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TW200800256A - Use of a PCV2 immunogenic composition for lessening clinical symptoms in pigs - Google Patents

Use of a PCV2 immunogenic composition for lessening clinical symptoms in pigs Download PDF

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Publication number
TW200800256A
TW200800256A TW095149552A TW95149552A TW200800256A TW 200800256 A TW200800256 A TW 200800256A TW 095149552 A TW095149552 A TW 095149552A TW 95149552 A TW95149552 A TW 95149552A TW 200800256 A TW200800256 A TW 200800256A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
arg
pro
thr
group
tyr
Prior art date
Application number
TW095149552A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Roof
Phillip Hayes
Marc Eichmeyer
Greg Nitzel
Merrill Schaeffer
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Vetmed
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38371964&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TW200800256(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Boehringer Ingelheim Vetmed filed Critical Boehringer Ingelheim Vetmed
Publication of TW200800256A publication Critical patent/TW200800256A/zh

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Description

200800256 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於包含豬2型環狀病毒（PCV2)抗原之免疫性 組合物於治療若干臨床表現（疾病）之用途。較佳地，彼等 臨床表現係與PCV2感染相關。更明確地說，本發明係關 於一種有效用於產生減緩或減輕與PCV2感染相關之臨床 症狀之嚴重性的免疫反應的免疫學組合物。較佳地，免疫 學組合物包含PCV2之重組性產生之抗原。更佳地，PCV2 抗原為由PCV2基因組中之開放閱讀框架（ORF)之一所編碼 的重組性產生之蛋白質。更佳地，該抗原為PCV2 ORF2蛋 白質。最明確地說，本發明係關於有效用於治療接受免疫 學組合物之豬隻與PCV2感染相關之臨床症狀的免疫學組 合物且其中該組合物包含由PCV2之ORF2表現的蛋白質。 本發明之另一態樣為由此提供之任何組合物作為藥物，較 佳作為獸醫學藥物，更佳作為疫苗的用途。此外，本發明 亦係關於本文中描述之組合物中之任一者用於製備供減缓 或減輕與PC V2感染相關之臨床症狀嚴重性的藥物的用 途。較佳地，該藥物係用於預防PCV2感染，甚至更佳用 於預防豬之PCV2感染。本發明之另一態樣係關於一種製 造藥物之方法，其包含用於治療若干臨床表現之PCV2免 疫性組合物。 【先前技術】 豬2型環狀病毒（PCV2)為小型（直徑為17 nm-22 nm)二十 面體無包膜DNA病毒，其含有單股圓形基因組。PCV2與 116349.doc 200800256 豬1型環狀病毒（PCV1)共用大約80%之序列一致性。然 而’與通常無毒性之PCV1相比，感染有pcv2之豬展現通 常稱為離乳後多系統消耗性症候群（PMWS)之症候群。 PMWS具有消耗性、皮膚蒼白、不健康、呼吸窘迫、腹 瀉、黃疸及黃膽之臨床特徵。在一些受感染之豬中，所有 症狀之組合將顯而易見而其他受感染之豬將僅僅具有此等 症狀中之一或兩者。在屍體剖檢期間，顯微鏡可見及肉眼 可見之病灶亦出現於多數組織及器官上，淋巴器官為最常 見之病灶部位。已觀測到PCV2核酸或抗原之量與顯微鏡 可見淋巴病灶嚴重性之間的強相關性。感染有PCv2之豬 之死亡率可達80%。除PMWS外，PCV2與包括以下之若干 其他感染相關：假性狂犬病、豬生殖及呼吸症候群 (PRRS)、格拉氏疾病（Glassei:’s disease)、鏈球菌性腦膜 炎、沙門氏桿菌病、離乳後大腸桿菌病、飲食性肝障礙及 化膿性支氣管肺炎。然而，迄今之研究未曾證實此等臨床 症狀中之任何一者是否事實上為pcv2感染之直接結果。 此外，尚未知此等臨床症狀中之任何一者是否可藉由針對 PCV2之活性劑有效減輕或治癒。 治療PCV2感染之現行方式包括諸如在美國專利第 6,703,023號中描述之彼等基於DNA之疫苗。然而，此等疫 苗在給與抗PCV2感染之保護性免疫力方面或在降低、減 輕任何與此相關之臨床症狀嚴重性或治癒任何與此相關之 臨床症狀方面不起作用。此外，在先前技術中描述之疫苗 僅僅集中於預防豬pcv2感染，而不認為具有任何其他醫 116349.doc 200800256 學用途。 口此在η亥項技術中需要一種用於治療若干臨床表現之 免疫性組合物°另外’在該項技術中需要-種給與抗 PCV2感木之保遵性免疫力，但亦可用於治療與pew感染 相關之現有臨床症狀之免疫學組合物。 【發明内容】 本發明解決先前技術巾固有之問題且提供*㈣技術現 狀之進步。本發明提供一種包含pcV2抗原之免疫性組合 物之藥用用途。
通常，料如用於本文中之任何PCV4原免疫性組合 物來說’應記錄無不良事件或注射部位反應。由此，當投 予仔豬，較佳投予不大於15週齡，更佳不大於6週齡，甚 至更佳不大於3週，最佳不大於2週之仔諸時，用於本文中 免疫1±、、且σ物看來為安全的。或者，較佳在暴露於毒性 V中至ν 2週内且較佳至少3週内進行本發明之免疫性組 合物之投藥。根據另_實施例’用於本文中描述之任何藥 用用途之在本文中使用之免疫性組合物係投予3週齡或更 大，較佳2週齡或更大，但最佳不大於15週齡之豬隻。 μ外地發現使用以下描述之免疫性組合物之治療可有效 用於減輕豬各種臨床症狀之嚴重性。尤其發現使用本發明 之免疫性組合物及尤其包含PCV2 ORF2抗原之組合物的治 療可有效用於減緩或減輕感染有PCV2之豬之淋巴結病、 淋巴萎縮及/或多核組織細胞/巨組織細胞。此外，使用如 由此提供且包含PCV2抗原，較佳〇RF2抗原之抗原組合物 I16349.doc 200800256 之治療可減少總環狀病毒負荷量及其免疫抑制衝擊，藉此 引起較尚程度之全身疾病抗性及與1>(：孓2相關之疾病及症 狀發生率的降低。 因此，本發明之一個態樣係關於如由此提供之包含 PCV2抗原，較佳重組性pcv2抗原且更佳pcv2 蛋白 質之免疫性組合物用於製備供預防、減輕及/或減缓豬淋 巴結病、淋巴萎縮及/或多核組織細胞/巨組織細胞之藥物 的用途。較佳地，該藥物可有效用於預防、減輕及域減 緩豬隻與PCV2感染相關之淋巴結病、、淋巴萎縮及/或多核 組織細胞/巨組織細胞。更佳地，當投予不大於15週齡， 更佳不大於6週齡，甚至更佳不大於3週，且最佳不大於二 週之豬隻時，該藥物可有效用於預防、減輕及/或減緩與 豬隻之PCV2感染相關的淋巴結病、淋巴萎縮及/或多核/巨 組織細胞。或者，較佳在暴露於毒性pcv至少2週内且較 佳至少3週内進行本發明之免疫性組合物之投藥。 本發明之另一悲樣係關於一種治療豬淋巴結病、淋巴萎 縮及/或多核組織細胞/巨組織細胞之方法，其包含投予豬 隻由此提供之免疫性組合物，該免疫性組合物包含pcv2 抗原，較佳重組性PCV2抗原且更佳pcv2 〇RF2蛋白質。 在另一悲樣中，本發明提供一種治療豬之與PCV2感染相 關之淋巴結病、淋巴萎縮及/或多核组織細胞/巨組織細胞 之方法’其包含投予豬隻由此提供之免疫性組合物，該免 疫性組合物包含pCV2抗原，較佺重組性pcv2抗原且更佳 PCV2 ORF2蛋白質。較佳地，該治療使得減輕、減緩、預 116349.doc 200800256 防及/或治癒接受該免疫性組合物之豬的淋巴結病、淋巴 萎縮及/或多核組織細胞/巨組織細胞。根據另一態樣，該 等治療方法進一步包含投予不大於15週齡，更佳不大於6 週齡，甚至更佳不大於3週，且最佳不大於2週之豬隻該免 疫性組合物。或者，較佳在暴露於毒性pcv至少2週内且 較佳至少3週内進行本發明之免疫性組合物之投藥。 另外發現使用由此提供之包含PCV2抗原，較佳重組性 PCV2抗原且最佳PCV2 0RF2蛋白質之免疫性組合物之治 療可減緩或減輕受感染豬之與一或多種以下症狀組合之淋 巴結病：(1)具有小葉間水腫之間質性肺炎，（2)皮膚蒼白 或黃疸，(3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃潰瘍，（5)腎炎及（6)生 殖病症，例如流產、死產、乾屍等。 因此，本發明之一個態樣係關於如由此提供之包含 PCV2抗原，較佳重組性PCV2抗原，且更佳PCV2 〇RF2蛋 白質之免疫性組合物用於製備供預防、減輕及/或減緩豬 隻之與一或多種以下症狀組合之淋巴結病的藥物的用途·· 豬隻之（1)具有小葉間水腫之間質性肺炎，（2)皮膚蒼白或 黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖 病症，例如流產、死產、乾屍等。較佳地，該藥物有效用 於預防、減輕及/或減緩豬隻之與一或多種與PC V2感染相 關之以下症狀組合的淋巴結病·（ 1)具有小葉間水腫之間質 性肺炎，（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃 潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖病症，例如流產、死產、乾屍 等。根據另一態樣，當投予不大於15週齡，更佳不大於6 116349.doc -10- 200800256 週齡，甚至更佳不大於3週且最佳不大於2週之豬隻時，該 藥物有效用於預防' 減輕及/或減緩豬隻之與一或多種以 下症狀組合之淋巴結病··豬隻之（1)具有小葉間水腫之間質 性肺火’（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃 潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖病症，例如流產、死產、乾屍 等或者’較佳在暴露於毒性PCV至少2週内且較佳至少3 週内進行本發明之免疫性組合物之投藥。 此外’本發明亦係關於一種治療豬隻之與一或多種以下 ⑩症狀組合之淋巴結病的方法··⑴具有小葉間水腫之間質性 肺义（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃潰 瘍，（5)腎炎及（6)生殖病症，例如流產、死產、乾屍等， 省方法包含投予如由此提供之包含pcv2抗原，較佳重組 I± PCV2抗原且更佳pCV2 〇RF2蛋白質之免疫性組合物。 車乂仫地，本發明亦係關於一種治療豬隻與一或多種與 PCV2^木相關之以下症狀組合之淋巴結病的方法：（1)具 • “、葉間水腫之間質性肺炎，(2)皮膚蒼白或黃:应，(3)斑 點狀萎縮性肝，⑷胃潰瘍，（5)腎炎及⑹生殖病症，例如 流產、死產、乾屍等，該方法包含投予豬隻如由此提供之 包s PCV2抗原’較佳重組性pcv2抗原，且更佳pm 2蛋白質之免疫性組合物。較佳地，該治療使得減輕 或減缓豬隻之淋巴結病及一或多種與pcv2感染相關之以 下症狀·⑴具有小葉間水腫之間質性肺炎，⑺皮膚蒼白 或戸、疸，（3)斑點狀萎縮性肝，（4)胃潰瘍，⑺腎炎及⑻生 殖病症，例如流產、死產、乾屍等。根據另一態樣，該等 116349.doc -11- 200800256 治療方法進-步包含投予不大於15週齡，更佳不大於6週 齡’甚至更佳不大於3週’ ^最佳不切2週之豬隻包含 PCV2抗原，較佳重組性PCV2抗原且更佳pcv2 _2蛋白 質之免疫性組合物。或者，較佳在暴露於毒性pcv至少2 週内且較佳至少3週内進行本發明之免疫性組合物之投 藥。 亦意外地發現使用如由此提供之包含pcv抗原，較佳重
組性PCV2抗原且更佳PCV2 ORF2蛋白質之免疫性組合物 之治療亦可減緩或減輕通常已知與細胞内勞索尼亞氏菌感 染（回腸炎）相關之Pia樣病灶。 因此，本發明之一個態樣係關於如由此提供之包含 PCV2抗原’較佳重組性PCV2抗原，且更佳pcv2 〇叮2蛋 白質之免疫性組合物用於製備供預防、減輕通常已知與豬 細胞内勞索尼亞氏菌感染相關之Pia樣病灶之嚴重性及/或 減缓Pia樣病灶的藥物的用途。根據另一態樣，當投予不 大於15週齡，更佳不大於6週齡，甚至更佳不大於3週，且 最佳不大於2週之豬隻時，該藥物可有效用於預防、減輕 通常已知與細胞内勞索尼亞氏菌感染相關之pia樣病灶之 嚴重性及/或減緩Pia樣病灶。或者，較佳在暴露於毒性 PCV至少2週内且較佳至少3週内進行本發明之免疫性組合 物之投藥。 此外，本發明亦係關於一種治療通常已知與細胞内勞索 尼亞氏菌感染相關之Pia樣病灶之方法，該方法包含投予 豬隻如本文中提供之包含PCV2抗原，較佳重組性pcv2抗 116349.doc -12- 200800256 原且更佳PCV2 ORF2蛋白質之免疫性組合物。較佳地，該 治療使得減輕或減缓通常已知與細胞内勞索尼亞氏菌感染 相關之Pia樣病灶。根據另一態樣，以上所描述之治療方 法進一步包含投予不大於15週齡，更佳不大於6週齡，甚 至更佳不大於3週，且最佳不大於2週之豬隻包含PCV2抗 原，較佳重組性PCV2抗原且更佳PCV2 ORF2蛋白質之免 _ 疫性組合物。或者，較佳在暴露於毒性PCV至少2週内且 較佳至少3週内進行本發明之免疫性組合物之投藥。 φ 免疫性組合物 如用於本文中之免疫性組合物可有效用於誘發抗PCV2 之免疫反應且預防、減緩及/或減輕與PCV2感染相關之臨 床症狀之嚴重性。該組合物通常包含至少一種PCV2抗 原。 除非另外定義，否則在本文中使用之所有技術及科學術 語具有如通常由本發明所屬之該項技術一般技術者瞭解之 相同含義。如用於本文中之術語”免疫性組合物"係指含有 • PCV2抗原之任何醫藥組合物，該組合物可用以預防或治 療個體與PCV2感染相關之疾病或病症。較佳免疫性組合 ^ 物可誘發、刺激或增強抗PCV2之免疫反應。因此，術語 包括如下所述之次單位免疫性組合物以及含有全滅活或減 毒及/或不活化PCV2之組合物兩者。 如用於本文中之術語"次單位免疫性組合物π係指含有來 源於PCV2之抗原或與PCV2之抗原同源的免疫性多肽或抗 原之至少一者，而非所有抗原的組合物。此組合物大體上 116349.doc -13 - 200800256 無完整PCV2。因此，”次單位免疫性組合物"係由來自 PCV2或其重組性類似物之至少部分純化或分離（較佳，大 體上純化）之免疫性多肽製備。次單位免疫性組合物可包 含次單位抗原或所欲的次單位抗原類，該次單位抗原類大 體上無來自PCV2之其他抗原或多肽或呈分裂形式者。較 佳免疫性次單位組合物包含如下所述之pcv2 〇RF2蛋白 質。 對組合物或疫苗之，，免疫學反應或免疫反應，，為宿主對所 馨 欲組合物或疫苗產生之細胞免疫反應及/或抗體介導之免 疫反應。通常，"免疫反應”包括（但不限於）一或多種以下 效應：產生或活化特定針對在所欲組合物或疫苗中所包括 之抗原之抗體、B細胞、辅助τ細胞、抑制τ細胞及/或細胞 毒性Τ細胞及/或yd Τ細胞。較佳地，宿主將顯示治療免疫 學反應或保護性免疫學反應，以增強抗新感染性及/或降 低疾病之臨床嚴重性。此保護係由與如上所描述之pCV2 _ 感染相關之一或多種症狀之數量或嚴重性之降低或與如上 所描述之PC V2感染相關之一或多種症狀之不產生來證 明。 如用於本文中之術語”免疫性，，蛋白質或多肽或”抗原"係 指引起如上所描述之免疫學反應之胺基酸序列。如用於本 文中之”免疫性••蛋白質或多肽包括任何PCV2蛋白質之全長 序列、其類似物或其免疫性片段。術語"免疫性片段"係指 包括一或多種抗原決定基且由此引起以上所描述之免疫學 反應之蛋白質片段。此等片段可使用在該項技術中熟知之 116349.doc -14- 200800256 任何數目之抗原決定基定位技術鑑定。例如參見Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology ’ 第 66 卷，（Glenn Ε· Morris, Ed·，1996) Humana Press，Totowa， New Jersey。例如，線性抗原決定基可藉由，例如同時在 固態載體上合成大量肽（該等肽對應於蛋白質分子的部分） 且使該等肽與抗體反應（同時，該等肽仍連接於載體）而測 定。此等技術在該項技術中已知且描述於，例如美國專利 第 4,708,871號；Geysen等人，（1984) Proc· Natl· Acad. Sci· USA 81:3998-4002; Geysen等人，（1986) Molec. Immunol. 23:709-715。同樣，構形抗原決定基易於藉由諸如藉由x射 線晶體分析儀及2維核磁共振測定胺基酸之空間構形而鑑 定。例如參見上文 Epitope Mapping Protocols。 在例如，多抗原決定基、側接抗原決定基之定義内亦包 括合成抗原及其他重組性抗原或合成得來之抗原。例如參 見 Bergmann 等人，（1993) Eur· J· Immunol. 23:2777-2781; Bergmann等人，（1996)，J. Immunol· 157:3242-3249; Suhrbier，Α· (1997)，Immunol· and Cell Biol· 75:402-408; Gardner等人，（1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998 〇 在本發明之一較佳實施例中，提供誘發免疫反應且更佳 給與抗PCV2感染之臨床徵象之保護性免疫力的免疫性組 合物。組合物最佳包含由PCV2之ORF2表現之多肽或其片 段作為該組合物之抗原組份。在本文中用於製備組合物且 在本文中提供之方法中之PCV2 ORF2 DNA及蛋白質為在 116349.doc -15- 200800256 PCV2分離物内之高度保守結構域，且藉此任何PCV2 ORF2可能有效作為如本文中使用之PCV ORF2 DNA及/或 多肽的來源。較佳PCV2 ORF2蛋白質為SEQ ID NO· 11之 該PCV2 ORF2蛋白質。在本文中提供之較佳PCV ORF2多 肽為SEQ ID NO. 5，但熟習該項技術者應瞭解此序列在序 列同源性方面可變化達到6%-10%且仍保持使其適用於免 疫性組合物中之抗原特徵。免疫學組合物之抗原特徵可例 如藉由如實例4提供之攻毒實驗加以估計。此外，當與由 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之聚核苷酸序列編碼之PCV2 ORF 2蛋白質相比，經修飾抗原給與至少70%，較佳80%， 更佳90%之保護性免疫力時，仍保持經修飾抗原之抗原特 徵。如用於本文中之”免疫性組合物"意謂引起宿主對PCV2 ORF2蛋白質之細胞免疫反應及/或抗體介導之免疫反應 之”免疫學反應"的PCV2 ORF2蛋白質。較佳地，此免疫性 組合物能夠引起或增強抗PCV2之免疫反應，藉此給與抗 PCV2感染之保護性免疫力且降低一或多種且較佳所有與 此相關之臨床徵象的發生率、嚴重性或預防一或多種且較 佳所有與此相關之臨床徵象。 在有些形式中，PCV2 ORF2蛋白質之免疫性部分用作組 合物中之抗原組份。如用於本文中之術語"免疫性部分"分 別係指PCV2 ORF2蛋白質及/或聚核苷酸之截斷形式及/或 經取代形式，或片段。較佳地，此等截斷形式及/或經取 代形式或片段應包含全長ORF2多肽之至少6個鄰近胺基 酸。更佳地，截斷形式或經取代形式或片段應具有全長 116349.doc -16- 200800256 ORF2多狀之至少1 〇個，更佳至. 又1主乂 15個且更佳至少19個鄰 近胺基酸。在本文中接供夕太、士 + π ^ 杈i、之在思方面的兩個較佳序列為 SEQ ID NO· 9及 SE〇 ID ΝΠ ι π 〇 ^ ^ V⑴Ν〇· 10。另外應瞭解此等序列可 為較大片段或截斷形式之一部分。 在本文中提供之另一較佳PCV2咖2多肽係由SEQ m ㈣：域剛①助：彳之核苦酸序列編碼^然而’熟習該 項技術者應瞭解此序列在序列同源性方面可變化達到6%_ 20%且仍保持使其適用於免疫性組合物中之抗原特徵。在 有些形式中，此PVC2 ORF2多肽之截斷形式或經取代形式 或片段係用作組合物之抗原組份。較佳地，此等截斷形式 或經取代形式或片段將包含例如，SEQ m N〇 : 3或犯卩 ID NO : 4之全長0RF2核苷酸序列之至少18個鄰近核苷 酸。更佳地，截斷形式或經取代形式或片段將具有例如 SEQ ID NO : 3或SEQ ID NO ·· 4之全長〇RF2核苷酸序列之 至少30個，更佳至少45個且更佳至少57個鄰近核苷酸。 如在該項技術中已知之”序列一致性”係指兩種或兩種以 上多肽序列之間或兩種或兩種以上聚核苷酸序列之間，即 參考序列及待與參考序列比較之給定序列之間的關係。如 由此等序列之間的匹配所測定，序列一致性係在序列經最 佳比對以產生最高序列相似度後，藉由比較給定序列與參 考序列而測定。在此比對後，在位置對位置之基礎上確定 序列一致性，例如，若在一特定位置處核苷酸或胺基酸殘 基致’則該專序列在彼位置處具有一致性。隨後，此等 位置一致性之總數除以參考序列中核苷酸或殘基之總數以 116349.doc •17- 200800256 產生序列一致性百分比。可藉由包括（但不限於）彼等在以 下文獻中描述之方法的已知方法容易地計算序列一致性： Computational Molecular Biology, Lesk，Α· Ν·編，Oxford
University Press， New York (1988)， Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith， D. W.編，
Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A. M·及 Griffin，H. G.編，
Humana Press，New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.及 Devereux，J.編， M. Stockton Press，New York (1991);及 Carillo，H·及 Lipman，D·，SIAM J. Applied Math·，48: 1073 (1988)，其教 示以引用的方式併入本文中。測定序列一致性之較佳方法 經設計以產生測試序列間的最大匹配。在測定給定序列間 的序列一致性之公開可用之電腦程式中系統化測定序列一 致性之方法。此等程式之實例包括（但不限於）GCG program package (Devereux， J·等人，Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul, S. F·等人，J· Molec. Biol·，215:403-410 (1990)。BLASTX程式公開地得自NCBI及其他來源（BLAST Manual，Altschul，S·等人，NCVI NLM NIH Bethesda，MD 20894，Altschul，S. F·等人，J. Molec. Biol” 215:403-410 (1990)，其教示係以引用的方式併入本文中）。此等程式最 佳使用預設空隙罰分（default gap weight)比對序列以產生 116349.doc -18 - 200800256 給定序列與參考序列之間的最高程度之序列一致性。例 如’具有與參考核苷酸序列之至少（例如）85%，較佳 90/d，甚至更佳95%之”序列一致性，，之核苷酸序列的聚核 苷酸意為除每一 100個核苷酸之參考核苷酸序列，給定聚 核苷酸序列可能包括至多15個，較佳至多1〇個，甚至更佳 至多5個點突變外，給定聚核苷酸之核苷酸序列與參考序 列一致。換言之，在具有相對於參考核苷酸序列之至少 85%，較佳90%，甚至更佳95%之一致性之核苷酸序列的 聚核苷酸中，參考序列中之至多15%，較佳1〇%，甚至更 佳5%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或可將參考 序列中至多15%，較佳10%，甚至更佳5%總數的核苷酸之 若干核苷酸插入參考序列中。參考序列之此等突變可能發 生在參考核苷酸序列之5,末端位置或3,末端位置處或彼等 末端位置之間的任何地方，個別地散佈於參考序列中之核 苷酸間或參考序列内之一或多個鄰近基團中。類似地，給 定胺基酸序列具有與參考胺基酸序列之至少（例如）85%， 車乂仫90 /。，甚至更佳95%之序列一致性的多肽意為除每一 參考胺基酸序列之1〇〇個胺基酸，給定多肽序列可能包括 至多15個，較佳至多10個，甚至更佳至多5個胺基酸改變 外，給定多肽之胺基酸序列與參考序列一致。換言之，為 獲知具有與參考胺基酸序列之至少85%，較佳9〇%，甚至 更佳95%之序列一致性之給定多肽序列，參考序列中之至 夕15 /d，車又佳至多ι〇〇/。，甚至更佳至多5%之胺基酸殘基可 缺失或經另一胺基酸取代，或可將參考序列中至多15% , 116349.doc -19- 200800256 車乂仏至多10%，甚至更佳至多5%總數的胺基酸殘基之若干 胺基酸插人參考序射。參考序狀此等改變可發生於參 考胺基酸序列之胺基末端或羧基末端位置處或彼等末端位 置之間的任何地方，個別地散佈於參考序列之殘基間或參 考序列内之一或多個鄰近基團中。較佳地，不一致之殘基 位置的保守胺基酸之取代不同。然而，當測定序列一致性 時，不包括保守取代作為匹配。 如用於本文中之”序列同源性"係指一種測定兩個序列之 相關性的方法。為測定序列同源性，最佳比對兩個或兩個 以上序列且必要時引入空隙。然而，與"序列一致性"相 比，當測定序列同源性時，將保守胺基酸取代視為匹配。 換5之，為獲得具有與參考序列之95%序列同源性之多肽 或聚核苷酸，參考序列中之85%，較佳90y❶，甚至更佳 95%之胺基酸殘基或核苷酸必須與另一胺基酸或核苷酸匹 配或包含經另一胺基酸或核苷酸之保守取代，或可將參考 序列中之至多15%，較佳至多1〇%，甚至更佳至多5%總數 的胺基酸殘基或核苷酸之若干胺基酸（不包括保守取代）插 入參考序列中。較佳地，同源序列包含至少一段5〇個，甚 至更佳至少100個’甚至更佳至少25〇個且甚至更佳至少 500個核苷酸。 保守取代"係指胺基酸殘基或核苷酸經具有類似特徵或 性質（包括大小、疏水性等）之另一胺基酸殘基或核苷酸取 代，如此總官能性不顯著變化。 分離π意谓π猎由人工"自其天然狀態改變，亦即若其以 116349.doc -20 - 200800256 天然狀態出現，則其自其原始環境變化或移出，或兩者 例如，當術語用於本文中時，不"分離"天然存在於活有機 體中之聚核苦酸或多肽，但分離自其天然狀態之共存物質 所分離的相同聚核苷酸或多肽。 ^ 由此，如用於本文中之免疫性組合物亦係指包含pcv2 ORF2蛋白質之組合物，其中該PCV2 〇RF2蛋白質為以上 所描述之彼等PCV2 ORF2蛋白質之任何一者。較佳地，該 PCV2 ORF2蛋白質為 ~
i)包含以下之序列之多肽：SEQ ID N0: 5、SEQ m
NO: 6、SEQ ID NO·· 9、SEQ ID NO: 1〇或 SEq ID NO: 11， ii) 與i)之多肽至少80%同源之任何多肽， iii) i)及/或ii)之多肽之任何免疫性部分，
iv) Hi)之免疫性部分，其包含在以下之序列中所包括 之至少10個鄰近胺基酸：SEQ ID NO: 5、SEQ ID
NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10或 SEQ ID NO: 11， v) 由包含SEQ ID NO : 3或SEQ ID NO : 4之序列之 DNA編碼的多肽， vi) 由與v)之聚核苷酸至少80%同源之聚核苷酸編碼的 任何多肽， vii) 由v)及/或vi)之聚核苷酸所編碼之多肽的任何免疫 性部分， viii) vii)之免疫性部分，其中編碼該免疫性部分之聚核 116349.doc -21 - 200800256 苦酸包含在SEQ ID NO : 3或SEQ ID NO : 4之序列 中所包括之至少30個鄰近核苷酸。 較佳地’任何彼等免疫性部分具有由SEq ID NO : 3或 SEQ ID NO : 4之序列編碼之PcV2 〇RF2蛋白質的免疫性特 徵。
根據另一態樣’在免疫學組合物中提供以有效用於誘發 所要免疫反應，即降低由PCV2感染產生之一或多種臨床 徵象之發生率，減輕其之嚴重性或預防由]?(：¥2感染產生 之一或多種臨床徵象的抗原包涵物之量的PCV2 ORF2蛋白 質。較佳地，PCV2 ORF2蛋白質包涵物之量為每毫升最終 免疫性組合物，至少〇·2 抗原（μ§/ηι1)，更佳為約〇·2 gg/ml至約 400 pg/m卜更佳為約 〇 3 μ§/ιη1 至約 2〇〇 gg/ml， 甚至更佳為約0·35 pg/ml至約1〇〇 μ§/ιη1，更佳為約〇 4 Mg/ml至約50 Hg/ml，更佳為約〇 45 Mg/ml至約3〇盹岫卜 更佳為約0·6 pg/ml至約15盹化〗，甚至更佳為約〇·75 gg/ml至約8㈣化卜甚至更佳為約1〇 yg/ml至約6叫/⑹， 更佳為約1.3 pg/ml至約3·〇 μ§/ιη卜甚至更佳為約14叫 至、力2·5 pg/ml，甚至更佳為約15 yg/ml至約2 〇吨/爪丨，且 最佳為約1.6 Mg/ml。 根據另-態樣，ORF2抗原包涵物之量為每劑量最終抗 原組合物’至少0.2 Μ如上所描述之pcv2咖2蛋白質（微 克/劑量）’更佳為約0.2叫/劑量至約4〇〇 μ§/劑量，更佳為 約〇.3叫/劑量至約200 μ§/劑量，甚至更佳為約〇 35…劑 量至約⑽…劑量，更佳為約〇4 μ§/劑量至約5"g/劑 116349.doc -22- 200800256 量，更佳為約〇·45 pg/劑量至約30 pg/劑量，更佳為約0.6 Kg/劑量至約15 pg/劑量，甚至更佳為約0.75 μ§/劑量至約8 Kg/劑量，甚至更佳為約1 ·0 pg/劑量至約6 pg/劑量，更佳 為約1.3 pg/劑量至約3·0 μ§/劑量，甚至更佳為約1.4 pg/劑 量至約2.5 pg/劑量，甚至更佳為約1.5 pg/劑量至約2.0 pg/ 劑量且最佳為約1.6 pg/劑量。 用於根據本發明之免疫性組合物中之PC V2 ORF2多肽可 以包括PCV2 ORF2之分離及純化、標準蛋白質合成且重組 性方法之任何方式獲得。用於獲得PC V2 ORF2多肽之較佳 方法在美國專利申請案第11/034,797號中提供，其教示及 内容係藉此以引用的方式併入本文中。簡言之，用含有 PCV2 ORF2 DNA編碼序列之重組性病毒載體感染易感細 胞，由重組性病毒表現PCV2 ORF2多肽且藉由過濾自上清 液回收所表現之PC V2 ORF2多肽且由任何習知方法，較佳 使用二元伸乙基亞胺使其不活化，隨後將其中和以終止不 活化過程。 用於本文中之免疫性組合物亦係指包含以下各物之組合 物i)較佳具有上述濃度之以上所描述PCV2 ORF2蛋白質的 任一者，及ii)表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，較佳 重組性桿狀病毒之至少一部分。此外，免疫性組合物可包 含〇較佳具有上述濃度之以上所描述PCV2 ORF2蛋白質的 任一者，ii)表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，較佳重 組性桿狀病毒之至少一部分，及iii) 一部分細胞培養物上 清液。 116349.doc -23 - 200800256 如用於本文中之免疫性組合物亦係指包含以下各物之組 合物i)較佳具有上述濃度之以上所描述PCV2 ORF2蛋白質 的任一者，ii)表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體，較佳 重組性桿狀病毒之至少一部分，及iii) 一部分細胞培養 物；其中約90%之組份具有小於1 μπι之尺寸。 如用於本文中之免疫性組合物亦係指包含以下各物之組 合物i)較佳具有上述濃度之以上所描述PCV2 ORF2蛋白質 的任一者，ii)表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體之至少 φ 一部分，iii) 一部分細胞培養物，iv)及使重組性病毒載體 不活化之不活化劑，較佳為ΒΕΙ，其中約90%之組份i)至組 份iii)具有小於1 μηι之尺寸。較佳地，BEI以有效使桿狀病 毒不活化之濃度存在。有效濃度為以上所描述。 如用於本文中之免疫性組合物亦係指包含以下各物之組 合物i)較佳具有上述濃度之以上所描述PCV2 ORF2蛋白質 的任一者，ii)表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體之至少 一部分，iii) 一部分細胞培養物，iv)使重組性病毒載體不 活化之不活化劑，較佳為BEI，及v)終止由不活化劑所介 . 導之不活化之中和劑，其中約90%之組份i)至組份iii)具有 . 小於1 μιη之尺寸。較佳地，若不活化劑為BEI，則該組合 物包含與ΒΕΙ等量之硫代硫酸鈉。 將多肽併入可投予對PCV2感染敏感之動物之組合物 中。在較佳形式中，組合物亦可包括熟習該項技術者已知 之額外組份（亦參見 Remington’s Pharmaceutical Sciences( 1990)。 第18版，Mack Publ·，Easton)。另外，該組合物可包括一 116349.doc -24- 200800256 或多種獸醫學上可接夸夕番令丨, ^ 』接又之载劑。如用於本文中之”獸醫學 上可接受之載劑”舍括以下番兔丨+ ' 科蜊匕祜以下載劑中之任一者及所有者：溶 劑、分散介質、塗料、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、 =、、、田囷劑及抗真g劑、等張劑、吸附延遲劑及其類似載 劑。在-較佳實施例中，免疫性組合物包含如由此提供之 較佳具有上述k度的PCV2 0RF2蛋白f，其與佐劑，較佳 卡波普（Carbopol)及生理鹽水混合。
熟習該項技術者應瞭解用於本文中之組合物可包括已知 可注射之生理學上可接受之無菌溶液。為製備用於非經腸 、射或灌/主之即用溶液，現成可用諸如鹽水或相應血漿蛋 白貝溶液之含水等張溶液。另外，本發明之免疫性組合物 及疫田組合物可包括稀釋劑、等張劑、穩定劑或佐劑。稀 釋劑可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油及其類似稀釋 ㈣。等張劑尤其可包括氯化鈉、右旋糖、甘露糖醇 '山梨 糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼 金屬鹽。 如用於本文中之”佐劑”可包括氫氧化鋁及磷酸鋁，例如
Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc” Cambridge MA)、 GPI-〇l〇〇(GaieniCa pharmaceuticals，Inc·，Birmingham，AL) 之皂素、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳 液尤其可基於輕液體石堪油（European Pharmacopea類型）； 由細，尤其異丁烯或癸烯之低聚合（theoligomerization)產生 之類異戊二烯油，諸如鯊烷油或角鯊烯油；含有線性烷基 之酸或醇之酯，更明確地說為植物油、油酸乙酯、丙二醇 116349.doc -25- 200800256 二（辛酸S旨/癸酸酿）、甘油三（辛酸自旨/癸酸S旨）或丙二醇二油 酸脂；支鏈脂肪酸或醇之酯，尤其異硬脂酸酯。該油用於 與乳化劑組合以形成乳液。乳化劑較佳為非離子型界面活 性劑，尤其為視情況乙氧基化之脫水山梨糖醇、二縮甘露 醇之酯（例如，無水甘露糖醇油酸酯）、乙二醇、聚甘油、 丙二醇之酯及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之 酯，及聚氧化丙烯-聚氧化乙烯共聚物嵌段體，詳言之為 Pluronic產物，尤其為L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull5 D. E. S·)· JohnWiley and Sons，NY，第 51-94 頁，（1995)及 Todd 等 人，Vaccine 15:564-570 (1997)。 例如，有可能使用由M. Powell及Μ· Newman編寫之 ’’Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach’’， Plenum Press，1995之第147頁中描述之SPT乳液，及在此 同一本書之第183頁中描述之乳液MF59。 佐劑之另一例子為選自丙烯酸或曱基丙烯酸之聚合物及 順丁烯二酸酐及烯基衍生物之共聚物的化合物。有利佐劑 化合物為尤其與糖或多元醇之聚烯基醚交聯之丙烯酸或曱 基丙烯酸之聚合物。此等化合物稱為術語卡波姆 (carbomer)(Phameuropa，第 8 卷，第 2號，June 1996)。熟 習該項技術者亦可參看美國專利第2,909,462號，其描述與 多羥基化合物交聯，具有至少3個羥基，較佳不超過8個羥 基之丙浠酸聚合物’至少三個經基之氫原子經具有至少2 個碳原子之不飽和脂族基置換。較佳基為含有2至4個碳原 116349.doc -26- 200800256 子之彼等基’例如乙烯基、稀丙基及其他烯系不飽和基 團。不飽和基本身可含有諸如曱基之其他取代基。以名稱 卡波普（BF Goodrich，Ohio, USA)出售之產品尤其適當。其 與烯丙基蔗糖或與烯丙基異戊四醇交聯。其中，可能提及 卡波普974P、卡波普934P及卡波普971P。最佳使用較佳每 劑量具有約500 pg至約5 mg之量，甚至更佳每劑量具有約 750 至約2.5 mg之量且最佳每劑量具有約i mg之量的卡 波普，尤其使用卡波普971P。 其他適當佐劑包括（但不限於劑系統（Ribi Inc.)、 喪段共聚物（CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron， Emeryville CA)、單磷醯基脂質a、安夫利定（Avridine)脂 質-胺佐劑、來自E. coH之熱不穩定腸毒素（重組性或其 他）、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯基二肽。 較佳地，佐劑以每劑量約100 至約1〇 mg之量添加。 甚至更佳地’佐劑以每劑量約100 至約10 mg之量添 加。甚至更佳地，佐劑以每劑量約5⑽叫至約5 mg之量添 加。甚至更佳地，佐劑以每劑量約75〇叫至約2·5 之量 添加。最佳地，佐劑以每劑量約1 mg之量添加。 另外’ δ亥組合物可包括一或多種醫藥上可接受之載劑。 如用於本文中之”醫藥上可接受之載劑”包括以下載劑之任 者及所有者：溶劑、分散介質、塗料、穩定劑、稀釋 劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑 及其類似載劑。最佳地，由此提供之組合物含有自活體外 培養之細胞之上清液所回收之p(：v2 ORF2蛋白質，其中用 116349.doc -27- 200800256 含有PCV2 ORF2 DNA且表現PCV2 ORF2蛋白質之重組 性病毒載體感染該等細胞，且其中用約2 mM至約8 mM ΒΕΙ ’車乂佳用約5 mM BEI處理以使病毒載體不活化及用 相等濃度之中和劑，較佳硫代硫酸鈉溶液處理該細胞 培養物至約2 mM至約8 mM，較佳約5 mM之最終濃 度。 本發明亦係關於包含以下各物之免疫性組合物i}較佳具 有上述濃度之以上所描述PCV2 ORF2蛋白質的任一者，⑴ 表現該PCV2 ORF2蛋白質之病毒載體之至少一部分，Hi) 一部分細胞培養物，iv)使重組性病毒載體不活化之不活化 劑，較佳為BEI，及v)終止由不活化劑所介導之不活化之 中和劑，較佳為與BEI等量的硫代硫酸鈉；及vi)適當佐 劑，較佳為具有上述量的卡波普971 ;其中約9〇%之組份〇 至組份iii)具有小於！ μιη之尺寸。根據另一態樣，此免疫 性組合物進一步包含以生理學上可接受之濃度的醫藥學上 可接受之鹽，較佳磷酸鹽。較佳地，將該免疫性組合物之 pH值調節至生理ρΗ值’意謂介於約6.5與75之間。 如用於本文中之免疫性組合物亦係指一種組合物，其包 含每一毫升i)至少1·6 上述PCV2 ORF2蛋白質，ϋ)至少 一部分表現該PCV2 ORF2蛋白質之桿狀病毒，Ηί)一部分 細胞培養物，W)約2 mN^8 mM BEI，V_BEI等量之硫代 硫酸鈉；及vi)約1 mg卡波普971，及vii)生理學上可接受之 濃度之磷酸鹽，其中約90%之組份〇至組份m)具有小於丄 μηι之尺寸且將該免疫性組合物值調節至約6·5至7 。 116349.doc -28- 200800256 免疫性組合物可進一步包括一或多種其他免疫調節劑， 諸如介白素、干擾素或其他細胞激素。免疫性組合物亦可 包括建它黴素（Gentamicin)及硫汞柳酸納（Merthiolate)。儘 管適用於本發明内容之佐劑及添加劑之量及濃度可容易地 由熟練技術者決定，但本發明涵蓋包含約50 pg至約2000 pg佐劑及較佳約.250 pg/ml劑量之疫苗組合物之組合物。 因此，如用於本文中之免疫性組合物亦係指包含約1 pg/ml 至約60 pg/ml抗生素且更佳小於約30 pg/ml抗生素之組合 物。 如用於本文中之免疫性組合物亦係指包含以下各物之組 合物i)較佳具有上述濃度之上述PCV2 ORF2蛋白質的任一 者，ii)表現該PCV2 0RF2蛋白質之病毒載體之至少一部 分，iii) 一部分細胞培養物，iv)使重組性病毒載體不活化 之不活化劑，較佳為BEI，及V)終止由不活化劑所介導之 不活化之中和劑，較佳為與BEI等量之硫代硫酸納；vi)適 當佐劑，較佳為具有上述量之卡波普971 ; vii)醫藥學上可 接受之濃度之鹽水缓衝液，較佳磷酸鹽，及viii)抗微生物 活性劑；其中約90%之組份i)至組份iii)具有小於1 μιη之尺 寸。 意外地發現，包含PCV2 ORF2蛋白質之免疫性組合物在 24個月期間内高度穩定。亦發現免疫性組合物在減緩與 PCV2感染相關之臨床症狀方面極為有效。亦發現，包含 上述表現PCV2 ORF2蛋白質之重組性桿狀病毒之免疫性組 合物意外地比包含不活化形式之全部PCV2病毒或經分離 116349.doc -29- 200800256 之病毒PC V2 ORF2抗原之免疫性組合物有效。尤其，意外 地發現表現PCV2 ORF2蛋白質之重組性桿狀病毒以極低濃 度（意謂以至多0.25 pg/劑量之濃度）時有效。此意外高免疫 性潛力之PCV2 ORF2蛋白質為增強之卡波普。實例1至實 例3詳細揭示包含PCV2 0RF2之免疫性組合物之產生。 如用於本文中之免疫性組合物亦係指C i r c 〇 F L E X ® (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc，St Joseph，MO，USA)、 CircoVac®(Merial SAS，Lyon，France)、CircoVent (Intervet Inc” Millsboro，DE，USA)或 Suvaxyn PCV-2 One Dose®(Fort Dodge Animal Health, Kansas City，KA，USA) o 投予免疫性組合物 根據本發明之組合物可皮層内、氣管内或陰道内施用。 該組合物較佳可肌肉内或鼻内施用，最佳肌肉内施用。在 動物體内，可證實經由靜脈内或藉由直接注射於靶組織中 施用上述醫藥組合物為有利的。就全身性施用而言，靜脈 内、血管内、肌肉内、鼻内、動脈内、腹膜内、經口或鞘 内途徑較佳。可經皮下、皮層内、皮内、心臟内、小葉 内、骨髓内、肺内或直接在待治療之組織（結締組織、骨 組織、肌肉組織、神經組織、上皮組織）中或其附近實現 更局部之施用。視治療之所要持續時間及有效性而定，可 例如，在每日基礎上一次或若干次，亦間歇地，歷時若干 天、數週或數月且以不同劑量投予根據本發明之組合物。 較佳地，至少一個劑量之上述免疫性組合物肌肉内投予 需要其之個體。根據另一態樣，PCV-2抗原或包含上述任 116349.doc -30- 200800256 何此PCV-2抗原之免疫性組合物經調配且以每劑量一（丨）毫 升投予。因此，根據另一態樣，本發明亦係關於包含如本 文中描述之PCV-2抗原之1 ml免疫性組合物用於減緩或減 輕感染有PCV2之豬隻的淋巴結病、淋巴萎縮及/或多核組 織細胞/巨組織細胞。 根據另一悲樣，本發明亦係關於一種包含如本文中所描 述之PCV-2抗原之1 mi免疫性組合物用於減缓或減輕與豬 隻之一或多種以下症狀組合之淋巴結病：具有小葉間水 腫之間質性肺炎，（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點狀萎縮性 肝’（4)胃潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖病症，例如流產、死 產、乾屍。 根據另一態樣，至少一個劑量之上述免疫性組合物之至 少另一投藥係給與需要其之個體，其中該第二或任何其他 投藥係在初始或任何先前投藥後至少14天給與。較佳地， 免疫性組合物與免疫刺激物一起投予。較金地，給與該免 疫刺激物至少兩次。較佳地，在免疫刺激物之第一次投予 與第二次或任何其他投予間為至少3天，更佳至少5天，甚 至更佳至少7天。較佳地，在初始投予本文中提供之免疫 性組合物後至少1〇天，較佳15天，甚至更佳2〇天，甚至更 it至少22天給與免疫刺激物。較佳免疫刺激物為，例如匙 孔螺血氰蛋白質（KLH)，較佳用佛氏不完全佐劑乳化 (KLH/ICFA)。然而，由此應瞭解亦可使用熟習該項技術者 已知之任何其他免疫刺激物。如用於本文中之術語"免疫 刺激物"意謂較佳在未起始或增強特異性免疫反應（例如抗 116349.doc -31- 200800256 特定病原體之免疫反應）之情況下，可觸發免疫反應之任 何藥劑或組合物。進一步指示以適當劑量投予免疫刺激 物。 此外，亦意外地發現用於本文中之免疫性組合物，較佳 包含表現PCV2 ORF2蛋白質之重組性桿狀病毒，甚至更佳 與卡波普組合之彼等免疫性組合物的免疫性潛力可進一步 藉由投予IngelVac PRRS MLV疫苗加以證實（參見實例5)。 當存在PRRS感染時，PCV2臨床徵象及疾病表現極大增 強。然而，如由此提供之免疫性組合物及疫苗接種策略會 極大減輕此效應且超過預期。換言之，當用如由此提供之 任何PCV2 ORF2免疫性組合物及Ingelvac PRRS MLV疫苗 (Boehringer Ingelheim)處理動物，較佳仔豬時，觀測到意 外之協同效應。 【實施方式】 以下實例闡述根據本發明之較佳材料及程序。儘管類似 或等效於本文中描述之彼等方法及材料之任何方法及材料 可用於實行或測試本發明，但現在描述較佳方法、裝置及 材料。然而，應暸解僅僅經由說明提供此等實例且不應認 為其中之實例限制本發明之總範疇。 實例1 此實例比較使用本發明之方法與在先前技術中已知方法 之ORF2之相對產率。將四個1〇〇〇 mL旋轉燒瓶各自以大約 1 .〇χ 106個Sf+細胞/毫升，於300 mL無昆蟲血清培養基 Excell 420(JRH Biosciences，Inc·，Lenexa，KS)中接種。將 116349.doc •32- 200800256 母細胞培養物標為SF+(草地黏蟲（办心)） 母細胞儲備物（Master Cell Stock)，第 19 代，Lot#N112-095W。用以產生SF+母細胞儲備物之細胞得自Protein
Sciences Corporation，Inc.，Meriden，CT。將用於此實例之 SF+細胞株限制在第19代與第59代之間。其他代可能用於 本發明之目的，但為按比例將製程擴大用於大規模生產， 或許將需要至少19代且超過59之代可能對表現有影響（儘 管未研究此情況）。更詳細地，在恆定攪動下，使來自液 氮貯槽之初始SF+細胞培養物懸浮生長於之無菌旋轉燒瓶 (spinner flask)中的Excell 420培養基中。使培養物生長於 具有25 mL至150 mL無血清Excell 420培養基之100 mL至 250 mL旋轉燒瓶中。當細胞繁殖至1·〇-8·〇χ106個細胞/毫 升之細胞密度時，將其以0·5-1·5χ106細胞/毫升之種植密度 分至新容器中。隨後，在25°C-29°C下，使擴充培養物生長 於體積高達36公升之旋轉燒瓶中或高達300公升之不銹鋼 生物反應器中，歷時2-7天之時間。 接種後，將燒瓶在27°C下培養四小時。隨後，將每一燒 瓶用含有PCV2 ORF2基因（SEQ ID NO : 4)之重組性桿狀病 毒接種。如下產生含有PCV2 ORF2基因之重組性桿狀病 毒：將來自PCV2之北美病毒株之PCV2 ORF2基因進行PCR 擴增以含有5fKozak序列（SEQ ID NO : 1)及3，EcoRl位點 (SEQ ID NO : 2)，且選殖於pGEM_T-Easy載體（Promega， Madison，WI)中。隨後，將其相繼切下且次選殖於轉移載 體 pVL1392(BD Biosciences Pharmingen，San Diego, CA) 116349.doc -33· 200800256 中。將次選殖部分在本文中表示為SEQ ID NO : 7。將含有 PCV2 ORF2基因之pVL1392質體命名為N47-064Y且隨後與 BaculoGold®(BD Biosciences Pharmingen)桿狀病毒 DNA共 轉染於 Sf+ 昆蟲細胞（Protein Sciences，Meriden，CT)中以 產生含有PC V2 ORF2基因之重組性桿狀病毒。本文中提供 為SEQ ID NO : 8之新穎構築體。將含有PCV2 ORF2基因之 重組性桿狀病毒進行溶菌斑純化且使母病毒種株（MSV)在 SF+細胞株中增殖、分成等份試樣且儲存於-70°C。藉由使 用桿狀病毒特異性引子之PCR-RFLP，將MSV肯定地鑑定 為PCV2 ORF2桿狀病毒。感染有PCV2 ORF2桿狀病毒以產 生MSV或工作病毒種株之昆蟲細胞表現如在間接螢光抗體 檢定中藉由多株血清或單株抗體所偵測之PCV2 ORF2抗 原。另外，藉由N-末端胺基酸定序確認PCV2 ORF2桿狀病 毒之一致性。亦根據 9 C.F.R· 113.27(c)、113.28及 113.55 測 試PCV2 ORF2桿狀病毒MSV之純度。接種於旋轉燒瓶中之 每一重組性桿狀病毒具有變化之病毒感染劑量（MOI)。將 燒瓶1用7.52 mL之.088 MOI之種株接種；將燒瓶2用3.01 mL之0.36 MOI之種株接種；將燒瓶3用1.5 mL之0.18 MOI 之種株接種；且將燒瓶4用0.75 mL之0.09 MOI之種株接 種。在本文中提供說明用以建構PCV2 ORF2重組性桿狀病 毒之基本步驟之示意性流程圖作為圖1。 用桿狀病毒接種後，隨後將燒瓶在27°C±2°C下培養7天 且在彼時間期間，亦在100 rpm下攪動。該等燒瓶使用通 風蓋以允許空氣流動。對於接下來之7天，每24小時自每 116349.doc -34- 200800256 一燒瓶取樣品。取出後，將每一樣品離心且將離心塊及上 清液兩者分離且隨後經由0.45 μπι-1·0 μηι孔徑之薄膜微過 濾。 隨後，經由ELIS Α檢定，定量所得樣品其中存在之ORF2 之量。用豬抗PCV2 Pab IgG Prot之捕捉抗體進行ELISA檢 定。將純G(在PBS中1:250稀釋）於0·05 Μ碳酸鹽緩衝液（pH 9.6)中稀釋至1:6000。隨後，將100 pL抗體置放於微量滴 定盤之孔中、密封且在37°C下培養隔夜。隨後，用包含0.5 mL Tween 20(Sigma，St· Louis, M0)、100 mLilOXD-PBS(Gibco Invitrogen，Carlsbad，CA)及 899.5 mL 蒸餾水之 洗滌溶液將該盤洗滌三次。隨後，將250 pL阻斷溶液（於 1 0 mL D-PBS 中之 5 g Carnation脫脂奶粉（Nestle，Glendale， CA)，用蒸餾水補至100 mL)添加至每一孔中。下一步為洗 滌測試盤且隨後添加預先稀釋之抗原。藉由將200 pL稀釋 劑溶液（於999.5 mL D-PBS中之0.5 mL Tween 20)添加至稀 釋盤上之每一孔中產生預先稀釋之抗原。隨後，將樣品以 1:240之比率及1:480之比率稀釋，且隨後將100 pL此等稀 釋樣品之每一者添加至稀釋盤上之一個頂部孔中（亦即， 一個頂部孔容納100 pL之1:240之稀釋物且另一者容納100 之1:480之稀釋物）。隨後，藉由自每一連續孔移出100 μΕ且將其轉移至盤上之下一個孔中而對其餘盤進行連續稀 釋。將每一孔混合，然後進行下一次轉移。測試盤之洗滌 包括用洗滌緩衝液洗滌該盤三次。隨後，將該盤密封且在 37°C下培養一小時，然後用洗滌緩衝液再洗滌三次。所使
Ii6349.doc -35- 200800256 用之偵測抗體為PCV ORF2之單株抗體。將偵測抗體以稀 釋劑溶液稀釋至1:300，且隨後，將loo pL經稀釋偵測抗 體添加至孔中。隨後，將該盤密封且在37°C下培養一小 時，然後用洗滌緩衝液洗滌三次。隨後，藉由將正常兔血 清（Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)添加至稀釋 劑溶液中至1%濃度而製備結合稀釋劑。將山羊抗小鼠之 結合抗體（H+l)-HRP(Jackson Immunoresearch)以結合稀釋 劑稀釋至1:10,000。隨後，將100 pL經稀釋之結合抗體添 加至每一孔中。隨後，將該盤密封且在37°C下培養45分 鐘，然後用洗滌缓衝液洗滌三次。將與等量過氧化物酶受 質B(KPL)混合之100 μι受質（TMB過氧化物酶受質， Kirkgaard及 Perry Laboratories(KPL)，Gaithersberg，MD)添 加至每一孔中。將該盤在室溫下培養15分鐘。隨後，將 100 pL之1 N HCL添加至所有孔中以終止反應。隨後，使 該盤通過ELISA讀取器。在以下表1中提供此檢定之結 果：
表1 天數 燒瓶 離心塊中之ORF2(pg) 上清液中之ORF2(pg) 3 1 47.53 12 3 2 57.46 22 3 3 53.44 14 3 4 58.64 12 4 1 43.01 44 4 2 65.61 62 4 3 70.56 32 4 4 64.97 24 5 1 31.74 100 5 2 34.93 142 ~ 116349.doc -36- 200800256 5 3 47.84 90 5 4 55.14 86 6 1 14.7 158 6 2 18.13 182 6 3 34.78 140 6 4 36.88 146 7 1 6.54 176 7 2 12.09 190 7 3 15.84 158 7 4 15.19 152 此等結果指示當延長培養時間時，ORF2於經離心細胞 及培養基之上清液中的表現大於在經離心細胞及培養基之 離心塊中的表現。相應地，使得ORF2表現進行至少5天且 在上清液中回收而非使得表現進行少於5天且自細胞回收 ORF2提供ORF2產率之極大提高及優於先前方法之顯著改 良。 實例2 此實例提供在本文中主張之本發明之功效的資料。將 1000 mL旋轉燒瓶以大約1.0X106個Sf+細胞/毫升，於300 mL Excell 420培養基中接種。隨後，將燒瓶在27°C下培養 且在1 00 rpm下攪動。隨後，培養24小時後，將燒瓶用具 0.1 MOI之 10 mL PCV2 ORF2/Bac p + 6(含有 PCV2 ORF2基 因，在Sf9昆蟲細胞中額外繼代6次之重組性桿狀病毒）病 毒種株接種。 隨後，將燒瓶在27t：下培養，歷時總共6天。培養後， 隨後將燒瓶離心且收集所得上清液之三個樣品且使其不活 化。藉由將上清液溫度到達37°C±2°C使上清液不活化。對 於第一個樣品，將環化成0.2 Μ二元伸乙基亞胺（BEI)之氫 116349.doc 37- 200800256 漠酸2-漠伸乙基胺於0 ·3 N NaOH中之0 ·4 Μ溶液添加至上 清液中以產生終濃度為5 mM之ΒΕΙ。對於第二個樣品，將 10 mM BEI添加至上清液中。對於第三個樣品，不添加 BEI至上清液中。隨後，將樣品連續攪拌48小時。添加產 生5 mM之最小終濃度之1 ·0 Μ硫代硫酸鈉溶液以中和任何 殘餘ΒΕΙ。隨後，使用如在實例1中描述之相同ELISΑ檢定 程序定量每一樣品中之ORF2的量。此結果可見於下表2 中： ⑩ 表2 樣品 上清液中之ORF2(pg) 1 78.71 2 68.75 3 83.33 此實例說明用BEI中和不會移除或降低大量重組性PCV2 ORF2蛋白質產物。此由在自BEI或高溫之上清液中，無 ORF2之大量損失得以證明。熟習該項技術者應瞭解回收 之ORF2為穩定的蛋白質產物。 實例3 此實例說明本發明自重組性PCV2 ORF2之小規模生產可 升級至重組性PCV2 ORF2之大規模生產。將於7000 mL ExCell 42〇培養基中之5·〇χ105個細胞/毫升之SF+細胞培植 於20000 mL Applikon生物反應器中。隨後，將培養基及細 胞在27°C下培養且在100 RPM下攪動，歷時接下來的68個 小時。在第68小時時，將41·3 mL PCV2 9RF2桿狀病毒 116349.doc -38- 200800256 MSV+3添加至7000 mL ExCeii 420培養基中。隨後，將所 得混合物添加至生物反應器中。對於接下來的七天，將混 合物在27°C下培養且在1〇〇 RPM下攪動。自感染後第4天開 始，每24小時自生物反應器抽取樣品且將每一樣品離心。 將樣品之上清液保留且隨後使用SDS-PAGE密度測定法定 量ORF2之量。此結果可見於下表3中： 表3 感染後之曰： 上清液中之〇RF2(pg/mL) 4 29.33 5 4L33 6 31.33 7 60.67 實例4 此實例測試七種PCV2候選疫苗之功效且進一步定義暴 露於PCV2之毒性病毒株後之功效參數。將9-14日齡之一百 零八（108)隻剖腹產術獲得之斷初乳（CDCD)仔豬隨機分成 相同規模之9個組。表4闡述用於此實例之通用研究設計。 表4.通用研究設計 組 豬隻數 處理 i處理 天數 在第21天及 第27天之 KLH/ICFA 在第24天用 毒性PCV2 攻毒_ 在第49天 屍體剖檢 ____—^ 1 12 1號PCV2疫苗一 (vORP2 16 μβ) 0 + + + 2 12 2號PCV2疫苗-(vORF2 8 μ^) 0 + + __ + ----- 3 12 3號PCV2疫苗一 (vORF2 4 μβ) 0 + + 十 4 12 4號PCV2疫苗-(vORF2 16 μβ) 0 + + + _____^ 116349.doc -39- 200800256 5 12 5號PCV2疫苗-(vORF2 8 μβ) 0 + + + 6 12 6號PCV2疫苗-(vORF2 4 pg) 0 + + + 7 12 7號PCV2疫苗-(經滅 活之全細胞病毒） 0 + + + 8 12 無疫苗-攻毒對照 N/A . + + + 9 12 無疫苗-嚴格陰性 對照組 N/A + + vORF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ;經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之PCV2 病毒 該等組中之七個（1-7組）接受PCV2 ORF2多肽劑量，——個 組充當攻毒對照且不接受PCV2 ORF2，且另一組充當嚴格 陰性對照組且亦不接受PC V2 ORF2。在第0天，將第1至7 組用指定之疫苗處理。在第14天，給與第7組中之仔豬辅 助劑處理。疫苗接種後，觀測仔豬之不良事件及注射部位 之反應且在第19天，將仔豬移至第二試驗點。在第二試驗 點，將第1-8組群養於一個豬舍（building)中而將第9組養於 另一豬舍中。在第21天及第27天及第24天，使所有豬隻接 受匙孔螺血氰蛋白質（KLH)/佛氏不完全佐劑（ICFA)，將第 1-8組用毒性PCV2攻毒。 攻毒前後，收集血液樣品用於PCV2血清特徵。攻毒 後，收集體重資料用於測定平均每曰體重增加（ADWG)及 臨床症狀以及鼻藥簽樣品（swab sample)用於測定鼻排出 PCV2。在第49天，將所有存活豬隻進行屍體剖檢，將肺 病灶計分且將經選擇組織保存於福馬林中用於日後之免疫 組織化學（IHC)測試。 116349.doc -40- 200800256 材料及方法 此為在第0天，在9至14曰齡之CDCD豬隻中進行之部分 盲法疫苗接種-攻毒可行性研究。在該研究中包括之母豬 之PCV2 IFA力價為<1:1000。另外，母豬之血清特徵狀態 # 來自已知PRRS-陰性畜群。測試二十八（28)隻母豬之PCV2 血清特徵狀態。十四（14)隻母豬具有<1000之pc V2力價且 轉移至第一試驗點。藉由剖腹產術手術提供一百一十（1 1 0) 隻仔豬且在第-4天用於此研究。在第_3天，將在第一試驗 _ 點之108隻CDCD豬隻稱體重、用耳標標記、按重量分組且 隨機分配至如以上在表4中列出之9組中之1組中。若滿足 納入標準（inclusion criteria)之任何測試動物參加該研究且 隨後由於任何原因而被排除，則研究者及監看人員進行商 議以決定自該動物所收集之資料在最後分析中之用途。記 錄參加之仔豬被排除之日期及排除之理由。起初，無母豬 排除。在第-3天，將可用110隻豬隻中之總共108隻隨機分 癱 配至9個組中之一個組中。兩隻最小豬隻（第17號及第19號） 不分配至組中且可用作備用（若需要）。在研究過程中，移 , 除若干動物。在攻毒之前，各自發現第82號豬隻（第9組）在 • 第-1天，第56號豬隻（第6組）在第、3天，第53號豬隻（第9組） 在弟4天’第28號豬隻（第8組）在第8天，第69號豬隻（第8 組）在第7天及第93號豬隻（第4組）在第9天死亡。在最後研 究結果中不包括此等六隻豬隻。將第17號豬隻（備用豬隻 之一）分配至第9組。將剩餘備用豬隻（第19號）自該研究排 除0 116349.doc • 41 - 200800256 給與每一組之調配物如下：指定第1組投予每毫升含有 16 pg ORF2之 1 ml病毒 ORF2(vORF2)。此藉由將 10.24 ml 病毒 ORF2(256 pg/25 pg/ml=10.24 ml vORF2)與 3.2 ml之 0.5%卡波普及pH值為7.4之2·56 ml磷酸鹽緩衝鹽水混合而 進行。此產生用於第1組之16 ml調配物。指定第2組投予 每毫升含有8μgvORF2之lmlvORF2。此藉由將5.12ml vORF2(128 pg/25 pg/ml=5.12 ml vORF2)與 3.2 ml之 0.5%卡 波普及pH值為7.4之7.68 ml磷酸鹽緩衝鹽水混合而進行。 此產生用於第2組之16 ml調配物。指定第3組投予每毫升 含有 4 pg vORF2 之 1 ml vORF2。此藉由將 2.56 ml vORF2(64 pg/25 pg/ml=2.56 ml vORF2)與 3·2 ml之 0.5%卡 波普及pH值為7·4之10.24 ml磷酸鹽緩衝鹽水混合進行。此 產生用於第3組之16 ml調配物。指定第4組投予每毫升含 有 16 pg rORF2之 1 ml重組性ORF2(rORF2)。此藉由將2.23 ml rORF2(512 pg/230 pg/ml=2.23 ml rORF2)與 6.4 ml之 〇·5%卡波普及pH值為7.4之23.37 ml磷酸鹽緩衝鹽水混合而 進行。此產生用於第4組之32 ml調配物。指定第5組投予 每毫升含有8 pg rORF2之1 ml rORF2。此藉由將1.11 ml rORF2(256 μ§/230 pg/ml=l.ll ml rORF2)與 6·4 ml 之 〇·5% 卡波普及pH值為7.4之24.49 ml磷酸鹽緩衝鹽水混合而進 行。此產生用於第5組之32 ml調配物。指定第6組投予每 毫升含有8 pg rORF2之1 ml rORF2。此藉由將0.56 ml rORF2(128 pg/230 pg/m卜0.56 ml rORF2)與 6·4 ml之 〇·5% 卡波普及pH值為7.4之25.04 ml磷酸鹽緩衝鹽水混合而進 116349.doc -42- 200800256 行。此產生用於第6組之3 2 ml調配物。設計第7組投予含 有MAX PCV2 KV之2 ml PCV2滅活全細胞疫苗（pcv2 KV)。此藉由將56 ml PCV2 KV與U如之以％卡波普混合 進行。此產生用於第7組之70 ml調配物。最後，設計第8 ，組投予每2 ml劑量〇.5 pg/mUl.〇叫/如之尺⑶。此藉由將 40.71 ml KLH(以 0.5 μ§·57〇 如（7 〇 _ι)(χ)= (0.5)(57〇 ml)之 7.0 盹蛋白 f / 毫升）、ρΗ 值為 74之244.29 mi磷酸鹽緩衝鹽水及285 ml佛氏佐劑混合而進行。表5描 • 述用於此實例之主要活動之時段。 表5·研究活動 研究之日 研究活動 --——----- -4、0 至49 3 對於總健康及臨床症狀之二^^~---— 稱體重；隨機化成组；自^座，、上--——- 0 0-7 认士 .隻收集血液樣品 健康核查，分別向弟1-7組蛋^7^^---— 觀測豬隻之注射部位反應 ------_ 14 用弟7號PCV2疫田輔助桌7細·.辛内^ΣψτΠΓ™—ν '- 14-21 觀測第 7 組之 16-19 用抗生素處理所有豬隻(資料丢奂·----- 19 將緒，自弔一測試％争_科平常 、n r γ-------- 21 n^KLmcFA4s¥l·^-—―^_ 24 自所有豬隻收而夜及鼻__—— 將第1-8組用PCV2攻春姑斜於查 ％所有豬隻之體重； 25、27、29、 3 卜 33 > 35、 37、39、41、 43、45、47 自所有豬隻收集鼻藥簽樣品~~——^___ 27 用KLH/ICFA處理第⑼組--—^__ 31 1--—-^ 自所有豬隻收集血液樣品 -—-- 116349.doc -43- 200800256 49 自所有豬隻收集血液及鼻藥簽樣品；稱所有豬隻之體重； 將所有豬隻屍體剖檢；記錄可見病灶，同時將重點放於黃 疸及胃潰瘍上；評估肺之病灶;保存新鮮組織樣品及經福 馬林固定之組織樣品；完成研究之存活生長期(In-life phase) 完成研究之存活生長期後，將經福馬林固定之組織由病 理學者藉由免疫組織化學（IHC)偵測PCV2抗原而檢查，評 估血液樣品之PCV2血清特徵，評估鼻藥簽樣品用於PCV2 排毒且測定自第24天至第49天之平均每日體重增加 (ADWG)。
I 自出生至大約11日齡（大約為該研究之第0天），將動物養 於在第一試驗點之五個房間中之個別籠中。每一房間布局 相同且由堆豐之個別不錄鋼龍組成’其中將加熱且過滤、空 氣獨立供應至每一分離單元。每一房間獨立加熱且通風， 藉此防止在房間之間的空氣交叉污染。將動物養於第二試 驗點之兩個不同豬舍中。將第9組（嚴格陰性對照組）獨立養 於經改裝之肥育豬舍（finisher building)中且將第1 -8組養於 馨 經改裝之保育豬舍（nursery building)中。將每一組養於獨 立圍欄（每圍欄11 -12隻豬隻）中且每一圍欄提供給每隻豬大 約3 ·0平方呎。每一圍欄在具塑膠漏缝地板之抬高平臺 上。圍攔下面之坑充當糞便及排泄物之儲料槽。每一豬舍 具有其自身獨立之供暖及通風系統，幾乎不可能有豬舍間 的空氣交叉污染。 在第一試驗點，在出生至大約3週齡，給仔豬餵以特定 調配之乳狀定糧。在第19天（大約4½週齡），使所有仔豬吃 116349.doc -44- 200800256 固體狀經特定混合之定糧。在第二試驗點，給所有仔豬餵 以適於其年齡及重量之習用未加藥之商業混合定糧（不限 里）。在兩個自式驗點’亦不限量使用水。 將所有測试豬隻在弟-2天用維生素e，在第_ 1天用鐵注 射且在第16天、第17天、第18天及第19天用NAXCEL⑧（1.0 mL ’股臀部輪流肌注）處理。另外，出於各種健康原因， 將弟5 2號豬隻（弟9組）在第3天用鐵注射處理，將第4 5號豬 隻（第6組）在第11天用鐵注射處理，將第69號豬隻（第8組） 在第6天用NAXCEL®處理，將第74號豬隻（第3組）在第14 天用地塞米松（dexamethazone)及盤尼西林（penicillin)處 理，且將苐5 1號豬隻（弟1組）在第13天用地塞米松及盤尼西 林且在第14天用NAXCEL®處理。 同時在兩個試驗點，豬隻接受獸醫學護理。在第〇天進 行動物健康檢查且記錄於健康檢查記錄表中。如第〇天之 觀測所確定，所有動物在疫苗接種前具有良好健康及營養 狀態。在攻毒前，觀測到所有測試動物具有良好健康及營 養狀態。回報（rendering)屠體及組織之處置。將研究動物 之最後處置記錄於動物處置記錄上。 在第〇天，为配至第1-6組之豬隻分別接受使用3〇 mL無 菌可換針頭型；^放量注射針（Luer_i〇ck Syringe)及2〇 gxl/2f，無 菌針在左頸區肌注（IM)iL〇 mL pcv2疫苗K6。分配至第 7組之豬隻接受使用3·〇 mL無菌可換針頭型微量注射針及 2〇 gx%”無菌針在左頸區肌注（IM)之2〇 mL第7號？(^2疫 苗。在第14天，分配至第7組之豬隻接受使用3〇 mL無菌 116349.doc •45- 200800256 可換針頭型微量注射針及20 τ汉ζυ sx/2無卤針在右頸區肌注 (IM)之2.0mL第7號PCV2疫苗。
在第21天，所有測試豬隻接受使用3.0 mL無菌可換針頭 型微量注射針及20 gxl"無菌針在右股臀部肌注（im)之2〇 mL KLH/ICFA。在第27天，所有測試緒隻接受使用3 〇 mL 無菌可換針頭型微量注射針及2G gxl"無菌針在左股臀部 之2.0 mL KLH/ICFA。 在第24天，分配至第^組之豬隻接受使用3〇瓜乙無菌 可換針頭型微量注射針及2〇 gxl，，無菌針在左頸區肌注（im) 之 1.0 mL PCV2 ISUVDL攻毒材料（5.U logl() TCID5()/mL)。 使用3·0 mL無菌可換針頭型微量注射針及鼻導管，將額外 1.0 mL之相同材料經鼻注射（IN)投予每隻豬（每鼻孔〇5 mL)。 在第-4天及自第〇天至第19天，每日觀測測試豬隻之總 健康及不良事件。將觀測結果記錄於臨床觀測記錄上。自 第〇天至第7天觀測所有測試豬隻，且自第14天至第21天進 步觀測弟7組之注射部位反應。在第_3天、第24天及第 49天或在攻毒後發現豬隻死亡當天，藉由以校準標度稱每 隻豬之體重測定平均每日體重增加。將體重記錄於體重表 中。在隨機化之前，利用第_3天之體重將豬隻分組。利用 第24天及第49天之重量資料測定每隻豬在此等時間點時之 平均每曰體重增加（ADWG)。對於攻毒後及第49天前死亡 之豬隻，ADWG經調整以表示自第24天至死亡之日的 ADWG 0 116349.doc -46- 200800256 為測定PCV2血清特徵，在第-3天及第14天，自每一仔 豬之眼眶靜脈竇收集靜脈全血。對於每一仔緒，藉由將無 菌毛細管插入一隻眼睛之内侧眼角中而自眼眶靜脈竇收集 血液且將大約3·0 mL之全血沒入4.0 mL血清分離管（Serum Separator Tube，SST)中。在第24天、第31天及第49天， 使用 18 gxl Z丨’無菌真空採血針（Vacutainer needle)(Becton Dickinson and Company，Franklin Lakes，New Jersey)、真 空採血持針器及13 mL SST，自前腔靜脈收集每隻豬之靜 脈全血。將在每一時間點之血液收集記錄於樣品收集記錄 上。使得在每一 SST中之血液凝結，隨後將每一 SST離心 且收集血清。將收集之血清轉移至無菌搭扣管中且儲存 於-70°C±l〇°C下直至日後測試為止。由BIVI-R & D人員測 試血清樣品中PCV2抗體之存在。 自第20天至第49天每曰一次觀測豬隻之臨床症狀且將臨 床觀測結果記錄於臨床觀測記錄上。 為在第24天、第25天及隨後，直至第49天且包括第49天 之所有其他奇數編號之研究之日測試PCV2之鼻排毒，將 無菌達克綸（dacron)藥簽盡可能無菌地鼻内插入每隻豬之 左鼻孔或右鼻孔（每豬隻一個藥簽），擦拭幾秒鐘且隨後移 出。隨後，將每一藥簽置放於含有具2% IFBS、500單位/ 毫升之盤尼西林（Penicimn)、500 pg/mL之鏈黴素 (Streptomycin)及 2·5 pg/mL兩性黴素 B(Fungizone)之 1.0 mL EMEM培養基之單無菌搭扣密封管中。將藥簽在管中折斷 且將搭扣管（snap tube)密封且適當標記動物編號、研究編 116349.doc -47- 200800256 號、收集日期、研究日及，，鼻藥簽”。將密封搭扣管儲存於-40°C 士 10°C直至隔夜於冰上送至ΒΐνΙ_^· joseph•。將鼻藥 簽收集記錄於鼻藥簽樣品收集表中。BIVI-R & D進行於鼻 藥簽樣品上之PCV2之定量病毒分離（VI)測試。結果以1〇^〇 值表示。認為1.3 logs或更小之值為負且認為大於13 1〇gs 之任何值為正。 將在第一試驗點死亡之豬隻（第28號、第52號 '第56 號、第69號、第82號及第93號）屍體剖檢至確定診斷所需 _ 要之程度。記錄可見病灶且不保留此等豬隻之組織。在第 一試驗點’將在第49天前死亡之緒隻（第45號、第23號、 第58號、第35號）、安樂死前發現在第49天死亡之豬隻（第2 號、第43號）及在第49天安樂死之豬隻屍體剖檢。記錄任 何可見病灶且將具有病灶之肺葉百分比記錄於屍體剖檢報 告表中。 將來自在第二試驗點屍體剖檢之1 03隻豬隻中之每一者 的扁桃艟、肺、心臟、肝、腸系膜淋巴結、腎及腹股溝淋 巴結之組織樣品置放於具10%缓衝福馬林之單一容器中； . 同時將自上述相同器官之另一組織樣品置放於Whirl- f Pak(M-Tech Diagnostics Ltd” Thelwall，UK)中且將每一
Whirl-Pak置放於冰上。將每一容器適當標記。將樣品收集 5己錄於屍體剖檢報告表中。之後’提交經福馬林固定之組 織樣品及診斷申請表用於IHC測試。根據用於接收樣品、 樣品及切片（slide)製備及染色技術之標準實驗室程序 進行IHC測試。將於Whirl-pak中之新鮮組^我用冰袋運送至 116349.doc •48· 200800256
Study Monitor用於儲存（-70°C 士10。〇及將來可能之使用。 將經福馬林固定之組織由病理學者藉由IHC偵測PC V2而檢 查且使用以下計分系統計分：〇=無；1 =陽性染色不足，幾 處；2=中等陽性染色，多處；及3 =大量陽極染色·，彌漫於 整個組織。由於病理學者不能肯定地區分腹股溝LN與勝 系膜LN，因此使得此等組織僅標記為淋巴結且對於每隻 動物，計分給出兩種組織中之每一者的最高計分。 結果 以下給出此實例之結果。注意到第〇天前第9組之一隻豬 隻死亡且疫苗接種後又有5隻豬隻死亡（第4組之1隻豬；第 6組之1隻豬；第8組之2隻豬；及第9組之1隻豬）。死後檢 查指示所有六隻豬隻死於與疫苗接種或PMWS不相關之潛 在感染。另外，任何組中無不良事件或注射部位反應記 錄。 平均每曰體重增加（ADWG)之結果呈現於下表6中。為嚴 格陰性對照組之第9組具有最高ADWG(1.06士0.17磅/天）’ 接著為接受一劑8 pg rORF2之第5組（0.94土0.22石旁/天）。接 受一劑4 pg vORF2之第3組具有最低ADWG(0.49 土 0.21磅/ 天），接著為接受2劑滅活疫苗之第7組（0.50士0.1 5磅/天）。 表6.組平均每日體重增加（ADWG)之概述 組 處理 N ADWG-碌/天(第24天至第49天)或經調整用於 第29天前死亡之豬隻 1 vORF2-16 pg(l 劑） 12 0.87 士 0.29碎7 天 2 vORF2-8 pg(l 劑） 12 0·70 土 0.32 镑/ 天 3 vORF2-4 pg(l 劑） 12 0.49 士 0.21 镑/天 4 rORF2-16 pg(l 劑） 11 0.84 土 0·30 續/ 天 116349.doc -49- 200800256 5 rORF2-8 pg(l 劑） 12 0.94 士 0.22碎 / 天 6 rORF2-4 pg(l 劑） 11 0.72 土 0.25 磅/ 天 7 KV(2 劑） 12 0·50 土 0·15磅/天 8 攻毒對照 10 0.76 土 0.19磅/天 9 嚴格陰性對照 11 1·06 士 0.17磅/天 vORF2=分離之病毒〇RF2 ; r〇RF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ;經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之pcv2 病毒。 PCV2血清特徵結果呈現於下表7中。在第-3天，所有九 個組對於PCV2為血清反應陰性。在第14天，接受v〇RF2疫 苗之組具有自187.5至529·2變化之最高力價。接受滅活病 毒疫苗之豬隻具有次最高力價，接著為接受r〇RF2疫苗之 組。此時，第8組及第9組保持血清反應陰性。在第24天及 第31天，接受v〇RF2疫苗之豬隻繼續展現強血清學反應， 緊接著為接受兩劑滅活病毒疫苗之組。接受r〇RF2疫苗豬 隻會減慢血清學反應且第8組及第9組繼續保持血清反應陰 性。在第49天，接受v〇RF2疫苗、2劑滅活病毒疫苗及最 低劑量rORF2之豬隻展現強血清學反應。接受16叫及8叫 rORF2疫苗之豬隻具有比攻毒對照稍高之IFA力價。第9組 在第49天展現強血清學反應。 表7·組PCV2 IFA力價之概述 IFA平均力價 組 處理 第-3天 第14天 第24天 第31天** 第49天*** 1 vORF2-16 pg(l 劑） 50.0 529.2 4400.0 7866.7 11054.5 2 vORF2-8 pg(l 劑） 50.0 500.0 3466.7 6800.0 10181.8 3 VORF2-4 pg(l 劑） 50.0 187.5 1133.3 5733.3 9333.3 4 rORF2-16 pg(l 劑） 50.0 95.5 1550.0 3090.9 8000.0 5 rORF2-8 μ€(1 劑） 50.0 75.0 887.5 2266.7 ~~7416J~~ 6 rORF2-4 pg(l 劑） 50.0 50.0 550.0 3118.2 10570.0 116349.doc -50- 200800256 7 KV(2 劑） 50.0 204.2 3087.5 4620.8 8680.0 8 攻毒對照 50.0 55.0 50.0 50.0 54333 9 嚴格陰性對照 50.0 59.1 59.1 54.5 6136.4 vORF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ;經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之PCV2 病毒 *為計算之目的，將S100之IFA力價指定為力價”50π ;將 26400之IFA力價指定為力價"12,800”。 * *攻毒之曰 ***屍體剖檢之曰 攻毒後臨床觀測之結果呈現於下表8中。此結果之概述 包括對於異常行為、異常呼吸、咳嗷及腹瀉之觀測結果。 表9包括來自組臨床症狀之總發生率之概述的結果且表10 包括來自組攻毒後死亡率之概述的結果。在此研究中記錄 之最常見之臨床症狀為計分為輕度至嚴重嗜睡症之異常行 為。接受2較低劑量VORF2之豬隻、接受16 pg rORF2之豬 隻及接受2劑KV疫苗之豬隻具有227.3%之發生率。接受8 pg rORF2之豬隻及嚴格陰性對照組無異常行為。此研究 中，無一隻豬展現任何異常呼吸。如腹瀉（0-20%)，在所 有組中經常記錄下咳嗷（0至25%)。無一所記錄臨床症狀為 PMWS之特異症狀。 臨床症狀之總發生率在組間變化。接受任何vORF2疫苗 之組、接受16 pg rORF2之組、接受2劑KV疫苗之組及攻毒 對照組具有最高總臨床症狀發生率（236.4%)。嚴格陰性對 照組、接受8 rORF2之組及接受4 pg rORF2之組分別具 I16349.doc -51 - 200800256 有0%、8.3%及9.1%之總臨床症狀之發生率。 組間之總死亡率亦變化。接受2劑KV疫苗之組具有最高 死亡率（16.7%);而接受4 pg vORF2、16 gg r〇RF2或8 pg rORF2之組及嚴格陰性對照組全部具有〇%之死亡率。 表8·組之異常行為、異常呼吸、咳嗽及腹瀉之觀測結果 之概述 組 處理 N 異常行為1 異常行為2 咳嗽3 腹瀉4 1 vORF2-16 pg(l 劑） 12 2/12(16.7%) 0/12(0%) 3/12(25%) 2/12(16/7%) 2 VORF2-8 pg(l 劑） 12 4/12(33.3%) 0/12(0%) 1/12(8.3%) 1/12(8.3%) 3 VORF2-4 pg(l 劑） 12 8/12(66.7%) 0/12(0%) 2/12(16.7%) 1/12(8.3%) 4 rORF2-16 pg(l 劑） 11 3/11(27.3%) 0/11(0%) 0/11(0%) 2/11(18.2%) 5 rORF2-8 pg(l 劑） 12 0/12(0%) 0/12(0%) 1/12(8.3%) 0/12(0%) 6 rORF2-4Hg(l 劑） 11 1/11(9.1%) 0/11(0%) 0/11(0%) 0/12(0%) 7 KV(2 劑） 12 7/12(58.3) 0/12(0%) 0/12(0%) 1/12(8,3%) 8 攻毒對照 10 1/10(10%) 0/10(0%) 2/10(20%) 2/10(20%) 9 嚴格陰性對照 11 0/11(0%) 0/11(0%) 0/11(0%) 0/11(0%)
vORF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ;經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之PCV2 病毒 1展現任何異常行為歷時至少一天之每一組中之豬隻總數 2展現任何異常呼吸歷時至少一天之每一組中之豬隻總數 3展現咳嗷歷時至少一天之每一組中之豬隻總數 4展現腹瀉歷時至少一天之每一組中之豬隻總數 表9.組總臨床症狀之發生率之概述 組 處理 N 具臨床症狀豬隻之 發生率1 發生率 1 vORF246 pg(l 劑） 12 5 一 41.7% 2 vORF2-8 pg(l 劑） 12 5 41.7% 3 vORF2-4 pg(l 劑） 12 8 66.7% 4 rORF2-16 pg(l 劑） 11 4 36.4% 5 rORF2-8 pg(l 劑） 12 1 Π 8.3% 6 rORF2-4 pg(l 劑） 11 1 9.1% -52- 116349.doc 200800256 7 KV(2 劑） 12 7 58.3% 8 攻毒對照 10 4 40% 9 嚴格陰性對照 11 0 0% vORF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ;經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒 1展現任何臨床症狀歷時至少一天之每一組中之豬隻總數 表10·組之攻毒後死亡率之概述 組 處理 N 攻毒後死亡數 死亡率 1 vORF2-16pg(l 劑） 12 1 8.3% 2 vORF2-8 pg(l 劑） 12 1 8.3% 3 vORF2-4 pg(l 劑） 12 0 0% 4 rORF2-16pg(l 劑） 11 0 0% 5 rORF2-8，g(l 劑） 12 0 0% 6 rORF2-4 pg(l 劑） 11 1 9.1% 7 KV(2 劑） 12 2 16.7% 8 攻毒對照 10 1 10% 9 嚴格陰性對照 1! 0 0%
vORF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORJF2 ;經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之PCV2 病毒 PCV2之鼻排毒結果呈現於下表11中。在第24天攻毒 後，第7組中之1隻豬在第27天開始排出PCV2。在第33 天，其他組無一者經歷排毒。自第35天至第45天記錄大量 鼻排毒。接受三種vORF2疫苗中之任何一者之組及接受4 pg或8 Mg rORF2之組具有PCV2之鼻排毒之最低發生率 (£9.1%)。攻毒對照組（第8組）具有最高排毒率（80%)，接著 為具有63.6%之發生率之嚴格陰性對照組（第9組）。 116349.doc •53- 200800256 表11·組PCV2之鼻排毒發生率之概述 組 處理 N 排毒至少一天之豬隻數 發生率 1 VORF2-16 pg(l 劑） 12 1 8.3% 2 vORF2-8 pg(l 劑） 12 1 8.3% 3 vORF2-4 pg(l 劑） 12 1 8.3% 4 rORF2-16 pg(l 劑） 11 2 18.2% 5 rORF2-8 pg(l 劑) 12 1 8.3% 6 rORF2-4pg(l 劑） 11 1 9.1% 7 KV(2 劑） 12 5 41.7% 8 攻毒對照 10 8 80% 9 嚴格陰性對照 11 7 63.6% ,
vORF2=分离隹之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ;經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之PCV2 病毒 組黃疸發生率、組胃潰瘍發生率、組平均肺病灶計分及 組肺病灶發生率之概述展示於下表12中。在該研究之疫苗 接種後期間，在第一測試點，六隻豬死亡（第4組，N=1 ; 第6組，N=1 ;第8組，N=2 ;第9組，N=2)。六隻豬中之四 隻具有在一或多個體腔中之纖維素性病灶，一隻豬（第6組） 具有符合梭菌病之病灶且一隻豬（第9組）無可見病灶。在該 研究之疫苗接種後期間死亡之豬隻無一者具有符合PMWS 之病灶。 將在攻毒後死亡之豬隻及在第49天安樂死之豬隻屍體剖 檢。在屍體刮檢時，黃疸及胃潰瘍不存在於讦何組中。關 於平均肺病灶百分比，第9組具有最低平均肺病灶百分比 (〇%)，接著為具有0.40士0.50%之第1組及具有0·68士 1.15〇/〇 116349.doc -54- 200800256 之第5組。第2組、第3組、第7組及第8組具有最高平均肺 病灶百分比.27%)。此等四個組中之每一者都含有肺病 灶百分比271.5%之一隻豬，其使得此等四個組之結果較 高。除具有所記錄之〇°/〇肺病灶之第9組外，其餘8組具有 <3 6%之肺病灶。幾乎所有記錄之肺病灶被描述為紅色/紫 色且實化。 表12·記錄之組黃疸發生率、組胃潰瘍發生率、組平均 肺病灶百分比計分及組肺病灶發生率之概述 組 處理 黃疸 胃潰癌 平均肺病灶百分比 記錄之肺病灶發生率 1 VORF2-16 pg(l 劑） 0/12(0%) 0/12(0%) 0.40 ±0.50% 10/12(83%) 2 vORF2-8 pg(l 劑） 0/12(0%) 0/12(0%) 7.41 ± 20.2% 10/12(83%) 3 VORF2-4 pg(l 劑） 0/12(0%) 0/12(0%) 9·20 ± 20,9% 10/12(83%) 4 rORF2-16 pg(l 劑） 0/11(0%) 0/11(0%) 1.5 ±4.74% 4/11(36%) 5 rORF2-8 pg(l 劑） 0/12(0%) 0/12(0%) 0.68 ± 1.15% 9/12(75%) 6 rORF2-4 pg(l 劑） 0/11(0%) 0/11(0%) 2.95 ±5.12% 7/11(64%) ~~~ 7 KV(2 劑） 0/12(0%) 0/12(0%) 7.27 ± 22.9% 9/12(75%) 8 攻毒對照 0/10(0%) 0/10(0%) 9.88 士 29.2% 8/10(80%) ~ 9 嚴格陰性對照 0/11(0%) 0/11(0%) 0/11(0%) 0/11(0%)
vORF2==分離之病毒〇RF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ; KV或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中 生長之PCV2病毒 組IHC陽性發生專結果之概述展現於表13中。第1組 (VORF2-16 pg)及第5組（rORF2-8 pg)具有最低IHC陽性發生 率之結果（16.7%)。第8組（攻毒對照）及第9組（嚴格陰性對 照）分別具有最高IHC陽性發生率之結果，90%及90.9%。 -55- 116349.doc 200800256 表13·組IHC陽性發生率之概述 組 處理 N 具有至少一種對於PCV2 為陽性之組織的豬隻數 發生率 ! VORF2-16 pg(l 劑） 12 2 16.7% 2 vORF2-8 pg(l 劑） 12 3 25.0% 3 vORF2-4pg(l 劑）· 12 8 66.7% 4 rORF2-16 pg(l 劑） Π 4 36.3% 5 rORF2-8 pg(l 劑） 12 2 16.7% 6 rORF2-4 pg(l 劑) 11 4 36.4% 7 KV(2 劑) 12 5 41.7% 8 攻毒對照 10 9 90.0% 9 嚴格陰性對照 11 10 90.9% vORF2=分離之病毒ORF2 ; K)RF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ; KV或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒 攻毒後，接受一劑8 pg rORF2抗原之第5組優於其他6個 疫苗組。第5組具有最高ADWG(0.94士0·22磅/天）、最低異 常行為發生率（〇%)、第二最低咳嗷發生率（8.3%)、最低總 臨床症狀發生率（8.3%)、最低死亡率（0%)、最低？(：¥2之鼻 排毒率（8.3%)、第二最低平均肺病灶百分比比率 (0.68士1.15%)及最低陽性組織發生率（16.7%)。接受各種量 之rORF2抗原之組總體優於接受各種量之vORF2之組且接 受2劑經滅活全細胞PCV2疫苗之組表現最差。表14及表15 含有組攻毒後資料之概述。 116349.doc -56- 200800256 表I4·組攻毒後資料概述-第1部分 組 N 處理 ADWG(磅/天） 異常行為 咳嗷 總臨床症狀之 發生率 1 12 VORF2-16 pg(l 劑） 0.87 ± 0.29 2/12(16.7%) 3/12(25%) 41.7% 2 12 VORF2-8 pg(l 劑） 0.70 ± 0.32 4/12(33.3% 1/12(8.3%) 41.7% 3 12 vORF2-4 pg(l 劑） 0.49 ± 0.21 8/12(66.7%) 2/12(16.7%) 66.7% 4 11 rORF2-16 pg(l 劑） 0.84 ±0.30 3/11(27.3%) 0/11(0%) 36.4% 5 12 rORF2-8 pg(l 劑） 0.94 ± 0.22 0/12(0%) 1/12(8.3%) 8.3% 6 11 rORF2-4 pg(l 劑) 0.72 ± 0.25 1/11(9.1%) 0/11(0%) 9.1% 7 12 KV(2 劑） 0.50 ±0.15 7/12(58.3) 0/12(0%) 58.3% 8 10 攻毒對照 0.76 ±0.19 1/10(10%) 2/10(20%) 40% 9 11 嚴格陰性對照 1.06 ±0.17 0/11(0%) 0/11(0%) 0%
vORF2=分離之病毒〇RF2 ; r〇RF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ; KV或經滅活之全細胞病毒==在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒 表15·組攻毒後資料概述-第2部分 組 N 處理 死亡率 鼻排毒 平均肺病灶 百分比 對於PCV2為me 陽性之至少一種 組織之發生率 1 12 VORF2-16 pg(l 劑） 8.3% 8.3% 0.40 土 0.50% 16.7% 2 12 vORF2-8 pg(l 劑） 83% 8.3% 7.41 ± 20.2% 25.0% 3 12 VORF2-4 gg(l 劑） 0% 8.3% 9.20 ±20.9% 66.7% 4 11 rORF2-16 pg(l 劑) 0% 18.2% 1.5〇 士 4.740/〇 36.3% 5 12 rORF2-8 pg(l 劑） 0% 8.3% 0.68 士 1.150/〇 16.7% 6 11 rORF2-4 pg(l 劑） 9.1% 9.1% 2_95 土 5.12〇/〇 36.4% 7 12 KV(2 劑） 16.7% 41.7% 7.27 士 22.9% 41.7% 8 10 攻毒對照 10% 80% 9.88 土 29.2% 90.0% 9 11 嚴格陰性對照 0% 63.6% 0/11(0%) 90.9%
vORF2=分離之病毒〇RF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ; KV或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒 此研究之結果指示所有其他疫苗研究計劃應集中於 rORF2疫苗。總的說來，攻毒後偵洌到PCV2之鼻排毒且用 116349.doc -57- 200800256 PCV2疫苗接種導致排毒減少。儘管在組間未偵測到 ADWG、臨床症狀及可見病灶方面之大的差異，但經選擇 淋巴組織之免疫組織化學亦用作疫苗功效之良好參數。如 由第9組，嚴格陰性對照組中之PCV2之鼻排毒、PCV2血清 轉化及陽性IHC組織證明，因在研究期間之有些點處引入 外來PCV2的事實而使此研究複雜化。 討論 在此研究中評估七種PCV2疫苗，其包括在第0天投予一 次之三種不同劑量含量之VORF2抗原、在第0天投予一次 之三種不同劑量含量之rORF2及在第0天及第14天投予之一 劑量含量之經滅活全細胞PCV2疫苗。總的說來，接受一 劑含有8 pg rORF2抗原之疫苗之第5組具有最佳結果。第5 組具有最高ADWG、最低異常行為發生率、最低異常呼吸 發生率、第二最低咳漱發生率、最低總臨床症狀發生率、 最低死亡率、最低PCV2之鼻排毒率、第二最低平均肺病 灶百分比比率及最低陽性IHC組織發生率。 有趣地是，接受比第5組更高劑量之rORF2抗原之第4組 未表現和第5組一樣好或表現比第5組好。與第5組相比， 第4組具有稍微較低ADWG、較高異常行為發生率、較高 總臨床症狀發生率、較高PCV2之鼻排毒率、較高平均肺 病灶百分比及較高陽性IHC組織比率。在此等資料中未進 行可能指示此等兩個組間之差異不具有統計上顯著性之統 計分析，但存在第4組表現不及第5組好之觀測趨勢。 疫苗接種後，6隻豬在第一試驗點死亡。該等六隻豬中 116349.doc -58 - 200800256 之四隻來自未接受疫苗之第8組或第9組。六隻豬中無一者 展現符合PMWS之病灶，無不良事件報導且總的說來，當 投予大約11日齡之豬隻時，所有七種疫苗看來為安全的。 在該研究之疫苗接種後期間，接受三劑量含量之VORF2疫 苗或經滅活全細胞疫苗之豬隻具有最高IFAT量，而在攻毒 前，疫苗組之第5組具有最低IFAT量。 儘管未正式證實，但咸信PCV2傳播至斷乳後不久之仔 豬之主要途徑係藉由口鼻直接接觸，且於生產環境中減少 PCV2之鼻排毒之有效疫苗將有助於控制感染之傳播。接 受三個vORF2抗原量中之一者之組及接受8 pg rORF2之組 具有最低PCV2之鼻排毒發生率（8.3%)。預料中地，攻毒對 照組具有最高鼻排毒發生率（8〇%)。 在具繼發於PCV2感染之PMWS之豬隻中的可見病灶通常 由與一或多種以下症狀組合之一般淋巴結病組成··（1)具有 小葉間水腫之間質性肺炎，（2)皮膚蒼白或黃疸，（3)斑點 狀萎縮性肝，（4)胃潰瘍，(5)腎炎及（6)生殖病症，例如流 產、死產、乾屍等。在屍體剖檢時，在任何組中未記錄黃 疸、肝炎、腎炎及胃潰瘍且未特定檢查淋巴結病。平均肺 病灶計分百分比在組間變化。接受16 pg vORF2抗原之組 具有最低平均肺病灶計分百分比（0.40±0.50%)，接著為接 受8 pg rORF2之組（0.68土1.15%)。如所預期，攻毒對照組 具有最高平均肺病灶計分百分比（9.88士29.2%)。在所有四 個組中，由於在此等組中之每一者中之一隻豬具有極高肺 病灶計分，因此平均肺病灶計分百分比升高。大多數肺病 116349.doc -59- 200800256 灶被描述為紅色/紫色且實化。通常，與PMWS相關之肺病 灶被描述為黃褐色且不可收縮，具有小葉間水腫。在此研 究中記錄之肺病灶與PCV2感染不相關或可能存在第二肺 傳染劑。在此研究範圍内，肺病灶計分百分比可能不反映 由PCV2所致肺感染量之真實量測。 其他研究人員已證明藉由IHC與組織病理學之PC V2抗原 存在間的直接相關性。在此研究中未進行關於選擇組織之 組織病理學。第1組（16 pg vORF2)及第5組（8 pg rORF2)具 有豬隻對PCV2抗原為陽性之最低發生率（8.3%)，而第9組 (嚴格陰性對照組-90.9%)及第8組（攻毒對照組-90.0%)具有 豬隻對PCV2抗原為陽性之最高發生率。由於此測試之非 主觀性，IHC結果可能為判斷疫苗功效之最佳參數之一。 因此，在本發明之一個態樣中，測定具所提取之PCV2 ORF2(rORF2)抗原之1毫升/1劑重組性產物在面對PCV2攻 毒之CDCD豬隻模型中的最小保護性劑量（MPD)。在接受 變化量之rORF2抗原之三個組中，第5組（8 pg rORF2抗原） 明顯具有最高保護量。第5組具有更佳結果或關於檢查之 所有參數具有最有利結果。當攻毒後，將第5組與其他六 個疫苗組進行比較時，第5組具有最高ADWG(0.94 士 〇·22磅/ 天）、最低異常行為發生率（〇%)、第二最低咳嗷發生率 (8·3%)、最低總臨床症狀發生率（8.3%)、最低死亡率 (〇%)、最低PCV2之鼻排毒率（8.3%)、第二最低平均肺病灶 百分比比率（0·68±1·15%)及最低陽性IHC組織發生率 (16.7%)。 116349.doc -60- 200800256 在本發明之另一態樣中，測定為部分純化之PCV2 ORF2(vORF2)抗原之1毫升/1劑習知產物在面對PCV2攻毒 之CDCD豬隻模型中的MPD。在接受變化量之VORF2抗原 之三個組中，第1組（16 pg VORF2)具有最高保護量。關於 AD WG、平均肺病灶百分比及IHC，第1組優於第2組及第3 組。關於臨床症狀之總發生率，第1組及第2組（8 pg vORF2抗原）同等地表現，第3組（4 pg vORF2抗原）具有最 低死亡率且關於鼻排毒，所有三個組同等地表現。總的說 來，vORF疫苗表現不及rORF疫苗好。 在本發明之另一個態樣中，測定最大劑量之2毫升/2劑 習知經滅活PCV2疫苗在面對PCV2攻毒之CDCD豬隻模型 中的功效。在此研究中所評估之七種疫苗中，經滅活全細 胞PCV2疫苗表現最差。接受兩劑經滅活全細胞PCV2疫苗 之仔豬具有最低ADWG、第二最高異常行為發生率 (58.3%)、第二最高臨床症狀總發生率（58·3%)、最高死亡 率（16.7%)、第二最高鼻排毒發生率（41.7%)、最高平均肺 病灶百分比（9·88土29.2%)、所記錄之高肺病灶發生率（75%) 及組織中之中等IHC發生率（41.7%)。然而，其在引起免疫 反應方面仍有效。 在本發明之另一態樣中，評估PCV2之鼻排毒作為功效 參數且再次證實來自先前研究之先前PCV2功效參數。自 此研究之結果指示在鼻内攻毒後，發生PCV2之鼻排毒且 PCV2疫苗減少攻毒後PCV2之鼻排毒。此外，此研究之結 果及文獻中之報導指示亦應繼續在將來的PCV2疫苗試驗 116349.doc -61- 200800256 中評估IHC。 自此研究中出現之一些額外結論為淋巴結病為PMWS之 一個標誌（hallmark)。PMWS之另一標誌為淋巴萎縮及多核 組織細胞/巨組織細胞。另外，對於7種PCV2疫苗中任一者 無不良事件或注射部位反應記錄且當投予仔豬時，所有7 種PCV2疫苗看來為安全的。 實例5 此實例測試八種PCV2候選疫苗之功效且再次證實來自 暴露於PCV2毒性菌株後之早期攻毒研究之PCV2攻毒參 數。將6-16日齡之一百五十（150)隻剖腹產術獲得之斷初乳 (CDCD)小豬按重量分組且隨機分成相同規模之10個組。 表16闡述用於此實例之通用研究設計。 表16·通用研究設計
組 豬隻 數 處理 處理之日 在第22天及 第28天之 KLH/ICFA 在第25天 用毒性 PCV2攻毒 在第46天之 PRRSV MLV 在第50 天屍體 剖檢 1 15 PVC2疫苗1 16 pg rORF2-IMS 1314 0 & 14 + + + + 2 15 PVC2疫苗2 16 pg vORF2-卡波普 0&14 + + + + 3 15 PCV2疫苗3 16 pg rORF2-卡波普 0&I4 + + + + 4 15 PCV2疫苗2 16 Hg vORF2-卡波普 0 + + + + 5 15 PVC2疫苗3 4pg rORF2-卡波普 0& 14 + + + + 6 15 PVC2疫苗3 1 m rORF2-卡波普 0& 14 + + + + I16349.doc -62- 200800256 7 15 PVC2疫苗3 0.25 pg rORF2-卡波普 0& 14 + + -------- + + 8 15 PVC2疫苗4 > 8.0 log KV-卡 波普 0 & 14 + + ------ 9 15 攻毒對照 N/A 十 + + 10 15 無疫苗-嚴格陰 性 對照組 N/A + - + ---— + vORF2=分離之病毒〇RF2 ; r〇RF2=重組性桿狀 ORF2 ; 或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物^ 1長之 給與每一組之疫苗調配物如下：以lx2 ml劑量投予第夏 組之1號PCV2疫苗為輔助有IMS 1314(16叫r〇RF2_iMs 1 3 14)之尚劑量（1 6微克/2毫升劑量）不活化重組性〇RF2抗 原。以1x2 nd劑量投予第2組之2號1>(：：¥2疫苗為辅助有卡 波普（16 VORF2-卡波普）之高劑量（16微克/2毫升劑量）部 分純化VIDO R_1產生的PCV2 〇RF2抗原。以1χ2瓜丨劑量投 予第3組之3號PCV2疫苗為辅助有卡波普（16 r〇RF2_ + 波普）之咼劑ϊ (16微克/2毫升劑量）不活化重組性〇11172抗 原。以lxl ml劑量投予第4組之4號1>(：¥2疫苗為辅助有卡 波普（16 pg v〇RF2·卡波普）之高劑量（16 μ§/1 ml劑量）部分 純化VIDO R-1產生的pCV2 〇RF2抗原。以1χ2劑量投予 第5組之5號疫苗為輔助有卡波普（4 gg r〇RF2_卡波普）之4 微克/2*升劑量之不活化重組性〇RF2抗原。以ΐχ2 ml劑量 投予第6組之6號PCV2疫苗為辅助有卡波普（丨r〇RF2-卡 波普）之1微克/2毫升劑量之不活化重組性〇RF2抗原。以 1 χ2 ml劑量投予第7組之7號pcv2疫苗為辅助有卡波普 116349.doc -63 - 200800256 (0·25 gg r〇RF2-卡波普）之低劑量（〇·25微克/2毫升劑量）不 活化重組性ORF2抗原。以1 χ2 ml劑量投予第8組之8號 PCV2疫苗為輔助有卡波普（>8.0 log KV-卡波普）之高劑量 (> 8.0 log/2 ml劑量之預不活化力價）不活化習知經滅活 VIDO R-1產生的PCV2 Struve抗原。在第0天，將第1至8組 用其指定之疫苗處理。在第14天，第1-3組及第5-8組再次 接受其各別疫苗之輔助。在第14天測試未接受輔助劑之第 4組單劑量16 gg v〇RF2-卡波普之有效性。在兩次疫苗接 種後，觀測仔豬之不良事件及注射部位。在第21天，將仔 褚移至弟一试驗點’其中第1 - 9組養於一個褚舍中且第1 〇 組養於另一豬舍中。在第22天及第28天，所有豬隻接受用 佛氏不完全佐劑乳化之匙孔螺血氰蛋白質（KLH/ICFA)。在 第25天，將第1-9組用大約4 logs毒性PCV2病毒攻毒。到 第46天為止，在攻毒對照組種出現極少死亡。在試圖免疫 刺激豬隻且增強PCV2攻毒材料之毒性過程中，在第46 天’將所有組用INGELVAC® PRRSV MLV(豬生殖及呼吸 疫苗，經改質活病毒）處理。 攻毒前後，收集血液樣品用於PCV2血清學。攻毒後， 收集測定平均每曰體重增加（ADWG)之體重資料及臨床徵 象之觀測結果。在第50天，將所有存活豬隻進行屍體剖 才双w己錄可見病灶、將肺計分用於病理學且將經選擇組織 保存於福馬林中用於日後藉由免疫組織化學（ihc)偵測 PCV2抗原之檢查。 ' 材料及方法 116349.doc -64- 200800256
此為在第0天，在6至16日齡之CDCD豬隻中進行之部分 盲法疫苗接種-攻毒可行性研究。在該研究中包括之母褚 之卩(^2卟八力價為幺1:1〇〇〇。另外，母豬之血清學狀態來 自已知PRRS-陰性畜群。測試十六（16)隻母豬PCV2血清學 狀態且所有十六（16)隻皆具有<1 〇〇〇之PCV2力，價且將其轉 移至第一試驗點。藉由剖腹產術手術分娩一百五十（I50)隻 仔豬且在第3天用於此研究。在第3天，將在第一試驗點之 150隻CDCD豬隻稱體重、用耳標標記、按重量分組且隨機 分配至如在以上表16中闡述之10個組中之1個組中。自所 有豬隻收集血液樣品。若滿足納入標準之任何測試動物參 加該研究且隨後由於任何原因而被排除，則研究者及監看 人員進行商議以決定自該動物收集之資料在最後分析中之 用途。記錄參加之仔豬被排除之日期及排除之理由。無滿 足該納入標準、經選擇用於該研究且送至第一試驗點之母 豬被排除。無仔豬自該研究排除且在結束前，無測試動物 自該研究移除。表17描述用於此實例之重要活動之時段。 表17·研究活動 研究之曰 實際曰期 研究活動 ___ -3 4-04-03 稱豬隻體重，健康檢查；隨機化成組；收隼血液樣品 -3 % 0-21 4- 04-03 4-07-03至 5- 27-03 觀測總健康及疫苗接種後之不良事件 0 4-07-03 向第1-8組投予各別ivp 0-7 4-07-03 至 4-14-03 觀測豬隻之注射部位反應 ~- —- 14 1 A 〇 1 4-21-03 Λ AO 14-21 4-21-03至 4-28-03 觀測豬隻心崎雜反應 —〜___ 116349.doc -65 - 200800256 19-21 21 4-26-03 至 4-28-03 用抗生素處理所有豬隻 4-28-03 22-50 4-28-03至 5-27-03 1-29-03 — 將豬隻自 Struve Labs，Inc·送至 Veterinary Resources，Inc. (VRI)___ 觀測豬隻攻毒後臨床徵象 22 用KLH/ICFA處理第1-10組
收集血液樣品、稱體重且屍^剖檢^ S樣;估 完成研究之存活生長期後’將經福馬林固定之組織由病 理學者猎由免疫組織化學(IHC)檢查镇測心2抗原而檢 查，評估i液樣品之PCV2血清特徵且測定自㈣天至第 49天之平均每日體重增加（ADWG)。 斤自出生至大_日齡(大約為該研究之第。天)，將動物在 第-試驗養於七料間中之個職巾。每—相布局相 同且由堆疊之個別不銹鋼籠組成’其中將加熱且過濾空氣 獨立供應至每一分離單元。每一房 、 ^ 厉间獨立加熱且通風，藉 此防止在房間之間的空氣交叉污染。將動物養於第二試驗 點之兩個不同豬舍中。將第1G組（嚴格陰性對照組）獨立養 於經改裝，肥育豬舍中且將第1-9組養於經改裝之產仔豬 舍中。將每一組養於獨立圍攔（每圍欄1415隻豬）且每一圍 欄提供每隻豬大約2.3平方,尺。將第2組、第4組及第8組關 入通道一側之三個相鄰圍攔中且將第丨組、第3組、第$ 組、第6組、第7組及第9組關人通道另—側之六個相鄰圍 116349.doc -66- 200800256 欄中。組分離係歸因於研究監看人員（study Monitor)對投 予第2組、第4組及第8組之疫苗的未完全不活化的擔心。 每一圍攔在具塑膠漏縫地板之抬高平臺上。圍欄下面之坑 充當糞便及排泄物之儲料槽。每一豬舍具有其自身獨立之 供暖及通風系統，幾乎不可能有豬舍間的空氣交叉污染。
在第一試驗點，自出生至大約3週齡，給仔豬餵以特定 调配之乳狀定糧。在第21天（大約4½週齡），使所有仔豬吃 固體狀特定混合之定糧。在第二試驗點，給所有仔豬餵以 適於其年齡及體重之習用未加藥之商業混合定糧（不限 量）。在兩個試驗點，亦不限量使用水。 在第19天、第2〇天及第21天，將所有測試豬隻用1() mL NAXCEL® ’在股臀部輪流肌注而處理。另外，出於各種 健康原因，將第11號豬隻（第在第10天用〇·5 mL NAXCEL®肌注而處理，將第13號豬隻（第1〇組）在第⑺天 用1 mL盤尼西林及1 mL PREDEF® 2X處理，將第4號豬隻 (第9組）在第U天用K0 mL NAXCEL⑧肌注而處理，且將^ 1號（第1組）、第4號及第11號豬隻在第14天用i 〇 NAXCEL®處理。 同時在兩個試驗點，豬隻受獸醫學護理。在第_3天進行 動物健康檢查且記錄於健康檢查記錄表中。在如由在第〇 天之觀測所決定，所有動物在疫苗接種之前具有良好健康 及營養狀態。在攻毒前’觀測到所有測試動物具有良好健 康及營養狀態。藉由再現’處置屠體及組織。將研究動物 之最後處理記錄於動物處置記錄上。 116349.doc -67- 200800256 在第0天及第14天’分配至第丨_3組及第5_8組之豬隻分 別接受使用3_0 mL無菌可換針頭型微量注射針及2〇 gxl/2，， 無菌針分別在右頸區及左頸區肌注之2〇 mL指定pcv2^ 田1-4。僅在第〇天，分配至第4組之豬隻接受使用3.〇瓜乙 無囷可換針頭型微量注射針及2〇 gxl/2，，無菌針在右頸區肌 注之1.0 mL 2號PCV2疫苗。 在弟22天所有測5式豬隻接受使用3 ·0 mL·無菌可換針頭 型微里注射針及20 gxp無菌針在左頸區肌注之2.〇 mL KLH/ICFA。在第28天，所有測試豬隻接受使用3 〇 mL# 囷可換針頭型微量注射針及2〇 gx丨"無菌針在右股臀部之 2.0 mL KLH/ICFA。 在第25天，分配至第卜9組之豬隻接受使用3 〇 m]L無菌 可換針頭型微量注射針及20 gx i"無菌針在右頸區肌注之 1.0 mL PCV2 ISUVDL 攻毒材料（3.98 logl。TCID5〇/mL)。使 用3.0 mL無菌可換針頭型微量注射針及鼻導管，將額外1〇 mL之相同材料經鼻注射（IN)投予每隻豬（每鼻孔〇·5 mL)。
在第46天’所有測試豬隻接受使用3 〇無菌可換針頭 型微量注射針及20 gxl”無菌針在右頸區肌注之2() mL INGELVAC⑧ PRRs MLV。投予 PRRSV MLV試圖增強 PCV2 攻毒材料之毒性。 在第-3天及自第〇天至第2丨天，每曰觀測測試豬隻之總 健康及不良事件。對每一隻豬之正常或異常行為、呼吸或 咳漱計分。將觀測結果記錄於臨床觀測記錄上。自第〇天 至第7天觀測所有測試豬隻，且自第14天至第21天進一步 116349.doc -68- 200800256 觀測第7組之注射部位反應。在第-3天、第25天及第50天 或在攻毒後發現豬隻死亡當天，藉由以校準標度稱每隻豬 之體重測定平均每日體重增加。將體重記錄於體重表中。 在隨機化之前，利用第_3天之體重將豬隻分組。利用第25 天及第50天之重量資料測定每隻豬在此等時間點時之平均 每曰體重增加（ADWG)。對於攻毒後及第50天前死亡之豬 隻，ADWG經調整以表示自第25天至死亡之日的ADWG。 為測定PCV2血清特徵，在第-3天及第14天，自每一仔 豬之眼眶靜脈竇收集靜脈全血。對於每一仔豬，藉由將無 菌毛細管插入一隻眼睛之内側眼角中而自眼眶靜脈竇收集 血液且將大約3.0 mL之全血汲入4.0 mL血清分離管（SST) 中。在第25天、第32天及第50天，使用20 gxlW Vacutainer® 針（Becton Dickinson and Company，Franklin Lakes，New Jersey)、 Vaccutainei·⑧持針器及13 mL SST，自前腔靜脈收集每隻豬 之靜脈全血。將在每一時間點之血液收集記錄於樣品收集 記錄上。使得在每一 SST中之血液凝結，隨後將每一 SST 離心且收集血清。將收集之血清轉移至無菌搭扣管中且儲 存於-70°C±10°C下直至日後測試為止。由BIVI-R & D人員 測試血清樣品中PCV2抗體之存在。 自第22天至第50天，每曰一次觀測豬隻之臨床症狀且對 正常或異常行為、呼吸或咳嗷計分。將觀測結果記錄於臨 床觀測記錄上。 第46號（第1組）及第98號（第9組）豬隻在第一試驗點死 亡。將此等死亡之兩者歸為出血死亡且不進行此等兩隻豬 116349.doc -69- 200800256 之屍體剖檢。在第二試驗點，將攻毒後及第5 〇天前死亡之 豬隻及在第5〇天安樂死之豬隻屍體剖檢。記錄任何可見病 灶且將具有病灶之肺葉百分比記錄於屍體剖檢報告表中。 將來自在第二試驗點屍體剖檢之每隻豬之扁桃體、肺、 心臟及％系膜淋巴結的組織樣品置放於具丨緩衝福馬林 之單一容器中；同時將來自上述相同器官之另一組織樣品 置放於 Whid-pak®(M-Tech Diagnostics Ltd·，Thelwall，UK) 中且將每一 Whirl-pak®置放於冰上。將每一容器適當標 記。將樣品收集記錄於屍體剖檢報告表中。之後，提交經 福馬林固定之組織樣品及診斷申請表用於IHC測試。根據 用於接收樣品、樣品及切片製備及染色技術之標準實驗室 私序進行IHC測試。將於whirl-paks®中之新鮮組織用冰袋 運送至Study Monitor用於儲存（_7〇°c 土 1〇。〇及用於將來可 能之使用。 將經1福馬林固定之組織由病理學者藉由IHC偵測pc；v2而 檢查且使用以下計分系統計分·· 〇=無；1 =陽性染色不足， 幾處；2=中等陽性染色，多處；及3 =大量陽極染色，彌漫 於整個組織。為分析之目的，認為〇之計分為„陰性"且認 為大於0之計分為”陽性”。 結果 以下給出此實例之結果。記錄到第46號豬隻及第98號豬 隻分別在第14天及第25天死亡。將此等死亡歸為出血死 亡。在第I5天’第11號豬隻（第D氣喘，同時呼吸急促。 另外，在此觀測期期間，所有豬隻行為、呼吸及咳嗽正常 116349.doc 200800256 且任何組無全身性不良事件記錄。在第0天疫苗接種後， 無注射部位反應記錄。在第14天疫苗接種後，第丨組豬隻 之十四（u)隻中之七⑺隻（50·0%)在第15天具有計分為,ς 之腫脹。第1組之十四（14)隻中之四（4)隻（28 6%)在第16天 仍具有為"2"之腫脹。在疫苗接種後’其他組無一者經歷
注射部位反應。 A
平均每曰體重增加（adwg)之結果呈現於下表18中。將 死於出血之第46號及第98號豬隻自組結果排除。接受一劑 i6吨VORF2-卡波普之第4組具有最高ADW(}(ii6 士 〇.2吟/ 天）’接著為第1組、第2組、第3組、第5組、第6組及第1〇組， 其具有自U7土0.23石旁/天至hll地天範圍内之awg。 第9組具有最低ADWG(0.88±(U9石旁/天），接著為第8組及第7 組’其分別具有0.93 士0.33磅/天及〇99±〇44磅/天之ADWG。 表18·組平均每日體重增加（ADWG)之概述 -f ---- N ~"XDWG-碑/天(第25天至第50天)或 經調整用於第50天前死亡之豬隻 1 rORF2-16 με-2 劑IMS 1314 14_ 1·08 土 0.30磅/天 2 vURF2-16 劑卡波普一 ~15 1.11±〇.16碎/天 3 Λ rORF2-16 μβ-2劑卡波普 15 1.07 ±0.21 磅/天 4 c vORF2-16 1 劑 士波普 15 1.16 ±0.26 碎/ 天 5 广 rORF2-4 1劑卡波普 ~15~ 1.07 土 0.26 磅/天 6 i:ORF2-l pg-2劑+油养 15 U1 ±0.26磅/天 7 〇 iORF2-(X25 ug-2劑卡波普 15 0.99 土 0.44磅 / 天 Ο 〇 KV > 8·0 l〇g-2劑卡波普 15 〇·93 ± 0·33 磅/天 y 1 Λ 攻毒對照 14 0.88 土 0.29磅/天 1U 嚴格陰性對照 15 1.07 ±0.23 磅/天 分離之病毒0RF2 ; r〇RF2=重組性桿狀病毒表現之 丄或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒 116349.doc -71 - 200800256 PVC2血清特徵結果呈現於下表19中。在第-3天，所有 十（10)組為PCV2血清反應陰性。在第14天，所有十（10)組 之PCV2力價仍然低（50-113之範圍）。在第25天，接受全細 胞滅活病毒疫苗之第8組具有最高PCV2力價（4617)，接著 為接受16 pg VORF2-卡波普之第2組、接受單劑量之16 pg vORF2-卡波普之第4組及接受16 pg rORF2-卡波普之第3 組，其分別具有2507、1920及1503之力價。在第32天（攻 毒後一週），第1-6組及第8組之力價自2360至76.19變化；而 第7組（0.25 pg rORF2-卡波普）、第9組（攻毒對照）及第10組 (嚴格陰性對照）分別具有382、129及78之力價。在第50天 (屍體剖檢之日），所有十（10)組展現高PCV2力價（21257)。 在第25天、第32天及第50天，接受兩劑16 pg rORF2-卡 波普之第3組具有比接受兩劑16μgrΌRF2-IMS1314之第l 組更高之抗體力價。在第25天、第32天及第50天，接受兩 劑16 pg VORF2之第2組具有比僅接受一劑相同疫苗之第4 組更高之力價。接受分別為16 pg、4 pg、1 jug及0.25 pg之 減少量之rORF2-卡波普的第3組、第5組、第6組、第7組在 第25天及第32天展現相對降低之抗體力價。 表19·組PCV2 IFA力價之概述 組 處理 第-3天 第Μ天** 第25天 氺** 第32天 第50天 氺氺傘氺 1 rORF2-16 pg，2劑IMS 1314 50 64 646 3326 4314 2 VORF2-16 pg-2劑卡波普 50 110 2507 5627 4005 3 rORF2-10 pg-2劑卡波普 50 80 1503 5120 6720 4 V〇RF2-16pg-l劑卡波普 50 113 1920 3720 1257 116349.doc -72- 200800256 5 rORF2-4 pg-1劑卡波普 50 ( ------- 1 ------ 6 rORP2-l pg-2劑卡波普 50 7 rORF2-0.25 pg-2劑卡波普 50 8 KV > 8.0 log-2劑卡波普 50 S 9 攻毒對照 50 5 10 嚴格陰性對照 50 5 經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中;κν或 *為計算之目的，將u〇〇之IFA力價指定為力價"5〇";將 26400之IFA力價指定為力價”12,8〇〇，， * *攻毒之日 ***屍體剖檢之日 以下呈現攻毒後臨床觀測之結果。表20包括異常行為、 異常呼吸、咳嗽及腹瀉之觀測結果。表21包括組臨床症狀 之總發生率之概述的結果且表22包括組攻毒後死亡率之概 述的結果。接受 16 gg rORF2-IMS 1314(第 1 組）、16 pg rORF2-卡波普（第3組）、1 pg r〇RF2-卡波普（第6組）、0·25 pg rORF2-卡波普（第7組）之豬隻及攻毒對照組（第9組）中之 豬隻的攻毒後異常行為、呼吸及咳漱之發生率低。接受16 pg vORF2-卡波普（第2組）、單劑量之16叫v0RF2-卡波普 (第4組）、4 pg rORF2-卡波普（第5組）、>8 log KV-卡波普 (第8組）之豬隻及嚴格陰性對照組（第10組）中之豬隻的攻毒 後異常行為、呼吸及咳嗽的發生率為零。 臨床症狀之總發生率在組間變化。接受16 pg vORF2-卡 波普（第2組）、單劑量16 pg vORF2-卡波普（第4組）之豬隻 及嚴格陰性對照組（第1 〇組）之豬隻具有0%之發生率；接受 116349.doc -73- 200800256 16 pg rORF2_卡波普（第3組）及1 pg rORF2-卡波普（第6組) 之豬隻具有6.7%之發生率；接受16 pg rORF2-IMS 1314(第 l組）之豬隻具有7.1%之總發生率；接受4μgrORF2-卡波普 (第5組）、0.25 pg rORF2-卡波普（第7組）及>8 log KV疫苗 之豬隻具有13·3%之發生率；且攻毒對照組（第9組）中之豬 隻具有I4·3%之發生率。 組間之總死亡率亦變化。接受2劑KV疫苗之第8組具有 20·0%之最高死亡率；接著為第9組攻毒對照組及接受0.25 pg fORF2-卡波普的第7組且分別具有14.3%及13.3%之死亡 率。接受一劑16 pg VORF2-卡波普之第4組具有6.7%之死 亡率。所有其他組第1組、第2組、第3組、第5組、第6組 及第10組具有〇%之死亡率。 表2〇·組之攻毒後異常行為、異常呼吸及咳嗽之觀測結 果的概述 組 處理 N 異常行為1 異常行為2 咳漱$ 1 rORF2-16ug-2 劑 IMS 1314 14 0/14(0%) 0/14(0%) 1/14(7.1%) 2 VORF2-16 劑卡波普 15 0/15(0%) 0/15(0%) 0/15(0%) 3 rORF2-16 μρ2劑卡波普 15 0/15(0%) 0/15(0%) 1/15(6.7%) 4 vORF2q6gg-l劑卡波普 15 0/15(0%) 0/15(0%) 0/15(0%) 5 rORF2_4 μ^ΐ劑卡波普 15 1/15(6.7%) 1/15(6.7%) 0/15(0%) 6 iC)RF2_l 劑卡波普 15 0/15(0%) 0/15(0%) 1/15(6.7%) 7 iORF2_a25 劑卡波普 15 0/15(0%) 1/15(6.7%) 1/15(06.7%) 8 KV > 8.0 l〇g-2劑+浊普 15 1/15(6.7%) 1/15(6.7%) 0/15(0%) 9 攻毒對照~^ 14 1/14(7.1%) 1/14(7.1%) 2/14(14/3%) 10 嚴格陰性對照 15 0/15(0%) 0/15(0%) 0/15(0%)
1展現任何異常行為歷時至少一天之每一組中之豬隻總數 2展現任何異常呼吸歷時至少一天之每一組中之豬隻總數 3展現咳漱歷時至少一天之每一組中之豬隻總數 116349.doc -74- 200800256 表21 ·組攻毒後臨床症狀之總發生率之概述 組 處理 N 具臨床症狀豬隻之 發生率1 發生率 1 rORF2-16 劑 IMS 1314 14 1 7.1% 2 VORF2-16 μ&2劑卡波普 15 0 0.0% 3 rORF2-16 pg-2劑卡波普 15 1 6.7% 4 vORF2-16pg-l劑卡波普 15 0 0.0% 5 rORF2-4 pg-1劑卡波普 15 2 13.3% 6 rORF2-l pg-2劑卡波普 15 1 6,7% 7 rORF2-0.25 pg-2劑卡波普 15 2 13.3% 8 KV> 8.0 log-2劑卡波普 15 2 13.3% 9 攻毒對照 14 2 14.3% 10 嚴格陰性對照 15 0 0.0%
vORF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ; KV或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒. 1展現任何臨床症狀歷時至少一天之每一組中之猪隻總數 表22·組攻毒後死亡率之概述 組 處理 N 攻毒後死亡 死亡率 1 rORF2_16，g-2 劑 IMS 1314 14 0 0.0% 2 VORF2-16 μ§-2劑卡波普 15 0 0.0% 3 rORF2-16 pg-2劑卡波普 15 0 0.0% 4 vORF2-16pg-l劑卡波普 15 1 6.7% 5 rORF2-4 pg-l劑卡波普 15 0 0.0% 6 rORF2-l |ig-2劑卡波普 15 0 0.0% 7 rORF2-0.25 pg-2劑卡波普 15 2 13.3% 8 KV> 8.0 log-2劑卡波普 15 3 20.0% 9 攻毒對照 14 2 14.3% 10 嚴格陰性對照 15 0 0.0%
V〇RF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ; KV或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒 116349.doc -75- 200800256 在下表23中給出組平均肺病灶百分比及臨時診斷之概 述。攻毒對照組第9組具有平均值為10.81=t23.27%之最高 肺病灶百分比，接著為接受0.25 gg rORF2-卡波普且具有 平均值為6.57士24.74%之第7組、接受4 pg rORF2-卡波普且 具有平均值為2.88士8.88%之第5組及接受KV疫苗且具有平 均值為2·01±4.98%之第8組。其餘六（6)個組具有在 0.11士0.38%至0.90士0.15%範圍内之較低平均肺病灶百分 比。 Φ 肺炎之臨時診斷在組間變化。接受兩劑16 pg rORF2-卡 波普之第3組具有13.3%之最低肺炎臨時診斷。攻毒對照組 第9組具有50%之組臨時診斷有肺炎，接著為嚴格陰性對 照組第10組及接受兩劑16 pg vORF2-卡波普的第2組，分 別具有46.7%及40%臨時診斷有肺炎。 第1組、第2組、第3組、第5組、第9組及第10組具有0% 之組臨時診斷為PCV2感染；而接受兩劑KV疫苗之第8組具 有20%之最高組臨時診斷為PCV2感染的比率。接受兩劑 W 0.25 pg rORF2-卡波普之第7組及接受一劑16 pg vORF2-卡 波普之第4組分別具有每一組13.3%及6.7%之PCV2感染的 組臨時診斷。 僅在第7組中之一隻豬中診斷出胃潰瘍（6.7%);而其他9 組仍然無胃潰瘍。 116349.doc -76- 200800256 表23·組平均肺病灶百分比及臨時診斷之概述 組 處理 N 排毒至少一天之豬隻數 發生率 1 rORF2-16 pg-2 劑 IMS 1314 15 0 0% 2 VORF2-16 pg-2劑卡波普 15 1 6.7% 3 rORF2-16 pg-2劑卡波普 15 3 20.0% 4 vORF2-16 pg-l劑卡波普 15 2 13.3% 5 rORF2-4 pg-l劑卡波普 15 3 20.0% 6 rORF2-l pg_2劑卡波普 15 6 40.0% 7 rORF2-0.25 pg-2劑卡波普 15 7 46.7% 8 KV> 8.0 log-2劑卡波普 15 12 80% 9 攻毒對照 14 14 100.0% 10 嚴格陰性對照 15 14 93.3%
vORF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ; KV或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒 組IHC陽性發生率結果之概述展示於下表24中。第1組 (16 pg rORF2-IMS 1314)具有0%之豬隻對於？(3¥2為陽性之 最低組IHC陽性結果比率，接著為第2組（16 pg vORF2-卡 波普）及第4組（單劑量16 pg vORF2-卡波普），其分別具有 6.7%及13.3%之組IHC比率。攻毒對照組第9組具有100%之 豬隻對於PCV2為陽性之最高IHC陽性發生率，接著為分別 93.3%及80%之豬隻對於PCV2為陽性之嚴格陰性對照組之 第10組及第8組（KV疫苗）。 表24.組IHC陽性發生率之概述 組 處理 N 排毒至少一天之豬隻數 發生率 1 K)RF2-16 pg-2 劑 IMS 1314 15 0 0% 2 V〇RF246pg-2劑卡波普 15 1 6.7% 3 K)RF2-16 pg-2劑卡波普 15 3 20.0% 116349.doc -77- 200800256 4 vOR]F2-16 pg，1 劑卡波普 15 2 13.3% 5 rORF2-4 pg-1劑卡波普 15 3 20.0% 6 rORF2-l pg-2劑卡波普 15 6 40.0% 7 rORF2-0.25 pg-2劑卡波普 15 7 46.7% 8 KV> 8.0 log-2劑卡波普 15 12 80% 9 攻毒對照 14 14 100.0% 10 嚴格陰性對照 15 14 93.3% vORF2=分離之病毒ORF2 ; rORF2=重組性桿狀病毒表現之 ORF2 ; KV或經滅活之全細胞病毒=在適當細胞培養物中生長之 PCV2病毒 討論 在此實例中評估七種PCV2疫苗，其包括投予兩次，辅 助有IMS 1314之高劑量（16 pg)rORF2抗原；向一組豬隻投 予一次且向第二組豬隻投予兩次，辅助有卡波普之高劑量 (16 pg)vORF2抗原；投予兩次，輔助有卡波普之高劑量 (16 pg)rORF2抗原；投予兩次，辅助有卡波普之4 pg劑量 之rORF2抗原；投予兩次，輔助有卡波普之1 pg劑量之 rORF2抗原；投予兩次，輔助有卡波普之低劑量（0.25 pg)i:ORF2抗原；.及輔助有卡波普之高劑量（>8 log)經滅活 全細胞PCV2疫苗。總的說來，接受兩劑16 pg IORF2-IMS 13 14之第1組比接受含有各種量之輔助有卡波普之vORF2 或rORF2抗原的疫苗的第.2組至第7組表現稍好且比接受兩 劑滅活全細胞PCV2疫苗之第8組好得多。第1組具有第三 最高ADWG(1.80士0.3 0磅/天）、最低異常行為發生率（0%)、 最低異常呼吸發生率（〇%)、低咳嗽發生率（7.1%)、低總臨 床症狀發生率（7.1%)，與其他三個組關於最低死亡率 (0%)、第二最低平均肺病灶百分比比率（0.15土0.34%)、第 116349.doc -78- 200800256 二最低肺炎比率（21.4%)及最低陽性IHC組織發生率（〇%)聯 繫在I然而，第1組為在第二疫苗接種後1天記錄注射 部位反應之唯一組（包括5〇%之疫苗接種）。投予第2組至第 7、、且之八他疫田比經滅活疫苗表現好且幾乎與投予第1組之 疫苗一樣好。 接受辅助有卡波普之兩劑滅活PCV2疫苗之第8組具有對 於任何疫苗組的最差結果集合。第8組具有最低 ADWG(0‘93±0.33磅/天）、第二最高異常行為發生率 • (6·7%)、最高異常呼吸（6·™)發生率，與其他三個組關於 最高臨床症狀總發生率（133%)聯繫在一起，具有所有組 中最南死亡率（20%)且具有任何疫苗組中之最高陽性mc比 率（80%)。存在對於滅活全細胞PCV2疫苗在投予第8組之 前可能未完全不活化（其可能解釋此組之不良結果）之擔 心。不幸地，未獲得確定資料以證實此擔心。總的說來， 在此實例範圍中，習知滅活PCV2疫苗在減少與疾病相關 之PCV2方面未給予幫助。 _ 如先前所述，除辅助有I]V[S 13 14之疫苗外，無不良事件 與測試疫苗相關。用IMS 1314調配之疫苗進行第二疫苗接 種後1天，在5〇.〇%之豬隻及在第二疫苗接種後2天，在 28.6%之豬隻中記錄注射部位反應。在接受卡波普輔助疫 苗之任何豬隻中無反應記錄。包括接種有IMS 1314辅助疫 苗之豬隻之任何其他研究應繼續密切監控豬隻注射部位反 應。 所有豬隻在第-3天對於PCV2為血清反應陰性且僅第2組 116349.doc -79- 200800256 在第I4天具有100以上之力價。在第25天（攻毒之曰），第8 組具有最高PCV2抗體力價（4619)，接著為第2組（2507)。♦ 除第7組、第9組及第10組外，到第32天為止，所有組展現 強抗體反應。到第50天為止，包括第7組、第9組及第1〇組 之所有組展現強抗體反應。 後期PCV2感染及隨後之PMWS背展之一個標誌為在斷乳 豬隻中生長遲缓且在嚴重情況下記錄到體重減輕。組之平 均每日體重增加為顯示生長遲緩或體重減輕之定量方法。 在此實例中，不存在組間ADWG之大差異。第8組具有 0.88土0·29磅/天之最低ADWG，而第4組具有1·16±0·26石旁/ 天之最南AD WG。在此研究之範圍内，不存在基於ad WG 之將來疫苗功效之組間充分差異。 除體重減輕外，呼吸困難、嗜睡（leghargy)、皮膚蒼白 及有時黃疸為與PMWS相關之臨床症狀。在此實例中，對 於母一組’偶爾記錄到異常行為及異常呼吸及咳傲。如在 此研究中證明，此攻毒模型及攻毒病毒株不引起無法抵抗 之臨床症狀且此非疫苗功效之基礎的有力參數。 總的說來，在此實例中死亡率不高且在攻毒對照組中缺 乏高死亡率會限制作為疫苗功效基礎之此參數。在第46天 前，第4組及第7組每一者十五隻豬中有一隻死亡，第9組 十四隻豬中有兩隻死亡且第8組十五隻豬中有三隻死亡。 由於第9、卫攻毋對照組未展現PCV2臨床症狀且到第46天 為止，此組中出現僅兩例死亡，因此在第粍天將豬呼吸及 生殖症候群病毒（PRRS V)MLV疫苗投予所有豬隻。早期研 116349.doc -80- 200800256 究已利用INGELVAC® PRRS MLV作為免疫刺激劑加劇 PCV2相關之PMWS疾病且在此等早期研究中死亡率較高。 在第46天投予PRRS疫苗後不久發生兩例死亡-第4組具有一 例死亡且第7組在第47天具有一例死亡-其可能與PRRS疫苗 之投藥不相關。到第50天為止，接受兩劑滅活疫苗之第8 組具有最高死亡率（20%)，接著為分別具有14.3%及13.3% 死亡率之第9組（攻毒對照）及第7組（0.25 pg rORF2-卡波 普）。總的說來，在此實例之攻毒後觀測期不久將PRRS疫 苗投予攻毒模型不會顯著提高死亡率。 在具繼發於PCV2感染之PMWS之豬隻中的可見病灶通常 由與一或多種以下症狀組合之一般淋巴結病組成：（1)具有 小葉間水腫之間質性肺炎，（2)皮膚倉白或黃症’（3)斑點 狀萎縮性肝，（4)胃潰瘍，（5)腎炎及（6)生殖病症，例如流 產、死產、乾屍等。在屍體剖檢（第50天）時，未在任何組 中記錄到黃疸、肝炎及腎炎。在第7組之一隻豬中記錄下 胃潰瘍，但未特定檢查淋巴結病。基於符合PCV2感染之 病灶之存在，三個組有至少一隻豬臨時診斷有 PCV2(PMWS) 〇接受兩劑滅活疫苗之第8組有20%臨時診斷 有PCV2，而第7組及第4組分別有13.3%及6.7%臨時診斷有 PCV2。在屍體剖檢時，平均肺病灶計分百分比在組間變 化。第1組、第2組、第3組、第4組、第6組及第10組具有 0· 11 士0.38%至0.90土0.15%範圍内之低肺病灶計分百分比。 如所預期，攻毒對照組第9組具有最高平均肺病灶計分百 分比（10.81 土23.27%)。在四個組中，由於在每一個此等組 116349.doc -81 - 200800256 中之一至三隻豬具有極高肺病灶計分，因此平均肺病灶計 分百分比升高。大多數肺病灶為紅色/紫色且實化。通 常，與PMWS相關之肺病灶被描述為黃褐色、不可收縮且 具有小葉間水腫。在此研究中記錄之肺病灶與PCV2感染 不相關或可能存在第二肺傳染劑。在此研究範圍内，肺病 灶計分百分比可能不反映由PCV2所致肺感染量之真實量 測。同樣，亦可能過度利用肺炎之臨時診斷。具有一些小 至0· 10%之肺病灶之任何豬隻被列為具有臨時診斷之肺 炎。在此實例中，不存在關於作為疫苗功效基礎之可見病 灶及肺病灶百分比之組間充分差異。 IHC結果展示組間之最大差異。第1組（16 pg rORF2-IMS 1314)具有對於PCV2抗原之最低陽性IHC結果（0%);而第9 組及第10組具有分別為100%及93.3%之發生率之最高陽性 IHC結果。分別接受 16 pg、4 pg、1 pg或 0.25 gg rORF2抗 原之第3組、第5組、第6組及第7組具有分別為20%、 20%、40%及46.7%之IHC陽性率。接受兩劑輔助有卡波普 之16 pg VORF2之第2組具有6.7%之IHC陽性率，而僅接受 一劑相同疫苗之第4組具有13.3%之IHC陽性率。由於此測 試之客觀性及IHC結果與預期結果相關之事實，IHC測試 可能為疫苗功效基礎之最佳參數之一。 因此，在本發明之一個態樣中，測定輔助有卡波普之 PCV2 rORF2抗原在面對PCV2攻毒之CDCD豬隻模型中之 最小保護性劑量（MPD)。第3組、第5組、第6組及第7組各 自接受兩劑辅助有卡波普之rORF2抗原，但rORF2抗原之 116349.doc -82 - 200800256 量對於每一組不同。第3組、第5組、第6組及第7組分別各 自接受16 pg、4 pg、1 gg或0·25 pg rORF2抗原。通常，減 少rORF2抗原之量會降低PCV2抗體力價且提高死亡率、平 均肺病灶百分比及IHC陽性組織之發生率。在接受不同量 之rORF2-卡波普之四個組中，分別接受兩劑16 pg rORF2 抗原或4 pg rORF2抗原之第3組及第5組各自具有僅20%之 IHC陽性率且各自具有類似抗體力價。總的說來，基於 IHC陽性結果，投予兩次之rORF2抗原之最小保護性劑量 大約為4 pg。 在本發明之另一態樣中，評估重組性（rORF2)及VIDO R-l(vORF2)PCV2抗原之抗原性。第2組接受兩劑16 pg vORF2且第3組接受兩劑16 pg rORF2。兩種疫苗輔助有卡 波普。發現兩種疫苗安全且兩者具有〇%之死亡率。在第 25天，第2組具有2507之PCV2抗體力價，而第3組具有 1503之PCV2抗體力價。第3組具有比第2組低之平均肺病 灶計分百分比（0.11 士0.38%對〇·9Ό士0.15%)，但第2組具有比 第3組低之IHC陽性發生率（6.7%對20%)。總的說來，兩種 疫苗具有類似抗原性，但vORF2與稍微較佳之IHC結果相 關。 在本發明之另一態樣中，測定兩種不同佐劑（卡波普及 IMS 13 14)之適用性。第1組及第3組兩者接受兩劑含有16 pg rORF2抗原之疫苗，但第1組接受辅助有IMS 1314之抗 原，而第3組接受輔助有卡波普之抗原。兩個組具有基本 上相同之ADWG、基本上相同之攻毒後臨床徵象發生率、 116349.doc -83- 200800256 相同死亡率及基本上相同之平均肺病灶百分比；但第ι組 具有0%之IHC陽性率而第3組具有20%之IHC陽性率。然 而，接受辅助有卡波普之疫苗的第3組在第25天、第32天 及第50天具有比接受輔助有丨!^^ 1314之疫苗的第i組高之 IFAT PCV2力價。總的說來，儘管輔助有11^ 1314之PCV2 疫苗未產生更佳IHC結果，但其未提供壓倒性的更佳保護 以免PCV2感染且確實誘發注射部位反應。而辅助有卡波 普之PCV2疫苗表現幾乎與IMS 13 14輔助之疫苗一樣好， 但不與任何不良事件相關。 在本發明之另一態樣中，測定PCV2 ORF2作為1 mi i劑 量產物之可行性。第2組及第4組兩者在第〇天接受辅助有 卡波普之VORF2疫苗，而第2組在第14天接受第二劑。第4 組具有比第2組稍高之ADWG及比第2組低之平均肺病灶百 为比’但苐2組在弟25天、弟32天及第50天具有較高ip* at PC V2力價及稍低IHC陽性組織發生率。此等兩個組之所有 其他結果類似。總的說來，輔助有卡波普之一劑vqrF2與 兩劑相同疫苗表現類似。 【圖式簡單說明】 圖1為較佳建構PCV2 ORF2重組性桿狀病毒之示意性流 程圖；及 圖2a及圖2b各自為如何產生根據本發明使用之組合物之 一者的示意性流程鼠。 116349.doc -84·

Claims (1)

  1. 200800256 十、申請專利範圍： 1 · 一種醫藥組合物，其係用於減緩或減輕與1>(：¥2感染相關 之臨床症狀之嚴重性、減輕動物之總豬環狀病毒負荷量 及/或降低豬隻之豬環狀病毒感染的免疫抑制效應，其包 含有效量之豬2型環狀病毒抗原。 2.如睛求項1之醫藥組合物，其中該抗原包含由與豬2型環 狀病毒之ORF2具有至少8〇%序列一致性之〇1^八序列編碼 的蛋白質。 3·如請求項1及2中任一項之醫藥組合物，其中該豬2型環 狀病毒抗原為重組性桿狀病毒表現之〇RF2抗原。 4.如请求項1或2之醫藥組合物，其中該豬2型環狀病毒抗 原係調配成每劑量一毫升。 5·如請求項1或2之醫藥組合物，其中該等臨床症狀係選自 由淋巴結病、淋巴萎縮及多核組織細胞或巨組織細胞組 成之群。 6·如請求項5之醫藥組合物，其中該等淋巴結病、淋巴萎 縮及/或多核組織細胞或巨組織細胞係與選自由下列症狀 組成之群的另一症狀組合：具有小葉間水腫之間質性肺 炎、皮膚蒼白或黃疸、斑點狀萎縮性肝、胃潰瘍、腎 炎、Pia樣病灶及生殖病症。 7如哨求項1或2之醫藥組合物，其中該等豬隻小於Η週 齡。 8·如請求項1或2之醫藥組合物，其中該等豬隻不大於3週 齡’較佳不大於2週齡。 116349.doc 200800256 9. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該組合物係用於在暴 鉻於毒性豬2型環狀病毒抗原的約3週内投藥該抗原。 10. 如請求項1或2之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含 至少一種選自由獸醫學上可接受之載劑、醫藥學上可接 5：之載劑及免疫調節劑組成之群的額外組份。 11. 如請求項丨或2之醫藥組合物，其中該組合物係用於投藥 該抗原，且該投藥係選自由下列所組成之群：皮層内、 氣管内、陰道内、肌肉内、鼻Θ、靜脈内、血管内、動 脈内、腹膜内、經口、鞘内、皮下、皮内、心臟内、小 葉内、骨髓内或肺内。 12·如明求項1或2之醫藥組合物，其中該組合物係用於投藥 該抗原，且δ亥投藥不展示不良事件或注射部位反應。 13. —種用於改善豬隻全身疾病抗性程度之醫藥組合物，其 包含有效量之豬2型環狀病毒抗原。 種製蕖物之方法，該藥物係用於減緩或減輕與 感^相關之臨床症狀之嚴重性、減輕動物之總豬環狀病 毒負荷量或降低豬環狀病毒感染之免疫抑制效應，該方 法包含獲得豬環狀病毒抗原且將該抗原與獸醫學上可接 受之載劑、醫藥學上可接受之載劑或免疫調節劑組合之 步驟。 1 5 ·如 #青求項 14 之 、、+ , 方去’其中該抗原包含由豬2型環狀病毒 之ORF2編碼之多肽。 16·二豬2型環狀病毒抗原之用途，其係用於製備藥物， 該藥物係用於減緩或減輕與PCV2感染相關之臨床症狀之 116349.doc 200800256 嚴重性、減輕動物之總豬環狀病毒負荷量及/或降低豬隹 之豬環狀病毒感染的免疫抑制效應’其中該藥物係投； 豬隻。 每狀病 碼的蛋 17.如請求項16之用途，其中該抗原包含由與豬2型 毒之ORF2具有至少80%序列一致性之Dna序列編 白質。 18·如請求項16及17中任一項之用祕，甘士 # ^ … 貞之用m，其中該豬2型環狀病 毒抗原為重組性桿狀病毒表現之〇RF2抗原。 19. 如請求項16或17之用途’其中該豬2型環狀病毒抗原係 經調配且以每劑量一（1)毫升投予。 20. 如請求項16或17之用途，其中該等臨床症狀係選自由淋 巴結病、淋巴萎縮及多核組織細胞或巨組織細胞組成之 群。 21·如請求項20之用途，其中該等淋巴結病、淋巴萎縮及/或 多核組織細胞或巨組織細胞係與選自由下列症狀組成之 群的另一症狀組合：具有小葉間水腫之間質性肺炎、皮 膚蒼白或黃疸、斑點狀萎縮性肝、胃溃瘍、腎炎、pia樣 病灶及生殖病症。 22·如請求項16或17之用途，其中該投藥係發生於小於^週 齡之豬隻中。 23·如請求項16或17之用途，其中該投藥係發生於不大於3 週齡，較佳不大於2週齡之豬隻中。 24.如請求項16或17之用途，其中該投藥係在暴露於毒性豬 2型環狀病毒抗原的約3週内。 116349.doc 200800256 25. 如請求項16或17之用途，其中該組合物進一步包含至少 一種選自由獸醫學上可接受之載劑、醫藥學上可接受之 載劑及免疫調節劑組成之群的額外組份。 26. 如請求項16或17之用途，其中該投藥為皮層内、氣管 内、陰道内、肌肉内、鼻内、靜脈内、血管内、動脈 内、腹膜内、經口、鞘内、皮下、皮内、心臟内、小葉 内、骨髓内或肺内投藥。 27. 如請求項16或17之用途，其中該豬2型環狀病毒抗原之 投藥不展示不良事件或注射部位反應。 28· —種豬2型環狀病毒抗原之用途，其用於製備用於改善 豬隻全身疾病抗性程度之藥物。 116349.doc 200800256 序列表 <110> 美商百靈佳殷格翰家畜藥品公司 <120> PCV2免疫性組合物於減輕豬隻臨床症狀之用途 <130> 34816-CIP1 <140> 095149552 <141> 2006-12-28 <150> 60/755,016; 60/829,809 <151> 2005-12-29; 2006-10-17 <160> 11 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 8 <212 > DNA <213> 人工 <220> <223> 此為經修飾之Kozak序列。 <400> 1 ccgccatg 116349-seq.doc 200800256 <210> 2 <211> 6 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 此為重組性EcoRl序列。 <400> 2 gaattc <210> 3 <211> 713 <212> DNA <213> 諸$哀狀病毒 <400> 3 cagctatgac ttggccagat gaaggaaaaa aggaaaaatg ttgttccccc gaaaggttaa gctccactgc acccatatgt gttacttcac aaaggaatca gcactgcgtt tacaattcag gtatccaagg cctccgccgc tggcatcttc gcatcttcaa gggagggggg ggttgaattc tgttattcta aaactactcc acccaaacct gctttggctg cgaaaacagt agaatttaat aggcgttacc cgcccctggc aacacccgcc cacccgcctc accaacaaaa tggccctgct gatgataact tcccgccata gttcttgact aggctacaaa aaatacgacc cttaaagacc gcagaagaag tcgtccaccc tctcccgcac tcccgcacct tctctatacc cccccatcac ttgtaacaaa caatccccca ccactattga cctctagaaa aggactacaa ccccacttaa acaccgcccc ccgccaccgc cttcggatat tcggatatac ctttgaatac ccagggtgat ggccacagcc acccttctcc ttacttccaa tgtggaccac tatccgtgta accctaaatg cgcagccatc taccgttgga actgtggaga tgtgacgact tacagaataa aggggagtgg ctaacctatg taccactccc ccaaataaca gtaggcctcg accatgtatg aat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 713 <210> 4 116349-seq.doc -2- 200800256 <211> 713 <212> DNA <213> 豬環狀病毒 <400> 4 ccgccatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg 180 ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360
    gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc 713 <210> 5 <211> 233 <212> PRT <213> 猪環狀病毒 <400> 5 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15 Ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 116349-seq.doc 200800256 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95
    Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr 100 105 110 Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 13 0 135 140 Ser Ser Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160
    Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe -4- 116349-seq.doc 200800256 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230
    <210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> 豬環狀病毒 <400> 6 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15 Ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 35 40 45
    Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Thr Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys He Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg lie Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr 100 105 no 116349-seq.doc 200800256 Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175
    Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Arg Asn 180 185 190 ^ Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205 Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro 225 230 <210> 7 <211> 756 <212> DNA <213> 人工 <220> < 2 2 3 > 此序列係來自豬2型環狀病毒之開放閱讀框架2連同來自pGEM T-easy載體之一部分 -6- 116349-seq.doc 200800256 <400> 7 gcggccgcgg gaattcgatc cgccatgacg tatccaagga ggcgttaccg cagaagaaga 60 caccgccccc gcagccatct tggccagatc ctccgccgcc gcccctggct cgtccacccc 120 cgccaccgct accgttggag aaggaaaaat ggcatcttca acacccgcct ctcccgcacc 180 ttcggatata ctgtcaaggc taccacagtc acaacgccct cctgggcggt ggacatgatg 240 agatttaata ttgacgactt tgttcccccg ggagggggga ccaacaaaat ctctataccc 300 tttgaatact acagaataag aaaggttaag gttgaattct ggccctgctc ccccatcacc 360 cagggtgata ggggagtggg ctccactgct gttattctag atgataactt tgtaacaaag 420 gccacagccc taacctatga cccatatgta aactactcct cccgccatac aatcccccaa 480 cccttctcct accactcccg ttacttcaca cccaaacctg ttcttgactc cactattgat 540 tacttccaac caaataacaa aaggaatcag ctttggctga ggctacaaac ctctagaaat 600 gtggaccacg taggcctcgg cactgcgttc gaaaacagta aatacgacca ggactacaat 660 atccgtgtaa ccatgtatgt acaattcaga gaatttaatc ttaaagaccc cccacttgaa 720 ccctaagaat tctatcacta gtgaattcgc ggccgc 756
    <210> 8 <211> 10387 <212> DNA <213> 人工
    <220> < 2 2 3 > 此為包括桿狀病毒及pGEM T-easy編碼序列之豬2型環狀病毒之ORF2構築體。 <400> 8 aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60 gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120 ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180 gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240 ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300 116349-seq.doc 360 360
    200800256 gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 116349-seq.doc 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280
    200800256 gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcagatctg cagcggccgc gggaattcga tccgccatga cgtatccaag gaggcgttac cgcagaagaa gacaccgccc ccgcagccat cttggccaga tcctccgccg ccgcccctgg ctcgtccacc 116349-seq.doc -9- 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3 660 3720 37 80 3840 3900 3960 402 0 4080 4140 4200 4260 200800256
    cccgccaccg ctaccgttgg agaaggaaaa atggcatctt caacacccgc ctctcccgca 432 0 ccttcggata tactgtcaag gctaccacag tcacaacgcc ctcctgggcg gtggacatga 4380 tgagatttaa tattgacgac tttgttcccc cgggaggggg gaccaacaaa atctctatac 4440 cctttgaata ctacagaata agaaaggtta aggttgaatt ctggccctgc tcccccatca 4500 cccagggtga taggggagtg ggctccactg ctgttattct agatgataac tttgtaacaa 4560 aggccacagc cctaacctat gacccatatg taaactactc ctcccgccat acaatccccc 4620 aacccttctc ctaccactcc cgttacttca cacccaaacc tgttcttgac tccactattg 4680 attacttcca accaaataac aaaaggaatc agctttggct gaggctacaa acctctagaa 4740 atgtggacca cgtaggcctc ggcactgcgt tcgaaaacag taaatacgac caggactaca 4800 atatccgtgt aaccatgtat gtacaattca gagaatttaa tcttaaagac cccccacttg 4860 aaccctaaga attctatcac tagtgaattc gcggccgccg gccgctccag aattctagaa 4920 ggtacccggg atcctttcct gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa 4980 atccgtaatg ttaaacccga cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc 5040 tacagggaaa cttggacccg cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa 5100 gtgatggatg ttttccttgt tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa 5160 ttcctggccc aacacgctct gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg 5220 atcgtcgagc cttcatgggt gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag 5280 ggcggcggct gcccaataat gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc 5340 atcgatcgtg tcatctggga gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct 5400 gctgaagagg aggaaattct ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca 5460 ccagacgcac ctctgttcac tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac 5520 atttattaag cgctagattc tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt 5580 aataattcat taaatttata atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt 5640 tcagcgtctt tatatctgaa tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt 5700 cgattagttt caaacaaggg ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt 5760 tcgctcaacg ccacaaaact tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc 5820 gtttgtgttt tgttttgtaa taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta 5880 tttctttcat cactgtcgtt agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct 5940 tggacatatt taacatcggg cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa 6000 ccctcgtcgt tagaagttgc ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta 6060 attgtgtcgg ctaacacgtc cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct 6120 gattgcgggc gtttttgggc gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac 6180 116349-seq.doc -10- 200800256
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    <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> 豬壞狀病毒 <400> 9 Ser Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His His Pro Pro Ser 1 5 10 15 His Leu Gly Gin 20
    <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> 豬環狀病毒 <400> 10 Pro Arg His His Tyr Arg Pro Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr 1 5 10 15 Thr Leu Ser 116349-seq.doc 13- 200800256 <210> 11 <211> 233 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>此為豬2型環狀病毒之開放閱讀框架2之胺基酸序列。
    <400> 11 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 l〇 15 Ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn lie Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 1 Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys lie Ser lie Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg lie Lys Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr -14- 116349-seq.doc 200800256 100 105 110 Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val lie Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr lie Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160
    Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr lie Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Arg Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser lie Tyr Asp 195 200 205 Gin Asp Tyr Asn lie Arg Val Thr Met Tyr Val Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230 15- 116349-seq.doc
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