TW201010717A - Coccidiosis vaccines - Google Patents

Description

201010717 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於提供對抗球蟲病之防護作用的疫苗。本發 明亦提供製備該等疫苗之方法及單獨使用該等疫苗或將該 等疫苗與其他保護劑組合使用之方法。 相關申請案之交又參考 本申請案係根據35 U.S.C· § 119(e)主張2008年5月29曰 申請之臨時申請案美國第61/〇57〇〇3號之優先權的非臨時 申請案，該臨時申請案之内容以全文引用的方式併入本文 中。 【先前技術】 球蟲病係一種折磨著全世界畜禽之動物腸道疾病。依賴 於動物生產之行業通常由於球蟲病而面臨著相當大的成 本，包括由患病家畜引起之財政損失，以及用於意在減少 及/或預防該疾病之預防性治療的費用。該等成本尤其與 養禽業有關，其中禽類之集中圈養促使球蟲病之傳播。 球蟲病之病因為專性細胞内孢子蟲綱（sp〇r〇Z〇a)亞綱球 蟲目（Cocci Αα)之成員。此亞綱中對動物生產具有重大影 β之個屬為又美爾球蟲屬（五iwer/a)。正如密切相關之屬 等抱球蟲屬（/ί〇Μ〇Γίΐ)、囊等孢球蟲屬幻及隱 抱子A屬（Cryptosporidium)般，艾美爾球螽屬僅需要單個 佰主來完成其生命週期。於天然條件下，此生命週期以自 環境中攝取孢子化卵囊為開始。 乂美爾球蟲屬為具有複雜單主寄生生命週期之單細胞寄 140536.doc 201010717 生蟲’其展現高度之宿主-種及組織特異性。艾美爾球蟲 屬種包括見於雞體内之彼等種：柔嫩艾美爾球蟲（丑 ie«e//a)、堆型艾美爾球蟲（五.、巨型艾美爾球 蟲（五_ wiznwa)、毒害艾美爾球蟲（£.加caihx)、和緩艾美 爾球蟲（五.miD)、早熟艾美爾球蟲（五.priZeco;c)、變位艾美 爾球蟲（五· wivfliz)及布氏艾美爾球蟲（五· 以及見 於火雞體内之彼等種：火雞和緩艾美爾球蟲（丑 me/eagW/m•沿）、腺型艾美爾球蟲（五、火雞孔 雀艾美爾球蟲（五· 、分散艾美爾球蟲（丑 i/iipersa)、火雞艾美爾球蟲（五.•山））、無害艾美爾 球蟲（五.⑽）及近圓艾美爾球蟲（£. ίΜ&〇ί⑽而）。對於 艾美爾球蟲屬之所有種而言，艾美爾球蟲屬之生命週期的 階段基本上係相同的，不過各個種就發育而言於腸中具有 較佳部位且完成生命週期所需之時間在種與種之間不同。 許多艾美爾球蟲屬種可經由經口途徑、經鼻途徑及/或 藉由傳染性粒子進入淚管中來感染單個宿主。被攝取後， 寄生蟲穿透腸黏膜細胞且經歷生命週期之無性及有性階 段。所引起之腸道損傷最終會導致生長異常（矮小）、飼料 利用性降低、色素沈著受損及死亡率增加。另外，腸壁内 層之損傷使動物易感染其他傳染性病狀，例如受折磨之雞 變得更易患產氣莢膜梭g (C7⑽沾⑽卿加·㈣如）誘發之 壞死性腸炎。 感染以宿主攝取孢子化艾美爾球蟲卵囊開始。接著所攝 取之印囊釋放孢子囊於宿主之腸内。料抱子㈣放子抱 140536.doc 201010717 子’該等子抱子進入腸上皮細胞且接著轉變為滋養體。滋 養體又經歷稱為卵片發育之過程，形成第一代裂殖體。由 於其尺寸相對較Λ，故正是該等裂殖體引起對宿主之感染 的主要病原性作用，亦即組織損傷。 早代裂殖體產生許多裂殖子，其經釋放且接著生長並形 成下一代裂殖體。此無性期在有性期開始之前可持續不定 之數代。當裂殖體形成小配子母細胞及大配子時，該有2 期即開始。該等小配子母細胞隨後發育為小配子，其使該 等大配子受精而產生未孢子化卵囊後代。接著該等未孢子 化卵囊釋放至腸腔中且隨宿主糞便排出。由宿主糞便中出 現未孢子化卵囊所預示之生命週期的完成被稱為顯露態 (patency) ° 當環境條件有利時，卵囊之孢子形成在宿主體外發生。 宿主不可避免地攝取孢子化卵囊，進入下一個感染週期。 自宿主攝取孢子化卵囊至糞便中出現未孢子化卵囊的時間 被稱為潛伏期。該潛伏期在各種艾美爾球蟲屬種之間有所 不同。 反覆暴露於艾美爾球蟲感染之家禽能獲得對抗球蟲病之 免疫力。事實上，視各艾美爾球蟲屬種之免疫原性而定， 每曰用少數孢子化卵囊感染肉雞可在僅僅兩次反覆感染後 使得禽類獲得完全免疫力。因此，目前使用活艾美爾球蟲 疫苗之方案係基於後天免疫力之原理’亦即用少數感染性 卵囊反覆感染。 疫苗接種通常係在孵化場於禽類出生當天藉由直接向禽 140536.doc 201010717 類身上投與活艾美爾球蟲疫苗或經由將該疫苗施加於其 料及/或㈣水巾來進行。如上文所述，料感染性印囊 在禽類腸道内完成其生命週期，視艾美爾 定，於-天内崎放新-代未孢子化㈣而結束。^ 子化印囊隨糞便排出，目而變得具感染性，亦即在外部環 境中形成孢子且經由宿主攝取使禽類再感I在兩個或: 個該等週期後，禽類變得對球蟲病免疫。此免疫力之特徵 在於：（1)用顯微鏡在腸内觀察到寄生蟲減少及/或不存 在；（ii)卵囊之排出減少；（iii)腸道病變減少；（iv)臨床疾 病減少；及/或（v)重量損失減少或得到阻止。在無後續暴 露於感染性卵囊之情況下後天免疫力經3至4個月時段發生 減弱。 野生型又美爾球蟲通常係自家禽群之臨床疾病的暴發中 分離得之且可加以繁殖以用作病原性攻毒菌株。典型非減 毒疫苗係由來自已藉由實驗室繼代而維持之不同艾美爾球 蟲屬種之輕微至中度病原性菌株的感染性卵囊構成。此等 非減毒艾美爾球蟲當以高數目被攝取時能夠引起球蟲病。 疫苗製造者及使用者必須小心地確保疫苗接種提供恰好足 以激發天然伯主體内之免疫力而不引起疾病之感染性卵 囊。在初始劑量後，疫苗接種過程僅依靠經由宿主自褥草 攝取孢子化卵囊來再感染。 減毒疫苗係由病原性降低之感染性卵囊組成。由於病原 性減弱與具有較短潛伏期之間的相關性較強，故許多減毒 菌株亦為早熟菌株。相符地，具有縮短之潛伏期之減毒株 140536.doc 201010717 通常被稱為「早熟株」。 因此，艾美爾球蟲之病原性一定程度的減弱可經由在寄 生蟲於宿主動物體内反覆繼代期間針對卵囊之早期出現進 行選擇來達成。以此方式’已鑑別出潛伏期大大縮短且病 原性大大降低之艾美爾球蟲屬的特定種群。儘管所觀察到 之病原性降低的原因尚未完全瞭解，但通常咸信與至少一 代裂殖體之耗減及/或尺寸減小有關，藉此減少宿主之組 織損傷。 對於非減毒疫苗與減毒疫苗而言皆存在利弊。由非減毒 寄生蟲組成之疫苗的一個優點在於寄生蟲可以較大數目複 製，從而使得卵囊在環境中較快積累，此為禽類之再感染 及後續免疫所必需。另一方面，非減毒艾美爾球蟲在天然 雞之腸道中的複製過程可能會產生導致不良動物福利 (animal welfare)、飼料效率受損及其他有害影響之病變， 包括繼發性感染及炎症。 非減毒疫苗之另一缺點在於必需確保各禽類接受正確的 初始劑量，此係因為相對於禽群，接種物過大將引起嚴重 的腸病變，而接種物過小將會導致免疫過程之起始延遲。 在後者之情況下，接受不足的初始劑量之禽類會由於在初 始潛伏期後由其群同伴所排出之感染性卵囊的數目擴增而 變得易於被攻毒擊倒。實際上，在該（等）後續艾美爾球蟲 攻毒之前缺乏足夠之免疫力可能係在使用活非減毒疫苗時 所經歷之大多數失敗的原因。 減毒疫苗之一個主要優點在於其僅引起輕微的病變。然 I40536.doc 201010717 二減毒疫苗產生比非減毒菌株少之印囊，從而導致感染 玉印囊在環境中積累較慢，使得初始潛伏期後再感染之概 率降低。此又導致完全建立免疫作用所需之時間延長且甚 至可能中斷整個免疫過程。當針對艾美爾球蟲屬種巨型艾 美爾球蟲進行免疫處理時，因為野生型巨型艾美爾球蟲產 生相對較多數目之㈣，所以感染性印囊在環境令之較慢 積累尤其成問題。 因為單一宿主物種可能受多個艾美爾球蟲屬種感染，所 以通常將對抗球蟲病之活疫苗設計成包含來自許多艾美爾 球蟲屬種之印囊。迄今為止，僅存在3類此等活疫苗：、僅 由實驗室培養之印囊組成的非減毒疫苗；僅由減毒印囊组 ^之減毒疫苗；及混合型疫苗’其中來自—些艾美爾球蟲 :種之印囊為非減毒的，且來自其他艾美爾球蟲屬種之印 為減毒的。不幸的是，此等疫苗中無—者可克服上文所 述之缺點。實際上’繁於當前類型之活艾美爾球蟲疫苗中 之每一者的重大缺點以及歸因於艾美爾球蟲感染而由行業 為對付球蟲病所付出之相當大的成本，仍長期需要可較好 地保護家禽以防此類頗費成本之腸道疾病的改良疫苗。 本文中對任何參考讀之引料耗為承認該參考文獻 可作為「先前技術」用於本申請案。 【發明内容】 因此，本發明提供可用於對抗球蟲病之疫苗中的新型免 疫原性組合物。在本發明之一態樣中’提供一種疫苗其 包含孢子蟲球蟲目屬之單一種之至少兩個不同菌株且該 140536.doc 201010717 孢子蟲球蟲目屬之該單—種的至少兩個不同菌株具有相對 於彼此非同步之潛伏期。 在一項實施例中，該疫苗組合物包含球蟲目之某一屬之 某一種的第一菌株以及該同一種之第二菌株，其中該第一 菌株及該第二菌株具有非同步潛伏期。在一項此類實施例 中’該球蟲目屬為等抱球蟲屬。在另_項實施例中，該球 蟲目屬為囊等孢球蟲屬。在又—項實施例中，該球蟲目屬

為隱孢子蟲屬。在-項特定實施例中，該球蟲目屬為艾美 爾球蟲屬。 純供包含球蟲目屬之任何及所有組合的多價疫苗。在 特定實施财，提供包含該等個別喊目屬中之兩者或兩 者以上之兩個或兩個以上菌株的疫苗。在此類型之一項實 施例中’該疫苗包含多個球蟲目屬之菌株對#中該⑷ 求蟲目屬之單一種的多個菌株對具有非同步潛伏期。在一 項特定實施例中，疫苗包含囊等孢球蟲屬之單一種之具有 非同步潛伏期#菌株對及等孢#蟲屬《單一種之具有非同 :潛伏期的菌株對。在另一項實施例中，疫苗中之球蟲目 屬之單一種的所有菌株對均具有非同步潛伏期。 在-項實施例中，疫苗中之孢子蟲球蟲目屬之種的第一 菌株為非減毒菌株且第二菌株為早熟菌株。在此類型之_ 項特疋實施例中，該早熟菌株亦為減毒菌株。 本發明之疫苗可包含處於生命週期之任何階段的抱子 包括其生命週期之-或多個或甚至所有階段的混合 在一項特定實施例中，疫苗中之該等孢子蟲為印囊。 140536.doc -9- 201010717 在另一項實施例甲，孢子蟲為子孢子。在又一項實施例 中，孢子蟲為裂植子。在又-項實施例中，抱子蟲為裂殖 子及/或子孢子及/或卵囊之混合物。 在本發明之一態樣中，提供包含規定比率及/或數量之 球蟲目之某-屬的同-種之非減毒孢子蟲及早熟抱子蟲的 疫苗。因此，在-項特定實施例中，本發明之疫苗包含球 蟲目之某-屬之同-㈣非減毒抱子蟲及早熟抱子蟲，其 中該疫苗中非減毒孢子蟲與早熟抱子蟲之比率為約工個非 減毒孢子蟲比約4個早熟孢子蟲。在此類型之另—項實施 例中，㈤-種之非減毒孢子蟲與早熟？包子蟲之比率為約！ 個非減毒孢子蟲比約2個早熟孢子蟲。在又一項實施例 中，同-種之非減毒孢子蟲與早熟抱子蟲之比率為約⑽ 非減毒孢子蟲比約i個早熟抱子蟲。在又一項實施例中， 同種之非減毒抱子蟲與早熟抱子蟲之比率為約2個非減 毒抱子蟲比約1個早熟抱子蟲。在又-項實施例中，同一 種之非減毒孢子蟲與早熟孢子蟲之比率為約4個非減毒孢 子蟲比約1個早熟孢早蛊。Α α & 、 L忆于蟲在此類型之特定實施例中，非 減毒孢子蟲為非減毒印囊。右呆 s ^ &毋卯襄在另一項實施例中，早熟孢子 蟲為早熟卵囊。在又一瑙疬w香 μ α ^ 項疫田實施例申，非減毒孢子蟲為 非減切囊，且早熟孢子蟲為早”囊。 亦提供包含球蟲目之某一屈 、屬之同一種的菌株之任何及/ 或所有組&及數量之疫苗， 〆寻囷株具有非同步潛伏期。 在此類型之一項特定實施 τ 疫田包含約I 0個至約 1〇〇〇個非減毒印囊。在另一 至約 項實施例中，疫苗包含約25個 I40536.doc 201010717 至約刪個非減切囊。在又一項實施例中疫苗包含約 50個至約250個非減切囊。在又一項實施例中，疫苗包 含約100個至約200個非減毒卵囊。 在此類型之-項相關實施例中，疫苗包含約5〇個至約 00個非減毒㈣。在另—項實施例中疫苗包含約⑽ 個至約1G，G()()個非減切囊。在又—項實施例中，疫苗包 含約250個至約5_個非減㈣囊。在又一項實施例中， 疫苗包含約500個至約3000個非減毒卵囊。在又一項實施 例中，疫苗包含約750個至約2000個非減毒卵囊。 在另一項實施例中，疫苗包含約5〇個至約編g個早熟 及/或減切囊。在另-項實施例中，疫苗包含約⑽個至 約10’_個早熟㈣β在又一項實施例中疫苗包含約 250個至約5000個早熟印囊。在又一項實施例中，疫苗包 含約500個至約3000個早熟卵囊。在又一項實施例中，疫 苗包含約750個至約2000個早熟卵囊。在又一項實施例 中，本發明之疫苗包含約10個至約1〇〇〇個早熟印囊。在另 一項實施例中，疫苗包含約25個至約5〇〇個早熟卵囊。在 又一項實施例中，疫苗包含約50個至約25〇個非減毒/早熟 印囊。在又一項實施例中’疫苗包含約1〇〇個至約2〇〇個早 熟卵囊。在特定實施例中，早熟卵囊為減毒卵囊。 當本發明之疫苗包括特定孢子蟲球蟲目屬（例如艾美爾 球蟲屬）時，可使用任何此類之種。在一項此類實施例 中，疫苗包含可有助於保護雞以防球蟲病之艾美爾球蟲屬 種。在一項此類實施例中，該艾美爾球蟲屬種為柔嫩艾美 140536.doc 201010717 爾球蟲。在另—項實施例中 爾球蟲。在又一項實施例中 爾球蟲。在又一項實施例中 爾球蟲。在又一項實施例中 爾球蟲。在又一項實施例中 爾球蟲。在又一項實施例中 爾球蟲。在一項特定實施例 美爾球蟲。 ，艾美爾球蟲屬種為堆型艾美 ，艾美爾球蟲屬種為毒害艾美 ，又美爾球蟲屬種為變位艾美 ’艾美爾ί求蟲屬種為和緩艾美 又美爾球蟲屬種為早熟艾美 ，艾美爾球蟲屬種為布氏艾美 中，艾美爾球蟲屬種為巨型艾 苗=包：該等艾美爾球蟲屬種之任何及所有組合的疫 β供包含該等個別物種中之兩者或兩者以上 兩個或兩個以上菌株的疫苗。在此類型之_項 該疫苗包含多個艾美爾球蟲屬種之菌株對，其中單―墓 爾球蟲屬種之多個菌株對具有非同步潛伏期。在此類^之 一項特定實施例巾，疫苗中之單—艾美_蟲屬種之 菌株對均具有非同步潛伏期。 在-項特定實施例中，疫苗包含旦型艾美爾球蟲之野生 型及/或非減毒菌株以及巨型艾美爾球蟲之減毒及/或早熟 菌株。在-項此類實施例中，巨型艾美爾球蟲之野生型及 /或非減毒菌株具有見於以名稱COCCIVAC(&出售之疫苗中 之巨型艾美爾球蟲菌株的基本上所有之識別特徵及/或基 本上所有之特性。在此類型之另一項特定實施例中，疫苗 包含具有見於以名稱PARACOX®出售之疫苗中之巨型艾美 爾球蟲菌株的基本上所有之識別特徵及/或基本上所有之 特性的減毒及/或早熟巨型艾美爾球蟲菌株。在又一項實 140536.doc -12· 201010717 施例中’疫苗包含具有見於以名稱CocciVAC®出售之疫 田中之巨型艾美爾球蟲菌株的基本上所有之識別特徵及/ 或基本上所有之特性的野生型及/或非減毒巨型艾美爾球 蟲菌株及具有見於以名稱PARAC〇x®出售之疫苗中之巨型 艾美爾球蟲菌株的基本上所有之識別特徵及/或基本上所 有之特性的減毒、早熟巨型艾美爾球蟲菌株。 本發明之另一疫苗包含一或多個可有助於保護火雞以防 籲 球蟲病之艾美爾球蟲屬種。在一項此類實施例中，該艾美 爾球蟲屬種為火雞和緩艾美爾球蟲。在另一項實施例中， 艾美爾球蟲屬種為腺型艾美爾球蟲。在又一項實施例中， 艾美爾球蟲屬種為火雞孔雀艾美爾球蟲。在又一項實施例 中，艾美爾球蟲屬種為分散艾美爾球蟲。在又一項實施例 中，艾美爾球蟲屬種為火雞艾美爾球蟲。在又一項實施例 中，艾美爾球蟲屬種為無害艾美爾球蟲。在又一項實施例 艾美爾球蟲屬種為近圓艾美爾球蟲^亦提供包含火雞 • $美爾球蟲屬種之任何及所有組合的疫苗。另外，提供包 含該等個別物種中之兩者或兩者以上之兩個或兩個以上菌 株的疫苗。在此類型之一項實施例中，該疫苗包含多個火 難又美爾球蟲屬種之菌株對，其中單一火雞艾美爾球蟲屬 種之多個菌株對具有非同步潛伏期。在此類型之一項特定 實施例中，疫苗中之單一火雞艾美爾球蟲屬種的所有菌株 對均具有非同步潛伏期。 在本發明之另一態樣令’提供包括等孢球蟲屬、囊等孢 球蟲屬及/或隱抱子蟲屬之一或多個種及/或種之-或多個 140536.doc -13· 201010717 菌株的疫苗。在此類型之該等實施例中，等孢球蟲屬、囊 等孢球蟲屬及/或隱孢子蟲屬之種的至少兩個菌株亦具有 非同步潛伏期。另夕卜本發明之艾美爾球蟲疫苗中的任一 者可與該等等孢球蟲、囊等孢球蟲及/或隱孢子蟲疫苗组 合。 、 在-項特定實施例中，疫苗包括隱孢子蟲屬之某一種的 非減毒菌株及隱孢子蟲屬之同一種的早熟菌株。在另一項 實施例中’此類隱抱子蟲疫苗進一步包含等抱球蟲屬之某 -種的非減毒菌株及等孢球蟲屬之同一種的早熟菌株。在 又一項實施例中，隱孢子蟲疫苗進一步包含囊等抱球蟲屬 之某一種的非減毒菌株及囊等孢球蟲屬之同-種的早熟菌 株。在又-項實施例中，隱抱子蟲疫苗進一步包含囊等抱 =:=::Γ種囊等孢球蟲屬之"的 屬之同-種的早熟=的非減毒菌株及等孢球蟲 -==例中’本發明提供一種包括等抱球蟲屬之某 # 2非減毒菌株及等抱球蟲屬之同一種的早熟菌株的疫 二實施例中’該疫苗包括囊等抱球蟲屬之某-:的=毒菌株及囊等孢球蟲屬之同一種的早熟菌株。在 實施例中，疫苗包含囊等抱球蟲屬之某 :;株播囊等抱球蟲屬之同-種的早熟菌株、等抱球蟲屬 株了的非減判株及㈣球蟲屬之同-種的早熟菌 在本發明之另-態樣中，提供使動物個體對球蟲病免疫 140536.doc 201010717 之方法。一項此類實施例包含向該動物投與免疫有效量之 本發明的任何疫苗。在一項實施例中，該疫苗係經口投 與。在另一項實施例中，疫苗係經即内㈣叫投與。在 項實施例中，疫苗係經局部投與。在又一項實施例 中，疫苗係藉由注射投與。 在一項特定實施例中，疫苗係於動物之飲用水中投與。 在另-項實施例中’疫苗係於動物之食物中投與。在又一 項實施例中’疫苗係於動物之食物與制水中投與。 在又一項實施例中，疫苗係藉由喷灑投與。在一項此類 實施例中’將含有疫苗之溶液喷灑於日齡小雞身上。在此 類型之-項特定實施例中，在醉化場使用喷麗箱給日齡小 雞接種疫苗。在又-項實施例中，疫苗係藉由將疫苗施加 於動物之眼睛來投與。在此類型之一項特定實施例中，將 疫苗施加於動物之眼睛係用滴眼管來進行。在又-項實施 幻中疫田係藉由兩種、三種、四種或四種以上投藥方式 來投與。 在項特疋實施例中，本發明之疫苗係向禽類投與。在 一項實施例中’該禽類為家養禽類。在—項此類實施例 中’該動物為雞。在另—項實施例中，該家養禽類為火 雞。在又一項實施例中’家養禽類為鴨。在又一項實施例 豕養禽類為野禽。在此類型之一項特定實施例中，該 野禽為轉鶉。在另—項實施例中野禽為雉雞。在又一項 實施例中疫田係向哺乳動物投與。在此類型之一項特定 實施例中，該哺乳動物為非人類靖乳動物。 140536.doc -15- 201010717 將參考[實施方式]及實例來較好地瞭解本發明之此等及 其他態樣。 【實施方式】 因此’本發明提供一種經調配以分別使非減毒及早熟球 蟲目疫苗之獨特特性的優點最大化而使其個別缺點最小化 的對抗球蟲病之疫苗。在本發明之一態樣中，疫苗包含野 生型球蟲目種之一或多個菌株與來自同一種之減毒球蟲目 之一或多個菌株的組合。與單獨兩種個別菌株相比，此類 疫苗可使宿主產生較強之免疫反應。此外’所引起之此兩 種菌株的雙重及全異寄生蟲生命週期可促進於宿主體内獲 得牢固免疫力。 一般而言，與使用非減毒菌株之疫苗相比，儘管早熟疫 苗之顯露態出現得較早，但用包含早熟菌株之疫苗仍需要 花更長時間來獲得針對艾美爾球蟲屬之特定種的牢固免疫 力。此結果表明相對於針對早㈣株所觀察到之結果在 潛伏期内非減毒菌株經歷之額外複製週期可加速宿主之免 疫反應’且/或在用非減毒艾美爾球蟲感染/接種後於顯露 也時所釋放之大體上較多數目的印囊可使宿主動物在較少 之寄生蟲生命週期内獲得完全免疫力。 儘t決不受任何特定作用她在丨丨祕从Λ

非同步潛伏期。 應一致，其中該等菌株中之至少兩者具有 此類非同步潛伏期允許免疫過程可比在單 140536.doc 201010717 獨使用任-菌株時所見更快地進行，此係歸因於交替顯露 態之增強效應。實際上，顯露態之較快連續發生藉由增加 新鮮產生之即囊可供宿主攝取之頻率而有助於再免疫過 程本文中稱為目波效應」之增強效應可藉此引發該宿 主動物之較早免疫力。

因此’在-態樣中，本發明提供—種包含具有較短潛伏 期之減毒菌株以及同-種之具有較長潛伏期但複製新一代 印囊且經由新一代卵囊污染環境之能力要比前者大得多的 非減毒菌株本發明之一種此類例示性疫苗包括巨型艾美 爾球蟲（以merk防似〜幻之兩個獨特菌株（或株）：用於製造 以名稱PARACOX®出售之疫苗的源自同一種源之減毒、早 熟菌株及用於製造以名稱c〇CCIVAC®出售之疫苗的源自 該種源之非減毒菌株。此等菌株皆提供針對巨型艾美爾球 蟲領域攻毒之功效。然而，用非減毒菌株接種使得肉雞群 至3週結束時顯示完全免疫力，而用早熟及/或減毒疫苗接 種須花至少四週來完全建立免疫力。 由於其潛伏期之長度不同，故宿主動物之較早免疫力可 經由回波效應獲得。因此，藉由形成免疫反應之非同步刺 激，亦即回波效應，組合型巨型艾美爾球蟲菌株可促使抗 原更長時間地暴露於免疫系統且藉此加速顯現保護性免疫 力之過程。 實際上’同時投與兩個菌株可引起免疫過程之效率提 南。非減毒與早熟卵囊皆同時在宿主體内開始其各自的生 命週期’但非減毒菌株在早熟菌株之潛伏期後11至31小時 140536.doc •17· 201010717 之間完成其潛伏期。非減毒菌株亦將顯著較大數目之印囊 排至糞便中。 因此，早熟菌株首先在宿主體内完成其生命週期，藉此 引發宿主之免疫反應。接著排出早熟印囊，形成抱子，且 在宿主攝取其後開始其第二個生命週期。同時，非減毒菌 株之第㈣生命週期持續進行以產生一或多代額外裂殖 體，最終導致形成配子母細胞，增強及擴大由早熟菌株引 發之免疫反應。接著排出之非減毒卵囊在褥草中形成孢 子’且由已具有經歷第二個生命週期之早熟菌株的宿主攝❹ 取因此’此等同時非同步生命週期可用以減少達成宿主 體内之牢固免疫力所需的時間。總過程亦可允許疫苗含有 較少初始劑量之非減毒印囊’從而使得由非減毒菌株感染 引起之於宿主腸中所形成之病變的數目減少及/或嚴重性 減輕。 在描述中為方便起見而使用單數術語決不意欲施加如此 之限制。因此’舉例而言，提及包含「某一數量」之組合 物包括提及—或多個該等數量。另外，除非另有指示，否0 則提及一個「卵囊」包括提及複數個該等卵囊。 如本文中所使用之以下術語應具有下文所述之定義。 術語「佐劑」及「免疫刺激劑」在本文中可互換使用， 且係定義為-或多種可刺激免疫系統之物質。佐劑為可非 特異性地提高針對特定抗原之免疫反應，從而減少任何特 定疫苗中所必需之抗原的數量及/或為產生針對所關注抗 原之足夠的免疫反應所必需之注射頻率的藥劑。就此而 140536.doc •18· 201010717 吕，佐劑係用於增強針對一或多種疫苗抗原/分離株之免 疫反應。佐劑可在投與疫苗之前、與投與疫苗一起或在投 與疫苗之後向目標動物投與。 如本文中所使用之術語「大約」可與術語「約」互換使 用且表示數值在指示值之50%内，亦即含有「大約」1〇〇 個卵囊之組合物含有50個至15〇個即囊。 ，文中所使用，球蟲目屬之某—種的「減毒」菌株

(諸如「減毒艾美爾球蟲」）為針對其在宿主體内降低之病 原性所選出的菌株。該減毒作用可藉由包括連續繼代（諸 如連續胚胎繼代）、化學誘變之許多方法及藉由照射方法 來達成。 如本文中所使用’球蟲目屬之某一種的「早熟」菌株 (諸如「早熟艾美爾球蟲」）為相對於同—種之非減毒菌株 而言具有縮短之潛伏期的菌株。早熟菌株亦可為減毒菌 株。 /本文中所使用，球蟲目屬之某-種的「野生型」菌株 (諸如「野生型艾美爾球蟲」）為尚未藉由減毒繼代或包括 利用以下方式進行選擇之任何直仙忐 7其他處理而改變的野外分離 株：單-㈣分離、免疫耐受性或其他分離方法。 如本文中所使用，球蟲目屬 茸接 屬之某一種的「非減毒」菌株 (諸如「非減毒艾美爾球蟲 π办蛾」J马相對於同一種之野生型菌 株而言既不具有縮短之潛伏期亦 乃力个具有在佰主體内降低之 病原性的菌株。 如本文中所使用，球蟲目屈 屬之某一種（例如艾美爾球蟲 140536.doc -19· 201010717 屬之某一種）的「菌株」為該球蟲目屬之該種的可根據一 或多個以下特點而與該種之一般群區別開的亞群：病原 性、免疫原性、潛伏期及/或由單一卵囊擴增所產生之 群。 術語「非同步潛伏期」係指球蟲目屬之兩個或兩個以上 種及/或球蟲目屬之某一種之兩個或兩個以上菌株的潛伏 期相差10%或更大。在一項特定實施例中，球轰目屬之兩 個或兩個以上種及/或球蟲目屬《單一冑的兩個或兩個以 上菌株具有相差20%或更大之非同步潛伏期。在又一項實 _ 施例中，球蟲目屬之兩個或兩個以上種及/或球蟲目屬之 單-種的兩個或兩個以上菌株具有相差2 5 %或更大之非同 步潛伏期。 參 關於早熟及/或減毒g株與非減毒g株之相差某一時間 百分比（〇/〇)的非同步潛伏期，該百分比係以非減毒菌株之 潛伏期计。因此，當球蟲目屬之非減毒菌株具有12〇小時 之潛伙期且該球蟲目屬之同一種的早熟菌株具有⑽小時 之潛伏期時，該兩個菌株具有相差1〇%之非同步潛伏期。 除非另有指不’否則如本文中所使用之術語「家養禽 ^包括雞、火雞、鴨、野禽（包括但不限於镇韓 '雉雞 )及平胸烏（包括但不限於鴯鷗及鴕鳥）。 :非另有指#，否則如本文中所使用之術語「艾美爾球 種。二意謂可感染家養禽類的艾美爾球蟲屬之—或多個 X美爾球蟲屬種包括見於雞體内之彼等種且包括 歹,如)柔嫩艾美爾球蟲、堆型艾美爾球蟲巨型艾美爾球 140536.doc •20· 201010717 蟲、毒害艾美爾球蟲、和緩艾美爾球蟲、早熟艾美爾球 蟲、變位艾美爾球蟲及布氏艾美爾球蟲；而且包括見於火 雞體内之彼等種，包括火雞和緩艾美爾球蟲、腺型艾美爾 球蟲、火難孔雀艾美爾球蟲、分散艾美爾球蟲、火雞艾美 爾球蟲、無害艾美爾球蟲及近圓艾美爾球蟲；以及可感染 如上文所定義之其他家養禽類的艾美爾球蟲屬種。術語 「艾美爾球蟲屬」亦包括艾美爾球蟲屬之上述種之所有菌 株’包括（但不限於）早熟菌株及減毒菌株，其亦包括已經 照射或者處理以致不能完成發育之菌株。術語艾美爾球蟲 屬進一步包括可感染如上文所定義之家養禽類的艾美爾球 蟲屬之任何新近發現之菌株或種。 術語「被囊」意謂原生動物寄生蟲之卵囊階段。 如本文中所使用之術語「免疫」及「接種」為同義的且 可互換使用。除非另有指示，否則如本文中所使用之術語 「有效免疫劑量」意謂足以於所接種之動物體内引發免疫 反應（例如引起相應抗體力價之升高及/或細胞介導免疫之 活化）的處於生命週期之任何階段之孢子蟲（包括其生命週 期之一或多個或甚至所有階段的混合物）的數目，例如子 孢子、卵囊及/或裂殖子之數目，或當為混合物時，例如 子抱子、卵囊及裂殖子之數目。較佳地，當用有毒劑量之 孢子蟲綱（例如艾美爾球蟲屬或隱孢子蟲屬 攻毒時，所引起之免疫反可提供限制或 減少接種動物（例如禽類）之臨床疾病跡象、重量損失、發 病及/或死亡的保護性免疫力。 140536.doc -21 - 201010717 除非另有指#，否則如本文中所使用之術語「印囊」、 「裂殖子」及「子孢子」意謂可為減毒或非減毒之有活」力 的（亦即，活的）球蟲目（例如艾美爾球蟲屬或隱孢子 卵囊、裂殖子及子孢子。 術語「牢固免疫力」在本文中可與術語「完全免疫力」 互換使用且表示賦予一組接種動物（例如一群接種禽類 可提供針對同源攻毒之防護作用以便使該等接種動物在健 康及效能方面在統計學上類似於非攻毒對照組（及/或在統 計學上不同於非接種攻毒對照組）（如以例如飼料轉化率、參 重量增加及/或球蟲病之病變（總體或微觀）衡量而得知）的 免疫力程度。 如本文中所使用之術語「在統計學上類似」表示對兩組 或兩群動物之統計比較將在< 01之顯著性水準下接受虛無 假設（或無差異假設）。 如本文中所使用之術語「在統計學上不同」表示對兩組 或兩群動物之統計比較將在< 0 i之顯著性水準下拒絕虛無 假設（或無差異假設）。 ❹ 術語「孢子囊」係指使子孢子包圍在卵囊内之囊。 動物個體 欲作此類處理之動物較佳（但不限於）為脊椎動物且更佳 - 為哺乳動物、禽類或魚類。本發明疫肖中之* —者可向動 - 物個體投與。適當動物個鍾包括彼等野生動物、家畜（例 如，為肉、奶、脂、蛋、皮毛、皮革、羽毛及/或羊毛而 飼養之豕畜）、役畜、研究用動物、伴侣動物以及彼等為 140536.doc -22· 201010717 動物園、野生生境及/或馬戲團而飼養/在動物園、野生生 境及/或馬戲團中飼養之動物。 用本發明之疫苗處理或保護之禽類可與商業或非商業養 禽業相關。此等禽類包括（例如）鴨科（―），諸如天 鶴、鶴及鴨；鳩鹤科（c〇/—如），例如斑鸿及鹤子諸 如家鴿；雉科（户w_·如），例如麴鶉、麟鴣、松雞、錐 雞及火雞；肉雞，__，例如飼養的雞；鹤轉科 ㈣’例如長尾鹦轉、金剛鹦轉及例如為寵物或收 集者市場而飼養之鸚鵡；以及其他類似者。 哺乳動物個體包括牛類（例如家牛或奶牛）、豬類（例如家 養豬或諸卜羊類（例如山羊或緯羊）、馬類（例如馬）、犬類 (例如狗）、貓類（例如家貓）、駱駝、鹿、羚羊、兔子、豚 鼠及齧齒動物(例如松鼠、大鼠、小鼠、沙鼠及倉鼠)、鯨 類（鯨魚、海豚 '鼠海豚）、鰭足類（海豹、海象）。 魚類亦可為本發明之疫苗的個體。出於本發明之目的， 術語「魚類」應理解為包括（但不限於）真骨魚目（7weoi⑴ 群之魚類，亦即硬骨魚。鮭形目(其包括鮭 科（心/則⑴也e))與鱸形目（P㈣办rWa)(其包括日鱸科 e))皆包含在真骨魚目分群中。可能的魚類受 體之實例包括鮭科、鮪科（&•而匀、鯛科（办而匀、 麗魚科（C7—e)、日鱸科、三線磯鱸（three Line Grunt)(二線雞魚（/^印门⑽））及藍眼豹 (Blue-Eyed Plecostomus)(琵琶魚（P/ec<m〇WMi 印尸））以及其 他類似者。可處理之魚類的其他實例包括（但不限於）鯰 140536.doc •23· 201010717 魚、海越、金搶魚、大比目魚、北極娃魚㈣“㈣、 I、、大菱鮮、鱗魚、鶴魚、經魚、羅非魚、條紋鍵、缓 魚、海網、黃尾魚（yellGwtail)、琥拍魚' 石斑魚及乱目 魚。 抗原 野生垔卵囊可獲自受感染動物之糞便或組織；受污染之 飼料或水；土壤；畜圈褥草或墊料；或各種其他來源。用 於分離孢子囊及㈣之方法係已知的。用於分離印囊之準 確程序將隨獲得卵囊之材料而變化且應易於為熟f此項技 術者所顯而易見。裂殖子可藉由例如us 7,25Q，286 B2中所 揭示之方法生長於培養物中。 一種可用於自原始環境樣品分離生物體之方法如下：初 始步驟為自外來材料分離孢子囊及/或卵囊。土壤或排泄 物一般係藉由用飽和生理食鹽水溶液形成漿料且自漿料分 離抱子囊及/或彡卩囊來處理。舉例而言，將欲處理之材料 與最少2體積（w/v)之飽和Naci水溶液混合以形式漿料。必 要時’可將該漿料在混合器或摻合器中處理直至達成均質 稠度。於4°C下將漿料以約80〇xg離心1 〇分鐘。藉由傾注穿 過雙層24x24編織紗布來收集上清液。自常用樣品純化印 囊之其他方法包括A氏庶糖漂浮法（Sheather sucrose flotation)及硫酸鋅漂浮法[例如參見LR Ash及TC Orihel， Parasites: A Guide to Laboratory Procedures and Identification, ASCP Press © 1991] ° 用兩體積之飲用水稀釋經過濾之上清液且於4°C下以約 140536.doc -24- 201010717 1600xg離心i〇分鐘。用水洗滌粒化卵囊且再藉由所述之離 心操作粒化3次。接著使用用於水洗滌之相同程序將印囊 於2.5%重鉻酸鉀中洗滌3次。最終洗滌後，可將卵囊於4它 下儲存於2.5%重鉻酸鉀中或轉移至容器中以供孢子化。 或者，連續過濾可用於基於尺寸來分離卵囊。若使用過 濾，則如前文所述，用水及2.5%重鉻酸鉀洗滌卵囊。 作為野生型野外分離株出現之非減毒株已藉由經許多年 連續繼代而維持於實驗室環境中且用中度至高度繁殖力、 規定之潛伏期及自宿主排出之已知模式來充分表徵其病原 性為低度至中度。 除如US 5,055,292(其内容以全文引用的方式併入本文 中)中所例示之現有早熟艾美爾球蟲株外，早熟株亦可在 雞體内連續繼代後自野生型、有毒母株或非減毒菌株獲 得。在一個此類情況下，僅在顯露態後最初幾個小時期間 自糞便收集到_囊。以此方式，可逐漸縮短潛伏期。此類 φ 型之繼代被稱為選擇性繼代。或者，為了增加可供收集之 印囊的數目，在介於顯露態開始時與近似之母株潛伏期之 間的時刻收集印囊可為有利的。此類型之繼代係稱為中性 繼代（neutral passage)。最後，在稱為鬆弛性繼代 passage)之過程中，收集幾乎所有印囊，包括彼等在母株 潛伏期之後所產生之卵囊。 疫苗 種子批號系統 舉例而言，各非減毒或減毒艾美爾球蟲株之種源可儲存 140536.doc •25· 201010717 於液氮中。工作種子可在接種於宿主（例如SPF雞）中後由 各種源之樣品製備。卵囊可自宿主糞便及/或盲腸回收以 產生工作種子。將該等工作種子儲存於4〇c下且用於開始 各疫苗製備。工作種子具有6至12個月之存放期，在此之 後應將其更換。當製備工作種子時，僅收集達到該種之野 生型母株之潛伏時間左右的卵囊，亦即中性繼代。當製備 疫苗時，收集整個感染顯露期内之卵囊，亦即鬆弛性繼 代。 難之飼養 自獲自合格SPF群之蛋孵出雞。在飼養期間在無球蟲目 之情況下將其養至適合於疫苗製造之年齡，通常為卜丨2週 齡。接著將雞：轉移至疫苗製造室（vaccine pr〇ducti⑽ accommodation)，分組分配至獨立室中，或轉移至為各艾 美爾球蟲屬種指定之隔離室。 接種 以口服方式向各組禽類接種先前確定之劑量的工作種 子。可根據交錯時程安排接種以便僅收集艾美爾球蟲屬之 一個種且於特定工作日進行處理。 收集 收集糞便，不過收集之時間及持續時間在種與種之間有 所不同。於水中製備糞便（及/或盲腸内含物）之漿料，接著 將其均質化。將勻漿經由15〇微米篩洗滌且於連續流動碗 式離心機中離心洗滌物。使經離心之沈積物再懸浮於飽和 鹽溶液中且再次離心。收集上清液，用水稀釋且用離心機 140536.doc •26- 201010717 對其進行第3次離心。使沈積物再懸浮於2%重鉻酸鉀溶液 中。 抱子化： 在強制通氣下將重絡酸鉀溶液中之卵囊懸浮液於Μ。〇下 培養48小時以使卵囊產生抱子。在孢子化後，藉由離心移 除重鉻酸鹽溶液且用1 〇% chl〇rox(次氣酸鈉溶液）將卵囊處 理1〇分鐘。使經處理之卵囊再懸浮於水中且添加福馬林 (formalin)至〇·〇5%之濃度。將懸浮液儲存於。 摻合： 進行各散裝卵囊溶液懸浮液之卵囊計數且將計算出體積 之各懸浮液與懸浮劑混合以產生具有以所需比例存在的各 個種之卵囊的多組份疫苗。將該疫苗填充至最終容器中且 儲存於4°C下。 佐劑 本發明之一些疫苗組合物可包括醫藥學上可接受之佐 劑。本發明之佐劑可自許多來源中之任一者獲得，包括自 天然來源、重組來源獲得及/或化學合成獲得等。適用於 動物之疫苗接種之佐劑包括（但不限於）佐劑65(包含花生 油、二縮甘露醇單油酸酯（mannide monooleate)及單硬脂酸 鋁），弗氏完全或不完全佐劑（Freundis e〇mplete/inc〇mplete adjuvant);礦物凝膠、紹化合物（諸如氫氧化紹、磷酸鋁 及明礬）；界面活性劑，諸如十六烷基胺、十八烷基胺、 溶血卵磷脂、溴化二曱基二（十八烷基）銨、N，N-二（十八烷 基）-N’，N’-雙（2-羥基甲基）丙二胺、曱氧基十六烷基甘油及 140536.doc 27- 201010717 複合多元醇（pluronic polyols);聚陰離子，諸如旅喃、硫 酸葡聚糖、多聚1C、聚丙烯酸；肽，諸如胞壁醯基二肽、 二甲基甘胺酸及特夫素（tuftsin);及油乳液。關於佐劑之 資訊係例如揭示於P. Tijssen之叢書[Praciz'ce TTzeory 〇/ Enzyme Immunoassays，第 3 版，Elsevier, New York, (1987)]中。 其他潛在佐劑包括（但不限於）可代謝及非可代謝油、嵌 段聚合物、ISCOM(免疫刺激複合物）、維生素及礦物（包括 但不限於：維生素E、維生素A、硒及維生素B 12)、Quil A(皂苷）、與聚烯基醚或二乙烯基二醇交聯之丙烯酸聚合 物（以商品名稱CARBOPOL®(例如CARBOPOL® 941)出售 者）及均勻分散於水中之微米尺寸油滴的乳液（例如，以商 品名稱Emulsigen®出售者）。 有時被特定地稱為免疫刺激劑之佐劑的其他實例包括細 菌及真菌細胞壁組份（例如脂多醣、脂蛋白、醣蛋白、胞 壁醯肽、β-1，3/1，6-葡聚糖）、源自植物之各種複合碳水化 合物（例如聚糖、醋孟南（acemannan))、源自動物之各種蛋 白質及肽（例如激素、細胞激素、協同刺激因子）及源自病 毒及其他來源之新穎核酸（例如雙鏈RNA、CpG卜另外， 上述物質之許多組合可提供輔助效果，且因此可形成本發 明之佐劑》 本發明之疫苗係容易地藉由任何途徑來投與，該等途徑 包括經口 (例如藉由滴眼劑、經鼻内、飼料中、水中或藉 由喷灑）、經卵内、局部或藉由注射(例如靜脈内、皮下、 140536.doc -28. 201010717 肌肉内、眶内、眼内、皮内及/或腹膜内）接種。技術人員 應瞭解疫苗組合物較佳經適當地調配成用於各類型之受體 動物及投藥途徑。 儘管本發明之疫苗係用艾美爾球蟲屬來例示，但本發明 之疫苗亦可用密切相關之屬的非減毒及減毒及/或早熟種 及/或種之菌株來建構：等孢球蟲屬 '囊等孢球蟲屬及隱 孢子蟲屬。

實例1 包含減毒及非減毒巨型艾美爾球蟲菌株之疫苗 巨型艾美爾球蟲之菌株 巨型艾美爾球蟲MFP :具有約96小時潛伏期（自母株之 121小時潛伏時間縮短25小時卜收集時間可在ι〇4_ιι〇小時 之間，例如108-110小時（4.5_4.58天）。配子母細胞出現於 感染後約72小時或更早。裂殖體之平均尺寸及裂殖子之平 均數目大體上類似於母株之彼等者。 巨型艾美爾球蟲C〇Ccivac具有約121小時之潛伏期且可 在14 4小時與1 9 2小時之間收集產生之卵囊。 疫苗調配物：如上文所述收集且接著形成孢子。選 擇已知力價之孢子化㈣的產品批號以提供單位體積所需 之孢子化卵囊數目。疫苗之製造係藉由將印囊懸浮液轉移 至無函容器中且接著將2.5%重路酸钾溶液定量添加至該容 器中來完成。將該疫苗無菌分配至容器中，接著密封。 應瞭解本發明並不㈣本文所揭*之特定 驟及材料，此仙為該等組態、過程步驟及材料可== 140536.doc •29· 201010717 變化。亦應瞭解本文中所用之術語僅用於描述特定實施例 之目的而非意欲限制本發明，此係因為本發明之範疇應僅 受隨附申請專利範圍及其等效體限制。 I40536.doc 30-

Claims (1)

1. 201010717 七、申請專利範圍： 1. 一種疫苗組合物，其包含球蟲目（Cocc/Aa)屬之某一物種 的第一菌株及該物種之第二菌株； 其中該第一菌株及該第二菌株具有非同步潛伏期。 2·如請求項丨之疫苗組合物，其中該屬係選自由等孢球蟲 屬（了*50·^0^^)、囊等抱球蟲屬、隱孢子蟲 屬（Crypt〇sporidium)反艾美爾珠螽屬（Eimeria、紕氙之 群。 • 3.如請求項2之疫苗組合物，其中該屬為艾美爾球蟲屬。 4.如請求項3之疫苗組合物，其中該第一菌株為非減毒艾 美爾球蟲菌株且該第二菌株為早熟艾美爾球蟲菌株。 5·如請求項4之疫苗組合物，其中該早熟艾美爾球蟲菌株 為減毒艾美爾球蟲菌株》 6·如請求項4之疫苗組合物，其包含非減毒艾美爾球蟲卵 囊及早熟艾美爾球蟲卵囊。 φ 7. *請求項6之疫苗組合物，其中非減毒艾美爾球蟲印囊 之數量為約10個至約1000個。 8·如請求項6之疫苗組合物’其中早熟艾美爾球蟲卵囊之 數量為約100個至約1〇,〇〇〇個。 9.如請，項8之疫苗組合物，其中非減毒艾美爾球蟲印囊 之數量為約10個至約1000個。 Ή求項6之疫苗組合物，其進—步包含非減毒艾美爾 裂殖子及子孢子’以及早熟艾美爾球蟲裂殖子及子 140536.doc 201010717 如明求項4之疫苗組合物，其中該艾美爾球蟲屬種係選 自由柔嫩艾美爾球蟲⑽、堆型艾美爾球_ _rvw/z•叫、巨型艾美爾球蟲（[咖—）、毒害艾美爾 球蟲（五.、和緩艾美爾球蟲（£阳·…）、早熟艾美 :球蟲⑻^⑽）、冑位艾美爾球蟲⑷論此)及布氏 又美爾球蟲（£· 組成之群。 12.如請求㈣之疫苗組合物，其中該艾美爾球蟲屬種為巨 型艾美爾球蟲。 13·如請求項12之疫苗組合物，其進一步包含選自由柔嫩艾 美爾球蟲、堆型艾美爾球蟲、毒害艾美爾球蟲和緩艾 美爾球蟲、早熟艾美爾球蟲、變位艾美爾球蟲及布氏艾 美爾球蟲組成之群的一或多個其他艾美爾球蟲屬種。 14.如請求項3之疫苗組合物，其進一步包含選自由等孢球 蟲屬、囊等孢球蟲屬及隱孢子蟲屬組成之群的球蟲目屬 之一或多個其他菌株。 15·如凊求項14之疫苗組合物，其中該球蟲目屬為隱孢子蟲 屬且該一或多個其他隱孢子蟲屬菌株包括隱孢子蟲屬之 某一種的非減毒菌株及該隱孢子蟲屬種之早熟菌株。 16.如請求項4之疫苗組合物，其中該艾美爾球蟲屬種係選 自由火難和緩义美爾球蟲（五· we/eayiw/iz.s)、腺型艾美 爾球蟲（五· 、火雞孔雀艾美爾球蟲（五 ga//opav〇mi)、分散艾美爾球蟲、火雞艾美 爾球蟲（五.we/e叹rzWi.j)、無害艾美爾球蟲（五· /⑽⑽)及 近圓艾美爾球蟲（£· 組成之群。 140536.doc 201010717 17. 如請求項2之疫苗組合物，其中該第一菌株為非減毒菌 株且該第二菌株為早熟菌株。 18. 如請求項17之疫苗組合物，其中該屬為隱孢子蟲屬。 19. 如請求項18之疫苗組合物，其進一步包含等孢球蟲屬之 某一種的非減毒菌株及該等孢球蟲屬種之早熟菌株。 20. 種如請求項1之疫苗組合物的用途，其係用於製造用 以使動物個體對球蟲病免疫之疫苗。 2 1 ·如請求項20之用途’其中該疫苗係經口投與。 馨22·如請求項21之用途，其中該疫苗係藉由選自由以下方法 組成之群的方法來投與：將該疫苗添加至該動物之飲用 水中，將該疫苗添加至該動物之食物中，將該疫苗施加 於該動物之眼睛及將該疫苗喷灑於該動物身上。 23.如請求項20之用途，其中該疫苗係經印内（h〇v〇)投與。 24_如請求項20之用途，其中該動物為家養禽類。 25. 如請求項24之用途，其中該家養禽類係選自由雞、火 $ 雞、鴨及野禽組成之群。 26. 如請求項25之用途，其中該家養禽類為雞。 140536.doc 201010717 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：（無） (二) 本代表圖之元件符號簡單說明· 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式·· (無）

   140536.doc