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CN116457004A - 用于保护猪免于各种疾病的组合疫苗 - Google Patents

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CN116457004A
CN116457004A CN202180074047.0A CN202180074047A CN116457004A CN 116457004 A CN116457004 A CN 116457004A CN 202180074047 A CN202180074047 A CN 202180074047A CN 116457004 A CN116457004 A CN 116457004A
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CN
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don
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conjugated
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R·P·A·M·西格斯
M·H·威特夫莱特
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Intervet International BV
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Abstract

本发明涉及一种用于保护猪免于猪圆环病毒2型感染、猪肺炎支原体感染和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导的霉菌中毒的疫苗，其包含组合的猪圆环病毒2型(PCV2)的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原和缀合的DON。

Description

用于保护猪免于各种疾病的组合疫苗
技术领域
本发明总体上属于猪健康领域。猪容易感染许多致病微生物和遭遇不良事件，如动物饲料中存在的真菌毒素中毒。这些方面的控制通常通过农场和饲料管理、抗病毒药物和抗生素等药物治疗、使用疫苗进行预防性治疗、使用毒素粘合剂处理饲料等方式进行。例如，几乎所有的猪都容易感染猪圆环病毒2型(PCV2或PCV-2)和猪肺炎支原体(Mhyo)，以及由动物饲料中存在的霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导的真菌中毒。
背景技术
PCV-2与在仔猪中观察到的断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)有关。这种疾病于1991年在加拿大首次出现。临床体征和病理首次发表于1996年，包括进行性消瘦、呼吸困难、呼吸急促，偶尔出现黄疸和黄疸。
Nayar等，Can.Vet.J.Volume 38,June 1997在有PMWS临床症状的猪上检测到了PCV，并得出结论，除了已知的PK-15细胞自然宿主PCV外，PCV可能与PMWS有关。后来出版的(Hamel等，J.Virol.,72(6),5262-5267,1998；Meehan等，J.Gen.Virol.,79,2171-2179,1998)证实了这些发现，并且有人建议(Meehan等，同上)将新的致病性PCV称为PCV-2，而最初的PK-15细胞培养分离物(Tischer等，Nature295,64-66,1982)则应称为PCV-1。
PCV-2是一种小的(17-22nm)二十面体非包膜病毒，含有一个环状单链DNA基因组。PCV-2基因组的长度约1768bp。来自世界不同地区的PCV-2分离株之间关系密切，显示出约95至99％核苷酸序列同一性(Fenaux等，J.Clin.Micorbiol.,38(7),2494-2503,2000)。PCV的ORF2编码病毒的衣壳蛋白。PCV-2的ORF2基因编码约233个氨基酸的蛋白质。所有PCV-2分离株的ORF2基因具有91-100％核苷酸序列同一性和90-100％的推导氨基酸序列同一性。
猪肺炎支原体是一种已知可引起猪地方性肺炎的细菌，这是一种影响猪的高度传染性和慢性疾病。Mhyo体积小(400-1200nm)，有一个小的基因组(893-920千碱基对(kb))并缺乏细胞壁。Mhyo附着在猪的肺部上皮细胞的纤毛上。它们导致纤毛停止跳动、结块和纤毛丢失，最终导致上皮细胞死亡。这是猪地方性肺炎猪肺部病变的来源。这种损伤阻碍了正常的纤毛清除，并且经常会发生继发性感染。这导致动物体重的显著下降。此前据估计，美国的损失每年高达10亿美元。猪流行性肺炎在全世界流行，Mhyo几乎存在于所有猪群中。猪体内存在Mhyo所诱发的免疫反应缓慢且无效。因此这种疾病的治疗是最重要的，但仅限于抗生素，因为抗生素目前仅部分有效，不能完全消除感染。已经发现疫苗可以降低疾病的严重程度，但不能完全防止该病在受感染猪群中发生。
另一种在世界范围内广泛分布于猪中的病原体是胞内劳森氏菌。这种细菌可能导致增殖性肠病，也称为回肠炎，这是世界各地断奶后猪常见的肠道疾病。特征性病变是回肠肠隐窝中未成熟肠细胞的增殖；这些细胞通常在顶端细胞质中含有致病细菌。尸检时，通过可见1.5-2.5μm长的弧菌状细菌，尤其是肠上皮细胞中的细菌，但通常也存在于隐窝之间固有层和肠系膜淋巴结中的巨噬细胞内，可以确认组织学病变为劳森氏菌阳性。从肠上皮细胞中清除细菌可导致相关增殖性病变的消退，表明细菌对隐窝的直接局部作用。已使用聚合酶链式反应证明在这些病变中存在胞内劳森氏菌，无论是在表现出疾病的动物中还是在仅表现出亚临床感染的动物中。临床病例通常出现在生长发育期；在一些年龄较大的肥育猪中，已经记录到急性出血形式。
真菌通常会在猪身上引起广泛的疾病，包括器官和组织的寄生以及过敏性表现。然而，除了通过摄入非食用蘑菇中毒外，真菌还可以产生真菌毒素和有机化学物质，这些毒素和化学物质导致各种毒性作用，称为真菌毒素中毒。这种疾病是由接触真菌毒素引起的，真菌毒素是由污染食品或动物饲料的丝状真菌产生的具有药理活性的化合物。真菌毒素是对真菌生理学不重要的次级代谢产物，在摄入、吸入或皮肤接触时，最低浓度对脊椎动物就具有剧毒。目前已识别出约400种真菌毒素，细分为具有类似生物和结构性质的化学相关分子家族。其中，大约有十几个群组经常因威胁动物健康而受到关注。具有最大公共利益和农业经济意义的真菌毒素的实例包括黄曲霉毒素(AF)、赭曲霉素(OT)、单端孢霉烯族毒素(T；包括DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏马菌素(F)、致肿瘤毒素和麦角生物碱。真菌毒素与急性和慢性疾病有关，其生物学效应主要因其化学结构的多样性而不同，也因生物、营养和环境因素而不同。真菌毒素的病理生理学是真菌毒素与动物细胞中的功能分子和细胞器相互作用的结果，其可能导致致癌性、遗传毒性、蛋白合成抑制、免疫抑制、皮肤刺激和其他代谢紊乱。在敏感动物物种中，真菌毒素可能引发复杂且叠加的毒性作用。真菌中毒症不会传染，也不会对免疫系统产生显著刺激。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇，也称为呕吐毒素，是一种B型三烯，主要存在于小麦、大麦、燕麦、黑麦和玉米等谷物中，也存在于水稻、高粱和小黑麦中。脱氧雪腐镰刀菌烯醇的出现主要与禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)(玉米赤霉)和黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)有关，这两种植物病原体都是导致小麦枯萎病以及玉米赤霉和枯萎病的重要植物病原体。小麦枯萎病发病率与脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染之间存在直接关系。枯萎病的发病率与开花时的水分密切相关，而降雨的时间而不是数量是最关键的因素。此外，DON含量受品种对镰刀菌属种的易感性、以前的作物、耕作方法和杀菌剂使用的显著影响。禾谷镰刀菌在25℃的温度下生长最佳，而黄色镰刀菌则在21℃下生长最佳。因此，禾谷镰刀菌是出现在温暖气候中的更常见的物种。
DON与人类和农场动物的真菌中毒事件有关。该毒素属于单端孢霉烯族毒素，是蛋白质合成的强抑制剂。暴露于DON会导致大脑对氨基酸色氨酸的摄取减少，进而减少血清素的合成。血清素水平的降低被认为是DON引起食欲不振作用的原因。胃肠道刺激也可能在减少采食量方面发挥作用，也可能部分解释在拒绝进食期间观察到的母猪食管旁胃溃疡的高发病率。
DON诱导的真菌毒素中毒的预防性治疗目前仅限于减少作物真菌毒素产生的良好农业实践，以及食品和饲料商品的控制计划，以确保真菌毒素水平保持在一定限度以下。药物或抗生素治疗对疾病的进程几乎没有影响。到目前为止，还没有人或动物疫苗可用于对抗真菌中毒。
这与上述确定的各种病原体不同，针对这些病原体的疫苗是众所周知的。预防性治疗动物，特别是猪，对抗PCV 2感染的常规疫苗可以基于作为(非复制性)免疫原的整个灭活的PCV-2病毒。另外，在本领域中已经证明ORF2编码的衣壳蛋白(例如，当重组表达时)适合作为猪圆环病毒2型的亚单位免疫原用于适当的疫苗。这是可以理解的，因为循环系统中的这个亚单位与病毒本身呈现相同的方式(其形成病毒样颗粒)，本质上的区别仅在于DNA和非结构蛋白不存在于衣壳内。目前，市售有几种针对PCV-2的疫苗。PCV(可购自MSD Animal Health,Boxmeer,The Netherlands)是一种针对猪圆环病毒2型的疫苗，适用于三周龄及以上的猪。当作为两针(两剂)疫苗接种时，免疫持续时间(DOI)为22周，几乎完全覆盖了猪的育肥期。Ingelvac(可购自Boehringer Ingelheim,Ingelheim)是一种针对猪圆环病毒2型的疫苗，适用于两周龄及以上的猪。其登记为仅一针(一剂)疫苗。(可购自Ceva SantéAnimale,Libourne,France)是一种用于保护猪免于猪圆环病毒2型的疫苗，适用于三周龄及以上的猪。PCV(可购自Zoetis,Capelle a/dIJssel,The Netherlands)是一种保护猪免于猪圆环病毒2型的疫苗，适用于三周龄及以上的猪。其他PCV2疫苗描述在例如WO2007/028823、WO 2007/094893和WO2008/076915中。这些疫苗都具有共同点，即其包含PCV2的ORF2衣壳蛋白。
关于猪肺炎支原体，存在很多商业疫苗并且这些疫苗通常用于大多数商业养猪作业。通常，这些疫苗包含Mhyo的非复制免疫原，如亚单位蛋白和/或菌苗，其通常通过胃肠外注射施用。一些实例是：(Zoetis)、M.hyo和(Boehringer Ingelheim)、Mycoplasma(Elanco Animal Health)、PCV MH(Zoetis)以及和M Hyo(均可购自MSD Animal Health)。
通过诱导活性保护来对抗胞内劳森氏菌的疫苗是市售的，并且在本领域中进行了描述。这些疫苗的商品名为Ileitis(Boehringer Ingelheim Vetmedica,USA)，这是一种减毒活疫苗，和Ileitis(Merck Animal Health,USA)或Lawsonia(MSD Animal Health,The Netherlands)，这两种疫苗都包含以菌苗形式存在的胞内劳森氏菌的非复制免疫原。
发明目的
本发明的目的是提供一种组合物，其能够一次性保护猪免于猪圆环病毒2型(PCV2或PCV-2)和猪肺炎支原体(Mhyo)的感染，以及由霉菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导的真菌中毒。
发明内容
为了满足本发明的目的，已经设计了一种疫苗，其包含组合的猪圆环病毒2型(PCV2)的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原以及缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。这种疫苗似乎适于一次性保护猪免受猪圆环病毒2型的感染、猪肺炎支原体的感染以及DON诱导的霉菌中毒，其均是在猪中非常普遍的疾病。尽管本领域已知针对PCV2和Mhyo的组合疫苗，但是令人吃惊的是，发现缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇适合用作保护动物免受DON诱导的真菌中毒的疫苗。研究发现，将DON转化为类毒素没有特别的必要(尽管权利要求没有排除)，这种缀合的毒素似乎对治疗的宿主动物是安全的。此外，令人吃惊的是，在治疗后口服DON后，诱导的免疫应答足以保护接种疫苗的动物免受真菌中毒。通过诱导针对真菌毒素的免疫应答在本领域中尚未显示出对任何真菌毒素，更不用说对高丰度和剧毒的化合物脱氧雪腐镰刀菌烯醇的主动保护。另一个令人吃惊的是，疫苗的三种组分不会产生负面干扰。使用组合疫苗，可以对每种抗原产生足够的免疫应答。这种应答对本领域公知的病原体PCV2和Mhyo具有保护作用，并且现在首次证明对DON摄入具有保护作用。
本发明还涉及一种用于保护猪免于猪圆环病毒2型感染、猪肺炎支原体感染和DON诱导的霉菌中毒的方法中的疫苗，所述疫苗包含组合的猪圆环病毒2型(PCV2)的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原和缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。
本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含第一组合物和第二组合物的组合，所述第一组合物包含组合的猪圆环病毒2型的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原(术语“组合物”不排除其涉及两个单独的容器，其中的内容物在施用前混合)，所述第二组合物包含缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。
试剂盒可以包含如何一次性使用这两种组合物向猪施用的说明，例如，在实际施用前将其混合，或者使用带有两个单独施用喷嘴/桶的施用装置(如3G TWIN(MSDAnimal Health))进行相关的非混合使用。
定义
疫苗是一种可安全施用于受试动物的药物组合物，并且能够诱导该动物对病原微生物或化合物的保护性免疫，即诱导成功的预防性治疗，如下所述。
病原体的非复制免疫原是与病原体相对应的任何物质或化合物，而不是整体的活体可复制病原体(野生型或减毒型)，病原体对其会产生免疫应答，从而使相应的毒性病原体或其一种或多种毒性因子作为这种免疫应答的结果被宿主的免疫系统所识别，并最终至少部分地被中和。非复制免疫原的典型实例是杀死的整个病原体(该术语包括裂解形式的病原体)和这些病原体的亚单位如衣壳蛋白、表面表达分子(例如重组表达蛋白或脂多糖)和分泌分子如毒素。这组免疫原的共同点是，其通常会激发体液免疫应答。
菌苗是被杀死的细菌混悬液，例如，通过浓缩细菌培养物，随后用化学试剂如二元亚乙基亚胺(BEI)、氯甲酚、福尔马林，或者例如通过紫外线或其他类型的灭活获得。
预防性治疗，例如针对病原体的感染或针对另一不良事件，是有助于预防、改善或治愈该病原体的感染(或由该感染引起的病症)，或有助于预防、改善或治愈所述事件，其中所述治疗分别在用所述致病性病原体攻击或所述事件发生之前进行。
真菌毒素中毒是由暴露于真菌毒素引起的疾病。临床症状、靶器官和结局取决于真菌毒素的内在毒性特征、暴露的数量和时间，以及暴露动物的健康状况。
为了针对真菌毒素中毒产生保护指防止或减少真菌毒素在动物中的一种或多种负面生理作用，如平均每日体重增加的减少。
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(简称DON，也称为呕吐毒素或VOM)是一种由真菌禾谷镰刀菌产生的真菌毒素，其会导致小谷物的小麦赤霉病(FHB)或赤霉病。DON会导致拒食和呕吐。基本化合物的分子式是C15H20O6。
缀合的分子是免疫原性化合物通过共价键与之偶联的分子。通常，免疫原性化合物是(大)蛋白，如KLH、BSA或OVA。
佐剂是非特异性免疫刺激剂。原则上，每种物质都能够促进或扩增免疫事件级联中的特定过程，最终导致更好的免疫应答(即，对抗原的综合身体应答，特别是由淋巴细胞介导的应答，通常涉及特异性抗体或此前致敏的淋巴细胞对抗原的识别)，可以定义为佐剂。佐剂通常不需要用于所述特定过程的发生，而仅仅有利于或放大所述过程。
具体实施方式
在根据本发明的疫苗的一个进一步的实施方式中，PCV2的非复制免疫原是PCV2的ORF2。这种免疫原已被证明能引发针对PCV2病毒的足够的保护性免疫应答，并且似乎适用于本组合疫苗，即，允许同时刺激免疫系统，这对受试猪来说仍然是安全的。免疫原可以是重组表达的PCV2的ORF2蛋白，比如例如杆状病毒表达的ORF2蛋白。
在又一个实施方式中，猪肺炎支原体的非复制免疫原是猪肺炎支原体菌苗，其可以包含灭活的全猪肺炎支原体。Mhyo的菌苗，特别是当仍含有全细胞时，已被证明足以用于本组合疫苗。
在再另一个实施方式中，缀合的DON包含与分子质量高于10.000Da的蛋白质缀合的DON。此类蛋白，特别是匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)，已发现能够在猪和其他动物中诱导足够的免疫应答。蛋白的实际上限可能是100MDa。超过该限度可能会出现物理上的缺点。
在再另一个实施方式中，疫苗包含胞内劳森氏菌的非复制免疫原，特别是灭活的胞内劳森氏菌的全细胞，比如例如已经形式的商业疫苗Porcilis Ileitis(可通过MerckAnimal Health获得)和Porcilis Lawsonia(可通过MSD Animal Health获得)。
在一个进一步的实施方式中，组合疫苗用于保护猪免于猪圆环病毒2型感染、猪肺炎支原体感染和DON诱导的霉菌中毒的方法中的用途，向猪全身施用疫苗。尽管局部施用，例如通过胃肠道(口腔或肛门)或眼睛中的粘膜组织(例如当给鸡免疫时)，已知是在各种动物中诱导免疫应答的有效途径，但发现全身施用可产生足够的免疫应答，以保护动物免受所有三种病症的影响。特别发现，肌内和/或皮内施用可以获得有效的免疫。
施用年龄并不重要，但最好在猪失去母体免疫力并能够摄入被大量DON污染的饲料之前施用。因此，施用时的优选年龄是6周龄或更小。进一步优选是4周龄或更小的年龄，比如例如1-3周龄。
根据本发明的疫苗可以向动物施用至少一次或两次。尽管很多动物(特别是猪、鸡、反刍动物)通常只需注射一针免疫原性组合物即可免疫，但据信，为了在经济上可行地对DON产生保护，最好注射两针。第一针或第二针可以是仅含有缀合的DON的单价疫苗，而另一针是用组合疫苗进行的。这是基于这样一个事实，即为了针对PCV2和Mhyo产生保护，一次注射已被证明在典型猪的整个生命周期内提供有效的保护。然而，也可以预见，动物会接受新型组合疫苗的初次和强化疫苗接种。两针疫苗之间的时间可以在1周到1-2年之间。对于年幼的动物，据信，初次免疫的方案，例如在1-3周龄时，然后在1-4周后，通常1-3周后，如2周后进行加强针施用，就足够了。年龄较大的动物可能需要每隔几个月(如最后一次施用后的4、5、6个月)进行一次加强针施用，或者每年或每两年进行一次，这是其他商业应用的动物免疫方案中公知的。
除了这三种抗原之外，组合疫苗还可以包含佐剂。如果抗原本身不能诱导免疫应答以获得预定水平的保护，则可以使用佐剂。尽管已知与载体分子如KLH或BSA的缀合分子能够在没有额外佐剂的情况下充分刺激免疫系统，但使用额外佐剂可能是有利的。这可以消除加强针施用的需要或延长其施用间隔。这一切都取决于特定情况下所需的保护水平。据信特别适合与当前疫苗一起使用的佐剂类型是水包油乳剂(比如例如基于矿物油、鲨鱼肝油、维生素E醋酸酯等)、溶液、alhydrogel和其他含铝佐剂系统。
现在将使用以下实施例来进一步解释本发明。
实施例
在第一系列实验(在下面的实施例1至3中描述)中，针对安全性和有效性测试单价DON疫苗的有效性。此后，相应地测试根据本发明的三价疫苗的有效性(实施例4)。
实施例1：使用缀合的DON的免疫激发实验
目的
本研究的目的是评价缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇保护猪免于由于DON摄入引起的真菌中毒的安全性和有效性。为了考察这一点，在用毒性DON攻击之前，使用DON-KLH免疫猪两次。使用不同免疫途径以研究施用途径的影响。
研究设计
在研究中使用了来自8头母猪的40头1周龄猪，分成5组。第1-3组的24头小猪在1周龄和3周龄时接种两次。第1组在这两个周龄时肌内(IM)免疫。第2组在1周龄时接受IM注射和在3周龄时接受口服强化。第3组进行两次皮内(ID)免疫。第1-3组从51/2周龄开始，在4周内以液体形式口服施用DON。第4组未进行免疫，但仅用DON攻击，如第1-3组所述。第5组作为对照，并且从5.5周龄开始持续4周仅接受对照液。
液体制剂中的DON浓度对应于5.4mg/kg饲料的量。这相当于每天2.5mg的平均量。攻击四周后，对所有动物进行尸检，特别注意肝脏、肾脏和胃。此外，在研究的第0天、第34天、第41天、第49天、第55天、第64天(处死后)进行血液采样，但第5组除外，该组仅在第0天、第34天、第49天以及处死后直接进行血液采样。
待测物
配制三种不同的免疫原性组合物，即待测物1，其在用于注射的水包油乳剂(X-solve 50,MSD AH,Boxmeer)中包含50μg/ml的DON-KLH，将其用于IM免疫；待测物2，其在油包水乳剂(GNE,MSD AH,Boxmeer)中包含50μg/ml的DON-KLH，将其用于口服免疫和待测物3，其在用于注射的水包油乳剂(X-solve 50)中包含500μg/ml DON-KLH，将其用于ID免疫。
将攻击的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(从Fermentek,Israel获得)在100％甲醇中稀释至终浓度100mg/ml，并在<-15℃下储存。在使用前，将DON进一步稀释，并在用于施用的处理中提供。
纳入标准
仅使用健康动物。为了排除不健康的动物，在研究开始前对所有动物进行检查，检查其的一般身体外观以及是否存在临床异常或疾病。每组使用来自不同母猪的仔猪。在日常实践中，即使通过摄入DON污染的饲料预先暴露于DON，所有动物也会免疫接种。由于DON本身不会引起免疫应答，因此人们认为，预先接触DON的动物和初免动物在DON方面没有主要区别。
结果
没有一只动物出现与DON-KLH免疫相关的负面影响。因此，该组合物看起来是安全的。
在实验开始时，所有猪对DON的滴度在血清学上均为阴性。在攻击过程中，肌内免疫组(第1组)和皮内免疫(第3组)产生了针对DON的抗体应答，这是用天然DON-BSA作为包被抗原通过ELISA测量的。表1描述了研究期间4个时间点的平均IgG值及其SD值。肌内免疫和皮内免疫都诱导了针对DON的显著滴度。
表1 IgG滴度
第1组 第2组 第3组 第4组 第5组
T＝0 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3 <4.3
T＝35 11.2 4.86 9.99 4.3 4.19
T＝49 9.56 4.64 8.81 4.71 3.97
T＝64 8.48 4.3 7.56 4.3 3.31
如在表2中所述，与攻击动物相比，在前15天期间，所有免疫的动物，包括第2组中的动物均未显示出显著的抗DON IgG滴度增加，显示出显著更高的体重增加。对于受攻击的动物，在研究过程中，所有动物的体重都增加了。
表2体重分析
1在攻击前15天的平均每日体重增加
2在攻击后13天的平均每日体重增加
还监测了小肠的状况(由空肠中的绒毛/隐窝比率确定)。在表3中描述了绒毛/隐窝的比例。可以看出，第3组动物的平均绒毛隐窝/隐窝比与健康对照组(第5组)相当，而未接种疫苗的攻击组(第4组)的绒毛隐窝比要低得多(具有统计学意义)。此外，第1组和第2组的绒毛/隐窝比明显好于(即，高于)非免疫攻击对照组。这表面免疫针对由DON引起的肠道损伤产生了保护。
表3绒毛/隐窝比
第1组 第2组 第3组 第4组 第5组
平均值 1.57 1.41 1.78 1.09 1.71
STD 0.24 0.22 0.12 0.10 0.23
还监测了其他器官的一般情况，更具体地说是肝脏、肾脏和胃。观察到，所有三个测试组(第1-3组)的健康状况都比未免疫接种的攻击对照组(第4组)好。在表4中描述了一般健康数据的总结。报告的胃溃疡程度从-(没有溃疡形成的证据)到++(多发性溃疡)。报告的胃部炎症的程度从-(没有炎症的证据)到++/-(引起胃部炎症)。
表4一般健康数据
肝脏颜色 胃溃疡 胃部炎症 肾脏
第1组 正常-黄色 - - 苍白
第2组 正常 +/-- - 正常
第3组 正常 +/- +/-- 正常
第4组 苍白 ++ ++/- 苍白
第5组 正常 + ++/- 正常
实施例2：免疫对DON水平的影响
目的
本研究的目的是评价用DON缀合物免疫对DON摄入毒代动力学的影响。为了考察这一点，在喂食毒性DON之前，用DON-KLH免疫接种猪两次。
研究设计
研究中使用10头3周龄的猪，分为2组，每组5头。在3周龄和6周龄时，用DON-KLH IM免疫第1组中的猪两次(待测物1；实施例1)。将第2组作为对照，仅接受对照液。在11周龄时，每只动物都以0.05mg/kg的剂量(基于每日饲料摄入量)通过推注施用DON(Fermentek,Israel)，类似于1mg/kg饲料的污染水平。仅在DON施用前以及DON施用后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8和12h采集猪的血样。
纳入标准
仅使用健康动物。
血浆中DON的分析
在与TQ-S MS仪器(Waters,Zellik,Belgium)偶联的UPLC系统上，使用经验证的LC-MS/MS方法对未结合的DON进行血浆分析。使用该方法对猪血浆中DON的定量下限为0.1ng/ml。
毒代动力学分析
通过非房室分析(Phoenix,Pharsight Corporation,USA)对DON的血浆浓度-时间曲线进行毒代动力学建模。计算以下参数：从时间零点到无穷大的曲线下面积(AUC0→∞)、最大血浆浓度(Cmax)和处于最大血浆浓度的时间(tmax)。
结果
毒代动力学结果如下表5所示。可以看出，DON-KLH免疫降低了所有毒代动力学参数。由于未结合的DON是发挥毒性作用的原因，因此可以得出结论，用DON-KLH免疫将通过减少动物血液中未结合DON的量来减少DON引起的毒性作用。
表5未结合DON的毒代动力学参数
毒代动力学参数 DON-KLH 对照
AUC0→∞ 77.3±23.6 187±33
Cmax 12.5±2.7 30.8±2.5
tmax 1.69±1.03 2.19±1.07
实施例3：对各种DON缀合物的血清学反应
目的
本研究的目的是评价不同缀合脱氧雪腐镰刀菌烯醇产物的有效性。
研究设计
在研究中使用了18头3周龄的猪，分为3组，每组6头。在3周龄和5周龄时使用DON-KLH(实施例1中使用的待测物1)肌内免疫第1组中的猪两次。第2组相应地用DON-OVA免疫。将第3组作为阴性对照。检查所有动物在3周龄、5周龄和8周龄时的抗DON IgG应答。
结果
血清学结果如下表中log2抗体滴度所示。
抗6抗DON IgG应答
待测物 3周 5周 8周
DON-KLH 3.5 6.6 8.3
DON-OVA 3.3 3.9 11.8
对照 4.8 3.3 3.3
看起来这两种缀合物都适于提高抗DON IgG应答。此外，应答似乎仅由一次注射引起。
实施例4：各种组合疫苗的有效性
目的
本研究的目的是确定是否有可能将针对DON的疫苗接种与针对PCV2、Mhyo和可选的胞内劳森氏菌的疫苗接种相结合。
研究设计
将由来自12头母猪组成的64头一周龄仔猪分成8组，每组8头。第1组至第3组使用(MSD Animal Health)装置进行皮内(ID)疫苗接种，在每种情况下每次施用0.2ml。来自第1组的仔猪接受实施例1(待测物3)中使用的单价DON-KLH疫苗，作为初免强化方案中的阳性对照。第2组(表示为“PM”)接受在水包油乳剂(包含角鲨烯和维生素E醋酸酯)中的单价DON-KLH疫苗(DON抗原水平与第1组相同)作为第一次疫苗接种，和使用包含本发明三种抗原的疫苗进行第二次疫苗接种，即非复制PCV2免疫原(在这种情况下，杆状病毒以与PCV ID相同的水平表达PCV2的ORF2蛋白)、非复制Mhyo免疫原(在这种情况下，以与M Hyo ID ONCE相同水平的Mhyo菌苗)和在相同佐剂中的DON-KLH。第3组作为DON ID的阴性对照，在三周龄时仅接受PCV MHyo。
第4组至第8组用于肌内注射(IM)疫苗接种，使用标准皮下注射器，在每种情况下每次施用2ml。第4组是肌内疫苗接种的阳性对照，接受X-solve 50中的单价DON-KLH疫苗(实施例1，待测物1)两次。第5组接受了第一针用Emmunde(MSD Animal Health)作为佐剂的单价DON-KLH疫苗，以及第二针用同一佐剂在三周时与PCV M Hyo和Lawsonia混合的DON-KL疫苗(即，商业三元PCV2M Hyo Lawsonia组合疫苗，在本申请中表示为“PML”)。DON-KLH水平与实施例1的待测物1中的水平相同。第6组接受X-solve50中的单价DON-KLH疫苗作为初免疫苗接种，以及用相同的单价DON-KLH疫苗和单独的PML疫苗作为加强针的非混合相关组合疫苗接种。第7组为阴性对照组(仅PML)。第8组为接受DON攻击的阴性对照。
在上述每一种情况下，第一次疫苗接种是在仔猪一周龄时在颈部右侧进行，第二次疫苗接种则是在仔猪三周龄时，在颈部左侧进行。攻击(第2组、第4组、第5组和第8组)如上所述在实施例1中使用DON与流体混合进行。在攻击的前两周，DON在上午和晚上进行，在攻击的后两周，DON在早餐、下午和晚上进行。给药方式是，在第一周，仔猪每天接受1mgDON，在第二周，其每天接受2mg DON，在第三周，其每天接受3mg DON和在第四周，其每天接受4mg DON。
纳入标准
仅使用健康动物。为了排除不健康的动物，在研究开始前对其进行了检查(一般身体外观和没有临床异常或疾病)。
结果
没有动物出现与各种疫苗接种相关的负面影响。因此，组合物看起来是安全的。
接种疫苗的所有组在疫苗接种后包含缀合的DON的血清转化(见表7)。ID滴度略低于IM滴度。在ID疫苗接种组中，组合接种OM的组的滴度高于单独接种DON的组。尽管DON+PM联合组(ID)只接受了DON剂量的30％，但情况依然如此。此外，值得注意的是，与单独使用DON(ID)组相比，DON+PM(ID)组合组的滴度下降较慢。肌内观察到，单独接受DON、组合PML(混合)和组合PML的组(非混合)的结果非常相似。这意味着，对于针对DON的血清学，无论是与其他抗原组合，还是混合，似乎都没有显著的效果。
表7 DON血清学(log2滴度)
组 T＝0 T＝28 T＝64
1 <4.3 8.7 5.0
2 <4.3 9.6 6.3
3 <4.3 <4.3 <4.3
4 <4.3 11.1 7.4
5 4.5 10.2 6.6
6 <4.3 10.6 7.4
7 <4.3 <4.3 <4.3
8 4.4 4.4 <4.3
通过测定绒毛/隐窝比，在肠道中测量对DON攻击的保护作用(见表8)。ID组(第2组)具有最高的比率，该比率与实施例1中所述的研究中的健康对照相同。单价DON IM组(第4组)和4元DON、PCV、Mhyo、Lawsonia组(第5组)的肠道都明显比未接种疫苗的攻击动物(第8组)健康。组合疫苗(第2组和第5组)的数值甚至好于接受单价DON疫苗的组(第4组)，这表明两种组合疫苗对DON攻击都有足够的保护作用，与疫苗接种途径和额外Lawsonia抗原的存在无关。
表8绒毛/隐窝比
第2组 第4组 第5组 第8组 第5组，实施例1
平均值 1.74 1.50 1.65 1.27 1.71
除此之外，与对照第8组相比，在所有接种疫苗的组中观察到胃溃疡的减少。这些数据以及关于肝脏状况的数据在下面的表9中描述。
表9一般健康数据
胃溃疡 肝损伤
第2组 +/---- 轻度
第4组 - 正常至轻度
第5组 - 轻度
第8组 +/- 中度至重度
因此，在胃溃疡和肝脏损伤的水平上，可以看出组合疫苗对DON攻击具有保护作用。
为了显示对其他病原体(PCV2、猪肺炎支原体和胞内劳森氏菌)的保护作用，在研究结束时测量了IM组的血清学。正如针对现有商业疫苗(系列)的这些现有抗原所知晓的，IM疫苗接种后的阳性血清学表明在IM和ID疫苗接种相同抗原后对相应病原体的感染具有保护作用。结果如表10所示。对于Mhyo，使用了阴性/阳性检测。对于PCV和Lawsonia，测量了Elisa滴度。
表10针对PCV,Mhyo和Lawsonia的血清学
第4组 第5组 第6组 第7组
PCV <2.0 9.5 12.1 11.5
Mhyo 阴性 阳性 阳性 阳性
Lawsonia <3.9 5.2 5.9 5.8
结果表明，每种抗原都引发了阳性血清学，表明已经达到对相应病原体的保护作用。
结论
这项研究表明，DON疫苗接种不会受到同时接种PCV、Mhyo和Lawsonia的非复制免疫原的影响，而且缀合的DON抗原不会抵消使用这三种抗原中的每一种可以达到的保护作用。

Claims (15)

1.一种用于保护猪免于猪圆环病毒2型感染、猪肺炎支原体感染和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)诱导的霉菌中毒的疫苗，其包含组合的猪圆环病毒2型(PCV2)的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原和缀合的DON。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述PCV2的非复制免疫原是PCV2的ORF2蛋白。
3.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于所述PCV2的非复制免疫原是重组表达的PCV2的ORF2蛋白。
4.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于所述猪肺炎支原体的非复制免疫原是猪肺炎支原体菌苗。
5.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于所述猪肺炎支原体的非复制免疫原包含灭活的全猪肺炎支原体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于所述缀合的DON是与分子量高于10.000Da的蛋白质缀合的DON。
7.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于所述缀合的DON是与匙孔血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)缀合的DON。
8.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于所述疫苗包含胞内劳森氏菌的非复制免疫原。
9.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其特征在于所述疫苗包含灭活的胞内劳森氏菌全细胞。
10.一种用于保护猪免于猪圆环病毒2型感染、猪肺炎支原体感染和DON诱导的霉菌中毒的方法中的疫苗，所述疫苗包含组合的猪圆环病毒2型(PCV2)的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原和缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。
11.根据权利要求10所述用途的疫苗，其特征在于在所述方法中所述疫苗是向所述猪全身施用的。
12.根据权利要求10或权利要求11所述用途的疫苗，其特征在于在所述方法中所述疫苗是向所述猪肌内或皮内施用的。
13.根据权利要求10至12中任一项所述用途的疫苗，其特征在于在所述方法中所述疫苗是向6周龄或更年幼的所述猪施用的。
14.根据权利要求10至13中任一项所述用途的疫苗，其特征在于在所述方法中所述疫苗是向4周龄或更年幼的所述猪施用的，优选地1-3周龄。
15.一种试剂盒，其包含组合的第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包含组合的猪圆环病毒2型(PCV2)的非复制免疫原、猪肺炎支原体的非复制免疫原，和所述第二组合物包含缀合的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)。
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