MX2008015309A - Anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana. - Google Patents
Anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana.Info
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Abstract
La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana teniendo mejores actividades (actividad de unión a antígeno, actividad inhibidora de migración de leucocito y lo similar) y/o estabilidad (resistencia a calor, condiciones de pH bajo, desnaturalizantes y lo similar) que aquellos de los anticuerpos de osteopontina anti-humana convencionales.
Description
ANTICUERPO HUMANIZADO DE OSTEOPONTINA ANTIHUMANA Campo Técnico La presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado de osteopontina antihumana teniendo actividad y estabilidad excelentes, y un método de diagnóstico y terapéutico de la enfermedad utilizando el anticuerpo . Técnica Anterior La osteopontina (de aquí en adelante referida como "OPN") es una glicoproteina de unión a calcio ácida abundantemente encontrada en el hueso, y en el caso de humanos, se sabe que al menos tres isoformas pueden ocurrir debido a las diferencias en división de ARNm : la os teopont ina-a (de aqui en adelante referida como "OPN-a"), os teopont ina-b (de aqui en adelante referida como "OPN-b") y os teopontina-c (de aqui en adelante referida como "OPN-c") (documento no patente 1) . En particular, el precursor de OPN-a tiene la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO:23 en el listado de secuencias dado abajo, y se conside-ra que experimenta la segmentación de
péptido de señal en secreción para formar la forma madura de' OPN-a de I17-N314. La forma madura de OPN se segmenta por trombina in vivo en el lado C-terminal del 168vo (en el caso de OPN-a) residuo arginina, resultando en un Fragmento N-terminal y un Fragmento C-terminal.
La OPN descrita arriba es responsable de una amplia variedad de funciones fisiológica y pa ológicamente importantes, y tiene funciones, por ejemplo, adhesión celular, migración celular, tumo ri géne s i s , respuestas inmunes, inhibición de citolisis mediada por complemento, y lo similar. Estas diversas funciones se median por una amplia variedad de receptores de superficie celular. OPN tiene la secuencia RGD en la misma (por ejemplo, para OPN-a, residuos 159no a 161ro); integrinas que reconocen esta secuencia RGD, tales como a?ß3, a,?ß? y a?ß5, son receptores principales de OPN, de las cuales las integrinas a?ß3, a?ß? y ?ß5 median la adhesión celular en células vasculares del músculo liso; además, a?ß3 se asocia con la migración de macrófagos, linfocitos, células endoteliales, células del músculo liso y lo similar.
Además, la búsqueda que se ha conducido a la fecha también ha demostrado que OPN se une a integrinas a9ß1, a4ß1 y a4ß7 a través de la secuencia SVVYGLR ( SEQ ID NO:10), y se ha encontrado una diferencia en el modo de unión en que 4ß1 se une tanto a OPN no segmentado por trombina (OPN tipo no segmentada) y un fragmento N-terminal segmentado por trombina (OPN tipo segmentada), mientras que a9ß1 se une solamente a OPN tipo segmentada por trombina (documentos no patente 2 a 4) . Estas subunidades de integrina a9 y oc4 y ß? y ß7 son altamente similares entre si en términos de secuencia de aminoácidos. Las integrinas a4ß1 y a4ß7 se encuentran principalmente en linfocitos y monocitos pero se expresan a niveles muy bajos en neutrófilos. Por el otro lado, a9ß1 se expresa altamente de manera selectiva en neutrófilos, y es responsable de las funciones esenciales para la migración de neutrófilo a través de VCAM-1, Tenascina-C y lo similar. a9ß1 se expresa ampliamente en miocitos, células epiteliales, hepatocitos y lo similar. En realidad, los dominios ci toplásticos de las subunidades de integrina a4 y a9 se consideran .
incluidos en varias reacciones inflamatorias al promover de manera cooperativa la migración y agregación de leucocitos a sitios de inflamación a través de las trayectorias de transducción de señal intracelular ligeramente diferentes, respectivas para mejorar las actividades de infiltración de los mismos . Como se describe arriba, debido a que una amplia variedad de integrinas promueven la migración de leucocitos y se incluyen en reacciones inflamatorias, se piensa que los fármacos que inhiben estas actividades de integrina tienen el potencial de servir como agentes anti-inflamatorios . Por ejemplo, integrina ?ß3 se expresa en os teoclas tos , células endoteliales vasculares, células del músculo liso y lo similar; debido a que se espera que la inhibición de la unión de integrina a?ß3 y varios ligandos de unión de la misma tenga acción supresora de depresión de la unión en, por ejemplo, uniones, el desarrollo de anticuerpo anti-aV" 3 actualmente está en proceso . Sin embargo, debido a que los receptores que pertenecen a la familia de integrina se
expresan de manera universal en un amplio rango de tejidos y son responsables de las funciones esenciales para el mantenimiento de las actividades biológicas, el uso de un anticuerpo contra integrina en el tratamiento de artritis reumatoide u os teoart rit i s puede causar inhibición similar en otros sitios, y el inicio de reacciones adversas es de interés. ? partir de este punto de vista, se han hecho intentos a la fecha de aclarar la etiología de artritis reumatoide, os eoartritis y lo similar, y proporcionar un mejor método terapéutico. Por ejemplo, en WO02/081522 (documento de patente 1), se encontró que en pacientes con reumatismo y pacientes con osteoartritis , la concentración de OPN del fluido .de cavidad articular tuvo valores altos, y en pacientes con reumatismo, la proporción del fragmento N-terminal tipo segmentado por trombina a la OPN total se incrementó, y se confirma que OPN se asocia prof ndamente con el inicio de estas enfermedades. En el documento de patente 1, se generan los anticuerpos que reconocen discretamente el fragmento N-terminal y el
fragmento C-terminal resultantes de la segmentación de OPN con trombina, respectivamente, y un estudio que los utiliza mostró que en pacientes con artritis reumatoide, el fragmento N-terminal segmentado por trombina, en particular, mostró altas concentraciones en la cavidad articular. En este fragmento N-terminal, la secuencia RGD y la secuencia SVVYGLR ( SEQ ID NO:10), reconocidas ambas por las integrinas tipo humano, coexisten; se ha confirmado que un anticuerpo que bloquea, simultáneamente estas dos secuencias inhibe completamente la unión de OPN e integrina, y que es efectivo en el tratamiento de artritis reumatoide, osteoartritis y lo similar. Específicamente, en el documento de patente 1, un anticuerpo que inhibe la unión entre la secuencia RGD de OPN de humano e integrina y se genera la unión entre la secuencia SVVYGLR de OPN de humano (SEQ ID NO: 10) e integrina, y su efecto se confirma por los experimentos en adhesión celular, migración celular y lo similar. Además, se adquiere un anticuerpo contra un péptido sintético- correspondiente a
la secuencia interna de OPN de ratón, y su efecto como un fármaco terapéutico se confirma utilizando, un modelo patológico de ratón de
Por lo tanto, ya que OPN de ratón tiene la secuencia RGD y la Secuencia SLAYGLR (SEQ ID N0:12), ambas reconocidas por integrina de ratón, n posiciones en las secuencia de aminoácidos homólogos a aquellos de OPN de humano, el anticuerpo M5 se adquiere como un anticuerpo que bloquea simultáneamente estas secuencias. Se confirma que la unión de este anticuerpo M5 a OPN de ratón y el producto digerido por trombina del mismo se inhibe por el péptido GRGDSP, el cual comprende la secuencia RGD, y que este anticuerpo M5 inhibió la migración de monocitos activados por TNF-cc derivados del bazo de ratón. Cuando este anticuerpo M5 se examina utilizando ün sistema de cultivo de órgano de calvaría de ratón, se observa la acción supresora de la destrucción del hueso. Además', cuando el anticuerpo arriba descrito se administra a un modelo de ratón de artritis de colágeno, " se confirma un efecto terapéutico distinto (documento de patente 1 y
documento no patente 5) . Estos resultados sugieren fuertemente ue un anticuerpo que bloquea de manera simultánea la unión entre la secuencia RGD e integrina tipo humano, y entre la secuencia SVVYGLR (SEQ ID NO: 10) e integrina tipo humano inhibe la unión entre OPN e integrina y es efectivo en el tratamiento de artritis reumatoide y lo similar, y además muestra que se espera que el anticuerpo sea efectivo no solamente en el tratamiento de formas de reumatismo tales como artritis reumatoide juvenil y reumatismo crónico, sino que también en el tratamiento de artritis psoriática y psoriasis. El rechazo de injerto crónico después del transplante del órgano se caracteriza por lesiones obstructivas en los vasos sanguíneos y bronquios; a partir de investigaciones histológicas de lo mismo, se considera que debido a la activación de células T y macrófagos causa la producción de citoquinas y factores de crecimiento y desorden de la célula endotelial vascular, y también debido a que el crecimiento del músculo -liso vascular causa fibrosis y lo similar, la condición progresa a obstrucción · vascular
(documentos no patente 6 a 8) . Se ha reportado que OPN funciona como una proteina esencial en esta activación de macrófago y fibrosis de músculo liso vascular (documento no patente 9) ; un anticuerpo inhibidor de OPN puede suprimir el proceso hacia fibrosis al suprimir la migración de monocitos y neutrófilos . Por lo tanto, se espera que el anticuerpo suprima el rechazo del injerto crónico después del transplante de órgano para contribuir a la toma de órganos, y que sea efectivo en el tratamiento de enfermedades autoinmunes tales como enfermedad autoinmune sistémica, eritematosa, uveitis, enfermedad de Behcet, miositis múltiple, nefritis glomeruloproli ferat iva , y sarcoidosis . También se ha confirmado que el nivel de expresión de OPN aumenta en varios cánceres, y que OPN promueve la progresión y metástasis del cáncer (documentos no patente 10 a 12), y que el crecimiento y metástasis celular del cáncer se suprimen por un anticuerpo anti-OPN (documento de patente 3, documento no patente 13) . Por lo tanto, también se espera que un anticuerpo anti-OPN sea efectivo en el
tratamiento de varios cánceres. Se describe en WO03/027151 (documento de patente 2) un anticuerpo de osteopontina antihumana quimérico teniendo tanto la región variable del anticuerpo de ratón de osteopontina anti-humana 2 1 descrito en el documento de patente 1 y la región constante de un anticuerpo humano, y un anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana teniendo tanto la región que determina la complementación del anticuerpo 2K1 y la región de estructura y región constante de un anticuerpo humano. Mientras tanto, un gran número de anticuerpos monoclonales para el tratamiento ya están disponibles en el mercado, incluyendo anticuerpos para el tratamiento de cáncer (por ejemplo, rituximab, trastuzumab, bevaci zumab ) , anticuerpos para el tratamiento de reumatismo (por ejemplo, infliximab, adalimumab), anticuerpos para el tratamiento para suprimir el rechazo del injerto (por ejemplo, muromonab, basiliximab) y lo similar. Debido a sus características básicas de alta especificidad y seguridad, parece que se
acelerará la búsqueda y desarrollo de preparaciones de anticuerpo monoclonal, particularmente teniendo como objetivo una amplia variedad de enfermedades para las cuales fármacos terapéuticos bajos moleculares son difíciles de desarrollar. Por el otro lado, el problema más grande poseído en el desarrollo de tales farmacéuticos de anticuerpos se refiere a la productividad del anticuerpo. Las dosis clínicas de anticuerpos monoclonales que se han lanzado al Mercado generalmente están en el orden de varios mg/kg, de manera que se requieren costos de producción considerables. Por esta razón, para seleccionar un anticuerpo que muestra excelente actividad y, fuera de los anticuerpos que muestran la misma actividad, un anticuerpo de altos niveles de expresión y alta estabilidad para una proteína, es un requerimiento muy importante para la aplicación actual como un anticuerpo farmacéutico . Documento de patente 1: Folleto para Publicación de Patente internacional No. WO02/081522.
Documento de patente 2 : Folleto para Publicación de Patente Internacional No. WO03/027151. Documento de patente 3: Folleto para Publicación de Patente Internacional No. WO06/043954. Documento no patente 1: Y. Saitoh et al., (1995) : Laboratory Investigation, 72, 55-63 Documento no patente 2: Y. Yokosaki et al., (1999) : The Journal of Biological Chemistry 274, 36328-36334. Documento no patente 3: P.M. Green et al., (2001) : FEBS Letters 503, 75-79. Documento no patente 4: S.T. Barry et al., (2000) : Experimental Cell Research 258, 342-351
Documento no patente 5 : Yamamoto et al . ,
(2003) : The Journal of Clinical Investigation,
112, 181-188. Documento no patente 6: P. Freese et al., (2001) : Nephrology, dialysis, transplantation,
16, 2401-2406. Documento no patente 7: J.R. Waller et al.,
(2001) : British Journal of Surgery, 88, 1429- 1441. Documento no patente 8: S.R. Lehtonen et
al., (2001) : Transplantation , 72, 1138-1144. Documento no patente 9: A. O'Regan et al.,
(2000) : International Journal of Experimental Pathology, 81, 373-390. Documento no patente 10: G. F. Weber,
(2001) : Biochimica et Biophysica Acta, 1552, 61-85. Documento no patente 11: H. Rangaswami et al., (2006) : TRENDS in Cell Biology 16, 79-87 Documento no patente 12: S. S . Forootan et al., (2006) : Int. J. Cáncer: 118, 2255-2261. Documento no patente 13: Z. Hu et al., (2005) : Clin. Cáncer Res. 11 4646-4652 Descripción de la Invención Problemas a Resolverse por la Invención La presente invención se desarrolla en vista de las circunstancias descritas arriba, y se propone proporcionar un anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana teniendo mejores actividades (actividad de unión a antigeno, actividad inhibidora de migración de leucocito y lo similar) y/o estabilidad (resistencia a calor, condiciones de pH bajo, desnaturalizantes y lo similar) que aquellos de anticuerpos de osteopontina anti-humana
convencionales. Los presentes inventores condujeron investigaciones extensivas con el objetivo de realizar el objeto, y tuvieron éxito en generar un anticuerpo humanizado de osteopontina ant i -humana teniendo tales
Medios para Resolver los Problemas De acuerdo con lo anterior, la presente invención tiene las siguientes características: (1) Un anticuerpo humanizado de osteopontina anti -humana comprendiendo una región variable de cadena pesada consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 1 y una región variable de cadena ligera consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 3. (2) El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito en (1) arriba, en donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo, es Igyl de humano. (3) El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito en (1) arriba, en donde la región constante de cadena ligera del anticuerpo es IgK de humano. (4) El anticuerpo - humanizado de
osteopontina anti-humana descrito en (1) arriba, en donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo es Igyl de humano y la región constante de cadena ligera del anticuerpo es IgK de humano. (5) Un anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana comprendiendo una cadena pesada consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 25 y una cadena ligera consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 27. (6) Un polinucleotido comprendiendo una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito en (1) arriba . (7) Un polinucleotido comprendiendo una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito en (1) arriba . (8) Un vector de expresión comprendiendo el polinucleotido descrito en (6) y/o (7) arriba. (9) Una célula huésped incorporando el vector de expresión descrito en (8) arriba.
(10) Un método para producir un anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana, comprendiendo una etapa de cultivar la célula huésped descrita en (9) arriba para permitir que la célula exprese el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana. (11) Un fármaco terapéutico para enfermedad autoinmune, reumatismo, artritis reumatoide u osteoartri is, comprendiendo el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito en cualquiera de (1) a (5) arriba. (12) Un método para prevenir o tratar enfermedad autoinmune, reumatismo, artritis reumatoide u osteoartritis, comprendiendo una etapa para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito en cualquiera de (1) a (5) arriba. (13) Un uso del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana descrito en cualquiera de (1) a (5) arriba, en la fabricación de un farmacéutico para prevenir o tratar enfermedad autoinmune, reumatismo, artritis reumatoide u osteoartritis .
Efecto de la Invención Se proporciona por la presente invención un anticuerpo humanizado de osteopontina antihumana teniendo mejores actividades (actividad de unión a antigeno, actividad inhibidora de migración de leucocito y lo similar) y/o estabilidad (resistencia a calor, condiciones de pH bajo, desnaturalizantes y lo similar) que aquellos de anticuerpos de osteopontina anti-humana convencionales. Teniendo estas características, el anticuerpo de la presente invención es útil para la prevención o tratamiento de varias enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedad autoinmune, reumatismo, artritis reumatoide, y osteoartritis . Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra la secuencia base (columna superior: SEQ ID NO: 15) y secuencia de aminoácidos (columna inferior: SEQ ID NO: 16) de un ADN comprendiendo la región de codificación R2K1-VH1.7 incorporada en un vector (la porción subrayada es la secuencia guía para expresión secretoria) . La Fig-ura 2 muestra la secuencia base
.(columna superior: SEQ ID NO.: 17) y secuencia de aminoácidos (columna inferior: SEQ ID NO: 18) de un ADN comprendiendo la región de codificación R2K1-VH1.8 incorporada en un vector (la porción subrayada es la secuencia guia para expresión secretoria ) . La Figura 3 muestra la secuencia base (columna superior: SEQ ID N0:19) y secuencia de aminoácidos (columna inferior: SEQ ID NO:20) de un ADN comprendiendo la región de codificación R2K1-VL1.7 incorporada en un vector (la porción subrayada es la secuencia guia para expresión secretoria ) . La Figura 4 muestra la secuencia base (columna superior: SEQ ID NO:21) y secuencia de aminoácidos (columna inferior: SEQ ID NO: 22) de un ADN comprendiendo la región de codificación R2K1-VL1.8 incorporada en un vector (la porción subrayada es la secuencia guia para expresión secretoria) . La Figura 5 muestra los resultados de una examinación de la capacidad de unión del anticuerpo 2K1 quimérico y anticuerpo 2K1 humanizado al péptido hOPN5 por un método ELISA.
La Figura 6 muestra los resultados de una examinación de la capacidad de unión del anticuerpo 2K1 quimérico y anticuerpo 2K1 humanizado, tratado por calor a 70°C, al péptido hOPN5 por un método ELISA. Se muestran las proporciones a la capacidad de unión sin el tratamiento térmico como 100%. La Figura 7 muestra los resultados de una examinación de la capacidad de unión del anticuerpo 2K1 quimérico y anticuerpo 2K1 humanizado, tratados con un regulador a pH 5, al péptido hOPN5 por un método ELISA. Se muestran las proporciones a la capacidad de unión sin el tratamiento con regulador pH 5 como 100%. La Figura 8 muestra los resultados de un diagrama de longitudes de onda máximas espectrales de fluorescencia del anticuerpo 2K1 quimérico y anticuerpo 2K1 humanizado, tratados con reguladores conteniendo varias concentraciones de hidrocloruro de guanidina. La Figura 9 muestra los resultados de una medición de los contenidos de la estructura aleatoria en anticuerpo 2K1 quimérico y anticuerpo 2K1 humanizado, tratados con
reguladores a varios niveles de pH, por CD. La Figura 10 es una ilustración que muestra los resultados de una examinación de la estabilidad térmica del anticuerpo 2K1 quimérico y anticuerpo 2K1 humanizado utilizando un calorímetro de exploración diferencial ultra-sensible. La flecha punteada y flecha sólida indican la Tm del anticuerpo 2K1 quimérico y anticuerpo R2Klvl.7, respectivamente. La Figura 11 muestra los efectos inhibidores celulares de adhesión de R2Klvl .7 y R2Klv0 en OPN de humano. La Figura 12 muestra los efectos de R2Klvl .7 en el hinchamiento de la unión en artritis inducida por colágeno de mono. Los datos se muestran como promedio+SE para 8 animales, 7 animales y 5 animales en el grupo de control, grupo de 25 mg/kg y grupo de 50 mg/kg, respecti amente. *p<0.05, **p<0.01: significativamente diferente del grupo de control según se determina por la prueba de comparación múltiple Dunnet. La Figura 13 muestra los resultados de un análisis de R2K1 i .7 -s cFv purificado por HPLC .
La Figura 14 muestra los resultados de una examinación de la capacidad de unión de R2Klvl .7-scFv purificado al péptido hOPN5 por un método ELISA. La Figura 15 muestra los resultados de SDS- PAGE del anticuerpo R2Klvl .7 tipo molécula completa y F (ab')2 y F (ab')2-PEG purificado del anticuerpo R2Klvl .7. La Figura 16 muestra los resultados de una examinación de la capacidad de unión de F (ab' ) 2-PEG de R2Klvl .7 al péptido hOPN5 por BIAcore . Mejor Modo para Llevar a Cabo la Invención La presente invención se describe en detalle abajo. Los presentes inventores condujeron investigaciones extensivas para resolver los problemas descritos arriba concernientes a los anticuerpos de osteopontina anti-humana convencionales, y tuvieron éxito en adquirir un anticuerpo humanizado de osteopontina antihumana teniendo mejores actividades y/o estabilidad que aquellos del anticuerpo 2K1 quimérico y anticuerpo 2K1 humanizado descrito en WO03/027151 (documento de patente 2) .
La estructura básica de una molécula de anticuerpo se comparte por todas las clases, y se configura con una cadena pesada teniendo un peso molecular de 50000 a 70000 y una cadena ligera teniendo un peso molecular de 20000 a 30000. Una cadena pesada usualmente consiste de una cadena polipeptidica comprendiendo aproximadamente 440 aminoácidos; las cadenas pesadas tienen estructuras características de diferentes clases, y se llaman las cadenas y, µ, a, d, y e correspondientes a IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. Además, IgG ocurre como IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4, y las cadenas correspondientes se llaman yl , y2 , y3 , y ?4 , respectivamente. Una cadena ligera usualmente consiste de una cadena polipeptidica comprendiendo aproximadamente 220 aminoácidos; dos tipos, tipo L y tipo K, se conocen, y se llaman las cadenas ? y ?, respectivamente. Considerando la configuración del péptido de la estructura básica de una molécula de anticuerpo, dos cadenas pesadas homologas y dos cadenas ligeras homologas se unen a través de enlaces de disulfuro (enlaces S-S) y enlaces no covalentes, y el peso molecular es 150000 a 190000. -Las dos clases
- 2.3 - de cadenas ligeras son capaces de formar pareja con cualquier cadena pesada. Cada molécula de anticuerpo siempre consiste de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénti cas . Existen cuatro enlaces S-S en la cadena en una cadena pesada (cinco enlaces para las cadenas µ y e) y dos en una cadena ligera; se forma un bucle por 100 a 110 residuos de aminoácido, y esta estérica es parecida entre los bucles, y se llama un dominio o unidad estructural. Para tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras, la secuencia de aminoácidos del dominio ubicado en el término N de la misma es inconstante, aún en un estándar de referencia de la misma clase (subclase) de la misma especie animal, y este dominio se llama una región variable (región V, región variable) (los dominios se expresan como VH y VL, respectivamente) . La secuencia de aminoácidos en el lado C-terminal de la misma es cercanamente constante en cada clase o subclase, y se llama una región constante (región C, región constante) (los dominios se expresan como CH1-, CH2, CH3 y CL,
respecti amente) . El sitio determinante antigénico de un anticuerpo se configura con VH y VL, y la especificidad de unión depende de la secuencia de aminoácidos de este sitio. Por el otro lado, las actividades biológicas tales como unión a complementos o varias células reflejan las diferencias en la estructura de la región C entre las diversas clases de Ig. La variabilidad de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada se ha encontrado que se limita cercanamente a tres variables pequeñas de hiperregión que existen en ambas cadenas, y estas regiones se llaman CDR (región que determina la complement ación ) . La porción restante de la región variable se llama una región de estructura, y es relativamente constante. Usualmente, solamente 5 a 10 aminoácidos en la región que determina la complementación de cada región variable han formado el sitio de unión a antigeno. En la presente descripción, un anticuerpo teniendo una región variable derivada de un anticuerpo de ratón (también referido como anticuerpo heterólogo donador) como la región
variable reactiva a antigeno y una región constante derivada de un anticuerpo humano como la región constante se refiere como un anticuerpo quimérico; un anticuerpo quimérico que reconoce la osteopontina y fragmentos de la misma se refiere como un anticuerpo anti-osteopontina quimérico. Un anticuerpo recombinante preparado al reemplazar todas las regiones, diferentes a la región que determina la complementación (sitio de unión a antigeno), de un mamífero no humano de antigeno especifico (por ejemplo, ratón) molécula de anticuerpo con aminoácidos de anticuerpo humano se refiere como un anticuerpo humanizado. Se incluyen en los anticuerpos humanizados aquellos que tienen una modificación de aminoácido (substitución, inserción, eliminación, adición) hecha a la región de estructura de los mismos, como el anticuerpo de la presente invención. Generalmente se sabe que en la preparación de un anticuerpo humanizado, cuando la secuencia de aminoácidos de la región que determina la complementación solamente se injerta simplemente a la estructura templada de anticuerpo humano, la actividad de unión a
antigeno disminuye en comparación con aquella del anticuerpo de ratón original en muchos casos. El anticuerpo 2K1 humanizado descrito arriba se confirma que tiene actividad inhibidora celular extremadamente de baja adhesión en OPN, y por lo tanto ser inadecuado para utilizarse como un anticuerpo farmacéutico, que se une a péptidos de OPN (Ejemplo 9 abajo) . Los presentes inventores condujeron investigaciones extensivas para mejorar las reducciones de actividad en anticuerpos humanizados, y obtener un anticuerpo humanizado teniendo mejor estabilidad para utilizarse como un anticuerpo farmacéutico, y encontraron que un anticuerpo humanizado de osteopontina antihumana comprendiendo una región variable de cadena pesada consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 1 y una región variable de cadena ligera consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 3 tuvo actividades significativamente mejoradas y/o mejor estabilidad en términos de varios índices de estabilidad, en comparación con los anticuerpos de osteopontina anti-humana
humanizados. Como tal, el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención se ha preparado al hacer modificaciones a algunos aminoácidos en las regiones de estructura de la cadena pesada y cadena ligera del anticuerpo humano templado, y tiene una secuencia diferente de la región de estructura de aquella de un anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana convencional preparado al injertar la región que determina la complementación solamente (documento de patente 2) . El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención puede preparase fácilmente por aquellos expertos en la materia en la base de la información' de secuencia en la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera de la misma descritas en la presente, utilizando un método comúnmente conocido en la materia. Específicamente, se preparan un fragmento de gen de región variable de cadena pesada teniendo una secuencia base que codifica el aminoácido de región variable de cadena pesada del anticuerpo de la presente invención (SEQ ID
NO: 1) , y un fragmento de gen de región variable de cadena ligera teniendo una secuencia base que codifica el aminoácido de región variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención (SEQ ID N0:3) . Entonces, los genes de región variable se unen a un gen de región constante en una clase apropiada de anticuerpo humano para preparar un gen de anticuerpo humanizado. Después, este gen de anticuerpo humanizado se une a un vector de expresión apropiado, y se introduce a una célula cultivada. Finalmente, esta célula cultivada se cultiva, mediante la cual un anticuerpo humanizado puede obtenerse del sobrenadante de cultivo . Cada uno de los fragmentos de gen de región variable descritos arriba que codifican los aminoácidos de región variable de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo de la presente invención (SEQ ID NO : 1 y SEQ ID NO:3) puede prepararse por, por ejemplo, preparar un fragmento de gen que codifica la región variable de cadena pesada o región variable de cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo 2K1 humanizado, descrito en WO03/027151, . de
acuerdo al método descrito en el documento, e induciendo una mutación al sitio especifico del fragmento de gen que codifica la región de estructura del anticuerpo 2K1 humanizado. Para inducir una mutación en el sitio especifico en la región de estructura, pueden utilizarse varios métodos obvios para aquellos expertos en la materia, tal como mutagénesis sitio-dirigida (Current Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 8.1-8.5) . Alternativamente, . los fragmentos de gen de las regiones variable de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo de la presente invención también pueden sintenti zarse en la base de secuencias base diseñadas en la base ' de las secuencias de aminoácidos de las regiones variable de cadena ligera y cadena pesada (SEQ ID N0:1 y SEQ ID NO:3), ó en la base de las secuencias base de las regiones variable de cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo de la presente invención, mostradas por SEQ ID N0:5 y SEO ID NO : 7 , utilizando un método de síntesis de gen comúnmente conocido en la materia. Como tal un método de sín-tesis de gen, pueden utilizarse
varios métodos obvios para aquellos expertos en la materia, tal como el método de síntesis genética de anticuerpo descrito en WO90/07861. Después, los fragmentos de gen descritos arriba de región variable y el gen de región constante del anticuerpo humano se unen para preparar un gen de anticuerpo humanizado. Aunque cualquier subclase de región constante puede elegirse como la región constante del anticuerpo humano utilizado, Igyl^ de humano como la región constante de cadena pesada, e IgK de humano como la región constante de cadena ligera, pueden utilizarse preferentemente. Subsiguiente a la preparación de este gen de anticuerpo humanizado, la introducción del gen de anticuerpo humanizado a un vector de expresión, la introducción del vector de expresión a células cultivadas, el cultivo de las células cultivadas, la purificación del anticuerpo y lo similar pueden realizarse al utilizar varios métodos comúnmente conocidos en la materia, o con referencia a los métodos para preparar un anticuerpo de osteopontina antihumana quimérico o un anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana, descrito en
WO02/081522 o WO03/027151. Como el vector de expresión a unirse al gen de anticuerpo humanizado asi obtenido, los vectores de expresión descritos en la Gaceta Oficial de Publicación de Patente Internacional
WO94/20632, tales como AG-?? y AG-?, pueden utilizarse, pero el vector de expresión no está sujeto a limitación, siempre que sea capaz de expresar el gen de anticuerpo humanizado. Es preferible utilizar un vector de expresión que ya tiene un gen de región constante de Ig de humano tal como AG-?? o AG-?, porque seria un vector de expresión teniendo el gen de anticuerpo humanizado simplemente cuando el gen de región variable de anticuerpo humanizado se inserta al mismo. El vector de expresión arriba descrito se introduce a células cultivadas mediante, por ejemplo, el método de fosfato de calcio y lo similar. Como ejemplos de las células cultivadas a las cuales se introduce el vector de expresión, las células cultivadas tales como células CHO-DG44 pueden utilizarse, y pueden cultivarse por un método convencional. .
Después del cultivo arriba descrito, el anticuerpo acumulado en el sobrenadante de cultivo puede purificarse mediante, por ejemplo, varias cromatografías utilizando una columna de Proteina A. La actividad de antígeno del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de esta manera obtenido puede medirse mediante, por ejemplo, ELISA utilizando un péptido de osteopontina y lo similar como se describe en un Ejemplo abajo, BIACore (BIAcore Company) y lo similar. La actividad inhibidora de migración de leucocito del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana puede medirse al, por ejemplo, cultivar monocitos de sangre periférica de humano en la presencia de un anticuerpo de prueba y OPN u OPN tipo segmentada por trombina como se describe en un Ejemplo abajo. El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención tiene una actividad biológica para inhibir la migración de monocitos de sangre periférica de humano activada por una citoquina (por ejemplo, TNF-a) a OPN tipo segmentada por trombina.
Después, el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana generado de esta manera se prueba para varios índices de estabilidad. El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención muestra los siguientes índices de estabilidad (A) a D ) ) : A) Muestra una estabilidad térmica en donde la actividad de unión a un péptido comprendiendo la secuencia SVVYGLR (SEQ ID NO: 10) después del tratamiento térmico en PBS a 70°C por 2 horas no es menos de 90% de aquel sin el tratamiento térmico. B) La temperatura de transición media (Tm) es más alta por al menos 5°C que aquella de un anticuerpo quimérico teniendo una región variable derivada de un anticuerpo heterólogo donador y una región constante derivada de un anticuerpo humano . C) Tiene una resistencia a hidrocloruro de guanidina a concentraciones más altas por al menos 0.5 M que aquellas para un anticuerpo quimérico teniendo una región variable derivada de un anticuerpo heterólogo donador y una región constan-te derivada de un anticuerpo
humano . D) Tiene una resistencia a niveles pH inferiores por al menos 0.3 que aquellos para un anticuerpo quimérico teniendo una región variable derivada de un anticuerpo heterólogo donador y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Aquí, los incisos A) y B) descritos arriba son ambos Índices de estabilidad en calor; ya que el anticuerpo tiene mejores características en estos índices, es más ventajoso en términos de forma de dosificación y estabilidad de almacenamiento a largo plazo. Es decir, una preparación de anticuerpo con frecuencia es problemática con respecto a la estabilidad de almacenamiento debido a que es una proteína, de manera que algunas veces se prepara como una preparación liofilizada (esto es problemático en términos de conveniencia en los establecimientos de práctica médica debido a que debe disolverse al momento de uso; en particular, una preparación de proteína con frecuencia toma más de 30 segundos en disolverse, la cual a su vez con frecuencia posee una carga en establecimientos, de práctica
médica); sin embargo, cualquier anticuerpo teniendo una buena estabilidad de temperatura puede almacenarse, aún en solución, mientras se asegura la estabilidad a largo plazo bajo refrigeración por 2 años o más. De hecho, R2Klvl.7, el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención descrito en un Ejemplo abajo, se asegura para ser estable por aproximadamente 1 año aún a temperatura ambiente (25°C) . Si una preparación de solución es posible, es posible preparar preparaciones más convenientes en la forma de jeringas " pre-llenadas y lo similar. Un anticuerpo de estabilidad a alta temperatura que satisface los incisos descritos arriba ofrece una variación más amplia de preparación lo que hace posible elaborar preparaciones que satisfacen la mayoría de las necesidades médicas, e incrementar las elecciones. El índice C) arriba descrito es un índice que se refiere a la resistencia a la sal; un anticuerpo teniendo tal resistencia a la sal permite una investigación de una fórmula más ventajosa para hacer una preparación farmacéutica. Particularmente en jeringas pre-
llenadas, este índice es útil debido a que altas concentraciones de sal con frecuencia se utilizan para diseñar una preparación de proteína de altas concentraciones como 100 a 200 µg/mL. El índice D) arriba descrito es un índice que se refiere a la resistencia a pH; un anticuerpo teniendo tal resistencia a pH permite el tratamiento a niveles de pH inferiores en la etapa de inactivación del virus del proceso de producción y purificación del anticuerpo, y por lo tanto es útil. Por esta razón, teniendo una resistencia a pH inferior por tan poco como aproximadamente 0.3 que los anticuerpos ordinarios sería una ventaja principal. El método de prueba para el índice A) se describe abajo. Primero, un anticuerpo de prueba humanizado de osteopontina anti-humana se diluye en PBS (preferentemente 50 µ%/?a.1.) y se trata por calor a 70°C por 2 horas. Después, la dilución se regresa a temperatura ambiente, y la actividad de unión del anticuerpo a un péptido comprendiendo la secuencia SVVYGLR (SEQ ID NO: 10) se mide por, por ejemplo, el método
ELISA de Kon et al. (Journal of Cellular Biology, 88: 420-432 (2002)) . La actividad de unión de este anticuerpo tratado con calor se compara con la actividad de unión del mismo anticuerpo pero se mide sin el tratamiento térmico. El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención, cuando se somete a este tratamiento térmico, muestra una actividad de unión no inferior a 90% de la actividad de unión del mismo anticuerpo pero sin tratar al péptido comprendiendo la secuencia SVVYGLR ( SEQ ID NO:10) . Preferentemente, el péptido comprendiendo la secuencia SVVYGLR (SEQ ID NO:10), utilizado en esta prueba Índice, es un péptido de osteopontina teniendo la secuencia CVDTYDGRGDSVVYGLRS (SEQ ID NO: 13) . El método de prueba para el índice ?·) se describe abajo. Primero, un anticuerpo de prueba humanizado de osteopontina anti-humana y el anticuerpo 2K1 quimérico descrito en WO03/027151 (C2K1) se ajustan utilizando una solución reguladora apropiada (preferentemente 20 mM regulador de citrato + 120 mM NaCl (pH 6.0)), y la estabilidad al calentamiento puede
evaluarse utilizando un calorímetro de exploración diferencial (preferentemente plataforma DSC capilar VP de MicroCal Company) . La temperatura de transición media (Tm), que muestra la temperatura de degeneración, del anticuerpo humanizado de osteopontina antihumana de la presente invención es más alta por al menos 5°C que aquella de C2K1. El método de prueba para el índice C) se describe abajo. Primero, un anticuerpo de prueba humanizado de osteopontina anti-humana y el anticuerpo 2K1 quimérico (C2 1) descritos arriba se disuelven en una solución reguladora comprendiendo hidrocloruro de guanidina a varias concentraciones de 0 a 5 M (preferentemente 20 mM fosfato de sodio + 120 mM Solución NaCl (pH 7.0)), y las soluciones se ajustan a una concentración apropiada (preferentemente 50 g/mL) . Después, cada muestra de solución se deja permanecer a 10°C durante la noche, después de lo cual el espectro fluorescente de cada muestra se mide. Específicamente, la fluorescencia emitida por triptofan bajo luz de excitación a 280 nm se escanea sobre el rango de longitud -de onda de
320 nía a 370 nm. Cambios de longitud de onda máxima debido al aflojamiento de la estructura esférica de la proteina de anticuerpo por hidrocloruro de guanidina. La concentración de hidrocloruro de guanidina para un cambio de longitud de onda máximo se mide para cada uno del anticuerpo de prueba y anticuerpo quimérico. Para el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención, la concentración de hidrocloruro de guanidina para un cambio de la longitud de onda máxima descrita arriba es más alta por al menos aproximadamente 0.5 M que aquella de C2 1. El método de prueba para el índice D) se describe abajo. Primero, un anticuerpo de prueba humanizado de osteopontina anti-humana y el anticuerpo 2K1 quimérico (C2 1) descritos arriba se ajustan utilizando una solución reguladora apropiada (preferentemente 20 mM regulador de citrato + 120 mM NaCl (pH 6.0) ) (preferentemente 2 mg/mL) , y mientras se agregan una solución ácida (preferentemente 0.1 N HC1) y agua a la misma, se prepara una muestra de cada nivel bajo de pH en la concentración especificada (1 mg/mL) . Después
de que esta muestra se trata a temperatura ambiente por 1 hora, se mide el espectro de dicroísmo (CD) . El espectro CD se mide sobre el rango de longitud de onda de 205 nm a 260 nm, y la proporción de contenido de la estructura aleatoria se mide para cada muestra tratada con pH de cada anticuerpo, en la base del método analítico espectral CD de Yang et al. (Methods in Enzymology, 130 , 208-269 (1986) ) . El pH al cual la proporción de contenido de la estructura aleatoria en el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención comienza a incrementar es inferior por al menos aproximadamente 0.3 que aquella de C2K1. Los presentes inventores condujeron investigaciones extensivas utilizando en combinación modificaciones del gen de región de estructura por mutagénesis sitio-dirigida y lo similar, y estudios de estabilidad utilizando los índices de estabilidad A) a D) descritos arriba, en la base del anticuerpo humanizado descrito en WO03/027151, y por primera vez tuvieron éxito en obtener un anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana teniendo
mejores actividades (actividad de unión a antigeno, actividad inhibidora de migración de leucocito y lo similar) y/o estabilidad (resistencia a calor, condiciones de pH bajo, desnaturaliza tes y lo similar) que aquellos de anticuerpos de osteopontina anti-humana convencionales, al volver a las porciones de estructura de anticuerpo humano (FR1 a 4} la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ' ID NO : 1 (números de aminoácido 1 a 30, 36 a 49, 67 a 98 y 106 a 116, respectivamente) y la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 3 (números de aminoácido 1 a 23, 40 a 54, 62 a 93 y 103 a 113, respectivamente) . El anticuerpo humanizado de osteopontina antihumana de la presente invención se prueba para la actividad de unión a antigeno descrita arriba, actividad inhibidora de migración de leucocito y varios índices de estabilidad, y se encuentra que tiene las actividades, y que muestra todos los incisos A) a D) como características del mismo. El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención, comprendiendo una región variable de cadena
pesada consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID N0:1 y una región variable de cadena ligera consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 3, puede adquirirse fácilmente al sintetizar un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 1 y un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 3 utilizando un método comúnmente conocido en la materia, uniéndolos a una clase apropiada de gen de región constante de anticuerpo humano, preferentemente el gen de región constante Igyl de humano para la cadena pesada y el gen de región constante de Igi de humano para la cadena ligera, para construir un gen de anticuerpo humanizado, introduciendo el gen de anticuerpo humanizado a un vector de expresión utilizando varios métodos comúnmente conocidos en la materia o el método descrito en WO02/081522 o WO03/027151 y lo similar, introduciendo el vector de expresión a células cultivadas, cultivando las células cultivadas, y purificando el anticuerpo del cultivo obtenido. Como el gen de cadena pesada de anticuerpo humanizado preferible de la presente
invención, obtenido al unir el gen de región variable de cadena pesada mostrado por SEQ ID N0:1 y el gen de región constante de cadena pesada de Igyl de humano, un gen comprendiendo una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO:25, más preferentemente un gen comprendiendo la secuencia base mostrada por SEQ ID NO:24, puede mencionarse. Como el gen de cadena ligera de anticuerpo humanizado preferible de la presente invención, obtenido al unir el gen de región variable de cadena ligera mostrado por SEQ ID NO: 3 y el gen de región constante de cadena ligera de IgK de humano, un gen comprendiendo una secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada por SEO ID NO:27, más preferentemente un gen comprendiendo la secuencia base mostrada por SEQ ID NO:26, puede mencionarse. Como el anticuerpo humanizado anti-os teopontina de la presente invención, codificado por un gen de cadena pesada comprendiendo la secuencia base mostrada por SEQ ID NO:24 y un gen de cadena ligera comprendiendo la secuencia base mostrada por SEQ ID NO: 26, R2Klvl.7, descrito en un Ejemplo
abajo, puede mencionarse. Alternativamente, el anticuerpo humanizado anti-os teopont ina de la presente invención, comprendiendo una región variable de cadena pesada consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 1 y una región variable de cadena ligera consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 3 , también puede sintetizarse con un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos descrita arriba mostrada por SEQ ID NO:l y un gen de región constante de cadena pesada de anticuerpo humano, y un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 3 y un gen de región constante de cadena ligera de anticuerpo humano, como los templados, utilizando . un sistema de transcripción/ traducción libre de célula. El sistema de transcripción/traducción libre de célula utilizado puede ser uno comercialmente disponible, y puede prepararse de acuerdo con un método conocido per se, específicamente el método descrito en Pratt J.M. et al., "Transcription and Translation", Hames B.D. y Higgins S.J. edf., IRL Press, Oxford 179-209.
(1984) y lo similar para extracto de Escherichia coli . Como el lisato celular comercialmente disponible, el sistema de extracto E. coli S30 (fabricado por Promega Company) , Sistema de Rápida Traducción RTS 500 (fabricado por Roche Company) y lo similar derivado de Escherichia coli puede mencionarse, Sistema de Lisato de Reticulocito de Conejo (fabricado por Promega Company) y lo similar derivado de reticulocitos de conejo pueden mencionarse, y PROTEIOSTM (fabricado por TOYOBO Company) y lo similar derivado de germen de trigo puede mencionarse. Entre ellos, aquellos utilizando un listado de germen de trigo es adecuado. Como un método para preparar un lisato de germen de trigo, por ejemplo, el método descrito en Johnston F.B. et al., Nature, 179, 160-161 (1957) o Erickson ?.?. et al-, Meth. Enzymol . , 96, 38-50 (1996) y lo similar puede utilizarse. La presente invención también comprende fragmentos de anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana (fragmentos de anticuerpo) tales como los fragmentos de región variable de filamento único (scFv), Fab, Fab',
y F (ab')2, comprendiendo una región variable de cadena pesada consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 1 y una región variable de cadena ligera consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO: 3, y manteniendo las actividades. El enlazador para unir una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL) , que puede utilizarse para preparar scFv, no se somete a limitación, siempre que el fragmento de anticuerpo de la presente invención pueda tener las características descritas arriba; por ejemplo, puede mencionarse un péptido consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:14) . Aquellos expertos en la materia son capaces de preparar un anticuerpo fusionado del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana o fragmento de anticuerpo y otro péptido o proteína, y para preparar un anticuerpo modificado con un agente de modificación unido al mismo, en la base de la presente invención. El otro péptido o proteína utilizado para la fusión no se somete a limitación, siempre que
no reduzca la actividad de unión del anticuerpo; por ejemplo, pueden mencionarse albúmina de suero humano, varios péptidos de etiqueta, péptido de motivo de hélice artificial, proteínas de unión a maltosa, transferasa glutationa S, varias toxinas, otros péptidos o proteínas capaces de promover la multimerización y lo similar. El agente de modificación utilizado para la modificación no se somete a limitación, siempre que no reduzca la actividad de unión del anticuerpo; por ejemplo, pueden mencionarse glicol de polietileno, cadenas de azúcar, fosfolípidos , liposomas, compuestos bajos moleculares y lo similar. El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención de esta manera obtenido o un fragmento de anticuerpo reteniendo una actividad debido al anticuerpo, un anticuerpo fusionado resultante de la fusión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo con un péptido u otra proteína, o un anticuerpo modificado consistiendo del anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un agente de modificación unido al mismo, después de
purificarse según se requiera, puede prepararse como una preparación farmacéutica de acuerdo a un método convencional, y puede utilizarse para tratar artritis reumatoide, reumatismo tal artritis reumatoide juvenil y reumatismo crónico, artritis psoriática, psoriasis y lo similar, para suprimir cáncer y rechazo crónico al injerto después del transplante de órgano, y para tratar enfermedades autoinmunes tales como os teoartrit i s , enfermedad autoinmune sistémica, eritematosa, uveitis, enfermedad de Behcet, miositis múltiple, nefritis glomeruloprolxferativa , y sarcoidosis . El anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención puede utilizarse preferentemente como un agente terapéutico de reumatismo, agente terapéutico de enfermedad autoinmune, agente terapéutico osteoartritis o agente terapéutico de artritis reumatoide, más preferentemente como un agente terapéutico de artritis reumatoide. Como los ejemplos de formas de dosificación para el agente terapéutico de reumatismo y lo similar, puede prepararse una preparación parenteral tal como una inyección o infusión de goteo, y se
administra preferentemente por administración intravenosa, administración subcutánea y lo similar (lo mismo aplica en el caso de un agente terapéutico de enfermedad autoinmune) . Para preparar una preparación farmacéutica, los vehículos y aditivos que se acoplan a estas formas de dosificación pueden utilizarse dentro de un rango farmacéuticamente aceptable. La cantidad de anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana agregada en la preparación descrita arriba varia dependiendo de la severidad de los síntomas del paciente y edad, puede utilizarse la forma de dosificación de la preparación utilizada o la concentración de unión del anticuerpo inhibidor de OPN recombinante y lo similar; por ejemplo, aproximadamente 0.1 mg/kg a 100 mg/kg. Considerando el agente terapéutico de la presente invención así obtenido, el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de ingrediente activo se une fuertemente a la secuencia RGD y secuencia SVVYGLR de OPN (SEQ ID NO: 10) para inhibir la unión entre esta porción de OPN e integrina, resultando en la supresión de la exacerbación de síntomas de
reumatismo y artritis reumatoide y otras enfermedades autoinmunes . Debido a que el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención se une específicamente al lado de OPN, en lugar de al lado de integrina, es improbable inhibir cualquier otra función importante de integrina, y se espera evitar el asunto de reacciones adversas . Además, el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención también puede utilizarse como un reactivo de diagnóstico para artritis reumatoide. Como se establece arriba, se ha probado que en las articulaciones de un paciente con artritis reumatoide, un fragmento N-terminal de OPN segmentada por trombina se encuentran a altas concentraciones . Por lo tanto, la medición de la cantidad de OPN o fragmento N-terminal de la misma en una muestra utilizando este anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana sería útil en diagnosticar artritis reumatoide. Como la técnica, pueden utilizarse varios métodos en uso para ensayos inmunoquímicos ordinarios,
- Sí ¬
tales como método de inmunoensayo de radioisótopo (Rlün método), método ELISA (E. Engvall et al., (1980) : Methods in Enzymol . , 70, 419-439), método de anticuerpo fluorescente, método de placa, método de mancha, método de aglutinación y método Ouchterlony ("Hybridoma method and Monoclonal Antibodies", publicado por R&D Planning, páginas 30-53,. Marzo 5, 1982) . Aunque uno apropiado puede seleccionarse de entre las técnicas descritas arriba de varios puntos de vista, el método ELISA es preferible en términos de sensibilidad, conveniencia y lo similar. Como un ejemplo de un método más preferido, por el ejemplo, el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención se inmoviliza en un vehículo, un anticuerpo que reconoce una porción en OPN diferente a aquella reconocida por el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención se marca, mediante lo cual OPN o un N-terminal del mismo puede detectarse, y esto puede utilizarse como un reactivo de diagnóstico para artritis reumatoide.
Como la substancia de marcado utilizada para marcar el anticuerpo arriba descrito, proteínas /pépt idos para formar una proteína /péptido fusionada, tal como S- transferasa de glutationa, enzimas tales como peroxidada de rábano picante (de aquí en adelante referida como "HRP") y fosfatasa alcalina (de aquí en adelante referida como "AP") , pueden mencionarse las substancias fluorescentes tales como isocianato de fluoresceína y rodamina, substancias radioactivas- tales como 32P e 1251, y agentes de modificación tales como substancias quimilumines cent es . Considerando el método para detectar isoformas de OPN, por ejemplo, la detección puede realizarse al utilizar un método comúnmente conocido en la materia, tal como método sándwich, o más específicamente, al utilizar el mismo método como el método de detección descrito en WO02/081522 (documento de patente 2) o WO03/027151 (documento de patente 3) . La presente invención también proporciona -un gen que codifica el anticuerpo de la
presente invención o un fragmento del mismo, y un vector de expresión comprendiendo el mismo. El vector de expresión de la presente invención no se somete a limitación, siempre que sea capaz de expresar un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo en varias células huésped de células procarióticas y/o células eucarióticas , y produciendo estos polipéptidos . Por ejemplo, pueden mencionarse vectores de plásmido, vectores virales (por ejemplo, adenovirus, retrovirus) y lo similar. El vector de expresión de la presente invención puede comprender un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo, y un promotor unido funcionalmente al gen. Como el promotor para expresar el polipéptido de la presente invención en una bacteria, cuando el huésped es una bacteria del género Escherichia, por ejemplo, pueden mencionarse promotor Trp, promotor lac, promotor recA, promotor PL, promotor lpp/ promotor tac y lo similar. Como el promotor para expresar el anticuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo e.n
levadura, por ejemplo, pueden mencionarse el promotor PH05, promotor PG , promotor GAP, y promotor ADH; cuando el huésped es una bacteria del género Bacillus, pueden mencionarse el promotor SL01, promotor SP02, promotor penP y lo similar. Cuando el huésped es una célula eucariótica tal como célula de mamífero, pueden mencionarse el promotor derivado de SV40, promotor de retrovirus, promotor de choque térmico y lo similar. Cuando una bacteria, particularmente Escherichia coli, se utiliza como la célula huésped, el vector de expresión de la presente invención puede comprender además un codón de inicio, un codón de parada, una región de terminación y una unidad de réplica. Cuando se utiliza una levadura, célula animal o célula de insecto como el huésped, el vector de expresión de la presente invención puede comprender un codón de inicio y un codón de detención. En este caso, una secuencia de mejora, regiones de no codificación en el lado 5' y lado 3' de un gen que codifica el polipéptido de la presente invención, una unión de división., un sitio de poliadenilación, o una unidad de réplica y lo
similar pueden contenerse. Un marcador de selección en uso común (por e j emplo ,
ampicilina , canamicina ) puede contenerse de acuerdo al uso propuesto. La presente invención también proporciona un transformador incorporando el gen de la presente invención. Tal un transformador puede prepararse, por ejemplo, al transformar una célula huésped con el vector de expresión de la presente invención. La célula huésped utilizada para preparar un transformador no se somete a limitación, siempre que se acople con el vector de expresión arriba mencionado, y sea transformable; pueden mencionarse como ejemplos varias células tales como células naturales o lineas de células artificialmente establecidas en uso común en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacteria (bacteria del género Escherichia, bacteria del género Bacillus), levaduras (el género Saccharomyces , el género Pichia y lo similar), células animales o células de insecto (por ejemplo, Sf9) y lo similar) . La transformación puede realizarse por un método conocido per se. La presente invención también proporciona
un método para producir el anticuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo, comprendiendo permitir a una célula huésped expresar el gen de la presente invención, es decir, utilizando tal transformador. Para producir el anticuerpo de la presente invención o ' un fragmento del mismo, el transformador puede cultivarse en medio nutriente. El medio nutriente preferentemente contiene una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno inorgánica o fuente de nitrógeno orgánica requeridas para el crecimiento del transformador. Como ejemplos de la fuente de carbono pueden mencionarse, glucosa, dextran, almidón soluble, sucrosa y lo similar; como ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánica o fuente de nitrógeno orgánica, pueden mencionarse las sales de amonio, nitratos, aminoácidos, licor excesivo de maíz, peptona, caseína, extracto de carne, torta de semilla de soya, extracto de papa y lo similar. Si se desea, otros nutrientes (por ejemplo, sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de calcio, fosfato de dihidrógeno de sodio, cloruro de magnesio), vitaminas, antibióticos (por
ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, canamicina y lo similar) pueden contenerse. El cultivo del transformador puede realizarse por un método conocido per se. Las condiciones de cultivo, por ejemplo, temperatura, pH del medio, y tiempo de cultivo se seleccionan como apropiadas. Por ejemplo, cuando el huésped es una célula animal, un medio ??? conteniendo aproximadamente 5 a 20% suero de bovino fetal (Science, Vol.122, p.501, 1952), medio DMEM (Virology, Vol.8, p.396, 1959), RPMI1640 médium (J. 7Am . Med. Assoc, Vol.199, p.519, 1967), 199 médium (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, p.l, 1950) y lo similar puede utilizarse como el medio. El pH del medio es preferentemente aproximadamente 6 a 8, el cultivo se realiza normalmente a aproximadamente 30 a 40°C por aproximadamente 15 a 72 horas, y el cultivo puede aerearse o agitarse según sea necesario. Cuando el huésped es una célula de insecto, por ejemplo, medio de Grace comprendiendo suero de bovino fetal (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol.82, p.8404, 1985) y lo similar puede mencionarse, y el pH del mismo es preferentemente aproximadamente 5
a 8. El cultivo se realiza normalmente a aproximadamente 20 a 40°C por 15 a 100 horas, y el cultivo puede aerarse o agitarse según sea necesario. Cuando el huésped sea una bacteria, actinómicas, levadura, o un hongo filamentoso, por ejemplo, un medio liquido comprendiendo las fuentes de nutriente descritas arriba es apropiado. Un medio teniendo un pH de 5 a 8 se prefiere. Cuando el huésped es E. coli, pueden mencionarse el medio LB, medio M9 (Miller et al., Exp . Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, p.431, 1972) y lo similar como medios preferidos. En este caso, el cultivo puede realizarse normalmente a 14 a 43°C por aproximadamente 3 a 24 horas, mientras se aerea o agita el cultivo según sea necesario. Cuando el huésped es una bacteria del género Bacillus, el cultivo puede realizarse normalmente a 30 a 40°C por aproximadamente 16 a 96 horas, mientras se . aerea o agita el cultivo según sea necesario. Cuando el huésped es levadura, medio mínimo de Burkholder (Bostian, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, Vol.77, p.4505, 1980) puede mencionarse como ejemplo del medio, y el pH es deseablemente 5 a 8. El cultivo se realiza
normalmente a aproximadamente 20 a 35°C por aproximadamente 14 a 144 horas, y el cultivo puede aerarse o agitarse según sea necesario. El anticuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo pueden recuperarse, preferentemente aislarse y purificarse, de un transformador cultivado como se describe arriba. Como ejemplos del método de' aislamiento y purificación, pueden mencionarse los métodos a base de diferencia en solubilidad, tales como precipitación de solvente y des-salado; métodos a base de diferencias en peso molecular, tales como diálisis, ultrafiltración, filtración de gel, y electrforeswis de . gel de sulfato-poliacrilamida de dodecilo de sodio; métodos en base a diferencias en carga eléctica, tal como cromatografía de intercambio de ión y cromatografía de apatatita de hidroxilo; métodos en base a la afinidad específica, tal como cromatografía de afinidad; métodos en base a las diferencias en hidrofobicidad, tal como cromatografía líquida de alto desempeño de fase inversa; métodos en base a diferencias en punto isoeléctrico, tal como focalización isoeléctrica; y lo similar.
La presente invención se ha descrito generalmente arriba; los ejemplos particulares a referirse para facilitar el entendimiento de la misma se dan abajo, los cuales, sin embargo, son para propósitos ilustrativos solamente y nunca limitan el alcance de la invención. Ejemplos Los ejemplos se dan abajo. Los procedimientos que incluyen el uso de un kit y lo similar se realizan como se dicta en el procedimiento anexo al mismo al menos que se establezca de otra manera. (1. Preparación de anticuerpo 2 1 humanizado) En la presente invención, se preparan dos clases de anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana preparadas al humanizar el anticuerpo 2K1, que es un anticuerpo de osteopontina anti-humana derivado de ratón descrito en Gaceta Oficial de Publicación de Patente Internacional W02003 / 027151 (de aqui en adelante también referido como anticuerpo 2K1 humanizado o anticuerpo R2K1) . Ya que cada anticuerpo 2K1 humanizado se prepara generalmente de acuerdo con el método descrito en la gaceta oficial descrita arriba,
se da un perfil abajo. Primero, ADNs que codifican la región variable de cadenas pesadas (VHs) de 2 clases de anticuerpo humanizado anti-OPN teniendo las secuencias base mostradas en la Figura 1 y Figura 2 y ADNs que codifican la región variable de cadenas ligeras (VLs) de 2 clases de anticuerpo humanizado anti-OPN teniendo las secuencias base mostradas en la Figura 3 y Figura 4 se preparan por un PCR utilizando un oligo-ADN sintético. En la descripción de abajo, para distinguir las VHs anticuerpo humanizado de OPN anti-humana mostradas en la Figura 1 y Figura 2 se refieren como R2K1-VH1.7 y R2 1-VH1.8, respectivamente. Del mismo modo, las VLs de anticuerpo humanizado de OPN antihumana mostradas en la Figura 3 y Figura 4 se refieren como R2K1-VL1.7 y R2K1-VL1.8, respectivamente . Después, cada uno de los ADNs descritos arriba que codifican las V-Hs de anticuerpo humanizado de OPN anti-humana se insertan en AG-?? , que es un vector de expresión comp endiendo el gen para la cadena ?? de región constante de inmunoglobulina humana, utilizando
un sitio de reconocimiento HindIII de endonucleasa de restricción y sitio de reconocimiento BamHI, mediante lo cual un plásmido de expresión de cadena pesada teniendo R2 1-VH1.7 y un plásmido de expresión de cadena pesada teniendo R2 1-VH1.8 se preparan. Del mismo modo, cada uno de los ADNs descritos arriba que codifican las VLs de anticuerpo humanizado de OPN anti-humana se insertan en AG-K, que es un vector de expresión comprendiendo el gen para la cadena ? de región constante de inmunoglobulina humana, mediante lo cual un plásmido de expresión de cadena ligera teniendo R2K1-VL1.8 y un plásmido de expresión de cadena ligera teniendo R2K1-VL1.7 se preparan. Estos plásmidos de expresión se introducen en y proliferan en Escherichia coli, y se purifican utilizando un kit de purificación de plásmido comercialmente disponible . Finalmente, varias combinaciones de los plásmidos de expresión purificados descritos arriba se transfectan a células CHO-DG44 por el método de fosfato de calcio, y las células se seleccionan- en un medio MEM (Invitxogen
Company) comprendiendo Geneticin (Invitrogen Company) y FCS dializado (Invitrogen Company), mediante el cual se obtienen las células que expresan dos clases de anticuerpo 2K1 humanizado. Es decir, se expresan el anticuerpo R2Klvl.8, que es un anticuerpo 2K1 humanizado consistiendo de una cadena pesada teniendo R2 1-VH1.8 y una cadena ligera teniendo R2K1-VL1.8, y el anticuerpo R2 lvl.7, que es un anticuerpo 2K1 humanizado consistiendo de una cadena pesada teniendo R2K1-VH1.7 y una cadena ligera teniendo R2K1-VL1.7, . Las células que producen cada anticuerpo R2 1, obtenido por los procedimientos descritos arriba, se dejan crecer completamente en un medio MEM complementado con 10% FCS dializado, colocado en una botella de rodillos (BD Biosciences Company), y cultivado bajo las condiciones de 37°C y una velocidad de rotación de 1 rpm. Varios dias después, se confirma que-las células se adhieren a y desarrollan en la pared del vaso, el caldo de cultivo se descarta, el medio se intercambia con 500 mL de medio MEM libre de suero, y las células se cultivan bajo las condiciones descrita arriba.
Aproximadamente 2 semanas después, cuando muchas células se suspenden de la pared del vaso, se detiene el cultivo, y el sobrenadante de cultivo se filtra a través de un filtro de 0.22 µ?t? y se recupera para producir un sobrenadante de cultivo conteniendo cada anticuerpo R2 1. Con estos sobrenadantes de cultivo como los materiales iniciales, y utilizando una columna de Proteina A (MILLIPORE Company) y una columna de intercambio de anión (Amersham Company), varios miligramos de cada una de las dos clases de anticuerpo humanizado purificado, es decir, el anticuerpo R2Klvl .8 y el anticuerpo R2Klvl.7, se obtienen. En los diversos experimentos descritos abajo, los anticuerpos purificados obtenidos como se describe arriba se utilizan. El anticuerpo 2K1 quimérico (de aqui en adelante también referido como anticuerpo C2K1) utilizado se obtiene por el método descrito en la Gaceta Oficial de Publicación de Patente Internacional arriba mencionada W02003 / 027151. (2. Confirmación de capacidad de unión con péptido de osteopontina de humano mediante
ELISA) Las actividades de unión de cada anticuerpo R2K1 y el anticuerpo C2K1 a un péptido de osteopontina de humano (CVDTYDGRGDSVVYGLRS: SEQ ID NO: 13) se comparan con referencia al Método ELISA de Kon et al. (Journal of Cellular Biology, 88:420-432 (2002)) . Se da un perfil abaj o . El péptido teniendo la secuencia descrita arriba (de aquí en adelante también referido como el péptido hOPN5) se reacciona con BSA incorporando un grupo maleimida introducido utilizando Sulfo-EMCS (Dojindo Laboratories) para preparar un conjugado hOPN5-BSA. El conjugado hOPN5-BSA se inmoviliza a 200 ng/100 µL/cavidad en una placa ELISA (Nunc Company) a 4°C durante la noche, y la placa se enjuaga, después de lo cual se realiza el bloqueo con PBS complementado con 1% . BSA a 4°C durante la noche. Un anticuerpo muestra diluido con PBS complementado con 1% BSA se agrega a la placa a 100 µ?/?ß???3?, y se reaccionan a 37°C por 1 hora. La detección se realiza utilizando un anticuerpo (H + L) de IgG anti-humana marcado con peroxidasa (HRP). (Wako Puré Chemical
Industries, Ltd.) . La absorbancia a una longitud de onda de 450 nm se mide utilizando un lector de microplacas (Molecular Devices Company) . Como un resultado, se confirma que las capacidades de unión del anticuerpo R2Klvl .7 y el anticuerpo R2Klvl .8 al péptido hOPN5 son equivalentes a aquellas del anticuerpo C2K1 ( Figura 5 ) . (3. Actividad inhibidora del anticuerpo
R2K1 en migración de monocito sanguíneo periférico humano) La actividad inhibidora de anticuerpo purificado en migración de monocito sanguíneo periférico activada por citoquina se examina como se describe abajo. Primero, la sangre heparinizada que se saca de una persona saludable se diluye 2 veces con medio RPMI1640. La sangre diluida se coloca en la Placa Ficoll (Pharmacia .K.), y centrifuga a 400xg y temperatura ambiente por 30 minutos. La capa blanca observada en la inferíase entre el plasma y la Placa Ficoll se recupera y utiliza como monocitos . Los monocitos de esta manera obtenidos se cultivan y activan con -TNF-
de humano (20 ng/mL) durante la noche, y se utilizan en experimentos de migración. Los experimentos de migración se realizan utilizando una cámara de microquimiotaxis de 48 cavidades (Neuro Probé Inc. ) . OPN de humano se segmenta por una reacción con trombina de bovino (Sigma) a 37°C por 2 horas. Cada uno del anticuerpo R2K1 y el anticuerpo C2 1 se agrega a varias concentraciones, y la mezcla se deja permanecer a 37°C por 15 minutos, después de lo cual se agrega a la cámara inferior (la concentración final de OPN de humano fue 10 µg/mL) . Se monta en la misma un filtro de pol i carbonato (tamaño de poro 5 µp?) , y 50 µ?, de una suspensión celular (2x106 células/mL) se agregan a la cámara superior. Después del cultivo a 37°C en la presencia de 5% C02 por 2 horas, el filtro de pol i carbonato se remueve, las células en la superficie del filtro superior se remueven, después de lo cual las células se colorean con Diff-Quick (Baxter Company) . El número celular en la superficie del filtro superior se cuenta bajo magnificación x40, y los resultados se expresan como el conteo celular ' promedio
( células /mm3 ) ±SEM para 6 cavidades (Tabla 1) . A partir de estos resultados, tanto el anticuerpo R2Klvl.7 como el anticuerpo R2Klvl .8 inhibieron la migración de monocitos de sangre periférica de humano activados por TNF-a a osteopontina de humano segmentada por trombina como con el anticuerpo C2K1. Tabla 1 R2Klvl.7 & R2Klvl.8
C2K1
(4. Evaluación de estabilidad térmica mediante ELISA) - Cada uno del anticuerpo C2K1 y las dos
clases de anticuerpo R2K1 se diluyen en 50 µg/mL con PBS, y tratan en un baño de agua a 70°C por 2 horas. Después, cada dilución se regresa a temperatura ambiente, y la proporción de la absorbancia obtenida por ELISA descrito arriba a la absorbancia de una muestra no tratada se gráfica como actividad residual. La actividad residual se calcula utilizando valores de absorbancia que caen en el rango de 0.2 a 2.0 con alineación (lo mismo aplica abajo) . Como un resultado, se encontró que la actividad residual después del tratamiento descrito arriba fue más alta para el anticuerpo R2Klvl.7 y el anticuerpo R2Klvl .8 que para el anticuerpo C2K1 (Figura 6) . Particularmente, el anticuerpo R2Klvl .7 mostró una actividad residual que excede el 90%. Esto demostró que el anticuerpo R2Klvl.7 y el anticuerpo R2Klvl .8 tuvieron estabilidad térmica mejorada en comparación con el anticuerpo C2K1. (5. Evaluación de pH de baja resistencia mediante ELISA) Cada uno de los suministros purificados del anticuerpo C2K1 y las dos clases de anticuerpo R2K1 se diluye con PBS a 50 g/mL. Cada
dilución se ajusta a pH 5 con 1 N HC1 utilizando un medidor pH (HORIBA Company) , y se tratan a 25°C por 2 horas. Después, la dilución se ajusta a pH 7 con 1 M Tris-HCl (pH 9.5), y la proporción de la absorbancia obtenida por ELIS7A descrito arriba a la absorbancia de una muestra no tratada se gráfica como actividad residual. Como un resultado, se encontró que la actividad residual después del tratamiento descrito arriba fue significati ame te más alta para el anticuerpo R2 lvl .7 que para el anticuerpo C2 1 y el anticuerpo R2Klvl.8 (Figura 7) . Esto demostró que el anticuerpo R2 lvl.7 tuvo resistencia mejorada a pH bajo en comparación con el anticuerpo R2Klvl .8 y el anticuerpo C2K1. (6. Evaluación de resistencia a hidrocloruro de guanidina por espectrometría fluorescente) Cada uno del anticuerpo C2K1 y las dos clases de anticuerpo R2K1 se ajusta a 50 µg/mL utilizando 20 mM regulador de fosfato de sodio + 120 mM NaCl (pH 7) conteniendo varias concentraciones de hidrocloruro de guanidina (para control-, hidrocloruro de guanidina no. se
agrega), y se deja permanecer a 10°C durante la noche, después de lo cual el espectro de fluorescencia de cada muestra se mide. La medición del espectro de fluorescencia se realiza utilizando el Spectrofluorometer FP- 6500 (JASCO Company) . Utilizando una célula teniendo una longitud de trayectoria ligera de 3 mm, la fluorescencia emitida por triptofan excitada por 280 nm de luz se escanea sobre el rango de longitud de onda de 320 nm a 370 nm . La relación entre concentración de hidrocloruro de guanidina y longitud de onda máxima se compara entre los anticuerpos. Como un resultado, un cambio de longitud de onda máximo debido al soltado de la estructura de proteina esférica se observa a partir de un punto en el tiempo donde la concentración de hidrocloruro de guanidina solo excedió 1 M para C2K1 o 2 M para R2Klvl.8, mientras la longitud de onda máxima no subió hasta 3.8 M para R2Klvl.7 (Figura 8) . Esto demostró que el anticuerpo R2Klvl.7 tuvo resistencia mejorada a hidrocloruro de guanidina en comparación con el anticuerpo R2Klvl .8 y el anticuerpo C2K1. (7. Evaluación de pH de baj.a resistencia
por CD) Cada uno del anticuerpo C2K1 y el anticuerpo R2Klvl.7 se ajusta a 2 mg/mL con 20 mM regulador de citrato + 120 m NaCl (pH 6) . 0.1 N HC1 y se agrega agua destilada al mismo para preparar muestras de varios niveles de pH teniendo una concentración de anticuerpo de 1 mg/mL; después de tratarse a temperatura ambiente por 1 hora, se mide el espectro CD de cada muestra. Las mediciones de CD (dicroismo circular) se realizan utilizando el Spectropolarimeter J— 820 (JASCO Company) . Utilizando una célula teniendo una longitud de trayectoria ligera de 0.1 mm, el espectro CD se mide sobre el rango de longitud de onda de 205 nm a 260 nm. El análisis espectral empleó el programa de análisis de la estructura de proteina modelo JWSSE-480 (JASCO Company) , que se basa en el método analítico espectral CD de Yang et al. (Methods in Enzymology, 130, 208-269 (1986)). La relación entre la proporción del contenido de estructura aleatoria como se calcula por este método y el pH del tratamiento se compara entre los anticuerpos. Como un resultado, la
proporción de contenido de estructura aleatoria incremento de pH 3 para el anticuerpo C2K1, mientras que no se observo incremento en la estructura aleatoria hasta pH 2.7 para R2Klvl .7 (Figura 9) . Esto confirmó que el anticuerpo R2Klvl.7 tuvo una resistencia a un nivel pH inferior por 0.3 que aquella del anticuerpo C2K1. ( 8. Evaluación de estabilidad térmica utilizando calorímetro de exploración diferencial) Cada uno del anticuerpo C2K1 y el anticuerpo R2Klvl.7 se disuelve en 20 mM regulador de citrato + 120 mM regulador NaCl (pH 6.0) a una concentración de 1 mg/mL, y su estabilidad térmica se examina utilizando un calorímetro de exploración diferencial ultrasensible MicroCal Company (plataforma DSC VP capilar) . Los resultados se muestran en la Figura 10. La temperatura de' transición media (Tm) , que indica la temperatura de desnaturalización de estructura más alta, fue 76.0°C para el anticuerpo C2K1 y 82.8°C para el anticuerpo R2Klvl.7; se confirma un incremento de aproximadamente 6°C. - Esto demostró que el
anticuerpo R2Klvl.7 tuvo estabilidad térmica remarcablemente mejorada. (9. Efecto inhibidor de la adhesión celular de R2Klvl.7 en OPN) Para comparar los efectos farmacológicos de R2 lvl .7 de la presente invención de esta solicitud y un anticuerpo humanizado anti-OPN comúnmente conocido (ver WOO 3 / 027151 ; de aquí en adelante referida como R2KlvO), los efectos inhibidores celulares de adhesión de estos dos anticuerpos en OPN de humano se examinan. 1. Cultivo y paso de células Las células Jurkat E6.1 se compran de Dainippon Pharmaceuti cal Co. , Ltd., y se pasan y cultivan utilizando RPMI1640 (10% FCS, penicilina-estreptomicina) . 2. Preparación de reactivos Regulador de adhesión (medio L-15, 1% BSA, 50 mM HEPES, pH 7.4) Solución ??? (40 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) [SIGMA] en regulador de adhesión ) Solución de coloración CV (0.5% Cristal Violeta, 1% formamida, 20% metanol)
Solución GST (5 µ9/p?--, glutationa S-transferasa (GST) [SIG A] en PBS (-)) Solución de IgGl de humano (400 µg/mL en PBS (- ) ) [CALBIOCHEM] 3. Preparación de osteopontina (OPN) de N-terminal de humano segmentada por trombina OPN N-terminal de humano segmentada por trombina fusionada a GST (GST-humano N-OPN, 1.6 mg/mL) se prepara como se describe en WO02/081522, y se utiliza en los experimentos después de diluirse con PBS (-) a 5 µg/mL. 4. Preparación de fármacos de prueba Cada uno de R2Klvl .7 (18.6 mg/mL) y R2KlvO (4.39 mg/mL) se diluye con PBS (-) a 4, 12, 40, 120, y 400 ^g/mL) ; IgGl de humano se agrega a todas estas soluciones diluidas para obtener una concentración de proteina total de 400 µg /mL . 5. Agrupamiento Grupo en Blanco (GST) Grupo Control Grupo de fármaco prueba R2Klvl .7 (1, 3, 10, 30, 100 µg/mL) R2 lvO (1, 3, 10, 30, 100 µg/mL) 6. Experimentos de Adhesión Celular
A todas las cavidades, excepto cavidades en blanco, de una microplaca de 96 cavidades, se agregan 25 µ??. de la solución GST-humano N-OPN,
0 25 µ?, de la solución GST se agrega para el grupo en blanco, y la placa se incuba a 37°C por
1 hora, después de la cual la placa se enjuaga dos veces con PBS (-) . 50 µ?^ de la solución PMA se agregan, y la placa se incuba a 37°C por 30 minutos, después de lo cual se agregan 25 L de la solución del fármaco prueba (grupo de fármaco prueba) o la solución de IgGl de humano (grupo en blanco y grupo control) . Las células Jurkat E6.1 se suspenden en el regulador de adhesión para obtener una densidad de célula de 2x106 células/mL, y se agregan 25 µ]^ a todas las cavidades. La suspensión se centrifuga a 15*g por 1 minuto para precipitar las células en la parte inferior de la placa, después de lo cual la placa se incuba a 37°C por 1 hora. Después de la terminación de la reacción, la placa se invierte y centrifuga a 47xg por 2 minutos, y el sobrenadante (células no adherentes) se remueve. Para cuantificación del conteo de célula adherente, se agregan 25 µL de la solución de coloración CV, la placa se deja
permanecer a temperatura ambiente por 10 minutos para colorear y fijar las células, después de lo cual la placa se enjuaga con agua pura tres veces, se agregan 25 µ?. de solución Triton-XlOO al 1% a todas las cavidades, y después de que se confirma la solubili zación de las, la absorbancia (longitud de onda de medición 595 nm) se mide utilizando un lector de microplacas ( S PECTRAmax250 , Molecular Devices ) . 7. Análisis Los experimentos emplearon 5 cavidades por grupo. El valor promedio de absorbancia y velocidad de supresión para cada grupo se calculan, y se calculan los valores IC50 (concentraciones de fármaco prueba para una velocidad de supresión de 50%) . La velocidad de supresión para el grupo blanco se define como 100% y aquella del grupo control como 0%. Los valores IC50 se calculan al diagramar la concentración de fármaco prueba logarítmica en el eje X y la velocidad de supresión en el eje Y, y . aplicar los datos a una ecuación de re'gresión lineal por el método al cuadrado. Los cálculos de los valores IC50 empleados se
obtienen en las concentraciones de fármaco prueba que muestran una relación de dosis-respuesta lineal. A partir de los resultados mostrados en la Figura 11, se entiende que el efecto inhibidor celular de adhesión de un anticuerpo humanizado de OPN anti-humana comúnmente conocido es extremadamente bajo, mientras que R2K1 i . tiene un excelente efecto inhibidor celular de adhesión (valor IC50: 6. ) . (10. Efectos de R2Klvl .7 en artritis inducida por colágeno en mono cynomolgus) Colágeno tipo II de bovino (Collagen Gijyutsu Kenshukai) en emulsión en adyuvante complete de Freund (Becton Dickinson and Company) se inmuniza a las espaldas y colas de los monos sinomolgo 36 días antes de la medicación, y un refuerzo se administra. 15 dias antes de la medicación. Los animales se aleatorizan en tres grupos tratados con la medicación (n=10) en la base de cambios de por ciento en el peso corporal y el área oblonga de la articulación interfalangeal próxima en comparación con niveles de pre- inmuni zación . R2Klvl.7 o control solvente se da a una dosis
de 25 mg/kg o 50 mg/kg por inyección intravenosa una vez a la semana ocho veces en total. El primer dia de medicación se define como el dia 0. Los dias 0, 6, 13, 20, 27 , 34 , 41, 48 y 55 durante el periodo de administración, como una señal de exploración de la articulación, se monitorea el área oblonga de la articulación interfalangeal próxima. Los ejes, menor y mayor, de las articulaciones interfalangeales próximas de las piernas anterior y posterior se miden utilizando calibres, las áreas oblongas se calculan, y el valor promedio de las áreas oblongas de los 16 dedos se utiliza como el área oblonga de articulación interfalangeal próxima. El por ciento de cambios en el área oblonga de articulación interfalangeal próxima se calcula relativa al valor de pre-medicación como 100. El dia 0, y los dias 6, 13, 20, 27, 34 , 41, 48 y 55 (6 después de la medicación), el plasma se recolecta, y el R2Klvl.7 y el anticuerpo anti-R2Klvl .7 se miden. Esta concentración medida de R2Klvl .7 en plasma corresponde al nivel directo. Los análisis de datos se realizan después de eliminar los datos
en los animales positivos en anticuerpo anti-R2Klvl.7 y animales que mueren durante el periodo de estudio. En 1 animal en el grupo R2Klvl .7 en una dosis de 25 mg/kg y 4 animales en el grupo R2Klvl.7 en una dosis de 50 mg/kg, se genera el anticuerpo anti-R2Klvl .7. Dos animales en el grupo de control solvente, 2 animales en el grupo R2Klvl.7 en una dosis de 25 mg/kg, y 1 animal en el grupo R2Klvl.7 en una dosis de 50 mg/kg murieron después de la medicación. Los casos de los decesos se atribuyen al debilitamiento general debido a inflamación severa. El tratamiento con R2Klvl .7 de 50 mg/kg redujo significativamente la exploración del pie según se mide por el cambio de por ciento en el área oblonga de articulación interfageal próxima en comparación con el grupo solvente de control entre el dia 27 y dia 55 (Figura 12) . R2Klvl .7 en una dosis de 25 mg/kg no tuvo efecto significativo en el cambio en el área oblonga de articulación int erfalangeal próxima. En dosis de 25 mg/kg y 50 mg/kg, las concen raciones directas de R2Klvl .7 en plasma fueron- 38.41 a 76.13 µg/mL y 73.91 a 125.3
µ /p?1,, respectivamente. La secuencia SVVYGLR de OPN de humano, diferente a la secuencia correspondiente de OPN de mono (SVAYGLR) (SEQ ID NO:ll), la afinidad de unión de R2Klvl.7 para este péptido de OPN de humano es 100 veces más alta que la afinidad de unión para el péptido de OPN de mono correspondiente. Con estos descubrimientos en mente, la concentración de plasma efectiva de R2Klvl .7 en el tratamiento de artritis se estima que no es más de 100 µ9/p??;. (11. Preparación de scFv de R2Klvl.7) Por un PCR con el plásmido de expresión de cadena pesada descrito arriba que tiene R2K1-VH1.7 y plásmido de expresión de cadena ligera que tiene R2K1-VL1.7 como los templados, se prepara un fragmento de ADN que codifica un fragmento de región variable de filamento único (scFv) teniendo la estructura de VH1.7-enlazador-VLl .7 (el enlazador fue la secuencia base que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada por GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:14)) . Se agrega al final de este fragmento de ADN una secuencia reconocida por las endonucleasas de restricción Sfil y Notl. Este fragmento de ADN
ssee ddiiggiieerree ccoonn llaass eennddoonnuucclleeaassaass ddee * SSffiill yy NNoottll,, yy ssee iinnsseerrttaann eenn eell ssiittiioo SSffiill yy ssiittiioo NNoottll ddeell vveeccttoorr ppCCAANNTTAABB55EE ((MMaarrkkss,, JJ..DD..,, eett.. aall,, JJ.. MMooll.. BBiiooll .. ,, vvooll..222222,, pp558811--9977,, 11999911)),, ttaammbbiiéénn pprreevviiaammeennttee ddiiggeerriiddaa ccoonn SSffiill yy NNoottll,, mmeeddiiaannttee lloo ccuuaall ssee pprreeppaarraa uunn pplláássmmiiddoo ddee eexxpprreessiióónn ssccFFvv RR22KK11--VVHH11..77.. EEnn eessttee pplláássmmiiddoo ddee eexxpprreessiióónn,, uunnaa sseeccuueenncciiaa bbaassee qquuee ccooddiiffiiccaa EE--TTaagg ssee aaggrreeggaa aagguuaass aabbaajjoo ddee llaa rreeggiióónn ddee ccooddiiffiiccaacciióónn ddee ssccFFvv.. EEssttee pplláássmmiiddoo ssee iinnttrroodduuccee aa llaa cceeppaa HHBB22115511 ddee EEsscchheerriicchhiiaa ccoollii ddee aaccuueerrddoo aa uunn mmééttooddoo ccoonnvveenncciioonnaall,, yy ssee ccoollooccaa eenn uunnaa ppllaaccaa ddee aaggaarr SSOOBBAAGG ((uunnaa ppllaaccaa SSOOBB ccoonntteenniieennddoo 22%% gglluuccoossaa yy 110000 µµgg//mmLL aammppiicciilliinnaa)) ppaarraa pprroodduucciirr uunn cclloonn ttrraannssffoorrmmaaddoorr.. AA ppaarrttiirr ddeell cclloonn oobbtteenniiddoo,, ssee eexxttrraaee uunn AADDNN ddee -- pplláássmmiiddoo;; llaa sseeccuueenncciiaa ddee llaa rreeggiióónn ddee ccooddiiffiiccaacciióónn ddee ssccFFvv ssee ccoonnffiirrmmaa ppoorr aannáálliissiiss ddee sseeccuueenncciiaa bbaassee ddee AADDNN ccoonn eell AADDNN ddee pplláássmmiiddoo ccoommoo eell tteemmppllaaddoo.. EEll aannáálliissiiss ddee sseeccuueenncciiaa bbaassee ddee AADDNN eemmpplleeóó eell KKiitt DDTTCCSS--QQuuiicckk SSttaarrtt yy eell SSiisstteemmaa ddee AAnnáálliissiiss ddee AADDNN CCEEQQ22000000XXLL ((aammbbooss ddee BBeecckkmmaann CCoouulltteerr,, KK..KK..)) .. LLaa sseeccuueenncciiaa bbaassee oobbtteenniiddaa ssee mmuueessttrraa ppoorr SSEEQQ IIDD NNOO:: 99.. D Deessppuuééss ddee qquuee eell cclloonn ddee EEsscchheerriicchhiiaa ccoollii..
cuya secuencia base se confirma se cultiva utilizando un medio 2xYT conteniendo 2% glucosa y 100 µg/mL ampicilina, una porción del mismo se suspende en un medio 2xYT complementado con 1 mM IPTG y 100 g/mL ampicilina, y se cultiva además durante la noche para inducir la expresión de scFv. Después de la terminación del cultivo, las células se recuperan por centrifugación, suspenden en un PBS conteniendo 1 mM EDTA, y se dejan permanecer en hielo por 30 minutos. Después, la suspensión se centrifuga a 10,000 rpm por 15 minutos, y el sobrenadante se recupera y filtra a través de un filtro de 0.45 µp?, mediante lo cual una fracción de periplasma conteniendo scFv . se obtiene. scFv de R2klvl.7 (de aqui en adelante referida como R2 Klvi .7 - s cFv ) se purifica de esta fracción de periplasma mediante cromatografía por afinidad utilizando anticuerpo anti-E-Tag. R2Klvl .7-scFv de esta manera preparado se somete a cromatografía por filtración de gel; del patrón de separación mostrado en la Figura 13, se conforma que casi todas fueron monoméricas.
(12. Confirmación de capacidad de unión de R2Klvl .7-scFv a péptido de osteopontina de humano ) La actividad de unión del R2 Kl i .7 -s cFv purificado al péptido hOPN5 se mide por un método ELISA. El método fue generalmente el mismo como se describe arriba; en esta medición, el anticuerpo anti-E-Tag marcado con HRP se utiliza como el anticuerpo marcado. Los resultados se muestran en la Figura 14. Se confirma que R2 Klvi .7 - s cFv purificado no se une a BSA de control negativo pero se une específicamente al péptido hOPN5. (13. Preparación de fragmento de anticuerpo modificado por glicol de polietileno) Después de que el anticuerpo R2Klvl .7 se pepsiniza por un método estándar, se obtiene F(ab')2 purificado utilizando una columna HP de Proteína G (ambos de Amersham Biosciences K.K.) y una columna de Alta Resolución Hi prep 16/60 Sephacryl S-200 (Amersham Biosciences K.K.) . Subsiguientemente, el F(ab')2 purificado se reduce con 0.1 M DTT para activar el grupo tiol, después de lo cual la filtración de gel utilizando una columna de Sephadex G-25
(Amersham Biosciences K.K.) se realiza para remover DTT . Fab' de esta manera obtenido se mezcla con glicol de polietileno maleimidado SUNBRIGHT ME-120MA (NOF Corporation) en una proporción molar de 1:10, y se dejo permanecer a 4°C durante la noche para causar una reacción de acoplamiento. Después de que yodoacetamida (Nacalai Tesque) se agrega para detener la reacción de acoplamiento, un F(ab')2 modificado por glicol de polietileno (de aqui en adelante también referida como F(ab')2-PEG) se obtiene por filtración de gel utilizando una columna de Alta Resolución Hi prep 16/60 Sephacryl S-200. Los resultados de SDS-PAGE se muestran en la Figura 15. Por una comparación F(ab')2 sin modificar electroforizado para control de referencia, se confirma un incremento en el peso molecular por la modificación con glicol de polietileno . (14. Confirmación de actividad de unión de
F(ab')2-PEG a péptido de osteopontina ) La actividad de unión del F(ab')2-PEG purificado de R2Klvl .7 al péptido hOPN5 se confirma utilizando ensayo de resonancia de plasmón de superficie. El -péptido biotinizado
hOPN5 se inmoviliza en Sensor Chip SA (BIAcore Company) , y su actividad de unión se confirma utilizando F(ab')2-PEG, previamente diluido a 5 g/mL con regulador HBS-EP (BIAcore Company) ; los resultados se muestran en la Figura 16. A partir de un aumento en la señal, este F (ab' ) 2-PEG se confirma como teniendo la misma actividad de unión al péptido hOPN5 como aquella de R2Klvl .7. Aplicación Industrial Debido a que el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la presente invención es excelente en actividades
(actividad de unión a antigeno, actividad inhibidora de migración de leucocito y lo similar) y/o estabilidad (resistencia a calor, condiciones de pH bajo, desnaturalizantes y lo similar), es útil como un fármaco más efectivo que los anticuerpos de osteopontina anti-humana convencionales en la prevención o tratamiento de varias enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedad autoinmune, reumatismo, artritis reumatoide, y os eoart rit is . Aunque la presente invención se ha descrito con énfasis a modalidades preferidas, es obvio.
para aquellos expertos en la materia que las modalidades preferidas pueden modificarse. La presente invención tiene la intención de poder incluir métodos diferentes a aquellos descritos en detalle en la presente especificación. De acuerdo con lo anterior, la presente invención comprende todas las modificaciones comprendidas en la esencia y alcance de las
"REIVINDICACIONES" anexas. Esta solicitud se basa en la solicitud de patente No. 2006-152892 presentada en Japón, y los contenidos descritos en la presente se incorporan completamente para referencia. Además, los contenidos descritos en cualquier publicación citada en la presente, incluyendo patentes y solicitudes de patente, se incorporan en la presente en sus totalidades para referencia, al grado de que se han des-crito en la presente.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES 1. Anticuerpo humanizado de os teopontina ant i-humana comprendiendo una región variable de cadena pesada consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 1 y una región variable de cadena ligera consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO : 3.
- 2. Anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la reivindicación 1, en donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo es Igyl de humano.
- 3. Anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la reivindicación 1, en donde la región constante de cadena ligera del anticuerpo es IgK de humano.
- 4. Anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la reivindicación 1, en donde la región constante de cadena pesada del anticuerpo es I yl de humano y la región constante de cadena ligera del anticuerpo es IgK de humano .
- 5. Anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana comprendiendo una cadena pesada consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO:25 y una cadena ligera consistiendo de la secuencia de aminoácidos mostrada por SEQ ID NO:27.
- 6. Polinucleótido comprendiendo una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la rei indicación 1.
- 7. Polinucleótido comprendiendo una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de la reivindicación 1.
- 8. Vector de expresión comprendiendo el polinucleótido descrito en la reivindicación 6 y/o reivindicación 7.
- 9. Célula huésped incorporando el vector de expresión de la reivindicación 8.
- 10. Método para producir un anticuerpo humanizado de osteopontina · anti-humana, comprendiendo una etapa de cultivar la célula huésped de la reivindicación 9 para permitir que la célula exprese el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana.
- 11. Fármaco terapéutico- para enfermedad autoinmune, reumatismo, artritis reumatoide u osteoartritis, comprendiendo el anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
- 12. Método para prevenir o tratar enfermedad autoinmune, reumatismo, artritis reumatoide u osteoartritis, comprendiendo una etapa para administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
- 13. Uso del anticuerpo humanizado de osteopontina anti-humana de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la fabricación de un farmacéutico para prevenir o tratar enfermedad autoinmune, reumatismo, artritis reumatoide u
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