Tarifnamede ve buradaki istemlerde kullanildigi üzere dozaj birim formu, birim dozajlar olarak uygun olan fiziksel olarak ayri birimlere refere eder, her birim, gereken farmasötik tasiyici ile birlikte istenen terapötik etkiyi olusturmak üzere hesaplanan önceden belirlenmis miktarda aktif bilesen içerir. Bu tür dozaj birim formlarinin örnekleri, tabletler (çentikli veya kapli tabletler de dahil), kapsüller, haplar, toz paketleri, yassi pilüller, enjekte edilebilir solüsyonlar veya süspansiyonlar, çay kasigi dolusu, yemek kasigi dolusu ve benzerleri ve ayrilmis çesitleridir. Uygulama kolayligi ve dozajin homojenligi için yukarida bahsedilen farmasötik bilesimlerin dozaj birim formunda formüle edilmesi özellikle avantajlidir. Tarifnamede ve buradaki istemlerde kullanildigi üzere dozaj birim formu, birim dozajlar olarak uygun olan fiziksel olarak ayri birimlere refere eder, her birim, gereken farmasötik tasiyici ile birlikte istenen terapötik etkiyi olusturmak üzere hesaplanan önceden belirlenmis miktarda aktif bilesen içerir. Bu tür dozaj birim formlarinin örnekleri, tabletler (çentikli veya kapli tabletler de dahil), kapsüller, haplar, toz paketleri, yassi pilüller, enjekte edilebilir solüsyonlar veya süspansiyonlar, çay kasigi dolusu, yemek kasigi dolusu ve benzerleri ve ayrilmis çesitleridir. Bulusun bilesigi, anti-tümör aktivitesini uygulamaya yeterli miktarda uygulanir. Teknikte uzman kisiler, buradan sonra sunulan test sonuçlarindan etkili miktari kolay bir sekilde belirleyebilir. Genel olarak terapötik olarak etkili bir miktarin, vücut agirligi olacagi öngörülür. Gerekli dozun gün içinde uygun araliklarla tek, iki, üç. dört veya daha fazla alt doz olarak uygulanmasi uygun olabilir. Söz konusu alt dozlar örnegin, birim dozaj formu basina 0.5 ila 500 mg, özellikle 1 mg ila 500 mg, daha belirgin olarak 10 mg ila 500 mg aktif bilesen içeren birim dozaj formlari olarak formüle edilebilir. Uygulama sekline bagli olarak farinasötik bilesim tercihen agirlikça %005 ila 99, daha çok tercih edildigi üzere agirlikça %0.] ila 70, daha çok tercih edildigi üzere agirlikça %01 ila 50 mevcut bulus bilesigi ve agirlikça %1 ila 99.95, daha çok tercih edildigi üzere agirlikça %30 ila 99.9, daha çok tercih edildigi üzere agirlikça %50 ila 99.9 farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici içerecektir, tüm yüzdeler, bilesimin toplam agirligina göredir. Mevcut bulusun bir baska açisi olarak özellikle ilaç olarak kullanima yönelik. daha spesifik olarak kanser veya ilgili hastaliklarin tedavisinde kullanilmaya yönelik mevcut bulus bilesiginin bir baska antikanser ajan ile kombinasyonu öngörülür. Yukaridaki durumlarin tedavisine yönelik olarak bulus bilesikleri, bir veya daha fazla diger tibbi ajanlar, daha belirgin olarak kanser terapisinde anti-kanser ajanlar veya adjuvanlar ile kombinasyon halinde avantajli bir sekilde kullanilabilir. Anti- kanser ajanlarin veya adjuvanlarin (terapide destekleyici ajanlar) örnekleri bunlarla sinirli olmamak üzere asagidakileri içerir: . platin koordinasyon bilesikleri, örnegin istege bagli olarak amifostin, karboplatin veya oksaliplatin ile kombine edilmis sisplatin; . taksan bilesikleri, örnegin paklitaksel, paklitaksel protein bagli partiküller (AbraxaneTM) veya dosetaksel; . kamptotesin bilesikleri, örnegin irinotekan, SN-38, topotekan, topotekan hcl gibi topoizomeraz l inhibitörleri; . anttümör epipodofillotoksinler veya podotîllotoksin türevleri, örnegin etoposid, etoposid fosfat veya teniposid gibi topoizomeraz Il inhibitörleri; . anti-tümör vinka alkaloidleri, örnegin vinblastin, vinkristin veya vinoelbin; i anti-tümör nükleozid türevleri, örnegin S-Üorourasil, lökovorin, gemsitabin, gemsitabin hcl, kapesitabin, kladribin, fludarabin, nelarabin; . istege bagli olarak mesna, pipobroinan, prokarbazin, streptozosin, telozolomid, urasil ile kombinasyon halindeki nitrojen hardali veya nitrozüre örnegin siklofosfamid, klorambusil, karmustin, tiyotepa, mefalan (melfalan), lomustin, altretamin, busulfan, dakarbazin, östramustin, ifosfamid gibi alkilleme ajanlari; . anti-tümör antrasiklin türevleri, örnegin istege bagli olarak deksrazoksan, doksil, idarubisin, mitoksantron, epirubisin, epirubisin hcl, valrubisin ile kombinasyon halindekli daunorubisin, doksorubisin; - IGF-l reseptörünü hedeIleyen moleküller, örnegin pikropodofilin; - tetrakarsin türevleri, örnegin tetrokarsin A; 0 glukokortikoidler, örnegin prednizon; - antikorlar, örnegin trastuzumab (HER2 antikoru), rituksimab (CDZO antikoru), gemtuzumab, gemtuzumab ozogamisin, setuksimab, pertuzumab, bevasizumab, alemtuzumab, ekulizumab, ibritumomab tiuksetan, nofetumomab, panitumumab, tositumomab, CNTO 328; östrojen reseptör antagonistleri veya selektif östrojen reseptör modülatörleri veya sötrojen sentezi inhibitörleri, örnegin tamoksifen, fulvestrant, toremifen, droloksifen, faslodeks, raloksifen veya letrozol; eksemestan, anastrozol, letrazol, testolakton ve vorozol gibi aromataz inhibitörleri; retinoidler, vitamin D veya retinoik asit ve retinoik asit metabolizmasi bloklama ajanlari (RAMBA), örnegin akutan gibi farklilasma aj anlari; DNA metil transferaz inhibitörleri, örnegin azasitidin veya desitabin; antifolatlar, örnegin premetreksed disodyum; antibiyotikler, örnegin antinomisin D, bleomisin, mitomisin C, daktinomisin, karminomisin, daunomisin, levamizol, plikamisin, mitramisin; antimetabolitler, örnegin klofarabin, aminopterin, sitozin arabinozid veya metotreksat, azasitidin, sitarabin, floksuridin, pentostatin, tiyoguanin; 1, TW 37 veya dekanoik asit gibi apoptoz indükleme ajanlari ve antianjiyogenik ajanlar; tubulin baglama ajanlari örnegin kombrestatin, kolsisinler veya nokodazol; kinaz inhibitörleri (örnegin EGFR (epitelyal büyüme faktörü reseptörü) inhibitörleri, MTKI (çok hedefli kinaz inhibitörleri), mTOR inhibitörleri, cmet inhibitörleri) örnegin, flavoperidol, imatinib mesilat, erlotinib, gefitinib, dasatinib, lapatinib, lapatinib ditosilat, sorafenib, sunitinib, sunitinib maleat, temsirolimus, 6-{diI10r0[6-(1-metil-lH-pirazol-4- il)[l,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3-il]metil}kin01in veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu, 6-[diflor0(6-piridin-4-il[1,2,4]triazolo[4,3- b]piridazin-3-il)metil]kinolin veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir fameziltransferaz inhibitörleri, örnegin tipifamib; histon deasetilaz (HDAC) inhibitörleri, örnegin sodyum bütirat, suberoilanilid hidroksamid asit (SAHA), depsipeptid (FR 901228), NVP- Ubikuitin-proteazom yolagi inhibitörleri, örnegin PS-34l, MLN .41 veya bortezomib; Yondelis; Telomeraz inhibitörleri, örnegin telomestatin; Matriks metalloproteinaz inhibitörleri, örnegin batimastat. marimastat, prinostat veya metastat. Rekombinant interlökinler, örnegin aldeslökin, denilökin diftitoks, interferon alfa 2a, interferon alfa 2b, peginterferon alfa 2b MAPK inhibitörleri Retinoidler, örnegin alitretinoin, beksaroten, tretinoin Arsenik trioksit Asparajinaz Steroidler örnegin, dromostanolon propiyonat, megestrol asetat, nandrolon (dekanoat, fenpropiyonat), deksametazon Gonadotropin salgilatici hormon agonistleri veya antagonistleri, örnegin abareliks, goserelin asetat, histrelin asetat, löprolid asetat Talidomid, lenalidomid Merkaptopürin, mitotan, pamidronat, pegademaz, pegaspargaz, rasburikaz BH3 mimetikleri örnegin ABT-737 koloni uyarici faktör analoglari örnegin, filgrastim, pegfilgrastiin, sargramostim; eritropoetin veya analoglari (örnegin darbepoetin alfa); interlökin ll; oprelvekin; zoledronat, zoledronik asit; fentanil; bisfosfonat; palifermin. (CYP17), örnegin abirateron, abirateron asetat. Bir düzenlemede mevcut bulus, formülün (1) bir bilesigi, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu veya solvati veya her türlü alt gruplari ve örnekleri ve 6- {diflor0[6-(l -metil-l H-pirazol-4-il)[l ,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3- il]metil_}kin01in veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunun kombinasyonu ile ilgilidir. Bir düzenlemede mevcut bulus, fonnülün (1) bir bilesigi, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu veya solvati veya her türlü alt gruplari ve örnekleri ve 6- farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunun kombinasyonu ile ilgilidir. Bir düzenlemede mevcut bulus, forrnülün (1) bir bilesigi, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu veya solvati veya her türlü alt gruplari ve örnekleri ve 6- {diflor0[6-(l-metil-lH-pirazol-4-il)[1 ,2,4]triazolo[4,3-b]piridazin-3- il]metil}kinolin veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu içeren farmasötik bir bilesim ile ilgilidir. Bir düzenlemede mevcut bulus, fonnülün (1) bir bilesigi, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu veya solvati veya her türlü alt grubu ve örnekleri ve 6- farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunu içeren farmasötik bir bilesim ile Mevcut bulus bilesikleri ayni zamanda tümör hücrelerinin radyoterapi ve kemoterapi için duyarli hale getirilmesinde terapötik uygulamalara sahiptir. Bu nedenle mevcut bulusun bilesikleri, "radyo-duyarlastirici" ve/veya "kemo- duyarlastirici" olarak kullanilabilir ve bir baska "radyo-duyarlastirici" ve/veya Burada kullanildigi üzere "radyo-duyarlastirici" terimi, hücrelerin iyonize edici radyasyona duyarliligini arttirmak ve/veya iyonize edici radyasyon ile tedavi edilebilen hastaliklarin tedavisini desteklemek amaciyla hayvanlara terapötik olarak etkili miktarlarda uygulanan bir molekül, tercihen düsük molekül agirlikli Burada kullanildigi üzere "kemo-duyarlastirici" terimi, hücrelerin kemoterapiye duyarliligini arttirmak ve/veya kemoterapötikler ile tedavi edilebilen hastaliklarin tedavisini desteklemek amaciyla hayvanlara terapötik olarak etkili miktarlarda uygulanan bir molekül, tercihen düsük molekül agirlikli bir molekül olarak tanimlanir. Literatürde asagidakileri içeren radyo-duyarlastiricilarin etki sekline yönelik birkaç mekanizma önerilmistir: oksijeni taklit eden veya alternatif olarak hipoksi altinda biyoredüktif ajanlar gibi davranan hipoksik hücre radyo-duyarlastiricilari (örnegin 2- nitroimidazol bilesikleri ve benzotriazin dioksit bilesikleri); hipoksik olmayan hücre radyo-duyarlastiricilari (örnegin halojenlenmis pirimidinler), DNA bazlarinin analoglari olabilir ve tercihen kanser hücrelerinin DNAssina yerlesebilir ve böylelikle DNA moleküllerinin radyasyon indüklü kopmasini destekler ve/Veya normal DNA onarim mekanizmalarini önler; ve hastalik tedavisinde radyo-duyarlastiricilara yönelik olarak çesitli diger potansiyel etki mekanizmalari varsayilmistir. Birçok kanser tedavi protokolü halihazirda, X-isinlari radyasyonu ile birlikte radyo-duyarlastiricilari kullanir. X-isini ile aktive edilen radyo-duyarlastiricilarin örnekleri bunlarla sinirli olmamak üzere sunlari içerir: metronidazol, misonidazol, desinetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomisin C, RSU iyododeoksiüridin (IUdR), bromodeoksisitidin, florodeoksiüridin (FudR), hidroksiüre, sisplatin ve bunun terapötik olarak etkili analoglari ve türevleri. Kanserlerin fotodinamik terapisi (PDT), duyarlastirici aj anin radyasyon aktivatörü olarak görünür isigi kullanir. Fotodinamik radyo-duyarlastiricilarin örnekleri bunlarla sinirli olmamak üzere hematoporfirin türevleri, Fotofrin, benzoporfirin türevleri, kalay etiyoportîrin, feoborbid-a, bacterioklorof'il-a, naftalosiyaninler, ftalosiyaninler, çinko ftalosiyanin ve terapötik olarak etkili analoglari ve türevlerini içerir. Radyo-duyarlastiricilar, bunlarla sinirli olmamak üzere radyo- duyarlastiricilarin hedef hücrelere eklenmesini destekleyen bilesikler; hedef hücrelere terapötik_` besin ve/veya oksijen akisini kontrol eden bilesikler; ek radyasyon ile veya olmadan tümör üzerine etki eden kemoterapötik ajanlar veya kanser veya diger hastaliklarin tedavi edilmesine yönelik terapötik olarak etkili diger bilesikler de dahil bir veya daha fazla bilesigin terapötik olarak etkili miktari ile birlikte uygulanabilir. Kemo-duyarlastiricilar, bunlarla sinirli olmamak üzere kemo-duyarlastiricilarm hedef hücrelere eklenmesini destekleyen bilesikler; hedef hücrelere terapötik, besin ve/veya oksijen akisini kontrol eden bilesikler; tümör üzerine etki eden kemoterapötik ajanlar veya kanser veya diger hastaliklarin tedavi edilmesine yönelik terapötik olarak etkili diger bilesikler de dahil bir veya daha fazla bilesigin terapötik olarak etkili miktari ile birlikte uygulanabilir. Örnegin verapamil olinak üzere kalsiyum antagonistlerinin, kabul edilen kemoterapötik ajanlara karsi dirençli tümör hücrelerinde kemo-duyarliligi olusturmak ve ilaca duyarli malignitelerde bu bilesiklerin etkinligini arttirmak üzere antineoplastik ajanlar ile birlikte faydali oldugu bulunur. Faydali farmakolojik özellikleri bakimindan bulusa göre kombinasyonlarin bilesikleri, yani bir veya daha fazla diger tibbi ajan ve mevcut bulusa göre bilesik, uygulama amaçlarina yönelik olarak çesitli farmasötik formlarda formüle edilebilir. Bu bilesenler, ayri farmasötik bilesimlerde ayri olarak veya tüm bilesenleri içeren bütün bir farmasötik bilesimde formüle edilebilir. Mevcut bulus bu nedenle, farmasötik bir tasiyici ile birlikte mevcut bulusa göre bilesik ve bir veya daha fazla diger tibbi ajani içeren farmasötik bir bilesim ile Mevcut bulus ayrica, bulusa göre bir kombinasyonun, tümör hücrelerinin büyümesinin inhibe edilmesine yönelik farmasötik bir bilesimin üretiminde kullanimi ile ilgilidir. Mevcut bulus ayrica, kanserden sikayet eden hastalarin tedavisinde es zamanli, ayri veya sirali kullanima yönelik kombine bir preparat seklinde birinci aktif bilesen olarak bulusa göre bir bilesigi ve diger aktif` bilesen olarak bir veya daha fazla antikanser ajani içeren bir ürün ile ilgilidir. Bir veya daha fazla diger tibbi ajanlar ve mevcut bulusa göre bilesik, es zainanli (örnegin ayri veya tek bilesimlerde) olarak veya herhangi bir sirada sirali olarak uygulanabilir. Bu durumda iki veya daha fazla bilesik, avantajli veya sinerjik bir etki saglanmasina yeterli olan bir süre içinde ve miktarda ve sekilde uygulanacaktir. Tercih edilen uygulama yöntemi ve sirasinin ve kombinasyonun her bilesenine yönelik ilgili dozaj miktarlari ve rejimlerinin, uygulanan belirli diger tibbi ajana ve mevcut bulus bilesigine, uygulanma yollarina, tedavi edilen belirli tümöre ve tedavi edilen belirli konakçiya bagli olacagi anlasilacaktir. Optimum uygulama yöntemi ve sirasi ve dozaj miktarlari ve rejim, burada verilen bilgilere göre ve klasik yöntemler kullanilarak teknikte uzman kisilerce kolay bir sekilde belirlenebilir. Bir kombinasyon olarak verildiginde mevcut bulusa göre bilesik ve bir veya daha fazla diger antikanser ajan(lar)1n agirlik orani, teknikte uzman kisi tarafindan belirlenebilir. Söz konusu oran ve kesin dozaj ve uygulama sikligi, teknikte uzman kisilerce iyi bilindigi üzere kullanilan bulusa göre belirli bilesige ve diger antikanser ajan(lar)a, tedavi edilen belirli duruma, tedavi edilen durumun siddetine, belirli hastalanin yasi, kilosu, cinsiyeti, diyeti, uygulama zamani ve genel fiziksel durumuna, uygulama sekline ve kisinin aldigi diger ilaçlara baglidir. Ayrica etkili günlük miktarin, tedavi edilen öznenin yanitina bagli olarak ve/veya mevcut bulusun bilesiklerini reçete eden doktorun degerlendirmesine bagli olarak düsürülebilecegi veya arttirilabilecegi açiktir. Formülün (1) mevcut bilesigi ve bir baska antikanser ajana yönelik belirli agirlik orani, 1/10 ila 10/1, özellikle 1/5 ila /1. daha belirgin olarak 1/3 ila 3/1 araligindadir. Platin koordinasyon bilesigi avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre karesi tedavi süresince sisplatin için yaklasik 75 mg/m2 dozajinda ve karboplatin için yaklasik 300mg/in2 dozajinda uygulanir. Taksan bilesigi avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre karesi basina (mg/m2) mg/m2 olan dozajda uygulanir. Kamptotesin bilesigi avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre karesi basina süresince irinotekan için yaklasik 100 ila 350 mg/m2 ve topotekan için yaklasik 1 ila 2 mg/m2 olan bir dozajda uygulanir. Anti-tümör podofillotoksin türevi avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre özellikle tedavi süresince etoposid için yaklasik 35 ila 100 mg/m2 ve teniposid için yaklasik 50 ila 250 mg/m2 olan bir dozajda uygulanir. Anti-tümör vinka alkaloidi avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre karesi basina (mg/m2) 2 ila 30 mg olan bir dozajda, özellikle tedavi süresince vinblastin için yaklasik 3 ila 12 mg/m2 olan bir dozajda, vinkristin için yaklasik 1 ila 2 mg/m2 olan bir dozajda ve vinoelbin için yaklasik 10 ila 30 mg/m2 olan bir dozajda uygulanir. Anti-tümör nükleozid türevi avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre karesi özellikle tedavi süresince 5-FU için 200 ila 500 mg/m2 olan dozajda, gemsitabin mg/m2 olan bir dozajda uygulanir. Nitrojen hardali veya nitrozüre gibi alkillenie ajanlari avantajli olarak, vücut olan bir dozajda, özellikle tedavi süresince siklofosfamid için yaklasik 100 ila 500 mg/m2 olan bir dozajda, klorambusil için yaklasik 0.1 ila 0.2 mg/kg olan bir dozajda, karmustin için yaklasik 150 ila 200 mg/m2 olan bir dozajda ve lomustin için yaklasik 100 ila 150 mg/in2 olan bir dozajda uygulanir. Anti-tümör antrasiklin türevi avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre karesi tedavi süresince doksorubisin için yaklasik 40 ila 75 mg/m2 olan bir dozajda, daunorubisin için yaklasik 25 ila 45 mg/m2 olan bir dozajda ve idarubisin için yaklasik 10 ila 15 mg/m2 olan bir dozajda uygulanir. Antiöstrojen ajan, belirli ajana ve tedavi edilen duruma göre avantajli olarak günde yaklasik 1 ila 100 mgslik bir dozajda uygulanir. Tamoksifen, terapi terapötik bir etkinin elde edilmesine ve idame ettirilmesine yeterli olan bir süre boyunca devam ettirilerek avantajli bir sekilde oral yoldan tercihen günde iki kez ila 20 mg olmak üzere 5 ila 50 mg olan bir dozajda uygulanir. Toremifen, terapi terapötik bir etkinin elde edilmesine ve idame ettirilmesine yeterli olan bir süre boyunca devam ettirilerek avantajli bir sekilde oral yoldan günde bir kez yaklasik 60 mg'lik bir dozajda uygulanir. Anastrozol, avantajli bir sekilde oral yoldan günde bir kez yaklasik 1 mg"lik bir dozajda uygulanir. Droloksifen avantajli bir sekilde oral yoldan günde bir kez yaklasik 20-100 mg°lik bir dozajda uygulanir. Raloksifen avantajli bir sekilde oral yoldan günde bir kez yaklasik 60 mg"lik bir dozajda uygulanir. Eksemestan avantajli bir sekilde oral yoldan günde bir kez yaklasik 25 mg"lik bir dozajda uygulanir. Antikorlar avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre karesi basina (mg/m2) yaklasik 1 ila 5 mgllik bir dozda veya farkli olmasi halinde teknikte bilinen sekilde uygulanir. Trastuzumab avantajli olarak, vücut yüzey alaninin metre karesi basina (mg/m2) 1 ila 5 mg, özellikle tedavi süresince 2 ila 4 mg/m2 olan bir dozajda uygulanir. Bu üç dozaj, örnegin 7, 14, 21 veya 28 günde bir tekrar edilebilen tedavi süresince bir kez, iki kez veya daha fazla uygulanabilir. Formülün (I) bilesikleri, farmasötik olarak kabul edilebilir ilave tuzlari, özellikle farmasötik olarak kabul edilebilir ilave asit tuzlari ve stereoizomerik formlari, etiketli bir bilesik ile diger moleküller, peptitler, proteinler, enzimler veya reseptörler arasindakiki kompleks olusumunun saptanmasi veya tanimlanmasi için kullanilabilmeleri nedeniyle degerli diagnostik özelliklere sahip olabilir. Saptama veya tanimlama yöntemleri, radyoizotoplar, enzimler, floresan maddeler, lüminöz maddeler ve benzeri gibi etiketleme ajanlari ile etiketlenen bilesikleri kullanir. Radyoizotoplarin örnekleri, 1251, 131I, 3H ve "C"yi içerir. Enzimler genellikle, akabinde saptanabilir bir reaksiyonu katalizleyen uygun bir substratin konjugasyonu yoluyla saptanabilir hale getirilir. Örnekleri örnegin, beta- galaktozidaz, beta-glukozidaz, alkali fosfataz, peroksidaz ve malat dehidrojenaz, tercihen yabanturpu peroksidazi içerir. Lüminöz maddeler örnegin, luminol, luminol türevleri, lusiferin, akuorin ve lusiferazi içerir. Biyolojik numuneler, vücut dokusu veya vücut sivilari olarak tanimlanabilir. Vücut sivilarinin örnekleri, serebrospinal sivi, kan, plazma, serum, idrar, baslgarn, tükürük ve benzerleridir. Genel Sentetik Yollar Asagidaki örnekler mevcut bulusu gösterir ancak sadece örnektirler ve istemlerin kapsamini herhangi bir sekilde sinirlandirmayi amaçlamazlar. Deney Kismi Buradan sonra 'DCM' terimi, diklorometan anlamina gelir, 'Me', metil anlamina gelir, 'Et', etil anlamina gelir, 'MeOH', metanol anlamina gelir, 'DMF', dimetilformamid anlamina gelir, 'EtzO', dietil eter anlamina gelir, 'EtOAc', etil asetat anlamina gelir, 'ACN', asetonitril anlamina gelir, 'HzO', su anlamina gelir, anlainina gelir, 'MgClz', magnezyum klorid anlamina gelir, 'iPrNH2', izopropilamin anlamina gelir, 'NH4HCO3', amonyum bikarbonat anlamina gelir, anlamina gelir, 'NADP', nikotinamid adeniri dinükleotid fosfat anlamina gelir, anlamina gelir. A. Ara ünlerin hazirlanisi Ara ürün 1 veya N-(3,5-dimetoksifenil)-N'-(1-metiletil)-N-[3-(1-metil-ll-l- (4) olarak açiklanir ve bilesik (4) için açiklanan protokollere göre hazirlanabilir. Ara ürün 2 veya N-(3,5-dimet0ksifenil)-N'-(l-metiletil)-N-[3-(lH-pirazol- bilesigi (137) olarak açiklanir ve bilesik (137) için açiklanan protokollere göre hazirlanabilir. Ara ürün 3 veya N-(3,5-dimet0ksifenil)-N'-(1-metil)-N-[3-(l-etil-1H- (449) olarak açiklanir ve bilesik (449) için açiklanan protokollere göre hazirlanabilir. Ara ürün 4 veya N-(3,5-dimet0ksifenil)-N'-(l-metiletil)-N-[3-(l-etil-lH- (135) olarak serbest baz veya HC] tuzu seklinde açiklanir ve bilesik (135) için açiklanan protokollere göre hazirlanabilir. Ara ürün 5 veya N-(3,5-dimetoksifenil)-N'-(l-metiletil)-N-[3-(l-metil-IH- bilesik (382) olarak açiklanir ve bilesik (382) için açiklanan protokollere göre hazirlanabilir. Ara ürün 6 veya 7-br0m0-2-(1-metil-1H-pirazol-4-il)-kinoksalin, açiklanan protokollere göre hazirlanabilir. Örnek A1 a) Ara ürün (7) hazirlanisi 1,1'-binaftil (0.54g; 0.87mmol) karisimi, oda sicakliginda nitrojen akisi altinda gazdan arindirilmistir. 10 dakika sonra paladyum (II) asetat (388mg; 1.7mmol), nitrojen akisi altinda oda sicakliginda parçalar halinde eklenmistir. Reaksiyon karisimi 95°Csde 5 saat isitilmistir. Reaksiyon karisimi oda sicakligina sogutulmustur ve buzlu su ve DCM içine dökülmüstür. Karisim, celite® pedinden filtrelenmistir. Organik katman ayrilmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti, dietileterden kristalize edilmistir ve çökelti filtrelenmistir, 4 g (%61) ara ürünü (7) vermek üzere vakum altinda kurutulmustur. b) Ara ürün (8) hazirlanisi Sodyum hidrit ( içindeki ara ürün (7) (0.7g; 1.85mmol) solüsyonuna eklenmistir. Karisim 5°Cide 1 saat karistirilmistir. (2-Br0m0etoksi)-tert-bütildimetilsilan (0.51mL; 2.40mmol), nitrojen akisi altinda 5°C"de damlatilarak eklenmistir ve reaksiyon karisimi oda sicakliginda 24 saat karistirilmistir. Karisim sogutulmus su içine dökülmüstür ve ürün, EtOAc ile özütlenmistir. Organik katman, H2O ile yikanmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, Iîltrelenmistir ve 1.2 g (nicel) ara ürünü (8) vermek üzere buharlastirilmistir. Ham ürün bir sonraki adimda herhangi bir saflastirma yapilmadan kullanilmistir. c) Ara ürün (9) hazirlanisi Tetrabütil amonyum florid (THF içinde IM) (2mL; meol), THF (20mL) içindeki ara ürün (8) (lg; 1.85mm01) solüsyonuna eklenmistir ve reaksiyon karisimi oda sicakliginda 3 saat karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, su ve EtOAc arasinda bölünmüstür. Organik katman tuzlu su ile yikanmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti (1.2 g), silika jel (düzensiz SiOH, 15-40 pm; 80 g; elüent: %98 DCM, %2 MeOH, toplanmistir ve solvent buharlastirilmistir. Kalinti (500 mg), dietileterden kristalize edilmistir. Çökelti filtrelenmistir ve 410 mg (%52) ara ürünü (9) vermek üzere kurutulmustur. MP: 172°C (K). (1) Ara ürün (10) hazirlanisi Metansülfonil klorid ( damlatilarak eklenmistir. Reaksiyon karisimi bu sicaklikta 1 saat karistirilmistir, DCM ile seyreltilmistir ve %10 aköz K2CO3 solüsyonuna dökülmüstür. Organik katman bosaltilmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve 850 mg (%100) ara ürünü (10) vermek üzere buharlastirilmistir. Ham ürün, bir sonraki adimda saflastirma yapilmadan kullanilmistir, e) Ara ürün (11) hazirlanisi (2.4mL; 28 mmol) karisimi, kapali bir tüp içinde 100°C`de 24 saat isitilmistir. Reaksiyon karisimi oda sicakligina sogutulmustur, DCM ile seyreltilmistir ve su üzerine dökülmüstür. Organik katman bosaltilmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti, silika jel (düzensiz SiOH; 24 g; gradyan: %3 MeOH, %97 DCM ila %10 MeOH, %90 DCM) üzerinde kromatografi ile saflastirilmistir. Saf fraksiyonlar toplanmistir ve 452 mg (%75) ara ürünü (11) vermek üzere buharlastirilmistir. B. Formülün (I) bilesiklerinin hazirlanisi Örnek B1: Bilesik (1) Hazirlanisi cl) _g Nj/LNN_ Dioksan (8mL) içindeki N-(3,5-dimet0ksifenil)-N'-(1-metiletil)-N-[3-(1-metil-lH- pirazol-4-il)kinoksalin-ö-il]etan-1,2-diamin (ara ürün 1) (0.42g; 0.9mmol), formaldehit (su içinde %37 solüsyon; 0.21mL; 2.8min01) solüsyonu oda sicakliginda 3 gün karistirilmistir. Su ve EtOAC eklenmistir. Organik katman bosaltilmistir, su ile yikanmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti (0.52 g), silika je1 (Durgun faz: Küresel saf silika saflastirilmistir. Istenen ürünü içeren fraksiyon toplanmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti (0.37 g), MeOH ve EtzO karisimindan kristalize edilmistir. Çökelti filtrelenmistir ve saglanarak kurutulmustur. Örnek B2: Bilesik (2) Hazirlanisi Dioksan (8mL) içindeki N-(3,5-dimetoksifenil)-N'-(1-metiletil)-N-[3-(lH-pirazol- (su içinde %37 solüsyon; 0.12mL; 1.55mmol) solüsyonu, dönüsüm olmadan oda solüsyon, oda sicakliginda 3 gün daha karistirilrnistir. Organik katman özütlenmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti (0.176g), silika jel (Durgun faz: Küresel saf silika Sum NH4OH, %87 DCM, %13 MeOH) üzerinde kromatografi ile saflastirilmistir. Istenen ürünü içeren fraksiyonlar toplanmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti (79 mg), sari zamkli toz olarak 66 mg (%34) bilesigi (2) vermek üzere asetonitril/su 20/80 ile dondurularak kurutulmustur. Örnek B3: Bilesik (3 ve 4) Hazirlanisi 50 uM ara ürün (1), l mg/ml proteinde 60 dakika siçan karacigerinden alman 12,000g fraksiyon ile 37°Cide inkübe edilmistir. Metanol içindeki 10 mM ara ürünün (1) stok solüsyonu hazirlanmistir ve bu, inkübasyon ortaminda (nihai seyreltilmistir. Inkübasyon tamponu, 1 mM EDTA, 5 mM MgClz ve 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.4) içermistir. Reaksiyon, NADP eklenerek baslatilmistir (1 mM nihai konsantrasyon). Inkübasyon, kuru buz üzerinde ani dondurma ile durdumlmustur, Ortaya çikan metabolitler ilk olarak etil asetat kullanilarak özütlenmistir. Metabolit fraksiyonu, kuruyana kadar buharlastirilmistir, DMSO:su (lzl, v/v) içinde sulandirilmistir ve revers faz UPLC kullanilarak ayrilmistir. Ayirma, 0.8 ml/dakikada 20 dakika boyunca %5-70 B lineer gradyani ile solvent A kullanilarak iki Interchim Strategy CIS-2, 2.2 um, (150mm x 3.0 mm ID) kolonu kullanilarak yapilmistir. Solventler, Solvent A, 25mM Amonyum asetat pH4.0 ve Solvent B, Asetonitril/metanolden (60/40, V/V) olusmustur. Istenen ürünlere karsilik gelen pik fraksiyonlari toplanmistir ve bilesik (3 ve 4) saglanarak kuruyana kadar buharlastirilmistir. Bilesik 3 Örnek 1"de açiklanan protokole göre hazirlanabilir. Bilesik 4 Alternatif olarak bilesik (3 ve 4) de asagidaki sekilde hazirlanmistir: Boron tribromid (DCM içinde lM; 6 mL; 6 mmol), nitrojen akisi altinda 5°C"de DCM (25 mL) içindeki bilesik (1) (485 mg; 1.06mmol) solüsyonuna damlatilarak eklenmistir. Solüsyon yavasça oda sicakligina yükseltilmistir ve 1.5 saat karistirilmistir. Reaksiyon karisimi DCM ile seyreltilmistir, tuzlu su üzerine dökülmüstür ve kati K2C03 ile baziklestirilmistir. Organik katman ayrilmistir, tuzlu su ile yikanmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti, silika jel (düzensiz SiOH, 40g; mobil karisimi saglanarak kuruyana kadar buharlastirilmistir. Bu fraksiyon, akiral SFC edilmistir ve Et20/ACNiden kristalize edilmistir. Çökeltiler, 53 mg (%1 l) bilesigi filtrelenmistir. Örnek B4: 2 mM ara ürünün (1) stok solüsyonu metanol içinde hazirlanmistir ve bu, inkübasyon ortaminda 200 kat seyreltilmistir (nihai metanol konsantrasyonu inkübat içinde %0.5"tir). inkübasyon, siçan karacigerinden alinan 12,000g fraksiyon ile 37°C3de 1 mg/ml proteinde 60 dakika boyunca yapilmistir. inkübasyon tamponu, 1 mM EDTA, 5 mM MgClz ve 100 mM potasyum fosfat tamponu (pH 7.4) içermistir. Reaksiyon, NADP eklenerek baslatilmistir (l mM nihai konsantrasyon). inkübasyon, kuru buz üzerinde ani olarak dondurma islemi ile durdurulmustur. Elde edilen inkübasyon (1 ml), 5 hacim asetonitril ile karistirilmistir, vorteks ile karistirilmistir ve 10 dakika sonike edilmistir. Protein, 8°C°de 3200 rpm°de 30 dakika santrifüj ile uzaklastirilmistir. Üst faz uzaklastirilmistir ve 30°C°de nitroj en akisi altinda kuruyana kadar buharlastirilmistir. Ekstrakt, asetonitril/su (l:1, V/V) içinde sulandirilmistir. Numune asagidaki sekilde analiz edilmistir: MS saptamasi ile UPLC . Ultra performansli sivi kromatografisi Pompasi Acquity Binary Solvent Manager/ Waters 2777 CTC-Pal-enjektör . UV detektörü: Waters Acquity PDA 0 MS Detektörü: Waters G2(S) QTOF MS / Thermo LTQ-Orbitrap . Veri Sistemi: Waters Masslynx 4.] Çalisma kosullari: - Kolon sicakligi: T = 60°C - Numune sicakligi: T = 10°C - Mobil faz: Solvent A: 0.025 M amonyum asetat pH 4.0 Solvent B: asetonitril/metanol - Elüzyon modu: lineer gradyan: - Islem Süresi: 30 dakika - akis: 0.8 ml/dakika Siringa infüzyonu: . Mobil faz: Asetonitrilzsu (lzl, v/v) . Akis: Sul/dakika Saptama kosullari MS kosullari - waters synapt g2 ve g2s kütle spektrometresi MS analizi, ikili elektrosprey iyonizasyon probu ile donatilan ve yüksek ayristirmali, pozitif iyon modunda çalistirilan Waters SYNAPT G2 ve G2S spektrometreleri kullanilarak gerçeklestirilmistir. Kapiler voltaj, 3 kV`ye ve koni 40Vlye ayarlanmistir. Kaynak sicakligi 120°C`dir, desolvasyon sicakligi 400°C°dir. Kütle spektrometresi, Numune Spreyinden uygulanan Sodyum Format solüsyonu ile kalibre edilmistir. LockSprayTM ESI probu, kaya kütle kalibranti olan Lösin Enkefalinin bagimsiz bir kaynagini saglamistir. m/2556.2771°deki Lösin iyonu, MSMS modunun yani sira tüm MSide kaya kütlesi olarak kullanilmistir. QTOF verileri (MS, MSMS), degisken tarama süresi (0.5 - 1.0 saniye) ile kütle merkezi modunda elde edilmistir. Tüm veriler, Masslynx yazilimi kullanilarak islenmistir. MS kosullari - thermo ltq-orbitrap kütle spektrometresi LTQ-Orbitrap kütle spektrometresi, pozitif iyon modunda çalistirilan bir elektrosprey iyonizasyon kaynagi ile saglanmistir. Dogru kütle ölçümleri, harici kalibrasyon veya kaya kütle kalibrasyonu (m/z 391.2843"te kaya kütle iyonu) kullanilarak elde edilmistir. Kaynak parametreleri, 10 ng/uL degistirilmemis ilaç standart solüsyonu kullanilarak maksimum duyarlilik için ayarlanmistir. Ayni solüsyon, MS" parçalanmasi esnasinda kullanilan optimal çarpisma enerjisini tanimlamak amaciyla kullanilmistir. Metabolitler, MSn parçalamasi veri bagimli tarama kullanilarak LC-MS izinden için seçilmistir. Veriler, kütle merkezi modunda toplanmistir ve XCalibur yazilimi kullanilarak islenmistir. Yukaridaki deneyde bilesik (4) ([MH]+ m/z 445). bilesik (3) ([MH]+ m/z 445) ve bilesik (5) ([MH]+ m/z 431) saptanmistir. Bilesik 5: Örnek B5 Bilesik (6) Hazirlanisi 154-di0ksan (, forrnaldehit (su içinde %37 solüsyon; solüsyonu oda sicakliginda 3 gün karistirilmistir. Düsük dönüsüm fark edildiginden ek formaldehit (su içinde %37 solüsyon; eklenmistir ve reaksiyon karisimi 70°C"de 16 saat karistirilmistir. HZO ve EtOAc eklenmistir. Organik katman bosaltilmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti (0.325g), silika jel kromatografisi (düzensiz SiOH, 40 g, mobil faz: NH4OI-I) ile saflastirilmistir. Ürünü içeren fraksiyonlar karistirilmistir ve filtrasyon ve kurutma sonrasinda 86 mg (%28) bilesigi (6) saglamak üzere Et20/ACN karisimindan kristalize edilen ara ürün fraksiyonunu (106 mg) saglamak üzere konsantre edilmistir. MP: 170°C (K) Örnek B6 Bilesik (7) Hazirlanisi HCl tuzu olarak (1.65HC1 2.2H20) 1,4-di0ksan (, formaldehit (su içinde %37 solüsyongl43 uL; 1.91mmol) solüsyonu oda sicakliginda 3 gün karistirilmistir. Hiçbir dönüsüm fark edilmediginden ek formaldehit (su içinde saat karistirilmistir. Tekrar ek formaldehit (su içinde %37 solüsyon; 477 uL; 6.36mmol) eklenmistir ve reaksiyon karisimi 70°C°de 16 saat karistirilmistir. HzO ve EtOAc eklenmistir. Organik katman bosaltilmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti (0.48g), silika jel kromatografisi (Küresel saf silika Sum 150x30.0mm, DCM, %10 MeOH) ile saflastirilmistir. Ürünü içeren fraksiyonlar karistirilmistir ve akiral SFC (Durgun faz: CYANO 6um 150x21.2mm, Mobil faz: %90 COz, saglamak üzere konsantre edilmistir. Ürünü içeren fraksiyonlar karistirilmistir ve MeOH içinde çözülen 100 mg ara ürün fraksiyonunu saglamak üzere konsantre edilmistir. iPrOH (2-5N) içindeki 0.1 mL HCl 0°Cide eklenmistir. Karisim akabinde konsantre edilmistir ve ortaya çikan kalinti. Et20 ile alinmistir. Çökelti filtrelenmistir ve kirmizi kati olarak 103 mg (%29) bilesigi (7) saglamak üzere kurutulmustur. MP: 152°C (K) Örnek B7 Bilesik (8) Hazirlanisi Dioksan (lOmL) içindeki ara ürün (1 l) (382mg; 0.82mm01) ve formaldehit (su HzO ve EtOAc eklenmistir. Organik katman bosaltilmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur, filtrelenmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti, silika EtOAc) üzerinde kromatografi ile saflastirilmistir. Saf fraksiyonlar toplanmistir ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Kalinti (:65 mg), revers faz kromatografi (X- toplanmistir ve 15 mg (%4) bilesigi (8) vermek üzere buharlastirilmistir. MP: 266°C (K). Örnek B8 Bilesik (9) Hazirlanisi içinde %37 solüsyon; 0.1mL; 1.4mmol) solüsyonu oda sicakliginda 3 gün karistirilmistir. Bir hafta sonra ek formaldehit (su içinde %37 solüsyon; 0.5mL; .55mmol) eklenmistir, karisim, oda sicakliginda 2 gün daha karistirilmistir. HzO ve EtOAc eklenmistir. Organik katman özütlenmistir, MgSO4 üzerinde kurutulmustur ve kuruyana kadar buharlastirilmistir. Ortaya çikan kalinti (170 mg), revers faz (Durgun faz: X-Bridge-C18 Sum NH4HCO3 %05, % ile saIlastirilmistir. Ürünü içeren fraksiyonlar karistirilmistir ve sari toz olarak 9 mg (%4) bilesigi (9) vermek üzere asetonitril/su /80 ile dondurularak kurutulan ara ürün fraksiyonunu (10 mg) saglamak üzere konsantre edilmistir. MP: 80°C°de zamk (K). Analitik Kisim LCMS (Sivi kromatografisi /Kütle spektrometrisi) (bakiniz Tablo Al) LC ölçümü, asagidaki ilgili yöntemlerde belirtildigi üzere gaz gidericisi olan ikili pompa, oto numuneleme cihazi, diyot dizisi detektörü (DAD) ve bir kolonu içeren UPLC (Ultra Performansli Sivi Kromatografisi) Acquity (Waters) kullanilarak gerçeklestirilmistir, kolon, 40°C°lik bir sicaklikta tutulur. Kolondan akis, MS detektörüne getirilmistir. MS detektörü, elektrosprey iyonizasyon kaynagi ile konfigüre edilmistir. Kapiler igne voltaji, 3 kV"dir ve kaynak sicakligi, Quattro (Watersatan üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi) üzerinde 130°C°de muhafaza edilmistir. Nebülizör gazi olarak nitrojen kullanilmistir. Veri toplama, Waters- Micromass MassLynx-Openlynx veri sistemi ile gerçeklestirilmistir. Revers faz UPLC, 0.343 ml/dakikalik akis orani ile Waters Acquity BEH (köprülenmis etilsiloksan/silika hibridi) C18 kolonu (1.7 mm, 2.1 x 100 mm) üzerinde kosullarina dönme, 0.73 dakika tutma islemlerinden olusan bir gradyan kosulunu gerçeklestirmek üzere iki mobil faz (mobil faz A: %95 7 mM amonyum asetat / enjeksiyon hacmi kullanilmistir. Koni voltaji, pozitif ve negatif iyon modu için 20V°dir. Kütle spektrumlari, 0.1 saniyelik taramalar arasi gecikme kullanilarak Birkaç bilesik için erime noktalari (MP), bir DSC] (Mettler-Toledo) ile belirlenmistir. Erime noktalari, 10°C/dakikalik bir sicaklik gradyani ile ölçülmüstür. Maksimum sicaklik, 350°C°dir. Degerler, pik degerleridir. Birkaç bilesik için erime noktalari, lineer sicaklik gradyani olan isitilmis bir plaka, kayar isaretleyici ve Santigrat derece cinsinden sicaklik skalasindan olusan bir Kofler sicak tezgahi ile elde edilmistir. Bilesik (1, 2, 6 ila 9) için NMR deneyleri, ters üçlü-rezonans ('H, 13C, 15N TXI) prob basligi ile donatilan ve dahili döteryum kilidinin kullanildigi Bruker Avance (ppm) cinsinden verilir. Bilesik (3 ve 4) için her fraksiyon, 250 pl su içermeyen DMSO-d6 içinde çözülmüstür ve ortaya çikan solüsyon, manyetik duyarliligi ilgili solvent ile eslestirilmis olan 5 mm Shigemi NMR tüpüne transfer edilmistir. Deneyler, 5-mm°lik ters saptama kriyoprobu (CPTCI) ile donatilan Bruker Avance 600 MHZ spektrometrede kaydedilmistir. 1D 1H ve 2D NOESY, HSQC ve HMBC spektrumlari, standart Bruker puls programlarinin çalistirilmasi ile kaydedilmistir. NOESY spektrumu, uzaydaki baglanabilirliklerin tayini için kullanilmistir: HMBC spektrumu, baglarin baglanabilirlikleri için kullanilmistir. Kimyasal kaymalar (ö), ppm cinsinden verilir. lH NMR kimyasal kayma verileri, dahili referans olarak 2.50 ppm`de DMSO-d5 çoklu merkezi veya 1.94 ppm°de asetonitril-d2 çoklu merkezi kullanilarak 1D 1H spektrumundan elde edilmistir. Birlesme sabitleri, Hz cinsinden ölçülür. 13C NMR kimyasal kaymalari, dahili referans olarak 3951 ppm°de DMSO-d6 çoklu merkezi kullanilarak elde edilmistir. Tablo AI: C0. No. bilesik numarasi anlamina gelir, Retansiyon süresi (Rt) dakika cinsindendir; MP, erime noktasi (°C) anlamina gelir. Teknikte uzman bir kisi tarafindan anlasildigi üzere protokoller kullanilarak belirtilen sekilde sentezlenen bilesikler, solvat, örnegin hidrat olarak bulunabilir ve/veya rezidüel solvent veya minör safsizliklar içerebilir Bilesik . . (Kofler(K) Bilesik MP Ri [M+H]+ No. veya DSC) 1 l 7 N- l90°C DSC (%98.l 459 û / saflik) 2 K (%943 445 (zamkli) saflik) Teknikte uzman bir kisi tarafindan anlasildigi üzere protokoller kullanilarak belirtilen sekilde sentezlenen bilesikler, solvat, örnegin hidrat olarak bulunabilir ve/veya rezidüel solvent veya minör safsizliklar içerebilir Bilesik (K0fler(K) Bilesik MP Rt [M+H]+ No. veya DSC) f( 2.07 HO û: saflik) 4 2.06 /0 (mm saflik) N j/CN 6 170°C K (%99 445 saflik) Teknikte uzman bir kisi tarafindan anlasildigi üzere protokoller kullanilarak belirtilen sekilde sentezlenen bilesikler, solvat, örnegin hidrat olarak bulunabilir ve/veya rezidüel solvent veya minör safsizliklar içerebilir Bilesik (K0fler(K) Bilesik MP Rt [M+H]+ No. veya DSC) Bilesik . ' (Kofler(K) Bilesik MP Rt [M+H]Jr No. veya DSC) 7 " N : `N`/ &OC K (0/ 95 473 / û( (zamkli) o saflik) as HCl salt 8 N ,NL 266°C K (%95 477 /0 :û , saflik) Â 80°C 223 " 4.. K (%100 473 û'lx \ (zamkli) /0 N, saflik) Bilesik 1 lH NMR 350°K"da gerçeklestirilmistir lH NMR ( 2.84 (spt,J=6.5 8.87 (s, 1 H) Bilesik 2 1H NMR 350°K"da gerçeklestirilmistir lH NMR ( 2.84 (spt, J=6.6 13.08 (br. s., 1 H) Bilesik 3 1H NMR 300°K°da gerçeklestirilmistir lH NMR ( 2.82 (spt, J=6.50 Bilesik 4 1H NMR 300°K"da gerçeklestirilmistir lH NMR ( 2.81 (spt, .#670 Bilesik 6 1H NMR 300°K`da gerçeklestirilmistir Bilesik 7 1H NMR 300°K"da gerçeklestirilmistir lH NMR ( 1.44 (t, #74 Bilesik 8 1H NMR 350°K`da gerçeklestirilmistir lH NMR ( 2.85 (spt, J:6.5 Bilesik 9 Diazepin halkasinin bazi sinyalleri, DMSO-d6 içinde 300 Ksda ölçülen spektrumlardaki saptamanin ötesine genisletilir. Farmakoloiik kisim Biyoloiik analizler A FGFRl (enzimatik analiz) pL"lik nihai reaksiyon hacminde FGFRl (h) (25 ng/ml), bilesik (%1 DMSO nihai) varliginda 50 mM HEPES pH 7.5, 6mM MnClz, l mM DTT, 0,1 mM edilmistir. Oda sicakliginda 60 dakika inkübasyondan sonra reaksiyon, 2.27 nM dakika bulunan %002 BSA ile durdurulmustur. Akabinde Zaman Çözümlemeli Floresans Rezonans Enerji Transferi (TR-FRET) sinyali (uyarilma 340 nm. Emisyon 620 nm, emisyon 655 nm) ölçülmüstür ve sonuçlar, RFU (Nispi Floresans Birimleri) cinsinden ifade edilir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinin (aralik 10 HM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve FGFRZ (enzimatik analiz) uL°lik nihai reaksiyon hacminde FGFR2 (h) (150 ng/ml), bilesik (%1 DMSO nihai) varliginda 50 mM HEPES pH 7.5, 6mM MnClz, 1 mM DTT, 0,1 mM edilmistir. Oda sicakliginda 60 dakika inkübasyondan sonra reaksiyon, 2.27 nM dakika bulunan %0.02 BSA ile durdurulmustur. Akabinde Zaman Çözümlemeli Floresans Rezonans Enerji Transferi (TR-FRET) sinyali (uyarilma 340 nm. Emisyon 620 nm, emisyon 655 nm) ölçülmüstür ve sonuçlar, RFU (Nispi Floresans Birimleri) cinsinden ifade edilir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinin (aralik 10 uM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve leo (M) ve pleo (-loglC50) degerini hesaplamak amaciyla kullanilmistir. FGFR_3 (enzimatik analiz) uLilik nihai reaksiyon hacminde FGFR3 (h) (40 ng/ml), bilesik (%1 DMSO nihai) varliginda 50 mM HEPES pH 7.5, 6mM MnClg, 1 mM DTT, 0,1 mM edilmistir. Oda sicakliginda 60 dakika inkübasyondan sonra reaksiyon, 2.27 nM dakika bulunan %0.02 BSA ile durdurulmustur. Akabinde Zaman Çözümlemeli Floresans Rezonans Enerji Transferi (TR-FRET) sinyali (uyarilma 340 nm. Emisyon 620 nm, emisyon 655 nm) ölçülmüstür ve sonuçlar, RFU (Nispi Floresans Birimleri) cinsinden ifade edilir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinin (aralik 10 uM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve leo (M) ve pleo (-10glC50) degerini hesaplamak amaciyla kullanilmistir. FGFR4 (enzimatik analiz) uL"lik nihai reaksiyon hacminde FGFR4 (h) (60 ng/ml), bilesik (%1 DMSO nihai) varliginda 50 mM HEPES pH 7.5, 6mM MnClz, 1 mM DTT, 0,1 mM edilmistir. Oda sicakliginda 60 dakika inkübasyondan sonra reaksiyon, 2.27 nM dakika bulunan %0.02 BSA ile durdurulmustur. Akabinde Zaman Çözümlemeli Floresans Rezonans Enerji Transferi (TR-FRET) sinyali (uyarilma 340 nm. Emisyon 620 nm, emisyon 655 nm) Ölçülmüstür ve sonuçlar, RFU (Nispi Floresans Birimleri) cinsinden ifade edilir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinin (aralik 10 HM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve KDR (VEGFRZ) (enzimatik analiz) pL`lik nihai reaksiyon hacminde KDR (h) (150 ng/ml), bilesik (%1 DMSO nihai) varliginda 50 mM HEPES pH 7.5, 6mM MnClz, 1 mM DTT, 0,1 mM edilmistir. Oda sicakliginda 120 dakika inkübasyondan sonra reaksiyon, 2.27 nM dakika bulunan %002 BSA ile durdurulinustur. Akabinde Zaman Çözümlemeli Floresans Rezonans Enerji Transferi (TR-FRET) sinyali (uyarilma 340 nm. Emisyon 620 nm, emisyon 655 nm) ölçülmüstür ve sonuçlar, RFU (Nispi Floresans Birimleri) cinsinden ifade edilir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinin (aralik 10 MM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve Ba/F3-FGFR1 (eksi IL3 veya arti IL3) (hücresel proliferasyon analizi) 384 gözlü bir plakada DMSO içindeki 100 nl bilesik dilüzyonu, Ba/F3-FGFR1- transfekte hücrelerin göz basina 20000 hücresini içeren 50 ;il hücre kültürü ortami (fenol kirmizisi içermeyen RPMl-l640, %10 PES, 2 mM L-Glutamin ve 50 tig/ml Gentamisin) eklenmeden önce püskürtülmüstür. Hücreler, 37°C ve %50 COz"de Tamponu) gözlere eklenmistir, RFU7lar (Nispi Floresans Birimleri) (uyarilma 540 nm., emisyon 590 nm.) Iloresans plaka okuyucuda ölçülmeden önce 37°C ve %5 COzidc 4 saat inkübe edilmistir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinin (aralik 10 nM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve IC50 (M) ve pleo (- logICso) degerini hesaplamak amaciyla kullanilmistir. Karsi tarama olarak ayni deney, 10 ng/ml mürin IL3 varliginda gerçeklestirilmistir. Ba/F3-FGFR3 (eksi IL3 veya arti IL3) (hücresel proliferasvon analizi) 384 gözlü bir plakada DMSO içindeki 100 nl bilesik dilüzyonu, Ba/F3-FGFR3- transfekte hücrelerin göz basina 20000 hücresini içeren 50 nl hücre kültürü ortami Gentamisin) eklenmeden önce püskürtülmüstür. Hücreler, 37°C ve %50 COfde Tamponu) gözlere eklenmistir, RFU*lar (Nispi Floresans Birimleri) (uyarilma 540 nm., emisyon 590 nm.) floresans plaka okuyucuda ölçülmeden önce 37°C ve %5 COzsde 4 saat inkübe edilmistir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinin (aralik 10 ptM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve IC50 (M) ve pIC50 (- logleo) degerini hesaplamak amaciyla kullanilmistir. Karsi tarama olarak ayni deney. 10 ng/ml mürin IL3 varliginda gerçeklestirilmistir. Ba/F3-KDR (eksi IL3 veya arti IL3) (hücresel proliferasvon analizi) 384 gözlü bir plakada DMSO içindeki 100 nl bilesik dilüzyonu, Ba/F3-KDR- transfekte hücrelerin göz basina 20000 hücresini içeren 50 nl hücre kültürü ortami Gentamisin) eklenmeden önce püskürtülmüstür. Hücreler, 37°C ve %50 COz"de Tamponu) gözlere eklenmistir, RFU7lar (Nispi Floresans Birimleri) (uyarilma 540 nm., emisyon 590 nm.) Iloresans plaka okuyucuda ölçülmeden önce 37°C ve %5 COzide 4 saat inkübe edilmistir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinm (aralik 10 üM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve IC50 (M) ve pICso (- Bilesik 1 logICso) degerini hesaplamak amaciyla kullanilmistir. Karsi tarama olarak ayni deney, 10 ng/ml mürin IL3 varliginda gerçeklestirilmistir. Ba/F3-FGFR4 (hücresel proliferasvon analizi) 384 gözlü bir plakada DMSO içindeki 100 nl bilesik dilüzyonu, Ba/F3-FGFR4- transfekte hücrelerin göz basina 20000 hücresini içeren 50 pl hücre kültürü ortami (fenol kirmizisi içermeyen RPMl-1640, %10 PES, 2 mM L-Glutamin ve 50 üg/ml Gentamisin) eklenmeden önce püskürtülmüstür. Hücreler, 37°C ve %50 CO2`de Tamponu) gözlere eklenmistir, RFUilar (Nispi Floresans Birimleri) (uyarilma 540 nm., emisyon 590 nm.) floresans plaka okuyucuda ölçülmeden önce 37°C ve %5 COzsde 4 saat inkübe edilmistir. Bu analizde farkli bilesik konsantrasyonlarinin (aralik 10 (LM ila 0.] nM) inhibitör etkisi belirlenmistir ve ve pIC50 (- logleo) degerini hesaplamak amaciyla kullanilmistir. Yukaridaki analizlerde bulusun bilesiklerine yönelik veriler, Tablo A2"de saglanir. Tablo A2 Biyoloiik analizler B Enzim Baglama Analizleri (KINOMEscan®) Burada açiklanan bilesiklerin kinaz enzimi baglama afiniteleri, DiscoveRx Corporation, San Diego, California, USA (WWW.kinomescan.com) tarafindan gerçeklestirilen KINOMEscan® teknolojisi kullanilarak belirlenmistir. Tablo A3, elde edilen Kd degerlerini (nM) gösterir, Kd, inhibitör baglanma sabitidir: TR TR TR TR TR TR TR TR TR