[go: up one dir, main page]

TR201808051T4 - Pirrolobenzodiazepin antikor konjugatları. - Google Patents

Pirrolobenzodiazepin antikor konjugatları. Download PDF

Info

Publication number
TR201808051T4
TR201808051T4 TR2018/08051T TR201808051T TR201808051T4 TR 201808051 T4 TR201808051 T4 TR 201808051T4 TR 2018/08051 T TR2018/08051 T TR 2018/08051T TR 201808051 T TR201808051 T TR 201808051T TR 201808051 T4 TR201808051 T4 TR 201808051T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
antibody
mmol
conjugate
drug
washed
Prior art date
Application number
TR2018/08051T
Other languages
English (en)
Inventor
Hendrikus Cornelis Van Berkel Patricius
Wilson Howard Philip
Original Assignee
Adc Therapeutics Sa
Medimmune Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adc Therapeutics Sa, Medimmune Ltd filed Critical Adc Therapeutics Sa
Publication of TR201808051T4 publication Critical patent/TR201808051T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001119—Receptors for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)

Abstract

PBD dimerleriyle CD25'e bağlanan bir antikorun konjugatları.

Description

TARIFNAMEPIRROLOBENZODIAZEPIN ANTIKOR KONJUGATLARIBu bulus, bir antikora bir baglayici formunda bir labil C2 veya N10koruma grubuna sahip pirrolobenzodiazepinlerle (PBD"1er) ilgilidir.Bulus hakkinda `Ön bilgiPirrolobenzodiazepinlerBazi pirrolobenzodiazepiriler (PBD"ler), spesifik DNA sekanslarmi tanima ve onlara baglanma kabiliyetine sahiptir; tercih edilen sekans, PuGPu"dur. Ilk PBD antiti'imör antibiyotigi antramisin, 1965 yilinda kesfedildi (Leimgruber, et al., J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965); Leimgruber, et al., J. Am. Chem. 800., 87, 5791-5793 (1965)). O zamandan bu yana, dogada mevcut birçok PBD"ler rapor edilmistir ve çesitli farkli analoglar için 10°un üzerinde sentetik yol gelistirilmistir (Thurston, et al., Chein. ReV. 1994, 433-465 (1994); Antonow, D. and Thurston, DE., Chem. ReV. 2011 111 (4), 2815-2864). Aile üyeleri arasinda abbeyinisin (Hochlowski, et al., .1. Antibiotics, 40, 145-148 (1987)), çikamisin (Konishi, et al., J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984)), DC-81 (Japon Patenti 58-180 487; Thurston, et al., Chem. Brit., 26, 767-772 (1990); Bose, et al., Tetrahedron, 48, 751-758 (1992)), mazetramisin (Kuminoto, et al., 1. Antibiotics, 33, 665-667 (1980)), neotramisinler A ve B (Takeuchi, etal., J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976)), porotramisin (Tsunakawa, et al., J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988)), protrakarsin (Shimizu, et al, J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982); Langley and Thurston, J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987)), sibanomisin (DC-102) (Hara, et al., J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988); Itoh, et al., J. Antibiotics, 41, 1281- 1284 (1988)), sibiromisin (Leber, et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988)) ve tomamisin (Ariina, et al., J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972)) vardir. PBD"ler asagida verilen genel yapiya sahiptir:10 Nsç H B 113 l 1 I II N 9" 2 3Bunlar, hem aromatik A halkalarinda hem de pirrolo C halkalarinda sübstitüentlerin sayisi, tipi ve pozisyonu açisindan ve C halkasi satürasyon derecesi açisindan farklilik gösterirler. B-halkasinda, DNA"yi alkilleineden sorumlu elektrofilik merkez olan N10-Cll pozisyonunda bir iinin (N=C), bir karbinolamin (NH-CH(OH)) ya da bir karbinolamjn metil eter (NH-CH(OMe)) vardir. Bilinen dogal ürünlerin hepsinde, C halkasindan A halkasina dogru bakildiginda bunlarin sag-el kuralina göre dönmesini saglayan bir kiral Clla pozisyonunda bir (S)-konfigürasyonu söz konusudur. Bu konfigürasyon, ürünlerin, baglanma yerinde siki geçme saglayan B-form DNA küçük oluklari bulunan, izohelisite için uygun üç- boyutlu bir sekle sahip olmalarini saglar (Kohn, In Antibiotics III. Springer-Verlag, New York, pp. 3-11 (1975); Hurley and Needham- VanDevanter, Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986)). Bunlarin küçükolukta bir eklenme ürünü olusturma kabiliyetleri, bunlarin DNA prosesine müdahale etmelerini ve dolayisiyla, antit'i'imör ajanlariolarak kullanilabilinelerini saglar.Ozellikle avantajli bir pirrolobenzodiazepin bilesigi, Gregson ve arkadaslari (Cheni. Commun. 1999, 797-798) tarafindan bilesik 1 olarak ve Gregson ve arkadaslari (J. Med. Chem. 2001, 44, 1161- 1174) tarafindan bilesik 4a olarak açiklanir. SG2000 olarak da bilinen bu bilesik asagida gösterilmektedir:SûîmûWO 2007/085930 numarali patentte, Örnegin bir antikor gibi, bir hücre baglama ajanina baglanti için baglayici gruplar içeren dimer PBD bilesiklerini hazirlama prosesleri tarif edilmektedir. Baglayici, dimerinnionomer PBD birimlerini baglayan köprüde bulunur.Bu bulusun sahipleri, WO 2011/130613 ve WO 2011/130616 numarali patentte, örnegin bir antikor gibi, bir hücre baglama ajanina baglanti için baglayici gruplar içeren dimer PBD bilesiklerini açiklamislardir. Bu bilesiklerde baglayici, PBD çekirdege C2 pozisyonuyla baglanir ve genellikle baglayici grupta bir enzimin etkinligiyle klevaja ugratilir. WO 201 1/ 130598 numarali patentte, bu bilesiklerdeki baglayici, PBD çekirdek üzerinde mevcut N10 pozisyonlarindan birine baglanir ve genellikle baglayici grupta birenzimin etkinligiyle klevaja ugratilir.Antikor-ilaç konjugatlariKanser, immünolojik ve anjiyogenik bozukluklar görülen hastalarin hedefli tedavisi için antikor tedavisi belirlenmistir (Carter, P. (2006) Nature Reviews Immunology 6:343-357). Sitotoksik veya sitostatik ajanlarin, yani kanser tedavisinde tümör hücrelerini öldürmeyi veya inhibe etmeyi hedefleyen ilaçlarin lokal uygulanmasi için antikor-ilaç konjugatlarinin (ADC), yani immünokonjugatlarin kullanilinasinin amaci, ilaç inoiyetesinin tümörlere verilmesi ve orada hücre içinde akümülasyonudur, ancak bu konjuge edilmemis ilaç ajanlarinin sistemik uygulanmasi normal hücrelerde de kabul edilemez seviyelerde toksisiteye neden olabilir (Xie et al (2006) Expert. Opin. Biol. Ther. 6(3):281-291; Kovtun et al (2006) Cancer Res. 66(6):3214-3121; Law et al (2006) Cancer Res. 66(4):2328-2337; Wu et al (2005) Nature Biotech. 23(9):ll37-ll45; Lambert J. (2005) Current Opin. in Pharmacol. 5:543-549; Hamann P. (2005) Expert Opin. Ther. Patents 15(9):1087-1103; Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Iinmuiiol. Immunother. 52:328- 337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614).Sonuç olarak, minimum toksisiteyle maksimum etkinlik elde edilmeye çalisilir. ADC tasarlama ve gelistirme çalismalari, monoklonal antikorlarin (mAb'ler) selektivitesi ve yaiii sira, ilaç etki mekanizmasi, ilaç-baglama, ilaç/antikor orani (yükleme) ve ilaç-salim özelliklerine odaklanmistir (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925- 932; Dornan et al (2009) Blood ll4(l3):272l-2729; US 7521541; US 7723485; W02009/052249; McDonagh (2006) Protein Eng. Design & Sel. 19(7): 299-307; Doronina et al (2006) Bioconj. Chem. 172114- 124; Erickson et al (2006) Cancer Res. 66(8):1-8; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852; Jeffrey et al (2005) J. Med. Chem. 48:1344-1358;Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. :7063-7070). ABD 2010/203007 A1 (LI WEI [US] ET AL) bir baglayici ajana kovalent olarak baglanan pirolobenzodiyazepini içeren konjugatlari açiklar, burada baglayici ajaii, CD25°e karsi yönlendirilen antikorlari da içeren bir listeden seçilir. Ilaç moiyeteleri, tübülin baglanmasi, DNA baglanmasi, proteazom ve/Veya topoizomeraz inhibisyonu da dahil mekanizmalarla sitotoksik ve ve sitostatik etkilerini gösterebilir. Bazi sitotoksik ilaçlar, büyük antikorlara ya da protein reseptör ligandlarina kon juge edildiklerinde, inaktif ya da dahaaz aktif olma egilimi gösterirler.Bu bulusun sahipleri, belirli PBD diiner antikor konjugatlarigelistirmislerdir. Bulus Hakkinda AçiklamaMevcut bulusun ilk özelligi, asagida verilen formülle ifade edilen birkonjugattan olusmaktadir:Con jA0 0@%N" OY` /Y ,AY/Yaw Yöigûî Waw Y (iCon jB:0 0 N V . N 1! H t) /-\\ /N m( / l fl; u' \ Mx \ H r 'KAON \/\"0./\/"i\i I F fx i \ O / \/ O\/\/o l \ 0/ `o / Compya da ConjE:burada, Ab CD25"e baglanan bir antikordur ve bu antikor, SEKANS KOD NO. 3,6 ait amino asit sekansina sahip olan bir VH CDRPI içeren VH domaininden, SEKANS KOD NO.4°e ait amino asit sekansina sahip olan bir VH CDR2"den ve SEKANS KOD NO.5°e ait amino asit sekansina sahip olan bir VH CDR3°ten olusmaktadir ve burada, ilaçlarin (D) antikora (Ab) ilaç yüklemesi (p) l°den 8"e kadarbir tamsayidirBu bulusta, asagida tanimlanan bir antikorla birlikte, sirasiyla A"dan:150 0N/\/lkN-i &o k/owo/VOWO/VO \/\cW" 0 ;CW/W img" aq& VbB°denz D'den:N N OH H 1 0\/\/o H \ \ N 0/ o FNM D Ve Eden: 0 r_›\ N Y\/ \0 O "NV\o/\/ \/\o/\ pOA/OwoA/O 0' 0 H ` H 0 5 o o o /\ Y UH H _\ seçilen bir bilesigin konjüge edilmesinden olusan ve ConjA, ConjB, ConjC, ConjD ve ConjE7den ibaret bir gruptan seçilen bir konjugatelde etmeye yönelik bir yöntem sunulmaktadir.WO 201 1/ 130615 sayili patentte, A,n1n parent bilesigi olan bilesik 26açiklanmaktadir: Q ,N O\/'\/0 V` ii V/ÇCQÇEM JC# / C) 0 Nl';› 26Bilesik A, bir hücre baglaina ajanina baglanti için bir baglayicidan ve bu PBD"den olusmaktadir. Bu hücre baglama ajani, konjugatlarin sentezi için faydali olan çözünürlügü saglayacak çok sayida etilenglikol moiyetesi sunmaktadir.WO 2010/043380 ve WO 2011/130613 sayili patentler bilesik 30°uaçiklamaktadir:, 1 0 - 4 is. , MU \ ii ./ \ \ N` U 0 N / \ NH; 0 0 | P / `\) 30 i /WO 201 1/ 130613 sayili patent de bilesik 51 "i açiklamaktadir:Bilesik B ve bilesik 30 arasindaki fark, bilesik B"nin PBD moiyeteleri arasinda bir (CH2)5 baglayici yerine, salinan PBD dimerinin lipofilisitesini azaltan bir (CH2)3baglayici olmasidir. Baglayici frup, meta pozisyonunda degil, para pozisyonundaki C2-fenil grubunabaglaninaktadir.WD 201 1/ 130613 sayili patent, bilesik 93 u açiklamaktadir:Bilesik C, bilesik 93"ten iki açidan farklidir. Hücre baglama ajani, konjugatlarin sentezinde faydali olan çözünürlügü temin edecek etilen glikol moiyetelerinin sayisinin artmasini saglainakta ve fenil sübstitüe, bir oksijen atomu yerine, çözünürlüge ayrica yardimci olan iki oksijen atomu saglamaktadir. Bilesik C'nin yapisi da, küçük olukta daha kuvvetli baglandigi anlamina gelebilir.A, B ve C bilesikleri her C-halkasinda iki adet sp2 merkezine sahiptir ve bu da, her C-halkasinda bir adet sp2 merkezine sahip olan bilesiklere kiyasla, küçük DNA olugunda daha kuvvetlibaglanmalarina olanak taniyabilir.WO 201 1/ 130598 sayili patentte, bilesik 80 açiklanmaktadir: I) I/\O/\:: \/\. :NNm/r ›i* ::W(ß \ A/YxÄýxllBilesik D ve bilesik 80 arasindaki fark, bilesik D°nin hücre baglama ajaniiia baglanti için bir iyodoasetamit grubundan olusmasidir. Bilesik 80"le kiyaslandiginda, bu grup, `Özellikle bir hücre baglama ajanina baglandigi zamanki stabilitesi açisindan avantaj saglayabilir (asagiya bakiniz). Bilesik 80 içerisindeki malemit grubu bir retro-Michael reaksiyonuna maruz kalarak hücre baglama a janiiidan konjüge edilinemis hale gelebilir ve dolayisiyla, albümin ve glutatiyon gibi tiyol içeren diger biyolojik moleküllerle temizlemeye karsi hassastir. Bu islem bilesik A ile yapildiginda baglama ajaiii bu sekilde konjüge edilmemis hale gelemez. Ayrica, iyodoasetamit grubu digeristenmeyen yan reaksiyonlari Önleyebilir.Bilesik E ve daha önce açiklanan, bir C2-3 endo-çift baga sahip bir ilaç baglayici içeren PBD diinerleri arasindaki fark, bilesik E"nin öniegin 4F-fenil, propilen gibi daha küçük, daha az lipofilik C2 sübstitüesine sahip olmasidir. Bu durumda, bilesik B7nin konjugatlarinin (asagiya bakiniz) sentezlendikten sonra t0paklanma olasiligi daha azdir. Konjugatlarin bu sekilde t0paklan1p t0paklanmad1gi, Boyut Dislaiiia Kromatografisi (SEC) ile ölçülebilir.Hem bilesik D hem de bilesik E, her C-halkasmda iki adet sp2 merkezine sahiptir ve bu da, her C-halkasinda yalnizca bir adetsp2 merkezi olanlarla kiyaslandiginda, küçük DNA olugunda dahakuvvetli baglanmalarina izin verebilir.Bulusun Detayli TaiiimiBu bulus, bir denekte bir tercih edilen yere bir PBD bilesigi saglamak 12için kullanilmaya uygundur. Konjugat, baglayiciniii herhangi bir kismini tutmayan bir aktif PBD bilesiginin salimina olanak saglar. PBD bilesiginin reaktivitesini etkileyebilecek herhangi bir kalinti yoktur. Sonuç olarak, Con jA, bilesik RelA saliniiiii yapacaktir:H 1 C'\/\/0 `l` ll / \ V/G/ o O:(:9/N / O 0 NI-1 ReIAConjB, bilesik RelB salinimi yapacaktir:*(4 O\/\/° ` H KI& 0/ "Kir" / \ i` \ i 0 0 | / /6 REP ConjC, bilesik RelC salininii yapacaktir:'li, , O\/\/0 ` H .i ,/ \ <. \ o 0 u/ <_ 0 0 0 Nil{ mali',Con jD, bilesik RelD salinimi yapacaktir:N N HI C\/\/O 1+1 AÄ/N 0/ \0 N ) / \ , \/\/\ o oRÜIDve ConjE, bilesik RelE salinimi yapacaktir:/N o 0 N HE( \/\/\/ »H /F / \ l A/N 0 0 N\/\ () Ü Re E13Bu bulusta PBD dimeri ile antikor arasinda tanimlanan bag tercihen ektraselüler olarak stabildir. Bir hücreye tasinmadan ya da uygulanmadan önce, antikor-ilaç konjugati (ADC) tercihen stabildir ve intakt halde kalir; yani, antikor, ilaç moiyetesine bagli kalir. Baglayicilar, hedef hücrenin disinda stabildir ve hücrenin içinde biraz etkili oranda klevaja ugrayabilir. Bir etkili baglayici: (i) aiitikorun spesifik baglanma özelliklerini sürdürecektir; (ii) konjugatin ya ilaç moiyetesinin intraselüler uygulamasina olanak saglayacaktir; (iii) kon jugat hedeflenen yerine uygulanana ya da tasinana kadar stabil ve intakt halde kalacak, yani klevaja ugramayacaktir ve (iv) PBD ilaç moiyetesinin bir sitotoksik, hücre-öldürücü etkisini ya da bir sitostatik etkisini koruyacaktir. ADC stabilitesi, kütle spektroskopisi, HPLC ve ayirma/analiz teknigi LC/MS gibi standart analitik tekniklerle ölçülebilir.RelA, RelB, RelC, RelD veya RelE formülleri ile temsil edilen bilesiklerin uygulamasi, baglama grubunda ve özellikle de valine- alanin dipeptid moiyetesinde katepsin gibi bir enzimin etkinligi yoluyla ConjA, ConjB, ConjC, ConjD veya ConjE formülleri iletemsil edilen kon jugatlarin istenen aktivasyon yerinde saglanir.AntikorBu bulusun bir yapisinda, antikor, CD25'e baglanan bir antikor olup, antikor asagidakileri içerir: SEKANS KOD NO.3'e ait ainino asit sekansina sahip olan bir VH CDR1°I içeren bir VH domeni, SEKANS KOD NO.4"e ait amino asit sekansina sahip olan bir VH CDR2 ve SEKANS KOD NO.5'e ait amino asit sekansina sahip olan bir VH CDR3. Bazi uygulamalarda antikor, SEKANS KOD NO.l"egöre sekans sahip olan bir VH domenini içerir.14Bu antikor ayrica asagidakileri içerir: SEKANS KOD NO.6°ya ait amino asit sekansina sahip olan bir VL CDRl"e, SEKANS KOD NO.7°ye ait amino asit sekansina sahip olan bir VL CDR2°ye ve SEKANS KOD NO.8"e ait amino asit sekansina sahip olan bir VL CDR3"e sahip bir VL domaininden de olusabilir. Bu bulusun bazi yapilarinda, bu antikor, SEKANS KOD NO. 2"ye uygun bir sekansa sahip olan bir VL domaininden de olusur.Bu bulusun bazi yapilarinda, bu antikor, bir VH domainini ve bir VL domainini içerir ve bu VH ve VL domainleri, SEKANS KOD NO. 2 ile eslestirilmis SEKANS KOD NO. 1 "e uygun sekanslara sahiptirler.VH ve VL domain(1er)i, CD25"e baglanan bir antikor antijenbaglanma yeri olusturacak sekilde eslestirilebilirler.Bu bulusun baska yapilarinda, bu antikor, bir VH domainini ve bir VL domainini içeren bir intakt antikordur ve bu VH ve VL domainleri,SEKANS KOD NO. 1 ve SEKANS KOD NO. 2"nin sekanslarinasahiptirler.Bazi uygulainalarda antikor, tercihen IgGl,K olmak 'uzere tam birinsan monoklonal IgGl antikorudur.Bazi uygulamalarda antikor WO 2004/045512 (Genmab A/S)°de tarif edilen AB12 antikorudur.Bu bulusun bir özelliginde, bu antikor, bu patent basvurusunda tanimlanan bir antikordur ve asagida açiklandigi gibi modifiyeedilmistir (ya da daha fazla modifiye edilecektir). Bu bulusun bazi15yapilarinda, bu antikor, bu patent basvurusunda açiklanan bir antikorun hümanize, deimmünize veya yeniden yüzey kaplamasiyapilmis bir versiyonudur.Terminolo jiBurada kullanilan "antikor" terimi, en genis anlamiyla kullanilir ve örnegin CD25°e baglanma becerisi gibi, istenen biyolojik etkinligi gösterdikleri sürece spesifik olarak monoklonal antikorlar, poliklonal antikorlar, dimerler, multimerler, multispesifik antikorlar (örnegin, bispesifik antikorlar), intakt antikorlar (ayni zamanda "tam uzunluklu" antikorlar olarak tarif edilir) ve antikor fragmanlarini kapsar (Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170:4854-4861). Antikorlar, murin antikorlari, insan antikorlari, hümanize antikorlar, kimerik antikorlar ya da baska türlerden türetilen antikorlar olabilir. Bir antikor, immün sistem tarafindan olusturulan ve bir spesifik antijeni taniyabilen ve ona baglanabilen bir proteindir (J aneway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Iinmuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, New York). Bir hedef antijen genellikle çoklu antikorlar üzerinde CDR"ler tarafindan taninan ve epitoplar da denilen birçok baglanma yeri içerir. Farkli bir epitopa spesifik baglanan her bir antikor farkli bir yapiya sahiptir. Bundan dolayi, bir anti jen, birden fazla tekabül eden antikor içerebilir. Bir antikor, bir tam-boy immünoglobulin molekülünü ya da bir tam-boy immünoglobulin molekülünün immünolojik açidan aktif kismini, yani ilgili bir hedefin bir anti jenini immünospesifik olarak baglayan bir anti jen baglanma yeri içeren bir molekülü ya da onun parçasini kapsar; atif yapilan hedefler arasinda,bunlarla sinirli kalmaksizin, kanser hücresi ya da bir otoimmün16hastalikla iliskili otoimmün antikorlar üreten hücreler vardir. Immünoglobulin, herhangi bir immünoglobulin molekülü tipinde (örnegin IgG, IgE, IgM, IgD ve IgA), sinifinda (örnegin IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl ve IgAZ) veya alt-sinifinda ya da allotipinde (örn. insan Glml, G1m2, G1m3, non-Glml [yani, Glml olmayan her türlü allotip], Glml7, G2m23, G3n121, G3m28, G3m11, G3mS, G3m13, G3ml4, G3m10, G3m15, G3m16, G31n6, G3n124, G3m26, G3m27, A2m1, A2n12, Kml, Km2 ve Km3) olabilir. Immünoglobulinler, insan, murin ya da tavsan kaynagi da dahil herhangi bit türeden türetilebilir.Bu patent basvurusunda kullanildigi üzere, CD25 baglar" ifadesi, Bovin Serum Albümini (BSA, Genbank erisim no. CAA76847, versiyon no. CAA76847.] (313336842, kayit güncelleme tarihi: 7 Ocak 2011 02:30 PM) gibi spesifik olmayan bir partnerden daha yüksek afiniteyle CD25 baglayan antikor anlaminda kullanilir. Bu bulusun bazi yapilarinda, bu antikor, fizyolojik kosullar altinda ölçüldügünde, antikorun BSA için ölçülen baglanma sabitinden en az 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000, 104, 105 veya 106 kat daha yüksek bir baglanma sabitiyle (Ka) cms baglar.Bu bulus konusu antikorlar, yüksek afiniteyle CD25 baglayabilirler. Örnegin, bu bulusun bazi yapilarinda, antikor, örnegin 1 X 106, 107, 108, 109,10", 10'", 10'", 10']3 veya 10'14 gibi yaklasik 10'6 M,ye esit veya ondan daha düsük bir KD ile CD25 baglayabilir.Bazi uygulamalarda, CD25 polipeptiti, Genbank erisim no. NP 000408, versiyon no. NP 000408.1 GI:4557667, kayit güncelleme tarihi: 9 Eylül 2012, sabah 04:59"a tekabül etmektedir. Bu bulusun bir17yapisinda, C D25 polipeptiti kodlayan nükleik asit, Genbank erisim no. NM 000417, versiyon no. NM 0004172 GI:269973860, kayit güncelleme tarihi: 9 Eylül 2012, sabah 04:59"a tekabül etmektedir. Bazi uygulamalarda CD25 polipeptidi Uniprot/Swiss-Prot erisim No. P01589°a karsilik gelir."Antikor fragmanlari", bir tam-boy aiitikorun bir kismini, genellikle antijen baglanma ya da degisken bölgesini kapsar. Antikor fragmanlarina örnek olarak Fab, Fab', F(ab')2 ve scFV fragmanlari; diabodies; lineer antikorlar; bir Fab ekspresyon kütüphanesi tarafindan üretilen fragmanlar; anti-idiyotipik (anti-Id) antikorlar; CDR (tamamlayicilik belirleme bölgesi) ve kanser hücresi anti jenleri, Viral aiitijenler ya da mikrobiyal antijenlere immünospesifik olarak baglanan yukaridakilerin herhangi birisinin epitop-baglayici fragmanlari; tek-Zincirli antikor molekülleri ve ayrica, antikorfragmanlarindan olusturulan multispesifik antikorlar gösterilebilir.Bu dokümanda kullanilan "monokloiial antikor" terimi, büyük ölçüde homojen antikorlardan olusan, yani popülasyonu olusturan münferit antikorlarin çok küçük miktarlarda buluiiabilecek olasi dogada mevcut mutasyoiilar hariç özdes oldugu bir popülasyondan elde edilen bir aiitikora atif yapar. Monoklonal antikorlar yüksek düzeyde spesifiktir ve tek bir anti jeiiik yere yönlendirilirler. Ek olarak, normalde farkli determinantlara (epitoplar) karsi yönlendirilen farkli antikorlari kapsayaii poliklonal antikor preparatlarinin aksine, her bir monokloiial antikor, antijen üzerindeki tek bir determinaiita karsi yönlendirilir. Monoklonal antikorlar, spesifisiteleriniii yani sira, diger antikorlartarafindan kontamiii edilmeden sentezlenebilmeleri açisindan da18avantajlidirlar. Niteleyici "monoklonal" sözcügü, antikorun büyük ölçüde homojen bir antikor popülasyonundan elde edilmis oldugunu gösteren bir terimdir ve antikor üretiininin belirli bir yöntemle gerçeklestirilmesini zorunlu kilacak sekilde anlasilmamali ve yorumlanmamalidir. Örnegin, bu bulusa göre kullanilacak inonokloiial antikorlar, ilk olarak "Kohler et al., Nature 256r495 (1975)" referansinda tanimlanan hibridom yöntemiyle hazirlanabilecegi gibi, rekombinan DNA yöntemleriyle de (bakiniz örnegin, ABD Patent No.: 4816567) hazirlanabilir. "Monoklonal antikorlar", örnegin "Clackson et al (1991) Nature, 352:624-628" ve "Marks et al (1991) J. Mol. Biol., 222:581-597" referanslarinda açiklanan teknikler kullanilarak faj antikor kütüphanelerinden ya da bir tamamen insan immünoglobulin sistemi tasiyan transgenik farelerden de (Lonberg(2008) Curr. Opinion 20(4):450-459) izole edilebilirler.Burada moiioklonal antikorlar spesifik olarak agir ve/Veya hafif zincirin bir kismi belirli bir türden türetilmis olan ya da belirli bir antikor sinifi ya da alt-sinifina ait olan antikorlarda kendilerine tekabül eden sekanslara özdes ya da homolog olan, zincir(1er)in geri kalan kismi ise baska bir türden türetilmis olan ya da baska bir antikor sinifi ya da alt-sinifina ait olan antikorlarda kendilerine tekabül eden sekaiislara özdes ya da homolog olan "kimerik" antikorlari ve ayni zamanda, istenen biyolojik aktiviteyi gösterdikleri sürece bu antikorlarin fragmanlarini kapsar (US 4816567 ve Morrison et al (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855). Kimerik antikorlar arasinda, insan sabit bölge sekanslarindan ve yani sira, insan-disi bir priinattan (örnegin, Eski Dünya Maymunu, Kuyruksuz Maymun)türetilen degisken domain antijen-baglanma sekaiislarindan olusan19"primatize" antikorlar da bulunur.Bu dokümanda kullanilan bir "intakt antikor" terimi, VL ve VH domainlerinin yani sira, bir hafif zincir sabit domaini (CL) ve agir zincir sabit domainleri CHl, CH2 ve CH3°ten olusan bir antikordur. Sabit domainler, nativ sekans sabit domainleri (ömegin, insan natiV sekans sabit domainleri) ya da onlarin amino asit sekansi varyantlari olabilirler. Intakt antikorda, bir antikorun FC bölgesine (bir natiV sekans FC bölgesi ya da amino asit sekans varyanti Fc bölgesi) atfedilebilecek biyolojik aktivitelere atif yapan bir ya da daha fazla sayida "efektör fonksiyon" bulunabilir. Antikor efekt'or fonksiyonlarina 'Örnek olarak asagida sayilanlar gösterilebilir: Clq baglama; tamamlayici bagimli sitotoksisite; Fc reseptörü baglanmasi; antikor-bagimli hücre-aracili sitotoksisite (ADCC); fagositoz; B hücresi reseptörü ve BCR gibi hücre yüzeyi reseptörlerinin asagiregülasyonu.Agir zincirlerinin sabit domaininin amino asit sekansina bagli olarak, intakt antikorlar, farkli "siniflara" atanabilir. Bes ana intakt antikor sinifi vardir: IgA, IgD, IgE, IgG ve IgM ve bunlarin birkaçi, örnegin IgGl , lgG2, IgG3, IgG4, IgA ve lgAZ gibi "alt-siniflara" da (izotipler) bölünebilir. Antikorlarin farkli siniflarina tekabül eden agir-zincir sabit domainleri, sirasiyla a, 5, 8, y ve H olarak adlandirilir. Immünoglobulinlerin farkli siniflarinin alt-birim yapilari ve üç-boyutlu konfigürasyonlari iyi bilinmektedir.Antikorlarin modifikasyonu20Bu patent basvurusunda açiklanan antikorlar modifiye edilebilir. Örnegin, bir insan denek için daha az immünojenik olinalarini saglamak amaciyla. Bu, sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerin asina olduklari birtakim tekniklerden herhangi biri kullanilarakgerçeklestirilebilir.HümanizasyonBir insan-disi antikorun ya da antikor fragmaninin in- Vivo immünojenisitesini azaltma teknikleri, "hümanizasyon" olarak adlandirilan teknikleri kapsar.Bir "hümanize antikor", bir insan antikorunun bir modifiye degisken bölgesinin en azindan bir kismini içeren bir polipeptide atif yapar; burada, degisken bölgenin bir kismi, tercihen intakt insan degisken domaininden önemli ölçüde daha küçük bir kismi, bir insan-disi türden türetilen tekabül eden sekansla sübstitüe edilmistir ve burada, modifiye degisken bölge, baska bir proteinin en azindan baska bir kismina, tercihen bir insan antikorunun sabit bölgesine baglanir. "Hümanize antikorlar" ifadesi, bir veya daha fazla tamamlayicilik belirleme bölgesi ("CDR") ainino asit artiginin ve/Veya bir veya daha fazla çerçeve bölgesi ("FW" ya da "FR") ainino asit artiginin kemirgen antikorlarinin ya da baska insan-disi antikorlarin analog yerlerinden amino asit artiklariyla sübstitüe edildigi insan antikorlarini kapsar. "Hümanize antikor" ifadesi, hemen hemen bir insan immünoglobulinin amino asit sekansina sahip bir FR ve hemen hemen bir insan-disi immünoglobulinin amino asit sekansina sahip bir CDR içeren bir immünoglobulin amino asit sekansi varyantini ya da onunfragmanini da kapsar.21Insan-disi aiitikorlarin (örnegin, murin antikorlari) "hümanize" formlari, insan-disi immünoglobulinden türetilmis minimum sekans içeren kiinerik antikorlardir. Baska bir açidan bakildiginda, bir hümanize antikor, insan sekanslari yerine insan-disi antikorlardan (Ömegin, murin antikorlari) seçilen sekanslari da içeren bir insan antikorudur. Bir hümanize antikor, baglanma ve/veya biyolojik aktivitesini anlamli ve 'Önemli düzeyde degistirineyen konservatif amino asit sübstit'ûsyonlari ya da ayni ya da farkli türlerden dogal- olinayaii artiklari içerebilir. Bu antikorlar, insan-disi immünoglobulinlerden türetilen minimum sekans içeren kimerikantikorlardir.'CDR greftleme', 'güdümlü seçim', 'deimmünizasyon', 'yeniden yüzey kaplama' ('kaplama' olarak da bilinir), 'koinpozit antikorlar', 'Insan Dizi Içerigi Optimizasyonu' ve çerçeve kayinasi da dahil bir dizihümanizasyon teknigi vardir.CDR greftlemeBu teknikte, hümanize antikorlar, insan immünoglobulinleridir (alici antikor), bu immünoglobulinlerde, alici antikorun tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDR) artiklari, istenen özelliklere sahip fare, siçan, deve, bovin, keçi ya da tavsan gibi bir insan-disi türün bir CDR°sinden elde edilen artiklarla (donör antikoru) ikaine edilirler (aslinda, insan- disi CDR°ler, insan çerçevesine 'greftlenir'). Bazi durumlarda, insan imniünoglobulinin çerçeve bölgesi (FR) artiklari, tekabül eden insan- disi artiklarla ikame edilir (bu, örnegin belirli bir FR artigi, anti jenbaglanmasi üzerinde anlainli etkiye sahip oldugunda meydana22gelebilir).Ek olarak, hümanize antikorlar, ne alici antikorunda ne de alinan CDR ya da çerçeve sekanslarinda bulunan artiklari içerebilirler. Bu modifikasyonlar, antikor performansini daha da iyilestirinek ve maksimize etmek için yapilirlar. Bundan dolayi, genelde, bir hümanize antikor, hiperdegisken luplarin hepsinin ya da hemen hemen hepsinin bir insan-disi immünoglobulininkine tekabül ettigi ve FR bölgelerinin hepsinin ya da hemen hemen hepsinin bir insan immünoglobulin sekansinin bölgeleri oldugu en az bir ve bu bulusun bir özelliginde iki degisken domainin hepsini kapsar. Hümanize antikor, istege bagli olarak, bir immünoglobulinin, normalde bir insan immünoglobulininin sabit bölgesinin (FC) en azindan bir kismini daiçerir.Güdümlü seçimBu yöntem, belirli bir epitop için spesifik belirli bir insan-disi antikorun VH ya da VL domainini bir insan VH ya da VL kütüphanesiyle birlestirme basamagindan olusur ve spesifik insan V domainleri, ilgili antijene karsi seçilir. Bu seçilen insan VH"si, daha sonra, bir VL kütüphanesiyle kombine edilerek bir tamamen insan VHXVL kombinasyonu olusturulur. Bu yöntem, "Nature Biotechnology (NY.) 12, (1994) 899-903" referansinda tarifedilmektedir.Kompozit antikorlarBu yöntemde, bir insan antikorundan amino asit sekansinin iki veya23daha fazla segmenti, nihai antikor molekülü içinde kombine edilir. Bunlar, nihai kompozit antikor V bölgelerinde insan T hücresi epitoplarini sinirlandiran ya da engelleyen kombinasyonlar halinde, çoklu insan VH ve VL sekansi segmentlerinin kombine edilmesi suretiyle olusturulurlar. Gerekirse, T hücresi epitoplari, bir T hücresi epitopuna katkida bulunan ya da onu kodlayan V bölgesi segmentleri T hücresi epitoplarini engelleyen alternatif segmentlerle degistirilerek sinirlandirilir ya da engelleiiir. Bu yöntem, "US 2008/0206239 A1"referansinda tarif edilmektedir.DeimmünizasyonBu yöntem, terapötik antikorun (ya da baska molekülün) V bölgelerinden insan (ya da baska ikinci tür) T-hûcresi epitoplarinin çikartilmasini kapsar. Terapötik antikorlar V-bölgesi sekaiisi, örnegin MHC-baglama motifleri veritabanlariyla (ömegin, wwwehieduau sitesinde sunulan "motif" veritabani) kiyaslanarak MHC sinif 11- baglanma motiflerinin varligi açisindan analiz edilir. Alternatif olarak, MHC sinif 11- baglama motifleri, Altuvia ve arkadaslari (J. Mol. Biol. 249 244-250 (1995)) tarafindan icat edilmis olanlar gibi bilgisayarli niotif tanima yöntemleri kullaiiilarak tanimlanabilirler; bu yöntemlerde, V-bölge sekanslarindan elde edilen ardisik üst üste binen peptidler, MHC sinif 11 proteinlere baglanma enerjileri açisindan tets edilirler. Bu veriler, daha sonra, amfipatisite, Rothbard motifleri ve katepsin B ve baska proses enzimleri için klevaj yerleri gibi, basarili sunulan peptidlerle iliskili baska sekans özelliklerine iliskin bilgilerlekombine edilebilir.24Potansiyel ikinci tür (örnegin insan) T-hücresi epitoplari tanimlandiktan sonra, bunlar, bir veya daha fazla amino asidin alterasyonuyla elimine edilirler. Modifiye edilmis amino asitler, genellikle T-hücresi epitopu içinde bulunurlar, fakat proteinin primer ya da sekonder yapisina göre epitopa bitisik de olabilirler (ve dolayisiyla, primer yapida bitisik olmayabilirler). En tipik olarak, alterasyon, sübstitüsyon yoluyla yapilir; fakat bazi durumlarda, aininoasit ekleme ya da silme daha uygun olacaktir.Alterasyonlarin hepsi, rekombinan DNA teknolojisiyle yapilabilir; böylece, Yere Yönlendirilmis Mutagenez gibi iyi bilinen ve tanimlanmis yöntemler kullanilarak bir rekombinan konakçidan ekspresyon yoluyla nihai molekül hazirlanabilir. Bununla birlikte, protein kimyasi ya da baska herhangi bir moleküler alterasyon yolukullanilmasi da mümkündür.Yeniden yüzey kaplama Bu yöntem asagida açiklanan basamaklari kapsar: (a) insan-disi antikor degisken bölgesinin üç-boyutlu modelini insa ederek insan-disi (örnegin kemirgen) antikorun (ya da oiiun fragmaninin) degisken bölgesinin konformasyonel yapisinibelirleme;(b) yeterli sayida insan-disi antikor ve insan antikoru degisken bölge agir ve hafif Zincirlerinin X-isini kristallografikyapilarindan elde edilen bagi] erisilebilirlik dagilimlarini25kullanarak sekans hizalari olusturmak suretiyle agir ve hafif zincir çerçeve pozisyonlari seti elde etme; burada, hizalama pozisyonlari, yeterli sayida insan-disi antikor agir ve hafifzincirlerinin %98sinde özdestir;(c) hümanize edilecek insan-disi antikor için, basamak (b)°de olusturulan çerçeve pozisyonlari setini kullanarak agir ve hafif zincir yüzey-açik ainino asit artiklari setini taniinlaina;((1) insan antikor aniino asit sekanslarindan, basamak (c)°de tanimlanan yüzey-açik amino asit artiklari setine en yakin düzeyde özdes bir agir ve hafif zincir yüzey-açik amino asit artiklari setini tanimlama; burada, insan antikorundan eldeedilen agir ve hafif zincir dogal olarak eslidir ya da esli degildir;(e) hümanize edilecek insan-disi antikorun amiiio asit sekansinda, basamak (c)"de tanimlanan agir ve hafif zincir yüzey-açik amino asit artiklari setini basamak (d)"de tanimlanan agir ve hafif zincir yüzey-açik amino asit artiklari setiyleSübstitüe etme;(f) basamak (e)°de belirtilen sübstitüsyondan kaynaklanan insan-disi antikor degisken bölgesinin üç boyutlu modelini insaetme;(g) basamak (a) ve basamak (f)"de insa edilen üç boyutlu modelleri karsilastirarak, basamak (0) ya da basamak (d)'de tanimlanan setlerden, hümanize edilecek insan-disi antikoruntainainlayicilik belirleme bölgelerinin herhangi bir artiginin 526Angstrom atoiiiu dahilinde olan amino asit artiklarini tanimlamave(h) basamak (g)'de tanimlanan herhangi bir artik insan kaynakli iken, onu orijinal insan-disi amino asit artigi olarak degistirme ve bu yolla yüzey-açik amino asit artiklari setini hümanize eden bir insan-disi antikor tanimlama; bu konuda tek kosul, basamak (a)°nin ilk önce gerçeklestirilmesi gerekmemesi, fakat basamak(g)°den `once gerçeklestirilmesinin gerekinesidir.Süperh'ûmanizasyonBu yöntem, insan-disi sekansi, fonksiyonel insan germline gen repertuariyla karsilastirir. Insan-disi sekanslara özdes ya da onlarla yakindaii iliskili kaiioiiik yapilari kodlayan insan genleri seçilir. CDR"ler içinde en yüksek homolojiye sahip seçili insan genleri, FR donörleri olarak seçilir. Son olarak, insan-disi CDR'ler, bu insan FR'lerine greftlenir. Bu yöntem, WO 2005/079479 A2 nuiriaralipateiitte tarif edilmektedir.Insan Dizi Içerigi Optimizasyonu Bu yöntem, insan-disi (örnegin fare) sekansi insan germline gen repertuariyla karsilastirir ve farklar, bir sekaiisi potansiyel MHC/T- hücresi epitoplari seviyesinde tayin eden Insan Dizi Içerigi (HSC) olarak skorlanir. Hedef sekans, çok çesitli hümanize varyantlar olusturmak amaciyla, bir global taiiima ölçütü kullanmak yerineHSC,si maksimize edilerek hümanize edilir (Molecular lmiiiunology,2744, (2007) 1986-1998 referansinda açiklanmaktadir).Çerçeve KaymasiInsan-disi antikorun CDR°leri, bilinen agir ve hafif zincir insan germline gen çerçevelerinin hepsini kapsayan cDNA havuzlarina çerçeve-içi füzyonlanir. Hümanize antikorlar, daha sonra, örnegin fajla gösterilmis antikor kütüphanesini panning islemi yoluyla seçilir. Bu yöntem, "Methods 36, 43-60 (2005)" referansinda açiklanmaktadir.Kon jugatlarMevcut bulus, bir Baglayici Birim araciligiyla antikora baglanmis birPBD bilesiginden olusan bir kon jugat saglar.Bu bulus, bir denekte bir tercih edilen yere bir PBD bilesigi saglainak için kullanilmaya uygundur. Bu bulusun tercih edilen yapilarinda, konjugat, baglayicinin herhangi bir kismini tutmayan bir aktif PBD bilesiginin salimina olanak saglar. PBD bilesiginin reaktivitesinietkileyebilecek herhangi bir kalinti yoktur.ADC"nin baglayicilarinin ADC moleküllerinin topaklanmasini önlemesi ve ADC"nin aköz vasatta kolaylikla çözünebilir vemonomerik durumda kalmasini saglamasi tercih edilir.ADC"nin baglayicilarinin ekstraselüler olarak stabil olmasi tercih edilir. Bir hücreye tasinmadan ya da uygulanmadan önce, antikor-ilaçkonjugati (ADC) tercihen stabildir ve intakt halde kalir; yani, antikor,28ilaç moiyetesine bagli kalir. Baglayicilar, hedef hücrenin disinda stabildir ve hücrenin içinde biraz etkili oranda klevaja ugrayabilir. Bir etkili baglayici: (i) antikorun spesifik baglanma özelliklerini sürdürecektir; (ii) konjugatin ya ilaç moiyetesinin intraselüler uygulamasina olanak saglayacaktir; (iii) konjugat hedeflenen yerine uygulanana ya da tasinana kadar stabil ve intakt halde kalacak, yani klevaja ugramayacaktir ve (iv) PBD ilaç moiyetesinin bir sitotoksik, hücre-öldürücü etkisini ya da bir sitostatik etkisini koruyacaktir. ADC stabilitesi, kütle spektroskopisi, HPLC ve ayirma/analiz teknigi LC/MS gibi standart analitik tekniklerle ölçülebilir.YapilarMevcut bulusun yapilari ConjA içerir; burada, antikor asagidaaçiklandigi gibidir.Mevcut bulusun yapilari ConjB içerir; burada, antikor asagidaaçiklandigi gibidir.Mevcut bulusun yapilari ConjC içerir; burada, antikor asagidaaçiklandigi gibidir.Mevcut bulusun yapilari ConjD içerir; burada, antikor asagidaaçiklandigi gibidir.Mevcut bulusun yapilari ConjE içerir; burada, antikor asagidaaçiklandigi gibidir.29Ilaç yüklemesiIlaç yüklemesi, beher antikor, örnegin antikor için ortalama PBD ilaci sayidir. Bu bulusa konu olan bilesikler sistemlere baglandiginda, ilaç yüklemesi, beher antikor için 1 ile 8 ilaç (DL) araliginda olabilir; yani burada, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ve 8 ilaç moiyetesi, antikora kovalent baglanir. Konjugat bilesimleri, 1 ile 8 araliginda ilaçla konjugeedilmis antikor koleksiyonlarini kapsar.Kon jugasyon reaksiyonlarindan elde edilen ADC preparatlarinda beher antikor için ortalama ilaç sayisi, UV, ters faz HPLC, HIC, kütle spektroskopisi, ELISA eseyi ve elektroforez gibi geleneksel yollarla karakterize edilebilir. p açisindan ADC'niii kaiititatif dagilimi da tayin edilebilir. ELISA yöntemiyle, belirli bir ADC preparatinda ortalama p degeri tayin edilebilir (Hamblett et al (2004) Clin. Cancer Res. 1027063-7070; Sanderson et al (2005) Clin. Cancer Res. 11:843-852). Bununla birlikte, p (ilaç) degerleri dagilimi, ELISA yönteminin antikor-antijen baglama ve belirleme siniriyla belirlenemez. Ayrica, antikor-ilaç konjugatlarini belirlemek için ELISA eseyi, 'Örnegin agir zincir ya da hafif zincir fragmanlari ya da belirli amino asit artiklari gibi ilaç moiyetelerinin antikora baglanma yerlerini de belirlemez. Bazi durumlarda, baska ilaç yüklemeleri yapilan ADC9den p degerinin belirli bir deger oldugu homojen ADC9yi ayirma, saflastirma ve karakterizasyon islemleri ters faz HPLC ya da elektroforez gibi yollarla gerçeklestirilebilir. Bu teknikler baska kon jugat tipleri için deuygulanabilir.30Bazi antikor-ilaç konjugatlari için, p degeri, antikor üzerindeki eklenme yerlerinin sayisiyla sinirlandirilabilir. Örnegin, bir antikor yalnizca bir ya da birkaç sistein tiyol grubu içerebilir ya da bir baglayicinin ekleninesi için kullanilabilecek yeterince reaktif tiyol gruplarindan yaiilica bir ya da birkaç tane içerebilir. Daha yüksek ilaç yüklemesi, örnegin p 5, belirli antikor-ilaç konjugatlarinin selüler geçirgenliklerinin kaybolmasina, agregasyonuiia, çözünmeinesiiie ya da toksisitesiiie neden olabilir.Normalde, teorik maksimum degerden daha az sayida ilaç moiyetesi, bir kon jugasyon reaksiyonu esnasinda bir antikora kon juge edilir. Bir antikor, örnegin ilaç-baglayici ara ürünü.er (D-L) ya da baglayici reaktifiyle reaksiyona girmeyen birçok lizin artigi içerebilir. Yalnizca en reaktif lizin gruplari, bir amin-reaktif baglayici reaktifiyle reaksiyona girebilir. Ayrica, yalnizca en reaktif sistein tiyol gruplari, bir tiyol-reaktif baglayici reaktifiyle reaksiyona girebilir. Genellikle, aiitikorlarda, eger varsa, bir ilaç moiyetesine baglanabilecek serbest ve reaktif sistein tiyol gruplari çok sayida bulunmaz. Bilesiklerin antikorlarinda sistein tiyol artiklarinin çogu, disülfür köprüleri olarak bulunurlar ve kismen ya da tamamen iiidirgeyici kosullar altinda, ditiyotreitol (DTT) ya da TCEP gibi bir indirgeyici ajanla indirgenmelidirler. Bir ADC"nin yükü (ilaç/antikor orani) asagida açiklananlar da dahil birkaç farkli yolla kontrol edilebilir: (i) antikora göre ilaç-baglayici ara ürününün (D-L) ya da baglayici reaktifinin molar fazlaligini sinirlandirma, (ii) konjugasyon reaksiyon süresini ya da sicakligini sinirlandirma ve (iii) sistein tiyol modifikasyonu içinkisnii ya da sinirlandirilmis indirgeyici kosullar.31Belirli antikorlar, indirgenebilir zincirler-arasi disülfürlere, yani sistein köprülerine sahiptir. Antikorlar, DTT (ditiyotreitol) gibi bir indirgeyici ajanla isleme tâbi tutularak, baglayici reaktifleriyle konjugasyon için daha reaktif hâle getirilebilir. Böylece, her sistein köprüsü, teorik olarak, iki reaktif tiyol nükleofili olusturacaktir. Ilave nükleofilik gruplar, bir aminin bir tiyole dönüsmesine yol açan lizinlerin 2-iminotiy01anla (Traut reaktifi) reaksiyonu yoluyla antikorlara sokulabilir. Reaktif tiyol gruplari, bir, iki, üç, dört ya da daha fazla sistein artiginin genetiginin degistirilinesi (örnegin, bir ya da daha fazla natiV olmayan sistein amino asit artigi içeren mutant antikorlarin hazirlanmasi) suretiyle antikora (ya da onun fragmanina) sokulabilir. US 7521541 numarali dokümanda, reaktif sistein amino asitlerin sokulmasi suretiyle antikorlarin genetiginin degistirilmesiprosesi açiklanmaktadir.Sistein amino asitleri, bir antikorda reaktif yerlerde degistirilebilirler ve zincir-içi ya da molekül-arasi disülfür baglari olustunnazlar (Junutula, et al., 2008b Nature Biotech., 26(8):925-932; Dornan et al (2009) Blood 114(l3):2721-2729; US 7521541; US 7723485; W02009/052249). Degistirilen sistein tiyoller, örnegin maleiinid ya da alfa-halo amidler gibi tiyol-reaktif elektrofilik gruplar içeren bu bulusun konusu baglayici reaktifleriyle ya da ilaç-baglayici reaktifleriyle reaksiyona girerek sistein degistirilmis antikorlar ve PBD ilaç moiyeteleri bulunan ADC olusturabilirler. Sonuçta, ilaç moiyetesinin lokasyonu tasarlanabilir, kontrol edilebilir ve bilinebilir. Degistirilmis sistein tiyol gruplari normalde tiyol-reaktif baglayici reaktifleriyle ya da ilaç-baglayici reaktifleriyle yüksek verimde reaksiyona girdiginden dolayi, ilaç yükü kontrol edilebilir. Agir ya da32hafif zincirde tek bir yerde sübstitüsyon yoluyla bir sistein ainino asidi sokmak için bir IgG antikorunu degistirme islemi, simetrik antikorda iki yeni sisten verir. 2 civarinda bir ilaç yükü, konjugasyon ürünüADC°nin hemen hemen hoinojenligiyle saglanabilir.Alternatif olarak, Axup ve arkadaslarinin ((2012), Proc Natl Acad Sci USA. 109(40):16101-16116) açikladigi gibi, antikorlarin yer-spesifik konjügasyon, genetiginin agir ve/Veya hafif zincirlerinde dogal olinayan amino asitler içermelerini saglayacak sekilde degistirilmesi yoluyla elde edilebilir. Dogal olinayan amino asitler, ortogonal kimyanin baglayici reaktife ve ilaca baglanacak sekilde tasarlanmasi gibi ilave bir avantaj da saglar.Antikorun birden fazla nükleofilik ya da elektrofilik grubunun bir ilaç- baglayici ara ürünüyle ya da baglayici reaktifiyle ve ardindan ilaç moiyetesi reaktifiyle reaksiyona girdigi durumlarda, elde edilen ürün, bir antikora ekli ilaç inoiyetelerinin dagiliini 'Örnegin 1, 2, 3 ve benzeri olan bir ADC bilesikleri karisimidir. Polimerik ters faz (PLRP) ve hidrofobik etkilesim (HIC) gibi sivi kromatografisi yöntemleri, ilaç yükü degeri yoluyla karisimdaki bilesikleri ayirabilir. Tekli ilaç yükleme degerine (p) sahip ADC preparatlari izole edilebilir; bununla birlikte, bu tekli yükleme degerli ADC"ler hâlâ heterojen karisimlar olabilirler, çünkü antikor üzerinde farkli yerlerde baglayicilararaciligiyla ilaç moiyeteleri eklenebilir.Sonuç olarak, bu bulusa konu olan antikor-ilaç konjugati bilesimleri, antikor-ilaç konjugati bilesiklerinin karisimlarini kapsar; burada, antikor, bir veya daha fazla PBD ilaç inoiyetesi içerir ve ilaçmoiyeteleri, çesitli farkli ainino asit artiklarinda antikora eklenebilir.33Bu bulusun bir yapisinda, beher antikor dimer pirrolobenzodiazepin gruplarinin ortalama sayisi, 1 ilâ 8, 2 ilâ 8, 2 ilâ 6, 2 ilâ 4 ve 4 ilâ 8arasindan seçilir.Bu bulusun bazi yapilarinda, beher antikorda bir dimerpirrolobenzodiazepin grubu bulunur.Diger Forinlar IçerilirAksi belirtilmedikçe, yukarida sayilan sübstitüentlerin kapsamina, bu sübstit'üentlerin iyi bilinen iyonik formlari, tuz formlari, solvat formlari ve korunan formlari da dahil edilir. Örnegin, karboksilik aside (-COOH) yapilan bir atif, anyonik (karboksilat) formu (-COO-), bir tuzunu veya solvatini ve geleneksel korunan formlari kapsar. Benzer sekilde, bir amino grubuna yapilan atif, protonlanmis formu (- N+HR'R2), amino grubunun bir tuzu veya solvatini, 'Örnegin bir hidroklor'ur tuzunu ve bir amino grubunun geleneksel korunan formlarini kapsar. Benzer sekilde, bir hidroksil grubuna yapilan atif, anyonik formu (-0-), bir tuzunu veya solvatini ve geleneksel korunanformlarini da kapsar.TuzlarEtkin bilesigin tekabül eden bir tuzunu, `Örnegin farmas'otik açidan kabul edilebilir bir tuzunu hazirlamak, saflastirrnak ve/veya isleme tâbi tutmak uygun ya da istenen bir durum olabilir. Farmasötik açidan kabul edilebilir tuzlarin `ornekleri, "Berge, et al., J. Pharm. Sci., 66, l-19 (1977)" referansiiida açiklanmaktadir.34Örnegin, bilesik anyonikse ya da anyonik olabilecek bir fonksiyonel grup içeriyorsa (örnegin -COOH, -COO- olabilir), uygun bir katyonla bir tuz olusturulabilir. Uygun inorganik katyonlarin örnek olarak, bunlarla sinirli kalmaksizin, Na+ ve K+ gibi bir alkali metal iyonlari, Ca2+ ve Mg2+ gibi alkalin toprak katyonlari ve Al+3 gibi baska katyonlar gösterilebilir. Uygun organik katyonlara örnek olarak, bunlarla siiiirli kalmaksizin, amoiiyum iyonu (yani NH4+) ve sübstit'ue edilmis amonyuin iyonlari (örnegin NH3R+, NH2R2+, NHR3+, NR4+) gösterilebilir. Uygun bazi sübstit'üe edilmis amonyuin iyoiilarinin `Örnekleri arasinda asagida sayilanlardan türetilenler vardir: etilamin, dietilamin, disikloheksilamin, trietilamin, bütilamin, etilendiamin, etanolainin, dietanolamin, piperazin, benzilamin, fenilbenzilamin, kolin, meglumin ve trometamin ve yani sira, lizin ve arginin gibi ainino asitler. Yaygin kuaterner ainonyuin iyonuiia bir Örnek olarakN(CH3,)4+ gösterilebilir.Bilesik katyonikse ya da katyonik olabilecek bir fonksiyonel grup içeriyorsa (örnegin -NHZ, -NH3+ olabilir), uygun bir anyonla bir tuz olusturulabilir. Uygun inorganik anyonlara örnek olarak, bunlarla siiiirli kalmaksizin, asagida sayilan inorganik asitlerden türetilenler gösterilebilir: hidroklorik, hidrobromik, hidroiyodik, sülfürik,sülfuröz, iiitrik, nitröz, fosforik ve fosforöz.Uygun organik anyonlara örnek olarak, bunlarla sinirli kalmaksizin, asagida sayilan organik asitlerden türetilenler gösterilebilir: 2- asetioksibenzoik, asetik, askorbik, aspartik, benzoik, kamforsülfonik, sinnamik, sitrik, edetik, etandisülfonik, etansülfonik, fumarik,glukheptonik, glukonik, glutamik, glikolik, hidroksimaleik,35hidroksinaftalen karboksilik, izetiyonik, laktik, laktobionik, laurik, nialeik, malik, metansülfonik, musik, oleik, oksalik, palmitik, panioik, pantotenik, fenilasetik, fenilsülfonik, propionik, piruvik, salisilik, stearik, süksinik, sülfanilik, tartarik, tolüensülfonik, trifloroasetik asit ve valerik. Uygun poliinerik organik anyonlara örnek olarak, bunlarla sinirli kalmaksizin, asagida sayilan polimerik asitlerden türetilenler gösterilebilir: tannik asit, karboksimetil selüloz.SolvatlarEtkin bilesigin tekabül eden bir solvatmi hazirlamak, saflastirmak ve/Veya isleme tâbi tutmak uygun ya da istenen bir durum olabilir. "Solvat" terimi, bu dokümanda, çözünen madde (ömegin etkin bilesik, etkin bilesik tuzu) ve çözücüden olusan bir komplekse atif yapmak için geleneksel anlamiyla kullanilir. Çözücü su ise, solvatin bir hidrat, örnegin bir mono-hidrat, bir di-hidrat, bir tri-hidrat ve benzeri olarak anilmasi uygun olabilir.Bu bulus, bir çözücünün, PBD moiyetesinin imin bagindan eklendigi bilesikleri kapsar; bunlar asagidaki formüllerle gösterilmektedir; bu formüllerde, çözücü su ya da bir alkoldür (RAOH; burada, RA simgesi C 1-4 alkildir):I R, 1& OH R &JSOH R*OH Q" - `KA *- _- R° 5Bu formlar, PBD°nin karbinolamin ve karbinolainin eter formlariolarak anilabilir (yukarida R10°1a ilgili bölümde açiklandigi gibi). Bu36dengelerin balansi, bilesiklerin bulundugu durumlara ve moiyeteninniteligine baglidir.Bu belirli bilesikler, örnegin liyofilizasyon yoluyla kati forinda izoleedilebilirler.I zomerlerBu bulusa konu olan belirli bilesikler, bunlarla sinirli kalinaksizin, cis- Ve trans-formlar; E- ve Z-formlar; 0-, t- ve r- formlar; endo- ve ekso- formlar; R-, S- ve mezo-formlar; D- ve L-formlar; (1- ve I-formlar; (+) ve (-) formlar; ket0-, enol- ve enolat-formlar; syn- ve anti-formlar; senklinal- ve antiklinal-fornilar; (1- ve ß-formlar; aksiyal ve ekvatoral formlar; kayik-, koltuk-, büküm-, zarf- ve yari-koltuk-formlar ve bunlarin kombinasyonlari (bu dokümanda bundan böyle bir bütün olarak "izomerler" (ya da "izomerik formlar") olarak anilacaktir) dahil bir veya daha fazla belirli geometrik, Optik, enantiomerik, diasteriomerik, epimerik, atropik, stereoizomerik, tautomerik,konformasyonel ya da anoinerik formda mevcut olabilir."Kiral" terimi, aynadaki görüntüsüyle birebir örtüsmeyen moleküllere atif yapar; "akiral" terimi ise, aynadaki görüntüsüyle birebir 'Örtüsenmoleküllere atif yapar."Stereoizomerler" terimi, özdes kimyasal bilesime sahip olan, fakat atomlarin ya da gruplarin uzamsal dizilimi açisindan farklilik gösterenbilesiklere atif yapar.37"Diastereomer" terimi, iki veya daha fazla kiralite merkezi bulunan ve molekülleri birbirinin ayna görüntüsü olmayan bir stereoizomere atif yapar. Diastereomerlerin örnegin erime noktalari, kaynaina noktalari, spektral 'Özellikleri ve reaktiviteleri gibi fiziksel 'Özellikleri farklidir. Diastereoinerlerin karisimlari, elektroforez ve kromatografi gibi yüksek rezolüsyonlu analitik prosedürler kullanilarak ayrilabilir."Enantioinerler", bir bilesigin ayna görüntüleri üst üste binmeyen veçakismayan iki stereoizomere atif yapar.Bu dokümanda kullanilan stereokimyasal tanimlar ve teamüller genellikle "8. P. Parker, Ed., McGraW-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraW-Hill Book Company, New York" ve "Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organik Bilesiks", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994" referanslarina uygundurlar. Bu bulusa konu olan bilesikler asimetrik ya da kira] merkezler içerebilirler ve bundan dolayi, farkli stereoizomerik formlarda bulunurlar. Bunlarla sinirli kalmaksizin diastereomerler, enantiomerler ve atr0pizomerler de dahil bu bulusa konu olan bilesiklerin tüm stereoizomerik formlarinin ve yani sira, rasemik karisimlar gibi karisimlarinin bu bulusun bir parçasini olusturmasi amaçlanir. Birçok organik bilesik optik açidan aktif formlarda bulunur, yani düzlem-polarize isigin düzlemini döndürme kabiliyetine sahiptir. Optik açidan aktif bilesik açiklanirken, molekülün kiral merkez(ler)i etrafindaki mutlak konfigürasyonunu tanimlamak için D ve L ya da R ve S önekleri kullanilir. Bilesik tarafindan düzlem-polarize isigin rotasyon yönünü tanimlamak için (:1 ve 1 ya da (+) ve (-) önekleri kullanilir; (-) ya da 1 önekleri, bilesigin sola çeviren oldugu anlainina gelir. (+) ya da dönekli bir bilesik, saga çevirendir. Belirli bir kimyasal yapi için, bu38stereoizomerler birbirlerinin ayna görüntüleri olmalari hariç özdestir. Bir spesifik stereoizomer, bir enantiomer olarak da anilabilir ve bu izomelerin bir karisimi çogunlukla bir enantiomerik karisimi olarak adlandirilir. Enantiomerlerin 50:50 oraninda bir karisimi, bir rasemik karisim ya da bir rasemat olarak anilir ve bu karisim, bir kimyasal reaksiyonda ya da proseste herhangi bir stereoseleksiyon ya da stereospesifisitenin olmadigi durumlarda elde edilebilir. "Rasemik karisim" ve "rasemat", Optik aktivitesi olmayan ve iki enantoineriktürden olusan bir esmolar karisima atif yapar.Asagida tautomerik formlar için açiklananlar hariç, yapisal (ya da konstitîisyonel) izomerlerin (yani, yalnizca atomlarin uzamsal pozisyoiiundan ziyade atomlar arasindaki baglar açisindan farklilik gösteren izomerler), spesifik olarak bu dokümanda kullanilan "izomerler" teriminin kapsami disinda tutuldugunu not ediniz. Örnegin, bir metoksi grubu -OCer yapilan atif, onun yapisal izomeri bir hidroksimetil grubu -CH20H°ye bir atif olarak yorumlanmamalidir. Benzer sekilde, orto-klorofenile yapilaii bir atif, onun yapisal izomeri meta-klorofenile bir atif olarak yorumlanmamalidir. Bununla birlikte, bir yapi sinifina yapilan atif, 0 sinifin kapsami içine yer alan yapisal izomerik formlari kapsayabilir (örnegin C1_7 alkil, n-propil ve izo-propili kapsar; bütil, n-, iz0-, sec- Ve tert-bi'itili kapsar; metoksifenil, orto-, meta- ve para-metoksifenilikapsar).Yukarida açiklanan hariç tutma kriteri, tautomerik formlarla, örnegin, keto-, enol- ve enolat-formlariyla ilgili degildir; bunlara 'Örnek olarakasagidaki tautomerik çiftler gösterilebilir: keto/enol (asagida39gösterilmektedir), imin/enamin, amid/imino alkol, amidin/amidin,nitrozo/oksim, tiyoketon/enetiyol, N-nitrozo/hiroksiazo ve nitro/asi-nitro. 'I' ,[0 \ ,OH n' \ ,o ""C C :: C=C = czc l \ / \ HA / \ koîo 0nd .enolat"Tautomer" ya da "tautomerik form" terimi, bir düsük enerji bariyeri araciligiyla karsilikli dönüstürülebilen, farkli enerjilere sahip yapisal izomerlere atif yapar. Örnegin, proton tautoinerleri (prototropik tautomerler olarak da bilinir), keto-enol ve imin-enamin izomerizasyonlari gibi, bir protonun migrasyonu araciligiyla karsilikli dönüsümleri kapsar. Valans tautomerleri, baglanma elektronlarinin bazilarinin yeniden organizasyonu yoluyla karsilikli dönüsümlerikapsar.Bir veya daha fazla izotopik sübstitüsyon bulunan bilesiklerin de spesifik olarak "izomer" terimi kapsaminda yer aldigini not ediniz. Örnegin, H simgesi IH,2H (D) ve 3H (T) de dahil herhangi bir izotopik forinda olabilir; C simgesi '2G, '3C, ve "C de dahil herhangi bir izotopik formda olabilir; o simgesi 16o ve 18o da dahil herhangibir izotopik formda olabilir ve bu benzeri örnekler çogaltilabilir.Bu bulusa konu olan bilesiklere dahil edilebilecek izotoplara örnek olarak, bunlarla sinirli kalmaksizin 2H (deuterium, D), 3*H (tritium), "C, 13C, "C, 'SN, 18P, 31P, 32P, 355, 36C1 ve 1251 gibi hidrojen, karbon, nitro jen, oksijen, fosforöz, flor ve klor izotoplari gösterilebilir.Izotopik olarak etiketlenmis bu bulusun konusu çesitli farkli bilesikler,40örnegin 3H, l3C ve 14C gibi radyoaktif izotoplarm dahil edildigi bilesikler vardir. Bu izotopik etiketleninis bilesikler, metabolik çalisinalarda, reaksiyon kinetik çalismalarinda, belirleme ya da görüntüleme tekniklerinde, örnegin pozitron emisyon tomografisi (PET) ya da tek-foton emisyon bilgisayarli tomografisi (SPECT) tekniklerinde ve ilaç ya da sûbstrat doku dagilimi eseylerinde ya da hastalarin radyoaktif tedavisinde kullanilabilir. Bu bulusa konu olan d'oteryum etiketli ya da sübstit'ue edilmis terap'otik bilesikler, dagilim, metabolizma ve atiliinla (ADME) ilgili olarak gelismis DMPK (ilaç metabolizmasi ve farmakokinetikler) özelliklerine sahip olabilir. Döteryum gibi daha agir izotoplarla sübstit'üsyon, 'Örnegin in-vivo yari-ömürde artis ya da dozaj kosullarinda azalma gibi, daha uzun metabolik stabiliteden kaynaklanan belirli terapötik avantajlar saglayabilir. Bir 18F etiketli bilesik, PET ya da SPECT çalismalari için kullanisli olabilir. Bu bulusa konu olan izotopik olarak etiketlenmis bilesikler ve onlarin ön-ilaçlari genellikle bir izotopik olarak etiketlenmemis reaktifin kolaylikla temin edilebilecek bir izotopik olarak etiketlenmis reaktifle sübstitüe edilmesi suretiyle, asagida verilen semalarda ya da örneklerde ve hazirlama prosedürlerinde açiklanan prosedürler gerçeklestirilerek hazirlanabilir. Ek olarak, daha agir izotoplarla, 'Özellikle döteryumla (yani, 2H ya da D) sübstitüsyon, örnegin in-vivo yari-ömürde artis ya da dozaj kosullarinda azalma ya da terap'otik indekste br gelisme gibi, daha uzun metabolik stabiliteden kaynaklanan belirli terapötik avantajlar saglayabilir. Bu baglamda d'oteryumun bir sübstitüent olarak düsünüldügü anlasilir. Böyle bir daha agir izotopun, 'Özellikle döteryumun konsantrasyonu, bir izotopik zenginlestirme faktörüylebelirlenebilir. Bu bulusa konu olan bilesiklerde, özellikle belirli bir41izotop olarak tanimlanmayan bir atom, o atomun herhangi bir stabilizotopunu temsil eder.Aksi belirtilmedikçe, belirli bir bilesige yapilan atif, (tamamen ya da kismen) raseinik de dahil bu izomerik formlarin hepsini ve bunlarin baska karisimlarini kapsar. Bu izomerik formlari hazirlama (örnegin asimetrik sentez) ve ayirma (örnegin fraksiyonel kristalizasyon ve kromatografik yollar) yöntemleri sektörde bilinmektedir ya da bunlar, burada açiklanan yöntemler uygulanarak ya da bilinen yöntemlerbilinen sekilde uygulanarak kolaylikla elde edilebilirler.Biyolojik AktiviteIn-Vitro hücre proliferasvonu esevleri Genellikle, bir antikor-ilaç konjugatinin (ADC) sitotoksik ya da sitostatik aktivitesi, reseptör proteinleri içeren memeli hücreleri bir hücre kültürü vasati içinde ADC antikoruna maruz birakilarak; hücreler yaklasik 6 saat ilâ yaklasik 5 gün süreyle kültürlenerek ve hücre canliligi belirlenerek ölçülür. Bu bulusa konu olan bir ADC"nin canliligini (proliferasyon), sitotoksisitesini ve apoptozunun indüklenmesini (kaspaz aktivasyonu) ölçmek için hücre-bazli in-Vitroeseyler kullanilir.Antikor-ilaç konjugatlarinin in-vitro potansi, bir hücre proliferasyonueseyiyle ölçülebilir. Coleoptera lusiferazinin (ABD Patent No.425583024; 5674713 ve 5700670) rekombiiian ekspresyonuna dayanan homojen esey yöntemi olarak CellTiter-Glo® Luminesan Hücre Canliligi Eseyi ticari piyasada mevcuttur (Promega Corp., Madison, WI). Bu hücre proliferasyonu eseyi, metabolik olarak aktif hücrelerin bir indikatörü olan mevcut ATP°nin tayini bazinda, kültür içindeki canli hücrelerin sayisini belirler (Crouch et al (1993) J. lmmunol. Meth. 160:81-88; US 6602677). CellTiter-Glo® Eseyi, 96 kuyucuklu formatta gerçeklestirilir; bu format, eseyi, otomatik yüksek-çiktili taramaya (HTS) (Cree et al (1995) AntiCancer Ilaçs 6:398-404) uygun hale getirir. Homojen esey prosedürü, serum-eklenmis vasat içinde kültürlenmis hücrelere tekli reaktifin (CellTiter-Glo® Reagent) dogrudan ilave edilmesini kapsar. Hücre yikama, vasat çikarma ve çoklu pipetleme basamaklari gerekmez. Bu sistem, reaktif ilave edildikten ve karistirildiktan sonra 10 dakika içinde 384-kuyucuklu formatta 15 hücre/kuyucuk kadar az belirleme yapar. Hücreler, ADC"yle kesintisiz biçimde isleme tabi tutulabilir ya da isleme tâbi tutulabilir ve ADC"den ayrilabilir. Genellikle, kisa bir süre, yani 3 saat isleme tâbi tutulan hücreler, kesintisiz isleme tâbi tutulan hücrelerleayiii potans etkilerini gösterdi.Hoinojen "ekle-karistir-ölç" formati, mevcut ATP miktariyla orantili hücre lizizine ve bir luminesan sinyal olusumuna yol açar. ATP miktari, kültürde bulunan hücrelerin sayisiyla dogru orantilidir. CellTiter-Glo® Eseyi, kullanilan hücre tipine ve vasata bagli olarak yari-ömrü genellikle bes saatten daha uzun olan, lusiferaz reaksiyonuyla üretilen bir "isilti-tipi" luminesan sinyal olusturur. Caiili hücreler, bagi] luminesan birimleriyle (RLU) ifade edilir. KinkanatliLusiferin sübstrati, ATP'den AMP°ye dönüsüm ve fotonlarin43olusumuyla eszamanli olarak rekombinan atesböcegi lusiferazitarafindan oksidatif dekarboksile edilir.Antikor-ilaç konjugatlarinin in-Vitro potansi, bir sitotoksik eseyle de ölçülebilir. Kültürlenen yapisik hücreler, PBS"y1e yikanir; tripsinle ayrilir; %10 FCS içeren tam vasat içinde seyreltilir; santritüjlenir; taze vasat içinde yeniden süspanse edilir ve bir hemositometreyle sayilir. SüSpansiyon kültürleri dogrudan sayilir. Sayim için uygun monodisperse hücre süspansiyonlarinda, hücre kümelerini parçalamak için yinelenen aspirasyon yoluyla süspansiyonun çalkalanmasinigerekebilir.Hücre süspansiyonu, istenen ekim yogunluguna kadar seyreltilir ve siyah renkte 96-kuyucuklu plakalara dagitilir (100 ul / kuyucuk). Yapisik hücre hatlarinin plakalari gece boyunca inkübe edilerek yapismaya olanak saglanir. SüSpansiyon hücre kültürleri, ekimgününde kullanilabilir.Uygun hücre kültürü. vasati içinde bir ADC (20 ug/ml) stok çözeltisi (lml) hazirlanir. 100 ul ilâ 900 ul hücre kültürü vasatini seri aktarmak suretiyle 15 ml santrifüj tüplerin içinde stok ADCsnin seri 10-katseyreltileri hazirlanir.Her ADC seyreltisinin (100 ul) dört replika kuyucugu, hücre süspansiyonuyla (100 ul) `onceden kaplanan 96-kuyucuklu siyah plakalara dagitilir ve sonuçta, 200 u] nihai hacim elde edilir. Kontrolkuyucuklarina, hücre kültürü vasati (100 ul) konur.44Hücre hattinin ikiye katlanma süresi 30 saatten daha uzunsa, ADCinkübasyonu 5 gün sürer ya da dört günlük iiikübasyon gerçeklestirilir.Inkübasyon süresinin sonunda, hücre canliligi, Alamar inavi eseyiyle degerlendirilir. AlamarBlue (Invitrogen), plakanin tamami üzerine dagitilir (20 al / kuyucuk) ve 4 saat süreyle inkübe edilir. Alamar mavi Iloresans, Varioskan Flash plaka okuyucuda 570 nm eksitasyon ve 585 nm emisyon seviyesinde ölçülür. Hücre sürvisi yüzdesi, kontrol kuyucuklarinda ortalama floresansa kiyasla ADC°yle islemetâbi tutulan kuyucuklarda ortalama floresans baz alinarak hesaplanir.KullanimBu bulusa konu olan konjugatlar, bir hedef lokasyonda bir PBDbilesigi sunmak için kullanilabilir.Hedef lokasyon tercihen bir proliferatif hücre popülasyonudur. Antikor, proliferatif hücre popülasyonunda mevcut bir anti jen için birantikordur.Bu bulusuii bir yapisinda, aiitijen, örnegin bir tümör hücre popülasyonu gibi proliferatif hücre popülasyonunda bulunan antijen miktarina kiyasla proliferatif-olinayan hücre popülasyonunda daha azseviyelerde bulunur ya da hiç bulunmaz.Hedef lokasyonda, baglayici klevaja tâbi tutularak bir bilesik RelA,45ReIB, RelC, ReID ya da RelE salinabilir. Dolayisiyla, kon jugat, hedef lokasyoiia bir bilesik ReIA, ReIB, ReIC, ReID ya da ReIE"yi selektif biçimde saglamak için kullanilabilir.Baglayici, hedef lokasyonda bulunan bir enzim tarafindan klevaja tâbitutulabilir.Hedef lokasyon in-Vitro, in-Vivo ya da ex-vivo olabilir.Bu bulusa konu olan antikor-ilaç kon jugati (ADC) bilesikleri arasinda antikanser aktivitesi için kullanisli olanlar vardir. Ozellikle, bilesikler, bir PBD ilaç moiyetesine, yani toksine kon juge edilmis, yani bir baglayiciyla kovalent baglanmis bir antikoru kapsar. Ilaç bir aiitikora konjuge ediliiiediginde, PBD ilaci bir sitotoksik etkiye sahiptir. Sonuç olarak, PBD ilaç moiyetesinin biyolojik aktivitesi, bir antikora konjugasyoii yoluyla modüle edilir. Bu bulusa konu olan antikor-ilaç konjugatlari (ADC), bir sitotoksik ajanin etkin ve etkili bir dozunu tümör dokusuna selektif biçimde uygular ve bu yolla, selektiviteniiidaha büyük olmasi, yani etkili dozun daha düsük olmasi saglanabilir.Sonuç olarak, bir özelliginde, bu bulus, tedavide kullanmak içinburada açiklandigi gibi olan bir konjugat bilesigi sunar.Bu bulusun ilave bir özelliginde, bir proliferatif hastaligin tedavisinde kullanmak için burada açiklandigi gibi olan bir konjugat bilesigi de sunulmaktadir. Mevcut bulusun ikinci bir özelligi, bir konjugat bilesiginiii bir proliferatif hastaligin tedavisine yönelik bir ilaçüretiiiiiiide kullanilmasini saglamaktadir.46Sektörde olagan bilgi ve beceri sahibi bir kisi, bir aday konjugatin belirli bir hücre tipi için bir proliferatif duruinu tedavi edip etinedigini kolaylikla tayin edebilir. Örnegin, belirli bir bilesigin sagladigi aktiviteyi degerlendirmek için kullanilmasi uygun Olabilecek eseylerasagida örnekler bölümünde açiklanmaktadir."Proliferatif hastalik" terimi, in-Vitro ya da in-Vivo ortamda, örnegin ne0plastik ya da hiperplastik çogalma gibi, fazlalik ya da anormal hücrelerin istenmeyen ya da kontrol edilemeyen selüler proliferasyonuyla ilgilidir ve bu, arzu edilmeyen bir durumdur.Proliferatif durumlara, bunlarla sinirli kalmaksizin ve fakat neoplazmalar ve tümörler (örnegin histositom, glioma, astrositom, osteom), kanserler (örnegin akciger kanseri, küçük hücreli akciger kanseri, gastrointestinal kanser, bagirsak kanseri, kolon kanseri, meme karsinomu, yumurtalik karsinomu, prostat kanseri, testiküler kanser, karaciger kanseri, böbrek kanseri, mesane kanseri, pankreas kanseri, beyin kanseri, sarkom, osteosarkom, Kaposi sarkomu, melanom), lenfomalar, lösemiler, psöriyazis, kemik hastaliklari, fibroproliferatif bozukluklar (örnegin bag dokularinin) ve aterosklerozu da içeren benign, pre-malign ve malign selüler proliferasyon olaylari, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla örnek gösterilebilir. Ozelikle ilgili kanserler arasinda, bunlarla sinirli kalmaksizin ve fakat, lösemiler ve yumurtalikkanserleri de vardir.Bunlarla sinirli kalmaksizin akciger, gastrointestinal (örnegin bagirsak, kolon dahil), meme (memeli), yumurtalik, prostat, karaciger (hepatik), böbrek (renal), mesane, pankreas, beyin ve cilt dahilherhangi bir tipte hücre tedavi edilebilir.47Ozellikle ilgili rahatsizliklar, bunlarla sinirli kalmaksizin ve fakat, non-Hodgkin lenfomasini yani diffüz büyük B-hücreli lenfomasini, (DLBCL), foliküler lenfomayi, (FL), Manto hücreli lenfomayi (MCL), kronik limpatik lenfomayi (CLL) ve lösemileri yani bir tüylü hücreli lösemiyi (HCL), tüylü hücreli lösemi varyantini (HCL-v) ve Akut Lenfoblastik Lösemiyi (ALL) içerir.Bu bulusa konu olan antikor-ilaç konjugatlarinin (ADC) Ömegin bir tümör anti jeninin asiri ekspresyonuyla karakterize edilen çesitli farkli hastaliklari ya da bozukluklari tedavi etmek için kullanilabilmesi tasarlanir. Ornek durumlar ya da hiperproliferatif bozuklular arasinda benign ya da malign tümörler; lösemi, hematolojik ve lenfoid malignensiler vardir. Diger örnekler arasinda nöronal, glial, astrosital, hipotalamik, glandüler, makrofajal, epitelyal, stromal, blastos'olik, inflamatuar, anjiyogenik ve otoimmün dahil immünolojik bozukluklarsayilabilir.Genelde, tedavi edilecek hastalik ya da bozukluk, kanser gibi bir hiperproliferatif hastaliktir. Burada tedavi edilecek kansere örnek olarak, bunlarla sinirli kalmaksizin ve fakat, karsinom, lenfoma, blastom, sarkoin ve lösemi ya da lenfoid malignensiler gösterilebilir. Bu kanserlerin daha somut 'Örnekleri arasinda skuamöz hücreli kanser (örnegin, epitelyal skuamöz hücreli kanser); küçük-hücreli akciger kanseri, küçük hücreli-disi akciger kanseri, akciger adenokarsinomu ve skuamöz akciger karsinomu da dahil akciger kanseri; peritoneum kanseri, hepatoselüler kanser, gastrointestinal kanser de dahil gastrik kanser ya da mide kanseri, pankreas kanseri, glioblastom, servikskanseri, yumurtalik kanseri, karaciger kanseri, mesane kanseri,48hepatom, meme kanseri, kolon kanseri, rektal kanser, colorektal kanser, endometriuin ya da uterin karsinoinu, tükürük bezi karsinomu, böbrek kanseri ya da renal kanser, prostat kanseri, vulva kanseri, tiroid kanseri, hepatik karsinom, anal karsinoin, penil karsinom ve bas veboyun kanseri sayilabilir.ADC bilesiklerinin tedavide kullanilabilecegi otoimmün hastaliklar arasinda asagida sayilanlar vardir: romatolojik bozukluklar (ömegin, roinatoid artrit, S jögren sendromu, skleroderma, SLE ve lupus nefritis gibi lupus, polimiyozit/dermatomiyozit, kriyoglobulinemi, anti- fosfolipid antikor sendromu ve psöriatik artrit), osteoartrit, otoimmün gastrointestinal bozukluklar ve karaciger bozukluklari (örnegin, inflamatuar bagirsak hastaliklari (örnegin ülseratif kolit ve Crohn hastaligi), otoimmün gastrit ve pernisiyöz anemi, otoimmün hepatit, primer biliyer siroz, primer sklerozan kolanjit ve çölyak hastaligi), vaskülit (örnegin Churg-Strauss vasküliti, Wegener granülomatözü ve poliarterit dahil ANCA-iliskili vaskülit gibi), otoimmün nörolojik bozukluklar (örnegin multipl skleroz, opsoklonus myoklonus sendromu, myastenia gravis, nöromiyelitis optika, Parkinson hastaligi, Alzheimer hastaligi ve otoimmün polin'oropatiler), renal bozukluklar (örnegin glomerülonefrit, Goodpasture sendromu ve Berger hastaligi gibi), otoimmün derinatolojik bozukluklar (örnegin psöriyazis, ürtiker, kurdesen, peinfigus vulgaris, büll'oz pemfigoid ve kutanöz lupus eritematozus), hematolojik bozukluklar (ömegin trombositopenik purpura, trombotik troinbositopenik purpura, post-transfüzyon purpurasi ve otoimmün hemolitik anemi gibi), ateroskleroz, üveit, otoimmün isitme hastaliklari (örnegin iç kulak hastaligi ve isitmekaybi gibi), Behçet hastaligi, Raynaud sendromu, organ transplanti ve49otoimmün endokrin bozukluklari (örnegin insülin-bagimli diabetes mellitus (IDDM), Addison hastaligi ve otoimmün tiroid hastaligi (örnegin Graves hastaligi ve tiroidit) dahil diyabet baglantili otoimmün hastaliklari). Daha çok tercih edilen hastaliklar arasinda, örnegin romatoid artrit, ülseratif kolit, ANCA-iliskili vaskülit, lupus, multipl skleroz, Sjögren sendromu, Graves hastaligi, IDDM,pernisiyöz anemi, tiroidit ve glomerülonefrit sayilabilir.Tedavi YöntemleriBu bulusa konu olan kon jugatlar bir tedavi yönteminde_kullanilabilir.Uygulanan fiili miktar ve uygulama hizi ve süresi, tedavi edilen durumun niteligine ve siddetin bagli olacaktir. Tedavi için verilecek reçete, örnegin dozaj kararlari, pratisyen doktorun ve baska tipdoktorlarinin sorumlulugundadir.Bu bulusa konu olan bir bilesik, tedavi edilecek duruina bagli olarak tek basina uygulanabilecegi gibi, baska tedavilerle koinbinasyon halinde eszamanli olarak ya da sirayla da uygulanabilir. Tedavilere ve terapilere örnek olarak, bunlarla sinirli kalmaksizin ve fakat, kemoterapi (örnegin kemoterapötikler gibi ilaçlar da dahil etkin maddelerin uygulanmasi), ameliyat ve radyasyon tedavisigösterilebilir.Bir "kemoterap'otik ajan", etki mekanizmasindan bagimsiz olarak, kanser tedavisinde kullanilabilecek bir kimyasal bilesiktir.Kemoterapötik ajan siniflari arasinda, bunlarla sinirli kalmaksizin ve50fakat, alkilleme ajanlari, antimetabolitler, igagaci zehiri bitki alkaloidleri, sitotoksik/antitümör antibiyotikleri, topoizomeraz inhibitörleri, antikorlar, fotosensitizerler ve kinaz inhibitörleri vardir. Keinoterap'otik ajanlar, "hedefli tedavide" ve geleneksel kemoterapidekullanilan bilesikleri kapsar.Kemoterap'otik ajanlara örnek olarak asagida sayilanlar gösterilebilir: erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharin.), dosetaksel (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (florourasil, 5-florourasil, CAS No. 51-21-8), gemsitabin (GEMZAR®, Lilly), PD-O32590l (CAS No. 391210-10-9, Pfizer), cisplatin (cis-diamin, dikloroplatinyum(ll), CAS No. 15663-27-1), karboplatin (CAS No. 41575-94-4), paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), trastuzuinab (HERCEPTIN®, Genentech), temozolomid (4-meti1-5-okso- 2,3,4,6,8-pentazabisiklo [4.3.0] nona- 2,7,9-trien-9-karboksamid, CAS No. 85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), tainoksifen ((Z)-2-[4-(l,2- difenilbüt- 1 -eni1)fenoksi]-N,N-dimetiletanamin, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®) ve doksorubisin (ADRIAMYCIN®), Akti-1/2, HPPD ve rapamisin.Kemoterapötik ajanlarin ilave örnekleri arasinda asagida sayilanlar vardir: oksaliplatin (ELOKSATIN®, Sanofi), bortezoinib (VELCADE®, Millennium Pharm.), sutent (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), letrozol (FEMARA®, Novartis), imatinib mesilat (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (Mek inhibitörü, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (Mek inhibitörü, AZD6244, Array BioPharnia, Astra Zeneca), SF-1126 (PI3K inhibitörü, Semafore Pharinaceuticals), BEZ-235 (PI3K inhibitörü, Novartis), XL-14751(PI3K inhibitörü, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), lokovorin (folinik asit), rapamisin (sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), lonafarnib (SARASARTM, SCH 66336, Schering Plough), sorafenib (NEXAVAR®, BAY43-9006, Bayer Labs), gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), irinotekan (CAMPTOSAR®, CPT-ll, Pfizer), tipifarnib (ZARNESTRATM, Johnson & Johnson), ABRAXANETM (Kremofor-içerinez), paklitakselin albumin-degistirilmis nanopartikül formülasyonlari (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, ll), vandetanib (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), klorambusil, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), temsirolimus (TORISEL®, Wyeth), pazopanib (GlaxoSinithKline), kanfosfamid (TELCYTA®, Telik), tiyotepa ve siklosfosfainid (CYTOKSAN®, NEOSAR®); busülfan, improsûlfan ve piposülfan gibi alkil sülfonatlar; benzodopa, karbokuon, ineturedopa ve uredopa gibi aziridinler; altretamin, trietilenmelainin, trietilenfosforainid, trietilentiofosforamid ve trimetilomelamin de dahil etileniminler ve metilainelaminler; asetogeninler (özellikle bullatakin ve bullatakinon); bir kamptotekin (sentetik analog topotekan dahil); briyostatin; kallistatin; CC-1065 (adozelesin, karzelesin ve bizelesin sentetik analoglari dahi1); kriptofisinler (özellikle kriptofisin 1 ve kriptofisin 8); dolastatin; duokarmisin (sentetik analoglar KW-2189 ve CBl-TMl dahi1); eleuterobin; pankratistatin; bir sarkodiktyin; spongistatin; klorambusil, klomafazin, klorofosfamid, estramustin, ifosfamid, mekloretamin, mekloretamin oksit hidroklorûr, melfalan, novembisin, fensterin, prednimustin, trofosfamid, urasil inustard gibi nitrojen mustardlar;nitrozoüreler, örnegin karmustin, klorozotokin, fotemustin, lomustin,52nimustin ve ranimnustin); antibiyotikler, örnegin enediyne antibiyotikler (örnegin, kalikeamisin, kalikeamisin gammall ve kalikeamisin omegall (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183- 186); dinemisin, dineinisin A; bisfosfonatlar, örnegin klodronat; bir esperainisin ve yani sira; neokarzinostatin kromofor ve iliskili kromoprotein enediyne antibiyotik kromoforlari), aklasinomisinler, aktinomisin, autramisin, azaserin, bleomisinler, kaktinomisin, karabisiri, karminomisin, karzinofilin, kroinomisinler, daktinomisin, daunorubisin, detorubisin, 6-diazo-5-okso-L-norlösin, inorfolino- doksorubisin, siyanomorfolino-doksorubisin, 2-pirrolino-doksorubisin ve deoksidoksorubisin), epirubisin, esorubisin, idarubisin, nemorubisin, markellomisin, mitomisinler, örnegin mitomisin C, mikofenolik asit, nogalamisin, olivomisinler, peplomisin, porfiromisin, puromisin, kuelamisin, rodorubisin, streptonigrin, streptozosin, tubersidin, ubenimeks, Zinostatin ve zorubisin; anti- metabolitler, örnegin metotreksat ve 5-Ilorourasil (5-FU); folik asit analoglari, örnegin den0pterin, metotreksat, pterOpterin, trimetreksat; purin analoglari, örnegin fludarabin, 6-merkaptopurin, tiyamiprin, tiyoguanin; pirimidin analoglari, örnegin ansitabin, azasitidin, 6- azaüridin, karmofur, sitarabin, dideoksiüridin, doksifluridin, enositabin, floksüridin; kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, niepitiostan, testolakton gibi androjenler; aminoglutetimid, mitotan, trilostan gibi anti-adrenaller; frolinik asit gibi folik asit takviyeleri; aseglaton; aldofosfamid glikozit; aminolevulinik asit; enilurasil; amsakrin; bestrabusil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolsin; diazikuon; elfornitin; elliptinyum asetat; bir epotilon; etoglusid; galyum nitrat; hidroksiüre; lentinan;lonidainin; maytansin ve ansamitokinler gibi maytansinoidler;53mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubisin; losoksantron; podofillinik asit; 2-eti1hidrazit; prokarbazin; PSK® polisakkarit kompleksi (JHS Natural Urüns, Eugene, OR); razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanyum; tenuazonik asit; triazikuon; 2,2',2"-triklorotrietilaiiiin; trikoteseiiler (özellikle T-2 toksin, verrakurin A, roridin A ve anguidin); üretan; Vindesin; dakarbazin; mannomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gasitozin; arabinozit ("Ara-C"); siklofosfamid; tiyotepa; 6-ti0guanin; merkaptopurin; metotreksat; cisplatin ve karboplatin gibi platin analoglari; vinblastin; etopozit (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vinkristin; viiiorelbin (NAVELBINE®); novantron; tenipozit; edatreksat; daunomisin; aminopterin; kapesitabin (XELODA®, Roche); ibaiidronat; CPT-ll; topoizomeraz iiihibitörü RFS 2000; diflorometilornitin (DMFO); retinoik asit gibi retiiioidler ve yukarida sayilanlarin herhangi birisinin farmasötik açidan kabuledilebilir tuzlari, asitleri ve türevleri.Asagida sayilanlar da "kemoterapötik ajan" tanimina dahil edilir: (i) hormonun tümörler üzerindeki etkinligini regüle ya da inhibe etme islevini gören anti-hormonal ajanlar, örnegin tamoksifen (NOLVADEX®; tamoksifen sitrat dahil), raloksifen, droloksifen, 4- hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LYll7018, oiiapriston ve FARESTON® da (toremifin sitrat) dahil anti-östrojenler ve selektif östrojen reseptör modülatörleri (SERM°ler); (ii) adrenal bezlerde östrojen üretimini regüle eden enzim aromatazi inhibe eden aromataz inhibitörleri, örnegin 4(5)-imidazoller, aminoglutetimid, MEGASE® (inegestrol asetat), AROMASIN® (eksemestam Pfizer), formestan, fadrozol, R1VIZOR® (vorozol), FEMARA® (1etrozol; Novartis) ve54ARIMIDEX® (anastrozoh AstraZ.eneca); (iii) flutamid, nilutamid, bikalutamid, löprolid ve goserelin gibi antiandrojenler ve yani sira troksasitabin (bir 1,3-di0ksolan nükleozit sitozin analogu); (iV) MEK inhibitörleri gibi (WO 2007/044515) protein kinaz inhibitörleri; (v) lipid kinaz inhibitörleri; (Vi) antisens oligonükleotidleri, özellikle anormal hücre proliferasyonunda rol oynayan sinyal yolaklarindaki genlerin ekspresyonunu inhibe edenler, örnegin PKC-alfa, Ralf ve H- Ras; örnegin obliniersen (GENASENSE®, Genta Inc.); (Vii) riboziniler, örnegin VEGF ekspresyon inhibitörleri (öriiegin, ANGIOZYME®) ve HERZ ekspresyon inhibitörleri; (Viii) gen tedavisi asilari gibi asilar, örnegin ALLOVECTIN®, LEUVECTIN® ve VAXID®; PROLEUKIN® rIL-Z; topoizomeraz l inhibitörleri, örnegin LURTOTECAN®; ABARELIX® rniRH; (ix) anti- anjiyogenik ajanlar, örnegin bevasizurnab (AVASTIN®, Genentech) ve yukarida sayilanlarin herhangi birisiiiin farmasötik açidan kabul edilebilir tuzlari, asitleri ve türevleri.Asagida sayilanlar da "kemoterapötik ajan" tanimina dahil edilir: terapötik antikorlar, örnegin alemtuzurnab (Cainpath), bevasizumab (AVAST1N®, Genentech); setuksimab (ERBITUX®, lmclone); panituinumab (VECTIBIX®, Amgen), rituksimab (RITUXAN®, Genentech/Biogen Idec), ofatumumab (ARZERRA®, GSK), pertuzuniab (PERJETATM, OMNITARGTM, 2C4, Genentech), trastuzuinab (HERCEPTIN®, Genentech), tosituinoniab (Bexxar, Corixia) ve antikor ilaç konjugati, gemtuzumab ozoganiisin(MYLOTARG®, Wyeth).Bu bulusa konu olan konjugatlarla kombinasyon halindekullanilabilecek kemoterapötik ajanlar olarak terapötik potansiyele55sahip hümanize monoklonal antikorlar arasinda asagida sayilanlar vardir: alemtuzumab, apolizumab, aselizumab, atlizumab, bapineuzumab, bevasizumab, bivatuzumab mertansin, kantuzumab mertansin, sedelizumab, sertolizumab pegol, sidfusituzumab, sidtuzumab, daklizumab, esulizumab, efalizumab, epratuzumab, erlizumab, felvizumab, fontolizumab, gemtuzumab ozogamisin, inotuzumab ozogamisin, ipilimumab, labetuzumab, lintuzumab, matuzumab, mepolizumab, motavizumab, motovizumab, natalizumab, nimotuzumab, nolovizumab, numavizumab, 0krelizumab, omalizumab, palivizumab, paskolizumab, pekfusituzumab, pektuzumab, pertuzumab, pekselizumab, ralivizumab, ranibizumab, reslivizumab, reslizumab, resivizumab, rovelizumab, ruplizumab, sibrotuzumab, siplizumab, sontuzumab, takatuzuinab tetraksetan, tadosizumab, talizumab, tefibazumab, tokilizumab, toralizumab, trastuzumab, tukotuzumab selmolökin, tukusituzumab, umavizumab,urtoksazumab ve Visilizumab.Bu bulusa uygun olan ve bu bulusa göre kullanma amacina yönelik olan farmasötik bilesimler, etkin maddeye, yani bir kon jugat bilesigine ek olarak, farmasötik açidan kabul edilebilir bir yardimci madde, tasiyici, tampon, stabilizör ya da sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerin iyi bildikleri baska malzemeler de içerebilir. Bu malzemeler toksik olmamali ve etkin madde etkinligine müdahale etmemelidir. Tasiyicinin ya da baska malzemenin kesin niteligi, uygulama yoluna bagli olacaktir; uygulama yolu oral olabilecegi gibi, örnegin kutanöz,subkutanöz ya da intravenöz enjeksiyon gibi enjeksiyon da olabilir.56Oral uygulamaya yönelik farmasötik bilesimler, tablet, kapsül, toz ya da sivi formunda olabilir. Bir tablet, bir kati tasiyici ya da bir ad juvan içerebilir. Sivi farmasötik bilesimler genellikle su, petrol, hayvansal ya da bitkisel yaglar, madeni yag ya da sentetik yag gibi bir sivi tasiyici içerebilir. Fizyolojik salin çözeltisi, dekstroz veya baska sakkarit çözeltisi ya da örnegin etilen glikol, propilen glikol ya da polietilen glikol gibi glikoller dahil edilebilir. Bir kapsül, jelatin gibibir kati tasiyici içerebilir.Intravenöz, kutanöz ya da subkutanöz enjeksiyon ya da hastalik yerine enjeksiyon için, etkin inadde, pirojen içermeyen ve uygun pH, izotonisite ve stabiliteye sahip olan, parenteral olarak kabul edilebilir bir aköz çözelti formunda olacaktir. Ilgili sektörde bilgi ve beceri sahibi kisiler, örnegin izotonik vehikülleri kullanarak Sodyuin Klorür Enjeksiyonu, Ringer Enjeksiyonu, Laktatli Ringer Enjeksiyonu gibi uygun çözeltileri hazirlaina kabiliyetine sahiptir. Gerektiginde, koruyucular, stabilizörler, tainponlar, antioksidanlar ve/Veya baskakatki maddeleri ilave edilebilir.FormülasyonlarKonjugat bilesiginin tek basina kullanilmasi (örnegin, uygulanmasi) mümkün olmasina ragmen, çogunlukla bir bilesim ya da formülasyonolarak bulunmasi tercih edilir.Bu bulusun bir yapisinda, bilesim, burada açiklanan bir konjugat bilesigi ve farinasötik açidan kabul edilebilir bir tasiyici, seyreltici yada yardiin madde içeren bir farmasötik bilesimdir (örnegin,57formülasyon, preparat, ilaç).Bu bulusun bir yapisinda, bilesim, bunlarla sinirli kalmaksizin farmasötik açidan kabul edilebilir tasiyicilar, seyrelticiler, yardimci inaddeler, ad juvanlar, dolgu maddeleri, tamponlar, koruyucular, anti- oksidanlar, kaydiricilar, stabilizörler, çözünürlestiriciler, yüzey-aktif maddeler (Örnegin, islatma ajanlari), maskeleme ajanlari, renkleiidirme ajanlari, aroina ajanlari ve tatlandirici ajanlar da dahil olinak üzere, sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerin iyi bildikleri farmasötik açidan kabul edilebilir bir veya daha fazla baska bilesenle birlikte, burada açiklanan en az bir konjugat bilesigini içeren bir farmasötik bilesimdir.Bu bulusun bir yapisinda, bilesim ek olarak 'Örnegin baska terapötik yada profilaktik ajanlar gibi baska etkin inaddeler de içerir.Uygun tasiyicilar, seyrelticiler, yardimci maddeler ve benzeri, standart farmasötik metinlerde bulunabilir. Bakiniz 'Örnegin, "Handbook ofPharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash and I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, lnc., Endicott, New York, USA)", "Remington's Pharinaceutical Sciences, 20th edition, pub.Lippincott, Williams & Wilkins, 2000" ve "Handbook of Pharinaceutical Excipients, 2nd edition, 1994". Bu bulusun baska bir özelligi, bir farmasötik bilesim hazirlama amacina yönelik olan ve burada açiklanan en az bir ["C]-radyoetiketli konjugati ya da konjugat-benzeri bilesigi `Örnegin tasiyicilar, seyrelticiler, yardimci maddeler ve benzeri gibi sektörde bilgi vebeceri sahibi kisilerin iyi bildikleri farmasötik açidan kabul edilebilir58bir veya daha fazla baska bilesenle karistirma basamagini kapsayan yöntemlerle ilgilidir. Ayri birimler (örnegin, tabletler ve benzeri) olarak formüle edilirlerse, her birim, önceden tayin edilen miktarda(dozaj) etkin bilesik içerir.Bu dokümanda kullanilan "farmasötik açidan kabul edilebilir" terimi, güvenilir tibbi degerlendirmenin kapsami dahilinde, asiri toksisite, irritasyon, alerjik cevap ya da baska problem veya komplikasyona neden olmadaii söz konusu denegin (örnegin, insan) dokulariyla temas halinde kullanmak için uygun ve makul fayda/risk oraniyla orantili olan bilesikler, bilesenler, malzemeler, bilesimler, dozaj formlari ve benzerleriyle ilgilidir. Her tasiyici, seyreltici, yardimci madde ve benzerinin de formülasyonun diger bilesenleriyle geçimli olmasiaçisindan "kabul edilebilir" olmasi gerekir.Formülasyonlar, eczacilik sektöründe iyi bilinen herhangi bir yöntemle hazirlanabilir. Bu yöntemler, bir veya daha fazla yardimci bileseni olusturan bir tasiyiciyla etkin bilesigi birlestirme basamagini kapsar. Genelde, etkin bilesik ile tasiyicilar (örnegin, sivi tasiyicilar, ince bölünmüs kati tasiyici ve benzeri) arasinda üniform ve yakiii bir iliski kurularak ve ardindan, gerekirse, ürün sekillendirilerekformülasyonlar hazirlanir. Formülasyon, hizli ya da yavas salim; çabuk, geciktirilmis, zamanlanmis ya da sürekli salim ya da bunlarin bir kombinasyonunusaglamayacak sekilde hazirlanabilir.Parenteral (örnegin, enjeksiyon yoluyla) uygulama için uygun59formülasyonlar arasinda etkin maddenin içerisinde çözündürüldügü, süspanse edildigi ya da sunuldugu (örnegin bir lipozom ya da baska mikropartik'ûl içinde) aköz ya da aköZ-olmayan, izotonik, pirojen- içermeyen, steril sivilar (örnegin çözeltiler, süspansiyonlar) vardir. Bu sivilar, örnegin anti-oksidanlar, tamponlar, koruyucular, stabilizörler, bakteriyostatlar, süspansiyon ajanlari, koyulastirici ajanlar ve formülasyonu hedeflenen alicinin kaniyla (ya da baska ilgili Vücut sivisiyla) izotonik hale getiren çözünmüs maddeler gibi farinasötik açidan kabul edilebilir baska bilesenler de içerebilir. Yardimci maddelere 'Örnek olarak su, alkoller, polioller, gliserol, bitkisel yaplar ve benzeri gösterilebilir. Bu formülasyonlarda kullanmak için uygun izotonik tasiyicilarin 'Örnekleri arasinda Sodyum Klorür En jeksiyonu, Ringer Çözeltisi ya da Laktatli Ringer Enjeksiyonu vardir. Normalde, sivi içinde etkin madde konsantrasyonu yaklasik 1 ng/ml ile yaklasik tig/ml araliginda, ömegin yaklasik 10 ng/ml ile yaklasik 1 ug/ml araligindadir. Formülasyonlar, sizdirmaz kapatilmis birim-doz ya da çoklu-doz kaplari içinde, örnegin ampuller ve flakonlar içinde sunulabilir ve dondurarak-kurutulmus (liyofilize) halde saklanabilir ve bu durumda, kullanmadan hemen önce yalnizca Örnegin en jeksiyonluk su gibi steril sivi tasiyicinin ilave edilmesi gerekir. Ekstamporane enjeksiyon çözeltileri ve süspansiyonlari, steril tozlardan, granüllerdenve tabletlerden hazirlanabilir. Doza j Sektörde bilgi ve beceri sahibi bir kisi, konjugat bilesiginin vekonjugat bilesigini içeren bilesimleriii uygun dozajlarinin hastadanhastaya degisebilecegini anlayacaktir. Optimum dozajin belirlenmesi60genellikle herhangi bir riske ya da zararli yan etkilere karsi terapötik fayda seviyesinin dengelenmesini kapsar. Seçilen dozaj seviyesi, bunlarla siiiirli olmaksizin ve fakat, belirli bilesigin aktivitesi, uygulama yolu, uygulama süresi, bilesik atiliin hizi, tedavi süresi, kombinasyon halinde kullanilan baska ilaçlar, bilesikler ve/veya malzemeler, hastaligin siddeti ve hastanin türü, yasi, cinsiyeti, kilosu, hastaligi, genel saglik durumu ve daha önceki tibbi hikayesi de dahil çesitli farkli faktörlere bagli olacaktir. Genellikle dozaj, etkinlik yerinde önemli zararli ya da istenmeyen yan-etkilere neden olinadan istenen etkiyi saglayan lokal konsantrasyonlari saglayacak sekilde seçilecek olmasina ragmen, bilesik miktari ve uygulama yolu nihai olarak doktorun, veterinerin ya da klinisyenin takdirinde olacaktir.Uygulama, tedavi süreci boyunca tek doz halinde, kesintisiz olarak ya da aralikli (örnegin, uygun araliklarda bölünmüs dozlar halinde) yapilabilir. En etkili uygulama yolunu ve dozajini belirleme ainacina yönelik yöntemler, sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerce iyi bilinmektedir ve tedavi için kullanilan formülasyona, tedavinin amacina, tedavi edilen hedef hücre(ler)e ve tedavi edilen denege göre degisecektir. Tekli ya da çoklu uygulamalar, tedaviyi yapan doktorun, veterinerin ya da klinisyenin seçtigi doz seviyesine ve patemine göreyapilabilir.Genelde, uygun bir etkin bilesik dozu, günlük olarak denegin vücut agirliginin beher kilogrami için yaklasik 100 ng ile yaklasik 25 mg (daha tipi olarak yaklasik 1 ug ile yaklasik 10 mg) araligindadir. Etkin bilesigin bir tuz, ester, amid, ön-ilaç ya da benzeri oldugu durumlarda, uygulanan miktar ana bilesik bazinda hesaplanir ve bundan dolayi,kullanilacak fiili agirlik bununla oranli olarak artar.61Bu bulusun bir yapisinda, etkin bilesik, bir insan hastaya asagidaverilen dozaj rejimine göre uygulanir: günde 3 defa yaklasik 100 mg.Bu bulusun bir yapisinda, etkin bilesik, bir insan hastaya asagidaverilen dozaj rejimine göre uygulanir: günde 2 defa yaklasik 150 mg.Bu bulusun bir yapisinda, etkin bilesik, bir insan hastaya asagidaverilen dozaj rejimine göre uygulanir: günde 2 defa yaklasik 200 mg.Bununla birlikte, bu bulusun bir yapisinda, kon jugat bilesigi, bir insan hastaya asagida verilen dozaj rejimine göre uygulanir: günde 3 ya da 4defa yaklasik 50 ya da yaklasik 75 mg.Bu bulusun bir yapisinda, konjugat bilesigi, bir insan hastaya asagida verilen dozaj rejimine göre uygulanir: günde 2 defa yaklasik 100 ya dayaklasik 125 mg.Yukarida açiklanan dozaj miktarlari, konjugat (PBD moiyetesi ve antikora baglayici da dahil) için ya da sunulan PBD bilesiginin etkin ve etkili miktari, `Örnegin baglayicinin klevajindan sonra salinanbilesik miktari için de uygulanabilir.Hastaligin önlenmesi ya da tedavisi için, bu bulusa konu olan bir ADC°nin uygun dozaji, yukarida açiklandigi gibi tedavi edilen hastaligin tipine, hastaligin siddetine ve seyrine, molekülün önleyici amaçlarla mi, yoksa terapötik amaçlarla mi uygulandiginda, `onceden uygulanan tedaviye, hastanin klinik hikayesine ve aiitikora cevaba vetedaviyi yapan doktorun kararina bagli olacaktir. Molekülün hastaya62bir defada ya da bir dizi tedavi boyunca uygulanmasi uygundur. Hastaligin tipine ve siddetine bagli olarak, yaklasik 1 ug/kg ilâ 15 mg/kg (örnegin 0,1 - 20 mg/kg) molekül, örnegin bir veya daha fazla ayri uygulama yoluyla ya da kesintisiz infûzyon yoluyla hastaya uygulamak için ilk aday dozajdir. Bir tipik günlük dozaj, yukarida atif yapilan faktörlere bagli olarak yaklasik 1 ug/kg ilâ 100 mg/kg ya da daha fazla olabilir. Bir hastaya uygulanacak bir örnek ADC dozaji, yaklasik 0,1 ile yaklasik 10 mg/kg hasta agirligi araligindadir. Tedavi edilen duruma bagli olarak birkaç gün ya da daha uzun bir süre boyunca yinelenen uygulamalar için, tedavi, hastalik semptomlarinin istenen supresyonu saglanana kadar sürdürülür. Bir örnek dozaj rejimi, bir ADC'nin yaklasik 4 mg/kg baslangiç yükleme dozunu ve ardindan, her hafta, iki haftada bir ya da üç haftada bir ilave dozlarini uygulama kürünü kapsar. Baska dozaj rejimleri de kullanilabilir. Bu tedavininseyri, geleneksel teknikler ve eseylerle kolaylikla izlenir.TedaviBu dokümanda bir durumu tedavi etme baglaminda kullanilan "tedavi" terimi genellikle öriiegiii durumun ilerlemesinin inhibisyonu gibi bazi istenen terapötik etkilerin saglandigi ve bu etkiler arasinda ilerleme hizinda bir azalma, ilerlemenin durmasi, hastaligin regresyonu, hastaligin düzelmesi ve hastaligin iyilesme etkilerinin yer aldigi, bir insan ya da bir hayvanin (örnegin, veterinerlik uygulamalarinda) tedavisi ve terapisiyle ilgilidir. Bir profilaktik ölçüt olarak tedavi de (yani, profilaksi, önleme) bu tanima kapsaminadahildir.63Bu dokümanda kullanilan "terapötik açidan etkin ve etkili miktar" ibaresi, bir etkin bilesigin ya da etkin bilesigi içeren bir malzeme, bilesim ya da dozaj formunun, istenen tedavi rejimine göre uygulandiginda, inakul bir fayda/risk oraniyla orantili olarak, istenen bazi terapötik etkileri saglamak için etkin ve etkili olan miktariylailgilidir.Benzer sekilde, bu dokümanda kullanilan "profilaktik açidan etkin ve etkili miktar" ibaresi de, bir etkin bilesigin ya da etkin bilesigi içeren bir malzeme, bilesim ya da dozaj formunun, istenen tedavi rejimine göre uygulandiginda, makul bir fayda/risk oraniyla orantili olarak, istenen bazi profilaktik etkileri saglamak için etkin ve etkili olanmiktariyla ilgilidir.[laç konjugatlarinin hazirlanmasiAntikor ilaç konjugatlari, bir aiitikorun bir nükleofilik grubunun bir ilaç-baglayici reaktifiyle reaksiyonu da dahil olmak üzere, sektörde bilgi ve beceri sahibi kisilerin bildikleri organik kiinya reaksiyonlari, kosullari ve reaktifleri kullanilarak birkaç yolla hazirlanabilir. Bu yöntem, bu bulusa konu olan antikor-ilaç konjugatlarini hazirlamakiçin uygulanabilir.Antikor üzerindeki nükleofilik gruplar, bunlarla sinirli kalmaksizin, örnegin sistein gibi yan zincir tiyol gruplariiii kapsar. Tiyol gruplari nükleofiliktir ve bu bulusa konu olanlar gibi baglayici moiyeteleri üzerindeki elektrofilik gruplarla reaksiyona girerek kovalent baglarolusturabilirler. Belirli antikorlar, indirgenebilir zincirler-arasi64disülfûrlere, yani sistein köprülerine sahiptirler. Antikorlar, örnegin DTT (Cleland reaktifi, ditiyotreitol) ya da TCEP (tris(2- karboksietil)fosfin hidroklorür; Getz et al (1999) Anal. Biochem. Vol 273273-80; Soltec Ventures, Beverly, MA) gibi bir indirgeyici ajanla islem yoluyla baglayici reaktifleriyle konjugasyon için reaktif hâle getirilebilirler. Sonuçta, her sistein disülfur köprüsü, teorik olarak, iki reaktif tiyol nükleofilleri olusturacaktir. Bir aminin bir tiyole dönüsmesine yol açan lizinlerin 2-iminotiyolanla (Traut reaktifi)reaksiyonu yoluyla antikorlara ilave nükleofilik gruplari sokulabilir.Denek/HastaDemek/hasta bir hayvan, memeli, plasentali meineli, keseli hayvan (örnegin, kanguru, vombat), inonotrem (ömegin, ornito renk), kemirgen (Örnegin, gine doinuzu, hamster, siçan, fare), murin (örnegin, fare), lagomorf (örnegin, tavsan), avian (örnegin, kus), kanin (örnegin, köpek), felin (örnegin, kedi), ekuin (örnegin, at), porsin (örnegin, domuz), ovin (örnegin, koyun), bovin (örnegin, inek), primat, siinian (örnegin, maymun ya da insansi maymun), maymun (örnegin, marmoset, babun), insansi maymun (örnegin, goril,sempanze, orangutan, jibon) ya da insan olabilir.Ek olarak, denek/hasta, gelisiminin herhangi bir evresinde, örnegin bir fetus olabilir. Bu bulusun tercih edilen bir yapisinda, denek/hasta birinsandir.65ÜNLHCTGenel Çalisma YöntemleriOptik rotasyonlar, bir ADP 220 polarimetrede (Bellingham Stanley Ltd.) ölçüldû ve konsantrasyonlar (e) g/ 100 mL cinsinden verildi. Eriine noktalari, bir dijital erime noktasi aparati (Electrotherinal) kullanilarak ölçüldü. IR Spektrumlari bir Perkin-Elmer Spektrum 1000 FT IR Spektrometresinde kaydedildi. 1H ve '3C NMR spektruinlari, sirasiyla 400 ve 100 MHz°de bir Bruker Avance NMR spektrometresi kullanilarak 300 K"de elde edildi. Kimyasal kaymalar, TMS"ye (5 = 0,0 ppm) göre rapor edilmektedir ve sinyaller, s (singlet), d (dublet), t (triplet), dt (duble triplet), dd (dubletlerin dubleti), ddd (dubletlerin dubletinin dubleti) ya da 111 (inultiplet) olarak adlandirilir; kuplajlaina sabitleri ise Hertz (Hz) birimiyle verilir. Kütle spektroskopisi (MS) verileri, Waters 2996 PDA donanimli bir Waters 2695 HPLC sistemine bagli bir Waters Microinass ZQ cihazi kullanilarak t0p1andi. Asagida açiklanan Waters Microinass ZQ parametreleri kullanildi: Kapiler (kV), 3,38; Koni (H), 35; Ekstraktör (H), 3,0; Kaynak sicaklik (OC), 100; Desolvasyon Sicakligi (°C), 200; Koni akis hizi (L/saat), 50; Desolvasyon akis hizi (L/saat), 250. Yüksek rezolüsyonlu kütle spektroskopisi (HRMS) verileri, nuinuneleri cihaza sokmak için metal-kapli borosilikat cam çubuklar kullanilarak, pozitif W-modunda bir Waters Microinass QTOF Global cihazinda kaydedildi. Ince Tabaka Kromatografisi (TLC), silika jel alüminyum plakalarda (Merck 60, Fm) gerçeklestirildi; flas kromatografide ise silika jel (Merck 60, 230-400 mesh ASTM) kullanildi. HOBt (NovaBiochem)ve kati-destekli reaktifler (Argonaut) hariç, diger tüm kimyasallar ve66çözücüler, Sigma-Aldrich firmasindan satin alindi ve ilave saflastirma basamaklarina tâbi tutulmadaii tedarik edildigi haliyle kullanildi. Anhidr çözücüler, uygun bir kurutma ajaninin varliginda bir kuru nitrojen atmosferi altinda distilasyonla hazirlandi ve 4A moleküler elekler ya da sodyum tel üzerinde saklandi. Petrol eteri, 40-60°C sicaklikta kaynayan fraksiyona atif yapar.Genel LC/MS kosullari:Yöntem l (varsayilan yöntem, aksi ifade edilmedikçe kullanilir)HPLC (Waters Alliance 2695); su (A) (formik asit %0, 1) ve asetonitril (B) (forniik asit %0,l) mobil fazi kullanilarak çalistirildi. Gradiyent: baslangiç bilesimi %5 B 1,0 dakika boyunca tutuldu ve ardindan, 3 dakika içinde %5 B°den %95 B°ye yükseltildi. Bilesim, %95 B°de 0,1 dakika süreyle tutuldu; ardindan, 0,03 dakika içinde %5 Bsye geri döndürüldü ve orada 0,87 dakika süreyle tutuldu. T0plam gradiyentçevrim süresi 5 dakikaya tekabül etmektedir.Yöntem 2HPLC (Waters Alliance 2695), su (A) (formik asit %0,1) ve asetonitril (B) (formik asit %0,1) mobil fazi kullanilarak çalistirildi. Gradiyent: baslangiç bilesimi %5 B 1,0 dakika boyunca tutuldu ve ardindan, 2,5 dakikada %5 B"den %95 B"ye yükseltildi. Bilesim, %95 B"de 0,5 dakika süreyle tutuldu; ardindan, 0,1 dakikada %5 B"ye geri döndürüldü ve orada 0,9 dakika süreyle tutuldu. Toplam gradiyeiitçevrim süresi 5 dakikaya tekabül etmektedir.67Her iki yöntem için3,0 mL/dakika akis hiziyla, 400 uL, kütle spektrometresine geçen bir sifir `Ölü hacim T parçasiyla bölünmüstür. Dalgaboyu belirleme araligi: 220 ilâ 400 nm. Fonksiyon tipi: diyot dizisi (535 tarama). Kolon: Phenomenex Oniks Monolitik C18 50 x 4,60 mm.Ters faz flas saflastirma kosullari söyleydi: Flas saflastirma sistemi (Varian 971-Fp); su (A) ve asetonitril (B) mobil fazi kullanilarak çalistirildi. Gradiyent: baslangiç bilesimi %5 B 20 C.V.,niii (Kolon Hacmi) üzerindeydi; ardindan, %5 B ilâ %70 B 60 CV. araligindaydi. Bu bilesim 15 CV. süreyle %95 B°de tutuldu ve ardindan, 5 CV. içinde %5 B"ye geri döndürüldü ve 10 C.V. süreyle %5 B°de tutuldu. Toplam gradiyent çevrim süresi 120 C.V.°ye tekabül etmektedir. Akis hizi 6,0 mL/dk°dir. Dalgaboyu tespit araligi: 254 nm. Kolon: Agilent AXl372-1 SF10-5.5gC8.Preparatif HPLC: Asagida verilen boyutlarda Fenomenex Gemini NX u C-18 kolonlarda, ters-faz ultra-yüksek-performansli siVi kromatografisi (UPLC) gerçeklestirildi: analiz için 150 x 4,6 mm ve preparatif çalisma için 150 x 21,20 mm. UPLC çalismalariniii hepsi, gradiyent kosullariyla gerçeklestirildi. Kullanilan elüe ediciler, çözücü A (%0,l Forinik asitle HZO) ve çözücü Baydi (%0,1 Formik asitle CH3CN). Kullanilan akis hizlari, analitik olanlar için 1,0 ml/dakika ve preparatif HPLC için 20,0 ml/dakikaydi. 254 ve 280 nm"de belirleme yapildi.68Ara Ürün 12'riin Sentezlenmesi,. ,l I , L,,I 1 t - 'ii (- *$- , i-. . \_. 's ... . __` h I I T 1 r i w ..1 IT ,L _' r v::.. .ri . 5:.. _n _f i _ r 1 1 0 I v IK . | 4:', -["›..-'[ I ,i › ~ I 'f' , _l t \ i' "ö -6 . **7- ._ - _ *1 4 l I I 1 * _° ""I _ l: 1 '4 ' _ `-. _ | L: _w 1 .. 4; '~.`_ .i L `I ß' \ l .. 1 , .` "\ i I" .- ,I Z__ ` .4,2 `_ Q› 4 " Ü " I ::4, ' ,.:j : i [ L' 3 'I, \ "luk, , ` -ç" 4 -4 P. 01-.(a) 1',3'-Bis[2-metoksi-4-(metoksikarboni1)ferioksi]propan (3)Tepegöz karistiricida karistirilmis, bir anhidr THF (800 mL) içerisinde metil vanilat 2 (60,0 g, 329 mmol) ve Ph3P (129.4 g, 494 mmol) çözeltisine diizopropil azodikarboksilat (71,3 mL, 73,2 g, 362 mmol),0-5°C (buz/aseton) sicaklikta, 60 dakika süreyle ve bir nitrojen atmosferi altinda damla damla ilave edildi. Reaksiyon karisimi, 0-5°C sicaklikta 1 saat daha karismaya birakildi; ardindan, THF (12 mL) içinde 1,3-pr0pandi01 (11,4 mL, 12,0 g, 158 mmol) çözeltisi 20 dakika süreyle damla damla ilave edildi. Reaksiyon karisimi, oda sicakligina ulasana kadar isinmaya birakildi ve 5 gün boyunca karistirildi. Elde edilen beyaz renkte çökelti 3 vakumlu filtrasyonla toplandi, THF ile yikandi ve sabit agirliga ulasana kadar bir vakumlu desikatördekurutuldu. Verim = 54,7 g (1,3-propandiol bazinda %84). LC/MS°ye69göre tatmin edici saflik (3,20 dakika (ES+) m/Z (bagil yogunluk) 427 ([M + Na]+', 10); 1H NMR (400 MHZ, CDC13) 5 7,64 (dd, 2H, J = 1,8, 8,3 Hz), 7,54 ((1, 2H, J = 1,8 Hz), 6,93 ((1, 2H, J = 8,5 Hz), 4,30 (t, 4H, J : 6,1 Hz), 3,90 (s, 6H), 3,89 (s, 6H), 2,40 (p, 2H, J : 6,0 Hz).(b) l',3'-Bis[2-metoksi-4-(metoksikarboni1)-5-nitrofenoksi] propan (4)Tepegöz karistiriciyla karistirilmis, bir asetik anhidrit (650 mL) içinde bis-ester 3 (54,7 g, 135 mmol) bulamacina kati Cu(NO3)2.3H20 (81,5 g, 337,5 mmol) 0-5°C (buz/aseton) sicaklikta yavas yavas ilave edildi. Reaksiyon karisimi, 0-5°C sicaklikta 1 saat süreyle karismaya birakildi ve ardindan, oda sicakligina ulasana kadar isinmaya birakildi. Bu asamada, karisimin koyulasmasinin ve N02 evol'i'isyonunun eslik ettigi hafif bir ekzoterm (ca. 40-50°C) gözlemlendi. Ilave asetik anhidrit (300 mL) ilave edildi ve reaksiyon karisimi oda sicakliginda 16 saat süreyle karismaya birakildi. Reaksiyon karisimi, buz (~ 1,5 L) üzerine döküldü, karistirildi ve tekrar Oda sicakligina ulasmasi saglandi. Elde edilen sari renkte çökelti vakumlu filtrasyonla toplandi, bir desikatörde kurutuldu ve sari renkte kati formunda arzu edilen bis- nitro bilesigi 4 elde edildi. Verim = 66,7 g (%100). LC/MS"ye göre tatmin edici saflik (3,25 dakika (ES+) ni/z (bagil yogunluk) 517 ([M + Na]+°, 40); 1H NMR (400 MHZ, CDC13) 8 7,49 (s, 2H_), 7,06 (s, 2H), 4,32 (t, 4H, J = 6,0 Hz), 3,95 (s, 6H), 3,90 (s, 6H), 2,45-2,40 (m, 2H).(c) 1',3'-Bis(4-karb0ksi-2-metoksi-5-nitrofenoksi) propan (5)THF (700 mL) içinde metil ester 4 (66,7 g, 135 mmol) bulamaci, 1 N70NaOH (700 mL) ile isleme sokuldu ve reaksiyon karisimi oda sicakliginda kuvvetli sekilde karismaya birakildi. 4 gün karistirildiktan sonra, bu bulamacin rengi koyulasarak koyu renkli bir çözelti haline geldi ve ardindan, THF'yi çikartinak için indirgenmis basinç altinda döner evoparasyona tâbi tutuldu. Elde edilen aköz artik, pH derecesi 1 olana kadar konsantre HCl ile asitlendi ve renksiz çökelti 5 toplandi ve bir vakumlu etüvde (50 0C) tamamen kurutuldu. Verim = 54,5 g (%87). LC/MS3ye göre tatmin edici saflik (2,65 min (ES+) ni/z (bagil yogunluk) 489 ([M+ Na]+', 30)); ]H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 5 7,62 (s, 2H), 7,30 (s, 2H), 4,29 (t, 4H,J = 6,0 Hz), 3,85 (s, 6H), 2,30- 2,26 (in, 2H).((1) 1,1'-[ [ (Propan-l ,3 -diil)dioksi] bis[ (5-metoksi-2-nitro- l ,4- fenilen)karbonil] ] bis[ (2 S,4R)-metil-4-hidr0ksipirrolidin-2- karboksilat] (6)Anhidr DCM (600mL) içinde nitrobenzoik asit 5 (43 g, 92,3 mmol) ve DMF°den (6 mL) olusan karistirilmis bir süspansiyona oksalil klorür (24,5 mL, 35,6 g, 281 mmol) ilave edildi. Baslangiçta köpürdükten sonra, reaksiyon süspansiyonu bir çözelti haline geldi ve bu karisim oda sicakliginda 16 saat süreyle karisinaya birakildi. Reaksiyon karisimindan alinan bir nuinunenin MeOH ile isleme tâbi tutulinasiyla asit klorüre dönüstügü dogrulanmis oldu ve elde edilen bis-metil ester LC/MS ile gözlemlendi. Çözücünün büyük bir kismi indirgenmisbasinç altinda evoparasyonla çikartildi; elde edilen konsantre çözelti,71minimum miktarda kuru DCM içinde tekrar çözündürüldü ve dietil eterle trit'ure edildi. Elde edilen sari renkte çökelti filtrasyonla toplandi, soguk dietil eterle yikandi ve 40°C°de bir vakumlu etüv içerisinde 1 saat süreyle kurutuldu. Kati asit klori'ir, 40°Csde DCM (400mL) - (kuru buz/CH3CN) içindeki (2S,4R)-metil-4- hidroksipirrolidin-Z-karboksilat hidroklorür (38,1 g, 210 mmol) ve TEA"dan (64,5 mL, g, 463 mmol) olusan karistirilmis bir sü5pansiyona 25 dakika süreyle alikotlar halinde ilave edildi. Hemen ardindan, LC/MS (2,47 dakika (ES+) iri/z (bagil yogunluk) 721 ([M + H]+`, 100) ile yapilan degerlendirmeye göre, bu reaksiyon tamamlanmis oldu. Turuncu renkte bir kati formunda saf 'ürün 6 (66,7 g, %100) elde etmek amaciyla, bu karisim DCM (200 mL) ile seyreltildi ve lN HCl (300 mL) ile yikandi, NaHCO3 (300 mL) ve brin (400 mL) ile satüre edildi, kurutuldu (MgSO4), filtrelendi ve çözücü vakumda buharlastirildi. [00% = -46,1° (c = 0,47, CHC13); 'H NMR (400 MHZ, CDC13) (rotamerler) 6 7,63 (s, 2H), 6,82 (s, 2H), 4,79-4,72 (m, 2H), 4,49-4,28 (m, 6H), 3,96 (s, 6H), 3,79 (s, 6H), 3,46- 3,38 (m, 2H), 3,02 (d, 2H, J : 11,1 Hz), 2,48-2,30 (m, 4H), 2,29-2,04 (m, 411);13C NMR (100 MHz, CDC13) (rotamerler) ö 172,4, 166,7, 154,6, 148,4, 137,2, 127,0, 109,7, 108,2, 69,7, 65,1, 57,4, 57,0, 56,7, 52,4, 37,8, 29,0; IR (ATR, CHC13) 3410 (br), 3010, 2953, 1741, 1622, 1577, 1519, 1455, 1429, 1334, 1274, 1211, 1177, 1072, 1050, 1008, 871 cm'l; MS (ES+) m/z (bagil yogunluk) 721 ([M+ H]+', 47), 388 (80); HRMS [M+ H]+'teorik C31H36N4016 m/z 721,2199, bulunan (Es+) m/z 721,2227.72(e) 1, 1 '-[[(Pr0pan-1,3-diil)dioksi]bis(11aS,2R)-2-(hidr0ksi)-7- metoksi-l, 2, 3, 10, 11, l1a-heksahidro-5H-pirr010[2,1-c][1,4]- benzodiazepin-5,l l-dion] (7)Yöntem A: MeOH (2,8 L) içinde bir nitro-ester 6 (44 g, 61,1 mmol) çözeltisi; 5L hacimli, 3-boyunlu, yuvarlak tabanli kap içindeki yeni satin alinmis Raney® nikel (HzO içinde bir ~ %50 bulamacin ~ 50 grami) ve kabarcik önleyici granüllere ilave edildi. Bu karisim, isitilarak geri akisa tâbi tutuldu ve ardindan, MeOH (200 mL) içerisinde bir hidrazin hidrat çözeltisiyle (21,6 mL, 22,2 g, 693 inmol) damla damla isleme tâbi tutuldu; bu noktada, kuvvetli bir köpürme gözlemlendi. Bu ekleme islemi tamamlandiginda (~ 45 dakika), köpürme durdurulana kadar ilave Raney® nikeli eklendi ve baslangiçta gözleinlenen sari renkte reaksiyon karisimi bosaltildi. Bu karisim isitilarak 5 dakika daha geri akisa tâbi tutuldu; bu noktada, TLC (90:10 h/h CHCl3/MeOH) ve LC/MS (2,12 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 597 ([M+ H]+›, 100)) ile yapilan gözlemlere göre, reaksiyon tamamlanmis kabul edildi. Bu reaksiyon karisimi, hemen, vakumlu einisle donatilmis Celite içeren bir sinter hunisinden geçirilerek sicak olarak filtrelendi. Vakum içerisinde evoparasyonla filtratin hacmi düsürüldü; bu noktada, filtrasyonla toplanan ve bir vakum desikatörde kurutulan renksiz bir çökelti olustu ve bunun sonucunda 7(31 g, %85) elde edildi. [01121,: +4040 (0: 0,10, DMF); lH NMR (400 MHZ, DMSO-dö) 6 10,2 (3, 2H, NH), 7,26 (s, 2H), 6,73 (s, 2H), 5,11 (d, 2H, J = 3,98 Hz, OH), 4,32-4,27 (m, 2H), 4,19-4,07 (m, 6H), 3,78 (s, 6H), 3,62 (dd, 2H,J= 12,1, 3,60 Hz), 3,43 (dd, 2H, J : 12,0, 4,72 Hz), 2,67-2,57 (m, 2H), 2,26 (p, 2H, J :735,90 Hz), 1,99-1,89 (m, 2H);13C NMR (100 MHz, DMSO-dö) b 169,1, 164,0, 149,9, 144,5, 129,8, 117,1, 111,3, 104,5, 54,8, 54,4, 53,1, 33,5, 27,5; IR (ATR, saf) 3438, 1680, 1654, 1610, 1605, 1516, 1490, 1434, 1379, 1263, 1234, 1216, 1177, 1156, 1115, 1089, 1038, 1018, 952, 870 cm'l; MS (ES+)n1/z(bagil yogunluk) 619 ([M + Na]+', ), 597 ([M+ H]_', 52), 445 (12), 326 (11); HRMS [M+ H]+' teorik C29H32N4010 m/z 597,2191, bulunan (ES+) m/z 597,2205.Yöntem B: DMF (40 mL) içinde bir %10 Pd/C (7,5 g, %10 a/a) süspansiyonu, DMF (360 mL) içinde bir nitro-ester6(75 g, 104 mmol) çözeltisine ilave edildi. Bu süspansiyon, bir Parr hidrojenasyon aparati içinde 8 saat süreyle hidrojenlendi. Hidrojen alimi durduktan sonra, LC/MS ile reaksiyonun seyri izlendi. Kati Pd/C filtrasyonla çikartildi ve filtrat, 40°C sicaklikta ve vakuin altinda döner evoparasyonla (101nbar altinda) konsantre edildi ve DMF ve artik kömür izleri içeren koyu renkte bir yag elde edildi. Bu artik, bir su banyosu (döner evaporatör banyosu) `üzerinde, 40°C sicaklikta ve EtOH (500 mL) içinde digeste edildi ve elde edilen süspansiyon, açik renkte berrak bir filtrat elde etmek için, Celitesten geçirilerek filtrelendi ve etanolle (500 mL) yikandi. Hidrazin hidrat (10 mL, 321 mmol), bu çözeltiye ilave edildi ve reaksiyon karisimi, isitilarak geri akisa tâbi tutuldu. 20 dakika sonra, beyaz renkte bir çökelti olustugu gözlemlendi ve geri akisin 30 dakika daha devam etmesi saglandi. Bu karisim oda sicakligina ulasana kadar soguinaya birakildi ve çökelti filtrasyonla geri kazanildi, dietil eterle (çökeltinin 2:] hacmi) yikandi ve bir vakuin desikatörde kurutuldu; bunun sonucunda, 7 (50 g, %81) elde edildi. Yöntem B için analitik veriler: Yöntem A için eldeedilenlere esdegerdir (optik rotasyon, lH NMR, LC/MS ve TLC).74(f) 1,1 '-[ [(Propan- 1 ,3-diil)di0ksi] bis( 1 1aS,2R)-2-(tert- bütildimetilsililoksi)-7-inetoksi-1,2,3,10,1 1,1 1 a-heksahidro-SH- pirrolo[2,1-c] [1,4]-benzodiazepin-5,1 l-dion] (8)Anhidr DMF (400 niL) içinde bulanik bir tetralaktam 7 (21,8 g, 36,6 mmol) çözeltisine, 0°C (buz/aseton) sicaklikta TBSCl (27,6 g, 182,9 mmol) ve iinidazol (29,9 g, 438,8 mmol) ilave edildi. Bu karisim, nitro jen atmosfer altinda 3 saat süreyle karismaya birakildi; ardindan, LC/MS (3,90 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 825 ([M + H]+', 100) ile yapilan degerlendirmeye göre, bu reaksiyon tamamlanmis kabul edildi. Bu reaksiyon karisimi, buz (~ 1,75 L) üzerine döküldü ve bir yandan karistirmak suretiyle oda sicakligina ulasana kadar isinmaya birakildi. Elde edilen beyaz renkte çökelti vakum filtrasyonla toplandi, HZO ve dietil eterle yikandi ve vakum desikatörde kurutuldu; bunun sonucunda, saf 8 (30,1 g, %99) elde edildi. [(11230 = +2340 (0 = 0,41, CHC13); lH NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,65 (s, 2H, NH), 7,44 (s, 2H), 6,54 (s, 2H), 4,50 (p, 2H, J = 5,38 Hz), 4,21-4,10 (m, 6H), 3,87 (s, 6H), 3,73-3,63 (m, 4H), 2,85-2,79 (m, 2H), 2,36-2,29 (m, 2H), 2,07- 1,99 (m, 2H), 0,86 (s, 18H), 0,08 (s, 12H); '3C NMR (100 MHZ, CDC13) ö 170,4, 165,7, 151,4, 146,6, 129,7, 118,9, 112,8, 105,3, 69,2, 65,4, 56,3, 55,7, 54,2, 35,2, 28,7, 25,7, 18,0, -4,82 ve -4,86; IR (ATR, CHC13) 3235, 2955, 2926, 2855, 1698, 1695, 1603, 1518, 1491, 1446, 1380, 1356, 1251, 1220, 1120, 1099, 1033 cin"; MS (ES+)1n/z (bagil yogunluk) 825 ([M+ H]+^, 62), 721 (14), 440 (38); HRMS [M+ H]+' teorik C41H,01\140105i2 m/z 825,392 1, bulunan (ES+) m/z 825,3948.75(g) 1,1 '-[ [(Propan- 1 ,3-diil)dioksi] bis( 1 1aS,2R)-2-(tert- büti1dimetilsililoksi)-7-inetoksi-l0-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)- l,2,3,10,l 1,1 1a-heksahidro-SH-pirrolo[2, 1 -c] [1,4]-benzodiazepin-5,1 1 -dion] (9)Bir n-BuLi (heksan içinde bir 1.6 M çözeltisinin 68,3 mL"si, 109 mmol) çözeltisi, anhidr THF (600 mL) içinde buluiian karistirilmis bir tetralaktam 8 (30,08 g, 36,4 mmol) süspansiyonuna -30°C (kuru buz/etilen glikol) sicaklikta, nitro jen atmosfer altinda ve damla damla ilave edildi. Bu reaksiyon karisimi, bu sicaklikta 1 saat süreyle karismaya birakildi (bu asamada kirmizimsi turuncu bir renktedir); bu noktada, anhidr THF (120 mL) içinde bir SEMCl (19,3 mL, 18,2 g, 109 inmol) çözeltisi damla damla ilave edildi. Bu reaksiyon karisimi, oda sicakligina ulasana kadar yavas yavas sogumaya birakildi ve nitro jen atmosfer altiiida 16 saat süreyle karistirildi. TLC (EtOAc) ve LC/MS (4,77 dakika (ES+) m/z(bag11 yogunluk) 1085 ([M+ H]+', 100) ile yapilan degerlendirineye göre, bu reaksiyon tamamlanmis kabul edildi. Vakum içinde evoparasyonla THF çikarildi ve elde edilen artik, EtOAc (750 mL) içinde çözündürüldü, HZO (250 mL) ve brin (250 mL) ile yikaiidi, kurutuldu (MgSO4), filtrelendi ve vakum içinde buharlastirildi; bunun sonucunda bir yag formunda ham N10- SEM-korumali tetralaktam 9 (maksm 39,5 g, %100) elde edildi. Urün, saflastirma yapilmadan bir sonraki basamaga tasindi. [OL]23D = +1630 (0 : 0,41, CHCl3); 1H NMR (400 MHZ, CDC13) 8 7,33 (s, 2H), 7,22 (s, 2H), 5,47 (d, 2H, J = 9,98 Hz), 4,68 ((1, 2H, J = 9,99 Hz), 4,57 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 4,29-4,l9 (m, 6H), 3,89 (s, 6H), 3,79-3,51 (m, 8H), 2,87-2,81 (m, 2H), 2,4] (p, 2H,] = 5,81 Hz), 2,03-1,9O (m, 2H), 1,02-0,81 (in, 22H), 0,09 (s, 12H), 0,01 (s, 18H); 13 C NMR (100 MHz,76CDC13)ö 170,0, 165,7, 151,2, 147,5, 133,8, 121,8, 111,6, 106,9, 78,1, 69,6, 67,1, 65,5, 56,6, 56,3, 53,7, 35,6, 30,0, 25,8, 18,4, 18,1, _1,24, - 4,73; IR (ATR, CHC13) 2951, 1685, 1640, 1606, 1517, 1462, 1433, 1360, 1247, 1127, 1065 cm", MS (ES+)m/z(bagil yogunluk) 1113 ([M+ Na]", 48), 1085 ([M+ H]+', 100), 1009 (5), 813 (6); HRMS [M + H]+4 teorik C53H88N4OIZSI4 m/z 1085,5548, buluiian (ES+) m/z 1085,5542.(h) 1 , l '-[[(Propan-l ,3-diil)dioksi] bis( l laS,2R)-2-hidroksi-7-met0ksi- -((2-(trimetilsilil)et0ksi)metil)-1,2,3,10,1 1,1 1 a-heksahidro-SH- pirr010[2,1-c] [1,4]-benzodiazepin-5,1 l-dion] (10)Bir TBAF (THF içinde bir 1.0 M çözeltisinin 150 mUsi, 150 mmol) çözeltisi, THF (800 mL) içinde bulunan karistirilmis bir ham bis-silil eter 9 [84,0 g (maksm 56,8 g), 52,4 mmol] çözeltisine oda sicakliginda ilave edildi. 1 saat karistirildiktan sonra, reaksiyon karisimi TLC (95:5 h/h CHCl3/MeOH) ile analiz edildi ve bunun sonucunda, reaksiyonun tamamlandigi görüldü. Oda sicakliginda ve indirgenmis basinç altinda evoparasyonla THF çikartildi ve elde edilen artik, EtOAc (500 mL) içinde çözündürüld'u ve NH4C1 (300 mL) ile yikandi. Ham ürün elde etmek amaciyla, birlestirilen organik tabakalar brin (60 mL) ile yikandi, kurutuldu (MgSO4), filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda buharlastirildi. Flas kromatografiyle saflastirma (gradiyent elüsyonu: %100 CHC13 ilâ 96:4 h/h CHCl3/MeOH) islemi sonucunda, beyaz renkte köpük formunda saf tetralaktam 10 (36,0 g, %79) elde edildi. LC/MS 3,33 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 879 ([M + Na]+', 100), 857 ([M + H]+', 40); [01]23 D = +202°(c = 0,34, CHC13); lH NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,28 (s, 2H), 7,20 (s, 2H), 5,44 (d, 2H,J = 10,0 Hz), 4,72 (d, 2H, J = 10,0 Hz), 4,61-4,58 (m, 2H), 4,25 (t, 4H, J = 5,8377Hz), 4,20-4,l6 (m, 2H), 3,91-3,85 (m, 8H), 3,77-3,54 (m, 6H), 3,01 (br s, 2H, OH), 296-290 (m, 2H), 2,38 (p, 2H, J = 5,77 Hz), 2,11- 2,05 (m, 2H), 1,00-0,91 (m, 4H), 0,00 (s, 18H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) 8 169,5, 165,9, 151,3, 147,4, 133,7, 121,5, 111,6, 106,9, 79,4, 69,3, 67,2, 65,2, 56,5, 56,2, 54,1, 35,2, 29,1, 18,4,-1,23; IR (ATR, CHC13) 2956, 1684, 1625, 1604, 1518, 1464, 1434, 1361, 1238, 1058, 1021 cm`l; MS (ES+) m/z(bag11 yogunluk) 885 ([M+29]+', 70), 857 ([M+ H]+', 100), 711 (8), 448 (17); HRMS [M+ HT› teorik C41H60N4012812 1n/z 857,3819, bulunan (ES+) in/Z 857,3826.(1) 1,1 '-[ [(Propan- 1 ,3-diil)dioksi] bis(1 1aS)-7-metoksi-2-okso-10-((2- (trimetilsilil)et0ksi)1netil)-1,2,3,10,l 1,1 1a-heksahidro-SH-pirrolo[2,1- C] [ 1,4] -benzodiazepin-5,1 l-dion] (1 1)D101 10 (25,6 g, 30 minol, 1 esdegeri), NaOAc (6,9 g, 84 mmol, 2,8 esdegeri) ve TEMPO (188 mg, 1,2 rninol, 0,04 esdegeri), DCM (326 mL) içinde Ar atmosferi altinda çözündi'irüldü. Bu, -8°C°ye (iç sicaklik) ulasana kadar sogutuldu ve alikotlar halinde TCCA (9,7 g, 42 mmol, 1,4 esdegeri) 15 dakika süreyle ilave edildi. 30 dakika sonra, TLC (EtOAc) ve LC/MS [3,60 dakika (ES+) ni/z(bagil yogunluk) 854,21 ([M + H]+', 40), (ES-) m/z (bagil yogunluk) 887,07 ([M - H + Cl]", 10)] ile yapilan degerlendirme, reaksiyonun tamamlanmis oldugunu gösterdi. Soguk DCM (200 mL) ilave edildi ve bu karisim bir Celit pedinden geçirmek suretiyle filtrelendi ve ardindan, doymus bir sodyum hidrojen karbonat / sodyum tiyosülfat (1 :1 h/h; 200 mL X 2) çözeltisiyle yikandi. Organik tabaka; MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve çözücü vakum içinde çikartildi; bunun sonucunda,Sari/turuncu renkte bir sünger (25,4 g, %99) elde edildi. LC/MS [3,6078dakika (ES+)m/Z(bagil yogunluk) 854,21 ([M + H]+`, 40); [d]2°D= +2910 (0 = 0,26, CHC13); 'H NMR (400 MHZ, CDC13) 8 7,32 (s, 2H), 7,25 (s, 2H), 5,50 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,75 (d, 2H, J = 10,1 Hz), 4,60 (dd, 2H, J : 9,85, 3,07 Hz), 4,31-4,18 (m, 6H), 3,89-3,84 (m, 8H), 3,78-3,62 (m, 4H), 3,55 (dd, 2H, J : 19,2, 2,85 Hz), 2,76 (dd, 2H, J : 19,2, 9,90 Hz), 2,42 (p, 2H, J = 5,77 Hz), O,98-0,91 (m, 4H), 0,00 (s, 18H);13C NMR (100 MHz, CDC13) ö 206,8, 168,8, 165,9, 151,8, 148,0, 133,9, 120,9, 111,6, 107,2, 78,2, 67,3, 65,6, 56,3, 54,9, 52,4, 37,4, 29,0, 18,4, _1,24; IR (ATR, CHC13) 2957, 1763, 1685, 1644, 1606, 1516, 1457, 1434, 1360, 1247, 1209, 1098, 1066, 1023 cm", MS (ES+) m/z (bagil yogunluk) 881 ([M+ 29]+', 38), 853 ([M+ H]+', 100), 707 (8), 542 (12); HRMS [M + Hr- teorik C41H56N4012812 in/z 853,3506, bulunan (ES+) in/z 853,3502.(j) 1,1 '-[[(Pr0paii-1 ,3-diil)dioksi]bis(1 1aS)-7-met0ksi-2- [[(triflorometil)sülfonil] oksi] -1O-((2-(trimetilsilil)etoksi)1netil)-1,10,1 1,1 1a-tetrahidro-SH-pirrolo[2, 1 -c] [ 1 ,4] -benzodiazepin-5,1 1- dion] (12)Anhidr 2,6-lutidin (5,15 inL, 4,74 g, 44,2 minol), kuvvetli karistirilan ve kuru DCM (180 niL) içinde bulunan bir bis-keton 11 (6,08 g, 7,1 mmol) çözeltisine -45°C (kuru buz/asetonitril) sicaklikta ve nitrojen atinosferi altinda, bir alikot halinde enjekte edildi. Bir yandan sicaklik 40°C"de ya da daha düsük bir sicaklikta tutulurken, diger yandan yeni açilmis bir ampülden alinan anhidr triflik anhidrit (7,2 inL, 12,08 g, 42,8 mmol) hizli sekilde damla damla enjekte edildi. Bu reaksiyonkarisimi, -45°C sicaklikta 1 saat süreyle karismaya birakildi; bu79noktada, TLC (50/50 h/h n-heksan/EtOAC), baslangiç malzemesinin tamamen tüketildigini gösterdi. Soguk reaksiyon karisimi, hemen DCM (200 mL) ile seyreltildi ve kuvvetlice çalkalanmak suretiyle su (1 x 100 mL), %5 sitrik asit çözeltisi (1 X 200 mL) doymus NaHCO3 (200 mL) ve brin (100 mL) ile yikandi ve kurutuldu (MgSO4). Çözücünün indirgenmis basinç altinda filtrelenmesi ve buharlastirilmasiyla, ham ürün elde edildi ve bu ürün, flas kolon kromatografisiyle (gradiyent elüsyonu: 90:10 h/h n-heksan/EtOAc to 70:30 h/h n-heksan/EtOAc) saflastirildi; bunun sonucunda, sari renkte köpük formunda bis-enol triflat 12 (5,5 g, %70) elde edildi. LC/MS 4,32 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1139 ([M+ Na]+', 20); [0124,, = +2710 (0 = 0,18, CHC13); lH NMR (400 MHZ, CDC13) 8 7,33 (s, 2H), 7,26 (s, 2H), 7,14 (t, 2H, J : 1,97 Hz), 5,51 ((1, 2H, J : 10,1 Hz), 4,76 (d, 2H, J : 10,1 Hz), 4,62 (dd, 2H, J: 11,0, 3,69 Hz), 4,32- 4,23 (m, 4H), 3,94-3,90 (m, 8H), 3,81-3,64 (m, 4H), 3,16 (ddd, 2H, J = 16,3, 11,0, 2,36 Hz), 2,43 (p, 2H, J = 5,85 Hz), 1,23-0,92 (m, 4H), 0,02 (s, 18H);13C NMR (100 MHz, CDC13) ö 167,1, 162,7, 151,9, 148,0, 138,4, 133,6, 120,2, 118,8, 111,9, 107,4, 78,6, 67,5, 65,6, 56,7, 56,3, 30,8, 29,0, 18,4, -1,25; IR (ATR, CHC13) 2958, 1690, 1646, 1605, 1517, 1456, 1428, 1360, 1327, 1207, 1136, 1096, 1060, 1022, 938, 913 cm`1; Ms (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1 144 ([M + 28]+', 100), 1117 ([M+ H]+', 48), 1041 (40), 578 (8); H RMS [M+ H]+`te0rik C43H54N40|681282F6 m/z 1117,2491, bulunan (ES+) m/zl 1 17,2465.80Örnek 1 f _( ' si:: v . i_4 ( J I - ."41 I | _, ( i . .--i.- . t i› ' '7- ~ 1 otu:: _~:._ 1 Il 0 l, l..-Ã."Ii.. ` . i-'n 1 l 1 i i# _ ~ 1 ` ._ '1 H , 1 ` _ .11, 1 '- - "îii::":~ i _ T w. _1; ' ~ ` _3' I i l.. ..1. 1..' L _ 1 Y .~ 1; ;1; 1 ,c, _ ..Jr-2,› '7' " i ` `0,` "Ir-'- i ` v __ - 1 NL.. , ki.. _4 ± `.__ "fiil" f ,4 -7 J` _- i 'h "r- .4. 2 '-I'- _1:_ f l i l 1. ..H.,_.:._ 1 1 1 i. l ;1(a) (8)-8-(3-(((S)-2-(4-aminofenil)-7-metoksi-S,1 l-diokso- 1 0-((2- (trimetilsilil)et0ksi)metil)-5,10,1 1,1 1 a-tetrahidro- `1 H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [1,4]diazepin-S-il)0ksi)propoksi)-7-met0ksi-5,1 1 -diokso-10-((2-(trimetilsilil)etoksi)11ietil`)-5,10,1 1,1 1 a-tetrahidro-1 H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [ 1 ,4 jdiazepin-Z-il triflorometansülfonat (13)Bis-enol triflat 12 (5,65 g, 5,06 11111101), 4-An1inofei1ilb010nik asit pinakol ester (1 g, 4,56 11111101), Na2C03 (2,46 g, 23,2 mmol), MeOH (37 mL), toluen (74 mL) ve sudan (37 mL) olusan karistirilmis bir karisima Pd(PPh3)4 (116,9 mg, 0,101 mmol) ilave edildi. Bu reaksiyonkarisimi, 30°C sicaklikta ve nitrojen atmosfer altinda 24 saat süreyle81karismaya birakildi; bu süre sonunda, boronik esterin tamami tüketilmisti. Ardindan, reaksiyon karisimi kuruyana kadar buharlastirildi; daha sonra, bu artik EtOAc (150 mL) içerisine alindi, HZO (2 X 100 mL) ve brin (150 mL) ile yikindi, kurutuldu (MgSO4), filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda buharlastirildi; bunun sonucunda, ham ürün elde edildi. Flas kromatografiyle (gradiyent elüsyonu: 80:20 h/h Heksan/EtOAc ilâ 60:40 h/h Heksan/EtOAC) saflastirma isleminden sonra, sarimsi köpük formunda ürün 13 (2,4 g, %45) elde edildi. LC/MS 4,02 dakika (ES+) m/z(bag11 yogunluk) 1060,21 ([ivi+ H]+', 100); lH-NMR: (CDCI3, 400 MHz) 6 7,40 (S, in), 7,33 (s, 1 H), 7,27 (bs, 3H), 7,24 ((1, 2H, J = 8,5 Hz), 7,15 (t, lH, J = 2,0 Hz), 6,66 (d, 2H,J = 8,5 Hz), 5,52 ((1, 2H,J = 10,0 Hz), 4,77 (d, lH, J : 10,0 Hz), 4,76 ((1, 1H,J : 10,0 Hz), 4,62 (dd, lH, J : 3,7, 11,0 Hz), 4,58 (dd, lH, J : 3,4, 10,6 Hz), 4,29 (t, 4H, J : 5,6 Hz), 4,00-3,85 (m, 8H), 3,80 - 3,60 (m, 4H), 3,16 (ddd, lH, J = 2,4, 11,0, 16,3 Hz), 3,11 (ddd, lH, J = 2,2, 10,5, 16,1 Hz), 2,43 (p, 2H, J = 5,9 Hz), 1,1-0,9 (m, 4H), 0,2 (5, 18H). 13C-NMR: (CDC13, 100 MHz) 5 169,8, 168,3, 164,0, 162,7, 153,3, 152,6, 149,28, 149,0, 147,6, 139,6, 134,8, 134,5, 127,9, 127,5, 125,1, 123,21, 121,5, 120,5, 120,1, 116,4, 113,2, 108,7, 79,8, 79,6, 68,7, 68,5, 67,0, 66,8, 58,8, 58,0, 57,6, 32,8, 32,0, 30,3, 19,7, 0,25.(b) (S)-2-(4-Aminofeni1)-8-(3-(((S)-2-siklopropil-7-metoksi-5,1 1- diokso-10-((2-(trimetilsi1i1)et0ksi)meti1)-5,10,1 1,1 la-tetrahidro- 1 H- benzo[e] pirr010[ 1,2-a] [ 1 ,4] diazepin-8-i1)0ksi)pr0p0ksi)-7-metoksi-l 0-((2-(trimetilsi1il)etoksi)metil)-1 l-l-benzo[e] pirrolo[ l ,2-a] [ 1,4] diazepi11-5,1 1(10H,1 1aH)-di0n (14)82Trifenilarsin (0,24 g, 0,8 mmol), gümüs (l) oksit (1,02 g, 4,4 mmol), siklopropilboronik asit (0,47 g, 5,5 minol) ve baslangiç malzemesi 13 (1,15 g, 1,1 mmol); argon atmosfer altinda dioksan (30 mL) içerisinde çözündürüldü. Potasyum fosfat tribasik (2,8 g, 13,2 mmol) bir havan ve tokinak kullanilarak ögütüldü ve hizli sekilde reaksiyon karisiinina ilave edildi. Bu reaksiyon karisimi bosaltildi, argonla 3 kez yikandi ve 71°C°ye ulasana kadar isitildi. Paladyum (II) bis (benzonitril klorür) (84 mg, 0,22 niinol) ilave edildi, reaksiyon küveti bosaltildi ve argonla 3 kez yikandi. 10 dakika sonra, TLC (80:20 h/h etil asetat/heksan) ve LC/MS ile analiz etmek için küçük bir numune alindi. 30 dakika sonra, bu reaksiyon tamamlanmis oldu (LC/MS analizi baslangiç malzemesinin tamamen tüketildigini gösterdi) ve bu reaksiyon, etil asetatla (400 mL) yikanmis Celite ve filtre pedinden geçirilerek filtrelendi. Bu filtrat, su (2 X 200 mL) ve brin (2 x 200 mL) ile yikandi. Organik tabaka; MgSO4 ile kurutuldu ve filtrelendi, çözücü vakum içinde çikartildi. Silika jel kolon kromatografisiyle (30:70 h/h Heksan/ Etil asetat) saflastirma islemi sonucunda, turuncumsu/sari renkte kati formda ürün 14 (0,66 g, %63) elde edildi. Yöntem 1, LC/MS (3,85 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 952,17 ([M + H]_', 100). 1H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,36 (d, 2H,] = 8,4 Hz), 7,30 (s, 1 H), 7,25 7 7,19 (m, 4H), 6,68 (s, 1 H), 6,62 ((1, 2H, J = 8,4 Hz), 5,49 (dd, 2H, J = 5,6, 10,0 Hz), 4,73 (app. t, 2H, J : 10,8 Hz), 4,54 (dd, 1 H, J : 3,2, 10,4 Hz), 4,40 (dd, lH, J= 3,2, 10,4 Hz), 4,29 - 4,23 (m, 4H), 3,91 - 3,85 (m, 7H), 3,80 - 3,71 (m, 2H), 3,70 7 3,61 (m, 2H), 3,38 7 3,32 (m, lH), 3,12 7 3,01 (m, 1 H), 2,50 7 2,69 (m, lH), 2,40 (q, 2H, J = 5,6 Hz), 1,50 7 1,43 (in, lH), 0,99 - 0,71 (m, 6H), 0,54 - 0,59 (m, 2H), 0,00 (s, 18H) ppm.83(c) (S)-2-(4-Aminofenil)-8-(3-(((S)-2-siklopropil-7-metoksi-5-okso- ,1 la-dihidro-lH-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8- i1)0ksi)pr0p0ksi)-7-metoksi- l H-benzo[ e] pirr010[ 1 ,2-a] [ 1,4] diazepin- (l laH)-0n (15)SEM dilaktam 14 (0,66 g, 0,69 mmol), THF (23 mL) içinde çözündürüldü ve argon atmosferi altinda -78°C,ye ulasana kadar sogutuldu. Bir yandan sicaklik takip edilirken, diger yandan Super- Hydride® çözeltisi (THF içinde 1,7 mL, 1 M) 5 dakika süreyle damla damla ilave edildi. 20 dakika sonra, LC/MS ile analiz etmek için küçük bir numune alindi ve suyla yikandi. Su (50 mL) ilave edildi ve soguk banyo çikartildi. Organik tabaka ekstrakte edildi ve brinle (60 mL) yikandi. Birlestirilmis aköz tabakalari CHZClz/MeOH (90/10 h/h) (2 x 50 mL) yikandi. Birlestirilmis organik tabakalar MgSO4 ile kurutuldu ve filtrelendi; çözücü vakum içinde çikartildi. Ham ürün; MeOH (48 mL), CH2C12 (18 mL) ve su (6 mL) içerisinde çözündürüldü ve yeterli miktarda silika jel ilave edildi; bunun sonucunda, yogun bir süspansiyon elde edildi. 5 gün karistirildiktan sonra, bu süspansiyon, ürünün elüe olmasi sonlana kadar, sinterlenmis bir huniden geçirilerek filtrelendi ve CHzClz/MeOH (9: 1) (~ 200 mL) ile yikandi. Organik tabaka; brin (2 x 70 mL) ile yikandi, MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve çözücü vakum içinde çikartildi. Silika jel kolon kromatografisiyle (%100 CHC13 ilâ 96/4 h/h CHCl3/MeOH) yapilan saflastirma islemi sonucunda, sari renkte kati formda ürün 15 (302 mg, %66) elde edildi. Yöntem l, LC/MS (2,42 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 660,74 ([M + H]_', 30). ]H NMR (400 MHz, CDC13) 5 7,86 (d, lH, J = 3,6 Hz), 7,78 (d, lH, J = 3,6 Hz),847,58 - 7,44 (m, 311), 7,34 - 7,20 (m, 3H), 6,88 - 6,66 (m, 4H), 4,35 - 4,15 (m, 6H), 3,95 - 3,75 (m, 7H), 3,39 - 3,22 (m, lH), 3,14 - 3,04 (m, 1H), 2,93 - 2,85 (m, lH), 2,46 - 2,36 (m, 2H), 1,49 - 1,41 (m, lH), 0,80 - 0,72 (m, 2H), 0,58 - 0,51 (app. s, 2H) ppm.(d) Allil ((2S)- l -(((2S)- l -((4-(B-(3-((2-siklopropi1-7-metoksi-5-okso- ,1 la-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5-okso-5,l la-dihidro-l H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [1,4]diazepin-Z-il)fenil)amino)-1-0ks0propan-2-i1)amino)-3-metil-1-Oksobutan-2-i1)karbamat (16)Degaze edilmis ve argonla doldurulmus yuvarlak tabanli bir kapta, 9:] oraninda bir kuru CHzClz/MeOH (5 mL) karisimi içerisinde, HO-Ala- Val-allok (149,6 mg, 0,549 mmol) ve EEDQ (135,8 mg, 0,549 ininol) çözündür'ûldü. Bu kap alüminyum folyoyla sarildi ve baslangiç malzemesi 15 (302 mg, 0,457 mmol) ilave edilmeden önce, reaksiyon karisimi oda sicakliginda 1 saat süreyle karismaya birakildi. Bu reaksiyon karisimi 40 dakika daha oda sicakliginda karismaya birakildi ve ardindan, indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla uçucu inaddeler çikartildi (bu reaksiyondan sonra LC/MS ile analiz yapildi, RT baslangiç malzemesi 2,32 dakika, (ES+ 660,29 ([M+H]+',100)). %42 verimde (174 mg) saf ürün (16) elde etmek için, ham ürün, silika jel kromatografi kolonuyla (%100 CHC13 ilâ 90/10 h/h CHCl3/MeOH) dogrudan dogruya saflastirildi. Yöntem 2 LC/MS (2,70 dakika (ES+›) in/z (bagil yogunluk) 914,73 ([M+H]+', 60), 660,43 (60), 184,31 (100)).85(e) (2 S)-2-a1nin0-N-((ZS)-1 -((4-(8-(3-((2-siklopropil-7-met0ksi-5- oks0-5,1 1a-dihidro-1H-benzo[e]pirrolo[1,2-a] [1,4]diazepin-8- il)0ksi)prop0ksi)-7-metoksi-S -0kso-5 ,1 la-dihidro-l H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [ l ,4] diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan- 2-il)-3-1netilbütanarnid (17)Pirrolidin (41 uL, 0,21 minol) eklenmeden önce, baslangiç malzemesi 16 (170 mg, 0,185 mmol), argonla doldurulmus yuvarlak tabanli bir kapta bulunan kuru CH2C12 (5 mL) içerisinde çözündürüldü. Pd(PPh3)4 (14 mg, 0,084 mmol) eklenmeden önce, bu kap üç kez argonla temizlendi/tekrar dolduruldu ve yikaina operasyonu tekrar edildi. 1 saat sonra, baslangiç malzemesinin tamamen tüketildigi gözlemlendi (bu reaksiyondan sonra LC/MS ile analiz yapildi) ve EtZO (50 mL) reaksiyon karisimina ilave edildi ve reaksiyon karisimi, ürünün tamami çözeltide çökeltilene kadar karismaya birakildi. Bu kati, sinterlenmis bir huniden geçirilerek filtrelendi ve EtZO (2 x 25 mL) ile iki kez yikandi. Toplama kabi ikame edildi ve izole edilen kati CHCl3 (100 mL ya da ürünün tamami sinterlenmis huniden geçene kadar) içinde çözündürüldü. Ardindan, dogrudan dogruya bir sonraki basamakta kullanilan ham ürün 17 (168 mg) elde etmek için, indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla uçucu maddeler çikartildi. LC/MS yöntemi 2 (2,70 dakika (ES+) m/z(bag11 yogunluk) 830,27 ([M+H]+', 50), 660,13 (80), 171,15 (100)).86(f) N-((R)- 1 -(((S)- 1 -((4-((S)-8-(3 -(((S)-2-siklopr0pil-7-met0ksi-5-okso- ,1 la-dihidro-lH-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepiii-8- il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5 -okso-5 ,l la-dihidro-l H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [ l ,4] diazepin-2-il)fenil)amino)- l -oksopropan- 2-il)amino)-3-metil- l -oksobutan-Z-i1)-l -(3-(2,5-diokso-2,5-dihidr0- lH-pirrol-l-il)propanamido)-3,6,9,12,15,18,21,24- oktaoksaheptakosan-27-amid (18)Baslangiç malzemesi 17 (154 mg, 0,185 mmol) ve EDCl.HCl (110 mg, 0,185 mmol), argonla temizlenmis ve doldurulmus bir yuvarlak tabanli kapta bulunan kuru CHZCIZ (5 mL) içerisinde çözündürüldü. Bu karisim oda sicakliginda 1 saat süreyle karismaya birakildi; ardindan, PEGg-maleimid (35,6 mg, 0,185 mmol) eklendi ve bu reaksiyon karisimi, 16 saat daha (ya da LC/MS ile yapilan izlemeye göre, reaksiyon tamamlanana kadar) karistirildi. Bu. reaksiyon çözeltisi CHZCIZ (50 mL) ile seyreltildi ve organik inaddeler; HZO (50 mL) ve brin (50 mL) ile yikandi, MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla çözücü çikartildi; bunun sonucunda, ham ürün elde edildi. Silika jel kolon kromatografisi (%100 CHC13 ilâ 85/15 h/h CHCl3/MeOH) ile yapilan saflastirma sonunda istenen ürün (l35mg) elde edildi; bununla birlikte, reaksiyona girmeyen PEGg-maleimidden kalan izler (LC/MS, 2,21 dakika, yöntem 2 ile) gözlemlendi. Otomatik ters faz Silika jel kromatografisiyle (HZO/CH3CN) (kosullar için genel bilgilere bakiniz) safsizlik basariyla çikartildi ve bunun sonucunda saf nihai ürün (18, l 10 mg"dan itibaren 37 mg saf ürün, %33) elde edildi. Genel verim =%17. Yöntem 2 LC/MS (2,58 dakika (ES+)m/z (bagil yogunluk)871404,03 ([M+H]+', 20), 702,63 (100)). 1H NMR (400 MHZ, CDC13) 8 7,91 (t, J = 3,5 Hz, lH), 7,80 ((1, J = 4,0 Hz, 1H), 7,75 ((1, J = 8,8 Hz, lH), 7,69 (d, J = 8,7 HZ, 1 H), 7,54 - 7,50 (m, 2H), 7,45 (s, 1 H), 7,39 - 7,31 (in, 2H), 6,87 (d, J : 10,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1H), 6,72 - 6,68 (m, 2H), 4,74 - 4,62 (111, lH), 4,45 - 4,17 (m, 7H), 3,95 (S, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,67 - 3,58 (m, 34H), 3,54 (m, 2H), 3,42 (dd, J = 10,2, 5,2 Hz, 2H), 3,16 - 3,07 (m, lH), 2,92 (dd, J = 16,1, 4,1 Hz, 1H), 2,62 - 2,49 (in, 4H), 2,48 7 2,39 (111, 2H), 2,37 7 2,25 (in, lH), 1,92 (s, lH), 1,52 7 1,44 (m, 3H), 1,10 - 0,93 (in, 6H), 0,79 (dd, J : 9,2, 5,3 HZ, 2H), 0,57 (dd, J = 9,2, 5,3 HZ, 2H), NH gözlemlenmedi. 88Ornek 2 i 1 _".-<' › L . Y . ;4 ' L i ;i ;i- -~ _ - """""T .- * " T T ' T \--` I 1 ' L 1 '-4-' ` . i r › 4 '\ ..s-'f' i 7`- , u ;F'ou :::-x _7 w 1' - l'_ __L'.;____v "10: ' ' *" ii «.:ii ':'.^ `P- "-.o°" _ _ _ -._` . I 34. . -s ,. _..r,. A 3 I L, î, "' i bi ' '1 "T ._ "u" .va- ' ' i ' ` 4 53`" ' L '1. 1 .. 1 - .1 .6 I :I I ' ' ' 'P' .i 4-4" .7 ^ tv (1:. _9; i "dmc- ' «~ .s' "'1 i __I -Li ' i1 . i -'-. l ., fî- , , "u/v. -l -. _. . f 1, ;v w 5 _ --- 0-- "e' ' `[0 Ü _L________w ___ _1. ___.;_ " › I T u ~_ :5-- (_ i-* ` o' -_:='~- '"55' i r" 1 'I m 2:31* %1_ , 'l '7 _ _ _ `r › -._ 43?" v': `_ \ I I; _.›. _ ,A` _ 1:` __ _-L S J`- I( I T :' 'l' i- -.- ._ _.. "In .. é» ; 1' : !1 .2/-›. a ..J-2,, "-«' ' " " "" "i- "›._`:».A_ 5.:: "7 f' L L J I '5: l i i "r" I I . . _1 ":51" "Ah, z If., - T-::J- 1 T" "A '1 l I( I T' '(a) (R)-2-((R)-2-((((9H-f10ren-9-il)met0ksi)karb0ni1)amin0)-3-metilbutanamido) propanoik asit (20b)HO-Ala-Val-H 2021 (350 mg, 1,86 mmol) ve Na2C03 (493 mg, 4,6589minol), damitilmis HZO (15 mL) içerisinde çözündürüldü ve bu karisim, 0°C'ye ulasana kadar sogutuldu; ardindan, dioksan (15 mL) ilave edildi (kismi ainino asit tuzu çökelmesi meydana geldi). Dioksan (15 mL) içinde Fmoc-Cl (504 mg, 1,95 inmol) çözeltisi, 10 dakika boyunca kuvvetli karistirilarak damla damla ilave edildi. Elde edilen karisim 0°C sicaklikta 2 saat süreyle karistirildi; ardindan, buz banyosu çikartildi ve 16 saat daha karistirildi. Indirgenmis basinç altinda döner ev0parasyonla çözücü çikartildi ve bu artik, su (150 mL) içerisinde çözündürüldü. 1 N HCl ile pH derecesi 9°dan 2°ye ayarlandi ve sonra, EtOAc (3x100 mL) ile aköz tabaka ekstrakte edildi. Birlestirilen organik maddeler brinle yikandi (100 mL), MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla uçucu maddeler çikartildi; bunun sonucunda, saf HO- Ala-Val-Fmoc 20b (746 mg, %97 verim) elde edildi. LC/MS 2,85 dakika (ES+)1n/z(bagil yogunluk) 410,60; lH-NMR (400 MHZ, CDC13) 5 7,79 ((1, J=7,77 Hz, 2H), 7,60(d, J=7,77 Hz, 2H), 7,43(d, J=7,5 Hz, 2H), 7,34 ((1, J=7,5 Hz, 2H), 6,30 (bs, lH), 5,30 (bs, lH), 4,71-7,56 (m, lH), 4,54-4,36 (m, 2H), 4,08-3,9l (m, lH), 2,21- 2,07 (m, lH), 1,50 (d, `1:7,1 Hz, 31-1), '1,06-0,90 (m, 6H).(b) (9H-floren-9-il)meti1 ((S)-3-metil-1-okso-l-(((S)-1-okso-1-((4- (4,4,5,5-tetrameti1-l,3,2-di0ksaborolan-2-il)fenil)ainino)propan-2- il)amino)butan-2-il)karbamat (20)Önceden oda sicakliginda ve 30 dakika süreyle argonla yikanmis bir kapta bulunan karistirilmis kuru DCM (8 mL) içinde HO-Ala-Val- Fmoc 20b (330 mg, 0,8 minol), DCC (166 mg, 0,8 inmol) ve DMAP(5 mg, cat.) çözeltisine 4-Aminofenilboronik asit pinakol ester (146,990mg, 0,67 mmol) ilave edildi. Ardindan, bu reaksiyon karisimi, oda sicakliginda bir gece boyunca karismaya birakildi. Reaksiyon LCMS ve TLC yöntemleriyle izlendi. Reaksiyon karisimi CH2C12 ile seyreltildi ve organik maddeler HZO ve brin ile yikandi; ardindan, MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla çözücü çikartildi. Ham ürün bir silika jel kromatografi kolonu (Heksan/EtOAC, 6:4) üzerine kuru olarak yüklendi ve %88 verimde (360 mg) beyaz renkte bir kati formunda saf ürün 20 izoleedildi.(0) 8-(3-((2-(4-((S)-2-((S)-2-((((9H-f10ren-9- il)metoksi)karbonil)amin0)-3-metilbutanamido)pr0panamid0)fenil)-7- metoksi-5,1 1-diokso-lO-((2-(trimetilsilil)et0ksi)metil)-5,10,1 1,1 la- tetrahidro-l H-benzo[e] pirr010[ 1 ,2-a] [ 1,4] diazepin-8- il)0ksi)prop0ksi)-7-metoksi-S ,1 1-di0kso-10-((2- (trimetilsilil)et0ksi)metil)-5,10,1 1,1 la-tetrahidro-l H-benzo[e] pirrolo[ 1 ,2-a] [ 1 ,4] diazepin-Z-il triflorometansülfonat (21)Bis-triflat 12 (2,03g, 1,81 mmol), boronik pinakol ester (1 g, 1,63 mmol) ve Na2C03 (881 mg, 8,31 mmol); toluen/MeOH/HZO, 2:1:1 karisiminda (40 mL) çözündürüldü. Reaksiyon kabi argonla üç kez yikandi ve dolduruldu; ardindan, tetrakis(trifenilfosfin)paladyum(0) (41 mg, 0,035 mmol) eklendi ve reaksiyon karisimi gece boyunca °Csye ulasana kadar isitildi. Çözücüler indirgenmis basinç altinda çikartildi; bu artik, H20 (100 mL) içerisine alindi ve EtOAc (3 x 100 mL) ile ekstrakte edildi. Birlestirilen organik maddeler brinle yikandi(100 mL), MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç91altinda döner evoparasyonla uçucu maddeler çikartildi. %33 verimde (885 mg) saf 21 elde etmek için, ham ürün, silika jel kromatografi kolonuyla (Heksan/EtOAc, 8:2 ilâ 25:75) saflastirildi. LC/MS 3,85 dakika (ES+)m/z (bagil yogunluk) 1452,90 ;'H NMR (400 MHZ, CDC13) 6 7,78 - 7,16 (m, 17H), 7,13 (s, lH), 6,51 - 6,24 (m, 1 H), ,51 (dd, J= 10,0, 5,1 Hz, 2H), 5,36 - 5,11 (m, lH), 4,74 (dd, J = ,1, 4,4 Hz, 2H), 4,70 - 4,53 (m, 2H), 4,47 ((1, J = 6,4 Hz, 1 H), 4,37 ((1, J = 7,2 Hz, lH), 4,27 (m, 4H), 4,20 7 4,14 (m, lH), 3,90 (s, 3H), 3,89 (s, 3H), 3,77 (ddd, J : 16,7, 9,0, 6,4 Hz, 3H), 3,71 - 3,61 (m, 2H), 3,24 - 2,91 (m, 3H), 2,55 - 2,33 (m, 2H), 2,22 - 2,07 (m, lH), 1,52 - 1,37 (m, 3H), 1,04 - 0,86 (m, 10H), 0,00 (s, 18H).(d) (9H-f10ren-9-il)metil((2 8)- 1 -(((28)- 1 -((4-(8-(3-((2-siklopr0pil-7- metoksi-5, 1 1-diokso-l0-((2-(trimetilsilil)etoksi)metil)-5,10,1 1,1 la- tetrahidr0-1H-benzo[e]pirrolo[ 1,2-a] [ 1,4] diazepin-8- il)oksi)prop0ksi)-7-met0ksi-5 ,1 l-diokso-l 0-((2- (triinetilsilil)etoksi)meti1)-5, 1 0,1 1,1 la-tetrahidro-l H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [ 1 ,4] diazepin-Z-il)fenil)amino)-1-oksopropan-2-il)amin0)-3-meti1-1-oksobutan-Z-il)karbamat (22)Kuru dioksan (10 mL) içinde PBD-triflat21 (250 mg, 0,172 mmol), siklopropilboronik asit (73,9 mg, 0,86 mmol), gümüs oksit (159 mg, 0,688 mmol) ve potasyum fosfat tribazik (438 mg, 2,06 mmol) karisimina argon atmosferi altinda trifenilarsin (42 mg, 0,137 mmol) ilave edildi. Reaksiyon argonla 3 kez yikandi ve bis(benzonitri1)paladyum(lI) klori'ir (13,2 mg, 0,034 mmol) eklendi. Bu reaksiyon Argonla 3 kez daha yikandi; ardindan, 75°C"ye ulasana92kadar isitildi ve 10 dakika süreyle karistirildi. Bu reaksiyon karisimi bir Celite pedinden geçirilerek filtrelendi ve sonra, etil asetatla çalkalandi. Indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla çözücü çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine (silika jel; %1 metanol/kloroform) tâbi tutuldu. Saf fraksiyonlar toplandi ve bir araya getirildi ve fazlalik elüe edici indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla çikartilarak arzu edilen ürün 22 (132 mg, %50 verim) elde edildi. LC/MS 3,83 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1345,91 ; iH NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,88 - 7,14 (m, 17H), 6,69 (s, lH), 6,45 - 6,25 (m, lH), 5,57 - 5,41 (m, 2H), 5,34 - 5,14 (m, lH), 4,78 - 4,67 (m, 2H), 4,62 - 4,55 (m, lH), 4,50 _ 4,45 (m, 2H), 4,51 - 4,44 (m, 1 H), 4,31 7 4,21 (m, 4H), 4,16 (m, '1 H), 3,92 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,82 - 3,71 (m, 2H), 3,66 (m, 3H), 3,40 - 3,28 (ni, lH), 3,07 (m, lH), 2,70 - 2,57 (m, lH), 2,47 - 2,36 (m, 2H), 2,15 (m, 1 H), 1,51 - 1,40 (m, 3H), 1,03 - 0,87 (m, llH), 0,77 - 0,71 (m, 2H), 0,60 - 0,54 (m, 2H), 0,00 (t, J = 3,0 Hz, 18H).(e) (9H-f10ren-9-il)metil((2S)-1-(((ZS)-1-((4-(8-(3-((2-siklopropil-7- metoksi-5-0kso-5,1 la-dihidro-l H-benzo[e] pirrolo[ l ,2-a] [ 1,4] diazepin-8-i1)0ksi)propoksi)-7-metoksi-5-0kso-5,1 la-dihidro- lH-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [1,4]diazepin-2-il)fenil)amino)-1-oksopropan-Z-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (23)Bir Super-Hydride® (0,5 mL, THF içinde 1 M) çözeltisi, THF (10 mL) içinde SEM dilaktam 22 (265 mg g, 0,19 mmol) çözeltisine argon atmosferi altinda ve -78°C sicaklikta damla damla ilave edildi.Reaksiyon karisiminin iç sicakligini sabit tutmak için, ilave etme93islemi 5 dakika sonunda tamamlandi. 20 dakika sonra, LC/MS analizi için bir alikot söndürüldü; bu analiz reaksiyonun tamamlandigini gösterdi. Reaksiyon karisimina su (20 mL) ilave edildi ve soguk banyo çikartildi. Organik tabaka EtOAc (3 X 30 mL) ile ekstrakte edildi ve birlestiriliiiis organik inaddeler brinle yikandi (50 mL), MgSO4 ile kurutuldu, filtreleiidi ve indirgenmis basinç altiiida döner evoparasyonla çözücü çikartildi. Ham ürün; MeOH (12 mL), CHZCIZ (6 mL), su (2 mL) ve yogun bir karistirma sü3pansiyonu elde etmeye yetecek iniktarda silika jel içerisinde çözündürüldü. 5 gün sonra, bu süspansiyon, ürün elüsyonu tainamlanana kadar sinterlenmis bir huniden geçirilerek filtrelendi ve CHzClz/MeOH (931) (200 mL) ile yikandi. Organik tabaka brinle (2 x 70 mL) yikandi, MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgeiiniis basinç altiiida döner evoparasyonla çözücü çikartildi. Silika jel kolon kromatografisiyle (%100 CHCl3 ilâ %96 CHCl3/ %4 MeOH) saflastirma isleini sonucunda, sari renkte kati formda ürün 23 (162 mg, %78) eldeedildi. LC/MS 3,02 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1052,37.(f) (2 S)-2-ainino-N-((2 8)- l -((4-(8-(3-((2-siklopropil-7-metoksi-5-okso- ,1 la-dihidro-lH-benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)oksi)propoksi)-7-metoksi-5 -okso-5 ,l la-dihidro-l H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [ l ,4] diazepin-Z-il)fenil)amino)- l -oksopropan- 2-il)-3-metilbütanamid (17)Fazlalik piperidin (0,2 mL, 2 mmol), DMF (l mL) içinde SEM- dilaktam 23 (76 mg, 0,073 mmol) çözeltisine ilave edildi. Bu karisim oda sicakliginda 20 dakika süreyle karismaya birakildi; bu noktada,(LC/MS ile yapilan izlemeye göre) reaksiyoiiun tamamlanmis oldugu94görüldü. Reaksiyon karisimi, piperidinin tamami çikartilana kadar, CHZCIZ (75 n1L) ile seyreltildi ve organik faz, HZO (3x75 inL) ile yikandi. Organik faz MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgeninis basinç altinda döner evoparasyonla fazlalik çözücü çikartildi ve bunun sonucunda, bir sonraki basamakta kullanilacak olan ham ürün 17 elde edildi. LC/MS 2,32 dakika (ES+) m/z(bagil yogunluk) 830,00.(g) N-((ZS)-1-(((2 S)-1-((4-(8-(3-((2-siklopr0pil-7-met0ksi-5-okso- ,1 la-dihidro-lH-benzo[e]pirr010[1,2-a][1,4]diazepin-8- il)0ksi)prop0ksi)-7-metoksi-S -0ks0-5 ,1 1 a-dihidro-l H- benzo[e]pirr010[ 1,2-a] [ 1 ,4] diazepin-2-i1)fenil)aniin0)- 1 -oksopropan- 2-il)amin0)-3-metil-1-0ksobutan-2-il)-1-(3-(2,5-di0ks0-2,5-dihidr0-1 H-pirrol-l-il)pr0panainid0)-3,6,9,12,15,18,21,24- oktaoksaheptakosan-27-amid (1 8)EDCI hidroklorür (14 mg, 0,0732 minol), kuru CH2C12 (5 mL) içinde Maleimid-PEGg-asit süspansiyonuna (43,4 mg, 0,0732 mmol) argon atmosferi altinda ilave edildi. Bu karisim oda sicakliginda 1 saat süreyle karistirildi ve ardindan, PBD 17 (60,7 mg, 0,0732 mmol) ilave edildi. Reaksiyoii tamamlanana kadar karistirilmaya devam edildi (genellikle 5 saat). Bu reaksiyon, CH2C12 ile seyreltildi ve organik faz, HZO ve brinle yikandi; ardindan, MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla fazlalik çözücü çikartildi. Reaksiyona girmeyen maleiinid-PEGg-asidi çikartmak için, bu ürün, önce silika jel kromatografisiyle (%100CHClfden baslayip 9:1 CHCl3/MeOH"ye kadar yavas elüsyon) 95dikkatli sekilde saflastirildi ve ardindan, ters faz kromatografisine tâbi tutuldu. %17,6 verimde ürün 18 (21,8 mg) izole edildi. LC/MS 2,57 dakika (ES+) m/z(bagil yogunluk) l405,30 ;lH NMR (400 MHz, CDC13) 6 7,91 (t,J : 3,5 Hz, lH), 7,80 (d,J: 4,0 Hz, lH), 7,75 (d, J = 8,8 Hz, lH), 7,69 (d, J = 8,7 Hz, lH), 7,54 - 7,50 (in, 2H), 7,45 (s, 1 H), 7,39 - 7,31 (m, 2H), 6,87 (d, J = 10,5 Hz, 2H), 6,76 (s, lH), 6,72 - 6,68 (m, 2H), 4,74 - 4,62 (m, lH), 4,45 - 4,17 (m, 7H), 3,95 (s, 3H), 3,94 (s, 3H), 3,67 7 3,58 (m, 34H), 3,54 (m, 2H), 3,42 (dd, J = ,2, 5,2 Hz, 2H), 3,16 - 3,07 (m, lH), 2,92 (dd, J : 16,1, 4,1 Hz, lH), 2,62 - 2,49 (m, 4H), 2,48 - 2,39 (m, 2H), 2,37 - 2,25 (m, '1 H), 1,92 (s, lH), 1,52 - 1,44 (m, 3H), 1,10 - 0,93 (m, 6H), 0,79 (dd, J = 9,2, 5,3 HZ, 2H), 0,57 (dd, J = 9,2, 5,3 l-lz, 2H), NH gözlemlenmedi. 96Örnek 3 i_`;; : ! J; 1 y'- P L '-1' "sir .i ` ' ii'.' â›- ~›r `"1 -- , c "1 1,, __1 1 '1 ?(1 I l______L_ L .5, ` . .iv 1. r' .+1 ' 1 I II T ;.- .- L.. .i 1" &'11; i' " i _3- 3* `.. _ _ .' __6. ..51' . I -I' , :"I.. .| L, 1. Y_ 1 7- v; * * 'tr w -- _ -,- ` .-.,_.I 1 11.4... J..., 1 ~ .v I T (Lan)- 9_ "J 1- " .':î'îizî 1:"î'1î "i" 'L -.yi . I u. _. i." 9-" 57"' .I _` __ _LI ~ 4 1,__l i i k, - __J` - L 1' ,IL-41'›- .. ._ , - "2,9 'Ak iyi - _1; _ '.. ,LI _10.5_ »4/'1 8› - "r i o` ` .____v ~....J~›,..I 1 L L _- _. ` ' a n `i...`;i:i 1:` ':11' m i-*w '1,' ' " "r' ~ . --,.- s __i,,__i - I '21., J « .i" 1 r ' (a) (S)-7-met0ksi-8-(3-(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-meti1piperazin-1-5 i1)feni1)-5,1 1-diokso-10-((2-(trimetilsi1i1)etoksi)meti1)-5,10,1 1,1 la-tetrahidro- 1 H-pirr010[2, 1 -c] [ 1 ,4] benzodiazepin-S-il)0ksi)pr0p0ksi)- ,1 1 -diokso-10-((2-(trimetilsili1)et0ksi)ineti1_)-5,10,1 1,1 1 a-tetrahidro-1H-pirr010[2,1 -c] [ 1,4] benzodiazepin-2-il triflorometansülfonat (24)10 Bis-eno] trif1at 12 (500 mg, 0,44 mmol), N-metil piperazin boronik ester (100 mg, 0,4 mmol), Na2C03 (218 mg, 2,05 mmol), MeOH (2,5mL), toluen (5 mL) ve sudan (2,5 mL) olusan karistirilmis birkarisima Pd(PPh3)4 (20,6 mg, 0,018 mmol) ilave edildi. Reaksiyon97karisimi 30°C sicaklikta ve nitrojen atmosfer altinda 24 saat süreyle karismaya birakildi ve bunun sonucunda, boronik esterin tamami tüketilmis oldu. Ardindan, reaksiyon karisimi kuruyana kadar buharlastirildi; sonrasinda, bu artik, EtOAc (100 mL) içerisine alindi ve HZO (2 X 50 mL) ve brin (50 mL) ile yikandi, kurutuldu (MgSO4), filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda buharlastirildi; bunun sonucunda, ham ürün elde edildi. Flas kromatografisiyle (gradiyent elüsyonu: 80:20 h/h Heksan/EtOAc ilâ 60:40 h/h Heksan/EtOAc) sailastirma islemi sonucunda sari köpük formunda 24 (122,6 mg, %25) elde edildi.LC/MS 3,15 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1144 ([M+ H]+', %20).(b) (9H-floren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-l-((4-((S)-7-metoksi-8-(3-(((S)-7- inetoksi-Z-(4-(4-1netilpiperazin- 1-il)fenil)-5, 1 1-diokso-10-((2- (trimetilsilil)etoksi)ineti1)-5,10,1 1,1 la-tetrahidro-lH-pirrolo[2,1-c] [ 1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5,l 1 -diokso- 10-((2- (trimetilsilil)etoksi)meti1)-5,10,1 1,1 la-tetrahidro-l H-pirr010[2, l -c] [ 1,4]benzodiazepin-Z-il)feni1)amino)- l -oksopropan-Z-i1)amino)-3-metil- 1 -oksobutan-Z-il)karbamat (25)PBD-triflat 24 (359 mg, 0,314 mmol), boronik pinakol ester 20 (250 mg, 0,408 mmol) ve trietilamin (0,35 mL, 2,51 mm01); toluen/MeOH/HZO, 2:1:1 karisiminda (3 mL) çözündürüldü. Tetrakis(trifenilfosfin)paladyum(0) (21,7 mg, 0,018 minol) eklenmeden önce, mikrodalga küvet argonla 'üç kez yikandi vedolduruldu ve reaksiyon karisimi, 80°C sicakliktaki mikrodalga firina98yerlestirildi ve 10 dakika süreyle burada tutuldu. Bunun ardindan, CHZCIZ (100 mL) ilave edildi ve organik maddeler, su (2 X 50 mL) ve brin (50 mL) ile yikandi; ardindan, MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla uçucu maddeler çikartildi. Ham ürün silika jel kromatografi kolonuyla (CHClglMeOH, %100 ilâ 9:l) saflastirildi ve bunun sonucunda, saf 25 (200 mg, %43 verim) elde edildi. LC/MS 3,27 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1478 ([M + H]+", %100).(c) (9H-f10ren-9-il)metil ((S)-1 -(((S)-l -((4-((S)-7-met0ksi-8-(3-(((S)-7- metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin- l -il)fenil)-5-oks0-5 ,l la-dihidro- 1 H- pirrolo[2, l-c] [1,4]benzodiazepin-8-il)0ksi)pr0poksi)-5-okso-S,l la- dihidro- 1 H-pirr010[2,l -c] [ l ,4] benzodiazepin-2-il)fenil)amino)- l - 0ksopr0pan-2-il)amino)-3-metil-1 -0ksobutan-2-il)karba1nat (26)Super-Hydride® (0,34 mL, THF içinde 1 M) çözeltisi, THF (5 mL) içinde SEM-dilaktam 25 (200 mg, 0,135 mmol) çözeltisine -78°C sicaklikta ve argon atmosferi altinda damla damla ilave edildi. Reaksiyon karisiminin iç sicakligini sabit tutmak için, ilave etme islemi 5 dakika sonunda tamamlandi. 20 dakika sonra, LC/MS analizi için bir alikot söndürüldü; bu analiz reaksiyonun tamamlandigini gösterdi. Reaksiyon karisimina su (20 mL) ilave edildi ve soguk banyo çikartildi. Organik tabaka, EtOAc (3 x 30 mL) ile ekstrakte edildi ve birlestirilmis organik maddeler brinle yikandi (50 mL), MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla çözücü çikartildi. Ham ürün; MeOH (6 mL), CHzClz (3mL), su (1 mL) ve koyu bir karistirma süspansiyonu elde etmeye99yetecek miktarda Silika jel içerisinde çözündürüldü. 5 gün sonra, bu süspansiyon, ürün elüsyonu tamamlanana kadar, sinterlenmis bir huniden geçirilerek filtrelendi ve CHzClz/MeOH (9:l) (100 mL) ile yikandi. Organik tabaka brinle yikandi (2 x 50 mL), MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgeninis basinç altinda döner evoparasyonla çözücü çikartildi. Silika jel kolon kromatografisiyle (%100 CHC13 ilâ %96 CHCl3 / %4 MeOH) saflastirma islemi sonucunda sari renkte kati formda ürün 26 (100 mg, %63) elde edildi.LC/MS 2,67 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1186 ([M + H]+', %5).(d) (S)-2-amino-N-((S)-1-((4-((R)-7-met0ksi-8-(3-(((R)-7-metoksi-2- (4-(4-metilpiperazin-l -il)fenil)-5-okso-5,l la-dihidro-lH-pirrolo[2,1- c] [ 1,4] benzodiazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-0ks0-5,l la-dihidro- 1 H- pirrolo[2, 1 -c] [ l ,4] benzodiazepin-2-il)feni1)amino)- l -oksopropan-2- il)-3-metilbütanamid (27)Fazlalik piperidin (0,1 mL, l mmol), DMF (0,9 mL) içinde PBD 26 (36,4 mg, 0,03 mmol) çözeltisine ilave edildi. Bu karisim oda sicakliginda 20 dakika süreyle karismaya birakildi; bu noktada, (LC/MS ile yapilan izlemeye göre) reaksiyonun tamamlanmis oldugu görüldü. Reaksiyon karisimi, piperidinin tainaini çikartilana kadar, CH2C12 (50 mL) ile seyreltildi ve organik faz, HZO (3 X 50 mL) ile yikandi. Organik faz MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla fazlalik çözücü çikartildi ve bunun sonucunda, bir sonraki basamakta kullanilacak olan ham ürün 27 elde edildi. LC/MS 2,20 dakika (ES+)m/z (bagil yogunluk) 964 ([M + H]+', %5).100(e) 6-(2,5-diokso-2,5-dihidr0-1H-pirrol-1 -il)-N-((S)-1 -(((S)-l -((4-((S)- 7-metoksi-8-(3 -(((S)-7-metoksi-2-(4-(4-metilpiperazin-1-il)feni1)-5- 0kso-5,1 1 a-dihidro- 1H-pirrolo[2,1 -c] [ 1,4] benzodiazepin-8- il)0ksi)prop0ksi)-5-oks0-5 ,l 1 a-dihidro- 1 H-pirrolo[2,1 -c] [ l ,4] benzodia zepin-2-il)fenil)ainino)- 1 -oksopropa n-2-il)amin0)-3-metil- l -oksobutan-2 -il)heksanamid (28)EDCl hidroklorür (4,7 mg, 0,03 mmol), kuru Cl-l2C12 (3 mL) içinde 6- inaleimidoheksanoil asit (6,5 mg, 0,03 mmol) süspansiyonuna argon atmosferi altinda ilave edildi. PBD 27 (34 mg, ham) ilave edilmeden önce, bu karisim, oda sicakliginda 1 saat süreyle karistirildi. Reaksiyon tamanilanana kadar karistirilmaya devain edildi (6 saat). Reaksiyon, CH2C12 ile seyreltildi ve organik faz, HZO ve brin ile yikandi; ardindan, MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla fazlalik çözücü çikartildi. Reaksiyona girmeyen maleimid-PEGg-asidi çikartinak için, bu ürün, silika jel kromatografisiyle (%100 CHCl3"ten baslayip 9:l CHCl3/MeOH"e kadar yavas elüsyon) dikkatli sekilde saflastirildi ve ardindan, ters faz kromatografisine tâbi tutuldu. Ürün 28, %41 yerimde ve iki basamakta izole edildi (14,6 mg). LC/MS 2,40 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1157 ([M + H]+`, %5) ]Örnek 4 - bilesik 25 için alternatif sentez/PBD-triflat2l (469 mg, 0,323 mmol), boronik pinakol ester (146,5 mg, 0,484 mmol) ve Na2C03 (157 mg, 1,48 mm01); toluen/MeOH/Hzû, 2:1:1 (10 mL) karisiminda çözündürüldü. Tetrakis(trifeni]fosfin)pa1adyum(0) (7,41 mg, 0,0064 mmol) ilave edilmeden önce, reaksiyon kabi argonla üç kez yikandi ve reaksiyon karisimi gece boyunca 30°C"ye ulasana kadar isitildi. Indirgeninis basinç altinda çözücüler çikartildi; bu artik, HZO (50 mL) içerisine alindi ve EtOAc (3 x 50 mL) ile ekstrakte edildi. Birlestirilen organik maddeler brinle yikandi (100 mL), MgSO4 ile kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evoparasyonla uçucu maddeler çikartildi. Ham ürün, silika jel kolon kromatografisiyle (CHC13 %100 ilâ CHC13/MeOH %95:%5) saflastirildi ve bunun sonucunda, %33 yerimde saf 25 (885 mg) elde edildi. LC/MS 3,27 dakika (ES+) m/z(bag11 yogunluk) 1478 ([M -+- H]+', %100). 102Örnek 5Q _› _J __ _`4 ' .ffi I "J- .- I Q` .:{:- .` 1. i 1 ":3" "m .-i ` - Ii . i. g. ` ~ __.« '7., :::I -._/ 2.41/ i r-4 L I 1 I Il i " . 1 \ u u J.. ~=:;_,›\ _ ~. L J` ,5.- |._. ./ i g `-.' ~. _:›' `-l \ T 1 "~ ::::- ii _ *1 . x _ ii ›^- ..::"- ~ 'un/'hu v "Ki ›- _"4" 1 U, U: ;(_1 ' \ '=::_.~' -.. ' ` f' 1._ :::23"- Ek:::- -7 - 1 .bu ..- K ii'_ "vîf'i , ` "211:" \ I - . ...J "9. o î`~ i ~. .."-\_,.-~--._, '-../`3:' ~ 1 iL r 4 d' . A.. ,- J 4 * 'i n› i" *4. y` I. E _. _° _,-' i! .-' 1 `d' i ,i . w.. ,1 v` 1. .L .1 ~,_, A`, ._ . . .. { Tr , _ \_ _ . _ 1._` u \ . x. _. .__ \ I( K-! . r" 11 1 Â. ' L "u" `--" "i-m `;~""^\ k. ' . il'-. - x n ~. - `1 z .A ~../ - __ \ ._«_:~ «. ,i - I 1 . . 1.. L "-1 .. \ [5 "m" H 1" 'I ._ "Db"- Wv- ` '-.. ."2'. a* 'A 1 'i l 1 "' --r .1 5 H 1 11 i ß i .__._;:r "3- -. v H.- \ .-5 (a) (S)-2-(4-Amin0feni1)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3] diokso]-5-i1)-7- 1net0ksi-5,1 1-diokso-lO-((2-(trimetilsilil)et0ksi)metil)-5,10,1 1,1 1 a- tetrahidro- 1 H-pirr010[2, 1 -c] [ 1 ,4] benzodiazepin-8-i1)0ks0)pr0p0kso)- 7-met0ksi-10-((2-(trimetilsi1i1)et0ksi)metil)-1 H-pirr010[2, 1 -c] [ 1,4] benzodiazepin-5,l l( 1 OH, 1 1 aH)-dion (29) 3, 4-(Meti1endiokso)feni1 boronik asit (356 mg, 2,1 mmol, 1,3 esdegeri), TEA (1,8 mL, 12,9 11111101, 8 esdegeri) ve103triflat/anilin 13 (1,75 g, 1,7 mmol, 1 esdegeri), bir Ar atmosferi altinda bir etanol (7 mL), toluen (13 mL) ve su (2 mL) karisimi içinde çözündürüldü. Reaksiyon karisimi bosaltildi ve 3 defa Ar püskürtülerek temizlendi ve ardindan, tetrakis(trifenilfosfin)paladyum(0) (114 mg, 0,1 mmol, 0,06 esdegeri) ilave edildi. Kap yeniden bosaltildi ve 3 defa Ar püskürtülerek temizlendi ve 80°C sicaklikta bir mikrodalgada 30 saniye ön- karistirma süresiyle birlikte 8 dakika süreyle isitildi. TLC yoluyla analiz (80:20 V/V etil asetat/heksan), baslangiç malzeinesinin tamainen tüketildigini gösterdi. Reaksiyon karisimi, dikloroinetanla (50 mL) seyreltildi ve suyla (50 mL) yikandi. Organik tabaka, MgSO4 ile kurutuldu; filtrelendi ve çözücü vakum altinda çikartildi. Silika jel kolon kromatografisiyle saflastirma islemi (60:40 ilâ 20:80 V/V heksan/ etil asetat), sari renkte bir kati formunda ürün 29 (1,21 g, %71) verdi. LC/MS (3,92 min (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1032,44 ([M + H]+', 100).(b) (S)-2-(4-Amin0fenil)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [ l ,3] dioksol-5-il)-7- inetoksi-S-okso-5,l la-dihidro-l H-pirrolo[2, 1 -c] [1,4]benzodiazepin- 8-il)0kso)pr0pokso)-7 -inetoksi- l H-pirr010[2, 1 -c] [ 1,4] benzodiazepin- (11aH)-on (30)SEM dilaktam 29 (0,25 g, 0,24 inmol, 1 esdegeri), THF (8 mL) içinde çözündürüldü ve bir Ar atmosferi altinda -78°C sicakliga kadar sogutuldu. Super-Hydride® (0,6 mL, THF içinde 1 M, 2,5 esdegeri), bir yandan sicaklik izlenerek 5 dakika boyunca damla damla ilave edildi. 20 dakika sonra, küçük bir numune alindi ve LCMS analizi içinislendi. Su (50 mL) eklendi; soguk banyo çikartildi ve çözelti, etil104asetatla (50 mL) yikandi. Organik tabaka ekstrakte edildi ve tuzlu suyla (60 mL) yikandi; MgSOJle kurutuldu; filtrelendi ve çözücü vakum altinda çikartildi. Ham ürün, EtOH (15 mL) içinde çözündürüldü; koyu bir süspansiyon elde edilene kadar CHZCIZ (7,5 mL) ve su (2,5 mL) ve yeterli silika jel eklendi. 5 gün süreyle karistirma isleminden sonra, bir sinterlenmis huiiiyle filtrelendi ve ürünün elüe edilmesi durana kadar CHzClz/MeOHyle (9: 1) (100 mL) yikandi. Organik tabaka tuzlu suyla (2 x 50 mL) yikandi; MgSO4"le kurutuldu; filtrelendi ve çözücü vakum altinda çikartildi. Silika jel kolon kromatografisiyle saflastirma islemi (%1 ilâ %4 MeOH gradiyentiyle CHC13), sari renkte bir kati formunda ürün 30 (94 mg, %53) verdi. LC/MS (2,53 min (ES+) m/z(bagil yogunluk) 739,64 ([Miü 70).(c) Allil ((S)-1-(((S)-l-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [1,3]dioksol-5- il)-7-met0ksi-5-0kso-5,l la-dihidro- 1 H-pirrolo[2, l -c] [ 1,4] benzodiazepin-8-il)0kso)pr0p0ks0)-7-met0ksi-5 -0kso-5 ,l la- dihidro- l H-pirrolo[2,l -c] [ l ,4] benzodiazepin-Z-il)fenil)amino)- l -oksopropan-Z-i1)amin0)-3-metil- l -oksobütan-Z-il)karba1nat (3 1)Bir Ar atmosferi altinda, Alanin-Valin-Allok (180 mg, 0,66 mmol, 1,2 esdegeri), anhidr CH2C12 (21 mL) ve inetaiiol (l mL) içinde EEDQ7y1a (163 mg, 0,66 mmol, 1,2 esdegeri) 1 saat süreyle karistirildi. PBD 30 (407 mg, 0,55 inmol, 1 esdegeri), anhidr CH2C12(21 mL) ve metanol (l mL) içinde çözündürüldü ve reaksiyona ilave edildi. Oda sicakliginda 5 gün süreyle karistirma isleminden sonra LC/MS, ürünün çogunlugunun olustugunu gösterdi. Çözücü,vakum altinda çikartildi ve ardindan, kolon kromatografisiyle105saflastirma islemi gerçeklestirilerek (%l ilâ %6 MeOH gradiyentiyle CHZClz) sari renkte bir kati formunda ürün 31 (184 mg, %34) elde edildi. LC/MS (2,95 dakika (ES') m/z(bagil yogunluk) 994,95 ([M + H]+', 60).(d) (S)-2-Amino-N-((S)- l -((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [ 1,3]di0ksol- -il)-7-metoksi-5-okso-5,l la-dihidro-l H-pirrolo[2, 1-c] [ 1,4] benzodia zepin-8-il)okso)propokso)-7-metoksi-5 -0kso-5 ,l la- dihidro-lH-pirrolo[2,1-C] [ l ,4] benzodiazepin-2-il)fenil)ainino)- l - oksopropan-Z-il)-3-metilbütanamid (32)Imin3l (100 mg, 0,1 mmol, l esdegeri), bir Ar atmosferi altinda anhidr DCM (10 mL) içinde (çözünmeye yardimci olinak için bir damla metanol yardimiyla) çözündürüldü. Pirrolidin (30 uL, 0,15 mmol, 1,5 esdegeri) dainla damla ilave edildi ve ardindan, kap bosaltildi ve üç defa Ar püskürtülerek teinizlendi. Pd(PPh3)4 (7 mg, 6 umol, 0,06 esdegeri) eklendi ve kap bosaltildi ve üç defa Ar püskürtülerek temizlendi. 1 saat sonra LC/MS analizi, ürün olusumu ve baslangiç malzemesinin tamamen kayboldugunu gösterdi. Reaksiyon karisimina, EtZO (60 mL) eklendi ve çözeltide ürünün tainami parçalanana kadar karistirilmaya birakildi. Çökelti, bir siiiterlenmis huniden filtrelendi ve Et20°yla (2 x 20 mL) iki defa yikandi. Toplama kabi degistirildi ve izole edilen kati çözündür'uldü ve sinterden geçirilerek CHClfle (100 mL) yikandi. Çözücü vakum altinda çikartilarak sari renkte bir kati formunda ham ürün 32 elde edildi ve bir sonraki basamakta kullanildi. LC/MS (1,14 dakika (Es+) m/z (bagil yogunluk) 910,40 ([M + H]+', 67).106(e) N-((S)-1 -(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(Benzo[d] [1,3]di0ksol-5-i1)- 7-met0ksi-5-0kso-5 ,1 1a-dihidr0-1H-pirr010[2, 1-c] [ 1,4] benzodia zepin-8-Il)0kso)pr0p0kso)-7-met0ksi-5 -0kso-5,1 la- dihidro- 1 H-pirrolo[2,1 -c] [1,4]benzodiazepin-2-il)fenil)amino)-l- oksopropan-Z-il)amin0)-3-metil-1-0ksobütan-2-i1)-1-(3-(2,5-di0kso- 2,5-dihidr0-lH-pirr01-1-il)pr0panamid0)-3,6,9,12,15,18,21,24- 0kt00ksaheptak0san-27-amid (33)Imin 32 (92 mg, 0,1 mmol, 1,1 esdegeri), bir damla anhidr MeOHsyle CHC13 (6 mL) Içinde çözündürülerek çözünmeye yardiin edildi. Maleimid-PEGg-asit (53 mg, 0,09 mmol, l esdegeri) ve ardindan, EEDQ (33 mg, 0,14 mmol, 1,5 esdegeri) eklendi. LC/MS analizi ürünün çogunun olustugunu gösterene kadar, oda sicakliginda Ar altinda 4 gün süreyle kuvvetlice karistirilmaya birakildi. Çözücü vakum altinda çikartildi ve ham ürün, silika jel kolon kromatografisiyle (%1 ilâ %10 MeOH gradiyentiyle CHC13) kismen saflastirilarak 33 (81 mg) elde edildi. Malzeme, preparatif HPLC yoluyla ilaveten saflastirilarak sari renkte bir kati formunda 33 (26,3 mg, %18) elde edildi. Fast Formic çevrimi: LC/MS (1,39 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1485,00 ([M + H]+', 64).107Örnek 6 ' N L 64"?" "'"vîî'h ___.-"'-. .::fx "'12/ H ` r' "1 _,- 1,1. 1. 1,!` î __iyi ,M1 › 4 ._. `km` _.;L .__.` .~ "-.___ `M " ' . 11 . .. L _ \ 'çu' `-i-' KI- Y 2.1- YL.- `î ii ,L'x' _ _› I I 1 ,, "ETA" :::'-v- »57" ;"41. J 3 o' ;- I i... I L 'I .45"- --"**-= "Il _A I_ MF." <--.. 5 ' ` ° : l" 1 1, 1 1, "ni --^'*; o 1 ., " ,Jbf'i " l "- ` "s,_-'"' ."57". '- ":i_ -:::11 ('_ V 1 v . . i "- _{::.,A›__'..;, _1, ..3. "41' `%4 _. . "af", . 0 __1 _J_ `JJ., -"--. _ ,q, \. a _ 7 1 11. ` L,, "5 (H. r::. i ., 1..` i?" _ .k 5,_ N, 1 . _J _`" ' i .. ° r _ 1:'-"-V-"1:I/ - /<-__.-]: 4 Iç. \}f' "J v 5 -.__. , L ,1 1› II 1 i I(21) 9H-Floren-9-il)meti1 ((S)-1 -(((S)-1 -((4-((S)-8-(3-(((S)-2- (benzo[d] [1,3]dioksol-5-il)-7-met0ksi-5,1 1-di0kso-10-((2- (trimetilsi1i1)et0ksi)meti1)-5, 1 0,1 1,1 la-tetrahidro-lH-pirr010[2,1-c] [ 1,4] benzodia zepin-8-il)0kso)pr0p0kso)-7-met0ksi-5 ,l 1 -diokso- 10- ((2-(trimetilsili1)et0ksi)meti1)-5,10, `1 1,1 1a-tetrahidr0- l H-pirr010[2, l - c] [ 1,4] benzodia zepin-Z-i1)t`enil)amin0)- 1 -0ksopr0pan-2-il)amin0)-3-metil-1-0ksobütan-2-i1)karbamat (34)TriflatZl (0,5 g, 0,35 mmol, 1 esdegeri), 3, 4-(metilendi0kso)feni1 boronik asit (75 mg, 0,45 mmol, 1,3 esdegeri) ve Na2C03 (0,17 g, 1,6 mmol, 4,5 esdegeri), bir Ar atmosferi altinda toluen (ll mL), EtOH (5,5 mL) ve su (5,5 mL) içinde çözündürüldü. Kap bosaltildi ve üç defa Ar püskürt'ûlerek temizlendi. Pd(PPh3)4 (24 mg, 0,02 mmol, 0,06 esdegeri) ilave edildi ve kap yeniden bosaltildi ve üç defa Ar108püskürtülerek temizlendi. 30°C sicakliga kadar isitildi ve gece boyunca karistirilmaya birakildi. LC/MS yöntemiyle analiz, baslangiç malzeinesiniii tamamen kayboldugunu gösterdi. Çözücü vakum altinda çikartildi ve elde edilen artik, etil asetatla (60 mL X 3) yikaiiinadaii önce su (60 mL) içinde çözündürüldü. Koinbine organik tabakalar, tuzlu suyla (50 1nL) yikandi; MgSOjle kurutuldu; filtrelendi ve çözücü vakum altinda çikartildi. Koloii kroinatografisiyle saflastirina islemi (50:50 ilâ 25:75 h/h heksan / etil asetat), sari renkte bir kati formunda ürün 34 (310 mg, %64) elde edildi. LC/MS (1,44 dakika ([58) m/z(bagil yogunluk) l423,35 ([M - H]", 79).(b) (9H-Floren-9-il)metil ((S)-1-(((S)-1-((4-((S)-8-(3-(((S)-2- (benzo[d] [1,3]dioksol-5-i1)-7-1netoksi-5-okso-5,l 1 a-dihidro- 1 H- pirrolo[2,1-c] [ l ,4] benzodiazepin-8-il)0kso)propokso)-7-metoksi-5 - okso-5 ,1 1a-dihidro-lH-pirrolo[2,1-c] [ 1,4] benzodiazepin-2- il)fenil)amino)-1-oks0pr0pan-2-il)a1nin0)-3-inetil-1-oksobütan-Z-il)karbainat (35)SEM dilaktam 34 (0,31 g, 0,22 minol, l esdegeri), THF (10 mL) içinde çözündürüldü ve bir Ar atmosferi altinda -78°C sicakliga kadar sogutuldu. Super-Hydride® (0,5 inL, THF içinde 1 M, 2,5 esdegeri), bir yandan sicaklik izlenerek 5 dakika boyunca damla damla ilave edildi. 30 dakika sonra, küçük bir numune alindi ve LC/MS analizi için izlendi. Su (50 1nL) eklendi; soguk banyo çikartildi ve çözelti, etil asetatla (50 1nL) yikandi. Organik tabaka ekstrakte edildi ve tuzlu suyla (60 1nL) yikandi; MgSO4 üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve çözücü vakuin altinda çikartildi. Ham ürün, EtOH (13,2 1nL),109CH2C12(6,6 mL) ve su (2,2 mL) içinde çözündürüldü ve koyu bir süspansiyon elde edilene kadar yeterli Silika jel ilave edildi. 5 gün süreyle karistirma isleminden sonra, bir sinterleninis huniyle filtrelendi ve ürünün elüe edilmesi durana kadar CHgClz/MeOH"yle (9:1) (100 mL) yikandi. Organik tabaka, tuzlu suyla (2 X 50 mL) yikandi; MgSO4°le kurutuldu; filtrelendi ve çözücü vakuin altinda çikartildi. Silika jel kolon kromatografisiyle saflastirma islemi (%1 ilâ %4 MeOH gradiyentiyle CHC13), sari renkte bir kati formunda saf ürün 35 (185 mg, %75) elde edildi. LC/MS (1,70 min (ES+) in/z (bagil yogunluk) 1 132,85 ([M + H]+', 60).(c) (S)-2-Amino-N-((S)- l -((4-((S)-8-(3-(((S)-2-(benzo[d] [ 1,3]dioksol- -il)-7-metoksi-5-0kso-5,l 1 a-dihidro- l H-pirrolo[2, l -c] [ 1,4] benzodia zepin-8-il)okso)propokso)-7-metoksi-5 -okso-5,1 la- dihidro- 1 H-pirrolo[2,l -c] [ l ,4] benzodiazepin-Z-il)fenil)amino)- l - oksopropan-2-il)-3-metilbütanamid (32)Imin 35 (82 mg, 0,07 mmol, 1 esdegeri), DMF (i mL) içinde çözündürüldü ve ardindan, piperidin (0,2 inL, 2 mmol, fazlalik) yavas yavas ilave edildi. LC/MS analizi baslangiç malzemesinin tamamen tüketildigini gösterene kadar, bu çözeltioda sicakliginda 20 dakika süreyle karismaya birakildi. Reaksiyon karisimi, CH2C12"yle (50 mL) seyreltildi; suyla (50 mL x 4) yikandi; MgSOjle kurutuldu; filtrelendi ve çözücü vakum altinda çikartildi. Ürün 33, bir sonraki basamakta ilaveten saflastirilmadan kullanildi. LC/MS (1,15 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 910,60 ([M + H]+', 58). 110Örnek 7(i) ( S)-(2-amino-5-metoksi-4-( (triizopropilsili1)oksi)feni1)(2-(( (tert- bütildimetilsilil)oksi)metil-4-metil-2,3 -dihidro- l H-pirrol- 1 -il)metanon(Q) .1 N HP_3` Jîswi"" ll \ u; `Hîcîî: › ;H 4 l It' + ›r/-` xx ' v" T ' Mi-î' "f" "Ir " `ü \__J` , 1 I 43 H "H, /cims i:.iTc~-.-. / _ . . 7 / TFSI` U: '; Phil_ .- NLI.. îý 'IP-'LI N), 2 .\ . n" / a` \ "It-k ^ '. NK_- › l / ra' 7 ' l . (F "1 ' .`17 _55' x.. › L "IS" \_- NH/ "5." W \:___ n' \- :m xx" kir: u ..Lius iTFi-i::_;-:. \ /xiy ;/ "vw" fî` xii ( 11) tir-`L J! g` uff-_k "~.- / "v-f' \/ .i ` i_i _--_ -.i ,-_-_ T "" x. .. ` .in4&(a) 5-metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)benzaldehid (42)Bir imidazol (48,7 g, 715,23 rriinol) ve 4-hidroksi-5-metoksi-2- nitrobenzaldehid 41 (47 g, 238 mmol) (birlikte ögütülmüs) karisimina, saf triizopropilsililklorûr (56,4 mL, 262 mmol) ilave edildi. Karisim, fenol ve iinidazol eriyene ve çözelti formuna gelene kadar isitildi (100°C). Reaksiyon karisimi, 15 dakika süreyle karismaya birakildi ve ardindan, sogumaya birakildi; daha sonra, kabin tabaninda bir kati (imidazol klorür) olustugu gözlemlendi. Reaksiyon karisimi, %5 EtOAc/heksanlarla seyreltildi ve dogrudan dogruya silika jele yüklendi ve ped, %5 EtOAc/ heksanlarla ve ardindan, %10ll]EtOAc/heksanlarla elüe edildi (fazlalik az oldugundan dolayi, üründe reaksiyona girmemis TIPSCI çok az miktarda bulunur). Istenen ürün, heksan içinde %5 etil asetatla elüe edildi. Indirgenmis basinç altinda döner evaporasyon ve ardindan, yüksek vakuin altinda kurutma yoluyla fazlalik elüe edici çikartilarak bir kristalin hafif hassas kati (74,4 g, %88) elde edildi. LC/MS"ye göre tatmin edici saflik (4,22 dakika (ES+) 1n/z(bag11 yogunluk) 353,88 ([M + H]+', 100)), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 8 10,43 (s, lH), 7,60 (s, lH), 7,40 (s, 1 H), 3,96 (s, 3H), 1,35 - 1,24 (in, 3H), 1,10 (m, 18H).(b) 5-metoksi-2-nitr0-4-((triizopropilsilil)0ksi)benzoik asit (43)Tetrahidrofuran (500 mL) içinde bilesik 2 (74 g, 209 ininol) çözeltisine, oda sicakliginda su (800 mL) içinde bir sodyum klorit (47,3 g, 523 inmol, %80 teknik kalite) ve sodyum dihidrojenfosfat monobazik (35,2 g, 293 inmol) (NaHZPO4) çözeltisi ilave edildi. Kuvvetlice karistirilan bifazik karisima, hidrojen peroksit (%60 a/a, 140 mL, 2,93 mol) derhal eklendi. Reaksiyon karisimi, gaz (oksijen) açiga çikardi; baslangiç malzemesi çözündü ve reaksiyon karisimi sicakligi 45°C seviyesine yükselti. 30 dakika sonra, LC/MS, reaksiyonun tamamlandigini gösterdi. Reaksiyon karisimi bir buz banyosunda sogutuldu ve hidroklorik asit (1 M) ilave edilerek pH degeri 3°e düsürüldü (birçok durumda, bu basamak gereksiz bulundu, çünkü reaksiyonun sonunda pH degeri zaten asidikti; ekstraksiyondan önce pH degerini lütfen kontrol ediniz). Daha sonra, reaksiyon karisimi etil asetatla (1 L) ekstrakte edildi ve organik fazlar, tuzlu suyla (2 x 100 mL) yikandi ve magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu.Organik faz filtrelendi ve fazlalik çözücü indirgenmis basinç altinda112döner evaporasyonla çikarilarak bir sari reiikte kati formunda kantitatif veriinde ürün 43 elde edildi. LC/MS (3,93 dakika (ES-) m/z(bag11 yogunluk) 367,74 ([M- H]", 100));'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,36 (s, lH), 7,24 (s, lH), 3,93 (s, 3H), 1,34 - 1,22 (m, 3H), 1,10 (m, 18H).(c) ((2S,4R)-2-(((tert-büti1di1netilsili1)oksi)meti1)-4-hidroksipirrolidin - 1-i1)(5-inetoksi-Z-nitro-4-((trii20pr0pilsilil)oksi)fenil)metanon (45)Diklorometan (200 mL) içinde asit 3 (43,5 g, 1 17,8 mmol, 1 esdegeri) ve hidroksibenzotriazol hidrat (19,8 g, 129,6 mmol, 1,1 esdegeri) çözeltisine, 0°C sicaklikta DCC (29,2 g, 141 mmol, 1,2 esdegeri) ilave edildi. Soguk banyo çikartildi ve reaksiyon oda sicakliginda 30 dakika süreyle devam etmeye birakildi; bu süre içerisinde, diklorometan (100 mL) içinde (2S,4R)-2-t-bütildimetilsililoksimetil-4- hidroksipirrolidin 44 (30 g, 129,6 mmol, 1,1 esdegeri) ve trietilamin (24,66 mL, 176 mmol, 1,5 esdegeri) çözeltisi -10°C sicaklikta argon altinda hizla ilave edildi (büyük ölçekte, reaksiyon karisimi daha da sogutularak ekleme süresi kisaltilabilir). Reaksiyon karisimi oda sicakliginda 40 dakika ilâ 1 saat süreyle karismaya birakildi ve LC/MS ve TLC (EtOAc) yöntemleriyle izlendi. Katilar, Celite filtrede filtrasyonla çikarildi ve pH degerinin 4 ya da 5 oldugu ölçülene kadar organik faz, soguk aköz 0,1 M HC1"yle yikandi. Daha sonra, organik faz, suyla ve ardindan, doymus aköz sodyum bikarbonat ve tuzlu suyla yikandi. Organik tabaka magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik çözücü indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, kolon flas kromatografisinetâbi tutuldu (silika jel; gradiyent 40/60 etil asetat/heksan ilâ 80/20 etil113asetat/heksan). Fazlalik çözücü indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak saf ürün 45 (45,5 g saf ürün %66 ve 17 g hafif saf-olmayan ürün, toplamda %90) elde edildi. LC/MS 4,43 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 582,92 ([M+ Hr, 100); 'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,66 (s, 1 H), 6,74 (s, 1 H), 4,54 (s, 1H), 4,40 (s, 1 H), 4,13 (s, 1 H), 3,86 (s, 3H), 3,77 (d,J = 9,2 Hz, 1 H), 3,36 (dd, J = 11,3, 4,5 Hz, 1 H), 3,14 - 3,02 (m, 1 H), 2,38 - 2,28 (m, 1 H), 2,10 (ddd, J = 13,3, 8,4, 2,2 Hz, 1 H), 1,36 - 1,19 (m, 3H), 1,15 - 1,05 (m, 18H), 0,91 (S, 9H), 0,17 - 0,05 (m, 6H), (rotamerlerin varligi).(d) (S)-5-(((tert-bütildimetilsilil)oksi)metil)-1-(5-metoksi-2-nitro-4- ((triizopropilsili1)oksi)benzoi1)pirrolidin-3-on (46)Kuru diklorometan (250 mL) içinde 45 (31,7 g, 54 ininol, 1 esdegeri) ve TEMPO (0,85 g, 5,4 mmol, 0,1 esdegeri) karistirilmis çözeltisine, 0°C sicaklikta TCCA (8,82 g, 40 mmol, 0,7 esdegeri) ilave edildi. Reaksiyon karisimi 20 dakika süreyle kuvvetlice karistirildi; bu zaman noktasinda, TLC (50/50 etil asetat/heksan), baslangiç malzemesinin tamamen tüketildigini gösterdi. Reaksiyon karisimi, Celite filtreyle filtrelendi ve filtrat, aköz doymus sodyum bikarbonat (100 mL), sodyum tiyosülfat (300 mL içinde 9 g) ve tuzlu suyla (100 mL) yikandi ve magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu. Indirgenmis basinç altinda döner evaporasyon, kantitatif veriinde ürün 46 verdi. LC/MS 4,52 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 581,08 ([M + H]+, 100); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,78 - 7,60 (m, 1H), 6,85 - 6,62 (m, lH), 4,94 (dd, 1 = 30,8, 7,8 Hz, 1 H), 4,50 - 4,16 (m, 1 H), 3,99 - 3,82 (m, 3H), 3,80 - 3,34 (m, 3H), 2,92 - 2,17 (m, 2H), 1,40 - 1,18 (m, 3H), 1,11 (t,J : 6,2 Hz, 18H), 0,97 - 0,75 (m, 9H), 0,15 - -0,06 (m, 6H),114(rotainerlerin varligi).(e) (S)-5-(((tert-büti1dimeti1si1i1)oksi)meti1)-1-(5-metoksi-2-nitro-4- ((triizopropilsilil)0ksi)benzoil)-4,5-dihidro-1H-pirr01-3-i1triflorometansülfonat (47)Triflik anhidrit (27,7 mL, 46,4 g, 165 nimol, 3 esdegeri), -50°C sicaklikta (aseton/kuru buz baiiyosu) 2,6-lutidin (25,6 mL, 23,5 g, 220 mmol, 4 esdegeri, elekler üzerinde kurutulmus) varliginda kuru dikloroinetan (900 mL) içinde keton 46°nin (31,9 g, 55 mmol, l esdegeri) kuvvetlice karistirilmis bir süspansiyonuna (sicaklik kontrollü) enjekte edildi. LC/MS, küçük bir work-up (su/diklorometan) sürecinden sonra, reaksiyonun tamamlandigini gösterdiginde, reaksiyon karisimi 1,5 saat süreyle karismaya birakildi. Hâlâ soguk olan reaksiyon karisimina su ilave edildi ve organik tabaka ayrildi ve doymus sodyum bikarbonat, tuzlu su ve magnezyum sülfatla kurutuldu. Organik faz filtrelendi ve fazlalik çözücü indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, kolon flas kroiiiatografisine tâbi tutuldu (silika jel; 10/90 h/h etil asetat/heksan); fazlalik elüe edicinin çikartilmasi, ürün 47 (37,6 g, 96 %) verdi. LC/MS, yöntem 2, 4,32 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 712,89 ([M + H]+°, 100); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 5 7,71 (s, 1 H), 6,75 (s, 1 H), 6,05 (d, J : 1,8 Hz, 1 H), 4,78 (dd, J : 9,8, 5,5 Hz, 1H), 4,15 - 3,75 (m, 5H), 3,17 (ddd,J= 16,2, 10,4, 2,3 Hz, 1H), 2,99 (ddd, J = 16,3, 4,0, 1,6 Hz, 1 H), 1,45 - 1,19 (m, 3H), 1,15 - 1,08 (m, 18H), 1,05 (s, 6H), 0,95 - 0,87 (m, 9H), 0,15 - 0,08 (m, 6H).115(f) (S)-(2-(((tert-bütildimetilsilil)oksi)meti1)-4-metil-2,3-dihidro- 1 H- pirrol- 1 -il)(5 -metoksi-2-nitro-4-((triizopropilsilil)oksi)fenil)metanon (48)Bir argon atmosferi altinda, kuru dioksan (80 mL) içinde triflat 47 (10,00 g, 14 mmol, 1 esdegeri), metilboronik asit (2,94 g, 49,1 mmol, 3,5 esdegeri), gümüs oksit (13 g, 56 nimol, 4 esdegeri) ve potasyum fosfat tribazik (17,8 g, 84 mmol, 6 esdegeri) karisimina, trifenilarsin (1,71 g, 5,60 nimol, 0,4 esdegeri) ilave edildi. Reaksiyona 3 defa argon püskürtüldü ve bis(benzonitril)paladyum(ll) klori'ir (540 mg, 1,40 mmol, 0,1 esdegeri) ilave edildi. Reaksiyona 3 defa daha argon püskürtûld'û ve ardindan, hemen 110°C sicakliga kadar isitildi (drysyn isitma blogu, kap ilave edilmeden önce 1 10°C sicakliga kadar isitildi). 10 dakika sonra, reaksiyon oda sicakligina kadar sogutuldu ve bir Celite filtre pediile filtrelendi. Indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çözücü çikartildi. Elde edilen artik, kolon flas kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; %10 etil asetat / heksan). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazladan el'ûe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 48 (4,5 g, %55) elde edildi. LC/MS, 4,27 dakika (ES+) m/z(bag11 yogunluk) 579,18 ([M+ H]+', 100); 1H NMR (400 MHZ, CDC13) 8 7,70 (s, 1 H), 6,77 (s, 1 H), 5,51 ((1, 1 = 1,7 Hz, 1 H), 4,77 - 4,59 (m, 1 H), 3,89 (s, 3H), 2,92 - 2,65 (m, lH), 2,55 ((1, J = 14,8 Hz, lH), 1,62 ((1, J : 1,1 Hz, 3H), 1,40 - 1,18 (m, 3H), 1,11 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,90 (s, 9H), 0,11 (d, J = 2,3 Hz, 6H).(g) (8)-(2-amino-5-metoksi-4-((triizopropilsilil)0ksi)fenil)(2-(((tert- bütildimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3-dihidro- 1 H-pirrol- 1 - il)metanon (49)116Etanol h/h (70 mL) içinde %5 formik asitte bilesik 48 (6,7 g, 11,58 nimol) çözeltisine, yaklasik 15°C sicaklikta çinko tozu (28 g, 430 mmol, 37 esdegeri) ilave edildi. Elde edilen eksoterm, reaksiyon karisiminin sicakligini 30°C"in altinda tutmak için bir buz banyosu kullanilarak kontrol edildi. 30 dakika sonra, reaksiyon karisimi, bir Celite filtre pediile filtrelendi. Filtrat, etil asetatla seyreltildi ve organik faz; su, doymus aköz sodyum bikarbonat ve tuzlu suyla yikandi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik çözücü, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; heksan içinde %10 etil asetat). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik çözücü, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 49 (5,1 g, %80) elde edildi. LC/MS, 4,23 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 550,21 ([M + H]+', 100); lH NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,28 (s, lH), 6,67 (s, lH), 6,19 (s, 1 H), 4,64 - 4,53 (m, J = 4,1 Hz, lH), 4,17 (s, 1 H), 3,87 (s, 1 H), 3,77 - 3,69 (m, 1 H), 3,66 (s, 3H), 2,71 - 2,60 (m, 1 H), 2,53 - 2,43 (m, 1 H), 2,04 - 1,97 (m,J : 11,9 Hz, 1 H), 1,62 (s, 3H), 1,26 - 1,13 (m, 3H), 1,08 - 0,99 (m, 18H), 0,82 (s, 9H), 0,03 - -0,03 (m, J : 6,2 Hz, 6H).(ii) (1 18,1 1aS)-a11i1 1 1-((tert-buti1dimeti1si1i1)oksi)-8-((5- iyodopentil)oksi)-7-met0ksi-2-metil-5-okso-1 1,1 la-dihidro-l H- benzolelpirrololl ,2-alll ,4ldiazepin-10(5H)-karboksilat 117, * *I ' -r L 41 - ir' . , j. , 2 H'- kç- iyi` .'15- "-. r "_:L 11 1 T 9" "i 1- "u ' I -' _ ._r' _j .. _i _I I _. i., fu(- _› " ~/ 1 -. ,- 1. G :1& 1 i l `i(_i 1' o** ' 'wir- `-..-~'--L 'r ` * ..11' _ 1 _ i lifli ~« 4;, a I 4: 2 -.._.: 30"". 1(a) (S)-a11il (2-(2-(((tert-büti1dimetilsilil)oksi)metil)-4-metil-2,3- dihidro- l H-pirrol- l -karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi) feni1)karbamat (50)Kuru diklorometan (20 inL) içinde kuru piridinin (0,48 mL, 6,00 mmol, 2,2 esdegeri) varliginda amin 49 (1,5 g, 2,73 mmol) çözeltisine, -78°C (aseton/kuru buz banyosu) sicaklikta allil kloroformat (0,30 mL, 3,00 minol, 1,1 esdegeri) ilave edildi. 30 dakika sonra, banyo çikartildi ve reaksiyon karisimi, oda sicakligina kadar isinmaya birakildi. Reaksiyon karisimi, diklorometanla seyreltildi ve doymus aköz bakir sülfat ilave edildi. Daha sonra, organik tabaka, sirasiyla doymus ak'oz sodyum bikarbonat ve tuzlu suyla yikandi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik çözücü, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün elde edildi ve bu ürün 50, bir sonraki reaksiyonda dogrudan kullanildi. LC/MS, 4,45 dakika (ES+)n1/z(bagil yogunluk) 632,91 ([M + H]+~, 100)118(b) (S)-a11i1 (2-(2-(hidroksimeti1)-4-meti1-2,3-dihidro-1H-pirrol-l- karbonil)-4-met0ksi-5-((triizopropilsilil)0ksi)fenil)karbamat (51)Ham ürün 50, asetik asit/metanol/tetrahidrofuran/suyun (28:4:4:8 mL) 7:1:1:2 oraninda karisimi içinde çözündürüldü ve oda sicakliginda karismaya birakildi. 3 saat sonra, LC/MS yöntemiyle baslangiç malzemesinin tamamen gözden kayboldugu gözlemlendi. Reaksiyon karisimi, etil asetatla seyreltildi ve sirayla su (2 x 500 inL), doymus aköz sodyum bikarbonat (200 mL) ve tuzlu suyla yikandi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik etil asetat, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel, heksan içinde %25 etil asetat). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak istenen ürün 51 (1 g, %71) elde edildi. LC/MS, 3,70 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 519,13 ([M + H]+`, 95); lH NMR (400 MHZ, CDC13) 6 8,34 (s, 1 H), 7,69 (s, 1 H), 6,78 (s, 1 H), 6,15 (s, lH), 5,95 (ddt, J : 17,2, 10,5, 5,7 Hz, lH), 5,33 (dq, J : 17,2, 1,5 Hz, lH), 5,23 (ddd,J : 10,4, 2,6, 1,3 Hz, 1 H), 4,73 (tt,J : 7,8, 4,8 Hz, 1 H), 4,63 (dt, J = 5,7, 1,4 Hz, 2H), 4,54 (s, lH), 3,89 - 3,70 (m, 5H), 2,87 (dd,1= 16,5, 10,5 Hz, 1 H), 2,19 (dd,J = 16,8, 4,6 Hz, 1 H), 1,70 (d,J = 1,3 Hz, 3H), 1,38 - 1,23 (m, 3H), 1,12 (s, 10H), 1,10 (s, 8H).(c) (1 18,1 1aS)-a11il 1 1-hidroksi-7-metoksi-2-meti1-5-okso-8- ((triizopropilsilil)oksi)-1 1,1 la-dihidro-lH-benzo[e]pirr010[1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (52)119Kuru dikloroinetan (IO mL) içinde oksalil klorür (0,2 inL, 2,32 minol, 1,2 esdegeri) çözeltisine, -78°C sicaklikta (kuru buz /aseton banyosu) bir argon atmosferi altinda dimetil sülfoksit (0,35 mL, 4,83 mmol, 2,5 esdegeri) damla damla ilave edildi. 10 dakika sonra, sicaklik hâlâ -78°C seviyesiiideyken kuru diklorometan (8 mL) içinde 51 (1 g, 1,93 mmol) çözeltisi yavas yavas ilave edildi. 15 dakika soiira, trietilamin (1,35 inL, 4A moleküler elekler üzerinde kurutulmus, 9,65 mmol, 5 esdegeri) damla dainla ilave edildi ve kuru buz/aseton banyosu çikartildi. Reaksiyoii karisimi, oda sicakligina ulasana kadar bekletildi ve soguk hidroklorik asit (0,1 M), doymus aköz sodyum bikarbonat ve tuzlu suyla ekstrakte edildi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik diklorometan, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 52 (658 mg, %66) elde edildi. LC/MS, 3,52 dakika (ES+) mlz (bagil yogunluk) 517,14 ([M + H]+`, 100); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 5 7,20 (s, 1 H), 6,75 - 6,63 (m, J = 8,8, 4,0 Hz, 2H), 5,89 - 5,64 (m, J = 9,6, 4,1 Hz, 2H), 5,23 - 5,03 (m, 2H), 4,68 - 4,38 (m, 2H), 3,84 (s, 3H), 3,83 - 3,77 (m, 1 H), 3,40 (s, 1 H), 3,05 - 2,83 (m, 1 H), 2,59 ((1, J : 17,1 Hz, 1H), 1,78 (d,J : 1,3 Hz, 3H), 1,33 - 1,316 (in, 3H), 1,09 (d,J : 2,2 Hz, 9H), 1,07 ((1, J = 2,1 Hz, 9H).(d) (118,11aS)-allil 11-((tert-büti1diinetilsilil)0ksi)-7-metoksi-2-metil- -0kso-8-((triizopropilsili1)0ksi)-1 1,1 1a-dihidr0-1H-benzo[e]pirrolo [1,2-a] [1,4]diazepin-l0(5H)-karb0ksilat (53)Kuru diklorometan (40 mL) içinde bilesik 52 (520 mg, 1,00 mmol) ve 2,6-lutidin (0,46 inL, 4,00 mmol, 4 esdegeri) çözeltisine, 0°C sicaklikta argon altinda tert-bütildimetilsililtriflat (0,70 inL, 3,00120mmol, 3 esdegeri) ilave edildi. 10 dakika sonra, soguk banyo çikartildi ve reaksiyon karisimi, oda sicakliginda 1 saat süreyle karistirildi. Reaksiyon karisimi, su, doymus aköz sodyum bikarbonat ve tuzlu suyla ekstrakte edildi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; gradiyent, heksan içinde %10 etil asetat ilâ heksan içinde %20 etil asetat). Saf fraksiyonlar t0plandi ve kombine edildi ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 53 (540 mg, %85) elde edildi. LC/MS, 4,42 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 653,14 ([M + Na]_', 100); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,20 (s, 1 H), 6,71 - 6,64 (m,J = ,5 Hz, 2H), 5,83 (d, J : 9,0 Hz, 1 H), 5,80 - 5,68 (m, J : 5,9 Hz, lH), ,14 - 5,06 (m, 2H), 4,58 (dd,J : 13,2, 5,2 Hz, lH), 4,36 (dd,J: 13,3, 5,5 Hz, lH), 3,84 (s, 3H), 3,71 (td, J = 10,1, 3,8 Hz, lH), 2,91 (dd, J = 16,9, 10,3 Hz, lH), 2,36 (d,J = 16,8 Hz, 1 H), 1,75 (s, 3H), 1,31 - 1,16 (in, 3H), 1,12 - 1,01 (ni, J = 7,4, 2,1 Hz, 18H), 0,89 - 0,81 (m, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,19 (s, 3H),(e) (1 1 S, 1 1aS)-allil 1 1-((tert-bütildimetilsilil)oksi)-8-hidroksi-7- metoksi-2-metil-5-oks0-l 1 ,l la-dihidro- l H-benzo[e] pirrolo[ l ,2-a] [1,4] diazepin- l 0(5H)-karboksilat (54)Islak dimetilformamid (6 mL, 50:] DMF/su) içinde bilesik 53 (540 mg, 0,85 minol) çözeltisine, lityum asetat (87 mg, 0,85 mmol) ilave edildi. 4 saat sonra, reaksiyon tamamlandi ve reaksiyon karisimi, etil asetatla (25 mL) seyreltildi ve aköz sitrik asit çözeltisi (pH ~ 3), su Vetuzlu suyla yikandi. Organik tabaka, magnezyum sülfat üzerinde121kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik etil asetat, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; gradiyent, heksan içinde %25 ilâ %75 etil asetat). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi Ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 54 (400 mg, kantitatif) elde edildi. LC/MS, (3,33 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 475,26 ([M+H]+, 100).(f) (1 18,1 1aS)-a11i1 1 l-((tert-büti1di1netilsi1i1)0ksi)-8-((5- iyodopentil)oksi)-7-met0ksi-2-metil-5-okso- 1 1,1 1 a-dihidro- 1 H-benzo [e] pirr010[ 1,2-a] [1,4]diazepin-10(5H)-karboksi1at (55)Aseton (4 mL, moleküler elekler üzerinde kurutulmus) içinde fenol 54 (400 mg, 0,84 inmol) çözeltisine, diiyodopentan (0,63 mL, 4,21 mmol, esdegeri) ve potasyum karbonat (116 mg, 0,84 mmol, 1 esdegeri) ilave edildi. Reaksiyon karisimi, daha sonra, 60°C sicakliga kadar isitildi ve 6 saat süreyle karistirildi. Aseton, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; 50/50, h/h, heksan/etil asetat). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik elüe edici çikartilarak %90 yerimde 55 elde edildi. LC/MS, 3,90 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 670,91 ([M]+, 100),1H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,23 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 6,60 (s, 1 H), 5,87 ((1, J = 8,8 Hz, 1 H), 5,83 - 5,68 (m, J : 5,6 Hz, 1 H), 5,15 - 5,01 (in, 2H), 4,67 - 4,58 (m, 1 H), 4,45 - 4,35 (m, 1 H), 4,04 - 3,93 (m, 2H), 3,91 (s, 3H), 3,73 (td, J = 10,0, 3,8 Hz, 1 H), 3,25 - 3,14 (m, J = 8,5, 7,0 Hz, 2H), 2,92 (dd, J = 16,8, 10,3 Hz, lH), 2,38 ((1, J = 16,8 Hz, lH), 1,95 - 1,81 (m, 4H), 1,77 (s, 3H), 1,64 - 1,49 (m, 2H), 0,88 (s, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,23 (s, 3H).122(iii) (1 18,1 1aS)-4-(2-(1-((1-(a11i10ksi)-4-metil-1,2-di0ksopentan-3-i1) amin0)-1-oksopropan-Z-iDhidrazinihbenzil 1 1-((tert- bütildimetisilil)0ksi)-8-hidroksi-7-metoksi-Z-metil-S -okso-l 1,1 la- dihidro- 1 H-benzofelpirrolof 1 ,2-a1f 1 ,41diazepin- 1 O(5H)-karb0ksi1at (E)[- _ I.: uca" MW& Y -'iiLi-.T F~:i:i . `J - / I"-i ALL-."UP/i 'H ALL' :dk: 11/'k /^\ `-,_ 'i _› ':4, _- _ :::310 '. I-' E; I-"1 fv- TH" i ,`~/ ii "w/"x I' i vw `i r" l .. "RV \-N\ýL Nur/V ' :VA(a) Allil 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(((tert-büti1dimetilsi1i1)oksi)meti1)-4- metil-2,3-dihidr0-lH-pirrol-1-karbonil)-4-met0ksi-5- ((triizopropilsilil)0ksi)feni1)karbamoi1)0ksi)metil)feni1)hidrazinil)propanainid0)-4-inetil-2-0ks0pentanoat (5 6)123Kuru tetrahidrofuran (40 mL) içinde amin 49 (4 g, 8,20 mmol) ve trifosgenin (778 mg, 2,95 mmol, 0,36 esdegeri) bir karistirilinis çözeltisine, 5°C (buz banyosu) sicaklikta trietilamin (2,23 mL, 18,04 mmol, 2,2 esdegeri) ilave edildi. Reaksiyon karisimindan alikotlar periyodik olarak çikartilarak ve metanolle söndürülerek ve LC/MS analizi gerçeklestirilerek izosiyanat reaksiyonunun seyri izlendi. Izosiyanat olusumu tamamlandiktan sonra, kuru tetrahidrofuran (40 mL) içinde alloc-Val-Ala-PABOH (4,12 g, 12,30 mmol, 1,5 esdegeri) ve trietilamin (1,52 mL, 12,30 inmol, 1,5 esdegeri) çözeltisi, taze hazirlanan izosiyanata enjeksiyon yoluyla hizla ilave edildi. Reaksiyon karisimi, 40°C sicaklikta 4 saat süreyle karismaya birakildi. Fazlalik çözücü, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; gradiyent, diklorometan içinde %1 metanol ilâ %5 metanol). (EtOAc ve Heksan kullanilan alternatif kromatografi kosullari da basarili olmustur). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik el'ûe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 56 (3,9 g, %50) elde edildi. LC/MS, 4,23 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 952,36 ([M+ H]+', 100); 1H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,62 (br s, lH), 8,46 (s, lH), 7,77 (br s, lH), 7,53 (d,J = 8,4 Hz, 2H), 7,32 (d,J = 8,5 Hz, 2H), 6,76 (s, 1 H), 6,57 (d,J= 7,6 Hz, lH), 6,17 (s, lH), 6,03 - 5,83 (m, 1 H), 5,26 (dd, J : 33,8, 13,5 Hz, 3H), 5,10 (s, 2H), 4,70 - 4,60 (m, 2H), 4,58 (dd,J = 5,7, 1,3 Hz, 2H), 4,06 - 3,99 (m, 1 H), 3,92 (s, 1 H), 3,82 - 3,71 (m, 1 H), 3,75 (s, 3H), 2,79 - 2,64 (m, 1 H), 2,54 ((1, J = 12,9 Hz, 1 H), 2,16 (dq, J = 13,5, 6,7 Hz, 1 H), 1,67 (s, 3H), 1,46 ((1, J = 7,0 Hz, 3H), 1,35 - 1,24 (m, 3H), 1,12 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,97 ((1, J : 6,8 Hz, 3H), 0,94 (d,J : 6,8 Hz, 3H), 0,87 (s, 9H), 0,07- -0,02 (m,1246H).(b) Allil 3-(2-(2-(4-((((2-((S)-2-(hidr0ksimetil)-4-metil-2,3-dihidr0- lH-pirrol-l -karbonil)-4-metoksi-5-((triizopropilsilil)oksi)fenil) karbamoil)oksi)nietil)fenil)hidrazinil)propanamido)-4-metil-2-oksopentanoat (57)TBS eter 56 (1,32 g, 1,38 mmol), asetik asit/metanol/tetrahidrofuran/ suyun (14:2:2:4 mL) 7:1:1:2 oranina karisimi içinde çözündür'uldü ve oda sicakliginda karismaya birakildi. 3 saat sonra, LC/MS yöntemiyle baslangiç malzemesi artik hiç gözlemlenmiyordu. Reaksiyon karisimi, etil asetatla (25 mL) seyreltildi ve sirayla su, doymus aköz sodyum bikarbonat ve tuzlu suyla yikandi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik etil asetat, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel, diklorometan içinde %2 metanol). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak istenen ürün 57 (920 mg, %80) elde edildi. LC/MS, 3,60 dakika (ES+) n1/z(bagil yogunluk) 838,18 ([M+H]+`, 100),]H NMR (400 MHz, CDCl3) 8 8,55 (s, 1 H), 8,35 (s, 1 H), 7,68 (s, 1 H), 7,52 (d,J = 8,1 Hz, 2H), 7,31 ((1, J = 8,4 Hz, 2H), 6,77 (s, 1 H), 6,71 ((1, J = 7,5 Hz, 1H), 6,13 (s, 1 H), 5,97 - 5,82 (m, J : 5,7 Hz, 1H), 5,41 - 5,15 (m, 3H), 5,10 (d, J = 3,5 Hz, 2H), 4,76 - 4,42 (m, 5H), 4,03 (t, J = 6,6 Hz, 1 H), 3,77 (s, 5H), 2,84 (dd, J = 16,7, 10,4 Hz, 1 H), 2,26 - 2,08 (m, 2H), 1,68 (s, 3H), 1,44 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,30 (dt, J = 14,7, 7,4 Hz, 3H), 1,12 (s, 9H), 1,10 (s, 9H), 0,96 (d, J : 6,8 Hz, 3H), 0,93 (d, J : 6,8 Hz, 3H).125(c) (1 18,1 laS)-4-(2-(1-((l -(alliloksi)-4-meti1-l ,2-dioksopentan-3-il) amino)- 1 -oksopropan-Z-il)hidrazini1)benzi1 1 l -hidroksi-7-metoksi-2- meti1-5-okso-8-((triizopropilsilil)oksi)-1 1,1 1 a-dihidro- 1 H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (5 8)Kuru dikloroinetaii (7 mL) içinde oksalil klorür (0,1 1 mL, 1,32 mmol, 1,2 esdegeri) çözeltisine, -780C (kuru buz /aseton banyosu) sicaklikta bir argon atmosferi altinda dimetil sülfoksit (0,2 mL, 2,75 mmol, 2,5 esdegeri) damla dainla ilave edildi. 10 dakika sonra, sicaklik hâlâ - 78°C seviyesindeyken kuru diklorometan (5 mL) içinde 57 (920 mg, 1,10 mmol) çözeltisi yavas yavas ilave edildi. 15 dakika sonra, trietilamin (0,77 mL, 4A moleküler elekler üzerinde kurutulmus, 5,50 mmol, 5 esdegeri) damla damla ilave edildi ve kuru buz/aseton banyosu çikartildi. Reaksiyon karisimi, oda sicakligina ulasana kadar beklemeye birakildi ve soguk hidroklorik asit (0,1 M), doymus aköz sodyum bikarbonat ve tuzlu suyla ekstrakte edildi. Organik faz, magnezyum sülfat 'üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik diklorometan indirgenmis basiiiç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik, flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; gradiyent: diklorometaii içinde %2 metanol ilâ %5 metanol). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 58 (550 mg, %60) elde edildi. LC/MS, 3,43 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 836,01 ([M]+', 100). 1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 8,39 (s, lH), 7,52 7 7,40 (m, 2H), 7,21 7 7,08 (m, J = 11,5 Hz, 2H), 6,67 (s, lH), 6,60 7 6,47 (m, J = 7,4 Hz, lH), 5,97 - 5,83 (m, lH), ,79 - 5,66 (m, lH), 5,38 - 4,90 (m, 6H), 4,68 - 4,52 (m, J : 18,4, 5,5 Hz, 4H), 4,04 - 3,94 (m, .1 : 6,5 Hz, 1 H), 3,87 - 3,76 (m, 5H), 3,00 -1262,88 (m, 1 H), 2,66 - 2,49 (m, 2H), 2,21 _ 2,08 (m, 2H), 1,76 (s, 311), 1,45 ((1, J = 7,0 Hz, 3H), 1,09 - 0,98 (m, J = 8,9 Hz, 18H), 0,96 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,93 (d, J = 6,9 Hz, 3H).(d) (1 1 S, 1 1aS)-4-(2-( l -(( l -(A11iloksi)-4-meti1- l ,2-dioksopentan-3- il)amin0)-1-oksopropan-2-il)hidrazinil)benzil 1 1-((tert-bütildimetil sili1)oksi)-7-metoksi-2-meti1-5-okso-8-((triizopropilsi1i1)0ksi)-1 1,1 1 a- dihidro- 1 H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (59)Kuru diklorometan (5 mL) içinde bilesik 58 (450 mg, 0,54 mmol) ve 2,6-1utidin (0,25 mL, 2,16 inmol, 4 esdegeri) çözetlisine, 0°C sicaklikta argon altinda tert-bütildimetilsililtriflat (0,38 niL, 1,62 inmol, 3 esdegeri) ilave edildi. 10 dakika sonra, soguk banyo çikartildi ve reaksiyon karisimi oda sicakliginda 1 saat süreyle karistirildi. Reaksiyon karisimi, su, doymus aköz sodyum bikarbonat ve tuzlu suyla ekstrakte edildi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik çözücü, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; 50/50 h/h heksan/etil asetat). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 59 (334 mg, %65) elde edildi. LC/MS, 4,18 dakika (ES+) m/z(bag11 yogunluk) 950,50 ([M]+`, 100),1H NMR (400 MHz, CDC13) 6 8,53 (s, 1 H), 8,02 (s, 1 H), 7,44 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,21 (s, 1 H), 7,08 (d, J = 8,2 HZ, 2H), 6,72 - 6,61 (m, J = 8,9 Hz, 2H), 6,16 (s, 1 H), 5,97 - 5,79 (m,J : 24,4, 7,5 Hz, 2H), 5,41 - 5,08 (in, 5H), 4,86(d, J : `12,5 Hz, 1 H), 4,69 - 4,60 (m, 1 H), 4,57 (s, 1 H), 4,03127(t,J = 6,7 Hz, 1 H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (td,.l : 9,6, 3,6 Hz, 1 H), 2,43 - 2,09 (m, J = 34,8, 19,4, 11,7 Hz, 3H), 1,76 (s, 3H), 1,43 ((1, J = 6,9 Hz, 3H), 1,30 - 1,21 (m, 3H), 0,97 (d, J = 6,7 Hz, 3H), 0,92 (t, J = 8,4 Hz, 3H), 0,84 (s, 9H), 0,23 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).(e) (1 18,1 laS)-4-(2-(1-((l-(Alliloksi)-4-metil-1,2-dioksopentan-3- il)amin0)- 1 -0ks0pr0pan-2-il)hidrazinil)benzil l 1-((tert-bütildimetil silil)0ksi)-8-hidroksi-7-met0ksi-2-metil-5-okso-1 1,1 la-dihidro-l H- benz0[e]pirr010[ 1,2-a] [ l ,4] diazepin-10(5H)-karb0ksilat (60)Islak dimetilformamid (4 mL, 50:] DMF/su) içinde bilesik 59 (470 mg, 0,49 mmol) çözeltisine, lityum asetat (50 mg, 0,49 mmol) ilave edildi. 4 saat sonra, reaksiyon tamainlandi ve reaksiyon karisimi, etil asetatla seyreltildi ve sitrik asit (pH ~ 3), su ve tuzlu suyla yikandi. Organik tabaka, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik etil asetat, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; gradiyent, 50/50 ilâ 25/75 h/h heksan/etil asetat). Saf fraksiyonlar toplandi ve koinbine edildi ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak ürün 60 (400 mg, kantitatif) elde edildi. LC/MS, 3,32 dakika (ES+) n1/z(bagil yogunluk) 794,18 ([M+H]+, 100), 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 5 8,53 (s, 1 H), 8,02 (s, 1 H), 7,44 ((1, J : 7,6 Hz, 2H), 7,21 (s, lH), 7,08 ((1, J = 8,2 Hz, 2H), 6,72-6,61 (m, J = 8,9 Hz, 2H), 6,16 (s, lH), 5,97 - 5,79 (m, J = 24,4, 7,5 Hz, 2H), 5,41 - 5,08 (m, 5H), 4,86 ((1, J = 12,5 Hz, 1 H), 4,69 - 4,60 (m, 1H), 4,57 (s, 1 H), 4,03 (t, J : 6,7 Hz, 1 H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (td, J : 9,6, 3,6 Hz, 1 H), 2,43 - 2,09 (m,J : 34,8, 19,4, 11,7 Hz, 3H), 1,76 (s, 3H), 1,43 (d,J 128= 6,9 Hz, 311), 1,30 - 1,21 (m, 311), 0,97 (d,J = 6,7 Hz, 311), 0,92 (1,1 = 8,4 Hz, 3H), 0,84 (s, 9H), 0,23 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).(iv) (1 15,1 1aS)-4-((ZS,5S)-37-(2,5-di0kso-2,5-dihidro-1H-pirrol-l-il)- 5-izopropil-Z-meti1-4,7,35-triokso-10,13,16,l9,22,25 ,28,31-0kta0ksa- 3,6,34-triazaheptatriakontanamido)benzil 1 1-hidr0ksi-7-met0ksi-8-((5-(((81-7-met0ksi-2-meti1-5 -0ks0-5 ,1 1 a-dihidro- 1 H- benzofe1pirr01011 ,2-21111 ,41diazepin-8-il)0ksi)pentil)0ksi)-2-metil-5- OkSO- 1 1,1 la-dihidro-lH-benzo1e]pirr010[1,2-a111,41diazepin-10(5H)- karboksilat g 64 ! i' .i ' _ i . .T i ' . v- , ü..- . '1 1 `r' ,i 2` 3 7 Y _0 ' .. , --( '1 , 1 .. l 1 _i ,l 'I J I ` 1. ' ., -...~:--.^ 4" 3_ _ 4. ' i' \ › _ .- _74` , 1 k. .(a) (1 1S)-a1111 8-((5-(((1 1S)-10-(((4-(2-(1-((1-(a11110ksi)-4-metil-1,2- dioksopentan-3-il)a1nin0)-1 -oksopropan-Z-il)hidrazinil)benzil)0ksi)karbonil)-1 1 -((tert-bütildimetilsili1)0ksi)-7-met0ksi-2-metil-5-okso-5,10,1 1,1la-tetrahidro-1H-benzo[e]pirr010[1,2-a][1,4]diazepin-8-129il)0ksi)penti1)oksi)- 1 l -((tert-bütildin1etilsi1il)0ksi)-7-metoksi-2-n1etil- -0kso-l 1,1 1 a-dihidro- 1 H-benzo[ e] pirrolo[ l ,2-a] [1,4]diazepin- lO(5H)-karb0ksilat (61)Kuru aseton (25 mL) içinde ürün 55 (370 mg, 0,552 m11101, 1,2 esdegeri) ve fe110160 (400 mg, 0,504 mmol) çözeltisine, potasyum karbonat (70 mg, 0,504 minol, l esdegeri) ilave edildi. Reaksiyon 70°C sicaklikta 8 saat süreyle karistirildi. LC/MS, baslangiç malzemesinin hepsinin tüketilmedigini gösterdi; bundan dolayi, reaksiyon, oda sicakliginda gece boyunca karismaya birakildi ve ertesi gün ilave 2 saat daha karistirildi. Aseton, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; heksan içinde %80 etil asetat ilâ %100 etil asetat). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak 'ürün 61 (385 mg, %57) elde edildi. LC/MS, 4,07 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) l336,55 ([M+H]+', 50).(b)(l 18)-alli1 8-((5-(((1 1S)-l0-(((4-(2-(1-((1-(a11iloksi)-4-meti1-1,2- dioksopentai1-3 -il)amino)-l -oksopropan-Zil)hidrazinil)benzi1)0ksi) karboni1)-l 1-hidroksi-7-metoksi-2-n1eti1-5-okso-5,10,1 1,1 la- tetrahidro- 1 H-benzo[e] pirr010[ 1,2-a] [ 1,4]diazepin-8-il)0ksi)penti1) 0ksi)-1 1-hidroksi-7-met0ksi-2-inetil-5-okso-l 1,1 1 a-dihidro- lH- benzo[e]pirrolo[1,2-a][1,4]diazepin-10(5H)-karb0ksilat (62)Kuru tetrahidrofuran (3 mL) içinde 61 (230 mg, 0,172 mmol) çözeltisine, tetra-n-bütilamonyuin florür (1 M, 0,34 mL, 0,34 nnnol, 2esdegeri) ilave edildi. Baslangiç malzemesinin tamami '10 dakika130sonra tüketildi. Reaksiyon karisimi, etil asetatla (30 mL) seyreltildi ve sirayla su ve tuzlu suyla yikandi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik etil asetat indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik 62, bir sonraki reaksiyon için ham karisim olarak kullanildi. LC/MS, 2,87 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1108,11 ([M+H]+'; 100).(0)(1 1S)-4-(2-(1-((1-amin0-3-metil-1-0ksobütan-2-il)amin0)-1- 0ksopropan-2-i1)hidrazini1)benzil l 1 -hidroksi-7-rnetoksi-8-((5-((7- metoksi-Z-metil-5-0kso-5,1 `1a-dihidr0-1 H-benzo[e]pirr010[ 1,2- a][1,4]diazepin-S-il)0ksi)pentil)0ksi)-2-metil-5-okso-1 1,1 la-dihidro-l H-benzo[e] pirr010[ 1 ,2-a] [ l ,4] diazepin- l 0(5H)-karb0ksi1at (63)Kuru diklorometan (10 mL) içinde ham ürün 62 (0,172 inmol) ve pirrolidin (36 uL, 0,43 inmol, 2,5 esdegeri) çözeltisine, tetrakis(trifeni1fosfin)paladyum(0) (12 mg, 0,01 mmol, 0,06 esdegeri) ilave edildi. Reaksiyon karisimi, 20 dakika süreyle karistirildi ve diklorometanla seyreltildi ve sirayla doymus aköz amonyum klorür ve tuzlu suyla yikandi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik diklorometan, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik 63, bir sonraki reaksiyon için bir ham karisim olarak kullanildi. LC/MS, 2,38 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 922,16 ([M+H]+, 40).(d)(l 18,1 1aS)-4-((28,5 S)-37-(2,5-di0ks0-2,5-dihidro- l H-pirrol-l -i1)- -izopropil-Z-metil-4,7,35-tri0kso-10,13,16,19,22,25,28,31-okta0ksa- 3,6,34-triazaheptatriakontanamido)benzil 1 l-hidroksi-7metoksi-8-((5- (((S)-7-metoksi-2-metil-5-okso-5, l la-dihidro-l H-benzo[e] pirr010[ l ,2- 131a] [ l ,4] diazepin-S-il)oksi)pentil)oksi)-2-metil-5-0kso-l 1,1 '1 a-dihidro- lH-benzo[e] pirr010[ 1,2-a] [1,4]diazepin-l0(5H)-karb0ksilat (64)Kuru diklorometan (10 mL) içinde ham 63 (0,172 mmol) ve Mal- (PEG)g-asit (100 mg, 0,172 minol) çözeltisine, l-etil-3-(3'- dimetilaminopropil)karb0diimid (EDCI, 33 mg, 0,172 mmol) ilave edildi. Reaksiyon 2 saat süreyle karistirildi ve LC/MS yöntemiyle baslangiç malzeinesinin artik mevcut olmadigi gözlemlendi. Reaksiyon, diklorometanla seyreltildi ve siraya su ve tuzlu suyla yikandi. Organik faz, magnezyum sülfat üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve fazlalik diklorometan, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartildi. Elde edilen artik flas kolon kromatografisine tâbi tutuldu (silika jel; kloroform içinde %100 kloroform ilâ %10 metanol). Saf fraksiyonlar toplandi ve kombine edildi ve fazlalik elüe edici, indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla çikartilarak 64(E) (60 mg, 3 basamak boyunca %25) elde edildi.Ornek8 . ›››››› u_ _J_ ,u, "T" ' r l!_.Âl._..- 1 L ' ...... ......,, T 1 _' l T ll 1_ ç i l i .. 1 ^ II; ` i 1 ISÇI; .j' r ' r"Bilesik 65, WO 2011/130598 sayili patent basvurusunda açiklanan bilesik 79°dur.132(l 1 S)-4-(1-iyodo-20-izopropil-23-metil-2,'l8,21-triokso-6,9,12,15- tetraoksa-3,19,22-triazatetrakosanamido)benzil 1 l -hidroksi-7- metoksi-8-(3-((7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-l -en- 1 -il)-5 ,l la-dihidro- 1H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [1,4]diazepin-8-il)oksi)propoksi)-5-oks0-2- ((E)-prop- l -en-l -il)-l 1,1 la-dihidro-lH-benzo[e]pirrolo[1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (66)Kuru dikloroinetan (0,8 mL) içinde amin 65 (0,0276 mmol) ve Iyodo- (PEG)4-asit (13,1 mg, 0,0304 mmol) çözeltisine N,N'- diizopropilkarbodiimid (DlC, 4,71 uL, 0,0304 mmol), ilave edildi. Bu reaksiyon 3 saat süreyle karistirildi ve LC/MS ile baslangiç malzemesinin mevcut oldugu gözlemlenemedi. Reaksiyon karisimi dogrudan dogruya bir ince-tabaka kromatografi (TLC) plakasina yüklendi ve prep-TLC (kloroform içinde %10 metanol) ile saflastirildi. Saf bantlar TLC plakasindan kazinarak çikarildi, kloroform içinde %10 metanol içerisinde alindi, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda döner evaporasyonla fazlalik elüe edici çikartildi ve bunun sonucunda, 66 (D) (20,9 mg, %56) elde edildi. LC/MS, yöntem 2, 3,08 dakika (ES+) m/z (bagil yogunluk) 1361,16 ([M+H]_, 100).Örnek 9 için Genel Çalisma YöntemleriLCMS verileri, bir Agilent 6110 kuadropol MS ve Elektrosprey iyonizasyonu ile donatilmis bir Agilent 1200 serisi LC/MS kullanilarak elde edildi. Mobil faz A 7 su içinde %0,1 Asetik asit. Mobil Faz B - asetonitril içinde %0,1. 1,001n1/dk akis hizi. 3 dakika içerisinde %5 Eden %95 B,ye yükselen, 1 dakika boyunca %95 B,de133kalaii ve ardindan, 6 saniye içerisinde tekrar %5 B'ye dönen gradiyent. Toplam çevrim süresi 5 dakikadir. Kolon: Phenomenex Gemini-NX 3 um C18, 30 X 2,00mm. 254nm"de UV tespitine dayanan kromatogramlar. Kütle Spektruinlari pozitif modda MS kullanilarak elde edildi. Proton NMR kimyasal kayma degerleri, bir Bruker AV400 kullanilarak 400 MHz°de delta ölçegi üzerinde ölçüldü. Su kisaltmalar kullanildi: s, singlet; cl, dublet; t, triplet; q, kuartet; m, multiplet; br, genis. Kuplajlaina sabitleri Hz cinsinden rapor edildi. Aksi belirtilmedikçe, (flas prosedürüyle) kolon kromatografisi, Merck Kieselgel silika (Malzeme no: 9385) üzerinde gerçeklestirildi. Kütle spektroskopisi (MS) verileri, bir Waters 2795 HPLC ayirma modülüne baglanmis bir Waters Micromass LCT cihazi kullanilarak toplandi. Ince Tabaka Kromatografisi (TLC), silika jel alüminyum plakalari (Merck 60, F254) üzerinde gerçeklestirildi. Tüin diger kimyasal maddeler ve çözücüler, Sigma-Aldrich ya da Fisher Scientific firmalarindan satin alindi ve daha fazla saflastirma yapilmadankullanildi.Optik rotasyonlar, bir ADP 220 polariinetrede (Bellingham Stanley Ltd.) Ölçüldü ve konsantrasyonlar (c), g/lOO mL birimiyle verilmektedir. Erime noktalari, bir dijital erime noktasi aparati (Electrothermal) kullanilarak ölçüldü. IR spektrumlari, bir Perkin- Elmer Spektrumu 1000 FT IR Spektrometresinde kaydedildi. 'H ve 13C NMR spektrumlari, sirasiyla 400 ve 100 MHz seviyesinde bir Bruker Avance NMR spektroinetresi kullanilarak 300 K"de elde edildi. Kimyasal kaymalar, TMS'ye (8 = 0,0 ppm) göre rapor edilmektedir ve sinyaller, s (singlet), d (dublet), t (triplet), dt (duble triplet), dd (dubletlerin dubleti), ddd (dubletlerin dubletinin dubleti) ya134da m (multiplet) olarak adlandirilir; kuplajlaina sabitleri ise Hertz (Hz) biriiniyle verilir. Kütle spektroskopisi (MS) verileri, Waters 2996 PDA donanimli bir Waters 2695 HPLC sistemine bagli bir Waters Micromass ZQ cihazi kullanilarak toplandi. Asagida açiklanan Waters Micromass ZQ parametreleri kullanildi: Kapiler (kV), 3,38; Koni (H), ; Ekstraktör (H), 3,0; Kaynak sicaklik (OC), 100; Desolvasyon Sicakligi (OC), 200; Koni akis hizi (L/saat), 50; Desolvasyoii akis hizi (L/saat), 250. Yüksek rezolüsyonlu kütle spektroskOpisi (HRMS) verileri, nuinuiieleri cihaza sokmak için metal-kapli borosilikat cain çubuklar kullanilarak, pozitif W-modunda bir Waters Micromass QTOF Global cihazinda kaydedildi. Ince Tabaka Kromatografisi (TLC), silika jel alüminyum plakalarda (Merck 60, 17254) gerçeklestirildi; flas kromatografide ise silika jel (Merck 60, 230-400 inesh ASTM) kullanildi. HOBt (NovaBiochein) ve kati-destekli reaktifler (Argonaut) hariç, diger tüm kiinyasallar ve çözücüler, Sigma-Aldrich firmasindan satin alindi ve ilave saflastirma basamaklarina tâbi tutulniadan tedarik edildigi haliyle kullanildi. Anhidr çözücüler, uygun bir kurutma ajaninin varliginda bir kuru nitrojen atmosferi altinda distilasyonla hazirlandi ve 4A moleküler elekler ya da sodyum tel üzerinde saklaiidi. Petrol eteri, 40-60°C sicaklikta kaynayan fraksiyona atif yapar.Genel LC/MS kosullari: HPLC (Waters Alliance 2695), su (A) (formik asit %0,1) ve asetonitril (B) (forinik asit %0,1) mobil fazi kullanilarak çalistirildi. Gradiyent: baslangiç bilesimi 1,0 dakika boyunca %5 B ve ardindan, 3 dakika içerisinde %5 B ilâ %95 B. Bilesim, %95 B°de 0,5 dakika süreyle tutuldu ve ardindan, 0,3 dakikada %5 B°ye döndü. Toplam gradiyent çevrim süresi 5 dakikaya 135tekabül eder. 3,0 mL/dakika akis hiziyla, 400 "L, kütle spektrometresine geçen bir sifir ölü hacim T parçasiyla bölünmüstür. Dalgaboyu belirleme araligi: 220 ilâ 400 nm. Fonksiyon tipi: diyot dizisi (535 tarama). Kolon: Phenomenex® Oniks Monolitik C18 50 x 4,60 mm.Örnek 9gi) Kilit Ara Ürünlerl i'l' uL ~ N I I _ 14",, ".'i ›1 _› _yi-PM* ' "W- ; H _v "ya/'ji / \\;/1L :ft "%112 A. " A 'ii' __/'\_ ` 'H L" :3N Nrfrr N Nr NmM(a-i) (S)-2-(alliloksokarbonilainino)-3-metilbütanoik asit (12)Allil kloroformat (36,2 ml, 340,59 mmol, 1,2 esdegeri), su (650 mL) ve THF (650 mL) içinde L-valin (Il)(33,25 g, 283,82 mmol, 1,0 esdegeri) ve potasyum karbonat (59,27 g, 425,74 mmol, 1,5 esdegeri) karistirilmis çözeltisine damla damla ilave edildi. Reaksiyon karisimi oda sicakliginda 18 saat süreyle karistirildi ve ardindan, çözücü indirgenmis basinç altinda konsantre edildi ve geriye kalan çözelti, dietil eterle (3 x 100 mL) ekstrakte edildi. Aköz kisim, konsantre HC1°yle pH 2 seviyesine kadar asitlestirildi ve DCM'yle (3 x 100 mL)136ekstrakte edildi. Kombine organikler tuzlu suyla yikandi; MgSO4 üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edilerek bir renksiz yag formunda ürün (57,1 g, varsayilan %100 verim) elde edildi. LC/MS (1,966 dakika (ES+)),1n/z: 202,1 [M+H]+,1H NMR (400 MHz, DMSO-dö) 8 12,57 (br s, lH), 7,43 (d, lH, J = 8,6 Hz), 5,96 - 5,86 (m, lH), 5,30 (ddd, lH, J = 17,2, 3,4, 1,7 Hz), 5,18 (ddd, lH, J = 10,4, 2,9, 1,6 Hz), 4,48 (dt, 2H, J = 5,3, 1,5 Hz), 3,85 (dd, lH, J = 8,6, 6,0 Hz), 2,03 (oct, lH, J = 6,6 Hz), 0,89 ((1, 3H, J : 6,4 Hz), 0,87 ((1, 3H, J : 6,5 Hz).(a-ii) (8)-2,5-dioks0pirrolidin-l-il 2-(alliloksokarbonilamin0)-3- metilb'ûtanoat (13)Kuru THF (800 mL) içinde korunan asit 12 (60,6 g, 301,16 mmol, 1,0 esdegeri) ve N-hidroksosüksinimid (34,66 g, 301,16 mmol, 1,0 esdegeri) karistirilmis çözeltisine, disikloheksilkarbodiimid (62,14 g, 301,16 mmol, l esdegeri) ilave edildi. Reaksiyon oda sicakliginda 18 saat süreyle karistirildi. Daha sonra, reaksiyon karisimi filtrelendi; kati madde THF"yle yikandi ve kombine filtrat indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen artik, DCM içinde yeniden çözündür'ûldü ve 0°C sicaklikta 30 dakika süreyle beklemeye birakildi. Süspansiyon filtrelendi ve soguk DCM"yle yikandi. Indirgenmis basinç altinda filtrat konsantrasyonu, viskoz renksiz bir yag formunda ürün (84,7 g, varsayilan %100 verim) verdi ve bu ürün de, ilave saflastirma islemine tâbi tutulmadan bir sonraki basamakta kullanildi. LC/MS (2,194 dakika (Es+)), m/z: 321,0 [M+Na]+, iH NMR (400 MHZ, DMSO-dö) 6 8,0 ((1, lH, J : 8,3 Hz), 5,97 - 5,87 (m, lH), 5,30 (ddd, lH,J : '17,2, 3,0, 1,7 Hz), 5,19 (ddd, lH,J : 10,4, 2,7, 1,4 Hz), 4,52137(dt, 211,1 = 5,3, 1,4 Hz), 4,32 (dd, 1H,J = 8,3, 6,6 Hz), 2,81 (m, 411), 2,18 (oct, 1H, J = 6,7 Hz), 1,00 ((1, 6H, J = 6,8 Hz),(a -iii) (S)-2-((S)-2-(a lliloksokarbonilamino)-3 -metilbütanainid0) propanoik asit (14)THF (50 mL) içinde süksinimid ester 13 (12,99 g, 43,55 inmol, 1,0 esdegeri) çözeltisi, THF (100 mL) ve H2O (100 mL) içinde L-alanin (4,07 g, 45,73 ininol, 1,05 esdegeri) ve NaHCO3 (4,02 g, 47,90 mmol, 1,1 esdegeri) çözeltisine ilave edildi. THF indirgenmis basinç altinda çikartildiktan sonra, karisim oda sicakliginda 72 saat süreyle karistirildi. pH degeri sitrik asitle 3-4°e ayarlanarak beyaz renkte bir zamk çökeltildi. Etil asetatla (6 x 150 mL) ekstraksiyondan sonra, kombine organikler, H20°y1a (200 mL) yikandi; MgSO4 üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Dietil eterle trit'ûrasyon, beyaz renkte bir toz formunda ürün verdi ve bu ürün de filtrasyonla t0plandi ve dietil eterle (5,78 g, %49) yikandi. LC/MS (1,925 dakika (ESÜ), m/z: 273,1 [M+H]+, lH NMR (400 MHz, DMSO-dö) 6 12,47 (br s, 1H), 8,17 (d, 1H,J : 6,8 Hz), 7,16 ((1, 1H, J = 9,0 Hz), 5,95 - 5,85 (m, lH), 5,29 (dd, 1H, J = 17,2, 1,7 Hz), ,17 (dd, 1H,J = 10,4, 1,5 Hz), 4,46 (m, 2H), 4,18 (kuin, 1H,J = 7,2 Hz), 3,87 (dd, 1H, J = 9,0, 7,1 Hz), 1,95 (oct, 1H, J = 6,8 Hz), 1,26 ((1, 3H, J : 7,3 Hz), 0,88 (d, 3H, J : 6,8 Hz), 0,83 ((1, 3H, J : 6,8 Hz).(a-iv) Allil (S)-l -((S)-1-(4-(hidroksometil)fenilainino)-1-oksopropan-2-ilamino)-3-metil- l -oksobütan-Z-ilkarbaniat (15)138Kuru THF (100 mL) içinde p-aminobenzil alkol (2,74 g, 22,29 mmol, 1,05 esdegeri) ve asit 14 (5,78 g, 21,23 mmol, 1 esdegeri) çözeltisine, EEDQ (5,51 g, 22,29 mmol, 1,05 esdegeri) ilave edildi ve oda sicakliginda 72 saat süreyle karistirildi. Daha sonra, reaksiyon karisiini indirgeninis basinç altinda konsantre edildi ve elde edilen kahverengi renkte kati, dietil eterle tritüre edildi ve fazladan dietil eterle müteakip yikaina yapilarak filtrelendi ve böylece, kirik beyaz renkte bir kati formunda ürün (7,1 g, %88) elde edildi. LC/MS (1,980 dakika (ESÜ), m/z: 378,0 [M+H]+, 1H NMR (400 MHz, DMSO-dö) 5 9,89 (br s, 1H), 8,13 ((1, 11-1, J = 7,0 Hz), 7,52 (d, 2H, J = 8,5 Hz), 7,26 (m, 1H), 7,23 ((1, 2H, J = 8,5 Hz), 5,91 (m, 1H), 5,30 (m, 1H), 5,17 (m, 1H), 4,46 (m, 2H), 5,09 (t, lH, J = 5,6 Hz), 4,48 (m, 21-1), 4,42 (m, 3H), 3,89 (dd, 1H, J: 8,6, 6,8 Hz), 1,97 (m, 1H), 1,30 ((1, 3H, J : 7,1 Hz), 0,88 ((1, 3H, J 1 6,8 Hz), 0,83 (d, 3H, J : 6,7 Hz).i: LI I1-iy0d0-2-0kso-6,9,12,15-tetra0ksa-3-azaoktodekan-18-0ik asit (17)Kuru DCM (1 mL) içinde iyodoasetik anhidrit (0,250 g, 0,706 mmol, 1,1 esdegeri) çözeltisi, DCM (1 mL) içinde amino-PEG(4)-asit16"ya (0,170 g, 0,642 mmol, 1,0 esdegeri) ilave edildi. Karisim, karanlik oda sicakliginda gece boyunca karistirildi. Reaksiyon karisimi, 0,] M HCl ve suyla yikandi; MgSO4 üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen artik, flaskromatografiyle (silika gel, kloroform içinde %3 MeOH ve %0,1 139formik asitten kloroform içinde %10 MeOH ve %0,1 formik aside kadar) saflastirilarak turuncu renkte bir yag formunda ürün (0,118 g, %42) elde edildi. LC/MS (1,623 dakika (ES+)), m/Z: 433,,98 [M+H]+, lH NMR (400 MHZ, CDC13) 8 8,069 (3, lH), 7,22 (br s, 1H),5 3,79 (t, 2H, J = 5,8 Hz), 3,74 (s, 2H), 3,72 - 3,58 (m, 14H), 3,50 - 3,46 (m, 2H), 2,62 (t, 2H, J = 5,8 Hz).(ii) (1 1S,1 laS)-allil 1 1-(tert-bütildiinetilsililokso)-8-(3- ivodopropokso)-7-rnet0ksi-5-0ks0-2-((E)-pr0p-1-enil)-1 1,1 1 a-dihidro- 1 H-benzoIeîpirrolofl,2-a][1,41diazepin-10(5H)-karb0ksolat (74) "x-::v .- _ _ . 7-_ .. 1 _ _› 1' 1 H . \ 45` 1 L .- '^ «- . '~ . N _. _ 5 'I \. - `T \ x.` i.: 'I __` : (f _ '. 1 ':, "i-l .4% ' ' V 1 _, Il v _ `1 \ i "- Fit `- d _1 , i'ii i' ': ` d. _ i #i , =." , f "4 ~ '_ I. _ I 1 P - ( ç #0 i" -› .-' :::dir -4 H H i * c.' i 1 .1, ,,..-.\ ?(-i ., . r .› H L ' - .- " "v4 `\.`.gr-J~`.__r4-\_ `fr \/.J*\`_/ \ `T 'xýkâr . 4 .' 1 -1' . . i ' 1 t' u _/ 'x_ ,i-\_ __. "- .. 31;:: , I!. I . *1 "I" .J il" t"\v:î:]"~._-:î:"›"~.15 (a) (8)-5-((tert-bütildimetilsi1i10kso)1neti1)-1-(5-met0ksi-2-nitr0-4- (triizopropilsililokso)benzoi1)-4,5-dihidro- l H-pirrol-3 -iltriflorometansülfonat (47)140-50°C sicaklikta 2,6-lutidin (14,4 g, 130,0 mmol, 4,0 esdegeri) içeren DCM (550 mL) içinde keton 46"n1n (19,5 g, 30,0 mmol, 1,0 esdegeri) kuvvetlice karistirilmis çözeltisine, triflik anhidrit (28,4 g, 100,0 mmol, 3,0 esdegeri) 25 dakika boyunca damla damla ilave edildi. LC/MS reaksiyonun tamamlandigini gösterdiginde, reaksiyon karisimi 1,5 sat süreyle karistirildi. Organik faz; su (100 mL), doymus sodyum bikarbonat (150 mL) ve tuzlu suyla (50 mL) art arda yikandi ve organik faz MgSO4 üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen artik, flas kromatografiyle (silika jel, 90/10 h/h n-heksan/EtOAc) saflastirilarak soluk sari renkte bir yag formunda ürün (19,5 g, %82) elde edildi. LC/MS (4,391 dakika (ES+)),m/z: 713,25 [M+H]+,1H NMR (400 MHZ, CDC13) 5 7,68 (s, lH), 6,72 (s, lH), 6,02 (t, lH, J : 1,9 Hz), 4,75 (m, lH), 4,05 (m, 2H), 3,87 (s, 3H), 3,15 (ddd, lH,J : 16,2, 10,3, 2,3 Hz), 2,96 (ddd, lH, J = 16,2, 4,0, 1,6 Hz), 1,28 - 1,21 (m, 3H), 1,07 (d, 18H, J = 7,2 Hz), 0,88 (s, 9H), 0,09 (s, 3H), 0,08 (s, 3H).(b) (S,E)-(2-((tert-büti1dimetilsi1i10kso)meti1)-4-(pr0p-1-enil)-2,3 - dihidro- l H-pirrol- l -i1)(5-metoksi-2-nitro-4-(triizopropilsililokso)fenil)nietanon (67)Kuru dioksan (60 mL) içinde triflat 47 (8,4 g, 11,8 mmol, 1,0 esdegeri), E-l-propen-l-ilboronik asit (1,42 g, 16,5 mmol, 1,4 esdegeri) ve potasyum fosfat (5,0 g, 23,6 mmol, 2,0 esdegeri) karisimina bir nitrojen atmosferi altinda tetrakis(trifeni1fosfin)paladyum(0) (0,41 g, 0,35 mmol, 0,03 esdegeri) ilave edildi. LC/MS reaksiyonun tamamlandigini gösterdiginde,karisiin 25°C sicaklikta 120 dakika süreyle karistirildi. Etil asetat (120141mL) ve su (120 mL) ilave edildi; organik faz çikartildi; tuzlu suyla (20 mL) yikandi; MgSO4 üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen artik, flas kromatografiyle (silika jel, 95/5 h/h n-heksan/EtOAc ilâ 90/10 h/h n-heksan/EtOAc) saflastirilarak sari renkte bir köpük formunda ürün (4,96 g, %70) elde edildi. LC/MS (4,477 dakika (ES+)), m/z: 605,0 [M+H]+, lH NMR (400 MHz, CDCl3) 8 7,67 (s, 1H), 6,74 (s, lH), 5,93 ((1, lH, J = 15,4 Hz), 5,67 (s, lH), 4,65 (m, 1H), 4,04 (m, 2H), 3,86 (s, 3H), 2,85 (m, lH), 2,71 (m, 1H), 1,72 (dd, 3H, J : 6,8, 1,0 Hz), 1,30 - 1,22 (m, 3H), 1,07 (d, 18H, J = 7,2 HZ), 0,87 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H).(c) (S,E)-(2-amino-5-metoksi-4-(triizopropilsililokso)fenil)(2-((tert- bütildimetilsi1i10kso)metil)-4-(prop-1-eni1)-2,3 -dihidro- l H-pirrol- 1 - i1)metanon (68)Sicakligi 25°C - 30°C arasinda tutmak için bir buz banyosu kullanilarak, %5 h/h formik asit / etanol (55 mL) içinde pr0penil ara ürünü 67 (5,5 g, 9,1 inmol, 1,0 esdegeri) çözeltisine 20 dakika boyunca alikotlar halinde çinko tozu (22,0 g, 0,33 mol, 37 esdegeri) ilave edildi. 30 dakika sonra, reaksiyon karisimi kisa bir celite® yatagindan fitrelendi. Celite®, etil asetatla (65 mL) yikandi ve kombine organikler; su (35 mL), doymus sodyum bikarbonat (35 mL) Ve tuzlu suyla (10 mL) art arda yikandi. Organik faz, MgSO4 üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen artik, flas kromatografiyle (silika gel, 90/ 10 h/h n- heksan/EtOAC) saflastirilarak soluk sari renkte bir yag formunda ürün (3,6 g, %69,0) elde edildi. LC/MS (4,439 dakika (ESÜ), m/z: 575,2 [M+H]+, 'H NMR (400 MHz,CDC13) 8 6,75 (m, lH), 6,40 (br s, in),1426,28 (m, in), 6,11 (d, 114,1 = 15,4 Hz), 5,53 (m, in), 4,67 (m, 111), 4,36 (m, 2H), 3,93 (br s, lH), 3,84 (br s, lH), 3,73 (s, 3H), 2,86 (dd, 1H,J= 15,7, 10,4 Hz), 2,73 (dd, 1H,J= 15,9, 4,5 Hz), 1,80 (dd, 3H, J : 6,8, 1,3 Hz), 1,35 - 1,23 (m, 3H), 1,12 (d, 18H, J : 7,3 Hz), 0,89 (s, 9H), 0,08 (s, 3H), 0,07 (s, 3H).(d) (S,E)-allil 2-(2-((tert-bütildimetilsililokso)metil)-4-(prop-l-enil)- 2,3-dihidro- 1 H-pirrol- 1 -karbonil)-4-inetoksi-5 - (triizopropilsililokso)fenilkarbamat (69)-78°C sicaklikta kuru piridin (1,09 g, 13,77 mmol, 2,2 esdegeri) içeren kuru DCM (80 mL) içinde amin 68 (3,6 g, 6,26 mmol, 1,0 esdegeri) çözeltisine, allil kloroformat (0,83 g, 6,88 inmol, 1,1 esdegeri) ilave dildi. Kuru buz çikartildi ve reaksiyon karisimi oda sicakligina kadar isinmaya birakildi. Ilave 15 dakika daha karistirma isleminden sonra, LC/MS, reaksiyonun tamamlandigini gösterdi. Organik faz, art arda 0,01 N HCl (50 mL), doymus sodyum bikarbonat (50 mL), tuzlu suyla (10 mL) yikandi; MgSO4 `uzerinde kurutuldu; filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edilerek soluk sari renkte bir yag (4,12 g, varsayilan %100 verim) elde edildi ve bu da, ilave saflastirma islemine tâbi tutulmadan bir sonraki basamakta kullanildi. LC/MS (4,862 dakika (ESÜ), m/z: 659,2 [M+H]+.(e)(S,E)-allil 2-(2-(hidroksometil)-4-(prop-1-enil)-2,3-dihidro-1H- pirrol- 1 -ka rbonil)-4-metoksi-5 -(triizopropilsililokso)fenilkarbamat(70)143Ham ara ürün 69 (varsayilan %100 verim, 4,12 g, 6,25 mmol, 1,0 esdegeri), bir asetik asit (70 mL), metanol (10 mL), THF (10 mL) ve su (20 mL) karisimi içinde çözündür'ûldü ve oda sicakliginda karismaya birakildi. 6 saat sonra, reaksiyon karisimi, etil asetatla (500 mL) seyreltildi ve art arda su (2 x 500 mL), doymus sodyuin bikarbonat (300 mL) ve tuzlu suyla (50 mL) yikandi. Organik faz, MgSO4 üzerinde kurutuldu; filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen artik, flas kromatografiyle (silika jel, 1/99 h/h metanol/DCM ilâ 5/95 h/h metanol/DCM) saflastirilarak sari renkte bir yag formunda ürün elde edildi ve bir ilave 1 g reaksiyona girmemis baslangiç malzemesi geri kazanildi. Bu malzeme, yukarida açiklanan reaksiyon kosullarinin aynisina tâbi tutuldu, fakat 16 saat süreyle karismaya birakildi. Isleme ve saflastirmadan sonra, ilave ürün izole edildi (2,7 g, %79, 2 basamak) LC/MS (3,742 dakika (ES+)), m/z: 545,2 [M+H]+, 'H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,38 (m, lH), 7,72 (in, lH), 6,81 (s, lH), 6,37 (m, lH), 6,10 ((1, lH, J = 15,8 Hz), 5,97 (in, lH), 5,53 (m, lH), 5,36 (ddd, lH, J = 17,2, 3,1, 1,5 Hz), ,25 (ddd, lH, J : 10,4, 2,5, 1,3 Hz), 4,78 (m, lH), 4,65 (dt, 2H, J : ,7, 1,3 Hz), 3,84 (m, 3H), 3,79 (s, 3H), 3,04 (dd, 1H,J : 16,7, 10,5 Hz), 2,40 (dd, lH, J = 16,0, 4,5 Hz), 1,82 (dd, 3H, J = 6,8, 1,0 Hz), 1,36 - 1,26 (m, 3H), 1,14 ((1, 18H, J = 7,3 Hz).(f) (1 1 S, 1 1aS)-alli1 1 1-hidroksi-7-met0ksi-5-0kso-2-((E)-prop-1-eni1)- 8-(triizopropilsililoksi)-1 1,1 1a-dihidro-lH-benzo[e]pirrolo[ 1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-karb0ksilat (71)Kuru dimetil sülfoksit (1,16 g, 14,87 mmol, 3,0 esdegeri), DCM (25 mL) içinde oksalil klor'ur (0,94 g, 7,43 mmol, 1,5 esdegeri) çözeltisine144-78°C sicaklikta ve nitrojen atmosferi altinda damla damla ilave edildi. Sicaklik -78°C"de tutuldu ve 10 dakika sonra, DCM (20 mL) içinde primer alkol 70 (2,7 g, 4,96 mmol, 1,0 esdegeri) çözeltisi damla damla ilave edildi. 15 dakika daha sonra, kuru trietilamin (2,5g, 24,78 mmol, 5,0 esdegeri) ilave edildi ve reaksiyoii karisimi oda sicakligina kadar sogumaya birakildi. Reaksiyoii karisimi, sirasiyla, soguk 0.1 N HCl (50 mL), doymus sodyum hidrojen karbonat (50 mL) ve brin (10 mL) ile yikandi ve organik tabaka; MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgeninis basiiiç altinda konsantre edildi ve bunun sonucunda, daha fazla saflastirilma islemine sokulmaksizin bir sonraki basamakta kullanilacak olan sari renkte yag formunda ürün elde edildi (2,68g, varsayilan %100 verim). LC/MS (3,548 dakika (ES+)), ni/z: 543,2 [M+H]+.(g) (1 18,1 1aS)-allil l l-(tert-bütildiinetilsililoksi)-7-metoksi-5-okso-2- ((E)-pr0p- l -eni1)-8-(triizopr0pi1sililoksi)-l 1,1 la-dihidro- 1 H- benzo[e] pirr010[ 1 ,2-a] [ l ,4] diazepin-10(5H)-karb0ksilat (72)Kuru DCM (40 mL) içinde karbinolaiiiin 7l (varsayilan %100 verim, 2,68 g, 4,96 minol, 1,0 esdegeri) ve 2,6-lutidin (2,12 g, 19,83 minol, 4,0 esdegeri) çözeltisine 0°C sicaklikta ve nitrojen atmosferi altinda tert-bütildiinetilsililtriflorometan sülfonat (3,93 g, 14,87 inmol, 3,0 esdegeri) ilave edildi. 10 dakika sonra, reaksiyon karisinii oda sicakligina ulasana kadar isinmaya birakildi ve 60 dakika daha karistirildi. Organik faz, sirasiyla, su (10 mL), doymus sodyum bikarbonat (10 mL) ve brin (5 mL) ile yikandi, MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basiiiç altinda konsantre edildi.Bu artik, flas kromatografisiyle (silika jel, kloroforni ilâ 2/98 h/h145Metanol/kloroform) saflastirildi ve bunun sonucunda, sari renkte yag forinunda ürün (2,0 g, %63, 2 basamak) elde edildi. LC/MS (4,748 dakika (ES+)), m/z: 657,2 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDC13) 8 7,19 (s, lH), 6,86 (m, lH), 6,66 (s, lH), 6,22 ((1, 1H, J : 15,4 Hz), 5,81 ((1, 1H, J: 8,8 Hz), 5,78 (m, lH), 5,48 (m, lH), 5,11 ((1, 1H, J : 5,0 Hz), ,08 (m, lH), 4,58 (dd, lH, J = 13,4, 5,4 Hz), 4,35 (dd, 1H, J = 13,2, ,7 Hz), 3,83 (s, 3H), 3,76 (s, lH), 3,00 (dd, 1H, J = 15,6, 11,0 Hz), 2,53 (m, lH), 1,81 (dd, 3H, J = 6,8, 0,9 Hz), 1,30 7 1,18 (ni, 3H), 1,08 ((1, 9H, J : 2,3 Hz), 1,06 (d, 9H, J : 2,3 Hz), 0,86 (s, 9H), 0,25 (s, 3H), 0,18 (s, 3H).(h) (1 1 S, 1 laS)-allil 1 l-(tert-bütildimetilsililoksi)-8-hidroksi-7- metoksi-5-0ks0-2-((E)-pr0p-1-enil)-1 1,1 la-dihidro- 1 H- benz0[e] pirr010[ 1,2-a] [ l,4]diazepin-10(5H)-karb0ksilat (73)Lityum asetat dihidrat (0,31 g, 3,04 mmol, 1,0 esdegeri), yas DMF (20 mL) içinde diazepin 72 (2,0 g, 3,04 mmol, 1,0 esdegeri) çözeltisine °C sicaklikta ilave edildi ve 4 saat süreyle karistirildi` Reaksiyon karisimi, eti] asetat (200 mL) ile seyreltildi ve sirasiyla, 0.1 M sitrik asit (50 mL, pH 3), su (50 mL) ve brin (10 mL) ile yikandi, MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Bu artik, flas kromatografisiyle (silika jel, 50/50 h/h n- heksan/EtOAc ilâ 25/75 h/h n-heksan/EtOAc) saflastirildi ve bunun sonucunda, soluk sari renkte kati formda ürün (0,68g, %45) elde edildi. LC/MS (3,352 dakika (ES+)),mlz: 501,1 [M+H]+. lH NMR (400 MHZ, CDCl3) 8 7,02 (s, lH), 6,66 (m, lH), 6,53 (s, lH), 6,03 ((1, 1H, J : 15,5 Hz), 5,80 (s, lH), 5,63 ((1, 1H, J : 8,9 Hz), 5,55 (m, lH), ,29 (m, lH), 4,87 (in, 21-1), 4,39 (dd, 1H,J : `13,5, 4,2 Hz), 4,20 (dd,146111,1: 13,2, 5,7 Hz), 3,73 (s, 3H), 3,59 (m, 111), 2,81 (dd, 111,1 = 16,1, 10,5 Hz), 2,35 (d, lH,J = 15,7 Hz), 1,61 ((1, 3H,J= 6,4 Hz), 0,67 (s, 9H), 0,05 (s, 3H), 0,00 (s, 3H).(i) (1 18,1 laS)-alli1 l 1-(tert-bütildinietilsililoksi)-8-(3-iyodopropoksi)- 7-niet0ksi-5-0kso-2-((E)-pr0p- l -enil)-1 1,1 la-dihidro- 1 H-benzo[e] pirr010[ 1,2-a] [ l ,4] diazepin-10(5H)-karb0ksi1at (74) Diiyod0pr0pan (0,295 g, 1,00 mniol, 5,0 esdegeri) ve potasyum karbonat (0,028 g, 0,20 minol, 1,0 esdegeri); kuru aseton (5 mL) içinde fenol 33 (0,100 g, 0,020 nimol, 1,0 esdegeri) çözeltisine ilave edildi. Reaksiyon karisimi 60°C sicaklikta 6 saat süreyle isitildi ve bu süre sonlandiginda, LC/MS reaksiyonun tamamlandigini gösterdi. Reaksiyon karisimi indirgenmis basinç altinda kuruyana kadar konsantre edildi ve bu artik, flas kroinatografisiyle (silika jel, 75/25 h/h n-heksan/EtOAc ilâ 50/50 h/h n-heksan/EtOAc) saflastirildi ve bunun sonucunda, renksiz yag formunda `ürün (0,074 g, %56) elde edildi. LC/MS (3,853 dakika (ES+)),1n/z: 669,0 [M+H]+. 'H NMR (400 MHZ, CDC13) 6 7,26 (s, lH), 6,90 (s, lH), 6,68 (s, lH), 6,24 ((1, 1H,J: 15,3 Hz), 5,87 ((1, 1H,J : 8,9 Hz), 5,78 (m, 1 H), 5,53 (m, lH), 5,12 (m, 2H), 4,65 (m, 2H), 4,41 (m, lH), 4,11 (m, lH), 3,93 (s, 3H), 3,81 (m, lH), 3,40 (t, 2H,J = 6,7 Hz), 3,05 (dd, lH,J = 16,3, ,1 Hz), 2,57 (ni, lH), 2,34 (in, 2H), 1,84 ((1, 3H, J = 6,6 Hz), 0,92 (s, 9H), 0,28 (s, 3H), 0,26 (s, 3H).(iii) (1 18,1 laS)-4-((S)-2-((S)-2-(alliloksikarbonilamino)-3- metilbutanamido)propanamido)benzil 1 l-(tert-bütildimetilsililoksi)-8- hidroksi-7-n1et0ksi-5-0ks0-2-((E)-prop-l -enil)-l 1,1 la-dihidro- lH- benzole]pirrolo[1,2-al[l ,4ldiazepin-10(5H)-karboksilat (79)147in... o " . i ' 1' 1 ":1 ..1. ..i n i :i . a '- i- "w-"- ._0 ~. . .T .I'îîiî `- -:~ 'TJ-.`-" 1 _I_ ` `_.___l'l__w_1 i. "'"r i: "1 ' 1 `(1.... - _1 _I_ Il . . .1 _l IL. ^-"` "vI- _s_ _ w.' ,V-Il L ç i 1 :L i ' n i T` "11_ l ll_ _* _ 3:( L 1;( `:4 1 :L i l ::[7 (Na-:L- ~- "' v ' x' (a) Allil ((S)-1-(((S)-1-((4-((((2-((S)-2-(((tert-büti1dimetilsilil)oksi)metil)-4-((E)-prop-l -en- 1 -il)-2,3-dihidr0- 1 H- pirrol- 1 -karbonil)-4-metoksi-5- ((triizopropilsili1)oksi)phenil)karbanioil)oksi)metil)pheni1)amin0)-1 -0ks0pr0pan-2-il)amino)-3-nietil-1-oksobutan-Z-il)karbamat (75)Kuru THF (15 mL) içinde amin 68 (0,480 g, 0,835 mmol, 1,0 esdegeri) ve trifosgenden (0,089 g, 0,301 inmol, 0,36 esdegeri) olusan karistirilmis bir çözeltiye 5°C sicaklikta (buz banyosu) trietilamin (0,256 mL, 1,84 mmol, 2,2 esdegeri) ilave edildi. Reaksiyon karisimindan periyodik olarak alikotlar çikartilarak, metanolle söndürülerek ve LC/MS analizi gerçeklestirilerek izosiyanat reaksiyonunun seyri izlendi. Izosiyanat reaksiyonu tamamlandiktansonra, kuru THF (10 mL) içinde Alloc-Val-Ala-PABOH 15 (0,473 g,1481,25 mmol, 1,5 esdegeri) ve trietilamin (0,174 mL, 1,25 mmol, 1,5 esdegeri) çözeltisi, taze hazirlanmis izosiyanata enjeksiyon yoluyla hizla ilave edildi. Reaksiyon, 40°C sicaklikta 4 saat süreyle karismaya birakildi ve ardindan, oda sicakliginda gece boyunca karistirildi. Bu karisini, indirgenmis basinç altinda konsantre edildi ve flas kromatografisiyle (silika jel, 20/80 h/h n-heksan/EtOAc ilâ 50/50 h/h n-heksan/EtOAc, ardindan 1/99 h/h DCM/MeOH ilâ 5/95 h/h DCM/MeOH) saflastirildi ve bunun sonucunda, sari renkte kati formda ürün (0,579 g, %71) elde edildi. LC/MS (4,468 dakika (ES+)), m/z: 978,55 [M+H]+. 1H NMR (400 MHz, CDC13) 5 8,63 (br s, lH), 8,42 (s, 1H), 7,78 (br s, 1H), 7,53 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,31 ((1, 2H, J = 8,6 Hz), 6,76 (s, 1H), 6,59 (d, 1H,J = 7,6 Hz), 6,36 (br s, 1H), 6,04 ((1, 1H, J : 15,9 Hz), 5,90 (m, lH), 5,55 (ni, 1H), 5,33 - 5,21 (m, 3H), 5,10 (s, 2H), 4,66 (m, 2H), 4,57 (dd, 2H, J : 5,6, 1,0 Hz), 3,98 (dd, lH, J = 7,3, 6,8 Hz), 3,90 (m, lH), 3,81 (m, lH), 3,78 (s, 3H), 2,82 (dd, lH, J = 15,4, 9,6 Hz), 2,72 (dd, lH, J = 15,9, 3,5 Hz), 2,17 (m, 1H), 1,78 (dd, 3H, J = 6,5, 0,8 Hz), 1,46 (d, 3H, J= 7,1 Hz), 1,29 (m, 3H), 1,11 ((1, 18H, J : 7,1 Hz), 0,97 ((1, 3H, J : 6,8 Hz), 0,92 ((1, 3H, J : 6,8 Hz), 0,83 (s, 9H), 0,04 (s, 3H), 0,01 (s, 3H).(b) Allil ((S)-1 -(((S)-1 -((4-((((2-((S)-2-(hidr0ksimeti1)-4-((E)-prop-1 - en-l -il)-2,3 -dihidro- lH-pirrol- 1 -karbonil)-4-metoksi-5 - ((triizopropilsilil)oksi)phenil)ka rbamoil)oksi)metil)phenil)aniino)- 1 -oksopropan-2-il)amino)-3-metil-1-oksobutan-2-il)karbamat (76)Silil eter 75 (1,49 g, 1,52 mmol, 1,0 esdegeri), asetik asit/ metanol/ tetrahidrofuran/ suyun (14:2:2:4 mL) 7:1:1:2 oraninda karisimiiçerisinde çözündürüldü ve oda sicakliginda karismaya birakildi. 2149saat sonra, reaksiyon EtOAc (100 mL) ile seyreltildi ve sirasiyla, su, aköz sodyum bikarbonat ve ardindan, brin ile yikandi. Organik faz; MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Bu artik, flas kromatografisiyle (silika jel, 100/0 ardindan 99/1 ilâ 92/8 h/h DCM/ MeOH) saflastirildi ve bunun sonucunda, turuncu renkte kati formda ürün (1,2 g, %92) elde edildi. LC/MS (3,649 dakika (ES+)), m/z: 865,44 [M+H]+.1H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,44 (s, lH), 8,35 (s, lH), 7,69 (br s, lH), 7,53 ((1, 2H, J : 8,7 Hz), 7,32 ((1, 2H, J : 8,3 Hz), 6,78 (s, lH), 6,56 (m, 2H), 6,32 (br s, lH), 6,05 ((1, '1H,J = 14,9 Hz), 5,90 (m, lH), 5,56 (m, 1 H), ,30 (m, 2H), 5,22 (m, lH), 5,10 ((1, 2H, J = 3,1 HZ), 4,73 (m, lH), 4,64 (m, lH), 4,57 ((1, 2H,] = 5,8 HZ), 4,01 (m, lH), 3,79 (m, 2H), 3,76 (s, 3H), 2,98 (dd, 1H, J : 16,3, 10,2 Hz), 2,38 (dd, lH, J : 16,6, 4,1 Hz), 2,16 (m, lH), 1,78 (dd, 3H, J : 6,8, 0,9 Hz), 1,46 (d, 3H, J : 7,1 Hz), 1,29 (m, 3H), 1,11 ((1, 18H, J = 7,4 Hz), 0,97 ((1, 3H, J = 6,7 Hz), 0,92 ((1, 3H, J = 6,8 HZ).(C) (1 1 S, 1 1aS)-4-((S)-2-((S)-2-(alliloksikarbonilamino)-3- inetilbutanainido)propanamido)benzil 1 l-hidroksi-7-metoksi-5-okso- 2-((E)-prop-1-enil)-8-(triizopropilsililoksi)-l 1,1 1a-dihidro-1H- benzo[e] pirrolo[ l ,2-a] [ l ,4] diazepin- l 0(5H)-karboksi1at (77)Kuru dimetil sülfoksit (0,180 g, 2,3 minol, 3,0 esdegeri), DCM (10 mL) içinde oksalil klorür (0,147 g, 1,1 mmol, 1,5 esdegeri) çözeltisine -78°C sicaklikta ve nitrojen atmosferi altinda damla damla ilave edildi. 20 dakika sonra, sicakligi -78°C"de tutarak, DCM (10 mL) içinde primer alkol 76 (0,666 g, 0,77 mmol, 1,0 esdegeri) çözeltisidamla damla ilave edildi. 15 dakika daha sonra, kuru trietilaniiii150(0,390 g, 3,85 mmol, 5,0 esdegeri) ilave edildi ve reaksiyon karisimi, oda sicakligina ulasana kadar isinmaya birakildi. Reaksiyon karisimi, sirasiyla, soguk 0.1 N HCl (10 mL), doymus sodyum hidrojen karbonat (10 mL) ve brin (5 mL) ile yikandi. Ardindan, organik tabaka MgSO4 `uzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Bu artik, flas kromatografisiyle (silika jel, 50/50 h/h n-heksan/EtOAc ilâ 25/75 11/11 n-heksan/EtOAc) saflastirildi ve bunun sonucunda, beyaz renkte kati formda ürün (0,356 g, %54) elde edildi. LC/MS (3,487 dakika (ES+)), m/z: 862,2 [M+H]+. IH NMR (400 MHz, CDCl3) 5 8,34 (br s, lH), 7,47 ((1, 2H,] = 7,6 Hz), 7,17 (s, lH), 7,14 (d, 2H, J = 7,5 Hz), 6,86 (br s, lH), 6,65 (br s, lH), 6,42 ((1, lH, J = 7,6 Hz), 6,22 (d, lH, J = 14,4 Hz), 5,80 (m, lH), 5,40 (m, lH), 5,53 (m, lH), 5,32 (m, lH), 5,21 ((1, 2H, J : 9,6 Hz), 5,06 ((1, lH, J : 12,3 Hz), 4,90 (m, lH), 4,58 (m, 3H), 3,98 (m, lH), 3,84 (m, lH), 3,81 (s, 3H), 3,50 (m, lH), 3,05 (dd, lH, J = 16,0, 10,3 Hz), 2,76 (m, lH), 2,15 (m, lH), 1,80 (dd, 3H, J = 6,7, 0,8 Hz), 1,44 ((1, 3H, J = 7,1 Hz), 1,16 (in, 3H), 1,01 ((1, 18H, J = 6,6 Hz), 0,96 ((1, 3H, J = 6,8 Hz), 0,92 ((1, 3H, J : 6,8 Hz).((1) (1 18,1 1 aS)-4-((S)-2-((S)-2-(alliloksikarbonilamino)-3- inetilbutanamido)pr0panamido)benzil l l-(tert-bütildimetilsililoksi)-7- metoksi-5-0ks0-2-((E)-pr0p-l-e11i1)-8-(triizopr0pilsi1i10ksi)-1 1,1 1 a- dihidro- 1 H-benzo[e] pirr010[ 1,2-a] [1,4]diazepin-10(5H)-karboksi1at (7 8)Kuru DCM (10 mL) içinde sekonder alkol 77 (0,5 g, 0,58 mmol, 1,0 esdegeri) ve 2,6-lutidin (0,25 g, 2,32 mmol, 4,0 esdegeri) çözeltisine0°C sicaklikta ve nitro jen atmosferi altinda tert-151bütildimetilsililtriflorometan sülfonat (0,46 g, 1,74 mmol, 3,0 esdegeri) ilave edildi. 10 dakika soiira, reaksiyon karisimi oda sicakligina ulasaiia kadar isinmaya birakildi ve 120 dakika daha karistirildi. Ardindan, organik faz, sirasiyla, su (10 mL), doymus sodyum bikarbonat (10 mL) ve brin (5 mL) ile yikandi, MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Bu artik, flas kromatografisiyle (silika jel, 50/50 h/h n- heksan/EtOAc) saflastirildi ve bunun soiiucunda, beyaz reiikte kati formunda `ürün (0,320 g, %57) elde edildi. LC/MS (4,415 dakika (ES+)), m/z: 976,52 [M+H]+. 1H NMR (400 MHZ, CDC13) 5 8,31 (br s, lH), 7,48 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,21 (s, lH), 7,14 ((1, 2H, J = 8,3 Hz), 6,89 (s, lH), 6,65 (s, lH), 6,38 (d, 1H,J= 7,3 Hz), 6,25 ((1, lH,J : 14,6 Hz), 5,93 (m, lH), 5,85 ((1, 1H, J : 8,8 Hz), 5,50 (m, lH), 5,34 (m, lH), 5,24 (m, 2H), 5,15 (d, 1H, J : 12,5 Hz), 4,86 (d, lH, J 1 12,2 Hz), 4,62 (m, 3H), 4,01 (m, lH), 3,86 (s, 3H), 3,78 (m, lH), 3,04 (m, lH), 2,56 (m, lH), 2,20 (m, 1 H), 1,84 (dd, 3H, J = 6,6, 0,7 HZ), 1,48 ((1, 3H, J = 6,8 Hz), 1,20 (ni, 3H), 1,05 ((1, 9H, J = 2,9 Hz), 1,03 ((1, 9H, J : 2,9 Hz), 0,99 ((1, 3H, J : 6,8 Hz), 0,95 (d, 3H, J : 6,8 Hz), 0,88 (s, 9H), 0,27 (s, 3H), 0,14 (s, 3H).(e) (1 1 8,1 1aS)-4-((S)-2-((S)-2-(alli10ksikarboni1amino)-3- metilbutanamido)propanamido)benzi1 l l-(tert-bi`1ti1dimetilsililoksi)-8- hidroksi-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-eni1)-l 1,1 1 a-dihidro- lH- benzo[e]pirr010[ 1,2-a] [ 1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (79)Yas DMF (2 mL) içinde silil eter 78 (0,100 g, 0,10 mmol, 1,0 esdegeri) çözeltisine 25°C sicaklikta 3 saat süreyle lityum asetat dihidrat (0,010 g, 0,10 mmol, 1,0 esdegeri) ilave edildi. Ardindaii, 152reaksiyon karisimi etil asetatla (20 mL) seyreltildi ve sirasiyla, 0.1 M sitrik asit (20 mL, pH 3), su (20 niL) ve brin (5 mL) ile yikandi, MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Bu artik, flas kromatografisiyle (silika jel, 5/95 h/h metanol/DCM) saflastirildi ve buiiun sonucunda, soluk sari renkte yag formunda ürün (0,070 g, %83) elde edildi. LC/MS (3,362 dakika (ES+)),m/z: 820,2 [M+H]+.1H NMR (400 MHZ, CDC13) 8 8,39 (s, lH), 7,48 ((1, 2H, J = 8,2 Hz), 7,25 (s, lH), 7,12 ((1, 2H, J = 8,] Hz), 6,88 (s, lH), 6,68 (s, 1H), 6,47 (d, lH, J : 7,6 Hz), 6,24 (d, lH, J : ,2 Hz), 6,03 (s, lH), 5,92 (m, lH), 5,84 ((1, 1H,J = 8,9 Hz), 5,50 (in, lH), 5,34 (m, lH), 5,26 (m, 2H), 5,18 ((1, lH, J = 12,3 Hz), 4,80 (d, lH,] = 12,4 Hz), 4,66 7 4,60 (m, 3H), 4,02 (m, lH), 3,95 (s, 3H), 3,81 (m, lH), 3,03 (m, 1H), 2,57 (m, lH), 2,19 (rn, lH), 1,84 (dd, 3H,J: 6,8, 0,8 Hz), 1,48 (d, 3H,J : 7,1 Hz), 1,00 (d, 3H,J : 6,8 Hz), 0,95 (d, 3H, J = 6,8 Hz), 0,87 (s, 9H), 0,26 (s, 3H), 0,12 (s, 3H).(iv) ( 1 1 8,1 1aS)-4-((208,23S)-1-iyodo-20-i20pr0pil-23-metil-2,18,21- triokso-6,9,12,15-tetraoksa-3,19,22-triazatetrakosanamido)benzil 1 1- hidroksi-7-metoksi-8-(3-((S)-7-metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)- ,1 la-dihidro- 1 H-benzolelpirrololl ,2-a111 ,41diazepin-8- iloksi)propoksi)-5-okso-2-(( E)-prop- l -enil)-1 1,1 la-dihidro-l H- benzolelpirrolof 1 ,2-alf 1 ,4ldiazepin- l 0( 5H)-karboksi1at (66, D) 153,'2`iî""`ii1`. S:i:""';:Ii" ra 'i '5' vi, 0 4 ...ci ~._-:\v`°"~.1 7- :A i '_. 'EN-"`25 1, ..\_ *****(a) (1 1 S, 1 1aS)-a11i1 8-(3-((1 18,1 1aS)-10-((4-((R)-2-((R)-2- (alliloksikarbonilami110)-3- metilbutanamid0)pr0panamid0)benzi10ksi)karb0ni1)-1 l -(tert- bütildimetilsililoksi)-7-1net0ksi-5-0kso-2-((E)-pr0p-1-enil)-5,10,1 1,1 la-tetrahidro-1H-ben20[e]pirr010[1,2-a] [1,4]diazepin-8- iloksi)pr0p0ksi)- 1 1-(tert-bütildimetilsililoksi)-7-met0ksi-5 -0ks0-2- ((E)-pr0p-l-eni1)-l 1,1 la-dihidro-lH-benzo[e]pirr010[1,2- a][1,4]diazepin-10(5H)-karb0ksilat (80)154Potasyum karbonat (0,030 g, 0,21 mmol, 1,0 esdegeri), aseton (10 mL) içinde fenol79 (0,175 g, 0,21 mmol, 1,0 esdegeri) ve iyodo baglayici 74 (0,214 g, 0,32 mmol, 1,5 esdegeri) çözeltisine ilave edildi. Reaksiyon karisimi, sizdirmaz kapatilmis bir kapta, 75°C sicaklikta ve nitrojen atmosferi altinda 17 saat süreyle isitildi. Reaksiyon karisimi, indirgenmis basinç altinda kuruyana kadar konsantre edildi ve Bas kromatografisiyle (silika jel, 2/98 h/h metanol/DCM ilâ 5/95 h/h metanol/DCM) saflastirildi ve bunun sonucunda, soluk sari renkte kati formda ürün (0,100 g, %35) elde edildi. LC/MS (4,293 dakika (ES+)), in/z:1359,13 [M]+.(b) (1 18,1 1aS)-alli1 8-(3-((1 lS,1 1aS)-l0-((4-((R)-2-((R)-2- (a11iloksikarb0ni1amin0)-3- inetilbutanamid0)pr0panamid0)benziloksi)karb0ni1)- 1 l -hidroksi-7- metoksi-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-5, 10,1 1,1 1 a-tetrahidro- 1 H- benzo[e] pirr010[ 1 ,2-a] [ 1 ,4] diazepin-8-iloksi)pr0poksi)-l l-hidroksi-7- inetoksi-5-0kso-2-((E)-pr0p-1-enil)-1 1,1 la-dihidro-lH-benz0[e] pirrolo[ 1,2-a] [1,4]diazepin-10(5H)-karboksilat (81)Tetra-n-bütilamonyum florür (1 M, 0,22 mL, 0,22 ininol, 2,0 esdegeri), kuru THF (2 mL) içinde silil eter 80 (0,150 g, 0,11 mmol, 1,0 esdegeri) çözeltisine ilave edildi. Bu reaksiyon karisimi, oda sicakliginda 20 dakika süreyle karistirildi ve ardindan, yapilan LC/MS analizi reaksiyonun tamamlandigini gösterdi. Reaksiyon karisimi, etil asetatla (10 mL) seyreltildi ve sirasiyla, su (5 mL) ve brinle (5 mL) yikandi. Sari renkte bir kati elde etmek için, organik faz; MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantreedildi. Flas kroinatografisiyle (silika jel, 6/94 h/h metanol/DCM ilâ15510/90 h/h metanol/DCM) saflastirma islemi sonucunda, soluk sari renkte kati formda ürün (0,090 g, %73) elde edildi. LC/MS (2,947 dakika (ES+)), 1n/z: 1154,0 [M+Na]+. 1H NMR (400 MHz, CDC13) 8 8,39 (br s, lH), 7,39 (d, 2H, J : 7,6 Hz), 7,18 ((1, 2H, J : 10,6 Hz), 7,10 (in, 3H), 6,86 ((1, 2H, J : 10,0 Hz), 6,74 (s, lH), 6,55 (s, lH), 6,22 (dd, 2H, J = 15,3, 6,6 Hz), 5,85 (ni, 2H), 5,74 (m, 3H), 5,52 (m, 2H), 5,22 (m, lH), 5,00 (m, 2H), 4,57 (m, 6H), 4,41 (in, 2H), 4,09 (m, 4H), 3,85 (in, 11H), 3,06 (m, 2H), 2,76 (ni, 2H), 2,20 (m, 2H), 2,08 (in, 1H), 1,79 ((1, 6H, J : 6,4 Hz), 1,40 ((1, 3H, J : 6,1 Hz), 0,90 (m, 6H).(c) (1 1 S, 1 1aS)-4-((R)-2-((R)-2-amino-3- inetilbutana1nido)propanamido)benzil l l-hidroksi-7-1net0ksi-8-(3- ((S)-7-metoksi-5-0kso-2-((E)-pr0p-1-enil)-5, 1 la-dihidro- 1 H-benzo[e] pirrolo[ 1,2-a] [1,4]diazepin-8-iloksi)prop0ksi)-5-0kso-2-((E)- prop- 1 -enil)-1 1,1 la-dihidro-lH-benzo[e]pirr010[1,2-a][1,4]diazepin- (5H)-karboksilat (65)Kuru DCM (5 mL) içinde bis-karbinolamin 81 (0,090 g, 0,08 mmol, 1,0 esdegeri) ve pirrolidin (16 uL, 0,20 inmol, 2,5 esdegeri) çözeltisine tetrakis(trifenilfospen)paladyum(0) (0,005 g, 0,005 minol, 0,06 esdegeri) ilave edildi. 20 dakika sonra, reaksiyon karisimi, DCM (10 mL) ile seyreltildi ve sirasiyla, doyinus aiiionyum klorür (5 mL) ve brin (5 mL) ile yikandi, MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve çözücü indirgenmis basinç altinda çikamldi ve bunun sonucunda, soluk sari renkte kati formda hani ürün elde edildi ve bu ürün de, dahafazla saflastirma islemine tâbi tutulmadan bir sonraki adimdakullanildi (0,075 g, varsayilan %100 verim). LC/MS (2,060 dakika156(ES+)), m/Z: 947,2 [M+H]+.(d) (1 18,1 1aS)-4-((ZOS,23S)-1-iyodo-20-izopr0pi1-23-meti1-2,18,21- triokso-6,9,12,15-tetra0ksa-3 ,19,22-triazatetrakosanainid0)benzi1 1 1- hidroksi-7-metoksi-8-(3-((S)-7-metoksi-5-0kso-2-((E)-prop-1-eni1)-5,1 la-dihidro-1H-benzo[e]pirr010[1,2-a][1,4]diazepin-8- i10ksi)pr0p0ksi)-5-okso-2-((E)-prop-1-enil)-1 1,1 1a-dihidro- 1 H- benzo[e] pirr010[ 1,2-a] [1,4]diazepin-10(5H)-karb0ksi1at (66, D)Kuru diklorometan (5 mL) içinde amin 65 (varsayilan %100 verim, 0,075 g, 0,08 mmol, 1,0 esdegeri) ve iyodoasetamid-PEG4- asit 17 (0,034 g, 0,08 mmol, 1,0 esdegeri) çözeltisine EDCl (0,015 g, 0,08 mmol, 1,0 esdegeri) ilave edildi ve reaksiyon, karanlik bir ortamda karistirildi. 50 dakika sonra, bir miktar daha iyodoasetamid- PEG4-asit 17 (0,007 g, 0,016 mmol, 0,2 esdegeri) ve EDCl (0,003 g, 0,016 mmol, 0,2 esdegeri) ilave edildi. Toplam 2,5 saat sonra, reaksiyon karisimi, diklorometanla (15 mL) seyreltildi ve sirasiyla, su (10 mL) ve brin (10 mL) ile yikandi. Organik faz; MgSO4 üzerinde kurutuldu, filtrelendi ve indirgenmis basinç altinda konsantre edildi. Elde edilen artik, flas kromatografisiyle (silika jel, Kloroform %100 ilâ 90: 10 h/h Kloroforszetanol) saflastirildi. Urün (0,0254 g, %23, 2 basamak) elde etmek için, saf fraksiyonlar bir araya getirildi. Ham fraksiyonlar toplandi ve preparatif TLC (silika jel, 90:10 h/h K10rof0rm:Metanol) ile saflastirildi ve bunun sonucunda, ikinci ürün serisi (0,0036 g, %3, 2 basamak) elde edildi. LC/MS (2,689 dakika (ES+)), m/z: 681,0 1/2[M+2H]+.157Ornek '10: Salman bilesiklerin aktivitesiK5 62 eseyiK562 insan kronik miyeloid lösemi hücreleri, 37°C sicaklikta 5% COZ içeren bir nemleiidirilmis atmosferde %10 fetal buzagi serumu ve 2 mM glutamin takviyeli RPM] 1640 vasati içinde tutuldu ve belirlenen dozda ilaçla 1 saat ya da 96 saat süreyle 37°C sicaklikta karanlikta inkübe edildi. Inkübasyon, santrifujleme (5 dakika, 300 g) yoluyla sonlandirildi ve hücreler, ilaç-içermeyen vasatla bir defa yikandi. Uygun ilaç tedavisinden sonra, hücreler, 96-kuyucuklu mikrotitre plakalarina (104 hücre/kuyucuk, 8 kuyucuk/numune) aktarildi. Daha sonra, plakalar, %5 COZ içeren bir nemlendirilniis atmosferde 37°C sicaklikta karanlikta tutuldu. Esey, canli hücrelerin sari renkte çözünür tetrazolyum tuzu 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeni1-2H-tetrazolyum bromürü (MTT, Aldrich-Sigma) bir çözünmeyen saf mor formazan çökeltisine indirgeme kabiliyetine dayanir. Plakalarin (kontrol hücrelerinin sayica yaklasik 10 kati artmasina olanak saglamak için) 4 gün süreyle inkübasyonundan sonra, her kuyucuga, 20 uL MTT çözeltisi (fosfat-tamponlu salin içinde 5 mg/mL) ilave edildi ve plakalar 5 saat süreyle ilaveten inkübe edildi. Daha sonra, plakalar, 300 g seviyesinde 5 dakika süreyle santrifüjlendi ve hücre peletinden vasat bulku pipetlenerek beher kuyucukta 10-20 uL birakildi. Her kuyucuga DMSO (200 uL) ilave edildi ve numune çalkalanarak tamamen karismasi saglandi. Daha sonra, bir Titertek Multiscan ELISA plaka okuyucuda 550 nm dalgaboyunda optik yogunluk okundu ve doz-cevap egrisi olusturuldu.Her egri için, nihai optik yogunlugu koiitrol degerinin %50"sine kadar158düsürmek için gereken doz olarak bir IC50 degeri okundu.Bu eseyde, bilesik RelC'nin IC50 degeri 0,1 pM'den düsüktü.Bu eseyde, bilesik Re1E°nin IC50 degeri O,425°ti.Ornek ll: Kon jugatlarin olusumuGenel antikor kon jugasyon prosedürüAntikorlar, bir indirgeme tamponu (örnekler: fosfat tamponlu salin PBS, histidin tamponu, sodyum borat tamponu, TRIS tamponu) içinde 1-5 mg/mL seviyesine kadar seyreltilir. Taze hazirlanmis bir TCEP (tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür) çözeltisi ilave edilerek sistein disülfur köprüleri selektif indirgenir. TCEP miktari, beher antikor için 1 ilâ 4 molar esdegeri dahilinde, hedef indirgeme seviyesiyle orantilidir ve 2 ilâ 8 reaktif tiyol olusturur. 37°C sicaklikta birkaç saat süreyle indirgeme isleminden sonra, karisim, oda sicakligina kadar sogutulur ve bir seyreltilmis DMSO çözeltisi (nihai DMSO içerigi: reaksiyon karisiinina göre en fazla %10 hacim/hacim) olarak fazlalik ilaç-baglayici (A, B, C, D, E) ilave edilir. Karisim, 4°C sicaklikta ya da oda sicakliginda uygun bir süre boyunca, genellikle 1-3 saat boyunca hafif hafif çalkalanir. Fazlalik reaktif tiyoller, ko jugasyonun sonunda N-etil maleiinid (NEM) gibi bir 'tiyol basliklama reaktifiyle' reaksiyona sokulabilir. Antikor-ilaç konjugatlari, lO kDa ya da daha yüksek molekül agirligi kesme degeriyle santrifuj spin filtreleri kullanilarak konsantre edilir; daha sonra, teget akis filtrasyon (TFF) ya da Hizli Protein Sivi Kromatografisi (FPLC) yöntemiyle saflastirilir.159Tekabül eden antikor-ilaç kon jugatlari, Yüksek Performansli Sivi Kromatografisi (HPLC) ya da Ultra-Yüksek-Performansli Sivi Kromatografisi (UHPLC) yöntemiyle analiz yoluyla tayin edilebilir ve böylece, UV-G'Ör'unür, Floresans ya da Kütle-Spektrometresi belirleine sisteinine bagli ters-faz kromatografi (RP) ya da Hidrofobik- Etkilesim Kromatografisi (HIC) kullanilarak beher antikor için ilaç orani (DAR) degerlendirilebilir; agregat seviyesi ve monomer safligi, UV-Gör'ün'ûr, Floresans ya da Kütle-Spektrometresi belirleine sistemine bagli boyut-dislama kromatografisi kullanilarak HPLC ya da UHPLC yöntemiyle analiz edilebilir. Nihai kojugat konsantrasyonu, bir spektroskopik (280, 214 ve 330 nm"de absorbans) ve biyokimyasal esey (bisinkoninik asit eseyi BCA; Smith, P.K., et al. (1985) Anal. Biochem. 150 (1): 76-85; referans olarak bilinen konsantrasyonda IgG aiitikoru kullanilir) kombinasyonuyla tayin edilir. Antikor-ilaç konjugatlari genellikle aseptik kosullar altinda 0,2 um filtreler kullanilarak steril filtrelenir ve +4°C, -200C ya da -80°Csicaklikta saklanir.DAR Tayini10 uL borat tamponu (100 mM, pH 8,4) ve 5 uL DTT (su içinde 0,5 M) ilave edilerek antikor ya da ADC (35 uL içinde yaklasik 35 ug) indirgendi ve 37°C sicaklikta 15 dakika süreyle isitildi. Nuinune, l hacim asetonitril: su: formik asitle (%49: %49: %2 h/h) seyreltildi ve %75 Tampon A (Su, Trifloroasetik asit (%0,1 h/h) (TFA), %25 tampon B (Asetonitril: su: TFA %90: %10: %0,1 h/h) içinde dengelenmis l ml/dakika akis hiziyla bir UPLC sisteminde (Shimadzu Nexera) 80°C sicaklikta bir Widepore 3,6u XB-C18 150 x 2,1 nim160(P/N 00F-4482-AN) koloiia (Phenomenex Aeris) enjekte edildi. 10 dakika %25"ten %55"e tampon B gradiyenti kullanilarak bagli malzeme elüe edildi. 214 nm"de UV absorpsiyonu pikleri entegre edildi. Her bir ADC veya antikor için asagidaki pikler taniinlandi: nativ antikor hafif zinciri (LO), natiV antikor agir zinciri (HO) ve ilaç- baglayicilar ilave edilmis bu ziiicirlerin her biri (bir ilaçli hafif zincir için L1 ve 1, 2 veya 3 ilaç-baglayici ekli agir zincir için Hl, H2, H3 etiketli). Ilaç-baglayicilar (yani, L1, Hl, HZ, H3) içeren fragmanlarintanimlanmasi için 330 nm°de UV kromatogrami kullanildi.PBD/protein molar orani, hem hafif zincirler hem de agir zincirler için hesaplandi. Ilaç Ll için %Alan ya da 214 nmHafif zincirde -------------- orani = ------Protein L0 ve L] için 214 nm"de %AlanIlaç --_X (Hn için Aialan ya da 214) Agir ziiicirde -------------- orani = --- ! Protein Hn için 214"te 5;Nihai DAR asagida gösterildigi gibi hesaplanir:DAR = 2 x (hafif zincirde ilaç/protein oraiii + agir zincirdeilaç/protein orani)DAR ölçümü, 214 nm"de gerçeklestirilir, çünkü ilaç-baglayiciabsorbansmdan enterferansi asgari düzeye indirir.161ADC"lerin olusturulmasiAntikor AB12 (sirasiyla VH ve VL sekanslari Sek.l ve Sek.2"ye sahip tam insan monoklonali IgGl,K antikoru) Conj AB12-A"nin elde edilmesi için ilaç baglayicisi A ile konjuge edilmistir ve DAR, 2.14olarak Ölçülmüstür.Antikor AB12 (sirasiyla VH ve VL sekanslari Sek.1 ve Sek.2"ye sahip tam insan monoklonali IgGl,K antikoru) Conj AB12-D"nin elde edilmesi için ilaç baglayicisi D ile konjuge edilmistir ve DAR, 1.25 olarak ölçülmüst'ûr (asagidaki tabloya bakiniz).Antikor AB12 (sirasiyla VH ve VL sekanslari Sek.1 ve Sek.2'ye sahip tam insan monoklonali IgG1,K antikoru) Conj AB12-E°nin elde edilmesi için ilaç baglayicisi E ile konjuge edilmistir ve DAR, 2.3 olarak Ölçülmûst'ûr (asagidaki tabloya bakiniz).Diger ADC,ler de asagidaki tabloda gösterildigi gibi hazirlaninistir.HuMax-TAC, SEKANS KIM. NO.1"e göre sekansa sahip olan bir VH domainini ve SEKANS KIM. NO.2"ye göre sekansa sahip olan bir VLdoinainini içeren bir anti-CD25 antikorudur.CD25°e hedeflenen ADC°ler, HuMax-TAC antikorlarinin yukarida tarif edildigi gibi üç farkli ilaç baglayicisina konjuge edilmesiyle üretilmistir. Sonuçta elde edilen ADC°ler, asagidaki tabloda listelenmistir. B12 anti-HIV gp 120 antikoru, kontrol CD25 disihedeflenmis ADC'leri üretmek içiii kullanilmistir. 162 ADC DAR Konsantrasyon [mg/ml] Verim [%] HuMax-TAC -A 2.19 0.97 62 HuMax-TAC-E 2.3 1.18 37 HuMax-TAC-D l .25 0.7 60 B 1 2-A 1 .94 0.5 49 B12-E 2.93 0.78 59 B 1 2-D 1 .67 1 .0 53 ÖRNEK 12: ADC71erin in-vitro sitotoksisitesiHücre KültürüSU-DHL-l ve Karpas299 hücreleri Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Culturessten alinmistir. Daudi hücreleri, Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan elde edildi. Hücre kültürü vasati, L-Glutamin ve %10 FBS takviyeli RPMI 16407ti. Hücreler, bir nemlendirilmis inkübat'orde 37°C sicaklik ve %5 C02kosullarinda çogaltildi.Sitotoksisite eseyiSüspanse edilen kültürlerin (en fazla 1 X 106/m1 seviyesinde) konsantrasyonu ve canliligi, Trypan maviyle lzl oraninda karistirma ve bir hemositometreyle saydam (canli) / mavi (ölü) hücreleri sayma yoluyla tayin edildi. Hücre süspansiyonu, gereken ekim yogunluguna (genellikle IOS/m1) kadar seyreltildi ve 96 kuyucuklu düz tabanli plakalara dagitildi. Alamar mavi eseyi için, 100 ul/kuyucuk, siyah163kuyucuklu plakalara dagitildi. MTS eseyi için, 50 ul/kuyucuk, sayda kuyucuklu plakalara dagitildi. Filtreyle sterilize edilmis ADC°nin hücre kültürü vasati içine seyreltilmesi yoluyla ADC7nin (20 tig/ml) bir stok çözeltisi (1 ml) hazirlandi. 8 x stok ADC"nin 10-kat seyreltisinden olusan bir set, 100 ul"nin 900 pl hücre kültürü vasatina seri transferi yoluyla bir 24 kuyucuklu plakada hazirlandi. Her bir ADC seyreltisi (Alamar mavi için 100 ul/kuyucuk, MTS için 50 ;tl/kuyucuk), hücre süspansiyonu içeren 96-kuyucuklu plakanin 4 replika kuyucuguna dagitildi. Kontrol kuyucuklarina yalnizca ayni hacimde kültür vasati konuldu. 4 gün süreyle inkübasyondan sonra,Alamar inavi veya MTS eseyiyle hücre canliligi ölçüldü.AlamarBlue® (Invitrogen, katalog nuinarasi DAL1025), her bir kuyucuga dagitildi (20 ul / kuyucuk) ve COg-gazli inkübatörde 37°C sicaklikta 4 saat süreyle inkübe edildi. Kuyucuk floresansi, 570 nm eksitasyon ve 585 nm emisyonda ölçüldü. Hücre sürvisi (%), 4 koiitrol kuyucugunda ortalama floresansa (%100) kiyasla 4 ADC uygulanmiskuyucukta ortalama floresans oranindan hesaplandi.MTS (Promega, katalog nuinarasi G5421), her bir kuyucuga dagitildi (20 ul / kuyucuk) ve COZ-gazli inkübat'orde 37°C sicaklikta 4 saat süreyle inkübe edildi. 490 nm'de absorbans Ölçüldü. Hücre sürvisi (0/0), 4 kontrol kuyucugunda ortalama absorbansa (%100) kiyasla 4 ADC uygulanmis kuyucukta ortalama absorbanstan hesaplandi. 3 replika deneyin ortalama verilerinden doz cevap egrileri olusturuldu ve verilerin Prism (GraphPad, San Diego, CA) kullanilarak degisken egimli bir sigmoidal doz-cevap egrisine uydurulmasi suretiyleEC50 tayin edildi.164HuMax-TAC ila CD25 +Ve hücre çizgilerinin baglanmasiKarpas299 ve SU-DHL-l anaplastik büyük hücreli lenfoma (ALCL)- türevli hücre çizgilerinin geçmiste CD25 (2,3)'ü eksprese ettikleri rapor edilmistir. Bunlarin ekspresyon profilini teyit etmek amaciyla, CD25 yüzey ekspresyonu, akis sitometrisi ile analiz edilmistir. HuMaX-TAC bir CD25-spesifik antikor olarak kullanilmistir. B12 birnegatif kontrol antikoru olarak kullanilmistir.Sekil 1, Karpa3299 ve SU-DH L-l hücre çizgilerinin üzerinde CD25°in ekspresyonunu göstermektedir. Karpas299 ve SU-DHL-l üzerindeki yüzey CD25 ekspresyonu, akis sitometrisi ile belirlenmistir. Grafikler, üç (Karpas299) ya da dört bagimsiz deneyin (SU-DHL-l) ortalamasiniteinsil eder. ECSO degerleri ng/ml olarak rapor edilmistir.Her iki hücre çizgisi spesifik olarak HuMaX-TAC'a baglanir ancak, hücre yüzeyi CD25"in ekSpresyonunu teyit eden negatif kontrolantikorlarina baglanmaz. EC50 (ng/ml) HuMax-TAC B12 Karpas 20.21 536558 SUDHL1 34.06 1.952e+022 In-vitro sitotoksisiteHuMaX-TAC-A"nin etkililigi SU-DHL-l hücrelerine karsi test edilmistir. bir CD25-negatif kontrolü olarak Daudi B hücrelerikullanilmistir. 165Sekil 2, HuMaX-TAC-Amin in vitro etkililigini gösterir. HuMax- TAC-Aanin seri 10 kat seyreltmeleri (mg/mL), SU-DHL-l ya da Daudi hücreleri ile enkübe edilmistir. Alamar Blue miktar tayini, enkübasyon periyodunun ve hesaplanan hücre sagkalimmin sonunda gerçeklestirilmistir. Grafikler, üç kopya deneyin ortalainasini teinsil eder.HuMaX-TAC-A, SU-DHL-l hücrelerine karsi 'Önemli sitotoksisite göstermistir (Sekil 2).Sekil 3A, B, C (ve tablolar 3A, 3B ve 3C) HuMaX-TAC-ADC konjugatlari için ilaç baglayici seçimini gösterir. Uç farkli baslik baglayicisina (A, E, D) konjuge edilen HuMax-TAC"nin seri lO-kat seyreltmeleri (mg/mL), SUDHL-l, Karpa3299 ya da Daudi hücreleri ile enkübe edilmistir. MTS miktar tayini, enkübasyon periyodunun sonunda gerçeklestirilmistir ve yüzde hücre `Ölümü tespit edilmistir. grafikleri, üç kopya deneyim ortalamasini temsil eder. EC50 degerlerimg/ml olarak rapor edilmistir. HT = HuMaX-TAC.Tablo 3A Ecso (tig/m L) Hu Max-TAC-A HuMax-TAC-E HuMax-TAC-D SUDHL1 0.0001963 0.0005923 0001037 DAUDl 0.1146 0.2737 Tablo 3B ECSO (prg/mL) B12-A B12-E B12-D SUDHL1 0.7562 0.1886 0.2311 DAUDl 0.5310 11.72 130.6 166Tablo 3C ECSOQig/mL) HuMax-TAC-A HuMax-TAC-E HuMax-TAC-D Karpas 0.002061 0.0007416 0.003379 ÖRNEK 13 - ADC,lerin in-Vivo anti-tümör aktivitesiCD25 +(Ve) insan anaplastik büyük hücreli lenfoma (ALCL)-türev1i hücre çizgisi Karpas299 in vivo olarak HuMaX-TAC için en güçlü PBD basligini tespit etmek için kullanilmistir. Antikor, yukarida tarif edildigi gibi A ve E ilaç baglayicilarina konjuge edilmistir ve Karpa3299 ksenogreft modelinde test edilmistir. CD25-baglayici olmayan kontroller olarak, ayni basliklara baglanmis anti-HIV gplZO aiitikoru, BlZ, kullanilmistir. Ayni zamanda, CD25-baglayici olmayan ADC kontrolleri ile gözlemlenen herhangi bir potansiyel anti-tümör aktivitesini arastirmak için (her ikisi de yukarida tarif edilen) HuMax- TAC-E ve BIZ-E insan IgG°sinin 30 kat fazlasi ile birlikte in vivoolarak test edilmistir. 167Çalisma tasarimiIlaçlar ve tedavi: ..:1 i .. hi'i "rw-y -siriisii .'ilgii.. Do," ser. .v9.5 AlJII; Du: -_;i:'i .-i_›:_; "(3 :lü: "iacr" " ' 14 "' ii;in hayvan :"'gf-:gi :"'çihigi -jrrilfk-;ii 1 'II isinin-:i 'mt-i.- .i' i :i ; II #URL-'si- [ i ii lu`~.1.ii› 1 I " "'.l . ' *1 ll -lu'yhii l ':.i 75 || 41:21:".- 1 I I :51_ .E ii 5.13; i i i 7' II F-îI--F 1 i i !'i II _lif-.Mi I I VI..." E li ii 15.1." 1 1 i Prosedürler: 0 I xKARPAS-299-SPN sayida tümör hücresi bulunan CR disiNCr nu/nu fareleri aliniz ve bögürlerine subkutan yoldan %0 Matrigel uygulayiniz.Hücre Enjeksiyon Hacmi 0,1 mL/faredir.Baslangiç Gününde Yas: 8 ilâ 12 haftalik.Tümörler 100 - 150 mm3 ortalama boyuta ulastiginda bir çift eslesmesi gerçeklestiriniz ve tedaviyi baslatiniz.Vücut agirligi: her gün x 5 ve ardindan çalisma sonlanana kadar haftada iki defaKaliper Ölçümü: çalisma sonlanana kadar haftada iki defa Herhangi bir advers reksiyonu veya 'Ölümü derhal rapor ediniz. %30 vücut agirligi kaybina dair tek bir gözlem yapilan ya da %25 Vücut agirligi kaybina dair art arda üç ölçüm yapilanherhangi bir münferit hayvana ötenazi uygulanacaktir.1680 %20 ortalama Vücut agirligi kaybina ya da %10 mortaliteye dair iki ölçüm yapilan herhangi bir grupta dozlama durdurulacaktir. Gruba 'Ötenazi uygulanmaz ve iyilesmelerine izin verilir. %20 agirlik kaybi olan bir grupta, münferit vücut agirligi kaybi sonlanim noktasina ulasan deneklere ötenazi uygulanacaktir. Grup tedavisiyle iliskili vücut agirligi kaybi, orijinal agirligin %loiu dahiline geri döndürülürse, dozlama daha düsük bir doz ya da daha seyrek dozlama programinda sürdürülebilir. Tedavi-disi vücut agirligi % geri kazanimina iliskin istisnalara vaka bazinda izin verilebilir.0 Sonlanim noktasi TGD. Hayvanlar tek tek izlenecektir. Deneyin sonlaniin noktasi, 2000 mm3 tümör hacmi ya da 60 gündür 7 hangisi önceyse. Cevap verenler daha uzun süre izlenebilir. Sonlanim noktasina ulasildiginda, hayvanlara ötenaziuygulanacaktir.Genel metodolojik yaklasimGrup ortalama tümör hacimlerini hesaplamak için, asagidaki kural uygulandi: bir hayvan tümör büyüklügünden dolayi çalismadan çiktiginda, hayvan için kaydedilen nihai tümör hacmi, müteakip zaman noktalarinda ortalama hacmi hesaplamak için kullanilan verilere dahil edildi. Hata çubuklari, ortalama standart hatasini (SEM) göstermektedir. Bir grupta hayvanlarin %50isinden azi çalismada kaldiginda, grup ortalaina tümör hacimlerini hesaplamak için tümör hacmi degerleri kullanilmadi. Grafik temsilleri ve istatistiksel analizleriçin Prism (GraphPad, San Diego, CA) kullanildi.169SonuçlarSekil 4, Karpas299 ksenogreft modelinde HuMax-TAC-ADCIer için ilaç baglayici seçimini göstermektedir. Beher deney grubunda ortalama tümör hacmi 0,] cm3 seviyesine ulastiginda farelere doz uygulandi ve bunlar, kuyruk veninde IV yoluyla 0,6 ve 1 mg/kg (ADC"leri baglamak için) ve (ADC°lerin baglarini açmak için) 1 mg/kg tek dozuyla tedavi edildi. IVIG deneyi için, fareler kuyruk venindeki IV vasitasiyla l mg/kg +/- 30 mg/kg°lik IgG'de HuMax- TAC-E ya da BlZ-E"nin tek bir dozu ile tedavi edilmistir. Veriler, her grupta on fareden elde dilen ortalama tümör hacmini (+/- SEM) temsiletmektedir.Her iki konsantrasyondaki HuMax-TAC-E, HuMax-TACA°ya kiyasla en güçlü anti-tümör aktivitesini sergilemistir (Sekil 4). Baglayici olmayan ADC kontrollerinin (BIZ-A ve BIZ-E) her ikisi de önemli biranti-tümör aktivitesini göstermistir.Hem HuMax-TAC-E hem de BIZ-E, Karpa3299 ksenogreft modelinde mg/kg"lik IgG ile kombinasyonlu olarak test edildigi zaman, bunlarin rölatif aktivitesi, arastirmanin tamami boyunca etkilenmemistir (Sekil 4) ve Karpas299 hücre çizgisini, in vivo olarak anti-CD25 PBD ADC"lerin degerlendirilmesi için uygun birksenogreft modeli olarak valide etmistir.Sekil 5, Vücut agirligi ölçümlerini gösterir. Vücut agirligi, her bir tedavi grubu için haftalik olarak izlenmistir. Deney gruplari arasindakivücut agirliklarinda hiçbir önemli degisiklik tespit edilmemistir. 170Veriler, her bir grupta, sekiz fareden alinan ortalama Vücut agirligini(+/- SEM) temsil eder.Farelerin hem CD25 hedefli hem de CD25 hedefli olmayan ADC"lerle tedavi edilmesi Vücut agirligindaki hiçbir önemli degisiklik ile iliskilendirilmemis olup, hiçbir büyük toksik etkiyi göstermez (Sekil ).Kisaltmalar Ac asetil Acm asetamidometilAlloc alliloksikarbonilBoc di-tert-bütil dikarbonatt-Bu tert-bütille benzil; burada, le-OMe, metoksibenzildir ve le-Me, metilbenzendir.CbZ ya da benziloksi-karbonil; burada, Z-Cl ve Z-Br, sirasiylaZ kloro- ve bromobenziloksi karbonildir. DMF N,N-dimetilformamid Dnp diiiitrofenilDTT ditiyotreitolFmoc 9H-floren-9-ilmetoksikarbonil imp N-lO iinin koruma grubu: 3-(2-metoksietoksi)propanoat- Val-Ala-PABMC-OSu maleimidokaproil-O-N-süksinimid Moc MP Mtr PAB PEG PNZ Psec TBDMS TBDPS Teoc Tos Troc TrtXan 171Metoksikarbonil Maleimidopropanamid 4-met0ksi-2,3,6-trimetilbenzensülfoni1 para-aininobenziloksikarbonil Etilenoksip-nitrobenzil karbainat 2-(fenilsülfoniDetoksikarbonil tert-b'ûtildimetilsilil tert-bütildifenilsilil 2-(trimetilsi1i1)et0ksikarb0ni1 Tosil2,2,2-trikloretoksikarbonil klorür Tritilksanti]3035172SEKANS LISTESI<1 10 ADC Therapeutics Sar] <120 Pirolobenzodiyazepin - Antikor Konjugatlari RJW/FP6936330<140 PCT/EP2013/O71349 2013-10-11<150 US 61/712,924 <151 2012-10-12<150 US 61/712,928 <151 2012-10-12<150 US 61/798,106 <151 2013-03-15<150 US 61/798,037 <151 2013-03-15<150 US 61/798,072 <151 2013-03-15<16011<170 Patentln versiyon 3.3 <210 1<211 127<212 PRT<213 Suni sekans<220<223 Sentetik sekans: PCT/EP2013/071349,un antikor sekansi AB12 VH.<400 1GlnSerIleGlyGln65MetAlaValValValIleArg50GlyGluArgSer<210 2<211 119GlnLysAsn35IleArgLeuLysSer 115<212 PRTLeuVal 20TrpIleValSerAsp 100Ala<213 Suni sekans<220<223 Sentetik sekans: PCT/EP2013/071349"un antikor sekansi ABIZ VL<400 2ValSerValProThrSer 85TrpSerGlnCysArgIleIle70Leu?heThrSerLysGlnLeu55ThrArgAspLysGlyAlaAla40GlyAlaSerTyrGly 120173AlaSer 25ProValAspGluTrp 1 05ProGlu GlyGiyGluLysAsp 90GlySerValGlyGlnAsnSer75ThrGlnValLySThrGiyTyr60ThrAlaGlyPheLysPheLeu45AlaSerValThrPro 125ProSer 30GluGlnThrTyrLeu 110LeuGly15ArgTrpLysAlaTyr 95ValAlaSerTyrMetPheTyr80CysThr 174Glu Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro GlyGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 40 45Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro 65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Va1 Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu 85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 115<210 3<21 I 5<212 PRT <213 Suni sekans<220 <223 Sentetik sekans: PCT/EP2013/071349'un antikor sekansi VH CDRl<4003Arg Tyr Ile Ile Asn 1 5<210 4<21 l 17<212 PRT <213 Suni sekans<220 <223 Sentetik sekans: PCT/EP2013/07l349"un antikor sekansi VH CDRZ<400 4303540175Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Val Glu Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15Gly<210 5<21 l 6<212 PRT <213 Suni sekans<220 <223 Sentetik sekans: PCT/EP2013/071349'un antikor sekansi Vl-l CDR3<400 5 Lys Asp Trp Phe Asp Ty: 1 5<210 6<211 ll<212 PRT <213 Suni sekans<220 <223 Sentetik sekans: PCT/EP2013/071349'un antikor sekansi VL CDRI<400 6Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ty: Leu Ala 1 5 10<210 7<21 I 7<212 PRT <213 Suni sekans<220 <223 Sentetik sekans: PCT/EP201 3/071349"un antikor sekansi VL CDR2<400 7Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr l 5<210 8<21 l 9<212 PRT<213 Suni sekans<220 <223 Sentetik sekans: PCT/EP2013/0713497u11 antikor sekansi VL CDR3<400 8Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 176<210 9<21 l 607 <212 PRT <213 Bos taurus<400 9Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu 1 5Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp 25His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu 40Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln Gln 50 55Lys Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe 65 70Glu Ser His Ala Gly Cys Glu Lys SerGlu Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg 100 105Asp Cys Cys Glu Lys Gln Glu Pro Glu 115 120Bis Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro 130 135Leu ThrHisCysAlaLeu90GluArgLysLeuHisPheProLys75HisThrAsnLeuLeuLysLysPhe60ThrThrTyrGluLys 140PheSerGly45AspCysLeuGlyCys125ProSerGlu30LeuGluValPheAsp110PheAspSer15IleValHisAlaGlyMetLeuProAlaAlaLeuValAsp80AspAlaSerAsn Thr145TyrLeuGlnArgSer225ArgLeuLeuAspPro305IleAspPheLeuAla 385LeuLeuLeuAlaGlu210IleLeuValLeuASR290LeuProValLeuLeu370LysCysTyrTyrGlu195LysGlnSerThrGlu275GlnLeuGluCysTyr355ArgAspAspGluTyr180AspValLysGlnAsp260CysAspGluAsnLys340GluLeuAspGluIle165AlaLysLeuPheLys245LeuAlaThrLysLeu325Asn'I'yrAlaProPhe150AlaAsnGlyThrGly230PheThrAspIleSer310ProTyrSerLysHis 390LysArgLysAlaSer215GluProLysAspSer295HisProGlnArgGlu375AlaAlaArgTyrCys200SerArgLysValArg280SerCysLeuGluArg360TyrCys177AspHisAsn185LeuAlaAlaAlaHis265AlaLysIleThrAla345HisGluTy:GluPro170GlyLeuArgLeuGlu250LysAspLeuAlaAla330LysProAlaSerLys155TyrValProGlnLys235PheGluLeuLysGlu315AspAspGluThrThr 395LysPhePheLysArg220AlavalCysAlaGlu300ValPheAlaTyrLeu380ValPheTyrGlnIle205LeuTrpGluCysLys285CysGluAlaPheAla365GluPheTrpAlaGlu190GluArgSerValHis270TyrCysLysGluLeu350ValGluAspGlyPro175CysThrCysValThr255GlyIleAspAspAsp335GlySerCysLysLys160GluCysMetAlaAla240LysAspCysLysAla320LysSerValCysLeu 400 178Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Asp 405 410 415Gln Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Leu Ile Val 420 425 430Arg Tyr Thr Arg Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu 435 440 445Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Vai Gly Thr Arg Cys Cys Thr Lys Pro 450 455 460Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr Glu Asp Tyr Leu Ser Leu Ile Leu 465 470 475 480Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val 485 490 495Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 500 505 510Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asp Glu Lys 515 520 525Leu Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys 530 535 540Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys Pro 545 550 555 560Lys Ala Thr Glu Glu Gln Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val Ala 565 570 575Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe Ala 580 585 590Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Val Ser Thr Gln Thr Ala Leu Ala 595 600 605<210 10 <211 272 <212 PRT<213 Homo sapienler<400 10Met Asp Ser Tyr Leu Leu Met Trp Gly Leu Leu Thr Phe Ile Met Val 1 5 10 15 ProHisCysMet65GlnGlnMetProGly145ArgTrpPheSerGlu225ValSerGlyAlaGlu50LeuCysProGlnPro130GlnGlyThrProGlu210MetAlaGlyCysThr35CysCysThrGluPro115TrpMetProGlnGly195ThrAlaValLeuGln20PheLysThrSerGlu100ValGluValAlaPro180GluSerAlaAlaThrAlaLysArgGlySer85GlnAspA511TyrGlu165GlnGluCysThrGly245TrpGluAlaGlyASR70AlaLysGlnGluTyr150SerLeuLysLeuMet230CysGlnLeuMetPhe55SerThrGluAlaAla135GlnValIleProVal215GluValArg179CysAla40ArgSerArgArgSer120ThrCysCysCysGln200ThrThrPheArgAsp25TyrArgHisAsnLys105LeuGluVaJ.LysThr185AlaThrSerLeuGlnAspLysIleSerThrThrProArgGlnMet170GlySerThrIleLeu250ArgAspGluLysSer75ThrThrGlyIleGly155ThrGluProAspPhe235IleLysProGlySer 60TrpLysGluHisTyr140TyrHisMetGluPhe220ThrSerSerProThr45GlyAspGlnMetCys125HisArgGlyGluGly205GlnThrValArgGlu30MetSerASRValGln110ArgPheAlaLysThr190ArgIleGluLeuArgIleLeuLeuGlnThr95SerGluValLeuThr175SerProGlnTyrLeu255ThrProASI]TyrCys80ProProProValHis160ArgGlnGluThrGln240LeuIle <21011<2113216260<212 DNA<213 Homo sapienler<400 llggcagtttcc tagagactgg tcctccggcg tccgcttcac tgggqactgc ccgccagaga aactgtgaat acaggaaact cggaacacaa gaaatgcaaa cctccaccat gtttattatc tgcaaaatga atggagacca gagagtgaga gcaaccatgg ttcctgctga agtagaagaa agacaacaga catccgttgt gtggcaacct aaatagcaat tcatgtatat tataaagaaa gaaagcccca ttgtctgcgttaataaacattggctgaaca atggacccac cgatgccaaa tgccccggct tcacgttcat tcccacacgc gcaagagagg ctagccactc cgaaacaagt gtccaatgca gggaaaatga agtgcgtcca cccacgggaa gtcagtttcc cttcctqcct agacgtccat tcagcgtcct caatctagaa agtcatgaag gcttgcctgc tgtctctatg ttcgccgttg gtgttcatta agtaggttta gcactaacgt ggttcctttcccttcaagaacgccagccca aagggtgaca aagaggctga ggtcccaagg catggtgcct cacattcaaa tttccgcaga gtcctgggac gacacctcaa gccagtggac agccacagag gggatacagg gacaaggtgg aggtgaagag cgtcacaaca atttacaaca cctcctgagt aaccaaaaga cccaagtgaa gttttggaag ccagctcagt aagaggaagg aagcatgaat cattcatctc aaatacacaa tcagccgcttctctgggctg180265atacttaaag gcccaggcgg cggcaactgg gtcaggaaga gqctgccagg gccatggcct ataaaaagcg aaccaatgtc cctgaagaac caagcgagcc agaatttatc gctctacaca acccagcccc aagcctcagg acagattttc gagtaccagg gggctcacct acaagaattt atcaaaggtg thtgaagtc cccatcagag gcaaaaccac qgtatggaac attccaactt cacacacact Ctgactgctgctacccagaaagagcaactc accgatcttc gccttctgca tggattcata cagagctctg acaaggaagg ggtcactcta aatgcacaag agaaagaaag ttccaggtca atttcgtqgt gaggtcctgc agctcatatg caagccccga aaatacagac tagcagtggc ggcagcggag cttggtaaga ctaaatggtc acatcacagg agcgagcgct tagaactctc tctctccacc cccagttcag Ctaccctata attctcccgtatcattttac270ctgactccga ccatcccaca gagaaagacc cctgctgatg tgacgatgac aaccatgttg tatgctctgt ctctgccact gaaaaccaca ctgcagggaa qgqgcaqatg tgagagcgtc cacaggtgaa aggccgtcct agaaatggct cggctgtgtt acagaggaag agccgggaac gcccaggaga acacggggca acccacttct catcttattt ctatatgtag gagtcccaag caactggaca tcacgttgccccttggctca6012024030036042048054060066072078084090096010201080114012001260132013801440150015601620 atcctctaag ccatggcaga tcaggaacag tgtgcgttac cctgaatttg gcgtacgttt atgcaaggaa agaacgtaac cagctcccta gggcagcata acgcctgtag tcgaggctgc tcctgtcttt aaagttcagc tcagagtctc ccaggtgctg gctctgcacg ttcggtggaa caacattcta actatcagcc tttcagcagg catacaaaca taaagttgaa agaactgatt atactaagat ccagaagctattgctattgtctaaccccct ataatctttg aaggatgaat taattggcct gcctgcacta cctgagaagt ggaaagaaag cacggaaaag ggagaccaag gcaagacaca tcctagccac agtcagtcat aaggaaaaaa atattagaat tgagttgttg ttgctgctgc cccacccact gtcctggttc gctcaacaac agttttcact gtccagattc gactcatctg aagaatctca acgacttttg gttatcgacc tgtgatacgtttataaaagatctactgagc ggtaacttca gaggtcccag ctttaagagt atttgatgtt gtctaaaaac aaggaagtga agcgcatcag gcgggagcat tccctacaaa tcaggaggct gatggcacca agacaagatg caccgggagg gtctggaata tactattcca ctcaactccc catatctggt atcacacgat tctgaagggg agattaaata tgcactctcc gaccagaaaa ggtgttgagg atttatctgt gatgatgtcaataaatgata181cttcagtctt aaacggggca gcagagaatc tagtttcttt tacaggtgga accaaaaagg agagggagaa gcctggcacg ctcttgaggc aaattagaaa gaggcaggag ctgcactcca agcataccag ccttgttaaa gagccaaatg ggaacacact acgaaaaaaa gcaagatctc taacattaac caggagagtg actattttct ccctccccct tatagatata qgtctataag ccttctctca tcactctgctttttttgaatttctaa gccaaaccca atacttagca gggattgcta cacacaaggt gatccgtaca gggatggagg gtggctcagg caggagtttg ttggctggat gattgcttga gcctgggcaa cagtccttga agagttcgct ttttgtgtgt ttgagaacca tcaacttcca ccctcacgaa gaaaattatt ttatgagaaa gtcatttctg tcaggtatat tatttaaatc atcaaaactt aaagtgtatggttaacatataaaacagagg tgaggcaatg aagttttacc tgaatgatac gcaaatcaat ttcaatgttt tcacactggt cctataaccc agaccagcct gtggtggcat gcccaggagt cagagcaaga acattatcaa gggcccatct ctaacaattc ttgtgttatt gagctaagat tcagttgagt catttgggaa tcacggcagt tgaccaacca gttttctgag ttacttgagt ttccatgata gtggaattttaataaattta168017401800186019201980204021002160222022802340240024602520258026402700276028202880294030003060312031803216182TARIFNAME IÇERISINDE ATIF YAPILAN REFERANSLARBasvuru sahibi tarafindan atif yapilan referanslara iliskin bu liste, yalnizca okuyucunun yardimi içindir ve Avrupa Patent Belgesinin bir kismini olusturmaz. Her ne kadar referanslarin derlenmesine büyük önem verilmis olsa da, hatalar veya eksiklikler engellenememektedirve EPO bu baglamda hiçbir sorumluluk kabul etmemektedir.Tarifname içerisinde atifta bulunulan patent dökümanlari:. JP 58180487 A [0002] . US 20080206239 A1 [0046] . wo 2007085930 A [0004] . wo 2005079479 A2 [0051] - WO 2011130613 A [0005] [0010] [0011] - US 5583024 A [0095] id="p-13" [0013] - US 5674713 A [0095]- wo 2011130616 A [0005] . us 5700670 A [0095]. WO 2011130598 A [0005] [0015] [0235] - US 6602677 B [0095]. US 7521541 B [0006] [0067] [0068] . WO 2007044515 A [0124] [0125] . US 7723485 B [0006] [0068] . EP 2013071349 W [0302]. WO 2009052249 A [0006] [0068] - Us 61712924 B [0302]- US 2010203007 A1 [0006] - us 61712928 B [0302]. WO 2011130615 A [0009] - US 61798106 B [0302]. WO 2010043380 A [0010] . US 61798037 B [0302]. wo 2004045512 A [0027] . US 61798072 B [0302]° US 4816567 A [0034] [0035]Tarifnamede belirtilen patentlestirilmemis literatür:° LEIMGRUBER et al. J. Am. Chem. ' ARIMA et al. J. Antibiotics, 1972, vol. 25, Soc., 1965, vol. 87, 5793-5795 [0002] 437-444 [0002]° LEIMGRUBER et al. J. Am. Chem. ° KOHN. Antibiotics llI. Springer-Verlag, 800., 1965, vol. 87, 5791-5793 [0002] 1975, 3-11 [0003]- THURSTON et al. Chem. Rev., - HURLEY ; NEEDHAM-1994, 433-465 [0002] VANDEVANTER. Acc. Chein. Res., 1986, o ANTONOW, D. ; THURSTON, vol. 19, 230-237 [0003]D.E. Chem. Rev., 2011, vol. 111 (4), 0 GREGSON et al. Chem. Commun., 1999, 2815-2864 [0002] 797-798 [0004]- HOCHLOWSKI et al. J. Antibiotics, ° GREGSON et al. J. Med. Chem., 2001, 1987, vol. 40, 145-148 [0002] vol. 44, 1161-1174 [0004]o KONISHI et al. J. Antibiotics, 1984, - CARTER, P. Nature Reviewsvol. 37, 200-206 [0002] lmmunology, 2006, vol. 6, 343-357 [0006] 0 THURSTON et al. Chem. Brit., - XIE et al. Expert. Opin. Biol. Ther., 2006, 1990, vol. 26, 767-772 [0002] vol. 6 (3), 281-291 [0006]° BOSE et al. Tetrahedron, 1992, vol. ' KOVTUN et al. Cancer Res., 2006, vol. 48, 751-758 [0002] 66 (6), 3214-3121 [0006] o KUMINOTO et al. J. Antibiotics, 1980, vol. 33, 665-667 [0002]- TAKEUCHI et al. J. Antibiotics, 1976, vol. 29, 93-96 [0002]0 TSUNAKAWA et al. J. Antibiotics, 1988, vol. 41, 1366-1373 [0002]o SHIMIZU et al. J. Antibiotics, 1982, vol. 29, 2492-2503 [0002]o LANGLEY ; THURSTON. J. Org. Chein., 1987, vol. 52, 91-97 [0002]° HARA et al. J. Antibiotics, 1988, vol.41, 702-704 [0002]- ITOH et al. J. Antibiotics, 1988, vol. 41,1281-1284[0002]0 LEBER et al. J. Am. Chem. 800., 1988, vol. 110, 2992-2993 [0002]o DORNAN et al. Blood, 2009, vol.1 14 (13), 2721-2729 [0006] [0068]0 MCDONAGH. Protein Eng. Design & Sel., 2006, vol. 19 (7), 299-307 id="p-6" [0006]° DORONINA et al. Bioconj. Chein., 2006, vol. 17, 1 14-124 [0006]° ERICKSON et al. Cancer Res., 2006, vol. 66 (8), 1-8 [0006]° SANDERSON et al. Clin. Cancer Res., 2005, vol. 11, 843-852 [0006] id="p-64" [0064]° JEFFREY et al. J. Med. Chein., 2005, vol. 48, 1344-1358 [0006]o HAMBLETT et al. Clin. Cancer Res., 2004, vol. 10, 7063-7070 [0006] id="p-64" [0064]0 MILLER et al. J our. of Immunology, 2003, vol. 170, 4854-4861 [0029]. JANEWAY, C. ; TRAVERS, P. ; WALPORT, M. ; SHLOMCHIK. lmmuno Biology. Garland Publishing, 2001 [0029]° KOHLER et al. Nature, 1975, vol. 256, 495 [0034]° CLACKSON et al. Nature, 1991, vol. 352, 624-628 [0034]0 MARKS et al. J. Mol. Biol., 1991, vol. 222, 581-597 [0034]° LONBERG. Curr. Opinion, 2008, vol. 20 (4), 450-459 [0034]- MORRISON et al. Proc. Natl. Acad.183- LAW et al. Cancer Res., 2006, vol. 66 (4), 2328-2337 [0006]° WU et al. Nature Biotech., 2005, vol. 23 (9), 1137-1145 [0006]° LAMBERT J. Current Opin. in Pharmacol., 2005, vol. 5, 543-549 [0006]' HAMANN P. Expert Opin. Ther. Patents, 2005, vol. 15 (9), 1087-1 103 [0006]- PAYNE, G. Cancer Cell, 2003, vol. 3, 207-212 [0006]' TRAIL et al. Cancer Immunol. Iminunother., 2003, vol. 52, 328-337 [0006] ° SYRIGOS ; EPENETOS. Anticancer Research, 1999, vol. 19, 605-614 [0006]- JUNUTULA et al. Nature Biotech., 2008, vol. 26 (8), 925-932 [0006] [0068]- Molecular Immunology, 2007, vol. 44, 1986-1998 [0052]- Methods, 2005, vol. 36, 43-60 [0053]- AXUP et al. Proc Natl Acad Sci U 5 A., 2012, vol. 109 (40), 16101-16116 [0069]- BERGE et al. J. Pharm. Sci., 1977, vol. 66, 1-19 [0075]- McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms. Mc-GraW-Hill Book Company, 1984 id="p-87" [0087]- ELIEL, E. ; WILEN, S. Stereochemistry of Organic Compounds. John Wiley & Sons, Inc, 1994 [0087]° CROUCH et al. J. linmunol. Meth., 1993, vol. 160, 81-88 [0095]' CREE et al. AntiCancer Drugs, 1995, vol. 6, 398-404 [0095]° CHEMICAL ABSTRACTS, 51-21-8 [0124] o CHEMICAL ABSTRACTS, 391210-10-9 id="p-124" [0124]- CHEMICAL ABSTRACTS, 15663-27-1 id="p-124" [0124]- CHEMICAL ABSTRACTS, 41575-94-4 id="p-124" [0124]- CHEMICAL ABSTRACTS, 85622-93-1 id="p-124" [0124]° Angew Chem. Intl. Ed. Engl., 1994, VOl. 33, 183-186 [0124]- Handbook of Pharmaceutical Additives. Synapse Information Resources, Inc, 2001 id="p-135" [0135]o Remington"s Pharmaceutical Sciences. Sci. USA, 1984, vol. 81, 6851-6855 id="p-35" [0035]- Nature Biotechnology, 1994, vol. 12, 899-903 [0045]o ALTUVIA et al. J. Mol. Biol., 1995, vol. 249, 244-250 [0047]184Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 id="p-135" [0135]- Handbook of Pharmaceutical Excipients. 1994 [0135]- GETZ et al. Anal. Biochem., 1999, vol. 273, 73-80 [0155]- SMITH, P.K. et al. Anal. Biochem., 1985, vol. 150 (1), 76-85 [0270] TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR

Claims (15)

ISTEMLER
1. Formül Con jA: veya Con jE: ile temsil edilen bir kon jugat olup, burada, Ab, CD25”e baglanan bir antikordur ve bu antikor, SEKANS KOD NO. 3°ün amino asit sekansa sahip bir VH CDRl ”i, SEKANS KOD NO. 4”ün amino asit sekansa sahip bir VH CDR2”yi ve SEKANS KOD NO. 5”in amino asit sekansa sahip bir VH CDR3°ü içeren bir VH doinaininden ibarettir ve burada, ilaçlarin (D) antikora (Ab) ilaç yükleme (p) degeri, 1 ilâ 8 arasinda bir tamsayidir.
2. Istem lae uygun kon jugat olup; burada, bu antikor SEKANS KOD NO. l”e göre sekansa sahip olan bir VH doinainini içerir.
3. Istem '1 “e veya 2°ye uygun kon jugat olup; burada, antikor SEKANS KOD NO. 6°n1n amino asit sekansina sahip bir VL CDRl ”i, SEKANS KOD NO. 7”nin amino asit sekansina sahip bir VL CDR2”yi ve SEKANS KOD NO. 8sin amino asit sekansina sahip bir VL CDR3”ü içeren bir VL domainini içerir.
4. 1 ila 3 arasindaki isteinlerden herhangi birine uygun kon jugat olup; burada, antikor, SEKANS KOD NO. 2“ye uygun sekansa sahip bir agir zincir VL domainini içermektedir.
5. 1 ila 4 arasindaki isteinlerden herhangi birine uygun konjugat olup; burada, antikor, bir intakt antikordur.
6. Istem 1 ilâ 5”ten herhangi birine uygun konjugat olup; burada, antikorun hümanize, deimmünize veya yeniden yüzey kaplamasi yapilmistir.
7. 1 ila 4 arasindaki istemlerden herhangi birine göre konjugat olup, burada antikor tam bir insan inonoklonal IgGl antikorudur, tercihen
8. 1 ila 7 arasindaki istemlerden herhangi birine uygun olan kon jugat olup, burada p degeri 1, 2, 3 ya da 4°tür.
9. Antikor-ilaç kon jugat bilesiklerinin bir karisimini içeren istem 176 uygun konjugat olup; burada, antikor-ilaç konjugat bilesikleri karisiminda beher antikor için ortalama ilaç yüklemesi yaklasik 2 ilâ yaklasik 5”tir.
10. Tedavide kullanma amacina yönelik olan ve istem 1 ila istem 8“in herhangi birisine uygun kon jugat.
11. Bir denekte bir proliferatif hastaligin tedavisinde kullanma amacina yönelik olan ve istem 1 ilâ istem 8°in herhangi birisine uygun kon jugat.
12. Istem l '1°e uygun kon jugat olup; burada, hastalik kanserdir.
13. Istem 125ye uygun konjugat olup; burada, kanser; non-Hodgkin lenfomasindan yani diffüz büyük B-hücreli lenfomasindan, foliküler lenfomadan, Manto hücreli lenfomadan kronik limpatik lenfomadan ve lösemilerden yani bir tüylü hücreli lösemiden tüylü hücreli lösemi varyantindan ve Akut Lenfoblastik Lösemiden olusan gruptan seçilmistir.
14. Istem 1 ilâ istem 8°in herhangi birisine uygun konjugati ve farmasötik açidan kabul edilebilir bir seyrelticiyi, tasiyiciyi ya da yardimci maddeyi içeren bir farmasötik bilesim.
15. Istem l4”e uygun olan ve ek olarak, terapötik açidan etkin ve etkili miktarda bir kemoterapötik ajan da içeren farmas'otik bilesim.
TR2018/08051T 2012-10-12 2013-10-11 Pirrolobenzodiazepin antikor konjugatları. TR201808051T4 (tr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261712924P 2012-10-12 2012-10-12
US201261712928P 2012-10-12 2012-10-12
US201361798106P 2013-03-15 2013-03-15
US201361798037P 2013-03-15 2013-03-15
US201361798072P 2013-03-15 2013-03-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201808051T4 true TR201808051T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=49515321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/08051T TR201808051T4 (tr) 2012-10-12 2013-10-11 Pirrolobenzodiazepin antikor konjugatları.

Country Status (24)

Country Link
US (3) US9931415B2 (tr)
EP (1) EP2906296B1 (tr)
JP (1) JP6392764B2 (tr)
KR (1) KR101995620B1 (tr)
CN (1) CN105102068B (tr)
AU (1) AU2013328625B2 (tr)
BR (1) BR112015008232A2 (tr)
CA (1) CA2887897C (tr)
CY (1) CY1120327T1 (tr)
DK (1) DK2906296T3 (tr)
ES (1) ES2670937T3 (tr)
HR (1) HRP20180945T1 (tr)
HU (1) HUE039329T2 (tr)
LT (1) LT2906296T (tr)
MX (1) MX364328B (tr)
NZ (1) NZ707543A (tr)
PL (1) PL2906296T3 (tr)
PT (1) PT2906296T (tr)
RS (1) RS57104B1 (tr)
SI (1) SI2906296T1 (tr)
SM (1) SMT201800346T1 (tr)
TR (1) TR201808051T4 (tr)
WO (1) WO2014057119A1 (tr)
ZA (1) ZA201502523B (tr)

Families Citing this family (67)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1578397T3 (da) * 2002-11-15 2013-03-11 Genmab As Humane monoklonale antistoffer mod CD25
GB0819095D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
CN107019804A (zh) 2010-04-15 2017-08-08 西雅图基因公司 靶向吡咯并苯并二氮杂卓结合物
BR112012026410B8 (pt) 2010-04-15 2023-01-31 Spirogen Dev Sarl Composto e conjugado de pirrolobenzodiazepinas e usos dos mesmos
CN103987718A (zh) 2011-09-20 2014-08-13 斯皮罗根有限公司 作为非对称二聚体pbd化合物用于内含在靶向结合物中的吡咯并苯并二氮杂卓
KR101961976B1 (ko) 2011-10-14 2019-03-25 시애틀 지네틱스, 인크. 피롤로벤조디아제핀 및 표적 접합체
AU2012322932B2 (en) 2011-10-14 2016-11-10 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines
CA2850103C (en) 2011-10-14 2019-09-10 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines
CN103987384A (zh) 2011-10-14 2014-08-13 西雅图基因公司 吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物
SMT201800346T1 (it) 2012-10-12 2018-09-13 Medimmune Ltd Coniugati pirrolobenzodiazepina-anticorpo
EP2839860B1 (en) 2012-10-12 2019-05-01 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
SMT202100265T1 (it) 2012-10-12 2021-07-12 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepine e loro coniugati
JP6367204B2 (ja) 2012-10-12 2018-08-01 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 結合用のピロロベンゾジアゼピン誘導体の合成および中間体
CN110627797A (zh) 2012-12-21 2019-12-31 麦迪穆有限责任公司 用于治疗增殖性和自身免疫疾病的非对称吡咯并苯并二氮杂卓二聚物
CN110452242A (zh) 2012-12-21 2019-11-15 麦迪穆有限责任公司 吡咯并苯并二氮杂卓及其结合物
CA2904044C (en) 2013-03-13 2020-03-31 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EA027910B1 (ru) 2013-03-13 2017-09-29 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины и их конъюгаты
GB201317982D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201317981D0 (en) 2013-10-11 2013-11-27 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
GB201409653D0 (en) * 2014-05-30 2014-07-16 Stell Dr Anneliese Pyrrolobenzodiazepine therapeutic agents
WO2015198144A2 (en) 2014-06-27 2015-12-30 Techflux, Ltd. Method and device for transmitting data unit
MX2017003126A (es) 2014-09-12 2017-08-28 Genentech Inc Anticuerpos anti-her2 e inmunoconjugados.
GB201416112D0 (en) 2014-09-12 2014-10-29 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN107148285B (zh) * 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
GB201506411D0 (en) 2015-04-15 2015-05-27 Bergenbio As Humanized anti-axl antibodies
GB201506405D0 (en) * 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
GB201506389D0 (en) * 2015-04-15 2015-05-27 Berkel Patricius H C Van And Howard Philip W Site-specific antibody-drug conjugates
TW201709932A (zh) 2015-06-12 2017-03-16 西雅圖遺傳學公司 Ｃｄ１２３抗體及其共軛物
EP4302784A3 (en) 2015-06-30 2024-03-13 Seagen Inc. Anti-ntb-a antibodies and related compositions and methods
GB201513607D0 (en) * 2015-07-31 2015-09-16 Feingold Jay M Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
GB201601431D0 (en) 2016-01-26 2016-03-09 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB201602356D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201602359D0 (en) 2016-02-10 2016-03-23 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
CA3020864A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Macrogenics, Inc. Novel b7-h3-binding molecules, antibody drug conjugates thereof and methods of use thereof
GB201607478D0 (en) 2016-04-29 2016-06-15 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine Conjugates
GB201617466D0 (en) 2016-10-14 2016-11-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine conjugates
GB201702031D0 (en) 2017-02-08 2017-03-22 Medlmmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
JP6671555B2 (ja) 2017-02-08 2020-03-25 アーデーセー セラピューティクス ソシエテ アノニム ピロロベンゾジアゼピン抗体複合体
NZ754811A (en) 2017-02-08 2023-06-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CN110582505B (zh) 2017-04-18 2021-04-02 免疫医疗有限公司 吡咯并苯并二氮杂*缀合物
AU2018253950A1 (en) * 2017-04-20 2019-09-19 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-CD25 antibody-drug conjugate
MX2019012464A (es) 2017-04-20 2019-12-11 Adc Therapeutics Sa Terapia combinada con un conjugado de anticuerpo y farmaco anti-axl.
US11426467B2 (en) 2017-06-14 2022-08-30 Adc Therapeutics Sa Dosage regimes for the administration of an anti-CD25 ADC
ES2906965T3 (es) 2017-08-18 2022-04-21 Medimmune Ltd Conjugados de pirrolobenzodiazepina
TWI820044B (zh) 2017-09-29 2023-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體
GB201803342D0 (en) 2018-03-01 2018-04-18 Medimmune Ltd Methods
GB201806022D0 (en) 2018-04-12 2018-05-30 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
MX2020012418A (es) 2018-05-23 2021-04-28 Adc Therapeutics Sa Adyuvante molecular.
GB201811364D0 (en) * 2018-07-11 2018-08-29 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
GB201820725D0 (en) 2018-12-19 2019-01-30 Adc Therapeutics Sarl Pyrrolobenzodiazepine resistance
WO2020127573A1 (en) 2018-12-19 2020-06-25 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine resistance
ES2967878T3 (es) 2019-03-15 2024-05-06 Medimmune Ltd Dímeros de azetidobenzodiazepina y conjugados que los comprenden para uso en el tratamiento del cáncer
GB201908128D0 (en) 2019-06-07 2019-07-24 Adc Therapeutics Sa Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
CA3142664A1 (en) 2019-06-10 2020-12-17 Adc Therapeutics Sa Combination therapy comprising an anti-cd25 antibody drug conjugate and a further agent
WO2021030358A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Macrophage stimulating 1 receptor (mst1r) variants and uses thereof
GB201917254D0 (en) * 2019-11-27 2020-01-08 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
US20230310640A1 (en) 2019-12-31 2023-10-05 Legochem Biosciences, Inc. Pyrrolobenzodiazepine derivative and ligand-linker conjugate thereof
GB202011993D0 (en) 2020-07-31 2020-09-16 Adc Therapeutics Sa ANTI-IL 13Ra2 antibodies
GB202015916D0 (en) 2020-10-07 2020-11-18 Adc Therapeutics Sa Combination therapy
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
WO2022197933A1 (en) 2021-03-18 2022-09-22 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for characterizing lymphoma and related conditions
KR20240028449A (ko) 2021-06-29 2024-03-05 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 항체-약물 접합체를 이용한 병용 요법
MX2024003988A (es) 2021-09-30 2024-04-26 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Derivado y conjugado de pirrolo-benzodiazepina, metodo de preparacion y uso del mismo.
JP2025502379A (ja) 2022-01-17 2025-01-24 諾納生物（蘇州）有限公司 Ｃｄ２５を標的とする抗体及びその製造方法と応用
AU2023298568A1 (en) 2022-06-30 2025-01-09 Toray Industries, Inc. Pharmaceutical composition for cancer treatment and/or prevention
WO2024235121A1 (zh) * 2023-05-12 2024-11-21 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 稠环化合物及其制备方法和用途

Family Cites Families (357)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3361742A (en) 1964-12-07 1968-01-02 Hoffmann La Roche 5-oxo-1h-pyrrolo-[2, 1-c][1, 4]-benzodiazepin-2-crylamides
US3523941A (en) 1967-03-06 1970-08-11 Hoffmann La Roche Benzodiazepine compounds and process for their preparation
US3524849A (en) 1967-10-27 1970-08-18 Hoffmann La Roche Process for the preparation of pyrrolo-benzodiazepine acrylamides and intermediates useful therein
DE1965304A1 (de) 1968-12-30 1970-07-23 Fujisawa Pharmaceutical Co Benzdiazepinon-Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung
JPS4843755B1 (tr) 1969-06-26 1973-12-20
IL33558A (en) 1968-12-30 1973-10-25 Fujisawa Pharmaceutical Co Antibiotic pyrrolo-benzodiazepine compound,its derivatives and processes for their production
JPS6053033B2 (ja) 1976-12-28 1985-11-22 財団法人微生物化学研究会 新制癌抗生物質マゼスラマイシン及びその製造方法
JPS585916B2 (ja) 1977-12-27 1983-02-02 株式会社ミドリ十字 新規ベンゾジアゼピン系化合物
JPS5615289A (en) 1979-07-17 1981-02-14 Green Cross Corp:The Novel benzodiazepinnbased compound 3
JPS57131791A (en) 1980-12-31 1982-08-14 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd Benzodiazepine derivative and its preparation
CA1185602A (en) 1981-02-27 1985-04-16 Emilio Kyburz Imidazodiazepines
CA1184175A (en) 1981-02-27 1985-03-19 Walter Hunkeler Imidazodiazepines
CA1173441A (en) 1981-02-27 1984-08-28 Hoffmann-La Roche Limited Imidazodiazepines
JPS58180487A (ja) 1982-04-16 1983-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 抗生物質ｄｃ−８１およびその製造法
US4427588A (en) 1982-11-08 1984-01-24 Bristol-Myers Company Process for conversion of oxotomaymycin to tomaymycin
US4427587A (en) 1982-11-10 1984-01-24 Bristol-Myers Company Total synthesis of antitumor antibiotics BBM-2040A and BBM-2040B
JPS59152329A (ja) 1983-02-17 1984-08-31 Green Cross Corp:The 局所障害抑制剤
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
FR2586683B1 (fr) 1985-08-29 1988-07-01 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de neothramycine, leur procede de preparation et leur application en tant que medicaments
US5583024A (en) 1985-12-02 1996-12-10 The Regents Of The University Of California Recombinant expression of Coleoptera luciferase
JP2660201B2 (ja) 1988-08-05 1997-10-08 塩野義製薬株式会社 新規ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン誘導体および老人性痴呆薬
CA2023779A1 (en) 1989-08-23 1991-02-24 Margaret D. Moore Compositions and methods for detection and treatment of epstein-barr virus infection and immune disorders
JPH053790A (ja) 1990-04-19 1993-01-14 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd デヒドロペプチダーゼ−ｉ
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
AU9016591A (en) 1990-10-25 1992-05-26 Tanox Biosystems, Inc. Glycoproteins associated with membrane-bound immunoglobulins as antibody targets on B cells
US5440021A (en) 1991-03-29 1995-08-08 Chuntharapai; Anan Antibodies to human IL-8 type B receptor
CA2407304A1 (en) 1991-03-29 1992-10-15 Genentech, Inc. Human pf4a receptors and their use
US5543503A (en) 1991-03-29 1996-08-06 Genentech Inc. Antibodies to human IL-8 type A receptor
FR2676230B1 (fr) 1991-05-07 1993-08-27 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de pyrrolo [1,4]-benzodiazepines, leur procede de preparation et medicaments les contenant.
JP3050424B2 (ja) 1991-07-12 2000-06-12 塩野義製薬株式会社 ヒトエンドセリンリセプター
US5264557A (en) 1991-08-23 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Polypeptide of a human cripto-related gene, CR-3
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US6153408A (en) 1991-11-15 2000-11-28 Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant
US5976551A (en) 1991-11-15 1999-11-02 Institut Pasteur And Institut Nationale De La Sante Et De La Recherche Medicale Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and method of using the determinant
GB9205051D0 (en) 1992-03-09 1992-04-22 Cancer Res Campaign Tech Pyrrolobenzodiazepine derivatives,their preparation,and compositions containing them
FR2696176B1 (fr) 1992-09-28 1994-11-10 Synthelabo Dérivés de pipéridine, leur préparation et leur application en thérapeutique.
IL107366A (en) 1992-10-23 2003-03-12 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Genes coding for megakaryocyte potentiator
US5644033A (en) 1992-12-22 1997-07-01 Health Research, Inc. Monoclonal antibodies that define a unique antigen of human B cell antigen receptor complex and methods of using same for diagnosis and treatment
US5801005A (en) 1993-03-17 1998-09-01 University Of Washington Immune reactivity to HER-2/neu protein for diagnosis of malignancies in which the HER-2/neu oncogene is associated
US5869445A (en) 1993-03-17 1999-02-09 University Of Washington Methods for eliciting or enhancing reactivity to HER-2/neu protein
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
GB9316162D0 (en) 1993-08-04 1993-09-22 Zeneca Ltd Fungicides
US5773223A (en) 1993-09-02 1998-06-30 Chiron Corporation Endothelin B1, (ETB1) receptor polypeptide and its encoding nucleic acid methods, and uses thereof
EP0647450A1 (en) 1993-09-09 1995-04-12 BEHRINGWERKE Aktiengesellschaft Improved prodrugs for enzyme mediated activation
US5750370A (en) 1995-06-06 1998-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor
JPH08336393A (ja) 1995-04-13 1996-12-24 Mitsubishi Chem Corp 光学活性なγ−置換−β−ヒドロキシ酪酸エステルの製造法
US5707829A (en) 1995-08-11 1998-01-13 Genetics Institute, Inc. DNA sequences and secreted proteins encoded thereby
US20020193567A1 (en) 1995-08-11 2002-12-19 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
JP3646191B2 (ja) 1996-03-19 2005-05-11 大塚製薬株式会社 ヒト遺伝子
US6218519B1 (en) 1996-04-12 2001-04-17 Pro-Neuron, Inc. Compounds and methods for the selective treatment of cancer and bacterial infections
KR20000011101A (ko) 1996-05-17 2000-02-25 둘락 노먼 씨. 사람 b-세포 항원, 관련 시제
AU739028B2 (en) 1996-09-27 2001-10-04 Bristol-Myers Squibb Company Hydrolyzable prodrugs for delivery of anticancer drugs to metastatic cells
US6759509B1 (en) 1996-11-05 2004-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Branched peptide linkers
US5945511A (en) 1997-02-20 1999-08-31 Zymogenetics, Inc. Class II cytokine receptor
US7033827B2 (en) 1997-02-25 2006-04-25 Corixa Corporation Prostate-specific polynucleotide compositions
US20030185830A1 (en) 1997-02-25 2003-10-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
CA2281877C (en) 1997-03-10 2010-01-05 The Regents Of The University Of California Psca: prostate stem cell antigen
US6261791B1 (en) 1997-03-10 2001-07-17 The Regents Of The University Of California Method for diagnosing cancer using specific PSCA antibodies
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
US6555339B1 (en) 1997-04-14 2003-04-29 Arena Pharmaceuticals, Inc. Non-endogenous, constitutively activated human protein-coupled receptors
US6319688B1 (en) 1997-04-28 2001-11-20 Smithkline Beecham Corporation Polynucleotide encoding human sodium dependent phosphate transporter (IPT-1)
US6890749B2 (en) 1997-05-15 2005-05-10 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the prostate
WO1998051824A1 (en) 1997-05-15 1998-11-19 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting disease of the urinary tract
US6602677B1 (en) 1997-09-19 2003-08-05 Promega Corporation Thermostable luciferases and methods of production
US20030060612A1 (en) 1997-10-28 2003-03-27 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20020034749A1 (en) 1997-11-18 2002-03-21 Billing-Medel Patricia A. Reagents and methods useful for detecting diseases of the breast
US6110695A (en) 1997-12-02 2000-08-29 The Regents Of The University Of California Modulating the interaction of the chemokine, B Lymphocyte Hemoattractant, and its Receptor, BLR1
ES2313779T3 (es) 1998-03-13 2009-03-01 The Burnham Institute Moleculas que migran a diversos organos o tejidos seleccionados.
AU4078599A (en) 1998-05-13 1999-11-29 Epimmune, Inc. Expression vectors for stimulating an immune response and methods of using the same
US20020187472A1 (en) 2001-03-09 2002-12-12 Preeti Lal Steap-related protein
US6835807B1 (en) 1998-05-22 2004-12-28 Daiichi Pharmaceuticals Co., Ltd. Drug complex and drug delivery system
US20030064397A1 (en) 1998-05-22 2003-04-03 Incyte Genomics, Inc. Transmembrane protein differentially expressed in prostate and lung tumors
EP1754995B1 (en) 1998-07-08 2012-04-04 E Ink Corporation Methods for achieving improved color in microencapsulted electrophoretic devices
EP1413582B1 (en) 1998-08-27 2006-03-15 Spirogen Limited Dimeric pyrrolobenzodiazepines
WO2000012130A1 (en) 1998-08-27 2000-03-09 Smithkline Beecham Corporation Rp105 agonists and antagonists
GB9818731D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
GB9818730D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Collections of compounds
GB9818732D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Collection of compounds
JP4689781B2 (ja) 1998-09-03 2011-05-25 独立行政法人科学技術振興機構 アミノ酸輸送蛋白及びその遺伝子
AU5963699A (en) 1998-10-02 2000-04-26 Mcmaster University Spliced form of (erb)b-2/neu oncogene
US6858710B2 (en) 1998-12-17 2005-02-22 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6468546B1 (en) 1998-12-17 2002-10-22 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20020119158A1 (en) 1998-12-17 2002-08-29 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US6962980B2 (en) 1999-09-24 2005-11-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030091580A1 (en) 2001-06-18 2003-05-15 Mitcham Jennifer L. Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
AU776672B2 (en) 1998-12-30 2004-09-16 Beth Israel Deaconess Medical Center Characterization of a calcium channel family
US20030009013A1 (en) 1998-12-30 2003-01-09 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CN1201004C (zh) 1999-01-29 2005-05-11 考丽克萨有限公司 HER－2/neu融合蛋白
GB9905124D0 (en) 1999-03-05 1999-04-28 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
AU3395900A (en) 1999-03-12 2000-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Human lung cancer associated gene sequences and polypeptides
US7304126B2 (en) 1999-05-11 2007-12-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6268488B1 (en) 1999-05-25 2001-07-31 Barbas, Iii Carlos F. Prodrug activation using catalytic antibodies
AU4952600A (en) 1999-06-03 2000-12-28 Takeda Chemical Industries Ltd. Screening method with the use of cd100
ES2662581T3 (es) 1999-06-25 2018-04-09 Immunogen, Inc. Métodos de tratamiento usando conjugados de anticuerpo anti-ErbB-maitansinoide
US6302318B1 (en) 1999-06-29 2001-10-16 General Electric Company Method of providing wear-resistant coatings, and related articles
US20030119113A1 (en) 1999-07-20 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7297770B2 (en) 1999-08-10 2007-11-20 Genentech, Inc. PRO6496 polypeptides
US7294696B2 (en) 1999-08-17 2007-11-13 Genentech Inc. PRO7168 polypeptides
US6909006B1 (en) 1999-08-27 2005-06-21 Spirogen Limited Cyclopropylindole derivatives
EP1208202A2 (en) 1999-09-01 2002-05-29 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030129192A1 (en) 1999-09-10 2003-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030232056A1 (en) 1999-09-10 2003-12-18 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
US20030206918A1 (en) 1999-09-10 2003-11-06 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of ovarian cancer
NZ518477A (en) 1999-10-29 2004-10-29 Genentech Inc Isolated anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies that internalise upon binding to PSCA on a mammalian cell, including a PSCA-expressing tumour cell, in vivo
CA2393126C (en) 1999-11-29 2016-05-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Isolation of five novel genes coding for new fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/melanoma
CA2392510A1 (en) 1999-11-30 2001-06-07 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of breast cancer
AU2087401A (en) 1999-12-10 2001-06-18 Epimmune, Inc. Inducing cellular immune responses to her2/neu using peptide and nucleic acid compositions
NZ502058A (en) 1999-12-23 2003-11-28 Ovita Ltd Isolated mutated nucleic acid molecule for regulation of ovulation rate
EP2248828A1 (en) 1999-12-23 2010-11-10 ZymoGenetics, Inc. Method for treating inflammation
AU783473B2 (en) 1999-12-23 2005-10-27 Zymogenetics Inc. Soluble interleukin-20 receptor
US6610286B2 (en) 1999-12-23 2003-08-26 Zymogenetics, Inc. Method for treating inflammation using soluble receptors to interleukin-20
ATE422369T1 (de) 1999-12-24 2009-02-15 Genentech Inc Verfahren und zusammensetzungen zur verlängerung der entsorgungshalbwertszeit von biowirksamen verbindungen
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US7294695B2 (en) 2000-01-20 2007-11-13 Genentech, Inc. PRO10268 polypeptides
US20030224379A1 (en) 2000-01-21 2003-12-04 Tang Y. Tom Novel nucleic acids and polypeptides
AU2001234493A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Corixa Corporation Compounds and methods for prevention and treatment of her-2/neu associated malignancies
AU2001243142A1 (en) 2000-02-03 2001-08-14 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030104562A1 (en) 2000-02-11 2003-06-05 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030219806A1 (en) 2000-02-22 2003-11-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel 18607, 15603, 69318, 12303, 48000, 52920, 5433, 38554, 57301, 58324, 55063, 52991, 59914, 59921 and 33751 molecules and uses therefor
US20020142377A1 (en) 2000-02-22 2002-10-03 Glucksmann Maria Alexandra 18607, a novel human calcium channel
US20040052793A1 (en) 2001-02-22 2004-03-18 Carter Paul J. Caspase activivated prodrugs therapy
US20040005561A1 (en) 2000-03-01 2004-01-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
CA2402293A1 (en) 2000-03-07 2001-09-13 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
AU2001249411B2 (en) 2000-03-24 2007-02-15 Fahri Saatcioglu Novel prostate-specific or testis-specific nucleic acid molecules, polypeptides,and diagnostic and therapeutic methods
WO2001072830A2 (de) 2000-03-31 2001-10-04 Ipf Pharmaceuticals Gmbh Diagnostik- und arzneimittel zur untersuchung des zelloberflächenproteoms von tumor- und entzündungszellen sowie zur behandlung von tumorerkrankungen und entzündlichen erkrankungen vorzugsweise mit hilfe einer spezifischen chemokinrezeptor-analyse und der chemokinrezeptor-ligand-interaktion
US7279294B2 (en) 2000-04-03 2007-10-09 The United States Of America As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services, Nih Tumor markers in ovarian cancer
JP2003532057A (ja) 2000-04-07 2003-10-28 アリーナ・フアーマシユーチカルズ・インコーポレーテツド 非内因性の、構成的に活性化される既知ｇタンパク質−共役受容体
WO2001088133A2 (en) 2000-05-18 2001-11-22 Lexicon Genetics Incorporated Human semaphorin homologs and polynucleotides encoding the same
AU2001274888A1 (en) 2000-05-19 2001-12-03 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
WO2001094641A2 (en) 2000-06-09 2001-12-13 Idec Pharmaceuticals Corporation Gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of ovarian carcinomas
EP1297130A2 (en) 2000-06-16 2003-04-02 Incyte Genomics, Inc. G-protein coupled receptors
WO2002002587A1 (en) 2000-06-30 2002-01-10 Human Genome Sciences, Inc. B7-like polynucleotides, polypeptides, and antibodies
AU2001273151A1 (en) 2000-06-30 2002-01-14 Incyte Genomics, Inc. Human extracellular matrix and cell adhesion polypeptides
US20020165347A1 (en) 2000-06-30 2002-11-07 Amgen, Inc. B7-like molecules and uses thereof
AU2002214531A1 (en) 2000-07-03 2002-01-30 Curagen Corporation Proteins and nucleic acids encoding same
US20040044179A1 (en) 2000-07-25 2004-03-04 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6891030B2 (en) 2000-07-27 2005-05-10 Mayo Foundation For Medical Education And Research T-cell immunoregulatory molecule
WO2002010382A2 (en) 2000-07-28 2002-02-07 Ulrich Wissenbach Trp8, trp9 and trp10, markers for cancer
US7229623B1 (en) 2000-08-03 2007-06-12 Corixa Corporation Her-2/neu fusion proteins
AU2001283360A1 (en) 2000-08-14 2002-02-25 Corixa Corporation Methods for diagnosis and therapy of hematological and virus-associated malignancies
CN1537164A (zh) 2000-08-14 2004-10-13 治疗和诊断Her-2/neu相关恶性肿瘤的组合物和方法
GB0020953D0 (en) 2000-08-24 2000-10-11 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
JP2004520806A (ja) 2000-08-24 2004-07-15 ジェネンテック・インコーポレーテッド 腫瘍の診断と治療のための組成物と方法
CA2421949A1 (en) 2000-09-11 2002-03-21 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US20030119121A1 (en) 2000-09-15 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6613567B1 (en) 2000-09-15 2003-09-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of Her-2 expression
DK1351703T3 (da) 2000-09-15 2006-11-27 Zymogenetics Inc Anvendelse af et polypeptid omfattende det ekstracellulære domæne af IL-20RA og IL-20RB til behandling af inflammation
CA2422814A1 (en) 2000-09-18 2002-03-21 Biogen, Inc. Cripto mutant and uses thereof
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
JP5010089B2 (ja) 2000-09-19 2012-08-29 スピロジェン リミテッド Ｃｃ−１０６５およびデュオカルマイシンのアキラルアナログの組成物およびその使用方法
JP2005506033A (ja) 2000-10-13 2005-03-03 イーオーエス バイオテクノロジー インコーポレイテッド 前立腺癌の診断法、前立腺癌モジュレータースクリーニングの組成物及び方法
ATE432986T1 (de) 2000-11-07 2009-06-15 Zymogenetics Inc Menschlicher rezeptor für tumor necrosis factor
US20020150573A1 (en) 2000-11-10 2002-10-17 The Rockefeller University Anti-Igalpha-Igbeta antibody for lymphoma therapy
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
WO2002061087A2 (en) 2000-12-19 2002-08-08 Lifespan Biosciences, Inc. Antigenic peptides, such as for g protein-coupled receptors (gpcrs), antibodies thereto, and systems for identifying such antigenic peptides
US20020159986A1 (en) 2001-01-12 2002-10-31 John Langenfeld Bone morphogenetic protein-2 in the treatment and diagnosis of cancer
US20030119119A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20030119133A1 (en) 2001-01-16 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
AU2002245317A1 (en) 2001-01-24 2002-08-06 Protein Design Labs Methods of diagnosis of breast cancer, compositions and methods of screening for modulators of breast cancer
AU2002251841A1 (en) 2001-01-30 2002-08-12 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of pancreatic cancer
US20040170994A1 (en) 2001-02-12 2004-09-02 Callen David Frederick DNA sequences for human tumour suppressor genes
WO2002071928A2 (en) 2001-03-14 2002-09-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid molecules and proteins for the identification, assessment, prevention, and therapy of ovarian cancer
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
US20040236091A1 (en) 2001-03-28 2004-11-25 Chicz Roman M. Translational profiling
US6362331B1 (en) 2001-03-30 2002-03-26 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the preparation of antitumor agents
WO2003008537A2 (en) 2001-04-06 2003-01-30 Mannkind Corporation Epitope sequences
US6820011B2 (en) 2001-04-11 2004-11-16 The Regents Of The University Of Colorado Three-dimensional structure of complement receptor type 2 and uses thereof
AU2002254615A1 (en) 2001-04-17 2002-10-28 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Repeat sequences of the ca125 gene and their use for diagnostic and therapeutic interventions
JP2005527180A (ja) 2001-04-18 2005-09-15 プロテイン デザイン ラブス， インコーポレイテッド 肺がんの診断方法、肺がんの修飾因子の組成及びスクリーニングの方法
ATE420659T1 (de) 2001-04-26 2009-01-15 Biogen Idec Inc Criptoblockierende antikörper und deren verwendung
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
WO2002089747A2 (en) 2001-05-09 2002-11-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of prostate cancer
US20030078399A1 (en) 2001-05-11 2003-04-24 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acid sequence encoding ovarian antigen, CA125, and uses thereof
ATE446771T1 (de) 2001-05-24 2009-11-15 Zymogenetics Inc Taci-immunoglobulin-fusionsproteine
WO2002098358A2 (en) 2001-06-04 2002-12-12 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis and treatment of androgen-dependent prostate cancer, prostate cancer undergoing androgen-withdrawal, and androgen-independent prostate cancer
WO2003000842A2 (en) 2001-06-04 2003-01-03 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
US20030087266A1 (en) 2001-06-05 2003-05-08 Lori Friedman IGs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
AU2002320264B2 (en) 2001-06-05 2008-05-01 Exelixis, Inc. GFATs as modifiers of the p53 pathway and methods of use
US7235358B2 (en) 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US7125663B2 (en) 2001-06-13 2006-10-24 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes, compositions, kits and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of cervical cancer
MXPA03011979A (es) 2001-06-18 2005-04-08 Eos Biotechnology Inc Metodos de diagnostico de cancer de ovario composiciones y metodos para rastrear moduladores de cancer de ovario.
US7189507B2 (en) 2001-06-18 2007-03-13 Pdl Biopharma, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
AU2002322280A1 (en) 2001-06-21 2003-01-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
WO2003002717A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Schering Corporation Biological activity of ak155
US20030120040A1 (en) 2001-06-29 2003-06-26 Genentech, Inc. Secreted and Transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
AU2002314433A1 (en) 2001-07-02 2003-01-21 Licentia Ltd. Ephrin-tie receptor materials and methods
US20040076955A1 (en) 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
WO2003003984A2 (en) 2001-07-05 2003-01-16 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
US7446185B2 (en) 2001-07-18 2008-11-04 The Regents Of The University Of California Her2/neu target antigen and use of same to stimulate an immune response
WO2003009814A2 (en) 2001-07-25 2003-02-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel genes, compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of prostate cancer
KR20040019105A (ko) 2001-08-03 2004-03-04 제넨테크, 인크. ＴＡＣＩｓ 및 ＢＲ3 폴리펩티드 및 이의 용도
US20070015145A1 (en) 2001-08-14 2007-01-18 Clifford Woolf Nucleic acid and amino acid sequences involved in pain
US20030092013A1 (en) 2001-08-16 2003-05-15 Vitivity, Inc. Diagnosis and treatment of vascular disease
WO2003018621A2 (en) 2001-08-23 2003-03-06 Oxford Biomedica (Uk) Limited Genes
US6902930B2 (en) 2001-08-29 2005-06-07 Vanderbilt University Human Mob-5 (IL-24) receptors and uses thereof
US20030124579A1 (en) 2001-09-05 2003-07-03 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of ovarian cancer, compositions and methods of screening for modulators of ovarian cancer
JP2005505271A (ja) 2001-09-06 2005-02-24 アジェンシス， インコーポレイテッド 癌の処置および検出において有用なｓｔｅａｐ−１と名称が与えられる核酸および対応するタンパク質
WO2003025138A2 (en) 2001-09-17 2003-03-27 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer compositions and methods of screening for modulators of cancer
IL160933A0 (en) 2001-09-18 2004-08-31 Proteologics Inc Methods and compositions for treating ?cap associated diseases
EP2151244A1 (en) 2001-09-18 2010-02-10 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CA2460621A1 (en) 2001-09-19 2003-03-27 Nuvelo, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
WO2003026493A2 (en) 2001-09-28 2003-04-03 Bing Yang Diagnosis and treatment of diseases caused by mutations in cd72
AU2002362454A1 (en) 2001-10-03 2003-04-14 Origene Technologies, Inc. Regulated breast cancer genes
AU2002362436A1 (en) 2001-10-03 2003-04-14 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Modulators of lymphocyte activation and migration
US20030228319A1 (en) 2002-04-16 2003-12-11 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CA2461665A1 (en) 2001-10-19 2003-05-01 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of inflammatory bowel disorders
AU2002356858A1 (en) 2001-10-24 2003-05-06 National Jewish Medical And Research Center Structure of tall-1 and its cognate receptor
KR100996226B1 (ko) 2001-10-31 2010-11-24 유니버시티 오브 노스 텍사스 헬스 사이언스 센터 뼈 형태발생 단백질(ｂｍｐ), ｂｍｐ 수용체 및 ｂｍｐ결합 단백질 및 녹내장 진단 및 치료에서 그의 용도
WO2003042661A2 (en) 2001-11-13 2003-05-22 Protein Design Labs, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20030232350A1 (en) 2001-11-13 2003-12-18 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of cancer, compositions and methods of screening for modulators of cancer
US20050123536A1 (en) 2001-11-20 2005-06-09 Che-Leung Law Treatment of immunological disorders using anti-dc30 antibodies
US7344843B2 (en) 2001-11-29 2008-03-18 Serono Genetics Institute S.A. Agonists and antagonists of prolixin for the treatment of metabolic disorders
AU2002349784A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Asahi Kasei Pharma Corporation Nf-kappab activating genes
CA2468744C (en) 2001-12-03 2013-05-14 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Hybrid antibodies
EP1504099A4 (en) 2001-12-10 2006-05-10 Nuvelo Inc NEW NUCLEIC ACIDS AND POLYPEPTIDES
US20030134790A1 (en) 2002-01-11 2003-07-17 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Bone Morphogenetic Protein-2 And Bone Morphogenetic Protein-4 In The Treatment And Diagnosis Of Cancer
CA2473549C (en) 2002-01-16 2011-02-15 Japan Science And Technology Agency Moving-image holographic reproducing device and color moving-image holographic reproducing device
US7452675B2 (en) 2002-01-25 2008-11-18 The Queen's Medical Center Methods of screening for TRPM4b modulators
JP2005526044A (ja) 2002-02-21 2005-09-02 デューク ユニバーシティ 抗ｃｄ２２抗体を使用した治療方法
EP1575480A4 (en) 2002-02-22 2008-08-06 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS OF TREATING IMMUNE-INFLAMMATORY DISEASES
WO2003073823A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Exelixis, Inc. PDPK1s AS MODIFIERS OF THE p53 PATHWAY AND METHODS OF USE
US6660856B2 (en) 2002-03-08 2003-12-09 Kaohsiung Medical University Synthesis of pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepine analogues
EP2258712A3 (en) 2002-03-15 2011-05-04 Multicell Immunotherapeutics, Inc. Compositions and Methods to Initiate or Enhance Antibody and Major-histocompatibility Class I or Class II-restricted T Cell Responses by Using Immunomodulatory, Non-coding RNA Motifs
CA2486490A1 (en) 2002-03-19 2003-12-31 Curagen Corporation Therapeutic polypeptides, nucleic acids encoding same, and methods of use
US7202033B2 (en) 2002-03-21 2007-04-10 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Identification of kinase inhibitors
EP1494693B1 (en) 2002-03-22 2010-12-08 Biogen Idec MA Inc. Cripto-specific antibodies
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
AU2003245239A1 (en) 2002-03-25 2003-11-03 Uab Research Foundation FC receptor homolog, reagents, and uses thereof
AU2003222103A1 (en) 2002-03-28 2003-10-13 Idec Pharmaceuticals Corporation Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of colon carcinomas
US20030194704A1 (en) 2002-04-03 2003-10-16 Penn Sharron Gaynor Human genome-derived single exon nucleic acid probes useful for gene expression analysis two
NZ535762A (en) 2002-04-05 2009-04-30 Agensys Inc Nucleic acid and corresponding protein entitled 98P4B6 (STEAP 2) useful in treatment and detection of cancer
WO2003087768A2 (en) 2002-04-12 2003-10-23 Mitokor Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
WO2003089904A2 (en) 2002-04-17 2003-10-30 Baylor College Of Medicine Aib1 as a prognostic marker and predictor of resistance to encocrine therapy
AU2003228869A1 (en) 2002-05-03 2003-11-17 Incyte Corporation Transporters and ion channels
AU2003229294A1 (en) 2002-05-15 2003-12-02 Avalon Pharmaceuticals Cancer-linked gene as target for chemotherapy
AU2003232453A1 (en) 2002-05-30 2003-12-19 David K. Bol Human solute carrier family 7 member 11 (hslc7a11)
EP1575492A4 (en) 2002-06-04 2007-05-09 Avalon Pharmaceuticals GENERAL ASSOCIATED WITH CANCER AS TARGET FOR CHEMOTHERAPY
WO2003101283A2 (en) 2002-06-04 2003-12-11 Incyte Corporation Diagnostics markers for lung cancer
AU2003242633A1 (en) 2002-06-06 2003-12-22 Molecular Engines Laboratories Dudulin genes, non-human animal model: uses in human hematological disease
EP1513934B1 (en) 2002-06-06 2011-03-02 Oncotherapy Science, Inc. Genes and polypeptides relating to human colon cancers
CA2488629A1 (en) 2002-06-07 2003-12-18 Avalon Pharmaceuticals, Inc Cancer-linked gene as target for chemotherapy
AU2003245441A1 (en) 2002-06-12 2003-12-31 Avalon Pharmaceuticals, Inc. Cancer-linked gene as target for chemotherapy
US20040249130A1 (en) 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
AU2003247576A1 (en) 2002-06-18 2003-12-31 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
US7304149B2 (en) 2002-06-20 2007-12-04 Washington University In St. Louis BTLA nucleic acids
WO2004001004A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Johns Hopkins University School Of Medicine Membrane associated tumor endothelium markers
DE10229834A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Zinser Textilmaschinen Gmbh Streckwerk für Spinnmaschinen mit nachgeordneter Verdichtungsvorrichtung
WO2004009622A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Cellzome Ag Protein complexes of cellular networks underlying the development of cancer and other diseases
MXPA05000940A (es) 2002-07-25 2005-05-16 Genentech Inc Anticuerpos taci y su uso.
PT2357006E (pt) 2002-07-31 2016-01-22 Seattle Genetics Inc Conjugados de fármacos e sua utilização para tratamento do cancro, de uma doença autoimune ou de uma doença infeciosa
AU2003294210A1 (en) 2002-07-31 2004-05-04 Seattle Genetics, Inc Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
WO2004015426A1 (en) 2002-08-06 2004-02-19 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with human cxc chemokine receptor 5(cxcr5)
JP2004121218A (ja) 2002-08-06 2004-04-22 Jenokkusu Soyaku Kenkyusho:Kk 気管支喘息または慢性閉塞性肺疾患の検査方法
EP1578371A4 (en) 2002-08-19 2009-05-20 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR TUMOR DIAGNOSIS AND TREATMENT
WO2004020583A2 (en) 2002-08-27 2004-03-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide predictor set for identifying protein tyrosine kinase modulators
WO2004020595A2 (en) 2002-08-29 2004-03-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Novel human polypeptides encoded by polynucleotides
US20050271615A1 (en) 2002-08-30 2005-12-08 Doron Shabat Self-immolative dendrimers releasing many active moieties upon a single activating event
AU2002951346A0 (en) 2002-09-05 2002-09-26 Garvan Institute Of Medical Research Diagnosis of ovarian cancer
EP1545610A4 (en) 2002-09-06 2006-11-08 Mannkind Corp EPITOPE SEQUENCES
CA2498264A1 (en) 2002-09-09 2004-05-13 Nura, Inc. G protein coupled receptors and uses thereof
JP2004113151A (ja) 2002-09-27 2004-04-15 Sankyo Co Ltd 癌遺伝子及びその用途
AU2003278002A1 (en) 2002-10-03 2004-04-23 Mcgill Univeristy Antibodies and cyclic peptides which bind cea (carcinoembryonic antigen) and their use as cancer therapeutics
EP1570078A4 (en) 2002-10-04 2006-09-13 Van Andel Res Inst MOLECULAR CLASSIFICATION OF RENAL TUMORS AND DISCOVERING NEW DIAGNOSTIC MARKERS
US20040138269A1 (en) 2002-10-11 2004-07-15 Sugen, Inc. Substituted pyrroles as kinase inhibitors
EP1581169A4 (en) 2002-11-08 2008-09-17 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF DISEASES RELATED TO NATURAL KILLER CELLS
CA2503621A1 (en) 2002-11-13 2004-05-27 Genentech, Inc. Methods and compositions for diagnosing dysplasia
WO2004043493A1 (en) 2002-11-14 2004-05-27 Syntarga B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
GB0226593D0 (en) 2002-11-14 2002-12-24 Consultants Ltd Compounds
WO2004045553A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions
DK1578397T3 (da) * 2002-11-15 2013-03-11 Genmab As Humane monoklonale antistoffer mod CD25
WO2004045520A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Musc Foundation For Research Development Complement receptor 2 targeted complement modulators
AU2003297300A1 (en) 2002-11-20 2004-06-15 Biogen Idec Inc. Novel gene targets and ligands that bind thereto for treatment and diagnosis of carcinomas
EP2410332A1 (en) 2002-11-21 2012-01-25 The University Of Utah Method for identifying purinergic modulators of the olfactory system
AU2003298786A1 (en) 2002-11-26 2004-06-18 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
WO2004053079A2 (en) 2002-12-06 2004-06-24 Diadexus, Inc. Compositions, splice variants and methods relating to ovarian specific genes and proteins
US20040157278A1 (en) 2002-12-13 2004-08-12 Bayer Corporation Detection methods using TIMP 1
ES2388280T3 (es) 2002-12-20 2012-10-11 Abbott Biotherapeutics Corp. Anticuerpos que reaccionan frente a GPR64 y utilización de los mismos
US20050249671A9 (en) 2002-12-23 2005-11-10 David Parmelee Neutrokine-alpha conjugate, neutrokine-alpha complex, and uses thereof
JP2007520995A (ja) 2003-01-08 2007-08-02 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 上皮増殖因子受容体モデュレーターに対する感受性を決定するためのバイオマーカーおよび方法
US20050181375A1 (en) 2003-01-10 2005-08-18 Natasha Aziz Novel methods of diagnosis of metastatic cancer, compositions and methods of screening for modulators of metastatic cancer
US20050227301A1 (en) 2003-01-10 2005-10-13 Polgen Cell cycle progression proteins
EP1583820A4 (en) 2003-01-14 2007-07-18 Bristol Myers Squibb Co ASSOCIATED POLYNUCLEOTIDES AND POLYPEPTIDES ASSOCIATED WITH THE NF-KB WAY
EP1583821A4 (en) 2003-01-15 2007-07-18 Millennium Pharm Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING UROLOGICAL DISORDERS USING GENES 44390, 54181, 211, 5687, 884, 1405, 636, 4421, 5410, 30905, 2045, 16405, 18560, 2047, 33751, 52872, 14063, 20739, 32544, 43239, 44373, 51164, 53010, 16852, 1587, 2207, 22245, 2387, 52908, 69112, 14990, 18547, 115, 579
CA2516128A1 (en) 2003-02-14 2004-09-02 Sagres Discovery, Inc. Therapeutic targets in cancer
US20030224411A1 (en) 2003-03-13 2003-12-04 Stanton Lawrence W. Genes that are up- or down-regulated during differentiation of human embryonic stem cells
EP1608664B1 (en) 2003-03-31 2009-01-28 Council of Scientific and Industrial Research Non-cross-linking pyrrolo[2,1-c][1,4]benzodiazepines as potential antitumour agents and process thereof
GB0321295D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Spirogen Ltd Synthesis of protected pyrrolobenzodiazepines
GB0416511D0 (en) 2003-10-22 2004-08-25 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
WO2005040170A2 (en) 2003-10-22 2005-05-06 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
PT1725249E (pt) 2003-11-06 2014-04-10 Seattle Genetics Inc Compostos de monometilvalina capazes de conjugação a ligandos
WO2005079479A2 (en) 2004-02-17 2005-09-01 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
WO2005082023A2 (en) 2004-02-23 2005-09-09 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404574D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Amino acids
JP4909258B2 (ja) 2004-03-01 2012-04-04 スピロゲン リミティッド Ｃ２置換ピロロベンゾジアゼピン類を調製するための主要な中間体としての１１−ヒドロキシ−５Ｈ−ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］ベンゾジアゼピン−５−オン誘導体
GB0404578D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB0404577D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
DE102004010943A1 (de) 2004-03-03 2005-09-29 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von N-geschützten 4-Ketprolinderivaten
US7528126B2 (en) 2004-03-09 2009-05-05 Spirogen Limited Pyrrolobenzodiazepines
FR2869231B1 (fr) 2004-04-27 2008-03-14 Sod Conseils Rech Applic Composition therapeutique contenant au moins un derive de la pyrrolobenzodiazepine et la fludarabine
GB0410725D0 (en) 2004-05-13 2004-06-16 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine therapeutic agents
BRPI0516284A (pt) 2004-09-23 2008-09-02 Genentech Inc anticorpo construìdo com cisteìna, método de selecionar anticorpos, compostos conjugados de droga-anticorpo, composição farmacêutica, método para matar ou inibir a proliferação de células de tumor, métodos de inibir a proliferação celular e o crescimento de células de tumor, artigo manufaturado e método para produzir um composto
JP2006203186A (ja) 2004-12-24 2006-08-03 Showa Denko Kk 熱電半導体合金の製造方法および熱電変換モジュールならびに熱電発電装置
DK1844074T3 (da) 2005-02-03 2013-07-15 Antitope Ltd Humane antistoffer og proteiner
CA2605507C (en) 2005-04-19 2016-06-28 Seattle Genetics, Inc. Humanized anti-cd70 binding agents and uses thereof
AU2006238686B2 (en) 2005-04-21 2011-10-06 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines
EP1931671B1 (en) 2005-10-05 2009-04-08 Spirogen Limited Alkyl 4- [4- (5-oxo-2, 3, 5, 11a-tetrahyd0-5h-pyrr0l0 [2, 1-c][1, 4]benzodiazepine-8-yloxy) -butyrylamino]-1h-pyrrole-2-carboxylate derivatives and related compounds for the treatment of a proliferative disease
GEP20125456B (en) 2005-10-07 2012-03-26 Exelixis Inc Azetidines as mek inhibitors for the treatment of proliferative diseases
DK2270050T3 (da) 2005-12-30 2013-08-12 Merck Patent Gmbh Anti-CD19-antistoffer med nedsat immunogenicitet
PT1813614E (pt) 2006-01-25 2012-01-09 Sanofi Sa Agentes citotóxicos compreendendo novos derivados de tomaimicina
CA2658276A1 (en) 2006-07-18 2008-01-24 Sanofi-Aventis Antagonist antibody for the treatment of cancer
ME01786B (me) 2006-08-14 2014-09-20 Xencor Inc Optimizovana antitela usmerena na cd19
US20080112961A1 (en) 2006-10-09 2008-05-15 Macrogenics, Inc. Identification and Engineering of Antibodies with Variant Fc Regions and Methods of Using Same
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
US8455622B2 (en) 2006-12-01 2013-06-04 Seattle Genetics, Inc. Variant target binding agents and uses thereof
US8168185B2 (en) * 2007-01-17 2012-05-01 Merck Serono Sa Process for the purification of anti CD-25 antibodies
EP2144628B1 (en) 2007-05-08 2012-10-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
ES2435779T3 (es) 2007-07-19 2013-12-23 Sanofi Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico
MY188455A (en) 2007-10-19 2021-12-09 Genentech Inc Cysteine engineered anti-tenb2 antibodies and antibody drug conjugates
PL2265283T3 (pl) 2008-03-18 2015-03-31 Seattle Genetics Inc Koniugaty aurystatyny lek łącznik
GB0813432D0 (en) 2008-07-22 2008-08-27 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
CN102176873A (zh) 2008-10-15 2011-09-07 捷迈有限公司 髓内钉
GB0819095D0 (en) * 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
GB0819097D0 (en) 2008-10-17 2008-11-26 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
CA2750519C (en) * 2009-02-05 2018-09-25 Immunogen, Inc. Benzodiazepine derivatives
EA201190132A1 (ru) 2009-02-23 2013-01-30 Гленмарк Фармасьютикалс С.А. Гуманизированные антитела, связывающиеся с cd19, и их применение
FR2949469A1 (fr) 2009-08-25 2011-03-04 Sanofi Aventis Derives anticancereux, leur preparation et leur application en therapeutique
AU2010289527C1 (en) 2009-09-01 2014-10-30 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
CA2775350A1 (en) 2009-09-24 2011-03-31 Seattle Genetics, Inc. Dr5 ligand drug conjugates
US9040526B2 (en) 2010-02-09 2015-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Benzylpyrrolidinone derivatives as modulators of chemokine receptor activity
WO2011130615A2 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Preparation of lacosamide
GB201006340D0 (en) 2010-04-15 2010-06-02 Spirogen Ltd Synthesis method and intermediates
TWI540136B (zh) 2010-04-15 2016-07-01 梅迪繆思有限公司 吡咯并苯并二氮呯及其共軛物
CN107019804A (zh) 2010-04-15 2017-08-08 西雅图基因公司 靶向吡咯并苯并二氮杂卓结合物
BR112012026410B8 (pt) * 2010-04-15 2023-01-31 Spirogen Dev Sarl Composto e conjugado de pirrolobenzodiazepinas e usos dos mesmos
SG191965A1 (en) * 2011-02-15 2013-08-30 Immunogen Inc Methods of preparation of conjugates
CN103987718A (zh) 2011-09-20 2014-08-13 斯皮罗根有限公司 作为非对称二聚体pbd化合物用于内含在靶向结合物中的吡咯并苯并二氮杂卓
CN103987384A (zh) 2011-10-14 2014-08-13 西雅图基因公司 吡咯并苯并二氮杂卓和靶向结合物
KR101961976B1 (ko) 2011-10-14 2019-03-25 시애틀 지네틱스, 인크. 피롤로벤조디아제핀 및 표적 접합체
CA2850103C (en) 2011-10-14 2019-09-10 Spirogen Sarl Pyrrolobenzodiazepines
BR112014009050B1 (pt) 2011-10-14 2022-06-21 Medimmune Limited Conjugado anticorpo-fármaco de pirrolbenzodiazepinas, composição farmacêutica que compreende o mesmo, bem como compostos de pirrolbenzodiazepinas
WO2013053872A1 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Spirogen Sàrl Synthesis method and intermediates useful in the preparation of pyrrolobenzodiazepines
AU2012322932B2 (en) 2011-10-14 2016-11-10 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines
IN2014DN10510A (tr) 2012-07-09 2015-08-21 Genentech Inc
US20140030280A1 (en) 2012-07-09 2014-01-30 Genentech, Inc. Anti-cd79b antibodies and immunoconjugates
US9464141B2 (en) 2012-08-02 2016-10-11 Genentech, Inc. Anti-ETBR antibodies and immunoconjugates
JP6367204B2 (ja) 2012-10-12 2018-08-01 メドイミューン・リミテッドＭｅｄＩｍｍｕｎｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ 結合用のピロロベンゾジアゼピン誘導体の合成および中間体
SMT201800346T1 (it) * 2012-10-12 2018-09-13 Medimmune Ltd Coniugati pirrolobenzodiazepina-anticorpo
SMT202100265T1 (it) 2012-10-12 2021-07-12 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepine e loro coniugati
EP2839860B1 (en) * 2012-10-12 2019-05-01 MedImmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
EA027910B1 (ru) 2013-03-13 2017-09-29 Медимьюн Лимитед Пирролобензодиазепины и их конъюгаты
CN107148285B (zh) * 2014-11-25 2022-01-04 Adc治疗股份有限公司 吡咯并苯并二氮杂䓬-抗体缀合物
AU2018253950A1 (en) * 2017-04-20 2019-09-19 Adc Therapeutics Sa Combination therapy with an anti-CD25 antibody-drug conjugate

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013328625A1 (en) 2015-04-23
BR112015008232A2 (pt) 2017-12-05
KR101995620B1 (ko) 2019-07-03
KR20150085814A (ko) 2015-07-24
MX2015004421A (es) 2015-10-29
US20180193480A1 (en) 2018-07-12
HRP20180945T1 (hr) 2018-08-10
RS57104B1 (sr) 2018-06-29
CY1120327T1 (el) 2019-07-10
PT2906296T (pt) 2018-06-01
CA2887897C (en) 2020-02-18
MX364328B (es) 2019-04-23
EP2906296B1 (en) 2018-03-21
ZA201502523B (en) 2017-09-27
WO2014057119A1 (en) 2014-04-17
US11779650B2 (en) 2023-10-10
CN105102068B (zh) 2018-06-01
US20200405880A1 (en) 2020-12-31
CA2887897A1 (en) 2014-04-17
AU2013328625B2 (en) 2016-12-15
LT2906296T (lt) 2018-06-11
NZ707543A (en) 2018-09-28
US20150283263A1 (en) 2015-10-08
ES2670937T3 (es) 2018-06-04
HUE039329T2 (hu) 2018-12-28
SI2906296T1 (en) 2018-06-29
US10799596B2 (en) 2020-10-13
EP2906296A1 (en) 2015-08-19
CN105102068A (zh) 2015-11-25
JP6392764B2 (ja) 2018-09-19
PL2906296T3 (pl) 2018-09-28
JP2015534579A (ja) 2015-12-03
SMT201800346T1 (it) 2018-09-13
US9931415B2 (en) 2018-04-03
DK2906296T3 (en) 2018-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TR201808051T4 (tr) Pirrolobenzodiazepin antikor konjugatları.
DK2906298T3 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
DK2906253T3 (en) Pyrrolobenzodiazepine anti-PSMA antibody conjugates
DK2906252T3 (en) Pyrrolobenzodiazepine Anti-Her2 antibody conjugates
EP2906251B1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-anti-cd22 antibody conjugates
EP2906297B1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP2906250B1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-anti-psma antibody conjugates
EP3054986B1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054985B1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3054983B1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
US20160256561A1 (en) Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates
EP3470086A1 (en) Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
BR122023013613B1 (pt) Pirrolobenzodiazepinas, conjugados destas, composição e composição farmacêutica compreendendo os conjugados, uso dos conjugados para o tratamento de uma doença proliferativa e método para preparar os conjugados