MX2011010166A

MX2011010166A - Anticuerpos biespecificos anti-erbb-3/anti-c-met.

Info

Publication number: MX2011010166A
Application number: MX2011010166A
Authority: MX
Inventors: Eike Hoffmann; Ulrich Brinkmann; Pablo Umana; Birgit Bossenmaier; Jan Olaf Stracke; Christian Klein; Wilma Lau; Juergen Michael Schanzer; Gerhard Niederfellner; Claudio Sustmann
Original assignee: Roche Glycart Ag
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2011-10-11
Also published as: TW201039851A; ECSP11011387A; WO2010115552A1; JP5587975B2; CR20110466A; SG175081A1; US20100256339A1; CO6420355A2; IL215062A0; US20140135482A1; EP2417159A1; KR20110124369A; BRPI1012589A2; AR076196A1; RU2011144312A; AU2010233994A8; CA2757531A1; AU2010233994A1; JP2012522524A; CN102378768A

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos biespecíficos contra la ErbB-3 humana y contra la c-Met humana, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos y a usos de los mismos.

Description

ANTICUERPOS BIESPECIFICOS ANTI-ERBB-3/ANTI-C-MET Campo de la Invención La presente invención se refiere a anticuerpos biespecificos contra la ErbB-3 humana y contra la c-Met humana, a métodos para su producción, a composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos y a usos de los mismos.

Antecedentes de la Invención Familia de proteinas ErbB La familia de proteinas ErbB está formada por 4 miembros ErbB-1, también llamada receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ErbB-2, también llamada HER2 en humanos y neu en roedores, ErbB-3, también llamada HER3 y ErbB-4, también llamada HER4.

ErbB-3 y anticuerpos anti-ErbB-3 La Erb-B3 (también conocida como homólogo 3 del oncogén de la leucemia viral eritroblástica V-erb-b2 (aviar) ; ERBB3, HER3; SEC ID NO: 46) es una proteina unida a membrana, que tiene un dominio de fijación sobre neurregulina, pero no un dominio cinasa activo (Kraus, M.H. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 9193-7, 1989, P lowman, G.D. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 4905-9, 1990; Katoh, M. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 1189-97, 1993) . Puede fijarse, pues, sobre su ligando, pero no transporta la señal Ref.223436 a la célula por fosforilación de la proteina. Sin embargo, forma heterodimeros con otros miembros de la familia de receptores de EGF, que tienen actividad de cinasa. La heterodimerización conduce a la activación de las trayectorias que conducen a la proliferación o la diferenciación celular. Se ha publicado la amplificación de este gen y/o la sobreexpresión de su proteina en numerosos tipos de cáncer, incluyendo tumores de próstata, vejiga y mama. Se han caracterizado variantes alternativas de empalme transcripcional que codifican a diferentes isoformas. Una isoforma carece de la región intermembrana y se secreta fuera de la célula. Esta forma actúa modulando la actividad de la forma fijada sobre la membrana (Corfas, G. y col., ?_(6) , 575-80, 2004) . Se cree que la ERBB3, cuando esta activada, se convierte en sustrato de la dimerización y posterior fosforilación con la ERBB1, ERBB2 y ERBB . Al igual que muchas tirosina-cinasas de receptor, la ERBB3 se activa con un ligando extracelular . Los ligandos conocidos que sé unen a la ERBB3 incluyen a la herregulina.

Ya se conocen anticuerpos anti-ErbB-3 que pueden utilizarse para la terapia del cáncer, por ejemplo de WO 97/35885, WO 2007/077028 o WO 2008/100624. c-Met y anticuerpos anti-c-Met El MET (factor de transición epitelio-mesinquima) es un proto-oncogén que codifica a una proteina MET (también conocida como c-Met; receptor del factor de crecimiento de hepatocitos = HGFR; receptor de HGF; receptor del factor de diseminación; receptor del SF; SEC ID NO: 45) (Dean, M. y col., Nature 318, 385-8, 1985; Chan, A.M. y col., Oncogene 1, 229-33, 1987; Bottaro, D.P. y col., Science 251, 802-4, 1991; Naldini, L. y col., E BO J. 10, 2867-78, 1991; Maulik, G. y col., Cytokine Growth Factor Rev. 13, 41-59, 2002). El MET es un receptor de membrana que es esencial para el desarrollo embrionario y la curación de heridas. El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es el único ligando Conocido del receptor del MET. El MET se expresa normalmente en células de origen epitelial, mientras que la expresión del HGF se restringe a células de origen mesenquimal. A raíz de la estimulación del HGF, el MET induce diversas respuestas biológicas que colectivamente dan lugar a un programa conocido como crecimiento invasivo. La activación anormal del MET en el cáncer guarda relación con un mal pronóstico, en donde el MET aberrantemente activo desencadena el crecimiento tumoral, la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis ) que abastecen al tumor con nutrientes y el cáncer se propaga a otros órganos (metástasis) . El MET se desregula en muchos tipos de enfermedades malignas humanas, incluidos el cáncer de riñon, de hígado, de estómago, de mama y de cerebro. Normalmente, solo las células madre y las células progenitoras expresan el MET, lo cual permite que estas células crezcan de modo invasivo, con el fin de generar nuevos tejidos en un embrión o de regenerar tejidos dañados en un adulto. Sin embargo, se cree que las células madre cancerígenas secuestran la capacidad de las células madre normales de expresar el MET y de este modo llegan a provocar la persistencia del cáncer y su propagación a otras partes del cuerpo.

El producto del proto-oncogén MET es el receptor del factor de crecimiento de hepatocitos y codifica la actividad de la tirosina-cinasa . La proteína precursora primaria de cadena simple se descompone después de la traducción para producir las subunidades alfa y beta, que se unen mediante un disulfuro para formar el receptor maduro. Varias mutaciones del gen MET se han asociado con el carcinoma papilar renal.

Los anticuerpos anti-c-Met se conocen por ejemplo de los documentos US 5,686,292, US 7,476,724, WO 2004072117, O 2004108766, WO 2005016382, WO 2005063816, WO 2006015371, WO 2006104911, WO 2007126799 o WO 2009007427.

Se conocen los péptidos de unión con el c-Met por ejemplo por los artículos de Matzke, A. y col., Cáncer Res ^5_ (14), 6105-10, 2005; y Tam, Eric M. y col., J. Mol. Biol. 385, 79-90, 2009.

Anticuerpos biespecificos En fecha recientes se ha desarrollado una gran variedad de formatos de anticuerpos recombinantes, por ejemplo anticuerpos biespecífieos tetravalentes por fusión de por ejemplo, un formato de anticuerpo IgG con dominios de cadena simple (véase por ejemplo Coloma, M.J. y col., Nature Biotech. 15, 159-163, 1997; O 2001/077342; y Morrison, S.L., Nature Biotech. 25, 1233-1234, 2007) .

Se han desarrollado también varios formatos nuevos, en los que ya no se conserva la estructura del núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) , por ejemplo en los dia-, tria- o tetracuerpos , minicuerpos, varios formatos de cadena simple (scFv, Bis-scFv) , que son capaces de unirse a dos o más antígenos (Holliger, P. y col., Nature Biotech. 23 , 1126-1136, 2005; Fischer, N . , Léger, O., Pathobiology 74, 3-14, 2007; Shen, J. y col., Journal of Immunological Methods 318, 65-74, 2007; Wu, C. y col., Nature Biotech. 25, 1290-1297, 2007) .

En todos estos formatos se emplean enlazadores para fusionar el núcleo del anticuerpo (IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) con otra proteína de unión (por ejemplo scFv) o para fusionar por ejemplo dos fragmentos Fab o las scFv (Fischer, N., Léger, O., Pathobiology 7_4' 3-14, 2007). Hay que tener en cuenta que puede ser deseable la conservación de las funciones efectoras, por ejemplo la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) , que vienen mediadas por la fijación del receptor del Fe, conservando un grado elevado de similitud con los anticuerpos de origen natural.

En O 2007/024715 se describen inmunoglobulinas duales de dominio variable diseñadas para que sean proteínas de fijación multiespecífica y multivalente . En la patente US 6,897,044 se describe un proceso para la obtención de dímeros de anticuerpo biológicamente activos. En la patente US 7,129,330 se describe un constructo de anticuerpo multivalente FV que tiene por lo menos cuatro dominios variables unidos entre sí mediante enlazadores peptxdicos. En el documento US 2005/0079170 se describen estructuras de unión de antígenos dímeros y multímeros. La proteína de unión a antígenos monoespecífieos tri- o tetravalentes contiene tres o cuatros fragmentos Fab unidos entre sí mediante enlace covalente gracias a una estructura conectora, la proteína no es la inmunoglobulina natural, según se describe en US 6,511,663. En WO 2006/020258 se describen anticuerpos biespecífieos tetravalentes que pueden expresarse eficazmente en células procariotas y eucariotas y que son útiles para métodos terapéuticos o de diagnóstico. En US 2005/0163782 se describe un método para separar o, con preferencia, para sintetizar dímeros que están unidos por lo menos un enlace disulfuro entre cadenas a partir de dímeros que no están unidos por lo menos mediante un enlace disulfuro entre las cadenas a partir de una mezcla que contiene los dos tipos de polipéptidos dímeros. Los receptores tetravalentes biespecificos se han descrito en US 5,959,083. Los anticuerpos modificados que tienen tres o más sitios funcionales de fijación sobre antigenos se han descrito en WO 2001/077342.

Los polipéptidos multiespecificos y multivalentes de fijación sobre antigenos se han descrito en WO 1997/001580. En WO 1992/004053 se describen homoconj ugados , obtenidos por ejemplo a partir de anticuerpos monoclonales de la familia IgG, que se fijan sobre él mismo determinante antigénico y que están unidos con enlace covalente mediante una reticulación realizada por síntesis. En el documento WO 1991/06305 se describen anticuerpos monoclonales oligómeros que tienen una gran avidez de antigeno, los oligómeros, normalmente de la familia IgG, se secretan con dos o más monómeros de inmunoglobulina asociados entre si para formar moléculas de IgG tetravalentes o hexavalentes . Los anticuerpos derivados de ovejas y los constructos de anticuerpos modificados se han descrito en US 6,350,860, pueden utilizarse para tratar enfermedades, en las que la actividad del interferón-gamma sea patogénica. En US 2005/0100543 se describen constructos que pueden tomarse como dianas y que son portadores multivalentes para anticuerpos biespecificos, es decir, cada ' molécula de anticuerpo que puede tomarse como diana puede servir de portador para dos o más anticuerpos biespecífieos . En el documento O 1995/009917 se describen anticuerpos tetravalentes biespecificos modificados. En WO 2007/109254 se describen moléculas de unión estabilizadas, formadas por, o constituidas por un scFv estabilizado. WO 2007/0274985 se refiere a formatos de anticuerpo que comprenden fragmentos Fab de cadena individual (scFab).

WO2009111707 (Al) se refiere una terapia de combinación con los antagonistas Met y HER. WO2009/111691 (A2A3) a una terapia de combinación con los antagonistas MET y EGFR.

WO 2008/100624 se refiere a anticuerpos anti-ErbB-3 con internalizacion del receptor ErbB-3 aumentada y su uso en anticuerpos biespecificos ínter alia con c-Met como segundo antigeno .

Sumario de la Invención Un primer aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecxfico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana, constituido por un primer sitio de unión a antígeno, que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque el anticuerpo biespecífico presenta una internalizacion del ErbB-3 no superior al 15%, cuando se mide después de 2 horas en un ensayo de citometría de flujo con células A431, si se compara con la internalización de la ErbB-3 en ausencia de anticuerpo .

En una modalidad de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico bivalente o trivalente que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que consta de uno o dos sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a la ErbB-3 humana y un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a c-Met humana.

En una modalidad de la invención el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico bivalente que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana y que contiene un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana.

En una modalidad de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico trivalente que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que contiene dos sitios de fijación sobre antígeno que se unen específicamente a la ErbB-3 humana y un tercer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana .

Un aspecto de la invención es un anticuerpo biespecifico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antigeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque i) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 53, una región CDR2H de SEC ID NO: 54 y una región CDRIH de SEC ID NO: 55, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 56, una región CDR2L de SEC ID NO: 57 y una región CDRIL de SEC ID NO: 58 ó una región CDRIL de SEC ID NO: 59; y el segundo sitio de fijación sobre antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 66, una región CDR2H de SEC ID NO: 67 y una región CDRIH de SEC ID NO: 68, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 69, una región CDR2L de SEC ID NO: 70 y una región CDRIL de SEC ID NO: 71; ii) el primer sitio de fijación sobre antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 60, una región CDR2H de SEC ID NO: 61 y una región CDRIH de SEC ID NO: 62, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 63, una región CDR2L de SEC ID NO: 64 y una región CDRIL de SEC ID NO: 65 o una región CDRIL de SEC ID NO: 66; y el segundo sitio de fijación sobre antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 66, una región CDR2H de SEC ID NO: 67 y una región CDR1H de SEC ID NO: ' 68, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 69, una región CDR2L de SEC ID NO: 70 y una región CDR1L de SEC ID NO: 71.

El anticuerpo biespecífico se caracteriza con preferencia porque i) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 47, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 48; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno que se une específicamente a la c-Met contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4 ; ii) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 50; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4; iii) el primer sitio de fijación sobre ántigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 51; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4; iv) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 52; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4; o v) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 1, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 2; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4.

Con preferencia, el anticuerpo biespecifico se caracteriza porque: el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 51; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4.

En una modalidad, el anticuerpo biespecifico según la invención se caracteriza porque contiene una región constante del subgrupo IgGl o IgG3.

En una modalidad, el anticuerpo biespecifico según la invención se caracteriza porque está gilcosilado con una cadena azúcar en Asn297, siendo la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar del 65% o menos.

Otro aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena del anticuerpo biespecifico .

Otros aspectos adicionales de la invención son una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo biespecifico, la composición para el tratamiento del cáncer, el uso del anticuerpo biespecifico para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer, un método de tratamiento de un paciente que tenga un cáncer mediante la administración del anticuerpo biespecifico al paciente que necesite tal tratamiento.

Los anticuerpos según la invención poseen propiedades muy valiosas, por ejemplo la inhibición del crecimiento de células cancerígenas que expresan a ambos receptores <ErbB3> y <c-Met>, la eficacia antitumoral que redunda en beneficio del paciente que sufra un cáncer. Los anticuerpos biespecífieos <ErbB3-c-Met> según la invención presentan una internalización reducida si se comparan con sus anticuerpos <ErbB3> originales en células cancerígenas que expresan a ambos receptores <ErbB3> y <c-Met>.

Descripción de las secuencias de aminoácidos SEC ID NO: 1 dominio variable de cadena pesada, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 2 dominio variable de cadena ligera, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 3 dominio variable de cadena pesada, ab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 4 dominio variable de cadena ligera, Mab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 5 cadena pesada, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 6 cadena ligera, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 7 cadena pesada, Mab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 8 cadena ligera, Mab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 9 cadena pesada, Fab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 10 cadena ligera, Fab 5D5 <c-Met> SEC ID NO: 11 cadena pesada 1, Her3/Met <ErbB3 -c-Met> SEC ID NO: 12 cadena pesada 2, Her3/Met <ErbB3 -c-Met> SEC ID NO: 13 cadena ligera, Her3/Met_KHSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO cadena pesada 1, Her3/Met SSKH <ErbB3-c-Met> SEC ID NO cadena pesada 2, Her3/ et SSKH <ErbB3-c-Met> SEC ID NO 16 cadena ligera, Her3/Met_SSKH <ErbB3-c-Met> SEC ID NO cadena pesada 1, Her3/Met SSKHSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO cadena pesada 2, Her3/Met SSKHSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO cadena ligera, Her3/Met SSKHSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO cadena pesada 1, Her3/Met lC <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 21 cadena pesada 2, Her3/Met 1C <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 22 cadena ligera, Her3/Met 1C <ErbB3-c- Met> SEC ID NO 23 cadena pesada 1, Her3/Met 6C <ErbB3-c-Met> SEC ID NO 24 cadena pesada 2, Her3/Met 6C <ErbB3-c-Met> SEC ID NO 25 cadena ligera, Her3/Met 6C <ErbB3-c- Met> SEC ID NO: 26 cadena pesada 1, Her3/Met_scFvSSKHSS <ErbB3-c- et> SEC ID NO: 27 cadena pesada 2, Her3/Met_scFvSSKHSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 28 cadena ligera, Her3/Met_scFvSSKHSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 29 cadena pesada 1, Her3/Me_ScFvSSKH <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 30 cadena pesada 2, Her3/Me_scFvSSKH <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 31 cadena ligera, Her3/Me_scFvSSKH <ErbB3-c- et> SEC ID NO: 32 cadena pesada 1, Her3/Me_scFvKH <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 33 cadena pesada 2, Her3/Me_scFvKH <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 34 cadena ligera Her3/ e_scFvKH <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 35 cadena pesada 1 Her3/ e_scFvKHSB <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 36 cadena pesada 2 Her3/ e_scFvKHSB <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 37 cadena ligera Her3/Me_ScFvKHSB <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 38 cadena pesada 1, Her3/ et_scFvKHSBSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 39 cadena pesada 2, Her3/Met_scFvKHSBSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 40 cadena ligera, Her3/Met_scFvKHSBSS <ErbB3-c-Met> SEC ID NO: 41 región constante de cadena pésada de IgGl humana SEC ID NO: 42 región constante de cadena pesada de IgG3 humana SEC ID NO: 43 región constante de cadena ligera kappa humana SEC ID NO: 44 región constante de cadena ligera lambda humana SEC ID NO: 45 c-Met humana SEC ID NO: 46 ErbB-3 humana SEC ID NO: 47 dominio variable de cadena pesada VH, Mab 205 (murino) <ErbB3> SEC ID NO: 48 dominio variable de cadena ligera VL, Mab 205 (murino) <ErbB3> SEC ID NO: 49 dominio variable de cadena pesada VH, Mab 205.10 (humanizado) <ErbB3> SEC ID NO: 50 dominio variable de cadena ligera VL, Mab 205.10.1 (humanizado) <ErbB3> SEC ID NO: 51 dominio variable de cadena ligera VL, Mab 205.10.2 (humanizado) <ErbB3> SEC ID NO: 52 dominio variable de cadena ligera VL, Mab 205.10.3 (humanizado) <ErbB3> SEC ID NO: 53 cadena pesada CDR3H, Mab 205.10 <ErbB3> SEC ID NO: 54 cadena pesada CDR2H, Mab 205.10 <ErbB3> SEC ID NO: 55 cadena pesada CDR1H, Mab 205.10 <ErbB3> SEC ID NO: 56 cadena ligera CDR3L, Mab 205.10 <ErbB3> SEC ID NO: 57 cadena ligera CDR2L, Mab 205.10 <ErbB3> SEC ID NO: 58 cadena ligera CDR1L, (variante 1), Mab 205.10 <ErbB3> SEC ID NO: 59 cadena ligera CDRlL, (variante 2), Mab 205.10 <ErbB'3> SEC ID NO: 60 cadena pesada CDR3H, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC 10 NO: 61 cadena pesada CDR2H, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 62 cadena pesada CDR1H, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 63 cadena ligera CDR3L, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 64 cadena ligera CDR2L, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 65 cadena ligera CDR1L, clon 29 de HER3 <ErbB3> SEC ID NO: 66 cadena pesada CDR3H, Mab 5D5 <c -Met> SEC ID NO: 67 cadena pesada CDR2H, ab 5D5 <c -Met> SEC ID NO: 68 cadena pesada CDR1H, Mab 5D5 <c--Met> SEC ID NO: 69 cadena ligera CDR3L, Mab 5D5 <c--Met> SEC ID NO: 70 cadena ligera CDR2L, Mab 5D5 <c--Met> SEC ID NO: 71 cadena ligera CDR1L, Mab 5D5 <c--Met> Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Estructura esquemática de un anticuerpo de longitud completa sin dominio CH4 que se une específicamente a un primer antígeno 1 con dos pares de cadena pesada y ligera que contienen dominios variables y constantes en un orden típico.

Figuras 2a-2c. Estructura esquemática de un anticuerpo biespecífico bivalente <ErbB3/c-Met>, que contiene: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana; y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c-Met humana, en donde los dominios constantes CL y CHl, y/o los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí, que se han modificado con la tecnología "superhélices" Figuras 3a-3d. Representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente <ErbB3/c-Met> según la invención, que contiene un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente al primer antígeno 1, con el que: Figura 3a: se han fusionado dos polipéptidos VH y VL (los dominios VH y VL de los dos forman, juntos, un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente al segundo antígeno 2; Figura 3b: se han fusionado dos polipéptidos VH-CHl y VL-CL (los dominios VH y VL de los dos forman, juntos, un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente al segundo antígeno 2); Figura 3c: representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención, que contiene un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente al primer antígeno 1, con el que se han fusionado dos polipéptidos VH y VL (los dominios VH y VL de los dos forman, juntos, un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente al segundo antígeno 2) con "superhélices" ; Figura 3d: Representación esquemática de un anticuerpo biespecífico trivalente según la invención, que contiene un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente al primer antígeno, con el que se han fusionado dos polipéptidos VH y VL (los dominios VH y VL de los dos forman, juntos, un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente al segundo antígeno 2; estos dominios VH y VL contienen un puente disulfuro entre las cadenas, situado entre las posiciones VH44 y VL100) con "cadenas sobreenrolladas y cadenas en forma de horquillas" Figuras 4a-4b.

Fig. 4a: Estructura esquemática de los cuatro fragmentos posibles Fab de cadena simple Fig. 4b: Estructura esquemática de los dos fragmentos Fv de cadena simple Figuras 5a-5b. Estructura esquemática de un anticuerpo biespecifico trivalente <ErbB3/c-Met> que contiene un anticuerpo de longitud completa y un fragmento Fab de cadena simple (Figura 5a) o un fragmento Fv de cadena simple (Figura 5b) - ejemplo biespecifico trivalente con cadenas sobreenrolladas y cadenas en forma de horquillas Figuras 6a-6b. Estructura esquemática de un anticuerpo biespecifico tetravalente <ErbB3/c-Met> que contiene un anticuerpo de longitud completa y dos fragmentos Fab de cadena simple (Figura 6a) o dos fragmentos Fv de cadena simple (Figura 6b) - los sitios de unión a la c-Met se derivan de anticuerpos que inhiben la dimerización de la c-Met; Figura 7. Estructura esquemática de un anticuerpo biespecifico bivalente <ErbB3-c-Met>, en donde un brazo Fab se ha reemplazado por un fragmento scFab; Figura 8. Fijación de anticuerpos biespecificos sobre la superficie de células cancerígenas; Figuras 9a-9c. Inhibición de la fosforilación del receptor de c-Met inducida por el HGF con formatos de anticuerpo biespecífico Her3/c-Met Figuras 10a-10b. Inhibición de la fosforilación del receptor de Her3 inducida por el HRG con formatos de anticuerpo biespecífico Her3/c-Met ; Figuras 11, 12 y 13. Inhibición de la proliferación de células HUVEC inducida por el HGF con formatos de anticuerpo biespecífico Her3/c-Met.

Figura 14. Inhibición de la proliferación de la línea celular cancerígena A431 con formatos de anticuerpo biespecífico Her3/c-Met.

Figuras 15 y 16. Análisis de la inhibición de la diseminación célula-célula inducida por el HGF en la línea celular cancerígena A431 con formatos de anticuerpo biespecífico Her3/c-Met.

Figura 17. Análisis de la expresión de la Her3 y de la c-Met en la superficie de las células de cuatro líneas celulares diferentes.

Figura 18. Análisis de la internalización de receptor mediada por anticuerpo en las líneas celulares cancerígenas A431, A549 y DU145.

Figuras 19a-19b. Análisis de la migración de las células A431 inducida por el HGF. Fig. 19a Migración de las células cancerígenas medida como función de la impedancia en presencia de una dosis creciente del anticuerpo biespecífico MH_TvAbl8. Se representan la lectura final después de 24 h. Fig. 19b Como control se añade una IgG humana inespecífica en un intervalo de concentraciones similar al del anticuerpo biespecífico .

Figuras 20a-20b. Análisis de la reticulación célula-célula con el anticuerpo biespecífico Her3/c-Met_scFv_SSKH en células HT29 (tinción con los colorantes PKH26 & PKH67 (SIGMA) ) Figura 21. SDS-PAGE de los anticuerpos Her3/Met_scFvSS_KH (lado izquierdo) y Her3/Met_scFv_KH (lado derecho), biespecífieos de Her3/c-Met .

Figuras 22a-22b. Análisis HP-SEC (proteína purificada) de los anticuerpos Her3 /Met_scFvSSKH (Figura 22a) y Her3/MetscFv_KH biespecífieos de Her3/c-Met (Figura 22b) .

Descripción detallada de la Invención Un primer aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque el anticuerpo biespecifico presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 15%, cuando se mide después de 2 horas en un ensayo de citometria de flujo con células A431, si se compara con la internalización de la ErbB-3 en ausencia del anticuerpo biespecifico.

Por lo tanto, la invención está dirigida a un anticuerpo biespecifico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, en donde el anticuerpo biespecifico origina un aumento en la internalización de la ErbB-3 en células A431 de no más de 15% cuando se mide después de 1 hora de incubación del anticuerpo de la célula A431 según medido, por ensayo de citometria de flujo, si se compara con la internalización de la ErbB-3 en células A431 en ausencia del anticuerpo.

En una modalidad, el anticuerpo biespecifico, que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c- et humana, se caracteriza porque el anticuerpo biespecifico presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 7%, cuando se mide después de 2 horas en un ensayo, de citometria de flujo con células A431, si se compara con la internalización de la ErbB-3 en ausencia del anticuerpo biespecifico .

En una modalidad, el anticuerpo biespecifico, que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c- et humana que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c- et humana, se caracteriza porque el anticuerpo biespecífico presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 5%, cuando se mide después de 2 horas en un ensayo de citometría de flujo con células A431, si se compara con la internalización de la ErbB-3 en ausencia del anticuerpo biespecífico .

El término "internalización de la ErbB-3" indica la internalización de receptor de la ErbB-3 inducida por anticuerpo en células A431 (ATCC No. CRL-1555) , si se compara con la internalización de la ErbB-3 en ausencia de anticuerpo. La internalización del receptor de la ErbB-3 se induce con los anticuerpos biespecificos según la invención y se mide después de 2 horas en un ensayo de citometría de flujo (FACS), tal como se describe en el ejemplo 8. Un anticuerpo biespecífico según la invención presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 15% en células A431 después de 2 horas de exposición al anticuerpo, si se compara con la internalización de la ErbB-3 en ausencia de anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 10%. En una modalidad, el anticuerpo presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 7%. En una modalidad, el anticuerpo presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 5%. Para determinar si un anticuerpo biespecífico ErbB3/cMet presenta una internalización de la ErbB-3 del 10% o inferior después de 2 horas en las células A431, puede compararse en un ensayo de citometría de flujo (FACS) con el anticuerpo biespecífico MH_TvAb24 ErbB3/c-Met descrito a continuación. Para determinar si un anticuerpo biespecífico ErbB3/cMet presenta una internalización de la ErbB-3 del 5% o inferior después de 2 horas en las células A431, puede compararse en un ensayo de citometría de flujo (FACS) con el anticuerpo biespecífico MH_TvAb29 ErbB3/c-Met descrito a continuación.

Otro aspecto de la presente invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana, que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque el anticuerpo biespecífico reduce la internalización de la ErbB-3, inducida por el (correspondiente) anticuerpo monoespecífico original ErbB-3, en un 50% o más (en una modalidad: en un 60% o más; en otra modalidad: en un 70% o más; en una modalidad: en un 80% o más) , cuando se mide después de 2 horas en un ensayo de citometria de flujo en células A431 (ATCC No. CRL-1555) . La reducción de la internalizacion de la ErbB-3 se calcula (empleando los valores medidos después de 2 horas en el ensayo de citometria de flujo con células A431) del modo siguiente: 100 x (% de internalizacion de la ErbB inducida por el anticuerpo monoespecifico original ErbB-3 - % de internalizacion de .. la ErbB inducida por el anticuerpo biespecifico ErbB-3/cMet ) /% de internalizacion de la ErbB inducida por el anticuerpo monoespecifico original ErbB-3. Por ejemplo: a) el anticuerpo MH_TvAb21 biespecifico ErbB-3/c et presenta una internalizacion de la ErbB-3 del 1% y el anticuerpo Mab 205 monoespecifico original ErbB-3 presenta una internalizacion de la ErbB-3 del 40%; por consiguiente, el anticuerpo MH_TvAb21 biespecifico ErbB-3/cMet presenta una reducción de la internalizacion de la ErbB-3 del 100 x (40-1) /40 = 97.5%; b) el anticuerpo MH_TvAb25 biespecifico ErbB-3/cMet presenta una internalizacion de la ErbB-3 del 11% y el anticuerpo Mab 205 monoespecifico original ErbB-3 presenta una internalizacion de la ErbB-3 del 40%; por consiguiente, el anticuerpo MH_TvAb25 biespecifico ErbB-3/cMet presenta una reducción de la internalizacion de la ErbB-3 del 100 x (40-11) /40 = 72.5%; c) el anticuerpo HER3/Met_6 biespecifico ErbB-3/cMet presenta una internalización de la ErbB-3 del 11% y el clon 29 del anticuerpo HER3 monoespecifico original ErbB-3 presenta una internalización de la ErbB-3 del 54%. De esta forma, el anticuerpo HER3/Met_6 biespecifico ErbB-3/cMet presenta una reducción de la internalización de la ErbB-3 del 100 x (54-6) /40% = 88.9% (véanse los valores de internalización medidos después de 2 horas en un ensayo de citometria de flujo con células A431, Ejemplo 8).

En una modalidad de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico trivalente que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que consta de dos sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a la ErbB-3 humana y un tercer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a c-Met humana .

En una modalidad de la invención el anticuerpo es un anticuerpo biéspecífico bivalente que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana y que contiene un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana .

En una modalidad de la invención, el anticuerpo es un anticuerpo biespecifico tetravalente que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que contiene dos sitios de fijación sobre antigeno que se unen específicamente a la ErbB-3 humana y dos sitios de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, el sitios de fijación sobre antígeno que se unen específicamente a la c-Met humana inhiben la dimerización de la c-Met (tal como se describe, por ejemplo en WO 2009007427) .

Tal como se emplea aquí, "anticuerpo" indica una proteína de unión que contiene sitios de fijación sobre antígenos. Los términos "sitio de fijación" o "sitio de fijación sobre antígeno" se emplean aquí para indicar la región o regiones de una molécula de anticuerpo a las que actualmente está unido un ligando y se derivan de un anticuerpo. El término "sitio de fijación sobre antígeno" incluye los dominios variables de cadena pesada del anticuerpo (VH) y/o los dominios variables de cadena ligera del anticuerpo (VL) o los pares de VH/VL, y pueden derivarse de anticuerpos enteros o fragmentos de anticuerpo, como son el Fv de cadena simple, un dominio VH y/o un dominio VL, el Fab o el (Fab)2. En una modalidad de la presente invención, cada uno de los sitios de fijación sobre el antígeno contiene un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , y está formado con preferencia por un par constituido por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) .

Además de los sitios de fijación sobre antigeno derivados de anticuerpo, también los péptidos de unión descritos por ejemplo en atzke, A. y col., Cáncer Res. ^5 (14), 6105-10, 2005 (15 de julio de 2005), pueden fijarse específicamente sobre un antígeno (por ejemplo c- et) . Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es una molécula de fijación biespecifica que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana, que contiene un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un péptido de unión que se une específicamente a la c-Met humana. Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención es una molécula de fijación biespecifica que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana, que contiene un sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana y un péptido de unión que se une específicamente a la ErbB-3 humana.

La Erb-B3 (también conocida como homólogo 3 del oncogén de la leucemia viral eritroblástica V-erb-b2 (aviar) ; ERBB3, HER3; SEC ID NO: 46) es una proteína unida a membrana, que tiene un dominio de fijación sobre neurregulina, pero no un dominio cinasa activo (Kraus, M.H. y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 86, 9193-7, 1989, P lowman, G.D. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 4905-9, 1990; Katoh, M. y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 1189-97, 1993). Puede fijarse, pues, sobre su ligando, pero no transporta la señal a la célula por fosforilación. Sin embargo, forma heterodímeros con otros miembros de la familia de receptores de EGF, que tienen actividad de cinasa. La heterodimerización conduce a la activación de las trayectorias que conducen a la proliferación o la diferenciación celulares. Se ha publicado la amplificación de este gen y/o la sobreexpresión de su proteina en numerosos tipos de cáncer, incluido el cáncer de próstata, de vejiga y de mama. Se han caracterizado variantes alternativas de empalme transcripcional que codifican a diferentes isoformas. Una isoforma carece de la región intermembrana y se secreta fuera de la célula. Esta forma actúa modulando la actividad de la forma fijada sobre la membrana (Corfas, G. y col., 1_ (6), 575-80, 2004). Se cree que la ERBB3, cuando esta activada, se convierte en Sustrato de la dimerización y posterior fosforilación con la ERBB1, ERBB2 y ERBB4. Al igual que muchas tirosina-cinásas de receptor, la ERBB3 se activa con un ligando extracelular . Los ligandos conocidos que se unen a la ERBB3 incluyen a la herregulina .

El sitio de fijación sobre el antigeno y en especial los dominios variables de cadena pesada (VH) y/o dominios variables de cadena ligera (VL) del anticuerpo, que se unen específicamente a la ErbB-3 humana, pueden derivarse a) de anticuerpos anti-ErbB-3 conocidos, descritos por ejemplo en WO 97/35885, WO 2007/077028 o WO 2008/100624; o b) de nuevos anticuerpos anti-ErbB-3 obtenidos de nuevo por métodos de inmunización, entre otros, la proteina ErbB-3 humana o el ácido nucleico o fragmentos de la misma o por exposición de fagos.

El MET (factor de transición epitelio-mesinquima) es un proto-oncogén que codifica a una proteina MET (también conocida como c-Met; receptor del factor de crecimiento de hepatocitos. = HGFR; receptor de HGF; receptor del factor de diseminación; receptor del SF; SEC ID NO: 45) (Dean, M. y col., Nature 318, 385-8, 1985; Chan, A.M. y col., Oncogene 1, 229-33, 1987; Bottaro, D.P. y col., Science 251, 802-4, 1991; Naldini, L. y col., E BO J. 10, 2867-78, 1991; Maulik, G. y col., Cytokine Growth Factor Rev. 13, 41-59, 2002). El MET es un receptor de membrana que es esencial para el desarrollo embrionario y la curación de heridas. El factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) es el único ligando Conocido del receptor del MET. El MET se expresa normalmente en células de origen epitelial, mientras que la expresión del HGF se restringe a células de origen mesenquimal. A raíz de la estimulación del HGF, el MET induce diversas respuestas biológicas que colectivamente dan lugar a un programa conocido como crecimiento invasivo. La activación anormal del MET en el cáncer guarda relación con un pronóstico malo, en donde el MET aberrantemente activo desencadena el crecimiento tumoral, la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis ) que abastecen al tumor con nutrientes y el cáncer se propaga a otros órganos (metástasis) . El MET se desregula en muchos tipos de enfermedades malignas humanas, incluidos el cáncer de riñon, de hígado, de estómago, de mama y de cerebro. Normalmente, solo las células madre y las células progenitoras expresan el MET, lo cual permite que estas células crezcan de modo invasivo, con el fin de generar nuevos tejidos en un embrión o de regenerar tejidos dañados en un adulto. Sin embargo, se cree que las células madre cancerígenas secuestran la capacidad de las células madre normales de expresar el MET y de este modo llegan a provocar • la persistencia del cáncer y su propagación a otras partes del cuerpo.

El sitio de fijación sobre el antígeno y, en especial, los dominios variables de cadena pesada (VH) y/o dominios variables de cadena ligera (VL) de anticuerpo, que se unen específicamente a la c-Met humana pueden derivarse de a) de anticuerpos anti-c-Met conocidos, descritos por ejemplo en US 5,686,292, US 7,476,724, WO 2004072117, WO 2004108766, WO 2005016382, WO 2005063816, WO 2006015371, WO 2006104911, WO 2007126799, o WO 2009007427; o b) de anticuerpos anti-c- Met nuevos, obtenidos por ejemplo por métodos de inmunización nueva empleando entre otros la proteína anti-c-Met humana o el ácido nucleico o fragmentos de la misma o por exposición de fagos.

Otro aspecto de la invención es un método para la selección de un anticuerpo biespecifico según la invención, que consta de los pasos siguientes: a) medir la internalización de la ErbB-3 en células A431 (ATCC No. CRL-1555) inducida por un anticuerpo biespecifico anti-ErbB-3/anti-c-Met después de 2 horas en un ensayo de citometria de flujo (FACS) , por comparación con la internalización de la ErbB-3 en ausencia de anticuerpo; b) medir la internalización de la ErbB-3 en células A431 (ATCC No. CRL-1555) en un ensayo de citometria de flujo (FACS) en ausencia de anticuerpo; c) seleccionar un anticuerpo biespecifico que presente una internalización de la ErbB-3 no superior al 15% en células A431 después de 2 horas de exposición al anticuerpo, por comparación con la internalización de la ErbB-3 en ausencia de anticuerpo.

En una modalidad se selecciona un anticuerpo biespecifico que presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 10%. En una modalidad se selecciona un anticuerpo biespecifico que presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 7%. En una modalidad se selecciona un anticuerpo biespecifico que presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 5%.

Otro aspecto de la invención es un método de selección de un anticuerpo biespecifico según la invención, que consta de los pasos siguientes: a) medir la internalización de la ErbB-3 en células A431 (ATCC No. CRL-1555) inducida por un anticuerpo biespecifico anti-ErbB-3/anti-c- et después de 2 horas en un ensayo de citometría de flujo (FACS), por comparación con la internalización de la ErbB-3 en ausencia de anticuerpo; b) medir la internalización de la ErbB-3 en células A431 (ATCC No. CRL-1555) inducida por el correspondiente anticuerpo monoespecifico anti-ErbB-3 después de 2 horas en un ensayo de citometría de flujo (FACS) ; c) seleccionar un anticuerpo biespecifico que reduzca la internalización de la ErbB-3 inducida por el correspondiente anticuerpo monoespecifico original ErbB-3 en un 50% o más (en células A431, después de 2 horas) .

En una ' modalidad se selecciona un anticuerpo biespecifico que reduce la internalización de la ErbB-3, comparada con la internalización de la ErbB-3 inducida por el correspondiente anticuerpo monoespecifico original ErbB-3, en un 60% o más. En una modalidad se selecciona un anticuerpo biespecifico que reduce la internalización de la ErbB-3, comparada con la internalización de la ErbB-3 inducida por el correspondiente anticuerpo monoespecifico original ErbB-3, en un 70% o más. En una modalidad se selecciona un anticuerpo biespecifico que reduce la internalización de la ErbB-3, comparada con la internalización de la ErbB-3 inducida por el correspondiente anticuerpo monoespecifico original ErbB-3, en un 80% o más.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo biespecifico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana, que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana caracterizado porque i) el primer sitio de fijación sobre antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 53, una región CDR2H de SEC ID NO: 54 y una región CDRIH de SEC ID NO: 55, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 56, una región CDR2L de SEC ID NO: 57 y una región CDR1L de SEC ID NO: 58 ó una región CDR1L de SEC ID NO: 59; y el segundo sitio de fijación sobre antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 66, una región CDR2H de SEC ID NO: 67 y una región CDRIH de SEC ID NO: 68, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 69, una región CDR2L de SEC ID NO: 70 y una región CDR1L de SEC ID NO : 71; ii) el primer sitio de fijación sobre antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 60, una región CDR2H de SEC ID NO: 61 y una región CDR1H de SEC ID NO: 62, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 63, una región CDR2L de SEC ID NO: 64 y una región CDR1L de SEC ID NO: 65 o una región CDR1L de SEC ID NO: 66; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 66, una región CDR2H de SEC ID NO: 67 y una región CDRlH de SEC ID NO: 68, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 69, una región CDR2L de SEC ID NO: 70 y una región CDR1L de SEC ID NO: 71.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo biespecifico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana, que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana caracterizado porque el primer sitio de fijación sobre antígeno Contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 53, una región CDR2H de SEC ID NO: 54 y una región CDRlH de SEC ID NO: 55, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 56, una región CDR2L de SEC ID NO: 57 y una región CDR1L de SEC ID NO: 58 ó una región CDR1L de SEC ID NO: 59; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 66, una región CDR2H de SEC ID NO: 67 y una región CDR1H de SEC ID NO: 68, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 69, una región CDR2L de SEC ID NO: 70 y una región CDR1L de SEC ID NO: 71.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana, que contiene un primer sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre antígeno que se une específicamente a la c-Met humana caracterizado porque el primer sitio de fijación sobre antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 60, una región CDR2H de SEC ID NO: 61 y una región CDR1H de SEC ID NO: 62, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 63, una región CDR2L de SEC ID NO: 64 y una región CDR1L de SEC ID NO: 65 o una región CDR1L de SEC ID NO: 66; y el segundo sitio de fijación sobre antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 66, una región CDR2H de SEC ID NO: 67 y una región CDR1H de SEC ID NO: 68, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 69, una región CDR2L de SEC ID NO: 70 y una región CDR1L de SEC ID NO: 71.

El anticuerpo biespecifico se caracteriza con preferencia porque: i) el primer sitio de fijación sobre antígeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 47, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 48; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno que se une específicamente a la c-Met contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4; ii) el primer sitio de fijación sobre antígeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 50; y el segundo sitio de fijación sobre antígeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4; iii) el primer sitio de fijación sobre antígeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 51; y el segundo sitio de fijación sobre antígeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4; iv) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 52; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4; o v) el primer sitio de fijación sobre ántigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 1, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 2; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la secuencia de SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la secuencia de SEC ID NO: 4.

La especificidad del anticuerpo indica el reconocimiento selectivo que realiza el anticuerpo de un epitopo concreto existente en un antigeno. Los anticuerpos naturales son, por ejemplo, monoespecíficos . Los "anticuerpos biespecificos" según la invención son anticuerpos que tienen dos especificidades diferentes para la fijación sobre antigenos. Cuando un anticuerpo tiene más de una especificidad, los epitopos reconocidos pueden asociarse con un solo antigeno o con más de un antigeno. Los anticuerpos de la presente invención son específicos de , dos antigenos diferentes, es decir, de la ErbB-3 como primer antígeno y de la c-Met como segundo antígeno.

El término anticuerpo "monoespecífico" se emplea aquí para indicar un anticuerpo que tiene uno o más sitios de fijación, cada uno de ellos se une al mismo epitopo del mismo antígeno .

El término "valente" se emplea dentro de la presente solicitud para indicar la presencia de un número determinado de sitios de fijación existentes en una molécula de anticuerpo. Por tanto, los términos "bivalente", "tetravalente", y "hexavalente" indican la presencia de dos sitios de fijación, cuatro sitios de fijación y seis sitios de fijación, respectivamente, en una molécula de anticuerpo. Los anticuerpos biespecificos según la invención son por lo menos "bivalentes" y pueden ser "trivalentes" o "multivalentes" (por ejemplo ("tetravalentes" o "hexavalentes") .

Un sitio de un anticuerpo de la invención para la fijación sobre antigeno puede contener seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) , que en grados variables contribuyen a la afinidad del sitio de fijación para con el antigeno. Hay tres CDR de dominio variable de cadena pesada (CDRH1, CDRH2 y CDRH3) y tres CDR de dominio variable de cadena ligera (CDRL1, CDRL2 y CDRL3) . La extensión de las CDR y de las regiones de armazón (FR) se determina comparándolas con una base de datos compilada de secuencias de aminoácidos, en las que estas regiones se hayan definido según la variabilidad entre las secuencias. Se incluye también dentro del alcance de la invención los sitios funcionales de fijación sobre antígeno que constan de pocas CDR (es decir, en los que la especificidad de fijación viene determinada por tres, cuatro o cinco CDR) . Por ejemplo, para la fijación puede ser suficiente con menos de un conjunto completo de 6 CDR. En algunos casos, puede ser suficiente con un dominio VH o un dominio VL.

Pueden utilizarse los anticuerpos biespecificos bivalentes del tipo IgG contra la ErbB-3 humana y la c- et humana que contienen las regiones constantes de la inmunoglobulina, tal como se ha descrito por ejemplo en la solicitud EP 07024867.9, la solicitud EP 07024864.6, la solicitud EP 07024865.3 o Ridgway, J.B., Protein Eng. 9, 617- 621, 1996; WO 96/027011; Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998; Atwell, S. y col., J. Mol. Biol. 270, 26-35, 1997 y EP 1870459A1.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" se emplean aqui para indicar una preparación de moléculas de anticuerpo que tienen una única composición de aminoácidos.

El término "anticuerpo quimérico" indica un anticuerpo que contiene una región variable, es decir, una región de fijación de una fuente o especie y por lo menos una porción de una región constante derivada de una especie o fuente diferente, obtenida normalmente por técnicas de ADN recombinante . Son preferidos los anticuerpos quiméricos que contienen una región variable murina y una región constante humana. Otras formas preferidas de "anticuerpos quiméricos" contempladas en la presente invención son aquellas, en las que la región constante se ha modificado o cambiado Con respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión con el Clq y/o la unión con el receptor de Fe (FcR) . Los anticuerpo quiméricos se denominan también "anticuerpos de clase cambiada". Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que contienen segmentos de ADN que codifican a las regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN que codifican a las regiones constantes de inmunoglobulina . Los métodos de obtención de anticuerpos quiméricos incluyen las técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección genética, que son bien conocidas en la técnica, véase por ejemplo Morrison, S.L. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855, 1984; US 5,202,238 y US 5,204,244.

El término "anticuerpo humanizado" indica anticuerpos en las que las regiones de estructura o "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) se han modificado para que contengan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente con respecto a la de la inmunoglobulina original. En una modalidad preferida, se injerta una CDR murina en la región de estructura de un anticuerpo humano para obtener el "anticuerpo humanizado", véase por ejemplo Riechmann, L. y col., Nature 332 , 323-327, 1988; y Neuberger, M.S. y col., Nature 314, 268-270, 1985. Las CDR especialmente preferidas corresponden a las que representan secuencias que reconocen a los antigenos antes mencionados de los anticuerpos quiméricos. Otras formas de "anticuerpos humanizados" contemplados en la presente invención son aquellas, en las que la región constante se ha modificado o cambiado adicionalmente con respecto al anticuerpo original para generar propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión con' el Clq y/o a la unión con el receptor de Fe (FcR) .

El término "anticuerpo humano" se emplea aquí para indicar anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 368-374, 2001). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse también en animales trans-génicos (por ejemplo, ratones) que, después de la inmunización, son capaces de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. La transferencia de la disposición genética de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a los ratones mutantes de línea germinal puede traducirse en la producción de anticuerpos humanos después del contacto con el antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits, A. y col . , Proc . Nati. Acad. Sci. USA _90, 2551-2555, 1993; Jakobovits, A. y col., Nature 362, 255-258, 1993; Bruggemann, M. y col., Year Immunol. 1_, 33-40, 1993) . Los anticuerpos humanos pueden producirse también en bibliotecas de exposición de fagos (Hoogenboom, H.R. y Winter, G., J. Mol. Biol. 227, 381-388, 1992; Marks, J.D. y col., J. Mol. Biol. 222 , 581-597, 1991). Se dispone también de las técnicas de Colé, A. y col. y Boerner, P. y col. para la obtención de anticuerpos monoclonales humanos (Colé, A. y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Liss, A.L., p. 77, 1985; y Boerner, P. y col., J. Immunol. 147, 86-95, 1991). Tal como se ha mencionado antes para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, el término "anticuerpo humano" se emplea aquí para indicar los anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar propiedades según la invención, en especial en lo que respecta a la unión al Clq y/o a la unión al FcR, por ejemplo por "cambio de clase", es decir, cambio o mutación de partes del Fe (por ejemplo de la IgGl a la IgG4 y/o mutación IgGl/IgG4) .

El término "anticuerpo humano recombinante" se emplea aquí para indicar todos los anticuerpos humanos que se obtienen, expresan, crean o aislan por medios recombinantes , como son los anticuerpos aislados de una célula hospedera por ejemplo una célula NSO o CHO o de un animal (por ejemplo un ratón) que sea transgénico en cuanto a los genes de la inmu-noglobulina humana o los anticuerpos expresados empleando un vector de expresión recombinante transfectado a una célula hospedera. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes en una forma reordenada. Los anticuerpos humanos recombinantes según la invención se han sometido a una hipermutación somática "in vivo". Por tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL del anticuerpo recombinante son secuencias que, en cuanto derivadas de y relacionadas con las secuencias VH y VL de línea germinal humana, no pueden existir de modo natural en del repertorio de líneas germinales de anticuerpos humanos "ir¡ vivo".

El "dominio variable" (dominio variable de una cadena ligera (VL) , región variable de una cadena pesada (VH) se emplea aquí para indicar cada uno de los pares de cadenas ligeras y pesadas que intervienen directamente en la fijación del anticuerpo sobre el antígeno. Los dominios de cadenas variables humanas, ligeras y pesadas, tienen la misma estructura general y cada dominio contiene cuatro regiones de estructura (FR), cuyas secuencias están muy conservadas, conectadas por tres "regiones hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad, CDR) . Las regiones estructurales adoptan una conformación de lámina y las CDR pueden formar bucles que conecten la estructura de lámina ß. Las CDR de cada cadena se mantienen en su estructura tridimensional gracias a las regiones de estructura y junto con las CDR de la otra cadena forman el sitio de fijación sobre el antígeno. Las regiones CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un rol especialmente importante en la especificidad de unión/afinidad de los anticuerpos según la invención y por ello constituyen otro objeto de la invención.

Los términos "región hipervariable" o "porción de un anticuerpo que se une al antígeno" se emplean aquí para indicar los residuo des aminoácido de un anticuerpo que producen la unión con el antigeno. La región hipervariable contiene residuo des aminoácido de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". Las regiones de "estructura" o "FR" son aquellas regiones de dominio variable distintas de los residuo des de región hipervariable que se acaban de definir. Por lo tanto, las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo abarcan desde el N-terminal al C-terminal de los dominios FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDR de cada cadena están separadas por los aminoácidos de estructura. En especial, la CDR3 de cadena pesada es la región que más contribuye a la fijación sobre el antigeno. Las regiones CDR y FR se determinan de acuerdo a la definición estándar de Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) .

Tal como se emplea ' aquí, el término "unión" o "fijación especifica" indica la unión del anticuerpo a un epitopo del antigeno (la ErbB-3 humana o la c-Met humana) en un ensayo "in vitro" , con preferencia en un ensayo de resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare Upsala, Suecia) con el antigeno de tipo silvestre purificado. La afinidad de la unión se define en términos ka (constante de velocidad de asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antigeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka). La unión o fijación especifica indica una afinidad de unión (KD) de 10~8 moles/1 o menos, con preferencia de 10~9 M a 10"13 moles/1. Por tanto, un anticuerpo biespecifico <ErbB3-c- et> según la invención se fija específicamente sobre cada antigeno del que es especifico con una afinidad de fijación (KD) de 10"8 moles/1 o menos, con preferencia de 10-9 M a 10~13 moles/1. La fijación del anticuerpo con el FCYRIII puede investigarse mediante un ensayo BIAcore (GE-Healthcare, Upsala, Suecia) . La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad de asociación del anticuerpo del complejo de anticuerpo/antigeno) , kD (constante de disociación) y KD (kD/ka) .

El término "epitopo" incluye cualquier determinante polipeptidico capaz de la unión especifica con un anticuerpo. En ciertas modalidades, el determinante epitopo incluye a grupos de moléculas de superficie químicamente activos, como son los aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en ciertas modalidades, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y o características específicas de carga. Un epitopo es una región de un antígeno que está unida a un anticuerpo.

En ciertas modalidades, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno si reconoce con preferencia su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas .

El término "región constante" se emplea en la presente solicitud para indicar la suma de los dominios de un anticuerpo distintos a la región variable. La región constante no participa directamente en la fijación sobre un antigeno, pero posee varias funciones efectoras. En función de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se dividen en los subgrupos : IgA, IgD, IgE, IgG e IgM y varios de ellos pueden dividirse a su vez en subgrupos, por ejemplo el IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4, IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a los diferentes grupos de anticuerpos se denominan a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las regiones constantes de cadena ligera, que pueden encontrarse en los cincos grupos de anticuerpo, se denominan (kappa) y ? (lambda) .

El término "región constante derivada de un origen humano" se emplea en la presente solicitud para indicar una región constante de cadena pesada de un anticuerpo humano de los subgrupos IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 y/o una región constante de cadena ligera kappa o lambda. Las regiones constantes son bien conocidas en el estado de la técnica y se han descrito por ejemplo en Johnson, G. y Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28, 214-218, 2000; Kabat, E.A. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 72, 2785-2788, 1975.

En una modalidad, los anticuerpos biespecificos según la invención tienen una región constante del subgrupo IgGl o IgG3 (con preferencia del subgrupo IgGl) , que se deriva con preferencia de un origen humano. En una modalidad, los anticuerpos biespecífieos según la invención contienen una parte Fe del subgrupo IgGl o IgG3 (con preferencia del subgrupo IgGl) , que se deriva con preferencia de un origen humano .

La región constante de un anticuerpo participa directamente en la ADCC ( citotoxicidad mediada por , la célula dependiente de anticuerpo) y en la CDC (citotoxicidad dependiente del complemento) . La activación del complemento (CDC) se inicia con la fijación del factor de complemento Clq sobre la región constante de la mayor parte de los subgrupos de anticuerpos IgG. La fijación del Clq sobre un anticuerpo viene provocada por interacciones proteina-proteina definidas en el llamado sitio de fijación. Los sitios dé fijación de región constante se conocen en el estado de la técnica y se han descrito por ejemplo en Lukas, T.J. y col., J. Immunol . 127, 2555-2560, 1981; Brunhouse, R. y Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16, 907-917, 1979; Burton, D.R. y col., Nature 288, 338-344, 1980; Thommesen, J.E. y col., Mol. Immunol. 37, 995-1004, 2000; Idusogie, E.E. y col., J. Immunol. 164 , 4178-4184, 2000; Hezareh, M. y col., J. Virol. 75, 12161-12168, 2001; Morgan, A. y col., Immunology 8_6, 319-324,' 1995; y EP 0 307 434. Los sitios de fijación de región constante son característicos por ejemplo de los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat) .

El término "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) " indica la lisis de células diana humanas por acción de un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras. La ADCC se mide con preferencia mediante el tratamiento de una preparación de células que expresan a la ErbB-3. y la c- et con un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras, por ejemplo las PBMC recién aisladas o las células efectoras purificadas a partir de capas leucocitarias , como son los monocitos o las células asesinas naturales (NK) o una línea celular de NK de crecimiento permanente. El término "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) " indica un proceso iniciado con la fijación del factor de complemento Clq sobre la parte Fe de la mayoría de subgrupos de anticuerpos IgG. La unión del Clq a un anticuerpo es causada por interacciones proteína-proteína definidas en el sitio llamado de fijación. Los sitios de fijación de la parte Fe son conocidos en el estado de la técnica (ver más arriba) . Los sitios de fijación de la parte Fe se caracterizan por ejemplo por los aminoácidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (numeración según el índice EU de Kabat) . Los anticuerpos de los subgrupos IgGl, . IgG2 e IgG3 presentan normalmente activación del complemento incluida la fijación sobre el Clq y C3, mientras que el IgG4 no activa el sistema de complemento y no se fija sobre el Clq y/o el C3.

Las funciones efectoras de los anticuerpos monoclonales de mediación celular pueden intensificarse diseñando su componente oligosacárido del modo descrito por Umana, P. y col., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999, y US 6,602,684. Los anticuerpos de tipo IgGl, que son los anticuerpos más utilizados en el ámbito terapéutico, son glicoproteinas que tienen un sitio de glicosilación unido a N conservado en Asn297 en cada dominio CH2. Los dos oligosacáridos biantenarios complejos unidos al Asn297 están sepultados entre los dominios CH2, formando contactos extensivos con el esqueleto del polipéptido y su presencia es esencial para que el anticuerpo pueda mediar en las funciones efectoras, por ejemplo la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (Lifely, M.R. y col., Glycobiology _5, 813-822, 1995; Jefferis, R. y col., Immunol. Rev. 163, 59-76, 1998; Wright, A. y orrison, S.L., Trends Biotechnol. 1_5, 26-32, 1997). Umana, P. y col. ha puesto de manifiesto en Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999 y O 99/54342 que la sobreexpresión de la ß ( 1 , 4 ) -N-acetil-glucosaminiltransferasa III ("GnTIII") , una glucosiltransferasa que cataliza la formación de oligosacáridos biseccionados , en células de ovarios de hámster chino (CHO) , aumenta significativamente la actividad ADCC de los anticuerpos "in vitro" . Las alteraciones de la composición del hidrato de carbono Asn297 o su eliminación afecta también su fijación sobre el FcyR y Clq (Umana, P. y col., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999; ' Davies, J. y col., Biotechnol. Bioeng. 7_4, 288-294, 2001; imura, Y. y col., J. Biol. Chem. 276, 45539-45547, 2001; Radaev, S. y col., J. Biol. Chem. 276, 16478-16483, 2001; Shields, R.L. y col., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604, 2001; Shields, R.L. y col., J. Biol. Chem. 277, 26733-26740, 2002; Simmons, L.C. y col., J. Immunol . Methods 263, 133-147, 2002) .

Los métodos para intensificar las funciones efectoras de anticuerpo monoclonales de mediación celular mediante la reducción de la cantidad de fucosa se han descrito por ejemplo en WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/ 065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/ 035835, WO 2000/061739, Niwa, R. y col., J. Immunol. Methods 306, 151-160, 2005; Shinkawa, T. y col., J. Biol. Chem. 278, 3466- 3473, 2003; WO 03/055993 o US 2005/0249722.

De modo sorprendente, los anticuerpos biespécificos <ErbB3-c-Met> según la invención presentan una fuerte reducción de la internalizacion del receptor de la ErbB-3, si se comparan con sus anticuerpos originales <ErbB3> y/o <c- Met> (ver Figura 18, ejemplo 8 y tabla). Por lo tanto, en una modalidad de la invención, se glicosila el anticuerpo biespecifico según la invención (subgrupo IgGl o IgG3) con una cadena azúcar en Asn297, siendo la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar del 65% o menos (numeración según Kabat) . En otra modalidad, la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar se sitúa entre el 5% y el 65%, con preferencia entre el 20% y el 40%. "Asn297" según la invención significa el aminoácido asparagina situad en la posición 297 de la región Fe. Basándose en variaciones de secuencia poco importantes de los anticuerpos, el Asn297 puede estar situado en una posición de algunos aminoácidos (por lo general no más de ±3 aminoácidos) más arriba o más abajo de la posición 297, es decir entre la posición 294 y la 300. Estos anticuerpos glicomodificados se llaman también anticuerpos afucosilados .

La glicosilación de la IgGl o IgG3 humana tiene lugar en el Asn297 como glicosilación de oligosacárido complejo biantenario fucosilado, terminada con hasta dos residuo de Gal. Las regiones constantes de cadena pesada humanas del subgrupo IgGl o IgG3 se han descrito con detalle en Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), y en Brüggemann, M. y col., J. Exp. Med. 166, 1351-1361, 1987; Love, T.W. y col., Methods Enzymol. 178, 515-527, 1989. Estas estructuras se denominan residuo des glucano GO, Gl (a-1,6- o a-1,3-) o G2, en función de la cantidad de residuo des Gal terminales (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1, 44-53, 2003). La glicosilacion de tipo CHO de las partes Fe del anticuerpo Fe se ha descrito por ejemplo en Routier, F.H., Glycocon ugate J. 14, 201-207, 1997. Los anticuerpos que se expresan de modo recombinante en células hospederas de CHO no glicomodificadas normalmente se fucosilan en el Asn297 en una cantidad por lo menos del 85%. Los. oligosacáridos modificados del anticuerpo original de longitud completa pueden ser híbridos o complejos. Con preferencia, los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados o de fucosilación reducida son híbridos. En otra modalidad, los oligosacáridos biseccionados, no fucosilados o de fucosilación reducida son complejos.

Según la invención "cantidad de fucosa" significa la cantidad de azúcar dentro de la cadena azúcar del Asn297, referida a la suma de todas las glicoestructuras unidas al Asn297 (por ejemplo estructuras de complejas, híbridas y de alto contenido de mañosa), medida por espectrometría de masas MALDI-TOF y calculada como valor promedio. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa, referidas a todas las glicoestructuras identificadas en una muestra tratada de N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas, de oligomanosa y de alto contenido de mañosa, respectivamente) , determinada por MALDI-TOF (respecto al procedimiento detallado para determinar la cantidad de fucosa, véase el ejemplo 14) .

El anticuerpo biespecifico afucosilado según la invención puede expresarse en una célula hospedera glicomodificada, diseñada para que exprese por lo menos un ácido nucleico que codifica a un polipéptido que tenga actividad GnTIII en una cantidad suficiente para fucosilar parcialmente los oligosacáridos de la región Fe. Como alternativa puede disminuirse la actividad de al, 6-fucosiltransferasa de la célula hospedera o puede eliminarse según US 6,946,292 para generar células hospederas glicomodificadas . El grado de fucosilación del anticuerpo puede predeterminarse por ejemplo por las condiciones de fermentación (por ejemplo el tiempo de fermentación) o por combinación por lo menos de dos anticuerpos que tengan grados de fucosilación diferentes. Tales anticuerpos afucosilados y sus correspondientes métodos glicomodificados se han descrito en WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/ 031875, Umana, P. y col., Nature Biotechnol . 17, 176-180, 1999, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 o WO 2000/061739. Estos anticuerpos glicomodificados tienen una mayor ADCC . Otros métodos glicomodificados que permiten obtener anticuerpos afucosilados según la invención se han descrito por ejemplo en Niwa, R. y col., J. Immunol . Methods 306, 151-160, 2005; Shinkawa, ;(T. y col., J. Biol. Chem. 278, 3466-2373, 2003; WO 03/055993 o US 2005/0249722.

Una modalidad es un método de preparación del anticuerpo biespecifico del subgrupo IgGl o IgG3 que se ha gilcosilado con una cadena azúcar en Asn297, con lo cual la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar es del 65% o menos, aplicando el procedimiento descrito en, WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO 2007/ 031875, Umana, P. y col., Nature Biotechnol. 17, 176-180, 1999, WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 97/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 o WO 2000/061739.

Una modalidad es un método de preparación del anticuerpo biespecifico del subgrupo IgGl o IgG3 que se ha gilcosilado con una cadena azúcar en Asn297, con lo cual la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar es del 65% o menos, aplicando el procedimiento descrito en Niwa, R. y col., J. Immunol. Methods 306, 151-160, 2005; Shinkawa, T. y col., J. Biol. Chem. 278, 3466-2373, 2003; WO 03/055993 o US 2005/0249722.

En una modalidad los anticuerpos de' acuerdo con la invención inhiben la fosforilación del receptor c-Met inducida por HGF en células A549 (como se describé en el Ej emplo 2 ) .

En una modalidad los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben la fosforilación del receptor Her3 inducida por HRG (Herregulina) en células MCF7 en al menos 70% a una concentración de 1 µ?/??? (como se describe en el Ejemplo 3) (comparado con HRG como control) .

En una modalidad los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben la proliferación inducida por HGF de células HUVEC en al menos 40% a una concentración de 12.5 µg/ml (como se describe en el Ejemplo 4) (comparado con HGF solo como control) .

Formatos de anticuerpo biespecifico Los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de fijación y son biespecificos . Es decir, los anticuerpos pueden ser biespecificos incluso en los casos, en los que hay más de dos sitios de fijación (es decir, cuando el anticuerpo es trivalente o multivalente) . Los anticuerpos biespecificos de la invención incluyen, por ejemplo, a los anticuerpos multivalentes de cadena simple, los diacuerpos y los triacuerpos, asi como los anticuerpos que tienen la estructura de dominio constante de los anticuerpos de longitud completa a los que se unen otros sitios de fijación sobre antígeno (por ejemplo Fv de cadena simple, un dominio VH y/o un dominio VL, Fab o (Fab)2,) mediante uno o más enlazadores peptídicos. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa de una especie única o pueden ser quimerizados o humanizados. En el caso de un anticuerpo con más de dos sitios de fijación sobre el antigeno, algunos sitios de fijación pueden ser idénticos, en el supuesto de que la proteina tenga sitios de fijación sobre dos antígenos diferentes. Es decir, un primer sitio de fijación es especifico para la ErbB-3, mientras que el segundo sitio de fijación es especifico de la c-Met, o viceversa.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana según la invención contiene la región Fe de un anticuerpo.

Formatos biespecificos bivalentes Pueden utilizarse anticuerpos biespecificos bivalentes contra la ErbB-3 humana y la c-Met humana que contienen regiones constantes de inmunoglobulina del modo descrito por ejemplo en WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253 o Ridgway, J.B., Protein Eng. 9, 617-621, 1996; WO 96/027011; Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 6, 677-681, 1998; Atwell, S. y col., J. Mol. Biol . 270, 26-35, 1997 y EP 1 870 459A1.

Por lo tanto, en una modalidad de la invención el anticuerpo biespecifico <ErbB3-c-Met> según la invención es un anticuerpo biespecifico bivalente, que contiene: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3; y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c- et humana, en donde los dominios constantes CL y CH1, y/o los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.

En otra modalidad de la invención, el anticuerpo biespecífico <ErbB3-c- et> según la invención es un anticuerpo biespecífico bivalente, que contiene: a) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c-Met humana; y b) la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a ErbB-3, en donde los dominios constantes CL y CH1, y/o los dominios variables VL y VH se reemplazan entre sí.

Sobre la estructura esquemática ilustrativa de la tecnología de "superhélices" descrita a continuación véanse las Figuras 2a-2c.

Para mejorar los rendimientos de tales anticuerpos biespecífieos anti-ErbB-3/anti-C-met , bivalentes, heterodímeros , pueden alterarse los dominios CH3 del anticuerpo de longitud completa con la tecnología de "superhélices" que se describe con detalle mediante varios ejemplos por ejemplo en WO 96/027011, Ridgway, J.B. y col., Protein Eng. 9, 617-621, 1996; y Merchant, A.M. y col., Nat. Biotechnol. H>, 677-681, 1998. En este método se alteran las superficies de interacción de los dos dominios CH3 para aumentar la heterodimerizacion de las dos cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser el "cadena sobreenrollada", mientras que el otro será el "cadena en forma de horquillas". La introducción de un puente disulfuro estabiliza los heterodímeros (Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998; Atwell, S. y col., J. Mol. Biol. 270, 26-35, 1997) y aumenta el rendimiento.

Por tanto, en un aspecto de la invención, el anticuerpo biespecífico bivalente está además caracterizado porque: el dominio CH3 de una cadena pesada y el dominio CH3 de la otra cadena pesada se encuentran entre sí en la interfase que contiene una inferíase original entre los dominios CH3 del anticuerpo; en donde la interfase se altera para promover la formación del anticuerpo biespecífico bivalente, la alteración se caracteriza porque: a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original, el dominio CH3 de una cadena pesada que entra en contactó con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada dentro del anticuerpo biespecifico bivalente, se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, generando de este modo una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que puede posicionarse dentro de una cavidad existente dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que entra en contacto con la inferíase original del primer dominio CH3 dentro del anticuerpo biespecifico bivalente se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral, generando de este modo una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3, dentro del cual puede posicionarse una protuberancia existente dentro de la interfase del primer dominio CH3.

Con preferencia el residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral se selecciona entre el grupo formado por arginina (R) , fenilalanina (F), tirosina (Y) , triptófano (W) .

Con preferencia, el residuo de aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral se selecciona entre el grupo formado por alanina (A), serina (S) , treonina (T) , valina (V) .

En un aspecto de la invención, los dos dominios CH3 se alteran además con la introducción de la cisteína (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3, de modo que pueda formarse un puente disulfuro entre los dos dominios CH3.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico bivalente contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla". Puede recurrirse también a un puente disulfuro adicional entre cadenas (Merchant, A.M y col., Nature Biotech. 16^, 677-681, 1998) por ejemplo introduciendo una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla". Por tanto, en otra modalidad, el anticuerpo biespecifico bivalente contiene las mutaciones Y349C, T366 en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecífico bivalente contiene las mutaciones Y349C, T366 en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación adicional E356C o S354C el otro dominio CH3 forman un puente disulfuro entre las cadenas) (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) . Pero, de forma alternativa o adicional pueden aplicarse también otras tecnologías de superhélices descritas en el documento EP 1870459A1. Un ejemplo preferido del anticuerpo biespecífico bivalente son las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico bivalente contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" y además las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobrenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico bivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecifico bivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y además las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla".

En los ejemplos que siguen (ver por ejemplo la tabla 5 .y la Figura 7) se describen ejemplos de anticuerpos biespecificos bivalentes en un formato descrito en la tabla 5 y en la Figura 7, que se expresan y purifican.

Formatos biespecificos trivalentes Otro aspecto preferido de la presente invención es un anticuerpo biespecifico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) un fragmento Fab de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana, en donde el fragmento Fab de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico en el C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Sobre la estructura esquemática ilustrativa de la tecnología de "superhélices" descrita a continuación véase la Figura 5a.

Otro aspecto preferido de la presente invención es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) un fragmento Fv de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana, en donde el fragmento Fv de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico en el C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Sobre la estructura esquemática ilustrativa de la tecnología de "superhélices" descrita a continuación véase la Figura 5b.

Por consiguiente, los correspondientes anticuerpos biespecífieos trivalentes se expresan y purifican con la nomenclatura scFv-Ab de la Tabla 1 (ver los ejemplos que siguen) .

En una modalidad preferida, los fragmentos Fab o Fv de cadena simple que se fijan sobre la c-Met humana se fusionan con el anticuerpo de longitud completa mediante un conector peptídico en el C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa.

Otro aspecto preferido de la presente invención es un anticuerpo biespecifico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; b) un polipéptido que consta de ba) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) ; o bb) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1), en donde el polipéptido se fusiona con el N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico con el C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa; c) un polipéptido que consta de ca) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) ; en donde el polipéptido se fusiona con el N-terminal del dominio VL mediante un conector peptídico con el C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa; y en donde el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido del apartado b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido del apartado c) forman, juntos, un sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c-Met humana.

Con preferencia los conectores peptídicos de los apartados b) y c) son idénticos y son un péptido de por lo menos 25 aminoácidos, con preferencia entre 30 y 50 aminoácidos.

Para observar estructuras esquemáticas ilustrativas, véanse las Figuras 3a-3c.

Por consiguiente, los correspondientes anticuerpos biespecífieos trivalentes se expresan y purifican con la nomenclatura VHVL-Ab en la Tabla 4 (ver los ejemplos que siguen y la Figura 3c) .

Opcionalmente, el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido del apartado b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido del apartado c) están unidos y estabilizados mediante un puente disulfuro entre las cadenas gracias a la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes : i) la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

Las técnicas para la introducción de puentes disulfuro no naturales con fines de estabilización se describen por ejemplo en WO 94/029350, Rajagopal y col., Prot. Engin. 1453-59, (1997); Kobayashi, H. y col., Nuclear Medicine & Biology 25, 387-393, 1998; o Schmidt, M. y col., Oncogene 1Q_, 1711 -1721, 1999. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos de los apartados b) y c) se sitúa entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los polipéptidos de los apartados b) y c) se sitúa entre la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) . En una modalidad es preferido un anticuerpo biespecífico trivalente sin la estabilización opcional con disulfuro entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de cadena simple.

Por la fusión de un fragmento Fab, Fv, de cadena simple con una de las cadenas pesadas (Figuras 5a ó 5b) o por la fusión de diferentes polipéptidos con las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa (Figuras 3a-3c) se forma un anticuerpo biespecifico trivalente heterodimero . Para mejorar los rendimientos de tales anticuerpos biespecificos anti-ErbB-3/anti-C-met trivalentes heterodimeros, pueden alterarse los dominios CH3 del anticuerpo de longitud completa con la tecnología de los "superhélices", que se describe con detalle mediante varios ejemplos por ejemplo en WO 96/027011, Ridgway, J.B. y col., Protein Eng. 9, 617-621, 1996; y Merchant, A.M. y col., Nat . Biotechnol. 1_6, 677-681, 1998. En este método se alteran las superficies de interacción de los dos dominios CH3 para aumentar la heterodimerizacion de las dos cadenas pesadas que contienen estos dos dominios CH3. Cada uno de los dos dominios CH3 (de las dos cadenas pesadas) puede ser la "cadena sobreenrollada" , mientras que el otro será el "cadena en forma de horquilla". La introducción de un puente disulfuro estabiliza a los heterodimeros (Merchant, A.M. y col., Nature Biotech. 16, 677-681, 1998; Atwell, S. y col., J. Mol. Biol. 270 , 26-35, 1997) y aumenta el rendimiento.

Por tanto, en un aspecto de la invención el anticuerpo biespecifico trivalente está caracterizado además porque el dominio CH3 de una cadena pesada del anticuerpo de longitud completa y el dominio CH3 de la otra cadena pesada del anticuerpo de longitud completa entran en contacto en la interfase que contiene una interfase original entre los dominios CH3 del anticuerpo; en donde la interfase se altera para promover la formación del anticuerpo biespecifico bivalente, la alteración se caracteriza porque: a) se altera el dominio CH3 de una cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original el dominio CH3 de una cadena pesada que entra en contacto con la interfase original del dominio CH3 de la otra cadena pesada existente dentro del anticuerpo biespecifico bivalente, se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un mayor volumen de cadena lateral, con lo cual se genera una protuberancia dentro de la interfase del dominio CH3 de una cadena pesada que puede posicionarse en una cavidad dentro de la interfase del dominio CH3 de la otra cadena pesada y b) se altera el dominio CH3 de la otra cadena pesada, de modo que dentro de la interfase original del segundo dominio CH3 que entra en contacto con la interfase original del primer dominio CH3 existente dentro del anticuerpo biespecifico trivalente se reemplaza un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene un volumen menor de cadena lateral, con lo cual se genera una cavidad dentro de la interfase del segundo dominio CH3 dentro del cual puede posicionarse una protuberancia existente dentro de la interfase del primer dominio CH3.

Con preferencia, el residuo de aminoácido que tiene un. mayor volumen de cadena lateral se selecciona entre el grupo formado por arginina (R) , fenilalanina (F), tirosina (Y) , triptófano (W) .

En un aspecto de la invención, los dos dominios CH3 se alteran además con la introducción de la cisteina (C) como aminoácido en las posiciones correspondientes de cada dominio CH3 de modo que pueda formarse un puente disulfuro entre los dos dominios CH3.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de . horquilla" . Puede recurrirse también a un puente disulfuro adicional entre cadenas (Merchant, A.M y col., Nature Biotech. 1_6, 677-681, 1998) por ejemplo introduciendo una mutación Y349C en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y una mutación E356C o una mutación S354C en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla". Por tanto, en otra modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones E356C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 (la mutación Y349C adicional en un dominio CH3 y la mutación adicional E356C o S354C el otro dominio CH3 forman un puente disulfuro entre las cadenas) (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) . Pero, de forma alternativa o adicional pueden aplicarse también otras tecnologías de superhélices descritas en el documento EP 1870459A1. Un ejemplo preferido del anticuerpo biespecífico trivalente son las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene una mutación T366W en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" y además las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla" .

En otra modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 o el anticuerpo biespecifico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C, T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y además las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla".

Otra modalidad de la présente invención es un anticuerpo biespecifico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1), una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras ' de anticuerpo formadas en dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) un fragmento Fab de cadena simple que se une específicamente a la c- et humana) , en donde el fragmento Fab de cadena simple consta de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1), un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) y un enlace, y en donde los dominios del anticuerpo y el enlace tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección del N-terminal al C-terminal : ba) VH-CHl-enlazador-VL-CL, o bb) VL-CL-enlazador- VH-CH1; en donde el enlace es un péptido de por lo menos 30 aminoácidos, con preferencia entre 32 y 50 aminoácidos; y en donde el fragmento Fab de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a), mediante un conector peptídico del C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera (con preferencia en el C-terminal de la cadena pesada) del anticuerpo de longitud completa; en donde el conector pept dico es un péptidó de por lo menos 5 aminoácidos, con preferencia entre 10 y 50 aminoácidos .

Dentro de esta modalidad, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene con preferencia una mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y con mayor preferencia el anticuerpo biespecifico trivalente contiene las Y349C, T356W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C (o E356C) , T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. Opcionalmente, en la modalidad, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla".

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecifico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1), una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) un fragmento Fv de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana) , en donde el fragmento Fv de cadena simple, del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico del C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera (con preferencia en el C-terminal de la cadena pesada) del anticuerpo de longitud completa; y en donde el conector peptídico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, con preferencia entre 10 y 50 aminoácidos .

Dentro de esta modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene con preferencia una mutación T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y con mayor preferencia el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C (o E356C), T366S, L368A, Y407V en el otro de los' dos dominios CH3. Opcionalmente, en la modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones R409D; ?370? en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla".

Por tanto, una modalidad preferida es un anticuerpo biespecífico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de: aa) dos cadenas . pesadas de anticuerpo formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1), una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3); y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) un fragmento Fv de cadena simple que se une específicamente a la c-Met humana) , en donde el fragmento Fv de cadena simple del apartado b) se fusiona con el anticuerpo de longitud Completa del apartado a) mediante un conector peptídico en el C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo de longitud completa (formándose dos péptidos de fusión de cadena pesada de anticuerpo y Fv de cadena simple) ; y en donde el conector peptidico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 26, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 27 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 28.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 29, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 30 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 31.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 32, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 33 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 34.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 35, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 36 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 37.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 38, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-Fv de cadena simple un polipéptido de la SEC ID NO: 39 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 40.

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecifico trivalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) ; y b) un polipéptido formado por ba) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) ; o bb) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante, 1 de anticuerpo (CH1), en donde el polipéptido se fusiona con el N-terminal del dominio VH mediante un conector peptidico con el C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa (formándose un péptido de fusión de la cadena pesada de anticuerpo y la VH) , en donde el conector peptidico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, con preferencia entre 25 y 50 aminoácidos; c) un polipéptido formado por: ca) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) ; en donde el polipéptido se fusiona con el N-terminal del dominio VL mediante un conector peptidico con el C-terminal de la otra de las dos . cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa (formándose un péptido de fusión de la cadena pesada de anticuerpo y la VL) ; en donde el conector peptidico es idéntico al conector peptidico del apartado b) ; y en donde el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) del polipéptido del apartado b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido del apartado c) forman, juntos, un sitio de fijación sobre el antigeno, que se une específicamente a la c-Met humana.

Dentro de esta modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene con preferencia una mutación T366 en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3 y con mayor preferencia el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones Y349C, T366W en uno de los dos dominios CH3 y las mutaciones S354C (o E356C) , T366S, L368A, Y407V en el otro de los dos dominios CH3. Opcionalmente, en la modalidad, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene las mutaciones R409D; K370E en el dominio CH3 de la "cadena sobreenrollada" y las mutaciones D399K; E357K en el dominio CH3 de la "cadena en forma de horquilla".

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecífico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VH un polipéptido de la SEC ID NO: 11, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VL un polipéptido de la SEC ID NO: 12 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 13.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VH un polipéptido de la SEC ID NO: 14, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VL un polipéptido de la SEC ID NO: 15 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 16.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VH un polipéptido de la SEC ID NO: 17, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VL un polipéptido de la SEC ID NO: 18 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 19.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VH un polipéptido de la SEC ID NO: 20, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VL un polipéptido de la SEC ID NO: 21 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 22.

En una modalidad preferida, el anticuerpo biespecifico trivalente contiene como primer péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VH un polipéptido de la SEC ID NO: 23, como segundo péptido de fusión de cadena pesada de anticuerpo-VL un polipéptido de la SEC ID NO: 24 y dos cadenas ligeras de anticuerpo de la SEC ID NO: 25.

En otro aspecto de la presente invención, el anticuerpo biespecifico trivalente según la invención contiene : a) un anticuerpo de longitud completa que se fija sobre la ErbB-3 humana, que consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo VH-CH1-HR-CH2-CH3 y dos cadenas ligeras de anticuerpo VL-CL; (en donde con preferencia uno de los dos dominios CH3 contiene las mutaciones Y349C, T366W y el otro de los dos dominios CH3 contiene las mutaciones S354C (o E356C) , T366S, L368A, Y407V) ; b) un polipéptido formado por: ba) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) ; o bb) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1), en donde el polipéptido se fusiona con el N-terminal del dominio VH mediante un conector peptídico con el C-terminal de una de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa: c) un polipéptido formado por: ca) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , o cb) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) ; en donde el polipéptido se fusiona con el N-terminal del dominio VL mediante un conector peptidico con el C-terminal de la otra de las dos cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa; y en donde el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo (VH) del polipéptido del apartado b) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) del polipéptido del apartado c) forman, juntos, un sitio de fijación sobre el antigeno que se une específicamente a la c-Met humana.

Formatos biespecificos tetravalentes En una modalidad, el anticuerpo multiespecífico según la invención es tetravalente, en donde el o los sitios de fijación sobre el antígeno, que se unen específicamente a la c-Met humana, inhibe la dimerización de la c-Met (tal como se describe por ejemplo en WO 2009/007427).

Otro aspecto de la presente invención es, pues, un anticuerpo biespecxfico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) dos fragmentos Fab de cadena simple idénticos que se une específicamente a la c-Met humana, los fragmentos Fab de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptidico del C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Otro aspecto de la presente invención es, pues, un anticuerpo biespecifico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c-Met humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) dos fragmentos Fab de cadena simple idénticos que se une específicamente a la ErbB-3, los fragmentos Fab de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptidico del C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Respecto a la estructura esquemática ilustrativa, véase la Figura 6a.

Otro aspecto de la presente invención es, pues, un anticuerpo biespecifico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3, y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) dos fragmentos Fv de cadena simple idénticos que se une específicamente a la c-Met humana, los fragmentos Fv de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico del C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Otro aspecto de la presente invención es, pues, un anticuerpo biespecifico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la c- et humana y consta de dos cadenas pesadas de anticuerpo y dos cadenas ligeras de anticuerpo; y b) dos fragmentos Fv de cadena simple idénticos que se une específicamente a la ErbB-3, los fragmentos Fv de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptídico del C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa.

Respecto a la estructura esquemática ilustrativa véase la Figura 6b.

En una modalidad preferida, los fragmentos Fab o Fv de cadena simple que se unen a la c-Met humana o a la ErbB-3 humana se fusionan con el anticuerpo de longitud completa mediante un conector peptídico en el C-terminal de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa.

Otra modalidad de la presente invención es un anticuerpo biespecifico tetravalente que contiene a) un anticuerpo de longitud completa que se une específicamente a la ErbB-3 humana y consta de: aa) dos cadenas pesadas de anticuerpo idénticas formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1), una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2), y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) ; y ab) dos cadenas ligeras de anticuerpo idénticas formadas en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) (VL-CL) ; y b) dos fragmentos Fab de cadena simple que se unen específicamente a la c-Met humana, los fragmentos Fab de cadena simple están formados por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1), un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) y un enlace, y los dominios del anticuerpo y el enlace tienen uno de los siguientes órdenes en la dirección del N-terminal al C-terminal : ba) VH-CHl-enlazador-VL-CL, o bb) VL-CL-enlazador- VH-CH1; el enlace es un péptido de por lo menos 30 aminoácidos, con preferencia entre 32 y 50 aminoácidos; y los fragmentos Fab de cadena simple del apartado b) se fusionan con el anticuerpo de longitud completa del apartado a) mediante un conector peptidico del C-terminal o N-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa; el conector peptidico es un péptido de por lo menos 5 aminoácidos, con preferencia entre 10 y 50 aminoácidos.

El término "anticuerpo de longitud completa" se emplea en formato trivalente o tetravalente e indica un anticuerpo formado por dos "cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa" y dos "cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa" (ver la Figura 1) . Una "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido formado en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de cadena pesada de anticuerpo (CH1) , una región bisagra de anticuerpo (HR) , un dominio constante 2 de cadena pesada de anticuerpo (CH2) y un dominio constante 3 de cadena pesada de anticuerpo (CH3) , abreviado por VH-CH1-HR-CH2-CH3 ; y opcionalmente un dominio constante 4 de cadena pesada de anticuerpo (CH4) en el caso de un anticuerpo del subgrupo IgE. Con preferencia, la "cadena pesada de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido formado en la dirección del N-terminal al C-terminal por VH, CH1, HR, CH2 y CH3. Una "cadena ligera de anticuerpo de longitud completa" es un polipéptido formado en la dirección del N-terminal al C-terminal por un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) , abreviado por VL-CL. El dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) puede ser el (kappa) o el ? (lambda) . Las dos cadenas de anticuerpo de longitud completa están unidas entre si mediante enlaces disulfuro entre polipéptidos , es decir entre el dominio CL y el dominio CH1 y entre las regiones bisagra de las cadenas pesadas del anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de anticuerpos típicos de longitud completa son los anticuerpos naturales del tipo IgG (por ejemplo IgG 1 e IgG2), Ig , IgA, IgD e IgE. Los anticuerpos de longitud completa según la invención pueden ser de una sola especie, por ejemplo humanos, o pueden ser anticuerpos guimerizados o humanizados. Los anticuerpos de longitud completa según la invención contienen dos sitios de fijación sobre antígeno, cada uno de ellos está formado por un par de VH y VL, estas dos se unen específicamente al mismo antígeno. El C-terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido del C-terminal de la cadena pesada o ligera. El N- terminal de la cadena pesada o ligera del anticuerpo de longitud completa indica el último aminoácido del N-terminal de la cadena pesada o ligera.

El término "conector peptídico" se emplea en la invención para indicar un péptido con secuencias de aminoácidos, que es con preferencia de origen sintético. Estos conectores peptidicos según la invención se emplean para fusionar los fragmentos Fab de cadena simple con el C-terminal o N-terminal del anticuerpo de longitud completa para formar un anticuerpo multiespecifico según la invención. Con preferencia, los conectores peptidicos del apartado b) son péptidos con una secuencia de aminoácidos de una longitud por lo menos de 5 aminoácidos, con preferencia con una longitud de 5 a 100, con mayor preferencia de 10 a 50 aminoácidos. En una modalidad, el conector peptídico es (GxS)n o (GxS)nGm, siendo G = glicina, S = serina, y (x = 3, n = 3, 4, 5 ó 6, y m = 0, 1, 2 ó 3) o (x = 4, n = 2, 3, 4 ó 5 y m = 0, 1, 2 ó 3) , con preferencia x = 4 y n = 2 ó 3, con mayor preferencia con x = 4, n= 2. Con preferencia, en los anticuerpos biespecífieos trivalentes, en los que un polipéptido VH o VH-CHl y un polipéptido VL o VL-C L (Figuras 7a-7c) se han fusionado mediante dos conectores peptidicos idénticos con el C-terminal de un anticuerpo de longitud completa; los conectores peptidicos son péptidos por lo menos de 25 aminoácidos, con preferencia péptidos entre 30 y 50 aminoácidos y con mayor preferencia el el conector peptídico es (GxS)n o (GxS)nGm, siendo G = glicina, S = serina y (x = 3, n = 5, 7 ú 8, y m = 0, 1, 2 ó 3) o (x = 4, n = 5, 6 ó 7 y m = 0, 1, 2 ó 3) , con preferencia x = 4 y n = 5, 6, 7.

Un "fragmento Fab de cadena simple" (ver Figura 2a) es un polipéptido que consta de un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio constante 1 de anticuerpo (CH1) , un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) , un dominio constante de cadena ligera de anticuerpo (CL) y un enlace, los dominios de anticuerpo y el enlace tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección del N-terminal al C-terminal: a) VH-CHl-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CHl, c) VH-CL-enlazador-VL-CHl o d) VL-CHl-enlazador-VH-CL; y el enlace es un polipéptido de por lo menos 30 aminoácidos, con preferencia entre 32 y 50 aminoácidos. Los fragmentos Fab de cadena simple a) VH-CHl-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CHl, c) VH-CL-enlazador-VL-CHl y d) VL-CHl-enlazador-VH-CL, se estabilizan mediante el enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1. El término "N-terminal" indica el último aminoácido del N-terminal, el término "C-terminal" indica el último aminoácido del C-terminal.

El término "enlazador" se emplea en la invención en relación con los fragmentos Fab de cadena simple e indica un péptido con secuencias de aminoácidos, . que es con preferencia de origen sintético. Estos péptidos según la son se emplean para unir a) VH-CH1 con VL-CL, b) VL-CL con VH-CH1, c) VH-CL con VL-CH1 o d) VL-CH1 con VH-CL para formar los siguientes fragmentos Fab de cadena simple según la invención a) VH-CHl-enlazador-VL-CL, b) VL-CL-enlazador-VH-CHl, c) VH-CL-enlazador-VL-CHl o d) VL-CHl-enlazador-VH-CL . Este enlace dentro de los fragmentos Fab de cadena simple es un péptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de por lo menos 30 aminoácidos, con preferencia una longitud de 32 a 50 aminoácidos. En una modalidad, el enlace es (GxS)n, siendo G = glicina, S - serina, (x = 3, n = 8, 9 ó 10 y m = 0, 1, 2 ó 3) o (x = 4 y n = 6, 7 ú 8 y m = 0, 1, 2 ó 3) , con preferencia siendo x = 4, n = 6 ó 7 y m = 0, 1, 2 ó 3, con mayor preferencia siendo x = 4, n = 7 y m = 2. En una modalidad, el enlace es (G4S)6G2.

En una modalidad preferida, los dominios de anticuerpo y el enlazador en el fragmento Fab de cadena simple tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección del N-terminal al C-terminal: a) VH-CHl-enlazador-VL-CL, o b) VL-CL-enlazador-VH-CHl, con mayor preferencia VL-CL-enlazador-VH-CHl.

En otra modalidad preferida, los dominios de anticuerpo y el enlace en el fragmento Fab de cadena simple tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección del N-terminal al C-terminal: a) VH-CL-enlazador-VL-CHl o b) VL-CHl-enlazador-VH- CL.

Opcionalmente, en el fragmento Fab de cadena simple, además del enlace disulfuro natural entre el dominio CL y el dominio CH1, también el dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH) y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) se estabilizan con disulfuro mediante la introducción de un enlace disulfuro entre las posiciones siguientes: i) la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al Indice EU de Kabat) .

La estabilización adicional con disulfuro de los fragmentos Fab de cadena simple se logra con la introducción de un enlace disulfuro entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de cadena simple. Las técnicas para introducir puentes disulfuro no naturales para la estabilización de un Fv de cadena simple se han descrito por ejemplo en WO 94/029350, Rajagopal, V. y col., Prot. Engin. 1453-59, (1997); Kobayashi, H. y col., Nuclear Medicine & Biology 25, 387-393, 1998; o Schmidt, M. y col., Oncogene 18, 1711-1721, 1999. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los fragmentos Fab de cadena simple existentes en el anticuerpo según la invención se sitúa entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera. En una modalidad, el enlace disulfuro opcional entre los dominios variables de los fragmentos Fab de cadena simple existente en el anticuerpo según la invención se sitúa entre la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera (numeración siempre de acuerdo al índice EU de Kabat) .

En una modalidad, son preferidos los fragmentos Fab de cadena simple sin la estabilización opcional con disulfuro entre los dominios variables VH y VL de los fragmentos Fab de cadena simple.

Un "fragmento Fv de cadena simple" (ver Figura 2b) es un polipéptido que consta de un dominio variable dé cadena pesada de anticuerpo (VH) , un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y un Fv de cadena simple-enlace, los dominios de anticuerpo y el Fv de cadena simple-enlace tienen uno de los órdenes siguientes en la dirección del N-terminal al C-terminal: a) VH-Fv de cadena simple-enlazador- VL, b) VL-Fv de cadena simple-enlazador-VH ; con preferencia a) VH-Fv de cadena simple-enlazador-VL, y el Fv de cadena simple-enlace es un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de por lo menos 15 aminoácidos, en una modalidad una longitud de por lo menos 20 aminoácidos. El término "N-terminal" indica el último aminoácido del N-terminal. El término "C-terminal" indica el último aminoácido del C-terminal.

El término "Fv de cadena simple-enlace" empleado en el fragmento Fv de cadena simple indica un péptido con secuencias de aminoácidos, que es con preferencia de origen sintético. El Fv de cadena simple-enlace es un péptido con una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de por lo menos 15 aminoácidos, en una modalidad una longitud de por lo menos 20 aminoácidos y con preferencia una longitud entre 15 y 30 aminoácidos. En una modalidad, el Fv de cadena simple-enlace es (GxS)n, en donde G = glicina, S = serina, (x = 3 y n= , 5 ó 6) o (x = 4 y n = 3, 4, 5 ó 6), con preferencia con x = 4, n = 3, 4 ó 5, con mayor preferencia con x = 4, n = 3 ó 4. En una modalidad, el Fv de cadena simple-enlace es (G4S)3 o (G4S)4.

Además, los fragmentos Fv de cadena simple son con preferencia estabilizados con disulfuro. La estabilización adicional con disulfu'ro de los anticuerpos de cadena simple se realiza mediante la introducción de un enlace disulfuro entre los dominios variables de los anticuerpos de cadena simple y se ha descrito por ejemplo en WO 94/029350, Rajagopal, V. y col., Prot. Engin. 10, 1453-59, 1997; Kobayashi, H. y col., Nuclear Medicine & Biology 25, 387-393, 1998; o Schmidt, M. y col., Oncogene 18, 1711 -1721, 1999.

En una modalidad de los fragmentos Fv de cadena simple estabilizados con disulfuro, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los fragmentos Fv de cadena simple existentes en el anticuerpo según la invención se selecciona con independencia de cada fragmento Fv de cadena simple entre : i) la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera, ii) la posición 105 del dominio variable de cadena pesada y la posición 43 del dominio variable de cadena ligera, o iii) la posición 101 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera.

En una modalidad, el enlace disulfuro entre los dominios variables de los fragmentos Fv de cadena simple existente en el anticuerpo según la invención se sitúa entre la posición 44 del dominio variable de cadena pesada y la posición 100 del dominio variable de cadena ligera.

El anticuerpo según la invención se produce por medios recombinantes . Por lo tanto, un aspecto de la presente invención un ácido nucleico que codifica al anticuerpo según la invención y otro aspecto es una célula que contiene el ácido nucleico que codifica a un anticuerpos según la invención. Los métodos de producción recombinante son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y consisten en la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas y el posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación del mismo hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión recién mencionada de los anticuerpos en una célula hospedera se insertan los ácidos nucleicos que codifican a las respectivas cadenas corta y larga modificadas en vectores de expresión por métodos estándar. La expresión se realiza en células hospederas procariotas o eucariotas apropiadas, por ejemplo las células CHO, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levadura o células de E. coli, y se recupera el anticuerpo de las células (líquido sobrenadante o células después de la lisis) . Los métodos generales de producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica y se han descrito, por ejemplo, en artículos de revistas científicas, de autores como Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17, 183-202, 1999;' Geisse, S. y col., Protein Expr. Purif. 8, 271-282, 1996; Kaufman, R. , J. Mol. Biotechnol. 16, 151-160, 2000; Werner, R.G., Drug Res. 48, 870-880, 1998.

Los anticuerpos biespecificos se separan del medio de cultivo de modo conveniente por procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina, por ejemplo proteina A-sefarosa, cromatografía a través de hidroxilapatita, electroforesis a través de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y el ARN que codifican a los anticuerpos monoclonales ·· se aisla fácilmente y se secuencia aplicando procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuentes de los ADN y ARN. Una vez aislado, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que se transfectan a células hospederas del tipo células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otro modo no producirían proteína de inmunoglobulina para realizar la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células hospederas.

Las variantes de secuencias de aminoácidos (o mutantes) del anticuerpo biespecífico se obtienen introduciendo los cambios apropiados de nucleotidos en el ADN del anticuerpo o por síntesis de nucleotidos. Sin embargo, estas modificaciones pueden realizarse solamente en un intervalo muy limitado, por ejemplo del modo antes descrito. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características del anticuerpo antes mencionadas, por ejemplo el isotipo de IgG y la fijación sobre el antigeno, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteina o facilitar la purificación.

El término "célula hospedera" se emplea en la presente solicitud para indicar cualquier tipo de sistema celular que puede diseñarse para generar los anticuerpos según la presente invención. En una modalidad, las células HEK293 y las células CHO se emplean como células hospederas. Tal como se emplea aquí, las expresiones "célula", "linea ce-lular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas las denominaciones incluyen a la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original.

La expresión en células NSO se ha descrito por ejemplo en Barnes, L.M. y col., Cytotechnology ^32, 109-123, 2000; Barnes, L.M. y col., Biotech. Bioeng. T3, 261-270, 2001. La expresión transitoria se ha descrito por ejemplo en D.urocher, Y. y col., Nucí. Acids. Res. 30, E9, 2002. La clonación de los dominios variables se ha descrito en Orlandi, R. y col., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86, 3833-3837, 1989; Cárter, P. y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289, 1992; y Norderhaug, L. y col., J. Immunol . Methods 204, 77-87, 1997. Un sistema de expresión transitoria preferido (HEK 293) se ha descrito en Schlaeger, E.-J. y Christensen, K., en Cytotechnology 30, 71-83, 1999 y en Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194, 191-199, 1996.

Las secuencias de control idóneas para procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador y un sitio de unión a un ribosoma. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilacion.

Un ácido nucleico está "unido operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una pre-secuencia o líder secretorio está unido operativamente con un ADN de un polipéptido si se expresa como pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido operativamente con una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión de un ribosoma está unido operativamente con una secuencia codificadora si está posicionado de tal manera que facilita la traducción. En general, "unido operativamente" significa que las secuencias de ADN que se van a unir son contiguas, y, en el ' caso de un lider secretorio, son contiguas y están dentro del marco de lectura. Sin embargo, los intensi icadores no tienen que estar contiguos. La unión se realiza por ligación en sitios de restricción oportunos. Si no existen tales sitios, se emplearán adaptadores o enlazadores oligonucleótidos sintéticos de acuerdo a la práctica convencional.

La purificación de anticuerpos se realiza con el fin de eliminar componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por técnicas estándar, incluido el tratamiento alcalino/SDS, el contraste con CsCl, la cromatografía de columna, la electro-foresis a través de gel de agarosa y otros métodos bien conocidos de la técnica, véase Ausubel, F. y col., coord. , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987). Los diferentes métodos se han consolidado y se emplean con frecuencia para la purificación de proteínas, por ejemplo la cromatografía de afinidad con proteínas microbianas (por ejemplo cromatografía de afinidad de proteína A o proteína G) , cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo intercambio catiónico (resinas de carboximetilo) , intercambio aniónico (resinas de aminoetilo) y de intercambio mixto) , la adsorción tiófila (por ejemplo con beta-mercapto-etanol y otros ligandos SH) , la interacción hidrófoba o la cromatografía de adsorción aromática (por ejemplo con fenil-sefarosa, resinas aza-arenófilas o con ácido m-aminofenil-borónico) , cromatografía de afinidad con quelatos metálicos (por ejemplo con material de afinidad Ni (II) y Cu(II)), la cromatografía de exclusión de tamaños y los métodos electroforéticos (por ejemplo la electroforesis a través de gel, la electroforesis capilar) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 7_5, 93-102, 1998).

Tal- como se emplean aquí, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se emplean indistintamente y todas las denominaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos derivados de la misma con independencia del número de transferencias. Se da también por supuesto que toda la progenie puede que no sea exactamente idéntica en cuanto al contenido de ADN, debido a las mutaciones deliberadas o inadvertidas. Se incluye la progenie variante que tiene la misma función o actividad biológica que se ha explorado en la célula transformada original. Cuando existan distintas denominaciones, su significado resultará claro por el contexto .

El término "transformación" se emplea aquí para indicar un proceso de transferencia de un vector/ácido nucleico a una célula hospedera. Si se emplean como células hospederas células sin barrera de pared celular formidable, la transfección se puede llevar a cabo por ejemplo por el método de precipitación con fosfato cálcico descrito por Graham, F.L., van der Eb, A.J., Virology 52, 456-467, 1978. Sin embargo pueden emplearse también otros métodos de introducción del ADN en las células, como son la inyección nuclear o la fusión de protoplastos . Si se emplean células procariotas o células que contienen construcciones sustanciales de pared celular, por ejemplo un método de transfección el tratamiento con calcio empleando el cloruro cálcico, descrito por Cohén, S.N. y col., PNAS . 69, 7110ff, 1972.

Tal como se emplea aquí, "expresión" indica el proceso por el que un ácido nucleico se transcribe al ARNm y/o el proceso por el que el ARNm transcrito (también llamado transcrito) se traduce seguidamente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Los transcritos y los polipéptidos codificados se denominan colectivamente productos genéticos. Si el polinucleótido deriva del ADN genómico, la expresión en una célula eucariota puede incluir el empalme del ARNm.

Un "vector" es una molécula de ácido nucleico, en particular una molécula autorreplicante, que transfiere una molécula de ácido nucleico insertada a y/o entre células hospederas. El término incluye a los vectores que funcionan primariamente para la inserción de ADN o ARN en una célula (por ejemplo, integración cromosómica) , la replicación de vectores que funcionan primariamente para la replicación de ADN o ARN y vectores de expresión que funcionan para la transcripción y/o traducción del ADN o ARN. Se incluyen también los vectores que proporcionan más de una de las funciones descritas.

Un "vector de expresión" es un polinucleótido que, cuando se introduce en una célula hospedera apropiada, puede transcribirse y traducirse en un polipéptido. Un "sistema de expresión" se emplea normalmente para indicar una célula hospedera apropiada que consta de un vector de expresión que puede funcionar para generar un producto de expresión deseado .

Composición farmacéutica Un aspecto de la invención es una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de una composición farmacéutica. Otro aspecto de la invención es un método para la fabricación de una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo según la presente invención, formulado junto con un portador farmacéutico.

Una modalidad de la invención es el anticuerpo biespecifico según la invención para el tratamiento del cáncer .

Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto ·· de la invención es método de tratamiento de un paciente que sufre un cáncer que consiste en administrar un anticuerpo según la invención a un paciente que necesite el tratamiento.

Tal como se emplea aquí, "portador farmacéutico" incluye a todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes isotónicos y retardantes de absorción y similares que sean fisiológicamente compatibles. Con preferencia, el portador es idóneo para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo por inyección o infusión) .

Una composición de la presente invención puede administrarse por una gran variedad de métodos ya conocidos de la técnica. Los expertos sabrán apreciar que la vía y/o el modo de administración pueden variar en función de los resultados deseados. Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vias de administración, puede ser necesario revestir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con un material para impedir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen la solución salina y las soluciones acuosas reguladas en pH. Los portadores farmacéuticos incluyen las soluciones o dispersiones acuosas estériles y los polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas ya es conocido en la técnica.

Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" se emplea aqui para indicar los modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, normalmente por inyección e incluyen, sin limitación, la inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca , intradermal, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular , intra-articular , subcapsular, subaracnoide, intraespinal , epidural e intraesternal y la infusión .

El término cáncer se emplea aqui para indicar enfermedades proliferativas, por ejemplo linfomas, leucemias linfociticas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no de células pequeñas (NSCL) , cáncer de pulmón de células bronquioloalveolares, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma cutáneo o intra-ocular, cáncer de útero, cáncer de ovarios, cáncer de recto, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de útero, carcinoma de los tubos de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cérvix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, cáncer de esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de glándula tiroides, cáncer de glándula paratiroides, cáncer de cápsula suprarrenales, sarcoma de tejido blando, cáncer de uretra, cáncer de pene, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de ríñones o de uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de pelvis renal, mesotelioma, cáncer hepatocelular , cáncer biliar, neoplasmas del sistema nervioso central (SNC) , tumores del eje espinal, glioma del tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas , schwanomas, ependimonas, meduloblastomas , meningiomas, carcinomas de células escamosas, adenoma pituitario y sarcoma de Ewings, incluidas las versiones refractarias de cualquiera de los cánceres recién mencionados o las combinaciones de uno o más de los cánceres anteriores.

Otro aspecto de la invención es el anticuerpo biespecífico según la invención o la composición farmacéutica como agente anti-angiogénico . Tal agente anti-angiogénico puede utilizarse para el tratamiento del cáncer, en especial tumores sólidos y otras enfermedades vasculares.

Una modalidad de la invención es el anticuerpo biespecifico según la invención para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Otro aspecto de la invención es la composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades vasculares.

Otro aspecto de la invención es método de tratamiento de paciente que sufre enfermedades vasculares mediante la administración un anticuerpo según la invención a un paciente que necesite el tratamiento.

El término "enfermedades vasculares" incluye el cáncer, enfermedades inflamatorias, aterosclerosis , isquemia, trauma, septicemia, COPD, asma, diabetes, AMD, retinopatia, apoplejía, adiposidad, lesión pulmonar aguda, hemorragias, derrame vascular, por ejemplo inducido por citocinas, alergia, enfermedad de Graves, tiroiditis autoinmune de Hashimoto, púrpura trombocitopénica idiopática, arteritis de células gigantes, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico (SLE) , nefritis por lupus, enfermedad de Crohn, esclerosis múltiple, colitis ulcerante, en especial los tumores sólidos, síndromes neovasculares intraoculares , por ejemplo retinopatías proliferativas o la degeneración macular debida a la edad (AMD) , artritis reumatoide y psoriasis (Folkman, J., Shing, Y. y col., J. Biol . Chem. 267, 10931-10934, 1992; Klagsbrun, M. y col., Annu. Rev. Physiol. 53, 217-239, 1991; y Garner, A., Vascular diseases, en: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A. y Klintworth, G.K., (coord. ) , 2a edición, Marcel Dekker, Nueva York 1994, pp. 1625-1710) .

Estas composiciones pueden contener también adyuvantes como son los conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia ' de microorganismos puede asegurarse tanto con procedimientos de esterilización, ver más arriba, como por la inclusión de varios agentes antibacterianos y ant ifúngicos , por ejemplo, parabeno, clorobutanol , fenol, ácido sórbico y similares. Puede ser también deseable la inclusión en las composiciones de agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro sódico y similares. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción, como son el monoesterato de aluminio y la gelatina.

Con independencia de la vía de administración elegida, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales, que los expertos ya conocen.

Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse con el fin de obtener una cantidad de ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada en un paciente, una composición y un modo de administración concretos, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de un gran número de factores farmacocinét icos , incluida la actividad de las composiciones concretas de la presente invención que se empleen, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto concreto que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales que se utilicen en combinación con las composiciones concretas empleadas, la edad, el sexo, el peso, el estado patológico, el estado general de salud y el historial médico previo del paciente a tratar asi como los factores bien conocidos en las técnicas médicas.

La composición tiene que ser estéril y liquida en un grado tal que la composición pueda administrarse con una jeringa. Además del agua, el portador es con preferencia una solución salina regulada en pH isotónica.

La fluidez correcta puede mantenerse, por ejemplo, con el uso de recubrimiento, tal como la lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y con el uso de tensioact ivos . En muchos casos es preferible incorporar a la¦¦ composición agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes , tales como la manitol o la sorbitol y cloruro sódico.

Ahora se ha encontrado que los anticuerpos biespecificos según la presente invención contra la ErbB-3 humana y la c-Met humana tienen características valiosas, por ejemplo su actividad biológica o farmacológica. Los anticuerpos biespecificos <ErbB3-c-Met> según la invención presentan una internal i zación reducida si se comparan con sus anticuerpos originales <ErbB3> y/o <c-Met>.

Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y Figuras se presentan para facilitar la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se define en las reivindicaciones adjuntas. Se da por supuesto que pueden introducirse modificaciones a los procedimientos definidos sin apartarse del espíritu de la invención.

Procedimiento experimental Ejemplos Materiales y métodos Técnicas de ADN recombinante Para manipular el ADN se aplican los métodos estándar descritos en Sambrook, J. y col., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989. Los reactivos de biología molecular-- se emplean de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Análisis de secuencias de ADN y de proteínas y gestión de los datos de las secuencias La información general respecto a las secuencias de nucleótido de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas humanas se encontrará en: Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed. , NIH, publicación No. 91-3242. Los aminoácidos de las cadenas de anticuerpo se numeran y nombran según la numeración EU (Edelman, G.M. y col., PNAS 63, 78-85, 1969; Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta ed. , publicación NIH No. 91-3242). Para la creación de la secuencia, mapeo, análisis e ilustración se emplean el paquete informático GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) , versión 10.2 y el programa infomax's Vector ??? Advance suite, versión 8.0.

Secuenciación del ADN Se determinan las secuencias de ADN por secuenciación bicatenaria realizada en SequiServe (Vaterstetten, Alemania) y Geneart AG (Regensburg, Alemania) .

Síntesis genética Los segmentos de genes deseados se preparan en Geneart AG (Regensburg, Alemania) a partir de oligonucleotidos sintéticos y productos de PCR por síntesis genética automatizada. Los segmentos de genes, que están flanqueados por sitios de rotura de endonucleasa de restricción singular se clonan en plásmidos pGA18 (ampR) . Se purifica el ADN plásmido a partir de las bacterias transformadas y la concentración se determina por espectroscopia UV. La secuencia de ADN de los fragmentos de genes subclonados se confirma por secuenciación del ADN. Se sintetizan los segmentos de genes que codifican la cadena pesada de anticuerpo de Her3 modificada "superhélices" (clon 29) , que lleva una mutación T366W en el dominio CH3, con una región VH de 5D5 en el C-terminal unida mediante un conector peptídico (G4S)n con sitios de restricción 5'-BamHI y 3'-XbaI. De manera similar se preparan por síntesis genética secuencias de ADN que codifican a la cadena pesada de anticuerpo Her3 (clon 29) modificada por "superhélices" , que lleva las mutaciones S354C y T366 en el dominio CH3 con una región VH de 5D5 del C-terminal unida mediante un conector peptídico (G4S)n asi como la cadena pesada de anticuerpo Her3 (clon 29) modificada por "superhélices" que lleva las mutaciones Y349C, T366S, L368A y Y407V, con una región VL de 5D5 del C-terminal unida mediante un conector peptídico (G4S)n, flanqueadas con sitios de restricción BamHI y Xbal. Finalmente se sintetizan secuencias de ADN que codifican a las cadenas pesada y ligera sin modificar del anticuerpos Her3 (clon 29) y 5D5, flanqueadas con sitios de restricción BamHI y Xbal. Todos los constructos se diseñan con una secuencia de ADN del extremo 5' que codifica a un péptido líder (MGWSCIILFLVATATGVHS), que se dirige a proteínas que se segregan en células eucariotas. La síntesis genética de otros anticuerpos biespecífieos que se describen a continuación se realiza de modo similar, empleando el elemento correspondiente de la región variable y constante (por ejemplo el que se especifica en la siguiente sección de diseño y en las tablas de 1 a 5) .

Construcción de plásmidos de expresión Se emplea un vector de expresión Roche para la construcción de todos los plásmidos de expresión que codifican a la proteína de fusión scFv de cadena pesada y ligera. El vector se compone de los elementos siguientes: un gen de resistencia a la higromicina como marcador de selección, un origen de replicación, oriP, de virus de Epstein-Barr (EBV) , - un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli, - un gen de beta-lactamasa que confiere resistente a la ampicilina en E. coli, el intensificador inmediato anterior y el promotor del citomegalovirus humano (HCMV) , - la secuencia de señal de poliadenilación de 1-inmunoglobulina humana ("poli A") y - sitios de restricción únicos BamHI y Xbal.

Los genes de fusión de inmunoglobulina que contienen los constructos de cadena ligera o pesada asi como los constructos de "superhélices" con dominios VH y VL de C-terminal se obtienen por síntesis genética y se clonan en plásmidos pGA18 (ampR) del modo descrito. Los plásmidós pG18 (ampR) que llevan los segmentos de ADN sintetizado y el vector de expresión Roche se digieren con enzimas de restricción BamHI y Xbal (Roche Molecular Biochemicals ) y se someten a electroforesis a través de gel de agarosa. Después se ligan los segmentos de ADN codificador de cadena ligera y larga al fragmento BamHI /Xbal del vector de expresión Roche aislado obteniéndose los vectores de expresión finales. Se transforman los vectores de expresión finales en células de E. coli, se aisla el ADN de plásmido de expresión (Miniprep) y se somete a análisis con enzimas de restricción y a secuenciacion del ADN. Se cultivan los clones correctos en 150 mi de medio LB-Amp, se aisla de nuevo el ADN plásmido (Maxiprep) y se confirma la integridad de secuencia por secuenciacion del ADN.

Expresión transitoria de variantes de inmunoglobulina en células HEK293 Se expresan variantes de inmunoglobulina recombinante por transfección transitoria de células 293-F de •riñon embrionario humano empleando el sistema de expresión FreeStyle™ 293 de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen, EE.UU.). Resumiendo, se cultivan en suspensión las células FreeStyle™ 293-F en un medio de expresión FreeStyle™ 293 a 37 °C con un 8% de C02 y se siembran las células en medio fresco, con una densidad de 1-2?10d células viables/ml el dia de la transfección. Se preparan complejos de ADN-293fectina™ en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, EE.UU.) empleando 325 µ? de la 293fectina™ (Invitrogen, Alemania) y 250 g de ADN plásmido de cadena pesada y ligera en una proporción molar 1:1 para un volumen final de transfección de 250 mi. Se preparan complejos de tipo "superhélices" de ADN- 293fectina en medio Opti-MEM® I (Invitrogen, EE.UU.) empleando 235 µ? de la 293fectina™ (Invitrogen, Alemania) y 250 µg del ADN plásmido de cadena pesada 1 y 2 y de cadena ligera "superhélices" en una proporción molar de 1:1:2 para un volumen final de transfección de 250 mi. Se recogen por centrifugación a 14000 g durante 30 minutos los líquidos sobrenadantes de cultivo celular que contienen anticuerpos a los 7 días de la transfección y se filtran en un filtro estéril (0.22 µ??) .' Se almacenan los líquidos sobrenadantes a -20°C hasta el momento de la purificación.

Purificación de anticuerpos biespecificos y de control Se purifican los anticuerpos biespecificos y los de control de los líquidos sobrenadantes de los cultivos celulares por cromatografía de afinidad empleando la Proteína A-Sepharose™ (GE Healthcare, Suecia) y la cromatografía de exclusión de tamaños Superdex200. Resumiendo, se depositan los líquidos sobrenadantes de cultivos celulares filtrados en condiciones estériles sobre la parte superior de una columna HiTrap Proteína A HP (5 mi) equilibrada con regulador de pH PBS (10 mM de Na2HP04, 1 mM de KH2P04, 137 mM de NaCl y 2.7 de m KC1, de pH = 7.4 ) . Se eliminan por lavado con regulador de pH de equilibrado las proteínas no fijadas. Se eluyen los anticuerpos y las variantes de anticuerpo con regulador de pH citrato 0.1 M, de pH 2.8, y se neutralizan las fracciones que contienen proteínas con 0.1 mi de regulador de pH Tris 1 , de pH 8.5. Después se recogen las fracciones que contienen proteína eluida, se concentran en un dispositivo de filtro centrifugador Amicon Ultra (MWCO: 30 K, Millipore) hasta un volumen de 3 mi y se depositan en la parte superior de una columna de filtración a través de gel Superdex200 HiLoad 120 mi 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, de pH 6.0. Se recogen las fracciones que contienen anticuerpos biespecífieos y de control purificados, que tienen menos de un 5% de agregados de peso molecular elevado y se almacenan a -80°C en forma de partes alícuotas de 1.0 mg/ml. Se generan los fragmentos Fab por digestión en papaína del anticuerpo monoclonal 5D5 purificado y posterior eliminación de ·¦ los dominios Fe contaminantes por cromatografía de Proteína A. Se siguen purificando los fragmentos Fab no fijados por cromatografía en columna de filtración a través de gel Superdex 200 HiLoad 120 mi 16/60 (GE Healthcare, Suecia) equilibrada con 20 mM de histidina, 140 mM de NaCl, de pH 6.0, se reúnen y se almacenan a -80°C en forma de partes alícuotas de 1.0 mg/ml.

Análisis de las proteínas purificadas Se determina la concentración de proteína de las muestras de proteína purificada midiendo la densidad óptica (OD) a 280 nm, empleando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos. Se analizan la pureza y el peso molecular de los anticuerpos biespecíficos y los de control por SDS-PAGE en presencia y en ausencia de un agente reductor (5 mM 1, 4-ditiotreitol) y tinción con el colorante azul brillante Coomassie (véase por ejemplo la Figura 21: SDS-PAGE de . los anticuerpos biespecífieos Her3/c-Met: el Her3/metscFvSS_KH (lado izquierdo) y el Her3/MetscFv_KH (lado derecho) ) . Se emplea el sistema de gel NuPAGE® Pre-Cast (Invitrogen, USA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (geles de Tris-glicina del 4-20%) . Se analiza el contenido de agregados en las muestras de anticuerpos biespecificos y de control mediante SEC de alta eficacia empleando una columna analítica de exclusión de tamaños Superdex 200 (GE Healthcare, Suecia) en un regulador de pH de trabajo 200 mM de KH2P04, 250 mM de KC1, de pH 7.0 a 25°C. Se inyectan 25 pg de proteína en la columna con un caudal de 0.5 ml/min y se someten a elución isocrática durante 50 minutos. Para los análisis de estabilidad se incuban concentraciones de 1 mg/ml de proteínas purificadas a 4°C y 40°C durante 7 días y después se evalúan por SEC de alta eficacia (por ejemplo análisis HP-SEC (proteína purificada) de los anticuerpos biespecífieos Her3/c-Met: el Her3/metscFvSS_KH (Figura 22a) y el Her3/MetscFv_KH (Figura 22b) ) . Se verifica la integridad del esqueleto de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo biespecífico reducido por espectrometría de masas Q-TOF con nanoelectro-aspersión después de haber eliminado los N-glicanos por tratamiento enzimático con la Péptido-N-Glucosidasa F (Roche Molecular Biochemicals ) . Los rendimientos son por ejemplo para los anticuerpos biespecífieos Her3/c-Met: para el Her3/metscFvSS_KH = 28.8 mg/1 (proteína A y SEC) y para el Her3/MetscFv_KH = 12.3 mg/1 (proteína A y SEC) .

Ensayo de fosforilación de la c-Met Se siembran 5xl05 células A549 por cavidad en una placa de 6 cavidades el día antes de la estimulación HGF en un medio RPMI con un 0.5% de FCS (suero fetal bovino). Al día siguiente se reemplaza el medio de cultivo durante una hora por medio RPMI que contiene un 0.2% de BSA (albúmina de suero bovino) . Después se añaden 5 µg/ml del anticuerpo biespecífico al medio y se incuban las células durante 10 minutos, después se añade el HGF durante 10 minutos más en una concentración final de 50 ng/ml. Se lavan las células una vez con PBS enfriado con hielo, que contiene vanadato sódico 1 mM, después se colocan sobre hielo y se lisan en una placa de cultivo celular con 100 µ? de regulador de pH de lisis (50 mM de Tris-Cl de pH 7.5, 150 mM de NaCl, 1% de NP40, 0.5% de DOC, aprotinina, 0.5 mM de PMSF, 1 mM de vanadato sódico). Se transfieren los lisados celulares a tubos eppendorf y se deja que la lisis progrese durante 30 minutos sobre hielo. Se determina la concentración de proteína aplicando el método BCA (Pierce) . Se separan 30-50 µg del lisado en un gel Bis-Tris NuPage 4-12% (Invitrogen) y se transfieren las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa . Se bloquean las membranas durante una hora con TBS-T que contiene un 5% de BSA y revelan con un anticuerpo c-Met fosfo-especifico dirigido contra Y1230.1234 , 1235 (44-888, Biosource) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las inmunotransferencias se exploran de nuevo con un anticuerpo que se fija sobre la c-Met no fosforilada (AF276, R&D) .

Ensayo de fosforilación de la Her3 (ErbB3) Se siembran 2xl05 células MCF7 por cavidad en una placa de 12 cavidades, en un medio de cultivo completo (RPMI 1640, 10% de FCS) . Se dejan crecer las células hasta una confluencia del 90% durante dos días. Se reemplaza el medio por un medio de inanición que contiene un 0.5% de FCS .¦¦ Al dia siguiente se suplementan los anticuerpos en cuestión en las concentraciones indicadas 1 hora antes de la adición de 500 ng/ml de herregulina (R&D) . Después de la adición de la herregulina se cultivan las células durante 10 minutos más, se recolectan las células y se lisan. Se determina la concentración de proteína aplicando el método BCA (Pierce) . Se separan 30-50 pg de lisado en un gel 4-12% de Bis-Tris NuPage (Invitrogen) y se transfieren las proteínas del gel a una membrana de nitrocelulosa . Se bloquean las membranas durante una hora con TBS-T que contiene un 5% de BSA y se revelan con un anticuerpo fosfo-específico Her3/ErbB3 que reconoce específicamente a la Tyrl289 (4791, Cell Signaling) .

Ensayo de diseminación Se siembran el A549 (4000 células por cavidad) o el A431 (8000 células por cavidad) el día antes del tratamiento con los compuestos en un volumen total de 200 µ? en placas E de 96 cavidades (Roche, 05232368001) en un medio RPMI con un 0.5% de FCS. Se hace el seguimiento de la adhesión y del crecimiento celular durante una noche con la máquina llamada Real Time Cell Analyzer, con barridos cada 15 min para la comprobación de la impedancia. Al día siguiente se pre-incuban las células con 5 µ? de las diluciones de los anticuerpo correspondientes en PBS con barridos cada cinco minutos. Pasados 30 minütos se añaden 2.5 µ? de una solución de HGF que produce una concentración final de 20 ng/ml y se continúa el ensayo durante 72 horas más. Se hace el seguimiento de los cambios inmediatos con barridos cada minuto durante 180 minutos y después con barridos cada 15 minutos durante el tiempo restante.

Ensayo de migración Se realizan los ensayos de migración en base a la tecnología llamada Real Time Cell Analyser Technology (Roche) . A tal fin, en la cámara inferior del dispositivo CIM que tiene poros de 8 µ?? se introducen 160 µ? de medio acondicionado con HGF (50 ng/ml) . Se monta el dispositivo y se siembran en la cámara superior 100000 células A431, en un volumen total de 150 µ?. Se les añaden los anticuerpos biespecífieos o los anticuerpos de control. Se deja progresar la migración durante 24 h, intercalando barridos regulares cada 15 min. Los datos se recogen y se presentan como lectura final después de 24 h.

Ensayo de citometria de flujo (FACS) a) Cuantificación relativa del estado de receptor de superficie celular Se mantienen las células en una fase de crecimiento logarítmico. Se destacan las células sub-confluentes con acutasa (Sigma) , se centrifugan (1500 rpm, 4°C, 5 min) y después se lavan una vez con PBS que contiene un 2% de FCS. Para determinar el estado receptor relativo en comparación con otras líneas celulares se incuban sobre hielo IxlO5 células con 5 µg/ml de anticuerpo específico primario Her3 o c-Met durante 30 min. Como control de especificidad se emplea la IgG inespecífica (isotipo de control) . Después del tiempo indicado se lavan las células una vez con PBS que contiene un 2% de FCS y después se incuban sobre hielo con un segundo anticuerpo asociado a un fluoróforo durante 30 minutos. Se lavan las células del modo descrito y se suspenden de nuevo en un volumen apropiado de una solución de BD CellFix (BD Biosciences) que contiene el 7-AAD (BD Biosciences) para discriminar las células vivas de las muertas. Se determina la intensidad de fluorescencia media (mfi) de las células por citometria de flujo (FACS Canto, BD) . Se determina la mfi por lo menos por duplicado, con dos tinciones independientes. Después se procesan los espectros de citometria de flujo empleando el programa informático FlowJo (TreeStar) . a) Ensayo de fijación Se destacan y se cuentan las células A431. Se siembran 1.5xl05 células por cavidad de una placa de 96 cavidades cónicas. Se centrifugan las células (1500 rpm, 4°C, 5 min) y se incuban sobre hielo durante 30 min en 50 µ? de una serie de diluciones del correspondiente anticuerpo biespecifico en PBS con 2% de FCS (suero fetal bovino) . Se centrifugan de nuevo las células, se lavan una vez con 200 µ? de PBS que contienen un 2% de FCS y se someten a una segunda incubación de 30 min con un anticuerpo asociado a ficoeritrina dirigido contra el Fe humano, que se diluye en PBS que contiene un 2% de FCS (Jackson Immunoresearch, 109116098). Se centrifugan las células, se lavan dos veces con 200 µ? de PBS que contiene un 2% de FCS, se suspenden de nuevo en una solución BD CellFix (BD Biosciences) y se incuban por lo menos durante 10 min sobre hielo. Se determina la fluorescencia media (mfi) de las células por citometria de flujo (FACS Canto, BD) . Se determina la mfi por lo menos por duplicado de dos tinciones independientes. Los espectros de citometria de flujo se procesan después con el programa informático FlowJo (TreeStar) . Se determina la fijación semi-máxima empleando el programa XLFit 4.0 (IDBS) y el modelo 205 de un sitio de dosis-respuesta. b) Ensayo de internalización Se destacan las células y se cuentan. Se depositan 5xl05 células en 50 µ? de medio completo en un tubo eppendorf y se incuban a 37 °C con 5 g/ml del correspondiente anticuerpo biespecifico . Después del tiempo indicado se almacenan células puntuales sobre hielo hasta que finaliza la cuenta del tiempo. Después se transfieren las células a tubos FACS, se centrifugan (1500 rpm, 4°C, 5 min) , se lavan con PBS + 2% de FCS y se incuban durante 30 minutos en 50 µ? de anticuerpo secundario asociado a ficoeritrina, dirigido contra el Fe humano, que se diluye en PBS que contiene un 2% de FCS (Jackson Immunoresearch, 109116098). Se centrifugan de nuevo las células, se lavan con PBS + 2% de FCS y se determina la intensidad de fluorescencia por citometria de flujo (FACS Canto, BD) . c) Ensayo de reticulación Se destacan las células HT29, se cuentan y se dividen en dos poblaciones, que se tiñen individualmente con los colorantes PKH26 y PKH67 (Sigma) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. De cada una de las poblaciones teñidas se toman 5xl05 células, se reúnen y se incuban durante 30 y 60 minutos con 10 g/ml del correspondiente anticuerpo biespecifico en un medio completo. Después de los tiempos indicados se almacenan las células sobre hielo hasta que se completa el periodo temporal. Se centrifugan las células (1500 rpm, 4°C, 5 min), se lavan con PBS + 2% de FCS y se determina la intensidad de fluorescencia por citometria de flujo (FACS Canto, BD) .

Ensayo de luminosidad de concentración celular La viabilidad y proliferación celulares se cuantifican aplicando el ensayo de luminosidad de concentración celular (Promega) . Se realiza el ensayo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Resumiendo, se cultivan las células en placas de 96 cavidades, en un volumen total de 100 µ?, durante el periodo de tiempo deseado. Para el ensayo de proliferación se sacan las células de la incubadora y se colocan a temperatura ambiente durante 30 min. Se añaden 100 µ? del reactivo de luminosidad de concentración celular y se colocan las placas multi-cavidad en un agitador orbital durante 2 min. Se cuantifica la luminiscencia después de 15 min en un lector de microplacas (Tecan) .

Ensayo st-1 Se realiza un ensayo Wst-1 de la viabilidad y proliferación celulares en forma de ensayo de punto final, detectando el número de células metabólicas activas. Resumiendo, se añaden 20 µ? del reactivo Wst-1 (Roche, 11644807001) a 200 µ? de medio de cultivo. Se incuban las placas de 96 cavidades durante un tiempo de 30 min a 1 h, hasta que el colorante tenga un revelado robusto. Se cuantifica la intensidad de la tinción en un lector de microplacas (Tecan) , a una longitud de onda de 450 nm.

Resonancia de plasmón de superficie Se determina la afinidad de fijación con un ensayo estándar de fijación a 25°C, por ejemplo la técnica de resonancia de plasmón de superficie (BIAcore®, GE-Healthcare Upsala, Suecia) . Para las mediciones de afinidad se unen 30 g/ml de anticuerpos anti-Fcy (de cabra, Jackson Immuno Research) con la superficie de un chip sensor CM-5 por química estándar de condensación de aminas y bloqueo en un instrumento SPR (Biacore T100). Después de la conjugación, se inyectan a 25°C anticuerpos mono- o biespecificos ErbB3/cMet con un caudal de 5 µ?/min, después se realiza una serie de diluciones (de 0 nM a 1000 nM) del ECD de la HER3 o de la c-Met humanas a 30 µ?/min. Como regulador de pH de trabajo para el ensayo de fijación se emplea el PBS/0.1% de BSA. Después se regenera el chip con un pulso de 60 s de una solución 10 mM de glicina-HCl, de pH 2.0.

Diseño de anticuerpos biespecificos <ErbB3-c-Met> expresados y purificados Todos los anticuerpos biespecificos <ErbB3-c-Met> purificados que se mencionan a continuación contienen una región constante o por lo menos la parte Fe del subgrupo IgGl (región constante de la IgGl humana, de la SEC ID NO: 11) que eventualmente se modifica del modo que se indica a continuación.

En la Tabla 1: los anticuerpos biespecífieos trivalentes <ErbB3-c- et> basados en un anticuerpo ErbB-3 de longitud completa (clon 29 de HER3) obtenido por inmunización (ratones NMRI inmunizados con el ECD de HER3 humana) y un fragmento Fv de cadena simple (en cuanto al esquema de la estructura básica, véase la Figura 5a; eventualmente no todas las características mencionadas en la tabla se incluyen en la Figura) a partir del anticuerpo c-Met (5D5 cMét) , con las correspondientes características recogidas en la Tabla 1, se expresan y purifican de acuerdo a los métodos generales antes descritos. Las VH y VL correspondientes del clon 29 de HER3 y del 5D5 de cMet se indican en el listado de secuencias.

Tabla 1: Nombre de la molécula, Her3/ et_ Her3/Me_ Her3/Met_ Her3/Me_ Her3/ et_ nomenclatura scFab- scFvSSKHSS scfvSSKH scFvKH scFvKHSB scFvKHSBSS Ab de anticuerpos biespecí fieos Características.

T366W:K370E: S354C:T36SW:K370E:K40 S354C:T366W/ T366W/ T366W/ K409D/ Mutaciones 9D/ Y349'C:T366'S: ?ß?T'&??ßß?????· T366'S:L368'A:Y 07' E357K:T366'S: supeitiélices Y349'C:E357'K:T366'S:L3 L368'A:Y407V V V L368'A:D399'K: 68'A:D399'K:Y40/V ?407·? Esqueleto del anticuerpo de clon 29 de Her3 don 29 de Her3 clon 29 de Her3 clon 29 de Heú clon 29 de Her3 longitud completa (quimérico) (quimérico) (quimérico) (quimérico) (quimérico) derivado de Fragmento Fv de 505 cMet 5D5 cMet 5D5 cMet cadena simple 5D5c et (humanizado) 505 cMét (humanizado) (humanizado) (humanizado) (humanizado) derivado de cadena pesada cadena pesada cadena pesada cadena pesada cadena pesada Poskion del scFv sobreenrollada de C- sobreenrollada de C- sobreenrollada de C- sobreenrollada de Cr sobreenrollada de C- unido al anticuerpo terminal temiinal terminal terminal termrnal Nombre de la molécula, Her3/Met_ Her3/Me_ Her3/MeL Hei3/Me_ Her3/Met_ nomenclatura scFab- scFvSSKHSS scFvSSKH scFvKH scFvKHSB scFvKHSBSS Ab de anticuerpos biespecificos Fv de cadena si ple- (G4S (G4S enlazador Conectar peptidico (G4S (G4S (G4S VH4WL100de ScFv estabilizado con + + - + + disulfuro (sí/no = +/-) En la Tabla 2 ; Se expresan y purifican anticuerpos biespecificos trivalentes <ErbB3-c-Met> basados en un anticuerpo ErbB-3 de longitud completa (Mab 205 , obtenido por inmunización de ratones NMRI con el ECD de HER3 humana) y un fragmento Fv o scFab de cadena simple (véase un esquema básico en las Figuras 5b y 5a; la estructura detallada se describe en la tabla) a partir del anticuerpo c-Met (5D5 cMet) con las características correspondientes recogidas en la Tabla 2 de acuerdo a los métodos generales antes descritos. Las correspondientes cadenas VH y VL del Mab 205 y del 5D5 cMet se describen en el listado de secue Tabla 2 Nombre de la molécula, MH_ H_ MH_ MH_ MH_ MH_ nomenclatura scFab- " AB18 TvAB21 TvAB22 TvAB23 TvAB24 TvAB25 Ab de anticuerpos biespecificos Características: S354C:T366VW S354C:T366W/ S354C:T366W/ S35 C:T366W/ S354C:T366W/ S354C:T366W/ Mutaciones ?349?: ?349?: Y349'C: ?349?: ?349?: Y349'C: superhélices T366'S: T366'S: T366'S: T366'S: T366'S: T366'S: L368'A:Y407'V L368'A:Y407'V L368'A:Y407'V L368'A:Y40rV Uee'AiYWV En la Tabla 3: Se expresan y purifican anticuerpos biespecificos trivalentes <ErbB3-c-Met> basados en un anticuerpo ErbB-3 de longitud completa (Mab 205.10.2, obtenido por inmunización de ratones NMRI con el ECD de HER3 humana) y un fragmento scFab (véase un esquema básico en las Figura 5a) a partir del anticuerpo c-Met (5D5 cMet) con las características correspondientes recogidas en la Tabla 3 de acuerdo a los métodos generales antes descritos. Las correspondientes cadenas VH y VL del Mab 205.10.2 y del 5D5 cMet se describen en el listado de secuencias.

Tabla 3 En la Tabla 4: Anticuerpos biespecificos trivalentes <ErbB3-c-Met> con base en el anticuerpo ErbB-2 de longitud completa (clon 29 HER3) y el dominio VH y VL (para un esquema de estructura básica véase Fig. 3a, 3c y 3d -eventualmente no todas las características mencionadas en la Tabla se incluyen en las figuras) de un anticuerpo c- et (c et 5D5) con las características respectivas mostradas en la Tabla 4 se expresaron y purificaron de acuerdo con los métodos generales descritos anteriormente. Los VH y VL correspondientes de HER3 clon29 y cMet 5D5 se dan en el listado de secuencias.

Tabla 4: El anticuerpo biespecífico, trivalente con nomenclatura VHVL-Ab en la Tabla 4 se expresó y purificó (ver también los Ejemplos siguientes y la Fig. 3c) Nombre de la molécula, nomenclatura scFa -Ab Her3/Met_KHSS Her3/ et_SSKH Hei3/MeLSSKHSS Her3/ et1C Her3/ eL6C de anticuerpos biespecificos características: S354C: S354C: S354C: S354C: T366W/ T366W/ T366VW T366W/ T366W/ Mutaciones Y349'C: T366'S: Y349C: Y349C: Y349'C: supei él¡ces T366'S: L368'A: T366'S: 7366'S: T366'S: L368'A: Y407V L368'A: L368'A: L368'A: Y407V Y« Y407V YWV Esqueleto del clon 29 de Her3 don 29 de Her3 clon 29 de Her3 don 29 de Her3 don 29 de Her3 anticuerpo de longitud (quimérico) (quimérico) (quimérico) (quimérico) (quimérico) completa derivado de Fragmento VHVL 5D5cMet 5D5cMet 5D5cMet 5D5cMet 5D5cMet derivado de (humanizado) (humanizado) (humanizado) (humanizado) (humanizado) cadena pesada cadena pesada cadena pesada cadena pesada cadena pesada Posición de la VH unida sobreenrollada de C- sobreenrollada de C- sobreenrollada de C- sobreenrollada de C- sobreenrollada de C-al anticuerpo terminal terminal terminal terminal terminal cadena pesada cadena pesada cadena pesada cadena pesada cadena pesada Posición de la VL unida sobreenrollada de C- sobreenrollada de C- sobreenrollada de C- sobreenrollada de C- sobreenrollada de C-a anticuerpo terminal terminal terminal terminal terminal Conectar peptidico (G4S (GS)> (G4S), VH4WL100 de ScFv estabilizado con - + + -disulfuro (+/-= si/ho) En la Tabla 5: Se expresan y purifican anticuerpos biespecificos bivalentes <ErbB3-c-Met> basados en un anticuerpo ErbB-3 de longitud completa (Mab 205 de HER3 o versiones humanizadas Mab 205.10.1, Mab 205.10.2 o Mab 205.10.3) y un fragmento scFab (véase un esquema básico en las Figura 7) a partir del anticuerpo c-Met (5D5 cMet) con las características correspondientes recogidas en la Tabla 5 de acuerdo a los métodos generales antes descritos. Las ¦ correspondientes cadenas VH y VL del Mab 205 de HER3 y del 5D5 cMet se describen en el listado de secuencias.

Tabla 5 Nombre de la molécula, nomenclatura scFab-Ab de MH_BvAB21 MH_BvAB28 anticuerpos biespecificos VH44/VL100 de scFab estabilizado con disulfuro - + (si/no = +/-) Ejemplo 1 (Figura 8) Unión de anticuerpos biespecificos a la superficie de las células cancerígenas Se analizan las propiedades de fijación de los anticuerpos biespecificos sobre la superficie celular de sus receptores respectivos en células cancerígenas A431 mediante un ensayo basado en la citometría de flujo. Se incuban las células con anticuerpos primarios mono- o biespecificos y se detecta la fijación de estos anticuerpos sobre sus receptores afines con un anticuerpo secundario asociado a un fluoroforo, que se une específicamente al Fe del anticuerpo primario. Se traza una gráfica de la intensidad de fluorescencia media de una serie de diluciones de los anticuerpos primarios frente la concentración del anticuerpo, obteniéndose una curva de fijación sigmoidea.

La expresión en la superficie celular del c-Met y del Her3 se valida por incubación con el anticuerpo bivalente 5D5 y con el anticuerpo clon 29 de Her3 solamente. El anticuerpo Her3/c-Met_KHSS se une rápidamente a la superficie de las células A431. En estas condiciones experimentales, el anticuerpo solamente puede fijarse a través de su parte Her3 y por consiguiente la intensidad de fluorescencia media no supera la tinción del clon 29 de Her3 solo.

Ejemplo 2 (Figura 9) Inhibición de la fosforilación del receptor de c- Met inducida por H6F con formatos de anticuerpos biespecificos Her3/c-Met Para confirmar la funcionalidad de la parte c-Met de los anticuerpos biespecificos se realiza un ensayo de fosforilación de la c-Met. En este ensayo se tratan células de cáncer de pulmón A549 o células de cáncer colorectal HT29 con los anticuerpos biespecificos o con anticuerpos de control antes de exponerlas al HGF. Después se lisan las células y se examina la fosforilación del receptor de c-Met. Ambas lineas celulares se estimulan con HGF como puede observarse con la aparición de la banda especifica de fosfo-c-Met en la inmunotransferencia . La adición del anticuerpo scFv o del fragmento Fab del 5D5 inhibe la fosforilación del receptor, lo cual demuestra la funcionalidad del componente scFv de c-Met.

Ejemplo 3 (Figura 10) Inhibición de la fosforilación del receptor de Her3 inducida por HRG con formatos de anticuerpos biespecificos Her3/c-Met Para confirmar la funcionalidad de la parte Her3 de los anticuerpos biespecificos se realiza un ensayo de fosforilación de la Her3. En este ensayo se tratan células CF7 con anticuerpos biespecificos o con anticuerpos de control antes de exponerlas a la HRG (herregulina) . Después se lisan las células y se examina la fosforilación del receptor de Her3. El Her3/c-Met_scFv_SSKH y el Her3/c- et_KHSS inhiben la fosforilación del receptor de la Her3 en igual medida que el clon 29 de la Her3 original, lo cual indica que la fijación sobre la Her3 y la funcionalidad del anticuerpo ·· no resulta comprometida por el formato de anticuerpo trivalente.

Ejemplo 4 (Figuras 11, 12, 13) Inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por HGF con los formatos de anticuerpos biespeci icos Her3/c-Met Pueden realizarse ensayos de proliferación de HUVEC para demostrar el efecto mitógeno del HGF. La adición de HGF a las HUVEC conduce a un aumento doble de la proliferación. La adición del anticuerpo de control IgG humano en el mismo intervalo de concentraciones que los anticuerpos biespecificos no tiene incidencia en la proliferación celular, mientras que el fragmento Fab 5D5 inhibe la proliferación inducida por el HGF. Si se emplean las mismas concentraciones, el anticuerpo Her/c-Met_scFv_SSKH inhibe la proliferación en igual medida que el fragmento Fab (Figura 11) . La adición de herregulina (HRG) sola (datos no presentados) o en combinación con el HGF no produce un incremento en la proliferación (Figura 12). Esto confirma que esta conclusión permite el análisis funcional del componente c-Met en un formato de anticuerpo biespecifico sin interferencia del componente Her3. La valoración del Her3/c-Met_KHSS demuestra un débil efecto inhibidor del anticuerpo (Figura 13) . Este efecto es más pronunciado para el anticuerpo Her3/Met-6C, lo cual indica que un conector más largo mejora la eficacia del anticuerpo. Tres anticuerpos scFv diferentes (Her3/c-Met-scFv_SSKH, Her3/c-Met_scFv_KH y Her3/c- et_scFv_KHSB) presentan el mismo grado de inhibición de la proliferación. Este demuestra la funcionalidad del componente c-Met en el formato de anticuerpo trivalente.

Ejemplo 5 (Figura 14) Inhibición de la proliferación de la linea celular cancerígena A431 con formatos de anticuerpos biespecificos Her3/c-Met Si se siembran células A431 en un medio de contenido reducido en suero, la adición de HGF induce la diseminación y además un débil efecto mitógeno. Esto se aprovecha para analizar el impacto del anticuerpo Her3/c-Met_scFv_SSKH y del Her3/c-Met_KHSS en la proliferación de las A431 tratadas con HGF. Como es obvio, los anticuerpos biespecificos pueden inhibir en gran manera el aumento de proliferación (15%) inducido por el HGF. El Her3/c- et_sc v_SSKH es igual de eficaz que el fragmento Fab del 5D5, mientras que el Her3/c-Met_KHSS tiene que dosificar en mayor cantidad (12.5 pg/ml, a diferencia de los 6.25 g/ml) para obtener efectos similares. Un anticuerpo IgG humano de control no tiene influencia en el crecimiento de las células A431 promovido con HGF.

Ejemplo 6 (Figura 15, 16) Análisis de la inhibición de la diseminación célula-célula inducida por HGF en la linea celular cancerígena A431 con formatos de anticuerpos biespecífieos Her3/c-Met La diseminación inducida por el HGF incluye los cambios morfológicos de la célula, que se traducen en un redondeo de las células, protrusiones de tipo filópodos, estructuras de tipo husillo y cierta motilidad de las células. Con el Real Time Cell Analyzer (Roche) se mide la impedancia de un cavidad determinado de cultivo celular y, por tanto, puede hacer un seguimiento indirecto de los cambios de la morfología y la proliferación celulares. La adición del HGF a las células A431 y A549 se traduce en cambios de la impedancia que pueden seguirse en función del tiempo. Los anticuerpos Her3/c-Met_KHSS y Her3/Met-6C inhiben la diseminación inducida por el HGF, siendo más eficaz el Her3/Met-6C (20.7% y 43.7% de inhibición de diseminación) (Figura 15). Tres anticuerpos scFv diferentes (Her3/c-Met_scFv_SSKH, Her3/c- et_scFv_KH, Her3/c- Met_scFv_KHSB) despliegan una eficacia media en la supresión de la diseminación inducida por el HGF, como puede observarse en la pendiente reducida de la curva de la gráfica junto a la curva de control sin tratamiento (inhibición de la diseminación en un 29%, 51.9% y 49.7%) (Figura 16) . Si se emplea la misma concentración de 12,5 µg ml, entonces el anticuerpo Her3/c-Met_scFv_KH y el Her3/c-Met_scFv_KHSB se comportan igual de bien.

Ejemplo 7 (Figura 17) Análisis de la expresión del receptor de Her3 y de c-Met en la superficie de las células de las lineas celulares cancerígenas T47D, A549, A431 y H441 Para identificar lineas celulares de diferentes proporciones de superficie celular de la Her3 y de la c-Met se realiza un ensayo basado en el FACS. La T47D no presenta expresión en la superficie de las células c-Met, lo cual está de acuerdo con los niveles de ARNm en esta linea celular (datos no presentados) . La A431 y la A549 presentan niveles similares de c-Met, mientras que la H441, una linea celular que sobre expresa la c-Met, tiene niveles muy elevados de c-Met. Y viceversa, la T47D tiene niveles elevados de Her3, mientras que la A549 presenta solamente una expresión baja en la superficie celular.

Ejemplo 8 (Figura 18 y tabla siguiente) Análisis de la internalizacion de receptor mediada por el anticuerpo en las lineas celulares cancerígenas A431 , A549 y DU145 (medida en un ensayo de citómetria de flujo (FACS) ) Sé ha demostrado que la incubación de células con anticuerpos que se unen específicamente con la Her3 o la c-Met desencadena la internalizacion del receptor. Con el fin de evaluar la capacidad de internalizacion de los anticuerpos biespecífieos , se diseña un método experimental para estudiar la internalización del receptor inducida por el anticuerpo. A tal fin se incuban a 37°C las células durante diferentes períodos de tiempo (por ejemplo 0, 30, 60 y 120 minutos = 0 h, 1/2 h, 1 h y 2 h) con el correspondiente anticuerpo primario. Se interrumpen los procesos celulares con el enfriamiento rápido de las células a 4°C. Se emplea un anticuerpo secundario asociado a un fluoróforo y que se une específicamente al Fe del anticuerpo primario para detectar los anticuerpos fijados sobre la superficie de las células. La internalización del complejo anticuerpo-receptor reduce los complejos anticuerpo-receptor de la superficie celular y se traduce en una menor intensidad de fluorescencia media. La internalización se ha estudiado en tres líneas celulares diferentes (A431, A549 y DU145) . La incubación con el clon 29 de la Her3 demuestra que este anticuerpo induce la internalización del receptor en A431 y en DU145, pero el efecto es menos pronunciado en la A549, que casi no tiene receptor en su superficie celular. La incubación con el 5D5 conduce a una buena internalización del receptor en las A549 y DU145 y menos pronunciada en las A431. El Her3/c-Met_scFv_SSKH casi no produce internalización en las A549 y DU145 y una internalización solamente modesta en las A431 (11% después de 2 h) . Resumiendo, el formato de anticuerpo scFv conduce solamente a un internalización muy modesta del receptor, lo cual indica que el anticuerpo biespecifico actúa de modo diferente a los componentes monoespecificos , lo cual sugiere que tiene lugar una fijación simultánea del anticuerpo scFv sobre ambos receptores, capturándolos sobre la superficie de la célula. Los resultados se presentan en la Figura 18 y en la tabla que sigue.

Tabla 6: % de internalización del receptor de ErbB3 por el anticuerpo biespecifico Her3/cMet comparado con el del anticuerpo original monoespecifico HER3 y cMet, medido por un ensayo FACS después de 2 h en célulaa A431. La medición del del receptor de ErbB3 en la superficie de las células a la 0 h se toma como 100% de receptor de ErbB3 en la superficie de las células. (Para el anticuerpo progenitor Mab 5D5 manoespecífico bivalmente < c-Met, el % de internalización de c-Met se calcula de forma análoga (consultar indicaión entre paréntesis para B) a continuación) % de internalización % de receptor del ErbB3 después de 2 de ErbB3 en la h en células A431 superficie de Anticuerpo (ATCC No. CRL-1555) las células (= 100-% de anticuerpo A 31 medida en la superficie de las después de 2 h células) A) anticuerpos monoespecífieos progenitores <ErbB3 > Mab 205 <ErbB3 > 60 40 (quimérico) clon 29 de HER3 <ErbB3 44 54 > B) anticuerpo monoespecífico original <c-Met> (61 (% del (39 (% de Mab 5D5 receptor c- internalización de c- Met) ) Met) ) C) anticuerpos biespecíficos <ErbB3- cMet > MHJTvAb 18 101 -1 MH_BvAb 20 103 -3 MH_TvAb_21 99 1 MH_TvAb22 99 1 MH_TvAb23 89 11 MH_TvAb2 90 10 MH_TvAb25 89 11 % de internalización % de receptor del ErbB3 después de 2 de ErbB3 en la h en células A431 superficie de Anticuerpo (ATCC No. CRL-1555) las células (= 100-% de anticuerpo A431 medida en la superficie de las después de 2 h células) MH_BvAb28 102 -2 MH_T Ab29 95 5 MH_TvAb30 95 5 Her3/ et_6C 94 6 Her3/Met_SSKH 89 11 Ejemplo 10 (Figura 19) Análisis de la inhibición dependiente de anticuerpo de la migración mediada por el HGF en la linea de células cancerígenas A 31 Un aspecto importante de la señalización activa de la c-Met es la inducción de un programa migratorio e invasivo. La eficacia de un anticuerpo inhibidor de la c-Met puede determinarse midiendo la inhibición de la migración celular inducida por el HGF. A tal fin se trata la linea celular cancerígena A431 inducible por HGF con el HGF en ausencia o en presencia de un anticuerpo biespecífico o de un anticuerpo IgG de control y se miden el número de células migrantes a través de un poro de 8 µ?t?, de forma dependiente del tiempo, en un analizador celular del tipo Acea Real Time, empleando placas CIM, con lectura de la impedancia. De forma independiente se visualiza cualitativamente la migración de las células por tinción de las células migradas (datos no presentados). El ejemplo demuestra la inhibición dependiente de la dosis de la migración celular inducida por HGF.

Ejemplo 11 (tabla siguiente) Análisis de la unión sucesiva y simultánea del receptor recombinante de Her3 , cMet y FcgammalII a los anticuerpos biespecificos Para comprender mejor el modo de acción de los anticuerpos biespecificos que se fijan sobre la Her3 y la c- et se determina el estado de fijación sobre el receptor mediante mediciones de la resonancia de plasmón de superficie (Biacore) . Se aplican diferentes métodos para evaluar la fijación de los anticuerpos biespecificos sobre el ectodominio (ECD) de la Her3 recombinante o de la c-Met recombinante o de ambas a la vez. Todos los anticuerpos biespecificos ensayados son capaces de fijarse simultáneamente sobre el ECD de la Her3 o de la c-Met. Además, la fijación de la prote na FCgammalII recombinante al complejo formado por el anticuerpo : ECD Her3:cMet. Todos los anticuerpos consiguen fijarse sobre el receptor de FcgammalII incluso en presencia de ambos ectodominios , lo cual proporciona una fuerte prueba de que la glicomodificados de anticuerpos biespecificos permite intensificar las funciones efectoras dependientes de las NK.

Tabla 7 Análisis de la reticulación célula-célula con el anticuerpo biespecifico Her3/c-Met_scFv_SSKH en células HT29 Debido a la mult ivalencia del formato de anticuerpo biespecifico, la reticulación célula-célula es un posible modo de acción que podría explicar además la reducida internalización del receptor. Para estudiar este fenómeno con mayor detalle se ha diseñado un método experimental encaminado a dilucidar esta cuestión. Para este fin se dividen en dos poblaciones las- células HT29 que expresan la Her3 y la c-Met en su superficie celular. Una población se tiñe con PKH26 (Sigma), la otra con PKH67 (Sigma), dos colorantes de membrana, el primero es verde y el último es rojo. Se mezclan las células teñidas y se incuban con Her/c-Met_scFv_SSKH . En un ensayo basado en la citometria de flujo, la reticulación de las células conduciría a un aumento de la población de células doblemente positivas ( verde+/roj o+ ) en el cuadrante 5 superior derecho. En base a este ensayo no se observa incremento en la reticulación célula-célula en las condiciones indicadas.

Ejemplo 13 Preparación de anticuerpo biespecificos Her3/c-]_Q Me'b por glicomodificados Se subclonan las secuencias de ADN del anticuerpo biespecifico Her3/c- et siguientes: MH_TvAbl8, MH_TvAb21 , MH_TvAb22 y MH_TvAb30 en vectores de expresión en mamíferos bajo el control del promotor PSV y en 15 posición anterior con respecto al sitio poliA sintético, cada vector lleva una secuencia OriP de EBV.

Se producen los anticuerpos biespecificos por co-trans fección de células HE 293-EBNA con los vectores de expresión de anticuerpos biespecificos en mamíferos, 20 empleando un método de transfección con fosfato cálcico.

Para la producción del anticuerpo glicomodificados se co- transfectan las células con dos plásmidos adicionales, uno para la expresión del polipéptido de fusión GnTIII (un vector de expresión) y el otro para la expresión de 25 la manosidasa II. (un vector de expresión de la manosidasa de Golgi II), en una proporción de 4:4:1:1, respectivamente. Se cultivan las células en forma de cultivos monocapa adherentes en frascos T empleando un medio de cultivo DMEM suplementado con un 10% de FCS y se transfectan cuando han alcanzado una confluencia entre el 50 y el 80%. Para la transfección en un frasco T150 se siembran 15 millones de células 24 horas antes de la transfección en 25 mi de medio de cultivo DMEM suplementado con FCS (en un 10% v/v final) y se colocan las células en la incubadora a 37°C con una atmósfera del 5% de C02 durante una noche. Para cada frasco TIO a transfectar se prepara una solución de ADN, CaC12 y agua por mezclado de 49 µg de ADN de vector de plásmido total dividido a partes iguales entre los vectores de expresión de la cadena ligera y la larga, el agua se añade hasta un volumen final de 469 µ? y también 469 µ? de una solución 1 M de CaC12. A esta solución se le añaden 938 µ? de HEPES 50 mM, NaCl 280 mM, Na2HP04 1.5 mM, de pH 7.05, se mezclan inmediatamente durante 10 s y se dejan en reposo a temperatura ambiente durante 20 s. Se diluye la suspensión con 10 mi de DMEM suplementado con un 2% de FCS y se añade al T150 en lugar del medio existente. Después se añaden otros 13 mi de medio de transfección. Se incuban las células a 37°C, con un 5% de C02, durante un tiempo de 17 a 20 horas, después se reemplaza el medio por 25 mi de DMEM , con un 10% de FCS. Se recolecta el medio de cultivo acondicionado 7 días después de la transfección por centrifugación a 210 x g durante 15 min, se filtra la solución en condiciones estériles (filtro de 0.22 µp?) , se añade la azida sódica en una concentración final del 0.01% p/v y se mantiene a 4°C.

Se purifican los anticuerpos glicomodificados afucosilados biespecificos secretados por cromatografía de afinidad con la proteína A, después por cromatografía de intercambio catiónico, un paso final de cromatografía de exclusión de tamaños en una columna Superdex 200 (Amersham Pharmacia) sustituyendo el regulador de pH por fosfato potásico 25 mM, cloruro sódico 125 mM, una solución de glicina 100 mM de pH 6.7 y se recogen los anticuerpos IgGl monoméricos puros. La concentración de anticuerpos se estima empleando un espectrofotómet ro y midiendo la absorbencia a 280 nm.

Se analizan por MALDI-TOF/EM los oligosacáridos unidos a la región Fe de los anticuerpos del modo descrito a continuación (Ejemplo 14) . Se liberan los oligosacáridos por vía enzimática a partir de los anticuerpos por digestión con PNGaseF, estando los anticuerpos o bien inmovilizados sobre una membrana de PVDF o bien en solución. La solución digerida resultanté, que contiene los oligosacáridos liberados, se prepara directamente para el análisis MALDI-TOF/EM o se sigue digiriendo con la EndoH-glucosidasa antes de la preparación de la muestra para el análisis MALDI-TOF/EM.

Ejemplo 14 Análisis de la glicoestructura de los anticuerpos biespecificos Her3/c-Met Para determinar las proporciones relativas de estructuras de oligosacáridós que contienen fucosa y no fucosa (a-fucosa) se- analizan por MALDI-TOF/espect romet ría de masas los glicanos liberados del material de anticuerpo purificado. Para ello se incuba la muestra de anticuerpo (unos 50 µ?) a 37°C durante una noche con 5 mU de N-glucosidasa F (Prozyme, No. GKE-5010B) en un regulador de pH fosfato sódico 0.1M de pH 6.0, con el fin de liberar los oligosacáridós del esqueleto de la proteina. A continuación se aislan las estructuras de glicano y se desalinizan empleando puntas de pipeta NuTip-Carbón (obtenidas de Glygen: NuTipl-10 µ?, No. de cat . NT1CAR) . Como primer paso, se preparan las puntas de pipeta NuTip-Carbón para la fijación sobre oligosacáridós lavándolas con 3 µ? de NaOH 1 M y después con 20 µ? de agua pura (por ejemplo agua de calidad para gradiente de HPLC, de Baker, No. 4218), 3 µ? de ácido acético del 30% v/v y después otra vez 20 µ? de agua pura. Para ellos se introducen las soluciones en cuestión en la parte superior del material cromatográfico en la punta de una pipeta NuTip-Carbón y se presionan a través del mismo. Después se fijan las estructuras de glicano correspondientes a 10 µ? de anticuerpo sobre el material de las puntas de pipeta NuTip-Carbón moviendo en sentido vertical y descendente cuatro o cinco veces el material digerido de la N-glucosidasa F, antes descrito. Se lavan los glicanos fijados sobre el material en la punta de la ¦ pipeta NuTip-Carbón con 20 µ? de agua pura del modo recién descrito y se eluyen gradualmente con 0.5 µ? de acetonitrilo del 10% y con 2.0 µ? de acetonitrilo del 20%, respectivamente. Para este paso se llenan las soluciones de elución en un vial de reacción de 0.5 mi y se mueven arriba y abajo cuatro o cinco veces cada uno. Para el análisis ALDI-TOF/espectrometría de masas se reúnen los dos líquidos eluidos. Para esta medición se mezclan 0.5 µ? de los eluidos reunidos en la diana MALDI con 1.6 µ? de una solución de matriz SDHB (ácido 2,5- dihidroxi-benzoico /ácido 2 -hidroxi- 5-metoxibenzoico [Bruker Daltonics, No. 209813] disueltos en etanol del 20%/NaCl 5 mM hasta una concentración de 5 mg/ml) y se analizan con el instrumento TOF Bruker Ultraflex TOF oportunamente ajustado. De forma rutinaria se registran 50-300 disparos, que se acumulan en un solo ensayo. Se evalúan los espectros obtenidos con el programa informático Flex analysis (Bruker Daltonics) y se determinan las masas para cada uno de los picos detectados. A continuación se asignan los picos a las estructuras de glicol que contienen fucosa o a-fucosa (no fucosa) comparando las masas calculadas y las masas teóricamente esperadas para las estructuras en cuestión (por ejemplo el complejo, el híbrido, la oligomanosa y la mañosa de concentración alta, respectivamente, con y sin la fucosa) .

Para determinar la proporción de las estructuras híbridas, se digieren las muestras de anticuerpo con N-glucosidasa F y endo-glucosidasa H, de modo concomitante. La N-glucosidasa F libera todas las estructuras de glicano unidas a N (estructuras complejas, híbridas, de oligomanosa y de mañosa de concentración alta) del esqueleto de la proteína y además la endo-glucosidasa H descompone todos los glicanos de tipo híbrido, rompiéndolos entre dos residuo des GlcNAc del extremo reductor del glicano. Seguidamente se trata este material digerido y se analiza por MALDI-TOF/espectrometría de masas de la misma manera que se ha descrito antes para la muestra digerida con la N-glucosidasa F. Comparando los modelos del material digerido con la N-glucosidasa F y el material digerido combinado de N-glucosidasa F/endo H, el grado de reducción de las señales de una glicoestructura concreta se emplea para estimar el contenido relativo de estructuras híbridas.

Se calcula la cantidad relativa de cada glicoestructura a partir del cociente entre la altura del pico de una estructura glicol concreta y la suma de las alturas de los picos de todas las glicoestructuras que se hayan detectado. La cantidad de fucosa es el porcentaje de estructuras que contiene fucosa referido a todas las glicoestructuras identificadas en la muestra tratada con N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas, de oligomanosa y de mañosa de mayor concentración, respectivamente) . El grado de a ucosilación es el porcentaje de estructuras carentes de fucosa, referido a todas las glicoestructuras identificadas en la muestra tratada con N-glucosidasa F (por ejemplo estructuras complejas, híbridas, de oligomanosa y de mañosa de mayor concentración, respectivamente) .

Ejemplo 15 ADCC "in vitro" de los anticuerpos biespecificos Her3/c-Met Los anticuerpos biespecificos Her3/cMet según la invención presentan una internalización reducida en las células que expresan a ambos receptores. La internalización reducida es un gran apoyo para el propósito de la glicoingeniería de estos anticuerpos, ya que la exposición prolongada del complejo anticuerpo-receptor en la superficie de las células es más probable que sea reconocido por las células NK. La internali zación reducida y la glicoingenieria se traducen en una mayor citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), si se comparan con la de los anticuerpos originales. Puede diseñarse un método experimental "in vitro" para demostrar · estos efectos empleando células cancerígenas que expresen tanto a la Her3 como a la cMet en la superficie celular, por ejemplo la A431, y células efectoras por ejemplo una línea celular NK o de células PBMC. Se pre-incuban las células tumorales con los anticuerpos monoespecí fieos originales o con los anticuerpos biespecí fieos durante un tiempo de hasta 24 h y después se añade la línea celular efectora. Se cuantifica la lisis celular, que permite la discriminación entre anticuerpos mono- y biespecí fieos .

Las células diana, por ejemplo las A431 (cultivadas en medio RPMI 1640 + L-glutamina 2 mM + 10% de FCS) (que expresan tanto a la Her3 como a la cMet) se recolectan con tripsina/EDTA (Gibco, No. 25300-054) en la fase de crecimiento exponencial. Después de un paso de lavado y de chequeo del número de células y la viabilidad se marca en la incubadora celular la parte alícuota necesaria con calceina (Invitrogen, No. C3100MP; se suspende de nuevo 1 vial en 50 µ? de DMSO para 5 millones de células en 5 mi de medio) a 37°C durante 30 rain. A continuación se lavan las células tres veces con medio AIM-V, se chequea el número de células y la viabilidad y se ajusta el número de células a 0.3 millones/ml.

Mientras se preparan las PB C como células efectoras mediante una centrifugación por gradiente de densidad (Histopaque-1077 , Sigma, No. H8889) de acuerdo a las instrucciones del fabricante (pasos de lavado: lx a 400 g y 2x a 350 g, cada uno durante 10 min) . Se chequea el número de células y la viabilidad y se ajusta el número de células a 15 millones/ml.

Se depositan 100 µ? de las células diana teñidas con calceina en las placas de 96 cavidades de fondo redondo, se les añaden 50 µ? de anticuerpo diluido y 50 µ? de células efectoras. En algunos ensayos, las células diana se mezclan con Redimune® NF Liquid (ZLB Behring) en una concentración de Redimune de 10 mg/ml.

Como controles se emplean la lisis espontánea, determinada por co-cultivo de células diana y células efectoras sin anticuerpo y la lisis máxima, determinada por lisis solamente de las células diana con un 1% de Tritón X-100. Se incuba la placa en una incubadora celular humidificado a 37°C durante 4 horas.

Se evalúa la muerte de las células diana midiendo la liberación de la LDH por parte de las células dañadas empleando el kit de detección de citotoxicidad (LDH Detection Kit, Roche, No. 1 644 793) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Resumiendo, en una placa transparente de 96 cavidades de fondo plano se mezclan 100 µ? de liquido sobrenadante de cada cavidad con 100 µ? de sustrato del kit. Se determinan los valores Vmax de la reacción de color de sustrato en un lector ELISA a 490 nm por lo menos durante 10 min. Se calcula el porcentaje de muerte especifica mediada por el anticuerpo del modo siguiente: ((A - SR) / (MR - SR)xl00, en la que A es la media del valor Vmax de una concentración concreta de anticuerpo, SR es la media del Vmax de la liberación espontánea y MR es la media del Vmax de la liberación máxima .

Ejemplo 16 Eficacia "in vivo" de los anticuerpos biespecificos Her3/cMet en un modelo de injerto ajeno subcutáneo con un bucle autocrino de HGF Un modelo de glioblastoma U87MG subcutáneo tiene un bucle autocrino de HGF y presenta la Her3 y la c-Met en la superficie de las células. Se fosforilan ambos receptores en explantes tumorales que se lisan y se someten a análisis por inmunotrans ferencia (datos no presentados). Se mantienen las células U87MG en condiciones estándar de cultivo celular en la fase de crecimiento logarítmico. Se injertan diez millones de células a ratones SCID de color beige. Se inicia del tratamiento después de que los tumores se hayan establecido y hayan alcanzado un tamaño de 100-150 mm3. Se tratan los tumores con una dosis de carga de 20 mg/kg de anticuerpo/ratón y después, una vez por semana, con 10 mg/kg de anticuerpo/ratón. Se mide el volumen del tumor dos veces por semana y se hace un seguimiento paralelo del peso los animales. Los tratamientos individuales y la combinación de los anticuerpos individuales se comparan con la terapia realizada con el anticuerpo biespecí fico .

Ejemplo 17 Eficacia "in vivo" de los anticuerpos biespecificos Her3/cMet en un modelo de injerto ajeno subcutáneo con un bucle paracrino de HGF Un modelo BxPc-3 subcutáneo, co-inyectado con células Mrc-5, imita un bucle de activación paracrina de la c- et. La BxPc-3 expresa la c- et y también la Her3 en la superficie de las células. Se mantienen las células BxPc-3 y Mrc-5 en condiciones de cultivo celular estándar en la fase de crecimiento logarítmico. Se inyectan las células BxPc-3 y Mrc-5 en una proporción 10:1, a saber, diez millones de células BxPc-3 y un millón de Mrc-5. Se injertan las células en ratones SCID de color beige . Se inicia el tratamiento después de que los tumores se hayan establecido y hayan alcanzado un tamaño de 100-150 mm3. Se tratan los tumores con una dosis de carga de 20 mg/kg de anticuerpo/ratón y después, una vez por semana, con 10 mg/kg de anticuerpo/ratón. Se mide el volumen del tumor dos veces por semana y se hace un seguimiento paralelo del peso los animales. Los tratamientos individuales y la combinación de los anticuerpos individuales se comparan con la terapia realizada con el anticuerpo biespecí fico .

Ejemplo 18 Eficacia "¿n vivo" de los anticuerpos biespecificos Her3/cMet en un modelo de injerto ajeno subcutáneo con un bucle paracrino de H6F Como fuente del HGF sistémico se emplean ratones transgénicos del HGF humano inmunocompromet idos . Estos ratones se han descrito en la bibliografía técnica y pueden obtenerse del Instituto Van Andel. Puede utilizarse la inyección subcutánea de las lineas celulares cancerígenas, por ejemplo la BxPc-3 o la A549, que expresan a ambos receptores en la superficie celular, para estudiar la eficacia de los anticuerpos biespecí fieos dirigidos contra la Her3 y la c-Met . Se mantienen las células en condiciones de cultivo celular estándar en la fase de crecimiento logarítmico. Se inyectan diez millones de células en ratones SCID de color beige que llevan el transgén del HGF. Se inicia del tratamiento después de que los tumores se hayan establecido y hayan alcanzado un tamaño de 100-150 mm . Se tratan los tumores con una dosis de carga de 20 mg/kg de anticuerpo/ratón y después, una vez por semana, con 10 mg/kg de anticuerpo/ratón. Se mide el volumen del tumor dos veces por semana y se hace un seguimiento paralelo del peso los animales. Los tratamientos individuales y la combinación de los anticuerpos individuales se comparan con la terapia realizada con el anticuerpo biespecí fico .

Ejemplo 19 Eficacia "in vivo" de los anticuerpos biespecificos Her3/cMet en un modelo de injerto ajeno ortotópico con un bucle paracrino de HGF Las células cancerígenas A549 expresan la Her3 y también la c-Met en la superficie celular. Se mantienen las células A549 en condiciones de cultivo celular estándar en la fase de crecimiento logarítmico. Se injertan diez millones de células en ratones SCID de color beige. Se inicia del tratamiento después de que los tumores se hayan establecido y hayan alcanzado un tamaño de 100-150 mm3. Se tratan los tumores con una dosis de carga de 20 mg/kg de anticuerpo/ratón y después, una vez por semana, con 10 mg/kg de anticuerpo/ratón. Se mide el volumen del tumor dos veces por semana y se hace un seguimiento paralelo del peso los animales. Los tratamientos individuales y la combinación de los anticuerpos individuales se comparan con la terapia realizada con el anticuerpo biespeci fico .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la ·· invención .

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. - Un anticuerpo biespecifico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana, que contiene un primer sitio de fijación sobre el antigeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque el anticuerpo biespecifico presenta una internalización de la ErbB-3 no superior al 15% cuando se mide después de 2 horas en un ensayo de citometría de flujo en células A431, si se compara con la internalización de la ErbB-3 en ausencia del anticuerpo.

2. - El anticuerpo biespecifico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo biespecifico bivalente o trivalente, que se une a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana y consta de uno o dos sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a la ErbB-3 humana y un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a la c-Met humana.

3. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo biespecifico bivalente o trivalente, que se une a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana y consta de dos sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a la ErbB-3 humana y un tercer sitio de unión a antigeno que se une específicamente a la c-Met humana.

4. - El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo biespecífico bivalente o trivalente, que se une a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana y consta de un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de unión a antígeno que se une específicamente a la c-Met humana.

5. - Un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a la ErbB-3 humana y a la c-Met humana que contiene un primer sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la ErbB-3 humana y un segundo sitio de fijación sobre el antígeno que se une específicamente a la c-Met humana, caracterizado porque i) el primer sitio de fijación sobre el antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 47, una región CDR2H de SEC ID NO: 54 y una región CDR1H de SEC ID NO: 55, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 56, una región CDR2L de SEC ID NO: 57 y una región CDRIL de SEC ID NO: 58 o una región CDRIL de SEC ID NO: 59; y el segundo sitio de fijación al antígeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 66, una región CDR2H de SEC ID NO: 67, y una región CDR1H de SEC ID NO: 68, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 69, una región CDR2L de SEC ID NO: 70 y una región CDRIL de SEC ID NO: 71; ii) el primer sitio de fijación al antigeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 60, una región CDR2H de SEC ID NO: 61 y una región CDR1H de SEC ID NO: 62, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 63, una región CDR2L de SEC ID NO: 64 y una región CDRIL de SEC ID NO: 65 o una región CDRIL de SEC ID NO: 66; y el segundo sitio de fijación al antigeno contiene en el dominio variable de cadena pesada una región CDR3H de SEC ID NO: 66, una región CDR2H de SEC ID NO: 67 y una región CDR1H de SEC ID NO: 68, y en el dominio variable de cadena ligera una región CDR3L de SEC ID NO: 69, una región CDR2L de SEC ID NO: 70 y una región CDRIL de SEC ID NO: 71.

6.- El anticuerpo biespecifico de conformidad con Ia reivindicación 5, caracterizado porque i) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 47, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 48; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 4; ii) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 50; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: ; iii) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 51; y el segundo sitio de fijación sobre antígeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 4 ; iv) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 52; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 4; o v) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 1, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 2; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 3, y como dominio variable.de cadena ligera la SEC ID NO: 4.

7. - El anticuerpo biespecifico de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque i) el primer sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 49, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 51; y el segundo sitio de fijación sobre antigeno contiene como dominio variable de cadena pesada la SEC ID NO: 3, y como dominio variable de cadena ligera la SEC ID NO: 4.

8. - El anticuerpo biespecifico de conformidad con las reivindicaciones 1 - 7, caracterizado porque contiene una región constante del subgrupo IgGl o IgG3.

9. - El anticuerpo biespecifico de las reivindicaciones 1 - 8, caracterizado porque el anticuerpo está gilcosilado con una cadena azúcar en Asn297, en la que la cantidad de fucosa dentro de la cadena azúcar es del 65% o menos .

10. - Un ácido nucleico caracterizado porque codifica a un anticuerpo biespecifico de conformidad con las reivindicaciones 1 - 9.

11. - Una composición farmacéutica caracterizada porque contiene a anticuerpo biespecifico de conformidad con las reivindicaciones 1 - 9.

12. - Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11 caracterizada porque es para el tratamiento del cáncer.

13. - Un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 - 9 caracterizado porque es para el tratamiento del cáncer.

14. - Uso de un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 - 9 para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer .

15. - Un método de tratamiento de un paciente que sufre de cáncer caracterizado porque consiste en administrar un anticuerpo biespecífico de conformidad con las reivindicaciones 1 - 9 a un paciente que necesite el tratamiento .