TW201039851A - Bispecific anti-ErbB-3/anti-C-met antibodies - Google Patents
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Description
201039851 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於針對人類ErbB-3及人類c_Met之雙特異性 抗體、其產生方法、含有該等抗體之醫藥組合物、及其用 途。 【先前技術】
ErbB蛋白質家族 〇 ❹
ErbB蛋白家族由4個成員組成：ErbBq，亦稱作表皮生 長因子受體（EGFR) ; ErbB-2，在人類中亦稱作HER2且在
齧齒動物中亦稱作neu ; ErbB-3，亦稱作HER3 ;及E bB 亦稱作HER4。
ErbB-3 及抗-ErbB-3 抗體
ErbB-3(亦稱作V-erb-b2成紅細胞白血病病主 ^ 母同源癌基因 3(禽類）、ERBB3、HER3 ; SEQ ID NO:46)係夏古、 、’、有神經納_
蛋白結合結構域但不具有活性激酶結構域$ ° P '結合蛋白 (Kraus, M.H等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U q δ • ·Α· 86 (1989、 9193-7 ; Plowman，G.D.等人，Proc. Natl. AcaH 〇
Sci· U.S.a 87 (1999) 4905-9 ; Katoh，M.等人，Bi〇cheiT1 ^ ·
Bi〇Phys.
Res. Commun. 192 (1993) 1189-97)。因此，其士 體但不能經由蛋白質磷酸化將信號傳遞至細胞中 其可與具有激酶活性之其他EGF受體家族成員带 成異二聚 體。異二聚化作用導致引發細胞增殖或分化之途中及、、 已報導在多種癌症中存在此基因之擴增及/或其 白質之 過表現，包括前列腺腫瘤、膀胱腫瘤、及乳腺腫 ' 竭。人們 /、 、、、Q合此配 然而， 147005.doc 201039851 已對編碼不同亞型之替代性轉錄剪接變體進行表徵。一種 亞型缺少膜内區且在細胞外分泌。此形式用於調節膜結合 形式之活性（Corfas, G.等人，7(6) (2004) 575-80)。人們認 為，ERBB3在活化時變成受質而與ERBB1、ERBB2及 ERBB4二聚化且隨後被其磷酸化。與多種受體酪胺酸激酶 類似，ERBB3係由細胞外配體活化。已知可結合ERBB3之 配體包括神經生長因子。 用於抗癌治療之抗-ErbB-3抗體可參見（例如）WO 97/35885 ' WO 2007/077028或 WO 2008/100624 ° c-Met及抗-c-Met抗艘 MET(間質-上皮轉型因子）係編碼蛋白MET(亦稱作c-Met ;肝細胞生長因子受體HGFR ; HGF受體；擴散因子受 體；SF受體；SEQ ID NO:45)之原癌基因（Dean, M.等人， Nature 3 18 (1985) 385-8 ; Chan, Α·Μ·等人，Oncogene 1 (1987) 229-33 ; Bottaro, D.P.等人，Science 251 (1991) 802-4 ; Naldini，L.等人，EMBO J. 10 (1991) 2867-78 ; Maulik, G.等人，Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2002) 41-59)。MET係胚胎發育及傷口癒合必需之膜受體。肝細 胞生長因子（HGF)係MET受體之唯一已知配體。MET通常 由上皮來源之細胞表現，而HGF之表現受限於間質來源之 細胞。在HGF刺激後，MET誘導若干種生物反應，其共同 引發稱作侵襲性生長之程序。癌症中之異常MET活化與預 後較差有關，其中活性異常的MET誘發腫瘤生長、形成向 腫瘤供應營養之新血管（血管發生）、及癌症向其他器官擴 147005.doc 201039851 散（轉移）。MET在多種類型之人類惡性腫瘤中解除調節， 包括腎癌、肝癌、胃癌、乳癌及腦癌。通常，僅幹細胞及 祖細胞表現MET，其使得該等細胞可侵襲性生長以在胚胎 中生成新組織或在成人中使受損組織再生。然而，人們認 為癌症幹細胞可劫持正常幹細胞表現MET之能力，且由此 使得癌症可持續存留並擴散至體内其他位點。 原癌基因MET之產物係肝細胞生長因子受體且編碼酪胺 酸-激酶活性。對原始單鏈前體蛋白實施轉譯後裂解以產 生α及β亞單元，使其以二硫鍵連接以形成成熟受體。MET 基因中之多種突變與乳突樣腎癌有關。 抗-c-Met抗體可參見（例如）US 5686292、US 7476724、 WO 2004072117、WO 2004108766、WO 2005016382、WO 2005063816、WO 2006015371、WO 2006104911、WO 2007126799、或 WO 2009007427。 c-Met結合肽可參見（例如）Matzke, A.等人，Cancer Res 2005 ; 65 (14)及 Tam, E.M·等人，J. Mol. Biol. 385 (2009) 79-90 ° 雙特異性抗體 最近幾年已研發出眾多種重組抗體形式，例如融合（例 如）IgG抗體形式及單鏈結構域之四價雙特異性抗體（例 如，參見 Coloma，M.J.等人，Nature Biotech 15 (1997) 159-163 ; WO 2001/077342 ;及 Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234)。 亦已研發出若干種不再保留抗體核心結構（IgA、IgD、 147005.doc 201039851
IgE、IgG或IgM)之其他新形式，例如雙鏈抗體、；鏈抗體 或四鍵抗體、微小抗體、若干種單鍵形式（scFv、雙 scFv)，其能結合兩種或更多種抗原（Holliger, P.等人， Nature Biotech 23 (2005) 1126-1 136 ； Fischer, N., Leger, 0_，Pathobiology 74 (2007) 3-14 ; Shen, J.等人，Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74 ; Wu, C.等人， Nature Biotech. 25 (2007) 1290-1297) ° 所有該等形式皆使用連接體來融合抗體核心（IgA、 IgD、IgE、IgG或IgM)與另一結合蛋白（例如scFv)或融合 (例如）兩個 Fab 片段或 scFv (Fischer，N·, L0ger，0., Pathobiology 74 (2〇07) 3_ 14)。必須牢記，可藉由維持與 天然抗體之高度相似性來保留經由pc受體結合介導之效應 子功能（例如補體依賴性細胞毒性（CDC)或抗體依賴性細胞 毒性（ADCC)) 〇 在WO 2007/024715中報導雙可變結構域免疫球蛋白，其 為經改造多價多特異性結合蛋白。製備生物活性抗體二聚 體之方法報導於US 6,897,044中。具有至少四個經由肽連 接體彼此連接之可變結構域的多價Fv抗體構成物報導於us 7，129,330中。二聚及多聚抗原結合結構報導於仍 2005/0079170中。包含三個或四個藉由連接結構彼此共價 結合之F ab片段的三價或四價單特異性抗原結合蛋白報導 於US 6,511，663中’該蛋白並非天然免疫球蛋白。在 2〇〇6/〇20258中報導四價雙特異性抗體，纟可在原核及真 核細胞中有效表現且可用於治療性及診斷性方法。一種自' 147005.doc 201039851 包含經由至少一個鏈間二硫鍵連接之二聚體與並非經由至 少一個鏈間二硫鍵連接之二聚體的混合物分離該兩種類型 之多肽二聚體或優先合成該經由至少一個鏈間二硫鍵連接 之二聚體的方法報導於US 2005/0163782中。雙特異性四 價受體報導於US 5,959,083中。具有三個或更多個功能性 抗原結合位點之經改造抗體報導於WO 2001/077342中。 多特異性及多價抗原結合多肽報導於WO 1997/001 580 中。WO 1992/004053報導通常自結合相同抗原決定簇之 IgG類單株抗體製備之均偶合物，其係藉由合成性交聯共 價連接。對抗原具有高親合力之寡聚單株抗體報導於WO 1991/06305中，其中分泌具有兩個或更多個免疫球蛋白單 體之募聚物（通常為IgG類），該等單體結合在一起形成四 價或六價IgG分子。綿羊源抗體及經改造抗體構成物報導 於US 6,350,860中，其可用於治療具有致病性干擾素γ活性 之疾病。在US 2005/0100543中報導可靶向構成物，其係 雙特異性抗體之多價載體，即可靶向構成物之每個分子胃 可用作兩個或更多個雙特異性抗體之載體。遺傳改造雙# 異性四價抗體報導於WO 1995/009917中。在 2007/109254中報導經穩定結合分子，其由經穩定scFv組成* 或包含該經穩定scFv。 雙特異性抗-ErbB_3/抗-c-Met抗體 WO 2008/100624係關於具有提高的ErbB-3受體内化X 抗-ErbB-3抗體及其在尤其具有c-Met作為第二抗原之雙特 異性抗體中之用途。 147005.doc 201039851 【發明内容】 本發明之第一態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類 c-Met之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-3之 第一抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結 合位點，其特徵在於，當在2小時後於流式細胞計數分析 中針對A43 1細胞進行測量時，與不存在抗體時ErbB-3之内 化相比，該雙特異性抗體顯示ErbB-3之内化不超過15%。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-3 及人類c-Met之二價或三價雙特異性抗體，其包含一個或 兩個特異性結合人類ErbB-3之抗原結合位點及一個特異性 結合人類c-Met之抗原結合位點。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-3 及人類c-Met之二價雙特異性抗體，其包含一個特異性結 合人類ErbB-3之抗原結合位點及一個特異性結合人類 c-Met之抗原結合位點。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-3 及人類c-Met之三價雙特異性抗體，其包含兩個特異性結 合人類ErbB-3之抗原結合位點及一個特異性結合人類 c-Met之第三抗原結合位點。 本發明之一態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類c-Met 之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-3之第一抗 原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位 點，其特徵在於
i) 該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ 147005.doc 201039851 ID NO: 53 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 54 之 CDR2H 區、及SEQ ID NO:55之CDR1H區，且在輕鏈可變結 構域中包含SEQ ID NO: 56之CDR3L區、SEQ ID NO:57之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO:58之 CDR1L 區或 8£卩1〇]^〇:59之0〇1111^區；且 該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 66 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 67 之 CDR2H 區、及SEQ ID NO: 68之CDR1H區，且在輕鏈可變結 構域中包含SEQ ID NO: 69之CDR3L區、SEQ ID NO: 70之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO: 71 之 CDR1L區； ii)該第一抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 60 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 61 之 CDR2H 區、及SEQ ID NO:62之CDR1H區，且在輕鏈可變結 構域中包含SEQ ID NO: 63之CDR3L區、SEQ ID NO:64之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO:65 之 CDR1L 區或 SEQIDNO:66iCDRlLg;a 該第二抗原結合位點在重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 66 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 67 之 CDR2H 區、及SEQ ID NO: 68之CDR1H區，且在輕鏈可變結 構域中包含SEQ ID NO: 69之CDR3L區、SEQ ID NO: 70之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO: 71 之 CDR1L區。 該雙特異性抗體之特徵較佳在於 i) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 47作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 48作為輕鏈可變結構 147005.doc 201039851 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； ii) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO·· 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 50作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； iii) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 51作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； iv) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 52作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域；或 v) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 1作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 2作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域。 該雙特異性抗體之特徵較佳在於 147005.doc -10- 201039851 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 51作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為重鏈 可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可變結構 域。 在一實施例中，本發明該雙特異性抗體之特徵在於包含 IgGl或IgG3亞類之恒·定區。 在一實施例中，本發明該雙特異性抗體之特徵在於，該 抗體在Asn297處經糖鏈糖基化，其中該糖鏈内岩藻糖之量 為65%或更低。 本發明另一態樣係編碼該雙特異性抗體鏈之核酸分子。 本發明之其他態樣係包含本發明雙特異性抗體之醫藥組 合物、該用於治療癌症之組合物，該雙特異性抗體用於製 造用於治療癌症之藥物之用途、藉由將該雙特異性抗體投 與需要治療之患者來治療患有癌症之患者之方法。 本發明抗體顯示高價值之性質，例如對表現兩種受體 <ErbB3>及<c-Met>之癌細胞生長的抑制，對患有癌症之患 者有益之抗腫瘤效能。在表現兩種受體<ErbB3>&<c-Met> 之癌細胞上，本發明雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體顯示較 其親代<ErbB3>抗體降低之内化。 【實施方式】 本發明之第一態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類 c-Met之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-3之 第一抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結 147005.doc • 11 - 201039851 合位點，其特徵在於在流式細胞計數分析中在2小時後對 A43 1細胞測量時，與該雙特異性抗體不存在下ErbB-3之内 化相比，該雙特異性抗體顯示ErbB-3之内化不超過15%。 在一個實施例中，該雙特異性抗體特異性結合人類 ErbB-3及人類c-Met，其包含特異性結合人類ErbB-3之第 一抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合 位點，其特徵在於在流式細胞計數分析中在2小時後對 A43 1細胞測量時，與該雙特異性抗體不存在下ErbB-3之内 化相比，該雙特異性抗體顯示ErbB-3之内化不超過10%。 在一個實施例中，該雙特異性抗體特異性結合人類 ErbB-3及人類c-Met，其包含特異性結合人類ErbB-3之第 一抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合 位點，其特徵在於在流式細胞計數分析中在2小時後對 A43 1細胞測量時，與該雙特異性抗體不存在下ErbB-3之内 化相比，該雙特異性抗體顯示ErbB-3之内化不超過7%。 在一個實施例中，該雙特異性抗體特異性結合人類 ErbB-3及人類c-Met，其包含特異性結合人類ErbB-3之第 一抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合 位點，其特徵在於在流式細胞計數分析中在2小時後對 A43 1細胞測量時，與該雙特異性抗體不存在下ErbB-3之内 化相比，該雙特異性抗體顯示ErbB-3之内化不超過5%。 術語「ErbB-3之内化」係指在A43 1細胞（ATCC號CRL-1555)上，相對於不存在抗體時ErbB-3之内化，由抗體誘 導之ErbB-3受體内化。該ErbB-3受體之内化係由本發明雙 147005.doc -12- 201039851 特異性抗體誘導，且係在2小時後於流式細胞計數分析 (FACS)中測量，如實例8中所述。在抗體暴露2小時後，與 不存在抗體時ErbB-3之内化相比，本發明雙特異性抗體在 A431細胞上顯示ErbB-3之内化不超過15%。在一實施例 中，該抗體顯示ErbB-3之内化不超過10%。在一實施例 中，該抗體顯示ErbB-3之内化不超過7%。在一實施例中， 該抗體顯示ErbB-3之内化不超過5%。為確定在2小時後在 A431細胞上雙特異性ErbB3/ cMet抗體所顯示ErbB-3之内 化是否為10%或更低，可在流式細胞計數分析（FACS)中將 其與下述雙特異性ErbB3/ cMet抗體MH_TvAb24進行比 較。為確定在2小時後在A431細胞上雙特異性ErbB3/ cMet 抗體所顯示ErbB-3之内化是否為5%或更低，可在流式細胞 計數分析（FACS)中將其與下述雙特異性ErbB3/ cMet抗體 MH_TvAb29進行比較。 本發明另一態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類c-Met 之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-3之第一抗 原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位 點，其特徵在於，當在2小時後於流式細胞計數分析中對 A431細胞（ATCC號CRL-1555)進行測量時，與由（相應）單 特異性親代ErbB-3抗體誘導之ErbB-3之内化相比，該雙特 異性抗體可使ErbB-3之内化降低50%或更多（在一實施例 中，降低60%或更多；在另一實施例中，降低70%或更 多；在一實施例中，降低80%或更多）。如下所述計算 ErbB-3之内化之降低（使用在2小時後於流式細胞計數分析 147005.doc -13- 201039851 中針對A431細胞之測量值）：100χ(單特異性親代ErbB-3抗 體誘導之ErbB之内化％-雙特異性ErbB-3/cMet抗體誘導之 ErbB之内化％)/單特異性親代ErbB-3抗體誘導之ErbB之内 化％。舉例而言：a)雙特異性ErbB-3/cMet抗體MH_TvAb21 顯示ErbB-3之内化為1°/❶，且單特異性親代ErbB-3抗體Mab 205顯示ErbB-3之内化為40%。因此雙特異性ErbB-3/cMet 抗體MH—TvAb21顯示ErbB-3之内化之降低為l〇〇x(40-l)/ 40%=97·5% ; b)雙特異性 ErbB-3/cMet抗體 MH_TvAb25 顯 示ErbB-3之内化為11%，且單特異性親代ErbB-3抗體Mab 205顯示ErbB-3之内化為40%。因此雙特異性ErbB-3/cMet 抗體MH_TvAb21顯示ErbB-3之内化之降低為l〇〇x(40-ll)/ 40%=72.5% ;或 c)雙特異性 ErbB-3/cMet抗體 HER3/Met_C6 顯示ErbB-3之内化為11%，且單特異性親代ErbB-3抗體 HER3純系29顯示ErbB-3之内化為54%。因此雙特異性 ErbB-3/cMet抗體HER3/Met_C6顯示ErbB-3之内化之降低為 100χ(54-6)/40ο/〇=88·9ο/〇 ° (參見實例8在2小時後於流式細胞 計數分析中針對Α43 1細胞測量之内化值）。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-3 及人類c-Met之三價雙特異性抗體，其包含兩個特異性結 合人類ErbB-3之抗原結合位點及一個特異性結合人類c-Met之第三抗原結合位點。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-3 及人類c-Met之二價雙特異性抗體，其包含特異性結合人 類ErbB-3之第一抗原結合位點及特異性結合人類c-Met之 147005.doc •14- 201039851 第二抗原結合位點。 在本發明一實施例中，該抗體係特異性結合人類ErbB-3 及人類c-Met之四價雙特異性抗體，其包含兩個特異性結 合人類ErbB-3之抗原結合位點及兩個特異性結合人類 c-Met之抗原結合位點，其中該等特異性結合人類c-Met之 抗原結合位點可抑制c-Met二聚化（例如，如WO 2009007427 中所述）。 本文所用「抗體」係指包含抗原結合位點之結合蛋白。 本文所用術語「結合位點」或「抗原結合位點」表示抗體 分子中實際結合配體且源自抗體之區域。術語「抗原結合 位點」包括抗體重鏈可變結構域（VH)及/或抗體輕鏈可變 結構域（VL)、或VH/VL對，且可源自完整抗體或抗體片 段，例如單鏈Fv、VH結構域及/或VL結構域、Fab、或 (Fab)2。在本發明之一實施例中，抗原結合位點各自包含 抗體重鏈可變結構域（VH)及/或抗體輕鏈可變結構域 (VL)，且較佳係藉由由抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體重 鏈可變結構域（VH)組成之對來形成。 除源自抗體之抗原結合位點外，結合肽（例如，如 Matzke，A.等人，Cancer Res. 65 (14) (2005)，2005 年 7 月 1 5日中所述）亦可特異性結合抗原（例如c-Met)。因此本發 明另一態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類c-Met之雙特 異性結合分子，其包含特異性結合人類ErbB-3之抗原結合 位點及特異性結合人類c-Met之結合肽。因此本發明另一 態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類c-Met之雙特異性結 147005.doc •15- 201039851 合分子’其包含特異性結合人類c-Met之抗原結合位點及 特異性結合人類ErbB-3之結合肽。
ErbB-3(亦稱作V-erb-b2成紅細胞白血病病毒同源癌基因 3(禽類）、ERBB3、HER3 ; SEQ ID NO:46)係具有神經調節 蛋白結合結構域但不具有活性激酶結構域之膜結合蛋白 (Kraus, M.H等人，Proc. Natl. Acad· Sci. xj.S a 86 (1989) 9193-7 ; Plowman, G.D.等人，Proc. Natl. Acad Sci U S A 87 (1990) 4905-9 ; Katoh，M_ #A，Bi〇chem Bi〇phyS·
Res. Commun· 192 (1993) 1189-97)。因此，其可结合此配 體但不能經由蛋白質磷酸化將信號傳遞至細胞中。然而， 其可與具有激酶活性之其他EGF受體家族成員形成異二聚 體。異二聚化作用導致引發細胞增殖或分化之途徑活化。 已報導在多種癌症中存在此基因之擴增及/或其蛋白質之 過表現，包括前列腺腫瘤、膀胱腫瘤、及乳腺腫瘤。人們 已對編碼不同亞型之替代性轉錄剪接變體進行表徵。一種 亞型缺少膜内區且在細胞外分泌。此形式用於調節膜結合 形式之活性（Corfas, G.等人，7(6) (2004) 575-80)。人們認 為，ERBB3在活化時變成受質而與ERBB1、ERBB2及 ERBB4二聚化且隨後被其磷酸化。與多種受體絡胺酸激酶 類似，ERBB3係由細胞外配體活化。已知可結合ERBB3之 配體包括神經生長因子。 特異性結合人類ErbB-3之抗原結合位點、且尤其重鏈可 變結構域（VH)及/或抗體輕鏈可變結構域（VL)可源自：a)已 知抗-ErbB-3 抗體，如（例如）WO 97/35885、WO 2007/077028 147005.doc -16 - 201039851 或WO 2008/100624中所述；b)藉由尤其使用人類ErbB-3蛋 白或其核酸或片段實施之重新免疫方法或藉由噬菌體展示 法獲得之新抗-ErbB-3抗體。 MET(間質-上皮轉型因子）係編碼蛋白MET(亦稱作 c-Met ;肝細胞生長因子受體HGFR ; HGF受體；擴散因子 受體；SF受體；SEQ ID NO:45)之原癌基因（Dean，M.等 人，Nature 3 18 (1985) 385-8 ; Chan, A.M.等人，Oncogene 1 (1987) 229-33 ; Bottaro, D.P.等人，Science 251 (1991) 802-4 ; Naldini, L.等人，EMBO J. 10 (1991) 2867-78 ; Maulik，G.等人，Cytokine Growth Factor Rev. 13 (2002) 41-59)。MET係胚胎發育及傷口癒合必需之膜受體。肝細 胞生長因子（HGF)係MET受體之唯一已知配體。MET通常 由上皮來源之細胞表現，而HGF之表現受限於間質來源之 細胞。在HGF刺激後，MET誘導若干種生物反應，其共同 引發稱作侵襲性生長之程序。癌症中之異常MET活化與預 後較差有關，其中活性異常的MET誘發腫瘤生長、形成向 腫瘤供應營養之新血管（血管發生）、及癌症向其他器官擴 散（轉移）。MET在多種類型之人類惡性腫瘤中解除調節， 包括腎癌、肝癌、胃癌、乳癌及腦癌。通常，僅幹細胞及 祖細胞表現MET，其使得該等細胞可侵襲性生長以在胚胎 中生成新組織或在成人中使受損組織再生。然而，人們認 為癌症幹細胞可劫持正常幹細胞表現MET之能力，且由此 使得癌症可持續存留並擴散至體内其他位點。 特異性結合人類c-Met之抗原結合位點、且尤其重鏈可 147005.doc -17- 201039851 變結構域（VH)及/或抗體輕鏈可變結構域（VL)可源自a)已知 抗-c-Met抗體，例如如 US 5686292、US 7476724、WO 2004072117、WO 2004108766、WO 2005016382、WO 2005063816、WO 2006015371、WO 2006104911、WO 2007126799、或 WO 2009007427 中所述）；b)藉由（例如）尤 其使用人類抗-c-Met蛋白或其核酸或片段實施之重新免疫 方法或藉由噬菌體展示法獲得之新抗-c-Met抗體。 本發明之另一態樣係選擇本發明雙特異性抗體之方法， 其包含以下步驟： a) 在2小時後，相對於不存在抗體時ErbB-3之内化，藉由 流式細胞計數分析（FACS)測量在A431細胞（ATCC號 CRL-1 555)上雙特異性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體誘導之 ErbB-3之内化； b) 在不存在抗體時，藉由流式細胞計數分析（FACS)測量 ErbB-3 在 A431細胞（ATCC 號 CRL-15 55)上之内化； c) 選擇在抗體暴露2小時後，相對於不存在抗體時ErbB-3 之内化，所顯示ErbB-3在A431細胞上之内化不超過15°/〇 之雙特異性抗體。 在一實施例中，選擇所顯示ErbB-3之内化不超過1 〇%之 雙特異性抗體。在一實施例中，選擇所顯示ErbB-3之内化 不超過7%之雙特異性抗體。在一實施例中，選擇所顯示 ErbB-3之内化不超過5%之雙特異性抗體。 本發明之另一態樣係選擇本發明雙特異性抗體之方法， 其包含以下步驟： 147005.doc -18- 201039851 a) 在2小時後，相對於不存在抗體時ErbB-3之内化，藉由 流式細胞計數分析（FACS)測量在A43 1細胞（ATCC號 CRL-1555)上雙特異性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體誘導之 ErbB-3之内化； b) 在2小時後藉由流式細胞計數分析（FACS)測量相應單特 異性抗-ErbB-3抗體誘導之ErbB-3在A43 1細胞（ATCC號 CRL-1 555)上之内化； c) 選擇可使ErbB-3之内化相對於相應單特異性親代ErbB-3 抗體誘導之ErbB-3之内化降低50%或更多之雙特異性抗 體（在2小時後針對A43 1細胞測量）。 在一實施例中，選擇可使ErbB-3之内化相對於相應單特 異性親代ErbB-3抗體誘導之ErbB-3之内化降低60%或更多 之雙特異性抗體。在一實施例中，選擇可使ErbB-3之内化 相對於相應單特異性親代ErbB-3抗體誘導之ErbB-3之内化 降低70%或更多之雙特異性抗體。在一實施例中，選擇可 使ErbB-3之内化相對於相應單特異性親代ErbB-3抗體誘導 之ErbB-3之内化降低80%或更多之雙特異性抗體。 本發明另一態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類c-Met 之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-3之第一抗 原結合位點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位 點，其特徵在於 i) 該第一抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含 SEQ ID NO: 53 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 54 之 CDR2H區、及SEQ ID NO:55之CDR1H區，且在該輕 147005.doc -19- 201039851 鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 56之CDR3L區、 SEQ ID NO:57 之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO:58 之 00尺11^區或8£()10 1<[〇:59之€0111[區；且 該弟二抗原結合位點在該重鍵可變結構域中包含 SEQ ID NO: 66 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 67 之 CDR2H區、及 SEQ ID NO: 68 之 CDR1H 區，且在該 輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO·· 69之CDR3L區、 SEQ ID NO: 70 之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO: 71 之 CDR1L 區； ii)該第一抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含 SEQ ID NO: 60 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 61 之 CDR2H區、及SEQ ID NO:62之CDR1H區，且在該輕 鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 63之CDR3L區、 SEQ ID NO:64 之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO:65 之 00尺11^區或8£()1〇]^0:66之€0111[區；且 該第二抗原結合位點在該重鍵可變結構域中包含 SEQ ID NO: 66 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 67 之 CDR2H區、及 SEQ ID NO: 68之CDR1H區，且在該 輕鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 69之CDR3L區、 SEQ ID NO: 70之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO: 71 之 CDR1L 區。 本發明另一態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類c-Met 之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-3之第一抗 原結合位點及特異性結合人類C-Met之第二抗原結合位 147005.doc • 20- 201039851 點，其特徵在於 該第一抗原結合位.點在該重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 53 之 CDR3H區、SEQ ID NO: 54之 CDR2H區、及 SEQ ID NO:55之CDR1H區，且在該輕鏈可變結構域中 包含 SEQ ID NO: 56 之 CDR3L 區、SEQ ID NO:57 之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO:58 之 CDR1L 區或 SEQ ID NO:59之 CDR1L 區；且
該第二抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含SEQ 〇 ID NO: 66之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 67之 CDR2H區、及 SEQ ID NO: 68之CDR1H區，且在該輕鏈可變結構域中 包含 SEQ ID NO: 69 之 CDR3L 區、SEQ ID NO: 70 之 CDR2L區、及 SEQ ID NO: 71 之CDR1L區。 本發明另一態樣係特異性結合人類ErbB-3及人類c-Met 之雙特異性抗體，其包含特異性結合人類ErbB-3之第一抗 原結合位點及特異性結合人類C-Met之第二抗原結合位 點，其特徵在於 Cur 該第一抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 60之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 61 之 CDR2H區、及 SEQ ID ΝΟ··62之CDR1H區，且在該輕鏈可變結構域中 包含 SEQ ID NO: 63 之 CDR3L 區、SEQ ID ΝΟ:64 之 CDR2L 區、及 SEQ ID ΝΟ:65 之 CDR1L 區或 SEQ ID NO:66之 CDR1L區；且 該第二抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 66之 CDR3H區、SEQ ID NO: 67之 CDR2H區、及 147005.doc •21- 201039851 SEQ ID NO: 68之CDR1H區，且在該輕鏈可變結構域中 包含 SEQ ID NO: 69 之 CDR3L 區、SEQ ID NO: 70 之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO: 71 之 CDR1L 區。 該雙特異性抗體之特徵較佳在於 i) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 47作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 48作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； Π)該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 5 0作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； iii) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 51作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； iv) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 5 2作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域；或 147005.doc -22- 201039851 V)該第一抗原結合位點包含SEQ ID N0: i作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NCh 2作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID N〇: 3作為 重鍵可變結構域，且包含SEQ ID N〇: 4作為輕鍵可 變結構域。 該雙特異性抗體之特徵較佳在於 該第-抗原結合位點包含SEq ID N〇: 49作為重鍵可 變結構域，且包含SEQ m 51作為輕鏈可變結構 域，且該第二抗原結合位點包含SEQ ID N〇: 3作為重鏈 可變結構域，且包含SEq ID N〇: 4作為輕鏈可變結構 域。 抗體特異性係指抗體對抗原特定表位之選擇性識別。例 如’天然抗體具有單特異性。本發明「雙特異性抗體」係 具有兩種不同抗原結合特異性之抗體。倘若抗體具有不止 一種特異性，則所識別表位可能與單一抗原或不止一種抗 Q 原相關。本發明抗體對兩種不同抗原具有特異性，即作為 第一抗原之ErbB-3及作為第二抗原之c_Met。 本文所用術語「單特異性」抗體表示具有—或多個結合 位點之抗體，該等結合位點各自結合相同抗原上之相同表 位。 本申請案所用術語「價」表示抗體分子中存在特定數量 之結合位點。因此，術語「二價」、「四價」、及「六價」 分別表不在抗體分子中存在兩個結合位點、四個結合位 點、及六個結合位點。本發明雙特異性抗體至少為「二 147005.doc -23· 201039851 價」且可為「三價」或Γ多價」（例如Γ四價」或「六 價」）。 本發明抗體之抗原結合位點可含有六個互補決定區 (CDR)，其不同程度地促進結合位點對抗原之親和力。存 在三個重鏈可變結構域CDR(CDRH1、CDRH2及CDRH3)及 三個輕鏈可變結構域CDR(CDRL1、CDRL2及CDRL3)。 CDR及框架區（FR)之範圍取決於與胺基酸序列之經編譯數 據庫的比對’其中該等區域已根據各序列間之差異加以界 定。本發明範圍内亦包含包括較少CDR(即其中結合特異 性取決於三個、四個或五個CDR)之功能性抗原結合位 點。舉例而言，不足全套6個CDR之CDR數對於結合即已 足夠。在某些情形下，VH或VL結構域即足夠。
可使用針對人類ErbB-3及人類c-Met之IgG樣雙特異性二 價抗體，其包含免疫球蛋白恆定區，如（例如）以下文獻中 所述：歐洲專利申請案第07024867.9號、歐洲專利申請案 第07024864.6號、歐洲專利申請案第07024865.3號或 Ridgway, J.B., Protein Eng. 9 (1996) 617-621 i WO 96/027011 ; Merchant, A.Μ·等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell，S.等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35及 EP 1870459A1。 本文所用術語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指 具有單一胺基酸組成之抗體分子製劑。 術語「嵌合抗體」係指包含來自一種來源或物種之可變 區（即結合區）及源自不同來源或物種之恆定區之至少一部 147005.doc -24- 201039851 分的抗體，其通常係藉由重組DNA技術來製備。包含鼠類 可變區及人類恆定區之嵌合抗體較佳。本發明所涵蓋之其 他較佳形式之「嵌合抗體」係彼等恆定區已相對於原始抗 體進行修飾或改變從而尤其在Clq結合及/或卜受體（FcR) 結合方面獲得本發明特性者。該等嵌合抗體亦稱作「種類 轉換抗體」。嵌合抗體係免疫球蛋白基因之表現產物，該 等免疫球蛋白基因包含編碼免疫球蛋白可變區之dna片段 及編碼免疫球蛋白恆定區之DNA片段。製備嵌合抗體之方 法涉及業内熟知之習用重組DNA及基因轉染技術。例如， 參見 Morrison，S.L.等人，proc. Natl. Acad Sci USA 81 (1984) 6851-6855 ; US 5,202,238及 US 5,204,244。 術s吾「人類化抗體」係指框架區或「互補決定區」 (CDR)已經修飾而包含與親代免疫球蛋白CDR相比具有不 同特異性之免疫球蛋白CDR的抗體。在一較佳實施例中， 將鼠類CDR移植入人類抗體之框架區中以製備「人類化抗 體」。例如，參見Riechmann, L.等人，Nature 332 (1988) 323-327 ;及 Neuberger, M.S.等人，Nature 314 (1985) 268· 270。尤佳CDR對應於嵌合抗體中彼等代表可識別上述抗 原之序列者。本發明所涵蓋之其他形式之「人類化抗體」 係彼等恆定區已相對於原始抗體進行額外修飾或改變從而 尤其在Clq結合及/或以受體（FcR)結合方面獲得本發明特 性者。 本文所用術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類種系 免疫球蛋白序列之可變區及恆定區之抗體。人類抗體已為 147005.doc -25- 201039851 €别業内所熟知（¥311〇4]<；,]^.八.及¥311(16\\^111<；61,1.〇.， CuiT· 〇Pin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374)。亦可在轉基因 動物（例如小鼠）中產生人類抗體，該等轉基因動物在免疫 後能在不產生内源免疫球蛋白之情況下產生全譜系之人類 抗體或所選人類抗體。將人類種系免疫球蛋白基因陣列轉 移至該等種系之突變小鼠中使得可在抗原激發後產生人類 抗體（例如’參見Jakobovits, A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555 ; Jakobovits，A.等人， Nature 362 (1993) 255-258 ; Brtiggemann, M.等人，Year Immunol. 7 (1993) 33-40)。人類抗體亦可在噬菌體展示文 庫中產生（Hoogenboom，H.R.及 Winter, G.J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 ; Marks，J.D·等人，J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597)。亦可使用 Cole，A.等人及 Boerner, P.等人 之技術來製備人類單株抗體（Cole，Α·等人，M〇nocl〇nal
Antibodies and Cancer Therapy，Liss，A.L.，第 77 頁 (1985);及 Boerner，P.等人 ’ j. Imrnunol· 147 (1991) 86_ 95)。如已提及之本發明嵌合及人類化抗體，本文所用術 語「人類抗體」亦包含該等恆定區中經修飾從而尤其在 Clq結合及/或FcR結合方面獲得本發明特性之抗體，例如 藉由「種類轉換」來修飾，即，使Fc部分發生改變或突變 (例如自IgGl變為IgG4及/或IgGl/IgG4突變）。 本文所用術語「重組人類抗體」意欲包括所有藉由重組 方式製備、表現、產生或分離之人類抗體，例如自諸如 NS0或CHO細胞等宿主細胞或自人類免疫球蛋白基因之轉 147005.doc •26· 201039851 基因動物（例如小鼠）分離之抗體、或使用轉染至宿主細胞 中之重組表現載體表現之抗體。該等重組人類抗體具有呈 重排开> 式之可變及恆定區。本發明之重組人類抗體已發生 體内體細胞超突變。因此，重组抗體之乂11及VL區之胺基 酸序列雖然源自人類種系VH及VL序列且與之相關，但並 非天然存在於活體内人類抗體種系譜中。 本文所用「可變結構域」（輕鏈可變結構域（VL)、重鍵 可變區（VH))表示直接參與抗體與抗原結合之輕鏈及重鏈 對中之每一者。人類輕鏈及重鏈可變結構域具有相同通用 結構，且每一結構域包含四個序列高度保守之框架區 (FR) ’其經由三個「超變區」（或互補決定區，cdR)連 接。框架區採用β-摺疊構象且CDR可形成連接0_摺疊結構 之環。各鏈中之CDR藉由框架區來保持其三維結構，並與 另一鏈中之CDR—起形成抗原結合位點。抗體重鏈及輕鏈 之CDR3區在本發明抗體之結合特異性/親和性方面具有特 別重要之作用’且由此提供本發明之又一目的。 本文所用術語「超變區」或「抗體之抗原結合部分或抗 原結合位點」係指抗體中負責與抗原結合之胺基酸殘基。 超變區包含來自「互補決定區」或r CDR」之胺基酸殘 基。「框架」或「FR」區係彼等除本文所定義超變區殘基 以外的可變結構域區。因此’抗體之輕鏈及重鏈自N_末端 至C-末端包含結構域fri、CDR1、FR2、CDR2、FR3、 CDR3及FR4。各鏈上之CDr係藉由該等框架胺基酸來間 隔。具體而言，重鏈之CDR3係對抗原結合作用最大之區 147005.doc 27- 201039851 域。CDR及 FR區係根據 Kabat 等人（Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，MD. (1991))之標 準定義來確定。 本文所用術語「結合」或「特異性結合」係指在體外分 析中抗體與抗原（人類ErbB-3或人類c-Met)表位之結合，較 佳係在電衆共振分析（BIAcore，GE-Healthcare Uppsala, Sweden)中與純化野生型抗原之結合。結合親和力定義為 術語ka(抗體/抗原複合物中抗體結合之速率常數）、kD(解 離常數）及KD (kD/ka)。結合或特異性結合意指結合親和力 (KD)為 10_8 mol/1或更低，較佳為 10_9 Μ至 10_13 mol/1。因 此，本發明雙特異性<ErbBl-c-Met>抗體以10_8 mol/1或更 低、較佳1(Τ9 Μ至10_13 mol/1之親和力（KD)與各特異性抗原 特異性結合。 可藉由 BIAcore分析（GE-Healthcare Uppsala, Sweden)來 研究抗體與FcyRIII之結合。結合親和力定義為術語ka(抗 體/抗原複合物中抗體結合之速率常數）、kD(解離常數）及 KD (kD/ka)。 術語「表位」包括能特異性結合抗體之任何多肽決定 簇。在某些實施例中，表位決定簇包括分子之化學活性表 面基團，例如胺基酸、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基，且在 某些實施例中可具有特定的三維結構特徵及/或比電荷特 徵。表位係抗原中結合抗體之區域。 在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或高分子複合混 147005.doc -28- 201039851 合物中優先識別某抗原時，認為該抗體可特異性結合其靶 抗原。 本申請案中所用術語「恆定區」表示抗體中除可變區以 外之結構域的總和。恆定區並非直接參與抗原結合，而是 表現出各種效應子功能。端視抗體重鏈恆定區之胺基酸序 列’可將抗體分為以下幾類：IgA、IgD、igE、igG及 IgM，且其中若干種類可進一步分為多個亞類，例如 〇 IgG1、砂2、邮3及IgG4、IgAl及IgA2。對應於不同抗 體種類之重鍵恆疋區分別稱作α、δ、ε、及μ。在所有五 種抗體種類中可發現之輕鏈恆定區稱作K (kappa)及λ (lambda)。 本申請案中所用術語「得自人類來源之恆定區」表示 IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類人類抗體之重鏈恆定區及/ 或輕鏈κ或λ恆定區。該等恆定區為當前業内所熟知且由 (例如）Kabat，Ε.Α.所闡述（例如，參見j〇hnson，g.及wu， Q Τ·Τ. » Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 ； Rabat, E.A. 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788)。 在一實施例中，本發明雙特異性抗體包含IgG i或igG3亞 類（較佳為IgGl亞類）之恆定區，其較佳得自人類來源。在 一實施例中，本發明雙特異性抗體包含IgG 1或igG3亞類 (較佳為IgG 1亞類）之Fc部分，其較佳得自人類來源。 抗體恆定區直接參與ADCC(抗體依賴性細胞介導細胞毒 性）及CDC(補體依賴性細胞毒性）。補體活化（CDC)係藉由 使補體因子C1 q與大多數IgG抗體亞類之恒定區結合來起 147005.doc -29- 201039851 始。Clq與抗體之結合係藉由在所謂的結合位點實施所定 義之蛋白質間交互作用來引發。該等恆定區結合位點為當 前業内所知且闡述於（例如）以下文獻中：Lukas，T., J.等 人，J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560 ； Brunhouse, R_及 Cebra, J., J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917 ； Burton, D.R.等人，Nature 288 (1980) 338-344 ; Thommesen，J·，E. 等人，Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004 ; Idusogie, E·，E. 等人，J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184 ; Hezareh，M.等 人，J· Virol. 75 (2001) 12161-12168 ; Morgan, A.等人， Immunology 86 (1995) 319-3 24 ;及 EP 0 3 07 434 ° 該等恆 定區結合位點之特徵在於（例如）胺基酸L234、L23 5、 D270、N297、E318、K320、K322 > P331 及 P329(根據 Kabat之EU索引來編號）。 術語「抗體依賴性細胞毒性（ADCC)」係指人類靶細胞 在效應子細胞存在下由本發明抗體溶解。較佳在效應子細 胞存在下藉由用本發明抗體處理ErB-3及c-Met表現細胞之 製劑來測量ADCC，該等效應子細胞例如剛分離之PBMC 或自血沉棕黃層純化之效應子細胞，例如單核細胞或天然 殺傷（NK)細胞或持久生長NK細胞系。術語「補體依賴性 細胞毒性（CDC)」表示藉由使補體因子Clq與大部分IgG抗 體亞類之Fc部分結合來起始之過程。Clq與抗體之結合係 藉由在所謂的結合位點實施所定義之蛋白質間交互作用來 引發。該等Fc部分結合位點為當前業内已知（參見上文）。 該等Fc部分結合位點之特徵在於（例如）胺基酸L234、 147005.doc -30- 201039851 L235 、 D270 、 N297 、 E318 、 K320 、 K322 、 P331 、及 P329(根據Kabat之EU索引來編號）。IgGl、IgG2及IgG3亞 類抗體通常顯示包括Clq及C3結合在内之補體活化，而 IgG4不活化補體系統且不結合Clq及/或C3。 單株抗體之細胞介導效應子功能可藉由改造其寡糖組份 來增強，如Umana，P·等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ;及US 6,602,684所述。IgGl型抗體係最常用治療 性抗體，其為在各CH2結構域中之Asn297處具有保守N-連 〇 V 接糖基化位點之糖蛋白。與Asn297附接之兩種複雜二天線 (biantennary)寡糖包埋於CH2結構域之間，與多肽骨架形 成廣泛接觸，且其存在為抗體介導諸如抗體依賴性細胞毒 性（ADCC)等效應子功能所必需（Lifely，M. R.等人， Glycobiology 5 (1995) 813-822 ; Jefferis，R.等人，
Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76 ; Wright，A.及 Morrison, S. L.，Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32)。Umana, P.等 人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180及 WO 99/54342 顯示，中國倉鼠卵巢（CHO)細胞中β(1，4)-Ν-乙醯葡糖胺基 轉移酶III (「GnTIII」）（一種催化形成二等分型（bisected) 募糖之糖基轉移酶）之過表現可顯著提高抗體之活體外 ADCC活性。Asn297碳水化合物組成中之改變或其消除亦 影響與FcyR及Clq之結合（Umana, Ρ·等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ; Davies, J.等人，81〇16。]111〇1· Bioeng. 74 (2001) 288-294 ; Mimura，Y.
Chem. 276 (2001) 45539-45547 ; Radaev，S.等人，J. Biol. 147005.doc -31 - 201039851
Chem. 276 (2001) 16478-16483 ; Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604 ; Shields, R.L.等人，J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740 ； Simmons, L.C.等 人，J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147) 〇 藉由減少岩藻糖之量來增強單株抗體之細胞介導效應子 功能之方法闡述於（例如）以下文獻中：WO 2005/018572、 WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、 WO 2005/01 1735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、 US 2006/0134709 ' US 2005/0054048 ' US 2005/0152894 ' WO 2003/035835、WO 2000/061739 ; Niwa，R.等人，J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 ; Shinkawa, T.等 人，J Biol Chem，278 (2003) 3466-3473 ; WO 03/055993 或 US 2005/0249722 ° 令人驚訝的是，本發明雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體顯 示ErbB-3受體之内化相對於其親代<ErbB3>及/或 抗體顯著降低。（參見圖1 8、實例8及表）。因此，在本發明 一較佳實施例中，雙特異性抗體在Asn297處經糖鏈糖基化 (IgGl或IgG3亞類），其中該糖鏈内岩藻糖之量為65°/。或更 低（根據Kabat進行編號）。在另一實施例中，該糖鍵内岩藻 糖之量介於5%與65%之間，較佳介於20%與40%之間。本 發明「Asn297」意指大致位於Fc區中297位之胺基酸天冬 醯胺。基於抗體間之較小序列差異，Asn297亦可位於297 位上游或下游之數個胺基酸（通常不超過士3個胺基酸）處， 即介於294位與3 00位之間。該等經糖改造抗體在本文中亦 147005.doc •32- 201039851 稱作非岩藻糖化抗體。 人類IgGl或IgG3之糖基化發生在Asn297處，其為核心岩 藻糖化二天線複雜寡糖糖基化形式，末端為最多2個Gal殘 基。人類IgGl或IgG3亞類之重鏈恆定區詳細報導於以下文 獻中：Kabat, Ε·Α·等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD· (1991);及 Bruggemann, M.等人，J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361 ; Love, T.W.等人，Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527。該等結構端視末端Gal殘基之量命名為GO、G1 (a-1,6-或 a-1,3-)或 G2 聚糖殘基（Raju, T.S., Bioprocess Int.l (2003) 44-53)。抗體Fc部分之CHO類糖基化闡述於（例如）Routier, F.H·，Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207中。以重組方式 在未經糖基修飾之CHO宿主細胞中表現之抗體通常在 Asn297處以至少85%之比例經岩藻糖化。全長親代抗體之 經修飾寡糖可為雜合寡糖或複雜寡糖。二等分型、經還原/ 未岩藻糖化寡糖較佳為雜合寡糖。在另一實施例中，二等 分型、經還原/未岩藻糖化寡糖為複雜寡糖。 本發明「岩藻糖之量」意指在Asn297處之糖鏈内，該糖 相對於附接至Asn297之所有糖結構（例如複雜結構、雜合 體結構及高甘露糖結構）之總和之量，其係藉由MALDI-TOF質譜法來測量且計算為平均值。岩藻糖之相對量係含 岩藻糖結構相對於N-糖苷酶F處理樣品中所有確定糖結構 (分別例如複雜結構、雜合體結構及寡-及高-甘露糖結構） 147005.doc •33· 201039851 之百分比（確定岩藻糖之量之詳細程序參見實例14)。 本發明非岩藻糖化雙特異性抗體可在經糖基修飾之宿主 細胞中表現，該宿主細胞經改造以表現至少一種編碼具有 GnTIII活性之多肽之核酸，該多肽之量足以部分岩藻糖化 Fc區中之寡糖。在一實施例中，該具有GnTIII活性之多肽 係融合多肽。或者，根據US 6,946,292，可降低或消除宿 主細胞之αΐ，6-岩藻糖基轉移酶活性以生成經糖基修飾之宿 主細胞。可預先確定抗體岩藻糖化之程度，例如藉由發酵 條件（例如發酵時間）或藉由至少兩種具有不同岩藻糖化程 度之抗體之組合來確定。該等非岩藻糖化抗體及相應糖基 改造方法闡述於以下文獻中：WO 2005/044859、WO 2004/065540、W02007/031875、Umana，P.等人（Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180)、WO 99/154342、WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 97/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/03 5 83 5、WO 2000/061 739 〇該等糖改造抗體具有增 強之ADCC。其他產生本發明非岩藻糖化抗體之糖基改造 方法闡述於（例如）以下文獻中：Niwa, R.等人，J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160 ； Shinkawa, T.等 人，J Biol Chem，278 (2003) 3466-3473 ; WO 03/055993 或 US 2005/0249722 ° 一實施例係製備在Asn297處經糖鏈糖基化之IgGl或IgG3 亞類雙特異性抗體之方法，其中岩藻糖在該糖鏈内之量為 147005.doc -34- 201039851 65%或更低，且使用以下文獻中所述之程序：WO 2005/044859 ' WO 2004/065540 > W02007/031875 ；
Umana，P.等人，Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180 ; WO 99/154342 ' WO 2005/018572 ' WO 2006/116260 ' WO 2006/114700、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 97/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835 或 WO 2000/061739。
一實施例係製備在Asn297處經糖鏈糖基化之IgGl或IgG3 亞類雙特異性抗體之方法，其中岩藻糖在該糖鏈内之量為 65%或更低，且使用以下文獻中所述之程序：Niwa, R.等 人，J. Immunol. Methods 3 06 (2005) 151-160 ； Shinkawa, Τ·等人，J Biol Chem，278 (2003) 3466-3473 ; WO 03/055993或 US 2005/0249722 ° 雙特異性抗體形式 本發明抗體具有兩個或更多個結合位點且為雙特異性。 亦即，抗體甚至在具有兩個以上結合位點（即抗體為三價 或多價）之情形下亦可為雙特異性。本發明雙特異性抗體 包括（例如）多價單鏈抗體、雙鏈抗體及三鏈抗體、以及具 有全長抗體恆定結構域結構之抗體，該結構經由一或多個 肽連接體連接其他抗原結合位點（例如單鏈Fv、VH結構域 及/或VL結構域、Fab、或（Fab)2)。抗體可為來自單一物種 之全長抗體，或為嵌合抗體或人類化抗體。對於具有兩個 以上抗原結合位點之抗體而言，某些結合位點可相同，只 要該蛋白具有針對兩個不同抗原之結合位點即可。亦即， 147005.doc -35· 201039851 若第一結合位點對ErbB-3具有特異性，則第二結合位點對 c-Met具有特異性，且反之亦然。 在一較佳實施例中，特異性結合人類ErbB-3及人類 c-Met之本發明雙特異性抗體包含抗體之Fc區。此一抗體 保留之特性，此意指。在一實施例中，全長抗體 二價雙特異性形式
可使用針對人類ErbB-3及人類c-Met且包含免疫球蛋白 恆定區之雙特異性二價抗體，如（例如）以下文獻中所述： WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253 或 Ridgway, J.B. 5 Protein Eng. 9 (1996) 617-621 ； WO 96/027011 ; Merchant, A.M.等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell, S.等人，J. Mol. Biol· 270 (1997) 26-35及 EP 1870 459A1。 因此，在本發明一實施例中，本發明雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體係二價雙特異性抗體，其包含： a) 全長抗體中特異性結合人類ErbB-3之輕鏈及重鏈；及 b) 全長抗體中特異性結合人類c-Met之輕鏈及重鏈， 其中恆定結構域CL及CH1、及/或可變結構域VL及VH可 彼此替代。 在本發明另一實施例中，本發明雙特異性<ErbB-3-c-Met>抗體係二價雙特異性抗體，其包含： a) 全長抗體中特異性結合人類c-Met之輕鏈及重鏈；及 b) 全長抗體中特異性結合人類ErbB-3之輕鏈及重鏈， 其中恆定結構域CL及CH1、及/或可變結構域VL及VH可 147005.doc -36- 201039851 彼此替代。 下文所述「隆凸-孔洞結合（kn〇b-into-hole)」技術之實 例性示意性結構參見圖2a-c。 為改良該等異二聚二價雙特異性抗_ErbB_3/抗_c_Met抗 體之產率’可藉由「隆凸·孔洞結合」技術來改變該全長 抗體之CH3結構域，該技術以若干個實例詳細闡述於（例 如）以下文獻中：WO 96/027011 ; Ridgway，J.B.等人， Protein Eng 9 (1996) 617-621 ;及 Merchant，A.M.等人， Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681。在此方法中，兩個 CH3 結構域之交互作用表面經改變以增強含有該兩個CH3結構 域之兩條重鏈之異二聚化作用。兩個CH3結構域（兩條重鏈 中）之母一者皆可為「隆凸」，而另一者為「孔洞」。引入 二硫橋可穩定異二聚體（Merchant，A.M.等人，Nature
Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell，S.等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)並提高產率。 因此在本發明一態樣中，該二價雙特異性抗體之特徵另 外在於： 一條重鏈之CH3結構域及另一條重鏈之CH3結構域各自 在包含抗體CH3結構域間之初始介面之介面處相遇； 其中該介面經改變以促進二價雙特異性抗體之形成，其 中該改變之特徵在於： a)—條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在二價雙特異性抗體内，在遇到一條重鏈之 CH3結構域之初始介面的另一條重鏈之ch3結構域的初始 147005.doc •37- 201039851 介面内， 胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替代，從 而在一條重鏈之CH3結構域之介面内生成突出物，其可定 位於另一條重鏈之CH3結構域之介面内的腔中， 及 b)另一條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在二價雙特異性抗體内，在遇到第一 CH3結構 域之初始介面的第二CH3結構域之初始介面内， 胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替代，由 此在第二CH3結構域之介面内生成腔，其中可定位第一 CH3結構域之介面内之突出物。 該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：精胺酸（R)、苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸 (W)。 該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：丙胺酸（A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)。 在本發明一態樣中，兩個CH3結構域進一步發生以下改 變：在各CH3結構域之相應位置引入半胱胺酸（C)作為胺基 酸，從而可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。 在一較佳實施例中，該二價雙特異性抗體在「隆凸鏈」 之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含T366S、L368A、Y407V突變。亦可藉由（例如） 在「隆凸鏈」之CH3結構域中引入Y349C突變且在「孔洞 鏈」之CH3結構域中引入E356C突變或S354C突變來使用 147005.doc -38- 201039851 CH3結構域之間之另一鏈間二硫橋（Merchant, A.M.等人， Nature Biotech 16 (1998) 677-681)。因此在另一較佳實施 例中，該二價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中 包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者 中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突變；或該二價雙 特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S354C、T366S、L368A、Y407V突變（一個 CH3結構域中之 額外Y349C突變與另一 CH3結構域中之額外E356C或S354C 突變形成鏈間二硫橋）（始終根據Kabat之EU索引來編號）。 但或者或另外，亦可使用其他隆凸-孔洞結合技術，如EP 187045 9A1所述。該二價雙特異性抗體之較佳實例係：在 「隆凸鏈」之CH3結構域中具有R409D ; K370E突變且在 「孔洞鏈」之CH3結構域中具有D399K ; E357K突變（始終 根據Kabat之EU索引來編號）。 在另一較佳實施例中，該二價雙特異性抗體在「隆凸 鏈」之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之 CH3結構域中包含T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 在另一較佳實施例中，該二價雙特異性抗體在兩個CH3 結構域中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3 結構域中之另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V 突變；或該二價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者 147005.doc -39- 201039851 中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一 者中包含S3 54C、T3 66S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 所表現且純化之呈表5及圖7中所示形式之二價雙特異性 抗體之實例闡述於以下實例中（例如，參見表5及圖7)。 三價雙特異性形式 本發明之另一較佳態樣係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-3且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鍵組成之全長抗體；及 b) —個特異性結合人類c-Met之單鏈Fab片段， 其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體重鏈或輕 鏈C-或N-末端之肽連接物與該全長抗體融合。 下文所述「隆凸-孔洞結合」技術之實例性示意性結構 參見圖5a。 本發明之另一較佳態樣係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-3且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鍵組成之全長抗體；及 b) —個特異性結合人類c-Met之單鏈Fv片段， 其中該b)中之單鏈Fv片段經由該a)中之全長抗體重鏈或 輕鏈C-或N-末端之肽連接物與該全長抗體融合。 下文所述「隆凸-孔洞結合」技術之實例性示意性結構 參見圖5b。 相應地表現並純化表1中具有scFv-Ab命名之對應三價雙 147005.doc -40- 201039851 特異性抗體（參見下文實例）。 在一較佳實施例中，該結合人類c-Met之單鏈Fab或Fv片 段經由該全長抗體重鏈C -末端之肽連接物與該全長抗體融 合〇 本發明之另一較佳態樣係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-3且由兩個抗體重鏈及兩個抗體 輕鏈組成之全長抗體； b) 由以下組成之多狀： ba) 抗體重鏈可變結構域（VH);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 (CH1)， 其中δ亥多肽以該vh結構域之N-末端經由肽連接物與 該全長抗體兩條重鏈中一條之C_末端融合； c) 由以下組成之多肽·· ca)抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 Q cb)抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 (CL); 其中該多肽以該VL結構域之N-末端經由肽連接物與 該全長抗體兩條重鏈中另一條之C-末端融合； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該c) 中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL) —起形成特異性 結合人類c-Met之抗原結合位點。 該等b)及c)中之肽連接物較佳相同且為具有至少25個胺 基酸、較佳介於30與50個胺基酸之間之肽。 147005.doc -41· 201039851 實例性示意性結構參見圖3a_c。 相應地表現並純化表4中具有VHVL-Ab命名之對應三價 雙特異性抗體（參見下文實例及圖3c)。 視需要藉由在以下位置之間引入二硫鍵經由鏈間二硫橋來 連接及穩定該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該 e)中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL): 1)重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域100位， η)重鏈可變結構域105位與輕鏈可變結構域43位，或 iii)重鏈可變結構域101位與輕鏈可變結構域1〇〇位（始終根 據Kabat之EU索引來編號）。 引入非天然二硫橋來進行穩定之技術閣述於（例如）以下 文獻中：WO 94/029350、Rajagopal等人，Pr〇t Origin. (1997) 1453-59 ; Kobayashi, Η.等人，Nuclear Medicine & Biology，第 25 卷 ’（1998) 387-393;或 Schmidt, M.等人，
Oncogene (1999) 18 1711-1721。在一實施例中，b)&c)中 之多肽之可變結構域之間的可選二硫鍵介於重鏈可變結構 域44位與輕鏈可變結構域1 〇〇位之間。在一實施例中，b) 及c)中之多狀之可變結構域之間的可選二硫鍵介於重鍵可 變結構域105位與輕鏈可變結構域43位之間（始終根據 Kabat之EU索引來編號）。在一實施例中，在單鏈Fab片段 之可變結構域VH與VL之間未經該可選二硫鍵穩定之三價 雙特異性抗體較佳。 藉由融合單鏈Fab、Fv片段與重鏈中之一者（圖5&或5b) 或藉由融合不同多肽與全長抗體之兩個重鏈（圖3a-c)，獲 147005.doc -42· 201039851 得異二聚三價雙特異性抗體。為改良該等異二聚三價雙特 異性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗體之產率，可藉由「隆凸-孔洞 結合」技術來改變該全長抗體之CH3結構域’該技術以若 干個實例詳細闡述於（例如）以下文獻中：wo 96/027011 ; Ridgway，J.B·等人，Protein Eng 9 (1996) 617-621 ;及 Merchant, A.Μ·等人，Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681。 在此方法中，兩個CH3結構域之交互作用表面經改變以增 強含有該兩個CH3結構域之兩條重鏈之異二聚化作用。兩 個CH3結構域（兩條重鏈中）之每一者皆可為「隆凸」，而另 一者為「孔洞」。引入二硫橋可穩定異二聚體（Merchant， Α·Μ·等人，Nature Biotech 16 (1998) 677-681 ; Atwell，S· 等人，J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)並提高產率。 因此在本發明一態樣中，該三價雙特異性抗體之特徵另 外在於 全長抗體中一條重鏈之CH3結構域及全長抗體中另一條 重鏈之CH3結構域各自在包含抗體CH3結構域之間之初始 介面的介面處相遇； 其中該介面經改變以促進二價雙特異性抗體之形成，其 中該改變之特徵在於： a)—條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在二價雙特異性抗體内，在遇到一條重鏈之 CH3結構域之初始介面的另一條重鏈之CH3結構域的初始 介面内， 胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基替代，從 147005.doc •43- 201039851 而在一條重鏈之CH3結構域之介面内生成突出物，其可定 位於另一條重鏈之CH3結構域之介面内的腔中， 及 b)另一條重鏈之CH3結構域經改變， 從而使得在三價雙特異性抗體内，在遇到第一 CH3結構 域之初始介面的第二CH3結構域之初始介面内， 胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基替代，由 此在第二CH3結構域之介面内生成腔，其中可定位第一 CH3結構域之介面内之突出物。 該具有較大側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：精胺酸（R)、苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸 (W)。 該具有較小側鏈體積之胺基酸殘基較佳選自由以下組成 之群：丙胺酸（A)、絲胺酸（S)、蘇胺酸（T)、纈胺酸（V)。 在本發明一態樣中，兩個CH3結構域進一步發生以下改 變：在各CH3結構域之相應位置引入半胱胺酸（C)作為胺基 酸，從而可在兩個CH3結構域之間形成二硫橋。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在「隆凸鏈」 之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含T366S、L368A、Y407V突變。亦可藉由（例如） 在「隆凸鏈」之CH3結構域中引入Y349C突變且在「孔洞 鏈」之CH3結構域中引入E356C突變或S354C突變來使用 CH3結構域之間之另一鏈間二硫橋（Merchant, A.M.等人， Nature Biotech 16 (1998) 677-681)。因此在另一較佳實施 147005.doc -44- 201039851 例中，該三價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中 包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者 中包含E356C、T366S、L368A、Y407V突變；或該三價雙 特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S354C、T366S、L368A、Y407V 突變（一個 CH3 結構域中之 額外Y349C突變與另一 CH3結構域中之額外E356C或S354C 突變形成鏈間二硫橋）（始終根據Kabat之EU索引來編號）。 但或者或另外，亦可使用其他隆凸-孔洞結合技術，如EP 1870459A1所述。該三價雙特異性抗體之較佳實例係：在 「隆凸鏈」之CH3結構域中具有R409D ; K3 70E突變且在 「孔洞鏈」之CH3結構域中具有D399K ; E357K突變（始終 根據Kabat之EU索引來編號）》 在另一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在「隆凸 鏈」之CH3結構域中包含T366W突變且在「孔洞鏈」之 CH3結構域中包含T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 「隆凸鏈」之CH3結構域中包含R409D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 在另一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體在兩個CH3 結構域中之一者中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3 結構域中之另一者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V 突變；或該三價雙特異性抗體在兩個CH3結構域中之一者 中包含Y349C、T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一 者中包含S354C、T366S、L368A、Y407V突變，且另外在 147005.doc -45- 201039851 隆凸鏈」之CH3結構域中包含R4〇9D ; K370E突變並在 「孔洞鏈」之CH3結構域中包含D399K ; E357K突變。 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-3且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個抗體重鏈，其在N_末端至c_末端方向上由以下 組成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域 1(CH1)、抗體鉸鏈區（hr)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (ch3);及 ab) 兩個抗體輕鏈，其在N_末端至c末端方向上由以下 組成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構 域（CL) (VL-CL);及 b) —個特異性結合人類c_Met之單鏈Fab片段， 其中該單鏈Fab片段係由抗體重鏈可變結構域（VH)及抗 體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕鏈可變結構域（VL) '抗體 輕鏈怪定結構域（CL)及連接體組成，且其中該等抗體結 構域及該連接體在N-末端至C-末端方向上具有以下順序 中之一種： ba)VH-CHl-連接體-VL-CL，或 bb) VL-CL-連接體-VH- CH1 ； 其中该連接體係具有至少30個胺基酸、較佳具有介於32 與50個之間之胺基酸的肽； 且其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 或輕鏈C-或N-末端（較佳位於重鏈C_末端）之肽連接物與該 全長抗體融合； 147005.doc -46- 201039851 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具有介於 10與50個之間之胺基酸之肽。 在此實施例中，三價雙特異性抗體較佳在兩個CH3結構 域中之一者中包含T366W突變且在兩個CH3結構域中之另 一者中包含T366S、L368A、Y407V突變，且該三價雙特 異性抗體更佳在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S354C(或 E3 56C)、T366S、L3 68A、Y407V 突變。在該實 施例中，三價雙特異性抗體視需要在「隆凸鏈」之CH3結 構域中包含R409D ; K370E突變並在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含D399K ; E357K突變。 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-3且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個抗體重鏈，其在N-末端至C-末端方向上由以下 組成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域 1(CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab) 兩個抗體輕鏈，其在N-末端至C-末端方向上由以下 組成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構 域（CL)(VL-CL);及 b) —個特異性結合人類c-Met之單鏈Fv片段， 其中該b)中之單鏈Fv片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 或輕鏈C-或N-末端（較佳位於重鏈C-末端）之肽連接物與 該全長抗體融合；且 147005.doc -47- 201039851 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具有介於 10與50個之間之胺基酸之肽。 在此實施例中，三價雙特異性抗體較佳在兩個CH3結構 域中之一者中包含T366W突變且在兩個CH3結構域中之另 一者中包含T366S、L368A、Y407V突變，且該三價雙特 異性抗體更佳在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S3 54C(或 E3 56C)、T366S、L3 68A、Y407V 突變。在該實 施例中，三價雙特異性抗體視需要在「隆凸鏈」之CH3結 構域中包含R409D ; K370E突變並在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含D399K ; E357K突變。 因此一較佳實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB-3且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個抗體重鏈，其在N-末端至C-末端方向上由以下 組成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域 1(CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab) 兩個抗體輕鏈，其在N-末端至C-末端方向上由以下 組成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構 域（CL)(VL-CL);及 b) —個特異性結合人類c-Met之單鏈Fv片段， 其中該b)中之單鏈Fv片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 C-末端之肽連接物與該全長抗體融合（產生兩個抗體重 鏈-單鏈Fv融合肽）；且 147005.doc -48- 201039851 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸之肽。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ IDNO:26作為第一抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，包含多肽SEQ ID NO:27作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，且包含SEQ ID NO:28之兩條抗體輕鏈。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ IDNO:29作為第一抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，包含多肽SEQ ID NO:30作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，且包含SEQ O ID NO:31之兩條抗體輕鏈。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ IDNO:32作為第一抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，包含多肽SEQ ID NO:33作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，且包含SEQ IDNO:34之兩條抗體輕鏈。
在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ
IDNO:35作為第一抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，包含多肽SEQ
_ ID NO:36作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，且包含SEQ ❹ ID NO:3 7之兩條抗體輕鏈。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ IDNO:38作為第一抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，包含多肽SEQ ID NO:39作為第二抗體重鏈-單鏈Fv融合肽，且包含SEQ ID NO:40之兩條抗體輕鏈。 本發明之另一實施例係三價雙特異性抗體，其包含 a)特異性結合人類ErbB-3且由以下組成之全長抗體： aa)兩個抗體重鏈，其在N-末端至C-末端方向上由以下 147005.doc -49- 201039851 組成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結構域 1(CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (CH3);及 ab)兩個抗體輕鏈，其在N_末端至c_末端方向上由以下 組成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定結構 域（CL);及 b) 由以下組成之多肽： ba) 抗體重鏈可變結構域（VH);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 〇 (CH1)， 其中該多肽以該VH結構域之N-末端經由肽連接物與該 全長抗體兩條重鏈中一條之C —末端融合（產生抗體重鏈-VH融合肽）’其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、 較佳具有介於25與50個之間之胺基酸之肽； c) 由以下組成之多肽： ea)抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb)抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域❹ (CL); 其中該多肽以該VL結構域之N_末端經由肽連接物與該 全長抗體兩條重鏈中另一條之C—末端融合（產生抗體重 鏈-VL融合肽）； 其中該肽連接物與b)中之肽連接物相同； 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該c)中 之多肽之抗體輕鏈可變結構域（V L) 一起形成特異性結合 147005.doc -50- 201039851 人類c-Met之抗原結合位點。 在此實施例中，三價雙特異性抗體較佳在兩個CH3結構 域中之一者中包含T366W突變且在兩個CH3結構域中之另 一者中包含T366S、L368A、Y407V突變，且該三價雙特 異性抗體更佳在兩個CH3結構域中之一者中包含Y349C、 T366W突變且在兩個CH3結構域中之另一者中包含 S354C(或 E356C)、T366S、L368A、Y407V 突變。在該實 施例中，三價雙特異性抗體視需要在「隆凸鏈」之CH3結 〇 ^ 構域中包含R409D ; K370E突變並在「孔洞鏈」之CH3結 構域中包含D399K ; E357K突變。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ ID ΝΟ:11作為抗體重鏈-VH融合肽，且包含多肽SEQ ID NO:12作為抗體重鏈-VL融合肽，且包含SEQ ID NO:13之 兩條抗體輕鏈。
在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ
^ ID NO:14作為抗體重鏈-VH融合肽，且包含多肽SEQ ID 〇 NO:15作為抗體重鏈-VL融合肽，且包含SEQ ID NO:16之 兩條抗體輕鍵。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ ID NO:17作為抗體重鏈-VH融合肽，且包含多肽SEQ ID NO:18作為抗體重鏈-VL融合肽，且包含SEQ ID NO:19之 兩條抗體輕鏈。
在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ ID NO:20作為抗體重鏈-VH融合肽，且包含多肽SEQ ID 147005.doc -51- 201039851 NO:21作為抗體重鏈-VL融合肽，且包含SEQ ID NO:22之 兩條抗體輕鍵。 在一較佳實施例中，該三價雙特異性抗體包含多肽SEQ ID NO:23作為抗體重鏈-VH融合肽，且包含多肽SEQ ID NO:24作為抗體重鏈-VL融合肽，且包含SEQ ID NO:25之 兩條抗體輕鏈。 在本發明另一態樣中，本發明三價雙特異性抗體包含 a) 結合人類ErbB-3且由兩個抗體重鏈VH-CH1-HR-CH2-CH3及兩個抗體輕鏈VL-CL組成之全長抗體； (其中兩個CH3結構域中之一者較佳包含Y349C、 T366W突變且兩個CH3結構域中之另一者包含 S354C(或 E356C)、T366S、L368A、Y407V突變）； b) 由以下組成之多肽： ba) 抗體重鏈可變結構域（VH);或 bb) 抗體重鏈可變結構域（VH)及抗體恆定結構域1 (CH1), 其中該多肽以該VH結構域之N-末端經由肽連接物與 該全長抗體兩條重鍵中一條之C -末端融合； c) 由以下組成之多肽： ca) 抗體輕鏈可變結構域（VL)，或 cb) 抗體輕鏈可變結構域（VL)及抗體輕鏈恆定結構域 (CL); 其中該多肽以該VL結構域之N-末端經由肽連接物與 該全長抗體兩條重鍵中另一條之C -末端融合； 147005.doc -52- 201039851 且其中該b)中之多肽之抗體重鏈可變結構域（VH)及該c) 中之多肽之抗體輕鏈可變結構域（VL)一起形成特異性 結合人類c-Met之抗原結合位點。 四價雙特異性形式 在一實施例中’本發明雙特異性抗體係四價，其中特異 性結合人類C-Met之抗原結合位點可抑制c_Met二聚化（例 如，如 WO 2009/007427 中所述）。 0 因此’本發明另一態樣係四價雙特異性抗體，其包含 a) 特異丨生結合人類ErbB_3且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鏈組成之全長抗體；及 b) 兩個相同的特異性結合人類c_Met之單鏈pa片段， 、中°亥b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 或輕鏈（：_或>^-末端之肽連接物與該全長抗體融合。 因此’本發明另一態樣係四價雙特異性抗體，其包含 寸異性結合人類c_Met且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鏈 ◎ 組成之全長抗體；及 )兩個相同的特異性結合人類ErbB-3之單鏈Fab片段， 其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 或fe鏈C-或N-末端之肽連接物與該全長抗體融合。 實例性示意性結構參見圖6a。 因此’本發明另一態樣係四價雙特異性抗體’其包含 a) 特異性結合人類ErbB_3且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕 鏈組成之全長抗體；及 b) 兩個相同的特異性結合人類c-Met之單鏈Fv片段， 147005.doc 53- 201039851 其中該b)中之單鏈!^片段經由該a)中之全長抗體的重鍵 或輕鏈C-或N-末端之肽連接物與該全長抗體融合。 因此’本發明另一態樣係四價雙特異性抗體其包含 a) 特異性結合人類卜胸且由兩個抗體重鏈及兩個抗體輕鍵 組成之全長抗體；及 b) 兩個相同的特異性結合人類ErbB_3之單鏈Fv片段， 其中該b)中之單物片段經由該a)中之全長抗體的重鍵 或輕鏈C-或N-末端之肽連接物與該全長抗體融合。 實例性示意性結構參見圖6b。 在一較佳實施例中，該等結合人類c_Met或人類ErbB_3 之單鏈Fab或Fv片段經由該全長抗體重鏈c_末端之肽連接 物與該全長抗體融合。 本發明之另一實施例係四價雙特異性抗體，其包含 a) 特異性結合人類ErbB_3且由以下組成之全長抗體： aa) 兩個相同抗體重鏈，其在N_末端至c_末端方向上由 以下組成：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鏈恆定結 構域1(CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (Ch3);及 ab) 兩個相同抗體輕鏈，其在N_末端至c_末端方向上由 以下組成：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及抗體輕鏈恆定 結構域（CL) (VL-CL);及 b) 兩個特異性結合人類c_Met之單鏈Fab片段， 其中該等單鏈Fab片段係由抗體重鏈可變結構域（VH)及 抗體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕鏈可變結構域（VL)、 147005.doc -54 - 201039851 抗體輕鏈恆定結構域（CL)及連接體組成，且其中該等^ 體結構域及該連接體在N-末端至C-末端方向上具有以 順序中之一種： ba) VH-CH1-連接體-VL-CL’ 或 bb) VL-CL-連接體 _VH_ CH1 ； 其中該連接體係具有至少30個胺基酸、較佳具有介於32 與50個之間之胺基酸的肽； 且其中該b)中之單鏈Fab片段經由該a)中之全長抗體的重鏈 或輕鏈C-或N-末端之肽連接物與該全長抗體融合； 其中該肽連接物係具有至少5個胺基酸、較佳具有介於 10與50個之間之胺基酸之肽。 三價或四價形式中所用術語「全長抗體」表示由兩個 「全長抗體重鏈」及兩個「全長抗體輕鏈」組成之抗體 (參見圖1)。「全長抗體重鏈」係在N-末端至C-末端方向上 由以下組成之多肽：抗體重鏈可變結構域（VH)、抗體重鍵 q 怪定結構域1 (CH1)、抗體鉸鏈區（HR)、抗體重鏈恆定結 構域2 (CH2)及抗體重鏈恆定結構域3 (Cil3)，縮寫為 VH-CH1-HR-CH2-CH3 ;且在抗體為lgE亞類之情形下視需 要包括抗體重鏈怪定結構域4 (CH4)。「全長抗體重鏈」較 佳為在N-末端至C-末端方向上由VH、CHI、HR、CH2及 CH3組成之多肽。「全長抗體輕鏈」係在N_末端至c_末端 方向上由以下組成之多肽：抗體輕鏈可變結構域（VL)、及 抗體輕鏈恆定結構域（CL)，縮寫為VL-CL。抗體輕鏈恆定 結構域（CL)可為K(kappa)或X(lambda)。兩個全長抗體鏈經 147005.doc -55- 201039851 由CL結構域與CH1結構域之間及全長抗體重鏈鉸鏈區之間 之多肽内一硫鍵連接在一起。典型全長抗體之實例係天然 抗體，例如 IgG(例如 IgG !及 IgG2)、IgM、IgA、IgD、及
IgE ^本發明全長抗體可來自單一物種（例如人類），或其可 為嵌合抗體或人類化抗體。本發明全長抗體包含兩個各自 由VH及VL對形成之抗原結合位點，二者可特異性結合相 同抗原。該全長抗體重鏈或輕鏈之c_末端表示該重鏈或輕 鏈c-末端之最後一個胺基酸❶該全長抗體重鏈或輕鏈之n_ 末端表示該重鏈或輕鏈义末端之最後一個胺基酸。 本發明所用術語「肽連接物」表示胺基酸序列較佳具有 合成來源之肽。使用本發明該等肽連接物來融合單鏈Fab 片段與全長抗體之C-或N-末端以形成本發明多特異性抗 體。較佳地，b)中之該等肽連接物係胺基酸序列長度為至 少5個胺基酸、較佳長度為5至1〇〇個、更佳為1〇至5〇個胺 基酸之狀。在一實施例中’該肽連接物係（GxS)n或 (GxS)nGm ’其中g=甘胺酸，S=絲胺酸，且（χ=3，n=3、 4、5 或 6，且…0、1、2或 3)或（x=4，n=2、3、4或 5且 m=0、1、2或3)，較佳地χ=4且n=2或3，更佳地χ=4， η-2。較佳地’在VH4VHCH1多肽及VI^VLCL多肽（圖 7a-c)經由兩個相同肽連接物與全長抗體c_末端融合之三價 雙特異性抗體中’該等肽連接物係具有至少25個胺基酸之 狀’較佳為具有30至50個胺基酸之肽，且該肽連接物更佳 為（GxS)n或（GxS)nGm，其中g=甘胺酸，S=絲胺酸，且 (X=3 ’ n=6、7 或 8 ’ 且 、1、2 或 3)或(χ=4，n=5、6 或 7 147005.doc •56· 201039851 且 m=0、1、2或 3)，較佳地 χ=4 且 n=5、6、7。 「單鏈Fab片段」（參見圖2a)係由以下組成之多肽：抗體 重鏈可變結構域（VH)、抗體恆定結構域1 (CH1)、抗體輕 鏈可變結構域（VL)、抗體輕鏈恆定結構域（CL)及連接體， 其中該等抗體結構域及該連接體在N-末端至C·末端方向上 具有以下順序中之一種：a) VH-CH1-連接體-VL-CL，b) VL-CL-連接體-VH-CH1，c) VH-CL-連接體-VL-CH1 或 d) VL-CH1-連接體-VH-CL ;且其中該連接體係具有至少3〇個 胺基酸、較佳具有介於32與50個之間之胺基酸的多肽。經 由CL結構域與CH1結構域之間之天然二硫鍵來穩定該等單 鏈 Fab 片段 a) VH-CH1-連接體-VL-CL、b) VL-CL-連接 體-VH-CH1、c) VH-CL-連接體-VL-CH1 及 d) VL-CH1-連接 體-VH-CL。術語「N-末端」表示N_末端之最後一個胺基 酸。術語「C-末端」表示C-末端之最後一個胺基酸。 術語「連接體」在本發明中係結合單鏈Fab片段來使 用’且表示胺基酸序列較佳具有合成來源之肽。使用本發 明該等肽來連接a) VH-CH1與VL-CL、b) VL-CL與 VH-CH1、c) VH-CL與 VL-CH1 或 d) VL-CH1 與 VH-CL·，從 而形成以下本發明單鏈Fab片段：a) VH-CH1-連接體-VL-CL、b) VL-CL-連接體-VH-CH1、c) VH-CL-連接體-VL-CH1或d) VL-CH1-連接體_VH-CL。單鏈Fab片段之内之該 連接體係胺基酸序列長度為至少3〇個胺基酸、長度較佳為 32至50個胺基酸之肽。在一實施例中，該連接體係 (GxS)n ’其中G=甘胺酸，s=絲胺酸（χ=3，n=8、9或10且 147005.doc -57- 201039851 m=0、1、2 或 3)或（x=4且 n=6、7 或 8且 m=0、丨、2 或 3)，較 佳地x=4 ’ n=6或、1、2或3，更佳地χ=4，㈣且 m=2。在一實施例中，該連接體係（G4S)6G2。 在一較佳貫施例中，在該單鏈F ab片段中，該等抗體結 構域及該連接體在N-末端至C-末端方向上具有以下順序中 之一種： a) VH-CH1-連接體-VL-CL，或 b) VL-CL-連接體-VH_ CH1，更佳為VL-CL-連接體-VH-CH1。 在另一較佳實施例中，在該單鏈Fab片段中，該等抗體 結構域及該連接體在N-末端至C-末端方向上具有以下順序 中之一種： a) VH-CL-連接體-VL-CH1 或 b) VL-CH1-連接體-VH-CL。 視需要，在該單鍵Fab片段中，除CL結構域與CH1結構 域之間之天然二硫鍵以外，抗體重鏈可變結構域（VH)及抗 體輕鏈可變結構域（VL)亦藉由在以下位置之間引入二硫鍵 而經二硫鍵穩定： i) 重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1 〇〇位， ii) 重鏈可變結構域105位與輕鏈可變結構域43位，或 iii) 重鏈可變結構域101位與輕鏈可變結構域1 〇〇位（始終 根據Kabat之EU索引來編號）。 該單鏈Fab片段之進一步二硫鍵穩定係藉由在單鏈Fab片 段之可變結構域VH與VL之間引入二硫鍵來達成。引入非 天然二硫橋來穩定單鏈Fv之技術闡述於（例如）以下文獻 中：WO 94/029350 ; Rajagopal，V_ 等人，Prot. Engin· 147005.doc ·58· 201039851 (1997) 1453-59 ; Kobayashi，Η.等人，Nuclear Medicine & Biology，第 25 卷（1998) 387-393 ;或 Schmidt，Μ·等人， Oncogene 18 (1999) 1711-1721。在一實施例中，本發明抗 體中所包括單鏈F a b片段可變結構域之間之可選二硫鍵介 於重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域1〇〇位之間。在 一實施例中，本發明抗體中所包括單鏈Fab片段可變結構 域之間之可選二硫鍵介於重鏈可變結構域1 〇5位與輕鏈可 0 變結構域43位之間（始終根據Kabat之EU索引來編號）。 在一貫施例中’在單鏈Fab片段可變結構域VH與VL之間 未經該可選二硫鍵穩定之單鏈Fab片段較佳。 「單鏈Fv片段」（參見圖2b)係由以下組成之多肽：抗體 重鏈可變結構域（VH)、抗體輕鏈可變結構域（vl)、及單 鏈-Fv-連接體，其中該等抗體結構域及該單鏈_Fv_連接體 在N-末知至C-末端方向上具有以下順序中之一種：a) vh_ 單鏈-Fv-連接體-VL、b) VL-單鏈-Fv-連接體-VH ;較佳為 Q a) VH_單鏈-Fv_連接體-VL，且其中該單鏈-Fv-連接體係胺 基酸序列長度為至少丨5個胺基酸之多肽，在一實施例中長 度為至少20個胺基酸。術語「N_末端」表示N_末端之最後 一個胺基酸。術語「C_末端」表示c_末端之最後一個胺基 酸。 術語「單鏈_Fv-連接體」在用於單鏈Fv片段中時表示胺 基酸序列較佳具有合成來源之肽。該單鏈_Fv_連接體係胺 基酸序列長度為至少15個胺基酸、在一實施例中長度為至 少20個胺基酸且長度較佳介於丨5與3〇個胺基酸之間之肽。 147005.doc -59- 201039851 在一實施例中，該單鏈-連接體係（GxS)n，其中甘胺 酸，S=絲胺酸，（x=3且n=4、5或6)或（x=4且n=3、4、5或 6)，較佳地x=4，n=3、4或5，更佳地x=4，n=3或4。在一 實施例中’該單鏈Fv-連接體係（g4S)^(G4S)4。 此外’該等單鏈Fv片段較佳經二硫鍵穩定。該單鏈抗體 之進一步二硫鍵穩定係藉由在單鏈抗體之可變結構域之間 引入二硫鍵來達成，且闡述於（例如）以下文獻中：W〇 94/029350 ; Rajag0pai, v 等人，Pr〇t Engin. 1〇 (1997) 1453-59 ; Kobayashi, Η.等人，Nuclear Medicine & Biology ’ 第 25 卷（1998) 387-393 ;或 Schmidt，M_ 等人， Oncogene 18 (1999) 1711-1721 。 在經二硫鍵穩定之單鏈Fv片段之一實施例中，本發明抗 體中所包括單鏈Fv片段之可變結構域之間之二硫鍵對各單 鏈Fv片段而言獨立地選自： I) 重鏈可變結構域44位與輕鏈可變結構域丨〇〇位， II) 重鏈可變結構域1〇5位與輕鏈可變結構域43位，或 in)重鏈可變結構域1〇1位與輕鏈可變結構域1〇〇位。 在一實施例中，本發明抗體中所包括單鏈Fv片段之可變 結構域之間之二硫鍵介於重鏈可變結構域44位與輕鏈可變 結構域100位之間。 本發明抗體係藉由重組方式來產生。因此，本發明一態 樣係編碼本發明抗體之核酸，且另一態樣係包含該編碼本 發明抗體之核酸之細胞。用於重組製造之方法廣泛為當前 業内所知且包含在原核及真核細胞中表現蛋白質及隨後分 147005.doc -60- 201039851 離抗體以及通常將其純化至醫藥上可接受之純度。對於上 述抗體在宿主細胞中之表現，藉由標準方法將編碼各經修 飾輕鏈及重鏈的核酸插入表現載體中。在適宜原核或真核 宿主細胞（例如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293 細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母或大腸桿菌（E.coli) 細胞）中進行表現，且自該等細胞（上清液或溶解後細胞）回 收抗體。重組產生抗體之通用方法已為當前業内所熟知且 闡述於（例如）以下综述文獻中：Makrides，S.C.，Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202 ; Geisse，S.等人，Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282 ； Kaufman 5 R.J. 5 Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161 ; Werner，R.G.，Drug Res. 48 (1998) 870-880 ° 雙特異性抗體適合藉由習用免疫球蛋白純化程序自培養 基分離，該等程序為例如蛋白質A-璦脂糖凝膠（Sepharose) 法、羥基磷灰石層析法、凝膠電泳、透析或親和層析法。 編碼單株抗體之DNA及RNA可使用習用程序輕易地分離及 測序。雜交瘤細胞可用作該DNA及RNA之來源。分離後， DNA可插入表現載體中，隨後轉染至原本不產生免疫球蛋 白之宿主細胞（例如HEK 293細胞、CHO細胞、或骨趙瘤細 胞）中，以在宿主細胞中獲得重組單株抗體之合成。 雙特異性抗體之胺基酸序列變體（或突變體）係藉由適當 核苷酸變化引入該抗體DNA或藉由核苷酸合成製備。然 而，該等修飾僅能在極有限範圍内（例如上文所述）實施。 舉例而言，該等修飾不改變上述抗體特徵，諸如IgG同型 147005.doc -61 - 201039851 (isotype)及抗原結合等，但可提高重組產生之產率、增強 蛋白質穩定性，或有利於純化。 本案中所用術s吾「宿主細胞」表示任何種類可經改造以 生成本發明抗體之細胞系統。在一個實施例中，使用HER 293細胞及CH0細胞作為宿主細胞。本文所用表述「細 胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用且所有該等 名稱皆包括子代。因此，詞語「轉化體」及「轉化細胞」 包括原代細胞及源自其之培養物而不論轉移次數。亦應瞭 解’所有子代之DN A含量可能因特意或無意的突變而不完 全相同。本發明包括最初轉化細胞中經篩選具有相同功能 或生物活性之變體子代。 在NS0細胞中之表現闡述於例如Barnes，L M等人，
Cytotechnology 32 (2000) 109-123 ; Barnes，L.Μ.等人，
Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 中。瞬時表現闡述於例 如 Durocher，Y.等人，Nucl. Acids. Res. 30 (2002)E9中。可 變結構域之選殖闡述於Orlandi, R.等人，proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837 ; Carter，P.等人，proc. Nati.
Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289 ;及 Norderhaug，L.等 人，J_ Immunol. Methods 204 (1997) 77-87。較佳瞬時表現 系統（HEK 293)闡述於 Schlaeger, E.-J.及 Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83 ; &Schlaeger，E,J.,J· Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 中 〇 舉例而言’適用於原核生物之控制序列包括啟動子、 (視需要）操縱子序列、及核糖體結合位點。已知真核細胞 147005.doc -62- 201039851 可利用啟動子、增強子及多聚腺苷酸化信號。 當：核酸與另一核酸序列具有功能性關係時，該核酸係 「可操作連接的」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列 之DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則該前序列或分泌 前導序列之DNA可操作連接至該多肽之DNA;若啟動子或 增強子可影響編碼序列之轉錄，則該啟動子或增強子可操 作連接至該編碼序列；或若核糖體結合位點之定位有助於 〇 轉譯，則該核糖體結合位點可操作連接至該編碼序列。一 般而5 ’「可操作連接」意指所連接ONA序列係鄰接序列 且在分泌前導序列情況下係鄰接序列且處於閱讀框内。然 而，增強子無需鄰接。藉由在便利的限制位點處接合可完 成連接。若不存在該等位點，則根據習用慣例可使用合成 性寡核苷酸銜接子或連接體。 藉由標準技術實施抗體純化以消除細胞組份或其他污染 物（例如其他細胞核酸或蛋白質），該等技術包括鹼/SDS處 Q 理、CsC1區帶法、管柱層析法、瓊脂糖凝膠電泳法、及其 他業内熟知方法。參見Ausubel, F等人編輯，Current
Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley lnterscience，New Y〇rk (1987)。已有多種不同方法 被人們所接受且廣泛用於蛋白質純化，例如使用微生物蛋 白質實施之親和層析（例如蛋白質A或蛋白質G親和層析）、 離子交換層析（例如陽離子交換（羧甲基樹脂）、陰離子交換 (胺基乙基樹脂）及混合型交換）、嗜硫菌吸附（例如使用β_ 疏基乙醇及其他SH配體）、疏水作用或芳香族吸附層析（例 147005.doc • 63 - 201039851 士使用笨基-瓊脂糖、氮雜_親芳烴（aren〇phiiic)樹脂、或 間胺基苯基硼酸）、金屬螯合親和層析（例如使用及 Cu(II)•親和性材料）、尺寸排除層析及電泳方法（例如凝膠 電冰、毛細官電泳）（Vijayalakshmi，M A，A沖 1 Bi〇chem
Biotech. 75 (1998) 93_i〇2)。 本文所用表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可 互換使用且所有該等名稱皆包括子代。因此，詞語「轉化 體」及「轉化細胞」包括原代個體細胞及源自其之培養物 而不考慮轉移次數。亦應瞭解，所有子代之DNA含量可能 因特意或無意的突變而不完全相同。本發明包括最初轉化 細胞中經篩選具有相同功能或生物活性之變體的子代。倘 若意欲使用獨特名稱’則可根據上下文來確定。 本文所用術語「轉化」係指將載體/核酸轉移至宿主細 胞中之過程。若使用不具有牢固細胞壁障壁之細胞作為宿 主細胞’則可藉由例如磷酸鈣沉澱法來實施轉染，如
Graham，F.L.及 van der Eb，A.J., Virology 52 (1973) 456- 467中所述。然而，亦可使用將〇να引入細胞中之其他方 法，例如細胞核注射或原生質體融合。若使用原核細胞或 含有牢固細胞壁構造之細胞，則一種轉染方法係（例如）使 用氣化鈣進行鈣處理，如Cohen，F.N.等人，PNAS 69 (1972) 711〇ff所述。 本文所用「表現」係指將核酸轉錄為爪尺^八之過程及/或 隨後將經轉錄mRNA(亦稱作轉錄物）轉譯為肽、多肽或蛋 白質之過程。轉錄物及所編碼多肽共稱為基因產物。若多 147005.doc -64 - 201039851 核苷酸源自基因組DNA，則在真核細胞中之表現可包括 mRNA之剪接。 載體」係核酸分子’具體而言為自主複製的核酸分 子，其將插入核酸分子轉移至宿主細胞中及/或宿主細胞 之間。該術語包括主要用於將DNA* RNA插入細胞（例如 染色體整合）之載體、主要用於複製DNA或RNA之複製载 體、及用於DNA或RNA轉錄及/或轉譯之表現载體。該術 語亦包括可提供不止一種上述功能之載體。 〇 表現載體」係在引入適宜宿主細胞時可轉錄並轉譯為 多肽之多核苷酸。「表現系統」通常係指包括可用於產生 期望表現產物之表現載體的適宜宿主細胞。 醫藥組合物 本發明之一態樣係包含本發明抗體之醫藥組合物。本發 明另一態樣係本發明抗體用於製造醫藥組合物之用途。本 發明另一態樣係製造包含本發明抗體之醫藥組合物之方 〇 法在另—惡樣中’本發明提供組合物（例如醫藥組合 物）其含有與醫藥載劑調配在一起之本發明抗體。 本發明—實施例係本發明雙特異性抗體，其用於治療癌 症。 本匙明另一態樣係該醫藥組合物，其用於治療癌症。 本發明另一態樣係本發明抗體之用途，其用於製造治療 癌症之藥物。 本發明另一態樣係藉由將本發明抗體投與需要治療之患 者來治療癌症患者之方法。 147005.doc •65· 201039851 質、包衣η菌及何及所有溶劑、分散介 ::二…及抗真菌試劑、等渗劑及吸收延遲剤、 上相谷之類似試劑。較佳地，载劑適合於靜脈内、 肌内、皮下、非經腸、經 射或輸注）。 ，· 表皮投與（例如藉由注
本發明組合物可藉由多種業内已知方法來投與。孰習出 項技術者應瞭解，投與途徑及/或模式可隨期望效果而變 化。為藉由某些投與途徑投與本發明化合物，需要用某種 材料塗佈該化合物或將該化合物與該材料共投與以防止兮 化合物失活。舉例而言，投與個體之化合物可存於適宜載 劑中，例如腊質體或稀釋劑。醫藥上可接受之稀釋劑包括 鹽水及水性緩衝溶液。醫藥載劑包括無菌水性溶液或分散 液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。 將該等介質及試劑用於醫藥活性物f為業内已知。
本文所用片語「非經腸投與」及「以非經腸方式投與」 意指除經腸及局部投與以外的投與模式，通常係藉由注射 來投與且包括(但不限於)靜脈内、肌内、動脈内：鞘内、 莢膜内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜腔内、經氣管、皮 下、表皮下、關節内、囊下、蛛網膜下、脊柱内、硬膜外 及胸骨内注射及輸注。 本文所用術語「癌症」係指增殖性疾病，例如淋巴瘤、 淋巴細胞性白血病、肺癌、非小細胞肺（NSCL)癌、細支氣 管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭或頸癌、皮 膚或眼内黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、 147005.doc -66 - 201039851 胃癌（stomach cancer)、胃癌（gastric cancer)、結腸癌、乳 癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、陰道 癌、陰戶癌、霍奇金病（Hodgkin's Disease)、食道癌、小 腸癌、内分泌系統癌症、曱狀腺癌、曱狀旁腺癌、腎上腺 癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、 腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞 癌、膽管癌、中樞神經系統（CNS)贅瘤 '脊椎腫瘤、腦幹 膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、許旺細胞瘤 (SChWannoma)、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、扁平細 月ϋ C 垂體腺瘤及尤文肉瘤（Ewings sarcoma)，包括任一 上述癌症之難治性形式，或一或多種上述癌症之組合。 本發明另一態樣係本發明雙特異性抗體或該醫藥組合 物，其用作抗血管生成劑。該抗血管生成劑可用於治療癌 症，尤其可用於治療實體腫瘤及其他血管疾病。 本發明一實施例係本發明雙特異性抗體，其用於治療血 管疾病。 本發明另一態樣係本發明抗體用於製造治療血管疾病之 藥物之用途。 本發明另-態樣係藉由向需要治療之患者投與本發明抗 體來治療患有血管疾病之患者的方法。 術β。血g疾病」包括癌症、炎症性疾病、動脈粥樣硬 化、缺血、創傷、敗血病、c〇pD、哮喘、糖尿病、 AMD、視網膜病變、中風、肥胖症 ' 急性肺損傷、出血、 血管滲漏（例如細胞因子誘導血管參漏）、過敏症、格雷夫 147005.doc -67- 201039851 氏病（Graves' Disease)、橋本自身免疫性曱狀腺炎 (Hashimoto's Autoimmune Thyroiditis) ' 自發性血小板缺乏 紫斑症、巨細胞動脈炎、類風濕性關節炎、全身性紅斑狼 瘡（SLE)、狼瘡性腎炎、克羅恩氏病（Cr〇hn，s Disease)、多 發性硬化症、潰瘍性結腸炎、尤其實體腫瘤、眼内新生血 管型症候群（例如增殖性視網膜病或老年性黃斑退化症 (AMD))、類風濕性關節炎、及銀屑病（F〇ikman，J.及Shing， Υ·等人，J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934 ; Klagsbrun，Μ.等人，Annu· Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239 ’ 及 Garner，A.，Vascular diseases，Pathobiology 〇f ocular disease，A dynamic approach，Garner, A.及 lintworth，G· K.(編輯）’第 2版 ’ Marcel Dekker，New York (1994)，第 1625-1710頁）。 該等組合物亦可含有佐劑，例如防腐劑、潤濕劑、乳化 劑及分散劑。可藉由上述消毒程序及藉由引入各種抗細菌 及抗真菌劑來確保防止存在微生物，該等抗細菌及抗真菌 劑為（例如）對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及諸 如此類。亦可期望該等組合物包括等滲劑，例如糖、氣化 鈉及諸如此類。另外，可藉由引入延遲吸收之試劑（例如 單硬，酸！g及明膠）來實現可注射f㈣式之長效吸收。 a不s選擇何種投與路徑，可藉由熟習此項技術者已知之 驾用方法將可以適宜水合形式使用之本發明化合物及/或 本發明醫藥組合物調配為醫藥上可接受之劑型。 本發明醫藥組合物中活性成份之實際劑量程度可改變， 147005.doc -68- 201039851 =Γ成份可有效地使特定患者、組合物及投與模式 療反應且對患者無毒性之量。所選劑量程度取 決於各種藥代動力學因I，包括本發明制特定組合物之 活性、、投與路徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速 率、治療持續時間、與所用特定化合物組合使用之其他藥 物、化合物及/或材料、所治療患者之年齡、性別、體 重身體狀; 兄t健康狀況及先前病史、及醫學領域熟 知的類似因素。 ‘'
組合物之無菌及流動性程度應使其可藉由注射器來遞 送。除水以外，載劑較佳為等滲緩衝鹽水溶液。 例如，可藉由使用諸如卵磷脂等包衣、藉由在分散物情 开/下維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持適當流動 性。在許多情形下，組合物中較佳包括等滲劑，例如糖、 多元醇（例如甘露醇或山梨醇）、及氯化鈉。 現在已發現，針對人類ErbB_3及人類c_Met之本發明雙 特異性抗體具有有價值的特徵，例如生物或醫藥活性、藥 代動力學特性。本發明雙特異性<ErbB3_c_Met^^體顯示 相對於其親代<£^33>及/或<(>Met>抗體降低之内化。 提供以下實例、序列表及圖來幫助理解本發明，本發明 之實際範圍陳述於隨附申請專利範圍中。應瞭解，可對各 程序實施修改而不偏離本發明之精神。 胺基酸序列說明 SEQ ID NO: 1重鏈可變結構域<ErbB3>HER3純系29 SEQ ID NO: 2輕鏈可變結構域<ErbB3>HER3純系29 147005.doc -69· 201039851 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 重鏈可變結構域<c-Met>Mab 5D5 輕鏈可變結構域<c-Met>Mab 5D5 重鏈 <ErbB3>HER3 純系 29 輕鏈<ErbB3>HER3純系 29
重鏈 <c-Met>Mab 5D5 輕』鍵 <c-Met>Mab 5D5 重鍵<c-Met>Fab 5D5 輕鍵<c-Met>Fab 5D5 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS 重鍵 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_lC 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_lC 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_l C 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C 重鍵 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS
147005.doc -70- 201039851 SEQ ID NO: 27 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS SEQ ID NO: 28 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met—scFvSSKHSS SEQ ID NO: 29 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH SEQ ID NO: 30 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH SEQ ID NO: 31 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH SEQ ID NO: 32 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH SEQ ID NO: 33 重鏈 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH SEQ ID NO: 34 o SEQ ID NO: 35 輕鍵 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB SEQ ID NO: 36 重鍵 2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB SEQ ID NO: 37 輕鍵 <ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB SEQ ID NO: 38 重鏈 l<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS SEQ ID NO: 39 重鏈 2<ErbB3-c_Met>Her3/Met_scFvKHSBSS SEQ ID NO: 40 輕鏈 <ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS SEQ ID NO: 41 人類IgGl之重鏈恆定區 八 SEQ ID NO: 42 人類IgG3之重鍵恆定區 SEQ ID NO: 43 人類輕鏈κ恒定區 SEQ ID NO: 44 人類輕鏈λ恆定區 SEQ ID NO: 45 人類c-Met SEQ ID NO: 46 人類ErbB-3 SEQ ID NO: 47 重鏈可變結構域VH,<ErbB3>Mab 205(鼠類） SEQ ID NO: 48 輕鏈可變結構域VL, <ErbB3>Mab 205(鼠類） SEQ ID NO: 49 重鏈可變結構域VH，<ErbB3>Mab 205.10 (人類化） 147005.doc -71 - 201039851 SEQ ID NO: 50 輕鏈可變結構域 VL,<ErbB3>Mab 205.10.1 (人類化） SEQ ID NO: 51 輕鏈可變結構域 VL,<ErbB3>Mab 205.10.2 (人類化） SEQ ID NO: 52 輕鏈可變結構域 VL,<ErbB3>Mab 205 · 10.3 (人類化） SEQ ID NO: 53 重鏈 CDR3H，<ErbB3>Mab 205.1 0 SEQ ID NO: 54 重鏈 CDR2H，<ErbB3>Mab 205.10 SEQ ID NO: 55 重鏈 CDR1 H,<ErbB3>Mab 205 · 1 0 SEQ ID NO: 56 輕鏈 CDR3L,<ErbB3>Mab 205.1 0 SEQ ID NO: 57 輕鏈 CDR2L，<ErbB3>Mab 205.1 0 SEQ ID NO: 58 輕鏈 CDR1L(變體 1 )，<ErbB3>Mab 205.1 0 SEQ ID NO: 59 輕鏈 CDR1L(變體 2),<ErbB3>Mab 205.1 0 SEQ ID NO: 60 重鏈 CDR3H，<ErbB3>HER3 純系 29 SEQ ID NO: 61 重鏈 CDR2H,<ErbB3>HER3 純系 29 SEQ ID NO: 62 重鏈 CDRlH，<ErbB3>HER3 純系 29 SEQ ID NO: 63 輕鏈 CDR3L，<ErbB3>HER3 純系 29 SEQ ID NO: 64 輕鏈 CDR2L,<ErbB3>HER3 純系 29 SEQ ID NO: 65 輕鏈 CDRlL<ErbB3>HER3 純系 29 SEQ ID NO: 66 重鏈 CDR3H，<c-Met>Mab 5D5 SEQ ID NO: 67 重鏈 CDR2H，<c-Met>Mab 5D5 SEQ ID NO: 68 重鏈 CDR1 H,<c-Met>Mab 5D5 SEQ ID NO: 69 輕鏈 CDR3L，<c-Met>Mab 5D5 SEQ ID NO: 70 輕鏈 CDR2L,<c-Met>Mab 5D5 147005.doc -72- 201039851 SEQ ID NO: 71 輕鏈 CDRlL，<c-Met>Mab 5D5 實驗程序 實例 材料及方法 重組DNA技術 使用標準方法來處理DNA ’如以下文獻中所述：
Sambrook，J.等人，Molecular cloning: A laboratory manual ； Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring O Harbor，New York, 1989。根據製造商說明書來使用分子生 物學試劑。 DNA及蛋白質序列分析及序列資料管理 關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈核苷酸序列之一般資訊 闡述於以下文獻中：Kabat, E.A.等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH出版號 91-3242。根據EU編號法對抗體鏈之胺基酸進行編號 (Edelman，G.M.等人，PNAS 63 (1969) 78-85 ; Kabat，Ε·Α. 等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5版，NIH 出版號 91-3242)。使用 GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)之軟體包（10.2版） 及 Infomax之 Vector NTI Advance suite(8.0版）來對序列實施 創建、製圖、分析、注釋及說明。 DNA測序 藉由用 SequiServe (Vaterstetten，Germany)及 Geneart AG (Regensburg, Germany)實施雙鏈測序法來測定DNA之序 147005.doc -73- 201039851 列。 基因合成 藉由 Geneart AG (Regensburg, Germany)自藉由自動化基 因合成產生之合成性寡核苷酸及PCR產物來製備期望基因 片段。將兩側具有單數個限制性内切核酸酶裂解位點之基 因片段選殖至pGA18 (ampR)質粒中。質粒DNA係自經轉化 細菌純化且藉由UV光譜法來測定濃度。藉由DNA測序來 確認亞選殖基因片段之DNA序列。使用5'-BamHI及3'-XbaI 限制性位點來合成基因片段，其編碼「隆凸-孔洞結合」 Her3(純系29)抗體重鏈，其在CH3結構域中具有T366W突 變且具有藉由連接物連接之C-末端5D5 VH區；以 及「隆凸-孔洞結合」Her3(純系29)抗體重鏈，其具有 T366S、L3 68A及Y407V突變且具有藉由（G4S)n肽連接物連 接之C-末端5D5 VL區。以類似方式藉由使用兩侧BamHI及 Xbal限制性位點之基因合成來製備DNA序列，該DNA序列 編碼「隆凸-孔洞結合」Her3(純系29)抗體重鏈，該抗體重 鏈在CH3結構域中具有S354C及T366W突變且具有藉由 (048)„肽連接物連接之C-末端5D5 VH區；以及「隆凸-孔 洞結合」Her3(純系29)抗體重鏈，該抗體重鏈具有 Y349C、T366S、L368A 及 Y407V 突變且具有藉由（G4S：Uii 連接物連接之C-末端5D5 VL區。最後，使用兩側BamHI及 Xbal限制性位點來合成編碼Her3(純系29)及5D5抗體之未 經修飾重鏈及輕鏈的DNA序列。所有構成物皆經設計而具 有編碼前導肽（MGWSCIILFLVATATGVHS)之5'-末端DNA序 147005.doc -74- 201039851 該前導絲向真核細胞中之分泌蛋白。下文所述其他 又特異性抗體之基因合成係使料變區妹定區之相應元 件以類似方式來實施（例如闡述於下文設計部分及表⑴ 中）〇 表現質粒之構建 使用Rde表現載體來構建編碼所有重鏈及輕鏈scFv融 合蛋白之表現質粒。該載體係由以下元件組成：
-作為選擇標記之抗潮黴素基因， _愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein_Barr virus) (ebv)之複製 起點oriP， 來自載體PUC18之複製起點，其容許此f粒在大腸桿 菌中複製， 在大腸桿菌中賦予氨苄西林抗性之p_内醯胺酶基因， 末自人類巨細胞病毒（HCMV)之立即早期增強子及啟 動子， -人類1-免疫球蛋白多聚腺苷酸化（「多聚Α」）信號序 列，及 •獨特的BamHI及Xbal限制性位點。 包含重鏈或輕鏈構成物以及具有C_末端VH及VL結構域 之「隆凸-孔洞結合」構成物的免疫球蛋白融合基因係藉 由基因合成來製備且將其選殖至所述pGA18 (ampR)質粒 中。用 BamHI 及 Xbal 限制性酶（Roche Molecular Biochemicals)來消化具有合成DNA片段及Roche表現載體 之pG18 (ampR)質粒且實施瓊脂糖凝膠電泳。然後將編碼 147005.doc -75- 201039851 重鏈及輕鏈之經純化DNA片段接合至經分離Roche表現載 體BamHI/Xbal片段，從而產生最終表現載體。將最終表現 載體轉化至大腸桿菌細胞中，分離表現質粒DNA (Miniprep)且對其實施限制性酶分析及DNA測序。使正確 純系在150 ml LB-Amp培養基中生長，再次分離質粒DNA (Maxiprep)並藉由DNA測序來確認序列完整性。 免疫球蛋白變體在HEK293細胞中之瞬時表現 根據製造商說明書藉由使用Freestyle™ 293表現系統 (Invitrogen, USA)瞬時轉染人類胚腎293-F細胞來表現重組 免疫球蛋白變體。簡言之，在Freestyle™ 293表現培養基 中在37°C/8% C02下培養懸浮FreeStyleTM 293-F細胞，且在 轉染當天將細胞以1-2χ106活細胞/ml之密度接種於新鮮培 養基中。在Opti-MEM® I培養基（Invitrogen, USA)中使用 325 μΐ 293fectin™ (Invitrogen, Germany)及 250 pg重鏈及 輕鏈質粒DNA以1:1莫耳比及250 ml之最終轉染體積來製備 DNA-293fectinTM 複合物。在 Opti-MEM® I 培養基 (Invitrogen, USA)中使用 325 μΐ 293fectinTM (Invitrogen, Germ any)及250 pg「隆凸-孔洞結合」重鏈1及2及輕鏈質 粒DNA以1:1:2之莫耳比及250 ml之最終轉染體積來製備 「隆凸-孔洞結合」DNA-293fectin複合物。在轉染後7天藉 由以14000 g離心30分鐘來收穫含有抗體之細胞培養上清 液且經由無菌濾器（0.22 μιη)過濾。在純化前將上清液儲存 在-20°C下。 雙特異性抗體及對照抗體之純化 147005.doc •76- 201039851 藉由使用 ProteinA-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden) 之親和層析及Superdex200尺寸排除層析自細胞培養上清 液純化雙特異性抗體及對照抗體。簡言之，將無菌過濾細 胞培養上清液施加至經PBS緩衝液（10 mM Na2HP04、1 mM KH2P〇4、137 mM NaCl 及 2.7 mM KC1，pH 7·4)平衡之 HiTrap Protein A HP (5 ml)管柱上。用平衡緩衝液洗去未結 合蛋白。用0.1 Μ檸檬酸鹽緩衝液（pH 2.8)洗脫抗體及抗體 變體，且用0.1 ml 1 M Tris (pH 8.5)來中和含有蛋白質之 流份。然後，彙集所洗脫蛋白質流份，用Amicon Ultra離 心過濾裝置（MWCO: 30 K，Millipore)濃縮至3 ml體積並裝 載至經20 mM Histidin、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡之 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 凝膠過渡管柱（GE Healthcare，Sweden)上。彙集含有經純化雙特異性抗體及 對照抗體以及低於5%之高分子量凝集體之流份且以1 ·〇 mg/ml之等份儲存於-80°C下。藉由用木瓜蛋白酶消化經純 化5D5單株抗體且隨後藉由蛋白質A層析移除摻雜的Fc結 構域來產生Fab片段。在經20mM Histidin、140 mM NaCl (pH 6.0)平衡之 Superdex200 HiLoad 120 ml 16/60 凝膠過濾、 管柱（GE Healthcare，Sweden)上進一步純化未結合Fab片 段，將其彙集且以1.0 mg/ml等份儲存於-80°C下。 純化蛋白質之分析 藉由在280 nm下測量光密度（OD)使用基於胺基酸序列計 算出之莫耳消光係數來確定經純化蛋白質樣品之蛋白質濃 度。在存在及不存在還原劑（5 mM 1，4-二硫蘇糖醇）之情形 147005.doc -77- 201039851 下藉由SDS-PAGE及用考馬斯亮藍（Coomassie brilliant blue)染色來分析雙特異性抗體及對照抗體之純度及分子量 (實例性圖 21 :雙特異性 Her3/c-Met抗體 HEr3/MetscFvSS_KH (左側）及Her3/MetscFv—KH(右側）之SDS-Page)。根據製造 商說明書來使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統（Invitrogen, USA)(4-20°/〇 Tris-甘胺酸凝膠）。在 200 mM KH2P〇4、250 mM KC1 (pH 7·0)運行緩衝液中於25°C下使用Superdex 200 分析型尺寸排除管柱（GE Healthcare, Sweden)藉由高效 SEC來分析雙特異性抗體及對照抗體樣品之凝集體含量。 以0.5 ml/min之流速將25 pg蛋白質注入管柱上且經50分鐘 實施等度洗脫。對於穩定性分析，在4°C及40°C下將純化 蛋白以1 mg/ml之濃度培育7天，且隨後藉由高效SEC進行 評估（例如雙特異性Her3/c-Met抗體HEr3/MetscFvSS_KH (圖 22a)及 Her3/MetscFv_KH(圖 22b)之 HP SEC 分析（純化蛋 白））。在藉由用肽-N-糖普酶F (Roche Molecular Biochemicals)實施酶處理來移除N-聚糖後，藉由奈升電喷 霧Q-TOF質譜法來驗證還原雙特異性抗體輕鏈及重鏈之胺 基酸骨架之完整性。例如，雙特異性Her3/c-Met抗體 HEr3/MetscFvSS_KH之產率為 28·8 mg/L(蛋白質 A及 SEC) 且Her3/MetscFv_KH之產率為12.3 mg/L(蛋白質A及 SEC)。 · c-Met磷睃化分析 在實施HGF刺激前一天以5xl0e5/孔將A549細胞接種於6 孔板中之含有0.5% FCS(胎牛血清）之RPMI中。第二天，經 147005.doc -78- 201039851 一小時用含有0.2% BSA(牛血清白蛋白）之RPMI替代生長 培養基。然後將5 pg/mL雙特異性抗體添加至培養基中且 將細胞培育1 〇分鐘，之後再經10分鐘以50 ng/mL之終濃度 添加HGF。用含有1 mM飢酸納之冰冷PB S將細胞洗蘇一 次，之後將其置於冰上並在細胞培養板中用1〇〇 pL溶解緩 衝液（50 mM Tris-Cl ρΗ7·5、150 mM NaCl ' 1% NP40、 0.5% DOC、抑肽酶、0.5 mM PMSF、1 mM釩酸鈉）進行溶 解。將細胞溶解產物轉移至埃彭道夫（eppendorf)管中並在 冰上使溶解繼續進行30分鐘。使用BCA方法（Pierce)來測 定蛋白質濃度。在 4-12% Bis-Tris NuPage 凝膠（Invitrogen) 上分離30-50 pg溶解產物且將凝膠上之蛋白質轉移至硝酸 纖維素膜上。用含有5% BSA之TBS-T將膜封閉1小時且根 據製造商說明書用針對Yl230、1234、1235之磷酸特異性 c-Met抗體（44-888，Biosource)進行顯影。用結合未碗酸化 c-Met之抗體（AF276, R&D)再次探測免疫印跡。
Her3 (ErbB3)磷酸化分析 以2xl0e5/孔將MCF7細胞接種於12孔板中之完全生長培 養基（RPMI 1 640，1 0% FCS)中。使細胞在兩天内生長至 90%融合。然後將培養基更換為含有0.5% FCS之饑餓培養 基。第二天以所示濃度補加各抗體，在1小時後添加5〇〇 ng/mL神經生長因子（R&D)。在添加神經生長因子後，將 細胞再培養1〇分鐘，之後收穫並溶解細胞。使用BCA方法 (Pierce)來測定蛋白質濃度。在4-12% Bis_Tris NuPage凝膠 (Invitrogen)上分離30·50 pg溶解產物且將凝膠上之蛋白質 147005.doc -79- 201039851 轉移至硝酸纖維素膜上。用含有5% BSA之TBS-T將膜封閉 一小時且用特異性識別Tyrl289 (4791，Cell Signaling)之填 酸特異性Her3/ErbB3抗體進行顯影。 擴散分析 在化合物處理前一天以200 pL總體積將A549(4000細胞/ 孔）或A43 1(8000細胞/孔）接種於96孔E-板（Roche, 05232368001)中之含有0.5% FCS之RPMI中。用實時細胞 分析機過夜監測細胞黏附及細胞生長，每1 5 min掃描一次 以監測阻抗。第二天，將細胞與5 pL之各抗體稀釋液在 PBS中一起預培育，且每5分鐘掃描一次。在30分鐘後，添 加2.5 pL具有20 ng/mL終濃度之HGF溶液並使實驗繼續再 進行72小時。經1 80分鐘每分鐘掃描一次來監測即時變 化，之後在剩餘時間内每1 5分鐘掃描一次。 遷移分析 遷移分析係基於實時細胞分析儀技術（Roche)來實施。 出於此目的，用160 kL HGF調整培養基（50 ng/mL)填充 CIM裝置之具有8 μηι孔之下室。裝配該裝置並以150 μι之 總體積將100000個A431細胞接種於上室中。向其中添加雙 特異性抗體或對照抗體。使遷移繼續進行24 h，其中每間 隔1 5 min進行一次例行掃描。在24 h後輸出數據並展示為 終點讀數。 流式細胞計數分析（FACS) a)細胞表面受體狀態之相對定量 使細胞維持在對數生長期。用accutase (Sigma)分離亞融 147005.doc •80· 201039851 合細胞，旋轉沉降（1500 rpm，4°C，5 min)且隨後用含有 2% FCS之PBS洗滌一次。為確定相對於其他細胞系之相對 受體狀態，將lxl〇e5個細胞與5 pg/mLHer3或c-Met特異性 第一抗體一起在冰上培育30 min。使用非特異性IgG(同型 對照）作為特異性對照。在指定時間後，用含有2% FCS之 PBS將細胞洗滌一次，隨後與偶合螢光體之第二抗體一起 在冰上培育30 min。如上所述洗滌細胞並使其再懸浮於適 宜體積之含有7-AAD (BD Bi〇sciences)之BD細胞固定溶液 (BD Biosciences)中，以區分活細胞與死細胞。藉由流式 細胞計數術（FACS Canto, BD)測定細胞之平均螢光強度 (mfi)。藉由至少兩次一式兩份的獨立染色來測定mfi。使 用FlowJo軟體（TreeStar)進一步處理流式細胞計數譜圖。 a)結合分析 分離並計數A43 1細胞。以1.5 X 10e5/孔將細胞接種於96 孔錐形板中。使細胞旋轉沉降（1 500 rpm，4°C，5 min)且 在冰上及50 μί各雙特異性抗體存於含有2% FCS(胎牛血 清）之PBS中之系列稀釋液中培育30 min。再次使細胞旋轉 沉降並用200 pL含有2% FCS之PBS洗滌一次，之後再次與 在含有2% FCS的PBS中稀釋之針對人類Fc且偶合藻紅蛋白 之抗體（Jackson Immunoresearch, 109116098) — 起培育 30 min。使細胞旋轉沉降且用200 pL含有2% FCS之PBS洗滌 兩次，使其再懸浮於BD細胞固定溶液（BD Biosciences)中 且在冰上培育至少10 min。藉由流式細胞計數術（FACS Canto，BD)測定細胞之平均螢光強度（mfi)。藉由至少兩次 147005.doc -81 - 201039851 一式兩份的獨立染色來測定mfi。使用FlowJo軟體 (TreeStar)進一步處理流式細胞計數譜圖。使用XLFit 4.0 (IDBS)及劑量反應一點式模型205來測定半最大結合。 b) 内化分析 分離並計數細胞。將5 X 1 0e5個細胞置於埃彭道夫管中之 50 pL完全培養基中且與5 pg/mL之各雙特異性抗體在37°C 下一起培育。在指定時間點後將細胞儲存在冰上，直至時 程結束。此後，將細胞轉移至FACS管中，旋轉沉降（1 500 rpm，4°C，5min)，用 PBS+2% FCS 洗滌且與在含有 2% FCS之PBS中稀釋之50 pL針對人類Fc且偶合藻紅蛋白之第 二抗體（Jackson Immunoresearch，109116098) — 起培育 30 分 鐘。再次使細胞旋轉沉降，用PBS + 2% FCS洗蘇並藉由流 式細胞計數術（FACS Canto, BD)測定螢光強度。 c) 交聯實驗 分離並計數HT29細胞且將其分為兩個細胞群，根據製 造商說明書用PKH26及PKH67 (Sigma)分別對該等細胞群 進行染色。自各經染色細胞群中取5x10e5個細胞，將其合 併並在完全培養基中與10 pg/mL之各雙特異性抗體一起培 育3 0及60分鐘。在所示時間點後，將細胞儲存在冰上直至 時程結束。使細胞旋轉沉降（1500 rpm，4°C，5min)，用 PBS + 2% FCS洗滌並藉由流式細胞計數術（FACS Canto, BD)測定螢光強度。
Cell Titer Glow分析 使用cell titer glow分析（Promega)來量化細胞活力及增 147005.doc -82- 201039851 殖。根據製造商說明書來實施分析。簡言之，在96孔板中 以100 pL之總體積將細胞培養期望時間段。對於增殖分 析，自培育器中移出細胞且將其於室溫下置放30 min。添 加100 pL cell titer glow試劑且將多孔板置於定軌振盪器上 並保持2 min。在15 min後於微量板讀數器（Tecan)上量化 發光。
Wst-Ι分析 根據終點法分析來實施Wst-Ι活力及細胞增殖分析，從 而檢測代謝活性細胞數。簡言之，將20 pL Wst-Ι試劑 (Roche, 11644807001)添加至200 pL培養基中。將96孔板 再培育30 min至1 h直至染料顯著顯影。在微量板讀數器 (Tecan)上於45 0 nm波長下量化染色強度。 表面電漿共振 使用標準結合分析在25°C下測定結合親和力，例如表面 電漿共振技術（BI Ac ore®, GE-Heal the are Uppsala, Sweden)。對於親和力測量，在SPR儀器（Biacore T100)上 藉由標準胺偶合及封阻化學方法使30 pg/ml抗FcY抗體（來 自山羊，Jackson Immuno Research)偶合至CM-5感受器晶 片表面。在偶聯後，在25°C下以5 pL/min之流速注入單-或 雙特異性Her3/cMet抗體且隨後以30 pL/min注入人類HER3 或c-Met ECD之連續稀釋液（0 nM至1000 nM)。使用 PBS/0.1% BSA作為結合實驗之運行缓衝液。然後用10 mM 甘胺酸-HC1 (pH 2.0)溶液之60s脈衝使晶片再生。 經表現及純化之雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體之設計 147005.doc -83 - 201039851 以下所表現及純化之所有雙特異性<ErbB3-c_Met>抗體 皆包含IgGl亞類之恆定區或至少Fc部分（SEQ ID NO: 11之 人類IgG 1恆定區），其最後如下文所述經修飾。 在表1中：根據上述通用方法表現並純化三價雙特異性 <ErbB3-c-Met>抗體，其係基於經由免疫（用人類HER3-ECD對NMRI小鼠進行免疫）獲得之全長ErbB-3抗體（HER3 純系29)及一個源自c-Met抗體（cMet 5D5)之單鏈Fv片段（基 礎結構示意圖參見圖5-該圖最終並未包括所有該表中所述 之特徵）且具有表1中所示之相應特徵。HER3純系29及 l # cMet5D5之相應VH及VL展示於序列表中。 表1 : 分子名稱 雙特異性抗 艘之scFv-Ab命名 Her3/Met scFv SSKHSS ~ Her3/Me scFvS SKH Her3/Met scF vKH Her3/Me scF vKHSB ~ Her3/Met scFv KHSBSS" 特徵： 隆凸-孔洞結 合突變 S354C:T366W/ Y349,C:T366,S; L368'A:Y407V T366W/ T366’S:L368’A: Y407V T366W/ Γ366公 L368W: Υ407Ύ T366W:K370E: K409D/ E357fK:T366’S: L368IA:D399'K: Υ407Ύ S354C:T366W: K370E:K409D/ Υ349*ε：Ε357'Κ: r366'S:L368'A: 〇399^:¥407^ ^ 全長抗體骨 架，源自： Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (嵌合） 單鏈Fv片 段，源自： cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） ScFv附接至 抗髏之位置 c-末端隆凸重鏈 c-末端隆凸重鏈 c-末端隆凸重鏈 c-末端隆凸重鏈 c-末端隆凸重鏈 單鍵Fv連接 體 (G4S)3 (G4S)3 (g4s)3 (G4S)3 (G4S)3 肽連接物 (g4s)2 (G4S)2 (G4S)2 (g4s)2 (g4s)2 ScFv二硫鍵 VH44/VL10 〇穩定(是/否 =+/-) + + - + + 147005.doc -84· 201039851 在表2中：根據上述通用方法表現並純化三價雙特異性 <ErbB3-c-Met>抗體，其係基於全長ErbB-3抗體（Mab 205，經由免疫（用人類HER3-ECD對NMRI小鼠進行免疫） 來獲得）及一個源自c-Met抗體（cMet 5D5)之單鏈Fv或scFab 片段（基礎結構示意圖參見圖5b及a-具體結構參見表）且具 有表2中所示之相應特徵。Mab205及cMet 5D5之相應VH及 VL展示於序列表中。 〇 表2 : 分子名稱 雙特異性 抗想之scFv-Ab命名 MH TVAB18 ΜΗ ΤνΑΒ21 MH TvAB22 MH一 TvAB23 ΜΗ TvAB24 ΜΗ TvAB25 特徵： 隆凸-孔洞結 合突變 S354C:T366W/ Y349,C:T366'S: L368’A:Y407'V S354C:T366W/ Y349C:T366S: L368'A:Y407V S354C:T366W/ Y349，C:T366，S: L368，A:Y407，V S354C:T366W/ Y349,C:T366'S: L368!A:Y407fV S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: L368，A:Y407*V S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: L368'A:Y407V 全長抗艟骨 架，源自： Mab 205 (嵌合） Mab 205 (嵌合） Mab 205 (嵌合） Mab 205 (嵌合） Mab (嵌合） Mab (欲合） 單鏈Fv片 段，源自： cMet 5D5 (人類化） - - cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） 單鍵scFab片 段，源自： - cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） - - scFv 或 scFab 附接至抗體之 位置 C-末端 隆凸重鏈 c-末端 隆凸重鏈 N-末端 隆凸重鏈 N-末端 隆凸重鏈 N-末端 隆凸重鏈 N-末端 隆凸重鍵 單鍵Fv連接 體 (G3S)4 - (g3s)4 (G3S)7 (G3S)7 連接逋 (scFab) - (G4S)5 GG (G4S)5 GG - - - 肽連接物 (g4s)2 (G4S)2 (G4S)2 (G4s)2 (G4S)2 (G4S)2 ScFv 或 ScFab 二硫鍵VH44/ VL100穩定 (是/ 否=+/-) + - - + - - -85- 147005.doc 201039851 在表3中：根據上述通用方法表現並純化三價雙特異性 <ErbB3-c-Met>抗體，其係基於全長ErbB-3抗體（Mab 205.10.2，經由免疫（用人類HER3-ECD對NMRI小鼠進行免 疫）及隨後之人類化來獲得）及一個源自c-Met抗體（cMet 5D5)之scFab片段（基礎結構示意圖參見圖5a)且具有表3中 所示之相應特徵。]\^1 205.10.2及^^6〖5〇5之相應¥^1及 VL展示於序列表中。 表3 : 分子名稱 雙特異性抗體之 scFv-Ab 命名 MH_TvAB29 MH_TvAB30 特徵： 隆凸-孔洞結合突 變 S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: L368'A:Y407'V S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: L368'A:Y407'V 全長抗體骨架， 源自： Mab 205.10.2 (人類化） Mab 205.10.2 (人類化） scFab片段，源自 cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） ScFv附接至抗體 之位置 C-末端隆凸重鏈 C-末端隆凸重鏈 連接體(scFab) ((G4S)5 gg (G4S)5 GG 肽連接物 (G4S)2 (G4S)2 ScFv 或 ScFab 二硫 鍵 VH44/VL100 穩 定(是/否=+/-) + - 在表4中：根據上述通用方法表現並純化三價雙特異性 <ErbB3-c-Met>抗體，其係基於全長ErbB-3抗體（HER3純系 147005.doc -86- 201039851 29)及源自c-Met抗體（cMet 5D5)之VH及VL結構域（基礎結 構示意圖參見圖3a、3c及3d-該等圖最終並未包括該表中 所示之所有特徵）且具有表4中所示之相應特徵。HER3純 系29及cMet5D5之相應VH及VL展示於序列表中。 表4:表現並純化表2中具有VHVL-Ab命名之三價雙特異 性抗體（亦參見下文實例及圖3c) 分子名稱 雙特異性抗體之 νΗνί^ΑΙ)命名 Her3/Met K HSS " Her3/Met SSK Η _ Her3/Met SSK HSS Her3/Met—1C Her3/Met_6C 特徵： 隆凸-孔洞結合突 變 S354C:T366W/ Y349,C:T366IS: L368,A:Y407,V T366W/ r366!S:L368'A: Υ407Ύ S354C:T366W/ Y349'C:T366，S: L368'A:Y407'V S354C:T366W/ Y349fC:T366'S: L368tA:Y407,V S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: L368fA:Y407'V 全長抗體骨架， 源自： Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (喪合） Her3 純系29 (嵌合） Her3 純系29 (嵌合） VHVL片段，源 自： cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） cMet 5D5 (人類化） VH附接至抗體 之位置 c-末端 隆凸重鏈 C-末端 隆凸重鏈 c-末端 隆凸重鏈 c-末端 隆凸重鏈 c-末端 隆凸重鏈 VL附接至抗體之 位置 C-末端 孔洞重鏈 C-末端 孔洞重鏈 C-末端 扎洞重鏈 C-末端 孔洞重鏈 c_末端 孔洞重鏈 肽連接物 (G4S)3 (G4S)3 (G4S)3 (G4S), (G4S)6 VHVL二硫鍵 VH44/VL100 穩 定(是/否=+/-) - + + - - 〇 〇 在表5中：根據上述通用方法表現並純化二價雙特異性 <ErbB3-c-Met>抗體，其係基於全長ErbB-3抗體（HER3 Mab 205 或人類化形式 Mab 205.10.1、Mab 205.10.2 或 Mab 205.10.2)及一個源自〇1^61抗體（〇]^61505)之3〇卩汪1)片段（基 礎結構示意圖參見圖7)且具有表5中所示之相應特徵。 -87- 147005.doc 201039851 HER3 Mab 205及cMet 5D5之相應VH及VL展示於序列表 中〇 表5 : 分子名稱雙特異 性抗體之scFv-Ab命名 MH_ BvAB21 ΜΗ 一 ΒνΑΒ28 特徵： 隆凸-孔洞 結合突變 S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: ί368Ά:Υ407Ύ S354C:T366W/ Y349'C:T366'S: L368'A:Y407'V 全長抗體骨架， Mab205 Mab205.10.2 源自： (嵌合） (人類化） 單鏈Fab片段， cMet 5D5 cMet 5D5 源自： (人類化） (人類化） scFab之附接位置 隆凸-CH2-CH3的片 段之N-末端 隆凸-CH2-CH3片 段之N-末端 單鍵Fab連接體 (G4S)5 GG (G4S)5 GG ScFab二硫鍵 VH44/VL100 穩 定(是/否=+/_) - + 實例1(圖8) 雙特異性抗體與癌細胞之細胞表面之結合 在基於流式細胞計數術之分析中在A431癌細胞上分析雙 特異性抗體與其位於細胞表面上之相應受體之結合特性。 將細胞與單-或雙特異性第一抗體一起培育且用偶合螢光 團且可特異性結合第一抗體Fc之第二抗體來檢測該等第一 抗體與其同源受體之結合。相對於第一抗體之濃度來繪製 該抗體之系列稀釋液之平均螢光強度，從而獲得S形結合 147005.doc • 88 · 201039851 曲線。藉由僅與二價5D5及Her3純系29抗體一起培育來驗 證c-Met及Her3之細胞表面表現。Her3/c-Met_KHSS抗體可 容易地結合A43 1之細胞表面。在該等實驗設定下，抗體僅 能經由其Her3部分來結合，因此平均螢光強度不會超過單 獨針對Her3純系29之染色。 實例2(圖9) 雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導c-Met受趙磷酸 化之抑制 為確認雙特異性抗體中c-Met部分之功能性，實施c-Met 磷酸化分析。在此實驗中，用雙特異性抗體或對照抗體處 理A549肺癌細胞或HT29結直腸癌細胞，之後暴露於HGF 中。然後溶解細胞並檢驗c-Met受體之磷酸化。兩種細胞 系皆可經HGF刺激，此結論可藉由免疫印跡中磷酸-c-Met 特異性區帶之出現來觀察得出。添加scFv抗體或5D5 Fab 片段可抑制受體磷酸化，此證實了 c-Met scFv組份之功能 性。 實例3(圖10) 雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導Her3受體磷酸化 之抑制 為確認雙特異性抗體十Her3部分之功能性，實施Her3磷 酸化分析。在此實驗中，用雙特異性抗體或對照抗體處理 MCF7細胞，之後暴露於HRG(神經生長因子）中。然後溶解 細胞並檢驗Her3受體之鱗酸化。Her3/c-Met_scFV—SSKH 及Her3/c-Met_KHSS抑制Her3受體磷酸化之程度與親代 147005.doc -89- 201039851
Her3純系29相同，表明抗體之Her3結合及功能性未受三價 抗體形式影響。 實例 4(圖 11、12、13) 雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導HUVEC增殖之 抑制 可實施HUVEC增殖分析來證實HGF之促有絲分裂效應。 將HGF添加至HUVEC可使增殖增強兩倍。以與雙特異性抗 體相同之濃度範圍添加人類IgG對照抗體對細胞增殖無影 響，而5D5 Fab片段可抑制HGF誘導增殖。若以相同濃度 使用，則Her3/c-Met_scFv_SSKH抗體可以與Fab片段（圖 11)相同之程度抑制增殖。單獨添加神經生長因子 (HRG)(數據未顯示）或與HGF組合添加不會進一步增強增 殖（圖12)。此證實此讀數使得可對雙特異性抗體形式中之 c-Met組份進行功能性分析而不干擾Her3組份。對Her3/c-Met_KHSS之滴定證實抗體具有弱抑制效應（圖13)。 Her3/Met-6C抗體之抑制效應更顯著，表明較長連接物可 改良抗體之效能。三種不同scFv抗體（Her3/c-MetscFvSSKH 、 Her3/c-Met_scFv_KH 、 Her3/c-Met_ scF v_KHSB)表現相同程度之增殖抑制。此證實了三價抗 體形式中c-Met組份之功能性。 實例5(圖14) 雙特異性Her3/c-Met抗體形式對癌細胞系A431增殖之抑制 若將A431接種於低血清培養基中，添加HGF除擴散外可 誘導較弱促有絲分裂效應。利用此作用來分析Her3/c- 147005.doc •90· 201039851
Met_scFv_SSKH及 Her3/c-Met_KHSS 對經 HGF 處理之 A43 1 之增殖的影響。實際上，雙特異性抗體可顯著抑制HGF誘 導之增殖增強（15%)。Her3/c-Met_scFv_SSKH 與 5D5 Fab 片 段同樣有效，而Her3/c-Met_KHSS必須以較高劑量（12.5 pg/mL，而非6.25 pg/mL)投用才能達成類似作用。對照人 類IgGl抗體對經HGF促進之A431細胞生長無影響。 實例6(圖15、16) 分析在癌細胞系A431中雙特異性Her3/c-Met抗體形式對 HGF誘導細胞-細胞擴散（擴散）之抑制 HGF誘導擴散包括細胞之形態改變，從而導致細胞變 圓、細胞產生偽足樣突出、紡錘體樣結構及獲得一定運動 性。實時細胞分析儀（Roche)測量給定細胞培養孔之阻抗 且由此可間接監測細胞形態及增殖之改變。將HGF添加至 A43 1及A549細胞導致阻抗改變，可監測阻抗且其隨時間 而變化。Her3/c-Met_KHSS 及 Her3/Met-6C 抑制 HGF誘導擴 散，且Her3/Met-6C更有效（20.7%及43.7%擴散抑制）（圖 15)。三種不同scFv抗體（Her3/c-Met_scFv_SSKH、Her3/c Met_scFv_KH、Her3/c-Met_scFv_KHSB)顯示抑制 HGF 誘 導擴散之中等效能，此結論可藉由繪製於未經處理對照曲 線附近之曲線的斜率降低（29%、5 1.9°/。及49.7%擴散抑制） 來觀察得出（圖16)。若以12.5 pg/mL之相同濃度來使用， 則 Her3/c-Met_scFv_KH抗體及 Her3/c-Met_scFv_KHSB 表現 同等有效。 實例7(圖17) 147005.doc -91- 201039851 在癌細胞系T47D、A549、A431及H441中分析Her3及 c-Met受體之細胞表面表現 為鑒定具有不同Her3及c-Met細胞表面比率之細胞系， 實施基於FACS之分析。T47D不顯示c-Met之細胞表面表 現，此與該細胞系中之mRNA含量一致（數據未顯示）。 A431及A549顯示相似之c-Met含量，而H441(過表現c-Met 之細胞系）具有極高c-Met含量。反之亦然，T47D具有極高 Her3含量，而A549僅顯示較低細胞表面表現。 實例8(圖18及下表） 分析在癌細胞系A431、A549及DU145中之抗體介導受體内 化（藉由流式細胞計數分析（FACS)測量） 已顯示將細胞與特異性結合Her3或c-Met之抗體一起培 育可誘發受體内化。為評價雙特異性抗體之内化能力，將 實驗設置設計為研究抗體誘導之受體内化。出於此目的， 將細胞與相應第一抗體在37°C下一起培育不同時間段（〇、 30、60及120分鐘（=0 h、1/2 h、1 h及2 h)。藉由將細胞快 速冷卻至4°C來終止細胞過程。使用偶合螢光體且特異性 結合第一抗體Fc之第二抗體來檢測與細胞表面結合之抗 體。抗體-受體複合物之内化減少了細胞表面之抗體-受體 複合物且導致平均螢光強度降低。在三種不同細胞系 (A431、A549、DU145)中研究内化。與Her3純系29—起培 育證實，此抗體可在A431及DU145中誘導受體内化，而該 效應在A549中顯著性較低，A549在其細胞表面上幾乎無 受體。與5D5 —起培育在A549、DU145及A431(顯著性較 147005.doc -92- 201039851 低）中導致良好受體内化。Her3/c-Met_scFv_SSKH在A549 及DU145中幾乎不顯示内化，且在A431中僅顯示微弱内化 (在2 h後為11%)。總之，scFv抗體形式僅導致極微弱受體 内化’此表明雙特異性抗體之作用與單特異性組份不同， 且表明使雙特異性scFv抗體同時結合兩種受體可將其捕獲 於細胞表面上^結果展示於圖18及下表中： 表6 :與親代單特異性Her3及cMet抗體相比，ErbB3受 體藉由雙特異性Her3/cMet抗體内化之％，其係在2 h後在 〇 ^ A43 1細胞上藉由FACS分析來測量。將在〇 h測量之細胞表 面上之ErbB3受體的測量％設定為細胞表面上之ErbB3受體 為 100%。 抗體 在2 h後在A431 細胞表面上測量 之Ert>B3受體％ 在2h後在A431細胞 (ATCC 編號 CRL-1555) 上ErbB3之内化％ (=100-細胞表面上之抗 體％) A)單特異性^出83> 親代抗體 <ErbB3>Mab 205(嵌合） 60 40 <ErbB3>HER3 純系 29 44 54 B)單特異性<〇-1^1> 親代抗體 Mab 5D5 61 39 C)雙特異性<£]^3-〇]^1> 抗體 — 147005.doc -93- 201039851 MH_TvAb_18 101 -1 ΜΗ—BvAb 一 20 103 -3 MH_TvAb_21 99 1 MH_TvAb22 99 1 MH_TvAb23 89 11 MH_TvAb24 90 10 MH_TvAb25 89 11 MH_BvAb28 102 -2 MH_TvAb29 95 5 MH_TvAb30 95 5 Her3/Met_6C 94 6 Her3/Met_SSKH 89 11 實例10(圖19) 分析在癌細胞系A431中HGF介導遷移之抗體依賴性抑制 活性c-Met信號傳導之一重要態樣係誘導遷移及侵入程 序。c-Met抑制性抗體之效能可藉由測量對HGF誘導細胞 遷移之抑制來確定。出於此目的，在不存在或存在雙特異 性抗體或IgG對照抗體時用HGF處理HGF可誘導癌細胞系 A43 1，且在Acea實時細胞分析儀上使用具有阻抗讀數器之 CIM板以時間依賴性方式測量穿過8 μιη管孔之遷移細胞 數。以獨立方式藉由對遷移細胞進行染色來定性地使細胞 遷移可見。該實例證實了 HGF誘導細胞遷移之劑量依賴性 抑制。 實例11(下表） 分析重組Her3、cMet及Fcylll受體與雙特異性抗體之依序 及同時結合 147005.doc -94- 201039851 為更好地理解雙特異性抗體結合Her3及c-Met之作用模 式，藉助表面電漿共振測量（Biacore)來測定受體結合狀 態。採用不同實驗設置來評價雙特異性抗體與重組Her3或 重組c-Met胞外結構域（ECD)之結合或同時與兩種胞外結構 域之結合。所測試所有雙特異性抗體皆能同時結合Her3及 c-MetECD。此外，測定重組Fcylll蛋白與抗體：Her3:cMet-ECD複合體之結合。甚至在兩種胞外結構域存在下所有抗 體亦皆可結合Fcylll受體，此為對雙特異性抗體進行糖改 造來增強NK依賴性效應子功能提供了強大的理論支持。 表7 : 抗體 同時結合兩 種受體 與c-Met之 親和力[nM] 與HER3之 親和力[nM] FcgRIIIa 結合 同時結合 FcgRIIIa MH_BvAb_20 是 1,2 0,9 + 是 MH_TvAb_21 是 0,8 1,8 ++ 是 MH_TvAb22 是 0,9 2,1 + 是 MH_TvAb23 是 1,8 U + 是 MH_TvAb24 是 1,3 1,6 + 是 MH_TvAb25 是 1,3 1,2 + 是 MH_TvAb30 是 1,4 1,3 +++ 是 實例12(圖20) 分析在HT29細胞中藉由雙特異性Her3/c-Met_scFv_SSKH 抗體進行之細胞間交聯 由於雙特異性抗體形式之多價性，細胞間交聯係一種亦 可解釋受體内化降低之可能的作用模式。為了更具體地研 147005.doc -95- 201039851 究此現象，設計解決此問題之實驗設置。出於此目的，將 在細胞表面上表現Her3及c-Met之HT29細胞分為兩個細胞 群。一個細胞群用PKH26 (SIGMA)染色，另一個用PKH67 (Sigma)染色，其中前者染成綠色，後者染成紅色，且該 兩種染料係膜染料。混合經染色細胞且與Her3/c-Met_scFv_SSKH—起培育。在基於流式細胞計數術之分析 中，細胞廣泛交聯可導致右上象限中之群中雙陽性（綠色+/ 紅色+)細胞增加。基於此實驗，在給定設定下未能觀察到 細胞間交聯增加。 實例13 雙特異性Her3/c-Met抗體之糖改造形式之製備 在MPSV啟動子及合成性多聚A位點上游之控制下將雙 特異性 Her3/c-Met 抗體 MH_TvAbl8、MH_TvAb21、 MH_TvAb 22及MH—TvAb 30之DNA序列亞選殖至哺乳動物 表現載體中，各載體具有EBVOriP序列。 雙特異性抗體係使用磷酸鈣轉染方法藉由用哺乳動物雙 特異性抗體表現載體共轉染HEK293-EBNA細胞來產生。 藉由磷酸鈣方法來轉染指數性生長之HEK293-EBNA細 胞。對於糖改造抗體之產生，用兩種額外質粒共轉染細 胞，一種用於融合GnTIII多肽表現（GnT-III表現載體），且 一種用於甘露糖苷酶II表現（高爾基體甘露糖苷酶II表現載 體），其比率分別為4:4:1:1。在T燒瓶中使用補加有10% FCS之DMEM培養基使細胞以黏附單層培養物形式生長， 且在其融合50%至80%時進行轉染。對於T150燒瓶之轉 147005.doc •96- 201039851 染，在轉染前24小時將1.5χ107個細胞接種於25 ml補加有 FCS(最終濃度為10% V/V)之DMEM培養基中，且將細胞在 37°C下於具有5% C02氣氛之培育器中置放過夜。對於欲轉 染之各T150燒瓶，藉由混合94 pg總質粒載體DNA(輕鏈與 重鏈表現載體各一半）、終體積為469 μΐ之水及469 μΐ 1M CaCl2溶液來製備DNA、CaCl2與水之溶液。向此溶液中添 加 938 μΐ 50 mM HEPES、280 mM NaCl、1.5 mM Na2HP04溶液（pH 7.05)，立即混合10秒且在室溫下靜置20 秒。用10 ml補加有2% FCS之DMEM稀釋懸浮液，且將其 添加至T150中來代替已有培養基。然後添加另外13 ml轉 染培養基。在37°C及5% C02下將細胞培育約17至20小時’ 然後將培養基更換為25 ml DMEM，10% FCS。在轉染後第 7天藉由以21〇xg離心15 min來收穫經調整培養基，對溶液 實施無菌過濾（0.22 μιη濾器）且以0.01% w/v之終濃度添加 疊氮化鈉，並保持在4°C下。 所分泌非岩藻糖化雙特異性糖改造抗體係藉由以下方式 來純化：實施蛋白質A親和層析，之後實施陽離子交換層 析，且最後在 Superdex 200 管柱（AmershamPharmacia)上實 施尺寸排除層析步驟，且將緩衝液更換為25 mM磷酸鉀、 125 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸溶液（pH 6.7)並收集純淨的 單體IgGl抗體。使用分光光度計根據在280 nm下之吸光度 來估計抗體濃度。 藉由MALDI/TOF-MS來分析附接至抗體Fc區域之寡糖， 如下文所述（實例14)。藉由PNGaseF消化自抗體酶促釋放 147005.doc •97· 201039851 寡糖，其中使該抗體固定在PVDF膜上或固定在溶液中。 所得含有所釋放寡糖之消化溶液直接經製備用於 MALDI/TOF-MS分析，或經EndoH糖苷酶進一步消化，之 後製備為用於MALDI/TOF-MS分析之樣品。 實例14 雙特異性Her3/c-Met抗體糖結構之分析 為確定含有岩藻糖與非岩藻糖（無岩藻糖）之寡糖結構之 相對比率，藉由MALDI-Tof-質譜法來分析純化抗體材料 之經釋放聚糖。為此，在37°C下將抗體樣品（約50 μβ)與存 於0.1 Μ碟酸鈉緩衝液（pH 6.0)中之5 mU Ν-糖普酶 卩（卩1>€^丫1116編號0^^-50108)—起培育過夜，以自蛋白質骨 架中釋放寡糖。隨後，使用NuTip-Carbon吸量管管嘴（得自 Glygen: NuTipl-10 μΐ’ 目錄Nr 編號 NT1CAR)分離所釋放 聚糖結構並進行除鹽。在第一步驟中，藉由依次用3成 1Μ NaOH、20 μί純水（例如得自Baker之HPLC梯度級，編 號4218)、3 μι 30% v/v乙酸及2〇 μΐ純水（同上）洗蘇來準備 NuTip-Carbon吸量管管嘴以供結合募糖。為此，將各溶液 裝載至NuTip-Carbon吸量管管嘴中之層析材料頂部且加壓 使其經過管嘴。此後，藉由將上述N-糖苷酶ρ消化物上下 抽吸四至五次來使對應於10叫抗體之聚糖結構結合至 NuTip-Carbon吸量管管嘴中之材料上。 以上述方式用20 μυ4水洗滌與NuTip-Carbon吸量管管嘴中之材料纟士人 糖’且分別用0.5 pL 10%及2·0 μί 20%乙腈逐步洗脫。在 此步驟中，將各洗脫溶液填充於〇·5 mL反應容器 °甲且各自 147005.doc -98- 201039851
上下抽吸四至五次。合併兩種洗脫液以供藉由MALDI-Tof 質譜法來分析。在此測量中，在MALDI靶上混合0.4 μί經 合併洗脫液與1.6 pL SDHB基質溶液（2,5-二羥基苯甲酸/2-羥基-5-甲氧基苯甲酸[Bruker Daltonics編號209813]，以5 mg/ml溶於20%乙醇/5 mM NaCl中）且用經適當調整之 Bruker Ultraflex T0F/T0F儀器加以分析。以例行方式記錄 單次實驗之50-300次脈衝並進行加和。藉由行以分析軟體 (Bruker Daltonics)評估所得譜圖並確定所檢測各峰之質 量。隨後，藉由比較各結構（例如分別具有或不具有岩藻 糖之複雜結構、雜合體結構及募_或高_甘露糖結構）質量之 計算值與理論預期值來將各峰分為含有岩藻糖或無岩藻糖 (非岩藻糖）之聚糖結構。 為確定雜合體結構之比率，同時跡糖苦酶F及糖芽内 切酶^化抗體樣品°N-糖㈣F自蛋白質骨架釋放所有 N-連接聚糖結構(複雜結構、雜合體結構及寡-及高甘露糖 結構），且糖苦内切酶H另外在聚糖還原端之兩個G1cNAc 殘基之間裂解所有雜合體型聚糖。隨後藉由MALm_T〇f質 谱法以與上述詩㈣苷_肖化樣品相同之方式處理並 =析該消化物。藉由比較N_糖㈣Μ化物與經合併Ν·糖 明内切酶⑴肖化物之譜圖，使用指定 降低程度來估計雜合體結構之相對含量。冑之^的 根據個別糖結構峰高度與所檢^有糖結構峰高产 ==計算各種糖結構之相對含量。岩_含量係;Η 相對於Ν-糖㈣F處理樣品中所蓉定所有糖結構（分 147005.doc -99- 201039851 別例如複雜結構、雜合體結構及募-及高-甘露糖結構）之百 分比。非岩藻糖化程度係無岩藻糖結構相對於N-糖苷酶F 處理樣品中所鑒定所有糖結構（分別例如複雜結構、雜合 體結構及寡-及高-甘露糖結構）之百分比。 實例15
雙特異性Her3/c-Met抗體之體外ADCC 本發明Her3/cMet雙特異性抗體在表現兩種受體之細胞 上顯示降低之内化。内化降低強有力地支持對該等抗體進 行糖改造之理論，此乃因延長抗體-受體複合物在細胞表 面上之暴露時間使得更有可能被Nk細胞所識別。内化降低 及糖改造可理解為抗體依賴性細胞毒性（ADCC)相對於親 代抗體有所增強。證實該等效應之體外實驗設置可設計為 使用在細胞表面上表現Her 1及cMet二者之癌細胞（例如 A43 1)及效應子細胞（例如Nk細胞系或PBMC細胞系）。使腫 瘤細胞與親代單特異性抗體或雙特異性抗體一起預培育最 多24 h，之後添加效應子細胞系。量化細胞溶解且使得可 辨別單-與雙特異性抗體。 用胰蛋白酶/EDTA(Gibco編號25300-054)收集指數生長 期之靶細胞，例如A431(在RPMI1640+2 mM L-麩胺醯胺 + 10% FCS中培養，可表現Her3及cMet二者）。在實施洗滌 步驟並檢查細胞數量及活力後，在37°C下於細胞培育器中 用|弓黃綠素（111^1；1*〇邑611編號〇3100]^1?;在1個小瓶中，約黃 綠素再懸浮於50 μΐ DMSO中，可用於標記存於5 ml培養基 中之5χ106個細胞）將所需等份樣品標記30 min。此後，用 147005.doc -100- 201039851 AIM-V培養基將細胞洗滌三次，檢查細胞數量及活力並將 細胞數量調整至3xl05/ml。 同時，根據製造商方案（洗滌步驟：lx400g及2x350g， 每次10 min)藉由密度梯度離心法（Histopaque-1077，Sigma 編號H8889)來準備作為效應子細胞之PBMC。檢查細胞數 量及活力並將細胞數量調節至1.5xl07/ml。 將100 μΐ經鈣黃綠素染色之靶細胞平鋪於圓底96孔板 中，添加50 μΐ經稀釋抗體及50 μΐ效應子細胞。在某些實 驗中將把細胞與Redimune ® NF液體（ZLB Behring)混合， 濃度為 10 mg/ml Redimune。 使用自發溶解作為對照，其係藉由在不存在抗體之情形 下共培養靶細胞及效應子細胞來測定；且使用最大溶解作 為對照，其係僅藉由靶細胞之1 % Triton X-1 00溶解來測 定。在37°C下於加濕細胞培育器中將板培育4小時。 根據製造商說明書使用細胞毒性檢測套組（LDH檢測套 組，Roche編號1 644 793)藉由測量自受損細胞釋放之LDH 來評價靶細胞之殺滅。簡言之，將100 μΐ來自各孔之上清 液與100 μΐ來自套組之受質於透明平底96孔板中混合。在 ELISΑ讀數器中於490 nm下經至少10 min測定受質顏色反 應之Vmax值。如下所述計算特定抗體介導殺滅百分比： ((A-SR)/(MR-SR)xlOO，其中A係在特定抗體濃度下之平均 Vmax，SR係自發釋放之平均Vmax且MR係最大釋放之平 均 Vmax。 實例16 147005.doc -101 - 201039851 雙特異性Her3/cMet抗體在具有自分泌HGF環之皮下異種 移植模型中之體内效能 皮下U87MG膠質母細胞瘤模型具有自分泌HGF環且在細 胞表面上顯示Her3及c-Met。兩種受體在腫瘤外植體中皆 經磷酸化，溶解該等外植體且對其實施免疫印跡分析（數 據未顯示）。在標準細胞培養條件下使U87MG細胞維持在 對數生長期。將1 X 107個細胞移植入SCID米色小鼠中。在 出現腫瘤且尺寸到達100-150 mm3後開始處理。用20 mg/kg(抗體/小鼠）之負荷劑量處理小鼠，且隨後每週一次 用10 mg/kg(抗體/小鼠）處理。每週兩次測量腫瘤體積且同 時監測動物體重。比較單一處理及單一抗體之組合與使用 雙特異性抗體之治療。 實例17 雙特異性Her3/cMet抗體在具有旁分泌HGF環之皮下異種 移植模型中之體内效能 經Mrc-5細胞共注射之皮下BxPc_3模型模擬c_Met之旁分 泌活化環。BxPc-3在細胞表面上表現c_Met以及Her3。在 標準細胞培養條件下使BxPc_3及mix-5細胞維持於對數生 長期。以10:1之比注射Bxpc_3及Mrc-5細胞，其中注射 1x10個BxPC-3細胞及ιχ1〇6個Mrc_5細胞。將細胞移植入 SCID米色小鼠中。在出現腫瘤且尺寸到達100-150 mm3後 開始處理。用20 mg/kg(抗體/小鼠）之負荷劑量處理小鼠， 且隨後每週—次用10 mg/kg(抗體/小鼠）處理。每週兩次測 里腫瘤體積且同時監測動物體重。比較單一處理及單一抗 147005.doc 201039851 體之組合與使用雙特異性抗體之治療。 實例18 雙特異性Her3/cMet抗體在具有旁分泌HGF環之皮下異種 移植模型中之體内效能
使用人類HGF之轉基因免疫妥協小鼠作為全身性HGF之 來源。該等小鼠已闡述於文獻中且可自Van Andel研究所 獲得。可使用皮下注射在細胞表面上表現兩種抗體之癌細 胞系（例如BxPc-3或A549)來研究雙特異性抗體靶向Her3及 c-Met之效能。在標準細胞培養條件下使細胞維持在對數 生長期。將ΙχΙΟ7個細胞移植入具有HGF轉基因之SCID米 色小鼠中。在出現腫瘤且尺寸到達10〇_15〇 mni3後開始處 理。用20 mg/kg(抗體/小鼠）之負荷劑量處理小鼠，且隨後 每週一次用10 mg/kg(抗體/小鼠）處理。每週兩次測量腫瘤 體積且同時監測動物體重。比較單一處理及單一抗體之組 合與使用雙特異性抗體之治療。 實例19 雙特異性Her3/cMet抗體在具有旁分泌HGF環之原位異種 移植模型中之體内效能 A549癌細胞在細胞表面上表現Her3以及c_Met。在標準 細胞培養條件下使A549細胞維持在對數生長期。將1 x i〇7 個細胞移植入SCID米色小鼠中。在出現腫瘤且尺寸到達 100-150 mm3後開始處理。用2〇 mg/kg(抗體/小鼠）之負荷 劑量處理小鼠，且隨後每週一次用丨〇 mg/kg(抗體/小鼠）處 理。每週兩次測量腫瘤體積且同時監測動物體重。比較單 147005.doc 103· 201039851 一處理及單一抗體之組合與使用雙特異性抗體之治療。 【圖式簡單說明】 圖1不含CH4結構域之全長抗體的示意性結構，其可以 兩對重鏈及輕鏈特異性結合第一抗原1，該等重鏈及輕鏈 以典型順序包含可變結構域及恆定結構域。 圖2a-c二價雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體之示意性結 構，其包含：a)全長抗體中特異性結合人類ErbB-3之輕鏈 及重鏈；及b)全長抗體中特異性結合人類c-Met之輕鏈及 重鏈，其中恆定結構域CL及CH1、及/或可變結構域VL及 VH彼此替代，該等鏈經隆凸-孔洞結合技術修飾。 圖3本發明三價雙特異性體之示意圖， 其包含特異性結合第一抗原1之全長抗體，該全長抗體上 融合有 a) 圖3a :兩個多肽VH及VL(VH及VL結構域二者一起形 成特異性結合第二抗原2之抗原結合位點）； b) 圖3b :兩個多肽VH-CH1及VL-CL(VH及VL結構域二 者一起形成特異性結合第二抗原2之抗原結合位點）； 圖3c :本發明三價雙特異性抗體之示意圖，其包含特異 性結合第一抗原1之全長抗體，該全長抗體上融合有兩個 多肽VH及VL(VH及VL結構域二者一起形成特異性結合第 二抗原2之抗原結合位點）且具有「隆凸及孔洞」； 圖3d :本發明三價雙特異性抗體之示意圖，其包含特異 性結合第一抗原1之全長抗體，該全長抗體融合有兩個多 肽VH及VL(VH及VL結構域二者一起形成特異性結合第二 147005.doc -104- 201039851 抗原2之抗原結合位點，其中該等VH及VL結構域在VH44 位與VL100位之間包含鏈間二硫橋）且具有「隆凸及孔 洞」。 圖4 4a :四種可能的單鏈Fab片段之示意性結構 4b :兩種單鏈Fv片段之示意性結構 圖5三價雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體之示意性結構，其 包含全長抗體及一個單鏈Fab片段（圖5a)或一個單鏈Fv片 段（圖5b)-具有隆凸及孔洞之雙特異性三價實例。 ^ 圖6四價雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體之示意性結構，其 包含全長抗體及兩個單鏈Fab片段（圖6a)或兩個單鏈Fv片段 (圖6b)-c-Met結合位點源自c-Met二聚化抑制性抗體。 圖7二價雙特異性<ErbB3-c-Met>抗體之示意性結構，其 中一個Fab臂經scFab片段替代。 圖8雙特異性抗體與癌細胞之細胞表面之結合。 圖9a-c雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導c-Met受 _ 體磷酸化之抑制 ❹ 圖10a-b雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HRG誘導Her3受 體磷酸化之抑制。 圖11、12及13雙特異性Her3/c-Met抗體形式對HGF誘導 HUVEC增殖之抑制。 圖14雙特異性Her3/c-Met抗體形式對癌細胞系A431增殖 之抑制。 圖15及16分析在癌細胞系A431中雙特異性Her3/c-Met抗 體形式對HGF誘導細胞-細胞擴散（擴散）之抑制。 147005.doc -105- 201039851 圖17分析Her3及c-Met在四種不同癌細胞系中之細胞表 面表現。 圖18分析在癌細胞系A431、A549及DU145中之抗體介導 受體内化。 圖19分析HGF誘導之A43 1細胞之細胞遷移。A.在劑量 遞增之雙特異性抗體MH_TvAbl8存在下測量A431癌細胞 之遷移，其隨阻抗而變化。24 h後展示之終點讀數。B. 以與雙特異性抗體類似之濃度範圍添加非特異性人類IgG 對照來作為對照。 圖 20a-b分析在 HT29細胞（用 PKH26 & PKH67 (SIGMA)染 色）中由雙特異性Her3/c-Met_scFv_SSKH抗體導致之細胞 間交聯。 圖 21 雙特異性 Her3/c-Met抗體 HEr3/Met_scFvSS_KH(左 側）及 Her3/Met_scFv_KH(右側）之 SDS PAGE。 圖 22 雙特異性 Her3/c-Met 抗體 HEr3/Met_scFvSSKH(圖 22a)及 Her3/MetscFv_KH(圖 22b)之 HP SEC 分析（純化蛋 白）。 147005.doc -106- 201039851 序列表 <110>瑞士商羅齊克雷雅公司 <120〉雙特異性抗_ErbB-3/抗-c-Met抗體
<130> 26064 FT <140> 099110644 <141> 2010-04-06 <150> EP 09005110.3 <151> 2009-04-07 <160> 71 <170> Patentln version 3.2 Ο
<210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> 小家鼠（mus musculus) <400> 1
Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala 20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45
Met Gly Tyr lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Asn Arg Phe Ser 工le Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 147005·序列表.doc 201039851 <210> 2 <211> 107 <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400> 2
Asp lie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Ser Cys Arg Ala Arg Gin Asp lie Ser Asn Tyr 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Trp 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 3 <211〉 119 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 重鏈可變結構域<C-Met> Mab 5D5 <400> 3
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 2- 147005-序列表.doc 201039851 35 40 45
Gly Met lie Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Thr Tyr Arg Ser Tyr Val 100
Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 113 <212〉 PRT <213> 人工的 <220> <223>輕鏈可變結構域<c-Met> Mab 5D5 <400> 4
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr 20 25 30
Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95 147005-序列表.doc 201039851
Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 100 105 no
Lys <210> 5 <211> 448 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223〉 重鏈Her3·純系29 <400> 5
Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Ala 20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp lie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45
Met Gly Tyr lie Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60
Lys Asn Arg Phe Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe 65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 4· 147005·序列表.doc 201039851
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190
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Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270
G
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 2Ί5 280 285
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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320
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G
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300
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Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415
Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 40 <211> 214 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 輕鏈 <ErbB3-c-Met> Her3/Met_scFvKHSBSS <400> 40 445
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Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe. Ser Gly 50 55 60
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Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Phe Pro Trp 85 90 95 •81· 147005-序列表.doc 201039851
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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 82 147005-序列表.doc 201039851
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
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O
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
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G
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Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Lys Trp Tyr 195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 o
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Ala Leu Pro Ala· Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin 260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 o
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn lie 340 345 350
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Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe 180 185 190 lie Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr lie Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp 195 200 205
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Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp Thr Arg Pro 1370 1375 1380
Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser 1385 1390 <21〇> 46 -93- 147005-序列表.doc 201039851 <211〉 1342 <212> PRT <213〉 智人 <400> 46
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Arg Cys Trp Gly Pro Gly Ser Glu Asp Cys Gin Thr Leu Thr Lys Thr 94· 147005-序列表.doc 201039851 195 200 205 工le Cys Ala Pro Gin Cys Asn Gly His Cys Phe Gly Pro Asn Pro Asn 210 215 220
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Gly Lys Val Cys Asp Pro Leu Cys Ser Ser Gly Gly Cys Trp Gly Pro 500 505 510
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G
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Glu Leu Gly Tyr Glu Tyr Met Asp Val Gly Ser Asp Leu Ser Ala 1220 1225 1230
Ser Leu Gly Ser Thr Gin Ser Cys Pro Leu His Pro Val Pro lie 1235 1240 1245
Met Pro Thr Ala Gly Thr Thr Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Tyr Met 1250 1255 1260
Asn Arg Gin Arg Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gly Asp Tyr Ala Ala 1265 1270 1275 -99- 147005-序列表.doc 201039851
Met Gly Ala Cys Pro Ala Ser Glu Gin Gly Tyr Glu Glu Met Arg 1280 1285 1290
Ala Phe Gin Gly Pro Gly His Gin Ala Pro His Val His Tyr Ala 1295 1300 1305
Arg Leu Lys Thr Leu Arg Ser Leu Glu Ala Thr Asp Ser Ala Phe 1310 1315 1320
Asp Asn Pro Asp Tyr Trp His Ser Arg Leu Phe Pro Lys Ala Asn 1325 1330 1335
Ala Gin Arg Thr 1340 <210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 47
Gin Gly Gin Met Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Ser 20 25 30
Tyr lie Ser Trp Leu Lys Gin Lys Pro Arg Gin Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Ala Trp lie Tyr Ala Gly Thr Gly Ser Pro Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Thr Gly Lys Ala Gin Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala lie Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Arg Asp Tyr Tyr Ser Asn Ser Leu Thr Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 -100- 147005·序列表.doc 115 <210> 48 <211> 113 <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400> 48 201039851
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 120
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr 15 10
Glu Asn Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 50 55 60
Pro Asn Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser.Gly Thr Asp Phe Thr 65 70 75 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ser lie Tyr Tyr Cys 85 90
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 100 105 110
Ala Gly 15 Asn Ser Gly Gin Gly Val
Leu Ala 80
Gin Ser 95
Glu lie <210> 49 <211> 120 <212> PRT <213〉人工的 <220> <223〉重鏈可變結構域VH, Mab 205.10 <400> 49
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 15 10 101 -
Gly Ala 15 147005·序列表.doc 201039851
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Ser 20 25 30
Tyr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Tyr Ala Gly Thr Gly Ser Pro Ser Tyr Asn Gin Lys Leu 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg His Arg Asp Tyr Tyr Ser Asn Ser Leu Thr Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211〉 113 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223〉輕鏈可變結構域VL, Mab 205.10.1 <400> 50
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 102- 147005-序列表.doc 201039851
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Ser 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He 100 105 110
Lys <210> 51 <211> 113
<212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 輕鏈可變結構域VL, Mab 205.10.2 <400> 51
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Val Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Ser 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110 -103- 147005-序列表.doc 201039851
Lys <210> 52 <211> 113 <212> PRT <213〉 人工的 <220〉 <223> 輕鏈可變結構域VL, Mab 205.10.3 <400> 52
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 工le Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ser lie Tyr Tyr Cys Gin Ser 85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie 100 105 110
Lys <210> 53 <211> 11 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223〉重鏈 CDR3H, Mab 205.10 <400> 53 104- 147005·序列表.doc 201039851
His Arg Asp Tyr Tyr Ser Asn Ser Leu Thr Tyr 15 10 <210> 54 <211> 17 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 重鏈 CDR2H, Mab 205.10 <400> 54
Trp lie Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu Gin 15 10 15
Gly
<210> 55 <211> 10 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223〉重鏈 CDR1H, Mab 205.10 <400> 55
Gly Tyr Thr Phe Arg Ser Ser Tyr lie Ser 15 10 <210> 56 <211> 9 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 輕鏈 CDR3L, Mab 205.10 <400> 56
Gin Ser Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 <210〉 57 <211> 7 <212> PRT <213> 人工的 -105- 147005-序列表.doc 201039851 <220> <223> 輕鏈 CDR2L, Mab 205.10 <400> 57
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> <211> <212> <213> 58 17 PRT 人工的 <220> <223> 輕鏈 CDR1L (變體 1), Mab 205.10 <400> 58
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <21〇> <211> 59 17 <212> <213> PRT 人工的 <220> <223> 輕鏈 CDR1L (變體 2), Mab 205.10 <400> 59
Lys Ser Ser Gin Ser Val Leu Asn Ser Gly Asn Gin Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Thr <210> <211> <212> <213> 60 9 PRT 小家鼠 <400> 60
Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr 1 5 106- 147005-序列表.doc 201039851
<210> 61 <211> 16 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 61 Tyr lie ：Ser Tyr Gly 1 5 <210〉 62 <211> 6 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 62 Ser Ala .Tyr Tyr Trp 1 5 <210〉 63 <211> 9 <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400> 63 Gin Gin Gly Asn Thr 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 64 Tyr Thi ' Ser Arg Leu 1 5 <210> 65 <211> 11 <212> PRT <213> 小家鼠 <400> 65
Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asn 10 15
Arg Ala Arg Gin Asp lie Ser Asn Tyr Leu Asn 15 10 147005-序列表.doc · 107· 201039851 <210> 66 <211> 10 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 重鏈 CDR3H, <c-Met> Mab 5D5 <400> 66
Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr 15 10 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 重鍵 CDR2H, <c-Met> Mab 5D5 <400> 67
Met 工le Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe Lys 15 10 15
Asp <210> 68 <211> 5 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 重鏈 CDR1H, <c-Met> Mab 5D5 <4 00> 68
Ser Tyr Trp Leu His 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 輕鍵 CDR3L, <c-Met> Mab 5D5 108- 147005-序列表.doc 201039851 <400> 69
Gin Gin Tyr Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 70 <211〉 Ί <212> PRT <213〉 人工的 <220> <223> 輕鏈 CDR2L, <c-Met> Mab 5D5 <400> 70
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 71 <211> 17 <212> PRT <213〉人工的 <220> <223> 輕鏈 CDR1L, <c-Met> Mab 5D5 <400> 71
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser Gin Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala
-109- 147005-序列表.doc
Claims (1)
- 201039851 七、申請專利範圍： 1. 一種雙特異性抗體，其特異性結合人類ErbB-3及人類 c-Met，其包含特異性結合人類ErbB-3之第一抗原結合位 點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位點，其特徵 在於在流式細胞計數分析中在2小時後對A43 1細胞測量 時，與抗體不存在下ErbB-3之内化相比，該雙特異性抗 體顯示ErbB-3之内化不超過15%。 2. 如請求項1之抗體，其特徵在於其係特異性結合人類 〇 ErbB-3及人類c-Met之二價或三價雙特異性抗體，其包含 一個或兩個特異性結合人類ErbB-3之抗原結合位點及一 個特異性結合人類c-Met之抗原結合位點。 3. 如請求項1之抗體，其特徵在於其係特異性結合人類 ErbB-3及人類c-Met之三價雙特異性抗體，其包含兩個特 異性結合人類ErbB-3之抗原結合位點及一個特異性結合 人類c-Met之第三抗原結合位點。 4. 如請求項1之抗體，其特徵在於其係特異性結合人類 ^ ErbB-3及人類c-Met之二價雙特異性抗體，其包含一個特 異性結合人類ErbB-3之抗原結合位點及一個特異性結合 人類c-Met之第二抗原結合位點。 5. 一種雙特異性抗體，其特異性結合人類ErbB-3及人類 c-Met，其包含特異性結合人類ErbB-3之第一抗原結合位 點及特異性結合人類c-Met之第二抗原結合位點，其特徵 在於 i) 該第一抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含 147005.doc 201039851 SEQ ID NO: 53 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 54 之 CDR2H區、及SEQ ID NO:55之CDR1H區，且在該輕 鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 56之CDR3L區、 SEQ ID NO: 57 之 CDR2L 區、及 SEQ ID N〇:58 之 0〇111[區或8£(5 1〇]^〇:59之€〇111]^區；及 該第二抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含 SEQ ID NO: 66 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 67 之 CDR2H區、及SEQ ID NO: 68之CDR1H區，且在該輕 鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 69之CDR3L區、 SEQ ID NO: 70 之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO: 71 之 CDR1L區； ii)該第一抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含 SEQ ID NO: 60 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 61 之 CDR2H區、及SEQ ID NO:62之CDR1H區，且在該輕 鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 63之CDR3L區、 SEQ ID NO: 64 之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO:65 之 〇0111[區或8£(^10]^0:66之€01111^區；及 該第二抗原結合位點在該重鏈可變結構域中包含 SEQ ID NO: 66 之 CDR3H 區、SEQ ID NO: 67 之 CDR2H區、及SEQ ID NO: 68之CDR1H區，且在該輕 鏈可變結構域中包含SEQ ID NO: 69之CDR3L區、 SEQ ID NO: 70之 CDR2L 區、及 SEQ ID NO: 71 之 CDR1L 區。 6_如請求項5之雙特異性抗體，其特徵在於 147005.doc 201039851 i) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 47作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 48作為輕鏈可變結構 域，及該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； ii) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 50作為輕鏈可變結構 域，及該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； iii) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 51作為輕鏈可變結構 域，及該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域； iv) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 52作為輕鏈可變結構 域，及該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 變結構域；或 v) 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 1作為重鏈可 變結構域，且包含SEQ ID NO: 2作為輕鏈可變結構 域，及該第二抗原結合位點包含SEQ ID NO: 3作為 重鏈可變結構域，且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可 147005.doc 201039851 變結構域。 7. 如請求項5之雙特異性抗體，其特徵在於 該第一抗原結合位點包含SEQ ID NO: 49作為重鏈可變結 構域，且包含SEQ ID NO·· 51作為輕鏈可變結構域，及該 第二抗原結合位點包含SEQ ID N〇: 3作為重鏈可變結構 域’且包含SEQ ID NO: 4作為輕鏈可變結構域。 8. 如請求項1至7中任一項之雙特異性抗體，其特徵在於包 含IgGl或IgG3亞類之恆定區。 9. 如請求項1至7中任一項之雙特異性抗體，其特徵在於該 抗體係在Asn297經糖鏈糖基化，其中該糖鏈内岩藻糖之 量為6 5 %或更低。 1 〇 · —種核酸，其編碼如請求項丨至9中任一項之雙特異性抗 體。 11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之雙特 異性抗體。 12. 如请求項11之醫藥組合物，其用於治療癌症。 13. 如請求項1至7中任—項之雙特異性抗體，其用於治療癌 症。 14. 一種如請求項1至9中任—項之雙特異性抗體之用途，其 用於製造治療癌症之藥物。 147005.doc
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