TW200813087A - Humanized anti-human osteopontin antibody - Google Patents

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200813087 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於活性及安定性優異的人化抗人造骨蛋白 (osteopontin)抗體，及使用該抗體治療及診斷疾病之方法。 【先前技術】 造骨蛋白（以下，稱爲「OPN」）爲骨中多半含有的酸性鈣 結合性糖蛋白質，於人類的情形，由於mRNA剪接作用 (splicing)的不同，已知可產生造骨蛋白-a (以下，稱爲 「OPN-a」）、造骨蛋白-b (以下，稱爲「〇PN-b」）及造骨蛋白 -c (以下，稱爲「OPN-c」）之至少3種同功型（isoform )(非 專利文獻1 )。其中，OPN-a之先驅物被認爲係由持有後述序 列表之序列編號23所示的胺基酸序列，藉由分泌，訊號胜肽 被切斷，而製造I17-N314之成熟體OPN-a。又，成熟體OPN， 藉由活體內凝血酶切斷168編號（OPN-a之場合）之精胺酸殘 基的C末端側，成爲N末端片段及C末端片段兩者。 上述OPN負責多種生理學、病理學上重要的機能，例如， ^ 負責細胞黏附、細胞遊走、腫瘤形成、免疫反應及媒介補體 的細胞溶解之抑制等機能，此多樣機能藉由多種細胞表面受 體媒介。OPN內部持有RGD序列（例如，OPN-a之第159-161 殘基），認識此RGD序列的ανβ3、ανβΐ及ανβ5等整合素 (integrin)爲 ΟΡΝ 之主要受體，其中，aV β3、aV βΐ 及 aV β5 整合素媒介血管平滑肌細胞之細胞黏附，更者，aV β3與巨 噬細胞、淋巴球、內皮細胞及平滑肌細胞等之遊走有關。 又，由迄今之硏究，亦已知ΟΡΝ藉由SVVYGLR序列（序列 200813087 編號10)與α9β1、α4β1及α4β7整合素結合，但此等中亦發現 α4β1與以凝血酶不能切斷的ΟΡΝ (非切斷型ΟΡΝ)及可以凝 血酶切斷的Ν末端片段（切斷型ΟΡΝ)之兩者結合，而α9β1 爲所謂僅結合凝血酶切斷型ΟΡΝ的樣式之差異（非專利文獻 2〜4)。此等之α9及α4、βΐ及β7之整合素次單元，彼此胺基酸 序列間之類似性高，而且，α4β1及α4β7整合素，主要於淋巴 球及單核球被發現，不過在嗜中性球中極少表現。另一方 面，介由嗜中性球中選擇性地高表現的VCAM-1或Tenascin-C f ! 等，（χ9β1負責嗜中性球遊走上必須的機能。又，於肌肉細胞 或上皮細胞、肝細胞等廣泛表現。如此，整合素次單元α4及 α9之細胞質功能域（domain)，各自通過微妙相異的細胞內 訊號傳導路徑，互相協同地促進白血球向炎症細胞之遊走及 凝集，增強此等之浸潤活性，而認爲與各種癌症反應有關。 如此，各式各樣種類之整合素，因促進白血球之遊走，且 與炎症反應有關，認爲抑制此等整合素活性的藥劑潛在性具 有作爲抗炎症劑的可能性。例如，整合素α V β3，於破骨細 〇 胞、血管內皮細胞及平滑肌細胞等中表現，經由抑制αν β3 整合素與各式各樣結合配位體之結合，例如，於關節，因可 期待關節破壞抑制作用，而實際進行aV β3抗體之開發。 然而，屬於整合素家族之受體，因於廣泛組織中普遍地表 現而負責生命活動維持上必須的機能，一旦於風濕性關節炎 或變形性關節炎之治療上使用抗整合素的抗體，於其他部位 上亦有相同抑制的可能性，亦擔心副作用之發生。 由如此的觀點，迄今爲止，風濕性關節炎、變形性關節症 -6 - 200813087 等病因明確，而嘗試提供更優異的治療方法。 例如，WOO2/08 1 522 (專利文獻1 )發現於風濕病患者及 變形性關節症患者中顯示關節腔液之OPN濃度爲高値，又， 風濕病患者中，於全OPN中所佔的凝血酶開裂型之N末端片 段之比例增大，確認OPN與此等疾病之發作有深度相關。專 利文獻1發現，於以凝血酶切斷OPN的N末端片段及C末端片 段，區域別個別片段而作成認識的抗體，經由使用此等的試 驗，於風濕性關節炎患者中，特別是經凝血酶切斷的N末端 片段於關節腔內顯示高濃度。於此N末端片段，認識人型整 合素的RGD序列與SVVYGLR序列（序列編號10 )共同存在， 同時阻斷此等兩者序列的抗體會大範圍抑制OPN與整合素 之結合，而確認對於風濕性關節炎或變形性關節炎等之治療 具有效果。 具體而言，於專利文獻1，作成抑制人OPN之RGD序列與整 合素之結合及人OPN之SVVYGLR序列（序列編號10 )與整合 素之結合的抗體，經由細胞黏附及細胞遊走等實驗確認此效 果。再者，取得抗對應小鼠OPN之該內部序列之合成胜肽的 抗體，使用小鼠關節炎病態模型，而確認如此抗體作爲治療 藥之效果。 即，小鼠OPN，由於具有根據人OPN與胺基酸序列上相同 位置的小鼠整合素被認識的RGD序列及SLAYGLR序列（序列 編號12 )，故作爲同時阻斷此等序列的抗體，而獲得M5抗體。 此M5抗體與小鼠ορν及其凝血酶消化物之結合，被含RGD序 列之GRGDSP胜肽抑制，又此M5抗體，抑制以TNF-α活性化 200813087 之小鼠脾臓由來的單核球之遊走被確認。將此M5抗體，於小 鼠之顱頂（calvaria )器官培養系中調查之結果，觀察到骨 破壞之抑制作用。再者，小鼠之膠原蛋白關節炎模型中，嘗 試投與上述抗體的結果，確認清楚顯示治療效果（專利文獻 1及非專利文獻5 )。 此等結果強烈暗示同時阻斷RGD序列、SVVYGLR序列（序 列編號10)與人型整合素結合的抗體，會抑制OPN與整合素 之結合，而對風濕性關節炎等之治療爲有效的，再者，顯示 〇 出不僅年輕性關節風濕病或慢性風濕病等之風濕病，對乾癬 性關節炎或乾癬之治療效果被期待。又，臓器移植後之慢性 排斥的特徵爲血管或支氣管閉塞性病變，但由此組織學的檢 討認爲T細胞或巨噬細胞活性化造成細胞激素（Cyt〇kine)、 增殖因子的産生、血管內皮細胞障礙，進而由於血管平滑肌 增殖造成纖維化等而持續向血管閉塞的進展（非專利文獻 6 〜8 ) 〇 又，此等巨噬細胞之活性化或血管平滑肌之纖維化上OPN 作爲必須的蛋白質的機能已被報告（非專利文獻9 )，OPN抑 制抗體經由抑制單核球或嗜中性球之遊走，有抑制向如此纖 維化的過程的可能性，因此，抑制臓器移植後之慢性排斥反 應，有助於臓器生存，又，全身性自體免疫疾病、全身性紅 斑狼瘡、葡萄膜炎、白塞病（Behcet’s disease)、多發性肌炎、 絲球體增殖性腎炎、類肉瘤等自體免疫疾病之治療效果被期 待。又，種種癌症中OPN之表現量增加，而OPN促進癌症之 進行及轉移（非專利文獻10-12)、經由抗OPN抗體抑制癌細 200813087 胞之增殖或轉移亦被確認（專利文獻3、非專利文獻1 3 )。因 此，亦期待抗OPN抗體對各種癌症的治療效果。 又，WOO 3/027 1 5 1 (專利文獻2 )中揭示具有專利文獻1記 載之小鼠抗人造骨蛋白抗體2K1可變區域及人抗體恆定區域 的嵌合抗人造骨蛋白抗體，同時，揭示具有2K1抗體之互補 性決定區域與人抗體之框架區域及恆定區域的人化抗人造 骨蛋白抗體。 不過，目前癌治療用抗體（例如，利妥昔單抗 ζ ] (Rituximab)、曲妥珠單抗（Trastuzumab)、貝伐單抗 (Bevacizumab))、風濕病治療用抗體（例如，英夫利昔單 抗（Infliximab )、阿達木單抗（Adalimumab ))、抑制移植片 排斥用之治療用抗體（例如，莫羅單抗（Muromonab )、巴 利西單抗（Basiliximab))等許多治療用單株抗體已上市。 今後亦因單株抗體製劑所謂之特異性及安全性高的基本 的特質，考慮加速特別是低分子治療藥開發爲困難的多種多 樣的疾病爲標的之硏究開發。 〇 另一方面，成爲如此的抗體醫藥開發中最大問題點爲抗體 之生産性。迄今市販之單株抗體之臨床投與量爲約數mg/kg 之程度，需花費相當的製造成本。 因此’顯示優異活性的抗體，即便顯示相同活性的抗體 中，選擇表現量高、作爲蛋白質之安定性高的抗體，爲抗體 醫藥之實用化上極重要的要件。 專利文獻1 :國際公開第W002/08 1 522小冊 專利文獻2 ··國際公開第w Ο 0 3 / 0 2 7 1 5 1小冊 200813087 專利文獻3:國際公開第WO06/043 954小冊 非專利文獻 1 : Y. Saitoh et al·， （ 1995) : Laboratory

Investigation，72，5 5-63 非專利文獻 2: Y. Yokosaki et al·，（ 1999): The Journal of Biological Chemistry 274，3 63 2 8 -3 63 3 4 非專利文獻 3: P. M. Green et al·，（ 2001): FEBS Letters 503， 75-79 非專利文獻 4: S . T. Barry et al.5 ( 2000)· Experimental

Cell Research 25 8，3 4 2 -3 5 1 非專利文獻 5: Yamamoto et al.，（ 2003): The Journal of Clinical Investigation，112，181-188 非專利文獻 6 : P· Freese et al.， （ 2001) : Nephrology, dialysis，transplantation, 16，2401-2406 非專利文獻 7 ·· J· R. Waller et al·， （ 2001 ) : British

Journal of Surgery，88，1429- 1 441 非專利文獻 8 : S. R· Lehtonen et al·， （ 2001 ): I’ Transplantation，72，1138-1144 非專利文獻 9: A. O’ Regan et al·，（ 2000): International Journal of Experimental Pathology, 81，3 73 -3 90 非專利文獻 10 : G· F· Weber， （ 2001) : Biochimica et

Biophysica Acta, 1 5 52，61-85

非專利文獻 11: H. Rangaswami et al·，（ 2006): TRENDS in Cell Biology 16，79-87 非專利文獻 12 ·· S. S. Forootan et al.， （ 2006 ) : Int. J. -10- 200813087

Cancer ： 118, 2255-2261 非專利文獻 13: Z. Hu et al·，（ 2005): Clin. Cancer Res. 11 4646-4652 【發明內容】 發明摘述 本發明鑑於上述狀況，爲解決如此的課題，提供相較於向 來之抗人造骨蛋白抗體於活性（抗原結合活性、白血球遊走 抑制活性等）及/或安定性（對熱、低酸性條件、變性劑之 ί 耐性等）更優異的人化抗人造骨蛋白抗體。本發明者們爲解 決上述課題不斷創意硏究的結果，成功製造出具有如此特性 之人化抗人造骨蛋白抗體。 即，本發明具有以下之特徴。 (1 ) 一種人化抗人造骨蛋白抗體，其包含序列編號1所示 之胺基酸序列構成的重鏈可變區域，及序列編號3所示之胺 基酸序列構成的輕鏈可變區域。 (2 )如申請專利範圍第1項之人化抗人造骨蛋白抗體’該 ^ 抗體之重鏈恆定區域爲人igyi。 (3 )如申請專利範圍第1項之人化抗人造骨蛋白抗體’該 抗體之輕鏈恆定區域爲人IgK。 (4 )如申請專利範圍第1項之人化抗人造骨蛋白抗體’該 抗體之重鏈恆定區域爲人IgY 1，該抗體之輕鏈恆定區域爲人 IgK ° (5) —種人化抗人造骨蛋白抗體，其包含序列編號25所 示之胺基酸序列構成的重鏈，及序列編號27所示之胺基酸序 200813087 列構成的輕鏈。 (6) —種多核苷酸，其包含編碼上述（1)中記載之人化 抗人造骨蛋白抗體之重鏈可變區域的序列。 (7) —種多核苷酸，其包含編碼上述（1)中記載之人化 抗人造骨蛋白抗體之輕鏈可變區域的序列。 (8) —種表現載體，其包含上述（6)及/或（7)中記載 之多核苷酸。 (9 ) 一種宿主細胞，其導入上述（8 )中記載之表現載體。 (10) —種人化抗人造骨蛋白抗體之生産方法，其包含培 養上述（9)中記載之宿主細胞，而使人化抗人造骨蛋白抗 體表現的步驟。 (1 1 ) 一種自體免疫疾病、風濕病、風濕性關節炎或變形 性關節症之治療藥，其包含上述（1 )至（5 )項中任一項記 載之人化抗人造骨蛋白抗體。 (1 2 ) —種預防或治療自體免疫疾病、風濕病、風濕性關 節炎或變形性關節症之方法，其包含投與上述（1 )至（5 ) 中任一項記載之人化抗人造骨蛋白抗體之治療有效量的步 驟。 (13) —種上述（1)至（5)中任一項記載之人化抗人造 骨蛋白抗體之用途，其用於預防或治療自體免疫疾病、風濕 病、風濕性關節炎或變形性關節症用之醫藥之製造。 依據本發明，提供較向來之抗人造骨蛋白抗體更爲優異的 活性（抗原結合活性、白血球遊走抑制活性等）及/或安定 性（對熱、低酸性條件、變性劑的耐性等）之人化抗人造骨 -12- 200813087 蛋白抗體，具有如此特質之本發明抗體有用於起始於自體免 疫疾病、風濕病、風濕性關節炎、變形性關節症之各種炎症 性疾病之預防或治療。 【實施方式】 發明詳細說明 以下詳述本發明。 本發明者們，爲克服上述向來與抗人造骨蛋白抗體有關的 課題而反覆創意檢討的結果，成功取得與WO03/027 1 5 1 (專 ’ 利文獻2 )中記載之嵌合2K1抗體及人化2K1抗體相比下活性 及/或安定性同時較爲優異的人化抗人造骨蛋白抗體。 抗體分子之基本構造爲各類組共通，由分子量5萬〜7萬之 重鏈與2〜3萬之輕鏈所構成。重鏈通常含有約440個胺基酸的 多胜肽鏈所構成，每一類組具有特徴的構造，對應於IgG、 IgM、IgA、IgD、IgE 稱爲γ、μ、α、δ、ε鏈。再者，於 IgG， 存有 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4，各自稱爲 γΐ、γ2、γ3、γ4。 輕鏈通常由含約220個胺基酸的多胜肽鏈構成，L型與Κ型之2 種爲已知，各自稱爲λ、κ鏈。抗體分子基本構造之胜肽構成， 各別相同的2條重鏈及2條輕鏈，經雙硫鍵（S-S鍵結）及非 共價鍵鍵結，分子量爲15萬〜19萬。2種輕鏈，與任一重鏈皆 可相對作成，各各抗體分子通常可由同一輕鏈2條及同一重 鏈2條所構成。 鏈內S-S鍵結中，重鏈由四個（於μ、ε鏈爲五個）、輕鏈爲 二個，每100-110個殘基胺基酸成爲一群，其立體構造於各 群組間爲類似，稱爲構造單位或功能域（domain)。位於重 -13- 200813087 鏈、輕鏈兩者之N末端上的功能域，即使來自同種動物之同 一群（亞群）的樣品，其胺基酸序列未必固定，而稱爲可變 區域（V區域，variable region，可變部）（各功能域個別表 示爲VH及VL )。由此C末端側之胺基酸序列，於每一各別群 或亞群中大約固定而稱爲恆定區域（C區域，constant region，恆定部）（各功能域各別表示爲CH1、CH2、CH3或CL)。 抗體之抗原決定部位由VH及VL所構成，結合之特異性依據 此部位之胺基酸序列而定。另一方面，所謂與補體或各種細 胞結合的生物學活性則反映出各群Ig之C區域的構造差異。 輕鏈與重鏈可變區域之可變性，已知大約限於任一鏈中存在 的3個小的超可變區域（hypervariable region)，此等區域稱 爲互補性決定區域（CDR，complementarity determining region)。可變區域之其餘部分稱爲框架區域（framework region)，相較下爲固定。通常，各可變區域之互補性決定區 域僅由5至1 0個胺基酸形成抗原結合部位。 本說明書中，將與抗原反應的可變區域中具有小鼠抗體 j (亦稱爲給予者異種抗體）由來之可變區域，且恆定區域中 具有人抗體由來之恆定區域的抗體，稱爲嵌合抗體，將認識 造骨蛋白及其片段之嵌合抗體稱爲嵌合抗造骨蛋白抗體。 又，抗原特異性非人類哺乳動物（例如，小鼠）抗體分子之 互補性決定區域（抗原結合部位）以外全部取代爲人類抗體 胺基酸的重組抗體稱爲人化抗體。於人化抗體，如本發明之 抗體，亦包含進一步於框架區域中加入胺基酸之改變（取 代、插入、刪除、添加）。 -14- 200813087 一般性地，人化抗體之製造中，僅將互補性決定區域之胺 基酸序列移植至模板之人抗體框架，多半場合，已知較原始 小鼠抗體更降低抗原結合活性。上述人化2K1抗體中，雖然 具有對OPN胜肽的結合性，但對OPN之細胞黏附抑制活性極 低，確認其不適合作爲抗體醫藥（後述實施例9 )。 本發明者們，改善如此之人化抗體之活性低下，且爲了獲 得具有用於作爲抗體醫藥使用上更優異安定性的人化抗體 不斷創意檢討的結果，鑑定出含序列編號1所示胺基酸序列 構成的重鏈可變區域及序列編號3所示之胺基酸序列構成的 輕鏈可變區域的人化抗人造骨蛋白抗體，與向來之嵌合及人 化抗人造骨蛋白抗體比較下具有意義地改善活性及/或種種 安定性指標之優異安定性。如此本發明之人化抗人造骨蛋白 抗體，係模板之人抗體重鏈及輕鏈框架區域中，加上幾個胺 基酸的改變而製造者，與僅移植互補性決定區域所製造之向 來的人化抗人造骨蛋白抗體（專利文獻2 )，框架區域之序列 不同。 本發明之人化抗人造骨蛋白抗體揭示於本案說明書，基於 此重鏈可變區域及輕鏈可變區域之序列資料，使用此項技藝 領域公知之方法，此項技術領域之人士可容易製造。具體而 言，製造具有編碼本發明之抗體重鏈可變區域胺基酸（序列 編號1 )的鹼基序列之重鏈可變區域基因片段，及，具有編 碼本發明之抗體輕鏈可變區域胺基酸（序列編號3 )的鹼基 序列之輕鏈可變區域基因片段。之後，將此可變區域基因連 接人抗體適當群組之恆定區域基因而製造人化抗體基因。其 -15- 200813087 次，連接此人化抗體基因於適當表現載體，導入培養細胞 中。最後培養此培養細胞而可由培養上清液獲得人化抗體。 編碼上述本發明之抗體重鏈及輕鏈可變區域胺基酸（序列 編號1及序列編號3 )之各可變區域基因片段，例如，依據 WO03/027 1 5 1中記載之方法，調製該文獻中揭示之編碼人化 2K1抗體重鏈可變區域及輕鏈可變區域之各種基因片段，可 由於編碼人化2K1抗體之框架區域之該基因片段之所定部位 上導入變異而製造。作爲於框架區域所定部位中導入變異的 方法，可使用部位特異的變異誘發法（Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausube 1 e t a 1 . ( 1987 ) Publish. Jho n Wiley & Sons Section 8.1-8.5 )等此項技術領域者公知之種 種方法。或者，本發明抗體之重鏈及輕鏈可變區域之基因片 段，基於該重鏈及輕鏈可變區域之胺基酸序列（序列編號1 及序列編號3 )設計的鹼基序列，或，基於序列編號5及序列 編號7所示之本發明抗體之重鏈及輕鏈可變區域之鹼基序 列，利用此項領域公知之基因合成方法亦可合成。作爲如此 的基因合成方法，可使用WO 90/07861記載之抗體基因合成 方法等之此項技藝領域者公知之種種方法。 其次，製作連結上述可變區域基因片段與人抗體恆定區域 基因之人化抗體基因。使用的人抗體之恆定區域，亦可選擇 任一種亞群的恆定區域，但較佳之重鏈恆定區域，爲人 Igyl，又，可使用作爲輕鏈恆定區域之人IgK。 接續此人化抗體基因之製作，人化抗體基因之表現載體之 導入，表現載體之培養細胞之導入，培養細胞之培養，抗體 -16- 200813087 之純化等，使用此項領域公知之種種方法，或，可參照wo 0 2/0 81522或WO 03/0 27151所記載之嵌合抗人造骨蛋白抗體 或人化抗人造骨蛋白抗體之製造方法進行。作爲與如上述獲 得的人化抗體基因連結的表現載體，可使用國際公開公報 〜〇9 4/2 0632中記載之八〇11或入〇4等之表現載體，但只要可 表現人化抗體基因者並未特別限制。又，若利用作爲表現載 體之AG-γΙ或AG-κ等之具有預備的人Ig恆定區域基因者，僅 插入如此的人化抗體可變區域基因而成爲具有人化抗體基 (i 因之表現載體爲較佳。 上述表現載體，例如，由磷酸鈣法等，導入培養細胞中。 作爲導入表現載體之培養細胞，例如，可使用CHO-DG44 細胞等培養細胞，依常法培養爲宜。 上述培養後，於培養上清液中蓄積的抗體，可使用例如， 蛋白質A管柱之各種層析法純化。 如此獲得之人化抗人造骨蛋白抗體之抗原活性，例如，使 用如後述實施例記載的造骨蛋白胜肽等之ELIS A或BIACore U ( BIAcor公司）等可測定。又，人化抗人造骨蛋白抗體之白 血球遊走抑制活性，例如，如後述實施例記載者，可由被驗 抗體與OPN或凝血酶切斷型OPN之存年下培養人末梢血液單 核球的方式測定。本發明之人化抗人造骨蛋白抗體，具有抑 制對於以細胞激素（例如，TNF-α )活性化的人末梢血液單 核球細胞之凝血酶切斷型OPN之遊走的生物活性。 其次，將如此製作的人化抗人造骨蛋白抗體，試驗各種安 定性指標。本發明之人化抗人造骨蛋白抗體顯示以下之安定 -17- 200813087 性指標（A)〜D)): A) 對於PBS中70°C下2小時加熱處理後之含SVVYGLR序列 (序列編號1 〇 )的胜肽之結合活性，顯示較未加熱處理時之 90%以上的熱安定性。 B) 與持有給予者異種抗體由來之可變區域與人抗體由來 之恆定區域的嵌合抗體相比，變性中點（Tm )至少高5 °C。 C) 與持有給予者異種抗體由來之可變區域與人抗體由來 之恆定區域的嵌合抗體相比，具有至少高0.5 Μ濃度之鹽酸胍 Γ 的耐性。 D) 與持有給予者異種抗體由來之可變區域與人抗體由來 之恆定區域的嵌合抗體相比，至少具有低0.3之pH。 其中，上述指標A )及B )，任一者對熱有安定性，此等爲 良好的抗體的程度，具有長期之保存安定性及劑型之優點。 即，抗體製劑，由於係蛋白質故有許多保存安定性的問題， 冷凍乾燥製劑（此等由於使用時應溶解，於醫療現場有便利 性面的問題，尤其，蛋白製劑溶解有需花費30秒以上之許多 I) 醫療現場之負担變多的情形），但只要具有良好溫度安定性 之抗體，即便於溶液狀態冷藏2年以上可確保長期安定性。 實際上，爲本發明之人化抗人造骨蛋白抗體之後述實施例記 載之R2K1 ν1·7，確保即便於室溫（25t ) 1年左右之安定性。 又，若溶液製劑成爲可能，預充式注射器（prefilled syringe) 等更便利性高的製劑化爲可能。滿足上述指標之溫度安定性 高的抗體，由製劑化之多樣性廣泛，醫療需求高的製劑化爲 可能而增加選擇項。 -18- 200813087 上述指標C )係關於耐鹽性的指標，由具有如此耐鹽性之 抗體，進行製劑化之有利處方檢討成爲可能’尤其關於預充 式注射器，因設計所謂1 00-200pg/mL之高濃度蛋白製劑的基 礎使用高鹽濃度的場合多而爲有用。 上述指標D )係關於pH耐性的指標，具有如此pH耐性的抗 體，因抗體之製造純化過程病毒失活步驟中更低PH之處理成 爲可能，而爲有用。因此，與通常之抗體相比較即便具有低 0.3左右pH耐性仍成爲大優點。 指標A )之試驗方法如下。首先，將被驗人化抗人造骨蛋 白抗體稀釋於PBS中（較佳爲5(^g/mL)，於70°C加熱處理2 小時，之後，回到室溫，測定對含該抗體之SVVYGLR序歹[1 (序列編號1〇 )的胜肽之結合活性，例如，以現今之ELISA 方法測定(Journal of Cellular Biology, 88 : 420-432 (2 002 ))。將經此熱處理的抗體之結合活性，與未處理之相 同抗體所測定的結合活性作比較。本發明之人化抗人造骨蛋 白抗體，於如此加熱處理的場合，相對於未處理之場合對於 J 含SVVYGLR序歹[J (序列編號1〇)的胜肽之結合活性具有90% 以上之結合活性。較佳爲使用於本指標試驗之含有的 SVVYGLR序歹[](序歹ij編號1〇 )之胜肽，爲具有 CVDTYDGRGDSVVYGLRS序歹tj (序歹ij編號13 )之造骨蛋白胜 肽。 指標B )之試驗方法如下。首先，將被驗人化抗人造骨蛋 白抗體及W003/027 1 5 1記載之嵌合2K1抗體（C2K1)於適切 的緩衝液（較佳爲20mM檸檬酸緩衝液+l20mMNaCl -19- 200813087 (ρΗ6·0 ))中調整，並以示差掃描型熱量計（較佳爲Micro cal 公司之VP毛細管DSC平台），可評價對加熱之安定性。顯示 本發明之人化抗人造骨蛋白抗體之變性溫度的變性中點 (Tm)，與C2K1相比較至少高5°C。 指標C )之試驗方法如下。首先，將被驗人化抗人造骨蛋 白抗體及上述嵌合2K1抗體（C2K1)溶解於含0〜5M之各濃度 鹽酸胍的緩衝液（較佳爲20mM磷酸鈉+120mM NaCl溶液 (ΡΗ7·0))，調整爲適切濃度（較佳爲5(^g/mL)。其次，將 各溶液樣品於1 〇°C下靜置一晚後，測定各樣品之螢光光譜。 具體而言，經280nm之激發光發出色胺酸的螢光於波長 3 20nm至3 70nm範圍中掃描。峰値波長依鹽酸胍之抗體蛋白 質立體構造之鬆弛造成位移（shift )。峰値波長位移的鹽酸 胍濃度，依被驗抗體及嵌合抗體各別測定。本發明之人化抗 人造骨蛋白抗體中上述峰値波長位移的鹽酸胍濃度，與C2K1 之値比較，至少高約0.5Μ濃度。 指標D )之試驗方法如下。首先，將被驗人化抗人造骨蛋 白抗體，及上述嵌合2Κ1抗體（C2K1)於適切緩衝液（較佳 爲20mM檸檬酸緩衝液+120mM NaCl ( pH 6.0 ))調整（較佳 爲2mg/mL )，於此等中一邊加入酸性溶液（較佳爲0.1N HC1 ) 與水，一邊調製規定之濃度（Inig/mL)之各低pH樣品。將 此樣品於室溫中處理1小時後，測定圓二色性（CD )光譜。 波長205nm至260nm之範圍下測定CD光譜，基於Yang等人之 CD光譜解析法（Methods in Enzymology，130，208-269 (1 9 8 6 ))，於各抗體之各pH處理樣品中，測定隨機構造含有 -20- 200813087 率。本發明之人化抗人造骨蛋白抗體中之隨機構造含有率開 始上昇的pH，與C2K1之値相比，至少約低0.3。 本發明者們，基於WO 03/027 1 5 1記載之人化抗體，組合依 據部位特異的變異誘發等的框架區域基因之改變，與使用上 述A )〜D )之安定性指標的安定性試驗而不斷創意檢討之結 果，由將人抗體框架部分（FR1〜4)以序列編號1所示之胺基 酸序列（各爲胺基酸編號1〜30、36〜49、67〜98及106〜116 ) 及序列編號3所示之胺基酸序列（各爲胺基酸編號1〜23、 (' 40〜54、62〜93及103〜113 )作成，首先成功獲得較向來之抗 人造骨蛋白抗體在活性（抗原結合活性、白血球遊走抑制活 性等）及/或安定性（對熱、低酸性條件、變性劑之耐性等） 之兩方面上優異的人化抗人造骨蛋白抗體。本發明之人化抗 人造骨蛋白抗體，於前述抗原結合活性、白血球遊走抑制活 性及各種安定性指標之試驗結果，顯示具有該活性且具有全 部該指標A)〜D)之特性。 含有序列編號1所示之胺基酸序列構成的重鏈可變區域， 及，序列編號3所示之胺基酸序列構成的輕鏈可變區域，本 發明之人化抗人造骨蛋白抗體，使用本項技術領域公知之方 法，合成編碼序列編號1所示之胺基酸序列的DNA及編碼序 列編號3所示之胺基酸序列的DNA，此等以適當群組之人抗 體恆定區域基因，較佳爲連結重鏈之人IgYl恆定區域基因、 輕鏈之人IgK恆定區域基因而構築人化抗體基因，使用該領 域公知之種種方法或WO 02/0 8 1 522或WOO 3/0 27 1 5 1中記載之 方法等，將該人化抗體基因導入表現載體，將該表現載體導 -21- 200813087 入培養細胞並培養該培養細胞，由獲得之培養物純化抗體， 可容易地獲取。序列編號1所示重鏈可變區域基因與人IgYl 重鏈恆定區域基因連結而獲得者，作爲本發明之較佳人化抗 體重鏈基因，可列舉例如爲含有編碼序列編號25所示之胺基 酸序列之鹼基序列的基因，更佳爲含有序列編號24所示之鹼 基序列的基因。又，序列編號3所示之輕鏈可變區域基因與 人IgK輕鏈恆定區域基因連結而獲得者，作爲本發明之較佳 人化抗體輕鏈基因，例如含有編碼序列編號27所示之胺基酸 序列之鹼基序列的基因，更佳爲含有序列編號26所示之鹼基 序列的基因。依據含序列編號24所示之鹼基序列的重鏈基 因，與含序列編號26所示之鹼基序列之輕鏈基因而編碼之本 發明人化抗造骨蛋白抗體，例如爲示於後述實施例之 R2Klvl.7。産生人化抗體R2Klvl.7的細胞，即導入上述重鏈 及輕鏈基因之小鼠骨髓瘤細胞（Sp2/0-R2Klvl.7 )，於2007 年4月26日，寄存於獨立行政法人産業技術綜合硏究所專利 生物寄託中心（〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番 J 地1中央第6 )給予FERM ABP- 1 082 1之受領_號。另亦於2007 年7月1 6日專利生物材料寄存於財團法人食品工業發展硏究 所，寄存編號BCRC 960309。 或，本發明之人化抗造骨蛋白抗體，含序列編號1所示之 胺基酸序列構成的重鏈可變區域及序列編號3所示之胺基酸 序列構成的輕鏈可變區域，以編碼上述序列編號1所示之胺 基酸序列之DNA與人抗體重鏈恆定區域基因，及編碼序列編 號3所示之胺基酸序列之DNA與人抗體輕鏈恆定區域基因作 -22- 200813087 爲模版，亦可使用無細胞轉錄/轉譯系合成。無細胞轉錄/轉 譯系亦可使用市販物，並以本身已知之方法，具體而言，大 腸菌抽出液依據Pratt J.M.等人之“Transcription and Translation”，Hames B.D·及 Higgins S.J.編，IRL Press， Oxford 1 79-209 ( 1 984 )中記載之方法等而調製者亦可。作 爲市販之細胞溶胞產物（lysate)，大腸菌由來者例如爲E. coli S30 extract system ( Promega公司製）或 RTS 500 Rapid Translation system (Roche公司製）等，兔網狀紅血球由來 者例如爲 Rabbit Reticulocyte Lysate System ( Promega公司 製）等，又小麥胚芽由來者例如爲PROTEIOStm ( TOYOBO 公司製）等。使用其中小麥胚芽溶胞產物者爲較適合。小麥 胚芽溶胞產物之製法，例如，可使用Johnston F.B.等人， Nature，179，1 60- 1 6 1 ( 1 957 )或 Erickson A.H.等人，Meth. Enzymol·，96, 3 8-50 ( 1 996 )等記載之方法。 本發明含有序列編號1所示之胺基酸序列構成的重鏈可變 區域及序列編號3所示之胺基酸序列構成的輕鏈可變區域， J 亦包含保持活性之一條鏈可變區域片段（scFv)、Fab、Fab’、 F ( ab’）2等之人化抗人造骨蛋白抗體片段（抗體片段）。 使用scFv之製作獲得，爲用於連接重鏈可變區域（VH)與 輕鏈可變區域（VL)之連結子，本發明之抗體片段並未特別 限於可具有如上述特性者，例如，可列舉 GGGGSGGGGSGGGGS (序歹!1編號14)所示之胺基酸序列構 成的胜肽。又只要爲此項技藝者，基於本發明，可製作該人 化抗人造骨蛋白抗體或抗體片段與其他胜肽或蛋白質之融 -23- 200813087 合抗體，或亦可使修飾劑結合修飾抗體而製作。融合用之其 他胜肽或蛋白質，只要未降低抗體之結合活性者並未特別限 定，例如，人血清白蛋白、各種tag胜肽、人工螺旋片層模 體（motif)胜肽、麥芽糖結合蛋白質、麩胱甘肽S轉移酶、 各種毒素、其他促進多量化之胜肽或蛋白質等。修飾用之修 飾劑，只要未降低抗體結合活性者並未特別限定，例如，聚 乙二醇、糖鏈、磷脂質、粒線體、低分子化合物等。 如此獲得之本發明人化抗人造骨蛋白抗體或起源於該抗 體保持活性之抗體片段，該抗體或抗體片段與胜肽或其他蛋 白質融合之融合抗體，或該抗體或抗體片段結合修飾劑而成 之修飾抗體，視必要純化後，依常法製劑化，可用於風濕性 關節炎·年輕性關節風濕病或慢性風濕病等之風濕性·乾療 性關節炎·乾癖等之治療、癌、臓器移植後之慢性排斥反應 抑制、變形性關節症·全身性自體免疫疾病·全身性紅斑狼瘡 •葡萄膜炎·白塞病·多發性肌炎·絲球體增殖性腎炎·類肉瘤 等之自體免疫疾病之治療。 1 本發明之人化抗人造骨蛋白抗體可用於作爲治療劑，較佳 爲風濕病治療劑、自體免疫疾病治療劑、變形性關節症治療 劑或風濕性關關節炎治療劑，更佳爲風濕性關節炎治療劑。 此等風濕性治療劑等之劑型之例，可舉例爲注射劑、點滴用 劑等之非經口劑，經由靜脈內投與、皮下投與等投與爲較佳 (依據作爲自體免疫疾病治療劑的場合爲宜）。又，於製劑 化，在藥學上可容許的範圍下，可使用適應此等劑型之載劑 或添加劑。 -24- 200813087 於上述製劑化之人化抗人造骨蛋白抗體之添加量，依患者 症狀程度、年齡或使用的製劑之劑型或重組ορν抑制抗體之 結合力價等而不同，但例如使用〇.lmg/kg至100mg/kg左右爲 宜。 如此獲得之本發明治療劑，爲有效成分之人化抗人造骨蛋 白抗體對OPN之RGD序列與SVVYGLR序列（序列編號10 )強 力結合，並抑制OPN之此部分與整合素之結合，結果可控制 風濕病及風濕性關節炎或此等以外之自體免疫疾病之症狀 的惡化。 又，本發明之人化抗人造骨蛋白抗體，因特異性結合非整 合素側之OPN側，抑制整合素之其他重要機能的疑慮爲少， 而期待回避副作用之問題。 再者，本發明之人化抗人造骨蛋白抗體，可作爲風濕性關 節炎之診斷劑被利用。如前述明白發現風濕性關節炎患者之 關節中，特別是經凝血酶切斷的Ο PN之N末端片段爲高濃 (.度，因此，使用此人化抗人造骨蛋白抗體測定檢體中的OPN 或此N末端片段之量，可應用於風濕性關節炎之診斷。作爲 此手法，可利用放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA 法（E· Engvall et al·， （ 1980): Methods in Enzymol·，70， 4 1 9-43 9 )、螢光抗體法、空斑測定法（Plaque assay)、點測 定法（Spot assay )、凝集法、奧克特洛尼平版雙向擴散法 (Ouchterlony method )等，一般性免疫化學測定法使用之 種種方法（「融合瘤法與單株抗體」，株式會社R&D計畫發行， 第30頁-第53頁，昭和57年3月5日）。 -25- 200813087 上述手法可由各種觀點適宜選擇，但由敏感度、簡便性等 之觀點則以ELISA法爲較佳，更佳方法之例，例如，將本發 明之人化抗人造骨蛋白抗體固相化於載體上，經由標識化認 識本發明人化抗人造骨蛋白抗體之OPN上的相異部位的抗 體，可檢測OPN或此N末端片段，而可作爲風濕性關節炎之 診斷藥。 作爲標識上述抗體使用之標識物質，例如爲形成融合蛋白 質/胜肽用之麩胱甘肽S-轉移酶等蛋白質/胜肽，西洋山葵過 _氧化酶（以下稱爲「HRP」）、鹼性磷酸酶（以下稱爲「AP」） 等酵素、螢光素異氰酸酯、羅丹明（Rhodamine)等螢光物 質，32p等放射性物質，化學發光物質等修飾劑。 關於ΟPN同功型之檢出方法，例如，使用三明治法等之此 項領域公知之方法，更具體而言，可使用相同於 W002/08 1 5 22 (專利文獻 2 )或 W003/027 1 5 1 (專利文獻 3 ) 記載之檢測方法而實施。 又本發明提供編碼本發明抗體或其片段之基因，及含此等 ^ 之表現載體。本發明之表現載體，只要於原核細胞及/或真 核細胞之各種宿主細胞中表現編碼本發明之抗體或其片段 的基因，且可產生此等多胜肽者並未特別限制，例如，可列 舉質體載體、病毒載體（例如，腺病毒、反轉錄病毒）等。 本發明之表現載體可含有編碼本發明之抗體或其片段的 基因，及可機能連結該基因的啓動子。作爲於細菌中表現本 發明多胜肽用之啓動子，於宿主爲大腸菌屬菌（Escherichia) 之場合，例如，可列舉Trp啓動子、lac啓動子、recA啓動子、 - 26- 200813087 XPL啓動子、lpp啓動子、tac啓動子等。作爲酵母中表現本 發明之抗體或其片段用之啓動子，例如，PHO 5啓動子、PGK 啓動子、GAP啓動子、ADH啓動子，宿主爲桿菌屬菌 (Bacillus )之場合，可列舉如SL01啓動子、SP02啓動子、 penP啓動子等。又，宿主爲哺乳動物細胞等之真核細胞的場 合，可列舉SV4〇由來之啓動子、反轉錄病毒之啓動子、熱休 克啓動子等。 作爲宿主細胞之細菌，特別是使用大腸菌的場合，本發明 % 之表現載體可進一步含有開始密碼子、終止密碼子、終止子 區域及複製可能單位。另一方面，使用作爲宿主之酵母、動 物細胞或昆蟲細胞的場合，本發明之表現載體可含有開始密 碼子、終止密碼子。又，此場合，亦可含有增強子序列，編 碼本發明多胜肽的基因之5’側及3’側之非轉譯區域、剪接作 用接合部、多聚腺苷酸化（polyadenylation)部位、或複製 可能單位等。又，視目的亦可含有通常使用的選擇標記（例 如，四環黴素、安比西林（ampicillin)、卡納黴素 ‘ ’ （kanamycin)) 〇 又本發明提供導入本發明基因之轉形體。如此之轉形體， 例如，經由以本發明之表現載體轉形宿主細胞而製作。作爲 轉形體之製作上使用的宿主細胞，只要適合前述表現載體且 可轉形者並未特別限定，例如本發明之技術領域中通常使用 的天然細胞或人工建立的細胞等種種之細胞（例如，細菌（大 腸菌屬菌、桿菌屬菌）、酵母（酵母屬（Saccharomyces )、 畢赤酵母（Pichia )等）、動物細胞或昆蟲細胞（例如，S f9 ) -27- 200813087 等）。轉形可依既知方法進行。 又本發明提供生產本發明之抗體或其片段之方法，其包含 使本發明基因於宿主細胞中表現，即，使用如此之轉形體。 關於生產本發明之抗體或其片段，轉形體可於營養培養基 中培養。營養培養基含有轉形體生育上必要的碳源、無機氮 源或有機氮源爲宜。作爲碳源，例如，葡萄糖、右旋糖、可 溶性澱粉、蔗糖等；作爲無機氮源或有機氮源，例如，銨鹽 類、硝酸鹽類、胺基酸、玉米浸泡液（corn steep liquor)、 蛋白腺、酪蛋白、肉萃取物、大豆粕、馬鈴薯抽出液等。又 依所欲亦可含有其他營養素（例如，無機鹽（例如，氯化鈣、 磷酸二氫鈉、氯化鎂）、維生素類、抗生素（例如，四環黴 素、新黴素、安比西林、卡納黴素等）等）。 轉形體之培養依既知方法進行。適宜選擇培養條件，例如， 溫度、培養基之pH及培養時間。例如，宿主爲動物細胞之場 合，作爲培養基，可使用含約5〜20%之胎牛血清的MEM培養 基（Science，Vo 1. 122, p. 501，1952)、DMEM培養基 ^ ( Virology，Vol. 8，ρ· 396，1959)、RPMI1640 培養基（J· Am·

Med. Assoc.，Vol. 199，p. 519，1967)、199培養基（Proc. Soc Exp. Biol. Med.，Vol· 73，p. 1，1950)等。培養基之 pH 較佳 爲約6〜8，培養通常於約30〜40°C下進行約15〜72小時，視必 要亦可進行通氣或攪拌。宿主爲昆蟲細胞之場合，例如，可 列舉含胎牛血清之Grace’s培養基（Proc· Natl. Acad. Sci. USA，Vol. 82，ρ· 8404，1985)等，pH較佳爲約 5〜8。培養通 常於約20〜40°C下進行15-100小時，亦可視必要進行通氣或 -28- 200813087 攪拌。宿主爲細菌、放線菌、酵母、絲狀菌的場合，例如， 含有上述營養源的液體培養基爲適當，較佳pH爲5〜8之培養 基。宿主爲大腸桿菌（£. 之場合，作爲較佳之培養基， 可列舉LB培養基、M9培養基（Miller等人，Exp. Mol. Genet， Cold Spring Harbor Laboratory，ρ· 431，1972)等。該場合可 視必要一邊通氣、攪拌，一邊通常於14〜43 °C進行約3〜24小 時爲宜。宿主爲桿菌屬（Bacillus )菌之場合，可視必要一 邊通氣、攪拌，一邊通常於30〜40°C進行約16〜96小時。宿主 爲酵母的場合，作爲培養基，可列舉例如，Burkholder最小 培養基（Bostian，Proc· Natl· Acad. Sci. USA，Vol. 77，45 05, 1 9 80 )’ PH5〜8爲所欲。培養通常於約20〜35 °C下進行約14〜144 小時，視必要亦可進行通氣或攪拌。 本發明之抗體或其片段，可由培養如上述之轉形體，而自 該轉形體回收，較佳經單離、純化。作爲單離、純化方法， 可列舉例如，鹽析、溶媒沈澱法等利用溶解度的方法，透析、 限外過濾、膠體過濾、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸醯胺膠體 電泳等利用分子量差的方法，離子交換層析法或羥磷灰石層 析法等之利用電荷的方法，親和性層析法等利用特異性親和 性的方法，逆相高速液體層析法等利用疏水性之差的方法， 等電點電泳等利用等電點之差的方法等。 關於本發明已全面性記載，但爲獲得進一步理解提供參考 之特定實施例，此等作爲例示目的，非爲限制本發明。 實施例 以下顯示實施例，關於使用套組等之部分，若無特別事由 -29- 200813087 則依據添附之步驟進行。 (1.人化2K1抗體之製作） 本發明中，人化國際公開公報W02003/027 1 5 1中記載之小 鼠由來抗人造骨蛋白抗體的2K1抗體，而製作2種類人化抗人 造骨蛋白抗體（以下，記載爲人化2K1抗體或R2K1抗體）。 各人化2K1抗體之製作，因大略依據上述公報記載之方 法，故以下僅槪略性記載。 首先，藉使用合成寡DN A的PCR，製作編碼持有第1圖及第 2圖所示鹼基序列的2種類人化抗OPN抗體之重鏈可變區域 (VH)的DNA，與編碼持有第3圖及第4圖所示鹼基序列的2 種類人化抗OPN抗體之輕鏈可變區域（VL )的DNA。以下之 記述中，爲區域別此等，將第1圖、第2圖中記載之人化抗人 OPN抗體VH各自稱爲R2K1-VH1.7、R2K1-VH1.8。同樣地，將 第3圖、第4圖中記載之人化抗人OPN抗體VL各自稱爲 R2K1-VL1.7、R2K1-VL1.8。 其次，各自將編碼上述人化抗人OPN抗體VH的DNA，利用 j 限制酵素Hind III認識部位及BamHI認識部位，插入含人免 疫球蛋白恆定區域γΐ鏈之基因的表現載體之AG-γΙ，而製作 持有R2K1-VH1.7的重鏈之表現質體，與持有R2K1-VH1.8的重 鏈之表現質體。同樣地，各自將編碼上述人化抗人ΟΡΝ抗體 VL的DNA，插入含人免疫球蛋白恆定區域κ鏈之基因的表現 載體之AG-κ中，而製作持有R2K1-VL1.8之輕鏈之表現質體， 與持有R2K1-VL 1.7的輕鏈之表現質體。將此等表現質體導入 大腸菌而使其增殖，經由市販之質體純化套組（QIAGEN公 -30- 200813087 司）純化。 最後’經由組合上述純化表現質體的磷酸鈣法於 CHO-DG44細胞中轉染，於含真內替辛（Geneticin) (Invitrogen 公司）與已透析 FCS(Invitrogen 公司）之 MEM 培養基（Invitrogen公司）中經由選擇，獲得2種類人化2K1 抗體之表現細胞。即，使持有R2K1-VH1.8的重鏈與持有 112尺1-¥1^1.8的輕鏈所構成的人化21：1抗體之11210〃1.8抗體， 持有R2K1-VH1.7的重鏈與持有R2K1-VL1.7的輕鏈所構成的 人化2K1抗體之R2Klvl.7抗體表現。 將以上述順序獲得的各R 2 K1抗體之産生細胞，於添加1 〇 % 已透析的FCS的MEM培養基中充份增殖，接種於旋轉瓶（BD Biosciences公司），於37°C、lrpm回轉速度之條件下培養。 數曰後，確認細胞附著於器壁而增殖，丟棄培養液，以不含 血清的MEM培養基500mL替換並以上述條件進行培養。約2 週後，由器壁剝離而浮遊的細胞變多時停止培養，將培養上 清液以0·22 μιη過濾器過濾而回收，獲得含各R2K1抗體的培養 上清液。 將此等培養上清液作爲材料，經使用蛋白質Α管柱 (MILLIPORE公司）及陽離子交換管柱（Amersham公司）， 獲得2種類純化人化抗體，即R2Klvl.8抗體及R2Klvl.7抗體 平均各數mg [又，R2K1 vl .7抗體由培養產生該抗體的小鼠骨 髓瘤細胞（Sp2/0-R2Kl ν1·7 )，以相同於上述方式可由所獲得 的培養上清液取得。3?2/0-112〖“1.7，於200 7年4月26日，寄 存於獨立行政法人産業技術綜合硏究所特許生物寄託中心 -31· 200813087 (〒305-8566日本國茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6) 授予FERM ABP-10821之受領編號]。 以下所記各種實驗使用如上述方式獲得之純化抗體。又， 嵌合2K1抗體（以下記載爲C2K1抗體）使用以前述國際公開 公報W02003/027 1 5 1記載之方法獲得者。 (2.由ELIS A之與人造骨蛋白胜肽之結合性確認） 各R2K1抗體與C2K1抗體，對於人造骨蛋白胜肽 (CVDTYDGRGDSVVYGLRS ··序列編號13 )的結合活性，參 考目前ELI SA法（Journal of Cellular Biology，88: 420-432 (2 002 ))並比較。以下槪略說明。

將持有上述序列的胜肽（以下記載爲hOPN5胜肽），與以 Sulfo-EMCS (同仁化學公司）導入馬來醯亞胺基的BSA反 應，而製作hOPN5-BSA共軛物。將hOPN5-BSA共軛物以 200ng/100pL/?L，於 ELISA 平盤（Nunc 公司）中 4°C 下固定一 夜，洗浄後，以添加1%BSA的PBS於4°C阻斷一夜。將以含 1%BSA的PBS稀釋的抗體樣品，於上述平盤中添加100μί/孔 ' 並於37°C反應1小時，使用過氧化酶（HRP )標識抗人IgG (H + L )抗體（和光純藥株式會社）進行檢測，使用微量盤 讀數機（Molecular Devices公司）測定波長45 Onm之吸光度。 此結果確認，R2Klvl.7抗體及R2Klvl.8抗體對hOPN5胜肽 之結合性，與C2K1抗體相同（第5圖）。 (3 .R2K1抗體對人末梢血液單核球遊走之抑制活性） 純化抗體對細胞激素活性化末梢血液單核球遊走之抑制 活性如下調查。 -32- 200813087 首先，將由健康人之淋巴採血的血液於RP MI 1640培養基 中2倍稀釋，將經稀釋的血液於Ficoll-Paque(Farumashia公 司）中重疊，以40 〇x g於室溫中離心30分鐘。可見血漿與 Ficoll-Pack之境界時回收白色層，作爲單核球使用。如此獲 得之單核球以人TNF-α ( 20ng/mL)培養一晚，將此活性化 物用於遊走實驗。 遊走實驗使用48孔微趨化室（micro chemotaxis chamber ; Neuro Probing公司）進行。將人OPN與牛凝血酶（Sigma) 同時於371反應2小時而切斷。R2K1抗體與C2K1抗體以各種 濃度添加者預先於37°C放置15分鐘，於下側室中添加（人 OPN最終濃度爲10pg/mL)。由其上承載聚碳酸酯過濾器（孔 徑5μη〇，進而上側室中力〇入50μΕ細胞懸浮液（2xl06個細胞 /mL ) 〇 於3 7°C、5% C02存在下培養2小時，取出聚碳酸酯過濾器， 由上側過濾器表面除去細胞，而將細胞染色於Diff-Quick (Baxter公司）。上側過濾器表面之細胞數於40倍倍率下計 -) 測，結果表示爲6孔平均細胞數（cells/mm3) ：tSEM (表1)。 由此結果，R2Klvl.7抗體及R2Klvl.8抗體兩者，與C2K1抗體 同樣地抑制對於以TNF-α活性化的人末梢血液單核球之凝血 酶切斷型人造骨蛋白的遊走。 -33- 200813087 表1 R2Klvl.7 & R2Klvl.8 平均細胞數 SEM 培養基 7 01.7 24.8 Thr-OPN 88 1.7 24.0 R2K1 vl.7 5 0 μ g/mL 723.3 43.0 R2K1 vl.8 5 0 pg/mL 68 8.3 16.6 C2K1 平均細胞數 SEM 培養基 68 6.7 15.9 Thr-OPN 860.0 30.7 C2K1 5 0 μ g / m L 671.7 48.5 (4.藉由ELIS A之熱安定性評價） C2K1抗體及2種類R2K1抗體於PBS中稀釋爲5(^g/mL，於 70 °C水浴中處理2小時，之後回到室溫，顯示進行前述ELISA 所得之吸光度，相對於未處理樣品之吸光度的比率作爲殘存 活性。殘存活性使用由具有直線性之0.2至2.0的範圍的吸光 度之値算出（以下相同）。此結果，判斷上述處理後之殘存 活性，R2Klvl.7抗體及R2K1 vl.8抗體較C2K1抗體爲更高値 (第6圖）。特別是，R2Klvl. 7抗體顯示超過90%的殘存活性。 因此，與C2K1抗體相比，判斷R2Klvl.7抗體及R2Klvl.8抗體 之熱安定性提升。 (5·藉由ELIS A之低pH耐性之評價） 將C2K1抗體及2種類之R2K1抗體的純化品於PBS稀釋爲 5 0gg/mL，使用IN HC1與pH計（HORIBA公司）調整爲pH 5 ’ 於25°C處理2小時，之後，以1M Tris-HCl ( pH9.5 )調整爲 pH 7，將進行前述ELIS A獲得的吸光度，相對於未處理樣品 -34- 200813087 之吸光度的比率作爲殘存活性，此結果，判斷上述處理後之 殘存活性，R2K1W.7抗體較C2K1抗體及R2Klvl.8抗體有意義 地變高（第7圖）。由此，R2Klvl.7抗體，與R2K1 vl.8抗體及 C2K1抗體相比下判斷對低pH之耐性提升。 (6 .藉由螢光光譜測定之鹽酸胍耐性之評價） 將C2K1抗體及2種之R2K1抗體，以含各濃度鹽酸胍之20mM 磷酸鈉緩衝液+120mM NaCl ( pH7 )成爲50pg/mL的方式調整 (對照組未添加鹽酸胍），於1 〇°C靜置一夜後，測定各樣品 之螢光光譜。螢光光譜之測定使用FP-6 5 00螢光光度計 (Spectrofluorometer)( JASCO公司）進行，使用光路長 3mm 之細胞，藉由2 80nm激發光激發色胺酸的螢光由波長3 20nm 至3 70nm的範圍下掃瞄，比較抗體之間鹽酸胍濃度與峰値波 長之關係，此結果，由C2K1之鹽酸胍濃度超過1M的時點， R2K1 vl.8超過2M之時點，相對於觀察到蛋白立體構造鬆弛造 成峰値波長之位移，R2Klvl.7中甚至3.8M之峰値波長並未位 移（第8圖）。由此，確認R2Klvl.7抗體，與R2Klvl.8抗體及 」 C2K1抗體相比下對鹽酸胍的耐性提升。 (7.藉由CD之低pH耐性評價） 將C2K1抗體及R2Klvl.7抗體於20mM檸檬酸緩衝液 + 120mM NaCl( pH6)調整爲2mg/mL，於此等中一邊加入〇. 1N HC1與蒸餾水一邊將抗體濃度調製爲lmg/mL之各pH的樣 品，於室溫處理1小時處理，測定CD光譜。 CD (圓二色性）之測定使用J-820分光光度計 (Spectropolarimeter)( JASCO公司）進行，使用光路長 0.1mm -35- 200813087 之細胞，於波長205nm至260nm之範圍測定CD光譜，光譜之 解析，基於Yang等人之CD光譜之解析法（Methods in Enzymology，130，208-269 ( 1986))使用 JWSSE-480型蛋白 質二次構造解析程式（JAS CO公司），比較抗體之間以本法 算出的隨機構造含有率與處理pH之關係，此結果爲，相對於 C2K1抗體由pH3之隨機構造含有率上昇，R2K1W.7甚至於 ρΗ2·7未觀察到隨機構造上昇（第9圖）。據此，R2Klvl.7抗 體與C2K1抗體相比，持有甚至低0.3的pH的耐性被確認。 (8.藉由示差掃描型量熱計之熱安定性評價） 將C2K1抗體及R2Klvl.7抗體於20mM檸檬酸緩衝液 + 1.2 0mM NaCl ( pH 6·0 )緩衝液中以lmg/mL之濃度溶解，經 Microcal公司之超高感度示差掃描型熱量計（VP毛細管DSC 平台）調查熱安定性。此結果示於第1 〇圖。顯示高次構造之 變性溫度的變性中點（Tm)，相對於C2K1抗體之76.0°C， R2K1W.7抗體爲82.8°C而上升約6°C被確認，由此確認 R2K1W.7抗體於熱安定性顯著提升。 ( 9.藉R2K1 vl.7對OPN的細胞黏附抑制效果） 爲比較本發明案之R2Klvl.7與公知之人化抗OPN抗體（參 照WO 0 3/0 27 1 5 1，以下稱爲R2KlvO )之藥理效果，調查此 等2個抗體對人OPN的細胞黏附抑制效果。 1. 細胞之培養、繼代

Jurkat E6. 1細胞購自大日本製藥（株），使用RPMI 1640 (10%FCS，青黴素-鏈黴素）繼代，進行培養。 2. 試藥調製 -36- 200813087 黏附緩衝液（L-15培養基，1%BSA，50mM HEPES，ρΗ7·4) ΡΜΑ溶液（黏附緩衝液中40ng/mL佛波醇12-肉豆蔻酸酯 13-乙酸酯（PMA) [SIGMA]) CV染色液（0.5 %結晶紫、1%甲醯胺、20%甲醇） GST溶液（PBS(-)中5Hg/mL麩胱甘肽S-轉移酶（GST) [SIGMA]) 人 IgGi 溶液（PBS(-)中 400pg/mL ) [CALBIOCHEM] 3·凝血酶切斷型人N末端造骨蛋白（OPN)之調製 ^ GST融合凝血酶切斷型人N末端〇PN(GST-人N-OPN， 1.611^/1111〇依冒〇0 2/081522記載製作，於？83(-)中稀釋爲 5 pg/mL而用於實驗。 4.被驗藥物之調製 將 R2Klvl.7 ( 18.6mg/mL)及 R2KlvO ( 4.39mg/mL)稀釋 於 PBS(-)成爲 4、12、40、120、400 (pg/mL)，任一者之 溶液以總蛋白質濃度成爲40(^g/mL的方式添加人IgGi。 5 .各組構成 空白組（GST) 對照組 被驗藥物組 R2Klvl.7 ( 1、3、10、30、lOOpg/mL) R2KlvO ( 1、3、10、30、100pg/mL) 6.細胞黏附實驗

96孔微量平盤中，除了空白組外全部孔中添加GST-人 N-OPN溶液25μί，空白組添加GST溶液25pL，於37°C、培育 1小時後，以PBS(-)洗滌2次。添加PMA溶液50μί，並於37°C -37- 200813087 下培育30分鐘後，添加被驗藥物溶液（被驗藥物組）或人IgGl 溶液（空白組及對照組）25pL。Jurkat E6.1細胞以2xl06個 細胞/mL的方式懸浮於黏附緩衝液，於全部孔中添加25 /z L。 以15xg離心1分鐘將細胞沉澱於平盤底部後，於37°C培育1 小時。反應終了後，反轉平盤於47 xg下離心2分鐘除去上清 液（非黏附細胞），黏附細胞數之定量，添加CV染色液25 // L並於室溫放置1 0分鐘將細胞染色、固定後，以純水洗滌3 次，全部孔中添加1% Triton-ΧΙΟΟ溶液25 // L確認細胞可溶 化後，於微量平盤讀數機（SPECTRAmax25 0 Molecular Devices)中測定吸光度（測定波長5 95nm)。 7.解析 實驗爲1組使用5孔，算出各組吸光度之平均値及抑制率， 算出1C 50値（抑制率爲50%之被驗藥物濃度）。抑制率爲空白 組爲100%，對照組爲〇%。IC5〇値爲將X軸以對數之被驗藥 物濃度，Y軸爲抑制率作圖，藉最小二乘法以直線回歸之式 算出。針對1C 50値算出，使用用量反應顯示直線性之被驗藥 物濃度之數據。由第1 1圖所示結果，由於相對於公知之人化 抗人OPN抗體之細胞黏附抑制效果極低，理解R2Klvl.7具有 優異細胞黏附抑制效果（1C 5 0値：6 · 4 )。 (10.R2Klvl.7 對食蟹猴（cynomologusmonkey)之膠原蛋 白誘導關節炎之效果） 以費氏（Freund)完全佐劑（Becton Dickinson and Company)乳劑化的牛第II型膠原蛋白（膠原蛋白技術硏修 會），於投藥3 6日前免疫雌性食蟹猴之背部及尾部，投藥1 5 -38- 200813087 曰前加強。基於與免疫前動物比較之體重及指骨近位關節橢 圓面積之變化率，無作爲化，而分成3個投藥治療組（n= 1 0 )。 2 511^/]^或5〇11^/]^用量之1121^卜1.7或溶媒對照組，以1週間1 次共計8次經靜脈內注射投與。最初之投藥日規定爲0日。投 與期間中之〇、6、13、20、27、34、41、48及55日，關節腫 脹之徵狀，監測指骨近位關節楕圓面積，前後肢指骨近位關 節使用卡尺測定短軸及長軸而算出楕圓面積，1 6指之楕圓面 積平均値作爲指骨近位關節楕圓面積，指骨近位關節楕圓面 積之變化率，由投藥前之値作爲100%而算出。於第〇日，及6、 13、20、27、34、41、48及55日（投藥6日後），收取血漿， 測定R2Klvl.7及抗R2Klvl.7抗體。此測定的R2Klvl.7之血漿 中濃度，相當於谷底程度。數據分析，將抗R2K lv K 7抗體陽 性動物及試驗期間中死亡的動物之數據削除而進行。 25mg/kg用量R2Klvl.7組之1隻動物、及50mg/kg用量 R2Klvl.7組之4隻動物中，產生抗R2Klvl.7抗體。溶媒對照 組之2隻動物，25mg/kg用量R2Klvl.7群之2隻動物，及 5 0mg/kg用量R2Klvl.7組之1隻動物於投藥後死亡。關於死亡 例推測爲高度炎症造成的衰弱死。50mg/kg之R2K1W.7的治 療，與對照溶媒組比較，第27日〜5 5日之間，測定指骨近位 關節楕圓面積之變化率而足腫脹爲有意義地減少（第1 2 圖）。25mg/kg用量之R2Klvl.7，未顯示相對於指骨近位關節 楕圓面積變化之有意義的效果。25mg/kg用量及50mg/kg用量 之血漿中R2Klvl.7谷底濃度各爲38.41〜76.13// g/mL及 73.91 〜125.3//g/mL。人 OPN 之 SVVYGLR 序列，與猴 OPN 之 -39- 200813087 相當序列（s VAYGLR )(配列編號π )不同，對此人OPN胜 肽之R2K1 vl.7之結合親和性，相對於對應的猴ΟΡΝ胜肽之結 合親和性更高1 〇〇倍以上，考慮此等點’推定關節炎治療之 R2Klvl.7有效血漿中濃度爲l〇〇//g/mL以下。 (ll.R2Klvl.7 之 Fv 之製作） 藉由將持有前述R2K1-VH 1.7的重鏈之表現質體與持有 R2K1-VL1.7的輕鏈之表現質體作爲模板之PCR，製作VH1.7-連結物- VLL7(連結物爲編碼GGGGSGGGGSGGGGS(序列編 號1 4 )所表示的胺基酸序列之鹼基序列）之構造爲編碼一條 鏈可變區域片段（scFv )的DNA片段。此DNA片段之末端上 添加限制酵素Sfil與Notl之認識序列。將此DNA片段以限制 酵素Sfil與Notl消化，以相同Sfil與Notl消化的pCANTAB5E 載體（Marks J. D. et. al，J. Mol· Biol· vol. 222，p5 8 1 -97， 1991)插入Sfil部位與Notl部位，製作R2K1-VH1.7之scFv表 現質體。又，本表現質體之scFv編碼區域的下游處加入編碼 E-Tag的鹼基序列，此質體以常法並導入大腸菌HB2151株， 接種於SOBAG洋菜膠盤（2%葡萄糖、100 // g/mL之安比西林 含有SOB盤）獲得轉形體。抽出所獲得的選殖株之質體DNA， 以此作爲模板藉由DNA鹼基序列解析確認scFv之編碼區域 序列。DNA鹼基序列解析使用DTCS-Quick Start套組及 CEQ2000XL DNA Analysis System (任一者皆爲 Beckman Coulter公司製）獲得之鹼基序列示於序列編號9。 確認鹼基序列的大腸菌選殖株培養於含2%葡萄糖及100 μ g/mL之安比西林的2χΥΤ培養基培養後，將其一部份於加入 -40- 200813087

ImM IPTG及100 μ g/mL之安比西林的2xYT培養基中懸浮， 進一步隔夜培養並進行s c F ν之表現誘導。培養終了後’將菌 體經離心分離而回收，於含lmM EDTA的PBS中懸浮並於冰 中放置30分鐘。其次，以l〇,〇〇〇rpm離心15分鐘，回收上清 液以0.4 5 // m之過濾器過濾，獲得含scFv的膜間帶 (periplasma)濾份。由此膜間帶濾份，使用抗E-Tag抗體的 親和性層析純化R2K1 vl .7之scFv (以下記載爲 R2K1 vl.7-scFv )。 (% 如此調製的R2K1 vl.7-scFv中，進行膠體過濾層析的結果， 由第1 3圖所示分離樣式，確認大約全爲單體。 (12.與R2Klvl.7-scFv人造骨蛋白胜肽之結合性確認） 經純化R2K1 vl.7-scFv之hOPN5，對胜肽之結合活性以 ELISA法測定。方法爲大略前述者，本測定中作爲標識抗體， 使用HRP標識抗E-Tag抗體，其結果示於第14圖。對陰性對照 之BSA爲未結合，確認對hOPN5胜肽之特異性結合。 (1 3 ·聚乙二醇修飾抗體片段之製作） l R2K1 vl.7抗體依所定方法以胃蛋白酶（pepsin )處理後， 使用 Protein GHP管柱（皆爲 Amersham Biosciences 公司）及 Hi prep 16/60 sephacryl S-200 High Resolution管柱 (Amersham Biosciences 公司）而純化獲得 F( ab’）2。接著， 經純化F( abf ) 2以0. 1M DTT還原處理而將硫醇基活性化後， 進行使用 Sephadex-25管柱（Amersham Biosciences公司）的 膠體過濾以去除DTT。之後將獲得的Fab’以馬來醯亞胺化聚 乙二醇SUNBRIGHTME-120MA(日本油脂）以莫耳比1:10 -41- 200813087 混合並於4°C隔夜靜置使偶合反應。添加碘代乙醯胺 (Nakarai )，停止偶合反應後，使用Hi prep 16/60 Sephacry Is-2 0 0 High Resolution管柱之膠體過濾，獲得聚乙 二醇修飾 F( a b' ) 2(以下記載爲 F( ab’）2-PEG )，此 SDS-PAGE 之結果示於第1 5圖。比較對照之泳動與未修飾F ( a V ) 2之 比較，可確認聚乙二醇修飾的分子量之增加。 (13.與F ( ab1) 2-PEG之造骨蛋白胜肽之結合活性確認） 對純化R2K1 ν1·7之F ( ab’）-PEG之hOPNS胜肽的結合活性 使用表面電漿共鳴測定法確認。將生物素化hOPN5胜肽固定 於 Sensor Chip SA( BIAcore 公司），以 HBS-EP 緩衝液（BIAco re公司）稀釋爲5 // g/mL而使用F ( ab’）2-PEG確認結合活性 之結果示於第.16圖。由訊號之上昇確認對本F ( ab’）-PEG之 hOPN5胜肽之R2Klvl.7有同樣的結合活性。 本發明之人化抗人造骨蛋白抗體，由於活性（抗原結合活 性、白血球游走抑制活性等）及安定性（對熱、低酸性條件、 變性劑之耐性等）兩方面爲優異，有用於作爲自體免疫疾病、 風濕病、風濕性關節炎、變形性關節症起始之各種炎症性疾 病之預防或治療上較向來之抗人造骨蛋白抗體更有效之藥 劑。 本發明以較佳態樣可強調說明，但較佳態樣可被變更爲此 項業者自明者。本發明意圖可以本發明之本說明書中詳細記 載以外之方法實施。且，本發明包含添付之「申請專利範圍」 之精神及範圍的全部變更。 本申請案以日本國申請之特願2006-152892號爲基礎，其 -42- 200813087 揭示之內容全部包含於本說明書。又，包含其中所述之專利 及專利申請說明書的全部刊物所記載的內容，經引用於此處 者，與其全部明示的相同程度倂入本說明書。 【圖式簡單說明】 第1圖顯示含有編入載體之R2K1-VH1.7編碼區域的DNA鹼 基序列（上段：序列編號1 5 )及胺基酸序列（下段：序列編 號1 6 )(底線部爲分泌表現用引導子序列）。 第2圖顯示含有編入載體之R2K1·VH1·8編碼區域的DNA鹼 # 基序列（上段：序列編號1 7 )及胺基酸序列（下段：序列編 號1 8 )(底線部爲分泌表現用引導子序列）。 第3圖顯示含有編入載體之R2K1-VL1.7編碼區域的DNA鹼 基序列（上段：序列編號1 9 )及胺基酸序列（下段：序列編 號20 )(底線部爲分泌表現用引導子序列）。 第4圖顯示含有編入載體之R2K1-VL1.8編碼區域的DNA鹼 基序列（上段··序列編號21 )及胺基酸序列（下段：序列編 號22 )(底線部爲分泌表現用引導子序列）。 d 第5圖顯示以ELISA法調查對嵌合2K1抗體及人化2K1抗體 之hOPN5胜肽結合性的結果。 第6圖顯示以ELIS A法調查對於以70 °C加熱處理的嵌合2K1 抗體及人化2K1抗體之hOPN5胜肽的結合性之結果’顯示未 加熱處理時之結合性作爲1〇〇%時之比率。 第7圖顯示ELIS A法調查對於以pH5緩衝液處理的嵌合2K1 抗體及人化2K1抗體之hOPN5胜肽的結合性之結果’顯示未 以PH5緩衝液處理時之結合性作爲100%時之比率。 -43- 200813087 第8圖顯示以含有各濃度鹽酸胍之緩衝液處理的嵌合2K1 抗體及人化2K1抗體之螢光光譜中峰値波長製圖的結果。 第9圖顯示以CD測定各pH緩衝液處理的嵌合2K1抗體及人 化2K1抗體之隨機構造之含量的結果。 第10圖顯示以超高感度示差掃描型熱量計調查嵌合2K1抗 體及人化2K1抗體熱安定性的結果圖，波浪線箭頭及實線箭 頭各自表示嵌合2K1抗體及R2Klvl.7抗體之Tm。 第1 1圖顯示以R2K1 vl.7及R2K1 v0對人OPN的細胞黏附抑 制效果。 第12圖顯示R2K1 vl.7對猴膠原蛋白誘導關節炎中關節腫 脹之效果，資料顯示每一對照組、2 5 m g / k g組及5 0 m g / k g組各 別爲8隻動物、7隻動物及5隻動物之平均値±SE，依*p<0.05、 **ρ<0·0 1 : Dunnet型多重比較檢定與對照組爲有意義的差 異。 第13圖顯示純化R2Klvl.7-scFv之HPLC的分析結果。 第14圖顯示以£1^13八法調查對純化1121(：1¥1.7-3〇?乂之 J hOPN5胜肽的結合性之結果。 第15圖顯示完全分子型R2Klvl.7抗體、R2K1W.7抗體之F (ab，）2及純化 F ( ab’）2-PEG 之 SDS-PAGE結果。 第16圖顯示以BIAcore調查對R2Klvl.7之F(ab’）2-PEG之 hOPN5胜肽的結合性之結果。 [主要元件符號說明] te 〇 y \ \\ -44-

Claims (1)

1. 200813087 十、申請專利範圍： 1. 一種人化抗人造骨蛋白抗體，其包含序列編號1所示之胺 基酸序列構成的重鏈可變區域，及序列編號3所示之胺基 酸序列構成的輕鏈可變區域。 2. 如申請專利範圍第1項之人化抗人造骨蛋白抗體，該抗體 之重鏈恆定區域爲人igyi。 3 .如申請專利範圍第1項之人化抗人造骨蛋白抗體’該抗體 之輕鏈恆定區域爲人IgK。 4. 如申請專利範圍第1項之人化抗人造骨蛋白抗體’該抗體 之重鏈恆定區域爲人Igy 1，該抗體之輕鏈恆定區域爲人 IgK ° 5. —種人化抗人造骨蛋白抗體，其包含序列編號25所示之胺 基酸序列構成的重鏈，及序列編號27所示之胺基酸序列構 成的輕鏈。 6. —種多核苷酸，其包含編碼申請專利範圍第1項之人化抗 人造骨蛋白抗體之重鏈可變區域的序列。 7. —種多核苷酸，其包含編碼申請專利範圍第1項之人化抗 人造骨蛋白抗體之輕鏈可變區域的序列。 8. —種表現載體，其包含申請專利範圍第6項及/或申請專利 範圍第7項之多核苷酸。 9. 一種宿主細胞，其導入申請專利範圍第8項之表現載體。 10. —種人化抗人造骨蛋白抗體之生産方法，其包含培養申 請專利範圍第9項之宿主細胞，而使人化抗人造骨蛋白抗 體表現的步驟。 -45- 200813087 11 · 一種自體免疫疾病、風濕病、風濕性關節炎或變形性關 節症之治療藥，其包含申請專利範圍第1至5項中任一項之 人化抗人造骨蛋白抗體。 1 2 · —種預防或治療自體免疫疾病、風濕病、風濕性關節炎 或變形性關節症之方法，其包含投與申請專利範圍第1至5 項中任一項之人化抗人造骨蛋白抗體之治療有效量的步 驟。 1 3 · —種申請專利範圍第1至5項中任一項之人化抗人造骨蛋 ^ 1 白抗體之用途，其用於預防或治療自體免疫疾病、風濕病、 風濕性關節炎或變形性關節症用之醫藥之製造。 -46- 200813087 序列表 <110> Astellas Pharma Inc. Juridical Foundation The Ghemo~Sero~Therapeutio Research Institute <120〉人化抗人造骨蛋白抗體 <130> 091084 <150> JP 2006-152892 <151> 2006-05-31 <160> 27 <170〉Patentln3.3 版 <210〉 1 <211〉 116 <212〉 PRT <213〉人工 <223〉合成建構物 <400> 1 / Gin Val 6ln Leu Qln 6ln Ser Gly Ala 6lu Val Lys Lys Pro 6ly Ala ( 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Giu Met His Trp Val Lys Qfn Thr Pro Val His Gly Leu G!u Trp lie 35 40 45 8ly Ala lie His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Qly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr €5 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser 6lu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Gys 85 90 95 Thr Arg lie Thr 6ly Tyr Phe Asp Val Trp Qly 6ln 6iy Thr Thr Val 100 105 110 Thr Vai Ser Ser 115 <210> 2 <211〉 116 <212〉 PRT <213〉人工 <220> <223〉合成建構物 <400> 2 6!n Val 6ln Leu Val Gin Ser Gly Ala 6lu Leu Val Arg Pro Gly Ser 15 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Qly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 6lu Met His Trp Val Lys Qln Thr Pro Val His fily Leu Glu Trp lie 35 40 45 8ly Ala lie His Pro Gly Arg Qly Gty Thr Ala Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 (1) 200813087 Thr Arg lie Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210〉 3 <211〉 113 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223〉合成建構物 <400> 3 Asp Val Val Met Thr Sin Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu 6ly 15 10 15 Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 6lu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 6ly Gin Ser 35 40 45

   Pro 6In Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Ar© Phe Ser Gly Ser Gly Ssr Giy Thr Asp Phs Tiir Leu Lys !!6 65 70 75 80 Ser Arg Val Qlu Ala 6lu Asp Val Qly Val Tyr Tyr Cys Phe 6ln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly 6ln Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110 Arg <210〉 4 <211〉 113 <212> PRT <213〉人工 <220> g銘合成建構物 <400> 4

   Asp Val Val Met Thr 6In Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 15 10 15 6ln Pro Ala Ser Me Ser Cys Arg Ser Ser 6ln Ser lie Val His Ser 20 25 30 A$n Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Qln Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro 61n Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gin fily Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 Arg 200813087 <210〉 5 <21t> 348 <212> ONA <213〉人工 <220> <223〉R2K 卜VH1.7 區域 <220> <221> CDS <222〉（1)..(348) <400> 5 cag gtg oag ctg cag cag tct ggg got gag gtg aag aag oct ggg gcc Gin Val (aln Leu 6ln Gin Ser G!y Ala filu VaT Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tcc gtg aag gto tcc tgc aag get ttg ggg tat acc tto act gac tat Ser Va! Lys Val Ser Cys Lys Ala Leu fily Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gaa atg cac tgg gtg aag cag aoo cot gta oat ggg ett gag tgg att 6lu Met His Trp Val Lys 6in Thr Pro Val His 6Iy Leu Glu Trp Me 35 40 45 gga get att cat cca gga aga ggt ggt act gcc tac aat cag aag tto g Gly Ala lie His Pro 6ly Arg 6Iy Gly Thr Ala Tyr Asn Gin Lys Phe f 50 55 60 aag ggc aag goo aeg ctg aca geg gac aaa tcc act agt aca gcc tac Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 SO atg gag ctg age ago ctg aoa tct gag gac aeg gcc gtg tat tao tgt Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser GIu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga att act ggg tac ttc gat gto tgg ggg oaa ggg aco aog gto Tlir Arg Ik Tfir GTy fyr Phe Xsp Val frp GTy Gin (3Ty Thr Thr Val 100 105 110 acc gto too tea Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 348 <212> DNA <213>人工 〈220〉 <223〉R2K1-VH1.8 區域 t / <220〉 <221> CDS <222〉⑴·，（348) <400> 6 cag gtg oag ctg gtg cag tot ggg get gag ctg gtg agg cot ggg tcc Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Giy Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 15 10 15 too gtg aag gto tcc tgc aag get tct ggg tat acc ttc act gac tat Ser Val Lys Val Ser Gys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gaa atg cac tgg gtg aag cag acc cct gta cat ggg ett gag tgg att Glu Met His Trp Val Lys Gin Thr Pro Val His Gly Leu 6lu Trp lie 35 40 45 gga get att cat cca gga aga ggt ggt act gcc tac aat cag aag tto Qly Ala He His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 6ln Lys Phe 50 55 60 aag ggc aag gcc aeg ctg aco geg gac aaa tcc act agt aca gcc tac Lys 6ly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 48 96 144 192 240 288 336 348 48 96 144 192 240 288 288

   200813087 65 70 75 80 atg gag ctg age ago ctg aoa tot gag gao aeg gee gtg tat tao tgt Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser 6tu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga att act ggg tac ttc gat gtc tgg ggg caa ggg aco aog gtc Thr Arg lie Thr 6ly Tyr Phe Asp Val Trp 6ly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110 acc gtc too toa Thr Val Ser Ser 115 <210> 7 <211〉 339 <212> DNA <213〉人工 R2K1-VL1.7 區域 <220> <221> CDS <222> (1)..(339) <400〉 7 gat gtt gtg atg act cag tot coa etc toe ctg ago gto acc ott gga Asp Val Val Met Thr 6jn Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 cag ccg goo too ate too tgc agg ago tet caa aga att gta cat agt Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser 6ln Ser Me Val His Ser 20 25 30 aat gga aac aac tat ttg gaa tgg tac ctg cag aag cca ggg cag tot Asn Gly A«n Thr Tyr Leu Qlu Trp Tyr Leu 6ln Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 oca cag etc ctg ato tat aaa gtt tcc aac ega ttt tot ggg gtc cca Pro Qln Leu Uu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gac aga ttc ago ggc agt ggg tea ggc act gat ttc aca ctg aaa ate Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 ago agg gtt gaa get gaa gac gtc gga gtt tat tac tgc ttt oaa ggt Ser Arg Val Glu Ala 6lu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe 6ln Gly 85 90 95 tea oat gtt ccg etc aeg ttt gga oag ggg acc aag otg gag ate aaa Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu Me Lys 100 105 110

   <210〉 8 <211> 339 <212〉 DNA <213〉人工 <220> <223〉R2K1-VL1.8區域 <220〉 <221> CDS <222〉(1).. (339) <400> 8 336 348 48 96 144 192 240 288 336 339 48 200813087 48

   gat gtt gtg atg act oag tot oca etc tee ctg cco gtc acc ett gga Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly \ 5 ΙΟ 15 cag cog gee tee ate tee tgc agg ago tot caa ago att gta cat agt Gin Pro Ala Ser ile Ser Cys Arg Ser Ser Qln Ser lie Val His Ser 20 25 30 aat gga aac aco tat ttg gaa tgg tac ctg oag aag coa ggg cag tet Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 6lu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 6ly Gin Ser 35 45 cca cag etc ctg ate tat aaa gtt tee aac ega ttt tet ggg gtc cca Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gao aga tto age ggo agt ggg tea ggc act gat ttc apa ctg aaa ato Asp Arg Phe Ser Gly Ser 6ly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 age agg gtt gaa get gaa gao gtc gga gtt tat tac tgc ttt caa ggt Ser Arg Val 6lu Ala 6lu Asp Val 6iy Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 tea oat gtt oog etc aeg ttt ggc oag ggg acc aag ctg gag ate aaa Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Sin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 cgt Arg 96 144 192 240 288 336 339

   <210> 9 <211〉 732 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> R2K1v1.7-scFv <400〉 9 caggtgcagc tgcagoagtc tggggctgag gtgaagaage ctggggcata ogtgaaggto tcotgcaagg ctttggggta tacottoact gactatgaaa tgcaotgggt gaagaagacc cctgtacatg ggcttgagtg gattggaget attcatccag gaagaggtgg taotgeotao aatcagaagt tcaagggoaa ggocaogctg acogcggaca aatccactag tacagcctac atggagctga gcagcotgac atetgaggao aoggccgtgt attactgtao aagaattact gggtacttcg atgtotgggg gcaagggaca acggtcaccg tctcctcagg tggaggcggt teaggeggag gtggctctgg oggtggogga tcggatgttg tgatgaccca gtctocactc tcoctgagcg tcaoccttgg acagccggco tccatotoct gcaggagctc tcaaagcatt gtacatagta atggaaaoao ctatttggaa tggtacotgG agaagccagg gcagtctcca oagctcotga tctataaagt ttccaaccga ttttctgggg tcccagacag attcagcggc agtgggtcag gcaotgattt cacactgada atcagcaggg ttgaagotga agaegtegga gtttattact gctttcaagg ttcaoatgtt ocgctoacgt ttggccaggg gaccaagotg gagatcaaao gt <210> 10 <211〉 7 <212> PRT <213〉人工 人或豬造骨蛋白之部分胜肽 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 732 200813087 <400〉 10 Set Val Val Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210> 11 <211〉 7 <212> PRT <213〉人工 <220> <223〉猴造骨蛋白之部分胜肽 <400> 11 Ser Val Ala Tyr Gly Leu Arg <2?0> 12 <211> 7 <212〉 PRT <213〉人工 <220

   <223〉小鼠或大鼠造骨蛋白之部分胜肽 <400 12 Ser Leu Ala Tyr Gly Leu Arg 1 5 <210〉 13 <211〉 18 <212〉 PRT <213〉人工 <220> <223〉造骨蛋白之部分胜肽 <400> 13 Leu Cys Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Val Tyr Gly 15 10 15 Arg Ser <210> 14 <211> 15 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉·連結子 <400〉 14 6ly Qly Gly Gly Ser 6ly Qly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210 15 <211> 441 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉描述於第1圖之R2K1-VH1.7 <2Z0> <221> CDS <222〉 (20).. (424) <400〉 15 cagcaagctt gccgccaco atg gaa tgg ago tgg ate ttt etc ttc eta ctg 52 100200813087 Leu Phe Leu Leu 10 Met Glu Trp Ser Trp lie Phe tea gta act gca ggt gtc caa tcc cag gtg cag Gtg cag cag tet ggg Ser Val Thr Ala Gly Val Gin Ser Gin Val Qln Leu 6!n 6ln Ser 6ly 15 20 25 get gag gtg aag aag cct ggg goc toe gtg aag gta tcc tgo aag get Ala 6lu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Vai Lys Val Ser Cys Lys Ala 30 35 40 148

   ttg ggg tat acc ttc act gao tat gaa atg cac tgg gtg aag cag acc Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 6lu Met His Trp Val Lys 6ln Thr 45 50 55 cct gta oat ggg ett gag tgg att gga get att oat cca gga aga ggt Pro VaJ His Gty Leu 6iu Trp lie 6ly Ala lie His Pro Gfy Arg Gly 60 65 70 75 ggt act goc tac aat cag aag tto aag ggc aag gcc aeg ctg acc geg Cly Thr Ala Tyr Asn filn Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala 80 85 90 gac aaa tcc act agt aca geo tao atg gag ctg age ago ctg aoa tet Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met 6lu Leu Ser Ser Leti Thr Ser 95 100 105 196 244 292 340 gag gac aeg goc gtg tat tac tgt aca aga att act ggg tac ttc gat Glu Asp Thr A!a Va! Tyr Tyr Gys Thr Arg !!s Thr Gly Tv，r Phs Asp 110 115 120 gtc tgg ggg caa ggg acc aeg gtc acc gto toe tea ggtgagtgga Val Trp Gly Gin Qly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 125 130 135 388 434 teegega 441 <210〉 16 <211> 135 <212> PRT <213〉人工 <22§> <400> 16 Met Glu Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Qly .10 15 Val Gin Ser Gin Val Qln Leu Gin Gin Ser Gly Ala 6lu Val lys Lys 20 25 30

   Pro Gly Ala Ser Val Lys Va! Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lye Gin Thr Pro Val His Gly Leu 50 55 60 G.u Trp lie Gly Ala lie His Pro Qly Arg 61y 6ly Thr A.a Tyr Asn 6ln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg lie Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 17 200813087 <211> 441 <212> DNA <213〉人工

   <223〉描述於第2圖之R2K1-VH1.8 <220> <221〉 CDS <222〉（20). · (424) <400> 17 cagcaagctt gocgccacc atg gaa tgg ago tgg ate ttt oto ttc etc ctg Met 61u Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu 1 5 10 tea gta act gca ggt gtc caa too cag gtg oag atg gtg cag tet ggg Ser Val Thr Ala Gly Vai Sin Ser 6ln Val Gin Leu Val Gin Ser Qly 15 20 25 got gag ctg gtg agg cot ggg tcc toe gtg aag gto tcc tgo aag get Ala Glu Leu VaT Arg Pro 6Iy Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala 30 35 40 tet ggg tat acc ttc act gao tat gaa atg oao tgg gtg aag cag aca Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Lys Gin Thr 45 50 55 act gta cat ggg ett gag tgg att gga get att cat ooa gga aga egt Pro vai His 0iy Leu QJu Trp He Gly Ala Me His Pro fily Arg Gly 60 65 70 75 ggt act goo tao aat cag aag tto aag ggc aag gcc aeg ctg acc geg Gly Thr Ala Tyr Asn 6ln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala 80 85 90 gac aaa tcc act agt aca gcc tac atg gag ctg ago ago ctg aca tet Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser 95 100 105 gag gao aeg gcc gtg tat tac tgt aca aga att act ggg tac ttc gat Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg lie Thr GTy Tyr Phe Asp 110 115 120 gto tgg ggg caa ggg acc aeg gto acc gtc tcc toa ggtgagtgga Val Trp Qly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 125 130 135 teegoga 52 100 148 196 244 292 340 388 434 441

   <210> 18 <211〉135 <2ί2> PRT <213〉人工 <223〉合成建構物 <400> 18 Met Glu Trp Ser Trp lie Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly 15 10 15 Val Qln Ser Qln Val Gin Leu Val Gin Ser Qly Ala Glu Leu Val Arg 20 25 30 Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 6Iy Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Asp Tyr Qiu Met His Trp Val Lys 6ln Thr Pro Val His Gly Leu 50 55 60 Glu Trp lie Gly Ala He His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 65 70 75 80 Gin Lys Phe Lys Qly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg He Thr 6ly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Sly 115 120 125 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 19 <211> 455 <212〉 DNA <213>人工 <223〉描述於第3圖之R2K1-VL1.7 <220〉 <221〉 CDS <222〉(20).. (415) <400〉 19 cagcaagctt gcogccacc atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met 1 5 10 ttc tgg att cct got toe ago agx gat gtt gtg atg act cag tot cca Phe Trp lie Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr 6ln Ser Pro 15 20 25 etc tcc ctg ago gtc acc ott gga cag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Giy Gin Pro Ala Ser Me Ser Cys Arg 30 35 40 age tot caa age att gta cat agt aat gga aac acc tat ttg gaa tgg Ser Ser 6ln Ser lie Val His Ser Asn 6ly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 45 50 55 tao ctg cag aag coa ggg oag tet cca cag etc ctg ato tat aaa gtt Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Qln Leu Leu Ile Tyr Lys Val 60 65 70 75 too aac ega ttt tet ggg gtc cca gac aga ttc ago ggo agt ggg tea S^r Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Pha Ser 6ly Ser Gly Ser BO 85 90 ggo act gat ttc aca otg aaa ato ago agg gtt gaa get gaa gac gto Gly Thr A$p Phe Thr Leu Lys He Ser Arg Val 6Iu Ala Glu Asp Val 95 100 105 gga gtt tat tac tgc ttt oaa ggt tea cat gtt ccg etc aeg ttt ggc 6ly Yal Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly 110 115 120 cag ggg acc aag ctg gag ate aaa cgt gagtagaatt taaaotttgc Qln 6ly Thr Lys Leu Qtu lie Lys Arg 125 130 ttcctcagtt ggatccgcga <210> 20 <211> 132 <212> PRT <213〉人工 <220〉 <223〉合成建構物 <400> 20 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Vai Leu Met Phe Trp lie Pro Ala 200813087 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val .20 25 30 Thr Leu 6Iy 6In Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Giu Trp Tyr Leu Qln Lys Pro 50 55 60 Qty Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Qly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys lie Ser Arg Val G!u Ala Giu Asp Val 6ty Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gin 6ly Thr Lys Leu 115 120 125 Giu Ile Lys Arg 130 <210〉 21 <211> 455 <212> ONA <213〉人]: <223〉描述於第4圖之R2K1-VL1.8 <220〉 <221〉 CDS <222〉 (20>..⑷5) <400> 21 cagoaagctt gccgocacc atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg Met Lys Uu Pro Val Arg Leu Leu 9aT Leu Met 1 5 10 tto tgg att cot get too ago agt gat gtt gtg atg act cag tet cca Phe Trp lie Pro Ala Ser Ser Ser Asp Val Val Bet Thr Gin Ser Pro 15 20 25 otc too otg ccc gtc acc ett gga cag ocg goo tcc ate tcc tgc agg Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg 30 35 40 age tet caa ago att gta cat agt aat gga aac aco tat ttg gaa tgg Ser Ser 6ln Ser lie Val His Ser Asn Qly Asn Thr Tyr Leu Giu Trp 45 50 55 tao ctg cag aag oaa ggg cag tet cca oag cto ctg ate tat aaa gtt Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Qln Ser Pro Qln Leu Leu lie Tyr Lys Val 60 65 70 75 too aac Gga ttt tet ggg gtc aca gac aga ttc age ggc agt ggg tea Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vat Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 80 85 90 ggc act gat tto aca ctg aaa ate ago agg gtt gaa get gaa gao gtc Qly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Giu Ala Giu Asp Val 95 100 105 gga gtt tat tao tgc ttt caa ggt tea cat gtt ccg etc aeg ttt ggc Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Hi$ Val Pro Leu Thr Phe Gly 110 115 120 cag ggg acc aag ctg gag ato aaa cgt gagtagaatt taaactttgc Qln Gly Thr Lys Leu Giu lie Lys Arg 125 130 ttcctcagtt ggatccgcga 52 100 148 196 244 292 340 388 435 455 -10- 200813087 <210〉22 <211> 132 <212> PRT <213〉人工 <220> <223〉合成建構物 <400> 22 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Vai Leu Met Phe Trp lie Pro Ala 15 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr 6ln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Thr Leu 6ly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser 6ln Ser lie 35 40 45 Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 6lu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro QIn Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 6ty Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95

   Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala 6lu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe 6ln Qly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu 115 120 125 6lu lie Lys Arg 130 <210> 23 <211> 314 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 23 Met Arg lie Ala Val lie Cys Phe Cys Leu Leu Gly lie Thr Cys Ala 15 10 15 He Pro Val Lys Gin Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Ly$ Gin Leu 20 25 30 Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asr» Pro Asp Pro 35 40 45 Ser Gin Lys 6ln Asn Leu Leu Ala Pro Gin Asn Ala Val Ser Ser Glu 50 55 60 Qlu Thr Asn Asp Phe Lys Gin Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu 65 70 75 80 Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His 85 90 95 Val Asp Ser Gin Asp Ser He Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp 100 105 110 Asp Thr Asp Asp Ser His Gin Ser Asp Glu Ser His His Ser Asp Qlu 115 120 125 Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu 130 135 140 Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Qly 145 150 155 160 Asp Ser Vat Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg 165 170 175 -11-

   200813087 Pro Asp Me Gin Tyr Pro Asp Ala Thr Asp 6lu Asp lie Thr Ser His 180 185 190 Met Qlu Ser 6lu 6lu Leu Asn 6ly Ala Tyr Lys Ala lie Pro Val Ala 195 200 205 6In Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Qly Lys Asp Ser 210 215 220 Tyr Qlu Thr Ser Gin Leu Asp Asp 6tn Ser Ala Qlu Thr Hi« Ser His 225 230 235 240 Lys Gin Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Qlu Ser Asn Giu 245 250 255 His Ser Asp Val Jle Asp Ser Gin Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg 6lti 260 265 270 Phe His Ser His Glu Phe His Ser His Qlu Asp Ket Leu Val Val Asp 275 280 285 Pro Lys Ser Lys Glu Glu Asp Lys His Leu Lys Phe Arg lie Ser His 290 295 300 filu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn 305 310 <210> 24 <211> 1338 <212> DNA <213〉人工 <220> <223〉R2Klvl.7H 鏈 <220〉 <221〉CDS <222> (1)., (1338) <400〉 24 oag gtg oag ctg cag cag tot ggg get gag gtg aag aag cct ggg geo 6ln Val Gin Leu Gin 6ln Ser Qly Ala Glu Val Lys Lys Pro 6Iy Ala 15 10 15 too gtg aag gtc tco tgc aag get ttg ggg tat aoo tto act gao tat Ser Val Lys Yal Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 gaa atg cac tgg gtg aag cag aco cct gta cat ggg ett gag tgg att Glu Met His Trp Vat Lys Gin Thr Pro Val His Gly Leu Slu Trp lie 35 40 45 gga get att cat cca gga aga ggt ggt act gcc tac aat cag aag tto Gly Ala lie His Pro 6ly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60 aag ggo aag geo aeg ctg aoc geg gao aaa tco act agt aca gcc tac Lys Qly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag otg age ago ctg aca tet gag gac aeg geo gtg tat tao tgt Met Qlu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 aca aga att act ggg tac tto gat gto tgg ggg caa ggg acc aog gtc Thr Arg lie Thr Qly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Qly Thr Thr Val 100 105 110 acc gtc tcc tea gcc toe aco aag ggo cca tog gtc ttc coc ctg gca Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 coc too tcc aag ago acc tot ggg ggc aca geg geo ctg ggo tgc ctg Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Sly Cys Leu 48 96 144 192 240 288 336 384 -12- 432 480200813087 f

   If； 130 135 140 gtc aag gac tao ttc coo gaa cog gtg acg gtg teg tgg aac tea ggc Va! Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 gee ctg aoc age ggc gtg cac aoo tto cog got gto ota Gag tee tea Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 165 170 175 gga otc tao too oto age age gtg gtg acc gtg cco tee age ago ttg Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 ggc aco cag acc tae sto tgc aao gtg aat cac aag ccc ago aao aoo Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 aag gtg gac aag aaa gtt gag odd aaa tot tgt gac aaa act cao aca Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 tgc cca ocg tgc cca goa oot gaa etc ctg ggg gga ccg tea gta tto Cys Pro Pro Gys Pro Ala Pro 6lu Leu Leu 6ty Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 otc tto oco ooa aaa ccc aag gac acc etc atg ato tee egg acc cct Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Lou Met lie Ser Arg Thr Pro 245 250 255 gag gtc aoa tgo gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc Glu Val Thr Cys Val Val Vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 aag ttc aao tgg tac gtg gac ggo gtg gag gtg cat aat gee aag aca Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 aag ccg egg gag gag cag tao aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc Lys Pro Arg Glu Glu <3ln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 etc aco gtc ctg cao cag gao tgg ctg aat ggc aag gag tao aag tgc Leu Thr Val Leu His 61 n Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 aag gtc toe aao aaa gee otc cca gee cqg ate gag aaa acc ato tee Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser 325 330 335 aaa gee aaa ggg cag; cca oga gaa cca oag gtg tac acc ctg ccc cca Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 6ln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 too egg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg aco tgc ctg gto Ser Arg Asp 61u Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 aaa ggc tto tat coo age gac ato gee gtg gag tgg gag ago aat ggg Lys 6ly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Qlu Trp Glu Ser Asn Qly 370 375 380 oag ocg gag aac aac tac aag acc acg cot occ gtg ctg gac tee gac Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Ly« Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 tee ttc ttc etc tac age aag oto acc gtg gaa aag age agg tgg Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 cag cag ggg aac gtc ttc tea tgo too gtg atg aat gag get ctg cac Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 aac cao tac acg cag aag age cto too ctg tet ccg ggt aaa Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 528 576 624 672 720 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 -13- 1338 200813087 435 440 445 <210〉 25 <211〉 446 <212〉 PRT <213〉人工 <220〉 <223〉合成建構物 <400〉 25 6ln Val 6ln Leu 6ln Gin Ser 6ly Ala GIu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cy$ Lys Afa Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 GIu Met His Trp Val Lys filn Thr Pro Val His Gly Leu GIu Trp lie 35 40 45 Gly Ala lie His Pro Gly Arg Gly Gly Thr Ala Tyr Asn 6ln Lys Phe 50 55 60 Lys 6ly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 / Met GIu Leu Ser Ser Leu Thr Ser GIu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 9Q 95 Thr Arg lie Thr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Qly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Giy Gly Thr Ala Ala Leu Qly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro GIu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 165 170 175 6ly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr filn Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205

   Lys Val Asp Lys Lys Val GIu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro GIu Leu Leu Qly Qly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro 245 250 255 GIu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His GIu Asp Pro GIu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val GIu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg GIu GIu Qln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr ΫαΙ Leu His Qln Asp Trp Leu Asn Gly Lys GIu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie GIu Lys Thr lie Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Qly Gin Pro Arg Qiu Pro Qln Val Tyr Thr Leu Pro Pro -14- 200813087 340 345 350 Ser Arg Asp Gtu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys 6ly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 6ly 370 375 380 Gin Pro Slu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 6ly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 6ln Gin 6ly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 6ly Lys 435 440 445 <210〉 26 <211〉 657 <212〉DMA <213〉人工 <220〉 <223〉R2Klvl.7L 鏈 ynnnv \IVJ/ <221 > CDS <222> (1)，，（657) <400> 26 gat gtt gtg atg act oag tct ooa etc tcc ctg age gtc acc ett gga Asp Val Val Met Thr Qln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu Gly 15 10 15 cag ccg gcc tcc ate too tgc agg ago tct caa age att gta cat agt 6ln Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Val His Ser 20 25 30 aat gga aac acc tat ttg gaa tgg tac ctg oag aag ooa ggg cag tct Asn Gly Asn Thr Tyr Leu filu Trp Tyr Leu Qln Lys Pro Gly Qln Ser 35 40 45 cca cag etc otg ate tat aaa gtt tcc aac ega ttt tct ggg gtc cca Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 gao aga tto ago gga agt ggg tea ggc act gat ttc aca ctg aaa ate Asp Arg Phe Ser fily Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 age agg gtt gaa get gaa gac gto gga gtt tat tao tga ttt caa ggt Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe 6ln Gly 85 90 95 tea oat gtt ccg cto aeg ttt ggc cag ggg aac aag ctg gag ate aaa Ser His Val Pro Leu Thr Phe Qly 6ln Qly Thr Lys Leu 6lu lie Lys 100 105 110 oga aot gtg got gca cca tct gtc ttc ato ttc ccg cca tct gat gag Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Me Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 cag ttg aaa tot gga act goo tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aao ttc 6ln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 tat ccc aga gag gcc aaa gta oag tgg aag gtg gat aac gcc etc caa Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 6ln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 teg ggt aac too cag gag agt gto aca gag cag gac age aag gac age Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 48 96 144 192 240 288 336 384 432 480 -15- 528 576 200813087 165 170 175 aco tac age etc age age acc ctg aeg Gtg age aaa gca gac tao gag Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 6lu 180 185 190 aaa cac aaa gtc tac gee tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg ago teg Lys Hj$ Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Qln ily Leu Ser Ser 195 200 205 cco gto aca aag ago ttc aac agg gga gag tgt Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210〉 27 <211> 219 <212〉 PRT <2t3>人工 <220> <223〉合成建構物 <400> 27 Asp Val Val Met Thr 61n Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Leu 6ly 10 15

   624 657 Gin Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser lie Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu G.n Lys Pro Gly Gin Ser Pro 6ln Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Qly Val Pro 50 55 6Q Asp Arg Phe Ser Qly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Slu A^p Val Qly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gin Leu Lys Ser 61 y Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 6In 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Giu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr AJa Cys 6iu Val Thr His 6ln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 -16-