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TWI861039B - 靶向腫瘤之促效cd28抗原結合分子 - Google Patents

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TWI861039B
TWI861039B TW108146682A TW108146682A TWI861039B TW I861039 B TWI861039 B TW I861039B TW 108146682 A TW108146682 A TW 108146682A TW 108146682 A TW108146682 A TW 108146682A TW I861039 B TWI861039 B TW I861039B
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Abstract

本發明係關於以單價結合至CD28為特徵之靶向腫瘤的雙特異性促效抗原結合分子、其產生方法、含有此等抗體之醫藥組合物，及其使用方法。

Description

靶向腫瘤之促效CD28抗原結合分子
本發明係關於以單價結合至CD28為特徵之靶向腫瘤的雙特異性促效CD28抗原結合分子、其產生方法、含有此等分子之醫藥組合物，及其用作治療癌症之免疫調節劑的用途。
癌症免疫療法正變成一種愈來愈有效的治療選項，其可以對諸如黑色素瘤、非小細胞肺癌及腎細胞癌之癌症類型產生顯著且持久的反應。驅動此療法的主要為若干免疫檢查點的成功阻斷，包括抗PD-1 (例如Keytruda, Merck；Opdivo, BMS)、抗CTLA-4 (例如Yervoy, BMS)及抗PD-L1 (例如Tecentriq, Roche)。此等藥劑有可能充當多種癌症類型之標準照護療法，或充當組合療法之骨幹，然而，僅一部分患者(＜25%)受益於此類療法。另外，多種癌症(前列腺癌、結腸直腸癌、胰臟癌、肉瘤、非三陰性乳癌等)對此等免疫調節劑呈現初始抗性。許多報導指出，缺乏預先存在之抗腫瘤T細胞導致一些患者缺乏反應或存在不良反應。總之，儘管現有免疫療法的抗癌作用令人印象深刻，但對於解決較大癌症患者群體及開發旨在誘導及增強新穎腫瘤特異性T細胞反應的療法存在明顯的醫學需求。
CD28為共刺激分子亞家族之創始成員，其特徵為成對V組免疫球蛋白超家族(IgSF)域連接至含有關鍵信號傳導基元之單一跨膜域及細胞質域(Carreno及Collins, 2002)。亞家族之其他成員包括ICOS、CTLA-4、PD1、PD1H、TIGIT及BTLA (Chen及Flies, 2013)。CD28表現受限於T細胞且普遍存在於所有初始及大部分經歷抗原之亞群上，包括表現PD-1或CTLA-4之彼等亞群。CD28與CTLA-4高度同源且競爭結合至樹突狀細胞、B細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞上所表現的相同B7分子CD80及CD86 (Linsley等人, 1990)。CTLA-4對配位體之B7家族之較高親和力使CTLA-4的配位體結合勝過CD28，且抑制效應T細胞反應(Engelhardt等人, 2006)。相比之下，PD-1展示藉由使CD28之細胞質域部分地去磷酸化來抑制CD28信號傳導(Hui等人, 2017)。初始T細胞的功能重新預致敏、隨後純系擴增、細胞介素產生、目標細胞溶解及長期記憶形成嚴格地需要專業抗原呈遞細胞表面上之CD80或CD86對CD28的接合。CD28配位體之結合亦促進諸如OX-40、ICOS及4-1BB之誘導型共同刺激受體之表現(評述於Acuto及Michel, 2003中)。CD28接合之後，二硫鍵連接的均二聚體、膜近端YMNM基元及遠端PYAP基元已展示與若干激酶及接附蛋白複合(Boomer及Green, 2010)。此等基元對於誘導IL2轉錄而言具有重要作用，該轉錄藉由NFAT、AP-1及NFκB家族轉錄因子之CD28依賴性活化介導(Fraser等人, 1991)(June等人, 1987)(Thompson等人, 1989)。然而，磷酸化及泛素化之其他未經充分表徵的位點發現於CD28之細胞質域內。如(Esensten等人, 2016)所評述，CD28起始路徑在促進習知T細胞增殖及效應功能方面具有關鍵作用。CD28接合亦促進調控性T細胞的消炎功能。CD28藉由部分地增強來自T細胞受體之信號共刺激T細胞，但亦展示介導獨特信號傳導事件(Acuto及Michel, 2003；Boomer及Green, 2010；June等人, 1987)。由CD28特異性觸發的信號控制T細胞功能之許多重要方面，包括下游蛋白質之磷酸化及其他轉譯後修飾(例如PI3K介導之磷酸化)、轉錄變化(例如Bcl-xL表現)、表觀遺傳變化(例如IL-2啟動子)、細胞骨架重塑(例如微管組織中心之定向)及糖分解速率變化(例如糖分解通量)。缺乏CD28之小鼠對感染性病原體、同種異體移植抗原、移植物抗宿主疾病、接觸過敏及哮喘的反應減少(Acuto及Michel, 2003)。缺乏CD28介導的共刺激使得活體外及活體內T細胞增殖減少，使得生發中心形成及免疫球蛋白同型類別轉換受到重度抑制，使T輔助(Th)細胞分化及Th2型細胞介素表現減少。亦影響CD4依賴性細胞毒性CD8+ T細胞反應。重要的是，缺乏CD28的初始T細胞展示減少的增殖反應，尤其在較低抗原濃度下。愈來愈多的文獻支持如下構思：與T細胞上的CD28接合具有抗腫瘤潛力。最新的證據證明，PD-L1/PD-1及CTLA-4檢查點抑制劑的抗癌作用依賴於CD28 (Kamphorst等人, 2017；Tai等人, 2007)。研究CTLA-4及PD-1阻斷之治療效果的臨床研究已表明對患有晚期黑色素瘤及其他癌症的患者存在特別有前景的結果。另外，表現人工嵌合T細胞受體之基因工程化T細胞的輸注已展示對B細胞癌症及其他癌症存在高反應率及高反應持久性，該等T細胞受體包含胞外抗原識別域與細胞內TCR信號傳導域(CD3z)及細胞內共刺激域(CD28及/或4-1BB域)的融合。
CD28促效抗體可分成兩類：(i) CD28超促效抗體及(ii) CD28習知促效抗體。通常，為了活化初始T細胞，需要T細胞抗原受體(TCR，信號1)的接合與CD28 (信號2)的共刺激信號傳導。CD28超促效劑(CD28SA)為CD28特異性單株抗體，其在無明顯T細胞受體接合的情況下能夠自主地活化T細胞(Hünig, 2012)。在嚙齒動物中，CD28SA活化習知的調控性T細胞。CD28SA抗體在自體免疫、炎症及移植之多種模型中為治療有效的。然而，2006年，對人類CD28SA抗體TGN1412的I期研究發現危及生命的細胞介素風暴。跟蹤研究已表明，由於臨床前動物模型之人類T細胞及T細胞的CD28反應存在差異，因此劑量誤差導致毒性。TGN1412當前正在針對RA患者及患有轉移性或不可切除之晚期實體惡性疾病之患者的開放標記、多中心劑量遞增研究中進行再評估。CD28習知促效抗體(諸如純系9.3)模擬CD28天然配位體且僅能在T細胞受體信號(信號1)存在下增強T細胞活化。公開的見解指出，抗體的結合抗原決定基對於抗促效抗體是否為超促效劑或習知促效劑具有重大影響(Beyersdorf等人, 2005)。超促效TGN1412結合至CD28之側向基元，而習知促效分子9.3緊密結合至配位體結合抗原決定基。由於結合抗原決定基不同，因此超促效及習知促效抗體與T細胞表面上之CD28分子形成線性複合物的能力不同。確切而言，TGN1412能夠有效地形成CD28之線性陣列，其可能引起足以超出T細胞活化之臨限值的信號傳導組分聚集。另一方面，習知促效劑9.3產生的複合物結構不呈線性。先前已公開(Otz等人, 2009)使用定向於黑色素瘤相關蛋白聚醣及CD28之重組雙特異性單鏈抗體嘗試轉化基於9.3純系的習知促效結合子。儘管使用習知CD28促效結合子9.3，但所報導的雙特異性單鏈抗體據報導可基於雙特異性單鏈抗體形成多聚構築體的固有傾向而發揮「超促效」活性。
已發現，當將限制量之抗CD3雙特異性抗體(亦即，T細胞雙特異性抗體(TCB)，諸如CEA-TCB)與促效性抗CD28分子組合時，達成較好的T細胞活化。鑒於CD28在多種腫瘤適應症中以基線表現於T細胞上(Lavin等人, 2017；Tirosh等人, 2016；Zheng等人, 2017)且CD28信號傳導的活化增強T細胞受體信號，因此TCB分子與靶向腫瘤之CD28分子的組合預期協同發揮作用以誘導強且長效的抗腫瘤反應。因此，吾人在本文中描述新穎的靶向腫瘤之促效CD28分子，其顯示與TCB協同作用且在TCB信號存在下，嚴格的腫瘤目標依賴性需要CD28結合為單價。
實體腫瘤之免疫療法 實體腫瘤治療為一種持續存在的挑戰，最近多年所見進展極小。療法典型地為手術與化學療法及/或放射療法之組合。雖然最近已開發出很多新治療型式，但仍需要進一步改良，以增加罹患實體腫瘤之患者的存活率且改善其生活品質。實體腫瘤很少表現一種腫瘤特異性抗原。對於大多數實體腫瘤而言，更通常為尋找富含於腫瘤上、而且以極低水準表現於正常組織上之腫瘤相關抗原(TAA)。TAA優先呈遞於實體腫瘤細胞表面上，或腫瘤基質細胞上。對於通常所靶向之實體腫瘤之多種TAA (包括纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、葉酸受體α (FolR1)、黑素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)及p95HER2)而言，情況確實如此。其他TAA包括HER3、EpCAM、TPBG (5T4)、間皮素、MUC1及PSMA。從而使包含特異性結合至腫瘤相關抗原之抗原結合域的雙特異性促效CD28抗原結合分子主要定向於腫瘤表面或腫瘤微環境且將特異性地活化腫瘤附近的T細胞，同時可以避免全身活化。
使 CD28 促效作用靶向 B 細胞 惡性疾病的基本原理 非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)為美國及歐洲之癌症死亡主要原因之一。濾泡性淋巴瘤(FL)在其病程中具有頑固性且演化速率慢，其中值存活期為8至10年；晚期臨床階段的患者通常不可治癒。同樣，在每年2%至3%之患者中，FL表型可以轉型為侵襲性大細胞淋巴瘤，病程中之關鍵事件且與增加之淋巴瘤相關死亡率相關。套細胞淋巴瘤及彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)更具侵襲性，且若不治療，則僅有6個月的中值存活期。儘管免疫治療學出現顯著的進步，其已使無進展之存活時間延長，但具有頑固性與侵襲性NHL亞型之許多患者缺乏治癒結果使得在醫學上仍存在未滿足的需求。在過去若干年期間，已觀測到DLBCL的存活期顯著延長，尤其在將抗CD20單株抗體利妥昔單抗(rituximab)(Rituxan®、MabThera®)添加至強細胞毒性化學治療方案的情況下。然而，儘管先前未治療之DLBCL的習知療法旨在治癒，但大部分患者最終將復發。同樣，晚期FL大部分仍不可治癒(根據現行SoC)且以反覆復發及逐漸縮短的緩解為特徵。當前，多種新一代單株抗體正處於評估的不同臨床前及臨床階段中，以進一步改善NHL患者的結果且克服利妥昔單抗抗性機制。使用自體幹細胞載體或同種異體幹細胞移植的高劑量化學療法僅為患有復發性/難治性(r/r) DLBCL的少數(10%)患者提供治癒選項且與大量的治療相關死亡相關。當前處於開發中的其他NHL治療方法包括分子靶向化合物，如維納妥拉(venetoclax)及BET抑制劑。最近批准的新穎藥劑包括來那度胺(lenalidomide)、艾德昔布(idelalisib)及考班昔布(copanlisib)。嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法已批准用於治療r/r B-NHL的侵襲形式，但此療法僅可在有限的背景下利用且可能與致命神經事件及細胞介素釋放症候群(CRS)相關。使細胞毒性細胞溶解再定向於惡性B細胞的雙特異性抗體構築體當前正處於開發中且已展示針對NHL的極有前景之功效。非化學療法的治療被設想用於NHL的未來且可能基於雙特異性抗體或嵌合抗原受體T細胞(CAR T細胞)。靶向B細胞表面抗原之CD28促效劑與免疫療法的組合應增強B細胞惡性疾病患者的存活率及/或治癒率，而無損於其生活品質。
作為針對 B 細胞 惡性疾病之 目標 的 B 細胞 表面抗原 與B細胞惡性疾病相關之TAA為B細胞表面抗原。人類CD19抗原為屬於免疫球蛋白超家族之95 KDa跨膜醣蛋白。CD19歸類為I型跨膜蛋白，其具有單一跨膜域、細胞質C末端及胞外N末端。在正常細胞中，其為B淋巴球譜系中表現最普遍的蛋白質。CD19表現在已經歷贅生性轉型的B譜系細胞中得以維持，且因此，CD19適用於診斷白血病及淋巴瘤(使用單株抗體(mAb)及流式細胞術)，CD20抗原亦適用。由於B譜系白血病及淋巴瘤很少失去CD19表現，且由於其不表現於多能幹細胞中，因此其已成為多種免疫治療劑(包括免疫毒素)之目標。CD79為B細胞受體之信號傳導組分，其由含有CD79a (Igα，mb-1)及CD79b (Igβ，B29)的共價雜二聚體組成。CD79a及CD79b各自含有胞外免疫球蛋白(Ig)域、跨膜域及胞內信號傳導域、基於免疫受體酪胺酸的活化基元(ITAM)域，如其他信號傳導蛋白質，諸如CD3或活化Fcγ受體。CD79a及CD79b因此為構成B細胞受體(BCR)之信號傳導亞單元的跨膜蛋白。CD79b為僅僅表現於B細胞上的39 KDa蛋白質且與CD79a協同起始BCR下游的信號轉導級聯，從而引起BCR複合物內化、其向核內體的易位，及抗原呈遞。在B細胞中，抗原誘導的BCR叢集觸發Src激酶對CD79a及CD79b之ITAM進行的酪胺酸磷酸化。由此引起屬於BCR信號級聯之多種效應分子(包括最顯著的SYK及BLNK)募集及活化。另外在下游，PLCg2、Btk及ERK的募集促進鈣通量且活化B細胞，其接著即用於接受將驅動其增殖及分化成記憶或效應細胞的其他共活化信號。在此過程中，B細胞變成穩定的APC且釋放可以影響免疫反應之結果及品質的細胞介素。CD79亞單元除其在BCR信號傳導中的作用之外，對於膜結合之Ig自內質網轉運且呈現至細胞表面亦為必需的。CD79b在NHL上的平均表面表現類似於正常B細胞上的平均表面表現，但範圍更大。鑒於CD79b之表現，因此產生針對CD79b抗原的治療性抗體係有益的，該抗原當投與患者(尤其用於慢性治療)時產生最小抗原性或不產生抗原性。
已發現，當將限量的抗CD3雙特異性抗體(亦即，T細胞雙特異性抗體(TCB)，諸如CD20/CD3雙特異性抗體)與促效性抗CD28分子組合時，達成較好的T細胞活化。鑒於CD28在多種腫瘤適應症中以基線表現於T細胞上(Lavin等人, 2017；Tirosh等人, 2016；Zheng等人, 2017)且CD28信號傳導的活化增強T細胞受體信號，因此T細胞雙特異性抗體與靶向B細胞表面抗原之雙特異性促效CD28抗原結合分子的組合預期協同發揮作用以誘導強且長效的抗腫瘤反應。因此，吾人在本文中描述靶向B細胞表面抗原的新穎雙特異性促效CD28抗原結合分子，其顯示與TCB協同作用且在TCB信號存在下，嚴格的腫瘤目標依賴性需要CD28結合為單價。
對多發性骨髓瘤的免疫療法 多發性骨髓瘤(MM)在歐盟及美國每年影響約75,000個新患者，為最常見的血液惡性病之一，對醫學的需求仍未得到較大滿足。多發性骨髓瘤之特徵為終末分化的漿細胞分泌非功能性單株免疫球蛋白。簡言之，免疫調節藥物，諸如來那度胺(lenalidomide)及泊利度胺(pomalidomide)，以及蛋白酶體抑制劑，諸如卡非佐米(carfilzomib)或硼替佐米(bortezomib)，可能仍為多發性骨髓瘤之第1線療法的骨幹(Moreau等人, 2016)。然而，此等藥物不能特異性靶向病變的腫瘤細胞，例如病變的漿細胞(PC)。已作出種種努力來選擇性地耗竭多發性骨髓瘤中的漿細胞。特異性標記漿細胞之表面蛋白質的缺乏已妨礙用於多發性骨髓瘤之抗體或細胞療法的開發。迄今為止，成功的生物製劑寥寥無幾，包括達土木單抗(daratumumab)(抗CD38)及埃羅妥珠單抗(elotuzumab)(抗CD319)，兩種抗原亦表現於其他正常組織(包括造血譜系及免疫效應細胞)上的警告可能限制其長期的臨床使用。B細胞成熟抗原(BCMA)，腫瘤壞死因子受體超家族17 (TNFRSF17)中的跨膜醣蛋白，以顯著較高的水準表現於所有患者MM細胞中，而不表現於其他正常組織上，但正常漿細胞除外。BCMA-嵌合抗原受體(CAR) T細胞已在RRMM患者中展示顯著的臨床活性，該等患者已經歷至少三種先前療法，包括蛋白酶體抑制劑及免疫調節劑。其他型式，包括抗BCMA抗體-藥物結合物，亦已在先前至少三線療法(包括抗CD38抗體、蛋白酶體抑制劑及免疫調節劑)失效的患者中達成顯著臨床反應(Cho等人, 2018)。靶向例如BCMA或CD38之療法的一個挑戰在於，MM患者血清中存在高含量的可溶性BCMA或CD38，此可能會減少患者體內之活性藥物的量。一種替代物可能為新目標，諸如G蛋白偶合的受體C類第5組成員D (GPRC5D)，其在多發性骨髓瘤之漿細胞中的表現不同於健康供者的漿細胞，且具有不可溶形式。已報導GPRC5D與多發性骨髓瘤患者的預後及腫瘤負荷相關(Atamaniuk, J.等人, 2012；及Cohen, Y.等人, 2013)。GPRC5D為一種孤兒受體，其無已知配位體且通常在人體中且尤其在癌症中的生物學很大程度上未知。定位於染色體12p13.3的GPRC5D編碼基因含有三個外顯子且跨度為約9.6 kb (Brauner-Osborne, H.等人, 2001)。較大的第一外顯子編碼七跨膜域。已展示GPRC5D涉及動物毛囊中的角蛋白形成(Gao, Y.等人, 2016, 及Inoue, S.等人, 2004)。WO 2018/017786 A2揭示GPRC5D特異性抗體或抗原結合片段。
使 CD28 促效作用靶向多發性骨髓瘤中之病變漿細胞的基本原理 CD28對多發性骨髓瘤的促效作用可以對免疫的各別MM漿細胞發揮不同生物學功能。雖然T細胞經由CD28共活化預期驅動抗腫瘤反應，但CD28對MM細胞的促效作用係經由PI3K/Akt、FoxO3a及Bimm的調控來介導促存活信號傳導，此信號傳導據描述又誘導多發性骨髓瘤的化學治療抗性(Murray M. E.等人, 2014)。新診斷之多發性骨髓瘤漿細胞上之CD28的過度表現據描述與更糟的臨床結果相關(Bahlis等人, 2007)。然而，雖然CD28活化增強骨髓瘤細胞存活，但其活化抑制骨髓瘤細胞增殖。在強免疫細胞介導之T細胞反應(諸如T細胞雙特異性活化)存在下對CD28進行促效可以進一步增強有效的抗腫瘤反應。本文中吾人提供特異性結合人類多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原之雙特異性促效CD28抗原結合分子。特定言之，靶向T細胞上所表現之選自BCMA、CD38及GPRC5D及CD28之TAA的本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子具有作為單一藥劑或與靶向人類MM細胞表面抗原之其他藥劑(諸如T細胞雙特異性抗體(TCB))組合治療多發性骨髓瘤的效能。
本發明描述靶向腫瘤之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其在無需形成多聚體的情況下達成腫瘤依賴性T細胞活化及腫瘤細胞殺滅。本發明之雙特異性CD28抗原結合分子的特徵在於，單價結合至CD28以及其包含至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原(諸如纖維母細胞活化蛋白(FAP)或癌胚抗原(CEA)、CD19或GPRC5D)之抗原結合域。另外，其具有由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。藉此消除Fc受體介導之交聯且經由至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之抗原結合域對其抗原的結合、藉由交聯來達成腫瘤特異性活化。
因此，本發明提供一種以單價結合至CD28為特徵的雙特異性促效CD28抗原結合分子，該分子包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域， (b)至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如下文所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中Fc域為IgG，特定言之，IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。在一個特定態樣中，由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域為IgG1 Fc域。在一個態樣中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，Fc域屬於人類IgG1亞類且包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (i)包含SEQ ID NO：36之重鏈互補決定區CDR-H1、SEQ ID NO：37之CDR-H2及SEQ ID NO：38之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：39之輕鏈互補決定區CDR-L1、SEQ ID NO：40之CDR-L2及SEQ ID NO：41之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)；或 (ii)包含SEQ ID NO：20之CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，及包含SEQ ID NO：23之CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：包含SEQ ID NO：36之CDR-H1、SEQ ID NO：37之CDR-H2及SEQ ID NO：38之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：39之CDR-L1、SEQ ID NO：40之CDR-L2及SEQ ID NO：41之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：包含SEQ ID NO：20之CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，及包含SEQ ID NO：23之CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
此外，提供如上文所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28之抗原結合域包含：含有胺基酸序列與SEQ ID NO：26之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD28)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：27之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含：含有胺基酸序列選自由以下組成之群的重鏈可變區(VH CD28)：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51；及含有胺基酸序列選自由以下組成之群的輕鏈可變區(VL CD28)：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (b)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (c)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (d)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (e)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (f)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (g)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (h)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (j)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (k)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：47的重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：54的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：46的重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：53的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：42的重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：27的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含 (i)重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：188的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：189的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：190的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：191的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：192的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：193的CDR-L3；或 (ii)重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：180的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：181的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：182的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：183的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：184的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：185的CDR-L3；或 (iii)重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：127的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：128的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：129的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：130的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：131的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：132的CDR-L3，或 (iv)重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：507的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：508的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：509的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：510的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：511的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：512的CDR-L3。
在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO：133之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CEA)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：134之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CEA)。特定言之，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：186的重鏈可變區(VH CEA)，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：187的輕鏈可變區(VL CEA)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (b)包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (c)包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (d)包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (e)包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (f)包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (g)包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (h)包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (i)包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (j)包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)。
特定言之，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：200的重鏈可變區(VH CEA)，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：201的輕鏈可變區(VL CEA)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含：(a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：12的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：13的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：14的CDR-H3，以及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：15的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：16的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：17的CDR-L3；或(b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：4的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：5的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：6的CDR-H3，以及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：7的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：8的CDR-L2，及(vi)胺基酸序列為SEQ ID NO：9的CDR-L3。特定言之，能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH FAP)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：12的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：13的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：14的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：15的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：16的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：17的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含(a)胺基酸序列與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH FAP)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：19之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL FAP)；或(b)胺基酸序列與SEQ ID NO：10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH FAP)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL FAP)。特定言之，能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：18的重鏈可變區(VH FAP)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：19的輕鏈可變區(VL FAP)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至上皮細胞黏附分子(EpCAM)的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至EpCAM的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH EpCAM)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：515的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：516的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：517的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL EpCAM)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：518的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：519的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：520的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至EpCAM的包含(a)胺基酸序列與SEQ ID NO：521之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH EpCAM)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：522之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL EpCAM)。特定言之，能夠特異性結合至EpCAM的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：521的重鏈可變區(VH EpCAM)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：522的輕鏈可變區(VL EpCAM)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至HER3的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至HER3的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH HER3)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：523的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：524的CDR-H2，及(iii) 含有胺基酸序列為SEQ ID NO：525的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL HER3)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：526的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：527的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：528的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至HER3的抗原結合域包含(a)胺基酸序列與SEQ ID NO：529之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH HER3)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：530之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL HER3)。特定言之，能夠特異性結合至HER3的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：529的重鏈可變區(VH HER3)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：530的輕鏈可變區(VL HER3)。
在又另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD30的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD30的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD30)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：531的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：532的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：533的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CD30)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：534的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：535的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：536的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD30的抗原結合域包含(a)胺基酸序列與SEQ ID NO：537之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD30)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：538之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD30)。特定言之，能夠特異性結合至CD30的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：537的重鏈可變區(VH CD30)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：538的輕鏈可變區(VL CD30)。
另外，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至TBPG的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至TBPG的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH TBPG)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：539的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：540的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：541的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL TBPG)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：542的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：543的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：544的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至TBPG的抗原結合域包含(a)胺基酸序列與SEQ ID NO：545之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH TBPG)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：546之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL TBPG)。特定言之，能夠特異性結合至TBPG的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：545的重鏈可變區(VH TBPG)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：546的輕鏈可變區(VL TBPG)。
在另一個態樣中，本發明提供一種以單價結合至CD28為特徵的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含(a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域、(b)至少一個能夠特異性結合至多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原的抗原結合域，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含使抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的一或多個胺基酸取代。在一個態樣中，多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原選自由CD38、BCMA及GPRC5D組成之群。
因此，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含：(a)重鏈可變區(VH GPRC5D)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：563的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：564的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：565的CDR-H3，與輕鏈可變區(VL GPRC5D)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：566的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：567的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：568的CDR-L3；或(b)重鏈可變區(VH GPRC5D)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：579的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：580的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：581的CDR-H3，與輕鏈可變區(VL GPRC5D)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：582的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：583的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：584的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：569之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH GPRC5D)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：570之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL GPRC5D)。特定言之，能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：569的重鏈可變區(VH GPRC5D)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：570的輕鏈可變區(VL GPRC5D)。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD38的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD38的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD38)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：547的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：548的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：549的CDR-H3；與輕鏈可變區(VL CD38)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：550的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：551的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：552的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD38的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：553之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD38)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：554之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD38)。特定言之，能夠特異性結合至CD38的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：553的重鏈可變區(VH CD38)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：554的輕鏈可變區(VL CD38)。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至BCMA的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至BCMA的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH BCMA)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：555的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：556的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：557的CDR-H3；與輕鏈可變區(VL BCMA)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：558的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：559的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：560的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至BCMA的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：559之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH BCMA)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：560之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL BCMA)。特定言之，能夠特異性結合至BCMA的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：561的重鏈可變區(VH BCMA)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：562的輕鏈可變區(VL BCMA)。
在另一個態樣中，本發明提供一種以單價結合至CD28為特徵的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含(a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域、(b)至少一個能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域，及(c)由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。在一個態樣中，B細胞表面抗原選自由以下組成之群：CD19、CD79b、CD20、CD22及CD37。
因此，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD19的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含：(a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：406的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：407的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：408的CDR-H3，與輕鏈可變區(VL CD19)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：409的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：410的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：411的CDR-L3；或(b)重鏈可變區(VH CD19)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：414的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：415的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：416的CDR-H3，與輕鏈可變區(VL CD19)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：417的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：418的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：419的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含(a)含有胺基酸序列與SEQ ID NO：412之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的重鏈可變區(VH CD19)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：413之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD19)；或(b)含有胺基酸序列與SEQ ID NO：420之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的重鏈可變區(VH CD19)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：421之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD19)。特定言之，能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：412的重鏈可變區(VH CD19)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：413的輕鏈可變區(VL CD19)。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域。在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD79b)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：422的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：423的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：424的CDR-H3，與輕鏈可變區(VL CD79b)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：425的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：426的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：427的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：428之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD79b)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：429之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD79b)。特定言之，能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：428的重鏈可變區(VH CD79b)，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：429的輕鏈可變區(VL CD79b)。
在另一態樣中，提供如上文所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域為Fab片段或互換Fab片段。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之第二Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與一個Fc域亞單元之N端融合。
在另一態樣中，提供如本文所揭示之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之第二及第三Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與第一Fc域亞單元之N端融合，且能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第三Fab片段在Fab重鏈之C端與第二Fc域亞單元之N端融合。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的VH及VL域，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的Fab片段在其C端與第一Fc域亞單元的N端融合，且其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之VH及VL域之一經由肽連接子與第一Fc域亞單元之C端融合，且能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之VH及VL域中之另一者經由肽連接子與第二Fc域亞單元之C端融合。
根據本發明之另一態樣，提供一或多種經分離之聚核苷酸，其編碼本發明的雙特異性促效CD28抗原結合分子。本發明進一步提供一或多種包含本發明之經分離聚核苷酸的載體，特定言之，表現載體，及包含本發明之經分離聚核苷酸或表現載體的宿主細胞。在一些態樣中，宿主細胞為真核細胞，特定言之，哺乳動物細胞。在另一態樣中，提供一種產生如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子的方法，包含在適於表現雙特異性促效CD28抗原結合分子的條件下培養本發明之宿主細胞。該方法視情況亦包含回收雙特異性促效CD28抗原結合分子。本發明亦涵蓋藉由本發明之方法產生的雙特異性促效CD28抗原結合分子。
本發明進一步提供一種醫藥組合物，其包含本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在一個態樣中，醫藥組合物用於治療癌症。
本發明亦涵蓋使用本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子及醫藥組合物的方法。在一個態樣中，本發明提供用作藥劑的本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子或醫藥組合物。在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其用於(a)增強細胞活化或(b)增強T細胞效應功能。在一個態樣中，提供用於治療疾病的本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子或醫藥組合物。在一個特定態樣中，該疾病為癌症。在另一態樣中，提供用於治療癌症的本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子或醫藥組合物，其中雙特異性促效CD28抗原結合分子與化學治療劑、輻射療法及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。在另一態樣中，提供一種用於治療癌症之雙特異性促效CD28抗原結合分子或醫藥組合物，其中雙特異性促效CD28抗原結合分子與T細胞活化抗CD3雙特異性抗體組合投與。在又另一態樣中，提供用於治療癌症的雙特異性促效CD28抗原結合分子或醫藥組合物，其中雙特異性促效CD28抗原結合分子與抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體組合投與。
亦提供本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子的用途，其用於製造供治療疾病用的藥劑；以及治療個體之疾病的方法，包含將治療有效量之本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子或包含本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子之組合物以醫藥學上可接受之形式投與該個體。在一個特定態樣中，該疾病為癌症。在一個態樣中，提供一種於個體中(a)增強細胞活化或(b)增強T細胞效應功能的方法，包含將本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子或包含本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子的組合物以醫藥學上可接受之形式投與該個體。在另一態樣中，提供本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子用於製造供治療疾病用之藥劑的用途，其中該治療包含與化學治療劑、輻射療法及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑共投與。在另一態樣中，提供一種治療個體之疾病的方法，包含將治療有效量之本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子或包含本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子之組合物以醫藥學上可接受之形式投與該個體，其中該方法包含與化學治療劑、輻射療法及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑共投與。在另一態樣中，提供一種治療個體之疾病的方法，包含將治療有效量之本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子或包含本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子之組合物以醫藥學上可接受之形式投與該個體，其中該方法包含共投與T細胞活化抗CD3雙特異性抗體。在另一態樣中，提供一種治療個體之疾病的方法，包含將治療有效量之本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子或包含本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子之組合物以醫藥學上可接受之形式投與該個體，其中該方法包含共投與抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體。亦提供一種抑制個體之腫瘤細胞生長的方法，包含將有效量之本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子或包含本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子之組合物以醫藥學上可接受之形式投與該個體以抑制腫瘤細胞生長。在任一上述態樣中，個體較佳為哺乳動物，尤其人類。
定義 除非另外定義，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與本發明所屬技術通常所用相同的含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下術語說明且只要適當，則以單數形式使用之術語亦將包括複數形式且反之亦然。
如本文所用，術語「抗原結合分子 」在其最廣泛的意義上係指特異性地結合抗原性決定子的分子。抗原結合分子之實例為抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段及骨架抗原結合蛋白。
如本文所用，術語「結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域 」或「能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的部分」係指特異性結合至抗原決定子之多肽分子。在一個態樣中，抗原結合域能夠經由其目標細胞抗原活化信號傳導。在一個特定態樣中，抗原結合域能夠將其所連接之實體(例如CD28抗體)導引至目標位點，例如特定類型的具有抗原決定子之腫瘤細胞或腫瘤基質。能夠特異性結合至目標細胞抗原之抗原結合域包括如本文進一步定義之抗體及其片段。另外，能夠特異性結合至目標細胞抗原的抗原結合域包括如本文進一步定義之骨架抗原結合蛋白，例如基於所設計之重複蛋白質或所設計之重複域的結合域(參見例如WO 2002/020565)。
關於抗原結合分子，亦即抗體或其片段，術語「能夠特異性結合至目標細胞抗原的抗原結合域」係指分子的一部分，該部分包含特異性結合至抗原之一部分或全部及與其互補的區域。能夠發生特異性抗原結合的抗原結合域可以由例如一或多個抗體可變域(亦稱為抗體可變區)提供。特定言之，能夠發生特異性抗原結合的抗原結合域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。在另一態樣中，「能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域」亦可為Fab片段或互換Fab片段。在另一態樣中，「能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域」亦可為Fab片段或互換Fab片段。如本文所用，術語「第一」、「第二」或「第三」與抗原結合域等關聯時，係為了便於區分而使用，此時存在的各類型部分超過一種。此等術語之使用並非旨在賦予該部分之特定次序或取向，除非明確有如此陳述。
如本文所用，術語「結合至 B 細胞表面抗原 的抗原結合域 」或「能夠特異性結合至B細胞表面抗原的部分」係指特異性結合至B細胞表面上之抗原決定子的多肽分子。在一個態樣中，抗原結合域能夠經由其目標細胞抗原活化信號傳導。在一個特定態樣中，抗原結合域能夠將其所連接之實體(例如CD28促效劑)導引至目標位點，例如B細胞上的目標位點。能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域包括如本文進一步定義之抗體及其片段。另外，能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域包括如本文進一步定義之骨架抗原結合蛋白，例如基於所設計之重複蛋白質或所設計之重複域的結合域(參見例如WO 2002/020565)。
術語「結合至多發性骨髓瘤 ( MM ) 細胞表面抗原的抗原結合域 」或「能夠特異性結合至多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原的部分」係指特異性結合至多發性骨髓瘤(MM)細胞上之抗原決定子的多肽分子。在一個態樣中，抗原結合域能夠經由其目標細胞抗原活化信號傳導。在一個特定態樣中，抗原結合域能夠將其所連接之實體(例如CD28促效劑)導引至目標位點，例如B細胞上的目標位點。能夠特異性結合至多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原的抗原結合域包括如本文進一步定義之抗體及其片段。另外，能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域包括如本文進一步定義之骨架抗原結合蛋白，例如基於所設計之重複蛋白質或所設計之重複域的結合域(參見例如WO 2002/020565)。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。
如本文所用，術語「單株抗體 」係指自基本上均質抗體之群體獲得的抗體，亦即，除可能之變異型抗體(例如含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間產生之變異型抗體，此等變異體一般少量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，單株抗體製劑中之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。
如本文所用，術語「單特異性 」抗體表示具有一或多個結合位點的抗體，其中每一個位點結合至相同抗原之相同抗原決定基。術語「雙特異性 」意謂抗原結合分子能夠特異性結合至至少兩個不同抗原決定子。典型地，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其中每一個位點特異性針對不同抗原決定子。然而，雙特異性抗原結合分子亦可包含結合至其他抗原決定子之其他抗原結合位點。在某些態樣中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，詳言之，兩個不同細胞或相同細胞上所表現的兩個抗原決定子。根據本發明，術語「雙特異性 」因此亦可包括三特異性分子，例如包含CD28抗體及兩個針對兩種不同目標細胞抗原之抗原結合域的雙特異性分子。
如本申請案中所用的術語「價 」指示特異性針對一個不同抗原決定子的抗原結合分子中存在指定數目個特異性針對一個獨特抗原決定子的結合位點。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」分別表示抗原結合分子中存在特異性針對某一抗原決定子的兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。在本發明之特定態樣中，本發明之雙特異性抗原結合分子對於某一抗原決定子可為單價，意謂其對於該抗原決定子僅具有一個結合位點，或其對於某一抗原決定子可為二價或四價，意謂其對於該抗原決定子分別具有兩個結合位點或四個結合位點。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指結構與原生抗體結構基本上類似的抗體。「原生抗體 」係指具有不同結構的天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，原生IgG類抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩個輕鏈及兩個重鏈構成。各重鏈自N端至C端具有可變區(VH)，亦稱為可變重域或重鏈可變域；繼之為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)，亦稱為重鏈恆定區。類似地，各輕鏈自N端至C端具有可變區(VL)，亦稱為可變輕域或輕鏈可變域；繼之為輕鏈恆定域(CL)，亦稱為輕鏈恆定區。抗體重鏈可歸為五種類型之一，稱為α (IgA)、δ (IgD)、ε (IgE)、γ (IgG)或μ (IgM)，其中一些可進一步分成亞型，例如γ1 (IgG1)、γ2 (IgG2)、γ3 (IgG3)、γ4 (IgG4)、α1 (IgA1)及α2 (IgA2)。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而歸為兩種類型之一，稱為kappa (κ)及lambda (λ)。
「抗體片段 」係指除完整抗體之外的分子，其包含完整抗體之一部分，該部分結合完整抗體所結合的抗原。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、互換Fab片段；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及單域抗體。關於某些抗體片段的評述，參見Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)。關於scFv片段之評述，參見例如Plückthun, 於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185以及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點的抗體片段，其可為二價的或雙特異性的，參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)；及Hollinger等人, Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人, Nat Med 9, 129-134 (2003)中。單域抗體為包含抗體重鏈可變域之全部或一部分或輕鏈可變域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis, Inc., Waltham, MA；參見例如美國專利第號6,248,516 B1)。抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)完整抗體的蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所述。
完整抗體之番木瓜蛋白酶消化產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其各自含有重鏈可變域及輕鏈可變域以及輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域(CH1)。因此，如本文所用，術語「Fab 片段 」係指抗體片段，其包含含有輕鏈可變(VL)域及輕鏈(CL)恆定域的輕鏈片段，以及重鏈可變(VH)域及重鏈之第一恆定域(CH1)。Fab'片段與Fab片段不同之處在於，重鏈CH1域的羧基端添加了幾個殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH為其中恆定域之半胱胺酸殘基具有自由硫醇基之Fab'片段。胃蛋白酶處理產生F(ab')2 片段，其具有兩個抗原組合位點(兩個Fab片段)及Fc區之一部分。
術語「互換 Fab 片段 」或「xFab片段」或「互換型Fab片段」係指其中重鏈與輕鏈之可變區或恆定區交換的Fab片段。互換型Fab分子可能存在兩種不同的鏈組成且該兩種鏈組成包含於本發明之雙特異性抗體中：一方面，Fab重鏈與輕鏈之可變區交換，亦即，互換型Fab分子包含由輕鏈可變(VL)域及重鏈恆定域(CH1)構成之肽鏈以及由重鏈可變域(VH)及輕鏈恆定域(CL)構成之肽鏈。此互換型Fab分子亦稱為互換Fab( VLVH ) 。另一方面，當Fab重鏈與輕鏈之恆定區交換時，互換型Fab分子包含由重鏈可變域(VH)及輕鏈恆定域(CL)構成之肽鏈，及由輕鏈可變域(VL)及重鏈恆定域(CH1)構成之肽鏈。此互換型Fab分子亦稱為互換Fab( CLCH1 ) 。
「單鏈Fab片段」或「scFab 」為一種多肽，其由抗體重鏈可變域(VH)、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成，其中該等抗體域及該連接子依N端至C端方向具有以下次序之一：a）VH-CH1-連接子-VL-CL，b）VL-CL-連接子-VH-CH1，c) VH-CL-連接子-VL-CH1或d) VL-CH1-連接子-VH-CL；且其中該連接子為具有至少30個胺基酸，較佳32至50個胺基酸的多肽。該等單鏈Fab片段經由CL域與CH1域之間的天然二硫鍵穩定化。另外，此等單鏈Fab分子可以經由插入半胱胺酸殘基(例如可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)、藉由產生鏈間二硫鍵而進一步穩定化。
「互換型單鏈Fab片段」或「x - scFab 」為一種多肽，其由抗體重鏈可變域(VH）、抗體恆定域1 (CH1)、抗體輕鏈可變域(VL)、抗體輕鏈恆定域(CL)及連接子組成，其中該等抗體域及該連接子依N端至C端方向具有以下次序之一：a）VH-CL-連接子-VL-CH1及b)VL-CH1-連接子-VH-CL；其中VH與VL一起形成特異性結合至抗原的抗原結合位點，且其中該連接子為具有至少30個胺基酸之多肽。另外，此等x-scFab分子可以經由插入半胱胺酸殘基(例如可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100，根據Kabat編號)、藉由產生鏈間二硫鍵而進一步穩定化。
「單鏈可變片段 ( scFv ) 」為抗體之重鏈可變區(VH )與輕鏈可變區（VL ）的融合蛋白，其經由十至約25個胺基酸之短連接肽連接。連接子通常富含甘胺酸以具有柔性，以及絲胺酸或蘇胺酸以具有溶解性，且可以使VH 之N端與VL 之C端連接，或反之亦然。儘管恆定區移除及連接子引入，但此蛋白質保持初始抗體之特異性。scFv抗體描述於例如Houston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-96)。另外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH域特徵，亦即，能夠與VL域一起組裝成功能抗原結合位點，或VL域特徵，亦即，能夠與VH域一起組裝成功能抗原結合位點，且藉此得到全長抗體的抗原結合特性。
「骨架抗原結合蛋白 」在此項技術中已知，例如纖維結合蛋白，且所設計的錨蛋白重複蛋白(DARPins)已用作抗原結合域之替代骨架，參見例如Gebauer及Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 (2009)及Stumpp等人, Darpins：A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13：695-701 (2008)。在本發明之一個態樣中，骨架抗原結合蛋白係選自由以下組成之群：CTLA-4 (艾維伯迪(Evibody))；脂質運載蛋白(抗運載蛋白)；蛋白質A衍生之分子，諸如蛋白質A之Z域(親和抗體)；A域(高親和性多聚體/最大抗體)；血清運鐵蛋白(反式體)；所設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin)；抗體輕鏈或重鏈可變域(單域抗體，sdAb)；抗體重鏈可變域(奈米抗體，aVH)；VNAR 片段；纖維結合蛋白(纖連蛋白(AdNectin))；C型凝集素域(四連接素(Tetranectin))；新抗原受體β-內醯胺酶之可變域(VNAR 片段)；人類γ-晶狀體球蛋白或泛素(阿菲林(Affilin)分子)；人類蛋白酶抑制劑之昆尼茲型(kunitz type)域；微體，諸如來自打結素(knottin)家族之蛋白質、肽適體及纖維結合蛋白(纖連蛋白)。CTLA-4 (細胞毒性T淋巴球相關抗原4)為大部分CD4+ T細胞上所表現之CD28家族受體。其胞外域具有可變域樣Ig摺疊。對應於抗體CDR之環可經異源序列取代以賦予不同結合特性。經工程改造以具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為艾維伯迪(例如US7166697B1)。艾維伯迪的尺寸與抗體(例如域抗體)之經分離之可變區大致相同。關於其他細節，參見Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)。脂質運載蛋白為胞外蛋白質家族，其轉運小疏水性分子，諸如類固醇、膽素、類視黃素及脂質。其具有剛性β片狀二級結構，其錐形結構之開放端具有許多環，其可經工程改造以結合至不同目標抗原。抗運載蛋白具有160-180個胺基酸的大小，且衍生自脂質運載蛋白。關於其他細節，參見Biochim Biophys Acta 1482：337-350 (2000)；US7250297B1及US20070224633。親和抗體為來源於金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白質A的骨架，其可經工程改造以結合至抗原。該域由具有約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化產生文庫。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 2004, 17, 455-462及EP 1641818A1。高親合性多聚體為衍生自A域骨架家族之多域蛋白質。約35個胺基酸之原生域採用所定義的二硫鍵結構。藉由改組A域家族所展現之天然變異來產生多樣性。關於其他細節，參見Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (2007年6月)。運鐵蛋白為單體血清轉運醣蛋白。運鐵蛋白可經工程改造以藉由在容許表面環中插入肽序列而結合不同目標抗原。經工程改造之運鐵蛋白骨架之實例包括反式體。關於其他細節，參見J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)。所設計之錨蛋白重複蛋白(DARPins)衍生自錨蛋白，錨蛋白屬於介導整合膜蛋白質與細胞骨架連接之蛋白質的家族。單一錨蛋白重複為由兩個α螺旋及一個β回旋組成之33個殘基基元。其可經工程改造以藉由使各重複之第一個α螺旋及β回旋中之殘基隨機化而結合不同目標抗原。可藉由增加模組數目來增加其結合界面(親和力成熟方法)。關於其他細節，參見J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003)及 J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)及US20040132028A1。單域抗體為由單一單體抗體可變域組成之抗體片段。第一單一域衍生自駱駝科抗體重鏈之可變域(奈米抗體或VH H片段)。此外，術語單域抗體包括自主人類重鏈可變域(aVH)或來源於鯊魚之VNAR 片段。纖維結合蛋白為可經工程改造以結合至抗原之骨架。纖連蛋白由III型人類纖維結合蛋白(FN3)之15個重複單元之第10個域的天然胺基酸序列之主鏈組成。β夾心結構之一端處的三個環可經工程改造以使纖連蛋白能夠特異性識別所關注的治療目標。關於其他細節，參見Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 (2005)；US20080139791、WO2005056764及US6818418B1。肽適體為組合型識別分子，其由恆定骨架蛋白(典型地為含有在活性位點處插入之限制性可變肽環的硫氧還蛋白(TrxA))組成。關於其他細節，參見Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)。微體衍生自長度為25-50個胺基酸之天然存在之微型蛋白質，其含有3-4個半胱胺酸橋，微型蛋白質之實例包括KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)及打結素。微型蛋白質具有環，該環可經工程改造以包括至多25個胺基酸而不影響微型蛋白質之整體摺疊。關於經工程改造之打結素域之其他細節，參見WO2008098796。
作為參考分子的「結合至相同抗原決定基之抗原結合分子 」係指一種抗原結合分子，其在競爭分析中將參考分子對其抗原的結合阻斷50%或更多，且反之，參考分子在競爭分析中將抗原結合分子對其抗原之結合阻斷50%或或更多。
術語「抗原結合域 」係指抗原結合分子之一部分，其包含特異性結合至抗原之一部分或全部且與其互補之區域。當抗原較大時，抗原結合分子僅可以結合至抗原之特定部分，該部分稱為抗原決定基。抗原結合域可由例如一或多個可變域(亦稱為可變區)提供。較佳地，抗原結合域包含抗體輕鏈可變域(VL)及抗體重鏈可變域(VH)。
如本文所用，術語「抗原決定子 」與「抗原」及「抗原決定基」同義且係指多肽大分子上的位點(例如連續胺基酸區段或由非連續胺基酸之不同區域構成的構形組態)，抗原結合部分結合至該位點，從而形成抗原結合部分-抗原複合物。適用的抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞表面上、病毒所感染細胞之表面上、其他病變細胞表面上、免疫細胞表面上、游離於血清中及/或胞外基質中(ECM)。除非另外指明，否則在本文中適用作抗原之蛋白質可以為來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之蛋白質的任何原生形式。在一個特定實施例中，抗原為人類蛋白質。在本文中提及特定蛋白質的情況下，該術語涵蓋未處理的「全長」蛋白質，以及在細胞中處理而得到的任何蛋白質形式。該術語亦涵蓋天然存在之蛋白質變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
「特異性結合 」意謂結合對於抗原而言具選擇性且可有別於非所需或非特異性相互作用。抗原結合分子結合至特定抗原的能力可以經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))。在一個實施例中，抗原結合分子對不相關蛋白質之結合程度小於抗原結合分子對抗原結合的約10%，如藉由例如SPR所量測。在某些實施例中，結合至抗原之分子的解離常數(Kd)為≤ 1 μM、≤ 100 nM、≤ 10 nM、≤ 1 nM、≤ 0.1 nM、≤ 0.01 nM或≤ 0.001 nM (例如10- 8 M或更低，例如10- 8 M至10- 13 M，例如10- 9 M至10- 13 M)。
「親和力 」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間非共價相互作用力之總和。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1:1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y的親和力一般可由解離常數(Kd)表示，該解離常數為解離速率常數與結合速率常數(分別為koff 與 kon )之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同。可藉由此項技術中已知之常見方法(包括本文所述之方法)量測親和力。一種用於測量親和力的特定方法為表面電漿子共振(SPR)。
如本文所用，「腫瘤相關抗原 」或TAA係指目標細胞(例如腫瘤細胞，諸如癌細胞、腫瘤基質細胞、惡性B淋巴球或黑色素瘤細胞)表面上所呈遞的抗原決定子。在某些態樣中，目標細胞抗原為腫瘤細胞表面上的抗原。在一個態樣中，TAA係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、葉酸受體α (FolR1)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)、p95HER2、EpCAM、HER3、CD30或TPBG (5T4)、CD19、CD79b、CD20、CD22、CD37、CD38、BCMA及GPRC5D。在一個特定態樣中，TAA係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、葉酸受體α (FolR1)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)及p95HER2。在另一特定態樣中，TAA係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、EpCAM、HER3、CD30或TPBG (5T4)。在一個特定態樣中，腫瘤相關抗原為纖維母細胞活化蛋白(FAP)或癌胚抗原(CEA)。在一個態樣中，TAA為選自由以下組成之群的B細胞表面抗原：CD19、CD79b、CD20、CD22及CD37，尤其CD19及CD79b。在一個態樣中，TAA為選自由CD38、BCMA及GPRC5D組成之群的多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原。
除非另外指明，否則術語「纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 」，亦稱為脯胺醯基內肽酶FAP或纖維母細胞活化蛋白(EC 3.4.21)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生FAP。該術語涵蓋未處理之「全長」FAP以及在細胞中處理而產生之任何FAP形式。該術語亦涵蓋天然存在之FAP變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，本發明之抗原結合分子能夠特異性結合至人類、小鼠及/或食蟹獼猴FAP。人類FAP之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q12884 (149版，SEQ ID NO：2)或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeqNP_004451.2中。人類FAP之胞外域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置760。His標記之人類FAP ECD之胺基酸序列展示於SEQ ID NO：135中。小鼠FAP之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P97321 (126版，SEQ ID NO：136)或NCBI RefSeq NP_032012.1中。小鼠FAP之胞外域(ECD)自胺基酸位置26延伸至胺基酸位置761。SEQ ID NO：137展示His標記之小鼠FAP ECD之胺基酸序列。SEQ ID NO 138展示His標記之食蟹獼猴FAP ECD的胺基酸序列。本發明之抗FAP結合分子較佳結合至FAP胞外域。
除非另外指明，否則術語「癌胚抗原 ( CEA ) 」，亦稱為癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CEA。人類CEA之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P06731 (151版，SEQ ID NO：3)中。CEA長久以來已鑑別為腫瘤相關抗原(Gold及Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965；Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002)。CEA最初歸類為僅表現於胎兒組織中之蛋白質，現已在若干正常成人組織中鑑別。此等組織主要來源於上皮，包括胃腸、呼吸道及泌尿道之細胞，以及結腸、子宮頸、汗腺及前列腺之細胞(Nap等人, Tumour Biol., 9(2-3):145-53, 1988；Nap等人, Cancer Res., 52(8):2329-23339, 1992)。上皮來源之腫瘤以及其轉移含有CEA作為腫瘤相關抗原。儘管CEA本身的存在並不表明轉型為癌細胞，但表明CEA之分佈。在正常組織中，CEA通常表現於細胞之頂端表面上(Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999))，使得血流中之抗體不可及。與正常組織形成對比，CEA傾向於在癌細胞之整個表面上表現(Hammarström S., Semin Cancer Biol. 9(2):67-81 (1999))。表現模式之此變化使得CEA可被結合於癌細胞中之抗體企及。另外，癌細胞中的CEA表現增加。此外，增強的CEA表現促進細胞間黏附增強，此可能導致轉移(Marshall J., Semin Oncol., 30(增刊8):30-6, 2003)。多種腫瘤實體中之CEA表現的盛行率通常極高。根據公開的資料，對組織樣品進行之自身分析證實其盛行率高，在結腸直腸癌(CRC)中為約95%，在胰臟癌中為90%，在胃癌中為80%，在非小細胞肺癌(NSCLC，其中其與HER3共表現)中為60%且在乳癌中為40%；在小細胞肺癌及神經膠母細胞瘤中發現低表現。
CEA容易自細胞表面裂解且自腫瘤直接進入血流或經由淋巴管進入血流。由於此特性，因此血清CEA含量已用作診斷癌症及篩選癌症(尤其結腸直腸癌)復發之臨床標記(Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992；Chau I.等人, J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004；Flamini等人, Clin Cancer Res；12(23):6985-6988, 2006)。
除非另外指明，否則術語「上皮細胞黏附分子 ( EpCAM ) 」係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何原生EpCAM。該術語涵蓋未處理的「全長」EpCAM以及在細胞中處理而產生的任何EpCAM形式。該術語亦涵蓋天然存在的EpCAM變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。在一個實施例中，本發明之抗原結合分子能夠特異性結合至人類、小鼠及/或食蟹獼猴EpCAM。人類EpCAM之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號P16422 (167版，SEQ ID NO：68)，或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_002345.2中。小鼠EpCAM之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q99JW5 (111版，SEQ ID NO：75)，或NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_032558.2中。上皮細胞黏附分子(EpCAM)，亦稱為腫瘤相關鈣信號轉導子1 (TACSTD1)、17-1A及CD326，為約40 kDa的I型跨膜醣蛋白，其通常在上皮來源之癌症中及被癌症幹細胞過度表現，且因此為治療及診斷之重要關注分子。胞外域EpCAM可以裂解而產生可溶性胞外域分子EpEX，及胞內分子EpICD。EpICD已展示與其他蛋白質結合而形成核複合物，該複合物上調基因表現，促進細胞增殖。EpCAM亦可涉及上皮向間葉細胞的轉變(EMT)，且可以促成大規模轉移形成。
「CD30 」或「TNFRSF8」為腫瘤壞死因子受體超家族成員。其特徵為表現於某些造血性惡性病中，包括退行性大細胞淋巴瘤及霍奇金氏淋巴瘤等。研究工作已聚焦於正常與惡性淋巴細胞上的CD30表現，以瞭解CD30上調的發病機制、其經由抗細胞凋亡機制對淋巴瘤發生的貢獻，及其對細胞存活的影響。鑒於CD30侷限於某些腫瘤類型，因此已對其進行邏輯延伸以嘗試利用其作為治療目標。CD30為屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的120 kD跨膜醣蛋白受體，其具有胞內域、跨膜域及胞外域，且人類CD30之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P28908 (SEQ ID NO：472)中。
術語「TPBG 」係指滋養層醣蛋白，亦稱為「5T4」。TBPG為涉及細胞黏附的富白胺酸跨膜醣蛋白。在成人中，此蛋白質在許多腫瘤細胞中高度表現且與許多癌症之不良臨床結果相關。除非另外指明，否則其係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何原生TPBG。人類TPBG之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號Q13641 (SEQ ID NO：473)中。
術語「FolR1 」係指葉酸受體α且已經鑑別為多種癌症中之潛在預後及治療目標。除非另外指明，否則其係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何原生FolR1。人類FolR1之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P15328 (SEQ ID NO：139)中，鼠類FolR1具有UniProt寄存編號P35846 (SEQ ID NO：140)之胺基酸序列，且食蟹獼猴FolR1具有如UniProt寄存編號G7PR14 (SEQ ID NO：141)中所示之胺基酸序列。FolR1為細胞之質膜上所表現的N-糖基化蛋白。FolR1對葉酸及若干經還原之葉酸衍生物具有高親和力且介導生理性葉酸5-甲基四氫葉酸遞送至細胞內部。FOLR1為FOLR1定向癌症療法之所需目標，原因為其在絕大部分卵巢癌以及許多子宮癌、子宮內膜癌、胰臟癌、腎癌、肺癌及乳癌中過度表現，而FOLR1在正常組織上之表現侷限於腎臟近端小管、肺之肺泡肺細胞、膀胱、睪丸、脈絡叢及甲狀腺中的上皮細胞之頂端膜。近期研究已鑑別，三陰性乳癌中的FolR1表現特別高(Necela等人，PloS One 2015, 10(3), e0127133)。
除非另外指明，否則術語「黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖 ( MCSP ) 」，亦稱為硫酸軟骨素蛋白聚糖4 (CSPG4)，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生MCSP。人類MCSP之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號Q6UVK1 (103版，SEQ ID NO：142)中。MCSP為由以下組成的高度糖基化整合膜硫酸軟骨素蛋白聚糖：N上連接的280 kDa醣蛋白組分及細胞膜上所表現的450 kDa硫酸軟骨素蛋白聚糖組分(Ross等人,Arch . Biochem . Biophys . 1983 , 225:370-38)。MCSP更廣泛地分佈於許多正常及轉型細胞中。特定言之，在表皮之幾乎所有基底細胞中發現MCSP。MCSP有差別地表現於黑色素瘤細胞中，且發現其表現於所分析的超過90%之良性痣及黑色素瘤病灶中。亦發現MCSP表現於非黑色素細胞來源之腫瘤中，包括基底細胞癌、神經脊來源之多種腫瘤，及乳癌。
除非另外指明，否則術語「表皮生長因子受體 ( EGFR ) 」，亦稱為原癌基因c-ErbB-1或受體酪胺酸-蛋白激酶erbB-1，係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生EGFR。人類EGFR之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P00533 (211版，SEQ ID NO：143)中。原癌基因「HER2 」(人類表皮生長因子受體2)編碼與人類表皮生長因子受體相關且有些同源之蛋白質酪胺酸激酶(p185HER2)。HER2在該領域中亦已知為c-erbB-2，且有時已知為大鼠同源物之名稱neu。HER2之擴增及/或過度表現與多種人類惡性疾病相關且在整體上似乎涉及25-30%人類乳癌及卵巢癌之進展。此外，擴增程度與所觀測之患者中值存活時間負相關(Slamon, D. J.等人, Science 244:707-712 (1989))。人類HER2之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P04626 (230版，SEQ ID NO：144)中。如本文所用，術語「p95HER2 」係指HER2受體蛋白之羧基端片段(CTF)，其亦稱為「611-CTF」或「100-115 kDa p95HER2」。在細胞中經由在全長HER2分子之密碼子位置611起始HER2 mRNA轉譯而產生p95HER2片段(Anido等人, EMBO J 25；3234-44 (2006))。其具有100至115 kDa之分子量且在細胞膜表現，其中其可以形成藉由分子間二硫鍵維持的均二聚體(Pedersen等人, Mol Cell Biol 29, 3319-31 (2009))。人類p95HER2之例示性序列明示於SEQ ID NO：145中。
「HER3 」或「ErbB3 」(人類表皮生長因子受體3)，如受體酪胺酸激酶家族之其他成員，係由胞外域、跨膜域及胞內域組成。胞外域含有四個亞域(I-IV)。亞域I及III富含白胺酸且主要參與配位體結合。亞域II及IV富含半胱胺酸且很可能經由二硫鍵形成來促成蛋白質構形及穩定性。亞域II亦含有二聚體形成所需的二聚環。細胞質域含有近膜區段、激酶域及C端域。雖然尚未發現有證據表明ErbB3過度表現、組成性活化或單獨突變為致癌的(https://en.wikipedia.org/wiki/ERBB3 - cite_note-pmid8632008-18)，但該蛋白質作為雜二聚搭配物(最關鍵的是與ErbB2)牽涉到生長、增殖、化學治療抗性，以及侵入及轉移的促進。ErbB3與許多癌症的靶向治療抗性相關。人類HER3之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P21860 (224版，SEQ ID NO：471)中。
如本文所用，「B 細胞表面抗原 」係指B淋巴球(特定言之，惡性B淋巴球，在此情況下，該抗原亦稱為「惡性B細胞抗原」)之表面上所呈遞的抗原決定子。就血液學惡性贅瘤之免疫療法而言，若干B細胞表面抗原受到關注。在一個態樣中，B細胞表面抗原選自由以下組成之群：CD19、CD79b、CD20、CD22及CD37。
除非另外指明，否則術語「CD19 」係指B淋巴球抗原CD19，亦稱為B淋巴球表面抗原B4或T細胞表面抗原Leu-12且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD19。人類CD19之胺基酸序列展示於UniProt寄存編號P15391 (160版，SEQ ID NO：434)中。該術語涵蓋未處理的「全長」人類CD19以及在細胞中處理而產生的任何人類CD19形式，只要如本文所報導之抗體結合至其即可。CD19為結構上不同的細胞表面受體，其表現於人類B細胞(包括(但不限於)前B細胞、早期發育之B細胞(亦即，不成熟B細胞)、經由終末分化為漿細胞之成熟B細胞，及惡性B細胞)之表面上。CD19表現於大部分前B急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病(CLL)、前淋巴球性白血病、毛細胞白血病、普通急性淋巴球性白血病，及一些剔除式急性淋巴母細胞性白血病。CD19表現於漿細胞上進一步表明其可以表現於分化的B細胞腫瘤(諸如多發性骨髓瘤)上。因此，CD19抗原為治療非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病及/或急性淋巴母細胞白血病之免疫療法之目標。
除非另外指明，否則「CD79b 」係指B細胞抗原受體複合物相關蛋白β鏈，亦稱為Ig-β或B細胞特異性醣蛋白B29，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何原生CD79b。人類CD79b之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P40259 (180版，SEQ ID NO：435)中。CD79b為僅僅表現於B細胞上的39 KDa蛋白質且與CD79a協同起始BCR下游的信號轉導級聯，從而引起BCR複合物內化、其向核內體的易位，及抗原呈遞。CD79 (由亞單元CD79a及CD79b構成)為B細胞受體之雜二聚信號轉導組分，其廣泛表現於成熟B細胞淋巴瘤中且藉由最早定型之B細胞祖細胞(表現免疫球蛋白μ之前)置於細胞表面上。術語「CD79b」涵蓋未處理之「全長」CD79b以及在細胞中處理而產生的任何CD79b形式。該術語亦涵蓋天然存在的CD79b變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
除非另外指明，否則術語「CD20 」係指B淋巴球抗原CD20，亦稱為B淋巴球表面抗原B1或白血球表面抗原Leu-16且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD20。人類CD20之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P11836 (149版，SEQ ID NO：436)中。CD20為前B及成熟B淋巴球上所表現之疏水性跨膜蛋白，其分子量為約35 kD。對應的人類基因為跨膜4域，亞家族A成員1，亦稱為MS4A1。此基因編碼跨膜4A基因家族成員。此新生蛋白質家族之成員的特徵為共同結構特徵及類似的內含子/外顯子剪接邊界且在造血細胞及非淋巴組織中顯示獨特的表現模式。此基因編碼B淋巴球表面分子，該分子在B細胞發育且分化為漿細胞時發揮作用。在家族成員之叢集中，此家族成員侷限於11q12。此基因之替代性剪接產生編碼相同蛋白質之兩種轉錄物變異體。術語「CD20」涵蓋未處理之全長CD20以及在細胞中處理而產生之任何CD20形式。該術語亦涵蓋天然存在的CD20變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
除非另外指明，否則「CD22 」係指B細胞受體CD22，亦稱為B淋巴球細胞黏附分子或SIGLEC2，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何原生CD22。人類CD22之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P20273 (209版，SEQ ID NO：437)中。CD22為屬於SIGLEC凝集素家族的分子且發現於成熟B細胞表面上及較小程度地發現於一些不成熟B細胞上。CD22因此為130-150 kDa之侷限於B細胞之細胞表面磷酸化醣蛋白且能夠調節B淋巴球抗原受體(BCR)介導的信號，以及BCR非依賴信號之產生。術語「CD22」涵蓋未處理之「全長」CD22以及在細胞中處理而產生之任何CD22形式。該術語亦涵蓋天然存在的CD22變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
除非另外指明，否則術語「CD37 」係指白血球抗原CD37，亦稱為四跨膜蛋白-26 (Tspan-26)，且包括來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生CD37。人類CD37之胺基酸序列展示於Uniprot寄存編號P11049 (162版，SEQ ID NO：438)中。CD37表現侷限於免疫系統之細胞，在成熟B細胞上的豐度最高且在T細胞及骨髓細胞上的表現發現較低。醣蛋白CD37為跨膜4超家族成員且控制體液與細胞免疫反應。術語「CD37」涵蓋未處理之「全長」CD37以及在細胞中處理而產生之任何CD37形式。該術語亦涵蓋天然存在的CD37變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。
如本文所用，「多發性骨髓瘤 ( MM ) 細胞表面抗原 」係指多發性骨髓瘤(MM)細胞表面上所呈遞的抗原決定子。就多發性骨髓瘤之免疫療法而言，若干MM細胞表面抗原受到關注。在一個態樣中，MM細胞表面抗原選自由CD38、BCMA及GPRC5D組成之群。
術語「CD38 」，亦稱為分化叢集38或環狀ADP核糖羥化酶，為一種醣蛋白，其發現於多種免疫細胞(白血球)之表面上，包括CD4+、CD8+、B淋巴球及自然殺手細胞。CD38亦在細胞黏附、信號轉導及鈣信號傳導方面起作用。在正常條件下，CD38以相對較低水準表現於骨髓及淋巴細胞及一些非造血組織中。相比之下，正常漿細胞及多發性骨髓瘤(MM)細胞的CD38表現量較高，使得CD38成為靶向MM之細胞表面分子的受關注之目標。除非另外指明，否則如本文所用，CD38係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何CD38蛋白質。人類CD38之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號P28907 (SEQ ID NO：474)中。
術語「BCMA 」係指B細胞成熟抗原，亦稱為腫瘤壞死因子受體超家族成員17 (TNFRS17)，且為不含信號肽且含有富半胱胺酸胞外域的III型跨膜蛋白。BCMA以顯著較高的水準表現於所有患者MM細胞中，但不表現於其他正常組織上(除正常漿細胞之外)。BCMA以及兩種相關的TNFR超家族B細胞活化因子受體(BAFF-R)及跨膜活化因子及鈣調節因子及親環素配位體相互作用因子(TACI)，至關重要地調控B細胞增殖及存活以及成熟及分化成漿細胞。此等在功能上相關的三種受體藉由結合至BAFF及/或APRIL (其同源配位體)來支持不同發育階段之B細胞的長期存活。除非另外指明，否則如本文所用，BCMA係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))的任何BCMA蛋白。人類BCMA之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q02223 (SEQ ID NO：475)中。
術語「GPRC5D 」係指G蛋白偶合受體C類第5組成員D，利用RNA測序自多發性骨髓瘤之漿細胞鑑別的目標。已報導GPRC5D與多發性骨髓瘤患者之不良預後及腫瘤負荷相關。除非另外指明，否則GPRC5D係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何GPRC5D蛋白。人類GPRC5D之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q9NZD1 (SEQ ID NO：476)中。
除非另外指明，否則術語「CD28 」(分化叢集28，Tp44)係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)的任何CD28蛋白質。CD28表現於T細胞上且提供T細胞活化及存活所需之共刺激信號。除T細胞受體(TCR)之外亦經由CD28發生的T細胞刺激可以提供有效信號來產生多種介白素。CD28為CD80 (B7.1)及CD86 (B7.2)蛋白質之受體且為初始T細胞上組成型表現的唯一B7受體。人類CD28之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號P10747 (SEQ ID NO：1)中。
「促效抗體 」係指包含針對指定受體之促效功能的抗體。一般而言，當促效劑配位體(因子)結合至受體時，受體蛋白之三級結構發生變化，且受體被活化(當受體為膜蛋白時，細胞生長信號或此類信號通常被轉導)。若受體為形成二聚體的類型，則促效抗體可以使受體以適當的距離及角度發生二聚，從而起到類似於配位體的作用。適當的抗受體抗體可以模擬配位體實施的受體二聚合，且因此可以變成促效抗體。
「CD28 促效抗原結合分子 」或「CD28習知促效抗原結合分子」為模擬CD28天然配位體(CD80或CD86)在T細胞受體信號(「信號2」)存在下增強T細胞活化之作用的抗原結合分子。T細胞需要兩種信號來變得完全活化。在生理條件下，「信號1」係由T細胞受體(TCR)分子與抗原呈遞細胞(APC)上之肽/主要組織相容複合體(MHC)複合物相互作用而產生且「信號2」係由共刺激受體(例如CD28)接合而提供。CD28促效抗原結合分子能夠共刺激T細胞(信號2)。其與特異性針對TCR複合物之分子組合，亦能夠誘導T細胞增殖及細胞介素分泌，然而CD28促效抗原結合分子在不額外刺激TCR的情況下不能完全地活化T細胞。然而，存在CD28特異性抗原結合分子之亞類，所謂的CD28超促效抗原結合分子。「CD28 超促效抗原結合分子 」為在不額外刺激TCR的情況下能夠完全地活化T細胞的CD28抗原結合分子。CD28超促效抗原結合分子在不預先進行T細胞活化(信號1)的情況下能夠誘導T細胞增殖及細胞介素分泌。
術語「可變域 」或「可變區」係指抗體重鏈或輕鏈中之涉及抗原結合分子結合至抗原的結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域一般具有類似的結構，其中各域包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)。參見例如Kindt等人, Kuby Immunology, 第6版, W.H. Freeman and Co., 第91頁(2007)。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗原結合可變域中序列高變且決定抗原結合特異性之每一個區域，例如「互補決定區」(「CDR」)。一般而言，抗原結合域包含六個CDR：三個在VH中(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，且三個在VL中(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中之例示性CDR包括： (a)存在於胺基酸殘基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)及96-101 (H3)處之高變環(Chothia及Lesk,J . Mol . Biol . 196:901-917 (1987))； (b)存在於胺基酸殘基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)及95-102 (H3)處之CDR (Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版. 美國公共衛生署(Public Health Service), 美國國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991))； (c)存在於胺基酸殘基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)及93-101 (H3)處之抗原接點(MacCallum等人，J . Mol . Biol . 262：732-745 (1996))。
除非另外指明，否則CDR係根據Kabat等人(同上)確定。熟習此項技術者應理解，CDR名稱亦可根據Chothia (同上)；McCallum (同上)，或科學上可接受的任何其他命名法確定。Kabat等人亦定義適用於任何抗體的可變區序列編號系統。一般技術者可以向任何可變區序列明確地指定此「Kabat編號」系統，而不依賴於序列本身以外的任何實驗資料。如本文所用，「Kabat編號」係指Kabat等人，美國健康及人類服務部(U.S. Dept. of Health and Human Services),「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)所闡述之編號系統。除非另外說明，否則提及抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置的編號係依據Kabat編號系統。
如本文所用，在抗原結合分子(例如抗體)之上下文中，術語「親和力成熟 」係指衍生自參考抗原結合分子(例如藉由突變來衍生)之抗原結合分子與參考抗體結合至相同的抗原，較佳結合至相同的抗原決定基；且對抗原的親和力高於參考抗原結合分子。親和力成熟通常涉及對抗原結合分子之一或多個CDR中的一或多個胺基酸殘基進行修飾。典型地，親和力成熟的抗原結合分子與初始參考抗原結合分子結合至相同的抗原決定基。
「構架 」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，在VH (或VL)中，HVR及FR序列一般依以下序列呈現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
用於本文目的之「受體人類構架 」為一種構架，其包含自如下文所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架衍生之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架的胺基酸序列。自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架「衍生」的受體人類構架可包含與人類免疫球蛋白構架或人類共同構架相同之胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化數目為10個或更少、9個或更少、8個或更少、7個或更少、6個或更少、5個或更少、4個或更少、3個或更少，或2個或更少。在一些實施例中，VL受體人類構架的序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。
術語「嵌合 」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分特來源於定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種的抗體。
抗體「類別 」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1 、IgG2 、IgG3 、IgG4 、IgA1 及IgA2 。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
「人類化 」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且典型地兩個可變域之基本上全部，其中全部或基本上全部HVR (例如CDR)皆對應於非人類抗體之HVR，且全部或基本上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含衍生自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式 」係指已經歷人類化之抗體。本發明所涵蓋之「人類化抗體」之其他形式為其中恆定區已另外經修飾或相對於原始抗體之恆定區已發生變化以產生根據本發明之特性(尤其在C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合方面)的彼等形式。
「人類 」抗體為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特別排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
術語「CH1 域 」表示抗體重鏈多肽之一部分，其大約自EU位置118延伸至EU位置215 (根據Kabat的EU編號系統)。在一個態樣中，CH1域具有胺基酸序列ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKV (SEQ ID NO：477)。通常，利用具有EPKSC之胺基酸序列(SEQ ID NO：480)的區段將CH1域連接至鉸鏈區。
術語「鉸鏈區 」表示抗體重鏈多肽的一部分，其使CH1域與CH2域連接成野生型抗體重鏈，例如約位置216至約位置230 (根據Kabat EU編號系統)，或約位置226至約位置230 (根據Kabat EU編號系統)。其他IgG亞類的鉸鏈區可以藉由與IgG1亞類序列之鉸鏈區半胱胺酸殘基比對來確定。鉸鏈區通常為由具有一致胺基酸序列之兩個多肽組成的二聚合分子。鉸鏈區通常包含至多25個胺基酸殘基且具有柔性，從而允許所結合之目標結合位點獨立移動。可將鉸鏈區細分為三個域：上鉸鏈域、中鉸鏈域及下鉸鏈域(參見例如Roux等人, J. Immunol. 161 (1998) 4083)。
在一個態樣中，鉸鏈區具有胺基酸序列DKTHTCPXCP (SEQ ID NO：481)，其中X為S或P。在一個態樣中，鉸鏈區具有胺基酸序列HTCPXCP (SEQ ID NO：482)，其中X為S或P。在一個態樣中，鉸鏈區具有胺基酸序列CPXCP (SEQ ID NO：483)，其中X為S或P。
術語「Fc 域 」或「Fc區」在本文中用於定義抗體重鏈中含有恆定區之至少一部分的C端區域。該術語包括原生序列Fc區及變異型Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3域。
人類IgG Fc區之「CH2域」通常自大約EU位置231之胺基酸殘基延伸至大約EU位置340之胺基酸殘基(根據Kabat之EU編號系統)。在一個態樣中，CH2域具有胺基酸序列APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAK (SEQ ID NO：478)。CH2域之獨特之處在於其與另一個域並非緊密成對。實情為，兩個N連接的分支碳水化合物鏈插入完整原生Fc區之兩個CH2域之間。已推測碳水化合物可向域-域成對提供替代物且有助於CH2域穩定化。Burton, Mol. Immunol. 22 (1985) 161-206。在一個實施例中，碳水化合物鏈連接至CH2域。CH2域在本文中可為原生序列CH2域或變異型CH2域。
「CH3域」包含Fc區中之CH2域的C端殘基區段，表示抗體重鏈多肽的一部分，該部分大約自EU位置341延伸至EU位置446 (根據Kabat之EU編號系統)。在一個態樣中，CH3域具有胺基酸序列GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO：479)。本文中之CH3區可為原生序列CH3域或變異型CH3域(例如其一條鏈中引入有「隆凸」(「杵」)且其另一條鏈中引入有相應「空腔」(「臼」)的CH3域；參見美國專利第5,821,333號，該專利明確地以引用之方式併入本文中)。此類變異型CH3域可用於促進如本文中所述之兩個不一致抗體重鏈發生雜二聚。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區之胺基酸殘基編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公共衛生署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991)中所述。
「臼包杵 」技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法包括在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應空腔(「臼」)，使得隆凸可定位於空腔中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築隆凸。大小與隆凸相同或相似的補償性空腔係藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而產生於第二多肽之界面中。隆凸及空腔可藉由改變編碼多肽之核酸(例如藉由定點突變誘發)或藉由肽合成來產生。在一個特定實施例中，杵修飾包含Fc域之兩個亞單元之一中的胺基酸取代T366W，且臼修飾包含Fc域之兩個亞單元中之另一者中的胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一特定實施例中，包含杵修飾之Fc域的亞單元另外包含胺基酸取代S354C，且包含臼修飾之Fc域的亞單元另外包含胺基酸取代Y349C。引入此兩個半胱胺酸殘基使得Fc區之兩個亞單元之間形成二硫橋鍵，由此進一步穩定二聚體(Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001))。
「與免疫球蛋白之Fc區等效的區域」意欲包括免疫球蛋白Fc區之天然存在的對偶基因變異體以及具有變化之變異體，該等變化產生取代、添加或缺失，但基本上不減少免疫球蛋白介導效應功能(諸如抗體依賴性細胞毒性)之能力。舉例而言，免疫球蛋白Fc區之N端或C端可以缺失一或多個胺基酸而生物功能無實質性損失。此類變異體可以根據此項技術中已知之通用規則選擇以便對活性產生的影響最小(參見例如Bowie, J. U.等人, Science 247:1306-10 (1990))。
術語「野生型 Fc 域 」表示與自然界中發現之Fc域之胺基酸序列一致的胺基酸序列。野生型人類Fc域包括原生人類IgG1 Fc區(非A異型及A異型)、原生人類IgG2 Fc區、原生人類IgG3 Fc區，及原生人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。野生型Fc區表示為SEQ ID NO：484 (IgG1，白種人異型)、SEQ ID NO：485 (IgG1，非裔美國人異型)、SEQ ID NO：486 (IgG2)、SEQ ID NO：487 (IgG3)及SEQ ID NO：488 (IgG4)。
術語「變異型 ( 人類 ) Fc 域 」表示與「野生型」(人類) Fc域胺基酸序列不同之處在於至少一個「胺基酸突變」的胺基酸序列。在一個態樣中，變異型Fc區相較於原生Fc區具有至少一個胺基酸突變，例如約一個至約十個胺基酸突變，且在一個態樣中，相較於原生Fc區具有約一個至約五個胺基酸突變。在一個態樣中，(變異型) Fc區與野生型Fc區具有至少約95%同源性。
術語「效應功能 」係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性，其因抗體同型而異。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合體介導抗原呈遞細胞攝入抗原、細胞表面受體(例如B細胞受體)下調及B細胞活化。
抗體Fc區與Fc受體(FcR)(其為造血細胞上的專門化細胞表面受體)的相互作用可以介導Fc受體結合依賴性效應功能。Fc受體屬於免疫球蛋白超家族，且已展示藉由免疫複合物之吞噬來介導經抗體塗覆之病原體移除，及經由抗體依賴性細胞毒性(ADCC)介導紅血球及經相應抗體塗覆之多種其他細胞目標(例如腫瘤細胞)溶解 (參見例如Van de Winkel, J.G.及Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524)。FcR係根據其對免疫球蛋白同型之特異性定義：針對IgG抗體之Fc受體稱為FcγR。Fc受體結合描述於例如Ravetch, J.V.及Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492；Capel, P.J.等人, Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, M.等人, J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341；及Gessner, J.E.等人, Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248。
受體對IgG型抗體Fc區的交聯(FcγR)觸發多種效應功能，包括吞噬、抗體依賴性細胞毒性，及炎性介體釋放，以及免疫複合物清除及對抗體產生的調控。人類中的三類FcγR已表徵，其為： - FcγRI (CD64)以高親和力結合單體IgG且在巨噬細胞、單核球、嗜中性球及嗜伊紅血球上表現。Fc區IgG中之胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327及P329 (根據Kabat之EU索引編號)中之至少一者的修飾使得對FcγRI的結合減少。將IgG2位置233-236之殘基代入IgG1及IgG4使得對FcγRI的結合減少10³倍且消除人類單核球對抗體敏化紅血球的反應(Armour, K.L.等人, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624)。 -FcγRII (CD32)以中至低親和力結合複合的IgG且受到廣泛表現。此受體可分為兩種亞型：FcγRIIA及FcγRIIB。在涉及殺滅作用之許多細胞(例如巨噬細胞、單核球、嗜中性球)上發現FcγRIIA且FcγRIIA似乎能夠活化殺滅過程。FcγRIIB似乎在抑制過程中起作用且發現於B細胞、巨噬細胞上及肥大細胞及嗜伊紅血球上。在B細胞上，其作用似乎為抑制免疫球蛋白進一步產生及同型轉換為例如IgE類別。在巨噬細胞上，FcγRIIB用以抑制如經由FcγRIIA介導的吞噬。在嗜伊紅血球及肥大細胞上，B形式可以經由IgE結合至其各別受體而有助於抑制此等細胞活化。發現對FcγRIIA的結合減少，例如IgG Fc區至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292及K414 (根據Kabat EU索引編號)之一處具有突變的抗體。 - FcγRIII (CD16)以中至低親和力結合IgG，且以兩種類型存在。FcγRIIIA發現於NK細胞、巨噬細胞、嗜伊紅血球及一些單核球及T細胞上且介導ADCC。FcγRIIIB高度表現於嗜中性球上。發現對FcγRIIIA的結合減少，例如IgG Fc區至少在胺基酸殘基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338及D376 (根據Kabat EU索引編號)之一處具有突變的抗體。
人類IgG1上之針對Fc受體之結合位點的定位、上述突變位點及用於量測對FcγRI及FcγRIIA之結合的方法描述於Shields, R.L.等人, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604中。
術語「ADCC 」或「抗體依賴性細胞毒性」為一種免疫機制，其引起免疫效應細胞溶解經抗體塗覆的目標細胞。目標細胞為包含Fc區之抗體或其衍生物特異性結合(一般經由Fc區N端之蛋白質部分結合)的細胞。如本文所用，術語「減少之ADCC」定義為在目標細胞周圍之介質中、在指定的抗體濃度下、在指定時間內、藉由上文所定義之ADCC機制溶解之目標細胞數目減少，及/或在目標細胞周圍之介質中，在指定時間內、藉由ADCC機制達成指定數目個目標細胞溶解所必需的抗體濃度增加。ADCC減少係相對於由同類型宿主細胞使用相同的標準生產、純化、調配及儲存方法(熟習此項技術者已知)所產生、但尚未經工程改造之相同抗體介導的ADCC而言。舉例而言，Fc域中包含減少ADCC之胺基酸取代的抗體所介導之ADCC減少係相對於Fc域中無此胺基酸取代之相同抗體所介導的ADCC而言。適於量測ADCC的分析在此項技術中已熟知(參見例如PCT公開案第WO 2006/082515號或PCT公開案第WO 2012/130831號)。藉由量測對Fcγ受體表現細胞(諸如重組表現FcγRI及/或FcγRIIA的細胞或NK細胞(基本上表現FcγRIIIA))的結合來探究抗體誘導初始介導ADCC步驟的能力。特定言之，量測對NK細胞上之FcγR的結合。
「活化 Fc 受體 」為一種Fc受體，其與抗體Fc區接合之後，引發信號傳導事件，刺激攜帶受體之細胞執行效應功能。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI (CD64)、FcγRIIa (CD32)及FcαRI (CD89)。特定活化Fc受體為人類FcγRIIIa (參見UniProt寄存編號P08637，141版)。
「胞外域 」為膜蛋白中之延伸至細胞外空間(亦即，目標細胞外之空間)的域。胞外域通常為蛋白質中之起始與表面接觸、引起信號轉導的部分。
術語「肽連接子 」係指包含一或多個胺基酸(典型地約2至20個胺基酸)的肽。肽連接子在此項技術中已知且描述於本文中。適合的非免疫原性連接肽為例如(G4 S)n 、(SG4 )n 或G4 (SG4 )n 肽連接子，其中「n」通常為1與5之間的數字，典型地在2與4之間，尤其為2，亦即，該等肽選自由以下組成之群：GGGGS (SEQ ID NO：146)、GGGGSGGGGS (SEQ ID NO：147)、SGGGGSGGGG (SEQ ID NO：148)及GGGGSGGGGSGGGG (SEQ ID NO：149)，而且包括序列GSPGSSSSGS (SEQ ID NO：150)、(G4S)3 (SEQ ID NO：151)、(G4S)4 (SEQ ID NO：152)、GSGSGSGS (SEQ ID NO：153)、GSGSGNGS (SEQ ID NO：154)、GGSGSGSG (SEQ ID NO：155)、GGSGSG (SEQ ID NO：156)、GGSG (SEQ ID NO：157)、GGSGNGSG (SEQ ID NO：158)、GGNGSGSG (SEQ ID NO：159)及GGNGSG (SEQ ID NO：160)。備受關注的肽連接子為(G4S) (SEQ ID NO：146)、(G4 S)2 或GGGGSGGGGS (SEQ ID NO：147)、(G4S)3 (SEQ ID NO：151)及(G4S)4 (SEQ ID NO：152)。
如本申請案內所用，術語「胺基酸 」表示天然存在之羧基α-胺基酸群組，包含丙胺酸(三字母碼：ala，單字母碼：A)、精胺酸(arg，R)、天冬醯胺(asn，N)、天冬胺酸(asp，D)、半胱胺酸(cys，C)、麩醯胺酸(gln，Q)、麩胺酸(glu，E)、甘胺酸(gly，G)、組胺酸(his，H)、異白胺酸(ile，I)、白胺酸(leu，L)、離胺酸(lys，K)、甲硫胺酸(met，M)、苯丙胺酸(phe，F)、脯胺酸(pro，P)、絲胺酸(ser，S)、蘇胺酸(thr，T)、色胺酸(trp，W)、酪胺酸(tyr，Y)及纈胺酸(val，V)。
「融合」或「連接」意謂組分(例如多肽及該TNF配位體家族成員之胞外域)藉由肽鍵(直接或經由一或多個肽連接子)連接。
相對於參考多肽(蛋白質)序列之「胺基酸序列一致性 百分比 (%) 」定義為在對準序列且必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將任何保守性取代視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中之與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術之技能內的各種方式達成，例如使用公開可獲得的電腦軟體，如BLAST、BLAST-2、ALIGN. SAWI或Megalign (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大對準所需的任何算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech, Inc.創作，且原始碼已隨使用者文件一起提交於美國版權局(U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559)，其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech, Inc., South San Francisco, California，或可自原始碼編譯。ALIGN-2程式應編譯用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均藉由ALIGN-2程序設定且不改變。在使用ALIGN-2比較胺基酸序列的情形中，如下計算所指定胺基酸序列A相對於、與或針對所指定胺基酸序列B的胺基酸序列一致性% (可以替代地稱為相對於、與或針對所指定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的所指定胺基酸序列A)：100乘以分數X/Y，其中X為藉由序列比對程式ALIGN-2、在該程式比對A與B時評為一致匹配之胺基酸殘基的數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%與B相對於A之胺基酸序列一致性%不相等。除非另外特定陳述，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值係使用ALIGN-2電腦程式，如剛剛前述的段落中所述獲得。
在某些實施例中，涵蓋本文所提供之CD28抗原結合分子的胺基酸序列變異體 。舉例而言，可能需要改良CD28抗原結合分子之結合親和力及/或其他生物特性。CD28抗原結合分子之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該等分子之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如抗體胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。為了獲得最終構築體，可以實現缺失、插入與取代的任何組合，其限制條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。所關注之取代型突變誘發位點包括HVR及構架(FR)。保守取代提供於表B中標題「較佳取代」項下且在下文中參考胺基酸側鏈類別(1)至(6)進一步描述。胺基酸取代可以引入所關注之分子中且根據所要活性(例如保持/改良之抗原結合、減少之免疫原性，或改良之ADCC或CDC)篩選產物。表 A
原始殘基 例示性取代 較佳取代
Ala (A) Val；Leu；Ile Val
Arg (R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn (N) Gln；His；Asp, Lys；Arg Gln
Asp (D) Glu；Asn Glu
Cys (C) Ser；Ala Ser
Gln (Q) Asn；Glu Asn
Glu (E) Asp；Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 Leu
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys (K) Arg；Gln；Asn Arg
Met (M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val；Ser Ser
Trp (W) Tyr；Phe Tyr
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 Leu
胺基酸可根據共同的側鏈特性分類： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。
術語「胺基酸序列變異體 」包括實質性變異體，其中在親本抗原結合分子(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基中存在胺基酸取代。一般而言，選用於進一步研究之所得變異體的某些生物特性相對於親本抗原結合分子將具有修改(例如改良)(例如增強的親和力、減少的免疫原性)且/或將基本上保持親本抗原結合分子之某些生物特性。例示性取代型變異體為親和力成熟抗體，其宜使用例如基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所述之彼等技術)來產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異型抗原結合分子，且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。在某些實施例中，一或多個HVR內可存在取代、插入或缺失，只要此類變化不實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，HVR中可發生不實質上減少結合親和力之保守變異(例如如本文所提供之保守取代)。一種適用於鑑別抗體中之可供突變誘發靶向之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells (1989)Science , 244:1081-1085所述。在此方法中，鑑別殘基或一組目標殘基(例如帶電荷殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且用中性或帶負電荷胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受到影響。可在對初始取代展現功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗原結合分子之晶體結構複合以鑑別抗體與抗原之間的接觸點。作為取代候選物，可以靶向或排除此類接觸殘基及鄰近殘基。可以篩選變異體以確定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有一百個或更多個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合體，以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。插入之實例包括與多肽之N端或C端融合的CD28抗原結合分子，從而延長CD28抗原結合分子之血清半衰期。
在某些實施例中，本文提供之CD28抗原結合分子經改變以增加或減少抗體糖基化程度。宜藉由改變胺基酸序列從而產生或移除一或多個糖基化位點來獲得分子之糖基化變異體。在促效ICOS結合分子包含Fc域之情況下，可改變與其連接的碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之原生抗體典型地包含分支雙觸角寡醣，其通常藉由N鍵聯連接至Fc區CH2域之Asn297。參見例如Wright等人,TIBTECH 15:26-32 (1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接至雙觸角寡醣結構之「莖」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可對促效ICOS結合分子中之寡醣進行修飾以便產生具有某些改良特性之變異體。在一個態樣中，提供碳水化合物結構缺乏連接(直接地或間接地)至Fc區之岩藻糖的促效ICOS結合分子變異體。此類海藻糖基化變異體可具有改良的ADCC功能，參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta, L.)或US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd)。本發明之CD28抗原結合分子的其他變異體包括具有對分之寡醣的變異體，例如其中與Fc區連接之雙觸角寡醣經GlcNAc平分。此類抗體變異體可具有減少之岩藻糖基化及/或經改良之ADCC功能， 參見例如WO 2003/011878 (Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；及US 2005/0123546 (Umana等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基連接至Fc區的抗體變異體。此類抗體變異體可以具有改良的CDC功能且描述於例如WO 1997/30087 (Patel等人)；WO 1998/58964 (Raju, S.)；及WO 1999/22764 (Raju, S.)。
在某些實施例中，可能需要產生本發明之CD28抗原結合分子的半胱胺酸工程化變異體 ，例如其中分子之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代的「thioMAb」。在特定實施例中，經取代之殘基存在於分子之可近接位點。藉由用半胱胺酸取代此等殘基，藉此將反應性硫醇基安置於抗體之可近接位點處且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生免疫結合物。在某些實施例中，以下殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)；重鏈之A118 (EU編號)；及重鏈Fc區之S400 (EU編號)。半胱胺酸工程化抗原結合分子可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生。
在某些態樣中，本文所提供之CD28抗原結合分子可經進一步修飾以含有此項技術中已知且可容易獲得之其他非蛋白性部分。適合於抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)，及聚葡萄糖或聚(N-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支或未分支的。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接超過一個聚合物，則聚合物可為相同或不同分子。一般而言，用於衍生化之聚合物的數目及/或類型可基於以下考慮因素來確定：包括(但不限於)待改良抗體之具體特性或功能、雙特異性抗體衍生物是否將用於限定條件下之療法等。在另一態樣中，提供抗體與非蛋白質部分之結合物，該非蛋白質部分可藉由暴露於輻射來選擇性地加熱。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam, N.W.等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605)。輻射可具有任何波長，且包括(但不限於)不傷害普通細胞、但將非蛋白質部分加熱至鄰近於抗體-非蛋白質部分之細胞被殺滅之溫度的波長。在另一態樣中，可獲得本文所提供之CD28抗原結合分子的免疫結合物。「免疫結合物 」為與一或多個異質分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)結合之抗體。
術語「聚核苷酸 」係指分離之核酸分子或構築體，例如信使RNA (mRNA)、病毒源RNA或質體DNA (pDNA)。聚核苷酸可包含習知磷酸二酯鍵或非習知鍵(例如醯胺鍵，諸如肽核酸(PNA)中所發現)。術語「核酸分子」係指聚核苷酸中存在的任一個或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。各核苷酸係由以下構成：鹼基，具體言之，嘌呤或嘧啶鹼基(亦即，胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))；糖(亦即，去氧核糖或核糖)；及磷酸酯基團。核酸分子通常用鹼基序列描述，因此該等鹼基代表核酸分子之一級結構(線性結構)。鹼基序列典型地係自5'至3'表示。在本文中，術語核酸分子涵蓋去氧核糖核酸(DNA)，包括例如互補DNA (cDNA)及基因組DNA；核糖核酸(RNA)，尤其信使RNA (mRNA)；合成形式之DNA或RNA；及包含兩個或更多個此等分子之混合型聚合物。核酸分子可呈線性或環狀。另外，術語核酸分子包括有義股與反義股，以及單股與雙股形式。另外，本文描述之核酸分子可含有天然存在或非天然存在之核苷酸。非天然存在之核苷酸之實例包括具有衍生化糖或磷酸酯主鏈鍵聯或經化學修飾之殘基的經修飾核苷酸鹼基。核酸分子亦涵蓋DNA及RNA分子，其適用作活體外及/或活體內(例如在宿主或患者中)直接表現本發明抗體之載體。此類DNA (例如cDNA)或RNA (例如mRNA)載體可以不修飾或經修飾。舉例而言，mRNA可經化學修飾以增強RNA載體之穩定性及/或所編碼分子之表現，以便可以將mRNA注射至個體中以在活體內產生抗體(參見例如Stadler等人, (2017) Nature Medicine 23:815-817，或EP 2 101 823 B1)。
「分離 」之核酸分子或聚核苷酸意指已自原生環境中移除的核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，編碼載體中所含之多肽的重組聚核苷酸視為經分離。分離之聚核苷酸的其他實例包括異質宿主細胞中所維持的重組聚核苷酸或溶液中經純化(部分或實質上)之聚核苷酸。分離之聚核苷酸包括通常含有聚核苷酸分子之細胞中所含的聚核苷酸分子，但聚核苷酸分子存在於染色體外或不同於其天然染色體位置之染色體位置。分離之RNA分子包括本發明的活體內或活體外RNA轉錄物，以及正股及負股形式，及雙股形式。本發明之經分離之聚核苷酸或核酸進一步包括合成方式產生的此類分子。另外，聚核苷酸或核酸可為或可包括調控元件，諸如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。
鑒於核酸或聚核苷酸的核苷酸序列與本發明之參考核苷酸序列至少(例如) 95%「一致」，因此希望聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，但其中聚核苷酸序列以參考核苷酸序列之每100個核苷酸計可以包括至多五個點突變。換言之，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95%一致的聚核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或參考序列中可插入佔參考序列核苷酸總數至多5%的多個核苷酸。參考序列之此等變化可發生於參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或彼等末端位置之間的任何位置，此等位置個別地散佈於參考序列殘基中或參考序列內的一或多個相連基團中。實際上，任何特定聚核苷酸序列是否與本發明之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致可習知地使用已知電腦程式確定，諸如上文針對多肽所論述的電腦程式(例如ALIGN-2)。
術語「表現卡匣 」係指使用允許特定核酸在目標細胞中發生轉錄的一系列指定核酸元件，以重組或合成方式產生的聚核苷酸。重組表現卡匣可併入質體、染色體、粒線體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表現載體之重組表現卡匣部分包括待轉錄的核酸序列及啟動子，以及其他序列。在某些實施例中，本發明之表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「載體 」或「表現載體」與「表現構築體」同義且係指用於引入特定基因且導引該特定基因表現的DNA分子，該DNA分子與該特定基因在目標細胞中可操作地結合。該術語包括載體作為自複製核酸結構，以及併入宿主細胞基因組中的載體，該基因組中已引入載體。本發明之表現載體包含表現卡匣。表現載體允許大量的穩定mRNA發生轉錄。一旦表現載體位於目標細胞內，則藉由細胞轉錄及/或轉譯機器產生由該基因編碼的核糖核酸分子或蛋白質。在一個實施例中，本發明之表現載體包含表現卡匣，該表現卡匣包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段的聚核苷酸序列。
術語「宿主細胞 」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指其中已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之後代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初始轉型細胞及來源於其之後代(不考慮繼代次數)。後代之核酸含量與親本細胞可能不完全相同，而是可能含有突變。本文包括所篩選或所選之與原始轉型細胞具有相同功能或生物活性的突變型後代。宿主細胞為可用於產生本發明之雙特異性抗原結合分子的任何類型之細胞系統。宿主細胞包括經培養的細胞，例如經培養的哺乳動物細胞，諸如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養植物或動物組織內所含的細胞。
藥劑之「有效量 」係指使其所投與之細胞或組織中產生生理學變化所必需的量。
藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量 」係指在必需的劑量及時間段情況下，有效達成所需治療或預防結果的量。舉例而言，治療有效量之藥劑消除、減少、延遲、最小化或預防疾病副作用。
「個體 (individual /subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)馴養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。特定言之，個體為人類。
術語「醫藥組合物 」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受之毒性的其他組分。
「醫藥學上可接受之賦形劑 」係指醫藥組合物中之除活性成分之外的對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)緩衝劑、穩定劑或防腐劑。
術語「藥品說明書 」用於指治療產品之商業包裝中通常所包括的說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、與使用此類治療產品有關之禁忌症及/或警告的資訊。
如本文所用，「治療 (treatment )」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入且可以針對預防或在臨床病理學過程中實施。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、症狀緩解、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、減緩疾病進展速率、改善或緩和疾病狀態，及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之分子用於延遲疾病發展或減慢疾病進展。
本文所提及之術語「組合治療 」或「共投藥 」涵蓋組合投藥(其中兩種或更多種治療劑包括於同一或各別調配物中)，及各別投藥，在此情況下，投與如本文所報導之抗體可在投與其他治療劑或藥劑(較佳為一或多種抗體)之前、同時及/或之後進行。
「B 細胞 增殖病症 」意謂其中患者之B細胞數目相較於健康個體之B細胞數目增加的疾病，且尤其其中B細胞數目增加為疾病之病因或標誌的疾病。
術語「血液癌症 」係指或描述典型地以不受調控之細胞生長/增殖為特徵之哺乳動物的生理性病狀。因此，如本文所用，術語癌症係指增殖疾病，諸如癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。特定言之，術語癌症係指B細胞增殖性病症。在一個態樣中，癌症選自由以下組成之群：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)，及霍奇金氏淋巴瘤(HL)。
術語「癌症 」係指或描述典型地以不受調控之細胞生長/增殖為特徵之哺乳動物的生理性病狀。因此，如本文所用，術語癌症係指增殖疾病，諸如癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。特定言之，術語癌症包括淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭癌或頸癌、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽道癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任何上述癌症之難治形式，或上述癌症中之一或多者的組合。在一個態樣中，癌症為實體腫瘤。在另一態樣中，癌症為血液癌症，特定言之，白血病，最特定言之，急性淋巴母細胞性白血病(ALL)或急性骨髓性白血病(AML)。
本發明之雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 本發明提供新穎的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其具有特別有利的特性，諸如可生產性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率、降低的毒性、可以給與患者且藉此得到可能增強之功效的經擴展之劑量範圍， 新穎的雙特異性促效CD28抗原結合分子包含由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個胺基酸取代，該等胺基酸取代使抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能(Fc靜默)減少且從而避免經由Fc受體發生非特異性交聯。實情為，其包含至少一個抗原結合域，該抗原結合域能夠特異性結合至促使在腫瘤位點發生交聯的腫瘤相關抗原，諸如纖維母細胞活化蛋白(FAP)或癌胚抗原(CEA)。從而達成腫瘤特異性T細胞活化。
本文提供一種單價結合至CD28之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域， (b)至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中Fc域為IgG，特定言之，IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。在一個特定態樣中，由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域為IgG1 Fc域。Fc域包含一或多個減少抗原結合分子對Fc受體之結合親和力且/或減少或消除效應功能的胺基酸取代。在一個態樣中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，Fc域屬於人類IgG1亞類且包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，其中第一亞單元包含SEQ ID NO：176之胺基酸序列且第二亞單元包含SEQ ID NO：177之胺基酸序列。
在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (i)包含SEQ ID NO：20之重鏈互補決定區CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：23之輕鏈互補決定區CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)；或 (ii)包含SEQ ID NO：36之CDR-H1、SEQ ID NO：37之CDR-H2及SEQ ID NO：38之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：39之CDR-L1、SEQ ID NO：40之CDR-L2及SEQ ID NO：41之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：包含SEQ ID NO：36之CDR-H1、SEQ ID NO：37之CDR-H2及SEQ ID NO：38之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：39之CDR-L1、SEQ ID NO：40之CDR-L2及SEQ ID NO：41之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：包含SEQ ID NO：20之CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：23之CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
此外，提供如上文所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28之抗原結合域包含：含有胺基酸序列與SEQ ID NO：26之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD28)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：27之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一態樣中，提供雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (b)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (c)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (d)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (e)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (f)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (g)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (h)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (j)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR，或 (k)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子,其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO：54之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR。在另一態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：包含SEQ ID NO：489之CDR-H1、SEQ ID NO：490之CDR-H2及SEQ ID NO：491之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：492之CDR-L1、SEQ ID NO：493之CDR-L2及SEQ ID NO：494之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：46之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO：53之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR。在另一態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：包含SEQ ID NO：495之CDR-H1、SEQ ID NO：496之CDR-H2及SEQ ID NO：497之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：498之CDR-L1、SEQ ID NO：499之CDR-L2及SEQ ID NO：500之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：42之重鏈可變區(VH CD28)的CDR及胺基酸序列為SEQ ID NO：27之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR。在另一態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：包含SEQ ID NO：501之CDR-H1、SEQ ID NO：502之CDR-H2及SEQ ID NO：503之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：504之CDR-L1、SEQ ID NO：505之CDR-L2及SEQ ID NO：506之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含：含有胺基酸序列選自由以下組成之群的重鏈可變區(VH CD28)：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51；及含有胺基酸序列選自由以下組成之群的輕鏈可變區(VL CD28)：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61。
在另一態樣中，提供雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (b)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (c)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (d)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (e)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (f)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (g)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (h)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (j)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (k)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域結合至CD28的親和力低於包含胺基酸序列為SEQ ID NO：26之重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：27之輕鏈可變區(VL CD28)的抗原結合域。藉由流式細胞術量測結合至表現CD28之CHO細胞的親和力。在一個態樣中，能夠特異性結合至CD28的抗原結合域以低於包含胺基酸序列為SEQ ID NO：26之重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：27之輕鏈可變區(VL CD28)之抗原結合域的親和力結合至CD28，且包含胺基酸序列為SEQ ID NO：47之重鏈可變區(VH CD28)的CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3以及胺基酸序列為SEQ ID NO：54之輕鏈可變區(VL CD28)的CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3。在一個態樣中，能夠以低於包含胺基酸序列為SEQ ID NO：26之重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：27之輕鏈可變區(VL CD28)之抗原結合域的親和力特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：47之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列與SEQ ID NO：54之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：47的重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：54的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：46的重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：53的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含胺基酸序列為SEQ ID NO：42的重鏈可變區(VH CD28)及胺基酸序列為SEQ ID NO：27的輕鏈可變區(VL CD28)。
靶向 CEA 的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含 (i)重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：188的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：189的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：190的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：191的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：192的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：193的CDR-L3；或 (ii)重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：180的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：181的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：182的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：183的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：184的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：185的CDR-L3；或 (iii)重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：127的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：128的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：129的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：130的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：131的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：132的CDR-L3，或 (iv)重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：507的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：508的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：509的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：510的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：511的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：512的CDR-L3。
在一個特定態樣中，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：188的CDR-H1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：189的CDR-H2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：190的CDR-H3；及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：191的CDR-L1、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：192的CDR-L2及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：193的CDR-L3。
特定言之，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：133之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CEA)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：134之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CEA)。在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：133的重鏈可變區(VH CEA)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：134的輕鏈可變區(VL CEA)。
在另一態樣中，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：186之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CEA)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：187之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CEA)。在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：186的重鏈可變區(VH CEA)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：187的輕鏈可變區(VL CEA)。
在另一態樣中，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：513之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CEA)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：514之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CEA)。在一個態樣中，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：513的重鏈可變區(VH CEA)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：514的輕鏈可變區(VL CEA)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：194之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：195之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (b)包含SEQ ID NO：196之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：197之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (c)包含SEQ ID NO：198之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：199之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (d)包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (e)包含SEQ ID NO：202之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：203之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (f)包含SEQ ID NO：204之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：205之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (g)包含SEQ ID NO：206之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：207之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (h)包含SEQ ID NO：208之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：209之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (i)包含SEQ ID NO：210之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：211之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (j)包含SEQ ID NO：212之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：213之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)。
特定言之，能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：200的重鏈可變區(VH CEA)，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：201的輕鏈可變區(VL CEA)。
靶向 FAP 的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：12的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：13的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：14的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：15的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：16的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：17的CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：4的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：5的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：6的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：7的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：8的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：9的CDR-L3。
特定言之，能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH FAP)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：12的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：13的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：14的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：15的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：16的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：17的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含(a)胺基酸序列與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH FAP)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：19之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL FAP)；或(b)胺基酸序列與SEQ ID NO：10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH FAP)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL FAP)。特定言之，能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：18的重鏈可變區(VH FAP)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：19的輕鏈可變區(VL FAP)。
靶向 EpCAM 的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至上皮細胞黏附分子(EpCAM)的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至EpCAM的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH EpCAM)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：515的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：516的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：517的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL EpCAM)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：518的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：519的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：520的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至EpCAM的包含胺基酸序列與SEQ ID NO：521之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH EpCAM)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：522之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL EpCAM)。特定言之，能夠特異性結合至EpCAM的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：521的重鏈可變區(VH EpCAM)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：522的輕鏈可變區(VL EpCAM)。
靶向 HER3 的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至HER3的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至HER3的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH HER3)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：523的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：524的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：525的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL HER3)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：526的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：527的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：528的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至HER3的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：529之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH HER3)，以及胺基酸序列與SEQ ID NO：530之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL HER3)。特定言之，能夠特異性結合至HER3的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：529的重鏈可變區(VH HER3)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：530的輕鏈可變區(VL HER3)。
靶向 CD30 的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD30的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD30的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD30)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：531的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：532的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：533的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CD30)，其包含(iv) 含有胺基酸序列為SEQ ID NO：534的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：535的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：536的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD30的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：537之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD30)，以及胺基酸序列與SEQ ID NO：538之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD30)。特定言之，能夠特異性結合至CD30的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：537的重鏈可變區(VH CD30)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：538的輕鏈可變區(VL CD30)。
靶向 TBPG ( 5T4 ) 的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至TBPG (5T4)的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至TBPG的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH TBPG)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：539的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：540的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：541的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL TBPG)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：542的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：543的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：544的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至TBPG的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：545之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH TBPG)，以及胺基酸序列與SEQ ID NO：546之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL TBPG)。特定言之，能夠特異性結合至TBPG的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：545的重鏈可變區(VH TBPG)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：546的輕鏈可變區(VL TBPG)。
靶向 MM 的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 本發明亦提供新穎的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其特別適用於治療多發性骨髓瘤。分子包含至少一個抗原結合域，該抗原結合域能夠特異性結合至在表現MM細胞表面抗原的細胞存在下引起交聯的多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原；及由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能(Fc靜默)減少的胺基酸取代。從而避免經由Fc受體發生的非特異性交聯且在表現MM細胞表面抗原的細胞存在下達成特異性T細胞活化。
因此，本文提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含能夠特異性結合至CD28的抗原結合域、能夠特異性結合至多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原的抗原結合域，及由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。在一個態樣中，如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子係以單價結合至CD28為特徵。在另一態樣中，如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子係以單價結合至多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原為特徵。
在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中Fc域為IgG，特定言之，IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。在一個特定態樣中，由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域為IgG1 Fc域。Fc域包含一或多個減少抗原結合分子對Fc受體之結合親和力且/或減少或消除效應功能的胺基酸取代。在一個態樣中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，Fc域屬於人類IgG1亞類且包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中MM細胞表面抗原係選自由CD38、BCMA及GPRC5D組成之群。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD38的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD38的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD38)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：547的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：548的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：549的CDR-H3；與輕鏈可變區(VL CD38)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：550的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：551的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：552的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD38的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：553之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD38)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：554之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD38)。特定言之，能夠特異性結合至CD38的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：553的重鏈可變區(VH CD38)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：554的輕鏈可變區(VL CD38)。
在又另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至BCMA的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至BCMA的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH BCMA)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：555的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：556的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：557的CDR-H3；與輕鏈可變區(VL BCMA)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：558的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：559的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：560的CDR-L3。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至BCMA的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：561之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH BCMA)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：562之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL BCMA)。特定言之，能夠特異性結合至BCMA的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：561的重鏈可變區(VH BCMA)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：562的輕鏈可變區(VL BCMA)。
靶向 GPRC5D 的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH GPRC5D)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：563的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：564的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：565的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL GPRC5D)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：566的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：567的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：568的CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含胺基酸序列選自由以下組成之群的重鏈可變區(VH GPRC5D)：SEQ ID NO：569、SEQ ID NO：571、SEQ ID NO：572及SEQ ID NO：573；及胺基酸序列選自由以下組成之群的輕鏈可變區(VL GPRC5D)：SEQ ID NO：570、SEQ ID NO：574、SEQ ID NO：575、SEQ ID NO：576、SEQ ID NO：577及SEQ ID NO：578。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：569之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH GPRC5D)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：570之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL GPRC5D)。特定言之，能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：569的重鏈可變區(VH GPRC5D)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：570的輕鏈可變區(VL GPRC5D)。
在另一態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH GPRC5D)，其包含(i)胺基酸序列為SEQ ID NO：579的CDR-H1、(ii)胺基酸序列為SEQ ID NO：580的CDR-H2及(iii)胺基酸序列為SEQ ID NO：581的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL GPRC5D)，其包含(iv)胺基酸序列為SEQ ID NO：582的CDR-L1、(v)胺基酸序列為SEQ ID NO：583的CDR-L2及(vi)胺基酸序列為SEQ ID NO：584的CDR-L3。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含胺基酸序列選自由以下組成之群的重鏈可變區(VH GPRC5D)：SEQ ID NO：585、SEQ ID NO：586、SEQ ID NO：587、SEQ ID NO：588、SEQ ID NO：589及SEQ ID NO：590；以及胺基酸序列選自由以下組成之群的輕鏈可變區(VL GPRC5D)：SEQ ID NO：591、SEQ ID NO：592、SEQ ID NO：593、SEQ ID NO：594及SEQ ID NO：595。
在另一態樣中，提供雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至GPRC5D的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：569之胺基酸序列的重鏈可變區(VH GPRC5D)及包含SEQ ID NO：570之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL GPRC5D)，或 (b)包含SEQ ID NO：573之胺基酸序列的重鏈可變區(VH GPRC5D)及包含SEQ ID NO：576之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL GPRC5D)，或 (c)包含SEQ ID NO：569之胺基酸序列的重鏈可變區(VH GPRC5D)及包含SEQ ID NO：572之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL GPRC5D)，或 (d)包含SEQ ID NO：586之胺基酸序列的重鏈可變區(VH GPRC5D)及包含SEQ ID NO：593之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL GPRC5D)，或 (e)包含SEQ ID NO：587之胺基酸序列的重鏈可變區(VH GPRC5D)及包含SEQ ID NO：592之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL GPRC5D)。
單價結合至 CD28 且 單價結合至腫瘤相關抗原的雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 ( 1 + 1 形式 ) 在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CEA的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO：65的第一輕鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：66的第一重鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：87的第二重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO：88的第二輕鏈(分子M)。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至FAP的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO：65的第一輕鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：66的第一重鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：67的第二重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO：68的第二輕鏈(分子C)。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之第二Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與一個Fc域亞單元之N端融合。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO：77的第一輕鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：78的第二輕鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：75的第一重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO：79的第二重鏈(分子H)。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的VH及VL域，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的Fab片段在其C端與第一Fc域亞單元的N端融合，且其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之VH及VL域之一經由肽連接子與第一Fc域亞單元之C端融合，且能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之VH及VL域中之另一者經由肽連接子與第二Fc域亞單元之C端融合。
在一個態樣中，肽連接子包含選自SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：151及SEQ ID NO：152之胺基酸序列。更特定言之，肽連接子包含SEQ ID NO：152。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子(分子I)，其包含胺基酸序列為SEQ ID NO：62的輕鏈、胺基酸序列為SEQ ID NO：72的第一重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO：80的第二重鏈。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CEA的互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (ii)包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (iii)包含SEQ ID NO：513之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：514之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：352的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：351的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：353的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：354的第二輕鏈(分子11A)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：352的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：351的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：355的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：356的第二輕鏈(分子11B)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：352的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：351的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：357的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：358的第二輕鏈(分子11C)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：352的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：351的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：359的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：354的第二輕鏈(分子11D)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：370的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：369的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：353的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：356的第二輕鏈(分子11I)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：370的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：369的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：359的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：354的第二輕鏈(分子11J)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：370的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：369的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：357的第二重鏈及胺基酸序列為SEQ ID NO：358的第二輕鏈(分子11K)。在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：370的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：369的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：359的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：356的第二輕鏈(分子11L)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：376的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：375的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：357的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：358的第二輕鏈(分子11R)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：376的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：375的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：355的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：356的第二輕鏈(分子11S)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：376的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：375的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：355的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：354的第二輕鏈(分子11T)。
在一個特定態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：376的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：375的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：355的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：356的第二輕鏈(分子11S)。在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：352的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：351的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：355的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：356的第二輕鏈(分子11B)。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CEA的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CEA的Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (ii)包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (iii)包含SEQ ID NO：513之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：514之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：361的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：360的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：362的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：363的第二輕鏈(分子11E)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：361的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：360的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：364的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：365的第二輕鏈(分子11F)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：361的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：360的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：366的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：367的第二輕鏈(分子11G)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：361的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：360的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：368的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：363的第二輕鏈(分子11H)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：372的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：371的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：368的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：363的第二輕鏈(分子11M)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：372的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：371的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：366的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：367的第二輕鏈(分子11N)。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：372的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：371的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：364的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：365的第二輕鏈(分子11O)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至EpCAM的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至EpCAM的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：521的重鏈可變區(VH EpCAM)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：522的輕鏈可變區(VL EpCAM)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至EpCAM的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至EpCAM的Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：521的重鏈可變區(VH EpCAM)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：522的輕鏈可變區(VL EpCAM)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：367的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：366的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：390的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：391的第二輕鏈(分子14A)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至HER3的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至HER3的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：529的重鏈可變區(VH HER3)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：530的輕鏈可變區(VL HER3)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：357的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：358的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：392的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：393的第二輕鏈(分子14B)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至HER3的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至HER3的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：529的重鏈可變區(VH HER3)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：530的輕鏈可變區(VL HER3)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CD30的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CD30的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：537的重鏈可變區(VH CD30)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：538的輕鏈可變區(VL CD30)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：357的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：358的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：394的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：395的第二輕鏈(分子14C)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CD30的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CD30的Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：537的重鏈可變區(VH CD30)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：538的輕鏈可變區(VL CD30)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至TPBG的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至TPBG的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：545的重鏈可變區(VH TPBG)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：546的輕鏈可變區(VL TPBG)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：357的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：358的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：396的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：397的第二輕鏈(分子14D)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至TPBG的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至TPBG的Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：545的重鏈可變區(VH TPBG)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：546的輕鏈可變區(VL TPBG)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CD38的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CD38的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：553的重鏈可變區(VH CD38)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：554的輕鏈可變區(VL CD38)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：357的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：358的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：400的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：401的第二輕鏈(分子16C)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CD38的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CD38的Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：553的重鏈可變區(VH CD38)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：554的輕鏈可變區(VL CD38)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至BCMA的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至BCMA的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：561的重鏈可變區(VH BCMA)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：562的輕鏈可變區(VL BCMA)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至BCMA的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至BCMA的Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：561的重鏈可變區(VH BCMA)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：562的輕鏈可變區(VL BCMA)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：367的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：366的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：402的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：403的第二輕鏈(分子16D)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至GPRC5D的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至GPRC5D的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：569的重鏈可變區(VH GPRC5D)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：570的輕鏈可變區(VL GPRC5D)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：365的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：364的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：398的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：399的第二輕鏈(分子16B)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至GPRC5D的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至GPRC5D的Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：569的重鏈可變區(VH GPRC5D)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：570的輕鏈可變區(VL GPRC5D)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：367的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：366的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：398的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：399的第二輕鏈(分子16A)。
單價結合至 CD28 且 二價結合至腫瘤相關抗原的雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 ( 1 + 2 形式 ) 在另一態樣中，提供如本文所揭示之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之第二及第三Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與第一Fc域亞單元之N端融合，且能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第三Fab片段在Fab重鏈之C端與第二Fc域亞單元之N端融合。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含兩個各自包含SEQ ID NO：78之胺基酸序列的輕鏈、一個包含SEQ ID NO：77之胺基酸序列的輕鏈、包含SEQ ID NO：75之胺基酸序列的第一重鏈，及包含SEQ ID NO：76之胺基酸序列的第二重鏈(分子G)。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)能夠特異性結合至CEA的第二及第三Fab片段，該第二及第三Fab片段包含 (i)包含SEQ ID NO：186之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：187之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (ii)包含SEQ ID NO：200之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：201之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)，或 (iii)包含SEQ ID NO：513之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CEA)及包含SEQ ID NO：514之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CEA)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含兩個各自包含SEQ ID NO：361之胺基酸序列的輕鏈、一個包含SEQ ID NO：368之胺基酸序列的輕鏈、包含SEQ ID NO：362之胺基酸序列的第一重鏈，及包含SEQ ID NO：373之胺基酸序列的第二重鏈(分子11P)。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含兩個各自包含SEQ ID NO：361之胺基酸序列的輕鏈、一個包含SEQ ID NO：368之胺基酸序列的輕鏈、包含SEQ ID NO：360之胺基酸序列的第一重鏈，及包含SEQ ID NO：374之胺基酸序列的第二重鏈(分子11Q)。
靶向 FAP 及 CEA 之 促效 CD28 抗原結合分子 本文亦提供一種單價結合至CD28之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域， (b)一個能夠特異性結合至第一腫瘤相關抗原的抗原結合域，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代，其特徵在於其另外包含一個能夠特異性結合至第二腫瘤相關抗原的抗原結合域。
在一個特定態樣中，提供一種單價結合至CD28的三特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域， (b)一個能夠特異性結合至CEA的抗原結合域及一個能夠特異性結合至FAP的抗原結合域， (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：88的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：87的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：388的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：389的第二輕鏈(分子Y)。
靶向 B 細胞表面抗原的 雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 本發明提供新穎的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其具有特別有利的特性，諸如可生產性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率、降低的毒性、可以給與患者且藉此得到可能增強之功效的經擴展之劑量範圍， 新穎的雙特異性促效CD28抗原結合分子包含由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個胺基酸取代，該等胺基酸取代使抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能(Fc靜默)減少且從而避免經由Fc受體發生非特異性交聯。實情為，其包含至少一個抗原結合域，該抗原結合域能夠特異性結合至在表現CD19或CD79b之B細胞存在下引起交聯的B細胞表面抗原，諸如CD19或CD79b。從而在表現CD19或CD79b之B細胞存在下達成特異性T細胞活化。
本文提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含能夠特異性結合至CD28的抗原結合域、能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域，及由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。在一個態樣中，如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子係以單價結合至CD28為特徵。在另一態樣中，如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子係以單價結合至B細胞表面抗原為特徵。
在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中Fc域為IgG，特定言之，IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。在一個特定態樣中，由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域為IgG1 Fc域。Fc域包含一或多個減少抗原結合分子對Fc受體之結合親和力且/或減少或消除效應功能的胺基酸取代。在一個態樣中，Fc域包含胺基酸取代L234A及L235A (根據Kabat EU索引編號)。在一個態樣中，Fc域屬於人類IgG1亞類且包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。
在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (i)包含SEQ ID NO：20之重鏈互補決定區CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：23之輕鏈互補決定區CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)；或 (ii)包含SEQ ID NO：36之CDR-H1、SEQ ID NO：37之CDR-H2及SEQ ID NO：38之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：39之CDR-L1、SEQ ID NO：40之CDR-L2及SEQ ID NO：41之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD28)，其包含SEQ ID NO：20之CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3，以及輕鏈可變區(VL CD28)，其包含SEQ ID NO：23之CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3。在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO：26之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD28)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：27之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD28)。在一個態樣中，能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：26的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：27的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD28)，其包含SEQ ID NO：28之CDR-H1、SEQ ID NO：29之CDR-H2及SEQ ID NO：30之CDR-H3，以及輕鏈可變區(VL CD28)，其包含SEQ ID NO：31之CDR-L1、SEQ ID NO：32之CDR-L2及SEQ ID NO：33之CDR-L3。在一個態樣中，提供如上文中所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO：34之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD28)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：35之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD28)。在一個態樣中，能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：34的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：35的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一態樣中，能夠特異性結合至雙特異性促效CD28抗原結合分子之CD28的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD28)，其包含SEQ ID NO：36之CDR-H1、SEQ ID NO：37之CDR-H2及SEQ ID NO：38之CDR-H3，以及包含SEQ ID NO：39之CDR-L1、SEQ ID NO：40之CDR-L2及SEQ ID NO：41之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。
在另一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含：含有胺基酸序列選自由以下組成之群的重鏈可變區(VH CD28)：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51；及含有胺基酸序列選自由以下組成之群的輕鏈可變區(VL CD28)：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61。
在另一態樣中，提供雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (b)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (c)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (d)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (e)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (f)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (g)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (h)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (j)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (k)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子包含能夠特異性結合至CD28的抗原結合域，該抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：46的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：53的輕鏈可變區(VL CD28)，或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：47的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：54的輕鏈可變區(VL CD28)，或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：47的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：27的輕鏈可變區(VL CD28)，或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：42的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：27的輕鏈可變區(VL CD28)。在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：46的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：53的輕鏈可變區(VL CD28)。在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：47的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：54的輕鏈可變區(VL CD28)。在另一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：47的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：27的輕鏈可變區(VL CD28)。在又一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：42的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：27的輕鏈可變區(VL CD28)。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD19的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含：(a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：406的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：407的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：408的CDR-H3，與輕鏈可變區(VL CD19)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：409的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：410的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：411的CDR-L3；或(b)重鏈可變區(VH CD19)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：414的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：415的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：416的CDR-H3，與輕鏈可變區(VL CD19)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：417的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：418的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：419的CDR-L3。特定言之，能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含(a)含有胺基酸序列與SEQ ID NO：412之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的重鏈可變區(VH CD19)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：413之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD19)；或(b)含有胺基酸序列與SEQ ID NO：420之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的重鏈可變區(VH CD19)，及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：421之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD19)。在一個特定態樣中，能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：412的重鏈可變區(VH CD19)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：413的輕鏈可變區(VL CD19)。
在另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域。
在一個態樣中，提供如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD79b)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：422的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：423的CDR-H2，及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：424的CDR-H3，與輕鏈可變區(VL CD79b)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：425的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：426的CDR-L2，及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：427的CDR-L3。特定言之，能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：428之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的重鏈可變區(VH CD79b)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：429之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD79b)。在一個態樣中，能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：428的重鏈可變區(VH CD79b)，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：429的輕鏈可變區(VL CD79b)。
在另一態樣中，提供如上文所定義之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域為Fab片段或互換Fab片段。在一個特定態樣中，能夠特異性結合至CD28的抗原結合域為Fab片段且能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域為互換Fab片段。
單價結合至 CD28 且 單價結合至 B 細胞表面抗原 的雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 ( 1 + 1 形式 ) 在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至B細胞表面抗原的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CD19的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CD19的互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：412之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及包含SEQ ID NO：413之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或 (ii)包含SEQ ID NO：420之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及包含SEQ ID NO：421之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：65的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：118的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：430的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：431的第二輕鏈(分子18A)。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：121的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：116的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：430的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：431的第二輕鏈(分子18B)。
在另一特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：122的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：114的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：430的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：431的第二輕鏈(分子18C)。
在另一個態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：65的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：114的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：430的第二重鏈，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：431的第二輕鏈(分子18D)。
在又另一態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：123的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：118的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：430的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：431的第二輕鏈(分子18E)。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CD19的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CD19的Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：412之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及包含SEQ ID NO：413之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)，或 (ii)包含SEQ ID NO：420之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD19)及包含SEQ ID NO：421之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD19)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CD79b的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CD79b的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：428的重鏈可變區(VH CD79b)，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：429的輕鏈可變區(VL CD79b)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個特定態樣中，提供一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：121的第一輕鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：116的第一重鏈、含有胺基酸序列為SEQ ID NO：432的第二重鏈及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：433的第二輕鏈(分子18F)。
在另一態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至CD19的Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
在一個態樣中，提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之互換Fab片段，其包含 (i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)， (b)一個能夠特異性結合至CD79b的互換Fab片段，其包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：428的重鏈可變區(VH CD79b)，及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：429的輕鏈可變區(VL CD79b)， 及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。
單價結合至 CD28 且 二價結合至 B 細胞表面抗原 的雙特異性促效 CD28 抗原結合分子 ( 1 + 2 形式 ) 在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子係以二價結合至B細胞表面抗原為特徵。
在另一態樣中，提供如本文所揭示之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至B細胞表面抗原的第二及第三Fab片段，以及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與第一Fc域亞單元之N端融合，且能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第三Fab片段在Fab重鏈之C端與第二Fc域亞單元之N端融合。
Fc 域修飾減少 Fc 受體結合及 / 或效應功能 本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子中的Fc域係由一對包含免疫球蛋白分子之重鏈域的多肽鏈組成。舉例而言，免疫球蛋白G (IgG)分子中之Fc域為二聚體，其中各亞單元包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定域。Fc域之兩個亞單元彼此間能夠穩定結合。Fc域賦予本發明之抗原結合分子有利的藥物動力學特性，包括長血清半衰期，此有助於在目標組織中良好積聚，及有利的組織-血液分佈率。然而，另一方面，其可能引起本發明之雙特異性抗體非所需地靶向表現Fc受體之細胞，而非較佳含抗原之細胞。
因此，相較於原生IgG1 Fc域，本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子中的Fc域對Fc受體展現減少的結合親和力及/或減少的效應功能。在一個態樣中，Fc基本上不結合至Fc受體及/或不誘導效應功能。在一個特定態樣中，Fc受體為Fcγ受體。在一個態樣中，Fc受體為人類Fc受體。在一個特定態樣中，Fc受體為活化人類Fcγ受體，更特定言之，人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定言之，人類FcγRIIIa。在一個態樣中，Fc域不誘導效應功能。減少的效應功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：減少的補體依賴性細胞毒性(CDC)、減少的抗體依賴性細胞介導細胞毒性(ADCC)、減少的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、減少的細胞介素分泌、免疫複合物介導抗原呈遞細胞對抗原的吸收減少、對NK細胞的結合減少、對巨噬細胞的結合減少、對單核球的結合減少、對多形核細胞的結合減少、誘導細胞凋亡的直接信號傳導減少、減少的樹突狀細胞成熟，或減少的T細胞預致敏。
在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗體的Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可以包含在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)的人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在一個特定態樣中，本發明提供一種抗原結合分子，其中Fc區包含一或多個減少結合至Fc受體(特定言之，Fcγ受體)的胺基酸取代。在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其中Fc區包含一或多個胺基酸取代且其中該抗體所誘導的ADCC減少至包含野生型人類IgG1 Fc區之抗體所誘導之ADCC的0-20%。
在一個態樣中，本發明之抗原結合分子的Fc域包含一或多個使Fc域對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸突變。典型地，Fc域之兩個亞單元中之每一者中存在該一或多個胺基酸突變。特定言之，Fc域包含位置E233、L234、L235、N297、P331及P329 (EU編號)處的胺基酸取代。特定言之，Fc域包含IgG重鏈之位置234及235 (EU編號)及/或329 (EU編號)處的胺基酸取代。更特定言之，提供本發明之抗原結合分子，其包含在IgG重鏈中具有胺基酸取代L234A、L235A及P329G (「P329G LALA」，EU編號)之Fc域。胺基酸取代L234A及L235A係指所謂的LALA突變。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除人類IgG1 Fc域對Fcγ受體的結合且描述於國際專利申請公開案第WO 2012/130831 A1號中，該文獻亦描述製備此類突變型Fc域之方法及測定其特性(諸如Fc受體結合或效應功能)之方法。
Fc受體結合及/或效應功能減少的Fc域亦包括Fc域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的彼等物(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者發生取代的Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
在另一態樣中，Fc域為IgG4 Fc域。相較於IgG1抗體，IgG4抗體展現減少之針對Fc受體的結合親和力及減少之效應功能。在一個更特定態樣中，Fc域為包含位置S228 (Kabat編號)之胺基酸取代(特定言之，胺基酸取代S228P)的IgG4 Fc域。在一個更特定態樣中，Fc域為包含胺基酸取代L235E及S228P及P329G (EU編號)的IgG4 Fc域。此類IgG4 Fc域突變體及其Fcγ受體結合特性亦描述於WO 2012/130831中。
突變型Fc域可使用此項技術中熟知之基因或化學方法、藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。基因方法可包括編碼DNA序列之定點突變誘發、PCR、基因合成及類似方法。正確的核苷酸變化可藉由例如測序來驗證。
對Fc受體的結合可容易測定，例如藉由ELISA，或藉由表面電漿子共振(SPR)、使用標準儀器，諸如BIAcore儀器(GE Healthcare)，且可藉由重組表現來獲得諸如Fc受體。或者，Fc域或包含Fc域之細胞活化抗體對Fc受體之結合親和力可使用已知表現特定Fc受體之細胞株(諸如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)來評估。
可藉由此項技術中已知之方法量測Fc域或包含Fc域之本發明抗原結合分子的效應功能。適用於量測ADCC的分析描述於本文中。用於評估所關注分子之ADCC活性的活體外分析實例描述於美國專利第5,500,362號；Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及Hellstrom等人, Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人, J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)中。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流式細胞術用的ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；及CytoTox 96® 非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可評估所關注分子之活體內ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes等人, Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)中所揭示。
在一些態樣中，Fc域對補體組分(尤其對C1q)的結合減少。因此，在其中Fc域經工程改造而具有減少之效應功能的一些態樣中，該減少之效應功能包括減少之CDC。可進行C1q結合分析以確定本發明之雙特異性抗體是否能夠結合C1q且因此具有CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補體活化，可執行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人, J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg等人, Blood 101, 1045-1052 (2003)；及Cragg及Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004))。
在一個特定態樣中，相較於原生IgG1 Fc域，對Fc受體展現減少之結合親和力及/或減少之效應功能的Fc域為包含胺基酸取代L234A、L235A及視情況存在之P329G的人類IgG1 Fc域，或包含胺基酸取代S228P、L235E及視情況存在之P329G的人類IgG4 Fc域(根據Kabat EU索引編號)。更特定言之，其為包含胺基酸取代L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)的人類IgG1 Fc域。
促進雜二聚之 Fc 域修飾 本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子包含與Fc域之兩個亞單元中之一者或另一者融合的不同抗原結合位點，因此Fc域之兩個亞單元可包含於兩個不一致的多肽鏈中。此等多肽之重組共表現及隨後二聚化引起兩種多肽出現若干種可能的組合。為提高本發明之雙特異性抗原結合分子在重組產生中的產量及純度，因此將促進所需多肽結合之修飾引入本發明之雙特異性抗原結合分子的Fc域中為有利的。
因此，在特定態樣中，本發明係關於單價結合至CD28的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含(a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域；(b)至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域；及(c)由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代，其中Fc域包含促進Fc域之第一與第二亞單元結合的修飾。人類IgG Fc域中之兩個亞單元之間最廣泛蛋白質-蛋白質相互作用的位點存在於Fc域之CH3域中。因此，在一個態樣中，該修飾存在於Fc域之CH3域中。
在一各特定態樣中，該修飾為所謂的「臼包杵」修飾，其包含Fc域之兩個亞單元之一中的「杵」修飾及Fc域之兩個亞單元之另一者中的「臼」修飾。因此，本發明係關於單價結合至CD28的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含(a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域；(b)至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域；及(c)由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能的胺基酸取代，其中根據臼包杵方法，Fc域的第一亞單元包含杵且Fc域的第二亞單元包含臼。在一個特定態樣中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
臼包杵技術描述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人, Prot Eng 9, 617-621 (1996)及Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)中。一般而言，方法包括在第一多肽之界面處引入隆凸(「杵」)及在第二多肽之界面處引入相應空腔(「臼」)，使得隆凸可定位於空腔中以便促進雜二聚體形成且阻礙均二聚體形成。藉由用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)置換第一多肽界面中之小胺基酸側鏈來構築隆凸。大小與隆凸相同或相似的補償性空腔係藉由用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)置換大胺基酸側鏈而產生於第二多肽之界面中。
因此，在一個態樣中，在本發明雙特異性抗原結合分子之Fc域之第一亞單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較大側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第一亞單元之CH3域內產生可定位於第二亞單元CH3域內之空腔中的隆凸；且在Fc域之第二亞單元的CH3域中，胺基酸殘基經具有較小側鏈體積之胺基酸殘基置換，從而在第二亞單元之CH3域內產生可供第一亞單元之CH3域內之隆凸定位的空腔。隆凸及空腔可藉由改變編碼多肽之核酸(例如藉由定點突變誘發)或藉由肽合成來產生。在一個特定態樣中，在Fc域之第一亞單元的CH3域中，位置366之蘇胺酸殘基經色胺酸殘基置換(T366W)，且在Fc域之第二亞單元的CH3域中，位置407之酪胺酸殘基經纈胺酸殘基置換(Y407V)。在一個態樣中，在Fc域之第二亞單元中，另外，位置366之蘇胺酸殘基經絲胺酸殘基置換(T366S)且位置368之白胺酸殘基經丙胺酸殘基置換(L368A)。
在又一態樣中，在Fc域之第一亞單元中，位置354之絲胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基置換(S354C)，且在Fc域之第二亞單元中，位置349之酪胺酸殘基另外經半胱胺酸殘基置換(Y349C)。此兩個半胱胺酸殘基的引入使得Fc域之兩個亞單元之間形成二硫橋鍵，從而進一步穩定二聚體(Carter (2001), J Immunol Methods 248, 7-15)。在一個特定態樣中，Fc域之第一亞單元包含胺基酸取代S354C及T366W (EU編號)，且Fc域之第二亞單元包含胺基酸取代Y349C、T366S及Y407V (根據Kabat EU索引編號)。
在一個替代態樣中，促進Fc域之第一與第二亞單元結合的修飾包含介導靜電轉向效應之修飾，例如PCT公開案WO 2009/089004中所述。一般而言，此方法涉及用帶電胺基酸殘基置換兩個Fc域亞單元界面處之一或多個胺基酸殘基，使得均二聚體形成在靜電上變得不利，但雜二聚在靜電上變得有利。
如本文所報導之雙特異性促效CD28抗原結合分子之重鏈的C端可為終止於胺基酸殘基PGK的完整C端。重鏈之C端可為縮短之C端，其中一或兩個C端胺基酸殘基已移除。在一個較佳態樣中，重鏈之C端為終止於P之縮短C端。在一個較佳態樣中，重鏈之C端為終止於PG之縮短C端。在如本文所報導之所有態樣的一個態樣中，如本文所指定之包含包括C端CH3域之重鏈的CD28抗原結合分子包含C端甘胺酸-離胺酸二肽(G446及K447，根據Kabat EU索引編號)。在如本文所報導之所有態樣的一個態樣中，如本文所指定之包含包括C端CH3域之重鏈的CD28抗原結合分子包含C端甘胺酸殘基(G446，根據Kabat EU索引編號)。
Fab 域之修飾 在一個態樣中，本發明係關於以單價結合至CD28為特徵的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含(a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域；(b)至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域；及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代，其中至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為Fab片段且在Fab片段中，可變域VH與VL或恆定域CH1與CL根據互換單抗技術發生交換。
一個結合臂中發生域置換/交換的多特異性抗體(互換MabVH-VL或互換MabCH-CL)詳細描述於WO2009/080252及Schaefer, W.等人, PNAS, 108 (2011) 11187-1191中。其明顯地減少由針對第一抗原之輕鏈與針對第二抗原之錯誤重鏈錯配而產生的副產物(與沒有此類域交換之方法相比)。
在一個態樣中，本發明係關於以單價結合至CD28為特徵的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含(a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域；(b)至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域；及(c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能的胺基酸取代，其中在能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的Fab片段中，恆定域CL與CH1彼此間置換，使得CH1域為輕鏈的一部分且CL域為重鏈的一部分。
在另一態樣中，為了進一步改良正確成對，以單價結合至CD28為特徵、包含(a)一個能夠特異性結合至CD28之抗原結合域、(b)至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之抗原結合域及(c)由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成、包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少之胺基酸取代之Fc域的雙特異性促效CD28抗原結合分子可以含有不同帶電荷胺基酸取代(所謂的「帶電荷殘基」)。將此等修飾引入互換或未互換的CH1及CL域中。在一個特定態樣中，本發明係關於雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中在一個CL域中，位置123處之胺基酸(EU編號)已經精胺酸(R)置換且位置124處之胺基酸(EU編號)已經離胺酸(K)取代且其中在一個CH1域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代。在一個特定態樣中，在能夠特異性結合至CD28之Fab片段的CL域中，位置123處之胺基酸(EU編號)已經精胺酸(R)置換且位置124處之胺基酸(EU編號)已經離胺酸(K)取代，且在能夠特異性結合至CD28之Fab片段的CH1域中，位置147 (EU編號)及位置213 (EU編號)處之胺基酸已經麩胺酸(E)取代。
聚核苷酸 本發明進一步提供編碼如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子的經分離之聚核苷酸或其片段。編碼本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子的一或多種經分離之聚核苷酸可以作為編碼整個抗原結合分子之單一聚核苷酸或作為共表現之多種(例如兩種或更多種)聚核苷酸表現。由共表現之聚核苷酸編碼的多肽可經由例如二硫鍵或形成功能抗原結合分子的其他方式結合。舉例而言，免疫球蛋白之輕鏈部分可由來自免疫球蛋白之重鏈部分的各別聚核苷酸編碼。共表現時，重鏈多肽與輕鏈多肽結合而形成免疫球蛋白。在一些態樣中，經分離之聚核苷酸編碼如本文所述之本發明之整個雙特異性促效CD28抗原結合分子。在其他態樣中，經分離之聚核苷酸編碼如本文所述之本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子中所包含的多肽。在某些態樣中，聚核苷酸或核酸為DNA。在其他態樣中，本發明之聚核苷酸為RNA，例如呈信使RNA (mRNA)形式。本發明之RNA可為單股或雙股的。
重組方法 本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子可藉由例如固態肽合成(例如梅里菲爾德固相合成(Merrifield solid phase synthesis))或重組產生獲得。為了重組產生，將一或多種編碼雙特異性促效CD28抗原結合分子或其多肽片段的聚核苷酸(例如如上文所述)分離且插入一或多種載體中用於在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類聚核苷酸可容易使用習知程序分離及測序。在本發明之一個態樣中，提供包含本發明之一或多種聚核苷酸的載體，較佳為表現載體。可使用熟習此項技術者熟知之方法來構築含有抗體(片段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術以及活體內重組/基因重組。參見例如以下文獻中所述之技術：Maniatis等人, MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)；及Ausubel等人, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現卡匣，其中選殖有與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作地結合之編碼抗體或其多肽片段的聚核苷酸(亦即，編碼區)。如本文所用，「編碼區」為由轉譯成胺基酸之密碼子組成的核酸之一部分。雖然「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)未轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區(若存在)之一部分，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'未轉譯區及類似序列)不為編碼區之一部分。兩個或更多個編碼區可以存在於單一聚核苷酸構築體中，例如存在於單一載體上，或存在於各別聚核苷酸構築體中，例如存在於各別(不同)載體上。此外，任何載體可含有單一編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如本發明之載體可編碼一或多種多肽，其經由蛋白水解分裂而後轉譯成或共轉譯分離成最終蛋白質。另外，本發明之載體、聚核苷酸或核酸可編碼與編碼本發明抗體或其多肽片段之聚核苷酸融合或未融合的異源編碼區，或其變異體或衍生物。異源編碼區包括(不限於)專門化元件或基元，諸如分泌性信號肽或異源功能域。當基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調控序列以基因產物表現置於調控序列之影響或控制下的方式結合時，為可操作的結合。若誘導啟動子功能引起編碼所要基因產物之mRNA轉錄且若兩個DNA片段之間連接的性質不干擾表現調控序列導引基因產物表現的能力或不干擾DNA模板轉錄的能力，則兩個DNA片段(諸如多肽編碼區及與其結合的啟動子)為「可操作地結合」。因此，若啟動子能夠實現核酸轉錄，則啟動子區域與編碼多肽之核酸可操作地結合。啟動子可為僅導引預定細胞中之DNA實質性轉錄的細胞特異性啟動子。除啟動子之外的其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可操作地與導引細胞特異性轉錄的聚核苷酸結合。
適合啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。多種轉錄控制區已為熟習此項技術者所知。此等區域包括(但不限於)在脊椎動物細胞中起作用的轉錄控制區，諸如(但不限於)啟動子及增強子區段，其來自巨細胞病毒(例如即刻早期啟動子，連同內含子-A)、猴病毒40 (例如早期啟動子)及逆轉錄病毒(諸如勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))。其他轉錄控制區包括來源於脊椎動物基因(諸如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔α-血球蛋白)的彼等區域，以及能夠控制真核生物細胞中之基因表現的其他序列。其他適合轉錄控制區域包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導性啟動子(例如啟動子誘導性四環素(tetracyclins))。類似地，多種轉譯控制元件已為一般技術者所知。此等元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子，以及來源於病毒系統的元件(特定言之，內部核糖體入口位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現卡匣亦可包括其他特徵，諸如複製起點，及/或染色體整合元件，諸如逆轉錄病毒長末端重複序列(LTR)，或腺相關病毒(AAV)反向末端重複序列(ITR)。
本發明之聚核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌肽或信號肽的其他編碼區結合，從而導引由本發明之聚核苷酸編碼的多肽分泌。舉例而言，若抗體或其多肽片段之分泌為所需，則編碼信號序列之DNA可置於本發明抗體或其多肽片段之核酸之上游。根據信號假設，哺乳動物細胞所分泌的蛋白質具有信號肽或分泌性前導序列，一旦生長的蛋白質鏈已開始跨越粗糙內質網輸出，則該信號肽或分泌性前導序列自成熟蛋白質裂解。一般技術者意識到，脊椎動物細胞分泌的多肽一般具有與多肽N端融合的信號肽，該信號肽自所轉譯多肽裂解而產生呈分泌或「成熟」形式的多肽。在某些實施例中，使用原生信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或該序列之保持導引與其可操作地結合之多肽分泌之能力的功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽，或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶之前導序列取代。
編碼可用於促進隨後純化(例如組胺酸標籤)或有助於標記雙特異性促效CD28抗原結合分子之短蛋白質序列的DNA可包括於編碼本發明抗體或其多肽片段之聚核苷酸的內部或末端。
在本發明之另一態樣中，提供包含一或多種本發明之聚核苷酸的宿主細胞。在某些實施例中，提供包含本發明之一或多種載體的宿主細胞。聚核苷酸及載體可合併本文分別關於聚核苷酸及載體所述之任一特徵(單獨或組合)。在一個態樣中，宿主細胞包含含有聚核苷酸的載體(例如，已經該載體轉型或轉染)，該聚核苷酸編碼本發明之抗體(一部分)。如本文所用，術語「宿主細胞」係指任何種類的細胞系統，其可經工程改造以產生本發明之融合蛋白或其片段。適於複製及支持抗原結合分子表現的宿主細胞在此項技術中已熟知。此類細胞適當時可經特定表現載體轉染或轉導且可使大量含有載體的細胞生長以便接種大型醱酵器，以獲得足量的抗原結合分子用於臨床應用。適合的宿主細胞包括原核微生物，諸如大腸桿菌，或各種真核生物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或其類似物。舉例而言，可利用細菌產生多肽，特別是不需要糖基化時。表現之後，可自可溶性部分之細菌細胞漿中分離出多肽且可對該多肽進一步純化。除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於編碼多肽之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」、從而產生具有部分或完全人類糖基化型態之多肽的真菌及酵母菌株。參見Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), 及Li等人, Nat Biotech 24, 210-215 (2006)。
適用於表現(糖基化)多肽的宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包含植物細胞及昆蟲細胞。已鑑別出多種桿狀病毒株，其可聯合昆蟲細胞使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞。植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述利用轉殖基因植物產生抗體的PLANTIBODIESTM 技術)。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40轉型的猴腎CV1株(COS-7)；人類胚腎細胞株(293或293T細胞，如例如Graham等人, J Gen Virol 36, 59 (1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠塞特利氏細胞(mouse sertoli cells)(TM4細胞，如例如Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(海拉細胞(HELA))；犬腎細胞(MDCK)；水牛鼠肝細胞(buffalo rat liver cells)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤細胞(MMT 060562)；TRI細胞(如例如Mather等人, Annals N. Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)中所述)；MRC 5細胞及FS4細胞。其他適用的哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人, Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。欲回顧適於產生蛋白質的某些哺乳動物宿主細胞株，參見例如Yazaki及Wu, Methods in Molecular Biology, 第248卷(B. K. C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), 第255-268頁(2003)。宿主細胞包括經培養之細胞，例如經培養之哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞(僅舉數例)，而且包括轉殖基因動物、轉殖基因植物或經培養之植物或動物組織中所包含的細胞。在一個實施例中，宿主細胞為真核生物細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。此項技術中已知用此等系統表現外源基因的標準技術。表現包含免疫球蛋白重鏈或輕鏈之多肽的細胞可經工程改造，以便亦表現免疫球蛋白鏈中之另一者，使得所表現產物為具有重鏈與輕鏈的免疫球蛋白。
在一個態樣中，提供一種產生本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子或其多肽片段的方法，其中該方法包含在適於表現本發明抗體或其多肽片段的條件下培養如本文所提供的包含編碼本發明抗體或其多肽片段之聚核苷酸的宿主細胞，及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明抗體或其多肽片段。
在某些態樣中，形成抗原結合分子之一部分、能夠特異性結合至目標細胞抗原(例如Fab片段)的部分包含至少一個能夠結合至抗原的免疫球蛋白可變區。可變區可形成天然或非天然存在之抗體及其片段的一部分且來源於天然或非天然存在之抗體及其片段。產生多株抗體及單株抗體之方法為此項技術中熟知(參見例如Harlow及Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。非天然存在之抗體可使用固相肽合成法構築，可以重組方式產生(例如如美國專利第4,186,567號中所述)或可藉由例如篩選包含可變重鏈及可變輕鏈的組合文庫來獲得(參見例如McCafferty之美國專利第5,969,108號)。
本發明中可使用任何動物物種之免疫球蛋白。適用於本發明之非限制性免疫球蛋白可為鼠類、靈長類動物或人類來源。若融合蛋白意欲用於人類用途，則可使用其中免疫球蛋白之恆定區來自人類的免疫球蛋白之嵌合形式。亦可根據此項技術中熟知之方法製備免疫球蛋白之人類化或完全人類形式(參見例如Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由各種方法達成，包括(但不限於)(a)將非人類(例如供者抗體) CDR移植至人類(例如受者抗體)構架及恆定區上，保留或不保留關鍵構架殘基(例如對於保持良好抗原結合親和力或抗體功能而言具有重要作用的彼等殘基)；(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用而言具有關鍵作用的殘基)移植至人類構架及恆定區上；或(c)移植整個非人類可變域，但藉由表面殘基置換而用人類類似區段「遮掩」其。人類化抗體及其製備方法評述於例如Almagro及Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如Riechmann等人, Nature 332, 323-329 (1988)；Queen等人, Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人, Nature 321, 522-525 (1986)；Morrison等人, Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)；Morrison及Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)；Verhoeyen等人, Science 239, 1534-1536 (1988)；Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)；Kashmiri等人, Methods 36, 25-34 (2005) (描述SDR (a-CDR)移植)；Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991) (描述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人, Methods 36, 43-60 (2005) (描述「FR改組」)；及Osbourn等人, Methods 36, 61-68 (2005)；及Klimka等人, Br J Cancer 83, 252-260 (2000) (描述FR改組的「導向選擇」方法)。根據本發明之特定免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。人類抗體及人類可變區可使用此項技術中已知之各種技術產生。人類抗體大體描述於van Dijk及van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)以及Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)。人類可變區可以形成藉由融合瘤方法所製得之人類單株抗體的一部分且來源於藉由融合瘤方法所製得之人類單株抗體(參見例如Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 第51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由將免疫原投與轉殖基因動物來製備，該轉殖基因動物已經改造以產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體作為對抗原性攻毒的反應(參見例如Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)。人類抗體及人類可變區亦可藉由分離選自人類源噬菌體呈現文庫之Fv純系可變區序列來產生(參見例如Hoogenboom等人, 於Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien等人編, Human Press, Totowa, NJ, 2001)；及McCafferty等人, Nature 348, 552-554；Clackson等人, Nature 352, 624-628 (1991))。噬菌體典型地將抗體片段以單鏈Fv (scFv)片段或Fab片段形式呈現。
在某些態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子係根據例如PCT公開案WO 2012/020006中所揭示的方法經工程改造以具有增強的結合親和力(參見關於親和力成熟的實例)或美國專利申請公開案第2004/0132066號。本發明之抗原結合分子結合至特異性抗原決定子的能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術量測，例如表面電漿子共振技術(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))及傳統的結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))。可使用競爭分析鑑別與參考抗體競爭結合至特定抗原之抗原結合分子。在某些實施例中，此類競爭性抗原結合分子結合至與參考抗原結合分子所結合相同的抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。用於對抗體所結合之抗原決定基進行定位的詳細例示性方法提供於Morris (1996)「Epitope Mapping Protocols」, 於Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press, Totowa, NJ)中。在例示性競爭分析法中，在溶液中培育經固著的抗原，該溶液包含結合至抗原之經標記的第一抗原結合分子及就與第一抗原結合分子競爭結合至抗原結合之能力接受測試的第二未標記抗原結合分子。第二抗原結合分子可存在於融合瘤上清液中。作為對照，所固著之抗原在包含經標記之第一抗原結合分子、但不包含未標記之第二抗原結合分子的溶液中培育。在允許第一抗體結合至抗原之條件下培育之後，移除過量的未結合抗體，且量測與所固著抗原結合之標記之量。若與對照樣品相比，測試樣品中與固定抗原結合之標記之量實質上降低，則表明第二抗原結合分子與第一抗原結合分子競爭結合至抗原。參見Harlow及Lane (1988) Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)。
如本文所述製備的本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子可以藉由此項技術中已知的技術來純化，諸如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、尺寸排阻層析及其類似技術。用於純化特定蛋白質的實際條件部分地視諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素而定，且對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。親和層析純化時，可使用抗原結合分子所結合的抗體、配位體、受體或抗原。舉例而言，親和層析純化本發明之抗原結合分子時，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可依序使用蛋白質A或G親和層析及尺寸排阻層析來分離抗原結合分子，基本上如實例中所述。CD28抗原結合分子或其片段之純度可以藉由多種熟知分析方法中之任一者測定，包括凝膠電泳、高壓液相層析及其類似方法。舉例而言，如實例中所述表現的CD28抗原結合分子展示為完整的且組裝正確，如還原及非還原SDS-PAGE所證實。
分析 可以鑑別、篩選出本文所提供之雙特異性促效CD28抗原結合分子，或藉由此項技術中已知的多種分析來表徵其生理/化學特性及/或生物活性。
1. 親和力分析 本文所提供之抗原結合分子對相應目標的親和力可以根據實例中所示之方法、藉由表面電漿子共振(SPR)、使用標準儀器(諸如Proteon儀器(Bio-rad))及受體或目標蛋白質(諸如可以藉由重組表現獲得)測定。含TNF家族配位三聚體之抗原結合分子對目標細胞抗原的親和力亦可藉由表面電漿子共振(SPR)、使用標準儀器(諸如Proteon儀器(Bio-rad))及受體目標蛋白質(諸如可以藉由重組表現獲得)測定。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於實例4中。根據一個態樣，藉由表面電漿子共振、使用Proteon®機器(Bio-Rad)在25℃下量測KD 。
2. 結合分析及其他分析 本文提供之雙特異性抗原結合分子對表現相應受體之細胞的結合可藉由例如流式細胞術(FACS)、使用表現特定受體或目標抗原的細胞株評估。在一個態樣中，結合分析中使用表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)。
在另一態樣中，利用表現目標細胞抗原(例如FAP或CEA、CD19或CD79b)的癌細胞株展現雙特異性抗原結合分子對目標細胞抗原的結合。
3. 活性分析 在一個態樣中，提供用於鑑別具有生物活性之CD28抗原結合分子的分析。生物活性可以包括例如T細胞增殖及細胞介素分泌(如實例6中所述的方法所量測)或腫瘤細胞殺滅(如實例7中所量測)。亦提供活體內及/或活體外具有此類生物活性的抗體。
醫藥組合物、調配物及投藥途徑 在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之任一種雙特異性促效CD28抗原結合分子的醫藥組合物，例如任一種以下治療方法中使用的醫藥組合物。在一個實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之雙特異性促效CD28抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。在另一態樣中，醫藥組合物包含本文提供之雙特異性促效CD28抗原結合分子及至少一種其他治療劑，例如如下文所述。
本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種雙特異性抗原結合分子，其溶解或分散於醫藥學上可接受之賦形劑中。片語「醫藥學上或藥理學上可接受」係指在所用劑量及濃度下對於接受者而言一般無毒性的分子實體及組合物，亦即當投與動物(適當時諸如人類)時，不產生有害、過敏或其他不良反應。熟習此項技術者根據本發明將知道含有至少一種雙特異性促效CD28抗原結合分子及視情況存在之另一種活性成分之醫藥組合物的製備，如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Printing Company, 1990所例示，該文獻以引用之方式併入本文中。特定言之，組合物為凍乾調配物或水溶液。如本文所用，「醫藥學上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、塗料、界面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如抗細菌劑、抗真菌劑)、等張劑、鹽、穩定劑及其組合，如一般技術者所知。
非經腸組合物包括為藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌肉內、鞘內或腹膜內注射)投藥所設計的彼等物。為了注射，本發明之含有TNF家族配位三聚體的抗原結合分子可以在水溶液中調配，較佳在生理學上相容之緩衝液(諸如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理食鹽水緩衝液)中調配。溶液可含有調配劑，諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑。或者，雙特異性促效CD28抗原結合分子可以呈粉末形式，以便在使用之前用適合媒劑(例如不含熱原質的無菌水)復原。必要時藉由將所需量之本發明之融合蛋白併入具有下文列舉之多種其他成分的適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌可容易達成，例如經由無菌過濾膜過濾達成。一般而言，分散液係藉由將各種經滅菌之活性成分併入含有基本分散介質及/或其他成分的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥技術，其利用預先無菌過濾之液體介質產生活性成分與任何其他所需成分之粉末。必要時，液體介質宜經緩衝，且首先用液體稀釋劑產生等張性，隨後與足夠生理鹽水或葡萄糖一起注射。組合物在製造及儲存條件下必須穩定，且經防腐以防止微生物(諸如細菌及真菌)之污染作用。應瞭解，內毒素污染應最低限度地保持在安全水準，例如低於0.5 ng/mg蛋白質。適合的醫藥學上可接受之賦形劑包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、聚葡萄糖或其類似物。視情況，懸浮液亦可含有適合穩定劑或增加化合物溶解度之藥劑以允許製備高度濃縮之溶液。另外，活性化合物懸浮液可製備成適當的油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或甘油三酯；或脂質體。
活性成分可截留於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；截留於膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences (第18版, Mack Printing Company, 1990)中。可以製備持續釋放型製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形物品形式，例如薄膜或微膠囊。在特定實施例中，可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來達成。本文中之醫藥學上可接受之例示性賦形劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)。某些例示性sHASEGP (包括rHuPH20)及使用方法描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所述之彼等物，後者調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。除先前描述之組合物以外，雙特異性促效CD28抗原結合分子亦可調配為儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內植入)或藉由肌肉內注射來投與。因此，舉例而言，雙特異性促效CD28抗原結合分子可用適合聚合物或疏水性材料(例如可接受油中之乳液)或離子交換樹脂調配，或調配為微溶性衍生物，例如調配為微溶性鹽。
包含本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子的醫藥組合物可藉助於習知混合、溶解、乳化、囊封、截留或凍乾方法製造。醫藥組合物可使用一或多種有利於將蛋白質處理成可在醫藥學上使用之製劑的生理學上可接受之載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑、以習知方式調配。適當調配物視所選投藥途徑而定。本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子可以在游離酸或鹼中調配成呈中性或鹽形式的組合物。醫藥學上可接受之鹽為實質上保持游離酸或鹼之生物活性的鹽。此等鹽包括酸加成鹽，例如與蛋白質組合物之自由胺基形成的鹽，或與無機酸(諸如鹽酸或磷酸)或有機酸(諸如乙酸、草酸、酒石酸或杏仁酸)形成的鹽。與自由羧基形成的鹽亦可衍生自無機鹼，諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵；或有機鹼，諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)。相較於對應游離鹼形式，醫藥鹽傾向於更溶於水性及其他質子溶劑中。本文之組合物亦可含有超過一種為治療特定適應症所必需之活性成分，較佳為彼此間不會產生不利影響之具有互補活性的活性成分。此類活性成分宜以對預期目的有效之量存在於組合中。用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌可容易達成，例如經由無菌過濾膜過濾達成。
治療方法及組合物 本文所提供之任一種雙特異性促效CD28抗原結合分子可以單獨或組合用於治療方法。
在一個態樣中，提供適用作藥劑之雙特異性促效CD28抗原結合分子。在其他態樣中，提供用於治療癌症的雙特異性促效CD28抗原結合分子。在某些態樣中，提供用於治療方法中的雙特異性促效CD28抗原結合分子。在某些態樣中，本文提供一種用於治療患有癌症之個體之方法中的雙特異性促效CD28抗原結合分子，該方法包含向個體投與有效量之雙特異性促效CD28抗原結合分子。在一個此類實施例中，方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑。
在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子用於治療B細胞增殖性病症。在特定態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子係用於治療選自由以下組成之群的B細胞增殖病症：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金氏淋巴瘤(HL)。在一個特定態樣中，B細胞癌為非霍奇金氏淋巴瘤或急性淋巴母細胞白血病。在某些態樣中，提供用於治療方法中的雙特異性促效CD28抗原結合分子。在某些態樣中，本文提供一種用於治療患有癌症之個體之方法中的雙特異性促效CD28抗原結合分子，該方法包含向個體投與有效量之雙特異性促效CD28抗原結合分子。在另一態樣中，提供用於治療患有B細胞增殖病症之個體之方法中的雙特異性促效CD28抗原結合分子，特定言之，選自由以下組成之群的B細胞增殖病症：非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性淋巴球性白血病(ALL)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、多發性骨髓瘤(MM)及霍奇金氏淋巴瘤(HL)，該方法包含向個體投與有效量之雙特異性促效CD28抗原結合分子。在一個此類實施例中，方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑。
在其他態樣中，提供癌症免疫療法中使用的如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子。在某些實施例中，提供癌症免疫治療方法中使用的雙特異性促效CD28抗原結合分子。根據任一上述態樣之「個體」較佳為人類。
在另一態樣中，本文提供如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子用於製造或製備藥劑的用途。在一個實施例中，藥劑係用於治療癌症。在另一態樣中，藥劑係用於治療癌症之方法中，該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之藥劑。在一個此類態樣中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如如下文所述。在另一態樣中，藥劑係用於治療B細胞增殖病症。在另一態樣中，藥劑係用於治療B細胞增殖病症之方法中，該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之藥劑。
在另一態樣中，本文提供一種治療癌症的方法。在一個態樣中，該方法包含向患有癌症之個體投與有效量之雙特異性促效CD28抗原結合分子。在一個此類態樣中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，如下文所述。根據上述態樣中之任一者之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本文提供包含如本文所報導之任一種雙特異性促效CD28抗原結合分子的醫藥調配物，例如用於任一種上述治療方法中。在一個態樣中，醫藥調配物包含如本文所報導之任一種雙特異性促效CD28抗原結合分子及醫藥學上可接受之載劑。在另一態樣中，醫藥調配物包含如本文所報導之任一種雙特異性促效CD28抗原結合分子及至少一種其他治療劑。
如本文所報導之雙特異性促效CD28抗原結合分子可以單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，如本文所報導之雙特異性促效CD28抗原結合分子可與至少一種其他治療劑共投與。
上述此類組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或更多種治療劑包括在相同或各別調配物中)及分開投藥，在此情況下，投與如本文所報導之抗體可在投與其他治療劑之前、同時及/或之後進行。在一個態樣中，雙特異性促效CD28抗原結合分子的投與與另一種治療劑的投與彼此發生於約一個月內，或約一週、兩週或三週內，或約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。
如本文所報導之抗原結合分子(及任一種其他治療劑)可以藉由任何適合方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內，及局部治療必要時，病灶內投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。可藉由任何適合途徑(例如注射，諸如靜脈內或皮下注射)給藥，此部分地視投藥是否為短期或長期而定。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投藥或在不同時間點的多次投藥、推注投藥及脈衝式輸注。
如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子將以符合良好醫學實務的方式調配、給藥及投與。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症之病因、藥劑遞送位點、投藥方法、投藥時程及從醫者已知之其他因素。雙特異性促效CD28抗原結合分子不一定而是視情況用當前用於預防或治療所討論之病症的一或多種藥劑調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體的量、病症或治療類型及如上文所論述之其他因素而定。此等藥劑一般以與本文所述相同之劑量且用如本文所述之投藥途徑使用，或以本文所述劑量之約1%至99%使用，或以任何劑量且憑經驗/臨床上確定為適當之任何途徑使用。
為了預防或治療疾病，如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子的適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視以下而定：待治療之疾病類型、抗體類型、疾病嚴重程度及病程、抗體是否為了預防或治療目的而投與、先前療法、患者臨床病史及對抗體之反應，及主治醫師之判斷。雙特異性促效CD28抗原結合分子宜一次性或經一系列療法投與患者。視疾病類型及嚴重度而定，約1 µg/kg至15 mg/kg (例如0.5 mg/kg-10 mg/kg)的雙特異性促效CD28抗原結合分子可為投與患者的初始候選劑量，不論例如藉由一或多次分開投藥或藉由連續輸注。視上述因素而定，一種典型的日劑量可以在約1 μg/kg至100 mg/kg或更大之範圍內。對於經數日或更長時間重複投藥而言，視病狀而定，治療一般持續至疾病症狀發生所需抑制為止。抗體的一種例示性劑量係在約0.05 mg/kg至約10 mg/kg範圍內。因此，可向患者投與約0.5 mg/kg、2.0 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kg (或其任何組合)之一或多次劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如使得患者接受約二次至約二十次或例如約六次劑量的抗體)。初始可投與較高起始劑量，隨後可投與一或多次較低劑量。然而，其他給藥方案可為適用的。此療法之進程容易藉由習知技術及分析來監測。
其他藥劑及療法 本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子可以在療法中與一或多個其他藥劑組合投與。舉例而言，本發明之抗原結合分子可與至少一種其他治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋為治療需要此類治療之個體之症狀或疾病而投與的任何藥劑。此類其他治療劑可包含適於治療特定適應症的任何活性成分，較佳為具有互補活性、彼此間無不利影響的彼等活性成分。在某些實施例中，另一種治療劑為另一抗癌劑，例如微管中斷劑、抗代謝物、拓樸異構酶抑制劑、DNA嵌入劑、烷化劑、激素療法、激酶抑制劑、受體拮抗劑、腫瘤細胞凋亡活化劑，或抗血管生成劑。在某些態樣中，另一種治療劑為免疫調節劑、細胞生長抑制劑、細胞黏附抑制劑、細胞毒性或細胞生長抑制劑、細胞凋亡活化劑，或增強細胞對細胞凋亡誘導劑之敏感性的藥劑。
因此，提供用於治療癌症的本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子或包含其之醫藥組合物，其中該雙特異性抗原結合分子與化學治療劑、輻射及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。
此類其他藥劑宜以有效達成預定目的之量組合存在。此類其他藥劑之有效量視所用融合蛋白之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體一般以相同劑量及如本文所述之投藥途徑，或約1至99%之本文所述劑量，或經驗上/臨床上確定為適當的任何劑量及任何途徑使用。上文提及之此類組合療法涵蓋組合投藥(其中相同或各別組合物中包括兩種或更多種治療劑)以及分開投藥，在此情況下，本發明之雙特異性抗原結合分子或抗體的投與可在其他治療劑及/或助劑投與之前、同時及/或之後進行。
在另一態樣中，提供用於治療癌症的如上文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中雙特異性抗原結合分子與另一種免疫調節劑組合投與。術語「免疫調節劑」係指影響免疫系統的任何物質，包括單株抗體。本發明之分子可視為免疫調節劑。免疫調節劑可用作治療癌症之抗腫瘤劑。在一個態樣中，免疫調節劑包括(但不限於)抗CTLA4抗體(例如伊匹單抗(ipilimumab))、抗PD1抗體(例如納武單抗(nivolumab)或帕博利珠單抗(pembrolizumab))、PD-L1抗體(例如阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)或德瓦魯單抗(durvalumab))、OX-40抗體、4-1BB抗體及GITR抗體。上文提及之此類組合療法涵蓋組合投藥(其中相同或各別組合物中包括兩種或更多種治療劑)以及分開投藥，在此情況下，雙特異性抗原結合分子的投與可在其他治療劑及/或佐劑投與之前、同時及/或之後進行。
與 T 細胞雙特異性抗體的組合 在一個態樣中，本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子可與T細胞活化抗CD3雙特異性抗體組合投與。在一個態樣中，特異性針對腫瘤相關抗原的T細胞活化抗CD3雙特異性抗體為抗CEA/抗CD3雙特異性抗體或抗MCSP/抗CD3雙特異性抗體。在一個特定態樣中，特異性針對腫瘤相關抗原的T細胞活化抗CD3雙特異性抗體為抗CEA/抗CD3雙特異性抗體。
在一個態樣中，包含至少一種能夠特異性結合至腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域的雙特異性促效CD28抗原結合分子適於與抗CEA/抗CD3雙特異性抗體組合投與，該腫瘤相關抗原選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、葉酸受體α (FolR1)、黑色素瘤相關硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、表皮生長因子受體(EGFR)、人類表皮生長因子受體2 (HER2)及p95HER2。在另一特定態樣中，TAA係選自由以下組成之群：纖維母細胞活化蛋白(FAP)、癌胚抗原(CEA)、EpCAM、HER3、CD30或TPBG (5T4)。
在一個特定態樣中，供組合使用之抗CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD3)，其包含SEQ ID NO：439的CDR-H1序列、SEQ ID NO：440的CDR-H2序列及SEQ ID NO：441的CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD3)，其包含SEQ ID NO：442的CDR-L1序列、SEQ ID NO：443的CDR-L2序列及SEQ ID NO：444的CDR-L3序列。更特定言之，抗CD3雙特異性包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含與SEQ ID NO：445之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區(VH CD3)及/或與SEQ ID NO：446之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變區(VL CD3)。在另一態樣中，抗CD3雙特異性抗體包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：445的重鏈可變區(VH CD3)及/或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：446的輕鏈可變區(VL CD3)。
在另一態樣中，供組合使用的抗CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD3)，其包含SEQ ID NO：596的CDR-H1序列、SEQ ID NO：597的CDR-H2序列及SEQ ID NO：598的CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD3)，其包含SEQ ID NO：599的CDR-L1序列、SEQ ID NO：600的CDR-L2序列及SEQ ID NO：601的CDR-L3序列。更特定言之，抗CD3雙特異性包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含與SEQ ID NO：602之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區(VH CD3)及/或與SEQ ID NO：603之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變區(VL CD3)。在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：602的重鏈可變區(VH CD3)及/或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：603的輕鏈可變區(VL CD3)。
在另一態樣中，供組合使用的抗CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD3)，其包含SEQ ID NO：604的CDR-H1序列、SEQ ID NO：605的CDR-H2序列及SEQ ID NO：606的CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD3)，其包含SEQ ID NO：607的CDR-L1序列、SEQ ID NO：608的CDR-L2序列及SEQ ID NO：609的CDR-L3序列。更特定言之，抗CD3雙特異性包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含與SEQ ID NO：610之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區(VH CD3)及/或與SEQ ID NO：611之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變區(VL CD3)。在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：610的重鏈可變區(VH CD3)及/或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：611的輕鏈可變區(VL CD3)。
在一個特定態樣中，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：161之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO：162之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽、與SEQ ID NO：163之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽，及與SEQ ID NO：164之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致之多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗體包含SEQ ID NO：161之多肽序列、SEQ ID NO：162之多肽序列、SEQ ID NO：163之多肽序列及SEQ ID NO：164之多肽序列(CEA CD3 TCB)。
在另一特定態樣中，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：165之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO：166之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO：167之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽，及與SEQ ID NO：168之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定實施例中，雙特異性抗體包含SEQ ID NO：165之多肽序列、SEQ ID NO：166之多肽序列、SEQ ID NO：167之多肽序列及SEQ ID NO：168之多肽序列(CEACAM5 CD3 TCB)。
特定雙特異性抗體進一步描述於PCT公開案第WO 2014/131712 A1號中。在另一態樣中，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體亦可包含雙特異性T細胞接合體(BiTE®)。在另一態樣中，抗CEA/抗CD3雙特異性抗體為如WO 2007/071426或WO 2014/131712中所述之雙特異性抗體。
在另一態樣中，包含能夠特異性結合至B細胞表面抗原之抗原結合域的本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子可與T細胞活化抗CD3雙特異性抗體組合投與。在一個態樣中，T細胞活化抗CD3雙特異性抗體特異性針對B細胞表面抗原，特定而言，其為抗CD20/抗CD3雙特異性抗體。
如本文所用之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體為包含結合至CD3之第一抗原結合域及結合至CD20之第二抗原結合域的雙特異性抗體。因此，如本文所用之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含：第一抗原結合域，其包含重鏈可變區(VH CD3)及輕鏈可變區(VL CD3)；以及第二抗原結合域，其包含重鏈可變區(VH CD20)及輕鏈可變區(VL CD20)。
在一個特定態樣中，供組合使用之抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD3)，其包含SEQ ID NO：439的CDR-H1序列、SEQ ID NO：440的CDR-H2序列及SEQ ID NO：441的CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD3)，其包含SEQ ID NO：442的CDR-L1序列、SEQ ID NO：443的CDR-L2序列及SEQ ID NO：444的CDR-L3序列。更特定言之，抗CD20/抗CD3雙特異性包含第一抗原結合域，該第一抗原結合域包含與SEQ ID NO：445之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的重鏈可變區(VH CD3)及/或與SEQ ID NO：446之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致的輕鏈可變區(VL CD3)。在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：445的重鏈可變區(VH CD3)及/或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：446的輕鏈可變區(VL CD3)。
在一個態樣中，特異性結合至CD3之抗體為全長抗體。在一個態樣中，特異性結合至CD3之抗體為人類IgG類抗體，特定言之，人類IgG1 類抗體。在一個態樣中，特異性結合至CD3之抗體為抗體片段，特定言之，Fab分子或scFv分子，更特定言之，Fab分子。在一個特定態樣中，特異性結合至CD3之抗體為互換型Fab分子，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域或恆定域交換(亦即，彼此間置換)。在一個態樣中，特異性結合至CD3之抗體為人類化抗體。
在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD20)，其包含SEQ ID NO：447的CDR-H1序列、SEQ ID NO：448的CDR-H2序列及SEQ ID NO：449的CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD20)，其包含SEQ ID NO：450的CDR-L1序列、SEQ ID NO：451的CDR-L2序列及SEQ ID NO：452的CDR-L3序列。更特定言之，抗CD20/抗CD3雙特異性包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含與SEQ ID NO：453之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區(VH CD20)及/或與SEQ ID NO：454之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區(VL CD20)。在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性包含第二抗原結合域，該第二抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：453之重鏈可變區(VH CD20)及/或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：454之輕鏈可變區(VL CD20)。
在另一特定態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含結合至CD20之第三抗原結合域。特定言之，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含第三抗原結合域，該第三抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD20)，其包含SEQ ID NO：447的CDR-H1序列、SEQ ID NO：448的CDR-H2序列及SEQ ID NO：449的CDR-H3序列；及/或輕鏈可變區(VL CD20)，其包含SEQ ID NO：450的CDR-L1序列、SEQ ID NO：451的CDR-L2序列及SEQ ID NO：452的CDR-L3序列。更特定言之，抗CD20/抗CD3雙特異性包含第三抗原結合域，該第三抗原結合域包含與SEQ ID NO：453之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之重鏈可變區(VH CD20)及/或與SEQ ID NO：454之胺基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%一致之輕鏈可變區(VL CD20)。在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性包含第三抗原結合域，該第三抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：453之重鏈可變區(VH CD20)及/或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：454之輕鏈可變區(VL CD20)。
在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體為雙特異性抗體，其中第一抗原結合域為互換Fab分子，其中Fab重鏈與輕鏈之可變域或恆定域交換，且第二抗原結合域及第三抗原結合域(若存在)為習知Fab分子。
在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體為雙特異性抗體，其中(i)第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與第一抗原結合域之Fab重鏈之N端融合，第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合，或(ii)第一抗原結合域在Fab重鏈之C端與第二抗原結合域之Fab重鏈之N端融合，第二抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第一亞單元之N端融合，且第三抗原結合域在Fab重鏈之C端與Fc域之第二亞單元之N端融合。
Fab分子可直接或經由包含一或多個胺基酸(典型地，約2-20個胺基酸)的肽連接子與Fc域融合或彼此間融合。肽連接子在此項技術中已知且描述於本文中。在一個態樣中，該肽連接子為(G4 S)2 (SEQ ID NO：147)。另一種適合的此類連接子包含序列(G4 S)4 (SEQ ID NO：152)。另外，連接子可包含免疫球蛋白鉸鏈區(之一部分)。特定言之，在Fab分子與Fc域亞單元N端融合的情況下，其可在另一種肽連接子存在或不存在下經由免疫球蛋白鉸鏈區或其一部分融合。在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含Fc域，該Fc域包含一或多個使對Fc受體之結合及/或效應功能減少的胺基酸取代。特定言之，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含含有胺基酸取代L234A、L235A及P329G的IgG1 Fc域。
在一個特定態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：455之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO：456之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO：457之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽，及與SEQ ID NO：458之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一個特定實施例中，雙特異性抗體包含SEQ ID NO：455的多肽序列、SEQ ID NO：456的多肽序列、SEQ ID NO：457的多肽序列及SEQ ID NO：458的多肽序列(CD20 TCB)。
特定雙特異性抗體描述於PCT公開案第WO 2016/020309 A1號或WO 2015/095392 A1中。在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體亦可包含雙特異性T細胞接合體(BiTE®)。在另一態樣中，抗CD20/抗CD3雙特異性抗體為XmAb® 13676。在另一態樣中，雙特異性抗體為REGN1979。在另一態樣中，雙特異性抗體為FBTA05 (林福木恩(Lymphomun ))。
在本發明之另一態樣中，本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子係用於治療或延遲癌症進展之方法中，其中雙特異性促效CD28抗原結合分子係與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體組合使用，且另外，其與阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑組合。阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為PD-L1結合拮抗劑或PD-1結合拮抗劑。特定言之，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體。
在另一態樣中，包含能夠特異性結合至MM細胞表面抗原之抗原結合域的本發明雙特異性促效CD28抗原結合分子可與T細胞活化抗CD3雙特異性抗體組合投與。在一個態樣中，T細胞活化抗CD3雙特異性抗體特異性針對MM細胞表面抗原，特定而言，其為抗GPRC5D/抗CD3雙特異性抗體。
在一個特定態樣中，抗GPRC5D/抗CD3雙特異性抗體包含與SEQ ID NO：398之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO：399之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽、與SEQ ID NO：404之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽，及與SEQ ID NO：405之序列至少95%、96%、97%、98%或99%一致的多肽。在另一特定態樣中，雙特異性抗體包含SEQ ID NO：398之多肽序列、SEQ ID NO：399之多肽序列、SEQ ID NO：404之多肽序列及SEQ ID NO：405之多肽序列(GPRC5D CD3 TCB)。
在另一態樣中，提供一種組合產物，其包含如本文所述之雙特異性促效CD28抗原結合分子及T細胞活化抗CD3雙特異性抗體。在一個態樣中，特異性針對腫瘤相關抗原的T細胞活化抗CD3雙特異性抗體為抗CEA/抗CD3雙特異性抗體或抗MCSP/抗CD3雙特異性抗體。在一個特定態樣中，特異性針對腫瘤相關抗原的T細胞活化抗CD3雙特異性抗體為抗CEA/抗CD3雙特異性抗體。在另一態樣中，特異性針對腫瘤相關抗原的T細胞活化抗CD3雙特異性抗體為抗CD20/抗CD3雙特異性抗體。在另一態樣中，特異性針對腫瘤相關抗原的T細胞活化抗CD3雙特異性抗體為抗GPRC5D抗CD3雙特異性抗體。
與阻斷 PD - L1 / PD - 1 相互作用之藥劑組合 在一個態樣中，本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子可與阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑(諸如PD-L1結合拮抗劑或PD-1結合拮抗劑，特定言之，抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體)組合投與。
在一個態樣中，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為抗PD-L1抗體。術語「PD - L1 」(亦稱為CD274或B7-H1)係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生PD-L1，尤其係指「人類PD-L1」。完整人類PD-L1之胺基酸序列展示於UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q9NZQ7 (SEQ ID NO：459)中。術語「PD - L1 結合拮抗劑 」係指一種分子，其減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1、B7-1)之相互相用引起的信號轉導。在一些態樣中，PD-L1結合拮抗劑為抑制PD-L1與其結合搭配物結合的分子。在一個特定態樣中，PD-L1結合拮抗劑抑制PD-L1結合至PD-1及/或B7-1。在一些態樣中，PD-L1結合拮抗劑包括抗PD-L1抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合搭配物(諸如PD-1、B7-1)中之一或多者之相互相用引起之信號轉導的其他分子。在一個態樣中，PD-L1結合拮抗劑使得藉由或經由T淋巴球上所表現之細胞表面蛋白質介導之負性共刺激信號(經由PD-L1介導信號傳導)減少，以便使功能異常T細胞的功能異常更少(例如增強效應子對抗原識別的反應)。特定言之，PD-L1結合拮抗劑為抗PD-L1抗體。術語「抗 PD - L1 抗體 」或「結合至人類PD-L1之抗體」或「特異性結合至人類PD-L1之抗體」或「拮抗性抗PD-L1」係指以KD值為1.0×10- 8 mol/l或更低，在一個態樣中，KD 值為1.0×10- 9 mol/l或更低之結合親和力特異性結合至人類PD-L1抗原的抗體。結合親和力係用標準結合分析(諸如表面電漿子共振技術(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden))測定。在一個特定態樣中，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為抗PD-L1抗體。在一個特定態樣中，抗PD-L1抗體選自由以下組成之群：阿特珠單抗(atezolizumab)(MPDL3280A, RG7446)、德瓦魯單抗(durvalumab)(MEDI4736)、艾維路單抗(avelumab)(MSB0010718C)及MDX-1105。在一個特定態樣中，抗PD-L1抗體為本文所述之YW243.55.S70。在另一個特定態樣中，抗PD-L1抗體為本文所述之MDX-1105。在另一個特定態樣中，抗PD-L1抗體為MEDI4736 (德瓦魯單抗(durvalumab))。在又一態樣中，抗PD-L1抗體為MSB0010718C (艾維路單抗)。更特定言之，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為阿特珠單抗(MPDL3280A)。在另一態樣中，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為包含SEQ ID NO：460之重鏈可變域VH (PDL-1)及SEQ ID NO：461之輕鏈可變域VL (PDL-1)的抗PD-L1抗體。在另一態樣中，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為包含SEQ ID NO：462之重鏈可變域VH (PDL-1)及SEQ ID NO：463之輕鏈可變域VL (PDL-1)的抗PD-L1抗體。
術語「PD - 1 」(亦稱為CD279、PD1或程式化細胞死亡蛋白1)係指來自任何脊椎動物來源(包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠))之任何原生PD-L1，特定言之，具有如UniProt (www.uniprot.org)寄存編號Q15116 (SEQ ID NO：464)中所示之胺基酸序列的人類蛋白質PD-L1。術語「PD - 1 結合拮抗劑 」係指抑制PD-1結合至其配位體結合搭配物的分子。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1結合至PD-L1。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1結合至PD-L2。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1結合至PD-L1與PD-L2。特定言之，PD-L1結合拮抗劑為抗PD-L1抗體。術語「抗 PD - 1 抗體 」或「結合至人類PD-1之抗體」或「特異性結合至人類PD-1之抗體」或「拮抗性抗PD-1」係指以KD值為1.0×10- 8 mol/l或更低，在一個態樣中，KD值為1.0×10- 9 mol/l或更低之結合親和力特異性結合至人類PD1抗原的抗體。結合親和力係用標準結合分析(諸如表面電漿子共振技術(BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Sweden))測定。在一個態樣中，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為抗PD-1抗體。在一個特定態樣中，抗PD-1抗體選自由以下組成之群：MDX 1106 (納武單抗(nivolumab))、MK-3475(派立珠單抗(pembrolizumab))、CT-011 (皮立珠單抗(pidilizumab))、MEDI-0680 (AMP-514)、PDR001、REGN2810及BGB-108，尤其為派立珠單抗及納武單抗。在另一態樣中，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為包含SEQ ID NO：465之重鏈可變域VH (PD-1)及SEQ ID NO：466之輕鏈可變域VL (PD-1)的抗PD-1抗體。在另一態樣中，阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑為包含SEQ ID NO：467之重鏈可變域VH (PD-1)及SEQ ID NO：468之輕鏈可變域VL (PD-1)的抗PD-1抗體。
在另一態樣中，提供一種組合產物，其包含如本文所述的雙特異性促效CD28抗原結合分子及阻斷PD-L1/PD-1相互作用的藥劑，諸如PD-L1結合拮抗劑或PD-1結合拮抗劑，特定言之，抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體。
上述此類組合療法涵蓋組合投藥(其中兩種或更多種治療劑包括在相同或各別調配物中)及分開投藥，在此情況下，投與治療劑可在投與另一種或多種治療劑之前、同時及/或之後進行。在一個實施例中，治療劑之投與及另一種治療劑之投與彼此在約一個月內，或在約一週、兩週或三週內，或在約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內進行。
製品 在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。製品包含容器及附於或繫連於容器之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器裝有單獨或與有效治療、預防及/或診斷病狀之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子。標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可以包含(a)其中含有組合物的第一容器，其中該組合物包含本發明之雙特異性促效CD28抗原結合分子；及(b)其中含有組合物的第二容器，其中該組合物包含另一種細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可以進一步包含指示組合物可以用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三）容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可以進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。表 B ( 序列 ) ：
SEQ ID NO: 名稱 序列
1 hu CD28 UniProt編號P10747，1版
2 hu FAP UniProt編號Q12884，168版
3 hu CEA UniProt寄存號P06731
4 FAP (28H1) CDR-H1 SHAMS
5 FAP (28H1) CDR-H2 AIWASGEQYYADSVKG
6 FAP (28H1) CDR-H3 GWLGNFDY
7 FAP (28H1) CDR-L1 RASQSVSRSYLA
8 FAP (28H1) CDR-L2 GASTRAT
9 FAP (28H1) CDR-L3 QQGQVIPPT
10 FAP(28H1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSHAMSWVRQAPGKGLEWVSAIWASGEQYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWLGNFDYWGQGTLVTVSS
11 FAP(28H1) VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSRSYLAWYQQKPGQAPRLLIIGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGQVIPPTFGQGTKVEIK
12 FAP(4B9)  CDR-H1 SYAMS
13 FAP(4B9)  CDR-H2 AIIGSGASTYYADSVKG
14 FAP(4B9)  CDR-H3 GWFGGFNY
15 FAP(4B9)  CDR-L1 RASQSVTSSYLA
16 FAP(4B9)  CDR-L2 VGSRRAT
17 FAP(4B9)  CDR-L3 QQGIMLPPT
18 FAP(4B9)  VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
19 FAP(4B9)  VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
20 CD28(SA) CDR-H1 SYYIH
21 CD28(SA) CDR-H2 CIYPGNVNTNYNEKFKD
22 CD28(SA) CDR-H3 SHYGLDWNFDV
23 CD28(SA) CDR-L1 HASQNIYVWLN
24 CD28(SA) CDR-L2 KASNLHT
25 CD28(SA) CDR-L3 QQGQTYPYT
26 CD28(SA) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
27 CD28(SA) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
28 CD28(mAb 9.3) CDR-H1 DYGVH
29 CD28(mAb 9.3) CDR-H2 VIWAGGGTNYNSALMS
30 CD28(mAb 9.3) CDR-H3 DKGYSYYYSMDY
31 CD28(mAb 9.3) CDR-L1 RASESVEYYVTSLMQ
32 CD28(mAb 9.3) CDR-L2 AASNVES
33 CD28(mAb 9.3) CDR-L3 QQSRKVPYT
34 CD28(mAb 9.3) VH EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSS
35 CD28(mAb 9.3) VL DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIK
36 CD28 CDR-H1共同序列 SYYIH
37 CD28 CDR-H2共同序列 SIYPX1 X2 X3 X4 TNYNEKFKD，其中 X1 為G或R X2 為N或D X3 為V或G X4 為N或Q或A
38 CD28 CDR-H3共同序列 SHYGX5 DX6 NFDV，其中 X5 為L或A X6 為W或H或Y或F
39 CD28 CDR-L1共同序列 X7 ASQX8 IX9 X10 X11 LN，其中 X7 為H或R X8 為N或G X9 為Y或S X10 為V或N X11 為W或H或F或Y
40 CD28 CDR-L2共同序列 X12 X13 SX14 LX15 X16 ，其中 X12 為K或Y X13 為A或T X14 為N或S X15 為H或Y X16 為T或S
41 CD28 CDR-L3共同序列 QQX17 QTYPYT，其中 X17 為G或A
42 CD28 VH變異體a QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
43 CD28 VH變異體b QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS
44 CD28 VH變異體c QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGADHNFDVWGQGTTVTVSS
45 CD28 VH變異體d QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRDGQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDYNFDVWGQGTTVTVSS
46 CD28 VH變異體e QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
47 CD28 VH變異體f QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSS
48 CD28 VH變異體g QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS
49 CD28 VH變異體h QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRDVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSS
50 CD28 VH變異體i EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVNTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
51 CD28 VH變異體j EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVATRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSS
52 CD28 VL變異體k DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAQTYPYTFGGGTKVEIK
53 CD28 VL變異體l DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
54 CD28 VL變異體m DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
55 CD28 VL變異體n DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
56 CD28 VL變異體o DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
57 CD28 VL變異體p DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
58 CD28 VL變異體q DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISNHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
59 CD28 VL變異體r DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
60 CD28 VL變異體s DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIK
61 CD28 VL變異體t DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIK
62 CD28(SA)輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
63 CD28(SA) hu IgG4重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
64 CD28(SA) hu IgG1 PGLALA重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
65 VL-CD28(SA)-CL「RK」 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
66 CD28(SA) hu IgG1 PGLALA Fc杵 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
67 FAP(4B9) VL-CH hu IgG1 PGLALA Fc臼 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
68 FAP(4B9) VH-Cκ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
69 CD28(SA) VHCH-VHCH Fc杵FAP(4B9) VH PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
70 CD28(SA) VHCH-VHCH Fc臼FAP(4B9) VL PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
71 CD28(SA) VHCH- Fc杵FAP(4B9) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
72 CD28(SA) VHCH- Fc臼FAP(4B9) VL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
73 CD28(SA) VHCH 「EE」- Fc PGLALA FAP(4B9) VHCL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
74 FAP(4B9) VLCH1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD
75 CD28(SA) VLCH1- FAP(4B9) VHCH1 「EE」- Fc杵PGLALA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
76 FAP(4B9) VHCH1 「EE」- Fc臼PGLALA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
77 CD28(SA) VHCL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
78 FAP(4B9) VLCL 「RK」 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
79 Fc臼PGLALA DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
80 Fc杵-FAP(4B9) VH DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
81 CD28(SA) VHCH1 「EE」- Fc PGLALA CEA VHCL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
82 CEAVLCH1 QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
83 CD28(SA) VHCH1- Fc杵CEA VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
84 CD28(SA) VHCH1- Fc臼CEA VL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL
85 CD28(SA) VHCH1 「EE」- Fc臼PGLALA HYRF QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP
86 Fc杵PGLALA DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
87 CEA VL-CH1 hu IgG1 PGLALA Fc臼 QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
88 CEAVH-CL EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
89 CD28(mAb 9.3)輕鏈 DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
90 CD28(mAb 9.3) hu IgG1 PGLALA重鏈 EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
91 CD28(mAb 9.3) hu IgG輕鏈「RK」 EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
92 CD28(mAb 9.3) hu IgG1 PGLALA Fc杵「EE」 DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
93 CD28(mAb 9.3) VHCH-VHCH Fc杵FAP(4B9) VH PGLALA EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
94 CD28(mAb 9.3) VHCH-VHCH Fc臼FAP(4B9) VL PGLALA EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
95 CD28(mAb 9.3) VHCH- Fc杵FAP(4B9) VH EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSS
96 CD28(mAb 9.3) VHCH- Fc臼FAP(4B9) VL EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
97 CD28(mAb 9.3) VHCH 「EE」- Fc PGLALA FAP(4B9) VHCL EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
98 CD28(mAb 9.3) VLCL 「RK」 DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
99 FAP(4B9) VLCH1 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
100 CD28(mAb 9.3) VLCH1- FAP(4B9) VHCH1 「EE」- Fc杵PGLALA DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
101 CD28(mAb 9.3) VHCL EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
102 CD28(mAb 9.3) VHCH1 「EE」- Fc PGLALA CEA VHCL EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
103 CD28(mAb 9.3) VHCH1- Fc杵CEA VH EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
104 CD28(mAb 9.3) VHCH1- Fc臼CEA VL EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL
105 CD28(mAb 9.3) VHCH1 「EE」- Fc臼PGLALA HYRF EVKLQQSGPGLVTPSQSLSITCTVSGFSLSDYGVHWVRQSPGQGLEWLGVIWAGGGTNYNSALMSRKSISKDNSKSQVFLKMNSLQADDTAVYYCARDKGYSYYYSMDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
106 CD28(mAb 9.3) VLCL 「RK」 DIELTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVEYYVTSLMQWYQQKPGQPPKLLIFAASNVESGVPARFSGSGSGTNFSLNIHPVDEDDVAMYFCQQSRKVPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
107 CD28(SA) VHCH1 「EE」 Fc臼PGLALA FAP(4B9) VH - CEA(Medi-565) VHCL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
108 CD28(SA) VHCH1 「EE」 Fc杵PGLALA FAP(4B9) VL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIK
109 CEA VLCH1 QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
110 CD28(SA) VHCH1 Fc臼PGLALA FAP(4B9) VH - CEA VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
111 CD28(SA) VHCH1 Fc杵PGLALA FAP(4B9) VL - CEA VL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL
112 VH (CD28 SA) CH1 (EE)- Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
113 VH (CD28變異體g) CH1 (EE) - Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPRNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
114 VH (CD28變異體f) CH1 (EE) - Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
115 VH (CD28變異體j) CH1 (EE) - Fc杵PGLALA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVATRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
116 VH (CD28變異體e) CH1 (EE)- Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
117 VH (CD28變異體b) CH1 (EE) - Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDHNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
118 VH (CD28變異體a) CH1 (EE) - Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
119 VH (CD28變異體i) CH1 (EE) - Fc杵PGLALA EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYYIHWVRQAPGKGLEWVASIYPGNVNTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
120 VL (CD28變異體k)-CL (RK) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVHLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
121 VL (CD28變異體l)-CL (RK) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
122 VL (CD28變異體m)-CL (RK) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
123 VL (CD28變異體r)-CL (RK) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
124 VL (CD28變異體s)-CL (RK) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGISVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
125 VL (CD28變異體t)-CL (RK) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
126 Fc臼PGLALA, HYRF DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSP
127 CEA CDR-H1 SYWMH
128 CEA CDR-H2 FIRNKANGGTTEYAASVKG
129 CEA CDR-H3 DRGLRFYFDY
130 CEA CDR-L1 TLRRGINVGAYSIY
131 CEA CDR-L2 YKSDSDKQQGSGV
132 CEA CDR-L3 MIWHSGASAV
133 CEA VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTVSSYWMHWVRQAPGKGLEWVGFIRNKANGGTTEYAASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
134 CEA VL QAVLTQPASLSASPGASASLTCTLRRGINVGAYSIYWYQQKPGSPPQYLLRYKSDSDKQQGSGVSSRFSASKDASANAGILLISGLQSEDEADYYCMIWHSGASAVFGGGTKLTVL
135 His標記的人類FAP ECD RPSRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEEYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
136 小鼠FAP UniProt寄存號P97321
137 His標記的小鼠FAP ECD RPSRVYKPEGNTKRALTLKDILNGTFSYKTYFPNWISEQEYLHQSEDDNIVFYNIETRESYIILSNSTMKSVNATDYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLQNGEFVRGYELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITYTGRENRIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPDGKFLAYVEFNDSDIPIIAYSYYGDGQYPRTINIPYPKAGAKNPVVRVFIVDTTYPHHVGPMEVPVPEMIASSDYYFSWLTWVSSERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWHAWECPKNQEHVEESRTGWAGGFFVSTPAFSQDATSYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAIYIFRVTQDSLFYSSNEFEGYPGRRNIYRISIGNSPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSYKAKYYALVCYGPGLPISTLHDGRTDQEIQVLEENKELENSLRNIQLPKVEIKKLKDGGLTFWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVKSVFAVNWITYLASKEGIVIALVDGRGTAFQGDKFLHAVYRKLGVYEVEDQLTAVRKFIEMGFIDEERIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASIYSERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGILSGRSQNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
138 His標記的食蟹獼猴FAP ECD RPPRVHNSEENTMRALTLKDILNGTFSYKTFFPNWISGQEYLHQSADNNIVLYNIETGQSYTILSNRTMKSVNASNYGLSPDRQFVYLESDYSKLWRYSYTATYYIYDLSNGEFVRGNELPRPIQYLCWSPVGSKLAYVYQNNIYLKQRPGDPPFQITFNGRENKIFNGIPDWVYEEEMLATKYALWWSPNGKFLAYAEFNDTDIPVIAYSYYGDEQYPRTINIPYPKAGAKNPFVRIFIIDTTYPAYVGPQEVPVPAMIASSDYYFSWLTWVTDERVCLQWLKRVQNVSVLSICDFREDWQTWDCPKTQEHIEESRTGWAGGFFVSTPVFSYDAISYYKIFSDKDGYKHIHYIKDTVENAIQITSGKWEAINIFRVTQDSLFYSSNEFEDYPGRRNIYRISIGSYPPSKKCVTCHLRKERCQYYTASFSDYAKYYALVCYGPGIPISTLHDGRTDQEIKILEENKELENALKNIQLPKEEIKKLEVDEITLWYKMILPPQFDRSKKYPLLIQVYGGPCSQSVRSVFAVNWISYLASKEGMVIALVDGRGTAFQGDKLLYAVYRKLGVYEVEDQITAVRKFIEMGFIDEKRIAIWGWSYGGYVSSLALASGTGLFKCGIAVAPVSSWEYYASVYTERFMGLPTKDDNLEHYKNSTVMARAEYFRNVDYLLIHGTADDNVHFQNSAQIAKALVNAQVDFQAMWYSDQNHGLSGLSTNHLYTHMTHFLKQCFSLSDGKKKKKKGHHHHHH
139 人類FolR1 UniProt寄存號P15328
140 鼠類FolR1 UniProt寄存號P35846
141 食蟹獼猴FolR1 UniProt寄存號G7PR14
142 人類MCSP UniProt寄存號Q6UVK1
143 人類EGFR UniProt寄存號P00533
144 人類HER2 UniProt寄存號P04626
145 p95 HER2 MPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTSIISAVVGILLVVVLGVVFGILIKRRQQKIRKYTMRRLLQETELVEPLTPSGAMPNQAQMRILKETELRKVKVLGSGAFGTVYKGIWIPDGENVKIPVAIKVLRENTSPKANKEILDEAYVMAGVGSPYVSRLLGICLTSTVQLVTQLMPYGCLLDHVRENRGRLGSQDLLNWCMQIAKGMSYLEDVRLVHRDLAARNVLVKSPNHVKITDFGLARLLDIDETEYHADGGKVPIKWMALESILRRRFTHQSDVWSYGVTVWELMTFGAKPYDGIPAREIPDLLEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDSECRPRFRELVSEFSRMARDPQRFVVIQNEDLGPASPLDSTFYRSLLEDDDMGDLVDAEEYLVPQQGFFCPDPAPGAGGMVHHRHRSSSTRSGGGDLTLGLEPSEEEAPRSPLAPSEGAGSDVFDGDLGMGAAKGLQSLPTHDPSPLQRYSEDPTVPLPSETDGYVAPLTCSPQPEYVNQPDVRPQPPSPREGPLPAARPAGATLERPKTLSPGKNGVVKDVFAFGGAVENPEYLTPQGGAAPQPHPPPAFSPAFDNLYYWDQDPPERGAPPSTFKGTPTAENPEYLGLDVPV
146 肽連接子(G4S) GGGGS
147 肽連接子(G4S)2 GGGGSGGGGS
148 肽連接子(SG4)2 SGGGGSGGGG
149 肽連接子G4(SG4)2 GGGGSGGGGSGGGG
150 肽連接子 GSPGSSSSGS
151 (G4S)3肽連接子 GGGGSGGGGSGGGGS
152 (G4S)4肽連接子 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
153 肽連接子 GSGSGSGS
154 肽連接子 GSGSGNGS
155 肽連接子 GGSGSGSG
156 肽連接子 GGSGSG
157 肽連接子 GGSG
158 肽連接子 GGSGNGSG
159 肽連接子 GGNGSGSG
160 肽連接子 GGNGSG
161 輕鏈 「CEA2F1 」 (CEA TCB) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASAAVGTYVA WYQQKPGKAPKLLIYSASYRKR GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
162 人類化輕鏈 CD3CH2527 (互換fab, VL-CH1) (CEA TCB) QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYAN WVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAP GTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWV FGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
163 CEACH1A1A 98/99 — 人類化CD3CH2527 (互換fab VH-Ck)—Fc(杵) P329GLALA (CEA TCB) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMN WVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKG RVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDY WGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMN WVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKG RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAY WGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
164 CEACH1A1A 98/99 (VH-CH1)—Fc(臼) P329GLALA (CEA TCB) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTEFGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTKTGEATYVEEFKGRVTFTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARWDFAYYVEAMDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
165 CD3 VH-CL (CEACAM5 TCB) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
166 人類化CEA VH-CH1(EE)-Fc (臼, P329G LALA) (CEACAM5 TCB) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
167 人類化CEA VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (杵, P329G LALA) (CEACAM5 TCB) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
168 人類化CEA VL-CL(RK) (CEACAM5 TCB) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
169 基於CEACAM5的抗原Hu N(A2-B2)A-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGTQQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQFHVYPELPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPRLQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTISPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNSGLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSALSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNLTCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEVFNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHHHHHH
170 CEA (A5B7)- CDR-H1 DYYMN
171 CEA (A5B7)- CDR-H2 FIGNKANGYTTEYSASVKG
172 CEA (A5B7)- CDR-H3 DRGLRFYFDY
173 CEA (A5B7)- CDR-L1 RASSSVTYIH
174 CEA (A5B7)- CDR-L2 ATSNLAS
175 CEA (A5B7)- CDR-L3 QHWSSKPPT
176 IgG1 Fc杵PGLALA APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
177 IgG1 Fc臼PGLALA APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
178 CEA (A5B7) VH (親本) EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS
179 CEA (A5B7) VL (親本) QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGGTKLEIK
180 CEA (A5H1EL1D)- CDR-H1 GFTFTDYYMN
181 CEA (A5H1EL1D)- CDR-H2 FIGNKANAYTTEYSASVKG
182 CEA (A5H1EL1D)- CDR-H3 DRGLRFYFDY
183 CEA (A5H1EL1D)- CDR-L1 RASSSVTYIH
184 CEA (A5H1EL1D)- CDR-L2 ATSNLAS
185 CEA (A5H1EL1D)- CDR-L3 QHWSSKPPT
186 CEA (A5H1EL1D) VH (3-23A5-1E) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
187 CEA (A5H1EL1D) VL (A5-L1D) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
188 CEA (A5H1EL1D親和成熟) CDR-H1共同序列 GFX1 FX2 DYX3 MN，其中 X1 為T或Y, X2 為T或S, 及 X3 為Y或A或E
189 CEA (A5H1EL1D親和成熟) CDR-H2共同序列 X4 IX5 NKANAYTTEYSASVKG，其中 X4 為F或V, X5 為G或S
190 CEA (A5H1EL1D親和成熟) CDR-H3共同序列 DRGX6 RFX7 FDY，其中 X6 為L或I, X7 為Y或G或Q或S
191 CEA (A5H1EL1D親和成熟) CDR-L1共同序列 X8 ASSSVTYIH，其中 X8 為R或H
192 CEA (A5H1EL1D親和成熟) CDR-L2共同序列 ATSNLAS
193 CEA (A5H1EL1D親和成熟) CDR-L3共同序列 QHWSSX9 X10 PT，其中 X9 為K或V或Q或I, X10 為P或S
194 CEA (P006.038) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
195 CEA (P006.038) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
196 CEA (P005.097) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFSFDYWGQGTTVTVSS
197 CEA (P005.097) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSQPPTFGQGTKLEIK
198 CEA (P005.103) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFYFDYWGQGTTVTVSS
199 CEA (P005.103) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
200 CEA (P002.139) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
201 CEA (P002.139) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
202 CEA (P001.177) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
203 CEA (P001.177) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
204 CEA (P005.102) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
205 CEA (P005.102) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
206 CEA (P005.102 combo1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
207 CEA (P005.102 combo1) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
208 CEA (P005.102 combo2) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
209 CEA (P005.102 combo2) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
210 CEA (P005.103 combo1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS
211 CEA (P005.103 combo1) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
212 CEA (P005.103 combo2) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS
213 CEA (P005.103 combo2) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
214 CEA (P006.038 combo1) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
215 CEA (P006.038 combo1) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
216 CEA (P006.038 combo2) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYEMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
217 CEA (P006.038 combo2) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
218 IGHV3-23-02 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK
219 IGHV3-15*01 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTT
220 3-23A5-1 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
221 3-23A5-2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
222 3-23A5-3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
223 3-23A5-4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
224 3-23A5-1A (全部回復突變) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
225 3-23A5-1C (A93T) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
226 3-23A5-1D (K73) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
227 3-15A5-1 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
228 3-15A5-2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGYTTEYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
229 3-15A5-3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGFIGNKANGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
230 IGKV3-11 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
231 A5-L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
232 A5-L2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
233 A5-L3 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
234 A5-L4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSKPPTFGQGTKLEIK
235 A5-L1A (全部回復突變) QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
236 A5-L1B (Q1T2) QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
237 A5-L1C (FR2) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
238 NABA-avi-His 參見表15
239 N(A2B2)A-avi-His 參見表15
240 NA(B2)A-avi-His 參見表15
241 A5H1EL1D_H1_rev_TN 參見表16
242 A5H1EL1D_H2_for_TN 參見表16
243 長LMB3 參見表16
244 HCDR3-rev-恆定區 參見表16
245 A5H1EL1D_L1_rev_TN 參見表17
246 A5H1EL1D_L2_for_TN 參見表17
247 A5H1EL1D _L3_for_TN 參見表18
248 A5H1EL1D _H3_rev_TN 參見表18
249 LCDR3-rev-恆定區 參見表18
250 HCDR3擴增 參見表18
251 CEA (P006.038)- CDR-H1 參見表22
252 CEA (P006.038)- CDR-H2 參見表22
253 CEA (P006.038)- CDR-H3 參見表22
254 CEA (P006.038)- CDR-L1 參見表23
255 CEA (P006.038)- CDR-L2 參見表23
256 CEA (P006.038)- CDR-L3 參見表23
257 CEA (P005.097)- CDR-H1 參見表22
258 CEA (P005.097)- CDR-H2 參見表22
259 CEA (P005.097)- CDR-H3 參見表22
260 CEA (P005.097)- CDR-L1 參見表23
261 CEA (P005.097)- CDR-L2 參見表23
262 CEA (P005.097)- CDR-L3 參見表23
263 CEA (P005.103)- CDR-H1 參見表22
264 CEA (P005.103)- CDR-H2 參見表22
265 CEA (P005.103)- CDR-H3 參見表22
266 CEA (P005.103)- CDR-L1 參見表23
267 CEA (P005.103)- CDR-L2 參見表23
268 CEA (P005.103)- CDR-L3 參見表23
269 CEA (P002.139)- CDR-H1 參見表22
270 CEA (P002.139)- CDR-H2 參見表22
271 CEA (P002.139)- CDR-H3 參見表22
272 CEA (P002.139)- CDR-L1 參見表23
273 CEA (P002.139)- CDR-L2 參見表23
274 CEA (P002.139)- CDR-L3 參見表23
275 CEA (P001.177)- CDR-H1 參見表22
276 CEA (P001.177)- CDR-H2 參見表22
277 CEA (P001.177)- CDR-H3 參見表22
278 CEA (P001.177)- CDR-L1 參見表23
279 CEA (P001.177)- CDR-L2 參見表23
280 CEA (P001.177)- CDR-L3 參見表23
281 CEA (P005.102)- CDR-H1 參見表22
282 CEA (P005.102)- CDR-H2 參見表22
283 CEA (P005.102)- CDR-H3 參見表22
284 CEA (P005.102)- CDR-L1 參見表23
285 CEA (P005.102)- CDR-L2 參見表23
286 CEA (P005.102)- CDR-L3 參見表23
287 CEA (P005.102-combo1)- CDR-H1 參見表22
288 CEA (P005.102-combo1)- CDR-H2 參見表22
289 CEA (P005.102-combo1)- CDR-H3 參見表22
290 CEA (P005.102-combo1)- CDR-L1 參見表23
291 CEA (P005.102-combo1)- CDR-L2 參見表23
292 CEA (P005.102-combo1)- CDR-L3 參見表23
293 CEA (P005.102-combo2)- CDR-H1 參見表22
294 CEA (P005.102-combo2)- CDR-H2 參見表22
295 CEA (P005.102-combo2)- CDR-H3 參見表22
296 CEA (P005.102-combo2)- CDR-L1 參見表23
297 CEA (P005.102-combo2)- CDR-L2 參見表23
298 CEA (P005.102-combo2)- CDR-L3 參見表23
299 CEA (P005.103-combo1)- CDR-H1 參見表22
300 CEA (P005.103-combo1)- CDR-H2 參見表22
301 CEA (P005.103-combo1)- CDR-H3 參見表22
302 CEA (P005.103-combo1)- CDR-L1 參見表23
303 CEA (P005.103-combo1)- CDR-L2 參見表23
304 CEA (P005.103-combo1)- CDR-L3 參見表23
305 CEA (P005.103-combo2)- CDR-H1 參見表22
306 CEA (P005.103-combo2)- CDR-H2 參見表22
307 CEA (P005.103-combo2)- CDR-H3 參見表22
308 CEA (P005.103-combo2)- CDR-L1 參見表23
309 CEA (P005.103-combo2)- CDR-L2 參見表23
310 CEA (P005.103-combo2)- CDR-L3 參見表23
311 CEA (P006.038-combo1)- CDR-H1 參見表22
312 CEA (P006.038-combo1)- CDR-H2 參見表22
313 CEA (P006.038-combo1)- CDR-H3 參見表22
314 CEA (P006.038-combo1)- CDR-L1 參見表23
315 CEA (P006.038-combo1)- CDR-L2 參見表23
316 CEA (P006.038-combo1)- CDR-L3 參見表23
317 CEA (P006.038-combo2)- CDR-H1 參見表22
318 CEA (P006.038-combo2)- CDR-H2 參見表22
319 CEA (P006.038-combo2)- CDR-H3 參見表22
320 CEA (P006.038-combo2)- CDR-L1 參見表23
321 CEA (P006.038-combo2)- CDR-L2 參見表23
322 CEA (P006.038-combo2)- CDR-L3 參見表23
323 VL CEA (A5H1EL1D) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
324 VH CEA (A5H1EL1D) - CL 參見表24
325 VL CEA (P006.038) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
326 VH CEA (P006.038) - CL 參見表24
327 VL CEA (P005.097) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
328 VH CEA (P005.097) - CL 參見表24
329 VL CEA (P005.103) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
330 VH CEA (P005.103) - CL 參見表24
331 VL CEA (P002.139) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
332 VH CEA (P002.139) - CL 參見表24
333 VL CEA (P001.177) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
334 VH CEA (P001.177) - CL 參見表24
335 VL CEA (P005.102) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
336 VH CEA (P005.102) - CL 參見表24
337 VL CEA (P005.102 combo1) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
338 VH CEA (P005.102 combo1) - CL 參見表24
339 VL CEA (P005.102 combo2) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
340 VH CEA (P005.102 combo2) - CL 參見表24
341 VL CEA (P005.103 combo1) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
342 VH CEA (P005.103 combo1) - CL 參見表24
343 VL CEA (P005.103 combo2) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
344 VH CEA (P005.103 combo2) - CL 參見表24
345 VL CEA (P006.038 combo1) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
346 VH CEA (P006.038 combo1) - CL 參見表24
347 VL CEA (P006.038 combo2) -CH1- Fc臼PGLALA 參見表24
348 VH CEA (P006.038 combo2) - CL 參見表24
349 VH CD28 (SA_變異體15) - CH1- Fc杵PGLALA 參見表24
350 VL CD28 (SA_變異體15) - CL 參見表24
351 CEA(A5H1EL1D) VL-CH1 hu IgG1 Fc臼PGLALA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
352 CEA(A5H1EL1D) VH-Cκ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
353 CD28(SA) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
354 CD28(SA) hu IgG1 VL-Ck 「RK」 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
355 CD28(SA_變異體8) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
356 CD28(SA_變異體8) hu IgG1 VL-Ck 「RK」 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
357 CD28(SA_變異體15) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
358 CD28(SA_變異體15) hu IgG1 VL-Ck 「RK」 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
359 CD28(SA_變異體29) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
360 CEA(A5H1EL1D) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc臼PGLALA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
361 CEA(A5H1EL1D) hu IgG1 VL-Ck 「RK」 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
362 CD28(SA) VL-CH1 hu IgG1 Fc杵PGLALA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
363 CD28(SA) VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
364 CD28(SA_變異體8) VL-CH1 hu IgG1 Fc杵PGLALA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
365 CD28(SA_變異體8) VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
366 CD28(SA_變異體15) VL-CH1 hu IgG1 Fc杵PGLALA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
367 CD28(SA_變異體15) VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
368 CD28(SA_變異體29) VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
369 CEA(T84.66) VL-CH1 hu IgG1 Fc臼PGLALA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
370 CEA(T84.66) VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
371 CEA(T84.66) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc臼PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
372 CEA(T84.66) hu IgG1 VL-Ck 「RK」 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
373 CEA(A5H1EL1D) VH-CH1-VH-CH1 「EE」 hu IgG1 Fc臼PGLALA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
374 CD28(SA) VL-CH1 CEA(A5H1EL1D) VH-CH1 「EE」 hu IgG1 Fc杵PGLALA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
375 CEA(P002.139) VL-CH1 hu IgG1 Fc臼PGLALA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
376 CEA(P002.139) VH-Cκ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
377 CD28 (SA_變異體8) hu IgG1輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
378 CD28(SA_變異體8) hu IgG1 PGLALA重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
379 CD28 (SA_變異體11) hu IgG1輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
380 CD28(SA_變異體11) hu IgG1 PGLALA重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDFNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
381 CD28 (SA_變異體15) hu IgG1輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
382 CD28(SA_變異體15) hu IgG1 PGLALA重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
383 CD28 (SA_變異體27) hu IgG1輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQGIYVYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
384 CD28(SA_變異體27) hu IgG1 PGLALA重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
385 CD28 (SA_變異體29) hu IgG1輕鏈 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
386 CD28(SA_變異體29) hu IgG1 PGLALA重鏈 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
387 Avi標籤 GLNDIFEAQKIEWHE
388 CD28 VHCH1 「EE」-(G4S)2 - FAP (4B9)-VHCH1 「EE」 - Fc杵PGLALA QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGCIYPGNVNTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIIGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKGWFGGFNYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
389 CD28 VLCL 「RK」-(G4S)2 - FAP (4B9)-VLCL 「RK」 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVWLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTSSYLAWYQQKPGQAPRLLINVGSRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQGIMLPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
390 EpCAM(MT201) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc臼PGLALA EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDMGWGSGWRPYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
391 EpCAM(MT201) VL-Cκ 「RK」 ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
392 Her3 VL-CH1 hu IgG1 Fc臼PGLALA DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQSDYSYPYTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
393 HER3 VH-Cκ QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFRSSYISWVRQAPGQGLEWMGWIYAGTGSPSYNQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARHRDYYSNSLTYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
394 CD30 VL-CH1 hu IgG1 Fc臼PGLALA DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
395 CD30 VH-Cκ QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSAASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
396 TPBG VL-CH1 hu IgG1 Fc臼PGLALA DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQIGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
397 TPBG VH-Cκ EVHLLESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFTFRSDAMHWVRQAPGKGLEWVSGVSGSGGSPYYADSVKGRFTISRDDSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGGSIAGSYYYYPMDVWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
398 GPRC5D (5E11) hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc臼PGLALA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
399 GPRC5D (5E11)VL-Cκ 「RK」 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
400 CD38 VL-CH1 hu IgG1 Fc臼PGLALA EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
401 CD38 VH-Cκ EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
402 BCMA hu IgG1 VH-CH1 「EE」 Fc臼PGLALA EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMSLWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
403 BCMA VL-Cκ 「RK」 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSAYYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYERWPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
404 GPRC5D (5E11) VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (杵, P329G LALA) (GPRC5D TCB) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
405 CD3 VH-CL (GPRC5D TCB) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
406 CD19 (8B8-2B11) CDR-H1 DYIMH
407 CD19 (8B8-2B11) CDR-H2 YINPYNDGSKYTEKFQG
408 CD19 (8B8-2B11) CDR-H3 GTYYYGPQLFDY
409 CD19 (8B8-2B11) CDR-L1 KSSQSLETSTGTTYLN
410 CD19 (8B8-2B11) CDR-L2 RVSKRFS
411 CD19 (8B8-2B11) CDR-L3 LQLLEDPYT
412 CD19 (8B8-2B11) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSS
413 CD19 (8B8-2B11) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIK
414 CD19 (8B8-018) CDR-H1 DYIMH
415 CD19 (8B8-018) CDR-H2 YINPYNDGSKYTEKFQG
416 CD19 (8B8-018) CDR-H3 GTYYYGSALFDY
417 CD19 (8B8-018) CDR-L1 KSSQSLENPNGNTYLN
418 CD19 (8B8-018) CDR-L2 RVSKRFS
419 CD19 (8B8-018) CDR-L3 LQLTHVPYT
420 CD19 (8B8-018) VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGSALFDYWGQGTTVTVSS
421 CD19 (8B8-018) VL DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLENPNGNTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLTHVPYTFGQGTKLEIK
422 CD79b (huMA79b.v28) CDR-H1 SYWIE
423 CD79b (huMA79b.v28) CDR-H2 EILPGGGDTNYNEIFKG
424 CD79b (huMA79b.v28) CDR-H3 RVPIRLDY
425 CD79b (huMA79b.v28) CDR-L1 KASQSVDYEGDSFLN
426 CD79b (huMA79b.v28) CDR-L2 AASNLES
427 CD79b (huMA79b.v28) CDR-L3 QQSNEDPLT
428 CD79b (huMA79b.v28) VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIE WVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKG RATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDY WGQGTLVTVSS
429 CD79b (huMA79b.v28) VL DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLN WYQQKPGKAPKLLIYAASNLES GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPLT FGQGTKVEIK
430 VL (CD19 2B11) -CH1 Fc臼PGLALA DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLETSTGTTYLNWYLQKPGQSPQLLIYRVSKRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCLQLLEDPYTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
431 VH (CD19 2B11) CL QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYIMHWVRQAPGQGLEWMGYINPYNDGSKYTEKFQGRVTMTSDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGTYYYGPQLFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
432 VL (huMA79b.v28) -CH1 Fc臼PGLALA DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDYEGDSFLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPLTFGQGTKVEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
433 VH (huMA79b.v28) CL EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFSSYWIEWVRQAPGKGLEWIGEILPGGGDTNYNEIFKGRATFSADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCTRRVPIRLDYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
434 人類CD19 UniProt寄存號P15391
435 人類CD79b UniProt寄存號P40259
436 人類CD20 UniProt寄存號P11836
437 人類CD22 UniProt寄存號P20273
438 人類CD37 UniProt寄存號P11049
439 CD3-HCDR1 TYAMN
440 CD3-HCDR2 RIRSKYNNYATYYADSVKG
441 CD3-HCDR3 HGNFGNSYVSWFAY
442 CD3-LCDR1 GSSTGAVTTSNYAN
443 CD3-LCDR2 GTNKRAP
444 CD3-LCDR3 ALWYSNLWV
445 CD3 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
446 CD3 VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
447 CD20-HCDR1 YSWIN
448 CD20-HCDR2 RIFPGDGDTDYNGKFK
449 CD20-HCDR3 NVFDGYWLVY
450 CD20-LCDR1 RSSKSLLHSNGITYLY
451 CD20-LCDR2 QMSNLVS
452 CD20-LCDR3 AQNLELPYT
453 CD20 VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSS
454 CD20 VL DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIK
455 CD20 VH-CH1(EE)-CD3 VL-CH1-Fc (杵, P329G LALA) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDGGGGSGGGGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
456 CD20 VH-CH1(EE)-Fc (臼, P329G LALA) QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSYSWINWVRQAPGQGLEWMGRIFPGDGDTDYNGKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNVFDGYWLVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
457 CD20 VL-CL(RK) DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLVSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
458 CD3 VH-CL EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
459 人類PD-L1 UniProt寄存號Q9NZQ7
460 VH (PD-L1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS
461 VL (PD-L1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIK
462 VH (PD-L1) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS
463 VL (PD-L1) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIK
464 人類PD-1 Uniprot Q15116
465 VH (PD-1) QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS
466 VL (PD-1) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK
467 VH (PD-1) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS
468 VL (PD-1) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK
469 人類EpCAM UniProt編號P16422
470 鼠類EpCAM UniProt編號Q99JW5
471 人類HER3 UniProt編號P21860
472 人類CD30 UniProt編號P28908
473 人類TBPG UniProt編號Q13641
474 人類CD38 UniProt編號P28907
475 人類BCMA UniProt編號Q02223
476 人類GPRC5D UniProt編號Q9NZD1
477 IgG CH1域 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
478 IgG CH2域 APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK
479 IgG CH3域 GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
480 CH1連接子 EPKSC
481 全鉸鏈 DKTHTCPXCP，其中X為S或P
482 中等鉸鏈 HTCPXCP，其中X為S或P
483 短鉸鏈 CPXCP，其中X為S或P
484 IgG1，白種人異型 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
485 IgG1，非裔美國人異型 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
486 IgG2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
487 IgG3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
488 IgG4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
489 CD28(變異體8) CDR-H1 SYYIH
490 CD28(變異體8) CDR-H2 SIYPGNVQTNYNEKFKD
491 CD28(變異體8) CDR-H3 SHYGLDWNFDV
492 CD28(變異體8) CDR-L1 HASQNIYVYLN
493 CD28(變異體8) CDR-L2 KASNLHT
494 CD28(變異體8) CDR-L3 QQGQTYPYT
495 CD28(變異體15) CDR-H1 SYYIH
496 CD28(變異體15) CDR-H2 SIYPGNVQTNYNEKFKD
497 CD28(變異體15) CDR-H3 SHYGLDWNFDV
498 CD28(變異體15) CDR-L1 HASQNIYVFLN
499 CD28(變異體15) CDR-L2 KASNLHT
500 CD28(變異體15) CDR-L3 QQGQTYPYT
501 CD28(變異體29) CDR-H1 SYYIH
502 CD28(變異體29) CDR-H2 SIYPGNVNTNYNEKFKD
503 CD28(變異體29) CDR-H3 SHYGLDWNFDV
504 CD28(變異體29) CDR-L1 HASQNIYVWLN
505 CD28(變異體29) CDR-L2 KASNLHT
506 CD28(變異體29) CDR-L3 QQGQTYPYT
507 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H1 DTYMH
508 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H2 RIDPANGNSKYVPKFQG
509 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-H3 FGYYVSDYAMAY
510 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L1 RAGESVDIFGVGFLH
511 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L2 RASNRAT
512 CEA (T84.66-LCHA)- CDR-L3 QQTNEDPYT
513 CEA (T84.66-LCHA) VH QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFNIKDTYMHWVRQAPGQGLEWMGRIDPANGNSKYVPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAPFGYYVSDYAMAYWGQGTLVTVSS
514 CEA (T84.66-LCHA) VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAGESVDIFGVGFLHWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTNEDPYTFGQGTKLEIK
515 EpCAM (MT201)- CDR-H1 SYGMH
516 EpCAM (MT201)- CDR-H2 VISYDGSNKYYADSVKG
517 EpCAM (MT201)- CDR-H3 DMGWGSGWRPYYYYGM
518 EpCAM (MT201)- CDR-L1 RTSQSISSYLN
519 EpCAM (MT201)- CDR-L2 WASTRES
520 EpCAM (MT201)- CDR-L3 QQSYDIPYT
521 EpCAM (MT201) VH EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDMGWGSGWRPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
522 EpCAM (MT201) VL ELQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSQSISSYLNWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQSYDIPYTFGQGTKLEIK
523 HER3- CDR-H1 SSYIS
524 HER3- CDR-H2 WIYAGTGSPSYNQKLQG
525 HER3- CDR-H3 HRDYYSNSL
526 HER3- CDR-L1 KSSQSVLNSGNQKNYLT
527 HER3- CDR-L2 WASTRES
528 HER3- CDR-L3 QSDYSYPYT
529 HER3 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFRSSYISWVRQAPGQGLEWMGWIYAGTGSPSYNQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARHRDYYSNSLTYWGQGTLVTVSS
530 HER3 VL DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQSDYSYPYTFGQGTKLEIK
531 CD30- CDR-H1 DYYIT
532 CD30- CDR-H2 WIYPGSGNTKYNEKFKG
533 CD30- CDR-H3 YGNYWF
534 CD30- CDR-L1 KASQSVDFDGDSYMN
535 CD30- CDR-L2 AASNLES
536 CD30- CDR-L3 QQSNEDPWT
537 CD30 VH QIQLQQSGPEVVKPGASVKISCKASGYTFTDYYITWVKQKPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNEKFKGKATLTVDTSSSTAFMQLSSLTSEDTAVYFCANYGNYWFAYWGQGTQVTVSA
538 CD30 VL DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDFDGDSYMNWYQQKPGQPPKVLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK
539 TPBG(FAB091)- CDR-H1 SDAMH
540 TPBG(FAB091)- CDR-H2 GVSGSGGSPYYADSVKG
541 TPBG(FAB091)- CDR-H3 GGSIAGSYYYYPMDV
542 TPBG(FAB091)- CDR-L1 QASQDISNYLN
543 TPBG(FAB091)- CDR-L2 AASTLQI
544 TPBG(FAB091)- CDR-L3 QQANSFPLT
545 TPBG(FAB091) VH EVHLLESGGGLVHPGGSLRLSCAASGFTFRSDAMHWVRQAPGKGLEWVSGVSGSGGSPYYADSVKGRFTISRDDSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATGGSIAGSYYYYPMDVWGQGTTVTVSS
546 TPBG(FAB091) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQIGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK
547 CD38- CDR-H1 SFAMS
548 CD38- CDR-H2 AISGSGGGTYYADSVKG
549 CD38- CDR-H3 DKILWFGEPVFDY
550 CD38- CDR-L1 RASQSVSSYLA
551 CD38- CDR-L2 DASNRAT
552 CD38- CDR-L3 QQRSNWPPT
553 CD38 VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTFNSFAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGGTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCAKDKILWFGEPVFDYWGQGTLVTVSS
554 CD38 VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPTFGQGTKVEIK
555 BCMA - CDR-H1 SYAMN
556 BCMA - CDR-H2 AITASGGSTYYADSVKG
557 BCMA - CDR-H3 YWPMSL
558 BCMA - CDR-L1 RASQSVSAYYLA
559 BCMA - CDR-L2 DASIRAT
560 BCMA - CDR-L3 QQYERWPLT
561 BCMA VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSAITASGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYWPMSLWGQGTLVTVSS
562 BCMA VL EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSAYYLAWYQQKPGQAPRLLMYDASIRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYERWPLTFGQGTKVEIK
563 GPRC5D (5E11) - CDR-H1 KYAMA
564 GPRC5D (5E11) - CDR-H2 SISTGGVNTYYADSVKG
565 GPRC5D (5E11) - CDR-H3 HTGDYFDY
566 GPRC5D (5E11) - CDR-L1 RASQSVSISGINLMN
567 GPRC5D (5E11) - CDR-L2 HASILAS
568 GPRC5D (5E11) - CDR-L3 QQTRESPLT
569 GPRC5D (5E11) VH1c EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS
570 GPRC5D (5E11) VL2b EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
571 GPRC5D (5E11) VH1a EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS
572 GPRC5D (5E11) VH1b ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYRDSVKARFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS
573 GPRC5D (5E11) VH1d ELQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSKYAMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGVNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATHTGDYFDYWGQGTMVTVSS
574 GPRC5D (5E11) VL1a DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
575 GPRC5D (5E11) VL1c DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
576 GPRC5D (5E11) VL2a EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPRLLIYHASILASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
577 GPRC5D (5E11) VL3a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGKQPKLLIYHASILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
578 GPRC5D (5E11) VL3b DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSISGINLMNWYQQKPGQQPKLLIYHASILASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTRESPLTFGQGTRLEIK
579 GPRC5D (5F11) - CDR-H1 NYGMA
580 GPRC5D (5F11) - CDR-H2 SISTGGGNTYYRDSVKG
581 GPRC5D (5F11) - CDR-H3 HDRGGLY
582 GPRC5D (5F11) - CDR-L1 RSSKSLLHSNGITYVY
583 GPRC5D (5F11) - CDR-L2 RMSNRAS
584 GPRC5D (5F11) - CDR-L3 GQLLENPYT
585 GPRC5D (5F11) VH1a QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
586 GPRC5D (5F11) VH1b EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
587 GPRC5D (5F11) VH1c QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
588 GPRC5D (5F11) VH1d EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
589 GPRC5D (5F11) VH2b EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYRDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
590 GPRC5D (5F11) VH2d EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFSNYGMAWVRQAPGKGLEWVASISTGGGNTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRHDRGGLYWGQGTMVTVSS
591 GPRC5D (5F11) VL1a DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
592 GPRC5D (5F11) VL1b DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGKSPQVLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
593 GPRC5D (5F11) VL2a DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLHSNGITYVYWYLQKPGQSPQLLIYRMSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
594 GPRC5D (5F11) VL2b DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQPPKLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
595 GPRC5D (5F11) VL2c EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASKSLLHSNGITYVYWYQQKPGQAPRLLIYRMSNLASGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYHCGQLLENPYTFGQGTKLEIK
596 CD3 (Cl22) CDR-H1 SYAMN
597 CD3 (Cl22) CDR-H2 RIRSKYNNYATYYADSVKG
598 CD3 (Cl22) CDR-H3 HTTFPSSYVSYYGY
599 CD3 (Cl22) CDR-L1 GSSTGAVTTSNYAN
600 CD3 (Cl22) CDR-L2 GTNKRAP
601 CD3 (Cl22) CDR-L3 ALWYSNLWV
602 CD3 (Cl22) VH EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFQFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHTTFPSSYVSYYGYWGQGTLVTVSS
603 CD3 (Cl22) VL QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
604 CD3 (V9) CDR-H1 GYSFTGYTMN
605 CD3 (V9) CDR-H2 LINPYKGVSTYNQKFKD
606 CD3 (V9) CDR-H3 SGYYGDSDWYFDV
607 CD3 (V9) CDR-L1 RASQDIRNYLN
608 CD3 (V9) CDR-L2 YTSRLES
609 CD3 (V9) CDR-L3 QQGNTLPWT
610 CD3 (V9) VH EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSS
611 CD3 (V9) VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIK
關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資訊明示於Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署(Public Health Service), 國家衛生研究院(National Institutes of Health), Bethesda, MD (1991)。抗體鏈之胺基酸係根據如上文所定義之Kabat之編號系統(Kabat, E.A.等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, 美國公眾衛生服務署, 國家衛生研究院, Bethesda, MD (1991))編號且提及。
以下編號段落(段)描述本發明之態樣： 1. 一種以單價結合至CD28為特徵的雙特異性促效CD28抗原結合分子，該分子包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28的抗原結合域， (b)至少一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。 2. 如第1段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中該Fc域為IgG，特定言之，IgG1 Fc域或IgG4 Fc域。 3. 如第1段或第2段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中該Fc域屬於人類IgG1亞類且包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。 4. 如第1段至第3段中任一段之雙特異性促效CD28雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (i)包含SEQ ID NO：20之重鏈互補決定區CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：23之輕鏈互補決定區CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)；或 (ii)包含SEQ ID NO：36之CDR-H1、SEQ ID NO：37之CDR-H2及SEQ ID NO：38之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：39之CDR-L1、SEQ ID NO：40之CDR-L2及SEQ ID NO：41之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。 5. 如第1段至第4段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD28)，其包含SEQ ID NO：20之CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CD28)，其包含SEQ ID NO：23之CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3。 6. 如第1段至第5段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO：26之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD28)；以及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：27之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD28)。 7. 如第1段至第4段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列選自由以下組成之群的重鏈可變區(VH CD28)：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51；以及含有胺基酸序列選自由以下組成之群的輕鏈可變區(VL CD28)：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：60。 8. 如第1段至第4段或第7段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (b)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (c)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (d)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (e)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (f)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (g)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (h)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (j)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (k)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)。 9. 如第1段至第8段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至癌胚抗原(CEA)的抗原結合域。 10. 如第1段至第9段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CEA)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：127的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：128的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：129的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CEA)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO:130的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：131的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：132的CDR-L3。 11. 如第1段至第10段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CEA的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：133之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CEA)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：134之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CEA)。 12. 如第1段至第8段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至纖維母細胞活化蛋白(FAP)的抗原結合域。 13. 如第1段至第8段或第12段中任一段之雙特異性抗原結合分子，其中能夠特異性結合FAP至CD28的抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：12的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：13的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：14的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：15的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：16的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：17的CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：4的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：5的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：6的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：7的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：8的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：9的CDR-L3。 14. 如第1段至第8段或第12段或第13段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO：18之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO：19之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH FAP)，其包含與SEQ ID NO：10之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列，及輕鏈可變區(VL FAP)，其包含與SEQ ID NO：11之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的胺基酸序列。 15. 如第1段至第8段或第12段至第14段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至FAP的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：18的重鏈可變區(VH FAP)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：19的輕鏈可變區(VL FAP)。 16. 如第1段至第15段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域為Fab片段或互換Fab片段。 17. 如第1段至第16段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。 18. 如第1段至第16段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之第二Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與一個Fc域亞單元之N端融合。 19. 如第1段至第16段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之第二及第三Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的該第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的該第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與第一Fc域亞單元之N端融合，且能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的該第三Fab片段在Fab重鏈之C端與第二Fc域亞單元之N端融合。 20. 如第1段至第16段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的VH及VL域，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的Fab片段在其C端與第一Fc域亞單元的N端融合，且其中能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之VH及VL域之一經由肽連接子與第一Fc域亞單元之C端融合，且能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之VH及VL域中之另一者經由肽連接子與第二Fc域亞單元之C端融合。 21. 一種聚核苷酸，其編碼如第1段至第20段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子。 22. 一種宿主細胞，其包含如請求項21之聚核苷酸。 23. 一種產生如第1段至第20段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子的方法，其包含在適於表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如技術方案22之宿主細胞。 24. 一種醫藥組合物，其包含如第1段至第20段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。 25. 如第24段之醫藥組合物，其用於治療癌症。 26. 如第1段至第20段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如第24段之醫藥組合物，其用作藥劑。 27. 如第1段至第20段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，或如第24段之醫藥組合物，其用於治療癌症。 28. 如第1段至第20段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其用於治療癌症，其中該促效CD28抗原結合分子與化學治療劑、輻射療法/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合投與。 29. 一種如第1段至第20段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如第24段之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療癌症用的藥劑。 30. 一種抑制個體之腫瘤細胞生長的方法，其包含向該個體投與有效量之如第1段至第20段中任一段的雙特異性促效CD28抗原結合分子，或如第24段之醫藥組合物，以抑制腫瘤細胞生長。 31. 一種治療癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如第1段至第20段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如第24段之醫藥組合物。 32. 一種雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含能夠特異性結合至CD28的抗原結合域、能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域，及由能夠穩定結合之第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。 33. 如第32段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其以單價結合至CD28為特徵。 34. 如第32段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其進一步以單價結合至B細胞表面抗原為特徵。 35. 如第32段至第34段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中該Fc域屬於人類IgG1亞類且包含胺基酸突變L234A、L235A及P329G (根據Kabat EU索引編號)。 36. 如第32段至第35段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (i)包含SEQ ID NO：20之重鏈互補決定區CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：23之輕鏈互補決定區CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)；或 (ii)包含SEQ ID NO：36之CDR-H1、SEQ ID NO：37之CDR-H2及SEQ ID NO：38之CDR-H3的重鏈可變區(VH CD28)，以及包含SEQ ID NO：39之CDR-L1、SEQ ID NO：40之CDR-L2及SEQ ID NO：41之CDR-L3的輕鏈可變區(VL CD28)。 37. 如第32至36段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD28)，其包含SEQ ID NO：20之CDR-H1、SEQ ID NO：21之CDR-H2及SEQ ID NO：22之CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CD28)，其包含SEQ ID NO：23之CDR-L1、SEQ ID NO：24之CDR-L2及SEQ ID NO：25之CDR-L3。 38. 如第32段至第37段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列與SEQ ID NO：26之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的重鏈可變區(VH CD28)；及含有胺基酸序列與SEQ ID NO：27之胺基酸序列至少約95%、96%、97%、98%、99%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD28)。 39. 如第32段至第36段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列選自由以下組成之群的重鏈可變區(VH CD28)：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50及SEQ ID NO：51；以及含有胺基酸序列選自由以下組成之群的輕鏈可變區(VL CD28)：SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：61。 40. 如第32段至第36段或第39段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含 (a)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (b)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (c)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (d)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (e)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (f)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (g)包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (h)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (j)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)，或 (k)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VH CD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VL CD28)。 41. 如第32段至第36段或第39段或第40段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD28的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：46的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：53的輕鏈可變區(VL CD28)，或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：47的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：54的輕鏈可變區(VL CD28)，或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：47的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：9的輕鏈可變區(VL CD28)，或含有胺基酸序列為SEQ ID NO：16的重鏈可變區(VH CD28)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：9的輕鏈可變區(VL CD28)。 42. 如第32段至第41段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中B細胞表面抗原係選自由以下組成之群：CD19、CD79b、CD20、CD22及CD37。 43. 如第32段至第42段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD19的抗原結合域。 44. 如第32段至第43段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：406的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：407的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：408的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：409的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：410的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：411的CDR-L3，或 (b)重鏈可變區(VH CD19)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：414的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：415的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：416的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：417的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：418的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：419的CDR-L3。 45. 如第32段至第44段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含 (a)重鏈可變區(VH CD19)，其包含與SEQ ID NO：412之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含與SEQ ID NO：413之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的胺基酸序列，或 (b)重鏈可變區(VH CD19)，其包含與SEQ ID NO：420之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的胺基酸序列；及輕鏈可變區(VL CD19)，其包含與SEQ ID NO：421之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的胺基酸序列。 46. 如第32段至第45段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD19的抗原結合域包含含有胺基酸序列為SEQ ID NO：412的重鏈可變區(VH CD19)及含有胺基酸序列為SEQ ID NO：413的輕鏈可變區(VL CD19)。 47. 如第32段至第43段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至B細胞表面抗原的抗原結合域為能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域。 48. 如第32段至第43段或第47段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域包含：重鏈可變區(VH CD79b)，其包含(i)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：422的CDR-H1、(ii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：423的CDR-H2及(iii)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：424的CDR-H3；以及輕鏈可變區(VL CD79b)，其包含(iv)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：425的CDR-L1、(v)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：426的CDR-L2及(vi)含有胺基酸序列為SEQ ID NO：427的CDR-L3。 49. 如第32段至第43段或第47段或第48段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其中能夠特異性結合至CD79b的抗原結合域包含胺基酸序列與SEQ ID NO：428之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的重鏈可變區(VH CD79b)，及胺基酸序列與SEQ ID NO：429之胺基酸序列至少約95%、98%或100%一致的輕鏈可變區(VL CD79b)。 50. 如第32段至第49段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)一個能夠特異性結合至CD28之Fab片段， (b)一個能夠特異性結合至B細胞表面抗原的互換Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代。 51. 如第32段至第49段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至B細胞表面抗原的第二Fab片段，及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與一個Fc域亞單元之N端融合。 52. 如第32段至第49段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含 (a)能夠特異性結合至CD28之第一Fab片段， (b)能夠特異性結合至B細胞表面抗原的第二及第三Fab片段，以及 (c)由能夠穩定結合的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代， 其中能夠特異性結合至CD28的第一Fab片段在Fab重鏈之C端與能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第二Fab片段之Fab重鏈之N端融合，該第二Fab片段的Fab重鏈又在其C端與第一Fc域亞單元之N端融合，且能夠特異性結合至腫瘤相關抗原的第三Fab片段在Fab重鏈之C端與第二Fc域亞單元之N端融合。 53. 一種醫藥組合物，其包含如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。 54. 一種聚核苷酸，其編碼如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子。 55. 一種載體，其包含如第54段之聚核苷酸。 56. 一種宿主細胞，其包含如第55段之載體或如第54段之聚核苷酸。 57. 一種產生如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子的方法，其包含在適於表現該雙特異性抗原結合分子之條件下培養如第25段之宿主細胞。 58. 如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如第53段之醫藥組合物，其用作藥劑。 59. 如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，或如第53段之醫藥組合物，其用於治療癌症。 60. 如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其用於治療癌症，其中該促效CD28抗原結合分子與化學治療劑、輻射療法/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合使用。 60. 如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其用於治療癌症，其中該促效CD28抗原結合分子與T細胞活化抗CD3雙特異性抗體組合使用。 61. 如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其用於治療癌症，其中該促效CD28抗原結合分子與抗CD20/抗CD3雙特異性抗體組合使用。 62. 如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其用於治療癌症，其中該促效CD28抗原結合分子與阻斷PD-L1/PD-1相互作用之藥劑組合使用。 63. 一種如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如第53段之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療癌症用的藥劑。 64. 一種抑制個體之腫瘤細胞生長的方法，其包含向該個體投與有效量之如第32段至第52段中任一段的雙特異性促效CD28抗原結合分子，或如第53段之醫藥組合物，以抑制腫瘤細胞生長。 65. 一種治療癌症之方法，其包含向該個體投與治療有效量之如第32段至第52段中任一段之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如第53段之醫藥組合物。***
實例 以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，鑒於上文提供之一般描述，因此可實施各種其他實施例。
重組 DNA 技術 使用標準方法操縱DNA，如Sambrook, J.等人, Molecular cloning：A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989中所述。分子生物學試劑係根據製造商說明書使用。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列的一般資訊提供於Kabat, E.A.等人, (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第五版, NIH公告第91-3242號中。
DNA 測序 藉由雙股測序法測定DNA序列。
基因合成 必要時，所要基因區段係藉由PCR、使用適當模板產生，或在Geneart AG (Regensburg, Germany)或Genscript (New Jersey, USA)藉由自動化基因合成、自合成寡核苷酸及PCR產物合成。將側接單數個限制性核酸內切酶裂解位點的基因區段選殖入標準選殖/測序載體中。自經轉型之細菌純化質體DNA且藉由UV光譜學來測定濃度。經次選殖之基因片段的DNA序列藉由DNA測序來證實。設計成具有適合限制位點的基因區段以允許次選殖入各別表現載體中。所有構築體經設計具有5'端DNA序列，該序列編碼靶向真核生物細胞所分泌之蛋白質的前導肽。
細胞培養技術 標準細胞培養技術如以下文獻中所述來使用：Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J.及Yamada, K.M. (編), John Wiley & Sons, Inc.。
蛋白質純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體施加於蛋白質A瓊脂糖管柱(GE healthcare)且用PBS洗滌。在pH 2.8下達成抗體溶離，隨即中和樣品。在PBS或20 mM組胺酸、150 mM NaCl pH 6.0中，藉由尺寸排阻層析(Superdex 200，GE Healthcare)將聚集之蛋白質與單體抗體分離。匯集單體抗體溶離份，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO)離心濃縮器濃縮(必要時)，冷凍且在-20℃或-80℃下儲存。提供一部分樣品用於隨後的蛋白質分析及分析型表徵，例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析(SEC)或質譜學進行。
SDS-PAGE 根據製造商說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。特定言之，使用10%或4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES (還原性凝膠，使用NuPAGE®抗氧化操作緩衝液添加劑)或MOPS (非還原性凝膠)操作緩衝液。
分析型尺寸排阻層析 藉由HPLC層析進行尺寸排阻層析(SEC)以便確定抗體之聚集及寡聚狀態。簡言之，將蛋白質A純化之抗體於300 mM NaCl、50 mM KH2 PO4 /K2 HPO4 pH 7.5中施加於Agilent HPLC 1100系統之Tosoh TSKgel G3000SW管柱上或於2 x PBS中施加於Dionex HPLC系統之Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。根據UV吸光度及峰面積積分來定量所溶離之蛋白質。BioRad凝膠過濾標準物151-1901充當標準物。
質譜法 此章節描述具有VH/VL交換(VH/VL互換單抗)之多特異性抗體的表徵，重點在於其正確組裝。藉由去糖基化完整互換單抗及去糖基化/纖維蛋白溶酶消化或以其他方式去糖基化/有限LysC消化之互換單抗進行電噴霧電離質譜法(ESI-MS)來分析預期的一級結構。
在1 mg/ml的蛋白質濃度下，在磷酸鹽或Tris緩衝液中，在37℃下，用N-糖苷酶F使VH/VL互換單抗發生去糖基化長達17小時。纖維蛋白溶酶或有限LysC (Roche)消化係用100 µg去糖基化VH/VL互換單抗在Tris緩衝液pH 8中分別在室溫下進行120小時及在37℃下進行40分鐘。在質譜分析之前，在Sephadex G25管柱(GE Healthcare)上，經由HPLC將樣品脫鹽。在配備有TriVersa NanoMate源(Advion)之maXis 4G UHR-QTOF MS系統(Bruker Daltonik)上經由ESI-MS測定總質量。
使用表面電漿子共振 ( SPR )( BIACORE ) 測定多特異性抗體對各別抗原的結合及結合親和力 使用BIACORE儀器(GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden)、藉由表面電漿子共振研究所產生之抗體對各別抗原之結合。簡言之，為了量測親和力，使山羊抗人類IgG (JIR 109-005-098抗體)經由胺偶合而固著於CM5晶片上以呈現針對各別抗原之抗體。在HBS緩衝液(HBS-P)(10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.005% Tween 20，pH 7.4)中，在25℃下(或替代地在37℃下)量測結合。添加多種濃度之抗原(R&D Systems或內部純化)的溶液。藉由80秒至3分鐘之抗原注射來量測結合；藉由用HBS緩衝液洗滌晶片表面3-10分鐘來量測解離且使用1:1朗格繆爾結合模型(Langmuir binding model)來估算KD值。自樣品曲線減去陰性對照資料(例如緩衝液曲線)以校正系統固有的基線偏移及減少雜訊信號。使用各別Biacore評估軟體分析感測圖譜及計算親和力資料。
實例 1 產生及製備靶向 CD28 及纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 或癌胚抗原 ( CEA ) 的 雙特異性抗原結合分子 1.1 選殖靶向 CD28 及纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 或癌胚抗原 ( CEA ) 的 雙特異性抗原結合分子 選殖抗原 ： 將編碼人類CD28 (Uniprot：P10747)之胞外域(成熟蛋白質之胺基酸1至134)的DNA片段同框插入編碼人類IgG1 Fc片段之片段上游的兩個不同哺乳動物接受者載體中，該Fc片段充當溶解標籤及純化標籤。一個表現載體的Fc區含有「臼」突變，另一者含有「杵」突變以及C端avi標籤(GLNDIFEAQKIEWHE，SEQ ID NO：387)，該標籤允許在與Bir A生物素連接酶共表現期間發生特異性生物素化。另外，兩個Fc片段均含有PG-LALA突變。兩種載體均與編碼BirA生物素連接酶之質體組合共轉染，以便得到在Fc-杵鏈之C端具有單價生物素化avi標籤的二聚CD28-Fc構築體。
使用FAP純系4B9之可變域、CEA結合子及CD28純系SA及mAb 9.3產生靶向腫瘤之多種CD28構築體。FAP純系4B9之產生及製備描述於WO 2012/020006 A2中，該文獻以引用之方式併入本文中。分子中所用的CEA純系描述於WO 2007/071422中且具有胺基酸序列為SEQ ID NO：26之VH及胺基酸序列為SEQ ID NO：27之VL的CD28超促效抗體(SA)描述於WO 2006/050949中。抗體mAb 9.3之描述可見於Tan等人, Immunology 2002, 169, 1119-1125中。為了產生各別表現質體，使用各別可變域之序列且與預插入各別接受者哺乳動物表現載體中的各別恆定區同框次選殖。所得分子之示意性描述展示於圖 1A 至圖 1M 中。在指定的情況下，已將Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變(PG-LALA)引入人類IgG1重鏈恆定區中以消除對Fcγ受體的結合。為了產生不對稱雙特異性抗體，Fc片段含有「杵」或「臼」突變以避免重鏈錯配。為了避免雙特異性及多特異性抗體構築體中之輕鏈錯配，將VH/VL或CH1/Cκ域之交換引入一個結合部分(互換Fab技術)。在另一結合部分中，將電荷引入CH1及Cκ域中。
選殖以下分子，其示意性說明展示於圖 1A 至圖 1M 中： 分子A：CD28(SA) (hu IgG4)，TGN1412，CD28 (SA)抗體的人類IgG4同型(圖 1A )包含SEQ ID NO：62及SEQ ID NO：63的胺基酸序列(P1AE1975)。 分子B：CD28(SA) (PG-LALA)，CD28(SA)抗體的huIgG1 PG-LALA同型( 圖 1B ) 包含SEQ ID NO：62及SEQ ID NO：64之胺基酸序列(P1AD9289)。 分子C：FAP(4B9)-CD28(SA) 1+1形式，CD28(SA) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且FAP(4B9) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子( 圖 1C ) 包含SEQ ID NO：65、66、67及68之胺基酸序列(P1AD4492)。 分子D：FAP(4B9)-CD28(SA) 1+4形式、雙特異性四價抗CD28(SA)及單價抗FAP huIgG1 PG-LALA構築體。使FAP純系4B9之VH及VL域與Fc域之各別鏈(VH：杵鏈，VL：臼鏈)的C端融合( 圖 1F )。分子包含SEQ ID NO：62、69及70之胺基酸序列(P1AD9018)。 分子E：FAP(4B9)-CD28(SA) 1+2形式，雙特異性二價抗CD28 (SA)及單價抗FAP huIgG1 PG-LALA構築體。使FAP純系4B9之VH及VL域與Fc域之各別鏈(VH：杵鏈，VL：臼鏈)的C端融合(圖 1D )。分子包含SEQ ID NO：62、71及72之胺基酸序列(P1AD9011)。 分子F：FAP(4B9)-CD28(SA) 2+2，雙特異性二價抗CD28 (SA)及二價抗FAP huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，抗CD28 Fab片段中具有帶電修飾，抗FAP互換Fab片段的VH經由CH1/Cκ交換與Fc片段的C端融合( 圖 1E ) 。分子包含SEQ ID NO：65、73及74之胺基酸序列(P1AD4493)。 分子G：FAP (4B9)-CD28 (SA) 2+1，雙特異性單價抗CD28 (SA)及二價抗FAP huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，「經典取向」，抗CD28互換Fab片段中存在VH/VL交換，抗FAP Fab片段中存在帶電修飾(圖 1L )。分子包含SEQ ID NO：75、76、77及78之胺基酸序列(P1AD5231)。 分子H：FAP(4B9)-CD28(SA)C-01，1+1雙特異性單價抗CD28 (SA)及單價抗FAP huIgG1 PG-LALA互換Fab分子，「頭對尾」，抗CD28互換Fab片段存在VH/VL交換，抗FAP結合子中存在帶電修飾(圖 1M )。該分子包含SEQ ID NO：75、77、78及79之胺基酸序列(P1AE2021)。 分子I：FAP(4B9)-CD28(SA) C-04，1+1雙特異性單價抗CD28 (SA)及單價抗FAP huIgG1 PG-LALA構築體。使FAP結合子4B9之VH及VL域與Fc片段之各別鏈(VH：杵鏈，VL：臼鏈)的C端融合(圖 1K )。分子包含SEQ ID NO：62、72及80之胺基酸序列(P1AE2236)。 分子J：CEA-CD28(SA) 2+2，雙特異性二價抗CD28 (SA)及二價抗CEA huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，抗CD28 Fab片段中具有帶電修飾，抗CEA互換Fab片段的VH經由CH1/Cκ交換與Fc片段的C端融合(圖 1H )。分子包含SEQ ID NO：65、81及82之胺基酸序列(P1AE1195)。 分子K：CEA-CD28(SA) 1+2，雙特異性二價抗CD28 (SA)及單價抗CEA huIgG1 PG-LALA構築體。使CEA結合子之VH及VL域與Fc片段之各別鏈(VH：杵鏈，VL：臼鏈)的C端融合(圖 1G )。分子包含SEQ ID NO：62、83及84之胺基酸序列(P1AE1194)。 分子L：單價IgG CD28 (SA)，單價抗CD28 (SA) huIgG1 PG-LALA構築體，其中CD28重鏈作為「臼」Fc鏈與Fc(杵)片段組合表現(圖 1I )。分子包含SEQ ID NO：65、85及86之胺基酸序列(P1AD8944)。 分子M：CEA-CD28(SA) 1+1形式，雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(其中CD28(SA) Fab片段(杵)中存在帶電修飾且CEA 互換Fab片段(臼)中存在VH/VL交換)( 圖 1J ) 包含SEQ ID NO：65、66、87及88之胺基酸序列(P1AE3127)。 分子N：mab 9.3 (PG-LALA)，mAb9.3純系的人類IgG1 PG-LALA同型(如圖 1B )。分子包含SEQ ID NO：89及90之胺基酸序列(P1AD5142)。 分子O：FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) C-03，雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，其中mAb9.3 Fab片段(杵)存在帶電修飾且抗FAP片段(臼)存在VH/VL交換( 如同 圖 1C 中)。分子包含SEQ ID NO：67、68、91及92之胺基酸序列(P1AE2238)。 分子P：FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) 1+4，雙特異性四價抗CD28 mAb9.3及抗FAP huIgG1 PG-LALA構築體。使FAP結合子之VH及VL域與Fc片段之各別鏈(VH：杵鏈，VL：臼鏈)的C端融合(如同 圖 1F )。分子包含SEQ ID NO：89、93及94之胺基酸序列(P1AD8969)。 分子Q：FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) 1+2，雙特異性二價抗CD28 mAb9.3及單價抗FAP huIgG1 PG-LALA構築體。使FAP結合子之VH及VL域與Fc片段之各別鏈(VH：杵鏈，VL：臼鏈)的C端融合(如同 圖 1D )。分子包含SEQ ID No：89、95及96之胺基酸序列(P1AD8962)。 分子R：FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) 2+2，雙特異性二價抗CD28 mAb9.3及二價抗FAP huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，mAb9.3 FAP片段中存在帶電修飾，抗FAP Fab片段之VH與Fc片段之C端經由CH1/Cκ互換Fab交換而融合( 如同圖 1E ) 。分子包含SEQ ID No：97、98及99之胺基酸序列(P1AD8968)。 分子S：FAP (4B9)-CD28 (mAb9.3) 2+1，雙特異性單價抗CD28 (mAb9.3)及二價抗FAP huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，「經典取向」，抗CD28 (mAb9.3)互換Fab片段中存在VH/VL交換，抗FAP Fab片段中存在帶電修飾(如同 圖 1L )。分子包含SEQ ID No：76、77、100及101之胺基酸序列(P1AD5560)。 分子T：FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) C-02，雙特異性單價抗CD28 (mAb9.3)及單價抗FAP huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，「頭對尾」，抗CD28 (mAb9.3)互換Fab片段存在VH/VL交換，抗FAP片段存在帶電修飾(如同圖 1M )。分子包含SEQ ID No：78、79、100及101之胺基酸序列(P1AE2022)。 分子U：FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) C-05，雙特異性單價抗CD28 (mAb9.3)及單價抗FAP huIgG1 PG-LALA構築體。使FAP結合子4B9之VH及VL域與Fc片段之各別鏈(VH：Fc杵鏈，VL：Fc臼鏈)的C端融合(如同圖 1K )。分子包含SEQ ID No：80、89及96之胺基酸序列(P1AE2237)。 分子V：CEA-CD28(mAb9.3) 2+2，雙特異性二價抗CD28 (mAb9.3)及二價抗CEA huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，mAb9.3 Fab片段中存在帶電修飾，抗CEA互換Fab片段之VH與Fc片段之C端經由CH1/Cκ交換而融合(如同圖 1H )。分子包含SEQ ID No：82、89及102之胺基酸序列(P1AE1193)。 分子W：CEA-CD28(mAb9.3) 1+2，雙特異性二價抗CD28 (mAb9.3)及單價抗CEA huIgG1 PG-LALA構築體。使CEA結合子之VH及VL域與Fc片段之各別鏈(VH：杵鏈，VL：臼鏈)的C端融合(如同 圖 1G )。分子包含SEQ ID No：89、103及104之胺基酸序列(P1AE1192)。 分子X：單價IgG CD28 (mAb9.3)，其中CD28重鏈作為「臼」Fc鏈與Fc(杵)片段組合表現( 如同 圖 1I ) 。分子包含SEQ ID No：86、105及106之胺基酸序列(P1AD8938)。
另外，製備三特異性分子： 分子Y：FAP(4B9)-CD28(TGN1412)-CEA 1+1+1，三特異性單價抗CD28 (TGN1412)、單價抗FAP及單價抗CEA huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，抗CEA互換Fab片段(臼)中存在VH/VL交換，抗FAP Fab片段(杵)中及抗CD28片段(杵)中存在帶電修飾(如同圖 1N )。分子包含SEQ ID No：87、88、388及389之胺基酸序列(P1AE4064)。
1.2 產生靶向 CD28 及纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 或癌胚抗原 ( CEA ) 的 雙特異性抗原結合分子 上述分子的表現係由嵌合MPSV啟動子或CMV啟動子驅動。聚腺苷酸化係由位於CDS之3'端的合成聚腺苷酸信號序列驅動。另外，各種載體含有用於常染色體複製的EBV OriP序列。
為了產生構築體C至W，使用聚乙烯亞胺作為轉染劑，用各別表現載體共轉染生長於懸浮液中的HEK293-EBNA細胞。抗體及雙特異性抗體係藉由瞬時轉染HEK293 EBNA細胞產生。將細胞離心且培養基用預溫熱的CD CHO培養基置換。在CD CHO培養基中混合表現載體，添加PEI，渦旋溶液且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至搖瓶中，且在具有5% CO2 氛圍之培育箱中在37℃下培育3小時。培育之後，添加具有補充劑的Excell培養基(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, 編者：Weichang Zhou, Anne Kantardjieff)。轉染之後的第一天，添加補充劑(饋料)(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, 編者：Weichang Zhou, Anne Kantardjieff)。7天之後，藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集細胞上清液且藉由標準方法純化。
利用習知(基於非PCR)選殖技術且使用適於懸浮的CHO K1細胞(最初自ATCC接收且適於在Evitria的懸浮培養液中無血清生長)，由Evitria使用其專有載體系統製備構築體A、B及X。為了產生，Evitria使用其專有的無動物組分及無血清培養基(eviGrow及eviMake2)及其專有的轉染劑(eviFect)。藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集上清液且藉由標準方法純化。
1.3 純化靶向 CD28 及纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 或癌胚抗原 ( CEA ) 的 雙特異性抗原結合分子 參考標準方案，自經過濾之細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，藉由使用蛋白質A的親和層析自細胞培養上清液純化含有Fc之蛋白質。在pH 3.0達成溶離，隨即中和樣品。濃縮蛋白質，且在20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉pH 6.0中藉由尺寸排阻層析將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。
1.4 靶向 CD28 及纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 或癌胚抗原 ( CEA ) 之 雙特異性或三特異性抗體的分析資料 根據Pace等人, Protein Science, 1995, 4, 2411-1423，使用基於胺基酸序列計算的質量消光係數，藉由量測280 nm光學密度(OD)來測定經純化之構築體的蛋白質濃度。在還原劑存在及不存在下，使用LabChipGXII (Perkin Elmer)、藉由CE-SDS分析蛋白質純度及分子量。聚集物含量測定係在25℃下、藉由使用分析型尺寸排阻管柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)的HPLC層析進行，該管柱在操作緩衝液(分別為25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽pH 6.7或200 mM KH2 PO4 、250 mM KCl pH 6.2)中平衡。所有分子之純化參數的概述明示於表1中。表 1 ： 產生及純化雙特異性或三特異性 CD28 抗原結合分子的概述
分子 描述 產量[mg/l] 分析型SEC (HMW/單體/LMW) [%] 藉由CE-SDS量測的純度[%]
A CD28(SA) (hu IgG4) 257 0 / 100 / 0 84.25
B CD28(SA) hu IgG1 (PG-LALA) 390 0 / 97.3 / 2.7 84
C FAP(4B9)-CD28(SA) 1+1 19.5 0.64 / 97.28 / 2.07 98.75
D FAP(4B9)-CD28(TGN1412) 1+4 1.75 3.53 / 96.48 / 0 n.d.
E FAP(4B9)-CD28(SA) 1+2 0.38 0.8 / 95.48 / 3.72 93.58
F FAP(4B9)-CD28(SA) 2+2 18.2 1.4 / 98.6 / 0 91.42
G FAP (4B9)-CD28 (SA)  2+1 2.66 3.79 / 94. 02 / 2.19 64
H FAP(4B9) - CD28(SA) C-01 10.6 0 / 100 / 0 99.38
I FAP(4B9) - CD28(SA) C-04 5.55 4.12 / 81.17 / 14.71 96.5
J CEA-CD28(SA) 2+2 6.25 1 / 99 / 0 n.d.
K CEA-CD28(SA) 1+2 5.8 0.5 / 99.5 / 0 64
L 單價IgG1 CD28 (SA) 38.5 0.2 / 99.6 / 0.2 99.3
M CEA-CD28(SA) 1+1 14.3 0 / 100 / 0 99.18
N CD28 (mAb 9.3) hu IgG1 (PG-LALA) 22.06 0 /100 / 0 88
O FAP(4B9) - CD28(mAb9.3) C-03 2.14 0 / 100 / 0 97.4
P FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) 1+4 7.6 1.2 / 98.8 / 0 97.6
Q FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) 1+2 16. 1 / 98.5 / 0.5 97.16
R FAP(4B9)-CD28(mAb9.3) 2+2 3.9 0 / 95.5 / 4.5 87
S FAP (4B9)-CD28 (mAb9.3) 2+1 2.63 2.1 / 96.3 / 1.6 90.55
T FAP(4B9) - CD28(mAb9.3) C-02 2.3 0 / 100 / 0 100
U FAP(4B9) - CD28(mAb9.3) C-05 23.78 0.68 / 97.82 / 1.5 96.1
V CEA-CD28(mAb9.3) 2+2 3.1 0 / 100 / 0 100
W CEA-CD28(mAb9.3) 1+2 2.25 0 / 100 / 0 92.8
X 單價IgG1 CD28 (mAb9.3) 20.2 1.4 / 98.6 / 0 97.7
Y FAP(4B9)-CD28(TGN1412)-CEA 1+1+1 1.57 0 /100 / 0 100
實例 2 靶向 CD28 及纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 或癌胚抗原 ( CEA ) 之雙特異性抗原結合分子中之雙特異性抗體的結合及動力學分析 2.1 靶向 CD28 及纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 之雙特異性抗體對表現 FAP 或 CEA 之 細胞及表現 CD28 之 細胞的結合 使用表現人類纖維母細胞活化蛋白(huFAP)之3T3-huFAP細胞(純系19)測試雙特異性FAP-CD28分子的結合。藉由在1.5 μg/mL嘌呤黴素選擇下使用表現huFAP之表現載體pETR4921轉染小鼠胚胎纖維母細胞NIH/3T3細胞株(ATCC CRL-1658)來產生此細胞株。用表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)來測試對人類CD28的結合。使用表現CEA之MKN45細胞(胃癌細胞株，DSMZ #ACC 409)測試對人類CEACAM5的結合。
為了評估結合，收集細胞，計數，檢查存活率且以2.5E5/ml再懸浮於FACS緩衝液(eBioscience，目錄號00-4222-26)中。在4℃下，在圓底96孔盤中，將5x104 個細胞與濃度增加之靶向FAP之CD28構築體(1 pM-100 nM)一起培育2小時。接著，細胞用冷FACS緩衝液洗滌三次，在4℃下與PE結合之山羊抗人類PE (Jackson ImmunoReserach，目錄號109-116-098)一起再培育60分鐘，用冷FACS緩衝液洗滌一次，離心且再懸浮於100 μL FACS緩衝液中。為監測構築體與細胞之間的非特異性結合相互作用，包括抗DP47 IgG作為陰性對照。藉由流式細胞術，使用FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva)評估結合。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線。
FAP-CD28分子能夠以濃度依賴性方式結合至細胞上之人類FAP與人類CD28 (某些實例見圖 2B 及圖 2C )。如所預期，用抗DP47 IgG未偵測到結合，表明結合之偵測歸因於各別靶向部分之特異性CD28及FAP結合。
CEA-CD28分子亦能夠結合至細胞上之人類CEA與人類CD28。
2.2 靶向 CD28 及 CEA 之 雙特異性或三特異性抗體的動力學分析 在25℃下，使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，使用藉由中性鏈親和素捕捉而固著於NLC晶片之生物素化huCD28-Fc抗原及生物素化Hu N(A2-B2)A-avi-His，藉由SPR量測包含抗CEA (Medi-565)及抗CD28之雙特異性或三特異性抗體中之兩個結合部分的親和力(KD )。
為了產生含有CEA(Medi-565)之抗原決定基的基於CEACAM5的抗原，產生由兩個CEACAM1及兩個CEACAM5 Ig域組成的嵌合蛋白。基於CEACAM1序列，用CEACAM5域A2及B2置換CEACAM1之第二及第三域。使C端avi標籤與His標籤融合以便進行定點生物素化及純化。所得蛋白質命名為Hu (A2-B2)A-avi-His (SEQ ID NO：169)。
重組抗原(配位體)之固著：抗原用PBST (10 mM磷酸鹽、150 mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20)稀釋至10 μg/ml，接著以不同接觸時間、以30微升/分鐘注射，以在豎直取向上達成約400、800及1600個反應單位(RU) 的固著水準。分析物之注射：為了進行一次性動力學量測，將注射方向改變為水平取向，以50 μl/min沿著各別通道1-5同時注射經純化之雙特異性CEA靶向抗CD28雙特異性抗體(50 nM與3.125 nM之間範圍的不同濃度)，其中結合時間為150秒，且解離時間為450秒。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「管線內」空白用於參照。使用簡單的一比一朗繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算結合速率常數(kon)及解離速率常數(koff)。平衡解離常數(KD )係以比率koff/kon計算。使包含一個抗CD28抗原結合域及一個抗CEA抗原結合域之雙特異性抗體(分子M)的KD 計算值與各別單特異性構築體之測定值一致。動力學及熱力學資料概述於下表2中。表 2 ： CEA - CD28 ( SA ) 1 + 1 ( 分子 M ) 的 動力學及熱力學分析
結合部分 kon  (1/(s*M) koff  (1/s) KD (nM)
抗CEA 4.13 exp5 1.2 exp-4 0.29
抗CD28 (TGN1412) 3.13 exp5 3.76 exp-4 1.2
實例 3 缺乏熱點且親和力減少之 CD28 ( SA ) 變異體的產生及表徵 3.1 不成對半胱胺酸殘基、色胺酸殘基、去醯胺位點的移除 ， 及親和力減少之 CD28 ( SA ) 變異體的產生 作為吾等詳細之結合子表徵的一部分，對CD28(SA)可變域序列進行計算分析。此分析揭露VH之CDR2區中的不成對半胱胺酸位置50，Kabat編號)、VH之CDR3中的色胺酸殘基(位置100a，Kabat編號)及VL之CDR1 (位置32，Kabat編號)，及VH之CDR2中的潛在天冬醯胺去醯胺位點(位置56，Kabat編號)。儘管色胺酸氧化為相當緩慢的過程且可以藉由添加還原化合物來阻止，但抗體可變域中之不成對半胱胺酸的存在可為關鍵。游離半胱胺酸具反應性且可以與其他蛋白質之其他不成對半胱胺酸或細胞或培養基之組分形成穩定的鍵。因此，此可產生具有未知修飾之異質不穩定產物，該等修飾潛在地具有免疫原性且因此可對患者造成風險。另外，天冬醯胺之去醯胺及所引起之異天冬胺酸及丁二醯亞胺的形成可以影響活體外穩定性與活體內生物學功能。親本鼠類結合子5.11A之晶體結構分析揭露，C50不參與結合至人類CD28且因此可經類似胺基酸(諸如絲胺酸)置換而不影響對CD28的親和力(表 6 ， 變異體29)。然而，位置50之色胺酸殘基與天冬醯胺均接近或涉及結合界面且類似胺基酸的置換因此可使得結合親和力減少。在此實例中，由於以下原因，吾等尤其旨在減少CD28 (SA)對人類CD28的親和力：CD28(SA)的親和力在1-2 nM範圍內，結合半衰期為約32分鐘。當靜脈內注射至患者時，此強親和力會引起含有大量CD28表現細胞之組織(諸如血液及淋巴組織)的下沉效應。因此，可以減少化合物經由靶向組分FAP及/或CEA之定點靶向且可以減弱構築體之功效。為了最小化此類效應，產生若干VH及VL變異體，以便以不同程度減少親和力(圖 3A 及圖 3C )。除先前提及之代表潛在穩定性熱點之位置以外，用原始鼠類生殖系胺基酸或用類似胺基酸置換直接或間接涉及結合至人類CD28之其他殘基。另外，亦將CD28(SA) VL與VH之CDR移植至曲妥珠單抗(trastuzumab)之各別構架序列(圖 3B 及圖 3D )。VH與VL變異體之若干組合接著作為單價單臂抗CD28 IgG樣構築體表現，且藉由SPR表徵結合。
3.2 藉由 SPR 分析經還原之單臂抗 CD28 變異體的解離速率常數 ( koff ) 為了表徵第一步驟中的抗CD28結合子變異體，所有結合子均作為單價單臂IgG樣構築體表現(圖 4A )。選擇此形式以便表徵1:1模型中之CD28的結合。轉染至HEK細胞之後的第5天，收集上清液且測定所表現之構築體的效價。
在25℃下，使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，使用藉由中性鏈親和素捕捉而固著於NLC晶片上的生物素化huCD28-Fc抗原，藉由表面電漿子共振(SPR)測定抗CD28結合子變異體的解離速率。為了使重組抗原(配位體)固著，huCD28-Fc用PBST (具有Tween 20的磷酸鹽緩衝鹽水，其由10 mM磷酸鹽、150 mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20組成)稀釋至100 nM至500 nM範圍內的濃度，接著以不同接觸時間、以25微升/分鐘注射。由此在豎直取向上產生1000至3000個反應單位(RU)的固著水準。
為了進行一次性動力學量測，將注射方向改為水平取向。基於所產生上清液之效價，用PBST稀釋單價單臂IgG，得到範圍為100 nM至6.25 nM的一系列兩倍稀釋液。沿著各別通道1-5，以50 μl/min同時進行注射，結合時間為120秒且解離時間為300秒。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「管線內」空白用於參照。由於結合相互作用係用未經純化及生物化學表徵之來自上清液之單價單臂IgG量測，因此僅使用蛋白質:蛋白質相互作用之解離速率作為進一步結論。在ProteOn Manager v3.1軟體中，使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型，藉由擬合解離感測圖譜來計算解離速率。所有純系的解離速率常數(koff )值概述於表 3 中。所產生之變異體的比較揭露koff 值相較於親本序列降低多達30倍。表 3 ： 具有解離速率常數 ( koff ) 值之所有經表現之單價抗 CD28 變異體的概述
結合子變異體 Tapir ID SEQ ID NO： SEQ ID NO: SEQ ID NO： koff (10-4 /M)
CD28(SA)_變異體_1 (親和CD28) P1AE4441 112 65 126 3.0
CD28(SA)_變異體_2 P1AE3058 113 120 126 N/A
CD28(SA)_變異體_3 P1AE3059 113 121 126 N/A
CD28(SA)_變異體_4 P1AE3060 113 122 126 N/A
CD28(SA)_變異體_5 P1AE3061 113 65 126 N/A
CD28(SA)_變異體_6 P1AE3062 114 120 126 N/A
CD28(SA)_變異體_7 P1AE3063 114 121 126 100
CD28(SA)_變異體_8 P1AE3064 114 122 126 68
CD28(SA)_變異體_9 P1AE3065 114 123 126 78
CD28(SA)_變異體_10 P1AE3066 114 124 126 N/A
CD28(SA)_變異體_11 P1AE3067 114 65 126 37
CD28(SA)_變異體_12 P1AE3068 115 125 126 2.4
CD28(SA)_變異體_13 P1AE3069 115 65 126 1.9
CD28(SA)_變異體_14 P1AE3070 116 120 126 100
CD28(SA)_變異體_15 P1AE3071 116 121 126 24
CD28(SA)_變異體_16 P1AE3072 116 122 126 10
CD28(SA)_變異體_17 P1AE3073 116 123 126 14
CD28(SA)_變異體_18 P1AE3074 116 124 126 82
CD28(SA)_變異體_19 P1AE3075 116 65 126 2.9
CD28(SA)_變異體_20 P1AE3076 117 120 126 N/A
CD28(SA)_變異體_21 P1AE3077 117 121 126 N/A
CD28(SA)_變異體_22 P1AE3078 117 122 126 61
CD28(SA)_變異體_23 P1AE3079 117 65 126 43
CD28(SA)_變異體_24 P1AE3080 118 120 126 80
CD28(SA)_變異體_25 P1AE3081 118 121 126 3.51
CD28(SA)_變異體_26 P1AE3082 118 122 126 9.7
CD28(SA)_變異體_27 P1AE3083 118 123 126 14
CD28(SA)_變異體_28 P1AE3084 118 124 126 69
CD28(SA)_變異體_29 P1AE3085 118 65 126 2.5
CD28(SA)_變異體_30 P1AE3086 119 125 126 3.22
CD28(SA)_變異體_31 P1AE3087 119 65 126 2.5
用表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61)測試對人類CD28的結合。此結合分析描述於下文實例4中。單價單臂IgG樣CD28變異體構築體展示結合存在差異，如自圖 4A 至圖 4C 可見。
3.3 靶向 FAP 之雙特異性抗 CD28 親和性變異體的製備及動力學分析 基於CD28表現細胞之解離速率分析及結合研究，選擇具有不同結合強度之抗CD28 VH與VL變異體的若干組合且作為靶向FAP之雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子表現(關於SEQ ID NO:之組合，參見表 4 )。所得構築體的1+1形式(圖 4B )經純化且進行生物化學分析(表 5 )。表 4 ：所有經表現之靶向 FAP 之 1 + 1 雙特異性抗 CD28 變異體的概述
結合子變異體 Tapir ID SEQ ID NO： SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
FAP (4B9)-CD28 (CD28(SA)_變異體8) 1+1 P1AE3131 67 68 114 122
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體11) 1+1 P1AE3132 67 68 114 65
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體12) 1+1 P1AE3133  67 68 115 125
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體15) 1+1 P1AE3134  67 68 116 121
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體16) 1+1 P1AE3135  67 68 116 122
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體17) 1+1 P1AE3136  67 68 116 123
 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體19) 1+1 P1AE3137 67 68 116 65
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體23) 1+1 P1AE3138  67 68 117 65
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體25) 1+1 P1AE3139  67 68 118 121
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體27) 1+1 P1AE3140  67 68 118 123
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體29) 1+1 P1AE3141  67 68 118 65
表 5 ： 靶向 FAP 之抗 CD28 變異體之產生及純化的概述
TaPIR ID 雙特異性分子 產量[mg/l] 分析型SEC (HMW/單體/LMW) [%] 藉由CE-SDS量測的純度[%]
P1AE3131 FAP (4B9)-CD28 (CD28(SA)_變異體8) 1+1 11.8 0.1 / 98.5 / 1.4 100
P1AE3132 FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體11) 1+1 8.1 0.5 / 97.4 / 2.1 100
P1AE3133  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體12) 1+1 6.1 0 / 100 / 0' 100
P1AE3134  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體15) 1+1 9.2 0 / 100 / 0 100
P1AE3135  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體16) 1+1 0.4 0 / 100 / 0 97
P1AE3136  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體17) 1+1 1.35 0 / 78.7 / 21.3 87
P1AE3137  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體19) 1+1 2.6 0 / 100 / 0 100
P1AE3138  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體23) 1+1 15.5 0 / 97.5 / 2.5 98
P1AE3139  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體25) 1+1 5.4 0 / 88.7 / 11.3 100
P1AE3140  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體27) 1+1 9.7 0 / 98.3 / 1.7 96
P1AE3141  FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體29) 1+1 1.76 1 / 99 / 0 96.3
在25℃下，使用藉由中性鏈親和素捕捉固著於NLC晶片上的生物素化huCD28-Fc抗原，使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，藉由SPR量測所產生之雙特異性抗原結合分子對CD28的親和力(KD )。重組抗原(配位體)之固著：抗原用PBST (10 mM磷酸鹽、150 mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20)稀釋至10 μg/ml，接著以不同接觸時間、以30微升/分鐘注射，以在豎直取向上達成約200、400或800個反應單位(RU)的固著水準。注射分析物：為了進行一次性動力學量測，將注射方向改為水平取向，沿著各別通道1-5、以50 μl/min同時注射經純化之靶向FAP之雙特異性抗CD28親和性變異體的一系列兩倍稀釋液(50 nM與3.125 nM之間範圍的不同濃度)，結合時間為150秒，且解離時間為450秒。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「管線內」空白用於參照。使用簡單的一比一朗繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算結合速率常數(kon )及解離速率常數(koff )。平衡解離常數(KD )係以比率koff /kon 計算。所分析的純系揭露KD 值在寬範圍內(1與25 nM之間)。動力學及熱力學資料概述於表 6 中。表 6 ： 經表現之靶向 FAP 之抗 CD28 變異體的動力學及熱力學分析
雙特異性分子 kon  (1/(s*M) koff  (1/s) KD (nM)
親本 3.79 exp5 3.6 exp-4 1
FAP (4B9)-CD28 (CD28(SA)_變異體8) 1+1 2.19 exp5 5.21 exp-3 23.8
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體11) 1+1 2.3 exp5 2.87 exp-3 12.5
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體12) 1+1 2.6 1exp5 2.67 exp-4 1
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體15) 1+1 2.59 exp5 1.84 exp-3 7.1
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體16) 1+1 1.87 exp5 9.94 exp-4 5.3
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體17) 1+1 3.38 exp5 1.25 exp-3 3.7
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體19) 1+1 2.8 exp5 3.04 exp-4 1.1
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體23) 1+1 2.11 exp5 3.42 exp-3 16.3
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體25) 1+1 2.38 exp5 3.96 exp-4 1.7
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體27) 1+1 2.27 exp5 1.21 exp-3 5.4
FAP (4B9) - CD28 (CD28(SA)_變異體29) 1+1 2.72 exp5 3.07 exp-4 1.1
實例 4 單價 CD28 促效 IgG 及靶向 FAP 之 CD28 促效抗體對 CD28 表現細胞及 FAP 表現細胞的結合 用表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)來測試對人類CD28的結合。為了評估結合，收集細胞，計數，檢查存活率且以2.5x105 /ml再懸浮於FACS緩衝液(eBioscience，目錄號00-4222-26)中。在4℃下，在圓底96孔盤中，將5x104 個細胞與濃度增加之CD28結合劑(1 pM-100 nM)一起培育2小時。接著，細胞用冷FACS緩衝液洗滌三次，在4℃下與PE結合之山羊抗人類PE (Jackson ImmunoReserach，目錄號109-116-098)一起再培育60分鐘，用冷FACS緩衝液洗滌一次，離心且再懸浮於100 ul FACS緩衝液中。為監測構築體與細胞之間的非特異性結合相互作用，包括抗DP47 IgG作為陰性對照。藉由流式細胞術，使用FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva)評估結合。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線。
單價單臂IgG樣CD28變異體構築體展示結合存在差異，如自圖 4A 至圖 4C 可見。另外，測定靶向FAP之雙特異性抗CD28抗體之1+1形式對表現人類CD28之CHO細胞的結合。具有所選CD28變異體之不同1+1構築體的KD 值展示於下表 7 中或圖 4D 及圖 4E 之相應圖形中。表 7 ： 靶向 FAP 之抗 CD28 1 + 1 構築體對表現人類 CD28 之 CHO 細胞的 結合
結合子 TAPIR KD (nM)
TGN1412 P1AD4492 1
變異體8 P1AE3131 23.8
變異體11 P1AE3132 12.5
變異體12 P1AE3133 1
變異體15 P1AE3134 7.1
變異體16 P1AE3135 5.3
變異體17 P1AE3136 3.7
變異體19 P1AE3137 1.1
變異體23 P1AE3138 16.3
變異體25 P1AE3139 1.7
變異體27 P1AE3140 5.4
變異體29 P1AE3141 1.1
靶向FAP之雙特異性抗CD28抗體之1+1形式對表現FAP之3T3-huFAP細胞(純系19)的結合亦如實例2.1中所述測定且展示於圖 4F 及圖 4G 之相應圖形中。
實例 5 靶向 CEA 之 CD28 促效抗體對 CD28 表現細胞的結合 用表現人類CD28之CHO細胞測試對人類CD28的結合(使用FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva)，藉由流式細胞術評估結合，如實例4中所述)。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線。具有所選之CD28變異體之不同1+1構築體的結合曲線展示於圖 16 中。
實例 6 靶向 CD28 及纖維母細胞活化蛋白 ( FAP ) 或癌胚抗原 ( CEA ) 的 活體外功能表徵 使用人類初代PBMC進行若干基於細胞的活體外分析，以評估CD28(SA)及靶向FAP之雙特異性CD28抗原結合分子在T細胞雙特異性(TCB)抗體所提供之TCR信號存在及不存在下的活性。如藉由流式細胞術、細胞介素ELISA及活細胞成像所測定之T細胞增殖、細胞介素分泌及腫瘤細胞殺滅係作為讀數獲得。 1.     藉由使用先前所述的高密度預培養系統恢復周邊血液源T細胞針對CD28介導性超促效作用之反應(Römer等人, 2011)來評估原始超促效CD28(SA) IgG4的活性。 2.     在人類初代PBMC共培養分析中評估目標CD28分子在TCR信號不存在下的功能，其中靶向FAP或CEA之CD28分子藉由同時結合至T細胞上之人類CD28及人類FAP而交聯，分別表現於3T3-huFAP細胞(親本細胞株ATCC #CCL-92，其經修飾以穩定地過度表現人類FAP)或表現MCSP及表現FAP之MV3黑色素瘤細胞，或表現CEA之MKN45胃癌細胞上。 3.     如上文所述，評估靶向FAP之CD28分子在TCR信號存在下、在TCB分子之額外存在下的功能，該等分子藉由同時結合至T細胞上之CD3及MKN45胃癌細胞、Lovo結腸癌細胞、HT-29結腸癌細胞上之人類CEA或MV3黑色素瘤細胞上所表現之MCSP而交聯。
PBMC 分離 藉由對獲自白血球層之肝素化血液的富淋巴球製劑進行密度梯度離心(「Blutspende Zürich」)來製備周邊血液單核細胞(PBMC)。使25 ml血液(在PBS中1:2稀釋)在15 ml淋巴球分離液(STEMCELL技術，目錄號07851)上分層且在室溫下以845xg連續離心25分鐘。使用10 ml移液管將含有PBMC的中間相收集於50 ml管中。細胞用PBS洗滌且以611xg離心5分鐘。丟棄上清液，將離心塊再懸浮於50 ml PBS中且以304xg離心5分鐘。重複進行洗滌步驟，以171xg離心。將細胞再懸浮於RPMI 1640 Glutamax (含有5%人類血清、丙酮酸鈉、NEAA、50 μM 2-巰基乙醇、青黴素/鏈黴素)中且加以處理以便根據各別分析方案進行進一步的功能分析。
PBMC 的 高密度預培養及 CD28 超促效劑 CD28 ( SA ) 所達成之 T 細胞活化的 活體外評估 為了恢復人類T細胞對TGN1412介導之CD28超促效作用的反應，在評估CD28超促效抗體的作用之前，以高密度(HD)預培養PBMC (Römer等人, 2011)。簡言之，將PBMC在完全培養基(RPMI 1640 Glutamax、5%人類血清、丙酮酸鈉、NEAA、50 uM 2-巰基乙醇、青黴素/鏈黴素)中調節至1E7個細胞/毫升且在24孔盤中、在37℃、5% CO2 下以每孔1.5 ml培養48小時。接著再收集細胞，在完全培養基中洗滌，以550xg離心5分鐘且調節至功能表徵所必需的期望細胞密度。為了評估T細胞增殖，用CFSE標記PBMC，且在刺激5天之後量測CFSE稀釋度作為T細胞增殖之表示。簡言之，將細胞在PBS中調節至2x107 /ml且在37℃、5% CO2 下用2.5 μM CFSE增殖染料(LifeTechnologies，目錄號65-0850-84)標記6分鐘。細胞在完全培養基中洗滌一次，隨後用PBS執行2個洗滌步驟。用TGN1412刺激時，PBMC於完全培養基中調節至2x106 /ml且將1x105 個細胞分佈於平底96孔盤之各孔中且用濃度增加的TGN1412 (0.0002 nM至10 nM，三重複)刺激。藉由流式細胞術評估CFSE稀釋度。簡言之，細胞以550xg離心5分鐘且用PBS洗滌。藉由流式細胞術評估CFSE稀釋度。簡言之，細胞以550xg離心5分鐘且用PBS洗滌。根據供應商指示，對CD8 (BV711抗人類CD8a，BioLegend #301044)、CD4 (PE-Cy7抗人類CD4，BioLegend # 344612)進行表面染色。細胞接著用每孔150 µl PBS洗滌兩次且再懸浮於每孔200 µl FACS緩衝液中且使用BD FACS Fortessa分析。活化後第5天，經由細胞介素ELISA (huTNFα，DuoSet #DY210-05及huIFNγ，DuoSet #DY285-05)或細胞介素多重(人類細胞介素17-plex分析，Bio-Rad #M5000031YV)分析，自培養物上清液量測細胞介素分泌。
活體外評估靶向 FAP 之 雙特異性 CD28 抗原結合分子在 TCB 信號不存在及存在下達成的 T 細胞增殖 及細胞介素分泌 泛T細胞用作效應細胞且使用泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)，根據製造商說明書，藉由MACS自PBMC分離出泛T細胞。
為了量測雙特異性FAP-CD28抗原結合分子在TCB不存在下達成的T細胞活化，將CFSE標記之泛T細胞與每孔3x104 個缺乏FAP表現之3T3-huFAP或親本3T3細胞(3T3-WT)(前一天接種於平底96孔盤中)共培養。雙特異性FAP-CD28抗原結合分子以增加的濃度(0.0002 nM-10 nM，三重複)添加。
為了量測TCB信號存在下的T細胞增殖，將CFSE標記的泛T細胞與每孔3x104 個表現FAP及表現MCSP之MV3細胞(前一天接種於平底96孔盤中)、濃度增加(0.0002 nM-10 nM，三重複)的雙特異性FAP-CD28抗原結合分子及固定濃度(5 pM，P1AD2189)的MCSP-TCB一起培育。作為對照，包括僅含有TCB之孔。
藉由流式細胞術評估CFSE稀釋度且在活化後第5天，經由細胞介素ELISA (huTNFα，DuoSet #DY210-05及huIFNγ，DuoSet #DY285-05)或細胞介素多重(人類細胞介素17-plex分析，Bio-Rad #M5000031YV)分析，自培養物上清液量測細胞介素分泌。
實驗中所用之抗MCSP/抗CD3雙特異性抗體(MCSP-TCB)的製劑描述於WO 2014/131712 A1中。
CD28 ( SA ) 之超促效作用需要 FcγRIIb 交聯 PBMC 之高密度預培養使 CD28 ( SA ) 超促效作用恢復 為了理解CD28(SA)的作用機制，吾等驗證PBMC之高密度(HD)預培養為恢復PBMC源T細胞對TGN1412介導之CD28超促效作用作出反應之能力的先前所述方案(Römer等人, 2011)。如圖 5A 及圖 5B 中所描繪，CD28(SA) IgG4 (P1AE1975 )在僅經歷HD預培養之PBMC刺激後的第5天以濃度依賴性方式誘導PBMC T細胞增殖(圖 5A )細胞介素產生(圖 5B )，而新製PBMC仍無反應。吾等得出結論：先前公開之使T細胞針對CD28(SA)之活體外反應恢復的方案(Römer等人, 2011)可以吾人之手再現。
CD28 ( SA ) 超促效活性需要經由 FcγRIIb 發生 交聯 - 阻斷 FcγRIIb 使 CD28 ( SA ) 功能消除 先前公開之文獻指出TGN1412潛在地依賴於FcγRIIb交聯。為了理解PBMC之HD預培養與CD28(SA)功能之Fc依賴性之間的關係，在HD預培養之前及之後，藉由流式細胞術評估PBMC上之FcγRIIb表現量。如圖 5C 中所描繪，新製PBMC單核球中不存在FcγRIIb表現，而在HD預培養2天之後，96.8%單核球表現FcγRIIb。用CD28(SA)刺激後，在隨後的T細胞增殖分析中，抗體介導FcγRIIb阻斷使T細胞增殖完全消除，如培養5天之後所量測(圖 5D )。在一個替代方案中，帶有P329G-LALA突變之CD28(SA)之Fc靜默變異體(CD28 ( SA ) IgG1 PG - LALA ： P1AD9289 )不顯示超促效功能(圖 6A )。此等資料證實CD28(SA)介導的CD28超促效作用依賴於經由FcγRIIb發生交聯。
將靶向 FAP 之 腫瘤靶向部分添加至 Fc 靜默 CD28 ( SA ) 中使 超促效作用恢復 ， 此超促效作用接著依賴於腫瘤 目標 的存在 鑒於TGN1412對CD28的超促效作用依賴於FcγRIIb交聯，因此吾等假設FcR依賴性可以藉由引入(i) Fc靜默P329G-LALA突變及(ii)與表面表現之腫瘤抗原交聯的靶向部分而再定向於腫瘤。為了檢驗此假設，FAP靶向部分以C端融合至Fc靜默TGN1412 (FAP - CD28 1 + 2 SA ： P1AD9011 )方式添加。由於此方案不需要FcR交聯，因此PBMC不經歷HD預培養。實情為，新製PBMC與3T3-huFAP或3T3-WT一起在濃度增加的FAP-CD28 (P1AD9011 )存在下共培養5天且經由流式細胞術、根據CFSE稀釋度評估T細胞增殖。如圖 6B 中所示，FAP結合部分的引入能夠使T細胞增殖僅在FAP存在下達成。吾等得出結論：超促效作用可以藉由Fc靜默及腫瘤靶向部分之添加而選擇性地靶向腫瘤抗原。
習知 CD28 促效抗體 ( 純系 9 . 3 ) 在靶向腫瘤之雙特異性形式中不以超促效方式起作用 文獻已報導兩種類型之CD28促效抗體：超促效CD28抗體(諸如TGN1412)能夠自主地活化T細胞而無需由TCR提供的額外信號。此等抗體稱為超促效劑，原因在於其超出天然CD28促效配位體CD80及CD86之功能，此功能嚴格地依賴於增強T細胞功能之TCR信號的存在。與超促效抗體(諸如TGN1412)相比，習知促效抗體(諸如純系mab 9.3)不能夠自主地活化T細胞，但正如天然CD28配位體，需要額外的TCR信號來增強T細胞活性。為了更詳細地評估CD28促效劑靶向腫瘤抗原的作用，吾等產生其他FAP-CD28分子：(i)具有2個CD28結合部分(TGN1412)及2個FAP結合部分的超促效(SA)分子 = 2+2 SA形式(P1AD4493 )，(ii)分別具有2個CD28結合部分(純系9.3)及1或2個FAP結合部分的習知促效劑(CA)：2+2 CA (P1AD8968 )、1+2 CA (P1AD8962 )。將新製PBMC與3T3-huFAP或3T3-WT在濃度增加的靶向FAP之分子存在下共培養5天且經由流式細胞術、根據CFSE稀釋度評估T細胞增殖。如圖 7A 至圖 7D 中所描繪，僅超促效結合劑能夠活化T細胞。另外，經由所述超促效構築體進行的T細胞活化嚴格地依賴於FAP的存在(圖 7B )，如在缺乏FAP的情況下缺乏T細胞活化所表明(圖 7D )。依據此等資料，僅具有超促效CD28(SA)抗體、但不具有習知促效9.3抗體之構築體亦觀測到細胞介素分泌(圖 7E )。吾等得出結論：僅超促效CD28抗體誘導靶向腫瘤之雙特異性抗體形式發生自主T細胞活化，而具有習知9.3結合子的相同形式不具有超促效作用。
實例 7 活體外評估靶向腫瘤之 CD28 分子在 TCB 不存在或存在下對腫瘤細胞的殺滅 為了評估雙特異性FAP-CD28或CEA-CD28抗原結合分子達成腫瘤細胞殺滅或支持TCB介導殺滅腫瘤細胞的能力，經純化之泛T細胞充當效應細胞且表現RFP之MV3細胞及MKN45細胞分別充當腫瘤目標。
為了評估MV3腫瘤細胞的殺滅，將前一天接種的5000個MV3目標細胞與每孔1x105 個泛T細胞在平底96孔盤(E:T 20:1)中、在5 pM MCSP-TCB (P1AD2189)單獨或與10 nM雙特異性FAP-CD28抗原結合分子之組合存在下共培養。為了評估MV3腫瘤細胞之殺滅，將前一天接種的5000個MV3目標細胞與每孔1x105 個泛T細胞在平底96孔盤(E:T 20:1)中、在2 nM FAP-CD28存在下共培養。為了評估MKN45腫瘤細胞的殺滅情況，將前一天接種的5000個MKN45與每孔1x105 個泛T細胞一起在平底96孔盤中、在2 nM CEA-CD28存在下共培養。使用IncuCyte活細胞成像系統(Essen Biosciences)(每3小時每孔捕捉4個影像)監測90個小時期間的目標細胞殺滅情況。每個影像的RFP+物隨時間的計數(經由IncuCyte ZOOM軟體評估，Essen Biosciences)充當目標細胞死亡的指示。藉由在單獨效應T細胞存在下監測目標細胞隨時間的計數(=基線對照)來區分抗體介導之目標細胞殺滅與自發的目標細胞死亡。殺滅率係依100 - x計算，x為相對於基線對照的目標%。使用斯圖登氏t測試(student's t-test)、比較隨時間之殺滅%之曲線下面積(AUC)來進行統計分析。
FAP - CD28 誘導 1 + 2 形式殺滅 目標 細胞 ， 但該形式僅具有超促效 CD28 結合子 ， 而不具有習知 CD28 促效結合子 評估FAP-CD28分子誘導腫瘤細胞殺滅的能力。如圖 8A 至圖 8D 中所描繪，PBMC源T細胞與表現FAP之MV3黑色素瘤細胞在FAP-CD28存在下共培養90小時使得MV3細胞排他性地被FAP CD28(SA)之1+2形式(P1AD9011)殺滅且類似於誘導靶向FAP之TCB (7)所達成的殺滅。FAP-CD28(SA)之2+2形式(P1AD4493)以及具有習知CD28促效9.3抗體(P1AD8968及P1AD8962)之FAP-CD28未觀測到殺滅。吾等得出結論：除T細胞增殖及細胞介素分泌之外，具有超促效結合子之FAP-CD28的1+2形式亦可誘使目標細胞殺滅，類似於TCB。
CEA - CD28 誘導 1 + 2 及 2 + 2 形式殺滅 目標 細胞 ， 但僅具有超促效抗體之形式具有此能力 ， 具有習知 CD28 促效抗體的形式則無。 在替代方案中，吾等使用靶向CEA之CD28促效分子的2+2 SA (P1AE1195 )、1+2 SA (P1AE1194 )、2+2 CA (P1AE1193 )及2+1 CA (P1AE1192 )形式來評估其誘導目標細胞殺滅的能力。將PBMC T細胞與表現CEA之MKN45細胞一起在CEA-CD28之前述形式存在下共培養90小時。含有超促效CD28結合子的兩種形式均能夠誘導表現CEA之MKN45細胞殺滅(圖 9A 及圖 9B )。吾等推測，FAP-CD28(SA) 2+2與CEA CD28(SA) 2+2殺死其各別目標細胞之能力之間的差異處於MKN45細胞相對於MV3細胞之目標表現量之差異範圍內。確切而言，內部資料證實MV3細胞之FAP表現量比MKN45細胞之CEA表現量低10倍。因此，在MV3細胞中，腫瘤目標結合位點可為有限的且殺滅MV3細胞需要FAP相對於CD28的有效占位，就此而言，1+2形式(亦即，1個FAP結合位點與2個CD28結合位點交聯)優於2+2 (亦即，2個CD28結合位點交聯需要2個FAP結合位點)。
TGN1412 結合子達成的 CD28 超促效作用依賴於 CD28 結合子多價 - 單價結合子不具有超促效作用 為了進一步研究CD28超促效作用之性質，吾等評估單價CD28 TGN1412結合子是否以靶向腫瘤之雙特異性形式的超促效特性。將PBMC T細胞與3T3-huFAP細胞共培養且與濃度增加之CD28呈二價之FAP-CD28 1+2 SA (P1AD9011 )及CD28呈單價之FAP-CD28 1+1 SA (P1AD4492 )一起培育。如圖 10A 中所示，與CD28二價構築體(P1AD9011 )相反，CD28單價結合的FAP-CD28 (P1AD4492 )不能誘導T細胞增殖。僅CD28二價始終觀測到T細胞活化標記物CD69及CD25的上調(分別為圖 10B 及圖 10C )。總之，TGN1412介導的超促效作用不僅依賴於經由Fc受體發生的交聯，而且需要CD28結合子為多價。
總之，可以確定CD28超促效作用尤其可以藉由Fc靜默及引入能夠特異性結合至腫瘤相關抗原之抗原結合域而靶向腫瘤抗原。另外，靶向腫瘤之雙特異性抗體僅當其包含基於CD28(SA)之結合子時才具有超促效作用，且當其包含習知促效結合子(純系9.3)時，則不具有超促效作用。另外，超促效作用需要CD28(SA)結合子具有多價且雙特異性構築體的單價CD28(SA)結合消除超促效T細胞活化。
FAP - CD28 支持 TCB 介導的 目標 細胞殺滅且需要 CD28 結合子為單價以維持腫瘤 目標 依賴性 CD28信號傳導經充分描述以增強T細胞受體介導之T細胞反應。因此，T細胞雙特異性抗體(TCB)為有望用於CD28促效作用的組合搭配物。經由靶向CD28促效作用與TCB之組合來增強TCB介導之效應功能、降低用於有效TCB介導T細胞活化之CEA表現臨限值的吾等設想提供了存活線索且支持經由PD-1及CTLA4針對T細胞抑制之抗性。
為了研究靶向CD28促效劑是否可以增強TCB，吾等評估FAP-CD28 (SA) 1+2 (P1AD9011 )及FAP-CD28 (SA) 1+1 (P1AD4492 )支持TCB介導殺滅目標細胞的能力。將PBMC源T細胞與MCSP及FAP共表現之MV3細胞一起在濃度增加之FAP-CD28及濃度固定、有限之MCSP-TCB (5 pM)存在下共培養5天可以FAP-CD28濃度依賴性方式增強對MV3目標細胞的殺滅(圖 11A )。然而，TCB的存在消除FAP-CD28之CD28二價形式(P1AD9011 )對FAP的依賴性，而FAP依賴性在CD8單價形式(P1AD4492 )中得以維持，如在刺激後第5天時在表現CEA之FAP陰性MKN45腫瘤細胞存在下CEACAM5-TCB介導之目標細胞殺滅的濃度依賴性增加所表明(圖 11B )。
在替代方案中，吾等評估FAP-CD28 1+2 SA (P1AD9011 )分別在TCB存在或不存在下及在FAP存在或不存在下所誘導的T細胞增殖。如圖 12A 中及先前實例所示，在TCB不存在下，FAP-CD28(SA) 2+1嚴格地依賴於FAP的存在來達成T細胞活化。然而在TCB存在下，如圖 12B 中所示，FAP-CD28(SA) 1+2誘導T細胞活化增強，即使FAP不存在。
吾等假設TCB誘導的TCR信號潛在地引起TCR信號傳導組分發生預叢集，從而使得CD28受體與足以誘發共刺激的二價CD28分子在T細胞表面上交聯。吾等得出結論：就TCB組合方法而言，維持靶向CD28促效抗原結合分子之腫瘤目標依賴性嚴格地需要CD28結合子為單價。
不同單價 FAP - CD28 形式的比較揭示一組多種功能 FAP - CD28 形式 ， 其中經典 1 + 1 形式的效能最高 為了評估FAP-CD28之特定抗體形式對其增強TCB介導T細胞活化之能力的影響，產生單價CD28結合之FAP-CD28抗原結合分子的不同形式且該等形式描繪於圖 1C 、圖 1K 、圖 1L 及圖 1M 中。具有CD28二價的FAP-CD28 1+2用作參照。為了評估此等形式之功能，將PBMC T細胞與MCSP及FAP共表現之MV3細胞一起在濃度增加之FAP-CD28形式以及濃度固定、有限之MCSP-TCB (5 pM)存在下培育5天。所有形式均能夠顯著增強CD8 T細胞增殖(圖 13A )、CD4 T細胞增殖(圖 13B )及目標細胞殺滅(圖 13C )。值得注意的是，分子C (P1AD4492)的效能最高，且類似於二價CD28參考形式1+2 SA (P1AD9011)的效能。所有分子對CD28及FAP的結合分別展示於圖 2F 及圖 2G 中。
實例 8 活體外評估靶向腫瘤之 CD28 分子與靶向 CEA 之 TCB 組合對腫瘤細胞的殺滅 製備 T 細胞 雙特異性 ( TCB ) 抗體 TCB分子已根據WO 2014/131712 A1或WO 2016/079076 A1中所述之方法製備。WO 2014/131712 A1之實例3中描述實驗中使用之抗CEA/抗CD3雙特異性抗體(CEA CD3 TCB或CEA TCB)之製備。CEA CD3 TCB為「2+1 IgG互換Fab」抗體且包含兩條不同重鏈及兩條不同輕鏈。引入CH3域中的點突變(「臼包杵」)以促進兩條不同重鏈之組裝。使結合CD3之Fab中的VH域與VL域發生交換以便促進兩條不同輕鏈之正確組裝。2+1意謂該分子具有兩個對CEA具有特異性之抗原結合域及一個對CD3具有特異性之抗原結合域。CEACAM5 CD3 TCB具有相同形式，但包含另一CEA結合子且在CD3結合子之CH及CL域中包含點突變以便支持輕鏈之正確成對。CEA CD3 TCB包含SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163及SEQ ID NO：164之胺基酸序列。CEACAM5 CD TCB包含SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167及SEQ ID NO：168之胺基酸序列。
CEA - CD28 與 CEACAM5 - TCB 協同殺滅 目標 細胞 在一個替代方法中，吾等產生CEA-CD28(SA) 1+1雙特異性抗原結合分子(分子M，P1AE3127)且評估其增強CEACAM5-TCB介導殺滅目標細胞的能力。為此目的，將表現CEA的MKN45結腸直腸癌細胞與PBMC T細胞及CEA-CD28 (分子M，P1AE3127)或非靶向單價CD28 (分子L，P1AD8944)一起在次最佳的CEACAM5-TCB (10 nM)存在或不存在下共培養且評估MKN45細胞隨時間的殺滅率。如圖 14 中所示，僅CEACAM5-TCB與CEA-CD28的組合引起目標細胞殺滅，而單獨的化合物未達成目標細胞殺滅，表明存在協同作用。另外，非靶向CD28與CEACAM5-TCB的組合亦未誘導殺滅，再次突顯交聯對單價CD28促效劑的需求及從而突顯對腫瘤目標之持續依賴性。
CEA - CD28 增強 CEA - TCB 及 CEACAM5 - TCB 且降低癌細胞上的 CEA 表現臨限值以便 TCB 活化 T 細胞 CEA-TCB及CEACAM5-TCB需要目標細胞上的CEA達成一定表現量，以實現T細胞活化及目標細胞殺滅。吾等評估CEA-CD28是否能夠降低TCB的CEA表現臨限值以誘導有效的目標細胞殺滅。為此目的，將PBMC T細胞與濃度增加的CEA-TCB (P1AD4646)或CEACAM5-TCB (P1AD5299)及濃度固定的CEA-CD28 (分子M，P1AE3127)一起在具有不同CEA表現量之以下目標細胞株存在下培育：(i) MKN45(高度表現，約400 000個CEA結合位點/細胞)；(ii) Lovo (中度表現，約60 000個CEA結合位點/細胞)；(iii) HT-29 (低度表現，約6 000個CEA結合位點/細胞)。量測T細胞增殖作為T細胞活化之指示。如圖 15 中所示，CEA-CD28可顯著增加CEA-TCB及CEACAM5-TCB之效能。最引人注目的是，儘管TCB針對低度表現CEA之單獨HT-29細胞未達成T細胞活化，但CEA-CD28的添加大幅增強TCB活性。吾等得出結論：CEA-CD2增強CEA-TCB及CEACAM5-TCB且降低癌細胞上的CEA表現臨限值以便TCB活化T細胞。
實例 9 親和性減少之 CD28 ( SA ) 變異體的活體外功能表徵 對於原始CD28(SA)結合子(TGN1412)而言，測定KD =1 nM之親和力。如此高親和力結合子具有經受周邊下沉效應的風險，尤其是目標在周邊血液中受到高度表現時，CD28之情況即如此。為了(i)減少周邊下沉效應，及(ii)減少周邊T細胞活化(經由靶向腫瘤之雙特異性CD28抗體偏離腫瘤結合至T細胞)的風險，吾等藉由在CDR中引入點突變而產生親和力減少的一系列31個CD28結合子(參見實例3)。圖 4A 、圖 4B 及圖 4C 展示來自上清液之CD28單特異性、單價IgG對CHO細胞上之CD28的結合，證實點突變的添加產生具有不同結合特性的寬範圍結合子。基於此等資料，選擇11種候選物的簡短清單以便轉化為FAP-CD28雙特異性形式(參見實例4、表6)用於進一步表徵。結合分析證實所選變異體對細胞上之FAP的陽性結合( 圖 4F 及圖 4G )以及對CD28的陽性且不同之結合(圖 4D 及圖 4E )。
親和性減少的 CD28 結合子變異體在 FAP - CD28 雙特異性形式中具有活體外功能 為了評估親和力減少的CD28結合子變異體是否仍具有功能且能夠支持TCB介導的效應功能，吾等評估TCB組合的T細胞增殖。為此目的，將PBMC T細胞與MCSP及FAP共表現之MV3細胞一起在濃度增加的FAP-CD28及濃度固定、有限的MCSP-TCB (5 pM)存在下共培養5天。如圖 4H 中所描繪，CD28結合子的所有變異體均具有功能且能夠以濃度依賴性方式增強TCB介導的T細胞增殖。值得注意的是，最低親和力變異體8 (P1AE3131)展示的親和力比親本CD28純系減少約20倍，但恢復其效能的約86% (圖 4I )。與此等發現一致，所有變異體可進一步增強TCB介導殺滅MV3目標細胞(圖 4J )。相應EC50 值展示於下表 8 中。表 8 ： TCB 介導 MV3 目標 細胞之 FAP - CD28 雙特異性分子殺滅 MV3 目標 細胞
FAP-CD28變異體 TAPIR EC50 殺滅(nM)
親本 P1AD4492 0.98
變異體8 P1AE3131 2.33
變異體11 P1AE3132 1.73
變異體12 P1AE3133 0.98
變異體15 P1AE3134 1.79
變異體29 P1AE3141 1.11
基於此等結果，選擇變異體8 (最低親和力：23 nM)、15 (中等親和力：7.1 nM)及29 (熱點移除，親和力幾乎未減少，KD =1.1 nM)用於進一步的活體外表徵及活體內測試，根據功效及改良的腫瘤生物分佈來判斷。
親和性減少的 CD28 結合子變異體在 CEA - CD28 雙特異性形式中具有活體外功能 在一個替代方法中，吾等將三種所選變異體8、15及29轉化成靶向CEA之雙特異性形式且評估其增強CEACAM5-TCB介導T細胞活化及殺滅目標細胞的能力。此等分子對CD28的結合展示於圖 16 中。為了評估功能，將PBMC T細胞與濃度增加之CEACAM5-TCB及濃度固定之CEA-CD28變異體一起在表現CEA之MKN45目標細胞存在下培育。如圖 17A 、圖 17B 及圖 17C 中所描繪，所有變異體均能夠在5天之後增強TCB介導CD8 T細胞增殖(圖 17A )、在5天之後增強TCB介導CD4 T細胞增殖(圖 17B )且在90小時時增強目標細胞殺滅(圖 17C )。相應EC50 值概述於下表 9 中。表 9 ： TCB 介導之 CD8 及 CD4 T 細胞增殖 及 CEA - CD28 雙特異性變異體殺滅 目標 細胞的 EC50 值
CEA-CD28 抗體 CD4 增殖 EC50 [nM] CD8 增殖 EC50 [nM] 殺滅 EC50 [nM]
親本CD28 0.0013 0.0015 0.002
變異體8 0.0035 0.0033 0.004
變異體15 0.0021 0.0016 0.005
變異體29 0.0013 0.0013 0.004
單獨 TCB 0.046 0.038 0.012
實例 10 產生及製備新抗 CEA 抗體 10.1 產生抗 CEA 抗體 A5B7 之人類化變異體 10.1.1 方法 抗CEA抗體A5B7揭示於例如M. J. Banfield等人, Proteins 1997, 29(2), 161-171中，且其結構可作為PDB ID:1CLO發現於蛋白質結構資料庫PDB (www.rcsb.org, H.M. Berman等人, The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 2000, 28, 235-242)中。此條目包括重鏈及輕鏈可變域序列。為了在抗CEA結合子A5B7發生人類化期間鑑別出適合人類受體構架，採取如下經典方法：搜尋具有高度序列同源性之受體架構、在此構架上移植CDR且評估可設想之回復突變。更明確而言，判斷所鑑別之構架相對於親本抗體之各胺基酸差異對結合子之結構完整性的影響，且在適當時向親本序列引入回復突變。結構評估係基於親本抗體與其人類化形式之Fv區同源性模型，該模型係使用Biovia Discovery Studio Environment 4.5版實施的內部抗體結構同源模型化工具產生。
10.1.2 受體構架及其調適之選擇 選擇如下表 10 中所述的受體架構：表 10 ： 受體構架
   最接近的鼠類V區生殖系 人類受體V區生殖系之選擇
A5B7 VH    mu-IGHV7-3-02 IGHV3-23-01或IGHV3-15-01
A5B7 VL    mu-IGKV4-72-01 IGKV3-11-01
CDR3後構架區係自人類J元件生殖系IGJH6調適用於重鏈，且自類似於κ J元件IGKJ2之序列調適用於輕鏈。
基於結構考慮因素，在重鏈之位置93及94處引入人類受體構架向親本結合子中之胺基酸的回復突變。
10.1.3 所得人類化 CEA 抗體之 VH 及 VL 區 人類化CEA抗體之所得VH域可見於下表 11 中，且人類化CEA抗體之所得VL域列於下表 12 中。表 11 ： 基於人類受體構架 IGHV3 - 23 或 IGHV3 - 15 之人類化 CEA 抗體的 VH 域胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
A5B7 VH 鼠類供體序列 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFTFTDYYMNWVRQPPGKALEWLGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSQSILYLQMNTLRAEDSATYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTLTVSS 178
IGHV3-23-02 人類供體序列 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSA ISGSGGSTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK    218
人類化變異體      
3-23A5-1    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 220
3-23A5-2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 221
3-23A5-3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF IGNKGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDR GLRFYFDYWGQGTTVTVSS 222
3-23A5-4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMSWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 223
3-23A5-1A (所有回復突變) EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 224
3-23A5-1C (A93T)    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 225
3-23A5-1D (K73)    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 226
3-23A5-1E (G54A)    EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGF IGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 186
        
IGHV3-15*01 人類供體序列 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMSWVRQAPGKGLEWVGR IKSKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTT 219
人類化變異體      
3-15A5-1    EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYSASVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 227
3-15A5-2 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGYTTEYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 228
3-15A5-3 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWVGF IGNKANGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTR DRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS 229
對於重鏈而言，發現初始變異體3-23A5-1在結合分析中為適合的(但展示的結合稍微小於親本鼠類抗體)且選作用於進一步修飾的起點。基於IGHV3-15之變異體展示的結合活性小於人類化變異體3-23A5-1。
為恢復親本嵌合抗體之完整結合活性，產生變異體3-23A5-1A、3-23A5-1C及3-23A5-1D。對於變異體3-23A5-1而言，亦測試CDR-H2之長度是否可適於人類受體序列，但此構築體完全失去結合活性。由於推定去醯胺熱點存在於CDR-H2 (Asn53-Gly54)中，因此吾等將該基元變為Asn53-Ala54。另一可能的熱點Asn73-Ser74回復突變為Lys73-Ser74。從而產生變異體3-23A5-1E。表 12 ： 基於人類受體構架 IGKV3 - 11 之人類化 CEA 抗體 VL 域的胺基酸序列
描述 序列 Seq ID No
A5B7 VL 鼠類供體序列 QTVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYAT SNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQHWSSKPPTFGGG TKLEIK 179
IGKV3-11 人類受體序列 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYD ASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP 230
人類化變異體      
A5-L1 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYAT SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG TKLEIK 231
A5-L2 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYIHWYQQKPGQAPRLLIYA TSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQ GTKLEIK 232
A5-L3 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYDA SNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG TKLEIK 233
A5-L4 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYAT SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQWSSKPPTFGQG TKLEIK 234
A5-L1A (所有回復突變) QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYAT SNLASGIPARFSGSGSGTDYTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG TKLEIK 235
A5-L1B (Q1T2) QTVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRLLIYAT SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG TKLEIK 236
A5-L1C (FR2) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGSSPKSWIYAT SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG TKLEIK 237
A5-L1D (46,47) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYAT SNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQG TKLEIK 187
基於人類IGKV3-11受體架構使輕鏈發生人類化。在系列A5-L1至A5-L4中，瞭解到變異體A5-L1展示良好的結合活性(但稍微小於親本抗體)。CDR-L1 (變異體A5-L2；Kabat位置30及31)之部分人類化完全消除結合。同樣，CDR-H2 (變異體A5-L3；Kabat位置50至56)之人類化亦完全消除結合。位置90 (變異體A5-L4)對結合特性展示顯著貢獻。此位置處之組胺酸對於結合係重要的。因此，選擇變異體A5-L1進行進一步修飾。
系列A5-L1A至A5-L1D解決的問題在於，需要哪些回復突變來恢復親本嵌合抗體之完全結合潛力。變異體A5-L1A展示Kabat位置1、2、整個構架2及Kabat位置71處之回復突變不增加任何其他結合活性。變異體A5-L1B及A5-L1C解決彼等位置之亞群且證實其不改變結合特性。在Kabat位置46及47處具有回復突變之變異體A5-L1D展示最佳結合活性。
10.1.4 人類化 A5B7 抗體之選擇 基於VH及VL之新穎人類化變異體，根據WO 2012/130831 A1中所述之方法，使新穎CEA抗體作為具有效應子靜默Fc (P329G；L234，L235A)之huIgG1抗體受到表現以消除對Fcγ受體的結合，且測試其對MKN45細胞上所表現之CEA的結合且對此結合與各別親本鼠類A5B7抗體進行比較。 表13：以huIgG1_LALA_PG抗體形式表現的VH/VL組合
   A5-L1A A5-L1B A5-L1C A5-L1D
3-23A5-1A P1AE2164 P1AE2165 P1AE2166 P1AE2167
3-23A5-1C - - P1AE2176 P1AE2177
3-23A5-1D P1AE2179 - P1AE2181 P1AE2182
MKN45 (DSMZ ACC 409)為表現CEA之人類胃腺癌細胞株。細胞提前在RPMI + 2% FCS + 1% Glutamax中培養。檢查MKN-45細胞之存活率，且將細胞再懸浮且調節至1百萬個細胞/毫升之密度。將100 µl之此細胞懸浮液(含有10萬個細胞)接種於96孔圓底盤中。使培養盤以400xg離心4分鐘且移除上清液。接著將40 µl稀釋抗體或FACS緩衝液添加至細胞中且在4℃下培育30分鐘。培育後，用每孔150 µl FACS緩衝液洗滌細胞兩次。接著將20 μl稀釋的二級PE抗人類Fc特異性二級抗體(109-116-170，Jackson ImmunoResearch)添加至細胞中。在4℃下再培育細胞30分鐘。為移除未結合的抗體，用每孔150 µl FACS緩衝液再次洗滌細胞兩次。為固定細胞，將含有1% PFA之100 µl FACS緩衝液添加至孔中。在量測之前，將細胞再懸浮於150 µl FACS緩衝液中。使用BD流式細胞儀量測螢光。
圖 18 中展示人類化A5B7變異體之結合曲線。所有測試結合子能夠結合至MKN45細胞，但結合力相較於親本A5B7抗體稍微減少。純系P1AE2167對於所有測試變異體均具有最佳結合且選用於進一步開發。
10.1.5 使用表面電漿子共振 ( BIACORE ) 測定鼠類 CEA - 抗體 A5B7 之人類化變異體之 Fab 片段 對人類 CEA 的親和力 使用BIACORE T200儀器、藉由表面電漿子共振評估鼠類CEA抗體A5B7之人類化變異體之Fab片段對人類CEA的親和力。在CM5晶片上，人類CEA (hu N(A2-B2)A-avi-His B)在40 nM濃度下藉由標準胺偶合而在流動池2上固著30秒直至約100 RU。隨後注射鼠類CEA抗體A5B7之人類化變異體之Fab片段的3倍稀釋液(範圍為500-0.656 nM)作為分析物，接觸時間為120秒，解離時間為250或1000秒且流量為30 µl/min。人類CEA (hu N(A2-B2)A-avi-His B)層面下的再生係藉由10 mM甘胺酸/HCl pH2.0之2次脈衝歷時60秒來達成。資料以未固著之流動池1及零濃度之分析物作為雙重參照。將分析物的感測圖譜與簡單的1:1朗格繆爾相互作用模型擬合。人類CEA (A2域)之親和力常數[KD ]概述於下表14中。表 14 ： 代表鼠類 CEA 抗體 A5B7 之不同人類化變異體之 Fab 片段相對於人類 CEA ( A2 域 ) 的親和力常數 .
Tapir ID 名稱 對人類 N(A2-B2)A-avi-His B 的親和力 [M]
P1AE0289  CEA (A5B7) Fab (親本鼠類抗體) 5.59 E-10
P1AE4135  P1AE2164衍生的Fab 1.70 E-09
P1AE4136  P1AE2165衍生的Fab 1.25 E-09
P1AE4137  P1AE2166衍生的Fab 1.13 E-08
P1AE4138  P1AE2167衍生的Fab 1.47 E-09
P1AE4139  P1AE2176衍生的Fab 7.58 E-09
P1AE4140  P1AE2177衍生的Fab 7.62 E-09
P1AE4141  P1AE2179衍生的Fab 1.83 E-09
P1AE4142  P1AE2181衍生的Fab 2.64 E-09
P1AE4143  P1AE2182衍生的Fab 2.92 E-09
鼠類CEA抗體A5B7之人類化變異體之親和力比親本鼠類抗體之親和力低。選擇衍生自P1AE2167 (具有VH變異體3-23A5-1A之重鏈及具有VL變異體A5-L1D之Cκ輕鏈)之Fab片段P1AE4138作為最終人類化變異體。另外，將Kabat位置54 (G54A)處之甘胺酸向丙胺酸突變引入VH域中以移除去醯胺位點，從而產生VL變異體3-23A5-1E。最終人類化抗體(具有VH變異體3-23A5-1E之重鏈及具有VL變異體A5-L1D之Cκ輕鏈)已命名為A5H1EL1D或huA5B7。
10.2 A 5H1EL1D 衍生之親和力成熟抗 CEA 抗體的產生 10.2.1 噬菌體呈現操作用之抗原的製備、純化及表徵 鼠類抗體A5B7及其人類化衍生物A5H1EL1D分別以約0.8 nM及約2.5 nM之親和力結合至CEACAM5 (CEA)之A2域。為了藉由噬菌體呈現產生親和力成熟的A5H1EL1D變異體，產生3種不同重組可溶性抗原。每種蛋白質含有用於定點生物素化的C端avi標籤及用於純化的his標籤：第一蛋白質由CEACAM1之細胞外部分組成，該細胞外部分由4個Ig樣域N、A1、B、A2組成(NABA-avi-His，SEQ ID NO：238，表15)。第二蛋白質為由2個CEACAM5及2個CEACAM1 Ig域組成之嵌合蛋白。基於CEACAM1之四個域的序列，編碼CEACAM1之第二域及第三域(A1及B域)的DNA用編碼CEACAM5 (N(A2B2)A-avi-His，SEQ ID NO：239，表15)之A2及B2域的DNA置換。第三蛋白質為由1個CEACAM5及3個CEACAM1 Ig域組成之嵌合蛋白。基於CEACAM1之四個域的序列，編碼CEACAM1之第三域(B域)的DNA用編碼CEACAM5 (NA(B2)A-avi-His，SEQ ID NO：240，表15)之B2域的DNA置換。三種構築體的示意性描述展示於圖 19A 、圖 19B 及圖 19C 中。表 15 ： 所用 CEA 抗原之胺基酸序列
抗原 序列 SEQ ID NO
NABA-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGT QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQF HVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAMAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPR LQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDTPTI SPSDTYYRPGANLSLSCYAASNPPAQYSWLINGTFQQSTQELFIPNITVNNS GSYTCHANNSVTGCNRTTVKTIIVTELSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNL TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEV FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDLEVLFQGPGSGLNDIFEAQKIE WHEARAHHHHHH 238
N(A2B2)A-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGT QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQF HVYPELPKPFITSNNSNPVEDEDAVALTCEPEIQNTTYLWWVNNQSLPVSPR LQLSNDNRTLTLLSVTRNDVGPYECGIQNKLSVDHSDPVILNVLYGPDDPTI SPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNS GLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSALSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNL TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEV FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHH HHHH 239
NA(B2)A-avi-His QLTTESMPFNVAEGKEVLLLVHNLPQQLFGYSWYKGERVDGNRQIVGYAIGT QQATPGPANSGRETIYPNASLLIQNVTQNDTGFYTLQVIKSDLVNEEATGQF HVYPELPKPSISSNNSNPVEDKDAMAFTCEPETQDTTYLWWINNQSLPVSPR LQLSNGNRTLTLLSVTRNDTGPYECEIQNPVSANRSDPVTLNVTYGPDDPTI SPSYTYYRPGVNLSLSCHAASNPPAQYSWLIDGNIQQHTQELFISNITEKNS GLYTCQANNSASGHSRTTVKTITVSALSPVVAKPQIKASKTTVTGDKDSVNL TCSTNDTGISIRWFFKNQSLPSSERMKLSQGNITLSINPVKREDAGTYWCEV FNPISKNQSDPIMLNVNYNALPQENLINVDGSGLNDIFEAQKIEWHEARAHH HHHH    240
將各別質體短暫轉染至HEK 293細胞中，從而穩定地表現EBV衍生之蛋白質EBNA (HEK EBNA)。同時共轉染的編碼生物素連接酶BirA之質體允許avi標籤在活體內發生特異性生物素化。使用固著式金屬親和層析(IMAC)，隨後藉由凝膠過濾，自經過濾的細胞培養上清液純化蛋白質(稱為標準方案)。匯集單體蛋白質溶離份，濃縮(必要時)，冷凍且在-80℃儲存。提供一部分樣品用於隨後的蛋白質分析及分析型表徵，例如藉由SDS-PAGE、尺寸排阻層析(SEC)或質譜學進行。
10.2.2 選擇 A5H1EL1D 衍生之親和力成熟抗體 抗體A5B7的人類化使得針對CEA的親和力減少約3至4倍，如SPR所量測。儘管對A5B7之親和力為約0.8 nM，但對A5H1EL1D量測到約2.5 nM之親和力。使用具有不同CEA表現量的細胞株進行的FACS實驗證實此研究結果。為了改良人類化純系A5H1EL1D之親和力，製備3種不同親和力成熟文庫且用於選擇親和力改良的純系(藉由噬菌體呈現)。
10 . 2 . 2 . 1 產生 A5H1EL1D 親和力成熟文庫 使用標準方案(Silacci等人, 2005)，藉由噬菌體呈現來產生A5H1EL1D衍生之親和力成熟抗體。在第一步驟中，將編碼人類化親本純系A5H1EL1D (胺基酸序列SEQ ID No：186及187)之VH及VL的DNA序列選殖至噬菌粒中，該噬菌粒接著用作隨機化之模板。在下一步驟中，產生三個文庫以便藉由噬菌體呈現來選擇有利純系。使成熟文庫1及2在重鏈之CDR1及CDR2中或輕鏈之CDR1及CDR2中發生隨機化。使第三成熟文庫在重鏈與輕鏈之CDR3區中發生隨機化。各別CDR區中的隨機化位置展示於圖 20A 及圖 20B 中。為了產生成熟文庫1 (在重鏈之CDR1及2中隨機化)，兩個片段藉由「重疊延伸拼接」(SOE) PCR組裝且選殖入噬菌體載體中(圖 21A )。使用以下引子組合產生文庫片段：片段1 (LMB3 (SEQ ID NO：243，表16)及A5H1EL1D_H1_rev_TN (SEQ ID NO：241，表16)及片段2 (A5H1EL1D_H2_for_TN (SEQ ID NO：242，表7)及HCDR3-rev-恆定區(SEQ ID NO：244，表16)。表 16 ： A5H1EL1D 親和力成熟文庫 H1 / H2 用的引子
名稱 序列 SEQ ID NO:
A5H1EL1D _H1_rev_TN CAG CCA CTC GAG GCC TTT ACC CGG TGC TTG GCG TAC CCA X17 CAT X16 X15 X14 X13 GAA X12 GAA GCC AGA AGC CGC GCA GCT GAG ACG    X12：60% T；5% A/S/G/Y/N/D/E/Q X13：50% T；20% S；4.3% A/G/Y/N/D/E/Q X14：50% D；20% S；4.3% G/Y/T/N/A/E/Q X15：60% Y；4% G/V/H/S/E/Q/N/D/R/F X16：50% Y；20% A；3.75% G/V/T/H/L/I/R/F X17：50% N；20% S；3% D/E/Q/G/Y/V/T/H/A/L 241
TN之A5H1EL1D _H2 CGC CAA GCA CCG GGT AAA GGC CTC GAG TGG CTG GGT X18 ATC X19 X20 X21 X22 X23 GCG TAC ACC ACG GAA TAC TCC GCC TCC    X18：60% F；10% A；6 % Y/V/L/I/G X19：50% G；20% S；3% A/K/T/V/N/D/E/Q/L/I X20：50% N；20% G；3.75 % D/E/Q/S/Y/T/H/A X21：60% K；5% A/T/Y/N/D/E/Q/R X22：60% A；4% V/G/D/P/H/N/E/Q/L/I X23：60% N；5% D/E/Q；4.17% G/T/H/S/A/R 242
長LMB3 CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT AC 243
HCDR3-rev-恆定區 AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC GAA ATA GAA GCG CAG ACC AC 244
為了產生成熟文庫2 (在輕鏈之CDR1及2中隨機化)，藉由「重疊延伸拼接」(SOE) PCR組裝兩個片段且選殖入噬菌體載體中(圖 21B )。使用以下引子組合產生文庫片段：片段1 (LMB3 (SEQ ID NO：243，表17)及A5H1EL1D_L1_rev_TN (SEQ ID NO：245，表17)及片段2 (A5H1EL1D_L2_for_TN (SEQ ID NO：246，表17)及HCDR3-rev-恆定區(SEQ ID NO：244，表17)。表 17 ： A5H1EL1D 親和力成熟文庫 L1 / L2 用的引子
名稱 序列 SEQ ID NO:
A5H1EL1D _L1_rev_TN GGA ACG CGG GGC CTG GCC TGG TTT TTG CTG ATA CCA X06 X05 X04 X03 X02 X01 GCT GGA TGC GCG GCA AGA CAG GGT AGC ACG    X01：50% S；20% V；3.33% T/A/G/N/D/E/Q/Y/H X02：50% V；20% S；3.33% T/A/G/N/Q/F/Y/P/H X03：50% T；20% S；2.72% A/G/Y/V/P/H/N/D/E/Q/R X04：60% Y；4% F/G/A/V/T/H/S/N/Q/R X05：70% I；30% L X06：50% H；20% A；3.33% R/K/G/S/T/Q/Y/N/V 245
TN之A5H1EL1D _L2 CAG CAA AAA CCA GGC CAG GCC CCG CGT TCC TGG ATC X07 X08 X09 X10 X11 CTC GCT TCT GGT ATC CCG GCA CGT TTC TCC GGC    X07：60% Y；10% F；7.5% H/K/N/S X08：50% A；20% D；3.33% V/G/S/T/Y/H/N/E/Q X09：50% T；20% A；3.33% S/G/V/P/H/N/D/E/Q X10：60% S；4% T/A/G/N/D/E/Q/Y/V/H X11：60% N；4% D/E/Q/Y/K/T/H/S/A/R 246
長LMB3 CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT AC 243
HCDR3-rev-恆定區 AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC GAA ATA GAA GCG CAG ACC AC 244
為了產生成熟文庫3 (在輕鏈及重鏈之CDR3中隨機化)，藉由「重疊延伸拼接」(SOE) PCR組裝兩個片段且選殖入噬菌體載體中(圖 21C )。使用以下引子組合來產生文庫片段：片段1 (LMB3 (SEQ ID NO：243，表18)及LCDR3-rev-恆定區(SEQ ID NO：249，表18)及片段2 (A5H1EL1D_L3_for_TN (SEQ ID NO：247，表18)及A5H1EL1D_H3_rev_TN (SEQ ID NO：248，表18)。表 18 ： A5H1EL1D 親和力成熟文庫 L3 / H3 用的引子
名稱 序列 SEQ ID NO:
TN之A5H1EL1D _L3_ GAG CCT GAA GAT TTT GCC GTA TAC TAT TGT X24 X25 X26 X27 X28 X29 X30 X31 ACT TTC GGT CAG GGC ACC AAG CTG GAA ATC    X24：90% Q；10% H X25：60% H；5% R/K/Q/E/Y/F/N/D X26：65% W；7% F/Y/V/L/I X27：58% S；4% T/A/G/N/D/E/Q；2% Y/V/P/H/L/I/R X28：58% S；4% T/A/G/N/D/E/Q；2% Y/V/P/H/L/I/R X29：60% K；5% R/H；2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I X30：70% P；5% A/S/T/R/S/L X31：60% P；5% L/G/R/M；2.86% A/V/L/I/F/S/R 247
A5H1EL1D _H3_rev_TN AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC X40 X39 X38 X37 X36 X35 X34 X33 X32 AGT ACA GTA GTA GGT GGC GGT GTC TTC TGC    X32：60% R；10% K；2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/H X33：60% D；5% N/E/Q；2.5% G/Y/V/T/H/S/A/L/I/R X34：60% R；5% K/H；2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I X35：60% G；5% A/S/T；2.5% Y/V/P/H/N/D/E/Q/L/I X36：60% L；4% I/V/A/F；2.4% G/Y/T/P/H/S/N/D/E/Q X37：60% R；5% K/H；2.72% A/V/T/P/Y/N/D/E/Q/L/I X38：65% F；5% Y/W/A/V/L/I/G X39：60% Y；5% F/W；2.14% G/A/V/T/P/H/S/N/D/E/Q/L/I/R X40：80% F；10% I/L 248
LCDR3-rev-恆定區 ACA ATA GTA TAC GGC AAA ATC TTC AGG CTC 249
長LMB3 CAG GAA ACA GCT ATG ACC ATG ATT AC 243
HCDR3擴增 AGA AAC GGT CAC CGT GGT ACC CTG GCC CCA GTA GTC 250
為了組裝各文庫之片段，使用等莫耳量之各片段且用各別外部引子擴增。為了組裝第三文庫(在HCDR3及LCDR3中隨機化)之片段，將引子LMB3 (SEQ ID NO：243，表18)與引子「HCDR3擴增」(SEQ ID NO：250，表18)組合使用。此引子依次序使用，以用含有KpnI位點的序列延伸VH之C端。在所有文庫之足量的全長隨機化片段組裝之後，將其與經相同處理之受體噬菌粒載體一起用NcoI/KpnI消化。用20 μg噬菌粒載體接合3倍莫耳過量的文庫插入片斷。使用經純化之接合物進行20次轉型，從而產生約0.7×109 至2×109 個轉型體。拯救呈現A5H1EL1D親和力成熟文庫之噬菌粒粒子且藉由PEG/NaCl純化來純化以用於選擇。
10 . 2 . 2 . 2 選擇 A5H1EL1D 衍生之親和力成熟純系 為了選擇親和力成熟純系，使用重組可溶性抗原對所有3個文庫進行噬菌體呈現選擇。根據以下模式，在溶液中進行多輪淘選：1.藉由與200 nM生物素化NA(B2)A-avi-His及NABA-avi-his一起培育0.5小時來預清除非特異性噬菌粒粒子；2.藉由添加5.4×107 個經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁珠捕捉生物素化NA(B2)A-avi-His、NABA-avi-his及所結合之噬菌粒粒子10分鐘；3.自上清液分離未結合的噬菌粒粒子用於進一步選擇；4.噬菌粒粒子結合至20 nM生物素化N(A2B2)A-avi-His 0.5小時，總體積為1 ml；5.藉由添加5.4×107 個經抗生蛋白鏈菌素塗佈的磁珠捕捉生物素化N(A2B2)A-avi-His蛋白質及尤其是所結合之噬菌體粒子10分鐘；6.使用5×1 ml PBS/Tween20及5×1 ml PBS洗滌珠粒；7.藉由添加1 ml 100 mM TEA溶離噬菌體粒子10分鐘且藉由添加500 μl 1 M Tris/HCl pH 7.4中和；8.感染指數培養的大腸桿菌TG1細菌；9.感染輔助噬菌體VCSM13；及10.隨後PEG/NaCl沈澱噬菌粒粒子用於後續多輪選擇。使用降低的抗原濃度(20×10- 9 M、10×10- 9 M及2×10- 9 M)進行3輪選擇。在第3輪中，用20×1 ml PBS/Tween20及5×1 ml PBS洗滌抗生蛋白鏈菌素珠粒。
藉由ELISA如下鑑別特異性結合子：在中性鏈親和素培養盤上塗佈每孔100 μl之10 nM生物素化N(A2B2)A-avi-His蛋白質或40 nM生物素化NA(B2)A-avi-His蛋白質。添加含有Fab之細菌上清液且使用抗Flag/HRP二級抗體經由其Flag標籤偵測結合Fab。藉由SPR進一步測試在ELISA中對重組N(A2B2)A-avi-His蛋白質呈陽性、但對NA(B2)A-avi-His蛋白質不呈陽性的純系。
10.2.2 .3 藉由 SPR 鑑別 A5H1EL1D 衍生之親和力成熟變異體 為了進一步表徵ELISA陽性純系，使用Proteon XPR36機器、藉由表面電漿子共振量測存活率且將結果與親本人類化純系A5H1EL1D進行比較。
在此實驗中，使用經抗生蛋白鏈菌素塗佈的NLC晶片，以豎直取向將約2000、1000及500 RU的生物素化N(A2B2)A-avi-His固著於3個通道上。作為非特異性結合之對照，將2000 RU生物素化NA(B2)A-avi-His蛋白質固著於通道4上。對經鑑別之ELISA陽性純系進行解離速率分析時，將注射方向改變為水平取向。在注射之前，過濾含有各種Fab之細菌上清液且用PBS稀釋3倍。結合時間在100微升/分鐘下為100秒且解離時間為600或1200秒。不具有Fab片段的細菌上清液用於參照。使用10 mM甘胺酸pH 1.5，以50 μl/min進行再生35秒(豎直取向)。
使用ProteOn Manager v3.1軟體，使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型，藉由同時擬合感測圖譜來計算解離速率常數(koff)。鑑別且簡短列舉具有最慢解離速率常數之表現Fab之純系。在額外的SPR實驗中，在相同條件下再評估簡短列舉的純系。此次，在每次注射期間，將4種親和力成熟純系與親本純系A5H1EL1D直接並行比較。不具有Fab片段的細菌上清液用於參照。選擇對N(A2B2)A-avi-His展示的解離速率比A5H1EL1D慢且不結合至NA(B2)A-avi-His的純系且對相應噬菌粒的可變域測序。最佳純系的實測解離速率展示於表 19 中且各別可變域的序列列舉於表 20 中。表 19 ：在細菌上清液之篩選分析中獲得之所選純系的解離常數
純系 解離常數kd (1/s)
A5H1EL1D 3.10E-04
P006.038 7.41E-05
P005.097 8.87E-05
P005.103 5.37E-05
P002.139 6.47E-05
P001.177 9.81E-05
P005.102 4.24E-05
表 20 ：親本純系 A5H1EL1D 的 胺基酸序列及所選親和力成熟純系
純系 鏈 SEQ ID NO 序列
A5H1EL1D VL 187 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
VH 186 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
P006.038 VL 195 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
VH 194 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
P005.097 VL 197 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSQPPTFGQGTKLEIK
VH 196 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFSFDYWGQGTTVTVSS
P005.103 VL 199 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
VH 198 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFYFDYWGQGTTVTVSS
P002.139 VL 201 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
VH 200 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
P001.177 VL 203 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIK
VH 202 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSS
P005.102 VL 205 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
VH 204 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
P005.102- combo1 VL 207 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
VH 206 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
P005.102- combo2 VL 209 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIK
VH 208 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSS
P005.103- combo1 VL 211 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
VH 210 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS
P005.103- combo2 VL 213 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIK
VH 212 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSS
P006.038- combo1 VL 215 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
VH 214 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
P006.038- combo2    VL 217 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIK
VH 216 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYEMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSS
10 . 2 . 2 . 4 親和力成熟 A5H1EL1D 純系之 Fab 純化 為了進一步表徵親和力成熟純系，純化各別Fab片段以便對動力學參數進行確切分析。對於各純系而言，用含有相應噬菌粒之細菌接種500 ml培養物且用1 mM IPTG誘導，在600 nm下量測的光學密度(OD600)為0.9。隨後，在25℃下培育培養物隔夜且藉由離心收集。使再懸浮之離心塊在25 ml PPB緩衝液(30 mM Tris-HCl pH8、1 mM EDTA、20%蔗糖)中培育20分鐘之後，再次使細菌離心且收集上清液。使用25 ml之5 mM MgSO4溶液重複此培育步驟一次。將兩個培育步驟的上清液匯集，過濾且負載於IMAC管柱(His gravitrap, GE Healthcare)。隨後，用40 ml洗滌緩衝液(500 mM NaCl、20 mM咪唑、20 mM NaH2 PO4 pH 7.4)洗滌管柱。溶離(500 mM NaCl、500 mM咪唑、20 mM NaH2 PO4 pH 7.4)之後，使用PD10管柱(GE Healthcare)將溶離液再緩衝。經純化之蛋白質的產量在300至500 μg/l範圍內。
10 . 2 . 2 . 5 經純化之親和力成熟 A5H1EL1DFab 片段的 SPR 分析 使用Proteon XPR36機器，使用如前所述的相同配置，藉由表面電漿子共振量測經純化之Fab片段的親和力(KD)。
使約2000、1000、500及250 RU生物素化N(A2B2)A-avi-His以豎直取向固著於經抗生蛋白鏈菌素塗佈之NLC晶片的4個通道上。作為非特異性結合之對照，將2000 RU生物素化NA(B2)A-avi-His蛋白質固著於通道5上。為了測定純化純系之親和力(KD)，將注射方向改變為水平取向。沿著各別通道1-5，以100 μl/min同時注射經純化之Fab片段的一系列兩倍稀釋液(100 nM與3 nM之間範圍內的不同濃度)，結合時間為100秒，且解離時間為1200秒。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「管線內」空白用於參照。使用10 mM甘胺酸pH 1.5，以50 μl/min進行再生35秒(豎直取向)。
使用簡單的一比一朗繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算結合速率常數(kon)及解離速率常數(koff)。平衡解離常數(KD)係以比率koff/kon計算。動力學及熱力學資料列舉於表21中。表 21 ： 藉由 SPR 測定經純化之 Fab 片段的動力學及熱力學參數
純系 ID k on (1/Ms) k off (1/s) KD (nM)
A5H1EL1D 1.08E+5 2.48E-4 2.3
P006.038 2.25E+5 5.78E-5 0.25
P005.097 0.94E+5 8.54E-5 0.91
P005.103 1.00E+5 4.99E-5 0.5
P002.139 1.05E+5 6.53E-5 0.63
P001.177 2.67E+5 7.85E-4 0.29
P005.102 1.34E+5 3.92E-4 0.29
10 . 2 . 2 . 6 親和力成熟純系之 CDR 位置組合 將先前鑑別之若干親和力成熟結合子的CDR位置彼此組合，以試圖進一步增強對CEA的親和力。此不僅包括CDR內之特定位置，而且包括來自不同結合子之CDR之組合。所有純系(噬菌體呈現衍生之純系及組合純系)之比對展示於圖 22A 及圖 22B 中。所有重鏈及輕鏈之CDR分別列於表22及表23中。VH及VL域概述於表20中。表 22 ：親和力成熟重鏈之 CDR 序列
純系 SEQ ID NO CDR-H1 SEQ ID NO CDR-H2 SEQ ID NO CDR-H3
A5H1EL1D 180 GFTFTDYYMN 181 FIGNKANAYTTEYSASVKG 182 DRGLRFYFDY
P006.038 251 GFTFTDYYMN 252 FIGNKANAYTTEYSASVKG 253 DRG I RF G FDY
P005.097 257 GFTFTDYYMN 258 FIGNKANAYTTEYSASVKG 259 DRGLRF S FDY
P005.103 263 GFTFTDYYMN 264 FIGNKANAYTTEYSASVKG 265 DRG I RFYFDY
P002.139 269 GF Y FTDY A MN 270 V I S NKANAYTTEYSASVKG 271 DRGLRFYFDY
P001.177 275 GF Y FTDYYMN 276 FI S NKANAYTTEYSASVKG 277 DRGLRFYFDY
P005.102 281 GFTFTDYYMN 282 FIGNKANAYTTEYSASVKG 283 DRG I RF Q FDY
P005.102- combo1 287 GF Y FTDYYMN 288 V I S NKANAYTTEYSASVKG 289 DRG I RF Q FDY
P005.102- combo2 293 GF Y F S DYYMN 294 V I S NKANAYTTEYSASVKG 295 DRG I RF Q FDY
P005.103- combo1 299 GFTFTDYYMN 300 FIGNKANAYTTEYSASVKG 301 DRG I RF S FDY
P005.103- combo2 305 GF Y FTDYYMN 306 V I S NKANAYTTEYSASVKG 307 DRG I RF S FDY
P006.038- combo1 311 GF Y FTDY A MN 312 V I S NKANAYTTEYSASVKG 313 DRG I RF G FDY
P006.038- combo2 317 GFTF S DY E MN 318 FI S NKANAYTTEYSASVKG 319 DRG I RF G FDY
表 23 ：親和力成熟輕鏈之 CDR 序列
純系 SEQ ID NO CDR-L1 SEQ ID NO CDR-L2 SEQ ID NO CDR-L3
A5H1EL1D 183 RASSSVTYIH 184 ATSNLAS 185 QHWSSKPPT
P006.038 254 RASSSVTYIH 255 ATSNLAS 256 QHWSS V PPT
P005.097 260 RASSSVTYIH 261 ATSNLAS 262 QHWSS Q PPT
P005.103 266 RASSSVTYIH 267 ATSNLAS 268 QHWSS IS PT
P002.139 272 H ASSSVTYIH 273 ATSNLAS 274 QHWSSKPPT
P001.177 278 RASSSVTYIH 279 ATSNLAS 280 QHWSSKPPT
P005.102 284 RASSSVTYIH 285 ATSNLAS 286 QHWSSK S PT
P005.102-combo1 290 RASSSVTYIH 291 ATSNLAS 292 QHWSSK S PT
P005.102-combo2 296 RASSSVTYIH 297 ATSNLAS 298 QHWSSK S PT
P005.103-combo1 302 RASSSVTYIH 303 ATSNLAS 304 QHWSS IS PT
P005.103-combo2 308 RASSSVTYIH 309 ATSNLAS 310 QHWSS IS PT
P006.038-combo1 314 RASSSVTYIH 315 ATSNLAS 316 QHWSS V PPT
P006.038-combo2 320 RASSSVTYIH 321 ATSNLAS 322 QHWSS V PPT
10.3 親和力成熟 A5H1EL1D 衍生之雙特異性抗體的產生及表徵 10.3.1 雙特異性抗體的選殖、產生及純化 合成所有純系之可變域且基於臼包杵突變及互換單抗技術與PG-LALA突變之組合而選殖於編碼雙特異性1+1 IgG分子的質體中。第二結合部分特異性針對CD28。最終分子之示意性描述繪製於圖 1J 中。所得分子係由表24中所列之序列構成：表現親和力成熟結合子(SEQ ID NO：323-348)之VL及VH序列之所有鏈組合與特異性針對CD28之兩個鏈(SEQ ID NO：349及350)組合。
所得構築體係利用習知(基於非PCR)選殖技術且使用適於懸浮的CHO K1細胞(最初自ATCC接收且適於在Evitria的懸浮培養液中無血清生長)，由Evitria使用其專有載體系統製備。為了產生，Evitria使用其專有的無動物組分及無血清培養基(eviGrow及eviMake2)及其專有的轉染劑(eviFect)。參考標準方案，自經過濾之細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，藉由使用蛋白質A的親和層析自細胞培養上清液純化含有Fc之蛋白質。在pH 3.0達成溶離，隨即中和樣品。濃縮蛋白質，且在20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉pH 6.0中藉由尺寸排阻層析將聚集的蛋白質與單體蛋白質分離。表 24 ： 所選親和力成熟抗 CEA 純系之雙特異性 P326G LALA 人類 IgG1 形式的胺基酸序列
純系 鏈 SEQ ID NO 多肽序列
A5H1EL1D VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 323 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 324 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
   P006.038 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 325 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 326 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P005.097 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 327 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSQPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 328 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFSFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P005.103 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 329 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 330 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P002.139 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 331 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCHASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 332 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P001.177 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 333 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 334 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGLRFYFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P005.102 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 335 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 336 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P005.102- combo1 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 337 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 338 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P005.102- combo2 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 339 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSKSPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 340 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFSDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFQFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P005.103- combo1 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 341 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 342 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGFIGNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P005.103- combo2 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 343 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSISPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 344 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYYMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFSFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P006.038- combo1 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 345 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 346 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFYFTDYAMNWVRQAPGKGLEWLGVISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
P006.038- combo2 VL-CH1-IgG1 Fc-(臼，PG-LALA) 347 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASSSVTYIHWYQQKPGQAPRSWIYATSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHWSSVPPTFGQGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VH-Ck 348 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYEMNWVRQAPGKGLEWLGFISNKANAYTTEYSASVKGRFTISRDKSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCTRDRGIRFGFDYWGQGTTVTVSSASVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
CD28 (SA_ Variant 15) VH-CH1-IgG1 Fc (臼，PG-LALA) 349 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVQTNYNEKFKDRATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYFCTRSHYGLDWNFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVEDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDEKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
VL-Ck 350 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCHASQNIYVFLNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGQTYPYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDRKLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
10.3.2 藉由 SPR 對 所選抗體進行親和力測定 在25℃下，使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，藉由SPR量測親本抗體A5H1EL1D以及其親和力成熟衍生物的親和力(KD )。
使約2000、1000、500及250 RU生物素化N(A2B2)A-avi-His以豎直取向固著於經抗生蛋白鏈菌素塗佈之NLC晶片的4個通道上。作為非特異性結合之對照，將2000 RU生物素化NA(B2)A-avi-His蛋白質固著於通道5上。為了測定經純化之雙特異性構築體之親和力(KD )，將注射方向改變為水平取向。沿著各別通道1-5，以100 μl/min同時注射經純化之雙特異性IgG的一系列兩倍稀釋液(25 nM與1.56 nM之間範圍內的不同濃度)，結合時間為180秒，且解離時間為1200秒。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「管線內」空白用於參照。使用10 mM甘胺酸pH 1.5，以50 μl/min進行再生20秒(豎直取向)。
使用簡單的一比一朗繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算結合速率常數(kon)及解離速率常數(koff)。平衡解離常數(KD )係以比率koff/kon計算。所有動力學及熱力學資料列於表25中。藉由噬菌體呈現選擇所鑑別的親和力成熟純系觀測到較高親和力(較低KD 值)。另外，對與交換之CDR及CDR位置的組合進行測試。雖然一些組合(例如純系「P005.103-combo2」及「P005.102-combo1」)使得解離速率非常緩慢且因此使得親和力非常高，但是2種組合純系(純系「P006.038-combo1」及「P006.038-combo2」)的親和力顯著減少。表 25 ： 藉由 SPR 測定經純化之雙特異性 CEA - CD28 構築體的動力學及熱力學參數
純系 ID k on (1/Ms) k off (1/s) KD (nM)
A5H1EL1D 1.58E+5 3.33E-4 2.11
P006.038 2.67E+5 5.87E-5 0.22
P005.097 2.69E+5 8.87E-5 0.33
P005.103 2.57E+5 1.12E-4 0.44
P002.139 2.49E+5 9.70E-5 0.39
P001.177 2.05E+5 8.83E-5 0.43
P005.102 1.60E+5 3.31E-5 0.20
P005.102-combo1 2.07E+5 1.23E-5 0.06
P005.102-combo2 2.25E+5 1.85E-5 0.08
P005.103-combo1 1.26E+5 3.42E-5 0.27
P005.103-combo2 1.23E+5 1.05E-5 0.09
P006.038-combo1 1.78E+5 7.99E-5 4.48
P006.038-combo2 1.91E+5 6.98E-4 3.66
實例 11 產生及製備靶向 CD28 及癌胚抗原 ( CEA ) 的其他 雙特異性抗原結合分子 11.1 雙特異性抗原結合分子的選殖 為了產生表現質體，使用各別可變域之序列且與預插入各別接受者哺乳動物表現載體中的各別恆定區同框次選殖。所得分子之示意性描述展示於圖 23 中。在Fc域中，Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變(PG-LALA)已根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831號中所述之方法引入人類IgG1重鏈恆定區中以消除對Fcγ受體的結合。為了產生雙特異性抗體，Fc片段含有「杵」突變(S354C/T366W突變，根據Kabat EU索引編號)或「臼」突變(Y349C/T366S/L368A/Y407V突變，根據Kabat EU索引)以避免重鏈錯配。為了避免雙特異性抗原結合分子中之輕鏈錯配，將VH/VL或CH1/Cκ域之交換引入一個結合部分(互換Fab技術)。在另一結合部分中，如國際專利申請公開案第WO 2015/150447號中所述將電荷引入CH1及Cκ域中。抗CEA純系T84.66之產生及製備描述於WO 2016/075278 A2中。
選殖以下分子，其示意性說明展示於圖 23A 至圖 23D 中：分子 11A ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA) 1+1形式，CD28(SA) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA(A5H1EL1D) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：351、352、353及354 (P1AE4773)。分子 11B ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8) 1+1形式，CD28 (SA_變異體8) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (A5H1EL1D) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：351、352、355及356 (P1AE4774)。分子 11C ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (A5H1EL1D) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：351、352、357及358 (P1AE4775)。分子 11D ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體29) 1+1形式，CD28 (SA_變異體29) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (A5H1EL1D) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：351、352、359及354 (P1AE4776)。分子 11E ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA) 1+1形式，CD28 (SA) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且CEA (A5H1EL1D) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：360、361、362及363 (P1AE4777)。分子 11F ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8) 1+1形式，CD28 (SA_變異體8) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且CEA (A5H1EL1D) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：360、361、364及365 (P1AE4780)。分子 11G ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且CEA (A5H1EL1D) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：360、361、366及367 (P1AE4791)。分子 11H ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體29) 1+1形式，CD28 (SA_變異體29) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且CEA (A5H1EL1D) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：360、361、368及363 (P1AE4793)。分子 11I ：CEA (T84.66)-CD28 (SA) 1+1形式，CD28(SA) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA(T84.66) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：369、370、353及354 (P1AE6488)。分子 11J ：CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體29) 1+1形式，CD28 (SA_變異體29) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (T.84.66) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：369、370、359及354 (P1AE6495)。分子 11K ：CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (T84.66) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：369、370、357及358 (P1AE6557)。分子 11L ：CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體8) 1+1形式，CD28 (SA_變異體8) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (T84.66) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：369、370、355及356 (P1AE6556)。分子 11M ：CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體29) 1+1形式，CD28 (SA_變異體29) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且CEA (T84.66) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：371、372、368及363 (P1AE9605)。分子 11N ：CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體8) 1+1形式，CD28 (SA_變異體8) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且CEA (T84.66) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：371、372、366及367 (P1AE9606)。分子 11O ：CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且CEA (T84.66) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：371、372、364及365 (P1AE9607)。分子 11P ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA-變異體29) 2+1，雙特異性單價抗CD28 (SA_變異體29)及二價抗CEA huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，頭對尾彼此融合之兩個抗CEA Fab片段(臼)中均具有帶電修飾，抗CD28互換Fab片段(杵)中具有VH/VL交換(圖 23C )。該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO：368、362、361及373 (P1AE6924)。分子 11Q ：CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體29) 2+1，雙特異性單價抗CD28 (SA)及二價抗CEA huIgG1 PG-LALA互換Fab構築體，「經典取向」，抗CD28互換Fab片段中具有VH/VL交換，兩個抗CEA Fab片段中均具有帶電修飾(圖 23D )。該分子包含胺基酸序列SEQ ID NO：368、374、361及360 (P1AE6925)。分子 11R ：CEA (P002.139)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (P002.139) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：375、376、357及358 (P1AE8371)。分子 11S ：CEA (P002.139)-CD28 (SA_變異體8) 1+1形式，CD28 (SA_變異體8) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (P002.139) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：375、376、355及356 (P1AF1115)。分子 11T ：CEA (P002.139)-CD28 (SA_變異體11) 1+1形式，CD28 (SA_變異體11) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且CEA (P002.139) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 23A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：375、376、355及354 (P1AF1116)。
為了比較，製得以下抗CD28抗體變異體：分子 11U ：CD28 (SA_變異體8) (PG-LALA)，CD28 (SA_變異體8)抗體的huIgG1 PG-LALA同型( 圖 1B ) 包含胺基酸序列SEQ ID NO：377及SEQ ID NO：378 (P1AE7035)。分子 11V ：CD28 (SA_變異體11) (PG-LALA)，CD28 (SA_變異體11)抗體的huIgG1 PG-LALA同型( 圖 1B ) 包含胺基酸序列SEQ ID NO：379及SEQ ID NO：380 (P1AE7036)。分子 11W ：CD28 (SA_Variant 15) (PG-LALA)，CD28 (SA_變異體15)抗體的huIgG1 PG-LALA同型( 圖 1B ) 包含胺基酸序列SEQ ID NO：381及SEQ ID NO：382 (P1AE7037)。分子 11X ：CD28 (SA_變異體27) (PG-LALA)，CD28 (SA_變異體27)抗體的huIgG1 PG-LALA同型( 圖 1B ) 包含胺基酸序列SEQ ID NO：383及SEQ ID NO：384 (P1AE7038)。分子 11Y ：CD28 (SA_變異體29) (PG-LALA)，CD28 (SA_變異體29)抗體的huIgG1 PG-LALA同型( 圖 1B ) 包含胺基酸序列SEQ ID NO：385及SEQ ID NO：386 (P1AE7039)。
11.2 分子的產生 上述分子的表現係由嵌合MPSV啟動子或CMV啟動子驅動。聚腺苷酸化係由位於CDS之3'端的合成聚腺苷酸信號序列驅動。另外，各種載體含有用於常染色體複製的EBV OriP序列。
為了產生分子11A至11D及11I至11T，使用聚乙烯亞胺作為轉染劑，用各別表現載體共轉染生長於懸浮液中的HEK293-EBNA細胞。抗體及雙特異性抗體係藉由瞬時轉染HEK293 EBNA細胞產生。將細胞離心且培養基用預溫熱的CD CHO培養基置換。在CD CHO培養基中混合表現載體，添加PEI，渦旋溶液且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至搖瓶中，且在具有5% CO2 氛圍之培育箱中在37℃下培育3小時。培育之後，添加具有補充劑的Excell培養基(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, 編者：Weichang Zhou, Anne Kantardjieff)。轉染之後的第一天，添加補充劑(饋料)(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, 編者：Weichang Zhou, Anne Kantardjieff)。7天之後，藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集細胞上清液且藉由標準方法純化。
利用習知(基於非PCR)選殖技術且使用適於懸浮的CHO K1細胞(最初自ATCC接收且適於在Evitria的懸浮培養液中無血清生長)，由Evitria使用其專有載體系統產生且純化分子11U、11V、11W、11X及11Y。為了產生，Evitria使用其專有的無動物組分及無血清培養基(eviGrow及eviMake2)及其專有的轉染劑(eviFect)。藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集上清液且藉由標準方法純化。分子11E、11F、11G及11H係由Proteros根據其標準方法及方案產生且純化。
11.3 分子的純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，含有Fc之蛋白質藉由蛋白質A-親和層析法(平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鈉、20 mM磷酸鈉，pH 7.5；溶離緩衝液：20 mM檸檬酸鈉，pH 3.0)自細胞培養上清液純化。在pH 3.0達成溶離，隨即對樣品進行pH中和。藉由離心(Millipore Amicon® ULTRA-15 (技術編號：UFC903096))濃縮蛋白質，且在20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉(pH 6.0)中藉由尺寸排阻層析將聚集之蛋白質與單體蛋白質分離。
11.4 靶向 CD28 及癌胚抗原 ( CEA ) 之雙特異性抗原結合分子的分析資料 根據Pace等人, Protein Science, 1995, 4, 2411-1423，使用基於胺基酸序列所計算的質量消光係數，藉由在280 nm量測吸光值來測定經純化之蛋白質的濃度。在還原劑存在及不存在下，使用LabChipGXII (Perkin Elmer)、藉由CE-SDS分析蛋白質純度及分子量。聚集物含量測定係在25℃下、藉由使用分析型尺寸排阻管柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)的HPLC層析進行，該管柱在操作緩衝液(分別為25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽pH 6.7或200 mM KH2 PO4 、250 mM KCl pH 6.2)中平衡。所有分子之純化參數的概述明示於表 26 中。表 26 ： CD28 抗原結合分子 11A 至 11Y 之產生及純化概述
分子 描述 產量[mg/l] 分析型SEC (HMW/單體/LMW) [%] 藉由CE-SDS量測的純度[%]
11A CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA) 1+1 11.4 0 / 100 / 0 97.8
11B CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8) 1+1 11.3 0 / 100 / 0 98.2
11C CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15) 1+1 45.1 0 / 100 / 0 97.1
11D CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體29) 1+1 58.1 0 / 100 / 0 96.6
11E CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA，互換) 1+1 N/A 0.97 / 95.2 / 3.93 98.8
11F CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8，互換) 1+1 N/A 0.3 / 96.83 / 2.86 96.43
11G CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15，互換) 1+1 N/A 0.1 / 98.34 / 1.56 97.9
11H CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體29，互換) 1+1 N/A 1.07 / 96.03 / 2.9 95.79
11I CEA (T84.66) - CD28 (SA) 1+1    N/A   
11J CEA (T84.66) - CD28 (SA_變異體29) 1+1 25.2 3.33 / 96.14 / 0.53 97.8
11K CEA (T84.66) - CD28 (SA_變異體15) 1+1 3 5.19 / 93.06 / 1.75 96.32
11L CEA (T84.66) - CD28 (SA_變異體8) 1+1 7.8 5.12 / 95.5 / 1.84 95.5
11M CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體29，互換) 1+1    N/A   
11N CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體15，互換) 1+1    N/A   
11O CEA (T84.66)-CD28 (SA_變異體8，互換) 1+1    N/A   
11P CEA (A5H1EL1D，頭對尾) - CD28 (SA_變異體29) 2+1    N/A   
11Q CEA (A5H1EL1D) - CD28 (SA_變異體29) 2+1, 經典    N/A   
11R CEA(P002.139)-CD28 (SA_變異體15) 1+1 7.27 044 / 99.56 / 0 100
11S CEA(P002.139)-CD28 (SA_變異體8) 1+1 12 0.57 / 97.68 / 1.75 99.44
11T CEA(P002.139)-CD28 (SA_變異體11) 1+1 7.25 0.7 / 96.61 / 2.69 95.1
11U CD28 (SA_變異體8) IgG1 PG LALA N/A 0 / 98.43 / 1.57 80.2
11V CD28 (SA_變異體11) IgG1 PG LALA N/A 0 / 98.52 / 1.48 72.5
11W CD28 (SA_變異體15) IgG1 PG LALA N/A 1.49 / 97.44 / 1.07 82
11X CD28 (SA_變異體27) IgG1 PG LALA N/A 1.46 / 97.15 / 1.39 84.6
11Y CD28 (SA_變異體29) IgG1 PG LALA N/A 1.02 / 97.3 1.68 84.4
11.5 藉由 SPR 對靶向 CD28 及癌胚抗原 ( CEA ) 之雙特異性抗原結合分子進行的結合分析 使用Proteon XPR36機器，藉由表面電漿子共振，藉由SPR量測分子10A-10D之CD28的親和力(KD )，該等分子具有抗CEA抗體A5H1EL1D及抗CD28結合子變異體8、11及29以及原始結合子CD28(SA)。為了使重組抗原(配位體)固著，huCD28-Fc用PBST (10 mM磷酸鹽、150 mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20)稀釋至100 nM至500 nM範圍內的濃度，接著以不同接觸時間、以25微升/分鐘注射。由此在豎直取向上產生500至3000個反應單位(RU)的固著水準。
為了測定純化分子之親和力(KD )，將注射方向改變為水平取向。沿著各別通道1-5，以100 μl/min同時注射經純化之構築體的一系列兩倍稀釋液(100 nM與6.25 nM之間範圍內的不同濃度)，結合時間為150秒，且解離時間為400秒。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「管線內」空白用於參照。使用10 mM甘胺酸pH 1.5，以50 μl/min進行再生35秒(豎直取向)。使用簡單的一比一朗繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算結合速率常數(kon)及解離速率常數(koff)。平衡解離常數(KD)係以比率koff/kon計算。動力學及熱力學資料列舉於表 27 中。表 27 ： 雙特異性分子 11A 至 11D 中之抗 CD28 變異體的動力學及熱力學分析
雙特異性分子 kon  (1/(s*M) koff  (1/s) KD (nM)
CEA (A5H1EL1D)-CD28 (SA) 1+1 3.77E+5 2.94E-4 0.8
CEA (A5H1EL1D)-CD28 (CD28(SA_變異體8) 1+1 1.69E+5 9.80E-3 58
CEA (A5H1EL1D)-CD28 (CD28(SA_變異體15) 1+1 2.59E+5 2.64E-3 10
CEA (A5H1EL1D)- CD28 (CD28(SA_變異體29) 1+1 2.71E+5 3.24E-4 1.2
11.6 抗 CD28 IgG 變異體及所選 1 + 1 雙特異性靶向 CEA 抗 CD28 抗原結合分子的生物化學表徵 為了表徵及比較其生物化學及生物物理學特性，詳細地分析以下分子：靶向CEA的抗CD28雙特異性變異體分子10A-10D及抗CD28 IgG變異體分子10U-10Y。結果概述於表27及表28中。
疏水相互作用層析 ( HIC ) 藉由將20 µg樣品注射於經25 mM磷酸鈉、1.5 M硫酸銨pH 7.0平衡之HIC-Ether-5PW (Tosoh)管柱上來測定表觀疏水性。以0至100%緩衝液B (25 mM磷酸鈉，pH 7.0)之線性梯度在60分鐘內執行溶離。將滯留時間與具有已知疏水性的蛋白質標準物比較。大部分抗體顯示0與0.35之間的相對滯留時間。
熱穩定性 在20 mM組胺酸/組胺酸氯化物、140 mM NaCl (pH 6.0)中製備濃度為1 mg/mL之樣品，經由0.4 µm過濾盤、藉由離心轉移至光學384孔培養盤中且用石蠟油覆蓋。在DynaPro讀盤器(Wyatt)上藉由動態光散射來反覆地量測流體動力學半徑，同時以0.05℃/min之速率將樣品自25℃加熱至80℃。
FcRn 親和層析 FcRn如以下文獻中所述表現、純化且生物素化：Cymer, Schlothauer等人, Bioanalysis 2017, 9(17), doi.org/10.4155/bio-2017-0109。將製得的受體添加至抗生蛋白鏈菌素-瓊脂糖(GE Healthcare)中用於偶合。將所得FcRn-瓊脂糖基質裝填於管柱外殼中。使用0.5 ml/min流量的20 mM 2-(N-嗎啉)-乙烷磺酸(MES)、140 mM NaCl pH 5.5 (溶離劑A)使管柱平衡。30 µg抗體樣品用溶離劑A以1:1體積比稀釋且施加於FcRn管柱。管柱用5倍管柱體積的溶離劑A洗滌，隨後用35倍管柱體積的20至100% 20 mM Tris/HCl、140 mM NaCl pH 8.8 (溶離劑B)線性梯度進行溶離。用柱式烘箱在25℃下進行分析。藉由連續量測280 nm吸光度來監測溶離概況。將滯留時間與具有已知親和力的蛋白質標準物進行比較。大部分抗體顯示0與1之間的相對滯留時間。
肝素親和層析 藉由將30-50 µg樣品注射於經50 mM Tris pH 7.4平衡之TSKgel肝素-5PW (Tosoh)管柱上來測定肝素親和力。在37分鐘內利用0至100%緩衝液B (50 mM Tris、1 M NaCl，pH 7.4 mM)的線性梯度進行溶離。將滯留時間與具有已知親和力的蛋白質標準物進行比較。
所有測試序列變異體均符合所有準則且在測試之所有生物物理學及生物化學特性方面彼此無顯著差異(表28及29)。表 28 ： 所測試之抗 CD28 IgG 變異體 10U - 10Y 之生物物理學及生物化學特性
樣品 熱穩定性 ( ℃ ) 表觀疏水性 FcRn 親和力 肝素親和力
CD28 (SA_變異體8) IgG1 PG LALA 79 0.218 0.17 0.58
CD28 (SA_變異體11) IgG1 PG LALA 78 0.313 0.21 0.58
CD28 (SA_變異體15) IgG1 PG LALA 79 0.265 0.25 0.59
CD28 (SA_變異體27) IgG1 PG LALA 78 0.194 0.28 0.59
CD28 (SA_變異體29) IgG1 PG LALA 78 0.308 0.37 0.59
表 29 ： 所測試之雙特異性靶向 CEA 抗 CD28 變異體分子 11A - 11D 之生物物理學及生物化學特性
樣品 熱穩定性 ( ℃ ) 表觀疏水性 FcRn 親和力 肝素親和力
CEA  (A5H1EL1D) - CD28 (SA) 1+1 70 0.22 0.21 0.66
CEA  (A5H1EL1D) - CD28 (SA_變異體8) 1+1 67 0.17 0.08 0.66
CEA  (A5H1EL1D) - CD28 (SA_變異體15) 1+1 70 0.19 0.1 0.66
CEA  (A5H1EL1D) - CD28 (SA_變異體29) 1+1 70 0.22 0.17 0.67
實例 12 靶向 CD28 及癌胚抗原 ( CEA ) 之雙特異性抗原結合分子的活體外功能表徵 12.1 對表現 CEA 之 MV3 細胞上之 CEACAM5 的 結合 為了評估A5H1EL1D之親和力成熟是否改良對CEACAM5的結合，對經基因修飾以表現CEA的MV3細胞進行FACS結合分析。如圖 24 中所示，攜有親和力成熟抗CEA純系P002.139的CEA-CD28雙特異性抗體(分子11R，P1AE8371)對CEACAM5展示的結合(EC50 = 4.1 nM)優於A5H1EL1D純系(分子11C，P1AE4775)(EC50 = 20.4 nM)。
12.2 對 CEA - CD28 雙特異性抗體與靶向 CEA 之 TCB 之 組合的活體外功能進行分析的 IL - 2 報導體分析 IL-2報導體細胞(J1631，Promega)為基因工程改造的Jurkat T細胞，其表現藉由IL-2啟動子驅動的螢光素酶報導體。為了評估靶向CEA之CD28促效劑增強TCB介導T細胞效應功能的能力，將每孔10000個MKN45細胞與105 個IL-2報導體細胞(E:T比率10:1)一起在濃度固定的CEA-TCB (5 nM)及一定濃度範圍的CEA-CD28雙特異性抗體(14 pM-10 nM)存在下培育。在37℃、5% CO2 下培育6小時之後，使用OneGlo (E6120，Promega)，根據製造商說明書評估發光。經由Tecan Spark 10M讀盤器讀盤。
使用IL-2報導體細胞分析評估攜有親和力成熟抗CEA純系P002.139 (分子11R，P1AE8371)或純系A5H1EL1D (分子11C，P1AE4775)之CEA-CD28雙特異性抗體與CEA-TCB (5 nM)組合在表現CEA之MKN45細胞存在下的功能。如圖 25A 及圖 25B 所示，親和力成熟純系P002.139之改良的親和力轉變成共刺激能力的效能高於純系A5H1EL1D。
實例 13 靶向 CD28 及癌胚抗原 ( CEA ) 之雙特異性抗原結合分子與 CEA TCB 組合的活體內功能表徵 13.1 具有不同 CEA 抗原結合域與 CEA - TCB 組合之 CEA - CD28 雙特異性抗原結合分子在人類化小鼠中對 MKN45 異種移植物的功效研究 本文所述之功效研究旨在理解CEA-CD28雙特異性抗原結合分子與CEA-TCB之組合在完全人類化NSG小鼠中在腫瘤消退方面的CEA純系依賴性效能。
最初自ATCC獲得人類MKN45細胞(人類胃癌)且在擴增之後寄存於Glycart內部細胞庫中。在37℃下，在5% CO2 下，在水飽和氛圍中，在含有10% FCS之DMEM中培養細胞。在97%之存活率下，使用活體外繼代12進行皮下注射。使用22G至30G針將與50微升基質膠混合之50微升細胞懸浮液(1×106 個MKN45細胞)皮下注射於麻醉小鼠之側腹。
根據承諾的準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)，將在實驗開始時4-5週齡之雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)以12小時亮/12小時暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(ZH225-17)。送達之後，讓動物維持一週以使其適應新環境及用於觀測。定期地進行連續健康監測。
對雌性NSG小鼠腹膜內注射15 mg/kg白消安(busulfan)，一天後靜脈內注射1×105 個自臍帶血分離之人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第14-16週，對小鼠進行舌下抽血，且針對成功人類化，藉由流式細胞術分析血液。經有效移植之小鼠根據其人類T細胞頻率隨機分成不同處理組。此時，如所述(圖 26 ，d0)向小鼠皮下注射腫瘤細胞，且當腫瘤尺寸達到約150 mm3 (第13天)時，用化合物或組胺酸緩衝液(媒劑)處理。所有小鼠靜脈內注射200 µl適當溶液。為獲得每200 µl適當量之化合物，必需時用組胺酸緩衝液稀釋儲備溶液(表30)。表 30 ：活體內實驗使用的組合物
化合物 調配緩衝液 濃度 (mg/mL)
CEA-TCB 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 4.82 (= 儲備溶液)
CEA(T84.66)-CD28 (SA_變異體15) 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 1.71 (=儲備溶液)
CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15) 20mM組胺酸，， 140mM NaCl， pH6.0 3.89 (=儲備溶液)
對於CEA-CD28與CEA-TCB之組合療法而言(C組及D組，圖26)，同時注射雙特異性分子。使用測徑規每週量測腫瘤生長兩次，且如下計算腫瘤體積： Tv：(W2 /2) x L           (W：寬度，L：長度)
利用Roche內部統計學程式如下計算腫瘤生長抑制值作為活體內效能的量度：
研究在第39天終止。圖 27A 展示每組小鼠的腫瘤生長動力學(平均值，+SEM)以及個別腫瘤生長動力學(圖 27B 至圖 27E )。如此處所描述，作為單一藥劑之CEA-TCB誘導的腫瘤生長抑制極少。然而，兩種CEA-CD28分子的組合展示改善的腫瘤生長抑制。特定言之，含有對CEA之親和力較低之結合子的CEA-TCB與CEA-CD28組合(A5H1EL1D)產生優良的腫瘤生長消退。如表31中所顯示，CEA-TCB與CEA-CD28之組合組(huA5B7)計算出最高TGI值(TGI：116%)，表明最強抗腫瘤作用。TGI意謂腫瘤生長抑制，TGI＞100意謂平均腫瘤消退且TGI = 100定義為腫瘤停滯。表 31 ： 研究第 39 天之 TGI ( 媒劑作為對照組 )
群組 TGI
CEA TCB 69
CEA TCB + CEA(T84.66)-CD28 (SA_變異體15) 89
CEA TCB + CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15) 116
13.2 具有三個不同 CD28 抗原結合域與 CEACAM5 - TCB 及抗 PDL1 抗體之組合的 CEA - CD28 雙特異性抗原結合分子在人類化小鼠中對 BXPC3 異種移植物的功效研究 此功效研究旨在理解CEA-CD28分子之CD28抗原結合域與CEACAM5-TCB及抗PD-L1組合的親和力在完全人類化NSG小鼠中在腫瘤消退及免疫PD模式方面的影響。當前研究中已測試三種不同親和力變異體(變異體8＜變異體15＜變異體29)。
人類BXPC3細胞(人類胰臟癌細胞)最初獲自ECACC (歐洲細胞培養保藏中心(European Collection of Cell Culture))且在擴增後，寄存於Roche Glycart內部細胞庫中。在含有10% FCS (PAA Laboratories, Austria)與1% Glutamax之RPMI中培養BXPC3細胞。在37℃、5% CO2 下、在水飽和氛圍中培養細胞。在存活率＞95%的情況下，使用活體外繼代20進行皮下注射。使用22G至30G針將與50微升基質膠混合之50微升細胞懸浮液(1×106 個BXPC3細胞)皮下注射於麻醉小鼠之側腹。
根據承諾的準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)，將在實驗開始時4-5週齡之雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)以12小時亮/12小時暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(ZH225-17)。送達之後，讓動物維持一週以使其適應新環境及用於觀測。定期地進行連續健康監測。
對雌性NSG小鼠腹膜內注射15 mg/kg白消安(busulfan)，一天後靜脈內注射1×105 個自臍帶血分離之人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第14-16週，對小鼠進行舌下抽血，且針對成功人類化，藉由流式細胞術分析血液。經有效移植之小鼠根據其人類T細胞頻率隨機分成不同處理組A至F。此時，如圖 28 中所述向小鼠皮下注射腫瘤細胞，且當腫瘤尺寸達到約150 mm3 (第20天)時，用化合物或組胺酸緩衝液(媒劑)處理。所有小鼠靜脈內注射200 µl適當溶液。為獲得每200 µl適當量之化合物，必需時用組胺酸緩衝液稀釋儲備溶液(表32)。表 32 ：活體內實驗使用的組合物
化合物 調配緩衝液 濃度 (mg/mL)
CEACAM5-TCB 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 20.5 (= 儲備溶液)
抗PD-L1 (阿特珠單抗(Atezolizumab)) 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 60 (= 儲備溶液)
CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8) 20mM組胺酸，140mM NaCl， pH6.0 3.78 (= 儲備溶液)
CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15) 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 3.89 (= 儲備溶液)
CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體29) 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 5.01 (= 儲備溶液)
在終止(第52天)時，處死小鼠，移出腫瘤，稱重且經由用膠原蛋白酶V及去氧核糖核酸酶進行酶消化來製備單一細胞懸浮液以便隨後進行FACS分析。單一細胞針對人類CD45、CD3、CD8及CD4加以染色且在FACS BDFortessa進行分析。
圖 29 展示所有處理組的腫瘤生長動力學(平均值，+SEM)，各處理組的相應TGI值展示於下表33中。如在此所述，CEACAM5 TCB單一療法以及與a-PD-L1的組合誘導的腫瘤生長抑制極少。僅CEA-CD28 (SA_變異體8)添加至CEACAM5-TCB與a-PD-L1之組合中引起腫瘤生長抑制增強(TGI：75%)。變異體15與變異體29皆不能增強抗腫瘤作用。有趣的是，研究終止時處死之動物之腫瘤的免疫PD資料(圖 30A - D )揭露，增強的瘤內T細胞頻率亦反映CEA-CD28變異體8誘導額外的腫瘤生長抑制。圖 30A 展示各處理組之經染色之腫瘤單一細胞懸浮液的代表性點陣圖。CD3、CD8及CD4 T細胞浸潤之概述分別描繪於圖 30B 、圖 30C 及圖 30D 中。在腫瘤的T細胞浸潤方面，CEA-CD28 (SA_變異體15)或CEA-CD28 (SA_變異體29)處理組相較於單獨CEACAM5-TCB或與PD-L1的組合，未觀測到統計學差異。已偵測到CEA-CD28 (SA_變異體8)存在最強的免疫PD效應。 表33：研究第52天之TGI (媒劑作為對照組)
群組 TGI
CEACAM5 TCB 35
CEACAM5 TCB + a-PD-L1 17
CEACAM5 TCB + a-PD-L1 + CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8) 75
CEACAM5 TCB + a-PD-L1 + CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15) 37
CEACAM5 TCB + a-PD-L1 + CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體29) 35
13.3 CEA - CD28 雙特異性抗原結合分子與 CEA TCB 組合在人類化 NSG 小鼠中對 MKN45 異種移植物的功效研究 本文所述之功效研究旨在在完全人類化NSG小鼠中在第二人類異種移植模型中在腫瘤消退及免疫PD模式方面研究CEA-TCB與CEA-CD28之組合(SA_變異體8)。
最初自ATCC獲得人類MKN45細胞(人類胃癌)且在擴增之後寄存於Glycart內部細胞庫中。在37℃下，在5% CO2 下，在水飽和氛圍中，在含有10% FCS之DMEM中培養細胞。在存活率下＞95%的情況下，使用活體外繼代12進行皮下注射。使用22G至30G針將與50微升基質膠混合之50微升細胞懸浮液(1×106 個MKN45細胞)皮下注射於麻醉小鼠之側腹。根據承諾的準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)，將在實驗開始時4-5週齡之雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)以12小時亮/12小時暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(ZH225-17)。送達之後，讓動物維持一週以使其適應新環境及用於觀測。定期地進行連續健康監測。
對雌性NSG小鼠腹膜內注射15 mg/kg白消安(busulfan)，一天後靜脈內注射1×105 個自臍帶血分離之人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第14-16週，對小鼠進行舌下抽血，且針對成功人類化，藉由流式細胞術分析血液。經有效移植之小鼠根據其人類T細胞頻率隨機分成不同處理組。此時，如圖 31 中所述向小鼠皮下注射腫瘤細胞，且當腫瘤尺寸達到約150 mm3 (第13天)時，用分子或組胺酸緩衝液(媒劑)處理。所有小鼠靜脈內注射200 µl適當溶液。為獲得每200 µl適當量之化合物，必需時用組胺酸緩衝液稀釋儲備溶液(表34)。表 34 ：活體內實驗使用的組合物
化合物 調配緩衝液 濃度 (mg/mL)
CEA-TCB 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 4.82 (= 儲備溶液)
CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8) 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 3.78 (= 儲備溶液)
對於組合療法而言(C組，圖31)，同時注射構築體。使用測徑規每週量測腫瘤生長兩次，且如下計算腫瘤體積： Tv：(W2 /2) x L           (W：寬度，L：長度)
利用Roche內部統計學程式如之前在實例12.1中所述來計算腫瘤生長抑制(TGI)值作為活體內效能的量度。
在終止(第48天)時，處死小鼠，移出腫瘤，稱重且經由用膠原蛋白酶V及去氧核糖核酸酶進行酶消化來製備單一細胞懸浮液以便隨後進行FACS分析。單一細胞針對人類CD45及CD3加以染色且在FACS BDFortessa加以分析。
圖 32 展示所有處理組的腫瘤生長動力學(平均值，+SEM)，各處理組的相應TGI值展示於下表35中。如本文所述，CEA-TCB單一療法誘導腫瘤生長抑制，TGI值為84%。然而，與CEA-CD28 (SA_變異體8)組合處理引起優良的腫瘤生長抑制(TGI：101%)。另外，研究終止時處死之動物之腫瘤的免疫PD資料(圖3)揭露，增強的瘤內T細胞頻率亦反映CEA-CD28 (SA_變異體8)與CEA-TCB組合誘導強烈的腫瘤生長抑制。圖 33A 展示各處理組之經染色之腫瘤單一細胞懸浮液的代表性點陣圖。圖 33B 中描繪CD3+ T細胞浸潤概況。表 35 ： 研究第 48 天之 TGI ( 媒劑作為對照組 )
群組 TGI
CEA TCB 84
CEA TCB + CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8) 10
實例 14 靶向 CD28 及上皮細胞黏附分子 ( EpCAM ) 、 HER3 、 CD30 或滋養層醣蛋白 ( TPBG ) 之雙特異性抗原結合分子的產生及製備 14.1 靶向 CD28 及 EpCAM 、 HER3 、 CD30 或 TPBG 之 雙特異性抗原結合分子的選殖
為了產生表現質體，使用各別可變域之序列且與預插入各別接受者哺乳動物表現載體中的各別恆定區同框次選殖。在Fc域中，Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變(PG-LALA)已根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831號中所述之方法引入人類IgG1重鏈恆定區中以消除對Fcγ受體的結合。為了產生雙特異性抗體，Fc片段含有「杵」突變(S354C/T366W突變，根據Kabat EU索引編號)或「臼」突變(Y349C/T366S/L368A/Y407V突變，根據Kabat EU索引)以避免重鏈錯配。為了避免雙特異性抗原結合分子中之輕鏈錯配，將VH/VL或CH1/Cκ域之交換引入一個結合部分(互換Fab技術)。在另一結合部分中，如國際專利申請公開案第WO 2015/150447號中所述將電荷引入CH1及Cκ域中。
抗EpCAM抗體MT201 (阿達木單抗(adecatumumab))的產生及製備描述於美國專利第7,632,925 B2號中。抗HER3抗體(倫土珠單抗(lumretuzumab))的產生描述於WO 2011/076683 A1中。抗CD30抗體貝倫妥單抗(brentuximab)揭示於WO 02/34661 A2中。抗TPBG抗體(例如FAB091)之產生及製備描述於WO 2017/072207 A1中。
選殖以下分子，其示意性說明展示於圖 34A 至圖 34D 中： 分子14A ：EpCAM (MT201)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且EpCAM (MT201) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子( 圖 34A ) ，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：366、367、390及391 (P1AE9051)。分子 14B ：HER3 (倫土珠單抗)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且抗HER3 Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 34B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：357、358、392及393 (P1AF0151)。分子 14C ：CD30 (貝倫妥單抗)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且抗CD30 Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 34C )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：357、358、394及395 (P1AF1751)。分子 14D ：TPBG (FAB091)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且抗TPBG Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 34D )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：357、358、396及397 (P1AF1752)。
14.2 分子的產生 上述分子的表現係由嵌合MPSV啟動子或CMV啟動子驅動。聚腺苷酸化係由位於CDS之3'端的合成聚腺苷酸信號序列驅動。另外，各種載體含有用於常染色體複製的EBV OriP序列。
抗體及雙特異性抗體係藉由瞬時轉染HEK293 EBNA細胞或CHO EBNA細胞產生。使細胞離心且培養基置換為預溫熱之CD CHO培養基(Thermo Fisher，目錄號10743029)。在CD CHO培養基中混合表現載體，添加PEI (聚乙烯亞胺，Polysciences, Inc，目錄號23966-1)，將溶液渦旋且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞(2 Mio/ml)與載體/PEI溶液混合，轉移至燒瓶中且在具有5% CO2 氛圍的振盪培育箱中、在37℃培育3小時。培育後，添加具有補充劑(總體積之80%)之Excell培養基(W. Zhou及A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。轉染後的第一天，添加補充劑(饋料，總體積之12%)。7天後藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集細胞上清液，且藉由如下文所指示之標準方法自所收集之上清液純化蛋白質。
14.3 分子的純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，含有Fc之蛋白質藉由蛋白質A-親和層析法(平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鈉、20 mM磷酸鈉，pH 7.5；溶離緩衝液：20 mM檸檬酸鈉，pH 3.0)自細胞培養上清液純化。在pH 3.0達成溶離，隨即對樣品進行pH中和。藉由離心(Millipore Amicon® ULTRA-15 (技術編號：UFC903096))濃縮蛋白質，且在20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉(pH 6.0)中藉由尺寸排阻層析將聚集之蛋白質與單體蛋白質分離。
14.4 雙特異性 CD28 抗原結合分子之分析資料 根據Pace,等人, Protein Science, 1995, 4, 2411-1423，藉由使用基於胺基酸序列所計算之質量消光係數量測280 nm吸光值來測定經純化蛋白質之濃度。在還原劑存在及不存在下，使用LabChipGXII (Perkin Elmer)、藉由CE-SDS分析蛋白質純度及分子量。聚集物含量測定係在25℃下、藉由使用分析型尺寸排阻管柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)的HPLC層析進行，該管柱在操作緩衝液(分別為25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽pH 6.7或200 mM KH2 PO4 、250 mM KCl pH 6.2)中平衡。所有分子之純化參數的概述明示於表 36 中。表 36 ： CD28 抗原結合分子 13A 至 13D 之產生及純化概述
分子 描述 產量[mg/l] 分析型SEC (HMW/單體/LMW) [%] 藉由CE-SDS量測的純度[%]
14A EPCAM (MT201) - CD28 (SA_變異體15) 1+1 34.6 8.28 / 91.72 / 0 94.24
14B HER3 (倫土珠單抗) - CD28 (SA_變異體15) 1+1 60.3 0.14 / 99.65 / 0.21 98.53
14C CD30 (貝倫妥單抗)- CD28 (SA_變異體15) 1+1 24.4 0 / 99.45 / 0.5 94.06
14D TPBG (5T4) - CD28 (SA_變異體15) 1+1 17.5 0 / 92.6 / 7.4 98.12
實例 15 靶向 CD28 及 EpCAM 、 HER3 、 CD30 或 TPBG 之 雙特異性抗原結合分子的活體外功能表徵 15.1 EpCAM - CD28 對 表現 EpCAM 之 細胞及表現 CD28 之 細胞的結合 使用HT-29細胞(ATCC #HTB-38)測試攜有中等親和力CD28純系變異體15 (P1AE9051)之EpCAM-CD28 (分子14A)對EpCAM的結合且使用表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)測試對人類CD28的結合。
為了評估結合，收集細胞，計數，檢查存活率且以0.5 Mio個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(eBioscience，目錄號00-4222-26)中。在4℃下，將5E4個細胞與濃度增加的EpCAM-CD28構築體(10 pM-500 nM)一起在圓底96孔盤中培育1小時。接著，細胞用冷FACS緩衝液洗滌兩次，在4℃下與PE結合的山羊抗人類PE (Jackson ImmunoReserach，目錄號109-116-098)一起再培育30分鐘，用冷FACS緩衝液洗滌兩次，離心且再懸浮於85 ul含有1:10000稀釋之DAPI (Roche，目錄號10236276001)的FACS緩衝液中。為監測構築體與細胞之間的非特異性結合相互作用，包括抗DP47 IgG作為陰性對照。藉由流式細胞術，使用FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva)評估結合。使用GraphPadPrism7獲得結合曲線。
活體外細胞結合分析證實，EpCAM-CD28 (P1AE9051)雙特異性促效抗體以濃度依賴性方式結合至人類CD28 (圖 35A )且結合至HT-29細胞上的人類EpCAM (圖 35B )。如所預期，在抗DP47 IgG存在下未偵測到結合，表明偵測到結合係歸因於各別靶向部分之特異性CD28及EpCAM結合。
15.2 基於 IL - 2 報導體分析對 EpCAM - CD28 分子進行的活體外功能表徵 為了評估EpCAM-CD28 (分子14A)支持抗CD3介導之T細胞活化的能力，IL-2報導體細胞(Promega，目錄號J1651)充當效應細胞(表現由IL-2啟動子驅動之螢光素酶報導體的Jurkat T細胞株)且HT-29充當腫瘤目標。在白色平底96孔盤中，在37℃下，將1E4個腫瘤目標細胞與5E4個IL-2報導體細胞(E:T 5:1)一起在10 nM抗CD3 (eBioscience #16-0037-85)單獨或與濃度增加之EpCAM-CD28構築體(24 pM-100 nM)之組合存在下培育6小時。在量測之前，將盤在室溫下培育15分鐘，且接著將100 μl受質(ONE-Glo溶液，Promega，目錄號E6120)添加至細胞中。在室溫下、在暗處培育10分鐘之後，使用Tecan Spark 10M量測發光(計數/秒)。
評估T細胞活化與恆定之次最佳抗CD3刺激的組合。為此目的，將IL-2報導體Jurkat細胞與表現EpCAM的HT29細胞一起在濃度增加的EpCAM-CD28 (P1AE9051)及濃度固定、有限的抗CD3 IgG純系OKT3 (10 nM)存在下共培養6小時。如圖 35C 中所描繪，EpCAM-CD28能夠增強T細胞活化，如根據以濃度依賴性方式暴露於次最佳CD3刺激的T細胞之IL-2產生增加所判斷。
15.3 HER3 - CD28 對 表現 HER3 之 細胞及表現 CD28 之 細胞的結合 使用T-47D細胞(ATCC #HTB-133)測試攜有中等親和力CD28純系變異體15 (P1AF0151)之HER3-CD28 (分子14B)對HER3的結合且使用表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)測試對人類CD28的結合。
為了評估結合，收集細胞，計數，檢查存活率且以0.5 Mio個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(eBioscience，目錄號00-4222-26)中。5E4 在4℃下，將細胞與濃度增加的HER3-CD28構築體(10 pM-500 nM)一起在圓底96孔盤中培育1小時。接著，細胞用冷FACS緩衝液洗滌兩次，在4℃下與PE結合的山羊抗人類PE (Jackson ImmunoReserach，目錄號109-116-098)一起再培育30分鐘，用冷FACS緩衝液洗滌兩次，離心且再懸浮於85 ul含有1:10000稀釋之DAPI (Roche，目錄號10236276001)的FACS緩衝液中。為監測構築體與細胞之間的非特異性結合相互作用，包括抗DP47 IgG作為陰性對照。藉由流式細胞術，使用FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva)評估結合。使用GraphPadPrism7獲得結合曲線。
FACS 分析 為了評估T-47D表面上之HER3的相對含量，使2E5個細胞以480xg離心5分鐘且用PBS洗滌。根據供應商指示進行表面HER3染色(APC抗人類，BioLegend #324708)。細胞用每孔150 ul PBS洗滌一次且再懸浮於每孔150 μl PBS中且使用BD FACS Fortessa分析。
活體外細胞結合分析證實，HER3-CD28 (分子14B)雙特異性促效抗體以濃度依賴性方式結合至細胞上的人類CD28 (圖 36A )以及人類HER3 (圖 36B )。如所預期，在抗DP47 IgG存在下未偵測到結合，表明偵測到結合係歸因於各別靶向部分之特異性CD28及HER3結合。
15.4 基於 IL - 2 報導體分析對 HER3 - CD28 分子進行的活體外功能表徵 為了評估HER3-CD28 (分子14B)支持抗CD3介導之T細胞活化的能力，IL-2報導體細胞(Promega，目錄號J1651)充當效應細胞(表現由IL-2啟動子驅動之螢光素酶報導體的Jurkat T細胞株)且T-47D充當腫瘤目標。1E4 在白色平底96孔盤中，在37℃下，將腫瘤目標細胞與5E4個IL-2報導體細胞(E:T 5:1)一起在10 nM抗CD3 (eBioscience #16-0037-85)單獨或與濃度增加之HER3-CD28構築體(24 pM-100 nM)之組合存在下培育6小時。在量測之前，將盤在室溫下培育15分鐘，且接著將100 μl受質(ONE-Glo溶液，Promega，目錄號E6120)添加至細胞中。在室溫下、在暗處培育10分鐘之後，使用Tecan Spark 10M量測發光(計數/秒)。
評估T細胞活化與恆定之次最佳抗CD3刺激的組合。為此目的，將IL-2報導體Jurkat細胞與表現EpCAM的HT29細胞一起在濃度增加的HER3-CD28 (P1AF0151)及濃度固定、有限的抗CD3 IgG純系OKT3 (10 nM)存在下共培養6小時。如圖 36C 中所描繪，EpCAM-CD28能夠增強T細胞活化，亦即，暴露於次最佳CD3刺激的T細胞以濃度依賴性方式產生IL-2。
15.5 TPBG - CD28 及 CD30 - CD28 促效抗體在 PBMC 分析中的活體外功能表徵 分別使用來自健康供者之初代PBMC T細胞作為效應細胞，及表現5T4之目標細胞，諸如JIMT-1、NCI-H1975、NCI-N87及Calu-1細胞，或表現CD30之目標細胞，諸如KARPAS-299，評估TPBG(5T4)-CD28 (分子14D)及CD30-CD28 (分子14C)增強藉由抗CD3刺激介導之T細胞活化的能力。在此類分析中，在37℃下，在圓底96孔盤中，將1E4個腫瘤目標細胞與1E5 (E:T 10:1)一起在次最佳濃度之抗CD3 (eBioscience #16-0037-85，純系OKT3)單獨或與濃度增加之CD28促效構築體(24 pM-100 nM)之組合存在下培育5天。藉由流式細胞術量測T細胞活化標記物(CD25、CD69)及T細胞增殖(CFSE稀釋)來評估靶向CD28之分子的功能。
實例 16 靶向 CD28 及多發性骨髓瘤 ( MM ) 細胞表面抗原之雙特異性抗原結合分子的產生及製備 16.1 靶向 CD28 及多發性骨髓瘤 ( MM ) 細胞表面抗原之雙特異性抗原結合分子的選殖 為了產生表現質體，使用各別可變域之序列且與預插入各別接受者哺乳動物表現載體中的各別恆定區同框次選殖。在Fc域中，Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變(PG-LALA)已根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831號中所述之方法引入人類IgG1重鏈恆定區中以消除對Fcγ受體的結合。為了產生雙特異性抗體，Fc片段含有「杵」突變(S354C/T366W突變，根據Kabat EU索引編號)或「臼」突變(Y349C/T366S/L368A/Y407V突變，根據Kabat EU索引)以避免重鏈錯配。為了避免雙特異性抗原結合分子中之輕鏈錯配，將VH/VL或CH1/Cκ域之交換引入一個結合部分(互換Fab技術)。在另一結合部分中，如國際專利申請公開案第WO 2015/150447號中所述將電荷引入CH1及Cκ域中。
抗GPRC5D抗體5E11為如WO 2019/154890 A1中所述之純系5E11之人類化型式。抗CD38抗體(例如達土木單抗(daratumumab))揭示於WO 2006/99875 A1中。抗BCMA抗體之產生及製備描述於WO 2016/166629 A1中。
選殖以下分子，其示意性說明展示於圖 37A 至圖 37C 中：分子 16A ：GPRC5D (5E11)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且GPRC5D (5E11) Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 37A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：366、367、398及399 (P1AF1272)。分子 16B ：GPRC5D (5E11)-CD28 (SA_變異體8) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且GPRC5D (5E11) Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 37A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：364、365、398及399 (P1AF2954)。分子 16C ：CD38 (達土木單抗)-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有帶電修飾且抗CD38 Fab片段(臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 37B )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：357、358、400及401 (P1AE9038)。分子 16D ：抗BCMA-CD28 (SA_變異體15) 1+1形式，CD28 (SA_變異體15) Fab片段(杵)中具有VH/VL交換且抗BCMA Fab片段(臼)中具有帶電修飾的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 34A )，該分子包含胺基酸序列SEQ ID No：366、367、402及403 (P1AE9053)。
16.2 分子的產生 上述分子的表現係由嵌合MPSV啟動子或CMV啟動子驅動。聚腺苷酸化係由位於CDS之3'端的合成聚腺苷酸信號序列驅動。另外，各種載體含有用於常染色體複製的EBV OriP序列。
抗體及雙特異性抗體係藉由瞬時轉染HEK293 EBNA細胞或CHO EBNA細胞產生。使細胞離心且培養基置換為預溫熱之CD CHO培養基(Thermo Fisher，目錄號10743029)。在CD CHO培養基中混合表現載體，添加PEI (聚乙烯亞胺，Polysciences, Inc，目錄號23966-1)，將溶液渦旋且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞(2 Mio/ml)與載體/PEI溶液混合，轉移至燒瓶中且在具有5% CO2 氛圍的振盪培育箱中、在37℃培育3小時。培育後，添加具有補充劑(總體積之80%)之Excell培養基(W. Zhou及A. Kantardjieff, Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, DOI：10.1007/978-3-642-54050-9；2014)。轉染後的第一天，添加補充劑(饋料，總體積之12%)。7天後藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集細胞上清液，且藉由如下文所指示之標準方法自所收集之上清液純化蛋白質。
或者，本文所述之抗體及雙特異性抗體係利用習知(基於非PCR)選殖技術且使用適於懸浮的CHO K1細胞(最初自ATCC接收且適於在Evitria的懸浮培養液中無血清生長)，由Evitria使用其專有載體系統製備。為了產生，Evitria使用其專有的無動物組分及無血清培養基(eviGrow及eviMake2)及其專有的轉染劑(eviFect)。藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集上清液，且藉由標準方法自所收集之上清液純化蛋白質。
16.3 分子的純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，含有Fc之蛋白質藉由蛋白質A-親和層析法(平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鈉、20 mM磷酸鈉，pH 7.5；溶離緩衝液：20 mM檸檬酸鈉，pH 3.0)自細胞培養上清液純化。在pH 3.0達成溶離，隨即對樣品進行pH中和。藉由離心(Millipore Amicon® ULTRA-15 (技術編號：UFC903096))濃縮蛋白質，且在20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉(pH 6.0)中藉由尺寸排阻層析將聚集之蛋白質與單體蛋白質分離。
16.4 雙特異性 CD28 抗原結合分子之分析資料 根據Pace,等人, Protein Science, 1995, 4, 2411-1423，藉由使用基於胺基酸序列所計算之質量消光係數量測280 nm吸光值來測定經純化蛋白質之濃度。在還原劑存在及不存在下，使用LabChipGXII或LabChip GX Touch (Perkin Elmer)、藉由CE-SDS分析蛋白質純度及分子量。聚集物含量測定係在25℃下、藉由使用分析型尺寸排阻管柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)的HPLC層析進行，該管柱在操作緩衝液(分別為25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽pH 6.7或200 mM KH2 PO4 、250 mM KCl pH 6.2)中平衡。所有分子之純化參數的概述明示於表 37 中。表 37 ： CD28 抗原結合分子 16A 至 16D 之產生及純化概述
分子 描述 產量[mg/l] 分析型SEC (HMW/單體/LMW) [%] 藉由CE-SDS量測的純度[%]
16A GPRC5D (5E11) - CD28 (SA_變異體15) 1+1 46.89 0.73 / 97.68 / 1.59 93.44
16B GPRC5D (5E11) - CD28 (SA_變異體8) 1+1 89.84 2.99 / 95.26 / 1.75 88.76
16C CD38 (達土木單抗)- CD28 (SA_變異體15) 1+1 56.55 0.29 / 99.71 / 0 93.96
16D BCMA - CD28 (SA_變異體15) 1+1 87.6 1.75 / 98.25 / 0 94.33
實例 17 靶向 CD28 及多發性骨髓瘤 ( MM ) 細胞表面抗原之雙特異性抗原結合分子的活體外功能表徵 17.1 靶向 CD28 及多發性骨髓瘤 ( MM ) 細胞表面抗原之雙特異性抗原結合分子對過度表現指定 目標 之細胞的結合 為了量測對GPRC5D、BCMA、CD38或CD28的結合，吾等對所報導的多發性骨髓瘤細胞株(Lombardi等人, Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics：insights into the biology of the diseas；Genes Chromosomes Cancer. 2007, 46(3), 226-38)或經轉導而穩定地過度表現人類GPRC5D或人類CD28的CHO轉染體執行基於FACS的結合分析：使用IM-9細胞(ATCC® CCL-159)評估對BCMA的結合；使用OCI-Ly18細胞(DSMZ ACC 699)評估對CD38的結合；使用CHO-hGPRC5D細胞評估對GPRC5D的結合；且使用CHO-hCD28細胞評估對CD28的結合。
根據製造商說明書培養IM-9及OCI-Ly18，將穩定的CHO轉染體(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61)在補充有10% FCS的F-12K中培養。簡言之，收集懸浮細胞，計數且檢查存活率。使用細胞解離緩衝液(Gibco)拆離黏附的CHO細胞，計數且檢查存活率。所有後續步驟均在4℃下執行。
細胞在FACS緩衝液(PBS、2%胎牛血清；1% 0.5m EDTA pH 8；0.25% NaN3 疊氮化鈉)中洗滌一次且以每毫升1百萬個細胞再懸浮於FACS緩衝液中。在圓底96孔盤中每孔接種10萬個細胞，用FACS緩衝液再次洗滌且捨棄上清液。細胞在4℃下以每孔50 ul的總體積、用濃度增加的指定CD28雙特異性分子(0.07-300 nM)染色30分鐘。細胞用FACS緩衝液洗滌兩次且在4℃下培育30分鐘，每孔總共25 ul，含有預稀釋的二級抗體(Alexa Fluor 488-親和純化F(ab')2片段山羊抗人類IgG、特異性Fcγ片段(分別為在FACS緩衝液中1:100稀釋的Jackson Immunoresearch 109-546-008、在FACS緩衝液中1:100稀釋的Jackson Immunoresearch 109-606-008 PE，如所指示)。洗滌細胞兩次且在配備有軟體FACS Diva的BD Fortessa流式細胞儀上分析。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線及EC50 值。
圖38A至圖38F表明所有雙特異性CD28分子均能夠以濃度依賴性方式結合人類CD28 (A)，以及各別第二目標，亦即，人類CD38、人類BCMA或人類GPRC5D。簡言之，GPRC5D-CD28分子結合至人類CD28之EC50 最低(表37)，但達成的最大結合低於其他兩種CD28雙特異性分子。
靶向CD38的分子與靶向BCMA的CD28分子對CD38及BCMA分別展示濃度依賴性結合，且在評估濃度範圍內達到飽和(EC50 結合值概述於表38中)。相比之下，GPRC5D-CD28分子以濃度依賴性方式結合，但在相同濃度範圍內達不到飽和，表明GPRC5D的親和力低於此等分子中所含的CD38或BCMA結合子。表 38 ： 指定雙特異性 CD28 分子結合至細胞上所表現之人類 CD28 或各別 MM 目標 抗原的 EC50 值 ( nM )
分子 結合至CD28 的EC50 (nM ) 結合至CD38 /BCMA /GPRC5D 的EC50 (nM )
CD38-CD28 26.8 4.3
BCMA-CD28 9.9 3.96
GPRC5D-CD28 (SA_變異體15) 4.7 - 5.2 未計算
GPRC5D-CD28 (SA_變異體8) 74.2 未計算
17.2 基於 IL - 2 報導體分析的活體外功能表徵 ( T 細胞活化的 功能表徵 ) 為了評估CD38-CD28、BCMA-CD28及GPRC5D-CD28雙特異性抗原結合分子支持TCB介導T細胞活化的能力，使用IL-2報導體細胞(Promega，目錄號J1651)作為效應細胞(表現由IL-2啟動子驅動之螢光素酶報導體的Jurkat T細胞株)且使用對CD38、BCMA以及GPRC5D呈陽性的NCI-H929細胞作為腫瘤目標。
簡言之，在37℃下，在白色平底384孔盤(353988 Falcon™ 384孔平底組織培養處理微量盤)中，將5×103 個腫瘤目標細胞與2.5×104 個IL-2報導體細胞(E:T 5:1)一起在1 nM GPRC5D-TCB單獨或與濃度增加之CD28雙特異性分子(12.2-50 nM)之組合存在下分別培育5小時及22小時。在量測之前，將盤在室溫下培育15分鐘，且接著將20 μl受質(ONE-Glo溶液，Promega，目錄號E6120)添加至細胞中。在室溫下、在暗處培育10分鐘之後，使用Tecan Spark 10M量測發光(計數/秒)。
由於圖39A至39F中所描繪，靶向MM之CD28分子中無一者在缺乏TCB信號的情況下誘導IL2 Jurkat報導體細胞活化(亮灰線，圖39A-9F)。如所預期，對於此等IL-2報導體細胞而言，在1 nM GPRC5D TCB存在下，報導體細胞活化亦不存在顯著誘導，不論在早期時間點(5小時)或在隨後時間點(在22小時之後)。
然而，所有靶向MMA之分子均能夠在1 nM GPRC5D-TCB存在下誘導IL-2報導體細胞發生顯著的濃度及時間依賴性活化。雖然CD38-CD28及BCMA-CD28分子能夠在5小時之後已誘導IL2報導體細胞活化(圖39A及圖39C)，但GPRC5D-CD28僅在後續評估時間點達到類似最大活化水準(22小時，圖39F)，表明活性動力學不同。
實驗中使用的抗GPRC5D/抗CD3雙特異性抗體(GPRC5D TCB，圖 37D )已類似於CEACAM5 TCB製備，如實例8及WO 2016/079076 A1中所述。GPRC5D TCB包含胺基酸序列SEQ ID NO：398、SEQ ID NO：399、SEQ ID NO：404及SEQ ID NO：405。
17.3 T 細胞 介導多發性骨髓瘤細胞株溶解 為了評估CD38-CD28、BCMA-CD28及GPRC5D-CD28增強GPRC5D TCB介導多發性骨髓瘤細胞株溶解的能力，將1.5×105 個人類泛T效應細胞與3x104 個NCI-H929目標細胞一起以1:1之最終E:T比率培育約22小時。使用泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotec，目錄號130-096-535)，根據製造商說明書，藉由MACS自PBMC分離出泛T細胞。添加濃度增加(0.064 pM-1 nM)之GPRC5D TCB，以0.2 nM之固定濃度添加靶向MM之不同雙特異性CD28抗原結合分子。如下評估腫瘤細胞溶解：將分析盤離心5分鐘，且將每孔50 ul上清液轉移至新的平底96孔盤中。為了歸一化，藉由將目標細胞與最終濃度的1% Triton X-100一起培育來誘導目標細胞最大溶解(=100%)。最小溶解(=0%)係指目標細胞與效應細胞共培育，而非與任何雙特異性構築體或TCB共培育。在37℃、5% CO2 下隔夜培育約22小時之後，使用LDH偵測套組(Roche Applied Science，#11 644 793 001)，根據製造商說明書來量測細胞凋亡/壞死目標細胞釋放至上清液中的LDH。
如圖40A至40C中所說明，GPRC5D TCB誘導NCI-H929細胞發生濃度依賴性溶解。相較於TCB單一療法，評估的所有三種靶向MM之雙特異性CD28抗原結合分子當以0.2 nM之固定濃度投與時，均能夠顯著地增強功效。另外，在缺乏TCB的情況下，靶向MM之雙特異性CD28抗原結合分子中無一者誘導腫瘤細胞溶解，此支持靶向MM之分子依賴於TCB信號。
表39概述由圖40A-40C中所示之資料推導出的EC50 值以及曲線下面積。使用GraphPadPrism6計算EC50 值。表 39 ： 抗 GPRC5D TCB 介導殺滅之 EC50 值 ( nM )
   GPRC5D TCB + CD38-CD28 + BCMA-CD28 + GPRC5D-CD28
22小時之後的溶解EC50 (pM) 1.86 3.1 3.7 3.3
曲線下面積 21.3 44.8 46.3 46.8
實例 18 靶向 CD28 及 CD19 或 CD79b 之 雙特異性抗原結合分子的產生及製備 18.1 靶向 CD28 及 CD19 或 CD79b 之 雙特異性抗原結合分子的選殖 CD19抗體之產生及製備揭示於WO 2017/55541 A1或WO 2017/55328 A1中。特定言之，CD19純系2B11描述於WO 2017/55328 A1中，該文獻以引用之方式併入本文中。如本文所用，CD79b純系huMA79b.v28 (對應於保納珠單抗(polatuzumab)描述於WO 2009/012268 A中。為了產生各別表現質體，使用各別可變域之序列且與預插入各別接受者哺乳動物表現載體中的各別恆定區同框次選殖。所得分子之示意性描述分別展示於圖 41A 及圖 41B 中。Pro329Gly、Leu234Ala及Leu235Ala突變(PG-LALA)已引入人類IgG1重鏈恆定區中以消除對Fcγ受體的結合。為了產生不對稱雙特異性抗體，Fc片段含有「杵」或「臼」突變以避免重鏈錯配。為了避免雙特異性及多特異性抗體構築體中之輕鏈錯配，將VH/VL或CH1/Cκ域之交換引入一個結合部分(互換Fab技術)。在另一結合部分中，將電荷引入CH1及Cκ域中。
選殖以下分子，其示意性說明展示於圖 41A 至圖 41B 中： 分子18A：CD19 (8B8-2B11)-CD28 (SA_v29) 1+1，CD28 v29 Fab (杵)中具有電荷修飾且CD19 (2B11) Fab (臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子( 圖 41A ) 。該分子包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：118及430以及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：65及431 (P1AE8002)。 分子18B：CD19 (8B8-2B11)-CD28 (SA_v15) 1+1，CD28 v15 Fab (杵)中具有電荷修飾且CD19 (2B11) Fab (臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子( 圖 41A) 。該分子包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：116及430以及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：121及431 (P1AE9040)。 分子18C：CD19 (8B8-2B11)-CD28 (SA_v8) 1+1，CD28 v8 Fab (杵)中具有電荷修飾且CD19 (2B11) Fab (臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子(圖 41A )。該分子包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：114及430以及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：122及431 (P1AF0175)。 分子D：CD19 (8B8-2B11)-CD28 (SA_v11) 1+1，CD28 v11 Fab (杵)中具有電荷修飾且CD19 (2B11) Fab (臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子( 圖 2B ) 。該分子包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：114及430以及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：65及431 (P1AF0377)。 分子E：CD19 (8B8-2B11)-CD28 (SA_v27) 1+1，CD28 v27 Fab (杵)中具有電荷修飾且CD19 (2B11) Fab (臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子( 圖 2B ） 。該分子包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：118及430以及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：123及431 (P1AF0378)。 分子F：CD79b (huMA79b.v28)-CD28 (SA_v15) 1+1，CD28 v15 Fab (杵)中具有電荷修飾且CD79b (huMA79b.v28) Fab (臼)中具有VH/VL交換的雙特異性huIgG1 PG-LALA互換Fab分子( 圖 2C ) 。該分子包含重鏈胺基酸序列SEQ ID NO：116及432以及輕鏈胺基酸序列SEQ ID NO：121及433 (P1AE9039)。
18.2 靶向 CD28 及 CD19 或 CD79b 之 雙特異性抗原結合分子的產生 上述分子之表現藉由CMV啟動子驅動。聚腺苷酸化係由位於CDS之3'端的合成聚腺苷酸信號序列驅動。另外，各種載體含有用於常染色體複製的EBV OriP序列。
為了產生所有構築體，使用聚乙烯亞胺作為轉染劑，用各別表現載體短暫共轉染生長於懸浮液中的HEK293-EBNA細胞。將細胞離心且培養基用預溫熱的CD CHO培養基置換。在CD CHO培養基中混合表現載體，添加PEI，渦旋溶液且在室溫下培育10分鐘。隨後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至搖瓶中，且在具有5% CO2 氛圍之培育箱中在37℃下培育3小時。培育之後，添加具有補充劑的Excell培養基(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, 編者：Weichang Zhou, Anne Kantardjieff)。轉染之後的第一天，添加補充劑(饋料)(Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing, 編者：Weichang Zhou, Anne Kantardjieff)。7天之後，藉由離心及隨後過濾(0.2 μm過濾器)收集細胞上清液且藉由標準方法純化。
18.3 靶向 CD28 及 CD19 或 CD79b 之 雙特異性抗原結合分子的純化 參考標準方案，自經過濾之細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，含有Fc之蛋白質藉由蛋白質A-親和層析法(平衡緩衝液：20 mM檸檬酸鈉、20 mM磷酸鈉，pH 7.5；溶離緩衝液：20 mM檸檬酸鈉，pH 3.0)自細胞培養上清液純化。在pH 3.0達成溶離，隨即對樣品進行pH中和。藉由離心(Millipore Amicon® ULTRA-15 (技術編號：UFC903096))濃縮蛋白質，且在20 mM組胺酸、140 mM氯化鈉(pH 6.0)中藉由尺寸排阻層析將聚集之蛋白質與單體蛋白質分離。
18.4 靶向 CD28 及 CD19 或 CD79b 之 雙特異性或三特異性抗體的分析資料 根據Pace等人, Protein Science, 1995, 4, 2411-1423，使用基於胺基酸序列計算的質量消光係數，藉由量測280 nm光學密度(OD)來測定經純化之構築體的蛋白質濃度。在還原劑存在及不存在下，使用LabChipGXII (Perkin Elmer)、藉由CE-SDS分析蛋白質純度及分子量。聚集物含量測定係在25℃下、藉由使用分析型尺寸排阻管柱(TSKgel G3000 SW XL或UP-SW3000)的HPLC層析進行，該管柱在操作緩衝液(分別為25 mM K2 HPO4 、125 mM NaCl、200 mM L-精胺酸單鹽酸鹽pH 6.7或200 mM KH2 PO4 、250 mM KCl pH 6.2)中平衡。所有分子之純化參數的概述明示於表 40 中。表 40 ：雙特異性 CD28 抗原結合分子產生及純化的概述
分子 描述 產量[mg/l] 分析型SEC (HMW/單體/LMW) [%] 藉由CE-SDS量測的純度[%]
18A CD19 (2B11) - CD28 (v29) 1+1 24.9 1.45 / 98.55 / 0 96.25
18B CD19 (2B11) - CD28 (v15) 1+1 45.05 0 / 99.1 / 0.9 98.78
18C CD19 (2B11) - CD28 (v8) 1+1 22.06 2.08 / 96.67 / 1.25 93.11
18D CD19 (2B11) - CD28 (v11) 1+1 40.9 0 / 98.9 / 1.1 97.1
18E CD19 (2B11) - CD28 (v27) 1+1 41.7 0.49 / 98.9 / 0.61 90.9
18F CD79b (huMA79b.v28) - CD28 (v15) 1+1 20.6 1.31 / 98.34 / 0.35 94.43
實例 19 靶向 CD28 及 CD19 或 CD79b 之 雙特異性抗原結合分子的結合及動力學分析 19.1 靶向 CD79b 之雙特異性抗原結合分子的動力學分析 使用Biacore T200機器、藉由表面電漿子共振、藉由SPR量測huMA79b.v28對重組CD79b-His (Sinobiological #29750-H08H)的親和力(KD )。為了捕捉CD79b-His，藉由胺偶合使抗五HIS抗體與CM5晶片流動池偶合。使用約5000個單位的固著水準。接著將CD79b-His稀釋至1 nM濃度且藉由流量為10 μl/min的抗五HIS抗體捕捉10秒。
為了測定經純化之分子F (CD79b (huMA79b.v28)-CD28 (SA_變異體15) 1+1)的親和力(KD )，以30 μl/min注射經純化之抗原結合分子的一系列兩倍稀釋液(125 nM與0.49 nM之間範圍內的不同濃度)，結合時間為180秒，且解離時間為400秒。注射HBS-EP+ 緩衝液(GE-Healthcare標準緩衝液BR-1006-69 1:10稀釋)用作參照。用10 mM甘胺酸pH 2.1進行再生2x60秒。使用簡單的一比一朗繆爾結合模型，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算結合速率常數(kon )及解離速率常數(koff )( 圖 42) 。平衡解離常數(KD)係以比率koff /kon 計算。結果展示於表41中。分子F (CD79b (huMA79b.v28)-CD28 (SA_變異體15) 1+1)對CD79b-His的親和力為76 nM。表 41 ： huMA79b . v28 對 重組可溶性 CD79b - His 之結合的表徵
純系 k on (1/Ms) k off (1/s) KD (nM)
huMA79b.v28 2.57E+5 1.95E-2 76
19.2 靶向 CD28 之雙特異性抗原結合分子的動力學分析 在25℃下，使用藉由中性鏈親和素捕捉固著於NLC晶片上的生物素化huCD28-Fc抗原，使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)，藉由SPR量測所產生之雙特異性抗原結合分子對CD28的親和力(KD )。重組抗原(配位體)之固著：抗原用PBST (10 mM磷酸鹽、150 mM氯化鈉pH 7.4、0.005% Tween 20)稀釋至10 μg/ml，接著以不同接觸時間、以30微升/分鐘注射，以在豎直取向上達成約200、400或800個反應單位(RU)的固著水準。注射分析物：為了進行一次性動力學量測，將注射方向改為水平取向，沿著各別通道1-5、以50 μl/min同時注射經純化之靶向CD19之雙特異性抗CD28親和性變異體的一系列兩倍稀釋液(50 nM與3.125 nM之間範圍的不同濃度)，結合時間為150秒，且解離時間為450秒。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供「管線內」空白用於參照。使用簡單的一比一朗繆爾結合模型，在ProteOn Manager v3.1軟體中，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算結合速率常數(kon )及解離速率常數(koff )。平衡解離常數(KD )係以比率koff /kon 計算。所分析的純系揭露KD 值在寬範圍內(1與50 nM之間)。
實例 20 雙特異性 CD28 促效抗原結合分子對表現 CD28 之細胞 及表現 CD19 或 CD79b 之細胞的 結合 用表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)來測試對人類CD28的結合。為了評估結合，收集細胞，計數，檢查存活率且以2.5x105 /ml再懸浮於FACS緩衝液(eBioscience，目錄號00-4222-26)中。在4℃下，在圓底96孔盤中，將5x104 個細胞與濃度增加之CD28結合劑(1 pM-100 nM)一起培育2小時。接著，細胞用冷FACS緩衝液洗滌三次，在4℃下與PE結合之山羊抗人類PE (Jackson ImmunoReserach，目錄號109-116-098)一起再培育60分鐘，用冷FACS緩衝液洗滌一次，離心且再懸浮於100 ul FACS緩衝液中。為監測構築體與細胞之間的非特異性結合相互作用，包括抗DP47 IgG作為陰性對照。藉由流式細胞術，使用FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva)評估結合。使用GraphPadPrism6獲得結合曲線。
單價單臂IgG樣CD28變異體構築體展示結合存在差異，如自圖 4A 至圖 4C 可見。
使用CD19及CD79b表現量不同之以下B細胞株測試對CD19及CD79b的結合：Nalm6 (DSMZ #ACC 128)、RCK8 (DSMZ #ACC 561)、WSU DLCL2 (DSMZ #ACC 575)及Z138 (M. Dyer, Univ. of Leicester贈)。
為了評估結合，收集細胞，計數，檢查存活率且以0.5 Mio個細胞/毫升再懸浮於FACS緩衝液(eBioscience，目錄號00-4222-26)中。在4℃下，將5E4個細胞與濃度增加的CD19-CD28 (或CD79b-CD28)構築體(10 pM-500 nM)一起在圓底96孔盤中培育1小時。接著，細胞用冷FACS緩衝液洗滌兩次，在4℃下與PE結合的山羊抗人類PE (Jackson ImmunoReserach，目錄號109-116-098)一起再培育30分鐘，用冷FACS緩衝液洗滌兩次，離心且再懸浮於85 ul含有1:10000稀釋之DAPI (Roche，目錄號10236276001)的FACS緩衝液中。為監測構築體與細胞之間的非特異性結合相互作用，包括抗DP47 IgG作為陰性對照。藉由流式細胞術，使用FACS Fortessa (BD, Software FACS Diva)評估結合。使用GraphPadPrism7獲得結合曲線。CD19-CD28 v15對不同B細胞株之結合的比較情況展示於圖 43A 及圖 43B 中。
FACS 分析 為了評估B細胞株(Nalm6、RCK8、WSU DLCL2及Z138)表面上的CD19相對含量，用Fc阻斷細胞，隨後使用人類Fc阻斷劑(BD，目錄號564220)染色，接著以480×g將2×105 個細胞離心5分鐘且用PBS洗滌。根據供應商指示進行表面CD19染色(BV650抗人類，BioLegend #302238)。細胞用每孔150 μl PBS洗滌一次且再懸浮於每孔150 μl PBS中且使用BD FACS Fortessa分析。
活體外細胞結合分析證實，所有CD19-CD28促效抗體均以濃度依賴性方式結合至細胞上的人類CD19以及人類CD28(圖 44A 及圖 44B )。如所預期，在抗DP47 IgG存在下未偵測到結合，表明偵測到結合係歸因於各別靶向部分之特異性CD28及CD19結合。結合至CD28之EC50 值展示於表42中且結合至CD19之EC50 值展示於表43中。表 42 ： CD19 - CD28 促效抗體結合至 CD28 之 EC50 值
ID 分子 EC50  (nM)
P1AF0175 CD19-CD28 v8 232
P1AF0377 CD19-CD28 v11 150.4
P1AE9040 CD19-CD28 v15 15.55
P1AF0378 CD19-CD28 v27 10.75
P1AE8002 CD19-CD28 v29 6.646
表 43 ： CD19 - CD28 促效抗體結合至 CD19 之 EC50 值
ID 分子 EC50  (nM)
P1AF0175 CD19-CD28 v8 0.2324
P1AF0377 CD19-CD28 v11 0.3631
P1AE9040 CD19-CD28 v15 0.416
P1AF0378 CD19-CD28 v27 0.368
P1AE8002 CD19-CD28 v29 0.2742
實例 21 靶向 CD19 或 CD79b 之 雙特異性 CD28 促效抗原結合分子的活體外功能表徵 使用人類初代PBMC進行基於細胞的若干活體外分析，以評估CD28(SA)及靶向CD19或CD79b之雙特異性CD28抗原結合分子在T細胞雙特異性(TCB)抗體所提供之TCR信號存在及不存在下的活性。如藉由流式細胞術、細胞介素ELISA及活細胞成像所測定之T細胞增殖、細胞介素分泌及腫瘤細胞殺滅係作為讀數獲得。
PBMC 分離 藉由對獲自白血球層之肝素化血液的富淋巴球製劑進行密度梯度離心(「Blutspende Zürich」)來製備周邊血液單核細胞(PBMC)。使25 ml血液(在PBS中1:2稀釋)在15 ml淋巴球分離液(STEMCELL技術，目錄號07851)上分層且在室溫下以845xg連續離心25分鐘。使用10 ml移液管將含有PBMC的中間相收集於50 ml管中。細胞用PBS洗滌且以611xg離心5分鐘。丟棄上清液，將離心塊再懸浮於50 ml PBS中且以304xg離心5分鐘。重複進行洗滌步驟，以171xg離心。將細胞再懸浮於RPMI 1640 Glutamax (含有5%人類血清、丙酮酸鈉、NEAA、50 μM 2-巰基乙醇、青黴素/鏈黴素)中且加以處理以便根據各別分析方案進行進一步的功能分析。
基於 IL - 2 報導體分析對 CD19 - CD28 及 CD79b - CD28 分子的活體外功能表徵 為了評估CD19-CD28及CD79b-CD28支持TCB介導之T細胞活化的能力，IL-2報導體細胞(Promega，目錄號J1651)充當效應細胞(表現由IL-2啟動子驅動之螢光素酶報導體的Jurkat T細胞株)且Nalm6、RCK8、WSU DLCL2及Z138充當腫瘤目標。在37℃下，在白色平底96孔盤中，將2x104 個腫瘤目標細胞與105 個IL-2報導體細胞(E:T 5:1)一起在次最佳濃度之CD20-TCB (P1AD4071)(對於Nalm6為10 nM，或對於RCK8、WSU DLCL2及Z138為0.05 nM)單獨或與濃度增加之CD19-CD28 (或CD79b-CD28)構築體(0.2 pM-10 nM)之組合存在下培育6小時。在量測之前，將盤在室溫下培育15分鐘，且接著將100 μl受質(ONE-Glo溶液，Promega，目錄號E6120)添加至細胞中。在室溫下、在暗處培育10分鐘之後，使用Tecan Spark 10M量測發光(計數/秒)。
基於自 PBMC 分離之 T 細胞活化 ， 對 CD19 - CD28 的 活體外功能表徵 為了評估CD19-CD28支持TCB介導T細胞活化的能力，泛T細胞用作效應細胞且使用泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotec，目錄號130-096-535)、根據製造商說明書、藉由MACS自PBMC分離且Nalm6、RCK8、WSU DLCL2及Z138充當腫瘤目標。在37℃下，在平底96孔盤中，將2x104 個腫瘤目標細胞與105 個泛T細胞(E:T 5:1)一起在次最佳濃度之CD20-TCB (P1AD4071)(對於Nalm6為10 nM，或對於RCK8、WSU DLCL2及Z138為0.05 nM)單獨或與濃度增加之CD19-CD28構築體(0.2 pM-10 nM)之組合存在下培育48小時。經由流式細胞術評估T細胞活化。簡言之，細胞以480xg離心5分鐘且用PBS洗滌。根據供應商的指示，針對CD8 (BV421抗人類，BioLegend #301036)、CD4 (PE-Cy7抗人類，BioLegend #344611)、CD25 (BV605抗人類，BioLegend #302632)、CD69 (PE抗人類，BioLegend #310906)進行表面染色。細胞用每孔150 ul PBS洗滌一次且再懸浮於每孔150 ul PBS中且使用BD FACS Fortessa分析。
細胞介素釋放評估 為了評估CD19-CD28在TCR信號傳導存在下觸發細胞介素釋放的能力，將5x105 個PBMC在U形底96孔盤中、在37℃下、在CD19-CD28 (1 nM)及次最佳濃度(0.4 pM)之CD20-TCB (P1AD4071)存在下培育48小時。為了評估CD19-CD28在缺乏TCR信號傳導的情況下觸發細胞介素釋放的能力，將5×105 個PBMC在U形底96孔盤中、在37℃下、在濃度增加的CD19-CD28構築體(0.08 nM-100 nM)存在下培育48小時。經由多重分析來評估細胞介素釋放。使用Bio-Plex Pro人類細胞介素17-plex分析(Bio-rad，目錄號m5000031yv)，根據供應商的指示，篩選每孔50 μl上清液中的G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12 (p70)、IL-13、IL-17、MCP-1 (MCAF)、MIP-1β及TNF-α分泌。
CD19 - CD28 增強 CD20 - TCB 介導多種 B 細胞株的 T 細胞活化 為了評估CD19-CD28抗體增強CD20-TCB介導效應功能的能力，評估TCB組合之T細胞活化。為此目的，將IL-2報導體Jurkat細胞與四種不同的CD19表現細胞株(Nalm6、WSU DLCL2、Z138、RCK8)一起在濃度增加的CD19-CD28 v15 (P1AE9040)及濃度固定、有限的CD20-TCB (P1AD4071)存在下共培養6小時。CD20 TCB為抗CD20/抗CD3雙特異性抗體的2+1形式，如WO 2016/020309 A1之實例1中所述。如圖 45A 至圖 45D 中所描繪，CD19-CD28在所有四種B細胞株存在下以濃度依賴性方式增強CD20-TCB介導之效應功能。
親和力減少的 CD28 結合子變異體在 CD19 - CD28 雙特異性形式中具有活體外功能 原始CD28(SA)純系具有KD = 1 nM之親和力。高親和力抗體純系具有經受周邊下沉效應的風險，尤其是目標在周邊血液中受到高度表現時，CD28之情況即如此。為了(i)減少周邊下沉效應，及(ii)減少周邊T細胞活化的風險(經由靶向CD28促效劑偏離腫瘤而結合至T細胞)，吾等藉由將點突變引入CDR中來產生親和力減少的一系列31種CD28純系(參見實例1.1)。如先前所述選擇候選純系。以靶向CD19的雙特異性形式產生CD28親和力不同的5種分子：CD19-CD28 v8 (P1AF0175)、CD19-CD28 v11 (P1AF0377)、CD19-CD28 v15 (P1AE9040)、CD19-CD28 v27 (P1AF0378)及CD19-CD28 v29 (P1AE8002)。圖 44A 及圖 44B 表明產生的所有CD19-CD28分子均結合至人類CD19以及CD28，且結合強度與結合子親和力相關。
為了評估親和力減少的CD28純系變異體是否具有功能且能夠支持TCB介導的效應功能，吾等評估TCB組合的T細胞活化。為此目的，將IL-2報導體Jurkat細胞與表現CD19的Nalm6細胞一起在濃度增加的CD19-CD28及濃度固定、有限的CD20-TCB存在下共培養6小時。如圖 46 中所描繪，CD28結合子之所有變異體均具有功能且能夠以濃度依賴性方式增加TCB介導之T細胞活化。泛T細胞用作效應細胞且使用泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)，根據製造商說明書，藉由MACS自PBMC分離出泛T細胞。
在缺乏 TCR 信號的情況下 ， CD19 - CD28 不活化 PBMC T 細胞 為了證實CD19-CD28構築體在缺乏TCR信號(諸如由CD20-TCB提供的信號)的情況下無活性，吾等評估PBMC源T細胞在CD20-TCB不存在或存在下與表現CD20之目標細胞(Nalm6)及CD19-CD28共培養之後的活化狀態。如圖 47 中所描繪，CD19-CD28以劑量依賴性方式增強CD20-TCB介導PBMC T細胞中之CD69表現，而在TCB不存在下，CD19-CD28不引起T細胞活化，即使在高濃度(100 nM)下。吾等觀測結果證實此研究結果：CD19-CD28在CD20-TCB存在或不存在下與CD19-CD28 v8或CD19-CD28 v15共培育之後不引起PBMC源T細胞釋放細胞介素(圖 48A 至圖 48D )。總之，此等資料證實CD19-CD28不為超促效抗體，但需要TCR信號(亦即，由TCB提供的信號)來增強T細胞活化。
CD79b - CD28 增強 CD20 - TCB 介導的 T 細胞活化 除靶向CD19之CD28促效抗體之外，吾等亦產生靶向CD79b之CD28抗體以評估其增強CD20-TCB介導T細胞活化的能力。為此，使用CD79b陽性B細胞株Z138。如圖 49A 中所示，CD79b-CD28結合至Z138。另外，CD79b-CD28當在0.05 nM CD20-TCB存在下與Z138一起培育時，能夠增強CD20-TCB介導IL-2 Jurkat細胞產生IL-2 (圖 49B )。
實例 22 靶向 CD28 及 CD19 之 雙特異性抗原結合分子的活體內功能表徵 具有不同 CD28 變異體之 CD19 - CD28 雙特異性抗原結合分子在人類化小鼠中對 NALM6 異種移植物的功效研究 本文中所述之功效研究旨在評估CD19-CD28雙特異性抗原結合分子中的哪種CD28變異體在單一療法中、在完全人類化NSG小鼠的CD19陽性人類淋巴瘤模型中引起的腫瘤生長抑制更強。
人類NALM6細胞(B細胞前驅體白血病)最初獲自ATCC且擴增之後，寄存於Glycart內部細胞庫。細胞於含有10% FCS及1x Glutamax之RPMI中培養。在37℃、5% CO2 下、在水飽和氛圍中培養細胞。使用22G至30G針將與50微升基質膠混合之50微升細胞懸浮液(1×106 個NALM6細胞)皮下注射於麻醉小鼠之側腹。
根據承諾的準則(GV-Solas；Felasa；TierschG)，將在實驗開始時4-5週齡之雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)以12小時亮/12小時暗之每日循環維持在無特定病原體之條件下。實驗研究方案由當地政府審查且批准(ZH225-17)。送達之後，讓動物維持一週以使其適應新環境及用於觀測。定期地進行連續健康監測。
對雌性NSG小鼠腹膜內注射15 mg/kg白消安(busulfan)，一天後靜脈內注射1×105 個自臍帶血分離之人類造血幹細胞。在幹細胞注射後第14-16週，對小鼠進行舌下抽血，且針對成功人類化，藉由流式細胞術分析血液。經有效移植之小鼠根據其人類T細胞頻率隨機分成不同處理組。此時，如所述(圖 50 )向小鼠皮下注射腫瘤細胞，且當腫瘤尺寸達到約150 mm3 (第18天)時，用化合物或組胺酸緩衝液(媒劑)處理。所有小鼠靜脈內注射200 µl適當溶液。為獲得每200 µl適當量之化合物，必需時用組胺酸緩衝液稀釋儲備溶液(表44)。表 44 ：活體內實驗使用的組合物
化合物 調配緩衝液 濃度 (mg/mL)
CD19-CD28 (變異體15) 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 5.63 (= 儲備溶液)
CD19-CD28 (變異體8) 20mM組胺酸， 140mM NaCl， pH6.0 3.53 (= 儲備溶液)
使用測徑規每週量測腫瘤生長兩次，且如下計算腫瘤體積： Tv：(W2 /2) x L           (W：寬度，L：長度)
研究在第53天終止。圖 51A 展示腫瘤生長動力學(平均值，+SEM)且圖 51B 至圖 51D 展示每組小鼠的個別腫瘤生長動力學。如本文所述，CD19-CD28變異體8作為單一藥劑誘導的腫瘤生長抑制比CD19-CD28變異體15更強。媒劑動物由於皮下腫瘤細胞注射後形成轉移而須較早處死。對人類化小鼠的單一治療效應可以根據同種異體反應性人類T細胞的增強來解釋，其作為新抗原識別的替代物可以在小鼠系統中發現。 ***參考文獻： Acuto, O., and Michel, F. (2003). CD28-mediated co-stimulation：a quantitative support for TCR signalling. Nat Rev Immunol 3, 939-951. Atamaniuk, J., Gleiss A., Porpazcy E., Kainz B., Grunt T.W., Raderer M., Hilgarth B., Drach J., Ludwig H., Gisslinger H., Jaeger U., Gaiger A. (2012). Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest. 42(9), 953-60. Bahlis N.J., King A.M., Kolonias D. Carlson L.M., Liu H.Y., Hussein M.A., Terebelo H.R., Byrne G.E. Jr, Levine B.L., Boise L.H., Lee K.P. (2007). CD28-mediated regulation of multiple myeloma cell proliferation and survival. Blood 109 (11), 5002-5010. Boomer, J.S., and Green, J.M. (2010). An enigmatic tail of CD28 signaling. 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圖 1A 至圖 1L 中展示所述分子之示意性說明。圖 1A 展示CD28促效抗體CD28(SA)的huIgG4同功異型物(TGN1412)。圖 1B 說明作為hu IgG1 PGLALA同型(「Fc靜默」)的CD28(SA)促效抗體。圖 1C 、圖 1D 、圖 1E 及圖 1F 中 分別展示雙特異性FAP-CD28抗原結合分子的1+1形式、1+2形式、2+2形式及1+4形式。圖 1G 、圖 1H 及圖 1J 中分別展示雙特異性CEA-CD28抗原結合分子的1+2形式、2+2形式及1+1形式。圖 1I 展示作為單價hu IgG1 PGLALA同型(「Fc靜默」)之CD28促效抗體變異體的示意性說明。圖 1K 展示雙特異性FAP-CD28抗原結合分子的1+1形式，其中FAP抗原結合域展示為各自與Fc域亞單元之一個C端融合的VH及VL域。圖 1L 說明雙特異性FAP-CD28抗原結合分子的2+1形式，其中CD28抗原結合域展示為互換Fab，該互換Fab在其C端與「二價」FAP抗體之一條重鏈的N端融合。圖 1M 展示另一種雙特異性FAP-CD28抗原結合分子的1+1形式，其中CD28抗原結合域展示為互換Fab，該互換Fab在其C端與結合至FAP之Fab片段的N端融合。圖 1N 說明三特異性FAP-CEA-CD28抗原結合分子的1+1+1形式，其中CD28抗原結合域展示為Fab，該Fab在輕鏈與重鏈的C端與huIgG1 PG-LALA Fc杵鏈上之抗FAP抗原結合域之輕鏈與重鏈的N端融合，且其中抗CEA互換Fab片段為huIgG1 PG-LALA Fc臼鏈的一部分。圖 2A 、圖 2B 、圖 2C 、圖 2D 及圖 2E 係關於CD28促效抗體及FAP-CD28抗原結合分子對細胞上之人類CD28或人類FAP的結合。圖 2A 中展示CD28(SA)之IgG4同功異型物相對於hu IgG1 PGLALA同型對人類CD28的結合及不同FAP-CD28分子對細胞上之人類CD28 (圖 2B ）及人類FAP (圖 2C )的結合。藉由流式細胞術評估不同CD28促效抗體或抗DP47靶向分子結合至表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)或表現人類FAP之3T3細胞(NIH/3T3細胞株(ATCC CRL-1658))的中值螢光強度。所描繪為技術性三重複與SEM。圖 2D (結合至人類CD28)及圖 2E (結合至人類FAP)中展示FAP(4B9)-CD28(SA)抗原結合分子(分子D、E及F，如實例1中所述)的比較。圖 2F 及2G 分別展示單價結合至CD28及FAP之FAP-CD28抗原結合分子之不同形式的結合。圖示為FAP-CD28 CTF 1+1 (P1AE2236，分子I)、FAP-CD28 1+1 (P1AD4492，分子C)、FAP-CD28 H2T 1+1 (P1AE2021，分子H)及作為參考物之兩種化合物FAP-CD28(SA) 1+2 (P1AD9011，分子E)及DP47的曲線。圖示為FAP-CD28抗體或抗DP47抗體(陰性對照)結合至表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)(圖 2F ) 或表現人類FAP之3T3細胞(NIH/3T3細胞株(ATCC CRL-1658))(圖 2G )的中值螢光強度,如藉由流式細胞術所評估。所示為技術性三重複與SEM。圖 2H 及圖 2I 分別展示FAP-CD28 2+1 (P1AE5231，分子G)對CD28及FAP的結合。 CD28(SA)及其變異體之可變域比對展示於圖 3A 至圖 3D 中。圖 3A 及圖 3B 中展示CD28(SA)VH域及其變異體之比對，以便移除半胱胺酸50且以不同程度減少所得抗CD28結合子的親和力。值得注意的是，在VH變異體i及j中，CD28(SA)之CDR自IGHV1-2構架移植至IGHV3-23構架中(圖 3B )。圖 3C 及3D 中展示CD28(SA) VL域及其變異體之比對，以便以不同程度減少所得抗CD28結合子的親和力。在變異體t中，CDR被移植至曲妥珠單抗(trastuzumab)(赫賽汀(Herceptin)) VL序列之構架序列中。圖 4A 至圖 4C 中展示來自上清液之親和力減少之CD28促效抗體變異體之單特異性單價IgG形式對細胞上之人類CD28的結合。藉由流式細胞術評估結合至表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)的中值螢光強度與陰性對照(抗DP47)及原始TGN1412的比較。圖 4A 中展示變異體1至10之結合曲線，圖 4B 中展示變異體11至22之結合曲線且圖 4C 中展示變異體23至31之結合曲線。所描繪為技術性三重複與SD。圖 4D 及圖 4E 中展示靶向FAP之雙特異性CD28促效抗體變異體與親和力減少之所選CD28促效抗體變異體的huIgG1 PG-LALA 1+1形式對細胞上之人類CD28的結合。圖 4D 中展示具有變異體8、11、12、15、16及17之雙特異性1+1構築體的結合曲線，而圖 4E 中展示具有變異體19、23、25、27及29之雙特異性1+1構築體的結合曲線。基於親和力來選擇所選結合子，以便產生靶向FAP之1+1雙特異性形式。圖 4F 及圖 4G 中展示靶向FAP之相同雙特異性CD28促效抗體變異體之huIgG1 PG-LALA 1+1形式對人類FAP的結合。提供結合至表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)或結合至表現人類FAP之3T3細胞(ATCC CRL-1658))的中值螢光強度與陰性對照(抗DP47)及TGN1412 (分子A)的比較，如藉由流式細胞術所評估。所示為技術性三重複與SEM。 靶向FAP之所選雙特異性CD28促效抗體變異體之huIgG1 PG-LALA 1+1形式的活體外效能說明於圖 4H 、圖 4I 及圖 4J 中。將PBMC T細胞與表現MCSP及表現FAP之MV3黑色素瘤細胞一起在限定濃度的MCSP-TCB (5 pM，P1AD2189)及濃度增加的具有指定CD28變異體結合子之FAP-CD28構築體存在下培育5天。圖 4H 中展示CFSE稀釋度為CD8 T細胞之T細胞增殖的量度，如藉由流式細胞術所評估。誤差條展示SEM，各圖描繪2位供者之代表性結果的技術性三重複。圖 4I 中以親本TGN1412純系(CD28 (SA))的%展示CD28結合子變異體之KD (nM)與效能((a)之曲線下面積)的相關度。圖 4J 中展示90h時的目標細胞殺滅。圖 5A 至圖 5D 提及高密度(HD)預培養物的建立及CD28(SA)的作用模式。PBMC T細胞以高密度(HD)預培養2天，或以PBMC分離的新鮮T細胞使用且用濃度增加的CD28(SA)刺激。所描繪為CFSE稀釋度，其表示CD28(SA)(分子A，P1AE1975)刺激5天後之T細胞增殖(圖 5A )及刺激2天後之細胞介素分泌(圖 5B )。圖 5C 展示2天HD PBMC預培養之前及之後之PBMC單核球及B細胞中之FcγRIIb表現的百分比，如藉由流式細胞術所評估。圖 5D ：HD預培養的PBMC與CD28(SA)一起在FcγRIIb阻斷抗體或同型對照物存在或不存在下共培養5天且藉由流式細胞術評估CD4 T細胞之CFSE稀釋百分比。圖形代表至少6位供者(圖 5A 、圖 5B )及2位供者(圖 5C 、圖 5D )，各自在獨立實驗中評估。圖形展示技術性三重複。誤差條指示SEM。藉由斯圖登氏t檢驗(student's t-test)進行統計分析。***：p＜0.001。CD28(SA)IgG4的超促效作用依賴於與FcγRIIb的交聯。圖 6A 及圖 6B 中展示原始Fc野生型IgG4 CD28(SA)(P1AE1975 )或具有P329G-LALA突變之CD28(SA)(P1AD9289 )刺激5天之後的T細胞增殖，亦即CD4 T細胞之CFSE稀釋度。T細胞以高密度預培養2天。圖形代表至少3個獨立實驗。展示技術性三重複。Fc靜默使TGN1412的超促效作用消除。將靶向腫瘤的部分添加至Fc靜默的TGN1412中使超促效作用恢復，該超促效作用接著視腫瘤目標的存在而定。圖 7A 、圖 7B 、圖 7C 及圖 7D 中展示不同形式(2+2及1+2)及具有超促效(CD28(SA))結合子及習知促效結合子(9.3，CD28(CA))之靶向FAP之CD28促效劑的比較。具有習知CD28促效結合子之靶向FAP的CD28促效劑不起超促效劑的作用。PBMC T細胞與3T3-huFAP細胞(存在FAP)一起在濃度增加之FAP-CD28形式存在下共培養5天，該等形式具有超促效結合子(SA，圖 7A )或習知促效結合子(9.3，圖 7B )。所示為T細胞增殖。PBMC T細胞接著亦與3T3 WT細胞(缺乏FAP)一起在濃度增加的FAP-CD28形式存在下共培養5天，該等形式具有超促效結合子(SA，圖 7C )或習知促效結合子(9.3，圖 7D )。所描繪為CFSE稀釋度，其為CD8 T細胞之T細胞增殖量度，如藉由流式細胞術在刺激後的第5天所評估。圖形展示3位供者在3次獨立實驗中的累積資料。誤差條展示SEM。在相同的實驗配置中，在共培養2天之後，亦量測上清液中的細胞介素。數值提供於圖 7E 中。 使用IncuCyte技術，藉由活細胞成像來評估FAP-CD28之各種形式在90小時過程中誘導殺滅表現FAP之RFP-MV3黑色素瘤細胞的能力，該等形式具有超促效CD28(SA)結合子或習知促效結合子(CD28(CA))。所有分子，包括FAP-TCB (P1AD4645)，均在10 nM下使用。圖 8A 、圖 8B 及圖 8C 分別展示三位供者之技術性三重複的代表性結果。圖 8D 展示3位供者在3次獨立實驗中的累積結果，以t=90h時的曲線下面積(AUC)表示。方框顯示百分之25至百分之75，晶鬚顯示最小值至最大值。藉由成對單因子變異數分析(paired 1-way ANOVA)進行統計分析。***：p＜0.001，ns：不顯著。圖 9A 及圖 9B 中展示具有超促效結合子及習知促效結合子之不同形式之靶向CEA之CD28促效劑的比較。使用IncuCyte技術，藉由活細胞成像來評估CEA-CD28之各種形式在90小時過程中誘導殺滅表現CEA之RFP+ MKN45胃癌細胞的能力，該等形式具有超促效CD28(SA)結合子或習知促效結合子(CD28(CA))。所有分子，包括CEACAM5-TCB (P1AD5299)，均在10 nM下使用。圖 9A 展示一位供者之技術性三重複的代表性結果。圖 9B 展示1位供者在1次實驗中之技術性三重複的統計分析，以t=90h時之曲線下面積(AUC)表示。方框顯示百分之25至百分之75，晶鬚顯示最小值至最大值。藉由成對單因子變異數分析進行統計分析。***：p＜0.001。已展示具有習知CD28促效結合子之靶向CEA的CD28促效劑不以超促效方式起作用。圖 10A 、圖 10B 及圖 10C 中展示具有單價超促效結合子之靶向CD28促效劑在功能上不具有超促效性。將PBMC T細胞與3T3-huFAP細胞一起在濃度增加的具有二價CD28結合子之FAP-CD28 (P1AD9011，實心圓)或對於CD28結合而言為單價之FAP-CD28 (P1AD4492，空心圓)存在下共培養5天。圖 10A 中展示CD8 T細胞之CFSE稀釋度。另外，藉由流式細胞術偵測活化標記物CD69 (圖 10B )及CD25 (圖 10C )來評估T細胞活化。所示為刺激後第5天之CD69及CD25染色平均螢光強度(MFI)。所示為來自1位供者的技術性三重複，誤差條指示SEM。已展示TGN1412樣超促效作用需要多價CD28結合。圖 11A 及圖 11B 展示若與T細胞雙特異性抗體(TCB)組合，則靶向FAP之促效CD28抗原結合分子以類似效能發生的單價及二價CD28結合支持TCB介導之效應功能，但需要CD28結合子單價維持CD28促效劑在TCB存在下之腫瘤目標依賴性。在圖 11A 中，FAP存在時，將PBMC T細胞與表現MCSP及表現FAP之MV3黑色素瘤細胞一起分別在組合之限制濃度之MCSP-TCB (5 pM，P1AD2189 )與濃度增加(範圍0-10 nM)之二價或單價結合至CD28之FAP-CD28(SA)存在下培育90小時。所描繪為90h時的目標細胞殺滅，如使用IncuCyte技術藉由活細胞成像所評估。在圖 11B 中，將PBMC T細胞與表現CEA之FAP陰性MKN45胃癌細胞(缺乏FAP)一起分別在組合之限制濃度之CEACAM5-TCB (10 pM，P1AD5299 )與濃度增加(範圍0-10 nM)之二價或單價結合CD28之FAP-CD28存在下共培養90小時。所描繪為90h時的目標細胞殺滅，如藉由IncuCyte所評估。資料展示1位供者在1次實驗(技術性三重複)中之MKN45目標細胞隨時間之殺滅，誤差條指示SEM。圖 12A 及圖 12B 中展示二價結合至CD28之FAP-CD28(SA)當與T細胞雙特異性抗體組合時失去FAP依賴性。圖 12A 中不存在TCB。將PBMC T細胞分別與表現CEA之MKN45及3T3-huFAP (「存在FAP」條件，實心圓)或3T3-WT (「缺乏FAP」條件，空心圓)一起在濃度增加之FAP-CD28(SA) 2+1存在下共培養。與TCB之組合展示於圖 12B 中。將PBMC T細胞分別與表現CEA之MKN45及3T3-huFAP (「存在FAP」條件，實心圓)或3T3-WT (「缺乏FAP」條件，空心圓)一起在限制濃度之CEACAM5-TCB (10 pM，P1AD5299 )及濃度增加之FAP-CD28 2+1 SA存在下共培養。所示為刺激5天之後的CD8 T細胞增殖。資料代表2位供者的2次獨立實驗。所示為一位供者的結果，資料點表示技術性三重複，誤差條指示SEM。圖 13A 、圖 13B 及圖 13C 展示呈不同形式之單價結合至CD28之FAP-CD28(SA)抗原結合分子的功能。分子C為FAP-CD28(SA)經典1+1形式(P1AD4492)，分子H為FAP-CD28(SA) 1+1「頭對尾」(H2T)形式(P1AE2021)，分子I為C端與FAP結合子融合的FAP-CD28(SA) 1+1形式(P1AE2236)，並且分子G為FAP-CD28(SA) 2+1形式(P1AD5231)。作為參考物，使用二價CD28抗原結合分子(P1AD9011)。將PBMC T細胞與表現MCSP及表現FAP之MV3黑色素瘤細胞一起在限制濃度之MCSP-TCB (5 pM，P1AD2189 )及濃度增加(範圍0-10 nM)之FAP-CD28之指定形式存在下培育。所描繪為CFSE稀釋度，其為5天後之CD8 (圖 13A )及CD4 T細胞(圖 13B )之T細胞增殖量度，如藉由流式細胞術所評估。圖 13C ：所示為相較於在5 pM MCSP-TCB與濃度增加之FAP-CD28之多種形式的組合存在下，MV3細胞在單獨5 pM MCSP-TCB存在下在84小時期間的殺滅。使用IncuCyte系統，藉由活細胞成像來評估殺滅。所有分子均能夠支持TCB介導之效應功能。圖形描繪得自3次獨立實驗及4位供者的累積資料，10 pM MCSP-TCB；E:T 20；統計學：雙因子變異數分析。星形指示用量相對於單獨TCB顯著時的最低濃度：*p≤0.05，**p≤0.01；***p≤0.001。誤差條指示SEM。圖 14 中展示CEA-CD28 1+1形式與TCB組合之目標細胞殺滅。將PBMC T細胞與表現CEA之MKN45胃癌細胞一起在限制濃度之CEACAM5-TCB (10 pM，P1AD5299 )與2 nM CEA-CD28 (P1AE3127 )或非目標CD28 (P1AD8944 )之組合存在下共培養90小時。資料展示1位供者之MKN45目標細胞在1次實驗中隨時間的殺滅。使用IncuCyte系統，藉由活細胞成像來評估殺滅。已展示僅該組合在單獨分子不誘導殺滅之指定濃度下引起目標細胞殺滅。CEA-CD28與CEACAM5-TCB協同作用。圖 15 中展示CEA-CD28增強CEA-TCB及CEACAM5-TCB且為TCB降低CEA表現臨限值以誘導T細胞活化。將PBMC T細胞與濃度增加的CEA-TCB (P1AD4646 )或CEACAM5-TCB (P1AD5299 )及固定濃度的CEA-CD28 (P1AE3127 )一起在具有不同CEA表現量之以下目標細胞株存在下培育：(i) MKN45(高度表現，約400 000個CEA結合位點/細胞)；(ii) Lovo (中度表現，約60 000個CEA結合位點/細胞)；(iii) HT-29 (低度表現，約6 000個CEA結合位點/細胞)。藉由流式細胞術評估表示T細胞活化的T細胞增殖。圖 16 中展示親和力減少之所選CD28結合子變異體之靶向CEA之雙特異性單價1+1形式對細胞上之CD28的結合。藉由流式細胞術評估CEA-CD28抗體或抗DP47抗體(陰性對照)結合至表現人類CD28之CHO細胞(親本細胞株CHO-k1 ATCC #CCL-61，其經修飾以穩定地過度表現人類CD28)的中值螢光強度。所示為技術性三重複與SEM。圖 17A 、圖 17B 及圖 17C 展示親和力減少之所選CD28結合子變異體之靶向CEA之雙特異性單價1+1形式的功能。將PBMC T細胞與表現CEA之MKN45胃癌細胞一起在限制濃度之CEACAM5-TCB (10 pM，P1AD5299 )與2 nM具有CD28結合子變異體之CEA-CD28 1+1分子之組合存在下共培養。共培養5天之後，藉由流式細胞術、根據CFSE稀釋度評估CD8 T細胞增殖(圖 17A )及CD4 T細胞增殖(圖 17B )。培育90小時之後，評估目標細胞殺滅(圖 17C )。資料展示1位供者之MKN45目標細胞在1次實驗中隨時間的殺滅。所有分子均能夠支持CEACAM5-TCB介導之效應功能。圖 18 展示相較於親本鼠類A5B7抗體的結合，人類化CEA(A5B7) huIgG1 P329G LALA變異體對MKN-45的結合。用螢光標記之二級抗體偵測抗體且藉由流式細胞術量測螢光。圖 19A 至圖 19C 為重組蛋白的示意性說明，其顯示在噬菌體呈現活動中用作抗原的CEACAM5蛋白質之不同域。圖 19A 展示由4個Ig樣域N、A1、B及A2組成的構築體NABA-avi-His。圖 19B 展示構築體N(A2B2)A-avi-His且圖 19C 說明構築體NA(B2)A-avi-His。圖 20A 及圖 20B 分別展示人類化CEA抗體A5H1EL1D的VH及VL序列，其中隨機化位置用X標記。圖 21A (CDRH1/H2親和力成熟文庫)、圖 21B (CDRL1/H2親和力成熟文庫) 及圖 21C (CDRH3/CDRL3擴增文庫)中展示親和力成熟文庫之噬菌體載體的示意圖。圖 22A 及圖 22B 展示親和力成熟之人類化CEA(A5H1EL1D)抗體變異體之胺基酸序列(圖 22A )及VL胺基酸序列(圖 22B )的比對。圖 23A 至圖 23D 展示如實例11中所述之雙特異性CEA/CD28抗原結合分子的示意性說明。圖 23A 展示雙特異性CEA-CD28抗原結合分子的1+1形式，其中CEA抗原結合域展示為互換Fab (VH/VL交換)且具有CD28抗原結合域的Fab片段中存在帶電修飾以便支持輕鏈正確成對。Fc域具有臼包杵式修飾及P329G LALA突變以消除對Fcγ受體的結合。在圖 23B 中，CD28抗原結合域展示為互換Fab (VH/VL交換)且具有CEA抗原結合域的Fab片段包含帶電修飾。圖 23C 說明雙特異性CEA-CD28抗原結合分子之2+1形式，其中CD28抗原結合域展示為互換Fab且具有CEA抗原結合域的兩個Fab片段彼此間經由重鏈融合(頭對尾)。圖 23D 說明雙特異性CEA-CD28抗原結合分子的2+1形式，其中CD28抗原結合域展示為互換Fab，該互換Fab在其C端與「二價」CEA抗體(「經典」形式)之一條重鏈的N端融合。圖 24 中展示親和力成熟的抗CEA純系P002.139對表現CEA之MV3細胞上的CEACAM5展示改良的結合。所示為攜有親和力成熟抗CEA純系P002.139或親本A5H1EL1D純系之CEA-CD28雙特異性抗體的結合。藉由流式細胞術評估CEA-CD28雙特異性抗體或抗DP47抗體(陰性對照)結合至經基因工程改造以表現人類CEACAM5之MV3細胞的中值螢光強度。所示為技術性雙重複與SEM。圖形代表3次獨立實驗。圖 25A 及圖 25B 中展示親和力成熟抗CEA純系P002.139在IL-2報導體分析中展示改良之功能。所示為MKN45細胞、IL-2報導體細胞與攜有親和力成熟純系P002.139或親本純系A5H1EL1D之5 nM CEA-TCB及CEA-CD28共培育6小時之後的發光讀數。圖 25A 展示劑量反應。虛線指示單獨CEA-TCB所達成的發光。圖 25B 中展示曲線下面積值，其利用圖 25A 中所描繪之資料計算。所示為技術性雙重複與SEM。圖形代表3次獨立實驗。圖 26 展示雙特異性CEA-CD28抗體(不同CEA純系之比較)與CEA TCB之組合在人類化小鼠中針對MKN45異種移植物之功效研究的研究設計。所示為設計及不同處理組。圖 27A 至圖 27E 展示CEA-CD28與CEA TCB組合在人類化小鼠中針對MKN45異種移植物之功效研究的結果。所示為四個處理組的平均腫瘤體積(圖 27A )或如y軸上所繪製之個別小鼠的腫瘤生長(圖 27B 至圖 27E )。圖 27B 展示媒劑組之每個個別小鼠的腫瘤生長，圖 27C 展示經單獨CEA TCB處理之小鼠的腫瘤生長，圖 27D 展示經CEA TCB及CEA(T84.66)-CD28 (SA_變異體15)處理之小鼠的腫瘤生長，且圖 27E 展示經CEA TCB及CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體15)處理之小鼠的腫瘤生長。可以發現，在兩種雙特異性CEA-CD28抗體存在下，TCB介導之腫瘤消退增強。圖 28 展示雙特異性CEA-CD28抗體(不同CD28純系之比較)與CEACAM5 TCB之組合在人類化小鼠中針對BXPC3異種移植物之功效研究的研究設計。所示為設計及不同處理組。圖 29 展示所有處理組的腫瘤生長動力學(平均值，+SEM)，各處理組的相應TGI值展示於表33 (實例13.2)中。圖 30A 至圖 30D 中展示離體免疫PD資料。圖 30A 展示各處理組之經染色之腫瘤單一細胞懸浮液的代表性點陣圖(CD3相對於CD45及CD4相對於CD8)。圖 30B (CD3)、圖 30C ( CD8)及圖 30D (CD4)中分別描繪CD3、CD8及CD4 T細胞浸潤概況。圖 31 展示雙特異性CEA-CD28抗體(CEA(A5H1EL1D)-CD28 (SA_變異體8))與CEA TCB之組合在人類化小鼠中針對MKN45異種移植物之功效研究的研究設計。所示為設計及不同處理組。圖 32 展示所有處理組的腫瘤生長動力學(平均值，+SEM)，各處理組的相應TGI值展示於表35 (實例13.3)中。圖 33A 及圖 33B 中展示離體免疫PD資料。圖 33A 展示各處理組之經染色之腫瘤單一細胞懸浮液的代表性點陣圖。圖 33B 中描繪CD3+ T細胞浸潤概況。圖 34A 至圖 34D 展示如實例14中所述之雙特異性CD28抗原結合分子的示意性說明。圖 34A 展示雙特異性EpCAM-CD28抗原結合分子的1+1形式，其中CD28抗原結合域展示為互換Fab (VH/VL交換)且具有EpCAM抗原結合域的Fab片段中存在帶電修飾以便支持輕鏈正確成對。Fc域具有臼包杵式修飾及P329G LALA突變以消除對Fcγ受體的結合。 在圖 34B 中，具有CD28抗原結合域的Fab包含帶電修飾且具有HER3抗原結合域的Fab展示為互換Fab (VH/VL交換)。圖 34C 說明雙特異性CD30-CD28抗原結合分子的1+1形式，其中具有CD28抗原結合域的Fab分子包含帶電修飾且具有CD30抗原結合域的Fab展示為互換Fab (VH/VL交換)。圖 34D 說明雙特異性TPBG-CD28抗原結合分子的1+1形式，其中具有CD28抗原結合域的Fab分子包含帶電修飾且具有TPBG (5T4)抗原結合域的Fab展示為互換Fab (VH/VL交換)。圖 35A 至圖 35C 係關於EpCAM-CD28雙特異性抗原結合分子之功能特徵。圖 35A 中展示EpCAM-CD28 (分子14A)結合至表現CD28之CHO-k1細胞上的人類CD28，如流式細胞術所評估。流式細胞術所評估之對HT29細胞上之EpCAM的結合展示於圖 35B 中。抗DP47充當抗體化合物非特異性結合至細胞的陰性對照。點表示技術性雙重複平均值。圖 35C 中展示EpCAM-CD28 (P1AE9051)在IL-2報導體分析中增強針對抗CD3刺激物的T細胞反應。所示為在次最佳濃度之抗CD3 IgG (10 nM)及濃度增加之EpCAM-CD28存在下與HT-29共培育6小時之後，根據發光讀數所量測的IL-2報導體細胞活化。點表示技術性雙重複平均值。圖 36A 至圖 36C 係關於HER3-CD28雙特異性抗原結合分子的功能特徵。圖 36A 中展示HER3-CD28 (P1AF0151)結合至表現CD28之CHO-k1細胞上的人類CD28，如流式細胞術所評估。流式細胞術所評估之HER3-CD28對T-47D細胞上之HER3的結合展示於圖 36B 中。抗DP47充當抗體化合物非特異性結合至細胞的陰性對照。點為技術性雙重複平均值。圖36C 中展示HER3-CD28 (P1AF0151)在IL-2報導體分析中增強針對抗CD3刺激物的T細胞反應。所示為在次最佳濃度之抗CD3 IgG純系OKT3 (10 nM)及濃度增加之HER3-CD28存在下與T-47D細胞共培育6小時之後，根據發光讀數所量測的IL-2報導體細胞活化。點表示技術性雙重複平均值。圖 37A 至圖 37C 中展示如實例16中所述之靶向多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原之雙特異性CD28抗原結合分子的示意性說明。圖 37A 展示雙特異性GPRC5D-CD28抗原結合分子的1+1形式，其中CD28抗原結合域展示為互換Fab (VH/VL交換)且具有CPRC5D抗原結合域的Fab片段中存在帶電修飾以便支持輕鏈正確成對。Fc域具有臼包杵式修飾及P329G LALA突變以消除對Fcγ受體的結合。 在圖 37B 中，具有CD28抗原結合域的Fab包含帶電修飾且具有CD38抗原結合域的Fab展示為互換Fab (VH/VL交換)。圖 37C 說明雙特異性BCMA-CD28抗原結合分子的1+1形式，其中具有CD28抗原結合域的Fab分子展示為互換Fab (VH/VL交換)且具有BCMA抗原結合域的Fab包含帶電修飾。圖 37D 說明抗GPRC5D/抗CD3雙特異性抗體(GPRC5D TCB)的2+1形式，其中具有GPCR5D抗原結合域的Fab分子包含帶電修飾且具有CD3抗原結合域的Fab展示為互換Fab (VH/VL交換)。圖 38A 至圖 38F 係關於靶向CD28及多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原之雙特異性抗原結合分子對細胞的結合(實例17.1)。所示為雙特異性抗原結合分子對CHO huCD28 cl45細胞上之人類CD28 (圖 38A 及圖 38E )、OCI-Ly18細胞上之人類CD38 (圖 38B )、IM-9細胞上之人類BCMA (B細胞成熟抗原，圖 38C )及CHO huGPRC5D L2細胞上之人類GPRC5D (圖 38D 及圖 38F )(指定細胞株上所表現)的結合。所描繪為雙重複的相對中值螢光值(MFI)與SD。藉由GraphPadPrism計算結合的EC50 值且該等值包括於表38中。圖 39A 至圖 39F 中展示如IL-2報導體分析中所評估之靶向CD28及多發性骨髓瘤(MM)細胞表面抗原之雙特異性抗原結合分子的T細胞活化。所示為培育5小時及22小時之後的IL2報導體細胞分析，如根據發光所測定。IL2報導體效應子與表現GPRC5D之目標細胞以5:1之效應子:目標比率(E:T)培育。以固定的最終分析濃度1 nM添加GPRC5D-TCB，如所示滴定指定的靶向MM之CD28雙特異性抗原結合分子。CD38-CD28的代表性劑量反應曲線描繪於圖 39A (培育5小時之後)及圖 39B (22小時之後)中，BCMA-CD28的代表性劑量反應曲線描繪於圖 39C (5小時之後)及圖 39D (22小時之後)中，且GPRC5D-CD28的代表性劑量反應曲線描繪於圖 39E (5小時之後)及圖 39F (培育22小時之後)中。圖 40A 至圖 40C 展示在0.2 nM指定CD28雙特異性分子CD38-CD28 (圖 40A )、BCMA-CD28 (圖 40B )及GPRC5D-CD28 (圖 40C )存在下，T細胞介導表現GPRC5D之MM細胞株NCI-H929溶解增強。人類泛T細胞與MM腫瘤目標細胞以1:1之最終E:T比率共培育22小時之後，測定溶解。所描繪為技術性三重複與SD。藉由GraphPadPrism計算EC50值及腫瘤細胞溶解曲線下面積值且該等值描繪於表39中。圖 41A 展示如實例18中所述之雙特異性CD19-CD28抗原結合分子之1+1形式的示意性說明，其中在包含CD19抗原結合域的Fab中，VH與VL域彼此間交換(VH/VL互換fab)且其中在包含CD28抗原結合域的Fab中，CH1及CL域中的某些胺基酸交換(電荷變異體)以便與輕鏈更好地成對。圖 41B 展示其中CD19抗原結合域已經CD79b抗原結合域置換的相應分子(抗CD79b互換fab)。圖 42 係關於構築體CD79b (huMA79b.v28) - CD28 (v15) 1+1中之CD79b (帕妥珠單抗)之動力學及熱力學參數的測定。可溶性重組CD79b-His經由抗五His抗體捕捉於CM5晶片上且雙特異性CD79b (huMA79b.v28) - CD28 (v15) 1+1用作分析物。平滑線表示資料相對於1:1相互作用模式的全面擬合。圖 43A 中展示CD19-CD28變異體15 (P1AE9040)結合至以不同量表現CD19之四種不同B細胞株的中值螢光強度(MFI)。藉由流式細胞術評估結合。所示為技術性雙重複與SEM。圖 43B 中描繪針對四種不同B細胞株之CD19的FACS染色(MFI)。圖 44A 及圖 44B 中展示CD19-CD28以不同CD28親和力對細胞上之人類CD19及CD28的結合。所示為結合至CHOk1-CD28細胞(圖 44A )及結合至Nalm6 B細胞上之CD19 (圖 44B )的中值螢光強度(MFI)。點表示技術性雙重複與SEM。相應EC50 值展示於實例20之表42 (CHOk1-CD28)及表43 (Nalm6)中。藉由流式細胞術評估結合。圖 45A 至圖 45D 中展示CD19-CD28v15在IL-2報導體分析中，在不同B細胞株存在下增強CD20-TCB。所示為在次最佳濃度之CD20-TCB及濃度增加之CD19-CD28v15存在下與不同B細胞株共培育6小時之後，根據發光讀數(LUM)量測的IL-2報導體細胞活化。點表示技術性雙重複與SEM。次最佳的CD20-TCB濃度隨目標細胞株而異：對於Nalm6而言，為10 nM；對於RCK8、WSU DLCL2及Z138而言，為0.05 nM。圖 46 說明具有不同CD28親和力的CD19-CD28增強CD20-TCB介導的T細胞活化。所示為在次最佳濃度之CD20-TCB (10 nM)及濃度增加之CD19-CD28v15存在下與Nalm6 B細胞共培育6小時之後，根據發光讀數(LUM)所量測的IL-2報導體細胞活化。點表示技術性雙重複與SEM。 評估PBMC源T細胞在CD20-TCB不存在或存在下與表現CD20之目標細胞(Nalm6)(E:T比率5:1)及CD19-CD28共培養之後的活化狀態。圖 47 中展示CD19-CD28在TCR信號不存在或存在下的活性。所示為PBMC源CD4 T細胞在10 nM CD20-TCB存在或不存在下與Nalm6細胞、濃度增加之CD19-CD28v15共培育48小時之後的CD69表現。點表示技術性雙重複與SEM。圖 48A 至圖 48D 中說明單獨的CD19-CD28不誘導PBMC分泌細胞介素。所示為在CD20-TCB存在或不存在下與CD19-CD28分子共培養48小時之後，完整PBMC的細胞介素釋放。條形圖表示技術性三重複的平均值+SEM。資料代表2位供者。藉由Bio-Plex Pro人類細胞介素17-plex分析來評估細胞介素分泌。所示為IFNγ (圖 48A )、IL-2 (圖 48B )、IL-10 (圖 48C )及TNF (圖 48D )。圖 49A 及圖 49B 中展示的功能資料提及CD79b-CD28在IL-2報導體分析中、在Z138 B細胞存在下增強CD20-TCB。圖 49A 中展示結合至Z138 B細胞上之CD79b的中值螢光強度(MFI)。圖 49B 中展示CD79b-CD28在IL-2報導體分析中、在Z138 B細胞存在下增強CD20-TCB。所示為在次最佳濃度之CD20-TCB及濃度增加之CD79b-CD28存在下與不同B細胞株共培育6小時之後，根據發光讀數(LUM)量測的IL-2報導體細胞活化。點表示技術性雙重複與SEM。圖 50 展示雙特異性CD19-CD28抗體(兩種不同CD28純系之比較)在人類化小鼠中針對NALM6異種移植物之功效研究的研究設計。所示為設計及不同處理組。圖 51A 至圖 51D 展示CD19-CD28在人類化小鼠中針對NALM6異種移植物之功效研究的結果。所示為三個處理組之平均腫瘤體積(圖 51A )或如y軸上所繪製之個別小鼠之腫瘤生長(圖 51B 至圖 51D )。圖 51B 展示媒劑組中之每隻個別小鼠的腫瘤生長，圖 51C 展示經CD19-CD28 (變異體15)處理之小鼠的腫瘤生長，且圖 51D 展示經CD19-CD28 (變異體8)處理之小鼠的腫瘤生長。可以發現，CD19-CD28 (變異體8)作為單一藥劑誘導的腫瘤生長抑制比CD19-CD28 (變異體15)更強。
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Claims (15)

  1. 一種以單價結合至CD28為特徵的雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含(a)一個能夠特異性結合至CD28的Fab片段，該Fab片段包含：(i)包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD28)及包含SEQ ID NO：54之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD28)，或(ii)包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD28)及包含SEQ ID NO：53之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD28)，或(iii)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD28)及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD28)，(b)一個能夠特異性結合至CD19的互換Fab(crossFab)片段，該互換Fab片段包含：(i)包含SEQ ID NO：412之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD19)及包含SEQ ID NO：413之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD19)；或(ii)包含SEQ ID NO：420之胺基酸序列的重鏈可變區(VHCD19)及包含SEQ ID NO：421之胺基酸序列的輕鏈可變區(VLCD19)及(c)由能夠穩定結合(association)的第一及第二亞單元構成的Fc域，該Fc域包含一或多個使該抗原結合分子對Fc受體之結合親和力及/或效應功能減少的胺基酸取代，其中該Fc域屬於人類IgG1亞類且包含胺基酸突 變L234A、L235A及P329G(根據Kabat EU索引編號)。
  2. 如請求項1之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含：包含SEQ ID NO：122之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO：114之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO：430之胺基酸序列的第二重鏈以及包含SEQ ID NO：431之胺基酸序列的第二輕鏈。
  3. 如請求項1之雙特異性促效CD28抗原結合分子，其包含：包含SEQ ID NO：121之胺基酸序列的第一輕鏈、包含SEQ ID NO：116之胺基酸序列的第一重鏈、包含SEQ ID NO：430之胺基酸序列的第二重鏈以及包含SEQ ID NO：431之胺基酸序列的第二輕鏈。
  4. 一種經分離的聚核苷酸，其編碼如請求項1至3中任一項之雙特異性促效CD28抗原結合分子。
  5. 一種載體，特定言之，表現載體，其包含如請求項4之聚核苷酸。
  6. 一種宿主細胞，其包含如請求項4之聚核苷酸或如請求項5之載體。
  7. 一種產生雙特異性促效CD28抗原結合分子的方法，其包含以下步驟：a)在適用於表現該雙特異性促效CD28抗原結合分子之條件下培養如請求項6之宿主細胞，及b)視情況回收該雙特異性促效CD28抗原結合分子。
  8. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至3中任一項之雙特異性促效CD28抗原結合分子及至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
  9. 如請求項8之醫藥組合物，其用於治療癌症。
  10. 一種如請求項1至3中任一項之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如請求項8之醫藥組合物的用途，其用於製造供增強(a)T細胞活化或(b)T細胞效應功能用的藥劑。
  11. 一種如請求項1至3中任一項之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如請求項8之醫藥組合物的用途，其用於製造供治療癌症用的藥劑。
  12. 一種如請求項1至3中任一項之雙特異性促效CD28抗原結合分子或如請求項8之醫藥組合物的用途，其用於製造供抑制個體中之腫瘤細胞生長的藥劑。
  13. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該藥劑進一步包含化學治療劑、輻射療法及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑，或該藥劑與化學治療劑、輻射療法及/或用於癌症免疫療法之其他藥劑組合使用。
  14. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該藥劑進一步包含T細胞活化抗CD3雙特異性抗體，或該藥劑與T細胞活化抗CD3雙特異性抗體組合使用。
  15. 如請求項10至12中任一項之用途，其中該藥劑進一步包含抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體，或該藥劑與抗PD-L1抗體或抗PD-1抗體組合使用。
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