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TW201800418A - 結合stat3之抗體治療劑 - Google Patents

結合stat3之抗體治療劑

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TW201800418A
TW201800418A TW106113765A TW106113765A TW201800418A TW 201800418 A TW201800418 A TW 201800418A TW 106113765 A TW106113765 A TW 106113765A TW 106113765 A TW106113765 A TW 106113765A TW 201800418 A TW201800418 A TW 201800418A
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TW
Taiwan
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antibody
stat3
seq
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
TW106113765A
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English (en)
Inventor
周賀鉞
喜映 李
Original Assignee
索倫多醫療公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 索倫多醫療公司 filed Critical 索倫多醫療公司
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Abstract

本揭示內容提供抗STAT3抗體及其抗原結合部分。在某些實施例中，該等抗體或其片段用於治療癌症。

Description

結合STAT3之抗體治療劑
在誘癌作用及癌症進展中重要之信號轉導蛋白為新穎抗癌治療劑之開發呈現有吸引力之靶標。STAT (信號轉導子及轉錄活化子)蛋白家族係在信號轉導及轉錄活化中起雙重作用之DNA結合蛋白。STAT家族之六種不同成員包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5及STATE。 STAT之活性受各種細胞介素及促有絲分裂刺激調節。細胞介素與其受體之結合導致與該等受體相關聯之傑納斯蛋白酪胺酸激酶(Janus protein tyrosine kinases，JAK)之活化。此使STAT磷酸化，導致易位至細胞核及STAT反應基因之轉錄活化。STAT上之特定酪胺酸殘基上之磷酸化使其活化，導致形成結合至特異性基因啟動子序列之STAT之同二聚體及/或異二聚體。藉助STAT活化由細胞介素調介之事件包括細胞增殖及分化及防止細胞凋亡。 STAT3在大多數細胞類型中表現(Zhong等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 4806-4810)，且誘導對組織損傷及發炎之反應中所涉及基因之表現。已顯示，STAT3藉助bcl-2之表現來防止細胞凋亡(Fukada等人，Immunity , 1996, 5, 449-460)。STAT3係控制細胞增殖、存活、遷移及免疫阻抑之基因之主調節子。STAT3之異常表現或組成性表現與多種疾病過程相關。STAT3之組成性活化已在眾多種癌症中發現，且已發現STAT3在腫瘤細胞中以及腫瘤微環境中之非轉形細胞中持續活化。
本發明包括抗體，其包括結合至STAT3 (包括人類STAT3)之經分離人類抗體。 在第一態樣中，本發明之特徵在於經分離之抗信號轉導子及轉錄活化子3 (STAT3)抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含含有如SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列之CDR1結構域；及輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含含有如SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列之CDR1結構域。 在一個實施例中，重鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列，且輕鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之特徵在於經分離之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含含有如SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列之CDR1結構域；及輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含含有如SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列之CDR1結構域。 在一個實施例中，重鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列，且輕鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列。 在另一態樣中，本發明之特徵在於經分離之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變結構域，該重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；及輕鏈可變結構域，該輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列。 在一個實施例中，重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少96%一致之胺基酸序列；且輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少96%一致之胺基酸序列。 在另一實施例中，重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少97%一致之胺基酸序列；且輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少97%一致之胺基酸序列。 在另一實施例中，重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少98%一致之胺基酸序列；且輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少98%一致之胺基酸序列。 在另一實施例中，重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少99%一致之胺基酸序列；且輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少99%一致之胺基酸序列。 在一個實施例中，重鏈可變結構域包含選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列；且輕鏈可變結構域包含選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。 在一個實施例中，抗體偶聯物係圖1B中所示之結構。圖1B係本發明之例示性抗體偶聯物化合物901a之圖式，其中抗體(AT )係ST3G12且圖1A中之一個R1 係烷基螢光團部分。 在一個實施例中，抗體偶聯物係圖1C中所示之結構。圖1C係本發明之例示性抗體偶聯物化合物901之圖式，其中抗體(AT )係ST3G12且圖1A中之每一R1 係氫。 在上文態樣之任一者之另一實施例中，抗STAT3抗體或其抗原結合片段之KD 為至少1 × 10-6 M。 在上文態樣之任一者之另一實施例中，抗STAT3抗體或其抗原結合片段之KD 為1 × 10-6 M或更小。 在上文態樣之任一者之另一實施例中，抗STAT3抗體或其抗原結合片段係人類抗體。 在上文態樣之任一者之另一實施例中，抗STAT3抗體或其抗原結合片段係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在特定實施例中，抗體係IgG1或IgG4同型。 在上文態樣之任一者之另一實施例中，抗STAT3抗體或其抗原結合片段係Fab片段或scFv。 在上文態樣之任一者之一個實施例中，抗STAT3抗體或其抗原結合片段偶聯至細胞內遞送化合物。 在一個實施例中，本發明之特徵在於用於治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之上文態樣之任一者之抗STAT3抗體或其抗原結合片段。 在另一實施例中，癌症係實體腫瘤。 在另一實施例中，癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤、神經膠質瘤、髓母細胞瘤、腎細胞癌、胰臟腺癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、神經膠母細胞瘤、乳癌、胰臟癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸癌及腎癌。在另一相關實施例中，癌症為血液癌。在相關實施例中，血液癌係選自急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病、慢性髓單核球性白血病(CMML)、幼年型髓單核球性白血病(JMML)、巨核細胞性白血病及大顆粒淋巴球白血病。 在另一實施例中，本發明之特徵在於用於治療患有自體免疫疾病之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之上文態樣之任一者之抗STAT3抗體或其抗原結合片段。 在另一實施例中，自體免疫疾病係選自多發性硬化、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、某些細菌誘發之結腸炎、關節炎、狼瘡、糖尿病、氣喘、發炎性腸病、硬皮症及血管炎。 在另一實施例中，本發明之特徵在於醫藥組合物，其包含上文態樣之任一者之抗STAT3抗體或抗體片段及醫藥上可接受之載劑。
相關申請案 本申請案主張於2016年11月9日提出申請之美國臨時申請案第62/419,778號及於2016年4月25日提出申請之美國臨時申請案第62/327,178號之優先權，該等申請案之每一者之全部內容皆係以全文引用的方式併入本文中。序列表 本申請案含有序列表，其已以ASCII格式電子提交，且係以全文引用的方式併入本文中。於2017年4月18日創建之該ASCII拷貝命名為126036-06220_SL.txt且大小為8,235個位元組。定義 「抗原結合蛋白」係包含結合至抗原之部分及視情況支架或框架部分之蛋白質，該支架或框架容許抗原結合部分採取促進抗原結合蛋白至抗原之結合之構象。抗原結合蛋白之實例包括抗體、抗體片段(即，抗體之抗原結合部分)、抗體衍生物及抗體類似物。抗原結合蛋白可包含(例如)具有經移植CDR或CDR衍生物之替代蛋白質支架或人造支架。此等支架包括(但不限於)包含為(例如)穩定化抗原結合蛋白之三維結構而引入之突變之抗體衍生支架，以及包含(例如)生物相容性聚合物之全合成支架。例如，參見Korndorfer等人，2003,Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics , 第53卷, 第1:121-129期；Roque等人，2004,Biotechnol. Prog. 20:639-654。另外，可使用肽抗體模擬物(「PAM」)，以及基於利用纖連蛋白組分作為支架之抗體模擬物之支架。 「抗原結合結構域」、「抗原結合區」或「抗原結合位點」係含有與抗原相互作用且促使抗原結合蛋白對抗原之特異性及親和力之胺基酸殘基(或其他部分)的抗原結合蛋白之一部分。對於特異性結合至其抗原之抗體，此將至少包括其CDR結構域中之至少一者之一部分。 「表位」係分子中由抗原結合蛋白(例如，由抗體)結合之部分。表位可包含分子之非連續部分(例如，在多肽中，在多肽之一級序列中不連續、但在多肽之三級及四級結構背景下彼此足夠近以由抗原結合蛋白結合的胺基酸殘基)。一般而言抗體之可變區、尤其CDR與表位相互作用。 術語「抗體」係指免疫球蛋白(Ig)分子，其包含4條多肽鏈，即兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈，或其任一功能片段、突變體、變體或衍生物，其保留Ig分子之基本表位結合特徵。 通常，每一抗體鏈之胺基末端部分包括主要負責抗原識別之可變區。每一鏈之羧基末端部分界定(例如)負責效應子功能之恆定區。人類輕鏈分類為κ或λ輕鏈。重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。在輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區由約12或更多個胺基酸之「J」區聯結，其中該重鏈亦包括約10或更多個胺基酸之「D」區。通常參見Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W.編輯，第2版，Raven Press, N.Y. (1989)。每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整免疫球蛋白具有兩個結合位點。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。 抗體重鏈及輕鏈(分別VH及VL)之可變區展現由三個超變區(亦稱為互補決定區或CDR)聯結之相對保守框架區(FR)之相同通用結構。輕鏈及重鏈二者自N末端至C末端包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。胺基酸至每一結構域之分配為業內所已知，包括(例如)如以下中所闡述之定義：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH出版號91-3242, 1991 (本文中稱為「Kabat編號」)。舉例而言，可根據Kabat編號確定抗體之CDR區。 術語「Fc多肽」包括源自抗體之Fc區之多肽的天然及突變蛋白質形式。亦包括此等多肽之含有鉸鏈區的截短形式，其可促進二聚作用。包含Fc部分(及自其形成之寡聚物)之融合蛋白提供可在蛋白質A或蛋白質G管柱上藉由親和層析容易純化的優勢。 術語「抗STAT3抗體」及「結合至STAT3之抗體」係指能夠以足夠親和力結合STAT3使得該抗體可用作靶向STAT3 (包括人類STAT3)之診斷劑及/或治療劑之抗體。 術語「完整抗體」或「全長抗體」係指由各自含有Fc區之兩條抗體輕鏈及兩條抗體重鏈構成之抗體。 如本文中所使用，術語「單特異性」係指抗體或其抗原結合片段對一個特定表位展現親和力。相比之下，雙特異性抗體或其抗原結合片段對兩個不同表位展現親和力。在一個實施例中，本文中所闡述之方法及組合物可用於單特異性抗體或其抗原結合片段之細胞內遞送。 「多特異性抗體」係識別一或多個抗原上之一個以上表位之抗體。此類型之抗體之亞類係識別相同或不同抗原上之兩個不同表位之「雙特異性抗體」。 如本文中在抗體背景下所使用之術語「特異性結合(specific binding、specifically binds或specifically binding)」係指相對於其他分子或部分，抗體非共價或共價優先結合至抗原(例如，相對於其他可獲得之抗原，抗體特異性結合至特定抗原)。在一個實施例中，若抗體結合至抗原之解離常數KD 為10-5 M或更小(例如，10-6 M或更小、10-7 M或更小、10-8 M或更小、10-9 M或更小或10-10 M或更小)，則抗體特異性結合至抗原(例如，STAT3)。 如本文中所使用，術語「人類抗體」係指抗體或抗體之抗原結合片段，其包含源自人類免疫球蛋白序列之重鏈及輕鏈。人類抗體可以各種方式鑑別，其實例闡述於下文中，包括藉助用經遺傳修飾以表現源自人類重鏈及/或輕鏈編碼基因之抗體之小鼠的所關注抗原免疫。在一個實施例中，人類抗體係使用重組方法製得，使得抗體之醣基化模式不同於具有相同序列之抗體(若其係天然存在)。 術語「嵌合抗體」係指含有一或多個源自特定來源或物種之區域及一或多個源自不同來源或物種之區域之抗體。 術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種(例如，小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列，但其中VH及/或VL序列之至少一部分已經改變得更「人類化」，即與人類種系可變序列更相似之抗體。「人類化抗體」係免疫特異性結合至所關注抗原之抗體或其變體、衍生物、類似物或片段，且其包含實質上具有人類抗體之胺基酸序列之框架(FR)區及實質上具有非人類抗體之胺基酸序列之互補決定區(CDR)。人類化抗體序列與源自非人類物種之抗體序列之差異在於一或多個胺基酸取代、缺失及/或添加。通常，在投與人類個體時，人類化抗體與非人類物種抗體(例如，鼠類或嵌合抗體)相比誘發免疫反應之可能性較低，及/或誘發較不嚴重之免疫反應。在一個實施例中，非人類物種抗體之重鏈及/或輕鏈之框架及恆定結構域中之某些胺基酸突變以產生人類化抗體。如何製得人類化抗體之實例可參見美國專利6,054,297、5,886,152及5,877,293。 「抗體片段」、「抗體部分」、「抗體之抗原結合片段」或「抗體之抗原結合部分」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原之一部分。抗體片段之實例包括(但不限於) Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2 ；Fd；及Fv片段，以及dAb；雙價抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；含有抗體之至少一部分之多肽，該抗體之至少一部分足以賦予特異性抗原結合至多肽。抗體之抗原結合部分可藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶或化學裂解產生。抗原結合部分尤其包括Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、結構域抗體(dAb)及互補決定區(CDR)片段、嵌合抗體、雙價抗體、三價抗體及四價抗體。 在一個實施例中，抗體片段係scFV。單鏈抗體(scFv)係其中VL 及VH 區經由連接體(例如，胺基酸殘基之合成序列)聯結以形成連續蛋白質鏈之抗體(例如，參見Bird等人(1988) Science 242:423-426；及Huston等人， (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883))。 Fab片段係具有VL 、VH 、CL 及CH1 結構域之單價片段；F(ab’)2 片段係具有兩個Fab片段之二價片段，該兩個Fab片段藉由鉸鏈區之二硫橋連接；Fd片段具有VH 及CH1 結構域；Fv片段具有抗體單臂之VL 及VH 結構域；且dAb片段具有VH 結構域、VL 結構域或者VH 或VL 結構域之抗原結合片段(美國專利6,846,634；6,696,245、美國申請公開案20/0202512；2004/0202995；2004/0038291；2004/0009507；2003/0039958，及Ward等人，Nature 341:544-546, 1989)。 雙價抗體係包含兩條多肽鏈之二價抗體，其中每一多肽鏈包含由連接體聯結之VH及VL結構域，該連接體太短以致不容許同一鏈上之兩個結構域之間配對，從而使得每一結構域與另一肽鏈上之互補結構域配對(例如，參見Holliger等人，1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48，及Poljak等人，1994, Structure 2:1121-23)。若雙價抗體之兩條多肽鏈相同，則自其配對產生之雙價抗體將具有兩個相同抗原結合位點。具有不同序列之多肽鏈可用於製造具有兩個不同抗原結合位點之雙價抗體。類似地，三價抗體及四價抗體係分別包含三條及四條多肽鏈且分別形成三個及四個可相同或不同之抗原結合位點之抗體。 兩個多核苷酸或兩個多肽序列之「一致性百分比」或「同源性百分比」係藉由使用GAP電腦程式(GCG Wisconsin Package之部分，10.3版(Accelrys, San Diego, Calif.))使用其缺省參數比較序列來測定。 術語「多核苷酸」、「寡核苷酸」及「核酸」通篇可互換使用且包括DNA分子(例如，cDNA或基因體DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、使用核苷酸類似物(例如，肽核酸及非天然核苷酸類似物)生成之DNA或RNA之類似物及其雜合體。核酸分子可為單鏈或雙鏈。在一個實施例中，本發明之核酸分子包含編碼抗體、或其片段、衍生物、突變蛋白或變體之連續開放閱讀框。 若兩個單鏈多核苷酸之序列可在反平行定向中比對使得一個多核苷酸中之每一核苷酸與另一多核苷酸中之其互補核苷酸相對、未引入空隙且在任一序列之5’或3’端無未成對核苷酸，則該兩個單鏈多核苷酸係彼此之「補體」。若兩個多核苷酸可在適度嚴格條件下彼此雜交，則多核苷酸與另一多核苷酸「互補」。因此，多核苷酸可與並非其補體之另一多核苷酸互補。 「載體」係可用於將與其連接之另一核酸引入細胞中之核酸。一類載體為「質體」，其係指額外核酸區段可連接至其中之直鏈或環形雙鏈DNA分子。另一類載體係病毒載體(例如，複製缺陷性反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)，其中額外DNA區段可引入至病毒基因體中。某些載體能夠在已將其引入其中之宿主細胞中進行自主複製(例如，包含細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)可在引入至宿主細胞中時整合至宿主細胞之基因體中，並藉此隨宿主基因體一同複製。「表現載體」係可引導所選多核苷酸之表現之一類載體。 若調控序列影響核苷酸序列之表現(例如，表現之程度、定時或位置)，則核苷酸序列「可操作地連接」至調控序列。「調控序列」係影響與其可操作連接之核酸之表現(例如，表現之程度、定時或位置)的核酸。調控序列可(例如)直接對調控核酸發揮其效應，或藉助一或多個其他分子(例如，結合至調控序列及/或核酸之多肽)之作用發揮其效應。調控序列之實例包括啟動子、增強子及其他表現控制元件(例如，多聚腺苷酸化信號)。調控序列之其他實例闡述於(例如) Goeddel, 1990, Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.及Baron等人，1995,Nucleic Acids Res. 23:3605-06中。 「宿主細胞」係可用於表現核酸(例如，本發明之核酸)之細胞。宿主細胞可為原核生物(例如大腸桿菌(E. coli ))，或其可為真核生物，例如單細胞真核生物(例如，酵母或其他真菌)、植物細胞(例如，煙草或番茄植物細胞)、動物細胞(例如，人類細胞、猴細胞、倉鼠細胞、大鼠細胞、小鼠細胞或昆蟲細胞)或雜交瘤。宿主細胞之實例包括猴腎COS-7細胞系(ATCC CRL 1651) (參見Gluzman等人，1981,Cell 23:175)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或其衍生物(例如Veggie CHO及於無血清培養基中生長之相關細胞系(參見Rasmussen等人，1998,Cytotechnology 28:31)或缺乏DHFR之CHO株DX-B11 (參見Urlaub等人，1980,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20))、HeLa細胞、BHK (ATCC CRL 10)細胞系、源自非洲綠猴腎細胞系CV1之CV1/EBNA細胞系(ATCC CCL 70) (參見McMahan等人，1991,EMBO J . 10:2821)、人類胚胎腎細胞(例如293、293 EBNA或MSR 293)、人類表皮A431細胞、人類Colo205細胞、其他經轉形之靈長類細胞系、正常二倍體細胞、源自原生組織之活體外培養物之細胞株、原生外植體、HL-60、U937、HaK或Jurkat細胞。在一個實施例中，宿主細胞係哺乳動物宿主細胞，但並非人類宿主細胞。通常，宿主細胞係可經編碼多肽之核酸(其隨後在宿主細胞中表現)轉形或轉染之經培養細胞。片語「重組宿主細胞」可用於表示經欲表現之核酸轉形或轉染之宿主細胞。宿主細胞亦可為包含核酸但不使其以期望程度表現之細胞，除非調控序列引入宿主細胞中使得其與核酸可操作地連接。應理解，術語宿主細胞不僅係指特定個體細胞，且亦係指此一細胞之後代或潛在後代。由於因(例如)突變或環境影響可使後續各代發生某些改變，因此，此後代實際上可能與母細胞不同但卻仍包括於本文中所使用術語之範圍內。 術語「重組抗體」係指自經表現載體(或可能一種以上之表現載體)轉染之細胞或細胞系表現之抗體，該(等)表現載體包含抗體或其部分之編碼序列(例如，編碼重鏈或輕鏈之DNA序列)。在一個實施例中，該編碼序列不與細胞天然相關。在一個實施例中，重組抗體之醣基化模式不同於具有相同序列之抗體(若其係天然存在)之醣基化模式。在一個實施例中，重組抗體係在哺乳動物宿主細胞(其並非人類宿主細胞)中表現。值得注意的是，個別哺乳動物宿主細胞具有獨特之醣基化模式。 如本文中所使用，術語「有效量」係指結合STAT3之抗體或其抗原結合部分在投與個體時足以實現與如本文中所闡述之STAT3信號傳導相關之疾病之治療之量。本文所提供之抗體之治療有效量在單獨或組合使用時將端視抗體及組合之相對活性(例如，抑制細胞生長)且端視所治療之個體及疾病病狀、個體之體重及年齡、疾病病狀之嚴重性、投與方式及諸如此類(其可由熟習此項技術者容易地確定)而變化。 術語「經分離」係指實質上不含其他細胞材料之蛋白質(例如，抗體)。在一個實施例中，經分離之抗體實質上不含來自相同物種之其他蛋白質。在一個實施例中，經分離之抗體係由來自不同物種之細胞表現且實質上不含來自不同物種之其他蛋白質。可藉由使用業內熟知之蛋白質純化技術分離使得蛋白質實質上不含天然相關之組分(或與用於產生抗體之細胞表現系統相關之組分)。在一個實施例中，本發明之抗體或抗原結合片段經分離。 「中和抗體」或「抑制性抗體」係使用諸如本文實例中所闡述之彼等之分析，當過量之抗STAT3抗體使活化量降低至少約20%時，抑制STAT3之蛋白水解活化之抗體。在各個實施例中，抗原結合蛋白將STAT3之蛋白水解活化之量降低至少30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、99%及99.9%。 如本文中所使用，「細胞內遞送化合物」係指偶聯(共價或非共價)至抗原結合蛋白(例如，抗體或抗體片段)之化合物，其能夠將抗原結合蛋白內化至細胞中。細胞內遞送化合物(偶聯至抗體)之實例提供於圖1A及1B中。STAT3 抗原結合蛋白 本發明提供抗STAT3抗原結合蛋白(例如，抗體及其片段)以及其使用及製造方法。信號轉導子及轉錄活化子3 (STAT3)係細胞質轉錄因子之STAT家族之成員。STAT3係由STAT3基因編碼之轉錄因子，其具有17q21之人類基因圖基因座。人類STAT3係770個胺基酸之蛋白質且分子量為約88 kDa。 本發明係關於STAT3結合蛋白、尤其結合STAT3 (例如人類STAT3)之抗STAT3抗體或其抗原結合部分及其用途。本發明之各個態樣係關於抗體及抗體片段、醫藥組合物、用於製備此等抗體及片段之核酸、重組表現載體及宿主細胞。本發明亦涵蓋使用本發明之抗體檢測人類STAT3、在活體外或活體內抑制STAT3活性及預防或治療諸如癌症之病症之方法。 如下表4中所描述，本發明包括對STAT3具特異性之新穎抗體重鏈及輕鏈可變區。在一個實施例中，本發明提供抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈，該重鏈具有含有如SEQ ID No. 1及3中任一者所示之胺基酸序列之可變結構域。在一個實施例中，本發明提供抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈，該輕鏈具有含有如SEQ ID No. 2及4中任一者所示之胺基酸序列之可變結構域。在一個實施例中，本發明提供抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈，該輕鏈具有含有如SEQ ID No. 2及4中任一者所示之胺基酸序列之可變結構域；及重鏈，該重鏈具有含有如SEQ ID No. 1及3中任一者所示之胺基酸序列之可變結構域。 在一個實施例中，本發明包括抗STAT3抗體，其係IgG且包含四條多肽鏈，包括兩條各自包含重鏈可變結構域及重鏈恆定區CH1 、CH2 及CH3 之重鏈，及兩條各自包含輕鏈可變結構域及輕鏈恆定區(CL )之輕鏈。在某些實施例中，抗體係IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。重鏈及輕鏈可變結構域序列可選自本文中闡述於SEQ ID No: 1、2、3及/或4中之彼等。 互補決定區(CDR)稱作輕鏈及重鏈可變結構域二者中之超變區。可變結構域之保守程度較高之部分稱為框架(FR)。給定抗體之互補決定區(CDR)及框架區(FR)可使用由Kabat等人(見上文)、Lefranc等人(見上文)及/或Honegger及Pluckthun (見上文)所述之系統鑑別。業內人士亦熟悉Kabat等人所闡述之編號系統(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.)。就此而言，Kabat等人定義用於可變結構域序列、包括CDR鑑別之編號系統，其適用於任何抗體。 可將一或多個CDR以共價或非共價方式併入分子中以製得抗原結合蛋白。 抗原結合蛋白可併入CDR作為較大多肽鏈之一部分，可共價連接CDR與另一多肽鏈，或可以非共價方式併入CDR。CDR容許抗原結合蛋白特異性結合至所關注之特定抗原。 在某些實施例中，本發明提供抗STAT3抗體，其包含如表4中所述之重鏈及輕鏈可變結構域之CDR (SEQ ID No: 1至4)。舉例而言，本發明提供抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有如SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 3中任一者所示之胺基酸序列中所述之CDR。在一個實施例中，本發明提供抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有如SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 4中任一者所示之胺基酸序列中所述之CDR。在一個實施例中，本發明提供抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有如SEQ ID NO. 2及SEQ ID NO. 4中任一者所示之胺基酸序列中所述之CDR；及重鏈可變區，該重鏈可變區具有如SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 3中任一者所示之胺基酸序列中所述之CDR。 在一個實施例中，本揭示內容提供以10-6 M或更小之結合親和力結合至STAT3表位之IgG類全人類抗體，其具有與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致或100%一致之重鏈可變結構域序列；且其具有與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致、至少99%一致或100%一致之輕鏈可變結構域序列。 在一個實施例中，本發明提供抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含含有如SEQ ID No. 1或3中任一者所示之CDR3結構域之重鏈，且包含含有與如SEQ ID No. 1或3中任一者所示之序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列之可變結構域。在一個實施例中，本發明提供抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含含有如SEQ ID No. 2或4中任一者所示之CDR3結構域之輕鏈，且具有含有與如SEQ ID No. 2或4中任一者所示之序列至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列之輕鏈可變結構域。因此，在某些實施例中，CDR3結構域保持恆定，而重鏈及/或輕鏈之剩餘CDR及/或框架區中可引入可變性，而抗體或其抗原結合片段保留結合至STAT3之能力且保留母體之功能特性(例如，結合親和力)。 在一個實施例中，重鏈或輕鏈內進行之至少95%一致(或至少96%一致、或至少97%一致、或至少98%一致、或至少99%一致)之取代係保守胺基酸取代。「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基由具有具有類似化學性質(例如，電荷或疏水性)之側鏈(R基團)之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。在其中兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同之情形下，可向上調整序列一致性百分比或類似性程度以校正取代之保守性質。進行此調整之方式為熟習此項技術者所熟知。例如，參見Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331，其係以引用的方式併入本文中。具有類似化學性質之側鏈之胺基酸之基團的實例包括(1) 脂肪族側鏈：甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；(2) 脂肪族-羥基側鏈：絲胺酸及蘇胺酸；(3) 含有醯胺之側鏈：天冬醯胺及麩醯胺酸；(4) 芳香族側鏈：苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；(5) 鹼性側鏈：離胺酸、精胺酸及組胺酸；(6) 酸性側鏈：天冬胺酸鹽及麩胺酸鹽及(7) 含硫側鏈係半胱胺酸及甲硫胺酸。 在一個實施例中，本發明係關於具有表4中所述抗體之任一者之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。本發明之抗體(包括表4中所述之彼等)結合至人類STAT3。在一個實施例中，全人類抗體具有重鏈及輕鏈二者，其中抗體具有選自SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 (本文中稱為ST1A5)或SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4 (本文中稱為ST3G12)之重鏈/輕鏈可變結構域序列。 在一個實施例中，本發明係關於具有抗體ST1A5之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO: 1中所示之重鏈可變結構域序列，及如SEQ ID NO: 2中所示之輕鏈可變結構域序列。在一個實施例中，本發明係關於抗體，其具有包含SEQ ID NO: 1之CDR之重鏈可變結構域，及包含SEQ ID NO: 2之CDR之輕鏈可變結構域。在一個實施例中，本發明之特徵在於經分離之人類抗體或其抗原結合片段，其包含具有與SEQ ID NO: 1中所示之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之胺基酸序列之重鏈可變區，且包含具有與SEQ ID NO: 2中所示之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之胺基酸序列之輕鏈可變區。在一個實施例中，本發明之特徵在於抗STAT3抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有如SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有如SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列之CDR1結構域。抗體可進一步係IgG1或IgG4同型。 在一個實施例中，本發明係關於具有抗體ST3G12之抗原結合區之抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明提供抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO: 3中所示之重鏈可變結構域序列，及如SEQ ID NO: 4中所示之輕鏈可變結構域序列。在一個實施例中，本發明係關於抗體，其具有包含SEQ ID NO: 3之CDR之重鏈可變結構域，及包含SEQ ID NO:4之CDR之輕鏈可變結構域。在一個實施例中，本發明之特徵在於經分離之人類抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區具有與SEQ ID NO: 3中所示之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之胺基酸序列，且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區具有與SEQ ID NO: 4中所示之序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之胺基酸序列。在一個實施例中，本發明之特徵在於抗STAT3抗體或其抗原結合部分，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含含有如SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列之CDR1結構域；且包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含含有如SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列之CDR1結構域。抗體可進一步係IgG1、IgG2、IgG2或IgG4同型。在特定實施例中，抗體係IgG1或IgG4同型。 應注意，通篇中所提及抗體(及相應序列)之名稱前可互換地具有或不具有「ST」。舉例而言，抗體名稱「ST1A5」在本文中亦稱為「1A5」。 本發明之抗原結合蛋白之抗原結合片段可藉由習用技術產生。此等片段之實例包括(但不限於) Fab及F(ab’)2片段。 在某些實施例中，本揭示內容提供Fab全人類抗體片段，其具有來自重鏈之可變結構域區及來自輕鏈之可變結構域區，其中該Fab全人類抗體片段具有與選自由SEQ ID No. 1或3組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之重鏈可變結構域序列，且該Fab全人類抗體片段具有與選自由SEQ ID No. 2或4組成之群之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之輕鏈可變結構域序列。 較佳地，全人類抗體Fab片段具有重鏈可變結構域區及輕鏈可變結構域區二者，其中抗體具有選自SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4之重鏈/輕鏈可變結構域序列。 單鏈抗體可藉由用胺基酸橋(較短之肽連接體)連接重鏈及輕鏈可變結構域(Fv區)片段來形成，從而產生單一多肽鏈。此等單鏈Fv (scFv)藉由將編碼肽連接體之DNA融合在編碼兩種可變結構域多肽(VL 及VH )之DNA之間來製備。所得多肽可自身向後摺疊以形成抗原結合單體，或其可形成多聚體(例如，二聚體、三聚體或四聚體)，此取決於兩個可變結構域之間之撓性連接體之長度(Kortt等人，1997,Prot. Eng. 10:423；Kortt等人，2001,Biomol. Eng. 18:95-108)。藉由組合包含不同VL 及VH 之多肽，可形成結合至不同表位之多聚scFv (Kriangkum等人，2001,Biomol. Eng. 18:31-40)。開發用於產生單鏈抗體之技術包括闡述於以下中之彼等：美國專利4,946,778；Bird, 1988,Science 242:423；Huston等人，1988,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879；Ward等人，1989,Nature 334:544；de Graaf等人，2002,Methods Mol. Biol. 178:379-87。 在一個實施例中，本揭示內容提供單鏈人類抗體，其具有來自重鏈之可變結構域區及來自輕鏈之可變結構域區及連結重鏈及輕鏈可變結構域區之肽連接體，其中該單鏈人類抗體具有與選自SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 3之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之重鏈可變結構域序列，且該單鏈人類抗體具有與選自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4之胺基酸序列至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之輕鏈可變結構域序列。在一個實施例中，全人類單鏈抗體具有重鏈可變結構域區及輕鏈可變結構域區二者，其中該單鏈全人類抗體具有選自SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4之重鏈/輕鏈可變結構域序列。 已知用於自所關注抗體衍生不同亞類或同型之抗體之技術，即，亞類切換。因此，例如，IgG抗體可源自IgM抗體且反之亦然。此等技術容許製備新穎抗體，該等新穎抗體具有給定抗體(母體抗體)之抗原結合性質，但亦展現與不同於母體抗體之抗體同型或亞類有關之生物學性質。可採用重組DNA技術。編碼特定抗體多肽之選殖DNA可用於此等程序中，例如，編碼期望同型抗體之恆定結構域之DNA (Lantto等人，2002,Methods Mol. Biol. 178:303-16)。此外，若期望IgG4，則亦可期望在鉸鏈區中引入點突變(CPSCP-＞CPPCP) (分別SEQ ID No. 5及6) (Bloom等人，1997,Protein Science 6:407)以減輕形成H鏈內二硫鍵之趨勢，該等H鏈內二硫鍵可在IgG4抗體中產生異質性。因此，在一個實施例中，本發明之抗體係人類IgG1抗體。因此，在一個實施例中，本發明之抗體係人類IgG4抗體。 本揭示內容提供結構上特徵在於其可變結構域區之胺基酸序列之多種抗體。然而，胺基酸序列可經歷一些改變，同時保留與其特異性靶標之高程度結合。更具體而言，可變結構域區中之許多胺基酸可經改變具有保守取代且可預測所得抗體之結合特性將不會不同於野生型抗體序列之結合特性。抗體可變結構域中存在許多並不與抗原直接相互作用或影響抗原結合之胺基酸且其對於確定抗體結構並非至關重要。舉例而言，所揭示抗體中之任一者中之預測非必需胺基酸殘基較佳經來自相同種類之另一胺基酸殘基代替。鑑別不消除抗原結合之胺基酸保守取代之方法為業內所熟知(例如，參見Brummell等人，Biochem. 32: 1180-1187 (1993)；Kobayashi等人，Protein Eng. 12(10):879-884 (1999)；及Burks等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997))。Near等人，Mol. Immunol . 30:369-377, 1993解釋如何藉助定點誘變影響或不影響結合。Near等人僅使其認為具有改變抗體結合之高機率之殘基突變。大部分對結合親和力(Near等人，表3)及結合至地高辛(digoxin)之不同形式(Near等人，表2)具有中等或陰性效應。 因此，在某些實施例中，本發亦包括與本文中所揭示之彼等序列具有至少95%一致性之可變序列。 在某些實施例中，本文中所提供之抗體或其抗原結合片段之解離常數(KD )為1 × 10-6 M或更小；5 × 10-7 M或更小；1 × 10-7 M或更小；5 × 10-8 M或更小；1 × 10-8 M或更小；5 × 10-9 M或更小；或1 × 10-9 M或更小。在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段之KD 為1 × 10-7 M至1 × 10-10 M。在一個實施例中，本發明之抗體或其抗原結合片段之KD 為1 × 10-8 M至1 × 10-10 M。 熟習此項技術者將瞭解已知用於測定抗體或其片段之KD 之標準方法。舉例而言，在一個實施例中，KD 係藉由經放射標記之抗原結合分析(RIA)來量測。在一個實施例中，RIA係利用所關注抗體及其抗原之Fab型式實施。舉例而言，Fab對抗原之溶液結合親和力係藉由以下來量測：在滴定系列之未標記抗原存在下，利用最低濃度之(125 I)標記之抗原平衡Fab，隨後利用抗Fab抗體塗覆之板捕獲所結合抗原(例如，參見Chen等人，J. Mol. Biol. 293:865-881(1999))。 根據另一實施例，KD 係使用BIACORE表面電漿共振分析來量測。如本文中所使用，術語「表面電漿共振」係指使得可藉由使用(例如) BIACORE系統(Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ)檢測生物感測器基質內之蛋白質濃度變化來分析實時相互作用之光學現象。 在特定實施例中，本發明之抗原結合蛋白對STAT3之結合親和力(Ka )為至少106 M-1 。在其他實施例中，抗原結合蛋白展現至少107 M-1 、至少108 M-1 、至少109 M-1 或至少1010 M-1 之Ka 。在特定實施例中，本發明之抗原結合蛋白對STAT3之結合親和力(Ka )為106 M-1 或更小。在其他實施例中，抗原結合蛋白展現107 M-1 或更小、108 M-1 或更小、109 M-1 或更小、1010 M-1 或更小之Ka 。在另一實施例中，抗原結合蛋白展現與本文實例中所闡述之抗體之Ka 實質上相同之Ka 。 在另一實施例中，本揭示內容提供自STAT3解離速率低之抗原結合蛋白。在一個實施例中，抗原結合蛋白之K解離 為1 × 10-4 sec-1 至1 × 10-1 sec-1 或更低。在另一實施例中，K解離 為5 × 10-5 sec-1 至5 × 10-1 sec-1 或更低。在另一實施例中，K解離 與本文中所闡述之抗體實質上相同。在另一實施例中，抗原結合蛋白以與本文中所闡述之抗體實質上相同之K解離 結合至STAT3。 在另一態樣中，本揭示內容提供抑制STAT3之活性之抗原結合蛋白。在一個實施例中，抗原結合蛋白之IC50 為1000 nM或更低。在另一實施例中，IC50 為100 nM或更低；在另一實施例中，IC50 為10 nM或更低。在另一實施例中，IC50 與本文實例中所闡述之抗體之IC50 實質上相同。在另一實施例中，抗原結合蛋白以與本文中所闡述之抗體實質上相同之IC50 抑制STAT3之活性。 在另一態樣中，本揭示內容提供活體外或活體內(例如，在投與人類個體時)半衰期為至少一天之抗原結合蛋白。在一個實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為至少三天。在另一實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為四天或更長。在另一實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為八天或更長。在另一實施例中，抗原結合蛋白經衍生或經修飾使得其與未經衍生或未經修飾之抗原結合蛋白相比具有更長之半衰期。在另一實施例中，抗原結合蛋白含有一或多個點突變以增加血清半衰期，例如WO2000/09560中所闡述，其係以引用的方式併入本文中。 本揭示內容進一步提供多特異性抗原結合蛋白，例如，雙特異性抗原結合蛋白，例如經由兩個不同的抗原結合位點或區結合至STAT3之兩個不同表位或STAT3之表位及另一分子之表位之抗原結合蛋白。此外，如本文中所揭示之雙特異性抗原結合蛋白可包含來自本文中所述抗體中之一者之STAT3結合位點及來自本文中所述抗體中之另一者之第二STAT3結合區，包括藉由參照其他公開案之本文中所闡述之彼等。或者，雙特異性抗原結合蛋白可包含來自本文中所述抗體中之一者之抗原結合位點及來自業內已知之另一STAT3抗體或來自藉由已知方法或本文中所述方法製備之抗體的第二抗原結合位點。 業內已知多種製備雙特異性抗體之方法。此等方法包括使用如Milstein等人，1983,Nature 305:537所闡述之雜交-雜交瘤，及抗體片段之化學偶合(Brennan等人，1985,Science 229:81；Glennie等人，1987,J. Immunol . 139:2367；美國專利6,010,902)。此外，雙特異性抗體可經由重組方式、例如藉由使用白胺酸拉鍊部分(即，來自Fos 及Jun 蛋白，其優先形成異二聚體；Kostelny等人，1992,J. Immunol .148:1547)或如美國專利5,582,996中所述之其他鎖與鑰匙相互作用性結構域結構來產生。其他可用技術包括美國專利5,959,083及5,807,706中所闡述之彼等。 在另一態樣中，抗原結合蛋白包含抗體之衍生物。經衍生之抗體可包含賦予抗體期望性質(例如特定用途中之增加半衰期)之任何分子或物質。經衍生之抗體可包含(例如)可檢測(或標記)部分(例如，放射性、比色、抗原性或酶分子)、可檢測珠粒(例如磁性或電子緻密(例如，金)珠粒)、或結合至另一分子(例如，生物素或鏈黴抗生物素)之分子、治療或診斷部分(例如，放射性、細胞毒性或醫藥活性部分)、或增加抗體對於特定用途(例如，投與個體(例如人類個體)、或其他活體內或活體外用途)之適用性之分子。可用於衍生化抗體之分子之實例包括白蛋白(例如，人類血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。抗體之白蛋白連接及聚乙二醇化衍生物可使用業內熟知之技術製備。在一個實施例中，抗體偶聯或以其他方式連接至轉甲狀腺素蛋白(TTR)或TTR變體。TTR或TTR變體可經(例如)選自由以下組成之群之化學物質化學修飾：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇及聚乙烯醇。 在某些實施例中，抗STAT3抗體或其抗原結合片段偶聯至細胞內遞送化合物。在一個實施例中，本發明提供圖1A或圖1B之化合物。圖1A係本發明之例示性抗體偶聯物之圖式，該例示性抗體偶聯物包含式(I)或其醫藥上可接受之鹽，其中X、q、Ba、R1、r、t、L、及AT 中之每一者係如PCT/US2016/057576中所定義及闡述，該案係以全文引用的方式併入本文中。 在一個實施例中，本發明提供具有式I 之化合物：
Figure TW201800418AD00001
(I )； 其中， 每一Ba係獨立地選自腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及胸腺嘧啶(T)； X係O或S； 每一R1 係獨立地選自氫及經螢光團取代之(C1 -C6 )烷基； q係12至35之整數； r係1至10之整數； t係1至10之整數； L係-CH2 -R2 -*； R2 係經1或2個選自以下之基團取代之-(C1 -C6 )烷基：-C(=O)NRa 、-NRa C(=O)Rb 、-NRa C(=O)Rd 、=NORe 、-NRa 、-NRa Rb 、-ORb 、-S(O)k Rb 、-NRa S(O)2 Rb 、-S(O)2 NRa Rb 、-S(O)2 NRa 、-C(=O)ORb 、-OC(=O)ORb 、-OC(=O)Rb 、-C(=O)NRa Rb 、-NRa C(=O)Rb 、-NRa C(=O)ORb 、-OC(=O)NRa Rb 、苯基、-OC(=O)NRa 、-NRa C(=O)NRa Rb 、-NRa C(=O)NRa 、-NRa (C=S)NRa Rb 、-NRa (C=S)NRa 及-C(=O)Rb ； k係0、1或2； 每一Ra 獨立地係氫或視情況經Rf 取代之(C1 -C6 )烷基； 每一Rb 獨立地係視情況經Rf 或-C(=O)Rf 取代之(C1 -C6 )烷基； Rd 係-[(C1 -C6 )烷基-O-(C1 -C6 )烷基]v C(=O)NH； Re 係-[(C1 -C6 )烷基-O-(C1 -C6 )烷基]p C(=O)； 每一Rf 獨立地係
Figure TW201800418AD00002
或
Figure TW201800418AD00003
，其中波浪鍵指示至由Ra 所定義之(C1 -C6 )烷基或各自由Rb 所定義之(C1 -C6 )烷基或羰基之附接點； Rg 係(C1 -C6 )烷基或-[(C1 -C6 )烷基-O-(C1 -C6 )烷基]w C(=O)NH； 環A係
Figure TW201800418AD00004
或
Figure TW201800418AD00005
，其中虛鍵指示至Rf 之三唑基之附接點，且波浪鍵指示至由所Ra 定義之(C1 -C6 )烷基或各自由Rb 所定義之(C1 -C6 )烷基或羰基之附接點； p係1至10之整數； v係1至10之整數； w係2至12之整數； *指示至AT 之附接點；且 AT 係抗體。 在一個實施例中，抗體偶聯物係圖1B中所示之結構。圖1B係本發明之例示性抗體偶聯物化合物901a之圖式，其中抗體(AT)係ST3G12且圖1A中之一個R1係烷基螢光團部分。化合物901a在實例5中測試。 在一個實施例中，抗體偶聯物係圖1C中所示之結構。圖1C係本發明之例示性抗體偶聯物化合物901之圖式，其中抗體(AT)係ST3G12且圖1A中之每一R1係氫。化合物901在實例2-10中測試。 可採用含有一或多種抗原結合蛋白之寡聚物作為STAT3拮抗劑。寡聚物可呈共價連接或非共價連接之二聚體、三聚體或更高寡聚物形式。涵蓋使用包含兩種或更多種抗原結合蛋白之寡聚物，其中一個實例係同二聚體。其他寡聚物包括異二聚體、同三聚體、異三聚體、同四聚體、異四聚體等。 一個實施例係關於包含經由融合至抗原結合蛋白之肽部分之間之共價或非共價相互作用聯結的多種抗原結合蛋白之寡聚物。此等肽可為肽連接體(間隔體)或具有促進寡聚化之性質的肽。白胺酸拉鍊及某些源自抗體之多肽屬可促進肽所附接之抗原結合蛋白之寡聚化的肽，如下文更詳細地闡述。 在特定實施例中，寡聚物包含兩種至四種抗原結合蛋白。寡聚物之抗原結合蛋白可呈任何形式，例如上文所述形式中之任一者，例如變體或片段。較佳地，寡聚物包含具有STAT3結合活性之抗原結合蛋白。 製備寡聚物抗原結合蛋白之另一方法涉及使用白胺酸拉鍊。白胺酸拉鍊結構域係促進其中發現有該等結構域之蛋白質寡聚化之肽。白胺酸拉鍊最初係在若干種DNA結合蛋白中鑑別出(Landschultz等人，1988,Science 240:1759)，且此後發現其存於各種不同蛋白質中。已知白胺酸拉鍊係天然肽及其二聚化或三聚化之衍生物。適於產生可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鍊結構域之實例闡述於WO 94/10308中，且源自肺表面活性蛋白質D (SPD)之白胺酸拉鍊闡述於Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344:191中。容許與其融合之異源蛋白之穩定三聚化之經修飾白胺酸拉鍊之使用闡述於Fanslow等人，1994,Semin. Immunol . 6:267-78中。在一種方法中，在適宜宿主細胞中表現包含融合至白胺酸拉鍊肽之抗STAT3抗體片段或衍生物之重組融合蛋白，且自培養上清液回收其形成之可溶性寡聚抗STAT3抗體片段或衍生物。 針對STAT3之抗原結合蛋白可用於(例如)分析中以檢測活體外或活體內STAT3多肽之存在。抗原結合蛋白亦可用於藉由免疫親和層析純化STAT3蛋白。封阻抗原結合蛋白可用於本文中所揭示之方法中。用作STAT3拮抗劑之此等抗原結合蛋白可用於治療任何STAT3誘發之病狀，包括(但不限於)各種癌症。 抗原結合蛋白可用於活體外程序，或活體內投與以抑制STAT3誘導之生物活性。因此可治療將受益於(直接或間接) STAT3之活化之病症，本文中提供其實例。在一個實施例中，本發明提供治療方法，其包含向有需要之哺乳動物活體內投與有效降低STAT3誘導之生物活性之量的STAT3封阻抗原結合蛋白。 在本發明之某些實施例中，抗原結合蛋白包括抑制STAT3之生物活性之全人類單株抗體。 包括本文中所闡述之抗體及抗體片段之抗原結合蛋白可藉由多種習用技術中之任一者製備。舉例而言，其可自天然表現其之細胞純化(例如，抗體可自產生其之雜交瘤純化)，或使用業內已知之任何技術在重組表現系統中產生。例如，參見Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet等人(編輯), Plenum Press, New York (1980)；及Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow及Land (編輯), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1988)。 可使用業內已知之任何表現系統來製備重組多肽，包括本發明之本文中所闡述之抗體及抗體片段。一般而言，宿主細胞係經包含編碼所期望多肽之DNA之重組表現載體轉形。其中可採用之宿主細胞係原核生物、酵母或更高級之真核細胞。原核生物包括革蘭氏(gram)陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌(bacilli )。更高級之真核細胞包括昆蟲細胞及哺乳動物來源之確立細胞系。適宜哺乳動物宿主細胞系之實例包括猴腎COS-7細胞系(ATCC CRL 1651) (Gluzman等人，1981,Cell 23:175)、L細胞、293細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL 163)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、BHK (ATCC CRL 10)細胞系及源自非洲綠猴腎細胞系CV1之CV1/EBNA細胞系(ATCC CCL 70) (如McMahan等人，1991,EMBO J . 10:2821中所闡述)。Pouwels等人闡述與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之適當選殖及表現載體(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., 1985)。 經轉形細胞可在促進多肽之表現之條件下培養，且多肽係藉由習用蛋白質純化程序回收。一種此純化程序包括(例如)在全部或一部分(例如，細胞外結構域) STAT3結合至其之基質上使用親和層析。預期用於本文中之多肽包括實質上不含污染內源材料之實質上同質之重組哺乳動物抗STAT3抗體多肽。 可藉由多種已知技術中之任一者針對期望性質製備並篩選抗原結合蛋白。某些技術涉及分離編碼所關注抗原結合蛋白(例如，抗STAT3抗體)之多肽鏈(或其一部分)之核酸，及藉助重組DNA技術操縱核酸。例如，可將核酸融合至另一所關注核酸，或改變(例如，藉由誘變或其他習用技術)以添加、缺失或取代一或多個胺基酸殘基。 本揭示內容之多肽可使用業內已知之任何標準方法來製備。在一個實例中，多肽係藉由重組DNA方法藉由將編碼該多肽之核酸序列(例如，cDNA)插入至重組表現載體中並使該DNA序列在促進表現之條件下表現來產生。 編碼本文中所揭示之各種多肽之任一者之核酸可以化學方式合成。可選擇密碼子使用以改良細胞中之表現。此等密碼子使用將取決於所選擇之細胞類型。已針對大腸桿菌及其他細菌以及哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞及昆蟲細胞開發專門的密碼子使用模式。 核酸操作之一般技術闡述於(例如) Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual , 第1-3卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第2版, 1989，或F. Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing and Wiley-Interscience: New York, 1987)及定期更新，其係以引用的方式併入本文中。編碼多肽之DNA可操作地連接至源自哺乳動物、病毒或昆蟲基因之適宜轉錄或轉譯調控元件。此等調控元件包括轉錄啟動子、控制轉錄之可選操縱子序列、編碼適宜mRNA核糖體結合位點之序列及控制轉錄及轉譯終止之序列。另外併入通常由複製起點賦予之在宿主中複製之能力及有助於識別轉形體之選擇基因。 重組DNA亦可包括可用於純化蛋白質之任何類型之蛋白質標籤序列。蛋白質標籤之實例包括(但不限於)組胺酸標籤、FLAG標籤、myc標籤、HA標籤或GST標籤。與細菌、真菌、酵母及哺乳動物細胞宿主一起使用之適當選殖及表現載體可參見Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, N.Y., 1985)。 使用適於宿主細胞之方法向宿主細胞中引入表現構築體。向宿主細胞中引入核酸之各種方法為業內已知，其包括(但不限於)電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖或其他受質之轉染；微粒轟擊；脂轉染；及感染(其中載體係傳染原)。適宜宿主細胞包括原核生物、酵母、哺乳動物細胞或細菌細胞。 適宜細菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性有機體，例如大腸桿菌或芽孢桿菌屬。亦可使用酵母、較佳地來自酵母菌屬(Saccharomyces )物種(例如啤酒酵母(S. cerevisiae ))來產生多肽。亦可採用各種哺乳動物或昆蟲細胞培養系統來表現重組蛋白質。Luckow及Summers (Bio/Technology , 6:47, 1988)對在昆蟲細胞中產生異源蛋白質之桿狀病毒(Baculovirus )系統進行了綜述。適宜哺乳動物宿主細胞系之實例包括內皮細胞、COS-7猴腎細胞、CV-1、L細胞、C127、3T3、中國倉鼠卵巢(CHO)、人類胚腎細胞、HeLa、293、293T及BHK細胞系。藉由培養適宜宿主/載體系統以表現重組蛋白質來製備經純化多肽。對於許多應用而言，本文中所揭示之許多多肽之較小大小將使在大腸桿菌中之表現成為較佳表現方法。然後自培養基或細胞提取物純化蛋白質。 亦可使用細胞轉譯系統來產生蛋白質。出於此等目的，必須對編碼多肽之核酸進行修飾以容許進行活體外轉錄以產生mRNA，並容許mRNA在所用無特定細胞之系統(無真核生物(例如哺乳動物或酵母)細胞轉譯系統或無原核生物(例如細菌)細胞轉譯系統)中進行無細胞轉譯。 STAT3結合多肽亦可藉由化學合成(例如藉由闡述於Solid Phase Peptide Synthesis, 第2版, 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.中之方法)來產生。對蛋白質之修飾亦可藉由化學合成來產生。 本揭示內容之多肽可藉由蛋白質化學領域中通常已知之用於蛋白質之分離/純化方法來純化。非限制性實例包括萃取、再結晶、鹽析(例如，利用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附層析、離子交換層析、疏水層析、正相層析、反相層析、凝膠過濾、凝膠滲透層析、親和層析、電泳、反流分佈或該等方法之任何組合。在純化後，多肽可交換至不同緩衝液中及/或藉由業內已知之各種方法中之任一者(包括但不限於過濾及透析)來濃縮。 經純化之多肽較佳地至少85%純、更佳地至少95%純且最佳地至少98%純。無論純度之確切數值為多少，多肽之純度均足以用作醫藥產品。 在某些實施例中，本揭示內容提供結合至STAT3之單株抗體。單株抗體可使用業內已知之任何技術來產生，例如，藉由在免疫時間表完成後使自轉基因動物收穫之脾細胞永生化。可使用業內已知之任何技術使脾細胞永生化，例如，藉由使其與骨髓瘤細胞融合來產生雜交瘤。用於產生雜交瘤之融合程序中之骨髓瘤細胞較佳不產生抗體，具有高融合效率，且具有使其不能在某些僅支持期望融合細胞(雜交瘤)生長之選擇性培養基中生長之酶缺陷。用於小鼠融合中之適宜細胞系之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XX0 Bul；用於大鼠融合中之細胞系之實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及48210。可用於細胞融合之其他細胞系係U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。 本發明之抗原結合蛋白之抗原結合片段可藉由業內已知之習用技術來產生。多肽之轉譯後修飾 在某些實施例中，本發明之結合多肽可進一步包含轉譯後修飾。例示性轉譯後蛋白質修飾包括磷酸化、乙醯化、甲基化、ADP-核醣基化、泛蛋白化、醣基化、羰基化、sumo化、生物素化或添加多肽側鏈或疏水基團。因此，經修飾之可溶性多肽可含有非胺基酸元件，例如脂質、多醣或單醣及磷酸鹽。醣基化之較佳形式係唾液酸化，其將一或多個唾液酸部分偶聯至多肽。唾液酸部分改良溶解性及血清半衰期，同時亦降低蛋白質之可能免疫原性。參見Raju等人，Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76。 在一個實施例中，標的可溶性多肽之經修飾形式包含將標的可溶性多肽連接至非蛋白質性聚合物。在一個實施例中，聚合物係聚乙二醇(「PEG」)、聚丙二醇或聚氧化烯烴，以如美國專利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中所述之方式。 PEG係市售或可藉由乙二醇之開環聚合根據業內熟知之方法所製備之水溶性聚合物(Sandler及Karo，Polymer Synthesis, Academic Press, New York，第3卷，第138-161頁)。術語「PEG」廣泛地用來涵蓋任何聚乙二醇分子，而不慮及大小或PEG末端之修飾，且可由下式表示：X--O(CH2 CH2 O)n -CH2 CH2 OH (1)，其中n係20至2300且X係H或末端修飾，例如，C1-4 烷基。在一個實施例中，本發明之PEG在一端上以羥基或甲氧基封端，即X係H或CH3 (「甲氧基PEG」)。PEG可含有其他化學基團，其係結合反應所需；其自分子之化學合成產生；或其係分子之部分之最佳距離的間隔體。另外，此PEG可由一或多個連接在一起之PEG側鏈組成。具有一個以上PEG鏈之PEG稱作多臂或具支鏈PEG。具支鏈PEG可(例如)藉由向各種多元醇(包括甘油、新戊四醇及山梨醇)添加聚環氧乙烷來製備。舉例而言，四臂具支鏈PEG可自新戊四醇及環氧乙烷來製備。具支鏈PEG闡述於(例如) EP-A 0 473 084及美國專利5,932,462中。PEG之一種形式包括經由離胺酸之一級胺基連接之兩個PEG側鏈(PEG2) (Monfardini等人，Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69)。 經PEG修飾之多肽之血清清除率相對於未經修飾之結合多肽之清除率可減小約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或甚至90%。經PEG修飾之多肽可具有相對於未經修飾之蛋白質之半衰期增加之半衰期(t1/2 )。PEG結合多肽之半衰期相對於未經修飾之結合多肽之半衰期可增加至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、400%或500%或甚至1000%。在一些實施例中，在活體外(例如在緩衝鹽水溶液或血清)中測定蛋白質半衰期。在其他實施例中，蛋白質半衰期係活體內半衰期，例如動物之血清或其他體液中之蛋白質之半衰期。治療方法、調配物及投與模式 本文中所揭示之抗體或抗原結合片段中之任一者可用於此等治療方法中。 本揭示內容進一步提供治療特徵可在於異常細胞增殖之疾病或病狀(例如癌症)之方法，其包含投與選自由以下組成之群之抗STAT3抗原結合蛋白：以至少10-6 M之結合親和力結合至STAT3表位之IgG類完全人類抗體、具有來自重鏈之可變結構域區及來自輕鏈之可變結構域區之Fab完全人類抗體片段、具有來自重鏈之可變結構域區及來自輕鏈之可變結構域區及連結該等重鏈及輕鏈可變結構域區之肽連接體之單鏈人類抗體，其包括表4中SEQ ID No. 1-4中所述之重鏈及輕鏈可變區或SEQ ID No 7-18中所述之CDR結構域。 本發明之治療方法及組合物中可使用之抗STAT3抗體及抗原結合片段之實例於上文中闡述。 在一個實施例中，本發明之抗STAT3抗體及抗體片段用於治療癌症。如上文所論述，本發明之抗STAT3抗體及抗體片段可用於治療或預防特徵可在於異常細胞增殖之任何疾病或病狀(例如癌症)。許多人類實體及血液腫瘤具有組成型STAT3活性(Yue等人， Expert Opin Investig Drugs. 2009年1月；18(1): 45-56)。因此，本發明之抗體及抗原結合片段可治療任何具有組成型STAT3活性之癌症。在某些實施例中，癌症係實體腫瘤。在其他實施例中，癌症選自由以下組成之群：黑色素瘤、神經膠質瘤、髓母細胞瘤、腎細胞癌、胰臟腺癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、神經膠母細胞瘤、乳癌、胰臟癌、卵巢、前列腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸癌及腎癌。在一個實施例中，癌症係血液癌。在另一實施例中，血液癌係選自急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病、慢性髓單核球性白血病(CMML)、幼年型髓單核球性白血病(JMML)、巨核細胞性白血病及大顆粒淋巴球白血病。 在一個實施例中，本發明之抗STAT3抗體及抗體片段可單獨投與或與一或多種額外療法(例如化學療法、放射療法、免疫療法、手術介入或該等之任何組合)組合投與。長期療法同樣可能在其他治療策略之情形中作為輔助療法，如上文所述。 在此等方法之某些實施例中，一或多種本發明之抗STAT3抗體及抗體片段可一起(同時)或於不同時間(依序)投與。另外，本發明之抗STAT3抗體及抗體片段可與另一類型之用於治療癌症或用於抑制血管生成之化合物一起投與。 在某些實施例中，本發明之抗STAT3抗體及抗體片段可單獨使用。 在某些實施例中，出於診斷目的，本發明之抗STAT3抗體及抗體片段可經標記或未經標記。通常，診斷分析需要檢測由於結合多肽至STAT3之結合所產生之複合物之形成。類似於抗體，本發明之抗STAT3抗體及抗體片段可直接經標記。可採用各種標記，包括(但不限於)放射性核種、螢光劑、酶、酶受質、酶輔因子、酶抑制劑及配體(例如，生物素、半抗原)。多種適當免疫分析為熟習此項技術者所已知(例如，參見美國專利3,817,827；3,850,752；3,901,654；及4,098,876)。結合蛋白質在未經標記時可用於諸如凝集分析之分析中。未經標記之結合蛋白質亦可與另一(一或多種)可用於檢測結合多肽之適宜試劑組合使用，例如與結合蛋白質反應之經標記抗體或其他適宜試劑(例如，經標記之蛋白質A)。 投與之技術及劑量端視具體結合蛋白質之類型及所治療之具體病狀而變，但可由熟習此項技術者容易地確定。一般而言，管理機構要求欲用作治療劑之蛋白質試劑經調配以便具有可接受低含量之熱原。因此，治療調配物與其他調配物之區別之處通常在於其實質上不含熱原，或至少含有不超過可接受含量之熱原，如由適當管理機構(例如，FDA)所測定。 包含本揭示內容之抗原結合蛋白之治療組合物可與醫藥上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑以單位劑型一起投與。作為非限制性實例，投與可為非經腸(例如，靜脈內、皮下)、經口或局部。另外，可採用使用編碼本發明之多肽之核酸的任何基因療法技術，例如裸DNA遞送、重組基因及載體、基於細胞之遞送(包括患者細胞之離體操控)及諸如此類。 因此，本發明之抗STAT3抗體或其抗原結合部分可併入至適於非經腸投與之醫藥組合物中。較佳地，抗STAT3抗體或其抗原結合部分將製備為含有0.1-250 mg/ml抗體之可注射溶液。可注射溶液可由於硬質或琥珀色小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或凍乾劑型構成。緩衝液可為pH 5.0至7.0 (最佳pH 6.0)之L-組胺酸(1-50 mM，最佳5-10 mM)。其他適宜緩衝液包括(但不限於)琥珀酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可使用氯化鈉以改變濃度為0-300 mM (對於液體劑型，最佳150 mM)之溶液之毒性。凍乾劑型可包括主要為0-10%蔗糖(最佳0.5-1.0%)之低溫保護劑。其他適宜低溫保護劑包括海藻糖及乳糖。凍乾劑型可包括主要為1-10%甘露醇(最佳為2-4%)之增積劑。穩定劑可用於液體及凍乾劑型二者中，主要為1-50 mM L-甲硫胺酸(最佳5-10 mM)。其他適宜增積劑包括甘胺酸、精胺酸，其可作為0-0.05%聚山梨醇酯-80(最佳0.005-0.01%)來納入。其他表面活性劑包括(但不限於)聚山梨醇酯20及BRIJ表面活性劑。 本發明之組合物可呈各種形式。該等形式包括(例如)液體、半固體及固體劑型，例如液體溶液(例如，可注射及可輸注溶液)、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、脂質體及栓劑。較佳形式取決於預期投予模式及治療應用。典型較佳組合物呈可注射或可輸注溶液形式，例如與用於以其他抗體對人類進行被動免疫之彼等類似之組合物。較佳投與模式係非經腸(例如，靜脈內、皮下、腹膜內、肌內)。在較佳實施例中，本文中所闡述之抗STAT3抗體或其抗原結合部分係藉由靜脈內輸注或注射來投與。在另一較佳實施例中，抗STAT3抗體或其抗原結合部分係藉由肌內或皮下注射來投與。 通常，治療組合物必須無菌且在製造及儲存條件下穩定。可將組合物調配為溶液、微乳液、分散液、脂質體或其他適於高藥物濃度之有序結構。無菌可注射溶液可藉由以下來製備：將活性化合物(即抗體或抗體部分)以所需量併入具有上文所列舉成分中之一者或組合(若需要)之適當溶劑中，隨後過濾滅菌。通常，藉由將活性化合物併入至含有基本分散介質及來自上文所列舉之彼等之所需其他成分之無菌媒劑中來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶液之無菌凍乾粉劑之情形中，較佳製備方法係真空乾燥及噴霧乾燥，其可產生活性成分加任何其他期望成分(來自其先前無菌過濾之溶液)之粉劑。可藉由(例如)使用諸如卵磷脂之包衣、藉由在分散液情形中維持所需粒徑及藉由使用表面活性劑來維持溶液之適當流動性。可藉由在組合物中包括延遲吸收之試劑(例如，單硬脂酸鹽及明膠)使可注射組合物之吸收延長。 本發明之抗STAT3抗體或其抗原結合部分可藉由業內已知之各種方法來投與，但對於許多治療應用，較佳投與途徑/模式係皮下注射、靜脈內注射或輸注。如熟習此項技術者將瞭解，投予途徑及/或模式可端視所期望之結果而變化。在某些實施例中，活性化合物可用將保護該化合物免於快速釋放之載劑(例如受控釋放調配物，包括植入物、經皮貼劑及微囊化遞送系統)來製備。可使用生物可降解之生物相容聚合物，例如乙烯基乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此等調配物之許多方法已獲得專利權或通常為熟習此項技術者所已知。例如，參見Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson編輯，(Marcel Dekker, Inc., New York, 1978)。 治療有效劑量係指投與其會產生治療效應之劑量。確切劑量將取決於所治療之病症，且可由熟習此項技術者使用已知技術來確定。一般而言，多肽係以約0.01 μg/kg/天至約50 mg/kg/天、較佳0.01 mg/kg/天至約30 mg/kg/天、最佳0.1 mg/kg/天至約20 mg/kg/天來投與。多肽可每日(例如，每日一次、兩次、三次或四次)或較佳地較不頻繁(例如，每週、每兩週、每三週、每月或每季度)給予。另外，如業內所已知，可能需要針對年齡以及體重、一般健康狀況、性別、飲食、投與時間、藥物相互作用及疾病之嚴重性進行調整。 其他實施例闡述於以下非限制性實例中。實例 實例 1. 抗 STAT3 抗體序列 針對治療特性鑑別並選擇對人類STAT3具特異性之重組人類抗體，該治療特性包括對人類STAT3之特異性及對STAT3之高親和力(例如，至少10-6 M))進行選擇。所鑑別之抗STAT3抗體(稱為抗體ST1A5及ST3G12)之重鏈及輕鏈可變結構域之胺基酸序列及其互補決定區(CDR)闡述於表1中。表 1. 重鏈及輕鏈可變結構域及 CDR 之胺基酸序列
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 實例 2. STAT3 抗體結合 表現及純化三種抗STAT3抗體，即，ST1A5、ST3G12、ST5G12。名稱1A5、3G12及5G12分別係指ST1A5、ST3G12及ST5G12，且通篇可互換使用。 在酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析中測試抗體純系ST1A5、ST3G12、ST5G12之結合以評價候選抗STAT3抗體至重組人類STAT3蛋白質之結合。將U251惡性神經膠母細胞瘤細胞接種於96孔板中過夜。將細胞用多聚甲醛(PFA)固定並用Triton試劑可滲透化處理，且然後與抗體候選者之連續稀釋液一起培育1小時。培育之後，洗滌細胞並與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯之抗人類IgG一起培育30分鐘。在讀板儀上量測化學發光。貝伐珠單抗(癌思停)，即抑制血管內皮生長因子A (VEGF-A)之單株抗體，用作陰性對照。結果顯示於圖2A中。圖2B顯示為評價全人類抗STAT3單株抗體至抗原(重組人類STAT3蛋白質)之結合所進行之ELISA分析之結果。Ab 1號、2號及3號分別指示STAT3純系ST3G12、ST1A5及ST5G12。圖2B展示抗STAT3抗體ST1A5、ST3G12及ST5G12對STAT3之敏感性及特異性。 接下來，在細胞結合分析中使用MDA-MB-435乳癌細胞及U251細胞來測試候選抗STAT3抗體至細胞靶標之結合。將細胞接種於96孔板中過夜，然後用PFA固定並用甲醇可滲透化處理。將細胞與抗STAT3抗體候選者ST1A5、ST3G12及ST5G12之連續稀釋液一起培育1小時30分鐘。培育之後，洗滌細胞並與藻紅素(PE)偶聯之抗人類IgG一起培育30分鐘。在Intellicyte高通量流式細胞術分析儀上量測螢光。圖3A及圖3B中所示之結果展示，此分析對STAT3具特異性及敏感性。圖3A顯示MDA-MB-468細胞(乳癌細胞系)中之抗STAT3抗體ST1A5、ST3G12及ST5G12之結合，且圖3B顯示U251細胞(神經膠母細胞瘤)中之抗STAT3抗體ST1A5、ST3G12及ST5G12之結合。貝伐珠單抗(癌思停)，即抑制血管內皮生長因子A (VEGF-A)之單株抗體，用作陰性對照。如圖3A及3B中所示，抗STAT3抗體ST5G12及ST3G12二者均結合STAT3，其中ST5G12係尤其強之結合子。與抗體ST5G12及ST3G12相比，ST1A5抗體未顯示與MDA-MB-468及U251細胞之強STAT3結合。 圖3C顯示抗STAT3單株抗體ST3G12至人類細胞系HeLa及U251以及至小鼠細胞系CT-26及MC-38之結合。同型對照用作陰性對照。實驗程序與上文針對圖3A及3B所闡述者相同。如圖3C中所示，抗STAT3單株抗體顯示至人類HeLa及U251細胞系之強結合，且亦能夠識別CT-26及MC-38小鼠細胞系中之小鼠STAT3。 在U251細胞中評價裸抗STAT3 ST3G12抗體(ST3G12)相對化合物901 (ST3G12-PS)之細胞結合。提取細胞，可滲透化處理並與於PBS +/- 2%胎牛血清(FBS)中之增加量之裸抗STAT抗體及PS抗STAT抗體(化合物901)一起培育。在室溫下45分鐘之後，將細胞洗滌兩次並與藻紅素(PE)偶聯之抗人類IgG在室溫下在黑暗中一起培育20分鐘。然後洗滌細胞並藉由高通量流式細胞術(HTFC)進行分析。結果顯示於圖4中用於評價抗體至U251細胞之結合。如圖4中所描繪，裸抗STAT3抗體ST3G12之結合顯著低於偶聯之抗STAT3抗體ST3G12-PS (化合物901)之結合。對於ST3G12-PS抗體偶聯物(化合物901)，相對於裸抗體在每一細胞系中檢測到較高之結合，與STAT3之表現程度無關。 接下來，測定抗STAT3抗體(裸化合物901及下文中標記為抗STAT3-PS之PS偶聯之化合物901)之結合親和力。使用Biacore T200量測抗STAT及抗STAT-硫代磷酸酯(PS)抗體(化合物901)至人類STAT3之親和力。使用標準NHS/EDC偶合方法將抗人類Fc抗體(GE, BR-1008-39)固定在CM5感測器晶片上至大約1000 RU。在10 ul/min之流速下捕獲抗體(大約10 ug/ml) 60秒。將重組人類STAT3-GST連續稀釋2倍成為運行緩衝液(HBS-EP+，自100 nm開始)。所有量測均係在30 ul/min之流速下進行。用3 M MgCl2 (來自人類抗體套組)將表面再生60秒。使用1:1 (Langmuir)結合模型來擬合數據。結果顯示於針對抗STAT3抗體、ST3G12及偶聯之抗STAT3抗體ST3G12-PS (化合物901)之下表2中。 表2
Figure TW201800418AD00007
 如表2中所述，裸抗STAT3抗體之偶聯(抗STAT3-PS (化合物901))改良抗體對STAT3之親和力。表2中之數據指示，當與未經修飾之抗STAT3抗體比較時，偶聯之抗體化合物901 (ST3G12-PS)以更大之親和力結合抗原(KD 愈小，抗體對於其抗原之親和力愈大)。在分析中未觀察到未經修飾之抗STAT3抗體或經PS修飾之抗體至GST蛋白質之結合，此表明抗原-抗體之相互作用率之差異促成差異結合親和力。 在上文所闡述之STAT3 ELISA結合分析中亦測試未經修飾及經修飾之抗體(化合物901)之結合。結果顯示於圖5及圖6中。ST3G12抗體之經PS修飾之化合物901型式(ST3G12-PS)顯示略低於未經修飾之ST3G12抗體之結合。然而，EC50 相同。鑒於該等結果，PS修飾可能會干擾檢測。未經修飾之c-met抗體(cMet (H8A2))及經PS修飾之c-met抗體(cMet(H8A2)-PS，其係具有抗c-Met抗體之化合物901)用作對照。抗cMet純系H8A2闡述於WO2013192594中，其係以全文引用的方式併入本文中。圖30亦顯示在上文所闡述之STAT3 ELISA結合分析中所測試之比較經PS修飾之抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)及抗STAT3單株抗體之結合之實驗的結果。如圖30中所示，修飾並不實質上影響抗體與其抗原之間之結合親和力。實例 3. 抗 STAT3 抗體累積及內化 各種測試細胞系中之相對STAT3含量示於圖7A及圖7B。人類包皮纖維母細胞(HFF)、正常人類星狀膠質細胞(NHA)、正常結腸纖維母細胞(CCD-18CO)、正常乳房上皮細胞(MCF-10A)、神經膠母細胞瘤(U251)、三陰性乳癌(MDA-MB-468)、三陰性乳癌(HCC1954)及ER+乳癌(MCF-7)中之STAT3之總含量及磷酸化STAT3 (磷酸-STAT3)之含量示於圖7A中。磷酸化STAT3之含量係藉由流式細胞術使用針對磷酸-STAT3之抗體來測定。所使用之對照係單獨之一級抗體、單獨之二級抗體及同型匹配對照IgG。圖7B顯示該等細胞中磷酸化STAT3對總STAT3之比率(比率P/T STAT3)。 用裸ST3G12抗體及偶聯之ST3G12-PS抗體(化合物901) (圖8A及8B中顯示為「OS-STAT3」)處理正常乳房上皮細胞(MCF-10A)及ER+乳癌細胞(MCF-7)以測定對STAT3磷酸化之效應。將細胞用抗體預處理過夜，且然後以各種濃度之IL-6刺激20分鐘(10 ng/ml或40 ng/ml)。IL-6係STAT3活化劑。然後將細胞溶解並使蛋白質溶解物經受ELISA以測定磷酸化狀態。圖8A中針對MCF-10細胞及圖8B中針對MCF-7細胞所示之結果展示裸ST3G12抗體或ST3G12-PS抗體偶聯物化合物901對STAT3磷酸化之效應極小至無效應。該等結果表明，ST3G12抗體表位並不干擾STAT3磷酸化位點。「OS-AIP」係指用作對照之寡醣偶聯之細菌AIP蛋白質。 利用於增加比例之人類血清(1%、5%、10%及20%)中之10 ug/ml ST3G12-PS (化合物901)將具有高程度之STAT3活性(STAT3高)之MDA-MB-468三陰性乳癌細胞(參見圖7A)在37℃下處理90分鐘，以誘導STAT3活化。然後將細胞固定，可滲透化處理並用抗人類IgG Alexa 546染色。發現ST3G12-PS (化合物901)在MDA-MB-468細胞中累積，且觀察到隨著血清濃度增加累積增加。 在亦具有高程度之STAT3活性之U251神經膠母細胞瘤細胞系中重複進行該等相同實驗，如圖7A中所描繪。利用於增加比例之人類血清(1%、5%、10%及20%)中之10 ug/ml ST3G12-PS抗體偶聯物化合物901將U251細胞在37℃下處理90分鐘。然後將細胞固定，可滲透化處理，並用抗人類IgG Alexa 546染色。發現ST3G12-PS (化合物901)在U251細胞中累積，且觀察到隨著血清濃度增加累積增加(數據未顯示)。具有低程度之STAT3活性(STAT3低)之正常人類乳腺上皮細胞系MCF-10A描繪於圖7A及7B中。此細胞系亦係根據上文方案來測試。發現ST3G12-PS (化合物901)在MCF-10A細胞中隨著血清濃度增加(1%、5%、10%及20%血清)而累積(數據未顯示)。所進行之測定抗STAT3抗體偶聯物(例如化合物901)之累積之另一實驗之結果顯示於圖7C中。圖7C顯示藉由HeLa細胞中之抗體穿入點數對經內化之抗體進行定量。 實施顯示MDA-MB-468細胞(STAT3高)中之抗ST3G12-PS (化合物901)累積之時程實驗。將細胞接種於96孔板中過夜。添加20 ug/ml之ST3G12-PS-Alexa488抗體(化合物901-Alexa488)達以下之指示持續時間：0.5、2、4、6、8及24小時。在與抗體一起培育達指示時間之後，將細胞固定並使用Incucyte成像。圖9A(i)及(ii)顯示隨著時間延長而增加之抗體累積。組(ii)顯示來自組(i)之正規化至細胞計數之數據。圖9B(i)及(ii)顯示在MCF-10A細胞(STAT3低)中所進行之相同實驗。來自用STAT3低之MCF-10A細胞進行之實驗的結果類似於來自STAT3高之MDA-MB-468細胞之彼等，顯示隨著時間延長PS-ST3G12 (化合物901)之累積增加。 圖9C及9D顯示所實施之顯示利用PS寡聚物修飾ST3G12抗體並不影響其結合親和力之ELISA實驗之結果。ST3G12-未經修飾係指未經修飾之ST3G12抗體且ST3G12-PS係指經PS修飾之ST3G12抗體(圖9C)。圖9D顯示所實施之顯示抗體之修飾並不影響其結合親和力之ELISA實驗之結果。ST3G12-未經修飾係指未經修飾之抗STAT3抗體且ST3G12-PS係指經PS修飾之抗STAT3抗體(化合物901)。 利用於增加比例之人類血清(1%、5%、10%及20%)中之10 ug/ml之ST3G12-PS將具有高程度之STAT3活性(STAT3高)之MDA-MB-468三陰性乳癌細胞在37℃下處理90分鐘，以誘導STAT3活化。然後將細胞固定，可滲透化處理並用抗人類IgG Alexa 546染色。10A中之結果顯示ST3G12偶聯物在MDA-MB-468細胞中累積，且觀察到隨著血清濃度增加累積增加。實例 5. 抗 STAT3-PS 之細胞攝取 實施實驗以確定ST3G12-PS抗體偶聯物(化合物901)滲透細胞。簡言之，將先前清潔之玻璃蓋玻片在37℃下用膠原塗覆2小時。將100,000個U251細胞接種於蓋玻片上。將培養基去除，並用fluorobrite將細胞沖洗一次。接下來，在37℃下添加20 ug/mL之指定抗體2小時。將細胞於4% PFA中固定15分鐘且然後用0.1% TritonX可滲透化處理15分鐘。利用3% BSA將細胞封阻30分鐘並添加1:250 GAH-Alexa fluor 488 1小時。接下來，添加200×麥胚凝集素Alexa fluor 555 (WGA 555)及1:1000 DAPI持續30分鐘。用PBS將細胞洗滌3次，並用prolong gold抗褪色劑封固。使用顯微鏡檢查，發現所有經化合物901a及化合物901處理之樣品均觀察到細胞滲透。陰性對照即未經修飾之ST3G12抗體未顯示內化。結果顯示於圖10A、圖10B及圖10E (針對化合物901a)中，其使用免疫螢光檢測以顯示化合物901及化合物901a滲透細胞。 在圖10B中，利用於增加比例之人類血清(1%、5%、10%及20%)中之10 ug/ml之ST3G12-PS抗體(化合物901)將U251細胞在37℃下處理90分鐘。如圖10B中所示，化合物901滲透細胞。圖10E係U251細胞中ST3G12及ST3G12-PS抗體偶聯物內化之共焦顯微影像。在圖10E中，紅色螢光指示質膜，藍色螢光指示細胞核且綠色螢光表示細胞內累積之ST3G12-PS抗體偶聯物化合物901a。圖10C顯示圖10A中所描繪之相同實驗之結果，但係在具有額外增加之血清濃度之MCF-10A人類正常乳房上皮細胞中進行。如圖10C中所示，化合物901滲透細胞。圖10D顯示經5 ug/mL及10 ug/mL之ST3G12-PS (化合物901a)處理之MDA-MB-468人類乳癌細胞之顯微影像。 在單獨實驗中，顯示在STAT3活化後抗STAT3-PS抗體(化合物901)內化至細胞中並圍繞細胞核重新分佈。將MCF-10A細胞(5,000個細胞/孔)不與血清或與20%人類血清一起培育過夜，以誘導STAT3活化。將10 ug/ml之經修飾之抗STAT3抗體(ST3G12-PS)添加至細胞2小時。藉由EVOS顯微鏡觀察經偶聯至Alexa546之抗人類IgG染色之細胞使細胞內抗體可視化。 圖11A及11B顯示溫度對ST3G12-PS抗體偶聯物之內化之效應。圖11A顯示溫度對U251細胞中ST3G12-PS抗體偶聯物之內化之效應。將U251細胞與濃度為10 ug/ml之具有Alexa flour NHS 488標記之ST3G12-PS抗STAT3抗體化合物901一起培育。結果顯示為綠色對象之數量，其對應於在4℃及37℃下隨時間內化抗體偶聯物之細胞之數量。在圖11A中，U251細胞中ST3G12-PS之內化在37℃下在約45-60分鐘時出現峰值且在4℃下在約300分鐘時出現峰值。圖11B係顯示溫度對MDA-MB-468細胞中ST3G12-PS抗體偶聯物化合物901之內化之效應之圖表。將MDA-MB-468細胞與濃度為10 ug/ml之具有Alexa flour NHS 488標記之ST3G12-PS抗體偶聯物(化合物901-Alexa488)一起培育。結果顯示為綠色對象之數量，其對應於在4℃及37℃下隨時間內化抗體偶聯物之細胞之數量。在圖11B中，MDA-MB-468細胞中ST3G12-PS之內化在37℃下在約240分鐘時出現峰值且在4℃下在約120分鐘時出現峰值。 亦實施時程分析以測定ST3G12-PS抗體偶聯物化合物901之細胞攝取。將MDA-MB-468 (STAT3高)及MCF-10A (STAT3低)細胞以5000個細胞/孔之濃度接種於96孔板中。24小時後，將20 ug/ml之經Alexa 488標記之經修飾之抗STAT3抗體化合物901添加至細胞達以下持續時間：0.5小時、2小時、4小時、6小時、8小時及24小時。然後將細胞固定並使用Incucyte成像。圖12A顯示MDA-MB-436細胞中累積之ST3G12-PS (化合物901)。圖12B顯示MCF-10A細胞中累積之ST3G12-PS (化合物901)。在兩種細胞系中，累積均在6小時時出現峰值。接下來，檢查ST3G12-PS抗體偶聯物化合物901如何進入細胞之機制。將MDA-MB-468 (STAT3高)及MCF-10A (STAT3低)細胞以5,000個細胞/孔接種於96孔板中過夜。利用格形蛋白抑制劑Pitstop2 (60 uM)或窖蛋白抑制劑非律平(1 ug/ml)將細胞處理30分鐘。再添加20 ug/ml之OS-STAT3-Alexa488 (化合物901-Alexa488)抗體30分鐘。單獨之媒劑用作對照。然後將細胞固定並利用Incucyte成像。圖13顯示ST3G12-PS抗體化合物901使用胞吞作用獨立機制進入MDA-MB-438 (STAT3高)腫瘤細胞。 檢查MCF-10A細胞中之窖蛋白及網格蛋白依賴性ST3G12-PS抗體偶聯物(化合物901)調介之攝取。網格蛋白調介之胞吞作用係藉由小囊泡來調介，該等小囊泡具有由主要與胞質蛋白網格蛋白結合之蛋白質複合體構成之形態學特性包被。胞膜窖係最常報導之非網格蛋白包覆之質膜芽，其存在於許多但並非全部細胞類型之表面上。其係由富含膽固醇及醣酯之具有雙層之膽固醇結合蛋白質窖蛋白(Vip21)組成。格形蛋白調介之胞吞作用及胞膜窖二者將細胞外分子轉運至細胞中。於96孔板中每孔接種5,000個細胞過夜。利用格形蛋白抑制劑Pitstop2 (30 uM或60 uM)或窖蛋白抑制劑非律平(0.5 ug/ml或1.0 ug/ml)將細胞預處理30分鐘。再添加20 ug/ml之ST3G12-PS-Alexa488 (化合物901-Alexa488)抗體30分鐘。將細胞固定並利用IncuCyte成像。僅使用DMSO及抗體作為對照。如圖14組(i)中所示，用濃度為30 uM及60 uM之格形蛋白抑制劑PS2處理抑制ST3G12-PS (化合物901)攝取，而用窖蛋白抑制劑非律平處理在0.5 ug/ml之濃度下具有極小效應且在1.0 ug/ml下具有較大之效應。圖14組(ii)顯示正規化至細胞計數之數據。圖15顯示在MDA-MB-468 (STAT3高)細胞中所進行之相同實驗之結果。實例 6. 抗 STAT3 抗體進入細胞中之溫度依賴性 實施實驗以確定經PS修飾之抗STAT3抗體之進入是否依賴於溫度。接種10,000個U251細胞。將ST3G12-PS偶聯物(化合物901)以20 ug/mL之濃度在37℃或4℃下培育選擇時間，然後於4% PFA中固定。利用0.1% tritonX可滲透化處理細胞，且然後用3% BSA封阻，並用1:250 Alexa 488 GAH IgG處理。然後洗滌細胞並成像。結果顯示於圖16A及圖16B中。圖16A顯示在4℃下ST3G12-PS (化合物901)之抑制，其中隨著時間延長，綠色對象計數並未增加。對於在37℃下之ST3G12-PS (化合物901)，綠色對象計數增加直至240 min為止。在240 min以後，出現漸減或平臺期。圖16B比較來自圖16A中所描繪之實驗(「37℃ 1」及「4℃ 1」)之240分鐘時間點與240分鐘時間點之第二個實驗(「37℃ 2」及「4℃ 2」)。4℃下之信號保持大致相同，但觀察到37℃之信號有較大提升。實例 7. 阻斷 COLO205 中之 IL-26-STAT3 路徑 檢查抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對STAT3下游基因之表現之效應。STAT3與SIE (sis-誘導元件)相互作用，藉此誘導基因轉錄。使用兩個構築體，一個在TATA盒上游具有SIE之串聯重複，且另一者不具有SIE串聯重複而用作對照。該等構築體之示意圖示於圖17C中。首先，測試抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對HeLa或U251細胞中報導基因活性之效應。圖17D顯示HeLa細胞中STAT3報導基因分析之結果。圖17E顯示U251細胞中STAT3報導基因分析之結果。報導與媒劑相比報導基因活性之誘導百分比。使用製瘤素M (OSM) (JAK活化劑)來活化JAK。經活化之JAK使包括受體及主要受質STAT二者之其他靶標磷酸化。亦使用STAT3 SH2結構域抑制劑5, 15-DPP。細胞經圖17C中所示之構築體轉染，然後在活化劑或抑制劑存在下用指示抗體進行處理。STAT3-下游轉錄活性係藉由螢光素酶報導基因分析來量測。如圖17D及圖17E中所示，與對照抗體偶聯物、無抗體及抗STAT3單株抗體相比，抗STAT3抗體偶聯物減小STAT3報導基因活性。 接下來，實施實驗以測試抗STAT3-PS抗體(例如，化合物901)是否可阻斷IL-26誘導之IL-10細胞介素及抗細胞凋亡基因BCL2L1及BIRC5之表現。簡言之，將COLO205細胞以100k/孔接種於12孔板中。將細胞與50 ug/mL PS-OPRF (偶聯至PS之針對OPRF細菌蛋白質之抗體，用作對照)、未經修飾之ST3G12、ST3G12-PS (化合物901)或1 uM JAK抑制劑托法替尼一起在37℃下預培育90分鐘。利用2.5 ug/mL IL-26 (0.1%人類血清載體蛋白)刺激細胞過夜。過夜刺激之後，自細胞提取RNA並反轉錄為cDNA，隨後進行rtPCR。結果顯示於圖17A中。如圖17A中所示，IL-26刺激IL-10、BCL2L1 (BCL-XL，STAT3-下游增殖/生存基因)及BIRC5 (生存素)之表現，其由ST3G12-PS抗體偶聯物化合物901顯著逆轉。圖17B顯示所進行之以使用與上文所闡述相同之方法評價經化合物901處理之Colo 205細胞中STAT3-下游基因之表現之另一組實驗。如圖17B中所示，IL-26刺激IL-10之表現且BCL2L1由ST3G12-PS抗體偶聯物化合物901顯著逆轉。實例 8. 抗 STAT3 抗體偶聯物對 2 維及 3 維腫瘤細胞生長之效應 實施實驗以在2維(2D)腫瘤生長分析中測定腫瘤細胞對抗STAT3偶聯物(化合物901)之藥物敏感性。圖18A顯示在2D分析中隨著抗體濃度(µg/ml)增加而發生之DU145人類前列腺癌細胞之殺死百分比。藉由MTS分析在一式三份之孔中監測生長。誤差槓顯示一個標準偏差。將細胞以4 × 103 /孔之密度平鋪於96孔板中。利用抗STAT3偶聯物(化合物901)或對照抗體偶聯物(對照)將細胞處理72小時。圖18B顯示在2D分析中隨著抗體濃度(µg/ml)增加而發生之MDA-MB-231人類三陰性乳癌(TNBC)細胞之殺死百分比。在用指示Ab將細胞處理3天之後，藉由CTG量測細胞存活率。 在用指示抗體將細胞處理72小時之後，藉由CTG量測細胞存活率。誤差槓顯示一個標準偏差。如圖18A及18B中所示，STAT3抗體偶聯物(化合物901)降低人類癌細胞之細胞存活率。 接下來，實施實驗以測定STAT3抗體偶聯物對三維(3D)模型中腫瘤細胞之滲透及對腫瘤細胞生長之效應。3D活體外模型(例如腫瘤球狀體模型)一直在癌症研究中用作介於活體外癌細胞系培養物與活體內腫瘤之間之中間模型。人類結腸癌HCT116細胞在3D腫瘤球狀體模型中於ULA (超低附著)板中生長，並用經alexa fluor 488染料標記之抗STAT3單株抗體或經alexa fluor標記之抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)處理1小時以起始攝取。此後，利用ImageExpress在接下來之80小時每10 min使球體成像。圖18C係顯示alexa fluor之檢測之影像。如圖18C中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)能夠滲透腫瘤球狀體(ii)，而抗STAT3單株抗體則不能(i)。接下來，檢查抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對3D腫瘤球狀體之生長之效應。將DU145人類前列腺癌細胞接種於ULA板中。使球體形成72小時，然後用指示抗體再處理5天。藉由ImageXpress HCS共焦顯微術監測生長(圖19A)。使用CTG分析以測定圖19B中之存活率百分比及圖19C中之殺死百分比。實驗係在一式三份之孔中進行。誤差槓代表一個標準偏差。如圖19A中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)降低3D腫瘤球狀體之生長。圖19B顯示抗體偶聯物(化合物901)減少細胞之存活率百分比。圖19C顯示抗體偶聯物(化合物901)增加細胞殺死百分比。 測試抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對3D腫瘤球狀體模型中神經膠母細胞瘤細胞之生長之效應。使神經膠母細胞瘤細胞於如上文所闡述之3D培養物中生長。利用抗STAT3單株抗體、對照抗體偶聯物(抗OprI-PS)或抗STAT3抗體偶聯物(例如化合物901)來處理細胞。活細胞經可用於測定細胞存活率之細胞滲透性染料鈣黃綠素AM活細胞染料染色。在活細胞中，非螢光鈣黃綠素AM轉化為綠色-螢光鈣黃綠素。如圖20A中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)可降低球狀體之大小。圖20A中所示之結果亦指示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)亦可誘導如形態學特性所顯示之分化表型。在神經膠母細胞瘤及神經胚細胞瘤中，已經認識到臨床行為與腫瘤細胞分化階段之間之緊密聯繫，其中更高程度之分化指示優於較低程度之預後。因此，圖20A中所示之結果亦展示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)可誘導分化，藉此產生較佳之預後。 在3D-腫瘤生長分析中測試患者源之經典神經膠母細胞瘤(GBM)間葉細胞對STAT3抗體偶聯物(化合物901)之藥物敏感性。圖20B顯示顯示經針對用於活細胞之鈣黃綠素AM (綠色)、用於死細胞之乙啡啶同二聚體-1 (紅色)及用於細胞核之Hoechst (藍色)之螢光標記物染色之球狀體之HCS共焦影像。藉由ImageExpress軟體基於球狀體之2D直徑來計算平均總面積。圖20C顯示在用經修飾之對照IgGs (抗OprI-PS)及經修飾之STAT3 mAb (化合物901)分別處理之後腫瘤球狀體之平均總面積。AZD1480係JAK抑制劑。在3D-腫瘤生長分析中在患者源經典神經膠母細胞瘤(GBM)中測試對STAT3抗體偶聯物(化合物901)之藥物敏感性。圖20D顯示細胞中之ATP含量作為3D球狀體培養物中活細胞之指示物。為此，將細胞接種於96孔板中，並容許球狀體形成4天。利用增加量之指示抗體將GBM球狀體再處理7天，並使用CTG 3D分析分析細胞存活率。圖20D及圖20E顯示抗STAT3抗體偶聯物(例如化合物901)可降低腫瘤球狀體之大小。 進行抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對經典GBM中之癌症幹細胞基因之效應之功能性評估。結果顯示於圖20F及圖20G中。圖20F顯示來自每一樣品對(經STAT3抗體偶聯物(化合物901)處理相對於對照抗體偶聯物(例如經抗OprI-PS處理)在基因表現層面上之信號強度之散佈圖。圖20G顯示由抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)下調之癌症幹細胞基因。如圖20G中所示，自經STAT3抗體偶聯物(化合物901)或對照抗體偶聯物(抗OprI-PS)處理之球狀體提取RNA。然後將總RNA轉化為cDNA以藉由實時定量PCR量測STAT3-下游幹細胞基因之轉錄程度。圖20F及圖20G中所示之結果顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)可下調GBM球狀體中之幹細胞基因表現。實例 9. 小鼠中抗 STAT3 抗體偶聯物之藥物動力學 在無胸腺裸小鼠中檢查抗STAT3抗體偶聯物之藥物動力學性質。結果顯示於圖21A及下表3中。如圖21A中所示，在小鼠中靜脈內投與之抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)展現可接受之藥物動力學。表 3
Figure TW201800418AD00008
 測試人類血清中之抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)穩定性。結果顯示於圖21B中。如圖21B中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)在7天培育時期期間具有較高之血清穩定性。大約60%之PS寡聚物保持結合至抗體。實例 10. 抗 STAT3 抗體偶聯物對發炎性細胞介素或趨化介素反應之效應 檢查6個供體之隊列中抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對促炎性細胞介素及TLR下游細胞介素/趨化介素自人類末梢血單核細胞(PBMC)之釋放之效應。測試以下化合物：作為細胞介素活化劑之陽性對照之ANC 28.1 (抗CD28)及OKT3 (抗CD3)、對照IgG、抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)、PS寡聚物及抗STAT3 ST3G12單株抗體。將PMBC與指示抗體或寡聚物一起培育24小時。24小時之後，收集條件培養基用於細胞介素檢測。以0.1、1、10及100 µg/ ml測試化合物。對於單株抗體，625 nM等於100 µg/mL；62.5 nM等於10 µg/mL；6.25 nM等於1 µg/mL且0.625 nM等於0.1 µg/mL。如圖22A中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激IL-2自人類PMBC之釋放。如圖22B中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激IL-6自人類PMBC之釋放。如圖22C中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激IL-8自人類PMBC之釋放。如圖22D中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激IFN-γ自人類PMBC之釋放。其他經測試但未顯示之細胞介素包括IL-4、IL-10及TNFα。該等結果一起顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激促炎性細胞介素及TLR下游細胞介素/趨化介素自人類末梢血單核細胞(PBMC)之釋放。 測試來自2個供體之隊列之類鐸受體下游細胞介素及趨化介素反應之效應。為確定定量之限值，將細胞介素標準品稀釋以產生12個標準濃度。使用每一細胞介素標準品來產生12點標準曲線。使用MultiCyt Qbeads PlexScreen平臺以一式四份量測標準品之已知濃度。原始數據量測為平均螢光強度(MFI)。使用自12個標準品產生之4-PLL曲線內插樣品之濃度。根據表示為實際摻加濃度百分比之回收濃度確定準確度。準確度之驗收標準設定為實際摻加濃度之± 30%回收。使用至少高於準確度驗收標準內最低濃度之最低標準確定定量下限(LLOQ)。藉由ANOVA (鄧尼特(Dunnett)之多重比較測試，具有單一合併方差)使用GraphPad Prism (, p≤0.05；**, p≤0.01；***, p≤0.001；****, p≤0.0001)進行統計分析。圖23 (i)-(vi)顯示顯示MultiCyt Qbeads plexscreen平臺中針對(i) TNFα、(ii) IL-6、(iii) IL-8、(iv) CCL5、(v) CCL4及(vi) IFNα之檢測範圍之標準曲線。 測試來自2個供體之隊列之類鐸受體下游細胞介素及趨化介素反應之效應。將PMBC與指示抗體或寡聚物一起培育24小時。24小時之後，收集條件培養基用於細胞介素檢測。使用如上文所闡述之MultiCyt Qbeads分析用於檢測TLR-下游細胞介素及趨化介素：TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8、CCL5 (RANTES)、CCL4 (MIP-1β)及IFNα。測試以下化合物：ODN 2395、ODN 5328、PS寡聚物及抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)。ODN 2395係CpG寡聚去氧核苷酸類鐸受體(TLR)激動劑，且用作陽性對照。ODN 5328係GpC對照。二者均具有硫代磷酸酯主鏈。以1000、500、250、125、62.5及31.25 nM測試化合物。化合物濃度(nM)顯示於x軸上，且在條件培養基中所檢測到之細胞介素/趨化介素(pg/mL)顯示於y軸上。 如圖24A及圖24B中所示，抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激TNFα自人類PMBC之釋放。如圖25A及圖25B中所示，抗STAT3抗體偶聯物不刺激IL-6自人類PMBC之釋放。如圖26A及圖26B中所示，抗STAT3抗體偶聯物不刺激IL-8自人類PMBC之釋放。如圖27A及圖27B中所示，抗STAT3抗體偶聯物不刺激CCL5自人類PMBC之釋放。如圖28A及圖28B中所示，抗STAT3抗體偶聯物不刺激CCL7自人類PMBC之釋放。如圖29A及圖29B中所示，抗STAT3抗體偶聯物不刺激IFNα自人類PMBC之釋放。參考文獻之引用 本申請案中通篇所引用之所有參考(包括參考文獻、授權專利、公開專利申請案及及共同待決之專利申請案)之全部內容均係以引用的方式明確地併入本文中。除非另有定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均符合業內熟習此項技術者所通常已知之含義。表 4. 序列表
Figure TW201800418AD00009
名稱STAT3 iTAb、抗ST3G12-PS、PS-ST3G12、ST3G12-PS、PS-STAT3及經修飾之STAT3 mAb在整個說明書中可互換使用，以指圖1B (化合物901a)或1C (化合物901)中所示之化合物。圖 1A 係本發明之例示性抗體偶聯物之圖式，該抗體偶聯物包含式(I)或其醫藥上可接受之鹽，其中X、q、Ba、R1、r、t、L及AT中之每一者係如PCT/US2016/057576中所定義及闡述，該案係以全文引用的方式併入本文中。圖 1B 係本發明之例示性抗體偶聯物化合物901a之圖式，其中抗體(AT )係ST3G12且圖1A中之一個R1 係係烷基螢光團部分，且該化合物在實例5中測試。圖1B揭示SEQ ID NO: 19 (tccatgagcttcctgatgct)，其對應於結構之寡核苷酸上之鹼基。圖 1C 係本發明之例示性抗體偶聯物化合物901之圖式，其中抗體(AT )係ST3G12且圖1A中之每一R1 係氫，且該化合物在實例2-10中測試。圖1C揭示SEQ ID NO: 19 (tccatgagcttcctgatgct)，其對應於結構之寡核苷酸上之鹼基。圖 2A 係顯示用於評價抗STAT3抗體純系ST1A5、ST3G12及ST5G12至U251惡性神經膠母細胞瘤細胞中之細胞抗原之結合之ELISA分析結果之圖表。貝伐珠單抗(癌思停) (Bevacizumab (Avastin))，即抑制血管內皮生長因子A (VEGF-A)之單株抗體，用作陰性對照。圖 2B 係顯示用於評價全人類抗STAT3單株抗體至抗原(重組人類STAT3蛋白質)之結合之ELISA分析結果之圖表。Ab 1號對應於抗STAT3 ST3G12，Ab 2號對應於抗STAT3 ST1A5且Ab 3號對應於抗STAT3 ST5G12。圖 3A 係顯示評價抗STAT3抗體ST1A5、ST3G12及ST5G12在增加之抗體濃度(nM)下至MDA-MB-468細胞中之細胞抗原之結合的細胞結合分析結果之圖表。MFI係指檢測到之平均螢光強度。貝伐珠單抗(癌思停)，即抑制血管內皮生長因子A (VEGF-A)之單株抗體，用作陰性對照。圖 3B 係顯示評價抗STAT3抗體ST1A5、ST3G12及ST5G12在增加之抗體濃度(nM)下至U251細胞中之抗原之結合的細胞結合分析結果之圖表。貝伐珠單抗(癌思停)，即抑制血管內皮生長因子A (VEGF-A)之單株抗體，用作陰性對照。圖 3C 係顯示抗STAT3單株抗體至人類細胞系HeLa及U251以及至小鼠細胞系CT-26及MC-38之結合之圖表。同型對照用作陰性對照。圖 4 係顯示評價裸抗STAT3 ST3G12抗體(ST3G12)及寡醣(PS)偶聯之抗STAT3 ST3G12抗體(命名為「PS-STAT3」)在增加之抗體濃度(nM)下至U251細胞中之細胞抗原之結合的細胞結合分析結果之圖表。圖 5 係顯示用於評價未經修飾之抗STAT3 ST3G12抗體(ST3G12-未經修飾)及經修飾之抗體偶聯物(ST3G12-PS)至人類IgG之結合之ELISA分析結果之圖表。未經抗cMet修飾之抗體((H8A2)-未經修飾)及經修飾之抗體偶聯物((H8A2)-PS)用作對照。圖 6 係顯示用於評價未經修飾之抗STAT3 ST3G12抗體(「ST3G12-未經修飾」)及經PS修飾之ST3G12抗體偶聯物(「ST3G12-PS」)至重組人類STAT3蛋白質之結合之ELISA分析結果之圖表。圖 7A 係顯示所實施之測定以下中之STAT3之總含量及磷酸化STAT3 (磷酸-STAT3)之含量的ELISA分析結果之圖表：人類包皮纖維母細胞(HFF)、正常人類星狀膠質細胞(NHA)、正常結腸纖維母細胞(CCD-18CO)、正常乳房上皮細胞(MCF-10A)、神經膠母細胞瘤(U251)、三陰性乳癌(MDA-MB-468)、三陰性乳癌(HCC1954)及ER+乳癌(MCF-7)。磷酸化STAT3之含量係藉由ELISA使用針對磷酸-STAT3之抗體來測定。所使用之對照係單獨之一級抗體、單獨之二級抗體及同型匹配對照IgG。圖 7B 係顯示圖7A中所測試之細胞中磷酸化STAT3對總STAT3之比率(比率P/T STAT3)之圖表。圖 7C 係顯示藉由HeLa細胞中之抗體穿入點(punctate)數對內化之抗STAT3抗體偶聯物「STAT3 iTAb」 (化合物901)進行定量之圖表。作為對照，使用Alexa 549-山羊抗人類IgG或單獨之細胞(無處理)。圖 8A 係顯示測定經修飾之STAT3抗體偶聯物(ST3G12-PS)對MCF-10A細胞中STAT3磷酸化之效應之實驗結果之圖表。利用抗體將細胞預處理過夜，且然後用各種濃度之IL-6 (10 ng/ml或40 ng/ml)刺激20分鐘，以活化STAT3。然後將細胞溶解並使蛋白質溶解物經受ELISA以測定磷酸化狀態。「OS-AIP」係指用作對照之寡醣偶聯之抗細菌AIP (葡萄球菌自誘導肽)抗體。「STAT3」係指抗STAT3 ST3G12抗體。「OS-STAT3」係指抗STAT3 ST3G12抗體偶聯物(化合物901)。IL-6係STAT3活化劑。具有符號「(+)」之柱指示經IL-6 (10 ng/ml或40 ng/ml)及指示濃度之抗STAT3 ST3G12抗體(「(+) STAT3」)或抗STAT3 ST3G12抗體偶聯物(化合物901) 「(+) OS-STAT3」)處理之細胞。圖 8B 係顯示測定ST3G12及ST3G12-PS抗體偶聯物對MCF7細胞中STAT3磷酸化之效應之實驗結果之圖表。實驗程序與圖8A中所描繪者相同。圖 9A 係顯示顯示MDA-MB-468細胞中之ST3G12-PS抗體累積之時程實驗之結果之圖表。將細胞接種於96孔板中過夜。添加20 ug/ml之抗STAT3抗體ST3G12-PS-Alexa 488達指示之0.5、2、4、6、8及24小時之持續時間，並將細胞固定且成像。綠色對象計數係指發綠色螢光之細胞之數量。圖9組(i)及組(ii)顯示隨著時間延長而增加之抗體累積。圖9A組(ii)顯示來自圖9A組(i)之正規化至細胞計數之數據。結果顯示ST3G12-PS抗體在腫瘤細胞中之長時累積。圖 9B 係顯示在MCF-10A細胞中進行的與圖9A中所描繪相同之實驗之圖表。結果顯示ST3G12-PS抗體之累積在6小時之後減少。圖 9C 係顯示所實施之顯示利用PS寡聚物修飾ST3G12抗體並不影響其對人類IgG之結合親和力的ELISA實驗結果之圖表。「ST3G12-未經修飾」係指未經修飾之ST3G12抗STAT3抗體且「ST3G12-PS」係指經修飾之ST3G12抗STAT3抗體偶聯物。Superblock係指ELISA分析中所使用之封阻緩衝液。圖 9D 係顯示所實施之顯示ST3G12抗體之修飾並不影響其結合親和力的ELISA實驗結果之圖表。「ST3G12-未經修飾」係指未經修飾之ST3G12抗STAT3抗體且「ST3G12-PS」係指經修飾之ST3G12抗STAT3抗體偶聯物。Superblock係指ELISA分析中所使用之封阻緩衝液。圖 10A 顯示來自其中利用於增加比例之人類血清(1%、5%、10%及20%)中之抗STAT3偶聯物T3G12-PS處理MDA-MB-468三陰性乳癌細胞之實驗之免疫螢光顯微影像。然後將細胞固定、可滲透化處理並用抗人類IgG Alexa 546染色。紅色螢光顯示抗體之累積，其中隨著血清濃度增加觀察到累積增加。圖 10B 係在U251細胞中累積之ST3G12-PS抗體偶聯物之免疫螢光顯微影像。紅色螢光顯示抗體之累積，其中隨著血清濃度增加觀察到累積增加。圖 10C 係MCF10A人類正常乳房上皮細胞中所攝取之ST3G12-PS抗體偶聯物之免疫螢光顯微影像。紅色螢光顯示抗體之累積，其中隨著血清濃度增加觀察到累積增加。圖 10D 係MDA-MB-468人類乳癌細胞中ST3G12-PS抗體偶聯物(化合物901a)之共焦顯微影像。以0 µg/ml、10 µg/ml及5 µg/ml測試ST3G12-PS。如圖10D中所示，在5 µg/ml及10 µg/ml之濃度下，ST3G12-PS在細胞中累積。圖 10E 係U251細胞中ST3G12及ST3G12-PS抗體偶聯物內化之共焦顯微影像。細胞核經Hoescht染料染色並以藍色顯示。麥胚凝集素(WGA)、Alexa Fluor 555偶聯物係以紅色顯示。PS-ST3G12、ST3G12或對照PS-OPRF係以綠色顯示。圖10E中所示之結果顯示ST3G12抗體偶聯物(ST3G12-PS)能夠滲透細胞。圖 11A 係顯示溫度對U251細胞中ST3G12-PS抗體偶聯物內化之效應之圖表。將U251細胞與濃度為10 ug/ml之具有Alexa flour NHS 488標記之PS-ST3G12一起培育。結果顯示為綠色對象之數量，其對應於在4℃及37℃下隨時間內化抗體偶聯物之細胞數。圖 11B 係顯示溫度對MDA-MB-468細胞中ST3G12-PS抗體偶聯物內化之效應之圖表。將MDA-MB-468細胞與濃度為10 ug/ml之具有Alexa flour NHS 488標記之ST3G12-PS一起培育。結果顯示為綠色對象之數量，其對應於在4℃及37℃下隨時間內化抗體偶聯物之細胞數。圖 12A 係顯示所實施之測定MDA-MB-468細胞中ST3G12-PS抗體偶聯物之細胞攝取之時程分析之結果之圖表。將經Alexa 488標記之ST3G12-PS添加至細胞達以下持續時間：0.5小時、2小時、4小時、6小時、8小時及24小時。然後將細胞固定並使用Incucyte成像。細胞中抗體之累積在6小時時出現峰值。圖 12B 係顯示所實施之測定MCF-10A細胞中ST3G12-PS抗體偶聯物之細胞攝取之時程分析之結果之圖表。將經Alexa 488標記之ST3G12-PS添加至細胞達以下持續時間：0.5小時、2小時、4小時、6小時、8小時及24小時。然後將細胞固定並使用Incucyte成像。ST3G12-PS之累積在6小時時出現峰值。圖 13 係顯示使用胞吞作用獨立機制ST3G12-PS進入MDA-MB-468 (STAT3高)腫瘤細胞之圖表。亦測試正常乳房上皮細胞系MCF-10A (STAT3低)。單獨之媒劑用作對照。結果量測為抗體進入細胞中之抑制百分比。圖 14 係顯示格形蛋白抑制劑Pitstop2 (PS2；30 uM或60 uM)或窖蛋白抑制劑非律平(filipin) (0.5 ug/ml或1.0 ug/ml)對MCF-10A細胞中ST3G12-PS調介之攝取之效應之圖表。如圖14組(i)中所示，用濃度為30 uM及60 uM之格形蛋白抑制劑PS2處理抑制ST3G12-PS攝取，而用窖蛋白抑制劑非律平處理在0.5 ug/ml之濃度下具有極小效應且在1.0 ug/ml下具有較大之效應。綠色細胞計數係指已內化ST3G12-PS並藉由其綠色螢光檢測之細胞。圖14組(ii)顯示來自圖14組(i)之正規化至細胞計數之數據。圖 15 係顯示在MDA-MB-468乳癌細胞中進行的與圖14相同的實驗之結果之圖表。圖 16A 係顯示所實施之確定ST3G12-PS抗體偶聯物之進入是否依賴於溫度的實驗之結果之圖表。圖16A顯示如藉由綠色對象之數量所測定之在4℃下ST3G12-PS之抑制。綠色對象之數量係指具有內化之ST3G12-PS之細胞。如圖16A中所示，隨著時間延長，綠色對象計數並未增加。對於在37℃下測試之ST3G12-PS，綠色對象計數增加直至240分鐘為止。在240分鐘以後，出現漸減或平臺期。圖 16B 係顯示所實施之確定ST3G12-PS抗體偶聯物之進入是否依賴於溫度的實驗之結果之圖表。圖16B比較來自圖16A中所描繪之實驗(「37℃ 1」及「4℃ 1」)之240分鐘時間點與240分鐘時間點之第二個相同實驗(「37℃ 2」及「4℃ 2」)。4℃下之信號保持大致相同，但37℃之信號有較大提升。圖 17A 係顯示所實施之測試ST3G12-PS是否可阻斷IL-26誘導之IL-10細胞介素及抗細胞凋亡基因BCL2L1及BIRC5之mRNA表現的實驗之結果之圖表。將細胞與50 ug/mL PS-OPRF (寡聚物偶聯之OPRF抗體)、未經修飾之STAT3-3G12及ST3G12-PS抗體偶聯物或1 uM JAK抑制劑托法替尼(Tofacitinib)一起預培育。OPRF係用作對照之細菌蛋白質。測定IL-10、BCL2L1 (BCL-XL)及BIRC5 (生存素)之基因表現程度之倍數變化。圖 17B 係顯示所實施之測定抗STAT3抗體偶聯物「STAT3 iTAb」 (化合物901)對Colo205細胞中STAT3下游基因之表現的效應之實驗結果之圖表。「對照iTAb」指示對照抗體偶聯物。圖 17C 係所使用之兩個構築體之示意圖：一者在TATA盒上游具有SIE之串聯重複，且另一者無SIE串聯重複而用作對照。圖 17D 係顯示HeLa細胞中STAT3報導基因分析之結果之圖表。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。「對照iTAb」係指對照抗體偶聯物。圖 17E 係顯示U251細胞中STAT3報導基因分析之結果之圖表。圖 18A 係顯示在2維(2D)腫瘤生長分析中隨著抗體濃度(µg/ml)增加殺死DU145人類前列腺癌細胞之百分比之圖表。藉由MTS分析在一式三份之孔中監測生長。誤差槓顯示一個標準偏差。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。「對照iTAb」指示對照抗體偶聯物。圖 18B 係顯示在2D分析中隨著抗體濃度(µg/ml)增加殺死MDA-MB-231人類三陰性乳癌(TNBC)細胞之百分比之圖表。藉由CTG分析在一式三份之孔中監測生長。誤差槓顯示一個標準偏差。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。「對照iTAb」指示對照抗體偶聯物。圖 18C 顯示藉由顯微術檢測Alexa fluor。如圖18C中所示，抗STAT3抗體偶聯物(例如化合物901)能夠滲透腫瘤球狀體(ii)，而抗STAT3單株抗體則不能(i)。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 19A 顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對3D腫瘤球狀體生長之效應。藉由ImageXpress HCS共焦顯微術在一式三份之孔中監測3D腫瘤球狀體分析中DU145人類前列腺癌細胞之生長。利用無抗體、抗STAT3單株抗體、對照偶聯物(「對照iTAb」)或抗STAT3抗體偶聯物ST3G12 「STAT3iTAb」 (化合物901)來處理細胞。圖 19B 係顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對3D腫瘤球狀體生長之效應之圖表。藉由CTG分析在一式三份之孔中監測3D腫瘤球狀體分析中DU145人類前列腺癌細胞之生長。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 19C 係顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)對3D腫瘤球狀體生長之效應之圖表。細胞殺死百分比示於圖19C中。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 20A 係顯示抗STAT3抗體偶聯物可降低球狀體之大小且亦可誘導分化表型之影像。利用抗STAT3單株抗體、對照抗體偶聯物(PS偶聯之抗細菌外膜蛋白I (OprI)抗體)或抗STAT3抗體偶聯物來處理細胞。活細胞經鈣黃綠素AM活細胞染料染色。在活細胞中，非螢光鈣黃綠素AM轉化為綠色-螢光鈣黃綠素。圖20A中之箭頭指向具有分化表型之細胞。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 20B 係顯示在3D-腫瘤生長分析中在患者源經典神經膠母細胞瘤(GBM)間葉細胞中測試對STAT3抗體偶聯物(化合物901)之藥物敏感性之實驗的結果之影像。圖20B中之高內涵篩選(HCS)共焦影像顯示經針對用於活細胞之鈣黃綠素AM (綠色)、用於死細胞之乙啡啶同二聚體-1 (紅色)及用於細胞核之Hoechst (藍色)之螢光標記物染色之球狀體。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 20C 係顯示經STAT3抗體偶聯物「經修飾之STAT3 mAb」(化合物901)處理之後腫瘤球狀體之平均總面積之圖表。圖 20D 係顯示在3D-腫瘤生長分析中在患者源經典神經膠母細胞瘤(GBM)中測試對STAT3抗體偶聯物(化合物901)之藥物敏感性之實驗的結果之圖表。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。「對照iTAb」指示對照抗體偶聯物。圖 20E 係顯示在3D-腫瘤生長分析中在患者源經典神經膠母細胞瘤(GBM)中測試對STAT3抗體偶聯物(化合物901)之藥物敏感性之實驗的結果之圖表。圖20E顯示隨著抗體濃度增加細胞之存活率百分比。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。「對照iTAb」指示對照抗體偶聯物。圖 20F 係顯示來自每一樣品對(經STAT3抗體偶聯物(化合物901)處理相對於經對照抗體偶聯物處理)在基因表現層面上之信號強度之散佈圖之圖表。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。「對照iTAb」指示對照抗體偶聯物。圖 20G 係顯示相對於對照抗體偶聯物(PS偶聯之抗細菌外膜蛋白I (OprI)抗體)由抗STAT3抗體偶聯物(化合物901a)下調之癌症幹細胞基因之圖表。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 21A 係顯示STAT3 ST3G12及STAT3抗體偶聯物「經修飾之STAT3 mAb」(化合物901)在無胸腺裸小鼠中之藥物動力學特徵之圖表。圖 21B 係顯示如藉由ELISA所測定之評價人類血清中抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)穩定性之實驗結果之圖表。使用經HRP標記之抗人類IgG測定人類血清中摻加之抗體量。為檢測結合至STAT3 ST3G12 (化合物901)之PS寡聚物，首先將與PS寡聚物互補之生物素-寡聚物與血清中摻加之抗體偶聯物雜交，且然後藉由如上文中所提及之ELISA評價抗體結合之寡聚物之量，唯使用抗鏈黴抗生物素蛋白-HRP作為檢測抗體。數據係繪示為來自寡聚物之信號對來自抗體之信號的比率之曲線且顯示為寡聚物/Ab比率以指示抗體結合之寡聚物量隨時間之變化。圖 22A 係顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激IL-2自人類PMBC釋放之圖表。IL-2之量係以pg/mL顯示。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 22B 係顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激IL-6自人類PMBC釋放之圖表。IL-6之量係以pg/mL顯示。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 22C 係顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激IL-8自人類PMBC釋放之圖表。IL-8之量係以pg/mL顯示。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 22D 係顯示抗STAT3抗體偶聯物(化合物901)不刺激IFN-γ自人類PMBC釋放之圖表。IFN-γ之量係以pg/mL顯示。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。圖 23 係報告顯示在MultiCyt Qbeads plexscreen平臺中之針對(i) TNFα、(ii) IL-6、(iii) IL-8、(iv) CCL5、(v) CCL4及(vi) IFNα之檢測範圍之標準曲線之一組圖表((i)-(vi))。圖 24A 及圖 24B 係顯示抗STAT3抗體偶聯物「經修飾之STAT3 mAb」(化合物901)不刺激TNFα自人類PMBC釋放之圖表。化合物濃度(nM)顯示在x軸上，且在條件培養基中所檢測到之TNFα (pg/mL)顯示在y軸上。圖 25A 及圖 25B 係顯示抗STAT3抗體偶聯物「經修飾之STAT3 mAb」 (化合物901)不刺激IL-6自人類PMBC釋放之圖表。化合物濃度(nM)顯示在x軸上，且在條件培養基中所檢測到之IL-6 (pg/mL)顯示在y軸上。圖 26A 及圖 26B 係顯示抗STAT3抗體偶聯物「經修飾之STAT3 mAb」(化合物901)不刺激IL-8自人類PMBC釋放之圖表。化合物濃度(nM)顯示在x軸上，且在條件培養基中所檢測到之IL-8 (pg/mL)顯示在y軸上。圖 27A 及圖 27B 係顯示抗STAT3抗體偶聯物「經修飾之STAT3 mAb」(化合物901)不刺激CCL5自人類PMBC釋放之圖表。化合物濃度(nM)顯示在x軸上，且在條件培養基中所檢測到之CCL5 (pg/mL)顯示在y軸上。圖 28A 及圖 28B 係顯示抗STAT3抗體偶聯物「經修飾之STAT3 mAb」(化合物901)不刺激CCL7自人類PMBC釋放之圖表。化合物濃度(nM)顯示在x軸上，且在條件培養基中所檢測到之CCL7 (pg/mL)顯示在y軸上。圖 29A 及圖 29B 係顯示抗STAT3抗體偶聯物「經修飾之STAT3 mAb」(化合物901)不刺激IFNα自人類PMBC釋放之圖表。化合物濃度(nM)顯示在x軸上，且在條件培養基中所檢測到之IFNα (pg/mL)顯示在y軸上。圖 30 係顯示用於評價經PS修飾之ST3G12抗體偶聯物(化合物901))及抗STAT3單株抗體至重組人類STAT3蛋白質之結合之ELISA分析結果之圖表。「STAT3 iTAb」係指抗STAT3偶聯物ST3G12。
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Claims (23)

  1. 一種經分離之抗信號轉導子及轉錄活化子3 (STAT3)抗體或其抗原結合片段，其包含 重鏈可變結構域，其包含含有如SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 7中所示之胺基酸序列之CDR1結構域；及 輕鏈可變結構域，其包含含有如SEQ ID NO: 12中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 11中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 10中所示之胺基酸序列之CDR1結構域。
  2. 如請求項1之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸序列，且該輕鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 2中所示之胺基酸序列。
  3. 一種經分離之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含 重鏈可變結構域，其包含含有如SEQ ID NO: 15中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 14中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 13中所示之胺基酸序列之CDR1結構域；及 輕鏈可變結構域，其包含含有如SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列之CDR3結構域、含有如SEQ ID NO: 17中所示之胺基酸序列之CDR2結構域及含有如SEQ ID NO: 16中所示之胺基酸序列之CDR1結構域。
  4. 如請求項3之抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 3中所示之胺基酸序列，且該輕鏈可變結構域包含如SEQ ID NO: 4中所示之胺基酸序列。
  5. 一種經分離之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其包含 重鏈可變結構域，其包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列；及 輕鏈可變結構域，其包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少95%一致之胺基酸序列。
  6. 如請求項5之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少96%一致之胺基酸序列；且該輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少96%一致之胺基酸序列。
  7. 如請求項5之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少97%一致之胺基酸序列；且該輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少97%一致之胺基酸序列。
  8. 如請求項5之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少98%一致之胺基酸序列；且該輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少98%一致之胺基酸序列。
  9. 如請求項5之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少99%一致之胺基酸序列；且該輕鏈可變結構域包含與選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列至少99%一致之胺基酸序列。
  10. 如請求項5之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該重鏈可變結構域包含選自SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 3之胺基酸序列；且該輕鏈可變結構域包含選自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體之KD 為1 × 10-6 M或更小。
  12. 如請求項1至10中任一項之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係人類抗體。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體係選自由以下組成之群：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
  14. 如請求項1至12中任一項之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段係Fab片段或scFv。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗STAT3抗體或其抗原結合片段，其偶聯至細胞內遞送化合物。
  16. 一種治療患有癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至15中任一項之抗STAT3抗體或其抗原結合片段。
  17. 如請求項16之方法，其中該癌症係實體腫瘤。
  18. 如請求項16之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：黑色素瘤、神經膠質瘤、髓母細胞瘤、腎細胞癌、胰臟腺癌、卵巢癌、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、神經膠母細胞瘤、乳癌、胰臟癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸癌及腎癌。
  19. 如請求項16之方法，其中該癌症係血液癌。
  20. 如請求項19之方法，其中該血液癌係選自由以下組成之群：急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病、慢性髓單核球性白血病(CMML)、幼年型髓單核球性白血病(JMML)、巨核細胞性白血病及大顆粒淋巴球白血病。
  21. 一種治療患有自體免疫疾病之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項1至15中任一項之抗STAT3抗體或其抗原結合片段。
  22. 如請求項21之方法，其中該自體免疫疾病係選自由以下組成之群：多發性硬化、克羅恩氏病(Crohn’s disease)、某些細菌誘發之結腸炎、關節炎、狼瘡、糖尿病、氣喘、發炎性腸病、硬皮症及血管炎。
  23. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至15中任一項之抗STAT3抗體或抗體片段及醫藥上可接受之載劑。
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