7-H3結合並介導增強的ADCC活性的Fc優化的單克隆抗體。 依諾妥珠單抗（WHO 藥物資訊，2017，推薦的INN：清單77，31（1）：149）的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列在本領域中是已知的。還提供了另外的代表性的抗B7-H3抗體。(1) hBRCA69D
人源化抗B7-H3抗體“hBRCA69D ”的代表性VH和VL結構域如下。下面提供了兩種人源化的VH結構域hBRCA69D VH1 和hBRCA69D VH2 ；以及兩種人源化VL結構域hBRCA69D VL1 和hBRCA69D VL2 ，它們可用於VH/VL的任何組合以產生功能性的人源化結合結構域。
hBRCA69D VH1 的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 96 ）（CDRH 殘基用底線顯示）： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGDGDTRY TQKFKG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
hBRCA69D VH2 的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 97 ）（CDRH 殘基用底線顯示）： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMQ WVRQA PGQGLEWMG T IYPGGGDTRY TQKFQG RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR RG IPRLWYFDV W GQGTTVTVSS
hBRCA69D VL1 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 98 ）（CDRL 殘基用底線顯示）。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQDIS NYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLHS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK
hBRCA69D VL2 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 99 ）（CDRL 殘基用底線顯示）。 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASQSIS SYLN WYQQKP GKAPKLLIY Y TSRLQS GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDIATYYC QQ GNTLPPT FGG GTKLEIK(2) hPRCA157
另一個代表性的人源化抗B7-H3抗體是“hPRCA157 ”。hPRCA157 VH1 的VH結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 100 ）（CDRH 殘基用底線顯示）： EVQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFTFS SYGMS WVRQA PGKGLEWVA T INSGGSNTYY PDSLKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR HD GGAMDY WGQG TTVTVSS
hPRCA157 VL1 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 101 ）（CDRL 殘基用底線顯示）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC RASESIY SYLA WYQQKP GKAPKLLVY N TKTLPEGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYGTPPWT FG QGTRLEIK(3) 其他 B7-H3 結合結構域
除了以上確定的B7-H3結合結構域之外，本發明還考慮使用任何以下抗B7-H3抗體的任何表位結合位點：LUCA1 ； BLA8 ； PA20 ；或 SKN2 （參見，美國專利號7,527,969； 8,779,098和PCT專利公開號WO 2004/001381）；M30 ； cM30 ； M30-H1-L1 ； M30-H1-L2 ； M30-H1-L3 ； M30-H1-L4 ； M30-H1-L5 ； M30-H1-L6 ； M30-H1-L7 ； M30-H4-L1 ； M30-H4-L2 ； M30-H4-L3 ； M30-H4-L4 和M30-H4-L4 （參見美國專利公開號2013/0078234和PCT專利公開號WO 2012/147713；和8H9 （參見美國專利號7,666,424；7,737,258；7,740,845；8,148,154；8,414,892；8,501,471；9,062,110；美國專利公開號2010/0143245和PCT專利公開號WO 2008/116219）。
本發明具體包括並涵蓋CD137 x B7-H3 結合分子 ，其包括抗人源化的BRCA69D 、 PRCA157 、 人源化的PRCA157 ，或依諾妥珠單抗，或任何本文提供的其他抗B7-H3抗體的VL和/或VH結構域，和/或VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH ；且更通常具有此類抗B7-H3單克隆抗體的VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH 。f)GpA33 結合結構域
43kD跨膜糖蛋白A33（gpA33 ）在所有結直腸癌中表達＞ 95％。 根據本發明，可以使用任何抗gpA33抗體的表位-結合位點。 代表性的人源化抗gpA33抗體（“gpA33 MAB-1 ”）如下所示。
gpA33 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 102 ）（CDR殘基用底線顯示）： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GSWMN WVRQA PGQGLEWIG R IYPGDGETNY NGKFKD RVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR IY GNNVYFDV WG QGTTVTVSS
gpA33 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 103 ）（CDR殘基用底線顯示）： DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITC SARSSIS FMY WYQQKPG KAPKLLIY DT SNLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLEAE DAATYYC QQW SSYPLT FGQG TKLEIK
本發明具體包括並涵蓋CD137 x gpA33 結合分子 ，其包括抗gpA33單克隆抗體gpA33 MAB-1或WO2015/026894中提供的任何抗gpA33單克隆抗體的VL和/或VH結構域，和/或VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH 。g)CEACAM5 和 CEACAM6 結合結構域
已發現癌胚胎抗原相關細胞黏附分子5（CEACAM5）和6（CEACAM6）與各種類型的癌症相關，包括甲狀腺髓樣癌、結直腸癌、胰腺癌、肝細胞癌、胃癌、肺癌、 頭頸癌、尿膀胱癌、前列腺癌、子宮癌、子宮內膜癌、乳腺癌、造血癌(hematopoietic cancer)、白血病和卵巢癌，尤其是結直腸癌、胃腸道癌、胰腺癌、非小細胞肺癌（NSCL）、乳腺癌、甲狀腺癌、胃癌、卵巢癌和子宮癌。根據本發明，可以使用任何抗CEACAM5/CEACAM6抗體的表位-結合位點。 以下提供了代表性的抗CEACAM5 / CEACAM6抗體。(1) 16C3
人源化抗CEACAM5 / CEACAM6抗體16C3 （EP 2585476）的VH結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 104 ）（CDR殘基以底線顯示）： QVQLQQSGPE VVRPGVSVKI SCKGSGYTFT DYAMH WVKQS HAKSLEWIG L ISTYSGDTKY NQNFKG KATM TVDKSASTAY MELSSLRSED TAVYYCAR GD YSGSRYWFAY WGQGTLVTVS S
人源化的抗CEACAM5 / CEACAM6抗體16C3 （EP 2585476）的VL結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 105 ）（CDR殘基用底線顯示）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC GASENIY GALN WYQRKP GKSPKLLIW G ASNLAD GMPS RFSGSGSGRQ YTLTISSLQP EDVATYY CQN VLSSPYT FGG GTKLEIK(2) hMN15
人源化抗CEACAM5 / CEACAM6抗體hMN15 （US8,287,865）的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 106 ）（CDR殘基用底線顯示）： QVQLVESGGG VVQPGRSLRL SCSSSGFALT DYYMS WVRQA PGKGLEWLG F IANKANGHTT DYSPSVKG RF TISRDNSKNT LFLQMDSLRP EDTGVYFCAR DMGIRWNFDV WGQGTPVTVS S
人源化抗CEACAM5 / CEACAM6抗體hMN15 （US8,287,865）的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 107 ）（CDR殘基用底線顯示）： DIQLTQSPSS LSASVGDRVT MTC SASSRVS YIH WYQQKPG KAPKRWIY GT STLAS GVPAR FSGSGSGTDF TFTISSLQPE DIATYYC QQW SYNPPT FGQG TKVEIKR
本發明具體包括並涵蓋CD137 x CEACAM5 / CEACAM6 結合分子，其包括抗CEACAM5/CEACAM6 單克隆抗體16C3 或hMN15 的VL和/或VH結構域，和/或VL區域的1個，2個或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1個、2個或全部3個CDRH 。h ） CD19 結合結構域
CD19（B淋巴細胞表面抗原B4，Genbank登錄號M28170）是B細胞受體（BCR）複合體的組分，並且是B細胞信號傳導的正調節物，其調節B細胞啟動和體液免疫的閾值。CD19是B細胞系中最普遍表達的抗原之一，並在＞95％的B細胞惡性腫瘤中表達，包括急性淋巴細胞白血病（ALL）、慢性淋巴細胞白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）。值得注意的是，CD19表達在對抗CD20治療變得抗性的B細胞淋巴瘤上得以維持。還已經建議將CD19作為治療自身免疫疾病的靶標。
根據本發明，可以使用任何抗CD19抗體的表位結合位點。結合人CD19並且可以在本發明中使用的代表性人源化抗體是在WO 2016/048938中公開的人源化抗CD19抗體（本文稱為“CD19 MAB-1 ”）。
CD19 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列為（SEQ ID NO ： 108 ）（CDRH 殘基用底線顯示）： QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMGVG WIR QPPGKALEWL A HIWWDDDKR YNPALKS RLT ISKDTSKNQV FLTMTNMDPV DTATYYCAR M ELWSYYFDY W GQGTTVTVSS
CD19MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 109 ）（CDRL 殘基用底線顯示）： ENVLTQSPAT LSVTPGEKAT ITC RASQSVS YMH WYQQKPG QAPRLLIY DA SNRAS GVPSR FSGSGSGTDH TLTISSLEAE DAATYYC FQG SVYPF T FGQG TKLEIK
本發明具體包括並涵蓋CD137 x CD19 結合分子 ，其包括抗CD19單克隆抗體CD19 MAB-1 或美國專利US 7,112,324中公開的任何抗CD19單克隆抗體或存在於蘭妥莫單抗（BLINCYTO®; 在WHO藥物資訊，2009，推薦的INN：清單62，23（3）：240-241中找到的氨基酸序列）和度妥昔珠單抗（aka MGD011；在WHO藥物資訊，2016年，建議的INN：清單116，30（4）：627-629中找到的氨基酸序列）的VL和/或VH結構域，和/或VL區域的1個、2個或全部3個CDRL 和/或VH區域的1個、2個或全部3個CDRH 。i) CD123 結合結構域
CD123（白細胞介素3受體）包括獨特的α鏈IL-3Ra，其為40kDa分子。白介素3（IL-3）驅動多能幹細胞早期分化為紅細胞樣細胞、骨髓細胞和淋巴祖細胞。已報導，CD123在包括急性髓系白血病（AML）和骨髓增生異常綜合症（MDS）在內的各種血液系統惡性腫瘤的惡性細胞上過表達。 CD123的過表達與AML預後較差有關。
根據本發明，可以使用任何抗CD123抗體的表位結合位點。 與人CD123結合並且可以在本發明中採用的代表性人源化抗體是“CD123 MAB-1”（參見，例如，PCT專利公開WO 2015/026892）。
CD123 MAB-1 的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 110 ）（CDRH 殘基用底線顯示）： EVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMK WVRQA PGQGLEWIG D IIPSNGATFY NQKFKG RVTI TVDKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCAR SH LLRASWFAY W GQGTLVTVSS
CD123 MAB-1 的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 111 ）（CDRL 殘基用底線顯示）： DFVMTQSPDS LAVSLGERVT MSC KSSQSLL NSGNQKNYLT WYQQKPGQPP KLLIY WASTR ES GVPDRFSG SGSGTDFTLT ISSLQAEDVA VYYC QNDYSY PYT FGQGTKL EIK
本發明具體包括並涵蓋CD137 x CD123 結合分子 ，其包括抗CD123單克隆抗體CD123 MAB-1 或公開於US 2017/081424和WO 2016/036937的任何抗CD123抗體或存在於JNJ-63709178（Johnson＆Johnson，也參見，WO 2016/036937）和XmAb14045（Xencor，也請參見，US 2017/081424）的VL和/或VH結構域，和/或VL區域的1個、2個或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1個、2個或全部3個CDRH 。j) IL13Rα2
白細胞介素-13受體α2（IL13Rα2 ）在各種癌症中過表達，包括膠質母細胞瘤、結直腸癌、宮頸癌、胰腺癌、多發性黑素瘤、骨肉瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和肺癌。免疫特異性結合IL13Rα2的抗體是商業上可得的並且已經在本領域中進行了描述（參見，例如，WO 2008/146911）。 結合人IL13Rα2的代表性人源化抗體包括“hu08 ”（參見，例如，WO 2014/072888）。
hu08 的VH結構域的氨基酸序列（SEQ ID NO ： 112 ）如下所示（CDR殘基用底線顯示）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAAS GFTFS RNGMS WVRQA PGKGLEWVA T VSSGGSYIYY ADSVKG RFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR QG TTALATRFFD V WGQGTLVTV SS
hu08 的VL結構域的氨基酸序列（SEQ ID NO ： 113 ）如下所示（CDR殘基用底線顯示）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITC KASQDVG TAVA WYQQKP GKAPKLLIY S ASYRST GVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYC QH HYSAPWT FGG GTKVEIK
本發明具體包括並涵蓋CD137 xIL13Rα2 結合分子 ，其包括抗IL13Rα2單克隆抗體hu08 的VL和/或VH結構域和/或VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個的CDRH 。k ） ROR1
受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1（“ROR1 ”）是屬於細胞表面受體ROR亞科的I型膜蛋白。ROR1是一種癌胚胎抗原，其在胚胎發生過程中由許多組織表達，在大多數成熟組織中不存在，並且在許多血液和實體惡性腫瘤包括卵巢、結腸、肺、淋巴瘤、皮膚、胰腺、睾丸、膀胱、子宮、前列腺、腎上腺、乳腺和B細胞惡性腫瘤，以及在某些癌症幹細胞中表達。ROR1表達與表現出較低分化形態的高級別腫瘤相關，並與差的臨床結果相關。根據本發明，可以使用任何抗ROR1抗體的表位-結合位點。下文在可用於產生本發明分子的代表性人源化/優化抗ROR1抗體中提出，該抗體的變體描述於WO 2017/142928中。(I) 抗 ROR1
抗ROR1抗體的代表性VH的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 114 ）（CDR殘基用底線顯示）： QEQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYYMS WXRQA PGKGLEWVA T IYPSSGKTYY ADSAKG RLTI SSDNAKDSLY LQMNSLRAED TAVYYCTR DS YADDAALFDI WGQGTTVTVS S 其中X為I或V。
抗ROR1抗體的代表性VL的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 115 ）（CDR殘基用底線顯示）： QLVLTQSPSA SASLGSSVKL TC TLSSGHKT DTID WYQQQP GKAPRYLMK L EGSGSY NKGS GVPDRFSGSS SGADWYLTIS SLQSEDEADY YC GTDYPGNY L FGGGTQLTV LG(2) 其他 ROR1 結合結構域
除了以上確定的ROR1結合結構域之外，本發明還考慮使用任何以下抗ROR1抗體的任何表位-結合位點：4A5 （參見US 8,212,009）；R11 ， R12 和 Y31 （參見US9,758,586）；和A1-A14 （參見，例如，US 9,228,023）。
本發明具體包括並涵蓋CD137 x ROR1 結合分子 ，其包括本文提供的任何抗ROR1單克隆抗體的VL和/或VH結構域和/或VL區域的1、2或全部3個CDRL 和/或VH結構域的1、2或全部3個CDRH 。D. 本發明的 CD137×TA 結合分子
本發明特別涉及能夠同時結合CD137和TA 的具有Fc的四價和三價CD137 x TA 結合分子 ，以及能夠同時結合CD137和TA 的其他具有Fc的CD137 x TA 結合分子 。本發明進一步涉及這樣的分子在癌症和其他疾病和病況的治療中的用途。1. 四價 CD137 x TA 具有 Fc 的雙抗體
本發明特別地涵蓋能夠同時結合CD137和TA 的各種具有Fc的雙抗體。代表性的具有Fc的CD137 x TA 雙抗體描述如下。
這樣的四價具有Fc的雙抗體將包括兩條多肽鏈。此類多肽鏈中的第一條可在N端至C端方向上包含N端、能夠結合“第一”抗原（VL1）（CD137或TA）的表位元的抗體的輕鏈可變結構域（VL）、能夠與“第二”抗原（VH2）（如果選擇VL1 與CD137的表位結合，則為TA；如果選擇VL1 結合至TA 的表位，則為CD137）的表位結合的抗體的重鏈可變結構域（VH）、含有半胱氨酸的結構域、一個或多個另外的結構域（如下文更詳細所述）和C末端。此類多肽鏈的第二條可以在N末端至C末端方向上包含N末端、能夠結合“第二”抗原（VL2）（如果第一個抗原是CD137，則為TA ；如果第一個抗原是TA ，則為CD137））的表位元的抗體的輕鏈可變結構域（VL ）、能夠與“第二”抗原（VH2）（如果選擇VL2 結合CD137的表位，則為TA ；如果選擇VL2結合TA 的表位，則為C137）的表位結合的抗體的重鏈可變結構域（VH ）、含半胱氨酸的結構域、一個或多個另外的結構域(如下更詳細提供)和C-末端。間插接頭肽（接頭 1 ）將輕鏈可變結構域（VL1 或 VL2 ）與重鏈可變結構域（VH1 或 VH2 ）分開。
在某些實施方式中，本發明的具有Fc的雙抗體是具有四個表位-結合位點的共價結合的四價雙抗體，其包含四條多肽鏈，並具有圖 1A 所示的一般結構。這種雙抗體的第一和第三多肽鏈在N末端至C末端方向上含有：（i）含VL1的結構域，（ii）含VH2的結構域，（iii）異質二聚體-促進結構域和（iv）含有CH2-CH3序列的結構域。第二和第四多肽鏈含有：（i）含有VL2的結構域，（ii）含有VH1的結構域和（iii）異質二聚體促進結構域，其中異質二聚體促進結構域促進第一/第三多肽鏈與第二/第四多肽鏈的二聚化和共價結合。VH結構域通過間插接頭肽（接頭 2 ）與異質二聚體-促進結構域連接，所述間插接頭肽可以包括半胱氨酸殘基。任選地，或另外地，異質二聚體促進結構域可包括半胱氨酸殘基。在代表性的具有Fc的CD137 x TA 雙特異性雙抗體的實施方式中，第一多肽鏈的異質二聚體-促進結構域的C-末端通過間插接頭肽（接頭 3 ）連接至CH2-CH3結構域。第三和第四多肽鏈的VL和/或VH結構域，以及第一和第二多肽鏈的VL和/或VH結構域可以相同或不同，以允許單特異性、雙特異性或四特異性的四價結合。在下面的表 3 中，符號“VL3 ”和“VH3 ”分別表示結合這種雙抗體的“第三”表位元的輕鏈可變結構域和可變重鏈結構域。類似地，符號“VL4 ”和“VH4 ”分別表示結合這種雙抗體的“第四”表位元的輕鏈可變結構域和可變重鏈結構域。表 3 提供了本發明的代表性的四鏈雙特異性含Fc區的雙抗體的多肽鏈的一般結構：
表 3
雙特異性  第二鏈  NH2 -VL2-VH1-©-HPD-COOH
第一鏈  NH2 -VL1-VH2-©-HPD-©-CH2-CH3-COOH
第一鏈  NH2 -VL1-VH2-©-HPD-©-CH2-CH3-COOH
第二鏈  NH2 -VL2-VH1-©-HPD-COOH
四特異性 第二鏈  NH2 -VL2-VH1-©-HPD-COOH
第一鏈  NH2 -VL1-VH2-©-HPD-©-CH2-CH3-COOH
第三鏈  NH2 -VL3-VH4-©-HPD-©-CH2-CH3-COOH
第四鏈  NH2 -VL4-VH3-©-HPD-COOH
（–©–表示具有一個、兩個或兩個以上半胱氨酸殘基的含半胱氨酸的多肽結構域。此表述旨在闡釋性而非限制性的。半胱氨酸殘基可以存在於另外或可選的結構域中，例如異質二聚體-促進結構域（HPD）中）
在某些實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子 是雙特異性的、四價的（即，具有四個表位結合位點）、具有Fc的雙抗體，其包括四條總多肽鏈（圖 1A-1C ）。本發明的CD137 x TA 結合分子 是雙特異性的、四價的、具有Fc的雙抗體，其包括對CD137具有免疫特異性的兩個表位-結合位點（其可以能夠與CD137的相同表位或CD137的不同表位結合），和對腫瘤抗原具有免疫特異性的兩個表位-結合位點（其可以能夠與TA 的相同表位或TA 的不同表位或不同TA 的不同表位結合）。
在進一步實施方式中，本發明的含有Fc結構域的雙抗體可以包括三條多肽鏈。這種雙抗體的第一多肽通常包含三個結構域：（i）含VL1的結構域，（ii）含VH2的結構域和（iii）含CH2-CH3序列的結構域。這種雙抗體的第二多肽通常含有：（i）含VL2的結構域，（ii）含VH1的結構域，和（iii）促進與雙抗體的第一多肽鏈異源二聚化和共價結合的結構域。這種雙抗體的第三條多肽通常包括CH2-CH3序列。因此，這種雙抗體的第一和第二多肽鏈通常締合在一起以形成能夠結合第一或第二表位的VL1/VH1表位-結合結構域以及能夠與其他此類表位結合的VL2/VH2表位-結合結構域。第一和第二多肽通常通過涉及其各自的第三結構域中的半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈通常彼此複合以通過二硫鍵形成穩定的Fc結構域。圖 1D 示出了這種雙抗體的代表性結構。
在上述每個實施方式中，協調選擇第一多肽鏈的輕鏈可變結構域（VL1 ），以使其與第二多肽鏈的重鏈可變結構域（VH1 ）相互作用從而形成功能性的表位結合位點，其能夠免疫特異性結合第一抗原（即TA 或CD137）的表位。相似地，協調選擇第二多肽鏈的輕鏈可變結構域（VL2 ），以使其與第一多肽鏈的重鏈可變結構域（VH2 ）相互作用，從而形成功能性表位結合位點，其能夠免疫特異性結合第二抗原（即TA 或CD137）的表位。因此，協調輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域的選擇，使得兩條多肽鏈共同包括能夠結合CD137和TA 的表位-結合位點。
本發明的另外的具有Fc的雙抗體包含5條多肽鏈，並在圖 2 中描繪。這種雙抗體的第一多肽鏈含有：（i）含VH1的結構域，（ii）含CH1的結構域域，以及（iii）含有CH2-CH3序列的結構域。第一多肽鏈可以是含有VH1和重鏈恆定區的抗體的重鏈。這種雙抗體的第二和/或第五多肽鏈含有：（i）含VL1的結構域，和（ii）含CL的結構域。這種雙抗體的第二和/或第五多肽鏈可以是包含與第一/第三多肽鏈的VH1互補的VL1的抗體的輕鏈。第一、第二和/或第五條肽鏈可以與天然存在的抗體分離。可選地，它們可以重組構建。在一個實施方式中，第二和第五多肽鏈具有相同的氨基酸序列。這種雙抗體的第三多肽鏈含有：（i）含VH1的結構域，（ii）含CH1的結構域，（iii）含CH2-CH3序列的結構域，（iv）含VL2的結構域，（v）含VH3的結構域和（vi）異質二聚體促進結構域，其中異質二聚體促進結構域促進第三鏈與第四鏈的二聚化。這種雙抗體的第四多肽含有：（i）含VL3的結構域，（ii）含VH2的結構域，和（iii）促進與雙抗體的第三多肽鏈的異源二聚化和共價結合的結構域。第三和第四多肽鏈的含有VH3和VH2的結構域的C末端通過間插接頭肽（接頭 2 ）與異質二聚體促進結構域相連，而第三多肽鏈的CH2-CH3結構域的C末端通過間插接頭肽（接頭 4 ）連接至含VL2的結構域。
因此，這種雙抗體的第一和第二以及第三和第五多肽鏈締合在一起以形成能夠結合第一表位的兩個VL1/VH1結合位點。這種雙抗體的第三和第四多肽鏈締合在一起形成一個雙抗體結合結構域，其包括能夠與第二表位結合的VL2/VH2結合位點以及能夠與第三表位結合的VL3/VH3結合位點。第一和第三多肽通過在其各自恆定區中涉及半胱氨酸殘基的二硫鍵彼此結合。值得注意的是，第一和第三多肽鏈彼此複合以形成Fc區。這樣的雙特異性雙抗體具有增強的效力。圖 2 闡釋了這種雙抗體的結構。應當理解的是，VL1/VH1、VL2/VH2和VL3/VH3結構域可以相同或不同，以允許單特異性、雙特異性或三特異性結合。然而，如本文所提供的，選擇這些結構域以結合CD137和TA 。
選擇多肽鏈的VL和VH結構域，以形成對所期望的表位特異性的VL/VH結合位點。由多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以相同或不同，以允許單特異性、雙特異性、三特異性或四特異性的四價結合。特別地，可以選擇VL和VH結構域，使得雙特異性雙抗體可以包括第一表位的兩個結合位點和第二表位的兩個結合位點，或第一表位的三個結合位點和第二表位的一個結合位點，或第一表位的兩個結合位點、第二表位的一個結合位點和第三表位的一個結合位點（如圖 2 所示）。表 4 提供了本發明的代表性的五鏈含Fc區的雙抗體的多肽鏈的一般結構：
表 4
雙特異性   (2x2) 第二鏈  NH2 -VL1—CL-©-COOH
第一鏈  NH2 -VH1-CH1-©-©-CH2-CH3-COOH
第三鏈  NH2 -VH1-CH1-©-©-CH2-CH3-VL2-VH2-©-HPD-COOH
第五 鏈  NH2 -VL1—CL-©-COOH
第四鏈  NH2 -VL2-VH2-©-HPD-COOH
雙特異性   (3x1) 第二鏈  NH2 -VL1—CL-©-COOH
第一鏈  NH2 -VH1-CH1-©-©-CH2-CH3-COOH
第三鏈  NH2 -VH1-CH1-©-©-CH2-CH3-VL1-VH2-©-HPD-COOH
第五 鏈  NH2 -VL1—CL-©-COOH
第四鏈  NH2 -VL2-VH1-©-HPD-COOH
三特異性 (2x1x1) 第二鏈  NH2 -VL1—CL-©-COOH
第一鏈  NH2 -VH1-CH1-©-©-CH2-CH3-COOH
第三鏈  NH2 -VH1-CH1-©-©-CH2-CH3-VL2-VH3-©-HPD-COOH
第五 鏈  NH2 -VL1—CL-©-COOH
第四鏈  NH2 -VL3-VH2-©-HPD-COOH
（–©–表示具有一個、兩個或兩個以上半胱氨酸殘基的含半胱氨酸的多肽結構域。此表述旨在闡釋性而非限制性的。半胱氨酸殘基可以存在於另外或可選的結構域中，例如異質二聚體-促進結構域（HPD）內）
在某些實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子 是雙特異性的、四價的（即，具有四個表位結合位點）、具有Fc的雙抗體，其包括五條總多肽鏈，具有對CD137免疫特異性的兩個表位結合位點（其可以能夠與CD137的相同表位或與CD137的不同表位結合），以及對TA 具有免疫特異性的兩個表位-結合位點（其可以能夠與結合到TA 的相同表位或TA 的不同表位或不同TA 的不同表位）。在另一個實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子 是雙特異性、四價、具有Fc的雙抗體，其包含對CD137具有免疫特異性的三個表位-結合位點（其可以能夠與CD137的相同表位或CD137的兩個或三個不同表位結合）和一個對TA 具有特異性的表位-結合位點。2. 三價 CD137 x TA 結合分子
在一個實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子 是三價的，並且將包括第一表位-結合位點（例如，VL1和VH1）、第二表位-結合位點（例如，VL2和VH2）以及第三表位-結合位點（例如VL3和VH3），從而能夠與TA 的表位、CD137的表位和第三表位結合，第三表位可以是： （a）TA 的相同或不同的表位； （b）CD137的相同或不同表位；或 （c）不同TA 的表位。
在某些實施方式中，本發明的這種“三價 CD137 x TA 結合分子 ”將包括用於CD137的表位的兩個表位-結合位點（這些表位可以相同或不同）和用於TA表位的一個表位-結合位點。
一般而言，本發明的這種三價 CD137 x TA 結合分子 包括三、四、五或多於五條多肽鏈，這些多肽鏈借助於這樣的多肽對之間的一個或多個二硫鍵形成共價結合的分子複合物，其包括“雙抗體型結合結構域 ”和“非雙抗體型結合結構域 ”。
“雙抗體型結合結構域 ”是雙抗體，尤其是DART® 雙抗體的表位-結合結構域。上面已經討論了術語“雙抗體 ”和“DART® 雙抗體 ”。“非雙抗體型 ”結合結構域 旨在表示不具有雙抗體型結合結構域的結構的結合結構域。典型地，非雙抗體型結合結構域為Fab 型結合結構域 或ScFv 型結合結構域 。如本文所用，術語“Fab 型結合結構域 ”是指通過免疫球蛋白輕鏈的VL結構域和免疫球蛋白重鏈的互補VH結構域相互作用形成的表位-結合結構域。Fab型結合結構域與雙抗體型結合結構域的不同之處在於，形成Fab型結合結構域的兩條多肽鏈僅包括單個表位-結合結構域，而形成雙抗體型結合結構域的兩條多肽鏈包括至少兩個表位-結合結構域。ScFv型結合結構域與雙抗體型結合結構域的區別在於同一條多肽鏈的VL和VH結構域相互作用以形成表位-結合結構域。因此，如本文所用，Fab型結合結構域和ScFv型結合結構域不同於雙抗體型結合結構域。
因此，本發明的三價 CD137 x TA 結合分子 包括： （I）“第一”表位-結合結構域，其能夠與“第一”表位免疫特異性結合； （II）“第二”表位-結合結構域，其能夠與“第二”表位免疫特異性結合； （III）“第三”表位-結合結構域，其能夠與“第三”表位免疫特異性結合；和 （IV）由兩個CH2-CH3結構域彼此締合形成的Fc結構域； 其中： （A）“第一”表位-結合結構域和“第二”表位-結合結構域均為“雙抗體型結合結構域； （B）“第三”表位-結合結構域是非雙抗體型結合結構域；和 （C）此類“第一”、“第二”或“第三”表位-結合結構域之一結合TA 的表位，而“第一”、“第二”或“第三”表位元結合結構域的另一種結合CD137的表位。
由剩餘的表位-結合結構域結合的表位元可以是任何期望的表位，例如CD137的表位。與CD137表位相同或不同的這種表位通過分子的其他表位-結合結構域結合。
圖 3A-3C 提供了代表性的三價CD137 x TA 結合分子 的結構域的圖示。圖3A示意性闡釋了代表性的三價 CD137 x TA 結合分子 的結構域，其包括四條多肽鏈的共價複合，並具有一個非雙抗體型結合位點（VL3/VH3，因此對於這種表位而言是單價的），和兩個雙抗體型結合位點（VL1/VH1和VL2/VH2，因此對於每個這樣的表位都是單價的）。圖 3B-3C 示意性地闡釋了代表性的三價 CD137 x TA 結合分子 的結構域，所述分子包括三條多肽鏈的共價複合，並具有一個非雙抗體型結合位點（VL3/VH3，因此對於這種表位是單價的），和兩個雙抗體型結合位點（VL1/VH1和VL2/VH2，因此對於每個這樣的表位都是單價的）。非雙抗體型結合位點是圖3A-3B 中的Fab 型結合結構域 ，並且是圖 3C 中的scFv 型結合結構域 。如下提供的，由多肽鏈的締合形成的VL/VH結合位點可以相同或不同，以允許單特異性、雙特異性或三特異性的三價結合。II. 代表性的 CD137 x TA 結合分子
本發明提供了CD137 x TA 結合分子 ，其是雙特異性四價Fc雙抗體，其能夠同時且特異性地與CD137和TA 結合。如上所述，本發明的CD137 x TA 結合分子 可包含三、四或五條多肽鏈。以下提供了能夠與CD137以及與TA 、PD-L1或HER2結合的代表性CD137 x TA 結合分子 的多肽鏈（稱為“DART-A” 、 “DART-A1” 、 “DART-A2” 、 “DART-A3” 、 “ DART-A4” 、 “ DART-A5” 、 “DART-A6” 、 “ DART-A7” 、 “DART-A8” 、 “DART-A9” 、 “ DART-A10” 、 “DART-B1” 和 “DART-B2” ）。本發明進一步提供了CD137 x TA 結合分子，其是能夠同時且特異性地與CD137和TA 結合的雙特異性三價結合分子。如上指出的，本發明的三價CD137 x TA 結合分子 可包括四條多肽鏈。代表性三價CD137 x TA 結合分子的多肽鏈能夠與CD137和TA 、PD-L1或HER2結合（命名為“TRIDENT-A” 、 “TRIDENT-A4” 、 “TRIDENT-A5” 、 “TRIDENT-A6” 、 “ TRIDENT-B1” 、 “TRIDENT-B1” ）。A. 四價 CD137 x TA 結合分子 1. DART-A
DART-A 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性的TA ，PD-L1的結合位點。DART-A 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，並且第二和第四多肽鏈相同（見圖 1B ）。DART-A 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） 的結合結構域。
DART-A 的第一和第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VL結構域（VLPD-L1 ）（hPD-L1 MAB-2 VL1 （ SEQ ID NO ： 58 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（ CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ）） 、間插接頭肽（接頭 2 ; GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體促進（E-螺旋）結構域（ E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K（SEQ ID NO ： 39 ））、接頭（LEPKSADKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 30 ） ）、包括L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E置換的代表性人IgG1的CH2-CH3結構域（SEQ ID NO ： 43 ，其中X不存在）和C末端。
因此，DART-A的第一和第三多肽鏈包括：SEQ ID NO：58─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：39─SEQ ID NO：30─SEQ ID NO：43。
DART-A 的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 116 ）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAA C E KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLY ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPG
可以採用可選的DART-A 第一和第三多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋）結構域（ E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K（SEQ ID NO ： 37 ） ）。這種可選的DART-A 第一和第三多肽鏈包括：SEQ ID NO ： 58 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 。可以使用另外可選的DART-A 第一和第三多肽鏈，其中氨基酸殘基SEQ ID NO ： 58 （ hPD-L1 MAB-2 VL1 ） 被SEQ ID NO ： 72 （ hPD-L1 MAB-2 VL2 ）的 氨基酸殘基取代。包括許多這樣的多肽鏈的可選分子描述如下。
DART-A 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ））、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （hPD-L1 MAB-2 VH1 ， SEQ ID NO ： 57 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域（ K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E（SEQ ID NO：40）和C末端。
因此，DART-A的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：57─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：40。
DART-A 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 117 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNTLYLQMN SLKTEDTAVY YCARQGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAA C KEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
可以採用可選的DART-A 第二和第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域（例如， K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。這種可選的DART-A 第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 57 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。可以使用另外可選的DART-A 第一和第三多肽鏈，其中SEQ ID NO ： 50 （ CD137 MAB-6 VL1 ） 的氨基酸殘基被SEQ ID NO ： 55 （ CD137 MAB-6 VL2 ） 或SEQ ID NO ： 56 （ CD137 MAB-6 VL3 ） 的氨基酸殘基代替，和/或SEQ ID NO ： 57 （ hPD-L1 MAB-2 VH1 ） 的氨基酸殘基被SEQ ID NO ： 67 （ hPD-L1 MAB-2 VH2 ） 、SEQ ID NO ： 68 （ hPD-L1 MAB-2 VH3 ）、 SEQ ID NO ： 69 （ hPD-L1 MAB-2 VH4 ）、 SEQ ID NO ： 70 （ hPD- L1 MAB-2 VH5 ） 或SEQ ID NO ： 72 （ hPD-L1 MAB-2 VH6 ） 的氨基酸殘基代替。可選地，可以用結合PD-L1的不同表位或結合不同TA 的TA 結合分子的VL / VH結構域代替PD-L1 VL/VH結構域。包括許多這樣的多肽鏈的可選分子描述如下。2.DART-A1
DART-A1 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。DART-A1包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，並且第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A1包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 2.1 ） 的結合結構域。
DART-A1 的第一和第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VL結構域（VLPD-L1 ）（hPD-L1 MAB-2 VL1 （ SEQ ID NO ： 58 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（ SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體促進（E-螺旋）結構域（ E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K（SEQ ID NO ： 39 ））、接頭（LEPKSADKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 30 ） ）、包括L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E置換的代表性人IgG1的CH2-CH3結構域（SEQ ID NO ： 43 ）和C末端。
因此，DART-A1的第一和第三多肽鏈包括：SEQ ID NO：58─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：39─SEQ ID NO：30─SEQ ID NO：43。
DART-A1 的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 118 ）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAA C E KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLY ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
DART-A1 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （hPD-L1 MAB-2 VH2 ， SEQ ID NO ： 67 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域（ K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E（SEQ ID NO：40）和C末端。
因此，DART-A1的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：67─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：40。
DART-A1 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO：119）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARQGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAA C KEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A1 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A1 第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 58 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A1 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 67 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。3. DART-A2
DART-A2 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。DART-A2 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A2 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 2.2 ） 的結合結構域。
DART-A2 的第一和第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VL結構域（VLPD-L1 ）（hPD-L1 MAB-2 VL2 （ SEQ ID NO ： 72 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體-促進（E-螺旋）結構域（ E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K（SEQ ID NO ： 39 ））、接頭（LEPKSADKTHTCPPCP（SEQ ID NO：30））、包括L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E置換的代表性人IgG1的CH2-CH3結構域（SEQ ID NO ： 43 ）和C末端。
因此，DART-A2的第一和第三多肽鏈包括：SEQ ID NO：72─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：39─SEQ ID NO：30─SEQ ID NO：43。
DART-A2 的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 120 ）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN EAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ GTKVEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLY ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
DART-A2 的第二和第四多肽鏈與DART-A1 的第二和第四多肽鏈（SEQ ID NO ： 119 ）相同。
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A2 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A2第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A2 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 67 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。4. DART-A3
DART-A3 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。 DART-A3包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A3包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 3.1 ） 的結合結構域。
DART-A3 的第一和第三多肽鏈與DART-A1 （ SEQ ID NO ： 118 ） 的第一和第三多肽鏈相同。
DART-A3 的第二和第四條肽鏈在N末端至C末端方向包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （hPD-L1 MAB-2 VH3 ， SEQ ID NO ： 68 ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ）異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 )和C末端。
因此，DART-A3的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：68─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：40。
DART-A3 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 121 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIK GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARQGLPYY GDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAA C KEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A3 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A3第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 58 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A3 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 68 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。5. DART-A4
DART-A4 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。DART-A4 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，並且第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A4 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 的結合結構域。
DART-A4 的第一和第三多肽鏈與DART-A2 （ SEQ ID NO ： 120 ） 的第一和第三多肽鏈相同。
DART-A4 的第二和第四多肽鏈與DART-A3 （ SEQ ID NO ： 121 ） 的第二和第四多肽鏈相同。
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A4 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A4第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A4 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 68 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。6. DART-A5
DART-A5 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。DART-A5 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A5 包括CD137 MAB-6 （ 1.2 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 的結合結構域。
DART-A5 的第一和第三多肽鏈與DART-A2 （ SEQ ID NO ： 120 ） 的第一和第三多肽鏈相同。
DART-A5 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL2 （ SEQ ID NO ： 55 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （hPD-L1 MAB-2 VH2 ， SEQ ID NO ： 68 ））、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 )和C末端。
因此，DART-A5的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：55─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：68─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：40。
DART-A5 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 122 ）： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWYQQK PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIK GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARQGLPYY GDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A5 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A5第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A5 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 55 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 68 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。7. DART-A6
DART-A6 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。DART-A6 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，並且第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A6 包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 和hPD-L1 MAB -2 （ 3.2 ） 的結合結構域。
DART-A6 的第一和第三多肽鏈與DART-A2 （ SEQ ID NO ： 120 ） 的第一和第三多肽鏈相同。
DART-A6 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL3 （ SEQ ID NO ： 56 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （ hPD-L1 MAB-2 VH3 ， SEQ ID NO ： 68 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 )和C末端。
因此，DART-A6的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：56 － SEQ ID NO：16 － SEQ ID NO：68 － SEQ ID NO：18 － SEQ ID NO：40。
DART-A6 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（ SEQ ID NO ： 123 ） ： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIK GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARQGLPYY GDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A6 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A6第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A6 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 56 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 68 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。8. DART-A7
DART-A7為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。DART-A7 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A7 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 4.2 ） 的結合結構域。
DART-A7 的第一和第三多肽鏈與DART-A2 （ SEQ ID NO ： 120 ） 的第一和第三多肽鏈相同。
DART-A7 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（ SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （hPD-L1 MAB-2 VH4 ， SEQ ID NO ： 69 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域（ K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 )和C末端。
因此，DART-A7的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：69─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：40。
DART-A7 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 124 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARAGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A7 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A7第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A7 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 69 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。9. DART-A8
DART-A8 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。DART-A8 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A8 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 5.2 ） 的結合結構域。
DART-A8 的第一和第三多肽鏈與DART-A2 （ SEQ ID NO ： 120 ） 的第一和第三多肽鏈相同。
DART-A8 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（ SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （hPD-L1 MAB-2 VH5 ， SEQ ID NO ： 70 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 )和C末端。
因此，DART-A8的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：70─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：40。
DART-A8 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 125 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIK GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARAGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A8 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A8第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A8 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 70 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。10. DART-A9
DART-A9為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。DART-A9 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A9 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 6.2 ） 的結合結構域。
DART-A9 的第一和第三多肽鏈與DART-A2 （ SEQ ID NO ： 120 ） 的第一和第三多肽鏈相同。
DART-A9 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（ SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （hPD-L1 MAB-2 VH6 ， SEQ ID NO ： 71 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ），異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域（ K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 )和C末端。
因此，DART-A9的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：71─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：40。
DART-A9 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 126 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARAGLPYY GDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A9 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A9第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A9 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 71 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。11. DART-A10
DART-A10 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA，PD-L1的結合位點。DART-A10 包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，並且第二和第四多肽鏈相同（見圖 3B ）。DART-A10 包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 4.2 ） 的結合結構域。
DART-A10 的第一和第三多肽鏈與DART-A2 （ SEQ ID NO ： 120 ） 的第一和第三多肽鏈相同。
DART-A10 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL3 （ SEQ ID NO ： 56 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（ SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 （hPD-L1 MAB-2 VH4 ， SEQ ID NO ： 69 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體-促進（K-螺旋）結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 )和C末端。
因此，DART-A10的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：56─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：69─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：40。
DART-A10 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（ SEQ ID NO ： 139 ） ： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGEVQL VESGGGLVQP GGSLRLSCAA SGFTFSSYTM SWVRQAPGKG LEWVAYISIG GGTTYYPDTV KGRFTISRDN AKNSLYLQMN SLRAEDTAVY YCARAGLPYY FDYWGQGTLV TVSSGGCGGG KVAACKEKVA ALKEKVAALK EKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-A10 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-A10第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-A10 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 56 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 69 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。 12. DART-B1
DART-B1為二價CD137 x TA 結合分子，其具有一個CD137結合位點和一個用於代表性TA，HER2的結合位點。DART-B1包括三條多肽鏈，其中第一、第二和第三條多肽鏈不同（見圖 1D ）。DART-B1 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的結合結構域。
DART-B1 的第一多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合HER2（的單克隆抗體的VH結構域VHHER2 （hHER2 MAB-1 VH1 ， SEQ ID NO ： 80 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體促進（E-螺旋）結構域（ E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )）、間插接頭肽（GGGDKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 21 ））、包括L234A / L235A / M252Y / S254T / T256E置換的“具有杵的” CH2和CH3結構域（SEQ ID NO：146），以及C末端。
因此，DART-B1的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：80─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：37─SEQ ID NO ：21─SEQ ID NO：146。
DART-B1 的第一多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 143 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTNYGM NWVRQAPGQG LEWMGWINTN IGEPTYTEEF KGRVTMTRDT SISTAYMELS RLRSDDTAVY YCARDDGYGN RVSYWGQGTL VTVSSGGCGG GEVAALEKEV AALEKEVAAL EKEVAALEKG GGDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLWCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK
DART-B1 的第二多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合HER2的單克隆抗體的VL結構域（VLHER2 （hHER2 MAB-1 VL3 ， SEQ ID NO ： 85 ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體促進（K-螺旋）結構域（ K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）和C末端。
因此，DART-B1的第二多肽鏈包括：SEQ ID NO：85─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：38。
DART-B1 的第二多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 144 ）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGKVAALK EKVAALKEKV AALKEKVAAL KE
DART-B1 的第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括接頭DKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 20 ）和包括L234A / L235A /M252Y / S254T / T256E / H435R置換的“具有杵的”CH2和CH3結構域（SEQ ID NO：149）。
因此，DART-B1的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO ： 20 – SEQ ID NO ： 149 。
如將認識到的，DART-B 的第三多肽鏈不含有任何表位-結合結構域，因此可以在具有圖 1D 所示的雙抗體結構的各種CD137 x TA 結合分子 中採用。
DART-B1 的第三多肽鏈具有SEQ ID NO ： 145 的氨基酸序列： DKTHTCPPCP APEAAGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLSCAVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLVSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNRYTQKS LSLSPGK13.DART-B2
DART-B2 為四價CD137 x CD137 x TA x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和兩個用於代表性TA，HER2的結合位點。DART-B1包括四條多肽鏈，其中第一和第三多肽鏈相同，並且第二和第四條多肽鏈相同（見圖 1B ）。DART-B1 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的結合結構域。
DART-B2 的第一和第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合HER2的單克隆抗體的VL結構域（VLHER2 （hHER2 MAB-1 VL3 ， SEQ ID NO ： 85 ））、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體促進（E-螺旋）結構域( E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:39 ))、接頭（LEPKSADKTHTCPPCP（SEQ ID NO：30））、包括L234A / L235A / M252Y / S254T / T256E置換的代表性人IgG1的CH2-CH3結構域（SEQ ID NO ： 43 ，其中X為不存在）和C末端。
因此，DART-B2的第一和第三多肽鏈包括：SEQ ID NO：85─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：39─SEQ ID NO：30─SEQ ID NO：43。
DART-B2 的第一和第三多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 151 ）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGQVQLQ ESGPGLVKPS ETLSLTCTVS GGSISSYYWS WIRQPPGKGL EWIGRIYTSG STNYNPSLKS RVTMSVDTSK NQFSLKLSSV TAADTAVYYC ARDGWYDEDY NYYGMDVWGQ GTTVTVSSGG CGGGEVAACE KEVAALEKEV AALEKEVAAL EKLEPKSADK THTCPPCPAP EAAGGPSVFL FPPKPKDTLY ITREPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK
DART-B2 的第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 （CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（ SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合HER2的單克隆抗體的VH結構域（VHHER2 （hHER2 MAB-1 VH1 ， SEQ ID ID ： 80 ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體促進（K-螺旋）結構域( K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 )和C末端。
因此，DART-B2的第二和第四多肽鏈包括：SEQ ID NO：50 － SEQ ID NO：16 － SEQ ID NO：80 － SEQ ID NO：18 － SEQ ID NO：40。
DART-B2 的第二和第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 152 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL VQSGAEVKKP GASVKVSCKA SGYTFTNYGM NWVRQAPGQG LEWMGWINTN IGEPTYTEEF KGRVTMTRDT SISTAYMELS RLRSDDTAVY YCARDDGYGN RVSYWGQGTL VTVSSGGCGG GKVAACKEKV AALKEKVAAL KEKVAALKE
特別考慮的是，可以採用可選的DART-B2 第一/第三和第二/第四多肽鏈，其包括缺乏半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 )和 K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 )）。此類可選的DART-B2第一/第三多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 85 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 37 ─ SEQ ID NO ： 30 ─ SEQ ID NO ： 43 ，而這種可選的DART-B2 第二/第四鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 80 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 38 。B. 三價 CD137 x TA 結合分子 1. TRIDENT-A
TRIDENT-A 為三價CD137 x CD137 x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和一個用於代表性TA，PD-L1的結合位點。TRIDENT-A 包括四條多肽鏈（見圖 3A ，其中VL1/VH1（位點A）與VL2/VH2（位點B）相同，並結合CD137，而VL3/VH3（位點C）結合PD-L1）。TRIDENT-A 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） 的結合結構域。
TRIDENT-A 的第一多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 ）（CD137 MAB-6 VL1 （（ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（ SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO:46 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（ SEQ ID NO ： 18 ） ）、異質二聚體促進（E-螺旋）結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 ))、間插接頭肽（GGGDKTHTCPPCP（ SEQ ID NO ： 21 ） ），包括L234A / L235A / M252Y / S254T / T256E置換的“具有杵的”CH2和CH3結構域（SEQ ID NO ： 146 ），以及C末端。
因此，TRIDENT-A的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：37─SEQ ID NO ：21─SEQ ID NO：146。
TRIDENT-A 的第一多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 127 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLYIT REPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
TRIDENT-A 的第二多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 ）（CD137 MAB-6 VL1 （（ SEQ ID NO ： 50 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（ SEQ ID NO ： 16 ） ）、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體促進（K-螺旋）結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 ))和C末端。
因此，TRIDENT-A的第二多肽鏈包括：SEQ ID NO：50─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：38。
TRIDENT-A的第二多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 128 ）： EIVMTQSPAT LSLTPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQI PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
可以採用可選的TRIDENT-A 第一和第二多肽鏈，其包括含有半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:39 ) 和 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 ))。此類可選的TRIDENT-A分子中，第一多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 39 ─ SEQ ID NO SEQ ID NO ： 21-SEQ ID NO ： 146 ，並且第二多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 － SEQ ID NO ： 16 － SEQ ID NO ： 46 － SEQ ID NO ： 18 － SEQ ID NO ： 40 。可以採用另外可選的TRIDENT-A 第一和第二多肽鏈，其中SEQ ID NO ： 50 （ CD137 MAB-6 VL1 ） 的氨基酸殘基被SEQ ID NO ： 55 （ CD137 MAB-6 VL2 ）或 SEQ ID NO ： 56 （ CD137 MAB-6 VL3 ） 的氨基酸殘基取代。還具體地考慮到CD137 VL/VH結構域對可以被TA 結合分子的VL/VH對取代。下文描述了包括許多這樣的多肽鏈的可選分子。
TRIDENT-A 的第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 ）（hPD-L1 MAB-2 VH1 （ SEQ ID NO ： 57 ） ）、人IgG1 CH1結構域（SEQ ID NO ： 3 ）、人IgG1鉸鏈區（SEQ ID NO ： 7 ）以及包括L234A / L235A / M252Y / S254T / T256E / H435R置換（SEQ ID NO ： 149 ）的“具有臼的”CH2和CH3結構域。
因此，TRIDENT-A的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO：57─SEQ ID NO：3─SEQ ID NO：7─SEQ ID NO：149。
TRIDENT-A 的第三多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 129 ）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY ISIGGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNTLY LQMNSLKTED TAVYYCARQG LPYYFDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
TRIDENT-A 的第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VL結構域（VLPD-L1 ）（hPD-L1 MAB-1 VL1 （ SEQ ID NO ： 58 ） ）、人IgG CLκ結構域（SEQ ID NO ： 1 ）和C末端。
因此，TRIDENT-A 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO ： 69 ─ SEQ ID NO ： 1 。
TRIDENT-A 的第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 130 ）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
可以使用可選的TRIDENT-A 第三和第四多肽鏈，其中SEQ ID NO ： 57 （ hPD-L1 MAB-2 VH1 ） 的氨基酸殘基被SEQ ID NO ： 67 （ hPD-L1 MAB-2 VH2 ） 、SEQ ID NO ： 68 （ hPD-L1 MAB-2 VH3 ） 、SEQ ID NO ： 69 （ hPD-L1 MAB-2 VH4 ） 、SEQ ID NO ： 70 （ hPD-L1 MAB- 2 VH5 ） 或SEQ ID NO ： 72 （ hPD-L1 MAB-2 VH6 ） 的氨基酸殘基取代，和/或SEQ ID NO ： 58 （ hPD-L1 MAB-2 VL1 ） 的氨基酸殘基被SEQ ID NO ： 72 （ hPD-L1 MAB-2 VL2 ） 的氨基酸殘基取代。可替選的，可以用結合PD-L1的不同表位或結合不同TA 的TA 結合分子的VL/VH結構域取代PD-L1 VL/VH結構域。還特別考慮了在通過第一和第二多肽鏈的締合形成TA 結合位元點的情況下，第三和第四多肽鏈的VL/VH結構域可以被本文提供的任何CD137 MAB-6 VL/VH結構域取代。包含幾個這樣的多肽鏈的可選分子描述如下。2. TRIDENT-A4
TRIDENT-A4 為三價CD137 x CD137 x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和一個用於代表性TA，PD-L1的結合位點。TRIDENT-A4 包括四條多肽鏈（見圖 3A ，其中VL1/VH1（位點A）與VL2/VH2（位點B）相同，並結合CD137，而VL3/VH3（位點C）結合PD-L1）。TRIDENT-A4 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 的結合結構域。
TRIDENT-A4 的第一多肽鏈與TRIDENT-A （SEQ ID NO ： 127 ）的第一多肽鏈相同。
TRIDENT-A4 的第二多肽鏈與TRIDENT-A （ SEQ ID NO ： 128 ） 的第二多肽鏈相同。
特別考慮的是，可以採用可選的TRIDENT-A4 第一和第二多肽鏈，其包括含有半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:39 ) 和 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 ))。在此類可選的TRIDENT-A4 分子中，第一多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 39 ─ SEQ ID NO SEQ ID NO ： 21-SEQ ID NO ： 146 ，並且第二多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 － SEQ ID NO ： 16 － SEQ ID NO ： 46 － SEQ ID NO ： 18 － SEQ ID NO ： 40 。
TRIDENT-A4 的第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合PD-L1的單克隆抗體的VH結構域（VHPD-L1 ）（hPD-L1 MAB-2 VH3 （ SEQ ID NO ： 68 ） ）、人IgG1 CH1結構域（SEQ ID NO ： 3 ）、人IgG1鉸鏈區（SEQ ID NO ： 7 ）和包括L234A / L235A / M252Y / S254T / T256E / H435R置換的“具有臼的”CH2和CH3結構域（SEQ ID NO ： 149 ）。
因此，TRIDENT-A4的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO：68─SEQ ID NO：3─SEQ ID NO：7─SEQ ID NO：149。
TRIDENT-A4 的第三多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 131 ）： EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYTMSWVRQA PGKGLEWVAY ISIKGGTTYY PDTVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG LPYYGDYWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT AALGCLVKDY FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTQTYI CNVNHKPSNT KVDKRVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS VFLFPPKPKD TLYITREPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLSCAV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLVSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNRYTQK SLSLSPGK
TRIDENT-A4 的第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠與PD-L1結合的單克隆抗體的VL結構域（VLPD-L1 ）（hPD-L1 MAB-1 VL2 （ SEQ ID NO ： 72 ））、人IgG CLκ結構域（SEQ ID NO ： 1 ）和C末端。
因此，TRIDENT-A4 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO ： 72 ─ SEQ ID NO ： 1 。
TRIDENT-A 的第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 132 ）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVN EAVAWYQQKP GKAPKLLIYW ASTRHTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYNTPLTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC3. TRIDENT-A5
TRIDENT-A 5為三價CD137 x CD137 x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和一個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。TRIDENT-A5 包括四條多肽鏈（見圖 3A ，其中VL1/VH1（位點A）與VL2/VH2（位點B）相同，並結合CD137，而VL3/VH3（位點C）結合PD-L1）。TRIDENT-A5 包括CD137 MAB-6 （ 1.2 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 的結合結構域。
TRIDENT-A5 的第一多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 ）（CD137 MAB-6 VL2 （（ SEQ ID NO ： 55 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ）），異質二聚體促進（E-螺旋）結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 ))、間插接頭肽（GGGDKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 21 ））、包括L234A / L235A / M252Y / S254T / T256E置換的“具有杵的”CH2和CH3結構域（SEQ ID NO ： 146 ）以及C末端。
因此，TRIDENT-A5的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO：55─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：37─SEQ ID NO ：21─SEQ ID NO：146。
TRIDENT-A5的第一多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 133 ）： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWYQQK PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLYIT REPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
TRIDENT-A5 的第二多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 ）（CD137 MAB-6 VL2 （（ SEQ ID NO ： 55 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ））、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體促進（K-螺旋）結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 ))和C末端。
因此，TRIDENT-A5的第二多肽鏈包括：SEQ ID NO：55─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：38。
TRIDENT-A5 的第二多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 134 ）： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWYQQK PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
特別考慮的是，可以採用可選的TRIDENT-A5 第一和第二多肽鏈，其包括含有半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:39 )和 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 ))。在此類可選的TRIDENT-A5 分子中，第一多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 55 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 39 ─ SEQ ID NO SEQ ID NO ： 21-SEQ ID NO ： 146 ，並且第二多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 55- SEQ ID NO ： 16-SEQ ID NO ： 46-SEQ ID NO ： 18-SEQ ID NO ： 40 。
TRIDENT-A5 的第三多肽鏈與TRIDENT-A4 （ SEQ ID NO ： 131 ） 的第三多肽鏈相同。
TRIDENT-A5 的第四多肽鏈與TRIDENT-A4 （ SEQ ID NO ： 132 ） 的第四多肽鏈相同。4.TRIDENT-A6
TRIDENT-A6 為三價CD137 x CD137 x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和一個用於代表性TA ，PD-L1的結合位點。TRIDENT-A6 包括四條多肽鏈（見圖 3A ，其中VL1/VH1（位點A）與VL2/VH2（位點B）相同，並結合CD137，而VL3/VH3（位點C）結合PD-L1）。TRIDENT-A6 包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 的結合結構域。
TRIDENT-A6 的第一多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 ）（CD137 MAB-6 VL3 （（ SEQ ID NO ： 56 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ））、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體促進（E-螺旋）結構域( E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:37 ))、間插接頭肽（GGGDKTHTCPPCP（SEQ ID NO ： 21 ））、包括L234A / L235A / M252Y / S254T / T256E置換的“具有杵的”CH2和CH3結構域（SEQ ID NO ： 146 ）以及C末端。
因此，TRIDENT-A6 的第一多肽鏈包括：SEQ ID NO：56─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：37─SEQ ID NO ：21─SEQ ID NO：146。
TRIDENT-A6 的第一多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 135 ）： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGEVAAL EKEVAALEKE VAALEKEVAA LEKGGGDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLYIT REPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
TRIDENT-A6 的第二多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 ）（CD137 MAB-6 VL3 （（ SEQ ID NO ： 56 ） ）、間插接頭肽（接頭 1 ；GGGSGGGG（SEQ ID NO ： 16 ））、能夠結合CD137的單克隆抗體的VH結構域（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ）、間插接頭肽（接頭 2 ；GGCGGG（SEQ ID NO ： 18 ））、異質二聚體促進（K-螺旋）結構域( K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:38 ))和C末端。
因此，TRIDENT-A6的第二多肽鏈包括：SEQ ID NO：56─SEQ ID NO：16─SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：18─SEQ ID NO：38。
TRIDENT-A6 的第二多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 136 ）： EIVMTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SNYLSWFQQK PGQAPRLLIY GASTRATGIP ARFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFAVYYCQ QDYDLPWTFG QGTKVEIKGG GSGGGGQVQL QESGPGLVKP SETLSLTCTV SGGSISSYYW SWIRQPPGKG LEWIGRIYTS GSTNYNPSLK SRVTMSVDTS KNQFSLKLSS VTAADTAVYY CARDGWYDED YNYYGMDVWG QGTTVTVSSG GCGGGKVAAL KEKVAALKEK VAALKEKVAA LKE
特別考慮的是，可以採用可選的TRIDENT-A6 第一和第二多肽鏈，其包括含有半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:39 )和 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 ))。在此類可選的TRIDENT-A6 分子中，第一多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 56 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 39 ─ SEQ ID NO SEQ ID NO ： 21-SEQ ID NO ： 146 ，並且第二多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 56 － SEQ ID NO ： 16 － SEQ ID NO ： 46 － SEQ ID NO ： 18 － SEQ ID NO ： 40 。
TRIDENT-A6 的第三多肽鏈與TRIDENT-A4 （ SEQ ID NO ： 131 ） 的第三多肽鏈相同。
TRIDENT-A6 的第四多肽鏈與TRIDENT-A4 （ SEQ ID NO ： 132 ） 的第四多肽鏈相同。5. TRIDENT-B1
TRIDENT-B1 為三價CD137 x CD137 x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和一個用於代表性TA ，HER2的結合位點。TRIDENT-B1 包括四條多肽鏈（見圖 3A ，其中VL1/VH1（位點A）與VL2/VH2（位點B）相同，並結合CD137，而VL3/VH3（位點C）結合HER2）。TRIDENT-B1 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的結合結構域。
TRIDENT-B1 的第一多肽鏈與TRIDENT-A （ SEQ ID NO ： 127 ） 的第一多肽鏈相同。
TRIDENT-B1 的第二多肽鏈與TRIDENT-A （ SEQ ID NO ： 128 ） 的第二多肽鏈相同。
特別考慮的是，可以採用可選的TRIDENT-B1 第一和第二多肽鏈，其包括含有半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:39 )和 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 ))。在此類可選的TRIDENT-B1 分子中，第一多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 85 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 39 ─ SEQ ID NO SEQ ID NO ： 21-SEQ ID NO ： 146 ，並且第二多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 85-SEQ ID NO ： 16-SEQ ID NO ： 46-SEQ ID NO ： 18-SEQ ID NO ： 40 。
TRIDENT-B1 的第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合HER2的單克隆抗體的VH結構域（VHHER2 （hHER2 MAB-1 VH1 ， SEQ ID NO ： 80 ） ）、人IgG1 CH1結構域（SEQ ID NO ： 3 ）、人IgG1鉸鏈區（SEQ ID NO ： 7 ）和包括L234A/L235A/M252Y/S254T/T256E/H435R置換的“具有臼的”CH2和CH3結構域（SEQ ID NO ： 149 ）。
因此，TRIDENT-B1的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO：80─SEQ ID NO：3─SEQ ID NO：7─SEQ ID NO：149。
TRIDENT-B1 的第三多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 153 ）： QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT NYGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTNIGEPTY TEEFKGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARDD GYGNRVSYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSVVTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN TKVDKRVEPK SCDKTHTCPP CPAPEAAGGP SVFLFPPKPK DTLYITREPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLSCA VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPVL DSDGSFFLVS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNRYTQ KSLSLSPGK
TRIDENT-B1 的第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合HER2的單克隆抗體的VL結構域（VLHER2 （hHER2 MAB-1 VL3 ， SEQ ID NO ： 85 ） ）、人IgG CLκ結構域（SEQ ID NO ： 1 ）和C末端。
因此，TRIDENT-B1 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO ： 85 ─ SEQ ID NO ： 1 。
TRIDENT-B1 的第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 154 ）： DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDIS NYLSWFQQKP GKAPKTLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCLQ HDEFPWTFGQ GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC6. TRIDENT-B2
TRIDENT-B2 為三價CD137 x CD137 x TA 結合分子，其具有兩個CD137結合位點和一個代表性TA ，HER2結合位點。TRIDENT-B1 包括四多肽鏈（見圖 3A ，其中VL1/VH1（位點A）與VL3/VH3（位點C）相同，並結合CD137，而VL2/VH2（位點B）結合HER2）。TRIDENT-B1 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的結合結構域。
TRIDENT-B2 的第一多肽鏈與DART-B1 （SEQ ID NO ： 143 ）的第一多肽鏈相同。
TRIDENT-B2 的第二多肽鏈與DART-B1 （ SEQ ID NO ： 144 ） 的第二多肽鏈相同。
特別考慮的是，可以採用可選的TRIDENT-B2 第一和第二多肽鏈，其包括含有半胱氨酸殘基的異質二聚體-促進（E-螺旋和K-螺旋）結構域（例如， E VAA C E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K (SEQ ID NO:39 )和 K VAA C K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E (SEQ ID NO:40 ))。在此類可選的TRIDENT-B2 分子中，第一多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 16 ─ SEQ ID NO ： 46 ─ SEQ ID NO ： 18 ─ SEQ ID NO ： 39 ─ SEQ ID NO SEQ ID NO ： 21-SEQ ID NO ： 146 ，並且第二多肽鏈有時包括：SEQ ID NO ： 50 － SEQ ID NO ： 16 － SEQ ID NO ： 46 － SEQ ID NO ： 18 － SEQ ID NO ： 40 。
TRIDENT-B2 的第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合能夠結合的單克隆抗體的VH結構域CD137（VHCD137 ）（CD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ））、人IgG1 CH1結構域（SEQ ID NO ： 3 ）、人IgG1鉸鏈區（SEQ ID NO ： 7 ）和包括L234A / L235A / M252Y / S254T / T256E / H435R置換的“具有臼的”CH2和CH3結構域（SEQ ID NO ： 149 ）。
因此，TRIDENT-B2的第三多肽鏈包括：SEQ ID NO：46─SEQ ID NO：3─SEQ ID NO：7─SEQ ID NO：149。
TRIDENT-B2 的第三多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 155 ）： QVQLQESGPG LVKPSETLSL TCTVSGGSIS SYYWSWIRQP PGKGLEWIGR IYTSGSTNYN PSLKSRVTMS VDTSKNQFSL KLSSVTAADT AVYYCARDGW YDEDYNYYGM DVWGQGTMVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKR VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLYIT REPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN RYTQKSLSLS PGK
TRIDENT-B2 的第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括N末端、能夠結合CD137的單克隆抗體的VL結構域（VLCD137 ）（CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ）、人IgG CLκ域（SEQ ID NO ： 1 ）和C末端。
因此，TRIDENT-B2 的第四多肽鏈包括：SEQ ID NO ： 50 ─ SEQ ID NO ： 1 。
TRIDENTB2 的第四多肽鏈的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 156 ）： EDFAVYYCQQ DYDLPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGECC. 可選的 CD137 x TA 結合分子
如鑒於本公開內容將認識到的，具有任何以上代表性分子的一般結構並且包括可選TA 的結合位點的另外的CD137 x TA 結合分子 可以通過採用可選的腫瘤抗原抗體的VL和VH結構域代替抗PD-L1或抗HER2的VL和VH結構域構建。類似地，如本文所提供的，可選的CD137 x TA 結合分子 同樣可以構建成包含可選的接頭和/或異質二聚體促進結構域和/或抗體恆定區（例如CL、CH2-CH3域）。D. 控制分子
為了更有意義地表明本發明的CD137 x TA 結合分子 的特性，本文中描述了其VL和VH結構域可用於產生對照具有Fc的雙抗體和其他比較物和對照結合分子的比較物和對照抗體。
帕利珠單抗（參見，例如，蛋白質資料庫（PDB）ID No.2HWZ）是針對RSV的F蛋白的A抗原位點中表位的人源化單克隆抗體（IgG），是適當的對照抗體，其VL和VH結構域可用於產生對照雙抗體和其他對照結合分子。可選的抗RSV糖蛋白F抗體包括莫他韋珠單抗（參見，例如，PDB ID No.3IXT）和被工程化以從輕鏈的CDR 1去除半胱氨酸殘基的帕利珠單抗變體。帕利珠單抗的變體用於產生如下所述的陰性對照分子。
帕利珠單抗變體的VH結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 137 ）（CDRH殘基用底線顯示）： QVTLRESGPA LVKPTQTLTL TCTFSGFSLS TSGMSVG WIR QPPGKALEWL ADIWWDDKKD YNPSLKS RLT ISKDTSKNQV VLKVTNMDPA DTATYYCAR S MITNWYFDV W GAGTTVTVSS
帕利珠單抗變體的VL結構域的氨基酸序列是（SEQ ID NO ： 138 ）（CDRL殘基用底線顯示）： DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITC RASQSVG YMH WYQQKPG KAPKLLIY DT SKLAS GVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPD DFATYYC FQG SGYPFT FGGG TKLEIK
用於比較的目的，使用包含先前描述的抗CD137抗體的表位-結合位點的幾個分子，包括烏瑞魯單抗（也稱為BMS-663513，參見美國專利號8,137,667）和utomilumab（也稱為PF-05082566，參見，美國專利號8,337,850）和鼠和人源化的hCD137 MAB-3（參見WO 2018/156740）。烏瑞魯單抗（WHO藥物資訊，2011，推薦的INN：清單66，25（3）：334）和utomilumab（WHO藥物資訊，2017，推薦的INN：取代77，31（1）：140-141）的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列是本領域已知的。WO 2018/156740中提供了本文用作比較物的人源化hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 的VH和VL結構域的氨基酸序列，參見[0254]和[0261]段。E. CD137 x TA 結合和對照分子的概述
表5總結了DART-A – DART-A9 、 TRIDENT-A 和TRIDENT-A4-A6 的結構域特性：
表 5
名稱 ( 鏈的數量 ) 親本的 mAbs Fc 結構域 鏈 編號 SEQ ID NO. 其他組分
DART-A (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (1.1) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 116 E/K 螺旋
2 117
3 116
4 117
DART-A1 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (2.1) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 118 E/K螺旋
2 119
3 118
4 119
DART-A2 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (2.2) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 120 E/K螺旋
2 119
3 120
4 119
DART-A3 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (3.1) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 118 E/K螺旋
2 121
3 118
4 121
DART-A4 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (3.2) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 120 E/K螺旋
2 121
3 120
4 121
DART-A5 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (3.2) CD137 MAB-6 (1.2) IgG1 (AA/YTE) 1 120 E/K螺旋
2 122
3 120
4 122
DART-A6 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (3.2) CD137 MAB-6 (1.3) IgG1 (AA/YTE) 1 120 E/K螺旋
2 123
3 120
4 123
DART-A7 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (4.2) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 120 E/K螺旋
2 124
3 120
4 124
DART-A8 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (5.2) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 120 E/K螺旋
2 125
3 120
4 125
DART-A9 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (6.2) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 120 E/K螺旋
2 126
3 120
4 126
DART-A10 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (4.2) CD137 MAB-6 (1.3) IgG1 (AA/YTE) 1 120 E/K螺旋
2 139
3 120
4 139
DART-B1 hHER2 MAB-1 (1.3) CD137 MAB-6(1.1) IgG1 (AA/TYE) (杵/臼) 1 143 E/K螺旋
2 144
3 145
DART-B2 hHER2 MAB-1 (1.3) CD137 MAB-6(1.1) IgG1 (AA/YTE) 1 151 E/K螺旋
2 152
3 151
4 152
TRIDENT-A (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (1.1) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA/TYE) (杵/臼) 1 127 CL/CH1和E/K螺旋
2 128
3 129
4 130
TRIDENT-A4 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (3.2) CD137 MAB-6 (1.1) IgG1 (AA) (杵/臼) 1 127 CL/CH1和E/K螺旋
2 128
3 131
4 132
TRIDENT A5 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (3.2) CD137 MAB-6 (1.2) IgG1 (AA) (杵/臼) 1 133 CL/CH1和E/K螺旋
2 134
3 131
4 132
TRIDENT-A6 hPD-L1 MAB-2 (3.2) CD137 MAB-6 (1.3) IgG1 (AA) (杵/臼) 1 135 CL/CH1和E/K螺旋
2 136
3 131
4 132
TRIDENT-B1 hHER2 MAB-1 (1.3) CD137 MAB-6(1.1) IgG1 (AA) (杵/臼) 1 127 CL/CH1和E/K螺旋
2 128
3 153
4 154
TRIDENT-B2 hHER2 MAB-1 (1.3) CD137 MAB-6(1.1) IgG1 (AA) (杵/臼) 1 143 CL/CH1和E/K螺旋
2 144
3 155
4 156
表 6 顯示了另外的DART和TRIDENT分子的特性，這些分子被製備為比較物和陰性對照：
表 6
名稱 ( 鏈的數量 ) 親本的 mAbs Fc 結構域 其他組分
DART-1 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (1.1) 帕利珠單抗變體 IgG1 (AA/YTE) 與DART-A相同，除了包含帕利珠單抗變體的VH/VL代替CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的VH/VL
DART-2 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (1.1) CD137 MAB-2 IgG1 (AA) 與DART-A相同，除了包含CD137 MAB-2 的VH/VL代替hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 的VH/VL
DART-3 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (1.1) VL/VL utomilumab IgG1 (AA) 與DART-A相同，除了包含utomilumab的VH/VL代替hCD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的VH/VL
DART-4 (3 條鏈 ) 帕利珠單抗變體 CD137 MAB-6(1.1) IgG1 (AA) (杵/臼) 與DART-B1相同，除了包含帕利珠單抗變體的VH/VL代替hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的VH/VL
DART-5 (4 條鏈 ) 帕利珠單抗變體 CD137 MAB-6(1.1) IgG1 (AA) 與DART-B2相同，除了包含帕利珠單抗變體的VH/VL代替hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的VH/VL
TRIDENT-2 (4 條鏈 ) hPD-L1 MAB-2 (1.1) hCD137 MAB-3(1B.3) IgG1 (AA) (杵/臼) 與TRIDENT-A相同，除了包含hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 的VH/VL代替CD137 MAB6 （ 1.1 ） 的VH/VL、針對接頭2的SEQ ID NO：19和含半胱氨酸的異質二聚體-促進結構域（完整序列參見WO 2020/041404的第[00306]-[00311]段）
TRIDENT-3 帕利珠單抗變體 CD137 MAB-6(1.1) IgG1 (AA) (杵/臼) 與TRIDENT-B1相同，除了包含帕利珠單抗變體的VH/VL代替hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的VH/VL
TRIDENT-4 帕利珠單抗變體 CD137 MAB-6(1.1) IgG1 (AA) (杵/臼) 與TRIDENT-B2相同，除了包含帕利珠單抗變體的VH/VL代替hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的VH/VL
III． 生產方法
本發明的結合分子可以使用本領域已知的任何方法重組製備並表達。可通過獲得編碼結合分子的核酸，並使用該核酸產生可用於在宿主細胞（例如，CHO細胞）中重組表達該分子的載體來重組地製備此類分子。可以採用的另一種方法是在植物（例如煙草）或轉基因奶中表達分子。
含有感興趣的多核苷酸（例如，編碼本發明結合分子的多肽鏈的多核苷酸）的載體可以通過許多適當方式中的任何一種引入宿主細胞，包括電穿孔；微粒轟擊；脂質轉染；和感染（例如，載體為致病因數，如牛痘病毒）。將核酸或載體引入宿主細胞的技術在本領域中是已經建立的，並且可以採用任何合適的技術。
能夠過表達異源DNA的任何宿主細胞都可以用於表達感興趣的結合分子（例如抗體、雙抗體、三價結合分子）的目的。適當的哺乳動物宿主細胞的非限制性示例包括但不限於COS、NSO、HEK-293、HeLa和CHO細胞。培養宿主細胞的方法是本領域所熟知的。
結合分子通常是從宿主細胞、培養基等中分離和/或純化的。純化包括抗體結構域（例如，Fc結構域）的重組結合分子的技術是本領域熟知的，包括：例如，使用HPLC、FPLC或親和色譜法（例如，使用蛋白質A或蛋白質G）。純化後，可以任選地與如下所述的藥學上可接受的賦形劑或其他物質一起將本發明的結合分子配製成藥物組合物。IV. 藥物組合物
本發明的組合物包括可用於製造藥物組合物（例如，不純或非無菌組合物）的原料藥組合物和藥物組合物（即，適合施用於受試者或患者的組合物），其可以是用於製備單位劑型。此類組合物包括本發明的CD137 x TA 結合分子，或此類試劑與藥學上可接受的載體的組合。如本文所提供的，本發明的組合物包括預防或治療有效量的本發明具有Fc的CD137 x TA 雙特異性雙抗體和藥學上可接受的載體。
本發明還涵蓋藥物組合物，其包括本發明的CD137 x TA 結合分子 和有效刺激免疫應答(例如，免疫檢查點抑制劑)的一種或多種另外的分子和/或與上述特異性結合對至少一種特定TA 特異性的腫瘤抗原（例如，腫瘤特異性單克隆抗體或雙抗體）的一種或多種另外的分子組合以及藥學上可接受的載體。
在一個具體的實施方式中，術語“藥學上可接受的”是指由聯邦或州政府的監管機構批准或在美國藥典或其他普遍認可的藥典中列出的用於動物，尤其是人類。術語“載體”是指與治療劑一起施用的稀釋劑、佐劑（例如弗氏佐劑（完全和不完全）、賦形劑或媒介物。此類藥物載體可以是無菌液體。當藥物組合物靜脈內施用時，優選水性載體，例如鹽溶液、水性右旋糖和甘油溶液。
通常，本發明的組合物的成分以單位劑型單獨或混合在一起供應，例如，作為乾燥的凍幹粉末或無水濃縮物，或以液體形式在指示活性劑的量的密閉容器（例如安瓿或小藥囊）中。當組合物要通過輸注施用時，可以用含有無菌藥物級水或鹽水的輸注瓶分配。在通過注射施用組合物的情況下，可以提供無菌注射用水或鹽水的安瓿，以便可以在施用之前將成分混合。
本發明還提供了藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個容器，所述容器包含單獨或與其他試劑（例如與藥學上可接受的載體）一起含有本發明的CD137xTA 結合分子。另外，可用於治療疾病的一種或多種其他預防或治療劑也可包括在藥物包裝或試劑盒中。本發明還提供了一種藥物包裝或試劑盒，其包括一個或多個裝有本發明藥物組合物的一種或多種成分的容器。任選地，與此類容器相關的可以是用於規範藥物或生物產品的製造、使用或銷售的政府機構規定的形式的通知，該通知反映了用於人類施用的製造、使用或銷售的機構的批准。
試劑盒可包括本發明的CD137 x TA 結合分子。試劑盒可以在一個或多個容器中進一步包括一種或多種其他用於癌症治療的預防和/或治療劑；和/或試劑盒可以進一步包括與一種或多種腫瘤抗原（TA ）結合的一種或多種細胞毒素抗體。在某些實施方式中，其他的預防或治療劑是化學治療劑。在其他實施方式中，所述預防或治療劑為生物學或激素治療劑。V. 施用方法
通過向受試者施用本發明有效量的分子或包括本發明分子的藥物組合物，可以提供本發明的組合物以用於治療、預防和改善與癌症或其他疾病或紊亂相關的一種或多種症狀。在一方面，此類組合物是基本上純化的（即，基本上不含限制其效果或產生不希望的副作用的物質）。在具體的實施方式中，所述受試者是動物。在另一個具體的實施方式中，受試者是哺乳動物，例如非靈長類動物（例如牛科動物、馬、貓科動物、犬科動物、齧齒動物等）或靈長類動物（例如，猴，比如，食蟹猴，人等）。在另一個實施方式中，所述受試者為人。
施用本發明的分子的方法包括但不限於腸胃外施用（例如，皮內、肌內、腹膜內、靜脈內和皮下）、硬膜外和黏膜（例如，鼻內和口服途徑）。在具體的實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子 是肌內、靜脈內或皮下施用的。組合物可以通過任何方便的途徑施用，例如，通過輸注或彈丸注射，通過上皮或黏膜皮膚內層（例如，口腔黏膜、直腸和腸黏膜等）吸收，並且可以與其他生物活性劑一起施用。施用可以是全身的，也可以是局部的。
本發明還提供了將本發明的CD137 x TA 結合分子 包裝在密封容器中，例如指示分子的量的安瓿或小藥囊。在一個實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子 作為乾燥的無菌凍幹粉末或無水濃縮物提供在密閉容器中，並且可以例如用水或鹽水重構至適當的濃度以施用於受試者。本發明凍幹的CD137 x TA 結合分子 應在2至8℃的其原始容器中存儲，並且分子在重構後應在12小時內、6小時內、5小時內、3小時內或1小時內施用。
在可選的實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子 以液體形式提供在指示分子、融合蛋白或綴合分子的量和濃度的密閉容器中。在某些實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子 的液體形式供應在密閉容器中，並且不需要重構。
在治療、預防或改善與紊亂有關的一種或多種症狀方面將是有效的本發明的組合物的量可以通過標準臨床技術來確定。製劑中採用的確切劑量將還取決於施用途徑和病症的嚴重性，並且應根據從業者的判斷和每個患者的情況來決定。可以從體外或動物模型測試系統得出的劑量回應曲線推斷有效劑量。
如本文所用，在一個實施方式中，藥物組合物的“有效量 ”是足以產生有益或期望結果的量，包括但不限於臨床結果，例如減少由疾病引起的症狀、減輕疾病症狀（例如，癌細胞的增殖、腫瘤的存在、腫瘤轉移等），從而提高了遭受該疾病的人們的生活品質，減少了治療疾病所需的其他藥物的劑量，增強了另一種藥物的效果例如通過靶向和/或內化，延遲疾病的進展，和/或延長個體的存活。
可以以一種或多種施用方式施用這樣的有效量。為了本發明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是足以減少病毒存在的增殖（或效果）並直接或間接地減少和/或延遲疾病（例如，癌症）進展的量。在一些實施方式中，有效量的藥物、化合物或藥物組合物可以與或可以不與另一種藥物、化合物或藥物組合物結合實現。因此，在施用一種或多種另外的試劑（例如化療劑或被認為是特定病症的治療標準的其他試劑）的情況下，可以考慮“有效量”，並且如果與一種或多種其他試劑一起可以達到或達到理想的結果，則可以認為單一試劑以有效量提供。儘管個體需求變化，但是測定每種組分的有效量的最佳範圍在本領域技術範圍內。
對於本發明涵蓋的CD137 x TA 結合分子 ，可以基於接受受試者的體重（kg）來確定施用至患者的劑量，或者可選地可以基於固定劑量來確定。
本發明的CD137 x TA 結合分子 的施用劑量和頻率可以通過修飾（例如脂質化）來增強CD137 x TA 結合分子 的吸收和組織滲透來降低或改變。
可以計算施用至患者的本發明的CD137 x TA 結合分子 的劑量，以用作單一試劑療法。可選地，本發明的CD137 x TA 結合分子 與其他治療組合物組合使用，使得施用至患者的劑量低於當所述分子用作單一試劑療法時的劑量。
具有治療或預防有效量的本發明的CD137 x TA 結合分子 的受試者的治療可以包括單一治療、或者可以包括一系列治療。在一個示例中，受試者每週一次、每兩週一次（即每隔一週一次）或每三週一次用本發明的分子治療約1至52周之間。本發明的藥物組合物可以每天一次、每天兩次或每天三次施用。可選地，藥物組合物可以每週一次、每週兩次、每兩週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每年兩次或每年一次施用。還應當理解，用於治療的分子的有效劑量可以在特定治療過程中增加或減少。VI. 本發明的組合物的用途
本發明的CD137 x TA 結合分子 具有結合T細胞（APC）的能力（例如，通過結合在此類T細胞的表面上表達的CD137）和結合表達TA 的腫瘤細胞的能力（例如，通過結合在這種腫瘤細胞的表面上表達的TA ）。因此，本發明的CD137 x TA 結合分子 具有將T細胞共定位於表達TA 的腫瘤細胞的能力，因此可以用於治療與TA 的表達相關或以TA 表達為特徵的任何疾病或病症。因此，非限制的，包括此類分子的藥物組合物可用於診斷或治療表達TA 的癌症，包括但不限於：膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、膽囊或膽管癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、胃癌、睾丸癌、胸腺癌和子宮癌。特別地，此類癌症高度表達TA。
本發明的CD137 x TA 結合分子 可以另外用於製造用於治療上述病症的藥物。
在某些實施方式中，本發明的CD137 x TA 結合分子與一種或多種其他可用於治療癌症的預防和/或治療劑組合使用。在某些實施方式中，其他的預防或治療劑是化學治療劑。在其他實施方式中，所述預防或治療劑為生物或激素治療劑。在其他實施方式中，生物治療劑是基於細胞毒素抗體的分子，包括但不限於抗體、抗體的抗原結合片段（例如，scFv、Fab、F(ab)2 等）、TandAb等）、多特異性結合分子（例如，雙抗體、雙特異性抗體、三價結合分子等），其結合一種或多種腫瘤抗原（TA ）。
本發明的CD137 x TA 結合分子 可以增強腫瘤靶向劑的活性。因此，本發明的CD137 x TA 結合分子 可以另外與其他腫瘤靶向劑組合使用，所述腫瘤靶向劑包括但不限於抗體、抗體的抗原結合片段（例如，scFv、Fab、F(ab)2 等）、TandAb等）、多特異性結合分子（例如，雙抗體、雙特異性抗體、三價結合分子等），其能夠結合所期望的TA 。特別考慮的是，腫瘤靶向劑可以結合與在此類組合中使用的CD137 x TA 結合分子相同或不同的TA 。在特定實施方式中，腫瘤靶向劑是多特異性分子，其與TA 和T細胞上表達的表位(包括例如CD3 和/或CD8 )結合並介導T細胞重定向殺傷。代表性的腫瘤靶向劑包括但不限於與TA 和CD3 結合的分子（ “TA x CD3” ） 。代表性的TA x CD3 結合分子 （例如，雙特異性抗體、DART®分子、BiTe®分子、TandAbs等和三價分子）及其製備方法(可用於這種組合中)是本領域眾所熟知的。（例如參見WO 2013/026835、WO 2013/158856、WO 2014/047231、WO 2014/110601、 WO 2014/131711、WO 2015/026894、WO 2015/026892、WO 2015/184203、WO 2015/184207、WO 2016/036937、WO 2016/182751、WO 2017091656、WO 2017/142928、WO 2017/118675）。
本發明的CD137 x TA 結合分子 與腫瘤靶向劑（例如，TA x CD3 結合分子）的組合使用可導致抑制性免疫調節劑程式性死亡-1（“PD-1”，也稱為“CD279”）的上調。PD-1通過結合PD-L1 和PD-L2 （也稱為B7-H1和B7-DC）來介導其對免疫系統的抑制（Flies，DB等人（2007），“The New B7s: Playing a Pivotal Role in Tumor Immunity ,” J. Immunother. 30(3):251-260; United States Patents Nos. 6,803,192; 7,794,710）。因此，進一步添加抑制PD-1抑制活性的試劑（“PD-1 / PD-L1 檢查點抑制劑 ”）下調PD-1的表達可進一步增強CD137 x TA 和腫瘤靶向劑（例如TA x CD3 結合分子 ）的活性。本發明特別地涵蓋PD-1/PD-L1檢查點抑制劑，其包括結合PD-1的抗體的表位-結合位點。
相應地，本發明的CD137 x TA 結合分子 可以另外與其他腫瘤靶向劑組合，進一步與PD-1 / PD-L1檢查點抑制劑組合使用。PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑 包括但不限於抗體、抗體的抗原結合片段（例如scFv、Fab、F(ab)2 等）、TandAb等）、多特異性結合分子（例如，雙抗體、雙特異性抗體、三價結合分子等），其能夠結合PD-1和/或PD-L1。可用於此類組合的代表性 PD-1 / PD-L1 檢查點抑制劑 及其製備方法是本領域眾所熟知的。可用於本發明方法中的PD-1 結合分子 包括：尼伏魯單抗（CAS註冊號：946414-94-4，也稱為5C4、BMS-936558、ONO-4538、MDX-1106，並由Bristol-Myers Squibb以OPDIVO ®出售）；培布利珠單抗（之前稱為lambrolizumab），CAS註冊號：1374853-91-4，也稱為MK-3475、SCH-900475，並由Merck以KEYTRUDA®銷售）；西米普利單抗（cemiplimab）（CAS註冊號：1801342-60-8，也稱為REGN-2810、SAR-439684，並以LIBTAYO®出售）。尼伏魯單抗（WHO藥物資訊，2013，推薦的INN：清單69，27（1）：68-69）、培布利珠單抗（WHO藥物資訊，2014，推薦的INN：清單75，28（3）：407）和西米普利單抗（cemiplimab）（WHO 藥物資訊 2018，建議的INN：清單119）的完整重鏈和輕鏈的氨基酸序列在本領域中是已知的。最近已經鑒定了另外的抗PD-1抗體（例如，hPD-1 mAb 7 （ 1.2 ） ；其具有在本發明的方法和組合物中有用的獨特結合特點（參見，PCT公開號WO 2017/019846）。
在採用此類組合的情況下，特別考慮了可以“同時”向受試者施用一種或多種分子（例如，CD137 x TA 結合分子可以與TA x CD3 結合分子和/或PD-1/PD-L1 檢查點抑制劑 同時施用）和/或可以“順序”施用一種或多種分子（例如，施用CD137 x TA 結合分子，並且稍後施用TA x CD3 結合分子和/或PD-1 / PD-L1 檢查點抑制劑 ，或反之亦然）。VII. 本發明的實施方式
現在已經大體上描述了本發明，通過參考以下編號的實施方式（“E”），將更容易理解本發明，除非另有說明，否則這些實施方式僅作為示例提供，並且不旨在限制本發明。 E1.CD137 結合分子 ，其包括與CD137的表位免疫特異性結合的第一結合位點，其中所述第一結合位點包括：第一輕鏈可變結構域，其包括CDRL 1，CDRL 2和CDRL 3；以及第一重鏈可變結構域，其包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3；並且其中： （A）所述第一輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是CD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） 的輕鏈CDR；和 （B）所述第一重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是CD137MAB-6VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） 的重鏈CDR。 E2.     E1的CD137 結合分子 ，其中所述第一重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hCD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） 。 E3.     E1-E2中任一項的CD137 結合分子 ，其中所述第一輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： （A）hCD137 MAB-6 VLx （ SEQ ID NO ： 54 ） ； （B）hCD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） ； （C）hCD137 MAB-6 VL2 （ SEQ ID NO ： 55 ） ；或 （D）hCD137 MAB-6 VL3 （ SEQ ID NO ： 56 ） 。 E4.     E1-E3中任一項的CD137 結合分子 ，其中： （A）所述第一重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hCD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ） ；和 （B）所述第一輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hCD137 MAB-6 VL1 （ SEQ ID NO ： 50 ） 。 E5.         E1-E3中任一項的CD137 結合分子 ，其中： （A）所述第一重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hCD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ）； 和 （B）所述第一輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hCD137 MAB-6 VL3 （ SEQ ID NO ： 56 ） 。 E6.     E1-E5中任一項的CD137 結合分子 ，其中所述分子為雙特異性分子，其包括免疫特異性結合腫瘤抗原（TA ）的第二結合位點，並且其中所述第二結合位點包括含有CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3的第二輕鏈可變結構域和含有CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3的第二個重鏈可變結構域。 E7.         E6的CD137 結合分子 ，其中所述TA 選自表 1-2 所示的抗原。 E8.         E6的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是PD-L1，並且其中： （A）所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hPD-L1 MAB-2 VLx （ SEQ ID NO ： 63 ） 的輕鏈CDR；和 （B）所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2VHx （ SEQ ID NO ： 59 ） 的重鏈CDR。 E9.         E8的CD137 結合分子 ，其中： (A)     (1)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和   CDRL 3 是hPD-L1 MAB-2 VL1 (SEQ ID NO:63 )的輕鏈CDR；或 (2)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:58 )的輕鏈CDR；或 (3)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hPD-L1 MAB-2 VL2 (SEQ ID NO:72 )的輕鏈CDR； 和 (B)     (1)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2、和   CDRH 3 是hPD-L1 MAB-2 VH1 (SEQ ID NO:59 )的重鏈CDR； (2)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VHx (SEQ ID NO:57 )的重鏈CDR； (3)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:67 )的重鏈CDR； (4)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH3 (SEQ ID NO:68 )的重鏈CDR； (5)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:69 ) 的重鏈CDR； (6)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:70 )的重鏈CDR；或 (7)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:71 )的重鏈CDR。 E10.   E9的CD137 結合分子 ，其中所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hPD-L1 MAB-2 VHx (SEQ ID NO:59 )； (B)hPD-L1 MAB-2 VH1 (SEQ ID NO:57 )； (C)hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:67 )； (D)hPD-L1 MAB-2 VH3 (SEQ ID NO:68 )； (E)hPD-L1 MAB-2 VH4 (SEQ ID NO:69 )； (F)hPD-L1 MAB-2 VH5 (SEQ ID NO:70 )；或 (G)hPD-L1 MAB-2 VH6 (SEQ ID NO:71 )。 E11.   E9或E10中任一項的CD137 結合分子 ，其中所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:63 )； (B)hPD-L1 MAB-2 VL1 (SEQ ID NO:58 )；或 (B)hPD-L1 MAB-2 VL2 (SEQ ID NO:72 )。 E12.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VHx (SEQ ID NO:59 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:63 )。 E13.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VH1 (SEQ ID NO:57 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:63 )。 E14.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:67 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:63 )。 E15.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VH3 (SEQ ID NO:68 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:63 )。 E16.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VH4 (SEQ ID NO:69 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:63 )。 E17.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中 (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VH5 (SEQ ID NO:70 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:63 )。 E18.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VH6 (SEQ ID NO:71 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VLx (SEQ ID NO:63 )。 E19.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VH1 (SEQ ID NO:57 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VL1 (SEQ ID NO:58 )。 E20.   E10-E11中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VH3 (SEQ ID NO:68 )；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VL2 (SEQ ID NO:72 )。 E21.   E6的CD137 結合分子 ，其中TA 是5T4且其中： (A)     (1)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-1 VL (SEQ ID NO:93 )的輕鏈CDR；和 (2)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-1 VH (SEQ ID NO:92 )的重鏈CDR；或 (B)     (1)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是5T4 MAB-2 VL (SEQ ID NO:95 ) 的輕鏈CDR；和 (2)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是5T4 MAB-2 VH (SEQ ID NO:96 ) 的重鏈CDR。 E22.   E21的CD137 結合分子 ，其中第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：5T4 MAB-1 VH (SEQ ID NO:92 )。 E23. E21或E22的CD137 x TA 結合分子 ，其中第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：5T4 MAB-1 VL (SEQ ID NO:93 )。 E24.   E6的CD137 結合分子 ，其中TA 是HER2，並且其中： (A)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2-MAB-1 VLx (SEQ ID NO:79 ) 的輕鏈CDR；和 (B)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2-MAB-1 VHx (SEQ ID NO:78 )的重鏈CDR； E25.   E24的CD137 結合分子 ，其中： (A)     (1)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2-MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:83 )的輕鏈CDR； (2)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2-MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:84 )的輕鏈CDR；或 (3)     所述第二輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3是hHER2-MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:85 )的輕鏈CDR； 和 (B)     (1)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2-MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:80 )的重鏈CDR； (2)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2-MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:81 )的重鏈CDR；或 (3)    所述第二重鏈可變結構域 CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hHER2-MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:82 )的重鏈CDR。 E26.   E25的CD137 結合分子 ，其中所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hHER2-MAB-1 VHx (SEQ ID NO:78 )； (B)hHER2-MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:80 )； (C)hHER2-MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:81 )；或 (D)hHER2-MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:82 )。 E27.   E25或26中任一項的CD137 結合分子 ，其中所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hHER2-MAB-1 VLx (SEQ ID NO:79 )； (B)hHER2-MAB-1 VL1 (SEQ ID NO:83 )； (C)hHER2-MAB-1 VL2 (SEQ ID NO:84 )；或 (D)hHER2-MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:85 )。 E28.   E24-E26中任一項的CD137 結合分子 ，其中： (A)     (1)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hHER2-MAB-1 VHx (SEQ ID NO:78 )；和 (2)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hHER2-MAB-1 VLx (SEQ ID NO:79) ； 或 (B)     (1)     所述第二重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hHER2-MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:80 )；和 (2)     所述第二輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hHER2-MAB-1 VL3 (SEQ ID NO:85 ). E29.   E1-E29中任一項的CD137 結合分子 ，其是抗體、雙特異性抗體、雙特異性雙價具有Fc的雙抗體或雙特異性四價具有Fc的雙抗體或雙特異性三價分子。 E30.   E1-E29中任一項的CD137 結合分子 ，其中所述分子是雙特異性和二價的，並且包括第一、第二和第三多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。 E31.   E1-E29中任一項的CD137 結合分子 ，其中所述分子是雙特異性和四價的，並且包括第一、第二、第三和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。 E32.   E1-E29中任一項的CD137 結合分子 ，其中所述分子是雙特異性和三價的，並且包括第一、第二、第三和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。 E33.   E31的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是PD-L1，並且其中： (A)     所述第一和第三多肽鏈在N末端至C末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:63 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ； (ii)SEQ ID NO:63 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ； (iii)SEQ ID NO:58 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ； (iv)SEQ ID NO:58 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ； (v)SEQ ID NO:72 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ; 或 (vi)SEQ ID NO:72 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ； 和 (B)     所述第二和第四多肽鏈在N末端至C末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:59 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (ii)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:59 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38; (iii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:57 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (iv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:57 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38; (v)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:67 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (vi)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:67 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (vii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (viii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (ix)SEQ ID NO:55 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (x)SEQ ID NO:55 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (xi)SEQ ID NO:56 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ; (xii)SEQ ID NO:56 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (xiii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (xiv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (xv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:70 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (xvi)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:70 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (xvii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:71 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (xviii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:71 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (xix)SEQ ID NO:56 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ；或 (xx)SEQ ID NO:56 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 。 E34.   E31或E33的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是PD-L1，並且其中： (A)     所述第一和第三多肽鏈包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:116 、SEQ ID NO:118 或SEQ ID NO:120 ；和 (B)     所述第二和第四多肽鏈包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:117 、SEQ ID NO:119 、SEQ ID NO:121 、SEQ ID NO:122 、SEQ ID NO:123 、SEQ ID NO:124 、SEQ ID NO:125 、SEQ ID NO:126 或SEQ ID NO:139 。 E35.   E34的CD137 結合分子 ，其中所述分子包括： (A)SEQ ID NO:116 和EQ ID NO:117 ； (B)SEQ ID NO:118 和SEQ ID NO:119 ； (C)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:119 ； (D)SEQ ID NO:118 和SEQ ID NO:121 ； (E)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:121 ； (F)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:122 ； (G)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:123 ； (H)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:124 ； (I)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:125 ； (J)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:126 ；或 (K)SEQ ID NO:120 和SEQ ID NO:139 。 E36.   E32的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是PD-L1，並且其中： (A)     所述第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (ii)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (iii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (iv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (v)SEQ ID NO:55 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (vi)SEQ ID NO:55 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (vi)SEQ ID NO:56 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ；或 (vii)SEQ ID NO:56 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (B)     所述第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (ii)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (iii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (iv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (v)SEQ ID NO:55 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (vi)SEQ ID NO:55 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (vi)SEQ ID NO:56 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ；或 (vii)SEQ ID NO:56 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (C)     所述第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:59 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； (ii)SEQ ID NO:57 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； (iii)SEQ ID NO:67 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； (iv)SEQ ID NO:68 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； (v)SEQ ID NO:69 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； (vi)SEQ ID NO:70 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ；或 (vii)SEQ ID NO:71 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； 和 (D)     所述第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:63 ─ SEQ ID NO:1 ；或 (ii)SEQ ID NO:72 ─ SEQ ID NO:1 。 E37.   E32的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是PD-L1，並且其中： (A)     所述第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:59 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ；或 (ii)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:59 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (B)     所述第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:63 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ；或 (ii)SEQ ID NO:63 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (C)     所述第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； 和 (D)     所述第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:1 ；或 (ii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:1 。 E38.   E32或E36的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是PD-L1，並且其中： (A)     所述第一多肽鏈包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:127 、SEQ ID NO:133 或SEQ ID NO:135 ； (B)     所述第二多肽鏈包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:128 、SEQ ID NO:134 或SEQ ID NO:136 ； (C)     所述第三多肽鏈包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:129 或SEQ ID NO:131 ；和 (D)     所述第四多肽鏈包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO:130 、SEQ ID NO:132 。 E39.   E38的CD137 結合分子 ，其中所述分子包括： (A)SEQ ID NO:127 、SEQ ID NO:128 、SEQ ID NO:129 和SEQ ID NO:130 ； (B)SEQ ID NO:127 、SEQ ID NO:128 、SEQ ID NO:131 和SEQ ID NO:132 ； (C)SEQ ID NO:133 、SEQ ID NO:134 、SEQ ID NO:131 和SEQ ID NO:132 ；或 (D)SEQ ID NO:135 、SEQ ID NO:136 、SEQ ID NO:131 和SEQ ID NO:132 。 E40.   E31的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是HER2，並且其中： (A)     所述第一和第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:79 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ；或 (ii)SEQ ID NO:79 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ； (iii)SEQ ID NO:85 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ；或 (iv)SEQ ID NO:85 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:30 ─ SEQ ID NO:43 ； 和 (B)     所述第二和第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:78 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (ii)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:78 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 。 (iii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:80 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ；或 (iv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:80 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 。 E41.   E32的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是HER2，並且其中： (A)     所述第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (ii)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (iii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ；或 (iv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (B)     所述第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (ii)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (iii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ；或 (iv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (C)     所述第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:78 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ；或 (ii)SEQ ID NO:80 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； 和 (D)     所述第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:79 ─ SEQ ID NO:1 ；或 (ii)SEQ ID NO:85 ─ SEQ ID NO:1 。 E42.   E32的CD137 結合分子 ，其中所述TA 是HER2，並且其中： (A)     所述第一多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:78 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (ii)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:78 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (iii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:80 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:37 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ；或 (iv)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:39 ─ SEQ ID NO:21 ─ SEQ ID NO:146 ； (B)     所述第二多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:79 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ； (ii)SEQ ID NO:79 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (iii)SEQ ID NO:85 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:38 ；或 (iv)SEQ ID NO:85 ─ SEQ ID NO:16 ─ SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:18 ─ SEQ ID NO:40 ； (C)     所述第三多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:46 ─ SEQ ID NO:3 ─ SEQ ID NO:7 ─ SEQ ID NO:149 ； 和 (D)     所述第四多肽鏈在N-末端至C-末端方向上包括： (i)SEQ ID NO:54 ─ SEQ ID NO:1 ；或 (ii)SEQ ID NO:50 ─ SEQ ID NO:1 。 E43.   E40-E42中任一項的CD137 結合分子 ，其中所述分子包括： (A)SEQ ID NO:151 和SEQ ID NO:152 ； (B)SEQ ID NO:127 、SEQ ID NO:128 、SEQ ID NO:153 和SEQ ID NO:154 ；或 (C)SEQ ID NO:143 、SEQ ID NO:144 、SEQ ID NO:155 和SEQ ID NO:165 。 E44.   一種藥物組合物，其包括E1-43中任一項的CD137 結合分子 ，以及生理學上可接受的載體。 E45.   E6-E43中任一項的CD137 結合分子 或E44的藥物組合物在治療與所述TA 的表達有關或以所述TA 的表達為特徵的疾病或病症中的用途。 E46.   一種PD-L1 結合分子 ，其包括輕鏈可變結構域和重鏈可變結構域，所述輕鏈可變結構域包括CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3，並且所述重鏈可變結構域包括CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3。其中： (A)     所述輕鏈可變結構域CDRL 1、CDRL 2和CDRL 3 是hPD-L1 MAB-2 VL2 (SEQ ID NO:72 )的輕鏈CDR； 和 (B)     (1)     所述重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:67 )的重鏈CDR； (2)     所述重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH3 (SEQ ID NO:68 )的重鏈CDR； (3)    所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH4 (SEQ ID NO:69 )的重鏈CDR； (4)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和   CDRH 3 是hPD-L1 MAB-2 VH5 (SEQ ID NO:70 ) 的重鏈CDR；或 (5)     所述第二重鏈可變結構域CDRH 1、CDRH 2和CDRH 3是hPD-L1 MAB-2 VH6 (SEQ ID NO:71 )的重鏈CDR。 E47.   E46的PD-L1 結合分子 ，其中所述重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (A)hPD-L1 MAB-2 VH2 (SEQ ID NO:67 )； (B)hPD-L1 MAB-2 VH3 (SEQ ID NO:68 )； (C)hPD-L1 MAB-2 VH4 (SEQ ID NO:69 )； (D)hPD-L1 MAB-2 VH5 (SEQ ID NO:70 )；或 (E)hPD-L1 MAB-2 VH6 (SEQ ID NO:71 )。 E48.   E46-E47中任一項的PD-L1 結合分子 ，其中所述輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列：hPD-L1 MAB-2 VL2 (SEQ ID NO:72 )。 E49.   E46-E48中任一項的PD-L1 結合分子 ，其中所述分子為抗體或其抗原結合片段。 E50.   E46-E48中任一項的PD-L1 結合分子 ，其中所述分子是多特異性結合分子。 E51.   E50的PD-L1 結合分子 ，其中所述分子是雙特異性雙抗體、雙特異性抗體或三價結合分子。 E52.   一種藥物組合物，其包括E46-E51中任一項的PD-L1 結合分子 和生理學上可接受的載體。 E53.   E46-E51中任一項的PD-L1 結合分子 或E52的藥物組合物在治療與免疫系統抑制或以PD-L1表達為特徵的疾病或病症中的用途。 E54.E53 的用途，其中所述與免疫系統抑制有關或以PD-L1表達為特徵的疾病或病症為癌症。 E55.   E45或E54中任一項的用途，其中所述癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、膽囊或膽管癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、胃癌、睾丸癌、胸腺癌和子宮癌。 E56.   一種增強腫瘤靶向劑活性的方法，該方法包括與E1-E43中任一項的CD137 結合分子 、E46-E51中任一項的PD-L1 結合分子 或E44或E52中任一項的藥物組合物組合施用所述腫瘤靶向劑。 E57. 一種治療與免疫系統抑制有關或以TA 表達為特徵的疾病或病症的方法，該方法包括向有此需要的受試者施用E1-E43中任一項的CD137 結合分子 、E46-E53中任一項的PD-L1 結合分子 或E44或E53的藥物組合物。 E58.   E57的方法，其中與免疫系統抑制相關或以TA 表達為特徵的病症是癌症。 E59.   E57或E58的方法，進一步包括施用腫瘤靶向劑。 E60.   E56或E59的方法，其中所述腫瘤靶向劑是抗體、抗體的表位結合片段或介導T細胞重定向殺傷靶細胞的試劑. E61.   E57-E60中任一項的方法，其中所述癌症選自由以下組成的組：膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、膽囊或膽管癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、胃癌、睾丸癌、胸腺癌和子宮癌。 E62.   編碼E1-E43中任一項的CD137 結合分子 或E46-E51中任一項的PD-L1 結合分子 的核酸。. E63.   表達載體，其包括根據E62的核酸。 E64.   一種細胞，其包括根據E62的核酸或根據E63的表達載體。. E65.   根據E64的細胞，其中所述細胞是哺乳動物細胞。實施例
現在已經概括地描述了本發明，通過參考以下示例將更容易理解本發明。下述示例闡釋了用於本發明的診斷或治療方法中的組合物的各種方法。所述實施例旨在說明但絕不限制本發明的範圍。實施例 1 方法
在基本上如下進行的CD137報告試驗(CD137 reporter assay)中，使用表達CD137的報告細胞系（Jurkat-NF-κB-Luc）評估了測試品（例如抗體、雙抗體或三價分子）介導NF / kB途徑的靶向依賴性信號轉導的能力：對於雙特異性分子，將100 µL試驗培養基（RPMI-1640，10％FBS）中的靶細胞（類型和數量在圖中和如下所示）鋪入無菌試驗微孔板中，並於37°C孵育過夜。在第2天，將過表達CD137的Jurkat-NF-κB-Luc報告細胞（在50 µL試驗培養基中4×104 到7.5×104 個細胞）和50 uL連續稀釋的測試品添加到每個含有靶細胞的孔中，並快速連續控制沒有靶細胞的孔。將板在37℃下孵育4-5小時。然後將BioGlo底物（Promega）添加到每個孔（50 µL）中，並將板在室溫（“RT”）下孵育另外的5-10分鐘，通過檢測發光來測量信號轉導，例如使用Perkin Elmer Envision裝置），並以發光相對光單位（RLU）作為讀數。對於單特異性抗CD137抗體，不使用靶細胞，而是添加四倍過量的山羊抗小鼠或山羊抗人抗體以使抗體交聯。
基本上按如下進行ELISA試驗，以評估測試品與CD137的結合：用可溶性人或食蟹猴CD137（人或食蟹猴CD137的胞外結構域域與His標籤（shCD137 His或scyCD137 His）或與人Fc區（shCD137 hFc或scyCD137 hFc融合）塗覆平底maxisorb 96孔板，每個濃度為0.5或1μg/ mL。所述板用含有0.5％牛血清白蛋白和0.1％Tween20的PBS緩衝液洗滌、封閉，並與測試品（例如細胞上清液或純化的mAb）一起孵育。對於雜交瘤上清液，以1.0μg/ mL和六次三倍連續稀釋度使用抗CD137抗體。使用山羊抗小鼠IgG-HRP二抗評估與固定化CD137（人或食蟹猴）結合的測試品的量。在酶標儀（Victor 2 Wallac，Perkin Elmer）上分析所有樣品，並通過非線性回歸分析由劑量回應曲線計算EC50值。
T細胞細胞因數釋放試驗（在沒有靶細胞的情況下使用次優刺激的原代T細胞）基本上如下進行：將50μL連續稀釋的測試品（抗體（與抗人Fc（Fab）'2 ）的+/-交聯））、50 µL預洗過的2×106 珠/mL的Dynabeads αCD3（REF 11151D； Thermo Fisher Scientific的Invitrogen，或類似物的）、以及100 µL /孔的106 細胞/mL的人泛T細胞（按照製造商的方案，使用Dynabeads Untouched Human T細胞試劑盒（Invitrogen Cat＃11344D）或類似物，從供體PBMC中純化的）添加到試驗板的每個孔中。板上每個孔的最終體積為200 µL。板上每個孔的最終體積為200 µL。對於不包含測試品或αCD3珠的對照孔，添加試驗培養基以使總體積達到200 µL，並將板在組織培養箱中孵育72小時。然後從每個孔中收集上清液，並根據製造商的說明使用細胞因數ELISA試劑盒（例如，R&D System Human IL-2 DuoSet ELISA (Cat: DY202), Human IFN-gamma DuoSet ELISA (Cat: DY285)和Human TNF-alpha DuoSet ELISA (Cat: DY210)或類似的市售試劑）測量IL-2、IL-10、TNF-α和IFN-γ的所釋放的細胞因數。使用Microsoft Excel和SoftMax Pro進行資料分析以推斷細胞因數水準，並用Prism進行繪製。
基本上按如下進行FACS分析，以評估測試品與細胞表面CD137的結合：將100μL表達CD137的CHO細胞（CHO/CD137）（1.0×105 至1×106 細胞/孔）和100μL連續稀釋的測試品或對照添加到微量試驗板的每個孔中，混合並在室溫下孵育約30分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞，然後將二抗（山羊抗人APC、PE或FITC）添加到每個孔中（1：1000），然後將組分混合，並將這些孔在室溫下孵育約30分鐘。洗滌細胞並將其重懸於250μLFACS緩衝液中，並通過流式細胞儀（BD LSR Fortessa或FACSCanto II）分析細胞事件收集。通過FloJo v10進行資料分析。
抗CD137抗體和CD137配體之間與CD137結合的競爭是在Octet生物感測器（Pall ForteBio）上使用即時、無標籤的生物層干涉試驗來確定的，基本上如下：將抗CD137抗體固定在抗人Fc生物感測器上，然後與融合至鼠Fc結構域的人CD137（shCD137 mFc； 10 ug / mL）的胞外結構域締合30秒。然後將感測器浸入重組人CD137配體（R＆D Systems；5 ug / mL）30秒，以監測配體是否可以結合至預成型的CD137/抗體複合物或其結合是否被阻斷。
使用BIACORETM SPR分析研究了抗CD137抗體（具有人Fc區）的結合動力學。抗CD137抗體被捕獲在Fab’2山羊抗人Fc表面上。監測shCD137 His或scyCD137 His（12.5 nM、50 nM、200 nM）的締合和解離，並使用1：1結合模型擬合傳感圖，以計算締合和解離速率常數並確定KD。
基本上按如下進行FACS分析以評估測試品與細胞表面PD-L1的結合：將100μL表達PD-L1的CHO細胞（CHO/PD-L1）（1.0×105 至1×106 細胞/孔）和100μL連續稀釋的測試品添加到微量試驗板的每個孔中，混合並在室溫下孵育約30分鐘。用FACS緩衝液洗滌細胞，然後將二抗（山羊抗人FITC、PE或APC）添加到每個孔中，此後，將組分混合並將孔在室溫下孵育約30分鐘。洗滌細胞並將其重懸於250μLFACS緩衝液中，並通過流式細胞儀（BD LSR Fortessa或FACSCanto II）分析細胞事件收集。通過FloJo v10進行資料分析。
在Jurkat-luc-NFAT/CHO/PD-L1螢光素酶PD-L1報告試驗中評估了測試品拮抗PD-1/PD-L1軸（即，阻斷PD-1/PD-L1相互作用並防止T細胞應答下調）的能力。基本上按如下進行：將CHO/PD-L1細胞以40,000/孔接種於100μL培養基（DMEM / F12 + 10％FBS + 200μg / mL潮黴素B + 250μg/ mL G418）中，孵育過夜。第二天，除去培養基，並加入在50μL試驗緩衝液（RPMI + 2％FBS）中以125,000個細胞/孔的NFAT-luc2 / PD-1 Jurkat細胞（Promega）和50μL連續稀釋的測試品，並在37℃下孵育6小時。然後將80μLBioGlo底物（Promega）添加到每個孔中，並將板在室溫下孵育另外的5-10分鐘，通過檢測發光（例如使用Perkin Elmer Envision裝置）來測量PD-1 / PD-L1阻斷(blockade)，其中發光相對光單位（RLU）作為讀數。
T細胞細胞因數釋放試驗（在靶細胞存在下使用次優刺激的原代T細胞）基本上如下進行：將人泛T細胞（從供體PBMC中純化，參見上文）重懸於測定培養基中並置於組織培養箱中過夜。從培養物中獲得TA陽性靶細胞（例如，CHO / PD-L1細胞、JIMT-1細胞、N87細胞）和對照TA陰性細胞（例如，CHO細胞）。洗滌後，將靶細胞（圖中和以下所示的數字）預先接種在平底明亮的96孔板中，並放置在組織培養箱中過夜。第二天，使用Beckman Coulter Vi-細胞計數器通過苔酚藍排斥法測量靜息的人泛T細胞的密度和活力，並調整為2×106 細胞/ mL的密度。第二天，棄去上清液，並將50 µL連續稀釋的測試品（抗體、雙抗體、三價分子等）、50 µL預洗的2.0 ×106 珠/ mL的Dynabeads αCD3（REF 11151D； Thermo Fisher Scientific的Invitrogen）、50 µL的2.0 × 106 細胞/ mL /孔的人泛T細胞和50 µL試驗培養基添加至試驗板的每個孔中。板上每個孔的最終體積為200 µL。對於不含測試品或αCD3珠的對照孔，添加試驗培養基以使總體積達到200 µL，並將板在組織培養箱中孵育72小時。然後從每個孔中收集上清液，並根據製造商的說明使用細胞因數ELISA試劑盒（例如，R＆D System (Human IL-2 DuoSet ELISA (Cat: DY202), Human IFN-gamma DuoSet ELISA (Cat: DY285)或類似的商業試劑）測量IFN-γ和IL-2的釋放的細胞因數。使用Microsoft Excel和SoftMax Pro進行資料分析以推斷細胞因數水準，其用Prism進行繪製。
食蟹猴血清中CD137 x TA 結合分子 的定量基本上如下進行：用2.0 µg/mL帶有His標籤的可溶性人CD137融合蛋白（huCD137）（包含人CD137的胞外部分與含組氨酸的肽融合）塗覆試驗板過夜。用含0.1％Tween-20的磷酸鹽緩衝鹽水（PBS）（PBST）中的0.5％牛血清白蛋白（BSA）封閉非特異性位點後，將板與CD137 x TA 結合分子 標準校準物、品質對照和測試樣品一起孵育。固定化的huCD137-His捕獲了標準校準物、品質對照和測試樣品中存在的CD137 x TA 結合分子 。通過添加0.05 µg/mL山羊抗人IgG（Fc）-HRP檢測捕獲的CD137 x TA 結合分子 。結合的HRP活性使用Thermo Scientific SuperSignal ELISA Pico化學發光底物通過發光產生來定量。通過Victor X4酶標儀測量發光強度，以相對光單位（RLU）表示。通過將來自AEX3370標準品的RLU信號與五參數邏輯模型擬合來生成標準曲線。然後從樣品的RLU信號和描述標準曲線的方程式中推斷出血清樣品中CD137 x TA 結合分子 的濃度。該試驗的定量下限（LLOQ）為6.1 ng / mL。
T細胞和NK細胞增殖試驗基本上如下進行：將包括CD3、CD4、CD8、CD56和CD159a的泛T細胞和NK細胞標誌物抗體添加到樣品板孔中，該板孔包含從食蟹猴研究獲得的充分混合的抗凝全血樣品，使用移液管充分混合，並在環境溫度下在黑暗中孵育25-35分鐘。然後將1× BD FACS裂解液添加到每個孔中，並用移液管混合；然後將每個板在環境溫度下在黑暗中孵育另外的10-20分鐘。將各板以400×g離心5分鐘，並棄去上清液。將FACS緩衝液添加到每個孔中，並作為洗滌步驟混合。然後將每個板以400×g離心5分鐘，並棄去上清液。用BD Cytofix / Cytoperm溶液重懸細胞沉澱，並在2-8o C下孵育20-40分鐘。孵育結束時，按照之前的洗滌步驟再次洗滌每個板，並將細胞沉澱與Ki67抗體或同種型對照一起重懸，並在2-8o C下孵育30-60分鐘。如先前的洗滌步驟中一樣再次洗滌每個板，最後將細胞沉澱重懸浮在FACS緩衝液中，並用BD FACSCanto II細胞分析儀分析樣品。通過分別監測CD3+ CD8+ Ki67+ 和CD56+ CD159a+ Ki67+ 群體來定量T-細胞和NK細胞的增殖。實施例 2 人非阻斷性抗 CD137 mAb 的分離和表徵
為了鑒定具有改進特點的CD137結合結構域，特別是當併入至不同的CD137 x TA 結合分子 時，使用TRIANNIMOUSE®平臺通過使具有His-標籤的可溶性人CD137融合蛋白（huCD137）（包含人CD137的胞外部分與含組氨酸的肽融合）的小鼠免疫產生了一組具有對人CD137特異性的完全人可變結構域的單克隆抗體。評估所得雜交瘤的上清液的CD137結合、介導劑量依賴性T細胞信號轉導的能力（在CD137報告試驗中）以及誘導細胞因數（例如IFN-γ、TNF-α）從T細胞釋放的能力。克隆了幾種雜交瘤的VH和VL結構域，並在CHO細胞中作為人IgG1（L234A/L235A）抗體表達，並評估了其結合親和力、配體阻斷活性、與細胞表面上的CD137的結合以及在CD137報告和細胞因數釋放試驗。這些評估中包括無關的陰性對照抗體和/或先前描述的嵌合抗CD137抗體chCD137 MAB-3（參見WO 2018/156740及以上）。上面提供了用於這種評估的方法。選擇了一種名為CD137 MAB-6（1.1）的抗體進行進一步研究。上文提供了VH和VL結構域CD137 MAB-6（1.1）的氨基酸序列，這些評估的代表性結果總結在表 7A-D 中。
表 7A – 雜交瘤上清液
   報告 試驗 (RLU) ELISA (EC50 ng/mL)
抗體 ( 濃度 ) IgG濃度 huCD137 cyCD137
0.02 µg/mL 0.1 µg/mL
CD137 MAB-6 (1.1) 3280 11670 38 49
chCD137 MAB-3 5540 18650 34 44
非特異性mAb 1020 1240 - -
表 7B – 雜交瘤上清液
T 細胞試驗 – 細胞因數釋放
   IL-2 IL-10
供體1 供體2 供體1 供體2
( 濃度 ) 0.1 µg/mL 1 µg/mL 0.1 µg/mL 1 µg/mL 0.1 µg/mL 1 µg/mL 0.1 µg/mL 1 µg/mL
抗體
CD137 MAB-6 (1.1) 25 307 172 402 35 393 204 973
chCD137 MAB-3 124 223 313 628 52 63 225 391
非特異性mAb 16 29 27 29 33 35 45 54
  
   TNF-α IFN-γ
供體1 供體2 供體1 供體2
( 濃度 ) 0.1 µg/mL 1 µg/mL 0.1 µg/mL 1 µg/mL 0.1 µg/mL 1 µg/mL 0.1 µg/mL 1 µg/mL
抗體
CD137 MAB-6 (1.1) 76 908 355 702 116 2901 546 2573
chCD137 MAB-3 275 368 370 508 194 303 287 455
非特異性 mAb 35 113 68 102 33 92 56 99
表 7C – CHO 細胞上清液
   配體 阻斷 SPR 表面結合
抗體 kon ， 1/(Ms) koff ， 1/s KD ，nM MFI max EC50 ng/mL
CD137 MAB-6 (1.1) no 4.2E+5 6.7E-3 16 5745 21
chCD137 MAB-3 yes 6.6E+5 2.5E-2 38 6046 10
非特異性 mAb -    - - 149 -
表 7D – CHO 細胞上清液
   報告試驗 (RLU) 原代 T 細胞試驗
供體1
INF γ TNF-α
( 濃度 ) 0.08 µg/mL 0.1 µg/mL 0.1 µg/mL
抗體
CD137 MAB-6 (1.1) 8530 174 101
chCD137 MAB-3 9170 63 45
非特異性mAb 1250 0 6
通過交叉競爭研究進行表位binning。這些和配體結合競爭研究的結果表明，CD137 MAB-6結合的表位不同於包括utomilumab可變結構域的比較抗體，包括烏瑞魯單抗的可變結構域的比較抗體和在WO 2018/156740中描述的包括chCD137 MAB-3的所有抗CD137抗體。總之，這些研究表明，如通過ELISA、FACS和BIACORE™試驗所確定的，CD137 MAB-6結合獨特的非封閉性表位，並展現出比先前描述的chCD137 MAB-3更好的結合親和力。CD137 MAB-6在T細胞細胞因數釋放試驗中也展示出更高的活性。實施例 3 CD137 x TA 結合分子的表徵
產生了併入CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和hPD-1 MAB-2 （ 1.1 ） 的VH和VL結構域的能夠結合CD137和代表性TA ，PD-L1的CD137 x TA 結合分子 。具體而言，產生了稱為“DART-A ”的四價雙特異性雙抗體，其包括兩個相同的雙特異性雙抗體結合結構域，並具有圖 1B 所示的抗體樣Y結構；以及稱為“TRIDENT-A ”的三價結合分子，其包括一個單特異性雙抗體型結合結構域和具有圖 3A 所示的的結構的非雙抗體型結合結構域。這些分子的結構域屬性以及具有相同結構的某些雙特異性對照和比較分子在上面進行了討論（例如，參見表 5-6 ）。
基本上如上所述進行的，通過FACS分析評估DART-A 、 TRIDENT-A 、 比較分子TRIDENT-2 （包括hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 的結合結構域）和陰性對照（hIgG1 -不相關的抗體作為同種型對照）結合細胞表面CD137的能力，以10μg/ mL和五倍連續稀釋使用測試品。圖 4 所示的代表性試驗結果顯示，所有CD137 × PD-L1 雙特異性分子均能夠有效結合細胞表面上表達的CD137。在該試驗中，比較分子似乎表現出更好的結合。
通過FACS分析評估DART-A 、 TRIDENT-A 、 hPD-1 MAB-2 （ 1.1 ） 和陰性對照hIgG1 與表達PD-L1的CHO細胞（CHO/PD- L1）的表面結合的能力，以及它們在Jurkat-luc-NFAT / CHO / PD-L1螢光素酶報告試驗中拮抗PD-1 / PD-L1軸的能力（即阻斷PD-1 / PD-L1相互作用並防止T細胞應答的下調），兩種試驗均基本上如上所述進行。測試品以10 µg / mL和五倍連續稀釋用於FACS分析，並以50 µg / mL和五倍連續稀釋用於PD-L1報告試驗。圖 5A-5B 所示的代表性試驗結果表明，DART-A 和TRIDENT-A 能夠有效結合細胞表面表達的PD-L1（圖 5A ），並能阻斷PD-1 / PD-L1相互作用（圖 5B ）。請注意，具有兩個PD-L1結合位點的分子（DART-A 和hPD-1 MAB-2 （ 1.1 ） ）的結合曲線會更快達到飽和，這表明一些分子展示出二價結合（即，結合表面上的兩個PD-L1分子）。在CHO/PD-L1細胞上表達高濃度的靶配體存在下，二價結合更可能發生。還觀察到，具有兩個PD-L1結合位點的分子相對於三價分子展示出更大的PD-L1阻斷活性。
在存在和不存在表達PD-L1的JIMT-1細胞（每孔10,000個細胞）的情況下，在基本上如上所述進行的CD137報告試驗中評估DART-A 、 TRIDENT-A 、 比較分子：DART-2 和 TRIDENT-2 （各自包括hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 的結合結構域）、DART-3 （包括utomilumab的結合結構域）、激動的抗CD137 mAb烏瑞魯單抗（r- 烏瑞魯單抗 ）的複製品和陰性對照：DART-1 （RSV x PD-L1結合分子）和hIgG1 的功能活性，測試品以1ug / mL和五倍連續稀釋使用。圖 6 中所示的代表性試驗結果表明，包括結合結構域CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的四價和三價CD137 x PD-L1 雙特異性分子（分別為DART-A 和 TRIDENT-A ）介導的靶標依賴性信號轉導，相反，僅包括hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 的結合結構域的三價分子（ TRIDENT-2 ） 展示活性，而相應的四價分子DART-2 在靶細胞存在下不顯示任何活性。另外，DART-A 展示了所有測試的四價分子中最高的活性。在沒有靶細胞的情況下，CD137 x TA 雙特異性分子均未展示出活性。如預期的那樣，在存在和不存在表達PD-L1的靶細胞的情況下，激動劑r-烏瑞魯單抗 展示出活性，而陰性對照則根本沒有展示出活性。
基本上如上所述進行的，在表達PD-L1的JIMT-1細胞（每孔10,000個細胞）存在下，在原代T細胞因數釋放試驗中也評估了的DART-A 、 TRIDENT-A 、比較分子：DART-2、TRIDENT-2 、DART-3 、r- 烏瑞魯單抗 和陰性對照：DART-1 和 hIgG1 的功能活性，測試品以1μg/ mL和五倍連續稀釋使用。圖 7A 和 7B 分別顯示了代表性細胞因數INF-γ和IL-2的代表性試驗結果。如在CD137報告試驗中所見，包括結合結構域CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的四價和三價CD137 x PD-L1 雙特異性分子（分別為 DART-A 和 TRIDENT-A ） 都介導細胞因數釋放，而僅包括hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 結合結構域的三價分子（ TRIDENT-2 ） 展示出活性，而四價分子DART-2 則沒有展示出活性。再者，DART-A 展示了所有測試的四價分子的最高活性，而陰性對照則沒有展示出活性。
這些研究表明，完全人結合結構域CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 在四價和三價CD137 x TA 雙特異性分子中均具有活性，並且在不存在表達PD-L1的靶細胞的情況下不展示出激動劑活性。儘管TRIDENT-2 展示了與CHO / CD137細胞的更高結合，但是TRIDENT-A 和TRIDENT-2 的活性相當，而DART-2 在兩種功能試驗中均沒有展示活性。實際上，CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 在圖 1B 所示的四價抗體樣結構中比包括hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 或utomilumab的結合結構域的分子更具活性。實施例 4 CD137 x TA 分子的藥代動力學
三價CD137 x TA 雙特異性分子TRIDENT-A （包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的結合結構域）和TRIDENT-2 （包括hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 的結合結構域）的藥代動力學在食蟹猴中進行了評估。簡而言之，向兩隻食蟹猴（雌性）輸注單劑量的1 mg / kg或10 mg / kg的每種測試品（四組），並監測動物22天，不進行屍檢。監測動物的食物消耗、體重和完整的血液學，並在研究過程中進行臨床化學分析。觀察到肝酶（ALT、AST和膽紅素）的暫態增加。測試品的耐受性良好，未觀察到不良反應。
基本上如上所述，隨著時間的推移監測分子的血清濃度。Cmax、AUC、t1/2β和CL值列於表 8 中，並且表明包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的結合結構域的三價CD137 x TA 雙特異性分子比包括hCD137 MAB-3 （ 1B.3 ） 的血清半衰期長約兩倍。前10天（240小時）中TRIDENT-A 的血清濃度繪製在圖 8A 中。另外，基本上如上所述地檢查了CD8+ T細胞（圖 8B ）和NK細胞（圖 8C ）的增殖。這項研究表明，包括新型抗CD137抗體CD137 MAB-6 的CD137結合結構域的代表性的CD137 x TA 雙特異性分子TRIDENT-A 展示出緩慢的清除和施用(其與臨時誘導CD8+ T細胞和NK細胞二者的增殖有關)，這表明刺激了這些免疫細胞。此外，如上所述，CD137 MAB-6 在四價抗體樣結構中更具活性。因此，與先前描述的CD137結合結構域相比，CD137 MAB-6 結合結構域提供了多個優點。
表 8 ： 藥代動力學
分子 劑量 動物 Cmax AUC t1/2  β CL
(mg/kg) ID (ug/mL) (hr*ug/mL) (hr) (mL/hr/kg)
TRIDENT-A 1 1F001 28 1598 98 0.48
1F002 32 1968 148 0.32
TRIDENT-A 10 2F003 242 18752 217 0.30
2F004 293 21333 167 0.27
TRIDENT-2 1 5F009 31 1227 29 0.81
5F010 26 945 42 0.97
TRIDENT-2 10 6F011 282 10313 100 0.78
6F012 293 11486 99 0.69
實施例 5 hPD-1 MAB-2 （ 1.1 ）可變結構域的去免疫化和優化
使用MAPP試驗（由Abzena執行）分析完整的hPD-1 MAB-2 （ 1.1 ） 抗體，以鑒定可由抗原呈遞細胞呈遞的肽簇。隨後通過iTope™進對hPD-1 MAB-2 （ 1.1 ） 的VH和VL結構域的氨基酸序列進行silico分析，其中肽簇被分為重疊的9-mer肽（相鄰肽之間8 aa重疊），並預測了9-mer肽與HLA-DR蛋白的結合親和力，並將9-mer肽針對已實驗上顯示刺激T細胞應答的肽資料庫進行交叉核對。鑒定了hPD-1 MAB-2 VH1 的構框架區域2的Kabat殘基72-88（對應於SEQ ID NO：57的殘基73-92）內的潛在T細胞表位。進一步的分析鑒定了在該區域中根據Kabat編號的三種非種系氨基酸：T77、K83和T84（對應於SEQ ID NO ： 57 的殘基T78、K87和T88），並引入了以下置換：T77S、K83R和T84A；或T77S、K83R和T84A，根據Kabat編號的。使用基本上如上文對CD137結合所述的ELISA試驗(除了平板以0.5µg/mL的shPD-L1塗覆，並且使用山羊抗人IgG-HRP二抗)評估包括這些置換的抗體的結合與融合至His標籤的可溶性PD-L1（shPD-L1）的結合。結果總結在表 9 中。
表9 ：shPD-L1 ELISA的總結
抗體 結 合
hPD-1 MAB-2 VH1 ++++
hPD-1 MAB-2 VH1 + T77S ++
hPD-1 MAB-2 VH1 + K83R和T84A +++
hPD-1 MAB-2 VH1 + T77S，K83R和T84A ++++
所有去免疫化的變體均與shPD-L1結合，該變體包括展示與親本抗體無法區分的結合的T77S、K83R和T84A置換。包括這些突變的VH命名為hPD-L1 MAB-2 VH2 。
另外，進行了突變分析以鑒定增強了與shPD-L1的結合的hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） 的VH和/或VL結構域的CDR中的氨基酸取代。在表 10 中提供了許多引起改進的結合的置換，具有使用Kabat編號系統呈現的置換以及上述序列中相應的氨基酸殘基。基本上如上所述，通過ELISA(除了使用了山羊抗人κ-HRP二抗)評估了包括這些取代的不同組合的Fab片段與shPD-L1-his的結合。評估的代表性變體總結在表 11 中，結合曲線示於圖9A-9B 中。這些研究表明，包括每種變體（繪製在圖 9A 中的hPD-L1 MAB-2B 、 hPD-L1 MAB-2D 和hPD-L1 MAB-2F ； 繪製在圖 9B 中的hPD-L1 MAB-2A 、hPD-L1 MAB-2C 和hPD-L1 MAB-2E ）的Fab展示出比包括親本hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） 的Fab更高的親和力。
表 10 ： CDR 置換
VH 結構域 VL 結構域
Kabat* SEQ ID NO:57^ Kabat* SEQ ID NO:58^
S31G 31 T31E 31
G53K 54 D28H或D28V或D28L 28
Q95A或Q95G 99 S52E 52
F100aG 105      
*根據Kabat的置換編號 ^指示de序列識別號的相應氨基酸殘基號
表 11 ：包括 CDR 置換的 hPD-L1 MAB-2 變體
變體 置換 *
hPD-L1 MAB-2A          VH(S31G/G53K/Q95A) & VL(D28H)
hPD-L1 MAB-2B VH(S31G/G53K/Q95G) & VL(D28V)
hPD-L1 MAB-2C VH(S31G/G53K/F100aG) & VL(D28L)
hPD-L1 MAB-2D VH(F100aG) & VL(D28L/S52E)
hPD-L1 MAB-2E VH(G53K/Q95A) & VL(D28L)
hPD-L1 MAB-2F VH(G53K/F100aG) & VL(T31E)
*根據Kabat的置換編號
hPD-L1 MAB-2 的許多變體VH和/或VL結構域用於產生CD137 x TA 雙特異性分子（均包含兩個CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 結合位點）。表 12 中總結了所用的特定hPD-L1 MAB-2 VL和VH變體，這些變體的氨基序列和包含它們的雙特異性分子在上面提供。如上所述，包括PD-L1 MAB-2 VH/VL結構域的分子是通過參考具體的VH/VL結構域來提及的，例如包括結合結構域PD-L1 MAB-2 VH3 和hPD-L1 MAB-2 VL2 的分子具體稱為“PD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） ”。
表 12 ：hPD-L1 MAB-2 變體 VH 和VL 結構域
變體 置換 *
hPD-L1 MAB-2 VH2 T77S/K83R/T84A
hPD-L1 MAB-2 VH3 T77S/K83R/T84A + G53K/F100aG
hPD-L1 MAB-2 VH4 T77S/K83R/T84A + Q95A
hPD-L1 MAB-2 VH5 T77S/K83R/T84A + G53K/Q95A
hPD-L1 MAB-2 VH6 T77S/K83R/T84A + Q95A/ F100aG
hPD-L1 MAB-2 VL2 VL(T31E)
*根據Kabat的置換編號
基本上如上所述，通過FACS分析對以下包括兩個PD-L1結合位點的分子：DART-A1 （包括hPD-L1 MAB-2 （ 2.1 ） ）；DART-A4 （包括hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） ）；hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） ；以及以下包括一個PD-L1結合位點的分子：TRIDENT-A （如上所述）；以及TRIDENT-A4 （包括hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） ），評估了在JIMT-1細胞表面上的PD-L1結合，以1μg/mL和四倍連續稀釋使用測試品。代表性試驗的結果顯示在圖10A-10B 中。這些分子在基本上如上所述的PD-L1報告試驗中檢查了它們阻斷PD-1/PD-L1相互作用的能力，25µg / mL的測試品和四倍連續稀釋。代表性的試驗結果顯示在圖 11A-11B 中。這些資料表明，包括去免疫化/優化的hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 的結合結構域的CD137 x TA 雙特異性分子展示出增強的結合（圖 10A-10B ），並且更有效地阻斷了PD-1/PD- L1相互作用（圖 11A-11B ）。在包括兩個PD-L1結合結構域的四價分子（圖 10A 和11A 中的DART-A4 ）中觀察到適度的提高，在僅包括一個PD-L1結合結構域的三價分子（在圖 10B 和 11B 中的TRIDENT-A4 ）中觀察到活性的較大提高。基本上如上所述，在PD-L1報告試驗中評估包括兩個PD-L1結合位點的其他分子：DART-A4 （包括hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） ）；DART-A7 （包括hPD-L1 MAB-2 （ 4.2 ） ）；DART-A8 （包括hPD-L1 MAB-2 （ 5.2 ） ）；和DART-A9 （包括hPD-L1 MAB-2 （ 6.2 ） ）阻斷PD-1 / PD-L1相互作用的能力，其中1.5μg/ mL的測試品和兩倍的連續稀釋。代表性的試驗結果顯示在圖 11C 中。這項研究表明，與包含hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 的DART -A4 相比，包括可選的去免疫化的/優化的hPD-L1 MAB-2 （ 4.2 ）、 hPD-L1 MAB-2 （ 5.2 ） 和hPD-L1 MAB-2 （ 6.2 ） 的CD137 x TA雙特異性分子展示出類似或改善的阻斷活性。實施例 6CD137 MAB-6 的去免疫化
為了最小化免疫原性的可能性，將置換引入CD137 MAB-6 的VL結構域的框架區中，以用人種系中存在的那些置換非種系殘基。特別地，引入以下置換的組合：T14S、F36Y和I39K，根據Kabat編號（對應於SEQ ID NO ： 50 的殘基14、37和40），所得的CD137 MAB-6 VL結構域總結於以下表 13 中，並用於產生能夠與CD137和代表性TA ，PD-L1結合的CD137 x TA 雙特異性分子，以上提供了這些變體的氨基序列和包括它們的雙特異性分子。
表 13 ：CD137 MAB-6 變體 VL 結構域
變體 置換 *
CD137 MAB-6 VL2 T14S/F36Y/I39K
CD137 MAB-6 VL3 T14S/I39K
*根據Kabat的置換編號
基本上如上所述進行的，通過FACS分析對以下包括兩個hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 結合位點的分子：DART-A4 （ 包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ）） ；DART-A5 （包括CD137 MAB-6 （ 1.2 ） ）； DART-A6（包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） ）；以下包括一個hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 結合位點的分子：TRIDENT-A4 （包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） ）；TRIDENT-A5 （包括CD137 MAB-6 （ 1.2 ） ）；TRIDENT-A6 （包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） ，烏瑞魯單抗（r- 烏瑞魯單抗 ）的複製品和陰性對照hIgG1 評估與細胞表面CD137的結合能力，其中以3μg/mL和四倍連續稀釋使用測試品。圖 12A-12B 中所示的代表性試驗的結果表明，包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 的結合結構域的四價（圖 12A ）和三價（圖 12B ）CD137 x PD-L1 雙特異性分子與包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的結合結構域的分子展示了幾乎相同的結合性能，而包括CD137 MAB-6 （ 1.2 ） 的分子展示出降低的結合。
在存在和不存在表達PD-L1的N87靶細胞（每孔10,000個細胞）或JIMT-1細胞（每孔20,000個細胞）的情況下，在基本上如上所述進行的CD137報告試驗中檢查了DART-A4 、 DART-A5 、 DART-A6 、 r- 烏瑞魯單抗 ， TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A5 和TRIDENT-A6 以及陰性對照hIgG1 的功能活性，以1 ug / mL的濃度和5倍連續稀釋使用測試品。圖 13A-13B 所示的代表性試驗的結果表明，在存在JIMT-1細胞（PD-L1++ ，圖 13B ）的情況下，所有以靶標依賴性方式表現出活性的分子均比在存在N87細胞（PD-L1+ ，圖 13A ）的情況下具有更高的活性。包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 的結合結構域的CD137 x PD-L1 雙特異性分子展示活性特徵與包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的結合結構域的相同分子幾乎相同，而包括CD137 MAB-6 （ 1.2 ） 的那些展示出降低的活性。在不存在靶細胞的情況下，沒有CD137 x PD-L1 雙特異性分子展示出活性。如預期的那樣，在存在和不存在表達PD-L1的靶細胞的情況下，激動劑r- 烏瑞魯單抗 展示出活性，而陰性對照則根本沒有展示出活性。
基本上如上所述進行的，在表達PD-L1的JIMT-1細胞（每孔10,000個細胞）存在下在原代T細胞因數釋放試驗中檢查了DART-A4 、 DART-A5 、 DART-A6 、 r- 烏瑞魯單抗、 TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A5 和TRIDENT-A6 以及陰性對照hIgG1 的功能活性，測試品以1 µg/mL和五倍連續稀釋使用。圖 14A 和14B 分別顯示了代表性細胞因數INF-γ和IL-2的代表性試驗的結果。 如在CD137報告試驗中所看出的，包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 的結合結構域的CD137 x PD-L1 雙特異性分子展示的活性特徵與包括CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的結合結構域的相同分子幾乎相同或稍好一些。而包括CD137 MAB-6 （ 1.2 ） 的那些展示出降低的活性。實施例 7 CD137 x TA 分子的另外表徵
進行了另外的體外研究，以評估以下代表性的包括PD-L1 MAB-2 、 新型CD137 MAB-6 或其去免疫/優化的變體的PD-L1和CD137結合結構域的CD137 x PD-L1 雙特異性分子：DART-A ； DART-A4 ； DART-A6 ； DART-A7 ； TRIDENT-A ； TRIDENT-A4 ； TRIDENT-A6 ； 和另外的四價分子：DART-A10 （包括兩個hPD-L1 MAB-2 （ 4.2 ） 結合位點和兩個CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 結合位點）的活性。這些分子的CD137和PD-L1結合結構域總結在上面的表 5 中。
基本上如上所述， DART-A 、 DART-A4 、 DART-A6 、 DART-A7 、 DART-A10 、 陰性對照hIgG1 和抗PD-L1抗體阿替利珠單抗（r-阿替利珠單抗）、hPD-L1 MAB-2F 或r- 烏瑞魯單抗 的複製品通過FACS分析評估與表達PD-L1（CHO/PD-L1）或表達CD137（CHO/CD137）的CHO細胞的表面結合的能力，其中以3μg/ mL的起始濃度和3至4倍的稀釋使用測試品。代表性的試驗結果顯示在圖 15A-15B 中。這些結合研究表明，與DART-A 相比，包括優化的PD-L1結合結構域的CD137 x TA 結合分子 （DART-A4 、 DART-A6 、 DART-A7 、 DART-A10 ）展示了與PD-L1的改進的結合（圖 15A ）。觀察到與JIMT-1（PD-L1+）細胞結合的類似的PD-L1結合特徵。這些研究還表明，包括CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 和CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的結合結構域的CD137 x TA 結合分子 展示出與r-uelumab相比改善的類似的結合（圖 15B ）。
基本上如上所述，在PD-L1報告試驗中評估了DART-A 、 DART-A4 、 DART-A6 、 DART-A7 、 DART-A10 、 TRIDENT-A 、 TRIDENT-A4 、 RIDENT-A6 、 hPD-L1 MAB-2F 、 r- 阿替利珠單抗 和陰性對照hIgG1 阻斷PD-1/PD-L1相互作用的能力，其中以3μg/mL的測試品和兩倍連續稀釋。代表性試驗的結果顯示在圖 16A-16B 中。這些研究再次表明，包括去免疫/優化的hPD-L1 MAB-2 （ 3.2 ） 或hPD-L1 MAB-2 （ 4.2 ） 的結合結構域的四價（圖 16A ）和三價（圖 16B ）CD137 x TA 雙特異性分子，展示了與包括親本結合結構域hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） 的分子相比，PD-1 / PD-L1相互作用的更有效的阻斷，增強的活性與CD137結合結構域無關。如上所述，在此試驗中，在包括一個PD-L1結合結構域的三價分子中觀察到了更大的活性改善，其活性接近抗PD-L1抗體hPD-L1 MAB-2F 和r- 阿替利珠單抗 （每個具有兩個PD-L1結合結構域）觀察到的活性。
在存在和不存在表達PD-L1的JIMT-1細胞（每孔10,000個細胞）的情況下，基本上如上所述進行的，在CD137報告試驗中檢查DART-A 、 DART-A4 、 DART-A5 、 DART-A6 、 TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A5 和TRIDENT-A6 、 r- 烏瑞魯單抗 和陰性對照hIgG1 的功能活性，使用1ug/mL和5倍連續稀釋的測試樣品（例如，圖14A的底部所示的量）。代表性試驗的結果顯示在圖 17A-17B 中，並且表明在JIMT-1細胞存在的情況下（圖 17A ），所有二價分子均以靶標依賴方式以高活性水準展示活性，而在不存在靶細胞的情況下則無活性（圖 17B ）。與包括親本結構域的那些分子相比，包括去免疫化/優化的PD-L1和CD137結合結構域的分子表現出更高的活性（例如，TRIDENT-A6 和DART-A10 ）。在該試驗中，三價分子展示出更高的活性，而三價分子的活性增加更大。
基本上如上所述進行的，在表達PD-L1的JIMT-1細胞（每孔10,000個細胞）的存在下，在原代T細胞細胞因數釋放試驗中還檢查了DART-A 、 DART-A4 、 DART-A5 、 DART-A6 、 r- 烏瑞魯單抗、 TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A5 和 TRIDENT-A6 、 r- 烏瑞魯單抗 和r- 阿替利珠單抗的 組合以及陰性對照hIgG1 的功能活性，以1 µg / mL和五倍連續稀釋使用測試品（例如，在圖14A的底部所示的量）。圖 18A 和 18B 分別顯示了代表性細胞因數INF-γ和IL-2的代表性試驗的結果。如在CD137報告試驗中所見，包括去免疫化/優化的PD-L1和CD137結合結構域的三價CD137 x PD-L1 雙特異性分子展示出更高的活性（例如TRIDENT-A6 ）。實施例 8 鼠異種移植模型
可與其它腫瘤靶向劑組合使用本發明的CD137 x TA 結合分子 。在人PBMC重構鼠異種移植模型中體內檢查了代表性PD-L1 x CD137 雙特異性分子DART-A4 、TRIDENT-A 和TRIDENT-A4 增強代表性TA x CD3 雙特異性分子5T4 x CD3 雙抗體（以下提供序列）的抗腫瘤活性的能力。簡而言之，在研究天數（SD）0時，將新鮮分離的PBMC（8×106 ）從後眼眶注入MHCI-/-小鼠。在SD7，將RKO結腸癌細胞（5×106 ）與Matrigel以1：1的混合物皮下注射。在SD7，小鼠用OKT4治療。在SD14，開始用5T4 x CD3 雙抗體進行治療（IV）（每週兩次，0.025 mg / kg），並用PD-L1 x CD137 雙特異性分子進行治療（每週，1或2 mg / kg）。每週用卡尺兩次測量腫瘤生長（N ＝ 7 /組）。如圖 19A-19C 所示，在測試濃度下， TA x CD3 僅展示出對腫瘤生長的最小抑制。但是，PD-L1 x CD137 雙特異性分子和5T4 x CD3 雙抗體的組合顯著抑制了腫瘤生長。這項研究表明，包括新型CD137 MAB-6 抗體的結合結構域的PD-L1 x CD137 雙特異性分子可以在體內與TA x CD3 雙特異性分子組合抑制腫瘤生長。
在另一項研究中，檢測了代表性PD-L1 x CD137 雙特異性分子DART-A10 和TRIDENT-A6 （ 各自包括兩個CD137 MAB-6 （ 1.3 ） 結合位點） 增強5T4×CD3 雙抗體抗腫瘤性活性的能力。基本上如上所述進行研究，不同之處在於，PD-L1 × CD137 雙特異性分子以0.5、1或2.5 mg / kg每5天（如果在週末則為4天）施用。每週用卡尺兩次測量腫瘤生長（N ＝ 8 /組）。如圖 20A-20B 所示，DART-A10 和 TRIDENT-A6 與5T4×CD3 雙抗體組合也抑制了腫瘤生長。這項研究表明，包括去免疫化的CD137 MAB-6 抗體的結合結構域的PD-L1 x CD137 雙特異性分子可以在體內與TA x CD3 雙特異性分子組合抑制腫瘤生長。
在另外的組合治療研究中，將PD-L1×CD137 雙特異性分子DART-A6 、 TRIDENT-A （每個都包括CD137 MAB-6 結合結構域的VH/VL）的活性與TRIDENT-2 以及在WO 2019/025545中描述的稱為“PD-L1-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR”的PD-L1 x CD137 DUOBODY®雙特異性分子（在本文中縮寫為DUO-1 （下面提供氨基酸序列））的活性進行了比較。基本上如上所述進行研究，除了在不同的實驗中，PD-L1 x CD137 雙特異性分子每5天（如果在週末則為4天）以0.1mg/kg至5mg/kg之間的範圍的濃度施用。每週用卡尺兩次測量腫瘤生長（N＝8/組）。兩項研究的代表性資料（注意–研究1中，TRIDENT-2 僅以1mg/kg給藥）繪製在圖 21A 和21B 中，並顯示出TRIDENT-A 和TRIDENT-A6 展示的抗腫瘤活性與TRIDENT-2 相當或稍好，並且比DUO-1更具活性。
代表性的TA x CD3 雙特異性分子（即在上述鼠異種移植研究中使用的5T4 x CD3 雙抗體）是具有對5T4腫瘤抗原的一個結合位點和對CD3的一個結合位點的二價雙抗體。該分子具有圖1D所示的一般結構，並包括以下三條多肽鏈：
5T4 x CD3雙抗體鏈1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWFQQKP GKAPKSLIYR ANRLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCLQ YDDFPWTFGQ GTKLEIKGGG SGGGGEVQLV ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVGRIRSKY NNYATYYADS VKGRFTISRD DSKNSLYLQM NSLKTEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS GGCGGGEVAA LEKEVAALEK EVAALEKEVA ALEKGGGDKT HTCPPCPAPE AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO:140)
5T4 x CD3雙抗體鏈2 QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCRSSTGAVT TSNYANWVQQ KPGQAPRGLI GGTNKRAPWT PARFSGSLLG GKAALTITGA QAEDEADYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLG GGGSGGGGQV QLVQSGAEVK KPGASVKVSC KASGYTFTSF WMHWVRQAPG QGLEWMGRID PNRGGTEYNE KAKSRVTMTA DKSTSTAYME LSSLRSEDTA VYYCAGGNPY YPMDYWGQGT TVTVSSGGCG GGKVAALKEK VAALKEKVAA LKEKVAALKE (SEQ ID NO:141)
5T4 x CD3雙抗體鏈3 Dkthtcppcp apeaaggpsv flfppkpkdt lmisrtpevt cvvvdvshed pevkfnwyvd gvevhnaktk preeqynsty rvvsvltvlh qdwlngkeyk ckvsnkalpa piektiskak gqprepqvyt lppsreemtk nqvslscavk gfypsdiave wesngqpenn ykttppvlds dgsfflvskl tvdksrwqqg nvfscsvmhe alhnrytqks lslspgk (SEQ ID NO:142)
在以上小鼠異種移植研究中使用的PD-Ll-547-FEALxCD137-009-HC7LC2-FEAR雙特異性分子在WO 2019/025545中描述。該分子包括不同於本文提供的PD-L1和CD137結合特異性，並包括以下四條多肽鏈：
VH_CD137-009-H7  IgGl-FEAR-Fc EVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCTASGFSLN DYWMSWVRQA PGKGLEWVGY IDVGGSLYYA ASVKGRFTIS RDDSKSIAYL QMNSLKTEDT AVYYCARGGL TYGFDLWGQG TLVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKSTSGGTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTQTYIC NVNHKPSNTK VDKRVEPKSC DKTHTCPPCP APEFEGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVAVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO:157)
VL_CD137-009-L2  κ-C DIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASEDIS SYLAWYQQKP GKAPKRLIYG ASDLASGVPS RFSASGSGTD YTFTISSLQP EDIATYYCHY YATISGLGVA FGGGTKVEIK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:158)
VH-PD-L1-547 IgGl-FEAL-Fc EVQLLEPGGG LVQPGGSLRL SCEASGSTFS TYAMSWVRQA PGKGLEWVSG FSGSGGFTFY ADSVRGRFTI SRDSSKNTLF LQMSSLRAED TAVYYCAIPA RGYNYGSFQH WGQGTLVTVS SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKRVE PKSCDKTHTC PPCPAPEFEG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVAV SHEDPEVKFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALPAPIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFLL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:159)
VL- PD-L1-547  λ-C SYVLTQPPSV SVAPGQTARI TCGGNNIGSK SVH WYQQKPG QAPVLVVYDD NDRPS GLPER FSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCQVW DSSSDHVV FG GGTKLTVLGQ PKAAPSVTLF PPSSEELQAN KATLVCLISD FYPGAVTVAW KADSSPVKAG VETTTPSKQS NNKYAASSYL SLTPEQWKSH RSYSCQVTHE GSTVEKTVAP TECS (SEQ ID NO:160)
實施例 9 另外的 CD137 x TA 結合分子的表徵
產生了能夠結合CD137和代表性TA ，HER2的CD137 x TA 結合分子 ，其併入了CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的VH和VL結構域以及hHER2 MAB-1 （ 1.3 ） 的VH和VL結構域。在這項研究中，檢查了許多另外的雙特異性構型。特別地，產生稱為“DART-B1 ”的雙價雙特異性雙抗體，其包括雙特異性雙抗體結構域，並具有圖 1D 所示的不對稱結構；以及稱為“TRIDENT-B2 ”的三價結合分子，其包括雙特異性雙抗體型結合結構域（其中位元點A結合CD137，位點B結合TA ）和非雙抗體型結合結構域（位元點C結合CD137），具有圖 3A 所示的結構。另外，產生了與之前表徵的分子具有相同的一般構型的分子。特別地，產生了稱為“DART-B2 ”的四價雙特異性雙抗體，其包括相同的雙特異性雙抗體結合結構域並具有圖 1B 所示的抗體樣Y結構；和稱為“TRIDENT-B1 ”的三價結合分子，其包括單特異性雙抗體型結合結構域（其中位元點A和B結合CD137）和非雙抗體型結合結構域（位元點C結合TA ）。這些分子的結構域特性以及具有相同結構的某些雙特異性對照和比較分子在上面進行了討論（參見例如表 5-6 ）。
在存在和不存在HER2表達細胞（JIMT-1（HER2++ ）或N87（HER2+++ ），20,000個細胞/孔）的情況下，在基本上如上所述進行的CD137報告試驗中評估DART-B1 、 DART-B2 、 TRIDENT-B1 、 TRIDENT-B2 、 親本CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和HER2 MAB-1 （ 1.3 ） 抗體以及陰性對照：DART-4 、 DART-5 、 TRIDENT-3 和TRIDENT-4 （CD137 x RSV結合分子，具有的結構可與各測試品相當）的功能活性。測試品以1 ug / mL和五倍連續稀釋使用。使用JIMT-1和N87細胞的代表性試驗的結果分別顯示在圖 22A 和22B 中，並證明包括結合結構域CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的所有CD137 x HER2 雙特異性分子均介導了靶向依賴性信號轉導，而親本抗體和陰性對照則沒有展示活性。
基本如上所述進行的，在HER2表達細胞（JIMT-1和N87，每孔10,000個細胞）的存在下，在原代T細胞細胞因數釋放試驗中還評估了DART-B1 、 DART-B2 、 TRIDENT-B1 、 TRIDENT-B2 、親本CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 和HER2 MAB-1 （ 1.3 ） 抗體以及陰性對照：DART-4 、DART-5 、TRIDENT-3 和TRIDENT-4 的功能活性。測試品以1 µg/mL和五倍連續稀釋使用。使用JIMT-1細胞的代表性試驗的結果在圖 23A （INF-γ）和23C （IL-2）中顯示，使用N87細胞在圖 23B （INF-γ）和23D （IL-2）中顯示。如在CD137報告試驗中所見，所有包括結合結構域CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的CD137 x HER2 雙特異性分子均介導靶向依賴性細胞因數釋放，尤其是高HER2表達N87細胞，而親本抗體和陰性對照沒有展示活性。
這些研究表明，包括結合結構域CD137 MAB-6 （ 1.1 ） 的二價、四價和三價CD137 x TA 雙特異性分子（分別為DART-B1、DART-B2、TRIDENT-B1/B2）介導靶標依賴性信號轉導。應當注意，CD137結合結構域的位置在TRIDENT-B2中相對於TRIDENT-B1是移位的。這項研究表明，CD137 MAB-6 當與另外的腫瘤抗原配對時，以多種構型都是功能性的，甚至當以單個結合位點存在時，也具有功能性。
本說明書中提及的所有出版物和專利都以相同的程度通過引用併入本文，就好像每個單獨的出版物或專利申請被具體地和單獨地指示整體地通過引用併入一樣。儘管已經結合本發明的具體實施方式對本發明進行了描述，但是應當理解，本發明能夠進行進一步的修改，並且本申請旨在覆蓋本發明的任何變型、用途或修改，一般而言，本發明的原理以及包括與本公開內容的這種偏離均落入本發明所屬領域的已知或慣常實踐之內，並且可以應用於上文闡述的基本特徵。
無
圖 1A-1D 提供了示出包括Fc區的代表性共價結合的雙抗體的示意圖。圖 1A-1D 示出了包括兩對多肽鏈（即，總共四條多肽鏈）的具有四個表位-結合位點的四價雙抗體。每對的一個多肽具有CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成Fc區的全部或部分。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充模式示出。兩對多肽鏈可以相同。在VL和VH結構域識別不同表位元的實施方式中（如圖 1A-1B 所示），所得分子具有四個表位結合位點，並且對於每個結合的表位是雙特異性和二價的。在其中VL和VH結構域識別相同的表位（例如，在兩條鏈上使用相同的VL結構域CDR和相同的VH結構域CDR）這樣的實施方式中，所得分子具有四個表位結合位點並且相對於單個表位是單特異性和四價的。可選地，兩對多肽可以不同。在其中每對多肽的VL和VH結構域識別不同的表位（如圖 1C 所示）這樣的實施方式中，所得分子具有四個表位結合位點，並且相對於每個結合的表位是四特異性和單價的。圖 1A 示出了Fc雙抗體，其包含含有半胱氨酸殘基的肽異質二聚體促進結構域。圖 1B 示出了包括兩對多肽鏈的Fc雙抗體，每對多肽鏈具有E-螺旋或K-螺旋異質二聚體促進結構域（即，總共四條多肽鏈）。在提供了結合分子結構域的示意圖的該圖和所有圖中的波浪線（WWW）表示存在的一個或多個任選的異質二聚體促進結構域。如所示，半胱氨酸殘基可存在於接頭中（主圖）和/或異質二聚體促進結構域中（框內）。每對的一條多肽鏈具有包括半胱氨酸的接頭（該接頭可以包括鉸鏈區的全部或一部分）和CH2和CH3結構域，使得締合的鏈形成Fc區的全部或部分。圖 1C 示出了包含Fc區的雙抗體，其包含抗體CH1和CL結構域。圖 1D 示出了代表性的共價結合的雙抗體分子，其包括三條多肽鏈的具有兩個表位-結合位點。兩條多肽鏈具有CH2和CH3結構域，以使締合的鏈形成Fc區的全部或部分。包括VL和VH結構域的多肽鏈進一步包括異質二聚體促進結構域，在此顯示為包括半胱氨酸殘基。
圖 2 提供了包括五條多肽鏈的具有四個表位-結合位點的代表性共價結合的結合分子的示意圖。兩條多肽鏈具有包含半胱氨酸的接頭（該接頭可以包含鉸鏈區的全部或一部分）以及CH2和CH3結構域，從而使締合的鏈形成包括Fc區的全部或部分的Fc區。包含連接的VL和VH結構域的多肽鏈還包括接頭和異質二聚體促進結構域（在圖 1B 中進一步描述）。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充模式顯示。可以選擇可變結構域以產生所得的CD137×TA 結合分子 ，其具有兩個對TA 特異性的非雙抗體型結合結構域和兩個對CD137特異性的雙抗體型結合結構域。可選地，可以選擇可變結構域以產生所得的CD137×TA 結合分子 ，其具有兩個對CD137特異性的非雙抗體型結合結構和兩個對TA 特異性的雙抗體型結合結構域。這種分子是雙特異性的，並且具有兩個對CD137的結合位點（其可以結合相同或不同的CD137表位）和兩個對TA 的結合位點（其可以結合相同或不同的TA 表位）。
圖 3A-3C 提供了具有三個表位結合位點的代表性的含有Fc區的三價結合分子的示意圖。圖 3A 示意性地示出了三價結合分子的結構域，其包含通過接頭/異質二聚體促進結構域（在圖 1B 中進一步描述）共價結合的兩個雙抗體型結合結構域和Fab型結合結構域，其中結合結構域在Fc區的N末端。圖 3A 中的分子包含四條鏈。圖 3B-3C 分別示意性地示出了包括兩個雙抗體型結合結構域以及其中輕鏈和重鏈通過多肽間隔子連接或包括scFv型結合結構域的Fab型結合結構域的三價結合分子的結構域。圖 3B-3C 中的三價結合分子包括三條鏈。識別相同表位元的VL和VH結構域使用相同的陰影或填充模式顯示。
圖 4 示出了CD137 x TA 結合分子 DART-A 、 TRIDENT-A 、 比較分子TRIDENT-2 和陰性對照hIgG1 與工程化CHO細胞表面上表達的CD137結合的能力。
圖 5A-5B 示出了CD137 x TA 結合分子 DART-A 、 TRIDENT-A 、 hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） 和陰性對照hIgG1 與工程化CHO細胞的細胞表面上表達的PD-L1結合的能力（圖 5A ），以及在PD-L1報告試驗中阻斷PD-L1/PD-1相互作用的能力（圖 5B ）。
圖 6 示出了CD137 x TA 結合分子 DART-A 、 TRIDENT-A 、 比較分子：DART-2 和TRIDENT-2 、 DART-3 、 r- 烏瑞魯單抗 以及陰性對照：DART- 1 和hIgG1 在CD137報告試驗仲介導靶依賴性信號轉導的能力。
圖 7A-7B 示出了CD137 x TA 結合分子 DART-A 、TRIDENT-A 、比較分子：DART-2 和TRIDENT-2 、 DART-3 、 r- 烏瑞魯單抗 以及陰性對照：DART-1 和hIgG1 在原代T細胞因數釋放試驗仲介導細胞因數INF-γ（圖 7A ）和IL-2（圖 7B ）的靶依賴性釋放的能力。
圖 8A-8C 示出了CD137 x TA 結合分子 TRIDENT-A 的血清水準和對免疫細胞增殖的誘導。繪製了用TRIDENT-A 以1 mg / kg（實心圓）或10 mg / kg（空心圓）治療的食蟹猴的藥代動力學（血清清除率）（圖 8A ）、CD8+ T細胞增殖（圖 8B ）、NK細胞增殖（圖 8C ）直至第20-24天。
圖 9A-9B 示出了包括hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） 的去免疫/優化變體的Fab的結合活性。繪製了Fab變體hPD-L1 MAB-2B 、 hPD-L1 MAB-2D 和hPD-L1 MAB-2F （圖 9A ）和 hPD-L1 MAB-2A 、 hPD-L1 MAB-2C 和hPD-L1 MAB-2E （圖9B）的ELISA結合曲線。
圖10A-10B示出了包括去免疫化或優化的PD-L1結合結構域的CD137 x TA 結合分子 與工程化CHO細胞的細胞表面上表達的PD-L1結合的能力。繪製了DART-A1 、 DART-A4 和抗PD-L1抗體hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ）（圖 10A ）、 TRIDENT-A 、 TRIDENT-A4 和陰性對照hIgG1 （圖 10B ） 的結合曲線。
圖 11A-11C 示出了包括去免疫化和/或優化的PD-L1結合結構域的CD137 x TA 結合分子 在PD-L1報告試驗中阻斷PD-L1 / PD-1相互作用的能力。繪製了DART-A1 、 DART-A4 和抗PD-L1抗體hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ）（圖 11A ）、 TRIDENT-A 、 TRIDENT-A4 和陰性對照hIgG1 （圖 11B ）、 DART-A4 、 DART-A7 、 DART-A8 、 DART-A9 和陰性對照hIgG1 （圖 11C ） 的活性曲線。
圖12A-12B示出了包括去免疫化的CD137結合結構域和/或去免疫化/優化的PD-L1結合結構域的CD137 x TA 結合分子 與工程化CHO細胞的表面上表達的CD137結合的能力。繪製了DART-A4 、 DART-A5 、 DART-A6 （圖 12A ）、 TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A5 、 TRIDENT-A6 （圖 12B ） 的結合曲線。在兩個圖上還繪製了比較物r-烏瑞魯單抗 和陰性對照hIgG1。
圖13A-13B示出了在用低PD-L1表達的N87靶細胞（圖 13A ）或中等PD-L1表達的JIMT-1靶細胞（圖 13B ）進行的CD137報告試驗中，包括去免疫化的CD137結合結構域和/或去免疫化/優化的PD-L1結合結構域的CD137 x TA 結合分子 介導靶依賴性信號轉導的能力。繪製了DART-A4 、 DART-A5 、 DART-A6 、 TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A5 、 TRIDENT-A6 、 比較劑r- 烏瑞魯單抗 和陰性對照hIgG1 的活性。
圖14A-14B示出了在原發性T細胞細胞因數釋放試驗中包括去免疫化的CD137結合結構域和去免疫化/優化的PD-L1結合結構域的CD137 x TA 結合分子 介導細胞因數INF-γ（圖 14A ）和IL-2（圖 14B ）的靶標依賴性釋放的能力。繪製了DART-A4 、 DART-A5 、 DART-A6 、 TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A5 、 TRIDENT-A6 、 比較物r- 烏瑞魯單抗 和陰性對照hIgG1 的活性。
圖 15A-15B 示出了包括親本的或去免疫化/優化的PD-L1和/或CD137結合結構域的CD137 x TA 結合分子 結合在工程化CHO細胞的細胞表面表達的PD-L1（圖 15A ）和CD137（圖 15B ）的能力。繪製了DART-A 、 DART-A4 、 DART-A6 、 DART-A7 、 DART-A10 、 抗PD-L1抗體hPD-L1 MAB-2 （ 1.1 ） 和r- 阿替利珠單抗 以及陰性對照hIgG1 （圖 15A ）、DART-A 、 DART-A4 、 DART-A6 、 DART-A7 、 DART-A10 、 r- 烏瑞魯單抗 和陰性對照hIgG1 （圖 15B ） 的結合曲線。
圖 16A-16B 示出了在PD-L1報告試驗中，包括親本或去免疫化/優化的PD-L1和/或CD137結合結構域的CD137 x TA 結合分子 阻斷PD-L1 / PD-1相互作用的能力。四價分子DART-A 、 DART-A4 、 DART-A6 、 DART-A7 、 DART-A10 的結果繪製在圖 16A 中，三價分子TRIDENT-A 、 TRIDENT-A4 和 TRIDENT-A6 的結果繪製在圖16B中。在兩個圖上還繪製了抗PD-L1抗體hPD-L1 MAB-2F 和r- 阿替利珠單抗 以及陰性對照hIgG1 。
圖 17A-17B 示出了存在中等PD-L1表達的JIMT-1靶細胞（圖 17A ）或在不存在靶細胞（圖 17B ）中進行的CD137報告試驗中，包括親本的或去免疫化/優化的PD-L1和/或CD137結合結構域的CD137 x TA 結合分子 介導靶依賴性信號轉導的能力。繪製了DART-A 、 DART-A4 、 DART-A6 、 DART-A7 、 DART-A10 、 TRIDENT-A 、 TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A6 、 比較物r- 烏瑞魯單抗 和陰性對照hIgG1 的活性。
圖 18A-18B 示出了包含親本或去免疫化/優化的PD-L1和/或CD137結合結構域的CD137 x TA 結合分子 介導細胞因數INF-γ（圖 18A ）和IL- 2（圖 18B ）的靶依賴性釋放的能力。繪製了DART-A 、 DART-A4 、 DART-A6 、 DART-A7 、 DART-A10 、 TRIDENT-A 、 TRIDENT-A4 、 TRIDENT-A6 、r-阿替利珠單抗和r-烏瑞魯單抗 的組合（r-atezo + r-ure combo）和陰性對照hIgG1的活性。
圖 19A-19C 示出了在鼠PBMC重構異種移植模型中，相對於單獨的TA x CD3 雙特異性分子或媒介物對照，幾種代表性的PD-L1 x CD137 雙特異性分子：DART-A （圖 19A ） 、TRIDENT-A （圖 19B ） 或TRIDENT-A4 （圖 19C ） ，與代表性的TA x CD3 雙特異性分子（5T4 x CD3 雙抗體）組合在體內預防或抑制RKO結腸癌細胞的腫瘤生長或發育的能力。
圖 20A-20B 示出了在鼠PBMC重構異種移植模型中，相對於單獨的TA x CD3 雙特異性分子或媒介物對照，幾種代表性的PD-L1 x CD137 雙特異性分子：DART-A6 （圖 20A ） 或TRIDENT-A6 （圖 20B ）， 與代表性TA x CD3 雙特異性分子（5T4 x CD3 雙抗體 ）組合在體內預防或抑制RKO結腸癌細胞的腫瘤生長或發育的能力。
圖 21A-21B 示出了在鼠PBMC重構異種移植模型中，相對於媒介物對照，幾種代表性的PD-L1 x CD137 雙特異性分子：TRIDENT-A 、 包括CD137 MAB-6 結合結構域的VH / VL的TRIDENT-A6 或比較分子：TRIDENT-2 、包括不同CD137結合結構域的VH / VL的DUO-1，與代表性的TA x CD3 雙特異性分子（5T4 x CD3 雙抗體）組合在體內預防或抑制RKO結腸癌細胞的腫瘤生長或發育的能力。來自第一項研究的代表性資料繪製在圖 21A 中，而來自第二項研究的代表性資料繪製在圖 21B 中。
圖 22A-22B 示出了在以中等HER2表達的JIMT-1細胞（圖 22A ）或在高HER2表達的N87靶細胞（圖 22B ）進行的CD137報告試驗中，包括CD137結合結構域和HER2結合結構域的CD137 x TA 結合分子 介導靶依賴性信號轉導的能力（圖22A）。繪製了DART-B1 、 DART-B2 、 TRIDENT-B1 、 TRIDENT-B2 、 親本的hHER2 MAB-1（1.3）和CD137 MAB-6（1.1）抗體以及陰性對照DART-4 、 DART-5 、 TRIDENT-3 、 TRIDENT-4 的活性。
圖23A-23D示出了在用中等HER2表達的JIMT-1細胞（圖 22A 和 23C ）或高HER2表達的N87靶細胞（圖 22B 和 23D ）進行的原代T細胞細胞因數釋放試驗中，包括CD137結合結構域和HER2結合結構域的CD137 x TA 結合分子 介導細胞因數INF-γ（圖 23A 和 23B ）和IL-2（圖 23C 和 23D ）的靶標依賴性釋放的能力。繪製了DART-B1、DART-B2、TRIDENT-B1、TRIDENT-B2、親本的hHER2 MAB-1（1.3）和CD137 MAB-6（1.1）抗體以及陰性對照DART-4、DART-5、TRIDENT-3、TRIDENT-4的活性。

Claims (22)

  1. 一種 CD137 結合分子，其包括與CD137的表位免疫特異性結合的第一結合位點，其中所述第一結合位點包括第一輕鏈可變結構域和第一重鏈可變結構域；並且其中： (A) 所述第一重鏈可變結構域包括 hCD137 MAB-6 VH1( SEQ ID NO:46)的氨基酸序列；和 (B) 所述第一輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： (1) hCD137 MAB-6 VL1( SEQ ID NO:50)； (2) hCD137 MAB-6 VL2( SEQ ID NO:55)；或 (3) hCD137 MAB-6 VL3( SEQ ID NO:56)。
  2. 如請求項1所述的 CD137 結合分子，其中， (A)所述第一重鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： hCD137 MAB-6 VH1 （ SEQ ID NO ： 46 ）；和 (B)所述第一輕鏈可變結構域包括以下氨基酸序列： hCD137 MAB-6 VL3 （ SEQ ID NO ： 56 ）。
  3. 如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子，其包括免疫特異性結合 PD-L1的表位的第二結合位點，其中所述第二結合位點包括第二輕鏈可變結構域和第二重鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDR L1、CDR L2和CDR L3，所述第二重鏈可變結構域包括CDR H1、CDR H2和CDR H3；並且其中： (A)所述第二輕鏈可變結構域CDR L1、CDR L2和CDR L3是 hPD-L1 MAB-2 VLx （ SEQ ID NO ： 63 ）的輕鏈CDR；和 (B)所述第二重鏈可變結構域CDR H1、CDR H2和CDR H3是 hPD-L1 MAB-2 VHx （ SEQ ID NO ： 59 ）的重鏈CDR； 其中CDR根據Kabat來識別。
  4. 如請求項3所述的 CD137 結合分子，其中： (A)    所述第二重鏈可變結構域包括下述氨基酸序列： (1) hPD-L1 MAB-2 VH1( SEQ ID NO:57)； (2) hPD-L1 MAB-2 VH2( SEQ ID NO:67)； (3) hPD-L1 MAB-2 VH3( SEQ ID NO:68)； (4) hPD-L1 MAB-2 VH4( SEQ ID NO:69)； (5) hPD-L1 MAB-2 VH5( SEQ ID NO:70)；或 (6) hPD-L1 MAB-2 VH6( SEQ ID NO:71)；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括下述氨基酸序列： (1) hPD-L1 MAB-2 VL1( SEQ ID NO:58)；或 (2) hPD-L1 MAB-2 VL2( SEQ ID NO:72)。
  5. 如請求項4所述的 CD137 結合分子，其中： (A)    所述第二重鏈可變結構域包括 hPD-L1 MAB-2 VH4 (SEQ ID NO:69)的氨基酸序列；和 (B)     所述第二輕鏈可變結構域包括 hPD-L1 MAB-2 VL2( SEQ ID NO:72) 的氨基酸序列。
  6. 如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子，其包括與 HER2的表位免疫特異性結合的第二結合位點，其中所述第二結合位點包括第二輕鏈可變結構域和第二重鏈可變結構域，所述第二輕鏈可變結構域包括CDR L1、CDR L2和CDR L3，所述第二重鏈可變結構域包括CDR H1、CDR H2和CDR H3；並且其中： (A)    (1)     所述第二輕鏈可變結構域CDR L1、CDR L2和CDR L3是 hHER2-MAB-1 VLx( SEQ ID NO:79)的輕鏈CDR；和 (2)     所述第二重鏈可變結構域CDR H1、CDR H2和CDR H3是 hHER2-MAB-1 VHx (SEQ ID NO:78)的重鏈CDR； 或 (B)     (1)     所述第二重鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： hHER2-MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:80)、 hHER2-MAB-1 VH2 (SEQ ID NO:81)或 hHER2-MAB-1 VH3 (SEQ ID NO:82)；和 (2)     所述第二輕鏈可變結構域包括下述的氨基酸序列： hHER2-MAB-1 VL1( SEQ ID NO:83)、 hHER2-MAB-1 VL2( SEQ ID NO:84)或 hHER2-MAB-1 VL3( SEQ ID NO:85)； 或 (C)     所述第二重鏈可變結構域包括 hHER2-MAB-1 VH1 (SEQ ID NO:80)的氨基酸序列和所述輕鏈可變結構域包括 hHER2-MAB-1 VL3( SEQ ID NO:85)的氨基酸序列； 其中CDR根據Kabat來識別。
  7. 如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子，其是抗體或雙特異性四價具有Fc的雙抗體或雙特異性三價分子。
  8. 如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子，其中所述分子是雙特異性和四價的，並且包括第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
  9. 如請求項8所述的 CD137 結合分子，其中所述第一多肽鏈包括氨基酸序列 SEQ ID NO:120；所述第二多肽鏈包括氨基酸序列 SEQ ID NO:139；所述第三多肽鏈包括氨基酸序列 SEQ ID NO:120；和所述第四多肽鏈包括氨基酸序列 SEQ ID NO:139。
  10. 如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子，其中所述分子是雙特異性和三價的，並且包括第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈和第四多肽鏈，其中所述多肽鏈形成共價結合的複合物。
  11. 如請求項10所述的CD137結合分子，其中所述第一多肽鏈包括 SEQ ID NO:135的氨基酸序列；所述第二多肽鏈包括 SEQ ID NO:136的氨基酸序列；所述第三多肽鏈包括 SEQ ID NO:131的氨基酸序列；和所述第四多肽鏈包括 SEQ ID NO:132的氨基酸序列。
  12. 如請求項10所述的 CD137 結合分子，其中所述第一多肽鏈包括氨基酸序列 SEQ ID NO:127；所述第二多肽鏈包括氨基酸序列 SEQ ID NO:128；所述第三多肽鏈包括氨基酸序列 SEQ ID NO:129；和所述第四多肽鏈包括氨基酸序列 SEQ ID NO:130。
  13. 如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子，用於製備藥物。
  14. 如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子，用於治療癌症。
  15. 如請求項14所述的 CD137 结合分子，其中所述癌症選自：膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、膽囊或膽管癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、胃癌、睾丸癌、胸腺癌和子宮癌。
  16. 一種藥物組合物，其包括如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子和生理學上可接受的載體。
  17. 如請求項16所述的藥物組合物，用於製備藥物。
  18. 如請求項16所述的藥物組合物，用於治療癌症。
  19. 如請求項18所述的藥物組合物，其中所述癌症選自：膀胱癌、骨癌、腦和脊髓癌、乳腺癌、宮頸癌、結直腸癌、膽囊或膽管癌、胃癌、膠質母細胞瘤、頭頸癌、肝細胞癌、腎癌、白血病、肝癌、肺癌、黑素瘤、成神經細胞瘤、非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、胰腺癌、咽癌、前列腺癌、腎細胞癌、橫紋肌肉瘤、皮膚癌、頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）、胃癌、睾丸癌、胸腺癌和子宮癌。
  20. 一種核酸，其編碼如請求項1或請求項2所述的 CD137 結合分子。
  21. 一種表達載體，其包含如請求項20所述的核酸。
  22. 一種細胞，其包括如請求項20所述的核酸或如請求項21所述的表達載體。
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