ES2351299T3 - Procedimientos mejorados para la producción de ooquistes. - Google Patents

Abstract

El uso de una composición en la recogida, esporulación y/o desinfección de ooquistes protozoarios viables, comprendiendo dicha composición del 0,1% al 10% (v/v) o (p/v) de un compuesto de peroxígeno y del 1% al 15% (v/v) o (p/v) de un ácido orgánico, en el que dicho ácido orgánico es ácido acético, ácido cítrico, ácido propiónico u otro mono- o poli- ácido acético o cualquier combinación de los mismos y conteniendo dicha composición un pH ácido de pH 1 a pH 3.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la producción de ooquistes de protozoos; en particular, la presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la producción de ooquistes de Eimeria. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La coccidiosis de las aves de corral es una enfermedad causada por parásitos protozoarios del género Eimeria. Los ooquistes de las especies de Eimeria son ubicuos en el medio ambiente y persisten durante muchos meses en los excrementos de las aves de corral. La ingestión de ooquistes conduce a infección de las diversas regiones del tracto intestinal de una manera específica en las especies. El organismo prolifera en el intestino durante un período de varios días, dando lugar la excreción de la siguiente generación de ooquistes en las heces. Ciclos múltiples de infección conducen a inmunidad y cuando la infección se presenta en una bandada al principio y en una cantidad de dosificación uniforme entre la bandada, la inmunidad desarrollada durante varios ciclos de exposición puede ser bastante fuerte.

En cambio, cuando las aves no presentan la infección de una manera uniforme, pueden surgir situaciones en las que las aves sin tratamiento previo están sujetas a infección repentina, masiva, conduciendo a una escasa producción en términos de conversión de alimento y aumento de peso y a un alto riesgo de infecciones secundarias. Actualmente, el procedimiento más común usado para el control de la coccidiosis, en la industria de las aves de corral, no es la vacunación sino más bien la administración de fármacos anticoccidiales en el alimento. La baja tasa de vacunación se atribuye, con frecuencia, a una incertidumbre en la uniformidad de la dosificación a través del alimento o del agua en la instalación de engorde o vacunación en gabinete de aspersión en la incubadora, que son las vías y tiempos de administración tradicionales. Existe un interés creciente en mejorar la uniformidad del suministro durante la administración en la incubadora.

Recientemente, se han descubierto técnicas de vacunación in ovo aplicables para la administración de una vacuna viva contra la coccidiosis basada en ooquistes (documentos WO 96/40234 y WO 96/40233; Pfizer, Inc.). La vía de administración in ovo proporciona un procedimiento de suministro conveniente de una dosis uniforme de vacuna a cada embrión cuando aún se encuentra en el huevo. En la actualidad, el suministro de vacunas aviares in ovo se realiza aproximadamente en el 85% de los 9 billones de aves broiler producidas en los Estados Unidos cada año y en un porcentaje en aumento en los 21 billones de aves broiler producidas fuera de los Estados Unidos cada año (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.458.630). Por lo tanto, la posible comercialización de una vacuna viva contra la coccidiosis, suministrada in ovo, es considerablemente mayor que la comercialización actual para vacunas contra la coccidiosis suministradas después de la eclosión.

Los ooquistes para su uso en una vacuna viva contra la coccidiosis, proceden de heces de pollos que inicialmente están muy cargadas con microorganismos contaminantes. Típicamente, las agencias reguladoras exigen que las vacunas administradas in ovo no presenten esencialmente microorganismos contaminantes. Para garantizar más completamente que los niveles de biocarga están minimizados del todo en el producto final, es beneficioso el uso de composiciones y metodologías que controlen eficazmente el nivel de microorganismos contaminantes en cada etapa del proceso de producción de ooquistes, incluyendo los procesos de recogida y esporulación así como los procesos de desinfección.

Los procedimientos actuales de producción de ooquistes, para la fabricación de vacunas, pueden presentar el inconveniente de que frecuentemente utilizan materiales que son biopeligrosos o corrosivos para el instrumental.

Por consiguiente, en la técnica, existe una necesidad de procedimientos mejorados de producción de ooquistes procedentes de protozoos, especialmente para su uso en la fabricación de vacunas. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En el presente documento se describen procedimientos y composiciones mejorados para la producción de ooquistes protozoarios (por ejemplo, Eimeria), para su uso, por ejemplo, en la fabricación de vacunas. En particular con respecto a vacunas de aves de corral, los procedimientos y composiciones que se describen en el presente documento son adecuados para la producción de vacunas para su uso después de la eclosión o in ovo. Del mismo modo, la vacuna puede usarse en la industria de aves broiler, ponedoras, reproductoras, de pavos, de aficionados y/o domesticadas.

Por consiguiente, la presente invención proporciona el uso de una composición en la recogida, esporulación y/o desinfección de ooquistes protozoarios viables, comprendiendo dicha composición del 0,1% al 10% (v/v) o (p/v) de un compuesto de peroxígeno y del 1% al 15% (v/v) o (p/p) de un ácido orgánico en el que dicho ácido orgánico es ácido acético, ácido cítrico, ácido propiónico u otro mono-o poli-ácido acético o cualquier combinación de los mismos y teniendo dicha composición un pH ácido de pH 1 a pH 3.

El uso puede ser de una composición, como se define en relación con el uso de la invención anterior, en un procedimiento de recogida de ooquistes protozoarios viables procedentes de un animal infectado, que comprende las etapas de:

(a)

obtener heces que comprenden ooquistes procedentes un animal infectado por un protozoo, en el que el animal libera en sus heces los ooquistes procedentes del protozoo,

y

(b)

poner en contacto las heces, que comprenden los ooquistes procedentes del animal infectado, con dicha composición.

De manera alternativa, el uso puede ser de una composición, como se define en conexión con el uso de la invención anterior, en un procedimiento de esporulación de ooquistes protozoarios viables que comprende las etapas

(a)

proporcionar una composición que comprende ooquistes protozoarios, y

(b)

provocar la esporulación de los ooquistes en dicha composición durante un tiempo y en condiciones adecuadas para la esporulación.

De manera alternativa el uso puede ser de una composición, como se define en conexión con el uso de la invención anterior, en un procedimiento de desinfección de ooquistes protozoarios viables, que comprende

(a) proporcionar una preparación que comprende ooquistes protozoarios y

(b) desinfectar los ooquistes en dicha composición durante un tiempo y en condiciones suficientes para conseguir el nivel de desinfección deseado de la preparación. En realizaciones particulares de lo anterior, el protozoo comprende una especie de Eimeria y el sujeto animal es un ave.

La presente invención se explica con más detalle en la descripción que se expone a continuación. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A continuación se describirá la presente invención con referencia a realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo, la presente invención, puede realizarse de diferentes formas y no debe interpretarse como una limitación de las realizaciones expuestas en el presente documento.

En cambio, estas realizaciones se proporcionan de manera que esta divulgación será minuciosa y completa y dará a conocer por completo, a los expertos en la materia, el ámbito de la invención.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece la presente invención. En el presente documento, la terminología usada en la descripción de la invención, tiene solamente la finalidad de describir realizaciones particulares y no pretende limitar la invención.

Como se usa en la descripción de la presente invención y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “una” y “el”, “la” pretenden incluir las formas plurales también, a menos que en el contexto se indique claramente otra cosa.

La presente invención es adecuada para usos médicos y veterinarios. Las expresiones “animal” y “sujetos animales” incluyen, pero sin limitación, sujetos mamíferos y aviares, preferentemente aviares.

Los sujetos mamíferos adecuados incluyen, pero sin limitación, seres humanos, sujetos simios, porcinos, bovinos, caprinos, equinos, felinos, ovinos, caninos, murinos y lagomorfos.

Las expresiones “aviar” y “sujetos aviares” o “ave” y “sujetos ave”, como se usa en el presente documento, pretenden incluir machos y hembras de cualquier especie aviar o de ave, pero principalmente pretenden incluir aves de corral criadas para la venta de huevos, carne o como mascotas. Por consiguiente, las expresiones “aviar” y “sujeto aviar” o “ave” y “sujeto ave” pretenden particularmente incluir pollos, pavos, patos, gansos, codornices, faisanes, periquitos, loros, cacatúas, cotorras, avestruces, emúes y similares. Los pollos y los pavos son los sujetos aviares o las aves preferidas, siendo los pollos las más preferidas.

En el presente documento se describen procedimientos y composiciones para la producción de ooquistes de protozoos. Dichos procedimientos y composiciones encuentran su uso, por ejemplo, en procedimientos de fabricación de vacunas. Muchos protozoos forman una etapa del ciclo de vida denominada “ooquiste”. La invención puede llevarse a la práctica para producir ooquistes procedentes de muchas especies de protozoos, que incluyen, pero sin limitación, Eimeria, Cryptosporidium, Toxoplasma, Plasmodia e Isospora. En realizaciones de la invención, la invención se usa para producir ooquistes de Eimeria.

Los términos “protozoo”, “ooquiste”, “esporoquiste”, “esporozoito” y “merozoito” tienen su significado aceptado en la técnica. A menos que se indique otra cosa, estos términos pretenden referirse a protozoos, ooquistes, esporocistos, esporozoitos y merozoitos vivos, aunque los expertos en la materia apreciarán que las vacunas pueden formularse usando protozoos, ooquistes, esporoquistes, esporozoitos y merozoitos destruidos (o atenuados).

El término “Eimeria” se refiere a una o más especies del género Eimeria. Estas especies de Eimeria incluyen las encontradas en pollos, incluyendo E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, E. mivati y E. brunetti, y también las encontradas en pavos, que incluyen E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. innocua y

E. subrotunda. El término “Eimeria” también incluye cepas o especies de Eimeria que infectan otras especies de aves o de mamíferos. Además, el término “Eimeria” incluye todas las cepas de las especies de Eimeria anteriores, que incluyen, pero sin limitación, cepas de tipo silvestre, cepas precoces o seleccionadas de otra manera, cepas atenuadas y ooquistes que se han atenuado, por ejemplo, por radiación, tratamiento químico y similar. Adicionalmente, el término “Eimeria” también incluye cualquiera de las especies o cepas de Eimeria recientemente descubiertas. Por último, el término “Eimeria” incluye Eimeria viva y destruida, aunque a menos

que se indique otra cosa, se desea Eimeria viva.

Las composiciones que comprenden ooquistes de Eimeria encuentran su uso en los procedimientos de inmunización de aves contra la coccidiosis. En la técnica se conocen procedimientos de vacunación de aves contra la coccidiosis e incluyen procedimientos de vacunación in ovo (por ejemplo, las publicaciones de patente internacional WO 96/40234 y WO 96 40233; Pfizer Inc.) y después de la eclosión (por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº

3.147.186 de Edgar; la Patente de Estados Unidos Nº 5.055.292 de McDonald y col.; y la Patente de Estados Unidos Nº 4.438.097 de Shirley y col.).

Los expertos en la materia apreciarán que los ooquistes pueden procesarse adicionalmente para liberar otras etapas del ciclo de vida (por ejemplo esporozoitos o esporocistos) para su uso en la composición final de la vacuna o para producir proteínas protozoales para los fines de la vacunación.

Del mismo modo, el término “protozoo” incluye cepas de tipo silvestre, cepas precoces

o seleccionadas de otra manera, cepas atenuadas, y ooquistes que se han atenuado, por ejemplo, por radiación, tratamiento químico y similar. Adicionalmente, el término “protozoo” también incluye cualquiera de las especies o cepas de protozoos recientemente descubiertas. Por último, el término “protozoo” incluye protozoos vivos y destruidos, aunque a menos que se indique otra cosa, se desean protozoos vivos.

Los términos “produce”, “producir” o “producción” de ooquistes y similares, incluyen las etapas de infectar a un animal (por ejemplo, un ave) y recoger las heces de este que contienen los ooquistes, provocar la esporulación, purificar y/o desinfectar los ooquistes y similar. Por lo tanto, los términos “produce”, “producir” o “producción” se refieren a todo el proceso de recogida de ooquistes procedentes del animal y a la purificación de los ooquistes procedentes de la materia fecal o a las etapas individuales (o un subconjunto de etapas) del proceso.

A menos que se indique otra cosa, los términos “purificar”, “purificación”, “purificador” y “purificado” como se usa en el presente documento en relación con las preparaciones de ooquistes, se refieren a la separación de o eliminación de, residuos u otros materiales no deseados de las preparaciones que contienen los ooquistes. Estos términos pretenden indicar que se potencia el grado de aislamiento o separación de los ooquistes de otros materiales presentes en las heces, no que todos los materiales extraños se eliminen absolutamente de las preparaciones de ooquistes. Del mismo modo, la preparación de ooquistes puede contener algún grado de contaminación microbiana, siempre que la preparación final sea adecuada para su uso pretendido (por ejemplo, como una vacuna). En realizaciones particulares, en el caso de vacunas destinadas para la administración in ovo en aves, esencialmente, la preparación no contendrá contaminación por microorganismos detectable, en particular, microorganismos que sean patógenos (es decir, que causen enfermedad o mortalidad significativa) al embrión.

Dependiendo del contexto, un proceso de “purificación” puede referirse a todo el proceso de purificación de ooquistes de las heces para producir una preparación adecuada para los fines de vacunación. Como alternativa, un proceso de “purificación” se refiere a cualquier subconjunto de etapas, o incluso a una sola etapa, dentro de todo el esquema de purificación.

La presente invención se refiere a, o hace uso de, los procedimientos y composiciones para la producción de ooquistes (por ejemplo, ooquistes de Eimeria). Los ooquistes que se producen son generalmente de infectividad, viabilidad y pureza suficiente para la fabricación de una composición inmunogénica para su uso en vacunación. Los procedimientos y composiciones pueden usarse junto con otros procedimientos conocidos en la técnica. Del mismo modo, los diversos procedimientos y composiciones pueden usarse individualmente o en combinación entre sí.

En la técnica se conocen procedimientos para producir ooquistes, tales como ooquistes de Eimeria, (véase, por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 3.147.186 de Edgar; las Patentes de Estados Unidos Nº 4.544.548 y 4.863.731 de Davis y col., la Publicación de Patente Internacional WO 00/50072 (Pfizer, Inc.) y la publicación de patente internacional WO 02/37961 (Novus international, Inc.); Hammond y col., (1944) Amer. J. Vet. Res. 5: 70; Hill y col., (1961) J. Parasit. 47:357; Jackson, (1964) Parasitology 54: 87; Lotze y col., (1961) J. Parasit. 47: 588; Schmatz y col., (1984) J. Protozool. 31: 181; Whitlock, (1959) Aust. Vat. J. 35:

310. En general, estos métodos implican infectar a un animal con el protozoo de interés, recoger las heces que contienen ooquistes, procedentes del animal infectado, purificar los ooquistes de la materia fecal mediante una serie de procedimientos de separación tales como tamización, centrifugación, filtración y/o flotación por densidad, provocar la esporulación de los ooquistes, etapas de separación opcionales adicionales y, opcionalmente, desinfectar los ooquistes esporulados para inactivar los microorganismos contaminantes (incluyendo bacterias, mohos, hongos, levaduras y virus). Para formar un producto final, pueden combinarse diferentes preparaciones de ooquistes (por ejemplo, de diferentes especies o cepas), por ejemplo, una vacuna contra especies protozoarias múltiples (por ejemplo, Eimeria).

Las expresiones “contaminación microbiana” o “contaminación por microorganismos” pretenden indicar la presencia de microorganismos viables detectables y no deseados que incluyen, pero sin limitación, bacterias, mohos, hongos, levaduras y virus. En realizaciones particulares, la preparación de ooquistes carece esencialmente de contaminación microbiana detectable lo que significa que, en la preparación, no se detectan niveles significativos de contaminación microbiana.

La abreviatura “v/v” se refiere a “volumen/volumen”. Del mismo modo, la abreviatura “p/v” se refiere a “peso/volumen”.

La presente invención se describe con más detalle a continuación. Composiciones Inmunogénicas

Las composiciones inmunogénicas, producidas usando los procedimientos descritos en el presente documento, pueden administrarse para vacunar, a un sujeto animal, contra una enfermedad protozoaria. Para provocar una respuesta inmunogénica, puede administrase una composición inmunogénica (por ejemplo, una vacuna) que contiene ooquistes producidos usando los procedimientos descritos en el presente documento. Típicamente, la composición inmunogénica comprende una cantidad inmunogénica de ooquistes, como se describe en el presente documento, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una “cantidad inmunogénica” es una cantidad de los ooquistes que es suficiente para iniciar o suscitar una respuesta inmune en el sujeto al cual se administra la composición inmunogénica. Tal como entiende un experto en la materia, la composición inmunogénica puede formularse con organismos vivos, atenuados y/o destruidos. En el caso de una vacuna viva contra la cocciodiosis, suministrada in ovo, la cantidad de ooquistes es generalmente suficiente para producir una infección inicial a un nivel relativamente bajo, que después, continúa con rondas múltiples de re-infección, a través de reciclaje, conduciendo, en última instancia, a inmunidad. El análisis anterior se refiere a ooquistes, pero también es aplicable a otras formas de vida, tales como esporozoitos o esporocistos.

Por “farmacéuticamente aceptable” se entiende un material que es biológicamente deseable o deseable de otra manera, es decir, el material puede administrarse a un sujeto sin causar ningún efecto biológico indeseable. Por lo tanto, dicha composición farmacéutica puede usarse, por ejemplo, para preparar composiciones para inmunización. Los vehículos fisiológica y farmacéuticamente aceptables pueden contener otros compuestos que incluyen, pero sin limitación, estabilizantes, sales, tampones, adyuvantes y/o conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, antifúngicos y antivirales) como se conoce en la técnica. No es preciso que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea estéril, aunque generalmente lo será para la administración in ovo a embriones aviares.

Puede emplearse cualquier vía administración de la composición inmunogénica conocida en la técnica siempre que se provoque una respuesta inmune activa (preferentemente, una respuesta inmune protectora) contra el protozoo. Cuando el sujeto es un ave, la composición inmunogénica puede administrarse in ovo o después de la eclosión. Las vías de administración ejemplares son administración oral después de la eclosión o inyección in ovo en el amnios. En realizaciones particulares de la invención, se emplea la administración

in ovo usando instrumental de inyección automatizado.

Los términos “vacunación” o “inmunización” se entienden bien en la técnica. Por ejemplo, puede entenderse que los términos "vacunación" o "inmunización" son un proceso que aumenta una reacción inmune en un sujeto contra un antígeno, y por lo tanto su capacidad para resistir o superar la infección. En la técnica se conocen procedimientos de vacunación de aves in ovo contra Eimeria (por ejemplo en las publicaciones de patente internacional WO 96/40234 y WO 96 40233; Pfizer, Inc.).

Las expresiones “inmunidad protectora” o “respuesta inmune protectora”, como se usa en el presente documento, pretenden significar que el animal huésped crea una respuesta inmune activa contra la vacuna, de tal manera que, después de una exposición o estimulación posterior, el animal es capaz de combatir la infección. Por lo tanto, una respuesta inmune protectora disminuirá la incidencia de morbilidad y mortalidad a partir de la exposición posterior contra el patógeno entre los animales tratados. Los expertos en la materia comprenderán que en un establecimiento comercial de cría de animales, puede valorarse la producción de una respuesta inmune protectora evaluando los efectos de la vacunación en la bandada o rebaño en su conjunto, por ejemplo, pudiendo haber aún signos de enfermedad o de morbilidad y mortalidad en una minoría de animales vacunados.

Por “respuesta inmune activa”, se entiende cualquier nivel de protección a partir de una exposición posterior al protozoo o antígenos protozoarios, que tenga algún beneficio en una población de sujetos, ya sea en forma de mortalidad disminuida, lesiones disminuidas, tasas de conversión de alimento mejoradas, o la reducción de cualquier otro efecto perjudicial de la enfermedad y similar, independientemente de si la protección es parcial o completa. Una “respuesta inmune activa” o “inmunidad activa” se caracteriza por la “participación de tejidos y células huéspedes después de una confrontación con el inmunógeno”. Esto implica diferenciación y proliferación de células inmunocompetentes en tejidos linforreticulares, lo que conduce a la síntesis de anticuerpos o al desarrollo de reactividad mediada por células, o ambas.” Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, en IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Indicado de manera alternativa, después de la exposición a inmunógenos por infección, el huésped crea una respuesta inmune activa o, como en este caso, por vacunación. La inmunidad activa puede contrastarse con la inmunidad pasiva, que se adquiere mediante la “transferencia de sustancias preformadas (anticuerpo, factor de transferencia, injerto tímico, interleucina-2) de un huésped inmunizado activamente contra un huésped no inmune”. Id. Recogida y Esporulación de Ooquistes

Los ooquistes se recogen típicamente en las heces de animales infectados y después

esporulan en presencia de oxígeno antes de adquirir la infectividad. De acuerdo con muchos procedimientos convencionales, los ooquistes se recogen y se provoca la esporulación en una solución que contiene dicromato de potasio al 2,5%. El dicromato de potasio actúa como una solución antimicrobiana y como una fuente de oxígeno para la esporulación de ooquistes. Sin embargo, el dicromato de potasio es un material peligroso y requiere eliminación especial como residuo peligroso. De acuerdo con procedimientos convencionales, el dicromato de potasio se elimina de la preparación de ooquistes para producir un producto final que esencialmente no contiene este compuesto peligroso.

De acuerdo con procedimientos de la técnica anterior, las heces que contienen ooquistes pueden recogerse en seco o en un medio líquido, que contiene dicromato de potasio, durante el período máxima producción para cada especie (por ejemplo, de aproximadamente tres, cuatro o cinco días a aproximadamente de seis a nueve días después de la post-inoculación para especies de Eimeria). Después del periodo de recogida, los ooquistes se someten posteriormente a una separación inicial de los desechos fecales usando técnicas tales como tamización o flotación por densidad y después se colocan en un medio de dicromato de potasio recién preparado, se agita, y se oxigena durante 48 a 72 horas para potenciar el proceso de esporulación.

En la Patente de Estados Unidos Nº 3.147.186 de Edgar, se describe la expoliación de ooquistes de Eimeria usando dicromato de potasio, del 1% al 4%, como un medio de esporulación. Esta patente indica que “este compuesto cumple los diversos objetivos de actuar como un agente antibacteriano, antifúngico y antiviral y también proporcionando oxígeno a los ooquistes durante y después de la esporulación de manera que ayuda a conservar su viabilidad” (Col. 11, líneas 47-50).

Ryley, y col., (1976) Parisitology 73(3): 311-326), describen el uso de soluciones de dicromato de potasio al 2,5% como un medio de recogida, de esporulación y de conservación a largo plazo.

Cost 89/820, Biotechnology, Guidelines on techniques in coccidiosis research. Eckert, J., R. Braun, M.W. Shirley, y P. Coudert, editors, 1995. European Commission, directorate-General XII, Science, Research and Development, Agriculture Biotechnology, Luxemburgo, pág. 8 también describen el uso de dicromato de potasio al 2,5% en la producción de ooquistes.

Un medio para la recogida de ooquistes, siendo el medio de recogida la composición como se define en conexión con el uso de la invención anterior y para controlar el crecimiento de microorganismos no deseados y también puede contener otros compuestos antimicrobianos.

Los ooquistes pueden recogerse de heces, núcleos fecales, revestimientos intestinales y similares procedentes de animales infectados. Sin embargo, para fines comerciales, los ooquistes se recogerán típicamente en las heces. Las heces se ponen en contacto con el medio de recogida, que puede servir para uno o más fines, por ejemplo, puede tener propiedades antimicrobianas (por ejemplo, antibacterianas, antifúngicas, antivirales y similares), y/o puede proporcionar oxígeno para mantener la viabilidad de los ooquistes. En el medio de recogida, el oxígeno, también puede inducir la esporulación durante el periodo recogida y puede acortar e incluso eliminar una etapa de esporulación distinta.

Por "recogida" o "recolección" de heces u ooquistes en el medio de recogida de la presente invención, no es necesario que las heces/ooquistes se recojan directamente en el medio de recogida. Las heces/ooquistes pueden recogerse en “seco” y después transferirse al medio de recogida descrito en el presente documento. Las heces/ooquistes pueden transferirse al medio de recogida aproximadamente 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 12, 24, 36 ó 48 horas después de la producción fecal. Las heces que contienen los ooquistes pueden extenderse en una cinta transportadora o superficie inclinada y después transferirse a un recipiente de recogida que contiene un medio de recogida de la invención. Las heces pueden pulverizarse con el medio de recogida durante la transferencia (es decir, en la cinta transportadora o superficie inclinada) al recipiente de recogida.

La proporción de heces con respecto al medio de recogida no es crítica siempre que ésta sea suficiente para controlar el crecimiento microbiano y, si se desea, iniciar el proceso de esporulación. Las proporciones ejemplares de heces con respecto al medio de recogida son aproximadamente: 1: 0,25, aproximadamente 1:0,5, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5 o aproximadamente

1:10 (v/v).

En el medio de recogida, puede usarse cualquier compuesto de peroxígeno conocido en la técnica. Los compuestos ejemplares incluyen peróxido de hidrógeno, perborato de sodio (por ejemplo, la forma monohidrato o tetrahidrato), percarbonato de sodio, peróxido de magnesio, peróxido de calcio, peróxido de cinc, peróxido de urea y una combinación de los mismos. Los compuestos de peróxido pueden usarse con o sin un activador tal como tetraacetilendiamina (TAED), la TAED se usa típicamente a una concentración de aproximadamente 1-3%.

El compuesto de peroxígeno se incluye en el medio de recogida a una concentración suficiente para conseguir el efecto deseado (por ejemplo acción microbiana y/o esporulación), pero insuficiente para causar lesión indebida a los ooquistes. La concentración del compuesto de peroxígeno puede ser tan baja como aproximadamente 0,1, 0,25, 0,5 o el 1% (v/v) o (p/v) y tan alta como aproximadamente 0,5%, 1%, 3%, 5% o 10% (v/v) o (p/v). Cuando el compuesto de peroxígeno es peróxido de hidrógeno, la concentración en el medio es típicamente de aproximadamente el 0,1%, 0,25% ó 0,5% (v/v) a aproximadamente el 1%, 3% o 5% (v/v).

El ácido orgánico es ácido cítrico, ácido acético, ácido propiónico o cualquier otro mono-o poli-ácido acético o una combinación de los mismos. La concentración del ácido orgánico en el medio puede ser aproximadamente del 1%, 2%, 3%, 5%, 8% o 10% (v/v) o (p/v)

o mayor. La concentración del ácido orgánico puede ser adicionalmente menor de aproximadamente el 15%, 12%, 10% (v/v) o (p/v) o inferior. El ácido orgánico puede incluirse a una concentración de aproximadamente el 1-15% o el 3-10% (v/v) o (p/v).

Además del compuesto de peroxígeno, la composición puede contener de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 20% o de aproximadamente el 2,5% a aproximadamente el 10% o el 15% de ácido cítrico y de aproximadamente el 0,05% a aproximadamente el 1% o de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 0,5% de ácido propiónico.

El medio de recogida puede contener adicionalmente otros componentes, que incluyen tampones, sales, agentes antimicrobianos y similares. Puede incluirse un agente antiespumante. Los agentes antiespumantes pueden usarse ventajosamente para reducir la formación de espuma y aglutinación de los ooquistes.

Puede usarse un compuesto de peroxígeno y un ácido (o ácidos) orgánico junto con más de un medio de recogida o de esporulación tradicional que contenga dicromato de potasio. El medio de recogida y esporulación descrito en el presente documento no contiene dicromato de potasio y puede ser seguro para su uso y más fácil de eliminar que los medios que contienen dicromato de potasio.

El medio de peroxígeno que comprende un compuesto de peroxígeno y un ácido orgánico (cada uno como se ha descrito anteriormente) puede usarse, de manera alternativa o adicionalmente como un medio de esporulación. Los presentes inventores han descubierto que, cuando se usa el medio de peroxígeno como un medio de recogida, un porcentaje significativo de ooquistes de Eimeria esporulan durante el periodo de recogida. Al menos aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95, 98% o más de los ooquistes pueden esporular durante el periodo de recogida (es decir, antes de cualquier etapa de purificación).

El medio de peroxígeno puede usarse como un medio de esporulación en una etapa de esporulación distinta para completar el proceso de esporulación. Además, si no se emplea el medio de recogida (por ejemplo, si se usa un medio de recogida de dicromato de potasio), es probable que se realice una etapa de esporulación diseñada para conseguir la suficiente esporulación de la preparación de ooquistes.

Por consiguiente, en el presente documento se describe un procedimiento de esporulación de ooquistes (por ejemplo, ooquistes de Eimeria), que comprende las etapas de proporcionar una composición que comprende ooquistes y provocar la esporulación de los ooquistes en un medio de esporulación de la invención durante un tiempo y en condiciones adecuadas para la esporulación.

Realizando la esporulación después del periodo de recogida, las heces se recogen típicamente del animal, y después se someten opcionalmente a etapas de purificación tales como tamización, filtración y similar. Después, los ooquistes se transfieren al medio de esporulación, y generalmente se deja que la esporulación prosiga durante aproximadamente 24-96 horas, por ejemplo, durante aproximadamente 48-72 horas en condiciones apropiadas. Por ejemplo, la solución puede removerse o agitarse y oxigenarse durante el proceso de esporulación.

Aunque entre el proceso de recogida y el de esporulación no es necesario cambiar el medio de peroxígeno, con fines de fabricación comerciales, generalmente habrá una o más etapas de purificación intermedia y antes de la etapa de esporulación se añadirá medio de esporulación recién preparado.

El proceso de esporulación puede realizarse conjuntamente con el proceso de recogida y/o desinfección (descrito a continuación).

La proporción de sólidos con respecto al medio de recogida no es crítica siempre que ésta sea suficiente para conseguir el nivel de esporulación deseado y para controlar el crecimiento microbiano. Las proporciones ejemplares de heces con respecto al medio de recogida son aproximadamente 1:0,25, aproximadamente 1:0,5, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5 o aproximadamente 1:10 (v/v).

Por ejemplo, las heces que contienen los ooquistes pueden recogerse en el medio de recogida/esporulación descrito en el presente documento. Los ooquistes se purifican del material fecal usando técnicas de tamización, flotación por densidad y/o de filtración. Después, los ooquistes se sedimentan por centrifugación y se resuspenden en medio de recogida/esporulación recién preparado y se deja que la esporulación prosiga en condiciones apropiadas (por ejemplo con agitación y/u oxidación) durante aproximadamente 48-72 horas.

Después, los protozoos esporulados pueden someterse opcionalmente a procedimientos de purificación y/o desinfección adicionales (descritos a continuación).

El uso del medio, como un medio de recogida y/o de esporulación puede ser ventajoso

ya que puede proteger a los ooquistes de la sequedad, reducir la biocarga desde el inicio del periodo de recogida, proporcionar tasas de esporulación elevadas y puede eliminarse más fácilmente que los medios convencionales que contienen dicromato de potasio.

Después de la esporulación, pueden realizase etapas para eliminar el compuesto de peroxígeno, por ejemplo, usando un proceso enzimático, diálisis y/o filtración. Por ejemplo, el compuesto de peroxígeno puede eliminarse usando descomposición catalítica (por ejemplo, un proceso enzimático o tratamiento químico tal como con dióxido de manganeso), diálisis y/o filtración. En el caso del peróxido de hidrógeno, para reducir o eliminar el peróxido de hidrógeno residual puede usarse catálisis. Desinfección de Ooquistes

La etapa de desinfección es una etapa opcional que se empleará típicamente en los procedimientos de producción de ooquistes para vacunas in ovo y, algunas veces, también se usa para vacunas después de la eclosión. Como se conoce en la técnica, para su uso en preparaciones de vacunas, los ooquistes se desinfectan convencionalmente usando soluciones de hipoclorito de sodio, que pueden producir daños en la pared del ooquiste, debilitando la estructura del ooquiste y posiblemente reduciendo la viabilidad a largo plazo de los ooquistes desinfectados durante el almacenaje.

Vetterling, J.M. ((1969) J. Parasitology 55(2): 412-417) describe la producción de ooquistes estériles usando medio con hipoclorito.

Jackson, A.R.B. ((1964) Parasitology 54: 87-93) también describe el aislamiento de esporozoitos coccidiales viables usando hipoclorito como un medio desinfectante.

Nyberg y Knapp ((1970) Proceeding of the Helminthological Society of Washington 37: 32-36) describen el efecto del hipoclorito de sodio sobre la pared de los ooquistes de Eimeria tenella como se muestra por microscopía electrónica.

Los presentes inventores han descubierto que el medio de recogida/esporulación, descrito anteriormente, que comprende un compuesto de peroxígeno y un ácido orgánico, también puede emplearse como un medio de desinfección (estéril). El medio de desinfección puede comprender adicionalmente hipoclorito (es decir, lejía) u otros agentes desinfectantes conocidos en la técnica.

Después de la esporulación (descrita anteriormente), la preparación de ooquistes puede someterse a procedimientos de purificación adicionales (por ejemplo, filtración por densidad, flotación y similar), seguido de desinfección. Como alternativa, puede usarse una etapa de desinfección antes de, o conjuntamente con, la etapa de esporulación. Sin embargo, generalmente es ventajoso desinfectar los ooquistes casi al final del proceso de purificación ya que, después de la desinfección, se realizaran etapas usando procedimientos y reactivos

estériles.

Por “desinfectando” o “desinfección” o “desinfectado” se entiende que existe una reducción en la carga microbiana contaminante (es decir, microorganismos contaminantes viables, como se ha definido anteriormente) en la preparación de ooquistes. No es necesario que la preparación de ooquistes esté absolutamente libre de contaminación microbiana, siempre que la preparación final sea adecuada para su uso deseado (es decir, por ejemplo, como una vacunas). En el caso de vacunas destinadas para administración in ovo en aves, la preparación, en general, no contendrá esencialmente contaminación microbiana detectable (es decir, no se detectan niveles de microorganismos contaminantes significativos). Puede haber una reducción de al menos aproximadamente un 50%, 60%, 75%, 85%, 90%, 95%, 99% o más en microorganismos contaminantes detectables en comparación con el nivel en ausencia de desinfección.

En la técnica se conocen procedimientos para detectar microorganismos y dependen de la clase de microorganismo a detectar.

Por consiguiente, en el presente documento se describe un procedimiento para desinfectar ooquistes, que comprende la etapa de proporcionar una composición que contiene ooquistes y desinfectar los ooquistes en un medio desinfectante (como se ha descrito anteriormente) durante un tiempo y en condiciones suficientes para conseguir el nivel de desinfección deseado de la composición.

El proceso de desinfección puede dar lugar a una preparación con un nivel de contaminación microbiana que sea adecuado para la administración a un sujeto animal (por ejemplo, en procedimientos de vacunación in ovo). El procedimiento de desinfección puede realizarse durante cualquier periodo de tiempo adecuado, típicamente durante aproximadamente una hora a aproximadamente 12, 24 ó 48 horas.

Los procesos de esporulación y desinfección pueden realizarse de manera simultánea.

La temperatura del proceso de desinfección no es crítica y generalmente puede realizarse a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 40ºC. Preferentemente, los ooquistes no se someten a congelación o a exposición prolongada a elevadas temperaturas (por ejemplo, la exposición a 40ºC sería típicamente durante menos de algunas horas o incluso menos de 1 hora). La desinfección puede realizarse durante aproximadamente 24 a 72 horas a aproximadamente 30ºC.

La proporción de la preparación de ooquistes con respecto al medio de desinfección no es crítica siempre que sea suficiente para reducir el crecimiento microbiano al nivel deseado. Las proporciones ejemplares de heces con respecto al medio de recogida son aproximadamente 1:0,25, aproximadamente 1:0,5, aproximadamente 1:1, aproximadamente 1:2, aproximadamente 1:3, aproximadamente 1:4, aproximadamente 1:5 o aproximadamente

1:10 (v/v).

Después de la desinfección, pueden realizarse etapas para eliminar el compuesto de peroxígeno, por ejemplo, usando descomposición catalítica (por ejemplo, un proceso enzimático o tratamiento químico tal como con dióxido de manganeso), dilución, diálisis y/o filtración. Por ejemplo, en el caso de peróxido de hidrógeno, para reducir o eliminar el peróxido de hidrógeno residual, puede usarse catalasa.

Como otra etapa adicional, la preparación de ooquistes puede ponerse en contacto (por ejemplo, pulverizarse, aclararse o mezclarse con) con una composición que disminuya la agregación entre los ooquistes, tal como una solución (por ejemplo, una solución acuosa) que contenga proteínas, péptidos, hidrolizado de proteína y/o aminoácidos. Los compuestos ilustrativos incluyen, pero sin limitación, proteína de soja, hidrolizado de soja, caseína, hidrolizado de caseína, lisozima, albúmina, albúmina de suero bovino, proteínas lácteas, aminoácidos (por ejemplo, arginina, fenilalanina y/o ácido aspártico), suero fetal de ternero, suero de pollo, leche completa y similar. En una realización particular, la solución antiagregación comprende un aminoácido cargado positivamente, un aminoácido cargado negativamente y un aminoácido neutro.

Típicamente, la concentración de cada componente en la solución será de aproximadamente 0,01 M a 10 M, aproximadamente de 0,05 M a 5 M o de aproximadamente 0,05 M a aproximadamente 2 M.

El pH de la solución puede seleccionarse de acuerdo con los componentes particulares usados en el medio y puede estar en el intervalo ácido neutro o alcalino. El pH de la solución anti-agregación puede estar en el intervalo neutro. Por ejemplo, la solución puede tamponarse con solución salina tamponada con fosfato (pH 7) o Solución Salina Equilibrada de Hanks (pH 7).

Para reducir la agregación, también pueden usarse otros compuestos, tales como agentes anti-espumantes (por ejemplo, antiespuma A).

Los ooquistes pueden ponerse en contacto con el medio anti-agregación en cualquier momento en el proceso de purificación en el que sea deseable reducir la agregación entre los ooquistes. Ventajosamente, esto puede usarse después del proceso de desinfección. En ausencia de una etapa de desinfección (por ejemplo, en algunos productos de vacunas después de la eclosión), este proceso puede usarse para reducir la agregación en el producto final. Como alternativa o de de manera adicional, la solución anti-agregación puede añadirse a la formulación final para reducir la agregación de ooquistes en su interior, Ryley, (1978) Parasitology 77: 33-39. En procedimientos de flotación, también se han usado soluciones no iónicas, tales como una solución de sacarosa concentrada. Un inconveniente de cualquier reactivo sólido, tal como cloruro de sodio o sacarosa, es que, antes de su uso, debe disolverse en una solución acuosa. En las Patentes de Estados Unidos Nº 4.544.548 y 4.863.731 de Davis y col., se demuestra un procedimiento para el control de coccidiosis en aves de corral. Estas patentes describen el uso de un proceso de flotación salina, es decir, flotación en una solución salina densa usando centrifugación y seguido de dilución y recuperación de ooquistes en una segunda etapa de centrifugación.

Ryley y col. ((1976) Parasitology 73(3): 311-326) describen un procedimiento para separar ooquistes de heces usando sacarosa, cloruro de sodio y flotación en sulfato de cinc.

Vetterling, J.M. ((1969) J. Parasitology 55(2): 412-417) describe técnicas de centrifugación de flujo continuo: flotación en solución de sacarosa a alta densidad, dilución con agua y recuperación de ooquistes por centrifugación adicional.

Marquardt, W.C. ((1961) J. Parasitology 47: 248-250) describe la separación de huevos de nematodos de desechos fecales por centrifugación en gradiente. Patnaik, B. ((1966) Indian Vet. J. 43: 414-422) desvela una técnica para obtener ooquistes coccidiales en estado puro procedentes de heces de pollo mediante una modificación del procedimiento de Marquardt.

Sharma y Reid ((1963) J. Parasitology 49: 159-960) desvelan un método de limpieza para ooquistes coccidiales usando sedimentación en gradiente de densidad.

La patente de publicación internacional WO 00/50072 (Pfizer, Inc.) describe el uso de un proceso de flotación en sulfato de sodio.

Dulski y col., (1988) Avian Diseases 32: 235, describen el uso de suspensiones en sílice coloidal (Percoll™) para flotación por densidad de ooquistes. En el presente documento, se describe un medio de flotación para purificar ooquistes de materia indeseable que comprende un líquido no iónico, de densidad elevada y una molécula o partícula policatiónica. El líquido no iónico, de densidad elevada, puede ser cualquier líquido acuoso que tenga una densidad de aproximadamente 1,08, 1,1, 1,12, 1,14, 1,16, 1,18 ó 1,2 g/ml. Típicamente, la densidad no será superior ya que la mayoría de los equipos de centrifugación comerciales no están destinados para su uso con soluciones de mayor densidad.

Las soluciones no iónicas, de densidad elevada, pueden ser glicerol, sorbitol, sacarosa, jarabe de maíz con alto contenido en fructosa, hidroximetilcelulosa o una combinación de los mismos.

Los presentes inventores han descubierto que, para mejorar las características de eliminación de desechos de los medios de flotación no iónicos, pueden usarse moléculas o partículas policatiónicas. En el medio de flotación puede incluirse cualquier policatión adecuado conocido en la técnica. Los policationes ilustrativos incluyen arginina, histidina, lisina, dietilaminoetil-celulosa (DEAE-celulosa) e iones metálicos polivalentes (por ejemplo, sales de hierro o aluminio tales como sulfato de aluminio y cloruro férrico). La concentración del policatión no es crítica, pero preferentemente, es lo suficientemente alta para promover la floculación de residuos, aunque insuficiente para dañar indebidamente a los ooquistes. Las concentraciones ejemplares del policatión en el medio son de aproximadamente 0,01 M, 0,05 M ó 0,1 M a aproximadamente 0,5 M, 1 M, 3 M o mayor.

El medio de flotación puede contener otros ingredientes tales como tampones o agentes anti-microbianos. En realizaciones particulares, el medio de flotación incluye un detergente no iónico (por ejemplo, Tween 20) y/o un agente anti-espumante (antiespuma A) para disminuir la probabilidad de que los ooquistes formen agregados.

También se describen procedimientos de purificación de ooquistes usando un procedimiento de flotación por densidad. El procedimiento puede comprender: suspender una preparación que contenga ooquistes, en una composición que comprenda un líquido no iónico, de densidad elevada y un policatión para formar una suspensión en condiciones suficientes para dar lugar a la flotación de los ooquistes, y recuperar los ooquistes de la suspensión. Generalmente, el material que contiene los ooquistes se mezcla con la solución de flotación, y se deja que la solución se separe, permaneciendo los ooquistes en la fracción sobrenadante y formando un sedimento los residuos fecales. Para facilitar o mejorar la separación, puede usarse centrifugación.

Los inventores han descubierto adicionalmente que el procedimiento de flotación puede potenciarse añadiendo aceite al medio de flotación, que comprende un medio de flotación no iónico, de densidad elevada (con o sin un policatión). El aceite puede ser cualquier aceite adecuado conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, aceite de maíz, aceite de cártamo, aceite de cacahuete, aceite de colza, aceite de semilla de soja y similar.

La adición del aceite puede mejorar la eliminación del residuo y pueden conseguir niveles de separación mejorados en ausencia de centrifugación a alta velocidad e incluso, puede eliminar del todo, la necesidad de centrifugación.

No existen límites particulares para la concentración del aceite en el proceso de flotación. El aceite se usa generalmente en el medio de flotación a una concentración de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 10% o aproximadamente del 3% a aproximadamente el 7% del volumen total de la solución de flotación.

Como alternativa, puede realizarse una etapa de flotación con aceite antes o después de la flotación en la solución no iónica, de densidad elevada, que contiene policatión, descrita anteriormente.

Después de la etapa (o etapas) de flotación, la fracción recuperada, que contiene los

ooquistes, puede procesarse adicionalmente por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la fracción puede someterse a procedimientos de purificación adicionales, y/o esporulación y/o desinfección como se conoce en la técnica o se describe en el presente documento.

El medio de flotación puede eliminarse de los ooquistes por cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo etapas de centrifugación/lavado, diálisis y filtración (por ejemplo filtración de flujo tangencial). Dieta de Producción

En particular, con respecto a la producción de ooquistes en aves, los inventores han observado que la dieta que las aves consumen en el momento o casi en el momento en que los ooquistes se liberan en las heces puede influir en el proceso de separación de los ooquistes de la materia fecal. De acuerdo con procedimientos tradicionales, las aves de corral generalmente consumen una dieta completa de puré o desmenuzada durante todo el periodo en el cual los ooquistes (por ejemplo, ooquistes de Eimeria) se liberan en las heces. Después de haber recogido la materia fecal, que contiene los ooquistes, comienzan las etapas de purificación basadas en técnicas generales tales como tamización y/o filtración. La dieta normal de las aves de corral contiene partículas muy finas, que pueden ser difíciles de separar de los ooquistes. Hasta donde alcanza el conocimiento de los inventores, las investigaciones descritas en el presente documento son las primeras que tratan y valoran el efecto de la dieta en el proceso de purificación de ooquistes de las heces de animales.

Los presentes inventores han observado que la separación de ooquistes de la materia fecal puede potenciarse (es decir, mejorarse) alimentando al ave infectada con una dieta de partículas grandes, es decir, una dieta que tenga un tamaño de diámetro medio grande. La dieta contiene típicamente una proporción sustancial de ingredientes que no están molidos (es decir, grano entero) o sólo parcialmente molidos o que están extruídos o extraídos. Los ingredientes ejemplares incluyen maíz craqueado, semillas de soja extruídas, avena entera y combinaciones de los mismos. Algunas veces los granos pueden tamizarse para eliminar los finos. La dieta de partículas grandes puede contener menos de aproximadamente el 40% (p/p), menos de aproximadamente el 30% (p/p), menos de aproximadamente el 20% (p/p), menos de aproximadamente el 10% (p/p), menos de aproximadamente 5% (p/p), o incluso menos, alimento molido o harina (por ejemplo, maíz molido, semilla de soja, harina de pescado o de hueso y similar). La dieta de partículas grandes puede contener esencialmente componentes harinosos no molidos. Los expertos en la materia apreciarán que a la harina se añadirán, típicamente, vitaminas minerales, aminoácidos y otros micronutrientes en una formulación granular premezclada.

Las dietas ilustrativas de las aves de corral, contienen al menos aproximadamente un 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o mayor (p/p) de semillas de soja extruídas, almidón craqueado, avena entera y/u otros componentes alimenticios no molidos o solo parcialmente molidos, extruídos o extraídos como se conoce en la técnica, así como cualquiera de vitaminas, minerales, aminoácidos y sales para mantener la salud nutricional del ave. Los pollos pueden consumir una dieta que consiste, esencialmente, en 45-55% (p/p) de semillas de soja extruídas, 30-40% (p/p) de almidón craqueado y 5-15% (p/p) de avena entera así como vitaminas, minerales, aminoácidos y sales para mantener la salud nutricional del ave.

En general, al menos aproximadamente el 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70% (p/p) o más de las heces producidas por un ave alimentada con una dieta de partículas grandes, durante el periodo de recogida, se retiene en un tamiz de 0,5 mm. De manera alternativa, al menos aproximadamente el 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% (p/p) o más de las heces se retiene en un tamiz de 0,075 milímetros.

Desde la eclosión, un ave puede alimentarse con una dieta de partículas grandes. De manera alternativa, el ave comienza con una dieta de ave de corral normal y después se cambia a una dieta de partículas grandes en algún momento o antes del periodo de recogida, por ejemplo, al menos aproximadamente siete días, cinco días, tres días, dos días, un día o doce horas antes de la recogida o, como alternativa, en el momento de la recogida. Las aves generalmente se alimentan de una dieta de partículas grandes durante todo el período de recogida. Las aves pueden alimentarse con la dieta de partículas grandes durante un período menor al de toda la recogida, siempre que se observe alguna mejora o ventaja en la purificación.

Las heces que contienen los ooquistes liberados se recogen típicamente durante el periodo de máxima producción para cada especie, comenzando típicamente tres, cuatro o cinco días después de la inyección y continuando la recogida durante aproximadamente de dos a cuatro días después de esto, dependiendo de la especie: El periodo de recogida puede tener lugar en algún momento durante aproximadamente 3-9 o aproximadamente de 4-8 días después de la infección.

La dieta de producción de partículas grandes de la presente invención puede dar lugar una eliminación más fácil de residuos, producciones de ooquistes mejoradas y/o costes de producción reducidos.

A continuación, para ilustrar la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos y no deben interpretarse como limitantes de la misma.

EJEMPLO 1

Uso de Medio Basado en Peroxígeno y Ácido Orgánico para la Recogida y Esporulación de Ooquistes

Este Ejemplo, así como en los dos ejemplos siguientes, describe un medio de

5 recogida/esporulación/desinfección que protege a los ooquistes de la sequedad, reduce la biocarga desde el principio del periodo de recogida, produce tasas de esporulación altas, es más fácil de eliminar que el dicromato de potasio y es un reactivo de desinfección más suave que el hipoclorito.

Se desarrolló un medio que consistía en peróxido de hidrógeno al 0,75%, ácido cítrico

10 al 10%, ácido propiónico al 0,25% y Antiespuma A al 0,1% que puede servir como un medio para la recogida y esporulación de ooquistes. El medio acuoso protege a los ooquistes de la sequedad, actúa como un medio anti-microbiano para destruir virus y previene la acumulación de bacterias o moho durante el proceso de recogida y promueve la esporulación durante el proceso de recogida. La antiespuma A se añade para evitar el exceso de formación de espuma

15 de la suspensión fecal y sirve para reducir la aglomeración de ooquistes. Sin embargo, la antiespuma A es opcional en el medio. Podrían usarse otros compuestos de peroxígeno, tales como perborato de sodio (la forma monohidrato o tetrahidrato) en lugar de, o en combinación con, el peróxido de hidrógeno. Los ooquistes de diversas especies de Eimeria se produjeron en pollos y se recogieron

20 en el medio durante el periodo de máxima producción para cada especie. Para recoger las heces de 8 a 10 aves, se usaron, aproximadamente, de 2 a 3 litros de medio de recogida. Al final del periodo de recogida, los ooquistes se purificaron usando técnicas de tamización y de flotación por densidad. Después, los ooquistes se colocaron en medio de esporulación recién preparado, se agitó y se oxigenó durante 72 h. Las tasas de

25 esporulación se determinaron usando técnicas microscópicas convencionales inmediatamente después de la recogida y de nuevo después de procesamiento a través de tamización, flotación y tratamiento de expoliación de 3 días. Los resultados se muestran en la Tabla 1: TABLA 1

Especies de Eimeria

Esporulación (%) (antes del procesamiento) Esporulación (%) (después del procesamiento)

E. maxima

82,3 94,3

E. mitis

92,7 92,8

E. tenella

78,3 97,6

E. acervulina

89,7 91,7

Cuando los ooquistes se recogieron en el nuevo medio, se observó que la mayoría de los procesos de esporulación se habían producido antes del procesamiento y en todas las cepas de Eimeria ensayadas, se observaron tasas altas de esporulación final. Estos resultados sugieren que el medio de recogida y esporulación propuesto proporciona un procedimiento eficaz para conseguir altos niveles de esporulación durante el periodo de recogida de los ooquistes, incluso antes de realizar el proceso de esporulación de 48 a 72 horas convencional.

5 EJEMPLO 2

Demostración de Propiedades Fungiestáticas y Fungicidas del Medio de Desinfección Basado en Peroxígeno y Ácido Orgánico

Se realizó un experimento para evaluar las propiedades fungiestáticas o fungicidas de los reactivos usados en el medio de recogida y de esporulación descrito en el Ejemplo 1. Se

10 realizaron ensayos de esterilidad iniciales usando caldo de soja tripticasa (TSB). Se creó una reserva fúngica suspendiendo raspados fúngicos de un cultivo de reserva de Scopulariopsis brumptil en 25 ml de PBS y filtrando este material a través de un filtro grueso Swinney (∼100: m). Para los tratamientos (Trt) 2-11 se inocularon doscientos litros de esta reserva fúngica en tres matraces con TSB.

15 Los tratamientos evaluaron diversos de los componentes del medio de recogida /esporulación/desinfección descritos en el Ejemplo 1, en solitario o en combinación. Además del ácido propiónico, también se ensayó el propionato de sodio. Los tratamientos se evaluaron a temperatura ambiente durante 28 días; después de 28 días de incubación, se sembró un ml de cada matraz duplicado, para todos los tratamientos, sobre una placa de agar de extracto de

20 malta (MEA) con cloramfenicol (50 g/ml) y penicilina -G (100 U/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 14 días. El reactivo se consideró fungiestático si no se observaba crecimiento durante los 28 días de incubación de los matraces con TSB (-) y se observó crecimiento cuando el medio, dentro del matraz, se transfirió a las placas MEA (+). El reactivo se consideró fungicida si no se observa crecimiento en los matraces con TSB (-) o después de

25 transferir a las placas MEA (-). En la Tabla 2 se presentan los resultados.

TABLA 2

Trt

Descripción Crecimiento en Matraces con TSB (Día 28) Crecimiento en placas MEA (Día 14)

1

Control de medios - +

2

Control de hongos + +

3

Peróxido de hidrógeno al 0,75% en el medio - -

4

Ácido propiónico al 0,25% en el medio +

5

Ácido cítrico al 10% en el medio -

6

Peróxido de hidrógeno al - -

Trt

Descripción Crecimiento en Matraces con TSB (Día 28) Crecimiento en placas MEA (Día 14)

0,75%, ácido propiónico al 0,25% en el medio

7

Peróxido de hidrógeno al 0,75%, ácido cítrico al 10% en el medio - -

8

Ácido cítrico al 10%, ácido propiónico al 0,25% en el medio - -

9

Peróxido de hidrógeno al 0,75%, ácido cítrico al 10%, ácido propiónico al 0,25 % en el medio - -

10

Propionato de sodio al 0,25% en el medio + +

11

Propionato de sodio al 0,5% en el medio + +

Como se esperaba, en este experimento, los controles de los medios permanecieron negativos para el crecimiento fúngico y los controles fúngicos fueron positivos. En los ensayos de matraces y placas, el propionato de sodio (0,25% o 0,50%) no inhibió el crecimiento

5 fúngico. El tratamiento con ácido propiónico (0,25%) en los medios (Tratamiento 4) fue fungistático: inhibió el crecimiento fúngico en el matraz, pero no en las placas MEA. Los otros tratamientos (excluyendo los controles) fueron aparentemente fungicidas, no observándose crecimiento fúngico en los matraces ni crecimiento en las placas. Estos resultados indican las potentes propiedades fungiestáticas y fungicidas de los reactivos usados en la formulación

10 propuesta (Tratamiento 9). EJEMPLO 3 Uso del Medio de Desinfección Basado en Peroxígeno y Ácido Orgánico en la Producción de Ooquistes Se realizó un experimento para investigar la utilidad del medio de esporulación descrito

15 en el Ejemplo 1 como un reactivo de desinfección. Se produjeron ooquistes de E. maxima en broilers y se purificó usando una técnica de flotación por densidad. Se provocó la esporulación de ooquistes durante 72 h usando ácido cítrico al 10%, ácido propiónico al 0,25%, peróxido de hidrógeno al 0,75% y 1 ml/l de Antiespuma A. Después de la esporulación, los ooquistes se centrifugaron y se resuspendieron en un medio de esporulación filtrado estéril (ácido cítrico al

20 10%, ácido propiónico al 0,25%, peróxido de hidrógeno al 0,75%, 1 ml/l de Antiespuma A) y se incubó durante una noche a temperatura ambiente con agitación. Después de la desinfección, se realizó un intercambio de tampón mediante diafiltración usando fosfato de potasio 200 mM, pH 7, seguido de PBS sin conservantes. La muestra a granel se conservó en frascos de vidrio aproximadamente un tercio de su capacidad a 4ºC. Las submuestras del producto final se enviaron a un laboratorio de ensayo comercial para ensayos de pureza de acuerdo con las directrices del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA). En la Tabla 3 se muestran los resultados de ensayos de esterilidad 9CFR después de la desinfección usando medio basado en peróxido.

TABLA 3

Número de Ensayo USDA

Descripción Periodo del Ensayo (Días) Resultados

9CFR 113.27

Detección de bacterias y hongos viables extraños en vacunas vivas 28 Negativo

9CFR 113.28

Detección de micoplasma 28 Negativo

9CR 113.30

Detección de salmonella 4 Negativo

9CFR 113.31

Detección de leucosis linfoide aviar 30 Negativo

9CFR 113.34

Detección de virus hemoaglutinante 7 Negativo

Los resultados de todos los ensayos indican que el medio de esporulación filtrado

10 estéril puede usarse como una alternativa eficaz frente al hipoclorito de sodio para la desinfección de ooquistes. EJEMPLO 4 Desinfección de Ooquistes Usando un Medio Basado en Peroxígeno y Ácido Orgánico Se prepararon dos lotes experimentales de ooquistes de E. máxima (Proceso A y

15 Proceso B). Cada lote se purificó usando procedimientos de tamización y flotación. Después cada lote se dividió y se ensayaron dos métodos de desinfección (hipoclorito de sodio y peróxido de hidrógeno con ácido cítrico y ácido propiónico). Las muestras de cada ensayo se sometieron a diversos ensayos de pureza incluyendo ensayos 9CFR y dos métodos PCR para la detección de virus. Los resultados se muestran en la Tabla 4:

20 TABLA 4

Ensayo de pureza

Descripción Proceso A Hipoclorito Proceso A Peróxido de hidrógeno con ácido cítrico y ácido propiónico Proceso B Hipoclorito Proceso B Peróxido de hidrógeno con ácido cítrico y ácido propiónico

9CFR 113.27

Detección de bacterias y hongos viables extraños en vacunas vivas Negativo Negativo Negativo Negativo

9CFR 113.28

Detección de micoplasma Negativo Negativo Negativo Negativo

9CFR 113.30

Detección de salmonella Negativo Negativo Negativo Negativo

Ensayo de pureza

Descripción Proceso A Hipoclorito Proceso A Peróxido de hidrógeno con ácido cítrico y ácido propiónico Proceso B Hipoclorito Proceso B Peróxido de hidrógeno con ácido cítrico y ácido propiónico

9CFR 113.31

Detección de leucosis linfoide aviar Negativo Negativo Negativo Negativo

9CFR 113.34

Detección de virus hemaglutinante Negativo Negativo Negativo Negativo

9CFR 113.55

Agentes extraños en inóculo primario Negativo Negativo Negativo Negativo

Virus de la Anemia infecciosa del pollo por PCR

Negativo Negativo Negativo Negativo

Virus Reticuloendotelial por PCR

Negativo Negativo Negativo Negativo

Los resultados de los ensayos de pureza indicaron que ninguno de los materiales

desinfectados presentó microorganismos contaminantes y que la solución de desinfección de

peróxido de hidrógeno fue tan eficaz como el hipoclorito.

Los ejemplos anteriores son ilustrativos de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes la misma.

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   El uso de una composición en la recogida, esporulación y/o desinfección de ooquistes protozoarios viables, comprendiendo dicha composición del 0,1% al 10% (v/v) o (p/v) de un compuesto de peroxígeno y del 1% al 15% (v/v) o (p/v) de un ácido orgánico, en el que dicho ácido orgánico es ácido acético, ácido cítrico, ácido propiónico u otro mono-o poli-ácido acético o cualquier combinación de los mismos y conteniendo dicha composición un pH ácido de pH 1 a pH 3.

2. 2.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho compuesto de peroxígeno se selecciona del grupo que consiste en peróxido de hidrógeno, perborato de sodio y una combinación de los mismos.

3. 3.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho compuesto de peroxígeno es peróxido de hidrógeno.

4. 4.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la concentración de peróxido de hidrógeno en la composición es del 0,1% (v/v) al 3% (v/v).

5. 5.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la concentración de peróxido de hidrógeno en la composición es del 0,25% (v/v) a 1% (v/v).

6. 6.

   El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho ácido orgánico comprende al menos ácido cítrico.

7. 7.

   El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho ácido orgánico comprende al menos ácido propiónico.

8. 8.

   El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha composición comprende peróxido de hidrógeno al 0,75%, ácido cítrico al 10% (p/v) y ácido propiónico al 0,25% (v/v).

9. 9.

   El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha composición es estéril.

10. 10.

    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, comprendiendo dicha composición adicionalmente ooquistes protozoarios.

11. 11.

    El uso, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de una composición en un procedimiento de recogida de ooquistes protozoarios viables, procedentes de un animal infectado, que comprende las etapas de:

    (a)

    obtener heces que comprenden ooquistes de un animal infectado por un protozoo, en el que el animal libera en sus heces los ooquistes del protozoo, y

    (b)

    poner en contacto las heces que comprenden los ooquistes del animal infectado, con dicha composición usada en cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

12. 12.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que las heces del animal, que comprenden los ooquistes procedentes del animal infectado, se recogen en una cinta transportadora o en una superficie inclinada.

13. 13.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que las heces del animal se ponen en contacto con la composición en la cinta transportadora o en la superficie inclinada.

14. 14.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que las heces, que comprenden los ooquistes procedentes de un animal infectado por un protozoo, se recogen en la composición.

15. 15.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 12, que adicionalmente comprende transferir las heces del animal a un recipiente de recogida que comprende la composición.

16. 16.

    El uso, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, de una composición en un procedimiento de esporulación de ooquistes protozoarios viables, que comprende las etapas de:

    (a)

    proporcionar una composición que comprende ooquistes protozoarios, y

    (b)

    provocar la esporulación de los ooquistes en dicha composición, usada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, durante un tiempo y en condiciones adecuadas para la esporulación.

17. 17.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la composición comprende las heces, que comprenden los ooquistes protozoarios, recogidas de un animal infectado por el protozoo.

18. 18.

    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, de una composición en un método de desinfección de ooquistes protozoarios viables, que comprende

    (a)

    proporcionar una preparación que comprende los ooquistes protozoarios, y

    (b)

    desinfectar los ooquistes en dicha composición usada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 durante un tiempo y en condiciones suficientes para conseguir el nivel de desinfección deseado de la preparación.

19. 19.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 18, en el que, después de dicha etapa de desinfección, la preparación no contiene contaminación microbiana detectable.

20. 20.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 19, en el que dicha etapa de desinfección se realiza de 12 a 48 horas.

21. 21.

    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 20, en el que el protozoo comprende una especie del género Eimeria.

22. 22.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la especie de Eimeria se selecciona del grupo que consiste en E. maxima, E. mitis, E. tenella, E. acervulina, E. brunetti,

    E. necatrix, E. praecox, E. mivati y una combinación de los mismas.

23. 23.

    El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la especie de Eimeria se selecciona del grupo que consiste en E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. innocua y E. subrotunda.

24. 24.

    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 23, en el que el animal es un ave.

25. 25.

    El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21 o reivindicación 23, en el que el ave es un pavo.

26. 25. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 22, en la que el ave es un pollo.