KR20000011101A

KR20000011101A - 사람 b-세포 항원, 관련 시제

Info

Publication number: KR20000011101A
Application number: KR1019980709260A
Authority: KR
Inventors: 용준 류; 이자벨 휘지에르-비비에르; 자크 방셰로
Original assignee: 둘락 노먼 씨.; 쉐링 코포레이션
Priority date: 1996-05-17
Filing date: 1997-05-15
Publication date: 2000-02-25
Also published as: BR9710968A; AU3059997A; SK157498A3; WO1997044452A1; CZ365098A3; IL126811A0; PL329930A1; EP0910636A1; NZ332598A; AU722499B2; NO985339D0; JP2000514281A; NO985339L; CA2254843A1

Abstract

본원에는 사람 B-세포 항원을 암호화하는 유전자의 정제 및 분리법이 기술되어 있다. 핵산, 단백질, 항체 및 세포의 성장을 조절하는데 유용한 기타 시제(유임파구)가, 이들을 사용하는 방법과 함께 본원에 기술되어 있다.

Description

사람 Ｂ-세포 항원, 관련 시제

백혈병, 임파종, 암종 및 기타 악성종양이 예를 들어 문헌[참조: Wilson, et al. (eds.) Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, New York, pp. 1599-1612]에 기술되어 있다. 이러한 질환중의 한가지 예로서, 악성 임파종은 임파 조직에 주로 존재하는 형질전환된 신생물 형성 세포이다[참조: Nadler, L. M. in Harrison's]. 미국에서 매년 약 30,000명의 새로운 환자가 발생하는 비-호드킨 임파종중 90%는 B 세포 임파종이다. 이들 환자 중 25% 미만이 치유된다. 다른 예는 미국에서 매년 약 30,000명의 새로운 환자가 발생하는 백혈병이다. 따라서, B 및 T 세포 임파종, 백혈병, 암종 및 기타 악성종양의 보다 효과적인 치료가 요구되고 있다.

정상 휴지 B 세포(또한 "B 임파구"라고 한다)의 성장은 독특한 2단계를 포함한다. 먼저, 휴지 세포는 활성화되어 세포 주기의 G₀내지 G₁단계를 통과한다[참조: Alberts, et al. (eds. 1989) Molecular Biology of the Cell Garland Publ., NY; and Darnell, et al. (1990) Molecular Cell Biology Freeman, NY]. 이어서, 활성화된 세포가 유도되어 증식된다[참조: Paul, ed. (1989) Fundamental Immunology, 2nd ed., Raven Press, NY; and the third edition]. 인터류킨-1(IL-1), IL-2, IL-4, IL-10 및 IL-13을 포함하는 B 세포의 성장을 유도하는 몇몇 인자가 동정되었다. 또한, 특정 B 세포 표면 분자에 대한 항체가 B 세포 증식을 촉진하는 것으로 입증되었다. T 세포(또한 "T 임파구"라 한다)가 식물성혈구응집소, 항-T 세포 수용체 모노클로날 항체, 항-CD3 모노클로날 항체 및 기타 시제를 포함하는 특정한 인자에 의해 유도되어 증식된다.

다수의 연구는 CD40 분자를 성장 인자 수용체로서 및 사람 B 세포 증식과 성장의 중요한 조절제로서 시사한다. B 임파구는 활성화된 헬퍼 T 세포상에서 일시적으로 발현되는 리간드와 B 임파구 표면상의 CD40 분자간의 상호작용에 의해 활성화된다.

CD40은 정상의 B 임파구 및 B 세포 악성종양, 지상구조(interdigitating) 세포, 여포성 수지상(dendritic) 세포, 흉선 상피 세포 및 일부 암종상에서 발현되는 막-결합된 당단백질이다. 사람 CD40은 거의 B 임파구상에서만 발현되는 모노클로날 항체의 에피토프로서 1985년에 최초 동정된, B 세포에 대한 유용한 마커이다. 사람 CD40 항원은 45 내지 50 Kd 당단백질이다.

항-CD40 항체는 포볼(phorbol) 미리스트 아세테이트(PMA), 항-CD20 항체 또는 항-면역글로블린 항체에 의해 유도된 B 세포 증식에 대한 효과적인 동시-자극 시그날을 제공한다. 활성화된 B 세포에 항-사람 CD40 항체 및 IL-4의 첨가는, 배양물에 CD32 형질감염된 L 세포를 추가로 보충하는 경우, 단시간 복제, IgE 합성의 유도 및 장기간의 증식을 포함하는 각종 효과를 유발한다.

B7(CD80) 및 B70(CD86)은 B 및 T 세포 상호작용을 강력히 매개하는 분자의 제2 "그룹"이다. B 세포상의 이들 분자는 T 세포상의 이들 리간드 CD28 및 CTLA-4와 상호작용한다. 이들 상호작용은 B 및 T 세포 모두의 활성화를 위한 주요한 동시-자극 시그날이다.

지난 15년 동안, 이들 2쌍의 표면 분자는 T 세포 및 B 세포 활성화에 기본적인 역할을 한다는 것이 명백해졌다. 각종 시험관내 및 생체내 실험에 의해 이들 2쌍의 분자가 면역억제를 위한 중요한 표적임이 입증되었다[참조: Ann. Rev. Immunol. 12: 881-922; van Kooten, et al. (1996) Adv. Immunol. 61: 1-77; Linsley and Ledbetter (1993) Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212].

면역억제는 매우 중요한 면역학적 간섭으로서 자가면역 질환 및 이식시의 이식 거부 반응을 예방 및 치유한다. 면역억제는 a) 항-증식성 약물(사이클로포스프아미드, 15-데옥시스페르구아린, 등); b) 글루코코르티코스테로이드; c) 세포내 시그날 과정의 억시제(예: 사이클로스포린); e) 항원에 의한 특이적 내성 유도(예: TGF-β, IL-10); 및 f) CD28/CTLA-4에 의한, CD40/CD40 리간드 및 B7/B70과 같은 T 및 B 임파구 활성화와 관련된 세포 표면 분자의 억제에 의해 달성될 수 있다.

1995년에, RP105로 명명된 또다른 분자가 마우스 비장 세포로부터 클로닝되었다[참조: Miyake, et al (1995) "RP105, a novel B cell surface molecule implicated in B cell activation, is a member of the leucine-rich repeat protein family" J. Immunol. 154: 3333-3340]. RP105에 대한 모노클로날 항체는 항-CD40 항체 또는 CD40-리간드와 유사한 방식으로 마우스 B 세포의 증식을 강력히 유도하고 조사-유도된 세포사멸(apoptosis)로부터 마우스 B 세포를 보호한다[참조: Miyake, et al., (1994) "Murine B cell proliferation and protection from apoptosis with an antibody against a 105 kDa molecule: Unresponsiveness of X-linked immunodeficient B cell" J. Exp. Med. 180: 1217-1224].

RP105 및 이의 추정 리간드는 T 세포 및 B 세포의 활성화에 중요한 역할을 하는 제3의 분자 쌍일 수 있다. 그러나, 지금까지, 사람 서열은 입수할 수 없었고, 이의 구조 및 활성이 측정되지 않았다. 본 발명은 이러한 것은 물론 기타 많은 유용한 이점을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 사람 BAS-1 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 분리된 또는 재조합 핵산; 실질적으로 순수한 BAS-1 단백질 또는 이의 펩티드; BAS-1 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질; 및 재조합 또는 정제된 영장류 BAS-1 단백질에 대해 생성된 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 조성물을 제공한다.

분리된 또는 재조합 핵산의 양태에 있어서, 핵산은 서열 1의 서열을 포함할 수 있다.

단백질 양태에서, 본 발명의 단백질은 실질적으로 순수한 BAS-1 단백질 또는 이의 펩티드일 수 있고; 사람을 포함하는 영장류로부터의 단백질 또는 펩티드, 서열 2의 하나 이상의 폴리펩티드 단편을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 천연 BAS-1 단백질과는 다른 해독후 변형 패턴을 나타내는 단백질 또는 펩티드, 및 BAS-1의 세포내 도메인이 결실된 단백질로 이루어진 그룹중에서 선택될 수 있으며; 당해 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물일 수 있다.

항체 양태에는, BAS-1 단백질이 사람을 포함하는 영장류의 단백질이고; 항체가 서열 2의 서열에 대해 생성되며; 항체가 약 10μM 이상의 Kd를 나타내고; 항체가 모노클로날 항체이거나; 항체가 표지된 항체가 포함된다. 추가의 양태에는 B 세포의 증식을 강력히 유도하고/하거나, B 세포를 조사- 유도된 또는 스테로이드 호르몬-유도된 세포자멸로부터 보호하는 항체가 포함된다.

본 발명은 또한, 예를 들어 BAS-1 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 핵산; 실질적으로 순수한 BAS-1 단백질 또는 단편; 또는 BAS-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 수용체를 포함하는 키트를 포함한다. 당해 핵산을 포함하는 키트는 서열 1의 암호화 서열을 포함할 수 있다. 단백질 또는 단편을 포함하는 키트의 경우, 종종 당해 폴리펩티드는 사람을 포함하는 영장류의 단백질 또는 펩티드; 서열 2의 하나 이상의 폴리펩티드 단편을 포함하는 단백질 또는 펩티드; 및 천연 BAS-1 단백질과는 다른 해독후 변형 패턴을 나타내는 단백질 또는 펩티드로 이루어진 그룹중에서 선택된다.

또 다른 키트에는 BAS-1 단백질이 사람을 포함하는 영장류의 단백질이고; 항체가 서열 2의 펩티드 서열에 대해 생성되며; 항체가 약 10μM 이상의 Kd를 나타내고; 항체가 모노클로날 항체이거나; 항체가 표지된, 항체 또는 수용체가 포함된다.

본 발명은 또한 정제된 또는 재조합 BAS-1 단백질을 생성시키고; BAS-1 단백질에 결합 파트너가 특이적으로 결합하는지에 대해 샘플을 스크리닝하여, 단계를 포함하는 BAS-1에 대한 결합 파트너에 대해 샘플을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 특정한 양태에서, 당해 샘플은 T 세포; 여포성 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포; 또는 섬유아세포, 내피 세포 및 상피 세포를 포함하는 간질(stroma) 세포를 포함한다. 다른 양태에서, 결합 파트너는 항체이고, 샘플은 하이브리도마 상층액이다.

본 발명의 다른 양태는 세포를 BAS-1 단백질의 효능제 또는 길항제와 접촉시킴을 포함하여 세포의 생리 또는 성장을 조절하는 방법을 포함한다. 전형적으로, 생리는 면역억제, 세포독성 치사의 활성화, 사이토킨 생성의 조절, 또는 임파종의 성장으로부터 선택된다. 길항제는 종종 영장류 BAS-1 단백질에 대한 항체일 수 있다. 또한, 당해 방법은 항원 수용체, CD40:CD40 리간드 경로, 또는 CD28/CTLA-4:B7/B70 경로를 통한 시그날의 매개자, 예를 들어 항-CD3, 항-CD 40, 항-CD40 리간드, 항-CD28, 항-CTLA-4, 항-B7, 항-B70, 또는 적당한 표면 시그날 분자의 가용성 부분과 함께 이루어질 수 있다.

본 발명은 사람 면역 반응의 조절에 유용한 각종 생물학적 시제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 예를 들어 B 및 T 세포 상호작용에 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

I. 일반

본 발명은 활성화 항원의 특성을 나타내는 사람 단백질의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 제공한다. 이 단백질은 B 세포 활성화 및 생존 항원-1(BAS-1; B cell Activation and Survial antigen-1)으로 명명된다. 본원에 기술된 영장류 서열은 마우스 유전자가 문헌[참조: Miyake, et al. (1995) J. Immunol. 154: 3333-3340]에 최초로 기술된 후에 수득되었다. 다른 영장류 종의 유사한 단백질 서열을 또한 입수할 수 있다. 하기 기술은 사람 BAS-1 천연 대립유전자를 예시를 위해 기술한 것이지만, 스플라이싱 변이체(예: 천연 형태) 뿐만 아니라 다른 개체로부터의 대립유전자 변이체 및/또는 다형태 변이체에 적용될 수 있다.

이들 유전자는 이와 관련된 단백질을 암호화하는 다른 영장류 유전자의 분리를 가능케 하고, 추가로, 기술된 특정 양태 이상으로 그 부류를 확장시켜 분리할 수 있다. 이 공정은 하기에 광범위하게 기술된다.

사람 B 세포 활성화 및 생존 Ag-1(BAS-1)은 이의 생물학적 활성 때문에 그렇게 명명되었다. 마우스 동족체에 대한 모노클로날 항체, 즉 RP105는 마우스 B 세포의 증식을 강력히 유도하고, 항-CD40 항체 또는 CD40-리간드와 유사한 방식으로 조사-유도된 세포자멸로부터 마우스 B 세포를 보호한다.

사람 BAS-1 cDNA는 마우스 RP105의 서열을 기초로 하는 핵산 서열을 사용하여 분리한다. 상응하는 암호화된 단백질의 분석은 사람 BAS-1이 류신-풍부 모티브를 함유하는 단백질 부류의 구성원임을 시사한다. 당해 부류의 기타 구성원에는 CD14-LPS 수용체, FSH/LH/TSH 수용체, 및 뉴로트로핀 수용체가 포함된다. 이들 수용체는 시그날 형질도입에 관여하는 것으로 여겨진다.

사람 BAS-1 cDNA는 마우스 RP105의 각종 영역으로부터의 서열을 사용하여 추정된다. 마우스와 사람의 BAS-1 개방 판독 프레임 사이의 상동성 비교는 마우스 RP105와 약 67%의 DNA 서열 동일성 및 약 73%의 아미노산 서열 동일성을 나타낸다.

사람 BAS-1은 또한 면역 시스템외에서, 예를 들어 다른 세포 유형에서의 성장 조절에서 기능적으로 작용할 수 있다[참조: Gilbert (1991) Developmental Biology (3d ed.), Sinauer Associates, Sunderland, MA; Browder, et al. (1991) Developmental Biology (3d ed.), Saunders, Philadelphia, PA.; Russo, et al. (1992) Development: The Molecular Genetic Approach, Springer-Verlag, New York, N.Y.; and Wilkins (1993) Genetic Analysis of Animal Development (2d ed.) Wiley-Liss, New York, N.Y.]. 사람 BAS-1의 리간드 동정은 다른 관찰에서 제기된 문제중 일부를 해소시키는데 도움을 줄 수 있다.

II. 정제된 사람 BAS-1

서열 1은 cDNA의 뉴클레오티드 서열 및 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산 서열은 또한 서열 2에 기술되어 있다. 시그날 서열은 met(1) 내지 val(20)에 미치고; 아미노 플랭킹 영역은 아스파라긴(잔기 34, 53)상의 2개의 잠재성 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는 cys(28) 내지 leu(58)에 미치며; 류신-풍부 모티브의 직렬 반복체는 아스파라긴(잔기 70, 78, 201, 234, 244, 394, 402, 451 및 573)상의 잠재성 N-결합된 글리코실화 부위를 갖는 thr(55) 내지 tyr(592)에 미치고; 카복시 플랭킹 영역은 leu(574) 내지 cys(625)에 미치며; 막통과(transmembrane) 영역은 ala(629) 내지 val(65)에 미치고; 세포내 영역은 try 잔기(652 및 658)상의 2개의 잠재성 포스포릴화 부위를 갖는 lys(651) 내지 phe(661)에 미친다.

하기 표는 서열 2에 도시된 사람 BAS-1 단백질의 류신-풍부 반복체의 배열을 나타낸다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "사람 BAS-1은" 단백질과 관련하여 사용되는 경우 서열 2에 도시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다. 본 발명에는 또한 이의 실질적인 단편, 예를 들어 돌연변이체 및 다형태 변이체는 물론 사람 BAS-1 특이적 결합 성분과 동일한 생물학적 기능을 나타내거나 당해 성분과 상호작용하는 사람-유래된 폴리펩티드를 포함하는 단백질도 속한다. 이들 결합 성분은 전형적으로 고도의 친화성, 예를 들어 약 100nM 이상, 통상 바람직하게는 약 30nM 이상, 바람직하게는 약 10nM 이상, 및 더욱 바람직하게는 약 3nM 이상의 친화성으로 사람 BAS-1에 결합한다. 상동성 단백질은 사람, 예를 들어 영장류 이외의 종에서 발견된다.

본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 단편 또는 절편을 포함하고, 약 8개 이상의 아미노산, 일반적으로 10개 이상의 아미노산, 보다 일반적으로 12개 이상의 아미노산, 종종 14개 이상의 아미노산, 보다 종종 16개 이상의 아미노산, 전형적으로 약 18개 이상의 아미노산, 보다 전형적으로 약 20개 이상의 아미노산, 통상적으로 약 22개 이상의 아미노산, 보다 통상적으로 약 24개 이상의 아미노산, 바람직하게는 약 26개 이상의 아미노산, 보다 바람직하게는 약 28개 이상의 아미노산, 및 특히 바람직한 양태로서 약 30개 이상(예: 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57 등)의 아미노산로 이루어진 아미노산 잔기 서열를 포함한다.

용어 "리간드" 또는 "결합 조성물"은, 예를 들어 항체-항원 유형 방식으로 BAS-1과 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 다른 상호작용에는, 예를 들어 리간드-수용체 유형, 또는 예를 들어 공유 또는 비공유 단백질-단백질 상호작용으로 BAS-1과 결합하는 화합물과의 상호작용이 포함한다. 분자는 중합체 또는 화학적 시제일 수 있다. 당해 상호작용이 특이적 친화성을 나타낸다는 것을 제외하고는 BAS-1이 리간드-수용체 상호작용의 리간드 또는 수용체인지에 대한 어떠한 암시도 제시되지 않았다. 작용성 동족체는 구조적으로 변형된 리간드이거나, 적절한 리간드 결합 결정기와 상호작용하는 분자 형상을 갖는 전혀 관련이 없는 분자일 수 있다. 리간드는 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있다[참조: Goodman, et al. (eds.) (1990) Goodman & Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics (8th ed.), Pergamon Press].

폴리펩티드 또는 단편의 용해도는 환경 및 당해 폴리펩티드에 따라 달라진다. 온도, 전해질 환경, 폴리펩티드의 크기 및 분자 특성, 및 용매의 성질을 포함하는 많은 파라미터가 폴리펩티드의 용해도에 영향을 미친다. 전형적으로, 폴리펩티드가 사용되는 온도는 약 4℃ 내지 약 65℃이다. 통상적으로, 사용 온도는 약 18℃ 이상 및 보다 통상적으로 약 22℃ 이상이다. 진단 목적을 위해, 온도는 일반적으로 약 실온 또는 그 이상일 수 있으나, 분석시 성분의 변성 온도 이하일 수 있다. 치료 목적을 위해, 온도는 일반적으로 체온, 전형적으로 사람의 경우 약 37℃일 수 있으나, 특정한 상황하에서 온도는 동일 부위에서 또는 시험관내에서 증가 또는 감소시킬 수 있다.

전해질은 통상적으로 본래의 생리학적 조건에 근접할 수 있으나, 유리한 경우 다소 높거나 낮은 이온성 농도로 변형시킬 수 있다. 실제의 이온을 변형시켜 생리학적 또는 분석학적 환경에서 사용된 표준 완충액을 확인할 수 있다.

일반적으로, 폴리펩티드의 크기 및 구조는 일반적으로 변성된 상태가 아닌 실질적으로 안정한 상태로 존재해야 한다. 폴리펩티드는 예를 들어 용해도를 부여하기 위해 4차 구조로 다른 폴리펩티드와 결합하거나, 천연 지질 이층 상호작용과 유사한 방식으로 지질 또는 변성제와 결합할 수 있다. 특히, 천연 단백질은 종종 PI 결합에 의해 지질에 결합하는 것으로 생각된다.

생리학적 활성의 보존을 위해 사용되는 유형의 용매는 통상적으로 생리학적으로 적합한 완충제일 수 있고, 통상적으로 생리학적 용매와 유사할 것이다. 통상적으로, 용매는 중성 pH, 전형적으로 약 5 내지 10의 pH, 및 바람직하게는 약 7.5의 pH일 수 있다. 어떤 경우에는 변성제, 전형적으로 약한 비-변성제, 예를 들어 CHS(콜레스테릴 헤미석시네이트) 또는 CHAPS(3-([3-콜아미도프로필]디메틸암모니오)-1-프로판 설포네이트)를 가하거나, 단백질의 4차 구조를 파괴하지 않는 충분히 저농도인 변성제를 가할 수 있다.

용해도는 Svedberg 단위로 측정된 침강으로 반영되는데, 이는 특정 조건하에 분자의 침강 속도를 측정하는 것이다. 침강 속도의 측정은 분석용 원심분리로 고전적으로 수행되었지만, 현재는 통상 표준 원심분리기로 수행된다[참조: Freifelder (1982) Physical Biochemistry(2d ed.), W.H. Freeman; and Cantor and Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, parts 1-3, W. H. Freeman & Co., San Francisco]. 예비 측정으로서, 추정상의 가용성 폴리펩티드를 함유하는 샘플을 표준 전체 크기의 원심분리기에서 약 10분 동안 약 50K rpm로 회전시키면, 가용성 분자는 상충액에 잔류할 것이다. 가용성 입자 또는 폴리펩티드는 전형적으로 약 30S 이하, 보다 전형적으로 약 15S 이하, 통상적으로 약 10S 이하, 보다 통상적으로 약 6S 이하일 수 있고, 특정한 양태에서 바람직하게는 약 4S 이하, 보다 바람직하게는 약 3S 이하일 수 있다.

III. 물리학적 변이체

본 발명은 또한 사람 BAS-1의 아미노산 서열과 실질적으로 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 예를 들어 1개, 2개, 및 3개의 보존성 치환체를 포함할 것이다. 바람직하게는, 치환체는 보존된 시스테인과 멀리 떨어져 있고, 종종 나선형 구조 도메인과 멀리 떨어진 다른 영역중에 존재할 것이다. 이러한 변이체는 특이적 항체의 제조에 유용할 수 있고, 종종 생물학적 특성을 대부분 또는 전부 공유할 것이다.

아미노산 서열 동일성은 잔기 일치를 최적화함으로써 측정된다. 이는, 보존성 치환체가 일치됨에 따라 변화한다. 보존성 치환체는 전형적으로 하기 그룹내의 치환체를 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소류신, 류신; 아스파르트산, 글루탐산; 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 유사한 아미노산 서열은 각각의 단백질 서열에서 천연 대립유전자 변이체를 포함하는 것으로 간주한다. 전형적인 상동성 단백질 또는 펩티드는 사람 BAS-1의 아미노산 서열과 85 내지 100% 동일성(갭이 도입될 수 있는 경우) 내지 90 내지 100% 동일성(보존성 치환체가 포함되는 경우)을 가질 수 있다. 동일성은 약 85% 이상, 일반적으로 약 87% 이상, 종종 약 89% 이상, 전형적으로 약 91% 이상, 통상적으로 93% 이상, 더 통상적으로 95% 이상, 바람직하게는 약 97% 이상, 보다 바람직하게는 약 98% 이상일 수 있고, 특히 바람직한 양태의 경우 약 99% 이상일 수 있다[참조: Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff, et al. (1983) Chapter One in Time Warps, String Edits, and Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Addison-Wesley, Reading, MA; and software packages from IntelliGenetics, Mountain View, CA; and the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WI].

분리된 사람 BAS-1 DNA는 뉴클레오티드 치환, 뉴클레오티드 결실, 뉴클레오티드 삽입, 및 뉴클레오티드 서열의 역위에 의해 용이하게 변형시킬 수 있다. 이들 변형은 유용한 항원, 이의 유도체, 또는 유사하거나 길항 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 신규한 DNA 서열을 생성시킬 것이다. 이들 변형된 서열을 사용하여 돌연변이체 항원을 생산하거나 발현을 증가시킬 수 있다. 증가된 발현은 유전자 증폭, 증가된 전사, 증가된 해독 및 기타 기작을 수반할 수 있다. 이러한 돌연변이체인 BAS-1 유도체는 각각의 단백질 또는 이의 단편의 예비결정된 또는 부위-특이적 돌연변이를 포함한다. "돌연변이체 BAS-1"은 달리는 결실, 치환 또는 삽입에 의해 천연적으로 발견되는 BAS-1의 아미노산 서열과는 상이한 아미노산 서열을 갖는 상술된 사람 BAS-1의 중요한 특징을 공유하는 폴리펩티드를 포함한다. 특히 "부위 특이적 돌연변이체 BAS-1"은 서열 2의 항원과 상동성을 갖고 이들 항원과 각종 생물학적 활성을 공유하는 것으로 정의된다. 유사한 개념이 상이한 BAS-1 단백질, 특히 각종 다른 영장류에서 발견되는 단백질에 적용된다. 상기 언급된 바와 같이, 상기 용어는 구체적으로 언급된 사람 양태로만 한정되는 것이 아니라, 추가의 BAS-1 단백질을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.

부위 특이적 돌연변이 부위가 예비결정된 경우라도, 돌연변이체는 부위 특이적이지 않다. 사람 BAS-1 돌연변이유발은 아미노산 삽입 또는 결실에 의해 수행될 수 있다. 치환, 결실, 삽입 또는 임의의 조합을 발생시켜 최종 작제물에 도달할 수 있다. 삽입에는 아미노- 또는 카복시-말단 융합이 포함된다. 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈에서 수행한 다음, 발현된 돌연변이체는 목적하는 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어 M13 프라이머 돌연변이 유발에 의해, 공지된 서열을 갖는 DNA의 예비결정된 부위에서 치환 돌연변이를 생성하는 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다[참조: Sambrook, et al. (1989) and Ausubel, et al.(1987 and Supplements].

DNA에서의 돌연변이에 의해, 통상적으로, 암호화 서열이 판독 프레임을 벗어나서는 안되고, 바람직하게는 하이브리드화하여 루프 또는 헤어핀과 같은 2차 mRNA 구조를 생성할 수 있는 상보성 영역을 생성해서는 않된다.

본 발명은 또한 재조합 단백질, 예를 들어 이들 단백질로부터의 단편을 사용한 이종성 융합 단백질을 제공한다. 이종성 융합 단백질은 통상 천연적으로는 동일한 방식으로 융합되지 않는 단백질 또는 단편의 융합이다. 따라서, 면역글로블린과 BAS-1 폴리펩티드의 융합 생성물은 전형적인 펩티드 결합으로 융합된 서열을 갖는 연속적인 단백질 분자로서, 통상적으로 단일 해독 생성물로서 제조되어 각각의 공급 펩티드로부터 유래되는 특성을 나타낸다. 유사한 개념이 이종성 핵산 서열에 적용된다.

또한, 신규한 작제물은 다른 단백질로 부터의 유사한 작용의 도메인들을 조합하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리간드-결합 또는 다른 단편들은 상이한 새로운 융합 폴리펩티드 또는 단편 사이에서 "치환"될 수 있다[참조: Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1330-1336; and O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992]. 따라서, 새로운 특이성의 조합을 나타내는 신규한 키메라성 폴리펩티드는 리간드-결합 특이성 또는 다른 작용성 도메인의 작용성 결합으로부터 생성될 것이다.

문헌[참조: Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862]에 기술된 포스포르아미다이트 방법은 적합한 합성 DNA 단편을 생성시킬 것이다. 이본쇄 단편은 종종 상보성 본쇄를 합성하고 적합한 조건하에 당해 본쇄와 함께 어닐링시키거나, 적절한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보성 본쇄를 부가함으로써 수득할 수 있다.

IV. 작용성 변이체

BAS-1 항원에 대한 생리학적 반응의 차단은 경쟁 억제와 마찬가지로 BAS-1에 대한 리간드의 결합 억제로 부터 발생할 것이다. 따라서, 본 발명의 시험관내 분석은 종정 분리된 단백질, 재조합 BAS-1을 발현하는 세포의 막, 이들 항원의 리간드 결합 단편을 포함하는 가용성 단편, 또는 고형상 기질에 결합한 단편을 사용한다. 이들 분석은 또한 결합 단편 돌연변이체 및 변형물, 또는 돌연변이체 및 변형물, 예를 들어 리간드 동족체의 영향의 진단적 측정을 가능케 한다.

본 발명은 또한 예를 들어 항원 또는 항원 단편에 대한 중화 항체가 단백질에 결합하는 시험 화합물과 경쟁하는 경우 경쟁 약물 스크리닝 분석물의 용도를 포함한다. 이러한 방식에서, 당해 항체를 사용하여 항원의 하나 이상의 결합 부위를 공유하는 임의의 폴리펩티드의 존재를 검출할 수 있으며, 또한 이들을 사용하여 리간드에 의해 점유될 수도 있는 단백질상의 결합 부위를 점유할 수도 있다.

또한, BAS-1 및 친화성이 높은 리간드 결합 부위를 함유하는 BAS-1의 가용성 단편에 대한 중화 항체를 사용하여 조직, 예를 들어 생리가 비정상적인 조직에서 리간드 작용을 억제시킬 수 있다.

BAS-1 항원의 "유도체"에는 아미노산 서열 돌연변이체, 글리코실화 변이체, 및 다른 화학적 잔기와 접합된 공유결합체 또는 응집물이 포함된다. 공유결합 유도체는 본 기술 분야에 공지된 수단에 의해 BAS-1 항원 아미노산 측쇄내에 또는 N- 또는 C-말단에 존재하는 그룹에 작용성 그룹을 연결시켜 제조할 수 있다. 이들 유도체에는 카복실 말단 또는 카복실 측쇄를 함유하는 잔기의 지방족 에스테르 또는 아미드, 하이드록실 그룹-함유 잔기의 O-아실 유도체, 및 아미노 말단 아미노산 또는 아미노-그룹 함유 잔기의 N-아실 유도체, 예를 들어 리신 또는 아르기닌이 포함된다. 아실 그룹은 C3 내지 C18 표준 알킬을 포함하여 알카노일 아로일 종을 형성하는 알킬-잔기의 그룹중에서 선택된다.

특히, 글리코실화 변형체에는 이의 합성 및 공정중에 또는 추가의 공정 단계에서 폴리펩티드의 글리코실화 패턴을 변형시켜 생성된 변이체가 포함된다. 이를 달성하는 특히 바람직한 수단은 통상적으로 이러한 공정을 제공하는 세포로부터 유도된 글리코실화 효소, 예를 들어 사람 글리코실화 효소에 당해 폴리펩티드를 노출시키는 것이다. 또한, 포스포릴화된 아미노산 잔기, 예를 들어 포스포티로신, 포스포세린, 또는 포스포트레오닌을 포함하여, 다른 미세한 변형을 갖는 동일한 1차 아미노 서열이 포함된다.

주요한 유도체 그룹은 폴리펩티드의 다른 단백질과 BAS-1 항원 또는 이의 단편과의 공유결합체이다. 이들 유도체는 N- 또는 C-말단 융합과 같은 재조합 배양으로, 또는 반응성 측쇄 그룹을 통한 가교-결합 단백질의 유용성에 대해 본 기술분야에 공지된 시제를 사용하여 합성할 수 있다. 가교-결합제에 의한 바람직한 리간드 유도체화 부위는 유리 아미노 그룹, 탄수화물 잔기, 및 시스테인 잔기이다.

또한, BAS-1 항원 및 다른 상동성 또는 이종성 단백질 사이의 융합 폴리펩티드가 제공된다. 상동성 폴리펩티드는 상이한 표면 마커간의 융합체로서, 예를 들어 하나 이상의 마커 단백질의 리간드 특이성을 나타내는 하이브리드 단백질을 생성시킬 수 있다. 마찬가지로, 유도체 단백질의 특성 또는 활성의 조합을 나타낼 수 있는 이종성 융합체가 작제될 수 있다. 전형적인 예는 목적하는 리간드의 존재 또는 위치를 용이하게 측정할 수 있도록 리포터 폴리펩티드, 예를 들어 루시퍼라제와 항원의 단편 또는 도메인(예: 리간드-결합 단편)과의 융합체이다[참조: 본원에 참조로서 기재된 둘(Dull) 등의 미국 특허 제4,859,609호]. 다른 유전자 융합 파트너에는 세균 β-갈락토시다제, trpE, 단백질 A, β-락타마제, α 아밀라제, 알콜 데하이드로게나제, 및 효모 α 교배 인자가 포함된다[참조: gODOWSKI, ET AL. (1988) Science 241: 812-816].

문헌[참조: Beaucage and Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862]에 기술된 포스포르아미다이트 방법은 적합한 합성 DNA 단편을 생성할 것이다. 이본쇄 단편은 종종 상보성 본쇄를 합성하고 적절한 조건하에 본쇄와 함께 어닐링시키거나, 적절한 프라이머 서열과 함께 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보성 본쇄를 부가함으로써 수득할 수 있다.

이러한 폴리펩티드는 또한 포스포릴화, 설폰화, 비오티닐화, 또는 다른 잔기, 특히 포스페이트 그룹과 유사한 분자 형태를 갖는 잔기의 부가 또는 제거에 의해 화학적으로 변형된 아미노산 잔기를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 변형은 유용한 표지화 시약이거나, 정제 표적, 예를 들어 치환성 리간드로서 사용될 수 있다.

융합 단백질은 전형적으로 재조합 핵산 방법 또는 합성 폴리펩티드 방법에 의해 제조될 수 있다. 핵산 조작 및 발현 기술은 예를 들어 문헌[참조: Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory]에 기술되어 있다. 폴리펩티드의 합성 기술은 예를 들어 문헌[참조: Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; and Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford]에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 아미노산 서열 또는 글리코실화의 변이체 이외의 BAS-1 항원 유도체의 용도를 포함한다. 이러한 유도체는 화학적 잔기와 공유결합 또는 응집 유도체일 수 있다. 이들 유도체는 3개의 부류: (1) 염, (2) 측쇄 및 말단 잔기 공유결합 변형체, 및 (3) 예를 들어 세포막과의 흡착 복합체로 대별된다. 이러한 공유결합 또는 응집 유도체는 면역원, 면역분석중의 시제로 유용하거나, 리간드 또는 다른 결합 리간드의 친화성 정제와 같은 정제 방법에 유용하다. 예를 들어, BAS-1 항원은 시아노겐 브로마이드-활성화된 세파로즈와 같은 고체 지지체에 대한 공유 결합에 의해 또는 본 기술 분야에 공지된 방법에 의해 고정화되거나, 글루타르알데하이드 가교-결합의 존재 또는 부재하에 항-BAS-1 항체 또는 이의 리간드의 분석 또는 정제에 사용하기 위한 폴리올레핀 표면상에 흡착시킬 수 있다. 또한, BAS-1 항원은 검출가능한 그룹으로 표지할 수 있는데, 예를 들어 클로르아민 T 공정에 의해 방사성요오도화시키고 희토류 킬레이트에 공유 결합시키거나, 진단 분석에 사용하기 위해 또 다른 형광 잔기에 접합시킬 수 있다.

본 발명의 용해된 BAS-1 항원은 항원 또는 이의 임의의 단편에 특이적인 항혈청 또는 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 정제된 항원은 당해 단백질을 함유하는 각종 형태의 불순물 제제로 면역화에 의해 제조한 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편의 스크리닝에 사용될 수 있다. 특히, 용어 "항체"는 천연 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 정제된 BAS-1은 또한 항원을 함유하는 BAS-1 또는 세포 단편의 농도 증가에 반응하여 생성된 항체를 검출하기 위한 시제로서 사용될 수 있는데, 이들 둘다는 비정상적 또는 특이적인 생리학적 또는 질환 조건의 진단제일 수 있다. 또한, BAS-1 항체는 하기 기술되는 바와 같이 본 발명의 항체를 생성하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 서열 1에 제시된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편에 의해 암호화된 서열 1의 아미노산 서열에 대해 생성된 항체를 포함한다. 특히, 본 발명은 지질 이층 외부에 존재하는 것으로 예상되는 특이적 단편에 대해 결합 친화성을 갖거나 이에 대해 생성되는 항체를 포함한다. 또한, 각종 작제물은 분자의 세포외 노출 부분에 막 결합 단편을 융합시켜 제조할 수 있다.

본 발명은 추가로 밀접한 변이체의 분리를 포함한다. 대립유전자 변이체가 예를 들어 본원에 기술된 양태와 90 내지 97% 동일성을 나타내는 상이한 개체에서 존재하는 것 같다.

본 발명은 또한 구조, 발현 및 작용상 특이성 및 유사성 모두를 나타내는 관련 항원 그룹을 분리하는 방법을 제공한다. 항원의 많은 생리학적 효과에 대한 설명은 항원의 독특한 종 상응체 분리 및 특성화에 의해 크게 가속화된다. 특히, 본 발명은 상이한 종에서 추가의 상동성 유전자 실체를 확인하기 위한 유용한 프로브를 제공한다.

분리된 유전자는 BAS-1의 발현-결실 세포, 예를 들어 상응하는 항원을 결실하고 네가티브 백그라운드 활성을 나타내는 종 형태 또는 세포의 형질전환을 가능케 할 수 있다. 형질전환된 유전자의 발현으로 정의된 또는 단일 종 변이체를 갖는 항원학적으로 순수한 세포주를 분리할 수 있다. 이러한 연구 방법은 임의의 리간드의 생리학적 효과의 검출 및 식별을 보다 민감하게 할 수 있다. 세포질 또는 막 단편과 같은 아세포 단편을 분리하고 사용할 수 있다.

리간드에 의해 제공된 각종 분화 작용에 영향을 미치는 중요한 구조 요소의 분해는 현대의 표준 분자 생물학 기술의 사용, 특히 관련 부류의 구성원을 비교함으로써 가능해졌다[참조: Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1339-1336; and approaches used in O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992; and Lechleiter, et al. (1990) EMBO J. 9: 4381-4390].

특히, 리간드 결합 단편은 어떠한 구조적 특징이 리간드 결합 친화성 및 특이성 모두에서 중요한지를 측정하기 위해 종 변이체 사이에서 치환될 수 있다. BAS-1 변이체의 상이한 배열을 사용하여 상이한 종류의 변이체에 의한 조합된 상호작용 특성을 나타내는 리간드를 스크리닝할 수 있다.

세포내 작용은 사이토졸에 통상 접근할 수 있는 항원의 단편을 포함하는 것으로 여겨진다. 그러나, 항원 내화가 특정한 상황하에서 발생할 수도 있고, 세포내 성분 및 지정된 "세포내" 단편 사이의 상호작용이 발생할 수도 있다. BAS-1과 다른 세포내 성분과의 상호작용에 의한 특이적 단편은 돌연변이 유발 또는 직접적인 생화학적 수단, 예를 들어 가교-결합 또는 친화성 방법에 의해 동정될 수 있다. 결정그래프 또는 다른 물리적 방법에 의한 구조 분석을 또한 적용할 수 있다. 시그날 형질도입 기작에 대한 추가의 연구는 친화성 방법에 의해 분리할 수 있는 결합 성분의 연구를 포함할 것이다.

BAS-1 항원의 발현 및 조절에 대한 추가의 연구가 추구될 수 있다. 항원과 결합된 조절 요소는 상이한 성장 패턴, 조직 특이적 패턴, 또는 다른 발현 패턴을 나타낸다. 상부 또는 하부 유전자 영역, 예를 들어 조절 요소가 관심이 된다.

BAS-1 항원의 구조 연구는 새로운 리간드, 특히 효능제 또는 길항제 특성을 나타내는 동족체의 작제를 유도한다. 이것은 상술된 스크리닝 방법과 배합하여 목적하는 활성 범위를 나타내는 리간드를 분리할 수 있다.

다른 세포 유형의 발현은 종종 특정 항원에서 글리코실화 차이를 나타낸다. 각종 변이체는 아미노산 이외의 구조적 차이에 근거하여 독특한 작용을 나타낼 수 있다. 상이한 변형체는 상이한 작용에 기인할 수 있으며, 당해 효과의 평가가 이제 가능하게 된다.

따라서, 본 발명은 이들로부터 성장된 중요한 성장 항원 및 시제를 제공한다. 상기 기술은 사람 BAS-1에 주로 초점이 맞추어져 있으나, 당해 분야의 숙련가는 본 발명이 다른 BAS-1 항원, 예를 들어 영장류 및 다른 포유동물 종의 변이체를 포함하는 것으로 인식할 것이다.

V. 항체

항체는 천연 발생 형태 및 이들의 재조합 형태 모두로 BAS-1 항원 및 이의 단편의 각종 대립유전자 변이체에 대해 생성될 수 있다. 또한, 항체는 이들의 활성 형태 또는 불활성 형태로 BAS-1에 대해 생성될 수 있다. 항-이디오타입 항체가 또한 고려된다.

결합 단편 및 일본쇄 형을 포함하는, BAS-1의 예비결정된 단편에 대한 항체는 당해 단편과 면역원성 단백질과의 접합체로 동물을 면역화시켜 생성할 수 있다. 모노클로날 항체는 목적하는 항체를 분비하는 세포로부터 제조된다. 이들 항체의 정상 또는 결손 BAS-1와의 결합에 대해 스크리닝하거나, 효능성 또는 길항성 리간드 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 이들 모노클로날 항체는 적어도 K_D가 약 1mM 이상, 보다 통상적으로 약 300μM 이상, 전형적으로 약 30μ 이상, 바람직하게는 약 10μ 이상, 보다 바람직하게는 약 3μM 이상, 예를 들어 1μM, 300nM, 100nM, 30nM, 10nM, 3nM, 1nM, 300pM, 100pM, 30pM 등일 수 있다.

항원 결합 단편을 포함하는 본 발명의 항체는 현저한 진단 또는 치료 용도를 가질 수 있다. 이들은 BAS-1에 결합하고 리간드 결합을 억제하거나 리간드의 생물학적 반응 유도능을 억제하는 효능있는 길항제일 수 있다. 또한, 이들은 비-중화 항체로서 유용할 수 있고, 항체가 항원과 결합하는 경우 세포 자체가 사멸하도록 독소 또는 방사성핵종에 결합시킬 수 있다. 추가로, 이들 항체는 약물 또는 다른 치료제와 직접 또는 링커에 의해 간접적으로 접합시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 항체는 진단 목적에 유용할 수 있다. 포획 또는 비-중화 항체로서, 이들은 리간드 결합을 억제하지 않고서 BAS-1에 결합할 수 있다. 중화 항체로서, 이들은 경쟁 결합 분석에 유용할 수 있다. 또한, 이들은 BAS-1 또는 이의 리간드를 검출 또는 정량하는데 유용할 수 있다

BAS-1 단편은 다른 물질, 특히 면역원으로서 사용되는 융합되거나 공유결합된 폴리펩티드로서 폴리펩티드에 결합될 수 있다. BAS-1 및 이의 단편은 키홀 림펫 헤모시아닌, 소 혈청 알부민, 파상풍 톡소이드 등과 같은 각종 면역원에 융합되거나 공유결합될 수 있다[참조: 폴리클로날 항혈청의 제조방법에 관한 문헌, Microbiology, Hoeber Medical Division, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York, and Williams, et al. (1967) Methods in Immunology and Immunochemistry, Vol. 1, Academic Press, New York]. 전형적인 방법은 항원으로 동물을 과면역화시키는 것이다. 이어서, 동물의 혈액을 반복된 면역화 직후에 수집하고, 감마 글로블린을 분리한다. 다른 한편으로, 세포를 수집하여 하이브리도마를 생성시킬 수 있다.

일부 예로서는 마우수, 설치류, 영장류, 사람 등과 같은 각종 포유동물 숙주로부터의 모노클로날 항체를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 모노클로날 항체를 제조하는 기술은 문헌[참조: Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA] 및 본원에 인용된 참조문헌[참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2d ed.) Academic Press, New York] 및 특히 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 언급하는 문헌[참조: Kohler and Milstein (1975) in Nature 256: 495-497]에서 발견할 수 있다. 간단히 요약하면, 이 방법은 동물에 면역원을 주사하는 것이다. 이어서, 당해 동물을 희생시키고, 세포를 이의 비장으로부터 채취한 다음 골수종 세포와 융합시킨다. 그 결과는 시험관내에서 생성될 수 있는 하이브리드 세포 또는 "하이브리도마"이다. 이어서, 하이브리도마의 집단을 스크리닝하여 개개 클론을 분리하는데, 이들 각각은 면역원에 대한 단일 항체 종을 분비한다. 이 방법에서, 수득된 개개 항체 종은 면역원성 물질상에서 인식되는 특이적 부위에 반응하여 생성된 면역 동물로부터의 불멸되고 클로닝된 단일 B 세포의 생성물이다.

다른 적합한 기술은 항원성 폴리펩티드에 대한 임파구의 시험관내 노출 또는 다른 한편으로 파지 또는 유사한 벡터중의 항체의 라이브러리의 선별을 포함한다[참조: Huse, et al. (1989) "Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda," Science 246: 1275-1281; and Ward, et al. (1989) Nature 341: 544-546]. 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 키메라 또는 사람화된 항체를 포함하여, 변형시키거나 변형시키지 않고서 사용할 수 있다. 종종, 당해 폴리펩티드 및 항체는 검출가능한 시그날을 제공하는 물질을 결합, 즉 공유결합 또는 비공유결합시켜 표지할 수 있다. 다양한 표지물 및 접합 기술이 공지되어 있으며, 과학 및 특허 문헌 모두에 광범위하게 보고되어 있다. 적합한 표지물은 방사성핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광 잔기, 화학발광 잔기, 자기 입자 등이 포함된다. 이러한 표지물의 사용에 대한 특허 및 교시에는 미국 특허 제3,817,837호, 제3,850,752호, 제3,939,350호, 제3,996,345호, 제4,277,437호, 제4,275,149호 및 제4,366,241호가 포함된다. 또한, 재조합 면역글로블린을 생성할 수 있다[참조: Cabilly의 미국 특허 제4,816,567호].

또한, 본 발명의 항체는 단백질의 분리시 친화성 크로마토그래피에 사용될 수 있다. 컬럼은 항체가 고체 지지체, 예를 들어 아가로즈, 세파덱스 등과 결합하는 경우, 세포 분해물이 컬럼을 통과하는 경우, 컬럼을 세척한 다음 약한 변성제의 농도를 증가시킴으로써 정제된 BAS-1 단백질을 방출할 수 있도록 제조할 수 있다.

또한, 당해 항체를 사용하여 특정한 발현 생성물에 대한 발현 라이브러를 스크리닝할 수 있다. 통상적으로, 이러한 공정에 사용된 항체는 잔기로 표지되어 항체 결합에 의해 항원의 존재를 용이하게 검출할 수 있도록 한다.

BAS-1 항원에 대해 생성된 항체를 또한 사용하여 항-이디오타입 항체를 생성할 수 있다. 이들은 각 항원의 발현과 관련된 각종 면역학적 조건을 검출 또는 진단하는데 유용하다.

VI. 핵산

사람 BAS-1 프로브, 또는 이의 단편을 사용하여 다른 종의 상동성 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 동일한 또는 또다른 종에서의 다른 관련 단백질을 동정 또는 분리할 수 있다.

본 발명은 생물학적으로 활성인 상응하는 BAS-1 폴리펩티드를 암호화하기 위한 분리된 DNA 또는 단편의 용도를 포함한다. 또한, 본 발명은 적당한 조건하에 본원에 기술된 DNA 서열과 하이브리드화할 수 있는 생물학적 활성 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 또는 재조합 DNA를 포함한다. 상기 생물학적 활성 단백질 또는 폴리펩티드는 순수한 BAS-1 또는 단편일 수 있고, 서열 1에 도시된 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 추가로, 본 발명은 BAS-1과 상동성이거나 사람 BAS-1을 암호화하는 cDNA를 프로브로서 사용하여 분리되는 분리된 또는 재조합 DNA, 또는 이의 단편을 포함한다. 분리된 DNA는 5' 및 3'내에 각각의 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 폴리-A 부가 시그날 등을 가질 수 있다.

"분리된" 핵산은 천연 서열을 수반하는 다른 성분, 예를 들어 고유 종으로부터의 리보솜, 폴리머라제 및 플랭킹 게놈 서열으로부터 실질적으로 분리된 핵산, 예를 들어 RNA, DNA 또는 혼합된 중합체일 수 있다. 본 발명은 이의 천연 발생 환경으로부터 제거되는 핵산 서열을 포함하며, 재조합 또는 클로닝된 DNA 분리물 및 이종성 계에 의해 화학적으로 합성된 동족체 또는 생물학적으로 합성된 동족체를 포함한다. 실질적으로 순수한 분자는 분리된 형태의 분자를 포함한다.

분리된 핵산은 일반적으로 상동성 분자 조성물일 수 있으나, 어떤 양태에서는 약한 이종성을 함유할 것이다. 이러한 이종성은 전형적으로 목적하는 생물학적 작용 또는 활성에 중요하지 않은 중합체 말단 또는 부분에서 발견된다.

"재조합" 핵산은 이의 제조 방법 또는 구조에 의해 정의된다. 이의 제조방법과 관련하여, 예를 들어 생성물은 뉴클레오티드 서열에 사람이 관여한 재조합 핵산 기술을 사용하는 공정에 의해 제조된다. 다른 한편으로, 이는 서로 자연히 접촉하지 않는 융합된 2개의 단편을 포함하는 서열을 생성함으로써 제조된 핵산일 수 있으나, 예를 들어 천연 발생 돌연변이체인 천연 생성물을 제외된다. 따라서, 임의의 합성 올리고뉴클레오티드 공정을 사용하여 유도된 서열을 포함하는 핵산이기 때문에, 예를 들어 세포를 임의의 비천연 발생 벡터로 형질전환시켜 제조한 생성물이 포함된다. 전형적으로 제한 또는 서열 인식 부위를 도입 또는 제거하면서, 종종, 동일한 또는 보존성 아미노산을 암호화하는 중복성 코돈으로 코돈을 치환시킨다. 다른 한편으로, 이는 목적하는 기능을 갖는 핵산 단편과 함께 결합시켜 통상 이용가능한 형태로 발견되지 않는 목적하는 기능의 조합을 포함하는 단일 유전자 실체를 생성한다. 제한 효소 인식 부위는 종종 이러한 인위적 조작의 표적이지만, 다른 부위 특이적 표적, 예를 들어 프로모터, DNA 복제 부위, 조절 서열, 제어 서열, 또는 다른 유용한 특징을 작제에 의해 혼입시킬 수 있다. 유사한 개념이 재조합체, 예를 들어 융합, 폴리펩티드에도 적용된다. 구체적으로, 유전 암호 중복성에 의해 이들 항원 단편에 유사한 폴리펩티드, 및 각종 상이한 종의 변이체로부터의 서열 융합체를 암호화하는 합성 핵산이 포함된다.

핵산과 관련하여 "단편"은 약 117개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 20개 이상의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 약 23개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 26개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 약 29개 이상의 뉴클레오티드, 종종 약 32개 이상의 뉴클레오티드, 보다 종종 약 35개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 38개 이상의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 약 44개 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 약 44개 이상의 뉴클레오티드, 보다 일반적으로 약 47개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 53개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 연속 단편이며, 특히 바람직한 양태로서 약 56개 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 60개, 75개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개 등의 뉴클레오티드일 수 있다.

BAS-1 단백질을 암호화하는 DNA는 상이한 종의 상동성 단백질을 암호화하는 DNA뿐만 아니라, 관련된 또는 상동성 항원을 암호화하는 유전자, mRNA, 및 cDNA 종을 동정하는데 특히 유용할 수 있다. 각종 BAS-1 단백질은 서열이 상이하여야 하며, 본원에 포함된다. 그러나, BAS-1과 진화상의 관계가 더욱 먼 단백질도 이들이 충분한 유사성을 나타낸다면 이들을 사용하여 용이하게 분리할 수 있다. 영장류 BAS-1 단백질이 특히 바람직하다.

본 발명은 추가로 본원에 기재된 분리된 DNA와 동일하거나 상동성이 높은 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 포함한다. 특히, 이들 서열은 전사, 해독 및 DNA 복제를 조절하는 DNA 단편에 작동적으로 결합할 수 있다. 다른 한편으로, 예를 들어 인트론을 함유하는 게놈 서열로부터 유도된 재조합 클론이 예를 들어 유전자이식(tansgenic) 세포 및 생물을 포함하는 유전자이식 연구 및 유전자 치료에 유용할 것이다[참조: Goodnow (1992) "Transgenic Animals" in Roitt (ed.) Encyclopedia of Immunology Academic Press, San Diego, pp. 1502-1504; Travis (1992) Science 256: 1392-1394; Kuhn, et al. (1991) Science 254: 707-710; Capecchi (1989) Science 244: 1288; Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford; and Rosenberg (1992) J. Clinical Oncology 10: 180-199].

비교하는 경우, 상동성 핵산 서열은 현저한 서열 유사성을 나타낸다. 핵산 상동성에 대한 기준은 서열 비교 또는 하이브리드화 조건을 토대로 하여 본 기술분야에서 일반적으로 사용되는 상동성을 측정하는 것이다. 하이브리드화 조건은 하기에 보다 상세히 기술된다.

핵산 서열 비교와 관련하여 실질적인 동일성은 단편 또는 이들의 상보성 본쇄가 적절한 뉴클레오티드 삽입체 또는 결실물과 비교하는 경우 약 50% 이상의 뉴클레오티드, 일반적으로 약 56% 이상, 보다 일반적으로 약 59% 이상, 통상적으로 약 62% 이상, 보다 통상적으로 약 65% 이상, 종종 약 68% 이상, 보다 종종 약 71% 이상, 전형적으로 약 74% 이상, 보다 전형적으로 약 77% 이상, 통상적으로 약 80% 이상, 보다 통상적으로 약 85% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 내지 98% 이상의 뉴클레오티드에서 최적으로 배열된다는 것을 의미한다. 다른 한편으로, 실질적인 동일성은 당해 단편이 선택된 하이브리드화 조건하에 본쇄 또는 이의 보체와 전형적으로 서열 1로부터 유래된 서열을 사용하여 하이브리드화할 수 있는 경우에 존재한다. 전형적으로, 선택 하이브리드화는 약 14개 이상의 뉴클레오티드의 서열에 걸쳐 상동성 약 55% 이상, 바람직하게는 약 65% 이상, 보다 바람직하게는 약 75% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상인 경우에 발생할 수 있다[참조: Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 재영 12: 203-213]. 상술된 바와 같이 상동성 비교의 길이는 보다 긴 서열에 걸쳐 존재할 수 있고, 특정한 양태에서는 약 17개 이상의 뉴클레오티드, 통상적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 보다 통상적으로 약 24개 이상의 뉴클레오티드, 전형적으로 약 28개 이상의 뉴클레오티드, 보다 전형적으로 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 75 내지 100개 이상의 뉴클레오티드, 예를 들어 125개, 150개, 200개, 250개, 300개 등의 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.

하이브리드화에서의 동일성과 관련하여, 엄격한 조건은 염, 온도, 유기 용매 및 전형적으로 하이브리드화 반응에서 조절되는 기타 요소의 엄격한 조합 조건일 수 있다. 엄격한 온도 조건은 통상적으로 약 30℃ 이상의 온도, 보다 통상적으로 약 37℃ 이상의 온도, 전형적으로 약 45℃ 이상의 온도, 보다 전형적으로 약 55℃ 이상의 온도, 바람직하게는 약 65℃ 이상의 온도, 보다 바람직하게는 약 70℃ 이상의 온도를 포함할 수 있다. 엄격한 염 조건은 통상적으로 약 500nM 이하, 통상적으로 약 350nM 이하, 보다 통상적으로 약 200nM 이하, 전형적으로 약 150nM 이하, 바람직하게는 약 100nM 이하, 보다 바람직하게는 약 50nM 이하일 수 있다. 그러나, 당해 파라미터의 조합이 어느 한 파라미터의 측정보다 훨씬 중요하다[참조: Wetmur and Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31: 349-370].

다른 사람 개체로부터의 BAS-1은 하이브리드화 또는 PCR에 의해 클로닝 및 분리될 수 있다. 다른 한편으로, 보다 작은 대립유전자 특이성을 나타내는 항체 제제의 제조는 발현 클로닝 연구에 유용할 수 있다. 대립유전자 변이체는 예를 들어 반복적인 PCR 및 서열 분석의 조합, 예를 들어 규정된 프라이머를 사용하여 사람 집단에서 대립유전자 변이에 대한 정보를 제공함으로써 특성화시킬 수 있다.

VII. BAS-1의 제조; 모의

BAS-1 항원 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA는 화학적 합성, 스크리닝 cDNA 라이브러리에 의해, 또는 다양한 세포주 또는 조직 샘플로부터 제조된 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다.

이 DNA는 예를 들어 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 생성에 사용될 수 있는 전체 길이의 항원 또는 단편의 합성; 결합 연구, 변형된 분자의 작제 및 발현, 및 구조/기능 연구를 위해 다양한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 각각의 항원 또는 이의 단편은 적절한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 이들 분자는 실질적으로 정제되어 단백질 또는 세포 오염물, 예를 들어 재조합 숙주 세포로부터 유래하는 오염물을 제거할 수 있으며, 이에 의해 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제와 배합하는 경우에 약제학적 조성물에서 특히 유용하다. 항원 또는 이의 부분은 다른 단백질의 융합물로서 발현시킬 수 있다.

발현 벡터는 전형적으로 목적하는 항원 유전자 또는 이의 단편을 함유하는 자가-복제 DNA 또는 RNA인데, 이는 통상적으로 적합한 숙주 세포에서 인식되는 적합한 유전자 조절 요소에 작동적으로 결합된다. 이들 조절 요소는 적합한 숙주내에서 발현될 수 있다. 발현되어야 하는 특정 유형의 조절 요소는 사용된 최종 숙주 세포에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 유전자 조절 요소는 원핵 프로모터 시스템 또는 진핵 프로모터 발현 조절 시스템을 포함할 수 있으며, 특히 전사 프로모터, 전사 개시를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터, mRNA 발현 수준을 상승시키기 위한 전사 인핸서, 적합한 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독을 종결시키는 서열을 포함한다. 또한, 발현 벡터는 통상적으로 복제 기원을 함유하여 벡터가 숙주 세포를 독립적으로 복제하게 된다.

본 발명의 벡터는 사람 BAS-1 항원을 암호화하는 DNA 또는 생물학적 활성 폴리펩티드를 암호화하는 이의 단편을 함유한다. DNA는 세균 프로모터의 조절하에 존재하고, 선별 마커를 암호화할 수 있다. 본 발명은 또한 벡터가 숙주에 적합한 경우와 항원을 암호화하는 진핵 cDNA가 벡터내로 삽입되는 경우에 당해 벡터를 함유하는 숙주가 당해 cDNA를 발현하도록 원핵 또는 진핵 숙주에서 사람 BAS-1 항원을 암호화하는 진핵 cDNA를 발현시킬 수 있는 발현 벡터의 용도를 포함한다. 통상적으로, 발현 벡터는 이들의 숙주 세포에서의 안정한 복제용으로 또는 세포당 목적하는 유전자의 전체 복제물 수를 크게 증가시키기 위한 증폭용으로 작제된다. 발현 벡터가 숙주 세포에서 언제나 복제되어야 할 필요는 없으며, 예를 들어 숙주 세포에 의해 인식되는 복제 기원을 함유하지 않는 벡터를 사용하여 각종 숙주에서 항원 또는 이의 단편을 일시적으로 발현시킬 수 있다. 또한, 사람 BAS-1 유전자 또는 이의 단편을 숙주 DNA로 재조합에 의해 통합시키는 벡터를 사용할 수 있다.

본원에 사용된 벡터는 플라스미드, 바이러스, 박테리오파지, 통합가능한 DNA 단편, 및 숙주의 게놈내로 DNA 단편을 통합시킬 수 있는 기타 비히클을 포함한다. 발현 벡터는 작동적으로 결합된 유전자를 발현시키는 유전자 조절 요소를 함유하는 특정한 벡터이다. 플라스미드는 가장 통상적으로 사용되는 형태의 벡터이지만, 동일한 작용을 나타내고 본 기술 분야에 공지되어 있는 기타 모든 형태의 벡터가 본원에 사용하기에 적합하다[참조: Pouwels, et al. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N. Y., and Rodriquez, et al. (1988) (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, MA].

형질전환된 세포는 바람직하게는 재조합 DNA 기술에 의해 작제된 사람 BAS-1 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 포유동물의 세포이다. 형질전환된 숙주 세포는 통상적으로 항원 또는 이의 단편을 발현하지만, 이의 DNA의 클로닝, 증폭 및 조작을 위해 단백질을 발현시키지 않아야 한다. 본 발명은 영양 배지에서 형질전환된 세포를 배양하여 당해 단백질을 배지에 축적시키는 방법을 포함한다. 당해 단백질은 배양물 또는 배양 배지로부터 회수할 수 있다.

본 발명의 목적상, DNA 서열은 서로 기능적으로 관련시키는 경우 작동적으로 결합된다. 예를 들어, 프리(pre)단백질로서 발현되거나 세포 막에 대한 폴리펩티드의 유도 또는 폴리펩티드의 분비에 관여하는 경우, 프리(pre)서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩티드에 작동적으로 결합된다. 폴리펩티드의 전사를 조절하는 경우에는 프로모터가 암호화 서열에 작동적으로 결합하고, 전사되도록 위치하는 경우에는 리보솜 결합 부위가 암호화 서열에 작동적으로 결합된다. 일반적으로, "작동적으로 결합된"이란 판독 프레임내에 연속적으로 결합되는 것을 의미하지만, 억제 유전자와 같은 특정 유전 요소는 연속적으로는 결합되지 않으나, 발현을 조절하는 오퍼레이터 서열에 결합한다.

적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 하등 진핵생물, 및 고등 진핵생물이 포함된다. 원핵생물에는 그람 음성 및 그람 양성 생물, 예를 들어 이. 콜라이 및 비. 서브틸리스가 포함된다. 하등 진핵생물에는 효모, 예를 들어 에스. 세레비지애 및 피키아, 및 딕티오스텔리움속의 종이 포함된다. 고등 진핵생물에는 비-포유동물 기원(예: 곤충 세포, 및 조류) 및 포유동물 기원(예: 사람, 영장류, 및 설치류) 모두의 확립된 조직 배양 세포주가 포함된다.

원핵 숙주-벡터 시스템은 다수의 상이한 종류에 대한 다양한 벡터를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 다른 원핵생물에 사용된 동등한 벡터를 포함하도록 이. 콜라이 및 이의 벡터가 일반적으로 사용될 수 있다. DNA를 증폭시키기 위한 대표적인 벡터는 pBR322 또는 다수의 이의 유도체이다. 사람 BAS-1 항원 또는 이의 단편의 발현에 사용될 수 있는 벡터는 lac 프로모터(pUC-시리즈); trp 프로모터(pBR322-trp); Ipp 프로모터(pIN-시리즈); 람다-pP 또는 pR 프로모터(pOTS); 또는 ptac(pDR540)과 같은 하이브리드 프로모터를 함유하는 벡터가 포함되며, 이로써 제한되는 것은 아니다[참조: Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", in Rodriguez and Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, Chapter 10, pp. 205-236].

하등 진핵생물, 예를 들어 효모 및 딕티오스텔리움은 사람 BAS-1 항원 서열 함유 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 본 발명의 목적상, 가장 통상적인 하등 진핵생물 숙주는 빵 효모, 사카로마이세스 세레비지애이다. 다수의 다른 균주 및 종이 또한 이용될 수 있으나, 일반적으로 하등 진핵생물을 나타내도록 사용될 것이다. 효모 벡터는 전형적으로 복제 기원(통합 형태가 아닌 경우), 선별 유전자, 프로모터, 목적하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 DNA, 및 해독 종결, 폴리아데닐화 및 전사 종결을 위한 서열로 이루어져 있다. 효모의 적합한 발현 벡터에는 3-포스포글리세레이트 키나제 및 각종 다른 글리콜분해성 효소 유전자 프로모터와 같은 구조 프로모터, 또는 알콜 데하이드로게나제 2 프로모터 또는 메탈로티오닌 프로모터와 같은 유도가능한 프로모터가 포함된다. 적합한 벡터에는 하기 형태: 자가 복제성 저 사본 수(예: YEp-시리즈), 자가-복제성 고 사본 수(예: YEp-시리즈); 통합 형태(예: YIp-시리즈), 또는 미니-염색체(예: YCp-시리즈)가 포함된다.

고등 진핵 조직 배양 세포는 작용적으로 활성인 사람 BAS-1 항원 단백질의 발현을 위한 바람직한 숙주 세포이다. 원칙적으로, 무척추 또는 척추 공급원으로부터의 고등 진핵생물 조직 배양 세포주, 예를 들어 곤충 바쿨로바이러스 발현 시스템을 이용할 수 있다. 그러나, 해독과 동시에 또는 해독후의 공정이라는 점에서 포유동물 세포가 바람직하다. 이러한 세포의 형질전환 또는 형질감염 및 번식은 통상의 공정이 되었다. 유용한 세포주의 예에는 헬라 세포, 차이니즈 햄스터 난모(CHO) 세포주, 베이비 랫트 신장(BRK) 세포주, 곤충 세포주, 조류 세포주, 및 원숭이(COS) 세포주가 포함된다. 이러한 세포주에 대한 발현 벡터는 통상적으로 복제 기원, 프로모터, 해독 개시 부위, RNA 스플라이싱 부위(게놈 DNA가 사용되는 경우), 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 부위를 포함한다. 이들 벡터는 또한 선별유전자 또는 증폭 유전자를 함유한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 예를 들어 아데노바이러스, SV40, 파르보바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 사이토메갈로바이러스와 같은 공급원으로부터 유도된 프로모터를 함유하는 레트로바이러스일 수 있다. 적합한 발현 벡터의 대표적인 예에는 pCDNA1; pCD[참조: Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5: 1136-1142]; pMC1neo 폴리-A[참조: Thomas, et al. (1987) Cell 51: 503-512], 및 pAC 373 또는 pAC 610과 같은 바쿨로바이러스 벡터가 포함된다.

종종, 특정한 또는 정의된 글리코실화 패턴을 제공하는 시스템에서 사람 BAS-1 항원 폴리펩티드를 발현시키는 것이 바람직할 것이다. 이러한 경우에, 통상적인 패턴은 발현 시스템에 의해 천연적으로 제공된 것일 수 있다. 그러나, 당해 패턴은 이종성 발현 시스템내로 도입된 적절한 글리코실환 단백질에 비글리코실화 형태의 폴리펩티드를 노출시킴으로써 변형시킬 수 있다. 예를 들면, BAS-1 항원 유전자를 포유동물 또는 다른 글리코실화 효소를 암호화하는 하나 이상의 유전자로 공동-형질전환시킬 수 있다. 이러한 방법을 사용함으로써, 특정한 포유동물 글리코실화 패턴이 원핵생물 또는 다른 세포에서 달성 또는 접근될 수 있다.

또한, BAS-1 항원은 포스파티딜 이노시톨(PI) 결합된 형태로 제조될 수 있으나, 포스파티딜 이노시톨 절단 효소, 예를 들어 포스파티딜 이노시톨 포스포리파제-C로 처리하여 막으로부터 제거할 수 있다. 이것은 항원을 생물학적 활성 형태로 방출시켜 단백질 화학의 표준 공정에 의해 정제한다[참조: Low (1989) Biochim. iophys. Acta 988: 427-454; Tse, et al. (1985) Science 230: 1003-1008; and Brunner, et al. (1991) J. Cell Biol. 114: 1275-1283]. 다른 한편으로, 정제 단편은 예를 들어 N-말단 또는 C-말단의 서열에서 유전자 조작하여 단백질 생성물의 정제 또는 검출을 보조할 수 있다. 이러한 단편을 제거하는 수단은 또한 예를 들어 프로테아제 절단 부위를 조작할 수 있다.

이때, 완전한 서열이 공지되어 있으면, 사람 BAS-1 항원, 단편, 또는 이의 유도체는 펩티드 합성에 대한 통상의 공정에 의해 제조할 수 있다. 이들에는 문헌[참조: Stewart and Yound (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky and Bodanszky (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York; and Bodanszky (1984) The Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York]에 기술된 바와 같은 공정을 포함한다. 예를 들면, 아지드 공정, 산 클로라이드 공정, 산 무수물 공정, 혼합된 무수물 공정, 활성 에스테르 공정(예: p-니트로페닐 에스테르, N-하이드록시석신이미드 에스테르, 또는 시아노메틸 에스테르), 카보디이미다졸 공정, 산화-환원 공정, 디사이클로헥실카보디이미드(DCCD)/첨가 공정을 사용할 수 있다. 고체 상 및 액체 상 합성을 모두 상기 공정에 적용할 수 있다.

사람 BAS-1 항원, 단편 또는 유도체는 일반적으로 말단 아미노산에 아미노산을 축합시키는 소위 단계적 공정에 의해, 또는 말단 아미노산에 대한 펩티드 단편의 결합에 의해 일반적으로 펩티드 합성에 사용되는 바와 같은 상기 공정에 따라 적합하게 제조된다. 결합 반응에 사용되지 않는 아미노 그룹은 부정확한 위치에서 결합하는 것을 방지하기 위해 보호시키지 않으면 안된다.

고체 상 합성법이 적용되는 경우, C-말단 아미노산은 불용성 담체 또는 지지체에 이의 카복실 그룹을 통해 결합된다. 불용성 담체는 반응성 카복실 그룹에 대한 결합 능력을 갖는한 특히 제한되지 않는다. 이러한 불용성 담체의 예에는 할로메틸 수지, 예를 들어 클로로메틸 수지 또는 브로모메틸 수지, 하이드록시메틸 수지, 페놀 수지, 3급-알킬옥시카보닐-하이드라지드화된 수지 등이 포함된다.

아미노 그룹-보호된 아미노산은 단계적으로 펩티드를 합성하기 위해 미리 형성된 펩티드 또는 쇄의 활성화된 카복실 그룹 및 반응성 아미노 그룹의 축합을 통해 서열내에서 결합된다. 완전한 서열을 합성한 후, 펩티드는 불용성 담체로부터 분리되어 펩티드를 생성한다. 이 고체-상 방법은 일반적으로 문헌[참조: Merrifield, et al. (1963) in J. am. Chem. Soc. 85: 2149-2156]에 기술되어 있다.

제조된 항원 및 이의 단편은 펩티드 분리 수단, 예를 들어 추출, 침전, 전기영동 및 각종 형태의 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물로부터 분리 및 정제될 수 있다. 본 발명의 사람 BAS-1 항원은 이의 목적하는 용도에 따라 순도가 다르게 수득할 수 있다. 정제는 본원에 기술된 단백질 정제 기술을 사용하거나 면역흡착 친화성 크로마토그래피에 본원에 기술된 항체를 사용하여 달성할 수 있다. 이러한 면역흡착 친화성 크로마토그래피는 먼저 고체 지지체에 당해 항체를 결합시킨 후 결합된 항체를 소형 세포 폐암 세포의 가용화된 용해물, BAS-1 항원을 발현하는 다른 세포의 용해물, 또는 DNA 기술에 의해 BAS-1 항원을 생산하는 세포의 용해물 또는 상층액로 접촉시켜 수행한다(하기 참조).

VIII. 용도

본 발명은, 본원의 다른 곳에서 예를 들면 발생적 또는 생리학적 이상에 대한 일반적 기술 또는 진단용 키트에 대한 하기의 기술중에서, 기술된 바와 같은 진단적 적용에서 용도가 밝혀진 시제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상당한 치료적 가치를 지닌 시제를 제공한다. 사람 BAS-1(천연 또는 합성), 이의 단편 및 이에 대한 항체와 함께 사람 BAS-1에 대해 결합 친화성을 지닌 것으로 확인된 화합물은 비정상적 B-세포 반응, 예를 들면 비정상적 증식(예: 암적 상태) 또는 변성 상태와 관련된 병리상태의 치료에 유용함에 틀림없다. 비장상적 증식, 재생, 변성 및 위축은 본원에 제공된 조성물을 사용하여 적당히 치료학적 처리를 함으로써 조절될 수 있다. 예를 들면, BAS-1의 비정상적 발현 또는 비정상적 유발과 관련된 질병 또는 장해는 당해 항원의 효능제 또는 길항제에 대한 적당한 표적일 것이다. BAS-1은 아마도 B 세포의 활성화 또는 조절에 관여할 것이며, 이는 면역학적 반응, 에를 들면 자가면역 장해 또는 알레르기성 반응에 영향을 미칠 것이다.

또한, BAS-1:BAS-1 결합 파트너 상호작용은 초-IgM 증후군에서 관찰된 바와 같이 초기 B-세포의 활성화, 증식 및/또는 분화를 허용하는 T:B 세포 상호작용과 관련이 있을 수 있다. 이러한 경우, 치료는, BAS-1:BAS-1 결합 파트너 시그날 전도의 방해에 의해 이루어질 것이다. 당해 시그날의 차단은, 예를 들면 가용성 BAS-1 또는 BAS-1에 대한 항체에 의해 영향 받을 것이다.

또한, BAS-1:BAS-1 결합 파트너 상호작용은 배중심의 암대에서 B 세포 아구 및 중심아구(centroblast)의 대량 증식의 개시 및/또는 조절과 관련이 있을 수 있다[참조: Banchereau and Rossert (1992) Adv. Immunol. 125:868-877]. Ig 체세포 돌연변이 과정을 개시하고/하거나 조절하는 시그날과 관련이 있는 세포 표면 상호작용은 BAS-1과 관련이 있을 수 있으며, 효능적 또는 길항적 작용에 의해 조절될 수 있다.

기타 비정상적 발생 상태가 노던 블롯 분석에 의해 BAS-1을 함유하는 것으로 밝혀진 각각의 세포 유형에서 공지되었다[참조: Berkow(ed.) The Merk Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Rahway, N.J.; and Thorn, et al. Harrison's Principles of Internal Medicine, McGraw-Hill, N.Y.]. 예를 들면, 치료적 면역억제는 당해 분자를 통한 T 림파구 및 B 임파구 상호작용을 차단함으로써 달성될 수 있다. 이는 이식중의 이식 거부 및 자가면역 질환을 억제하는 중요한 치료법을 제공한다. 달리, 항-B-세포 종양 치료법은 B-세포에 미치는 BAS-1의 성장 및 생존 효과를 차단함으로써 달성될 수 있다. 이러한 차단은 결합 조성물(예: 중화 항체)을 차단시키거나 BAS-1과 이의 대응수용체의 상호작용을 방해하는 분자를 차단시킴으로써 초래될 수 있다. 가용성 BAS-1은 대응수용체 상호작용을 차단시킬 수 있다.

재조합 BAS-1 또는 BAS-1 항체를 정제한 후 환자에 투여할 수 있다. 이러한 시제는 치료적 용도를 위하여, 생리학적으로 무독성인 안정화제 및 부형제와 함께, 예를 들면 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제중에서 추가적 활성 성분(예: 면역원성 보조제)과 함께 배합될 수 있다. 이러한 배합물은 멸균 여과될 수 있고, 안정화된 수성 시제를 투여량 바이알 또는 저장소중에서 동결건조함으로써 투여량 형태로 제조된다. 또한, 본 발명은 항체 또는 이의 결합 단편(보체 결합이 아님)의 용도를 제공한다.

BAS-1 또는 이의 단편을 사용하는 약물의 스크리닝을 수행하여, 관련 성분의 분리를 포함하여 BAS-1에 대해 결합 친화성을 지닌 화합물을 동정할 수 있다. 이어서, 후속적인 생물학적 분석을 이용하여, 당해 화합물이 고유 자극 활성을 갖는지를 측정할 수 있고 또한 당해 화합물이 리간드의 활성을 차단하는 점에서 차단제 또는 길항제인지를 결정할 수 있다. 마찬가지로, 고유 자극 활성을 지닌 화합물이 항원을 활성화시킬 수 있고, 따라서 이 화합물이 BAS-1의 활성을 자극한다는 점에서 효능제이다. 또한, 본 발명은 길항제로서의, BAS-1에 대한 항체의 치료적 용도를 제공한다. 이러한 연구는 기타 BAS-1 종의 변이체를 사용하는 경우에도 특히 유용하다.

효과적인 치료에 필요한 시제의 양은 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리적 상태 및 기타 투여된 의약을 포함한, 여러 상이한 인자에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 치료 투여량은 안전성 및 효능을 최적화되도록 적정되어야 한다. 전형적으로, 시험관내에서 사용된 투여량은 이들 시제의 동소 투여에 유용한 양의 유용한 지침을 제공할 수 있다. 또한, 특정 질환 치료의 유효량에 관한 동물 시험은 사람 투여에 대한 예견을 제공할 것이다. 여러 고려사항이 문헌[Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; and Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn.]에 기술되어 있다. 예를 들면, 경구, 정맥내, 복강내 또는 근육내 투여, 경피 확산 및 기타의 투여 방법이 본원에서 후술된다. 약제학적으로 허용되는 담체에는 물, 염수, 완충액 및 문헌[Merk Index, Merck & Co., Rahway, New Jersey]에 기술된 기타 화합물이 포함될 것이다. 통상, 투여량 범위는, 적당한 담체와 함께, 1mM미만의 농도, 전형적으로 약10㎛미만의 농도, 통상적으로 약 100nM미만의 농도, 바람직하게는 약 10pM(피코몰)미만의 농도, 가장 바람직하게는 약 1fM(펨토몰)미만의 농도의 양일 것으로 기대된다. 서방성 제형 또는 서방성 장치는 계속적 투여에 종종 이용될 수 있다.

사람 BAS-1, 이의 단편, 사람 BAS-1과 이의 단편에 대한 항체, 길항제 및 효능제는 치료 숙주에 직접 투여될 수 있으며, 당해 화합물의 크기에 따라, 이를 투여하기 전에 난알부민 또는 혈청 알부민과 같은 담체 단백질에 결합시키는 것이 바람직할 것이다. 치료적 제형은 여러 통상의 투여 제형으로 투여될 수 있다. 활성 성분을 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 이를 약제학적 제형으로 제공하는 것이 바람직하다. 전형적으로, 제형은 상기 정의한 바와 같은 하나 이상의 활성 성분과 함께 하나 이상의 허용가능한 이의 담체를 포함한다. 각각의 담체는 다른 성분과 상용적이며 환자에 무해하다는 점에서 약제학적 및 생리학적으로 허용가능해야 한다. 제형은 국소적, 경구, 직장, 경비 또는 비경구(피하, 근육내, 정맥내 및 피내) 투여에 적합한 것들이다. 당해 제형은 편의상 단위 투여량 형태로 제공될 수 있으며, 제약 분야에서 익히 공지된 임의의 방법에 제조될 수 있다[참조: Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed., Pergamon Press; Mack Publishing Co., Easton, Penn.]. 본 발명의 치료제는 다른 화학치료제 또는 화학예방제와 병용되거나 이들과 공동으로 사용될 수 있다.

본 발명의 BAS-1의 천연형 및 재조합형은 모두 당해 단백질에 대한 결합 활성에 대해 화합물을 스크리닝할 수 있는 키트 및 분석 방법에서 특히 유용하다. 자동분석의 여러 방법이 최근 개발되어, 수만가지의 화합물을 단기간에 스크리닝할 수 있다[참조 문헌: Fordor, et al. (1991) Science 251:767-773; 고체 기질상에 합성된 다수의 규정된 폴리머를 사용하여 결합 친화성을 시험하는 수단을 기술]. 적당한 분석법의 개발은 본 발명에 의해 제공된 바와 같은 정제된, 가용성 BAS-1을 대량으로 이용할 수 있음으로써 훨씬 용이해졌다.

예를 들면, 일단 BAS-1이 구조적으로 한정되면, 길항제는 통상적으로 발견될 수 있다. 정제된 BAS-1을 사용하는 고도로 자동화돤 분석법의 개발에 따라, 잠재적 리간드 길항제의 시험이 본 발명에 이르러 가능해졌다. 특히, 신규 효능제 및 길항제는 본원에서 이용가능한 스크리닝 기술을 사용함으로써 발견될 수 있다. 다중 BAS-1 단백질에 대해 배합된 결합 친화성을 갖는 것으로 밝혀진 화합물, 예를 들면 BAS-1의 대립유전자성 변이체에 대한 길항제로서 작용하는 화합물이 특히 중요하다.

더욱이, BAS-1:BAS-1 결합 파트너를 통한 시그날은 다른 시그날, 예를 들면 CD28/CTLA-4:B7/B70 및/또는 CD40:CD40 리간드 경로와 함께 작용하기 때문에, 배합 조성물 또는 상기 경로를 이용한 병행 치료도 또한 고려될 것이다. 따라서, 다중 시그날 경로의 길항 또는 다중 경로의 자극도 유용할 것이다.

본 발명은 다양한 약물의 스크리닝 기술에서 재조합 항원을 사용하여 화합물을 스크리닝하는데 특히 유용하다. 특이적인 리간드를 스크리닝함에 있어 재조합 단백질을 사용하는 이점에는 다음의 것이 포함된다: (a) 특정 공급원으로 부터의 BAS-1의 개선된 재생가능한 공급원; (b) 분석중 잡음비에 대해 우수한 시그날을 주는 세포당 잠재하는 더 많은 수의 항원 분자 및 (c) 종 변이체의 특이성(이론적으로 더큰 생물학적 및 질환 특이성을 부여함).

약물 스크리닝의 한 방법은 BAS-1을 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질감염된 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 다른 것으로 부터 분리시 BAS-1을 발현하는 세포를 분리한다. 이러한 생존형 또는 고정형의 세포를 표준 항원/리간드 결합 분석에 사용할 수 있다[참조 문헌: Parce, et al. (1998) Science 246:243-247; and Owicki, et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87: 4007-4001; 세포 반응을 검출하는 감응성 방법을 기술]. 경쟁적 분석법이 특히 유용하며, 이 방법의 경우 세포(BAS-1의 공급원)를, 당해 항원에 대해 공지된 결합 친화성을 갖는 표지된 리간드(¹²⁵I-리간드) 및 BAS-1에 대한 결합 친화성이 측정되어진 시험 화합물과 접촉시키고 배양한다. 이어서, 결합 리간드 및 유리 리간드를 분리하여 리간드 결합의 정도를 산정한다. 결합된 시험 화합물의 양은 측정되어진 표지된 리간드 결합의 양과 반비례한다. 각종 기술을 이용하여 유리 리간드로 부터 결합 리간드를 분리하여 리간드 결합의 정도를 산정힐 수 있다. 이러한 분리 단계는 전형적으로 필터에 대한 흡착 후 세척, 플라스틱에 대한 흡착 후 세척 또는 세포막의 원심분리와 같은 과정을 수반한다. 또한, 생존 세포를 사용하여 BAS-1에 의해 매개되는 작용[예: 제2 메신저(Ca⁺⁺) 수준, 세포 증식, 이노시톨 포스페이트 혼주물(pool) 변화 등]에 미치는 약물의 효과를 스크리닝한다. 일부 검출 방법의 경우 분리 단계, 예를 들면 근접 감작(proximity sensitive) 검출 시스템을 제거할 수 있다. 형광계 또는 형광성 세포 분류 장치를 사용하여, Ca⁺⁺수준을 검출하는데는 칼슘 감작성 염료가 유용할 것이다.

또 다른 방법은 사람 BAS-1의 공급원으로서 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포로 부터의 막을 이용한다. 이들 세포를 사람 BAS-1 항원의 발현을 지시하는 DNA 벡터로 안정하게 형질전환시킨다. 실질적으로, 당해 막은 당해 세포로 부터 제조될 것이며, 특정한 수용체/리간드 결합 분석, 예를 들면 상기한 바와 같은 경쟁적 분석법에 사용될 것이다.

또 다른 해법은 형질전환된 진핵 또는 원핵 숙주 세포로 부터의 가용화되고 비정제된 또는 가용화되고 정제된 BAS-1을 사용하는 것이다. 이는 증가된 특이성, 자동화 가능성 및 약물 시험의 높은 처리량의 이점을 지닌 "분자" 결합 분석을 가능하게 한다.

약물 스크리닝의 또 다른 기술은 사람 BAS-1에 대한 적당한 결합 친화성을 지닌 화합물을 스크리닝함에 있어서 높은 처리량을 제공하는 방법을 포함한다[참조: Geysen, 1984년 9월 13일에 공개된 유럽 특허출원 제84/03564호]. 먼저, 다수의 상이한 작은 펩티드 시험 화합물을 고체 기질, 예를 들면 플라스틱 핀 또는 임의의 다른 적당한 표면상에서 합성한다[참조: Fodor, et al. (1991)]. 이어서, 모든 핀을, 가용화되고 비정제된 BAS-1 또는 가용화되고 정제된 BAS-1과 반응시키고 세척한다. 다음 단계는 결합 BAS-1을 검출하는 과정을 포함한다.

BAS-1 및 기타의 효과인자 또는 리간드의 분자 형태의 구조적 연구를 토대로 하여 적당한 약물을 설계할 수 있다. 효과인자는 리간드 결합에 반응하여 기타 작용을 매개하는 기타 단백질이거나, 통상적으로 항원과 상호작용하는 기타 단백질일 수 있다. 특이적인 다른 단백질과 상호작용하는 부위를 측정하는 수단은 물리적 구조 측정법, 예를 들면 X-레이 결정학적 방식 또는 2차원 NMR 기술이다. 이들은 아미노산 잔기가 분자 접촉 영역을 형성하는 것에 대한 지침을 제공할 것이다. 단백질 구조 결정에 대한 상세한 설명은 문헌[Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York]을 참조한다.

정제된 BAS-1을 전술한 약물 스크리닝 기술에 사용하기 위하여 플레이트상에 직접 피복할 수 있다. 그러나, 상기 항체에 대한 비-중화성 항체를 포획 항체로서 사용하여 고체상에 각각의 BAS-1를 고정시킬 수 있다.

IX. 키트

또한, 본 발명은 BAS-1 펩티드 또는 리간드의 존재를 검출하는 각종 진단용 키트 및 방법에서의, BAS-1 단백질, 이의 단편, 펩티드 및 이들의 융합 산물의 용도를 고려한다. 전형적으로, 본 키트는 규정된 BAS-1 펩티드 또는 유전자 단편 또는 이들을 인식하는 시제를 포함하는 구획을 갖는다.

BAS-1에 대한 시험 화합물의 결합 친화성을 측정하기 위한 키트는 전형적으로 시험 화합물; 표지된 화합물, 예를 들면 BAS-1에 대한 공지된 결합 친화성을 갖는 리간드 또는 항체; BAS-1(천연 또는 합성)의 공급원; 및 표지된 유리 화합물로 부터 결합 화합물을 분리하기 위한 수단, 예를 들면 BAS-1을 고정화시키기 위한 고체상을 포함한다. 일단 화합물을 스크리닝한 후, BAS-1에 대한 적당한 결합 친화성을 갖는 것을, 당업계에서 공지된 바와 같이, 적당한 생물학적 분석법으로 평가하여 이들이 효능제 또는 길항제로서 작용하는지를 측정한다. 또한, 재조합 BAS-1 폴리펩티드의 이용가능성은 이러한 분석을 위한 익히 규정된 표준을 제공한다.

예를 들면, 간단히 BAS-1의 농도를 측정하기 위한 바람직한 키트는 전형적으로 표지된 화합물, 예를 들면 BAS-1에 대한 공지된 결합 친화성을 갖는 리간드 또는 항체; BAS-1(천연 또는 합성)의 공급원; 및 표지된 유리 화합물로 부터 결합 화합물을 분리하기 위한 수단, 예를 들면 BAS-1을 고정화시키기 위한 고체상을 포함한다. 시제를 포함하는 구획 및 설명서도 통상적으로 제공될 것이다.

간단히 BAS-1의 농도를 측정하기 위한 방법은 전형적으로 하기 단계를 포함할 것이다: (1) BAS-1 공급원으로 이루어진 샘플로 부터 막을 제조하는 단계; (2) 막을 세척하고 완충액중에서 현탁시키는 단계; (3) 적당한 세제가 가해진 배지중에서 막을 배양하여 BAS-1를 가용화시키는 단계; (4) 가용화된 BAS-1의 세제 농도를 조정하는 단계; (5) 상기 희석물을 방사성 표지된 리간드와 접촉시키고 배양하여 복합체를 형성시키는 단계; (6) 폴리에틸렌이민-처리된 필터를 통해 여과시켜, 복합체를 회수하는 단계; 및 (7) 회수된 복합체의 방사성을 측정하는 단계.

항원 결합 단편을 포함하여, 사람 BAS-1 또는 BAS-1 단편에 특이적인 항체는 진단적 적용, 예를 들면 BAS-1 및/또는 이의 단편의 증가된 수준의 존재를 검출하는데 유용하다. 이러한 진단적 분석법은 용해물, 살아있는 세포, 고정된 세포, 면역형광성, 세포 배양물 및 체액을 사용할 수 있고, 또한 혈청 등 중의 BAS-1과 관련이 있는 항원의 검출을 포함한다. 진단적 분석법은 균질적(유리 시제와 항원-리간드 복합체간의 분리 단계의 부존재) 또는 이질적(분리 단계의 존재)일 수 있다. 각종 상업적 분석법에는 방사성면역분석(RIA), 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA), 효소 면역분석(EIA), 효소-다중 면역분석 기술(EMIT), 기질-표지된 형광성 면역분석(SLFIA) 등이 있다. 예를 들면, BAS-1 또는 이의 특정 단편에 대한 항체를 인식하는, 표지된 제2의 항체를 사용하는 경우, 표지되지 않은 항체를 사용할 수 있다. 이들 분석법은 문헌[Harlow and Lane (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH]에서 광범위하게 논의 되었다.

항-이디오타입 항체는, 그 자체가 각종 비정상적 상태의 진단에 도움이 되는 사람 BAS-1에 대한 항체의 존재를 조사 분석하는데 있어서 유사한 용도를 갖는다. 예를 들면, BAS-1의 과잉생성은 비정상적 생리적 상태, 특히 증식성 세포 상태(예: 암 또는 비정상적 분화)의 진단에 도움이 되는 다양한 면역학적 반응을 발생시킬 수 있다.

종종, 진단 분석용 시제는, 분석의 감작을 최적화하기 위하여, 키트로 제공된다. 본 발명의 경우, 분석법, 프로토콜 및 표지의 특성에 따라, 표지되거나 표지되지 않은 항체 또는 표지된 BAS-1이 제공된다. 이는 통상적으로 다른 첨가물, 예를 들면 완충제, 안정화제, 효소에 대한 기질과 같이 시그날 생성에 필요한 물질 등과 혼합된다. 바람직하게는, 당해 키트는 또한 적합한 사용 및 사용 후 내용물의 폐기를 위한 설명서를 포함한다. 전형적으로, 당해 키트는 각각의 유용한 시제를 위한 구획을 갖는다. 바람직하게는, 당해 시제는 동결건조된 분말로서 제공되며, 당해 시제를 수성 매질중에서 재구성하여, 당해 분석을 수행하기에 적당한 농도의 시제를 제공한다.

약물 스크리닝 및 진단적 분석중의 전술한 요소를 변경하지 않고 사용하거나 다양한 방법으로 변경하여 사용할 수 있다. 예를 들면, 표지화는 직접 또는 간접적으로 검출가능한 시그날을 제공하는 성분을 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 분석법의 경우, 리간드, 시험 화합물, BAS-1 또는 이의 항체를 직접 또는 간접적으로 표지화할 수 있다. 직접적인 표지화가 가능한 표지 그룹에는 방사성 표지(예:¹²⁵I), 효소(미국 특허 제3,645,090호)(퍼옥시다제 및 알카린 포스파타제) 및 형광 강도의 변화를 모니터링할 수 있는 형광 표지(미국 특허 제3,940,475호)가 포함된다. 상기 특허 모두 참고로서 본원에 기재되어 있다. 가능한 간접적인 표지화에는 구성분중의 하나를 바이오티닐화 한 후, 상기 표지 그룹중의 하나에 결합된 아비딘에 결합시키는 것이 포함된다.

또한, 유리 리간드로 부터 결합 리간드를 분리시키거나, 또는 달리 유리 시험 화합물로 부터 결합 시험 화합물을 분리시키는 수 많은 방법이 있다. BAS-1을 각종 매트릭스상에 고정시킨 후, 세척할 수 있다. 적합한 매트릭스에는 ELISA 플레이트, 필터 및 비드와 같은 플라스틱이 포함될 수 있다. 매트릭스에 BAS-1을 고정시키는 방법에는 플라스틱에 대한 직접적인 흡착, 및 포획 항체, 화학적 커플링 및 비오틴-아비딘의 사용이 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 본 방법의 최종 단계는, 예를 들면 유기 용매(예: 폴리에테르 글리콜) 또는 염(암모늄 설페이트)를 이용하는 경우를 포함하여, 여러 방법에 의해 항원/리간드 복합체를 침전시키는 과정을 포함한다. 기타 적당한 분리 기술에는 형광체 항체 자기화가능성 입자법[참조: Rattle, et al. (1984) Clin. Chem. 30: 1457-1461] 및 이중 항체 자성 입자 분리법[참조: 미국 특허 제4,659,678호]이 포함되나, 이에 제한되지는 않는다.

각종 표지에 단백질 또는 이의 단편을 결합시키는 방법은 문헌에 광범위하게 보고되었다. 많은 기술이 카보이미드 또는 활성 에스테르를 사용하여 펩티드 결합을 형성하기 위하여 활성화된 카복실 그룹을 사용하고, 결합시키기 위한 활성화된 할로겐(예: 클로로아세틸) 또는 활성화된 올레핀(예: 말레이미드)과 머캅토 그룹을 반응시켜 티오에테르를 형성시키는 것과 관련이 있다. 또한, 융합 단백질은 이러한 적용중에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 진단적 면은 BAS-1의 서열로 부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 서열의 사용을 포함한다. 이들 서열은 비정상적 병리상태, 예를 들면 암 또는 발생상의 문제를 지닌 것으로 의심되는 환자로 부터 취해진 샘플중에서 항원의 수준을 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. RNA 및 DNA 뉴클레오티드 서열의 제조, 서열의 표지화, 및 당해 서열의 바람직한 크기는 문헌에 폭넓게 기술되고 논의 되어 있다. 통상적으로, 올리고뉴클레오티드 프로브는 약 14 뉴클레오티드 이상, 일반적으로 약 18 뉴클레오티드 이상이어야 하며, 폴리뉴클레오티드 프로브는 수 kb이하일 수 있다. 각종 표지가 사용되며, 가장 통상적으로 방사성 핵종, 특히³²P가 사용된다. 그러나, 비오틴 변형된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 도입하는데 사용하는 것과 같은 다른 기술도 또한 사용될 수 있다. 이 경우 비오틴은 방사성 핵종, 형광제, 효소 등과 같은 매우 다양한 표지로 표지화할 수 있는 아비딘 또는 항체에 대한 결합 부위로서 작용한다. 또는, DNA 이본쇄, RNA 이본쇄, DNA-RNA 혼성 이본쇄, 또는 DNA-단백질 이본쇄를 포함한 특이적 이본쇄를 인식할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 당해 항체를 재차 표지화하고, 이본쇄가 표면에 결합하여, 표면상에 이본쇄가 형성되는 경우 이본쇄에 결합된 항체의 존재가 검출될 수 있는 분석을 수행한다. 신규한 안티-센스 RNA에 대한 프로브를 사용하여 핵산 하이브리드화, 플러스 및 마이너스 스크리닝, 재조합 프로빙, 하이브리드 방출 해독(HRT) 및 하이브리드 정착 해독(HART)과 같은 통상의 기술을 수행할 수 있다. 이는 또한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 증폭 기술을 포함한다. 다른 마커의 정성적 또는 정량적 존재를 시험하는 진단 키트도 또한 고려된다. 진단 또는 예후는 마커로서 사용된 다중 지시체의 조합에 의존적일 수 있다. 따라서, 키트는 마커의 조합에 대해 시험할 수 있다[Viallet, et al. (1989) Progress in growth Factor Res. 1:89-97].

X. 리간드 또는 대응수용체

본원에서의 BAS-1 단백질에 대한 기술은 대응수용체 또는 리간드를 동정하는 수단을 제공한다. 이러한 리간드 또는 대응수용체는 상당히 높은 친화성으로 BAS-1에 특이적으로 결합되어야 한다. BAS-1를 표지화하여 이의 파트너를 검출할 수 있는 다양한 작제물이 이용가능하다. 예를 들면, 직접적으로 BAS-1을 표지화하고, 이에 마커를 융합시켜 제2의 표지(FLAG 또는 기타 에피토프 태그, Ig 도메인 융합체 등)를 만듬으로써 결합 파트너를 검출할 수 있다. 이는 생화학적 정제를 위한 친화성 방법과 같이, 조직학적이거나, 발현 클로닝 방법에서의 표지화 또는 선별일 수 있다. 또한, 2-하이브리드 선별 시스템은 구입가능한 BAS-1 서열을 사용하여 적당한 작제물을 제조하는데 적용될 수 있다[참조: Fields and Song (1989) Nature 340:245-246]

본 발명의 범위는 본 발명을 구체적 양태으로 제한하고자 하는 것이 아닌 하기 실시예를 통해 가장 잘 이해된다.

I. 일반적 방법

표준 방법의 일부가 문헌[Maniatis, et al. (1992) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, Sambrook, et al. (1988) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2d ed.), vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; or Ausubel, et al. (1987 and Supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Greene/Wiely, New York]에 기술되고 참조되어 있다. 단백질 정제의 방법은 암모늄 설페이트 침전법, 칼럼 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리, 결정법 등과 같은 방법을 포함한다[참조: Ausubel, et al. (1987 및 주기적인 부록); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification", Methods in Enzymology, vol. 182, 및 본 시리즈물의 다른 권; 및 단백질 정제 산물의 용도에 관한 제조자, 예를 들면 Pharmacia(Piscataway, N.J.) 또는 Bio-Rad(Richmond, CA)의 문헌]. 재조합 기술과의 결합은 프로테아제-제거가능한 서열를 통해 융합될 수 있는 적당한 단편, 예를 들면 FLAG 서열 또는 동등체에의 융합을 가능케하였다[참조: Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Houchi (1990) "Purification of Recombinant Protein with Metal Chelate Absorbent", Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principle and Methods 12: 87-98, Plenum Press, N.Y.; and Crowe, et al. (1992) OIAexpress: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA].

컴퓨터 서열 분석을 시판되는 소프트웨어 프로그램, 예를 들면 GCG(U. Wisconsin) 및 GeneBank 공급처로 부터의 프로그램을 사용하여 수행한다. 예를 들면 GeneBank 및 기타로 부터의 공개된 서열 데이터베이스도 또한 사용된다.

II. PCR에 의한 사람 BAS-1 단편의 증폭

마우스 RP105 서열에 따라, 두 개의 프라이머를 설계한다[참조: Miyake, et al (1995) J. Immunol. 154:3333-3340]. 뉴클레오티드 표시는 그안의 CTT서열로 부터 카운트된다. 5' 프라이머 A(TTG...)는 162 내지 185 위치의 24개 뉴클레오티드에 상응하고 3' 프라이머 F(...TTC)는 1462 내지 1485의 24개 뉴클레오티드에 상응한다. PCR 산물이 사람 편도선 B 세포로 부터 전혀 수득되지 않는다.

3개의 5' 프라이머가 제조되었다: 뉴클레오티드 위치 321 내지 344을 포함하는 프라이머 B(ACA...), 뉴클레오티드 위치 568 내지 591를 포함하는 프라이머 C(AAG...) 및 뉴클레오티드 위치 859 내지 882를 포함하는 프라이머 D(TCT...). 3개의 다른 프라이머도 또한 제조되었다: 뉴클레오티드 위치 1765 내지 1788을 포함하는 프라이머 G(...TTA), 뉴클레오티드 위치 2024 내지 2047를 포함하는 프라미머 H(...GAA) 및 뉴클레오티드 위치 1164 내지 1187을 포함하는 프라이머 E(...TGG).

사람 편도선 B 세포로 부터 PCR 산물을 수득하는 기회를 증가시키기 위해, PCR반응을 4개의 3' 프라이머와 함께 하나의 5' 프라이머를 사용하여 수행한다. PCR 반응의 이들 4개의 그룹중에서, 5' 프라이머 D로 부터 3' 프라이머 E에 걸쳐있는 300bp의 명확한 산물 하나만을 수득한다. 이 산물을 정제하고, PCR^TM벡터(Invitrogen, San Diego CA)내로 서브클로링한 다음, 서열을 분석한다[참조: 서열 1].

300bp 사람 서열에 따라, 3개의 프라이머를 설계한다: 5' 프라이머 K; 3' 프라이머 I 및 L. 프라이머 C 및 I를 병용하면서, 유사하게 PCR 방법을 사용하여 또 다른 300bp 사람 단편을 수득한다[참조: 서열 1].

III. 사람 BAS-1의 조직 분포

프라이머 쌍 D-E에 의해 증폭된 PCR 산물을 프로브(D-E 프로브)로서 사용하여 사람 조직중의 BAS-1의 조직 분포를 연구한다. 노던 블롯을 사용하는 경우 2.6 kb mRNA가 사람 지라에서 검출되고 저수준으로 사람 심장에서 검출된다. 이는 사람 뇌, 흉선, 폐, 간, 골격근, 신장, 전립선, 고환, 난소, 소장, 결장 및 말초혈 백혈구에서는 쉽게 검출되지 않는다. 또한, 노던 블롯을 사용하는 경우 2.6 kb mRNA가 sIgD+ 임파종 세포주 B104에서 검출되고 저수준으로 Burkitt 임파종 세포주 BL2에서 검출되지만 신장 상피 암종 세포주 CHA, 페 상피 암종 세포주 MRC-5, EBV 세포주 JY 또는 단구 세포주 U937에서는 검출되지 않는다.

PCR에 의해, 사람 BAS-1 mRNA가 sIgD⁺CD38^-초기 B세포, sIgD⁺CD38⁺배중심 B 세포, sIgD^-CD38⁺배중심 B 세포, sIgD^-CD38^-기억 B세포, sCD38⁺⁺CD20^low형질 세포, GM-CSF 및 IL-4와 함께 배양된 CD14+ 단구로 부터 생성된 수지상 세포, GM-CSF 및 TNF-α와 함께 배양된 CD34+ 삭상조직 혈액 세포로 부터 생성된 수지상 세포중에서 발견되었다. 이러한 mRNA는 사람 T 세포주 MT9에서는 PCR에 의해 검출될 수 없다.

IV. 사람 sIgD+ 임파종 세포주 B104로 부터 유래된 플라스미드 cDNA 라이브러리의 스크리닝

노던 블롯 분석의 결과로 부터, BAS-1 발현이 B104 세포주의 폴리-A-mRNA 6㎍중에서 검출되었다. 따라서, B104 cDNA 라이브러리를 pSPORT1 플라스미드(Gibco Life Technologies, Cergy Pontoise, Frans)중에서 작제한다. 150,000개의 박테리아 콜로니를 스크리닝한 결과, D-E프로브를 사용하는 경우 양성 클론이 전혀 수득되지 않았다. 이는 사람 세포에서의 BAS-1의 발현율이 매우 낮다는 것을 반영할 수 있다.

V. 사람 지라의 λgt10 박테리아파지 라이브러리의 스크리닝

더 많은 클론을 스크리닝하기 위하여, 사람 지라의 λgt10 박테리아파지 라이브러리(Clontech)를 사용한다. 2.4×10⁶개의 클론을 스크리닝한 후, 8개의 양성 클론을 동정한다. 3개의 클론을 분리하고, 정제하고 pME18S 플라스미드(DNAX, Palo Alto, CA)내로 서브클로닝한다. 서브클로닝한 후, 2개의 클론 S2 및 L1이 완전한 길이의 사람 BAS-1을 나타낸다는 것을 알게 되었다(서열 1 참조). 분리된 완전한 길이의 사람 BAS-1 cDNA은 약 2635bp를 포함하고, 약 661개 아미노산의 단백질을 암호화한다. 이 단백질 산물은 약 11개의 잠재적인 글리코실화 부위 및 약 22개의 루신이 많은 반복 모티프를 포함한다. 이 사람 BAS-1 cDNA의 암호화 영역은 마우스 RP105 서열의 암호화 영역과 약 72% 상동성을 공유하고, 이 완전한 BAS-1 cDNA는 완전한 마우스 cDNA 서열과 약 67% 상동성을 공유한다. 사람 BAS-1과 마우스 RP105간의 아미노산 상동성은 약 73.5%이다.

VI. 사람 BAS-1 단백질의 발현

모든 작제물을, 해독 수준이 증가되도록 5' 및 3' 비-암호화 영역을 제거하고 Marylin Kozak(Ref: J. Biol. Chem. 266: 19867, 1991) 공통(consensus) 서열(ACCATGG; 서열 3)을 가하여 제조한다.

가용성 BAS-1-FLAG 단백질은 후술하는 바와 같이 Cos 7 세포에서 일시적으로 발현된다. 카복시 말단에 FLAG 펩티드를 갖는 BAS-1의 재조합형(Hoppe, et al., (1988) Biotechnology 6:1205-1210)을 발현 벡터 pME18S에 도입하고, 이어서 전기천공으로 Cos-7 세포내로 형질감염시킨다. 전기천공시킨 세포를 1% Nutridoma HU(Boehringer Mannheim, Mannheim, Mannheim, Germany)를 보충한 DMEM 배지 또는 순수한 DMEM 배지에서 5일간 성장시킨다.

VII. 가용성 BAS-1 플래그 단백질

전형적으로, 가용성 BAS-1 FLAG를 함유하는 상층액 280ml을 킬레이팅 세파로즈 패스트 플로우(Chelating Sepharose Fast Flow) 매트릭스(Pharmacia, Upsalla, Sweden)에 결합된 Cu⁺⁺이온의 20ml 칼럼상에 통과시킨다. 결합 완충제(His-Bind Buffer Kit, Novagen, Madison, WI)의 16 용량으로 세척한 후, 금속 이온을 보유하는 단백질을 이미다졸 20 내지 100mM 구배로 용출시킨다. 용출된 분획중의 사람 BAS-1 FLAG의 함량을, 항-FLAG 모노클로날 항체 M2(Eastman Kodak, New Haven, CT)를 사용하는 도트 블롯 및 꼬마지애 블루 및 환원성 SDS-PAGE의 은 염색으로 측정한다. 이어서, BAS-1 FLAG 단백질을 함유하는 분획을 혼주하고 PBS에 대해 투석한다. 웨스턴 블롯에 의하면, 많은 사람 BAS-1은, 아미노산 서열로 부터 예견된바와 같이, 약 95 및 97kd 단백질에 상응한다.

VIII. NIH-3T3 세포에서의 막 BAS-1의 안정한 발현

고유 막형을, 덱사메타손-유도성 MMTV-LTR 프로모터에 결합된 RSV-LTR 인핸서을 포함하는 발현 벡터 pMAMneo(Clontech, Palo Alto, California)내로 서브클로닝한다. 이어서, 이 작제물을 전기천공으로 NIH-3T3 세포내로 형질감염시킨다. 형질감염된 NIH-3T3 세포를 10% 태아 소 혈청을 보충시킨 선택적인 0.5mg/ml Geneticin(G418)(Boehringer-mannheim, Mannheim, Germany) DMEM에 시딩(seeding)시킨다.

이들 안정한 형질감염된 NIH-3T3 세포중의 막 BAS-1 단백질의 생화학적 특성을 대사적 표지화에 의해 분석한다. 이어서, 10% 태아 소 혈청 및 1μM 최종 덱사메타손(Sigma, Saint Quentin Fallavier, France)를 보충한 DMEM 배지에서 세포를 24시간 동안 배양한다. 이어서, 세포를 최종적으로 12시간 동안³⁵S-Met 및³⁵S-Cys와 함께 배양하여 세포 단백질을 표지화시킨다. 환원 상태하에서 SDS-PAGE로 단백질을 분석한 결과, 예견된 110 kDa 단백질이 형질감염된 NIH-3T3 세포의 용해물에서는 나타났지만, 형질감연되지 않은 NIH-3T3 세포의 용해물에서는 나타나지 않았다.

IX. BAS-1에 특이적인 항체의 제조

동종 교배의 Balb/c 마우스에 사람 단백질 재조합형을 복강내 투여하여 면역시킨다. 먼저, 정제된 가용성 BAS-1 FLAG를 투여하고, 두 번째로 안정한 형질감염된 NIH-3T3 세포를 투여한다. 추가로 보조제를 가하거나 가하지 않으면서, 적당한 시점에 단백질로 동물을 부스팅시켜, 항체 생성을 더욱 자극한다. 혈청을 수집하거나, 수거된 지라를 이용하여 하이브리도마를 생성시킨다.

달리, Balb/c 마우스를, 당해 유전자 또는 이의 단편으로 형질감염시킨 내생 또는 외래 세포로 면역시키거나, 항원의 발현을 위해 농화시킨 분리된 막으로 면역시킨다. 전형적으로, 수차례의 투여 후, 혈청을 적당한 시점에 수집한다. 다양한 유전자 치료 기술이 면역 반응을 일으키기 위해, 예를 들면 동일 부위에서 단백질을 생성시키는데 유용할 수 있다.

모노클로날 항체가 제조될 수 있다. 예를 들면, 비세포를 적당한 융합 파트너와 융합시키고 하이브리도마를 표준 공정에 의해 성장 배지에서 선별한다. 하이브리도마 상층액을, ELISA 또는 기타 분석을 이용하여 사람 BAS-1에 결합하는 항체의 존재를 확인하기 위해 스크리닝한다. 종 변이체가 아닌 사람 BAS-1을 특이적으로 인식하는 항체를 선별하거나 제조할 수 있다.

또 다른 방법에서, 합성 펩티드 또는 정제된 단백질을 면역 시스템에 제공하여 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생성시킨다[참조: Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wieley/Greene; and Harlow and Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press]. 적당한 경우, 결합 시제를 상기한 바와 같이, 예를 들면 형광성 또는 기타 방법으로 표지시키거나, 패닝(panning) 방법을 위해 기질에 고정화시킨다. 또한, 핵산을 동물내 세포에 도입하여, 면역 반응을 유발하는데 작용하는 항원을 생성시킨다[참조: Wang, et al. (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:4156-4160; Barry, et al. (1994) BioTechniques 16:616-619; and Xiang, et al. (1995) Immunity 2: 129-135].

X. NS0 세포에서의 BAS-1의 대규모 생성

예를 들면, Celltech에 의해 개발된 방법[Slough, Berkshire, UK; 국제특허출원 제WO/86/05807호, 제WO/87/04462호, 제WO89/01036호 및 WO89/10404호]에 따라 제조된 NS0 세포의 안정한 형질감염체로 부터, 가용성 BAS-1 및 가용성 BAS-1 FLAG를 대량으로 생성시킨다. BAS-1 및 BAS-1-FLAG를 모두 pEE12내로 서브클로닝시키고, 이어서 전기천공으로 NS0 세포를 형질감염시킨다. 형질감염된 NS0 세포를 Celltech 프로토콜에 기술된 바와 같이 10% 태아 소 혈청을 보충한, 선택적인 글루타민-부존재 DMEM에 시딩한다. 가장 우수한 생성 세포주로 부터의 상층액을 생물학적 분석 및 가용성 BAS-1 및 가용성 BAS-1-FLAG의 정제에 사용한다.

다른 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질을 대량으로 생성시킬 수 있다.

XI. BAS-1과의 융합 단백질의 생성

다양한 융합 작제물을 BAS-1 세포외 도메인으로 제조한다. 당해 유전자의 이 부분을 또 다른 단백질, 예를 들면 FLAG 에피토프 태그, Ig 도메인 또는 두 개의 하이브리드 시스템 작제물에 융합시킨다[참조: Fields and Song (1989) Nature 340:245-246].

당해 에피토프 태그를, 결합 파트너, 예를 들면 BAS-1에 대한 리간드를 검출하기 위하여 항-FLAG 항체로 검출하면서, 발현 클로닝 방법에 사용할 수 있다. 또는, 리간드에 대한 항원과 유사한 친화성을 이용하여, Ig 도메인을 정제하는데 사용할 수 있다. 또한, 두 개의 하이브리도마 시스템을 사용하여 BAS-1에 특이적으로 결합하는 단백질을 분리할 수 있다.

XII. 원 위치(in situ) 하이브리드화에 의한 사람 BAS-1의 지도화

염색체 분산질을 제조한다. 원 위치 하이브리드화를, 72시간 동안 배양한 식물성혈구응집소-자극된 사람 임파구로 부터 수득된 염색체 제제상에서 수행한다. 5-브로모데옥시우리딘을 최종적으로 72시간 동안 배양하는 동안에 가하여, 양호하게 하이브리드화-후 염색체를 밴딩시킨다.

전체 B 세포 cDNA 주형상에서, 예를 들면 뉴클레오티드 395 내지 411 및 1027 내지 1050에 상응하는 프라이머를 이용하여 증폭시킨 655 염기쌍의 PCR 단편을 적당한 벡터내로 서브클로닝시킨다. 당해 벡터를³H를 이용한 틈(nick)-해독으로 표지화시킨다. 방사성 표지된 프로브를, 문헌[Mattei, et al. (1985) Hum. Genet. 69:327-331]에 기술된 바와 같이 하이브리드화 용액의 최종 농도 200ng/ml에서 중기의 분산질에 하이브리드화시킨다.

핵 추적(track) 에멀션으로 피복시킨 후, 슬라이드를 18일 동안 4℃에 노출시킨다. 밴딩 과정 동안, 은 그레인이 벗겨지는 것을 피하기 위해, 염색체 분산질을 먼저 완충된 Giemsa 용액으로 염색하고 중기의 분산질의 사진을 찍는다. 이어서, R-밴딩을 형광색소-광분해-Giemsa(FPG) 방법으로 수행하고 분석하기 전에 중기의 분산질의 사진을 다시 찍는다.

원 위치 하이브리드화 후 조사된 100개의 중기의 세포중에서, 은 그레인의 20%는 염색체 5상에 위치한다. 그레인의 분포는 무질서하지는 않고, 이들의 67%는 염색체 5 장지(long arm)의 q11.2-q13.1 영역에 위치하게된다. 이는 사람 BAS-1을 사람 게놈의 5q11.2-q13.1 영역에 위치하게 한다.

XIII. 사람 BAS-1에 대한 수용체의 분리

사람 BAS-1을, 항체가 사용되었던 바와 같이 이의 결합 특이성의 이점을 이용하여, 이의 결합 파트너를 동정하기 위한 특이적인 결합 시제로서 사용할 수 있다. 결합 시제를 상기한 바와 같이, 예를 들면 형광성 또는 다른 방법을 이용하여 표지화시키거나, 패닝 방법을 위해 기질에 고정시킨다.

결합 조성물을 사용하여, 결합 파트너, 즉 수용체를 발현하는 세포주로 부터 제조된 발현 라이브러리를 스크리닝한다. 표준 염색 기술을 사용하여 세포내 또는 표면에 발현된 수용체를 검출 또는 분류하거나, 형질전환된 세포를 발현하는 표면을 패닝으로 스크리닝한다. 세포내 발현의 스크리닝을 다양한 염색 방법 또는 면역형광 방법으로 수행한다[참조: McMahan, et al. (1991) EMBO J. 10:2821-2832].

예를 들면, 0일째에, PBS중 10ng/ml으로, 피브로넥틴 챔버당 1ml로 2-챔버 퍼마녹스 슬라이드를 예비피복시킨다. PBS로 1회 수세한다. 이어서, 성장 배지 1.5ml중 챔버당 2 내지 3 ×10⁵세포로 COS 세포를 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 배양한다.

1일째에, 각각의 샘플에 대해, 혈청-부존재의, DEAE-덱스트란 66㎍/ml, 클로로퀸 66μM 및 DME중의 DNA 4㎍의 용액 0.5ml을 제조한다. 각각의 셋트에 대해, 예를 들면 1 및 1/200 희석도의 사람 BAS-1-FLAG cDNA의 양성 대조군, 및 음성 모사물을 제조한다. 혈청-부존재의 DME로 세포를 수세한다. DNA 용액을 가하고 5시간 동안 37℃에서 배양한다. 배지를 제거하고 DME중의 10% DMSO 0.5ml를 2.5분간 가한다. DME로 1회 제거 및 세척한다. 성장 배지 1.5ml를 가하고 밤새 배양한다.

2일째에, 배지를 바꾼다. 3 또는 4일째에, 세포를 고정시키고 염색한다. 세포를, Hank 완충 염수 용액(HBSS)으로 2회 수세하고 4% 파라포름알데히드(PFA)글루코즈중에서 5분간 고정시킨다. HBSS로 3회 세척한다. 모든 액체를 제거한 후, 슬라이드를 -80℃에서 보관한다. 각각의 챔버에 대해, 0.5ml 배양을 후술하는 바와 같이 수행한다. HBSS/사포닌(0.1%)를 1M NaN₃32㎕/ml과 함께 20분간 가한다. 이어서, 세포를 HBSS/사포닌으로 1회 세척한다. 사람 BAS-1 또는 BAS-1/항체 복합체를 세포에 가하고 30분간 배양한다. 세포를 HBSS/사포닌으로 2회 세척한다. 적당한 경우, 먼저 항체를 30분간 가한다. 2차로 항체, 예를 들면 벡터 항-마우스 항체를 1/200 희석도로 가하고 30분간 배양한다. ELISA 용액, 예를 들면 벡터 Elite ABC 고추냉이 퍼옥시다제 용액을 제조하고, 30분간 예비배양한다. 예를 들면, HBSS/사포닌 2.5ml당 용액 A(아비딘) 1소적 및 용액 B(비오틴) 1소적을 사용한다. 세포를 HBSS/사포닌으로 2회 세척한다. ABC HRP 용액을 가하고 30분간 배양한다. 세포를 HBSS로 2회 세척하는데, 제2 세척은 2분간 수행하여, 세포를 차단시킨다. 이어서, 벡터 디아미노벤조산(DAB)를 5 내지 10분간 가한다.

글라스 증류된 물 5ml당 완충액 2소적, DAB 4소적 및 H₂O₂2소적을 사용한다. 주의하여 챔버를 제거하고 물로 슬라이드를 수세한다. 수 분간 공기 건조시키고, 이어서 Crystal Mount 1소적 및 커버 슬립을 가한다. 5분간 85 내지 90℃에서 베이킹한다.

혼주물의 양성 염색물을 평가하고, 결합에 관여하는 단일 유전자를 분리하기 위해 점진적으로 서브클로닝한다.

달리, BAS-1 시제를 사용하여 수용체를 발현하는 세포를 친화성으로 정제하거나 분류해낸다[참조: Sambrook et al. Ausubel, et al.]

또 다른 방법은 패닝으로 막 결합된 수용체를 스크리닝하는 것이다. 당해 수용체 cDNA를 상기한 바와 같이 작제한다. 당해 리간드를 고정시킬 수 있고 발현 세포를 고정시키는데 사용할 수 있다. 고정화는, 예를 들면 BAS-1 융합 작제물의 FLAG 서열을 인식하는 적당한 항체를 사용하거나, 제1의 항체에 대해 발생한 항체를 사용함으로써 달성될 수 있다. 선별 및 증폭의 반복적인 사이클에 의해 적당한 클론이 농화되고, 결국 수용체를 발현하는 클론이 분리될 수 있다.

파지 발현 라이브러리를 사람 BAS-1을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 적당한 표지화 기술, 예를 들면 항-FLAG 항체를 이용하여 적당한 클론을 특이적으로 표지화시킬 수 있다.

본원중의 모든 인용문헌은, 각각의 공보 또는 특허출원이 구체적으로 또는 개별적으로 참조로서 기재되었음이 니타난 바와 같은 정도로 본원에 참조로서 기재되었다.

본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서, 당업자에게는 명백한 본 발명의 많은 변화 및 변경이 가능하다. 본원에 기술된 구체적인 양태는 단지 실시예의 방법에 의해 제공되며, 본 발명은 첨부된 청구범위의 한계 및 이러한 청구범위에 부여되는 귄리에 상당하는 전범위에 의해 제한될 것이다.

서열 목록

(1) 일반적 정보:

(i) 출원인: 쉐링 코포레이션

(ii) 발명의 명칭: 사람 B 세포 항원; 관련 시제

(iii) 서열 수: 3

(iii) 서신 주소

(A) 수신인: 쉐링-플로우 코포레이션

(B) 거리: 갤로핑 힐 로드 2000

(C) 도시: 케닐워쓰

(D) 주: 뉴 저지

(E)국가: 미국

(F) 우편번호: 07033

(iv) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: 매킨토시

(C) 운영 체계: 7.5.3.

(vi) 현 출원 데이터:

(A) 출원번호:

(B) 출원일:

(vii) 전 출원 데이터:

(A) 출원번호: US 08/649,553

(B) 출원일: 1996. 5. 17

(viii) 대리인/ 대리기관 정보:

(A) 성명: 포울크 에스크 신티아 엘

(B) 등록번호: 32, 364

(C) 참조/사건 번호: DX0580PCT

(ix) 전자통신 정보:

(A) 전화번호: 908-298-2987

(B) 팩스번호: 908-298-5388

(2) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 2635 염기쌍

(B) 형태: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(ⅸ) 특징:

(A) 명칭/특징: CDS

(B) 위치: 97..2082

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 661 아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: 단백질

(xi) 서열 기술:

(2) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징

(A) 길이: 7 염기쌍

(B) 형태: 핵산

(C) 쇄의 수: 일본쇄

(D) 형태: 선형

(ii) 분자 형태: cDNA

(xi) 서열 기술:

ACCATGG 7

Claims

사람 BAS-1 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는, 분리된 또는 재조합 핵산.
제1항에 있어서, 서열 1의 서열을 포함하는, 분리된 또는 재조합 핵산.
제2항에 있어서, 사람 BAS-1 단백질의 단편을 암호화하는 천연 cDNA와 약 80% 이상의 동일성을 보이는 핵산.
제2항에 있어서, 서열 2의 8개 이상의 연속 잔기를 암호화하는, 분리된 또는 재조합 핵산.
제4항에 있어서, 12개 이상의 연속 잔기를 암호화하는 핵산.
제4항에 있어서, 사람 BAS-1 단백질의 단편을 암호화하는 천연 cDNA와 약 80% 이상의 동일성을 보이는 핵산.
실질적으로 순수한 BAS-1 단백질 또는 이의 펩티드.
제7항에 있어서, a) 사람을 포함한 영장류로 부터의 단백질 또는 펩티드;

b) 서열 2의 폴리펩티드 단편을 하나 이상 포함하는 단백질 또는 펩티드;

c) 천연 BAS-1 단백질과는 구별되는 해독후 변형 패턴을 나타내는 단백질 또는 펩티드; 및

d) BAS-1의 세포내 도메인이 결실된 단백질로 이루어진 그룹중에서 선택된 단백질 또는 펩티드.
제8항에 있어서, a) 사람 BAS-1의 상응하는 약 9개 이상의 아미노산과 약 90% 이상의 동일성을 갖는 서열 상동성;

b) 사람 BAS-1의 상응하는 약 17개 이상의 아미노산과 약 80% 이상의 동일성을 갖는 서열 상동성; 또는

c) 사람 BAS-1의 상응하는 약 25개 이상의 아미노산과 약 70% 이상의 동일성을 갖는 서열 상동성을 나타내는 단편을 포함하는 단백질 또는 펩티드.
제7항의 BAS-1 펩티드를 포함하는 융합 단백질.
제7항의 단백질 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
재조합 또는 정제된 영장류의 BAS-1 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 결합 단편.
제12항에 있어서, BAS-1 단백질이 사람의 단백질을 포함한 영장류 단백질인 항체.
제12항에 있어서, 서열 2의 펩티드 서열에 대하여 발생한 항체.
제12항에 있어서, 약 10μM 이상의 Kd를 나타내는 항체.
제12항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
제12항에 있어서, 표지된 항체.
제12항에 있어서, a) B 세포의 증식을 강력히 유도하고/하거나

b) 조사-유도된 세포자멸(apoptosis)로 부터 B 세포를 보호하는 항체.
제1항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제19항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
정제된 또는 재조합 BAS-1 단백질을 생성시키고, BAS-1 단백질에 결합 파트너가 특이적으로 결합하는지에 대해 샘플을 스크리닝하는 단계를 포함하여, BAS-1에 대한 결합 파트너에 대해 샘플을 스크리닝하는 방법.
제21항에 있어서, 샘플이 T 세포; 여포성 수지상 세포를 포함하는 수지상 세포; 또는 섬유아세포, 내피 세포 및 상피 세포를 포함하는 간질 세포로 부터 유래한 단백질을 포함하는 방법.
제21항에 있어서, 결합 파트너가 항체이고, 샘플이 하이브리도마 상층액인 방법.
세포를 BAS-1 단백질의 효능제 또는 길항제와 접촉시키는 것을 특징으로 하여, 세포의 생리 또는 성장을 조절하는 방법.
제24항에 있어서, 길항제가 영장류의 BAS-1 단백질에 대한 항체인 방법.
제24항에 있어서, 접촉이 항원 수용체, CD40:CD40 리간드 경로 또는 CD28/CTLA-4:B7/B70 경로를 통한 시그날의 매개자와 함께 이루어지는 방법.