SK288086B6 - Polynucleotide molecule comprising mutated nucleotide sequence of Streptomyces avermitilis aveC allele, vector and host cell, method of making strain of S. avermitilis and process for producing avermectins and final composition - Google Patents

Abstract

A polynucleotide molecule comprising a nucleotide sequence that is otherwise the same as the Streptomyces avermitilis aveC allele, the S. avermitilis AveC gene product-encoding sequence of plasmid pSE186 according to ATCC 209604 or the nucleotide sequence of the aveC ORF of S. avermitilis according to SEQ ID NO: 1, or a degenerate variant thereof, but which nucleotide sequence further comprises one or more mutations encoding an amino acid substitution at one or more amino acid residues corresponding to amino acid position 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 154, 179, 228, 238, 289, or 298 of SEQ ID NO: 2, such that cells of S. avermitilis strain ATCC 53692 in which the wild-type aveC allele has been inactivated and that express the polynucleotide molecule comprising the mutated nucleotide sequence produce a class 2: 1 cyclohexyl B2: cyclohexyl B1 avermectins that is reduced from the ratio produced by cells of S. avermitilis strain ATCC 53692 that instead express only the wild-type aveC allele. A recombinant vector and a host cell, a method for making a strain of S. avermitilis, comprising mutating the aveC allele, a mutated cell this strain and a process for producing said avermectins and a final composition.

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka preparátov a spôsobov prípravy avermektínov primáme v odbore zdravia živočíchov. Konkrétnejšie sa predkladaný vynález týka polynukleotidových molekúl obsahujúcich nukleotidové sekvencie kódujúce produkt génu aveC, ktorý môže byť použitý na moduláciu pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných fermentáciou kultúr 5. avermitilis, a preparátov a spôsobov vyhľadávania takých polynukleotidových molekúl. Predkladaný vynález sa ďalej týka vektorov, transformovaných hostiteľských buniek a nových mutovaných kmeňov S. avermitilis, v ktorých bol gén aveC inaktivovaný alebo mutovaný tak, že došlo na moduláciu vytváraného pomeru alebo množstva triedy 2 : 1 avermektínov.

Doterajší stav techniky

Avermektíny

Streptomycety produkujú celý rad sekundárnych metabolitov vrátane avermektínov, ktoré zahŕňajú sériu ôsmich príbuzných šestnásťčlenných makrocyklických laktónov majúcich silnú antihelmintickú a insekticidálnu aktivitu. Osem odlišných a blízko príbuzných zlúčenín je označovaných ako Ala, A1 b, A2a, A2b, B la, Blb, B2a a B2b. Séria „a“ zlúčenín sa týka prirodzeného avermektínu, kde substituentom v pozícii C25 je (S)-sek-butyl, a „b“ séria zlúčenín sa týka tých zlúčenín, kde substituentom v C5 pozícii je izopropyl. Označenie „A“ a „B“ sa týka avermektínov, kde substituent v C5 pozícii je metoxy, respektíve hydroxy skupina. Číslo „1“ sa týka avermektínov, kde dvojitá väzba je prítomná v pozícii C22,23 a číslo „2“ sa týka avermektínov majúcich vodík v pozícii C22 a hydroxy skupinu v pozícii C23. Medzi príbuznými avermektínmi je typ BI avermektínu rozpoznávaný ako avermektín majúci najúčinnejšiu antiparazitickú a pesticídovú aktivitu a je preto komerčne najviac žiaducim avermektínom.

Avermektíny a ich produkcia aeróbnou fermentáciou kmeňov S. avertimilis sú opísané v patentoch United States Patents 4310519 a 4429042. Biosyntéza prirodzených avermektínov je pravdepodobne začaná endogénne z CoA tioesterových analógov kyseliny izomaslovej a kyseliny S-(+)-2-metylmaslovej.

Kombinácia zlepšenia kmeňa náhodnou mutagenéziou aj použitie exogénne dodaných mastných kyselín viedla na účinnú tvorbu analógov avermektínu. Mutanty S. avertimitilis s deficienciou dehydrogenázy 2-oxo kyselín (bkd deficientné mutanty) môžu produkovať avermektíny len, keď sú fermentácie suplementované mastnými kyselinami. Vyhľadávanie a izolácia mutantov s deficienciou dehydrogenázovej aktivity vetvených reťazcov (napríklad 5. avermitilis, ATCC 535567) sú opísané v patente European Patent (EP) 276103. Fermentácia takých mutantov v prítomnosti exogénne dodaných mastných kyselín vedie na produkciu len štyroch avermektínov zodpovedajúcich použitým mastným kyselinám. Takto dochádza suplementáciou fermentáciou 5. avermitilis (ATCC 53567) S-(+)-2-metylmaslovou kyselinou na tvorbu prirodzených avermektínov Ala, A2a, B la a B2a, suplementácia fermentáciou kyselinou izomaslovou vedie na tvorbu prirodzených avermektínov Alb, A2b, Blb a B2b, a suplementácia fermentáciou kyselinou cyklopentankarboxylovou vedie na tvorbu štyroch nových cyklopentylavermektínov Al, A2, BI a B2.

Pokiaľ je uskutočnená suplementácia inými mastnými kyselinami, dochádza na tvorbu nových avermektínov. Vyhľadávaním viacej ako 800 potenciálnych prekurzorov bolo identifikované viac ako 60 ďalších nových avermektínov (pozri napríklad Dutton et al., 1991, J Antibiot 44:357-367, a Banks et al., 1994, Roy Soc Chem 147:16-26). Mutanty 5. avermitilis s deficienciou aktivity 5-O-metyltransferázy navyše produkujú len B analógové avermektíny. Mutanty 5. avermitilis bez aktivity dehydrogenázy vetvených 2-oxo kyselín aj 5O-metyltransferázy produkujú len B avermektíny zodpovedajúce mastným kyselinám použitým na suplementáciu fermentácie. Suplementácia takých dvojitých mutantov S-(+)-2-metylmaslovou kyselinou vedie na tvorbu len prirodzených avermektínov B la a B2, zatiaľ čo suplementácia kyselinou izomaslovou alebo cyklopentankarboxylovou vedie na tvorbu prirodzených avermektínov Blb a B2b, alebo nových cyklopentyl BI a B2 avermektínov. Suplementácia dvojitých zmutovaných kmeňov cyklohexan karboxylovou kyselinou je prednostný spôsob na produkciu komerčne dôležitého nového avermektínu, cyklohexylavermektínu B1 (doramektínu). Izolácia a charakteristiky takých dvojitých mutantov, napríklad S. avermitilis (ATCC 53692) sú opísané v EP 276103.

Gény hrajúce úlohu v biosyntéze avermektínov

V mnohých prípadoch sú gény hrajúce úlohu v produkcii sekundárnych metabolitov a gény kódujúce konkrétne antibiotikum nachádzané v zhlukoch na chromozóme. Toto je prípad napríklad zhlukov génov Streptomyces pre polyketíd syntázu (PKS) (pozri Hopwood a Sherman, 1990, Ann Rev Genet 24:37-66). Jednou zo stratégií klonovania génov v biosyntetickej dráhe bola izolácia génu pre liekovú rezistenciu, a potom testovanie priľahlých oblastí chromozómu na ďalšie gény majúce vzťah k biosyntéze takého konkrétneho antibiotika. Ďalšou zo stratégií klonovania génov hrajúcich úlohu v biosyntéze dôležitých metabolitov bola komplementácia mutantov. Časti DNA knižnice z organizmu produkujúceho konkrétny metabolit sú vlo2

SK 288086 Β6 žene do neprodukujúceho mutovaného kmeňa a transformované kmene sú vyhľadávané podľa tvorby metabolitu. Navyše bola použitá na identifikáciu a klonovanie génov v biosyntetických dráhach hybridizácia knižnice s použitím prób odvodených z kmeňov Streptomyces.

Gény hrajúce úlohu v biosyntéze avermektínu (ave gény), podobne ako gény vyžadované na biosyntézu iných sekundárnych metabolitov Streptomyces (napríklad PK.S) sú nachádzané v zhlukoch na chromozóme. S použitím vektorov na komplemetáciu mutantov S. a.vermitilis s blokádou biosyntézy avermektínu bol úspešne naklonovaný celý rad ave génov. Klonovanie takých génov je opísané v patente US Patent 5252474. Ikeda et al. 1995, J Antibiot 48:532-534 navyše opísal lokalizáciu chromozomálnej oblasti obsahujúcu C22,23 dehydratačný krok (aveC) na fragmente S. avermitilis 4,82 Kb BamHI, rovnako tak ako mutácie v géne aveC, ktoré vedú na produkciu jedného komponentu B2a. Pretože ivermektín, účinná antihelmintická zlúčenina, môže byť chemicky produkovaná z avermektínu B2a, je tento kmeň produkujúci jeden komponent avermektínu B2a považovaný za obzvlášť užitočný na komerčnú tvorbu ivermektínu.

Identifikácia mutácií aveC génu, ktoré minimalizujú komplexnosť tvorby avermektínu, ako sú napríklad mutácie, ktoré znižujú pomer B2 : B1 avermektínov, by mohli zjednodušiť produkciu a purifikáciu komerčne dôležitých avermektínov.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je izolovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako aveC alela Streptomyces avermitilis, AveC Streptomyces avermitilis génový produkt kódujúca sekvencia plazmidu pSE186 podľa ATCC 209604, alebo nukleotidová sekvencia aveC ORF S. avermitilis podľa SEQ ID č. 1 alebo jej degenerovaný variant, pričom táto nukleotidová sekvencia ďalej obsahuje jednu alebo viacej mutácií, ktoré kódujú substitúciu aminokyseliny v jednom alebo viacerých aminokyselinových rezíduách, ktoré korešpondujú s amino-kyselinovými pozíciami 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 289 alebo 298 sekvencie SEQ ID č. 2, takže bunky kmeňa S. avermitilis ATCC 53692, v ktorých bola aveC alela divokého typu inaktivovaná, a ktoré exprimujú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu mutovanú nukleotidovú sekvenciu, produkujú pomer triedy 2 : 1 cyklohexyl B2 : cyklohexyl BI avermektínov, ktorý je nižší ako pomer produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis ATCC 53692, ktoré namiesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely.

Predmetom vynálezu je ďalej

- rekombinantný vektor obsahujúci skôr definovanú polynukleotidovú molekulu a hostiteľská bunka obsahujúca túto polynukleotidovú molekulu alebo rekombinantný vektor,

- spôsob prípravy nového kmeňa S. avermitilis, ktorý zahŕňa mutáciu aveC alely v bunkách kmeňa S. avermitilis, ktorá vedie k substitúcii rôznych aminokyselinových rezíduí v AveC génovom produkte v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozíciách zodpovedajúcich aminokyselinovým rezíduám 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 289 alebo 298 sekvencie SEQ ID č. 2, takže bunky kmeňa 5. avermitilis ATCC 53692, v ktorých bola aveC alela mutovaná produkujú pomer triedy 2 : 1 cyklohexyl B2 : cyklohexyl B1 avermektínov, ktorý je nižší ako pomer produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis ATCC 53692, ktorý exprimuje len divoký typ aveC alely,

- bunka Streptomyces avermitilis s mutáciou aveC alely, ktorá kóduje aveC génový produkt majúci substitúciu v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozíciách zodpovedajúcich aminokyselinovým rezíduám 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 289 alebo 298 sekvencie SEQ ID č. 2, kde bunka produkuje pomer triedy 2 : 1 cyklohexyl B2 : cyklohexyl B1 avermektínov, ktorý je nižší ako pomer produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, ktorý exprimuje len divoký typ aveC alely,

- spôsob produkcie avermektínov s pomerom triedy 2 : 1 cyklohexyl B2 : cyklohexyl B1 avermektínov, ktorý je nižší ako pomer produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis ATCC 53692, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely, ktorý zahŕňa kultiváciu skôr uvedených buniek v kultivačnom médiu za podmienok, ktoré umožňujú alebo indukujú produkciu avermektínov, a získanie zmienených avermektínov z kultúry a

- kompozícia cyklohexyl B2 : cyklohexyl BI avermektínov produkovaná bunkami kmeňa Streptomyces avermitilis, ktorý exprimuje mutovanú aveC alelu, ktorá kóduje génový produkt, ktorý vedie na zníženie pomeru triedy 2 : 1 cyklohexyl B2 : cyklohexyl B1 avermektínov produkovaného bunkami v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa 5. avermitilis, ktorý neexprimuje mutovanú aveC alelu, ale exprimuje len divoký typ aveC alely, pričom táto kompozícia zahŕňa cyklohexyl B2 : cyklohexyl B1 avermektíny v pomere 0,68 : 1 alebo menej v kultivačnom médií, v ktorom boli bunky kultivované.

V ďalšom opise je vynález objasňovaný v širšom kontexte ako zodpovedá rozsahu, ktorý je skutočne predmetom tohto vynálezu. Výslovne sa preto uvádza, že do rozsahu vynálezu patria len aspekty explicitne uvedené skôr, a iba tie sú tiež predmetom pripojených patentových nárokov. Nasledujúci opis má len ilustratívny význam.

Predkladaný vynález poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu kompletný aveC ORF

SK 288086 Β6

S. avermitilis alebo jeho významnú časť, a táto izolovaná polynukleotidová molekula je bez ďalšieho kompletného ORF, ktorý je lokalizovaný smerom dole od aveC ORF in situ na chromozóme 5. avermitilis. Izolovaná polynukleotidová molekula, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu obsahuje prednostne nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako produkt génu AveC S. avermitilis kódujúci sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo ktorá je rovnaká ako nukleotidová sekvencia aveC ORF z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo jej významná časť. Predkladaný vynález ďalej zahŕňa nukleotidovú sekvenciu SEQ ID č. 1, alebo jej degenerovaný variant.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homológna s produktom génu AveC S. avermitilis kódujúcim sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo ktorá je rovnaká ako nukleotidová sekvencia aveC ORF z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo ako jej významná časť.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homológna s produktom génu AveC S. avermitilis kódujúcim sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo ako aminokyselinová sekvencia z obrázku 1 (SEQ ID č. 2), alebo ako jej významná časť.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu homológny AveC génový produkt. V prednostnej forme vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula nukleotidovú sekvenciu kódujúcu homológny AveC produkt génu S. hygroscopicus, a tento homológny génový produkt obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID č: 4, alebo jej významnú časť. V prednostnej forme vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula, ktorá je predmetom vynálezu, a ktorá kóduje homológny AveC produkt, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID č: 3, alebo jej významnú časť.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homológna s nukleotidovou sekvenciou SEQ ID NO: 3. Predkladaný vynález ďalej poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid, ktorý je homológny s homológnym AveC produktom génu S. hygroscopicus, majúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID č: 4.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje oligonukleotidy, ktoré hybridizujú s polynukleotidovou molekulou majúcou nukleotidovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo SEQ ID č. 3, alebo s polynukleotidovou molekulou majúcou nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna s nukleotidovou sekvenciou uvedenou na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo SEQ ID č. 3.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje rekombinantné klonovacie vektory a expresné vektory, ktoré sú užitočné na klonovanie a expresiu polynukleotidu, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu vrátane polynukleotidových molekúl obsahujúcich aveC ORF S. avermitilis alebo aveC homológny ORF. V nelimitujúcej forme vynálezu poskytuje predkladaný vynález plazmid pSE186 (ATCC 209604), ktorý obsahuje celý ORF aveC génu S. avermitilis. Predkladaný vynález ďalej poskytuje transformované hostiteľské bunky obsahujúce polynukleotidovú molekulu alebo rekombinantný vektor, ktorý je predmetom vynálezu, a nové kmene, alebo bunkové línie od nich odvodené.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje rekombinantne exprimovaný AveC génový produkt alebo AveC homológny génový produkt, alebo ich významnú časť. Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob produkcie rekombinantného AveC génového produktu, zahŕňajúci kultiváciu transformovanej hostiteľskej bunky s rekombinantným expresným vektorom, kde zmienený rekombinantný expresný vektor obsahuje polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt alebo AveC homológny génový produkt, a táto polynukleotidová molekula je v operačnom spojení s jedným alebo viacerými regulačnými elementmi, ktoré kontrolujú expresiu polynukleotidovej molekuly hostiteľskej bunky, za podmienok pomáhajúcich produkcii rekombinantného AveC génového produktu alebo AveC homológneho génového produktu, a zahŕňajúce získanie AveC génového produktu alebo AveC homológneho génového produktu z bunkovej kultúry.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je inak rovnaká ako AveC alela S. avermitilis, alebo AveC génový produkt kódujúci sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo jej degenerovaný variant, alebo nukleotidovú sekvenciu aveC ORF S. avermitilis, ako je uvedené na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo jej degenerovaný variant, ale ktorá ďalej obsahuje jednu alebo viacej mutácií, takže bunky kmeňa S. avermitilis ATCC 53692, v ktorých bola divoká aveC alela inaktivovaná, a ktorá exprimuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu zmutovanú nukleotidovú sekvenciu, produkujú odlišný pomer alebo množstvo avermektínov, ktoré sú produkované bunkami kmeňa 5. avermitilis ATCC 53692, ktoré miesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely. Podľa predkladaného vynálezu môžu byť takéto polynukleotidové molekuly použité na produkciu nových kmeňov S. avermitilis, ktoré vykazujú detegovateľnú zmenu v produkcii avermektínu v porovnaní s rovnakým kmeňom, ktorý miesto toho exprimuje len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu sú takéto polynukleotidové molekuly užitočné na produkciu nových kmeňov S. avermitilis, ktoré produkujú avermektíny v zníženom pomere 2:1, v porovnaní s rovnakým kmeňom, ktorý miesto toho exprimuje len divoký typ aveC alely. V ďalšej prednostnej forme vynálezu sú takéto polynukleotidové molekuly užitočné na produkciu nových kmeňov S. avermitilis, ktoré produkujú zvýšené množstvá avermektínov v porovnaní s rovnakým kmeňom, ktorý miesto toho exprimuje len jednu divokú aveC alelu. V ďalšej prednostnej forme vynálezu sú takéto polynukleotidové molekuly užitočné na produkciu nových kmeňov S. avermitilis, v ktorých bol aveC gén inaktivovaný.

Predkladaný vynález poskytuje spôsoby identifikácie mutácií aveC ORF S. avermitilis schopných zmeniť pomer a/alebo množstvo produkovaných avermektínov. V prednostnej forme vynálezu poskytuje predkladaný vynález spôsob identifikácie mutácií aveC ORF schopných zmeniť pomer triedy 2 : 1 produkovaných avermektínov, a tento spôsob zahŕňa: (a) určenie pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorých bola natívna aveC alela inaktivovaná, a do ktorých bola vložená polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu zmutovaný AveC génový produkt, a táto molekula je exprimovaná, (b) určenie pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami rovnakého kmeňa 5. avermitilis ako v kroku (a), ale tieto bunky miesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely alebo ORF z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo nukleotidovú sekvenciu, ktorá je k ORF homológna a (c) porovnanie pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (a) s pomerom triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (b), takže keď je pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (a) odlišný od pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (b), potom môže byť identifikovaná mutácia aveC ORF schopná zmeniť pomer triedy 2 : 1 avermektínov. V prednostnej forme vynálezu je pomer triedy 2 : 1 avermektínov touto mutáciou znížený.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález spôsoby identifikácie mutácií aveC ORF alebo genetických konštruktov obsahujúcich aveC ORF schopných zmeniť množstvo produkovaných avermektínov, a tento spôsob zahŕňa: (a) určenie množstva avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorých bola natívna aveC alela inaktivovaná, a do ktorých bola vložená polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu zmutovaný AveC génový produkt, alebo obsahujúca genetický konštrukt zahŕňajúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt a táto molekula je exprimovaná, (b) určenie množstva avermektínov produkovaných rovnakým kmeňom 5. avermitilis ako v kroku (a), ale tento kmeň miesto toho exprimuje len jednu aveC alelu majúcu nukleotidovú sekvenciu ako ORF z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo nukleotidovú sekvenciu, ktorá je k ORF homológna a (c) porovnanie množstva avermektínov produkovaných bunkami 5. avermitilis z kroku (a) s množstvom avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (b), takže keď je množstvo avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (a) odlišné od množstva avermektínov produkovaných bunkami 5. avermitilis z kroku (b), potom môže byť identifikovaná mutácia aveC ORF alebo genetického konštruktu schopná zmeniť pomer triedy 2 : 1 avermektínov. V prednostnej forme vynálezu je produkované množstvo avermektínov touto mutáciou zvýšené.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje rekombinantné vektory, ktoré sú užitočné na prípravu nových kmeňov 5. avermitilis s narušenou produkciou avermektínov. Predkladaný vynález navyše posyktuje vektory, ktoré môžu byť použité na cielenie ktorýchkoľvek polynukleotidových molekúl obsahujúcich mutované nukleotidové sekvencie, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, do miesta aveC génu chromozómu 5. avermitilis buď na inzerciu, alebo na nahradenie aveC alely, alebo ORF, alebo ich časti pomocou homológnej rekombinácie. Podľa predkladaného vynálezu ale môže tu poskytnutá polynukleotidová molekula obsahujúca mutovanú nukleotidovú sekvenciu, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, tiež modulovať biosyntézu avermektínov, keď je inzerovaná do chromozómu 5. avermitilis do miesta iného, ako je miesto aveC génu, alebo keď je v bunkách S. avermitilis udržiavaná epizomálne. Predkladaný vynález teda poskytuje tiež vektory obsahujúce mutovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu mutovanú nukleotidovú sekvenciu, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, a tieto vektory môžu byť použité na inzerciu polynukleotidovej molekuly do miesta v chromozóme S. avermitilis iného, ako je miesto aveC génu, alebo ktorá môže byť v týchto bunkách udržiavaná epizomálne. V prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález vektory na náhradu génu, ktoré môžu byť použité na inzerciu mutovanej aveC alely do chromozómu 5. avermitilis na účely tvorby nových kmeňov buniek, ktoré produkujú avermektíny v zníženom pomere triedy 2 : 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsoby prípravy nových kmeňov 5. avermitilis zahŕňajúce bunky, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu, čím vznikajú narušené pomery a/alebo množstvá avermektínov v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu poskytuje predkladaný vynález spôsoby prípravy nových kmeňov S. avermitilis obsahujúcich bunky, ktoré exprimujú mutovanou aveC alelu, čím vzniká narušený pomer triedy 2 : 1 avermektínov v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely, ďalej zahŕňajúce transformujúce bunky kmeňa S. avermitilis s vektorom, ktorý nesie mutovanú aveC alelu kódujúcu génový produkt, ktorý narušuje pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú mutovaný typ aveC alely v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré

SK 288086 Β6 exprimujú len divoký typ aveC alely, a ďalej výber transformovaných buniek, ktoré produkujú avermektíny v narušenom pomere triedy 2 : 1 avermektínov v porovnaní s pomerom triedy 2 : 1 produkovaným bunkami kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu je znížený pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných v bunkách nového kmeňa.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález spôsoby prípravy nových kmeňov S. avermitilis zahŕňajúce bunky, ktoré produkujú narušené množstvá avermektínov, zahŕňajúce transformujúce bunky kmeňa S. avermitilis s vektorom, ktorý nesie mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktorých expresia vedie na narušené množstvo avermektínov produkovaných bunkami kmeňa 5. avermitilis, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely, a ďalej zahŕňajúce výber transformovaných buniek, ktoré produkujú avermektíny v narušenom množstve v porovnaní s množstvom avermektínov produkovaných bunkami kmeňa 5. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu je množstvo avermektínov produkovaných v bunkách nového kmeňa zvýšené.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález spôsoby prípravy nových kmeňov S. avermitilis, ktorých bunky obsahujú inaktivovanú aveC alelu, obsahujúcu transformujúce bunky kmeňa 5. avermitiis, ktoré exprimujú ktorúkoľvek aveC alelu s vektorom, ktorý inaktivuje aveC alelu a ďalej výber transformovaných buniek, v ktorých bola aveC alela inaktivovaná.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje nové kmene S. avermitilis, ktoré boli transformované ktoroukoľvek polynukleotidovou molekulou alebo vektormi obsahujúcimi mutované nukleotidové sekvencie, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu. V prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález nové kmene 5. avermitilis zahŕňajúce bunky, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu na miesto alebo navyše k divokému typu aveC alely, kde bunky nového kmeňa produkujú avermektíny v narušenom pomere triedy 2 : 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnejšej forme vynálezu produkuje nový kmeň avermektíny v narušenom pomere triedy 2 : 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. Takéto nové kmene sú užitočné na produkciu komerčne žiaducich avermektínov, ako je napríklad doramektín, vo veľkej miere.

V ďalšej prednostnej forme vynálezu poskytuje predkladaný vynález nové kmene S. avermitilis, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu na miesto alebo navIAC k natívnej aveC alele, čo vedie na bunkovú produkciu narušeného množstva avermektínov v porovnaní s množstvom avermektínov produkovaných bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu produkujú nové bunky zvýšené množstvá avermektínov.

V ďalšej prednostnej forme vynálezu poskytuje predkladaný vynález nové kmene S. avermitilis obsahujúce bunky, v ktorých bol aveC gén inaktivovaný. Takéto kmene sú užitočné pre rôzne spektrum avermektínov, ktoré tieto bunky produkujú v porovnaní s divokým kmeňom, aj na komplementáciu vyhľadávacích analýz, ako sú tu opísané, aby sa určilo, či cielená alebo náhodná mutagenézia aveC génu ovplyvňuje produkciu avermektínov.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje postup produkcie avermektínov zahŕňajúci kultiváciu buniek kmeňa S. avermitilis, a tieto bunky exprimujú mutovanú aveC alelu, ktorá kóduje génový produkt, ktorý alteruje pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami kmeňa 5. avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely v kultivačnom médií za podmienok, ktoré z nich umožňujú alebo indukujú produkciu avermektínov, a získanie zmienených avermektínov z kultúry. V prednostnej forme vynálezu je znížený pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami exprimujúcich mutáciu. Postup poskytuje zvýšenú účinnosť produkcie komerčne hodnotných avermektínov, ako je napríklad doramektín.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje postup produkcie avermektínov zahŕňajúci kultiváciu buniek kmeňa 5. avermitilis, a tieto bunky exprimujú mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktoré vedú na narušené množstvo avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S. avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré neexprimujú len mutovanú aveC alelu alebo genetiký konštrukt, ale miesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely, v kultivačnom médií za podmienok, ktoré z nich umožňujú alebo indukujú produkciu avermektínov, a tento spôsob zahŕňa ďalej získanie zmienených avermektínov z kultúry. V prednostnej forme vynálezu je zvýšené množstvo avermektínov produkovaných bunkami exprimujúcich mutáciu alebo genetický konštrukt.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje nové zloženie avermektínov produkované kmeňom S. avermitilis exprimujúcim mutovanú aveC alelu, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, kde avermektíny sú produkované v zníženom pomere triedy 2 : 1 v porovnaní pomerom 2 : 1 triedy avermektínov produkovaných bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré neexprimujú mutovanú aveC alelu, ale miesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely. Nové zloženie avermektínov môže byť prítomné, ako je produkované vo fermentačnej kultivačnej tekutine, alebo z nej môže byť stiahnuté alebo môže byť z nej významne purifikované.

SK 288086 Β6

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1. DNA sekvencie (SEQ ID č. 1) obsahujúcej aveC ORF 5. avermitilis a odvodenú aminokyselinovú sekvenciu (SEQ ID č. 2).

Obrázok 2. Plazmidový vektor pSE186 (ATCC 209604) obsahujúci celý ORF aveC génu S avermitilis.

Obrázok 3. gén nahradzujúci vektor pSE180 (ATCC 209605) obsahujúci ermE gén Sacc. erythraea inzerovaný do aveC ORF S. avermitilis.

Obrázok 4. BamHI reštrikčná mapa zhlukov génov pre avermektín polyketíd syntázu zo 5. avermitilis s identifikovanými piatimi presahujúcimi kozmidovými klonmi (to je pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Uvedený je tiež vzťah pSEl 18 a PSE119.

Obrázok 5. HPLC analýza fermentačných produktov produkovaných kmeňmi S. avermitilis. Kvantifikácia vrcholu bola uskutočnená porovnaním množstva štandard cyklohexylu B1. Retenčný čas cyklohexylu B2 bol 7,4-7,7 minúty, retenčný čas cyklohexylu BI bol 11,9-12,3 minúty. Obrázok 5A. Kmeň S. avermitilis SE 180-11 s inaktivovaným aveC ORF. Obr. 5B. Kmeň S. avermitilis SE 180-11 transformovaný pomocou pSE187. Obr. 5D. Kmeň S. avermitilis SE180-11 transformovaný pomocou pSE188.

Obrázok 6. Porovnanie vyvodených aminokyselinových sekvencii kódovaných aveC ORF S. avermitilis (SEQ ID č.2), aveC homológnym čiastočným ORF z 5. griseochromogenes (SEQ ID č. 5) a aveC homológnym ORF z 5. hygroscopicus (SEQ ID č. 4). Valínové rezíduum označené hrubo je mysliace štartovacie miesto pre bielkovinu. Konzervované rezíduá sú uvedené veľkými písmenami pre homológiu vo všetkých troch sekvencíách a malými písmenami pre homológiu v dvoch z troch sekvencii. Aminokyselinové sekvencie majú približne 50 % identitu sekvencii.

Obrázok 7. Hybridný plazmidový konštrukt obsahujúci 564 bp BsaAI/KpnI fragment z S. hygroscopicus aveC homológneho génu inzerovaného do BaaAI/KpnI miesta v S. avermitilis aveC ORF.

Predkladaný vynález sa týka identifikácie a charakterizácie polynukleotidových molekúl majúcich nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú aveC génový produkt zo Streptomyces avermitilis, konštrukcia nových kmeňov 5. avermitilis, ktoré môžu byť použité na vyhľadávanie mutovaných AveC génových produktov pre ich efekt na produkciu avermektínov, a objave, že určité mutované AveC génové produkty môžu znižovať pomer B2 : BI avermektínov produkovaných S. avermitilis. Vynález je opísaný príkladom v častiach uvedených neskôr ako polynukleotidová molekula majúca buď nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako pre 5. avermitilis AveC génový produkt-kódujúcu sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo nukleotidovú sekvenciu ORF uvedenú na obrázku 1 (SEQ ID č.l), a polynukleotidové molekuly majúce z nich odvodené mutované nukleotidové sekvencie a ich degenerované varianty. Princípy uvedené v predkladanom vynáleze ale môžu byť analogicky aplikované na ďalšie polynukleotidové molekuly vrátane aveC homológnych génov z iných druhov Streptomyces, zahŕňajúce medzi inými napríklad S. hygroscopicus a S. griseochromogenes.

Polynukleotidové molekuly kódujúce S. avermitilis AveC génový produkt

Predkladaný vynález poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu kompletný aveC ORF S. avermitilis alebo jeho významnú časť, a táto izolovaná polynukleotidová molekula je bez ďalšieho kompletného ORF, ktorý je lokalizovaný smerom dole od ORF in situ na chromozóme S. avermitilis.

Izolovaná polynukleotidová molekula, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu obsahuje prednostne nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká, ako je 5. avermitilis AveC génový produkt kódujúci sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo je rovnaká ako nukleotidová sekvencia ORF z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo jej významná časť. Ako je tu použité, „významná časť“ izolovanej polynukleotidovej molekuly obsahujúca nukleotidovú molekulu kódujúcu S. avermitilis AveC génový produkt znamená izolovanú polynukeotidovú molekulu obsahujúcu aspoň 70 % kompletnej aveC ORF sekvencie uvedenej na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), ktorý kóduje funkčne ekvivalentný AveC génový produkt. V tomto ohľade je „fukčne ekvivalentný“ AveC génový produkt definovaný ako génový produkt, ktorý keď je exprimovaný v kmeni S. avermitilis ATCC 53692, v ktorom bola natívna aveC alela inaktivovaná, vedie na produkciu významne rovnakého pomeru a množstva avermektínov, ako je produkované kmeňom S. avermitilis ATCC 53692, ktorý exprimuje len divokú, funkčnú aveC alelu natívnu pre kmeň 5. avermitilis ATCC 53692.

Navyše k nukleotidovej sekvecii aveC ORF môže izolovaná polynukleotidová molekula, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, ďalej obsahovať nukleotidové sekvencie, ktoré prirodzene hraničia s aveC génom in situ v S. avermitilis, ako sú napríklad hraničiace nukleotidové sekvencie uvedené na obrázku 1 (SEQ IDč. 1).

Predkladaný vynález ďalej poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu SEQ ID č. 1, alebo jej degenerovaný variant.

Ako je tu používané, týkajú sa termíny „polynukleotidová molekula“, „polynukleotidová sekvencia“, „kódujúca sekvencia“, „otvorený čítací rámec“ a „ORF“, DNA aj RNA molekúl, ktoré môžu byť buď jednovláknové alebo dvojvláknové, a ktoré môžu byť transkribované alebo translátované (DNA), alebo transláto7

SK 288086 Β6 vane (RNA) do AveC génového produktu, alebo do polypeptidu, ktorý je homológny s AveC génovým produktom alebo s AveC homológnym génovým produktom v príslušnom expresnom systéme hostiteľskej bunky, keď je pod kontrolou príslušných regulačných elementov. Kódujúca sekvencia môže zahŕňať, ale nie je obmedzená na prokaryotické sekvencie, cDNA sekvencie, genomické DNA sekvencie a chemicky syntetizované DNA a RNA sekvencie.

Nukleotidová sekvencia uvedená na obrázku 1 (SEQ ID č. 1) zahŕňa štyri odlišné GTG kodóny v pozíciách bp 42, 174, 177 a 180. Ako je uvedené neskôr, boli konštruované početné delécie 5 - oblasti aveC ORF (obrázok 1, SEQ ID č. 1), aby sa pomohlo definovať, ktorý z týchto kodónov by mohol íúngovať v aveC ORF ako štarovacie miesto na expresiu bielkovín. Delécia prvého GTG miesta v pozícii 42 bp neeliminovala AveC aktivitu. Ďalšie delécie všetkých GTG kodónov v pozíciách 174, 177 a 180 bp spoločne eliminovali AveC aktivitu, čo ukazuje, že táto oblasť je potrebná na expresiu bielkovín. Predkladaný vynález teda zahŕňa aveC ORF s variabilnou dĺžkou.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homológna so 5. avermitilis AveC génový produkt-kódujúcou sekvenciou plazmidu pSE186 (ATC 209604), alebo s nukleotidovou sekvenciou aveC ORF prezentovanou na obrázku 1 (SEQ ID č. 1) alebo s jej významnou časťou. Termín „homológny“, keď je použitý vo vzťahu k polynukleotidovej molekule, ktorá je homológna so 5. avermitilis AveC génový produkt-kódujúcou sekvenciou, znamená polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu: a) ktorá kóduje rovnaký AveC génový produkt ako S. avermitilis génový produkt-kódujúcu sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo ktorá kóduje rovnaký AveC génový produkt, ako je nukleotidová sekvencia aveC ORF prezentovaná na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), ale ktorá zahŕňa jednu alebo viacej nemých zmien nukleotidovej sekvencie podľa degenerácie genetického kódu (to je degeneračný variant), alebo b) ktorá hybridizuje, aby skomplementovala polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje AveC génový produkt-kódujúcu sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu uvdenú na obrázku 1 (SEQ ID č. 2) za mierne prísnych podmienok, to je hybridizácia na odfiltrovanie naviazanej DNA v 0,5 M NaHPO₄, 7 % sodnom dodecylsulfáte (SDS), 1 mM EDTA pri teplote 65 °C, a premytie v 0,2 x SSC/0,1 % SDS pri teplote 42 °C (pozri Ausubel et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Sv. I, Green Publishing Associates, Inc, a John Wiley and Sons, Inc, New York, strana 2.10.3), ktorá kóduje funkčne ekvivalentný AveC génový produkt, ako je definované skôr. V prednostnej forme hybridizuje homológna polynukleotidová molekula, aby skomplementovala AveC génový produkt-kódujúcu sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo skomplementovala nukleotidovú sekvenciu aveC ORF prezentovanú na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo jej významnú časť za vysoko prísnych podmienok to je hybridizácia na odfiltrovanie naviazanej DNA v 0,5 M NaHPO₄, 7 % SDS, 1 mM EDTA pri teplote 65 °C, a premytie v 0,1 x SSC/0,1 % SDS pri teplote 68 °C (pozri Ausubel et al., 1989, vyššie), ktorá kóduje funkčne ekvivalentný AveC génový produkt, ako je definované skôr.

Aktivita AveC génového produktu a jeho potenciálne funkčných ekvivalentov môže byť určená HPLC analýzou fermentačných produktov, ako je opísané v príkladoch uskutočnenia vynálezu. Polynukleotidové molekuly majúce nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú funkčné ekvivalenty 5. avermitilis AveC génového produktu, zahŕňajú prirodzene sa vyskytujúce aveC gény prítomné v iných kmeňoch S. avermitilis, aveC homológne gény prítomné v iných druhoch Streptomyces, a mutované aveC alely prirodzene sa vyskytujúce alebo pripravené genetickým inžinierstvom.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je homológna s aminokyselinovou sekvenciou kódovanou AveC génový produkt-kódujúcou sekvenciou plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo aminokyselinovou sekvenciou z obrázku 1 (SEQ ID č. 2) alebo s jej významnou časťou. Ako je tu použité, znamená „významná časť“ aminokyselinovej sekvencie z obrázku 1 (SEQ ID č. 2) polypeptid obsahujúci okolo 70 % aminokyselinovej sekvencie uvedenej na obrázku 1 (SEQ ID č. 2), ktorá konštituje funkčne ekvivalentný AveC génový produkt, ako je definované skôr.

Ako je tu používané s odkazom na aminokyselinové sekvencie, ktoré sú homológne s aminokyselinovými sekvenciami AveC génového produktu S. avermitilis, týka sa termín „homológny“ polypeptidu, ktorý má inak aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1 (SEQ ID č. 2), ale v ktorom jedno alebo viacej aminokyselinových rezíduí je konzervatívne substituovaných odlišným aminokyselinovým rezíduom, kde zmienená aminokyselinová sekvencia má aspoň zhruba 70 %, prednostnejšie aspoň zhruba 80 %, a najprednostnejšie aspoň zhruba 90 % identity aminokyselinovej sekvencie s polypeptidom kódovaným AveC génový produkt-kódujúcou sekvenciou plazmidu pSE186 (ATCC 209604) aminokyselinovej sekvencie z obrázku 1 (SEQ ID č. 2), ako je určené ktorýmkoľvek štandardným algoritmom identity aminokyselinových sekvencií, ako je napríklad algoritmus BLASTP (GENBANK, NCBI), a kde taká konzervatívna substitúcia vedie na vznik funkčne ekvivalentného génového produktu, ako je definované. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie sú dobre známe v odbore. Pravidlá na uskutočňovanie takých substitúcií zahŕňajú pravidlá opísané medzi inými Dayhofem MD, 1978, Nat Biomed Res Found, Washington, DC, sv. 5, Sup. 3. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie sú špecifickejšie tie substitúcie, ktoré sa všeobecne uskutočňujú v rámci rodiny aminokyselín, ktoré sú príbuzné aciditou alebo polaritou. Geneticky kódované aminokyseliny sú všeobecne rozdelené do štyroch skupín: 1) kyslé = aspartát, glutamát, 2) bázické = lysín, arginín, histidín, 3) nepoláme = alanín, valín, leucín, izoleucín, prolín, fenylalanín, metionín, tryptofan a 4) poláme bez náboja = glycín, asparigín, glutamín, cystein, serín, treonín, tyrosín. Fenylalanín, tryptofan tyrosín sú tiež spoločne klasifikované ako aromatické aminokyseliny. Jedna alebo viacej náhrad v ktorejkoľvek konkrétnej skupine, napríklad náhrada leucínu za izoleucín alebo valín, alebo aspartátu za glutamát, alebo treonín za serín, alebo za ktorékoľvek iné aminokyselinové rezíduum so štrukturálne príbuzným aminokyselinovým rezíduom, napríklad aminokyselinové rezíduum s podobnou aciditou alebo polaritou, alebo podobných v kombinácii týchto vlastností, budú mať všeobecne nevýznamný efekt na funkciu polypeptidu.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC homológny génový produkt. Ako je tu používané, je „AveC homológny génový produkt“ definovaný ako génový produkt majúci aspoň zhruba 50 % aminokyselinovú sekvenčnú identitu s AveC génovým produktom 5. avermitilis obsahujúcim aminokyselinovú sekvenciu kódovanú AveC génový produkt- kódujúcou sekvenciou plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo aminokyselinové sekvencie uvedené na obrázku 1 (SEQ ID č. 2), ako je určené ktorýmkoľvek štandardným algoritmom identity aminokyselinových sekvencií, ako je napríklad algoritmus BLASTP (GENBANK, NCBI). V neobmedzujúcej forme vynálezu je AveC homológny génový produkt zo S. hygroscopicus (opísaný v prihláške EP 0298423, depozit FERM BP-1901) a obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID č.: 4 alebo jej významnú časť. „Významná časť“ aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 4 znamená polypeptíd obsahujúci aspoň 70 % aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 4, a ktorý konštituje funkčne ekvivalentný AveC homológny génový produkt. „Funkčne ekvivalentný“ AveC homológny génový produkt je definovaný ako génový produkt, ktorý keď je exprimovaný v kmeni S. hygroscopicus FERM BP-1901, v ktorom bola natívna aveC homológna alela inaktivovaná, vedie na produkciu významne rovnakého pomeru a množstva milbemycínov, ako sú produkované kmeňom S. hygroscopicus FERM BP-1901 exprimujúcim miesto divokého typu funkčnú aveC homológnu alelu natívnu kmeňu S. hygroscopicus FERM BP-1901. V neobmedzujúcej forme vynálezu obsahuje izolovaná polynukleotidová molekula, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, a ktorá kóduje S. hygroscopicus AveC homológny génový produkt, nukleotidovú sekvenciu SEQ ID č. 3 alebo jej významnú časť. V tomto ohľade znamená „významná časť“ izolovanej polynukleotidovej molekuly obsahujúcej nukleotidovú sekvenciu SEQ ID č. 3 izolovanú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu aspoň 70 % nukleotidovej sekvencie SEQ ID č. 3, ktorá kóduje funkčne ekvivalentný AveC homológny génový produkt, ako je definované skôr.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homológna so S. hygroscopicus nukleotidovou sekvenciou SEQ ID č. 3. Termín „homológny“, keď je použitý na odkaz na polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je homológna s 5. hygroscopicus AveC homológny génový produkt-kódujúcou sekvenciou SEQ ID č. 3, znamená polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu: a) ktorá kóduje rovnaký génový produkt, ako je nukleotidová sekvencia SEQ ID č. 3, ale ktorá obsahuje jednu alebo viacej nemých zmien v nukleotidovej sekvencii podľa degenerácie genetického kódu (to je degenerovaný variant), alebo b) ktorá hybridizuje, aby komplementovala polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID č. 4 za mierne prísnych podmienok, to je hybridizácia na odfiltrovanie naviazanej DNA v 0,5 M NaHPO₄, 7 % SDS, 1 mM EDTA pri teplote 65 °C, a premytie v 0,2 x SSC/0,1 % SDS pri teplote 42 °C (pozri Ausubel et al. pozri skôr), ktorá kóduje funkčne ekvivalentný AveC homológny génový produkt, ako je definované skôr. V prednostnej forme vynálezu hybridizuje homológna polynukleotidová molekula, aby skomplementovala AveC génový produkt-kódujúcu nukleotidovú sekvenciu SEQ ID č. 3 za vysoko prísnych podmienok, to je hybridizácia na odfiltrovanie naviazanej DNA v 0,5 M NaHPO₄, 7 % SDS, 1 mM EDTA pri teplote 65 °C, a premytie v 0,1 x SSC/0,1 % SDS pri teplote 68 °C (pozri Ausubel et al., 1989, vyššie), ktorá kóduje funkčne ekvivalentný AveC génový produkt, ako je definované skôr.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje polypeptíd, ktorý je homológny s S. hygroscopicus AveC homológnym génovým produktom. Ako je tu používané, týka sa termín „homológny“ s odkazom na polypeptídy, ktoré sú homológne s AveC homológnym génovým produktom so sekvenciou SEQ ID č. 4 zo S. hygroscopicus, polypeptidu, ktorý má inak aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID č. 4, ale v ktorej jedno alebo viacej aminokyselinových rezíduí bolo konzervatívne substituovaných odlišným aminokyselinovým rezíduom, ako je definované, kde zmienená aminokyselinová sekvencia má aspoň 70 %, prednostnej šie aspoň 80 %, naj prednostnej šie aspoň 90 % aminokyselinovú sekvenčnú identitu na polypeptíd so sekvenciou SEQ ID č. 4, ako je určené ktorýmkoľvek štandardným algoritmom aminokyselinovej sekvenčnej identity, ako je napríklad algoritmus BLASTP (GENBANK), NCBI), kde taká konzervatívna substitúcia vedie na funkčne ekvivalentný AveC homológny génový produkt, ako je definované skôr.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje oligonukleotídy, ktoré hybridizujú s polynukleotidovou molekulou majúcou nukleotidovú sekvenciu uvedenú na obrázku 1 (SEQ ID č. 1) alebo SEQ ID č. 3, alebo polynukleo9

SK 288086 Β6 tidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je komplementárna nukleotidovej sekvencii uvedenej na obrázku 1 (SEQ ID č. 1) alebo SEQ ID č. 3. Takéto oligonukleotidy majú aspoň 10 nukleotidov, prednostne od zhruba 15 do zhruba 30 nukleotidov, a hybridizujú s jednou z uvedených polynukleotidových molekúl za vysoko prísnych podmienok, to je premytie v 6 x SSC/0,5 % pyrofosfáte sodnom pri teplote zhruba 37 °C pre oligonukleotidy so zhruba 14 bázami, pri teplote zhruba 48 °C pre oligonukleotidy so zhruba 17 bázami, pri teplote zhruba 55 °C pre oligonukleotidy so zhruba 20 bázami, a pri teplote zhruba 60 °C pre oligonukleotidy so zhruba 23 bázami. V prednostnej forme vynálezu sú oligonukleotidy komplementárne k časti jednej zo zmienených polynukleotidových molekúl. Tieto oligonukleotidy sú užitočné na celý rad účelov vrátane kódovania alebo účinkovania ako antisensie molekuly na reguláciu génov, alebo ako priméry na amplifikáciu aveC alebo aveC homolog-kódujúcich polynukleotidových molekúl.

Ďalšie aveC homológne gény môžu byť identifikované pre iné druhy alebo kmene Streptomyces s použitím polynukleotidových molekúl alebo oligonukleotidov uvedených tu v spojení so známymi technikami. Napríklad oligonukleotidová molekula obsahujúca časť S. avermitilis nukleotidovej sekvencie z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo časť S. avermitilis nukleotidovej sekvencie SEQ ID č. 3 môže byť detegovateľne označená a použitá na vyhľadávanie genomickej knižnice konštruovanej z DNA odvodenej z organizmu, ktorý je predmetom záujmu. Prísnosť hybridizačných podmienok je zvolená na základe vzťahu referenčného organizmu, v tomto prípade S. avermitilis alebo S. hygroscopicus, k organizmu, ktorý je predmetom záujmu. Požiadavky na rôzne prísne podmienky sú dobre známe osobám skúseným v odbore, a tieto podmienky sa líšia v závislosti od špecifických organizmov, z ktorých sú knižnica a označené sekvencie odvodené. Takéto oligonukleotidy majú prednostne aspoň zhruba 15 nukleotidov, napríklad ide o oligonukleotidy opísané v príkladoch uskutočnenia vynálezu neskôr. Amplifikácia homológnych génov môže byť uskutočnená s použitím týchto aj iných oligonukleotidov použitím štandardných techník, ako je napríklad polymerázová reťazová reakcia (PCR), aj keď môžu byť použité aj iné amplifikačné techniky známe v odbore.

Klony identifikované ako obsahujúce aveC homológne nukleotidové sekvencie môžu byť testované na schopnosť kódovať funkčný AveC homológny génový produkt. Na tento účel môžu byť klony podrobené sekvenčej analýze na účely identifikácie vhodného čítacieho rámca, rovnako tak ako iniciačných a terminačných signálov. Klonované DNA sekvencie môžu byť alternatívne alebo navyše inzerované do vhodného expresného vektora, to je do vektora, ktorý obsahuje potrebné elementy na transkripciu a transláciu inzerovanej proteín-kódujúcej sekvencie. Môže byť použitý ktorýkoľvek z celého radu hostiteľských/vektorových systémov, ako je opísané neskôr, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na bakteriálne systémy, ako sú napríklad plazmidové, bakteriofágové alebo kozmidové expresné vektory. Príslušné hostiteľské bunky transformované takými vektormi zahŕňajúce potenciálne aveC homolog-kódujúce sekvencie môžu byť potom analyzované na aktivitu AveC s použitím spôsobov, ako je napríklad HPLC analýza fermentačných produktov, ako je opísané napríklad v časti 7 neskôr.

Produkcie a manipulácie polynukleotidových molekúl tu uvedených sú známe v odbore a môžu byť uskutočnené podľa rekombinantných techník opísaných napríklad v Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N Y; Sambrok et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR strategies, Academic Press, Inc., San Diego; a Erlich (ed), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, a tieto publikácie sú všetky do vynálezu začlenené ako referencie. Polynukleotidové klony kódujúce AveC génové produkty alebo AveC homológne génové produkty, môžu byť identifikované pomocou metód známych v odbore, ktoré zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na spôsoby uvedené v časti 7 neskôr. Genomické knižnice môžu byť vyhľadávané na aveC a aveC homológne kódujúce sekvencie s použitím techník, ako sú napríklad metódy uvedené v publikácii Benton a Davis, 1977, Science 196:180 pre bakterifágové knižnice, a v publikácii Grunstein a Hodness, 1975, Proc Natl Acad sci USA, 72: 3961- 3965 pre plazmidové knižnice. Polynukleotidové molekuly majúce nukleotidové sekvencie, o ktorých je známe, že zahŕňajú aveC ORF samotný, napríklad v plazmide pSE186 (ATCC 209604) alebo v plazmide pSEl 19 (opísané v časti 7), môžu byť použité ako próby v týchto vyhľadávacích experimentoch. Oligonukleotidové próby môžu byť syntetizované alternatívne tak, že korešpondujú s nukleotidovými sekvenciami odvodenými od čiastočných alebo úplných aminokyselinových sekvencii purifikovaného AveC homológneho génového produktu.

Rekombinantné systémy

Klonovacie a expresné vektory

Predkladaný vynález ďalej poskytuje rekombinantné klonovacie vektory a expresné vektory, ktoré sú užitočné na klonovanie alebo exprimovanie polynukleotidových molekúl, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, napríklad aveC ORF S. avermitilis alebo ktorýchkoľvek aveC homológnych ORF. V nelimitujúcej forme poskytuje predkladaný vynález plazmid pSE186 (ATCC 209604), ktorý obsahuje kompletný ORF aveC gén S. avermitilis.

SK 288086 Β6

Všetky z nasledujúcich opisov týkajúcich sa aveC ORF z S. avermitilis, alebo polynukleotidovej molekuly obsahujúcej aveC ORF z S. avermitilis, alebo jej časť, alebo S. avermitilis AveC génový produkt, sa tiež týkajú aveC homológov a AveC homológnych génových produktov, ak nie je výslovne alebo z kontexte uvedené inak.

Na špecifické použitie pre Streptomycet bol použitý celý rad rôznych vektorov, zahŕňajúcich medzi inými vektory fágové, plazmidy s vysokým počtom kópií, plazmidy s nízkym počtom kópií a E.coli-Streptomyces prenosové vektory, a ktorýkoľvek z nich môže byť použitý na uskutočnenie predkladaného vynálezu. Zo Streptomycet bol tiež klonovaný celý rad génov na liekovú rezistenciu a niektoré z týchto génov boli začlenené do vektorov ako vektory, ktoré je možno zvoliť. Príklady bežných vektorov na použitie v Streptomyces sú prezentované medzi inými miestami v publikácii Hutchinson 1980, Applied Biochem Biotech 16:169-190.

Rekombinantné vektory, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, zvlášť expresné vektory, sú prednostne konštruované tak, že kódujúca sekvencia polynukleotidovej molekuly, ktorá je predmetom vynálezu, je v operačnom spojení s jedným alebo viacerými regulačnými elementmi potrebnými na transkripciu a transláciu kódujúcej sekvencie na účely produkcie polypeptidu. Ako je tu používané, termín „regulačný element“ zahŕňa, ale nie je obmedzený na nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú induktibilné a neinduktibilné promotory, enhancery a ďalšie elementy známe v odbore, ktoré slúžia na reguláciu expresie polynukleotid-kódujúcich sekvencií. Ako je tu tiež použité, je kódujúca sekvencia v „operačnom spojení“ s jedným alebo viacerými regulačnými elementmi, kde regulačné elementy účinne regulujú a umožňujú transkripciu kódujúcej sekvencie alebo transláciu jeho mRNA, alebo oboch.

Typické plazmidové vektory, ktoré môžu byť pripravené, aby obsahovali medzi mnohými inými pCRBlunt, pCR2.1 (Invitrogén), pGEM3Zf (Promega) a transportný vektor pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171:5872-5881).

Spôsoby na konštrukciu rekombinantných vektorov obsahujúce konkrétne kódujúce sekvencie v operačnom spojení s príslušnými regulačnými elementmi sú dobre známe v odbore, a tieto spôsoby môžu byť použité na uskutočnenie predkladaného vynálezu. Tieto spôsoby zahŕňajú in vitro rekombinantné techniky, syntetické techniky a in vivo genetickú rekombináciu. Pozri napríklad techniky opísané v publikácii Maniatis et al., 1989, vyššie; Ausubel et al., 1989, vyššie; Sambrook et al., 1989, vyššie; Innis et al., 1995, vyššie; Erlich 1992, vyššie.

Regulačné elementy týchto vektorov sa môžu líšiť vo svojej sile vo svojich špecifitách. V závislosti od použitého hostiteľského/vektorového systému môže byť použité akékoľvek množstvo vhodných transkripčných a translačných elementov. Neobmedzujúce príklady transkripčných regulačných oblastí alebo promótorov pre baktérie β-gal promotor, T7 promotor, TAC promotor, λ ľavý a pravý promotor, trp a lac promotory, trp- lac fúzne promotory a špecifickejšie pre Streptomyces, promotory ermE, melC a tipA, atď. V špecifickej forme opísanej v časti 11 neskôr bol generovaný expresný vektor, ktorý obsahuje klonovaný aveC ORF priľahlé k silnému konštitutívnemu ermE promotoru zo Sacharopolyspora erythraea. Vektor bol transformovaný do S. avermitilis a následná HPLC analýza fermentačných produktov ukázala zvýšený titer produkovaných avermektínov v porovnaní s produkciou rovnakého kmeňa, ktorý ale exprimuje divoký typ aveC alely.

Fúzne proteínové expresné vektory môžu byť použité na expresiu AveC génový produkt-fúzneho proteínu. Purifikovaný fúzny proteín môže byť použitý na získanie antiséra proti AveC génovému produktu, na štúdium biochemických vlastností AveC génového produktu, na prípravu AveC fúznych proteínov s odlišnými biochemickými aktivitami a na pomoc identifikovať alebo purifikovať exprimovaný AveC génový produkt. Možné expresné vektory pre fúzny proteín zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na vektory inkorporujúcej sekvencie, ktoré kódujú β-galaktosidázu a trpE fúzie, maltózu viažucu proteínové fúzie, glutation-Stranferázové fúzie a polyhistidinové fúzie (nosičové oblasti). V alternatívnej forme vynálezu môžu byť AveC génový produkt alebo jeho časť sfúzované s AveC homológnym génovým produktom alebo jeho časťou, odvodené od iných druhov alebo kmeňa Streptomyces, ako sú napríklad S. hygroscopicus alebo 5. griseochromogenes. V konkrétnej forme vynálezu opísanej v časti 12 a zobrazenej na obrázku 7 bol skonštruovaný chimérický plazmid. Ktorý obsahuje 564 bp oblasť 5. avermitilis aveC ORF. Takéto hybridné vektory môžu byť transformované do buniek S. avermitilis a testované na účely určenia ich efektu napríklad na pomer triedy 2 : 1 produkovaných avermektínov.

AveC fúzne proteíny môžu byť pripravené, aby obsahovali oblasť užitočnú na purifikáciu. Fúzny AveCmaltózu viažuci proteín môže byť napríklad purifikovaný s použitím amylózovej živice, fúzne proteíny AveC-glutation-S-transferáza môžu byť purifikované s použitím glutation-agarózy, fúzne proteíny AveCpolyhistidin môžu byť purifikované s použitím živice s bivalentným niklom. Na purifikáciu fúzneho proteínu afinitnou Chromatografiou môžu byť alternatívne použité protilátky proti nosičovému proteínu alebo peptidu. Napríklad nukleotidová sekvencia kódujúca cieľový epitop monoklonálnej protilátky môže byť pripravená do expresného vektora v operačnom spojení s regulačnými elementmi a situovaná tak, že exprimovaný epitop je sfúzovaný do AveC polypeptidu. Napríklad nukleotidová sekvencia kódujúca FLAG™ epitopovú návesť (International Biotechnologies Inc.), čo je hydrofilný markerový peptid, môže byť inzertovaný štandardnými technikami do expresného vektora v bode zodpovedajúcom napríklad karboxylovému koncu AveC polypep11

SK 288086 Β6 tídu. Exprimovaný AveC polypeptid-FLAG™ epitop fuzny produkt môže byť potom detegovaný a afinitne purifikovaný s použitím komerčne dostupných anti-FLAG™ protilátok.

Expresný faktor kódujúci AveC fuzny protein môže byť tiež pripravený, aby obsahoval polyspájajúce sekvencie kódujúce špecifické proteázové štiepiace miesta tak, že exprimovaný AveC polypeptid môže byť uvoľnený z nosičovej oblasti alebo z fuzneho partnera pomocou špecifickej proteázy. Fúzny proteínový vektor môže napríklad zahŕňať DNA sekvencie kódujúce medzi inými trombín alebo faktor Xa štepiace miesta.

Signálna sekvencia smerom hore od, a v čítacom rámci aveC ORF môže byť vpravená do expresného vektora známymi spôsobmi, aby sa usmernil smer a sekrécia exprimovaného génového produktu. Neobmedzujúce príklady signálnych sekvencii zahŕňajú medzi inými sekvencie α-faktora, imunoglobulínov, vonkajších membránových proteinov, penicilínázy a T bunkových receptorov.

Na pomoc pri výbere hostiteľských buniek transformovaných alebo transfektovaných klonovacími alebo expresnými vektormi, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu môže byť vektor pripravený tak, že ďalej obsahuje kódujúcu sekvenciu pre reportérový génový produkt alebo iný voliteľný marker. Taká kódujúca sekvencia je prednostne v operačnom spojení so sekvenciami kódujúcimi regulačný element, ako je opísané skôr. Reportérové gény, ktoré sú užitočné vo vynáleze, sú dobre známe v odbore a zahŕňajú gény kódujúce medzi inými zelený fluorescenčný protein luciferázu, xylE a tyrosinázu. Nukleotidové sekvencie kódujúce voliteľné markery sú dobre známe v odbore a zahŕňajú sekvencie, ktoré kódujú génové produkty poskytujúce rezistenciu proti antibiotikám alebo antimetabolitám, alebo ktoré dodávajú auxotrofické požiadavky. Príklady takých sekvencii zahŕňajú sekvencie, ktoré kódujú rezistenciu medzi inými na erytromycín, tiostreptón alebo kanamycín.

Transformácia hostiteľských buniek

Predkladaný vynález ďalej poskytuje transformované hostiteľské bunky obsahujúce polynukleotidovú molekulu alebo rekombinantný vektor, ktoré sú predmetom vynálezu, a nové kmene alebo bunkové línie od nich odvodené. Hostiteľské bunky užitočné na uskutočnenie vynálezu sú prednostne bunky Streptomyces, aj keď môžu byť použité aj iné prokaryotické alebo eukaryotické bunky. Takéto transformované hostiteľské bunky typicky zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na mikroorganizmy, ako sú napríklad baktérie transformované medzi inými rekombinantnými bakteriofágovými DNA, plazmidovými DNA alebo kozmidovými DNA vektormi, alebo kvasnicami transformovanými rekombinantnými vektormi.

Polynukleotidové molekuly, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu, sú zamýšľané, aby fungovali pre bunky Streptomyces, ale môžu byť tiež transformované do iných bakteriálnych alebo eukaryotických buniek, napríklad na klonovacie alebo expresné účely. Môže byť typicky použitý kmeň E. coli, ako napríklad kmeň DH5a, dostupný z Americkej zbierky typových kultúr (ATCC), Rockville, MD, USA) (prístupové číslo 31343) a z komerčných zdrojov (Stratagene). Prednostné hostiteľské bunky zahŕňajú kvasnicové bunky, aj keď môžu byť účinne použité aj savčie bunky alebo bunky hmyzu.

Rekombinantný expresný vektor, ktorý je predmetom vynálezu, je prednostne transformovaný alebo tranfektovaný do jednej alebo viacerých hostiteľských buniek alebo významne homogénnej kultúry buniek. Expresný vektor je všeobecne začlenený do hostiteľských buniek v zhode so známymi technikami, ako sú napríklad protoplastová transformácia, precipitácia kalcium fosfátom, reakcia s chloridom vápenatým, mikroinjikácia, elektroporácia, transfekcia kontaktom s rekombinovaným vírusom, transfekcia riadená lipozómom, transfekcia s DEAE dextránom, transdukcia, konjugácia alebo bombardovanie mikroprojektilmi. Voľba transformačných látok môže byť uskutočnená štandardnými postupmi, ako je napríklad pre bunky exprimujúci voliteľný marker voľba, napríklad antibiotické rezistencie združené s rekombinantným vektorom, ako je opísané skôr.

Akonáhle je expresný vektor začlenený do hostiteľskej bunky, môže byť integrácia a udržanie aveC kódujúcej sekvencie, buď v chromozóme hostiteľskej bunky, alebo epizomálne, potvrdená štandardnými technikami, napríklad Southern hybridizačnou analýzou, reštrikčnou enzýmovou analýzou, PCR analýzou zahŕňajúcou PCR s reverznou transkriptázou (rt-PCR), alebo imunologickou analýzou na účely detekcie očakávného génového produktu. Hostiteľské bunky obsahujúce a/alebo exprimujúce rekombinantnú aveC kódujúci sekvenciu, môžu byť identifikované ktorýmkoľvek z aspoň štyroch všeobecných prístupov, ktoré sú dobre známe v odbore, ktoré zahŕňajú: i) DNA-DNA, DNA-RNA, alebo RNA-antisensie RNA hybridizáciu, ii) detekciu prítomnosti funkčnosti „markerového“ génu, iii) posúdenie stupňa transkripcie meraním expresie aveC-špecifických mRNA transkriptov v hostiteľskej bunke a iv) detekciu prítomnosti zrelého polypetidového produktu napríklad imunoanalýzou alebo prítomnosťou AveC biologickej aktivity (ako je napríklad produkcia alebo špecifické pomery a množstvá avermektínov ukazujúce na AveC aktivitu v napríklad S. avermitilis hostiteľských bunkách).

Expresia a charakterizácia rekombinantného AveC génového produktu

Akonáhle bola stabilne vložená do príslušnej hostiteľskej bunky aveC kódujúcej sekvencie, je transformovaná hostiteľská bunka klonovo propagovaná, a výsledné bunky môžu rásť za podmienok pomáhajúcich maximálnej produkcii AveC génového produktu. Takéto podmienky typicky zahŕňajú rastúce bunky do vy12

SK 288086 Β6 sokej hustoty. Kde expresný vektor obsahuje induktibilný promotor, sú použité príslušné indukčné podmienky, ako sú napríklad teplotný posun, deplécia živín, pridanie bezdôvodných induktérov (ako sú napríklad analógy karbohydrátov, ako napríklad izopropyl-P-D-tiogalaktopyranosidu (IPTG)), akumulácia nadbytku metabolických vedľajších produktov, alebo podobne, ako je požadované na indukovanie expresie.

Kde je exprimovaný AveC génový produkt zadržaný vnútri hostiteľských buniek, sú tieto bunky zozbierané a zlyzované, a produkt je izolovaný a purifikovaný z lyzátu za extrakčných podmienok známych v odbore, aby sa minimalizovala degradácia bielkovín, ako sú napríklad teplota 4 °C alebo prítomnosť inhibítorov proteáz, alebo oboje. Kde je exprimovaný AveC génový produkt sekretovaný z hostiteľských buniek, môže byť vyčerpané živné médium jednoducho zobrané a produkt z neho môže byť izolovaný.

Exprimovaný AveC génový produkt môže byť izolovaný alebo významne purifikovaný podľa vhodnosti z bunkových lyzátov alebo kultivačného média s použitím štandardných spôsobov zahŕňajúcich, ale neobmedzujúcich sa na ktorúkoľvek kombináciu z nasledujúcich spôsobov: amonsulfátová precipitácia, fŕakcionácia podľa veľkosti, ionexová chromatografia, HPLC, denzitná centrifugácia a afinitná chromatografia. Kde exprimovaný AveC génový produkt vykazuje biologickú aktivitu, môže byť zvyšujúca sa čistota preparátu monitorovaná v každom kroku purifikačného postupu použitím ktorejkoľvek vhodnej analýzy. Či už exprimovaný AveC génový produkt vykazuje biologickú aktivitu alebo nie, môže byť detegovaný na základe napríklad veľkosti, alebo reaktivity s protilátkou inak špecifickou pre AveC, alebo pomocou prítomnosti fúznej náveste. Ako je tu používané, je AveC génový produkt „významne purifikovaný“ tam, kde produkt konštituje viac ako 20 váhových % bielkoviny v konkrétnom preparáte. Ako je tu tiež používané, je AveC génový produkt „izolovaný“, kde tento produkt konštituje aspoň 80 váhových % bielkoviny v konkrétnom preparáte.

Predkladaný vynález teda poskytuje rekombinantne- exprimovaný izolovaný alebo významne purifikovaný S. avermitilis AveC génový produkt obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu kódovanú AveC génový produkt-kódujúcou sekvenciou plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo aminokyselinovou sekvenciou z obrázku 1 (SEQ ID č. 2), alebo jej významnú časť a jej homológy.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje rekombinantne- exprimovaný izolovaný alebo významne purifikovaný S.hygroscopicus AveC homológny génový produkt obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID č. 4, alebo jej významnú časť a jej homológy.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob produkcie AveC génového produktu zahŕňajúci kultiváciu hostiteľskej bunky transformovanej rekombinantným expresným vektorom, kde zmienený vektor zahŕňa polynukleotidovú molekulu majúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt, a táto polynukleotidová molekula je v operačnom spojení s jedným alebo viacerými regulačnými elementmi, ktoré kontrolujú expresiu polynukleotidovej molekuly v hostiteľskej bunke za podmienok pomáhajúcich produkcii rekombinantného AveC génového produktu a získanie AveC génového produktu z bunkovej kultúry.

Rekombinantne exprimovaný 5. avermitilis AveC génový produkt je užitočný na celý rad účelov zahŕňajúcich vyhľadávanie zlúčenín, ktoré narušujú funkciu AveC génového produktu a tým modulujú biosyntézu avermektínov, a ďalej získavanie protilátok namierených proti AveC génovému produktu.

Akonáhle je AveC génový produkt s dostatočnou čistotou získaný, môže byť charakterizovaný štandardnými spôsobmi zahŕňajúcimi SDS-PAGE, chromatografiu na základe separácie podľa veľkosti, aminokyselinovú sekvenčnú analýzu, biologickú aktivitu v produkujúcich príslušných produktoch v biosyntetickej dráhe avermektínov atď. Amínokyselinová sekvencia AveC génového produktu môže byť napríklad určená s použitím štandardných sekvenčných techník pre peptidy. AveC génový produkt môže byť ďalej charakterizovaný s použitím analýzy hydrofility (pozri napríkad Hopp a Woods, 1981, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78:3824), alebo analogickým softvérovým algoritmom na účely identifikácie hydrofóbnych a hydrofilných oblastí AveC génového produktu. Štrukturálna analýza môže byť uskutočnená na účely identifikácie oblastí AveC génového produktu, ktoré sú zodpovedné za sekundárnu štruktúru. Na mapovanie a štúdium miest interakcií medzi AveC génovým produktom a jeho substrátom môžu byť použité biofyzikálne metódy, ako sú napríklad rôntgenová kryštalografia (Engstrom, 1974, Biochem Exp Biol 11:7-13) počítačové modelovanie (Fletterick a Zoller (eds), 1986, v: Current Communications in Molecular Biology, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) a nukleárna magnetická rezonancia (NMR). Informácie získané z týchto štúdií môžu byť použité na vybranie nových miest pre mutácie v aveC ORF, aby sa pomohlo vyvinúť nové kmene S. avermitilis majúce viac žiaduce charakteristiky produkcie avermektínov.

Konštrukcia a použitie AveC mutantov

Predkladaný vynález poskytuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako S. avermitilis aveC alela alebo jej degeneračný variant, alebo AveC génový produkt-kódujúca sekvencia plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo jej degeneračný variant, alebo nukleotidová sekvencia aveC ORF S. avermitilis, ako je prezentované na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo jej degeneračný variant, ale ktoré ďalej obsahujú jednu alebo viacej mutácií, takže bunky kmeňa S. avermitilis ATCC 53692, v ktorých bol divoký typ aveC alely inaktivovaný, a ktorý exprimuje polynukleotidovú molekulu obsahujúcu mutovanú nukleotidovú sekvenciu, alebo jej degeneračný variant, produkujú odlišný pomer alebo množstvo avermektí13

SK 288086 Β6 nov, ktoré sú produkované bunkami kmeňa 5. avermitilis ATCC 53692, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely.

Podľa predkladaného vynálezu môžu byť takéto polynukleotidové molekuly použité na produkciu nových kmeňov S. avermitilis, ktoré vykazujú detegovateľnú zmenu v produkcii avermektínov v porovnaní s rovnakým kmeňom, ktorý exprimuje len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu sú takéto polynukleotidové molekuly užitočné na produkciu nových kmeňov 5. avermitilis, ktoré produkujú avermektíny v zníženom pomere triedy 2 : 1 v porovnaní s rovnakým kmeňom, ktorý exprimuje len divoký typ aveC alely. V ďalšej prednostnej forme sú takéto polynukleotidové molekuly užitočné na produkciu nových kmeňov S. avermitilis, ktoré produkujú zvýšené množstvá avermektínov v porovnaní s rovnakým kmeňom, ktorý exprimuje len jediný divoký typ aveC alely. V ďalšej prednostnej forme sú takéto polynukleotidové molekuly užitočné na produkciu nových kmeňov S. avermitilis, v ktorých aveC gén inaktivovaný.

Mutácie aveC alely alebo kódujúcej sekvencie ktorejkoľvek mutácie, ktoré vedú na jednu alebo viac delícií, adícií alebo substitúcií do AveC génového produktu, alebo ktoré vedú na vznik skomoleného AveC génového produktu, alebo na ktorúkoľvek ich kombináciu, a ktoré vedú na požadovaný výsledok. Takéto mutované sekvencie aveC alely sú tiež zamýšľané, aby obsahovali ich degenerované varianty. Predkladaný vynález napríklad poskytuje polynukleotidové molekuly obsahujúce nukleotidovú sekvenciu aveC alely alebo jej degenerované varianty, alebo AveC génový produkt-kódujúcu sekvenciu plazmidu pSE186 (ATCC 209604), alebo jej degenerovaný variant, alebo nukleotidovú sekvenciu aveC ORF S. avermitilis, ako je uvedené na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo jej degenerovaný variant, ale ktoré ďalej obsahujú jednu alebo viacej mutácií, ktoré kódujú substitúciu aminokyselinového rezídua odlišným aminokyselinovým rezíduom vo zvolených pozíciách v AveC génovom produkte. V niekoľkých neobmedzujúcich formách vynálezu, z ktorých niekoľko je uvedených príkladom neskôr, môžu byť takéto substitúcie uskutočnené v ktorýchkoľvek aminokyselinových pozíciách AveC génového produktu, ktoré korešpondujú s aminokyselinovými pozíciami 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 alebo 298 sekvencie SEQ ID č. 2, alebo niektorými ich kombináciami.

Mutácie aveC kódujúcej sekvencie sú uskutočnené ktoroukoľvek zo známych metód zahŕňajúcich použitie PCR náchylnej na chyby, alebo kazetovej mutagenézie. Na narušenie sekvencie aveC alely alebo ORF definovaným spôsobom, napríklad vložením jedného alebo viacerých reštrikčných miest, alebo terminačného kodónu, do špecifických oblastí v aveC alele alebo ORF môže byť napríklad použitá mutagenézia riadená oligonukleotidom. Na tvorbu veľkých knižníc polynukleotidov majúcej nukleotidové sekvencie kódujúce aveC mutácie môžu byť tiež použité metódy napríklad opísané v patentoch US Patent 5605793, US Patent 5830721 a US Patent 5837458, ktoré zahŕňajú náhodnú fragmentáciu, opakované cykly mutagenézie a nukleotidové premiestňovanie.

Užitočné môžu byť cielené mutácie, zvlášť tam, kde slúžia na narušenie jedného alebo viacerých konzervovaných aminokyselinových rezíduí v AveC génovom produkte. Napríklad porovnanie odvodených aminokyselinových sekvencií AveC génových produktov a AveC homológnych génových produktov zo S. avermitilis (SEQ ID č. 2), S. griseochromogenes (SEQ ID č. 5) a S. hygroscopicus (SEQ ID č. 4), ako sú uvedené na obrázku 6, ukazuje miesta významnej konzervácie aminokyselinových rezíduí medzi týmito druhmi. V tvorbe nových mutovaných kmeňov, ktoré vykazujú požadované alterácie produkcie avermektínov môže byť zvlášť účinná cielená mutagenézia, ktorá vedie na zmenu v jednom alebo viacerých týchto konzervovaných aminokyselinových rezíduí.

Užitočná môže byť tiež náhodná mutagenézia, ktorá môže byť uskutočnená expozíciou buniek S. avermitilis ultrafialovému žiareniu alebo rôntgenovému žiareniu, alebo chemickým mutagénom, ako sú napríklad N-metyl-N'-nitrosoguanidín, etyl metán sulfonát, kyselina dusičná alebo nitrogén mustard. Na zhrnutie techník mutagenézie pozri napríklad Ausubel, 1989 vyššie.

Akonáhle sú mutované polynukleotidové sekvencie generované, sú prehliadané, aby sa určilo, či môžu modulovať biosyntézu avermektínov v S. avermitilis. V prednostnej forme vynálezu je polnukleotidová molekula majúca mutovanú nukleotidovú sekvenciu testovaná komplementáciou kmeňa 5. avermitilis, v ktorom bol aveC gén inaktivovaný za vzniku aveC negatívneho (aveC‘) pozadia. V neobmedzujúcom spôsobe je mutovaná polynukleotidová molekula zostrihaná do expresného plazmidu v operačnom spojení s jedným alebo viacerými regulačnými elementmi, a tento plazmid tiež prednostne obsahuje jeden alebo viacej génov na liekovú rezistenciu, ktoré umožňujú výber transformovaných buniek. Tento vektor je potom transformovaný do aveC hostiteľských buniek pomocou známych techník a transformované bunky sú vybrané a kultivované v príslušnom fermentačnom médiu za podmienok, ktoré umožňujú alebo indukujú produkciu avermektínov. Fermentačné produkty sú potom analyzované pomocou HPLC, aby sa určila schopnosť mutovanej polynukleotidovej molekuly na komplementáciu hostiteľskej bunky. Niektoré vektory nesúce mutované polynukleotidové molekuly schopné znížiť B2 : Bi pomer avermektínov zahŕňajúci pSE 188, pSE 199, pSE 231, pSE 239 a pSE 290 až pSE 297, ako je uvedené príkladom v časti 8,3 neskôr.

Predkladný vynález poskytuje spôsoby identifikácie mutácií S. avermitilis aveC ORF schopných narušiť pomer a/alebo množstvo produkovaných avermektínov. V prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález

SK 288086 Β6 spôsob identifikácie mutácií schopných narušiť pomer triedy 2 : 1 produkovaných avermktínov, a tento spôsob zahŕňa (a) určenie pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorých bola natívna aveC alela inaktivovaná, a do ktorých bola vložená polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutovaný AveC génový produkt, a táto molekula je exprimovaná, (b) určenie pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis ako v kroku (a), ale a tieto bunky miesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely alebo ORF z obrázku 1 (SEQ ID č. 1), alebo nukleotidovú sekvenciu, ktorá je k ORF homológna a (c) porovnanie pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (a) s pomerom triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (b), takže keď je pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami 5. avermitilis z kroku (a) odlišný od pomeru triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (b), potom môže byť identifikovaná mutácia aveC ORF schopná zmeniť pomer triedy 2 : 1 avermektínov. V prednostnej forme vynálezu je pomer triedy 2 : 1 avermektínov touto mutáciou znížený.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález spôsob identifikácie mutácií aveC ORF alebo genetických konštruktov obsahujúcich aveC ORF schopné zmeniť množstvo produkovaných avermektínov, a tento spôsob zahŕňa: (a) určenie množstva avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorých bola natívna aveC alela inaktivovaná, a do ktorých bola vložená polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutovaný AveC génový produkt, alebo obsahujúca genetický konštrukt zahŕňajúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu AveC génový produkt a táto molekula je exprimovaná, (b) určenie množstva avermektínov produkovaných rovnakým kmeňom 5. avermitilis ako v kroku (a), ale tento kmeň miesto toho exprimuje len divoký typ aveC alely alebo homológnu nukleotidovú sekvenciu a (c) porovnanie množstva avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (a) s množstvom avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (b), takže keď je množstvo avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (a) odlišné od množstva avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis z kroku (b), potom môže byť identifikovaná mutácia aveC ORF alebo genetického konštruktu schopná zmeniť pomer triedy 2 : 1 avermektínov. V prednostnej forme vynálezu je produkované množstvo avermektínov touto mutáciou zvýšené.

Ktorýkoľvek z uvedených spôsobov na identifikáciu mutácií môže byť uskutočnený s použitím fermentačného kultivačného média prednostne suplementovaného cyklohexan karboxylovou kyselinou, aj keď môžu byť použité aj iné vhodné prekurzory mastných kyselín, ako sú napríklad ktorékoľvek prekurzory mastných kyselín uvedených v tabuľke 1.

Akonáhle je identifikovaná mutovaná polynukleotidová molekula, ktorá moduluje produkciu avermektínov žiaducim smerom, môže byť určené umiestnenie mutácie v nukleotidovej sekvencií. Polynukleotidová molekula majúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu mutovaný AveC génový produkt môže byť napríklad izolovaná pomocou PCR a podrobená DNA sekvenčnej analýze s použitím známych spôsobov. Mutácia zodpovedná(é) za alteráciu produkcie avermektínov môže byť určená porovnaním DNA sekvencie mutovanej aveC alely so sekvenciou divokého typu aveC alely. V špecifických, ale neobmedzujúcich formách predkladaného vynálezu viedli S. avermitilis AveC génové produkty obsahujúce buď jedinú aminokyselinovú substitúciu v ktoromkoľvek z rezíduí 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T), alebo 230 (G23 OD), alebo dve substitúcie v pozíciách 138 (S138T) a 139 (A139T alebo A139F) na zmeny vo funkcii AveC génového produktu, takže pomer triedy 2 : 1 produkovaných avermektínov bol narušený (pozri časť 8), kde uvedené aminokyselinové pozície korešpondujú s pozíciami na obrázku 1 (SEQ ID č. 2). Navyše bolo preukázané, že nasledujúcich sedem kombinácií mutácií účinne znižuje pomer triedy 2 : 1 avermektínov: 1) D48E, 2) S138T/A139T/G179S, 3) Q38P/L136P/E238D, 4) F99S/S138T/A139T/G179S, 5) A139T/M228T, 6) G111V/P289T. Ako je tu používané, uvedené označenia, ako napríklad A139T, ukazujú pôvodné aminokyselinové rezíduum jednopísmenovým označením, v ktorom je v tomto prípade alanín (A) v uvedenej pozícii, ktorá je v tomto prípade pozícia 139 (týka sa SEQ ID č. 2) polypeptidu, a nasleduje aminokyselinové rezíduum, ktoré nahradzuje pôvodné aminokyselinové rezíduum, ktorým je v tomto prípade treonín (T). Z tohto dôvodu sú polynukleotidové sekvencie majúce nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú mutované S. avermitilis génové produkty obsahujúce aminokyselinové substitúcie alebo delécie v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozícií 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289, alebo 298 (pozri obrázok 1), alebo ktorékoľvek ich kombinácie, zahrnuté predkladaným vynálezom.

V prednostnej forme vynálezu kódujú takéto mutácie aminokyselinové substitúcie vyrané z jednej alebo viacerých skupín obsahujúce:

(a) aminokyselinové rezíduum Q v pozícii 38 nahradené P alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre P, (b) aminokyselinové rezíduum D v pozícii 48 nahradené E alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre E, (c) aminokyselinové rezíduum A v pozícii 89 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (d) aminokyselinové rezíduum F v pozícii 99 nahradené S alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre S, (e) aminokyselinové rezíduum G v pozícii 111 nahradené V alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre V, (f) aminokyselinové rezíduum L v pozícii 136 nahradené P alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre P, (g) aminokyselinové rezíduum S v pozícii 138 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (h) aminokyselinové rezíduum A v pozícii 139 nahradené T alebo F alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T alebo F, (i) aminokyselinové rezíduum K v pozícii 154 nahradené E alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre E, (j) aminokyselinové rezíduum G v pozícii 179 nahradené S alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre S, (k) aminokyselinové rezíduum M v pozícii 228 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (l) aminokyselinové rezíduum E v pozícii 238 nahradené D alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre D, (m) aminokyselinové rezíduum P v pozícii 289 nahradené L alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre L a (n) aminokyselinové rezíduum Q v pozícii 298 nahradené H alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre H, kde konzervatívne aminokyselinové substitúcie sú rovnaké, ako je definované skôr v Sekcii 5.1.

V ďalšej prednostnej forme vynálezu kódujú takéto mutácie kombináciu aminokyselinových substitúcií, kde kombinácia substituovaných aminokyselinových rezíduí je vybraná zo skupiny obsahujúcej:

(a) aminokyselinové rezíduá S138 a A139, (b) aminokyselinové rezíduá D48 a A89, (c) aminokyselinové rezíduá S138 a A139 a G179, (d) aminokyselinové rezíduá Q38, L136 a E238, (e) aminokyselinové rezíduá F99, S138, A139 a G179, (f) aminokyselinové rezíduá A139 a M228, (g) aminokyselinové rezíduá G111 a P289 a (h) aminokyselinové rezíduá A139, K154 a Q298.

V ďalšej prednostnej forme vynálezu sú špecifické kombinácie mutácií aveC alely užitočné na efektívne zníženie pomeru triedy 2 : 1 avermektínov podľa predkladaného vynálezu vybranej z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

(a) S138T/A139T, (b) S138T/A139F, (c) D48E/A89T, (d) S138T/A139T/G179S, (e) Q38P/L136P/E238D, (f) F99S/S138T/A139T/G179S, (g) A139T/M228T, (h) G111V/P289L a (i) A139T/K154E/Q298H.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje preparáty na prípravu nových kmeňov 5. avermitilis, ktorých bunky obsahujú mutovanú aveC alelu, ktorá vedie na narušenie produkcie avermektínov. Predkladaný vynález napríklad poskytuje rekombinantné vektory, ktoré môžu byť použité na zacielenie ktorejkoľvek polynukleotidovej molekuly obsahujúcej mutované nukleotidové sekvencie, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu na miesto aveC génu chromozómu S. avermitilis buď na inzerciu alebo na nahradenie aveC ORF alebo jeho časti pomocou homológnej rekombinácie. Podľa predkladaného vynálezu ale môže polynukleotidová molekula obsahujúca tu poskytnutú mutovanú nukleotidovú sekvenciu, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, tiež modulovať biosyntézu avermektínov, keď je inzerovaná do chromozómu v mieste inom, ako je aveC gén, alebo keď je udržiavaná epizomálne v bunkách S. avermitilis. Predkladaný vynález teda tiež poskytuje vektory obsahujúce polynukleotidovú molekulu obsahujúcu mutovanú nukleotidovú sekvenciu, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, a tieto vektory môžu byť použité na inzerciu polynukleotidovej molekuly na miesto v chromozóme 5. avermitilis inej, ako je aveC gén, alebo môžu byť udržiavané epizomálne.

V prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález vektory na náhradu génov, ktoré môžu byť použité na inzerciu mutovanej aveC alely alebo jej degenerovaného variantu do buniek kmeňa 5. avermitilis, čím dochádza na tvorbu nových kmeňov S. avermitilis, ktorých bunky produkujú avermektíny v narušenom pomere

SK 288086 Β6 triedy 2 : 1 v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktorý miesto toho exprimuje len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme je pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami znížený. Takéto vektory nahradzujúce gény môžu byť konštruované s použitím mutovaných polynukleotidových molekúl prítomných v tu poskytnutých expresných vektoroch, ako sú napríklad pSE188, pSE199 a pSE231, a tieto expresné vektory sú uvedené príkladom v časti 8 neskôr.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález vektory, ktoré môžu byť použité na inzerciu mutovanej aveC alely alebo jej degenerovaného variantu do buniek kmeňa S. avermitilis na tvorbu nových kmeňov buniek, ktoré produkujú avermektíny v narušenom množstve v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktorý miesto toho exprimuje len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme je množstvo avermektínov produkovaných bunkami zvýšené. V špecifickej, ale neobmedzujúcej forme vynálezu zahŕňa taký vektor silný promotor, ako je známy v odbore, ako je napríklad silný konštitutívny ermE promotor z Sacharopolysora erythraea, ktorý je situovaný v smere hore od a v operačnom spojení s aveC alelou. Takým vektorom môže byť pSE189, opísaný v príklade uskutočnenia vynálezu 11 neskôr, alebo môže byť konštruovaný s použitím mutovanej aveC alely plazmidu pSE189.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález vektory na náhradu génov, ktoré sú užitočné na inaktiváciu aveC génu divokého typu kmeňa S. avermitilis. V neobmedzujúcej forme vynálezu môžu byť takéto vektory nahradzujúce gén skonštruované s použitím mutovanej polynukleotidovej molekuly prítomnej v plazmide pSE180 (ATCC 209605), ktorá je uvedená príkladom v časti 8.1 (obrázok 3). V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález vektory na náhradu génov, ktoré zahŕňajú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu alebo skladajúcu sa z nukleotidových sekvencií, ktoré prirodzene hraničia s aveC génom in situ v chromozóme S. avermitilis, a zahŕňajú napríklad hraničiace nukleotidové sekvencie uvedené na obrázku 1 (SEQ ID č. 1), a tieto vektory môžu byť použité na vymazanie S. avermitilis aveC ORF.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsoby na prípravu nových kmeňov S. avermitilis zahŕňajúce bunky, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu, a ktoré produkujú porušený pomer a/alebo množstvo avermektínov v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález spôsob na prípravu nových kmeňov S. avermitilis zahŕňajúci bunky, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu, a ktoré produkujú porušený pomer triedy 2 : 1 avermektínov v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely, ďalej zahŕňajúci transformujúce sa bunky kmeňa S. avermitilis s vektorom, ktorý nesie mutovanú aveC alelu kódujúcu génový produkt, ktorý narušuje pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami kmeňa 5. avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely, a vybranie transformovaných buniek, ktoré produkujú narušený pomer triedy 2 : 1 v porovnaní s pomerom triedy 2 : 1 produkovaným bunkami kmeňa, ktorý exprimuje len divoký typ aveC alely. V prednostnejšej forme poskytuje predkladaný vynález spôsob na prípravu nového kmeňa S. avermitilis zahŕňajúci transformujúce sa bunky kmeňa S. avermitilis s vektorom schopným vytvoriť mutáciu v aveC alele takých buniek, kde mutácia aveC alely vedie na substitúciu v kódovanom AveC génovom produkte rôzneho aminokyselinového rezídua v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozíciách zodpovedajúcich aminokyselinovým rezíduám 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289, alebo 298 so sekvenciou SEQ ID č. 2, takže bunky kmeňa S. avermitilis, v ktorých bola aveC alela mutovaná, produkujú pomer triedy 2:1, ktorý je odlišný od pomeru produkovaného bunkami rovnakého kmeňa S. avermitilis, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu je znížený pomer triedy 2 : 1 avermektínov.

Ako je tu používané, tam, kde aminokyselinové rezíduum kódované aveC alelou v chromozóme S. avermitilis, alebo vo vektore alebo izolovanej polynukleotidovej molekule, ktorá je predmetom predkladaného vynálezu, je označované ako „zodpovedajúce“ konkrétnemu aminokyselinovému rezíduu so sekvenciou SEQ ID č. 2, alebo kde aminokyselinová substitúcia je označovaná ako vyskytujúca sa v konkrétnej pozícii „zodpovedajúce“ špecifickému očíslovanému aminokyselinovému rezíduu so sekvenciou SEQ ID č. 2, týka sa aminokyselinové rezíduum rovnakého relatívneho umiestnenia v AveC génovom produkte, ktorý osoba pohybujúca sa v odbore môže rýchle určiť pomocou odkazu na aminokyselinovú sekvenciu prezentovanú tu ako SEQ ID č. 2.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsoby na prípravu nových kmeňov, kde špecifické mutácie v aveC alele kódujúcej konkrétne mutácie sú uvádzané ako základné zmeny v špecifických nukleotidových pozíciách v aveC alele „zodpovedajúcej“ konkrétnym nukleotidovým pozíciám, ako je uvedené v sekvencií SEQ ID č. 1. Ako je uvedené skôr, s ohľadom na zodpovedajúce aminokyselinové pozície, kde nukleotidová pozícia v aveC alele je uvádzaná ako „zodpovedajúca“ konkrétnej nukleotidovej pozícii v sekvencií SEQ ID č. 1, týka sa nukleotidov rovnakého relatívneho umiestnenia v aveC nukleotidovej sekvencií, ktorú môže osoba pohybujúca sa v odbore rýchle určiť pomocou odkazu na nukleotidovú sekvenciu prezentovanú tu ako sekvencia SEQ ID č. 1.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález spôsob na prípravu nových kmeňov S. avermitilis zahŕňajúci bunky, ktoré produkujú porušené množstvá avermektínov, zahŕňajúci transformujúce sa

SK 288086 Β6 bunky kmeňa 5. avermitilis s vektorom, ktorý nesie mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktorej expresia vedie na narušenie množstva avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S. avermitilis exprimujúcimi mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely, a vybranie transformovaných buniek, ktoré produkujú avermektíny v narušenom množstve v porovnaní s množstvom avermektínov produkovaným bunkami kmeňa, ktorý exprimuje len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu je zvýšené množstvo avermektínov produkovaných transformovanými bunkami.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález spôsob na prípravu nových kmeňov 5. avermitilis, ktorých bunky obsahujú inaktivovanú aveC alelu, zahŕňajúcu transformujúce sa bunky kmeňa 5. avermitilis, ktoré exprimujú ktorúkoľvek aveC alelu s vektorom, ktorý inaktivuje aveC alelu, a vybranie transformovaných buniek, v ktorých bola aveC alela inaktivovaná. V prednostnejšej, ale neobmedzujúcej forme vynálezu sú bunky kmeňa S. avermitilis transformované vektorom nahrazujúcim gén, ktorý nesie aveC alelu, ktorá bola inaktivovaná mutáciou alebo náhradou časti aveC alely heterológnou génovou sekvenciou, a sú vybrané transformované bunky, v ktorých bola inak natívna aveC alela nahradená inaktivovanou aveC alelou. Inaktivácia aveC alely môže byť určená HPLC analýzou fermentačných produktov, ako je opísané neskôr. V špecifickej, ale neobmedzujúcej forme vynálezu opísanej v časti 8.1 neskôr, bola aveC alela inaktivovaná inzerciou ermE génu zo Sacharopolyspora erythraea do aveC ORF.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje nové kmene S. avermitilis zahŕňajúce bunky, ktoré boli transformované ktorýmikoľvek polynukleotidovými molekulami alebo vektormi, ktoré sú predmetom predkladaného vynálezu. V prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález nové kmene S. avermitilis zahŕňajúce bunky, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu, alebo jej degenerovaný variant na miesto alebo navyše k divokému typu aveC alely, kde bunky nového kmeňa produkujú avermektíny v narušenom pomere triedy 2 : 1 v porovnaní s pomerom triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu je znížený narušený pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný novými bunkami. Takéto nové kmene sú užitočné na produkciu komerčne žiaducich avermektínov, ako je napríklad doramektín, vo veľkej miere. V prednostnejšej forme poskytuje predkladaný vynález nové kmene S. avermitilis zahŕňajúce ktorúkoľvek zo skôr uvedených mutácií alebo kombináciu mutácií v aveC alele v nukleotidových pozíciách zodpovedajúcich pozíciám prezentovaných skôr, alebo ktoré inak kódujú ktorúkoľvek zo skôr uvedených aminokyselinových substitúcií AveC génového produktu. Aj keď takéto mutácie môžu byť prítomné v takých bunkách na extrachromozomálnej časti, ako je napríklad plazmid, je preferované, že takéto mutácie sú prítomné v aveC alele lokalizovanej na chromozóme S. avermitilis. V prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález kmeň Streptomyces avermitilis zahŕňajúci bunky mutácií v aveC alele, ktorá kóduje AveC génový produkt majúci substitúciu v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozíciách zodpovedajúcich aminokyselinovým rezíduám 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289, alebo 298 v sekvencií SEQ ID č. 2, kde bunky produkujú pomer triedy 2 : 1 avermetínov, ktorý je odlišný od pomeru produkovaného bunkami rovnakého kmeňa 5. avermitilis, ktorý exprimuje divoký typ aveC alely.

Primárnym cieľom vyhľadávacích analýz tu opísaných je identifikovať mutované alely aveC génu, ktorých expresia je v bunkách 5. avermitilis narušená a konkrétnejšie dochádza na zníženie pomeru triedy 2 : 1 avermektínov. V prednostnej forme vynálezu je pomer B2 .B1 avermektínov produkovaných bunkami nového kmeňa 5. avermitilis, ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, a ktorý exprimuje mutovanú aveC alelu alebo jej degenerovaný variant, a ktorý je predmetom predkladaného vynálezu, zhruba 1,6 : 1 alebo menej. V prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,84 : 1 alebo menej. V prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,80 : 1 alebo menej. V prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,75 : 1 alebo menej. V prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,73 : 1 alebo menej. V prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,68 : 1 alebo menej. V ešte prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,67 : 1 alebo menej. V prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,57 : 1 alebo menej. V ešte prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,53 : 1 alebo menej. V ešte prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,42 : 1 alebo menej. V ešte prednostnejšej forme vynálezu je pomer 0,40 : 1 alebo menej.

V špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2: cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 1,6 : L V odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,94 : 1. V ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,88 : L V ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,84 : 1. V ešte ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,75 : 1. V ešte ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,73 : 1. V ešte ďalšej odlišnej špecifickej forme vy18 nálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,68 : 1. V ešte ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,67 : 1. V ešte ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,57 : 1. V ešte ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,53 : 1. V ešte ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,42 : 1. V ešte ďalšej odlišnej špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr produkujú nové bunky, ktoré sú predmetom vynálezu, cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere menšom ako 0,40 : 1.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález nové kmene S. avermitilis zahŕňajúce bunky, ktoré exprimujú mutovanú aveC alelu, alebo jej degenerovaný variant, alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu alebo jej degenerovaný variant na miesto alebo navyše k divokému typu alely, kde bunky nového kmeňa produkujú narušené množstvá avermektínov v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely. V prednostnej forme vynálezu produkuje nový kmeň zvýšené množstvá avermektínov. V neobmedzujúcej forme vynálezu zahŕňa genetický konštrukt silný promotor, ako je napríklad silný konštitutívny promotor ermE zo Sacharopolyspora erythraea v smere hore a v operačnom spojení s aveC ORF.

V ďalšej prednostnej forme poskytuje predkladaný vynález nové kmene S. avermitilis zahŕňajúce bunky, v ktorých bol aveC gén inaktivovaný. Takéto kmene sú užitočné na rozličné spektrum avermektínov, ktoré produkujú v porovnaní s divokým typom kmeňa aj na komplementáciu vyhľadávacích analýz, ako je tu opísané, aby sa určilo, či cielená alebo náhodná mutagenézia aveC génu ovplyvňuje produkciu avermektínov. V špecifickej forme vynálezu opísanej neskôr boli hostiteľské bunky S. avermitilis geneticky upravené, aby obsahovali inaktivovaný aveC gén. Napríklad kmeň SE180-11 opísaný v príkladoch bol generovaný s použitím plazmidu pSE180 nahradzujúceho gén (ATCC 209605) (obrázok 3), ktorý bol konštruovaný, aby inaktivoval S. avermitilis aveC gén inzerciou génu ermE rezistencie do aveC kódujúcej oblasti.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje rekombinantne exprimované mutované 5. avermitilis AveC génové produkty kódované ktoroukoľvek z uvedených polynukleotidových molekúl, ktoré sú predmetom vynálezu a spôsoby ich prípravy.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje postup produkcie avermektínov zahŕňajúci kultiváciu buniek kmeňa S. avermitilis, a tieto bunky exprimujú mutovanú aveC alelu, ktorá kóduje génový produkt, ktorý narušuje pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami S. avermitilis exprimujúcich mutovanú aveC alelu v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely, v kultivačnom médiu za podmienok, ktoré umožňujú alebo indukujú produkciu avermektínov z týchto buniek. V prednostnej forme vynálezu je znížený pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných v kultúre bunkami exprimujúcimi mutovanú aveC alelu. Tento spôsob poskytuje zvýšenú účinnosť v produkcii komerčne cenných avermektínov, ako je napríklad doramektín.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje postup produkcie avermektínov zahŕňajúci kultiváciu buniek kmeňa S. avermitilis, a tieto bunky exprimujú mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt obsahujúci aveC alelu, ktorá vedie na produkciu narušeného množstva avermektínov produkovaných bunkami kmeňa S. avermitilis exprimujúcich mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré neexprimujú mutovanú aveC alelu alebo genetický konštrukt, ale miesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely, v kultivačnom médiu za podmienok, ktoré umožňujú alebo indukujú produkciu avermektínov z týchto buniek, a získanie zmienených avermektínov z kultúry. V prednostnej forme vynálezu je zvýšené množstvo avermektínov produkovaných v kultúre bunkami exprimujúcimi mutovanú aveC alelu, degenerovaný variant alebo genetický konštrukt.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje nový preparát avermektínov produkovaných kmeňom 5. avermitilis exprimujúcim mutovanú aveC alelu alebo jej degenerovaný variant, ktorá kóduje génový produkt, ktorý znižuje pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami kmeňa 5. avermitilis exprimujúcich mutovanú aveC alelu alebo jej degenerovaný variant v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa, ktoré miesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely, kde avermektíny v novom preparáte sú produkované v zníženom pomere triedy 2 : 1 v porovnaní s pomerom triedy 2 : 1 avermektínov produkovaných bunkami rovnakého kmeňa 5. avermitilis, ktoré miesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely. Nový avermektínový preparát môže byť prítomný, ako je produkovaný vo vyčerpanej fermentačnej kultivačnej tekutine, alebo z nej môže byť stiahnutý. Nový avermektínový preparát môže byť čiastočne alebo významne purifikovaný z kultivačnej tekutiny pomocou známych biochemických techník purifikácie, ako sú napríklad precipitácie amónium sulfátom, dialýza, frakcionácia podľa veľkosti, ionexová chromatografia, HPLC atď.

SK 288086 Β6

Použitie avermektínov

Avermektíny sú vysoko aktívne antiparazitáme látky majúce zvláštne využitie ako antihelmintiká, ektoparaziticídy, insekticídy a akaricídy. Avermektínové zlúčeniny produkované podľa spôsobov predkladaného vynálezu sú užitočné na ktorýkoľvek z týchto účelov. Avermektínové zlúčeniny produkované podľa predkladaného vynálezu sú užitočné napríklad na liečbu rôznych ochorení alebo stavov človeka, zvlášť tých, ktoré sú spôsobené parazitickými infekciami, ako je známe v odbore. Pozri napríklad Ikeda a Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7):2591-2609. Konkrétnejšie avermektínové zlúčeniny produkované podľa predkladaného vynálezu sú účinné v liečbe celého radu ochorení alebo stavov spôsobených endoparazitmi, ako sú napríklad parazitické nematódy, ktoré môžu infikovať človeka, domáce zvieratá, prasce, ovce, hydinu, kone alebo dobytok.

Špecifickejšie avermektínové zlúčeniny produkované podľa predkladaného vynálezu sú účinné nematódam, ktoré infikujú človeka, rovnako tak ako nematódy, ktoré infikujú rôzne druhy živočíchov. Také nematódy zahŕňajú gastrointestinálne parazity, ako sú napríklad Ancylostoma, Necatotor, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria a parazity, ktoré sa nachádzajú v krvi iných tkanív a orgánov, ako sú napríklad filariálne červy a črevové formy Strongyloides a Trichinella.

Avermektínové zlúčeniny produkované podľa predkladaného vynálezu sú tiež účinné v liečbe ektoparazitických infekcií zahŕňajúcich napríklad infestáciu savcov a vtákov artropódy, spôsobenej kliešťami, roztočmi, všami, blchami, mäsiarkami, bodavým hmyzom alebo migrujúcimi larvami dvojkrídlového hmyzu, ktoré môžu napadnúť medzi iným dobytok a kone.

Avermektínové zlúčeniny produkované podľa predkladaného vynálezu sú tiež užitočné ako insekticídy proti domácim škodcom, ako sú napríklad medzi iným šváby, mole, kobercové chrobáky a domáce muchy, rovnako tak ako hmyz napádajúci uskladnené zrno a poľnohospodárske rastliny, a tieto škodce zahŕňajú medzi inými roztoče, vošky, húsenice a hmyz z rodu Ortoptera, ako sú napríklad kobylky.

Zvieratá, ktoré môžu byť liečené avermektínovými zlúčeninami produkovanými podľa vynálezu, zahŕňajú ovce, dobytok, jelene, kozy, prasce, vtáky vrátane hydiny a psy a mačky.

Avermektínová zlúčenina produkovaná podľa predkladaného vynálezu je podávaná v preparáte vhodnom na špecifické zamýšľané použitie, konkrétny druh hostiteľského zvieraťa, ktoré má byť liečené a parazitu alebo hmyzu, ktorý je infekčným agens. Na použitie ako paraziticídum môže byť avermektínová zlúčenina produkovaná podľa predkladaného vynálezu podávaná vo forme kapsuly, bólu, tablety alebo tekutého lieku, alebo môže byť alternatívne podaná ako forma polievacia, injekčná alebo ako implantát. Takéto formy sú pripravené konvenčným spôsobom v zhode so štandardnou veterinárnou praxou. Kapsuly, bolusy alebo tablety môžu byť teda pripravené zmiešaním aktívnej zložky s vhodnou presne rozdelenou riediacou látkou alebo s nosičom, ďalej obsahujúcim dezintegračnú látku a/alebo väzbovú látku, ako sú napríklad škrob, laktóza, mastenec, magnézium stearát atď. Namáčacie preparáty môžu byť pripravené disperziou aktívnej zložky vo vodnom roztoku spolu s napríklad dispergujúcou alebo zvlhčujúcou látkou. Injekčné preparáty môžu byť pripravené vo forme sterilného roztoku, ktorý môže obsahovať ďalšie substancie, ako sú napríklad dostatočné soli a/alebo glukóza, aby mohol byť pripravený roztok izotonický s krvou.

Takéto preparáty sa líšia váhou aktívnej zlúčeniny v závislosti od pacienta, druhu hostiteľského zvieraťa, ktoré má byť liečené, závažnosti a typu infekcie a telesnej hmotnosti hostiteľa. Všeobecne je na perorálne podanie dostatočná dávka aktívnej zlúčeniny od zhruba 0,001 do 10 mg na kg telesnej hmotnosti pacienta alebo zvieraťa podanej ako jedna dávka alebo rozdelene počas od 1 do 5 dní. Môžu ale nastať prípady, kde je indikované vyššie alebo nižšie dávkovacie rozmedzie, ako je určené napríklad lekárom alebo veterinárom podľa klinických príznakov.

Ako alternatíva môže byť avermektínová zlúčenina produkovaná podľa predkladaného vynálezu podaná v kombinácii s krmivom pre zvieratá a na tento účel môže byť pripravené koncentrované krmivové aditívum alebo premix na zmiesenie s normálnym krmivom pre zvieratá.

Na použitie ako insekticídum a na liečbu poľnohospodárskych škodcov môže byť avermektínová zlúčenina produkovaná podľa predkladaného vynálezu podaná ako sprej, prášok, emulzia a podobne v zhode so štandardnou poľnohospodárskou praxou.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Fermentácia Streptomyces avermitilis a analýza B2:B1 avermektínov

Kmene bez aktivity dehydrogenázy vetvených 2-oxo kyselín aj 5-0-metyltransfreázy neprodukujú žiadne avermektíny, pokiaľ fermentačné médium nie je suplementované mastnými kyselinami. Tento príklad demonštruje, že pre také mutanty môže byť získané široké spektrum pomerov B2 : B1 avermektínov, keď je fermentácia začaná v prítomnosti rôznych mastných kyselín.

Materiál a metodika

Bunky Streptomyces avermitilis ATCC 53692 boli skladované pri teplote -70 °C ako plný bujón pripravený v očkovacom médií zloženom z: škrobu (Nadex, Laing National) - 20g; Pharmamedia (Trader's Proteín, Memphis, TN) - 15 g; Ardamin pH (Yeast Products Inc.) - 5 g; uhličitanu vápenatého - 1 g. Finálny objem bol upravený na 1 liter tečúcou vodou, pH bolo upravené na 7,2 a médium bolo autoklávované pri teplote 121 °C počas 25 minút.

Na inokuláciu nádoby obsahujúcej rovnaké médium boli použité dva ml rozmrazenej suspenzie uvedeného preparátu. Po 48 hodinách inkubácie pri teplote 28 °C na rotačnej trepačke pri rýchlosti 180 rpm, boli použité 2 ml bujónu na inokuláciu nádoby obsahujúcej 50 ml produkčného média obsahujúceho: škrob - 80 g; uhličitan vápenatý - 7 g; Pharmamedia - 5 g; hydrogen fosfát draselný - 1 g; síran horečnatý - 1 g; kyselina glutamová - 0,6 g; heptahydrát síranu železnatého - 0,01 g; síran zinočnatý - 0,001 g; síran manganatý - 0,001 g. Finálny objem bol upravený do 1 litra tečúcou vodou, pH bolo upravené na 7,2 a médium bolo autoklávované pri teplote 121 °C počas 25 minút.

Rozličné substráty karboxylovej kyseliny (pozri tabuľka 1) boli rozpustené v metanole a pridané do fermentačného bujónu 24 hodín po inokulácii za vzniku finálnej koncentrácie 0,2 g/liter. Fermentačný bujón bol inkubovaný 14 dní pri teplote 28 °C, potom bol bujón scentrifúgovaný (2500 rpm, počas 2 minút) a supematant bol odstránený. Mycéliová peleta bola extrahovaná acetónom (15 ml), potom dichlórmetánom (30 ml) a organická fáza bola separovaná, sfiltrovaná, a potom odparená do sucha. Rezíduum bolo extrahované do metanolu (1 ml) a analyzované pomocou HPLC pomocou kvapalinového chromatografu Hewlett-Packard 1090A vybavenom skenovacím diode-array detektorom pri 240 nm. Bola použitá kolóna Beckman Ultrasphere C-18, 5 um, 4,6 mm x 25 cm, teplota kolóny bola udržiavaná na 40 °C. Na kolónu bolo injikovaných 25 μΐ uvedeného metanolického roztoku. Elúcia bola uskutočnená lineárnym gradientom metanol-voda z pomeru 80 : 20 do 95 : 5 počas 40 minút pri prietoku 0,85 ml/minútu. Na kalibráciu odpovede detektora boli použité dve štandardné koncentrácie cyklohexylu B1 a bola meraná plocha pod krivkami B2 a B1 avermektínov.

Výsedky

HPLC retenčné časy pozorované pre B2 a B1 avermektíny a pomery 2 : 1 sú uvedené v tabuľke 1

Tabuľka 1

	HPLC retenčný čas (min.)	Pomer
Substrát	B2	BI	B2 : BI
4-Tetrahydropyran karboxylová kyselina	8,1	14,5	0,25
Kyselina izomaslová	10,8	18,9	0,5
Kyselina 3-fúroová	7,6	14,6	0,62
Kyselina S-(+)-2-metylmaslová	12,8	21,6	1,0
Kyselina cyklohexankarboxylová	16,9	26,0	1,6
Kyselina 3-tiofénkarboxylová	8,8	16,0	1,8
Kyselina cyklopentankarboxylová	14,2	23,0	2,0
Kyselina 3-trifluórometylmaslová	10,9	18,8	3,9
Kyselina 2-metylpentanoová	14,5	24,9	4,2
Kyselina cykloheptankarboxylová	18,6	29,0	15,0

Dáta prezentované v tabuľke 1 demonštrujú extrémne široké rozmedzie pomerov B2 : BI avermektínových produktov, čo ukazuje na významný rozdiel vo výsledkoch dehydratačnej konverzie triedy 2 zlúčenín na triedu 1 zlúčenín, v závislosti od charakteru bočného reťazca mastnej kyseliny dodávanej ako iniciačná zlúčenina. To ukazuje, že zmeny v pomeroch B2 : BI, ktoré sú výsledkom alterácií AveC proteínu, môžu byť špecifické konkrétnym substrátom. Následné vyhľadávanie mutantov vykazujúcich zmeny v pomere B2 : BI získané s konkrétnym substrátom musia byť uskutočňované v prítomnosti tohto substrátu. Následné príklady opísané neskôr používajú kyselinu cyklohexankarboxylovú ako substrát na vyhľadávanie mutantov. Tento subsrát je ale používaný len ako príklad potenciálu a nie je zamýšľaný ako obmedzujúci použiteľnosť predkladaného vynálezu.

Izolácia aveC génu

Tento príklad opisuje izoláciu a charakterizáciu oblasti chromozómu Streptomyces avermitilis, ktorý kóduje AveC génový produkt. Ako je demonštrované neskôr, bol aveC gén identifikovaný ako schopný modifikovať pomer produkovaných cyklohexyl B2 avermektínov na cyklohexyl BI avermektíny (B2 : BI).

SK 288086 Β6

Materiál a metodika

Rast Streptomyces pre izoláciu DNA

Pre rast Streptomyces bola použité nasledujúca metóda. Jednotlivé kolónie S. avermitilis ATCC 31272 (izolát jednotlivé kolónie č. 2) boli izolované na polovičnej pôde YPD-6 obsahujúcej: Difco kvasnicový extrakt - 5 g; Difco Bacto-pepton - 5 g; dextróza - 2,5 g; MOPS - 5 g; Difco Bacto agar - 5 g. Finálny objem bol upravený na 1 liter pomocou dH₂O, pH bolo upravené na 7,0 a médium bolo autoklávované pri teplote 121 °C počas 25 minút.

Mycéliá vykultivované na uvedenom médiu boli použité na inokuláciu 10 ml TSB média (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g, v 1 litri dH₂O, autoklávované pri teplote 121 °C počas 25 minút) v skúmavke s rozmermi 25 x 150 mm, ktorá bola pretrepávaná (300 rpm) pri teplote 28 °C počas 48-72 hodín.

Chromozomálna DNA izolácia zo Streptomyces

Alikvóty (0,25 ml alebo 0,5 ml) mycélia vykultivovaného, ako bolo opísané skôr, boli umiestnené v 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmavkách a bunky boli zakoncentrované centrifugáciou pri 12 000 g počas 60 sekúnd. Supernatant bol odstránený a bunky boli resuspendované v 0,25 ml TSE pufra (20 ml 1,5 M sacharózy, 2,5 ml IM Tris-HCl, pH 8,0, 2,5 ml IM EDTA, pH 8,0 a 75 ml dH₂O) obsahujúcim 2 mg/ml lysozymu. Vzorky boli inkubované pri teplote 37 °C počas 20 minút pri pretrepávaní, vložené do automatizovaného zariadenia na izoláciu nukleových kyselín AutoGen 540™ (Integrated Separation systems, Natick, MA) a genomická DNA bola izolovaná s použitím Cycle 159 (Software zariadenia) podľa inštrukcií výrobcu.

Alternatívne bolo 5 ml mycélia umiestnených do skúmavky s rozmermi 17 x 100 mm, bunky boli zakoncentrované centrifugáciou pri 3000 rpm počas 5 minút a supernatant bol odstránený. Bunky boli resuspendované v 1 ml TSE pufra, zakoncentrované centrifugáciou pri 3000 rpm počas 5 minút a supernatant bol odstránený. Bunky boli resuspendované v 1 ml TSE pufŕu obsahujúcim 2 mg/ml lysozymu a inkubované pri teplote 37 °C pri pretrepávaní počas 30-60 minút. Po inkubácii sa pridalo 0,5 ml 10 % dodecyl sulfátu sodného (SDS) a bunky boli inkubované pri teplote 37 °C až do dokončenia lýzy. Lyzát bol inkubovaný pri teplote 65 °C počas 10 minút, ochladený na teplotu miestnosti, rozdelený do dvoch ependorfiek a extrahovaný lx 0,5 ml fenol/chlóroformom (50 % fenol napred ekvilibrovaný 0,5 M Trisom, pH 8,0; 50 % chloroform). Vodná fáza bola odstránená a extrahovaná 2 až 5 x zmesou chlorofomrizoamylalkohol (24:1), DNA bola precipitovaná pridaním 1/10 objemu 3 M octanu sodného, pH 4,8, inkubáciou zmesi na ľade 10 minút, centrifugáciou zmesi pri 15000 rpm pri teplote 5 °C počas 10 minút, a vybraním supematantu do čistej skúmavky, do ktorej bol pridaný 1 objem izopropanolu. Supernatant plus zmes izopropanolu bola potom inkubovaná na ľade počas 20 minút pri 5 °C, supernatant bol odstránený a DNA peleta bola premytá lx 70 % etanolom. Po vysušení pelety bola DNA resuspendovaná v TE pufri (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).

Izolácia plazmidovej DNA zo Streptomyces

Alikvóta (1,0 ml) mycélia bola umiestnená do 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek a bunky boli zakoncentrované centrifugáciou pri 12 000 g počas 60 sekúnd. Supernatant bol odstránený, bunky boli resuspendované v 1,0 ml 10,3 % sacharóze a zakoncentrované centrifúgáciou pri 12 000 g počas 60 sekúnd a supematant bol odstránený. Bunky boli potom resuspendované v 0,25 ml TSE pufra obsahujúce 2 mg/ml lysozymu a inkubované pri teplote 37 °C počas 20 minút pri pretrepávaní a nanesené do automatizovaného zariadenia na izoláciu nukleových kyselín AutoGen 540™. Plazmidová DNA bola izolovaná s použitím softvéru Cycle 106 podľa inštrukcií výrobcu.

Alternatívne bolo 1,5 ml mycélia umiestnených do 1,5 ml mikrocentrifugačných skúmaviek a bunky boli zakoncentrované centrifugáciou pri 12 000 g počas 60 sekúnd. Supernatant bol odstránený, bunky boli resuspendované v 1,0 ml 10,3 % sacharózy a zakoncentrované centrifugáciou pri 12 000 g počas 60 sekúnd a supematant bol odstránený. Bunky boli resuspendované v 0,5 ml TSE pufra obsahujúce 2 mg/ml lysozymu a inkubované pri teplote 37 °C počas 15-30 minút. Po inkubácii sa pridalo 0,25 ml alkalického SS (0,3 N NaOH, 2 % SDS) a bunky boli inkubované pri teplote 55 °C počas 15-30 minút, až bol roztok čistý. Do roztoku DNA bol pridaný octan sodný (0,1 ml, 3M, pH 4,8) a roztok bol potom inkubovaný na ľade počas 10 minút. Vzorky DNA boli centrifugované pri 14 000 rpm počas 10 minút pri teplote 5 °C. Supernatant bol vybraný do čistej skúmavky a pridalo sa 0,2 ml zmesi fenokchlóroform (50 % fenol: 50 % chloroform) a zmes bola jemne premiešavaná. Roztok DNA bol centrifugovaný pri 14 000 rpm počas 10 minút pri teplote 5 °C a vrchná vrstva bola vybraná do čistej ependorfky. Bol pridaný izopropanol (0,75 ml) a roztok bol jemne premiešavaný, a potom inkubovaný pri teplote miestnosti počas 20 minút. Roztok DNA bol centrifugovaný pri 14 000 rpm počas 15 minút pri teplote 5 °C, supernatant bol odstránený a DNA peleta bola premytá 70 % etanolom, vysušená a resuspendovaná v TE pufri.

Izolácia plazmidovej DNA z E. coli

Jediná transformovaná kolónia E. coli bola inokulovaná do 5 ml Luria-Bertani (LB) média (BactoTrypton - 10 g, Bacto- kvasnicový extrakt - 5 g a NaCl - 10 g v 1 litri dH₂O, pH 7,0, autoklávované pri 121 °C počas 25 minút a suplementované 100 pg/ml ampicilínu). Kultúra bola inkubovaná cez noc a 1 ml alikvóty bol umiestnený do 1,5 ml mikrocentrifugačnej skúmavky. Vzorky kultúry boli nanesené na automatizované zariadenie na izoláciu nukleových kyselín AutoGen 540™ a plazmidová DNA bola izolovaná s použitím softvéru Cycle 106 podľa inštrukcií výrobcu.

Príprava a transformácia protoplastov S. avermitilis

Jednotlivé kolónie S. avermitilis boli izolované na 1/2 médiu YPD-6. Mycéliá boli použité na inokuláciu 10 ml média TSB v skúmavke s rozmermi 25 mm x 150 mm, ktoré bolo potom inkubované pri pretrepávaní (300 rpm) pri teplote 28 °C počas 48 hodín. Jeden ml mycélia bol použitý na inokuláciu 50 ml YEME média. YEME médium obsahuje na jeden liter: Difco kvasnicový extrakt - 3 g, Difco Bacto-pepton - 5 g, Difco Mat Extract - 3 g, sacharóza - 300 g. Po autoklávovaní pri teplote 121 °C počas 25 minút boli pridané nasledujúce substancie: 2,5 M MgCl₂.6 H₂O (separátne autoklávované pri teplote 11 °C počas 25 minút) - 2 ml a glycín (20 %) (sterilizácia filtrom) - 25 ml.

Mycéliá boli kultivované pri teplote 30 °C počas 48-62 hodín a zbierané centrifugáciou v 50 ml centrifugačnej skúmavke (Falcon) pri 3 000 rpm počas 20 minút. Supematant bol odstránený a mycéliá boli resuspendované v P pufri, ktorý obsahuje: sacharózu - 205 g; K₂SO₄ - 0,25 g, MgCl₂.6 H₂O - 2,02 g, H₂O - 600 ml, K_2PO4 (0,55) - 10 ml, roztok stopových prvkov* - 20 ml, CaCl₂.2H₂O (3,68 %) - 100 ml, a MES pufor (1,0 M, pH 6,5 - 10 ml. (* Roztok stopových prvkov obsahuje na jeden liter: ZnCl₂ - 40 mg; FeCl₃.6H₂O 200 mg; CuCl₂.2H₂O -10 mg, MnCl₂.4H₂O - 10 mg; Na₂B₄O₇. 10H₂O - 10 mg; (NH₄)₆ Mo₇O₂₄.4H₂O 10 mg). PH bolo upravené na 6,5, finálny objem bol upravený na 1 liter a médium bolo horúce sfiltrované cez 0,45 mikrónový filter.

Mycéliá boli speletované pri 3 000 rpm počas 20 minút, supematant bol odstránený a mycéliá boli resuspendované v 20 ml P pufra obsahujúcom 2 mg/ml lysozymu. Mycéliá boli inkubované pri teplote 35 °C počas 16 minút pri pretrepávaní a kontrolované mikroskopicky, aby sa určil rozsah tvorby protoplastov. Keď bola tvorba protoplastov dokončená, boli protoplasty centrifugované pri 8 000 rpm počas 10 minút. Supematant bol odstránený a protoplasty boli resuspendované v 10 ml P pufra. Protoplasty boli centrifugované pri 8 000 rpm počas 10 minút, supematant bol odstránený, protoplasty boli resuspendované v 2 ml P pufra a približne 1 x 10⁹ protoplastov bolo disribuovaných do 2,0 ml kryogénnych vialiek (Nalgene).

Vialka obsahujúca 1 x 10⁹ protoplastov bola centrifugovaná pri 8 000 rpm počas 10 minút, supematant bol odstránený a protoplasty boli resuspendované v 0,1 ml P pufra. K protoplastom boli pridané 2 až 5 pg transformujúce sa DNA okamžite nasledované pridaním 0,5 ml pracovného T pufra. Základ T pufra obsahoval: PEG-1000 (Sigma)-25 g; sacharózu-2,5_g; H₂O-83 ml. pH bolo upravené na 8,8 pomocou IN NaOH (sterilizácia filtráciou) a základ T pufra bol sterilizovaný filtráciou a uskladnený pri 4 °C. Pracovný T pufer pripravený rovnaký deň, keď bol pripravený, sa skladal zo základu T pufru-8,3 ml; K₂PO₄ (4 mM)-l,0 ml; CaCL₂.2H₂O (5M)-0,2 ml a TS (IM, pH 8) - 0,5 ml. Každá zložka pracovného T pufra bola individuálne sterilizovaná filtráciou.

Počas 20 sekúnd pridávania T pufra k protoplastom bol tiež pridaný 1,0 ml P pufru a protoplasty boli centrifugované pri 8 000 rpm počas 10 minút. Supematant bol odstránený a protoplasty boli resuspendované v 0,1 ml P pufra. Protoplasty boli potom umiestnené do RM14 média, ktoré obsahuje: sacharózu-205 g, K₂SO₄0,25 g, MgCl₂.6H₂O-10,12 g, glukóza 10 g, Difco Casamino kyseliny-0,1 g, Difco kvasnicový extrakt-5 g, Difco Oatmeal Agar-3g, Difco Bacto Agar-22 g, dH₂0-800 ml. Roztok bol zautoklávovaný pri teplote 121 °C počas 25 minút. Po autoklávovaní boli pridané sterilné zásobné roztoky: K₂PO₄ (0,5 %)-10 ml, CaCl₂.2H₂O (5 M), L-prolín (20 %)-15 ml, MES pufer (1,0 M, pH 6,5)-10 ml, roztok stopových prvkov (rovnaký, ako je uvedené skôr)-2 ml, cykloheximidový zásobný roztok (25 mg/ml-40 ml a 1 N NaOH-2 ml). Dvadsaťpäť ml média RM14 bolo alikvotné nanesených na doštičku a doštičky boli vysúšané 24 hodín pred použitím.

Protoplasty boli inkubované v 95 % vlhkosti pri teplote 30 °C počas 20-24 hodín. Na výber transformantov rezistentných na tiostreptón bol rovnomerne rozptýlený 1 ml prekryvného pufra obsahujúceho 125 pg tiostreptónu na 1 ml na regeneračnej doštičky RM14. Prekryvný pufer obsahoval na 100 ml: sacharózu- 10,3 g, roztok stopových prvkov (rovnaký, ako je uvedené skôr)-0,2 ml a MES (IM, pH 6,5)-1 ml. Protoplasty boli inkubované v 95 % vlhkosti pri teplote 30 °C počas 7-14 dní do.tej doby, ako sa stali kolónie rezistentné na tiostreptón (Tio^r) viditeľné.

Transformácia protoplastov Streptomyces lividans

V niektorých prípadoch bola použitá na transformáciu S. lividans TK64 (poskytnutá John Innes Inštitúte, Norwich, Spojené kráľovstvo). Spôsoby a zloženie na rast, tvorbu protoplastov a transformáciu S. lividans sú opísané v publikácii Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Spojené kráľovstvo, a uskutočnené podľa postupov tu opísaných. Plazmidová DNA bola izolovaná zo S. lividans, ako je opísané v časti 7.1.3. skôr.

SK 288086 Β6

Fermentačná analýza kmeňov 5. avermitilis

Mycéliá 5. avermitilis kultivované na 1/2 YPD-6 počas 4-7 dní boli inokulované 1x6 palcových skúmaviek obsahujúcich 8 ml preformovaného média a dve 5 mm sklenené guľôčky. Preformované médium obsahovalo: rozpustný škrob (buď málo povarený škrob, alebo tiež KOSO, Japan Com Starch Co., Nagoya) - 20 g/1, Pharmamedia-15 g/1, Ardamin pH-5 g/1 (Champlain Ind. Clifton, NJ), CaCO₃-2 g/1, 2xbcfa („bcfa“ znamená mastné kyseliny s vetveným reťazcom) obsahujúca finálnu koncentráciu v médii 50 ppm 2-(+/-)metylmaslovej kyseliny, 60 ppm izomaslovej kyseliny a 20 ppm kyseliny izovalerovej. pH bolo upravené na 7,2 a médium bolo zautoklávované pri teplote 121 °C počas 25 minút.

Skúmavka bola pretrepávaná v uhle 17° pri 215 rpm pri teplote 29 °C počas 3 dní. Na inokuláciu 300 ml Erlenmeyerovej nádoby obsahujúcej 25 ml produkčného média obsahujúceho: škrob (buď málo povarený škrob, alebo tiež KOSO) - 160 g/1. Nutrisoy (Archer daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/1, Ardamin pH-10 g/1; K2HPO₄-2 g/1, MgSO₄.4H₂O-2 g/1, FeS0₄.7H₂0-0,02 g/1, MnCl₂- 0,002 g/1, ZnS0₄.7H₂0-0,002 g/1, CaCO₃-14 g/1, 2xbcfa (ako skôr), a cyklohexán karboxylovú kyselinu (CHC) vytvorenú ako 20 % roztok pri pH 7,0) - 800 ppm bola použitá 2 ml alikvóta inokulačnej kultúry. pH bolo upravené na 6,9 a médium bolo zautoklávované pri teplote 121 °C počas 25 minút.

Po inokulácií bola nádoba inkubovaná pri teplote 29 °C počas 12 dní s pretrepávaním pri 200 rpm. Po inkubácii boli 2 ml vzorky odobrané z nádoby, nariedené 8 ml metanolu, zmiešané a zmes bola centrifugovaná pri 1 250 g počas 10 minút, aby došlo na peletizáciu zvyškov. Supernatant bol potom analyzovaný pomocou HPLC s použitím kolóny Beckamn Ultrasphere ODS (25 cm x 4,6 mm vnútorný priemer) s prietokom 0,75 ml/min. a s detekciou pomocou absorbancie pri 240 nm. Mobilná fáza bola 86/8,9/5,1 metanol/voda/acetonitril.

Izolácia génov S. avermitilis

Kozmidová knižnica S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) chromozomálnej DNA bola pripravená a hybridizovaná s ketosyntázovou próbou pripravenou z fragmentu génu na polyketid syntázu (PKS) zo Saccharopolyspora erythraea. Detailný opis prípravy kozmidových knižníc môže byť k dispozícii v publikácii Sambrook et al., 1989, skôr. Detailný opis prípravy chromozomálnych DNA knižníc Streptomyces je uvedený v publikácii Hopwood et al., 1985, skôr. Kozmidové klony obsahujúce ketosyntázu hybridizujúcej oblasti boli identifikované hybridizáciou s 2,7 kB Nde/Eco47III fragmentom z pEX26 (láskavo poskytnutým dr. P. Leadlay, Cambridge, Spojené kráľovstvo). Približne 5 ng pEX26 bolo natrávených pomocou Ndel a Eco47III. Reakčná zmes bola nanesená na 0,8 % agarózový gél SeaPlaque GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME). Po elektroforéze bol vyrezaný z gélu 2,7 kB Ndel/Eco47III fragment a DNA bola získaná z gélu s použitím GELase™ od Epicentre Technologies s použitím Fst Protocol. 2,7 kB Ndel/Eco47III fragment bol označený [a³²]dCTP (deoxycytidín 5'-trifosfát, tetra (trietylamónium) soľ, [a- ³²P] -) (NEN-Dupont, Boston, MA) s použitím systému BRL Nick Translation Systém (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), podľa inštrukcií dodávateľa. Typická reakcia bola uskutočnená v objeme 0,05 ml. Po pridaní 5 μΐ zastavovacieho pufra bola označená DNA oddelená od neinkorporovaných nukleotidov s použitím G-25 Sehadex Quick Spin™ kolónií (Boehringer Manheim) podľa inštrukcií dodávateľa.

Približne 1 800 kozmidových klonov bolo prehliadaných hybridizáciou kolónií. Desať klonov bolo identifikovaných ako silne hybridizujúcich s Sacc. erythraea KS próbou. Kolónie E. coli obsahujúce kozmidovú DNA boli kultivované v LB tekutom médii a kozmidová DNA bola izolovaná z každej kultúry v automatizovanom zariadení na izoláciu nukleových kyselín AutoGen 540™ s použitím programu Cycle 3 (Softvére zariadenie) podľa inštrukcií výrobcu. Mapovanie reštrikčnou endonukleázou a analýzy Southern blot odhalili, že päť z klonov obsahovalo prekrývajúce sa chromozomálne oblasti. Genomická BamHI reštrikčná mapa 5. avermitilis piatich kozmidov (to je pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) bola skonštruovaná analýzou prekrývajúcich sa kozmidov a hybridizáciou (obrázok 4).

Identifikácia DNA, ktorá moduluje pomery Avermektínov B2:B1 a identifikácia aveC ORF

Na testovanie subklonovaných fragmentov odvodených od pSE66 kozmidového klonu boli použité pre AveC mutanty nasledujúce metódy na zistenie schopnosti modulácie pomerov avermektínov B2:B1. PSE66 (5 pg) bol natrávený pomocou Sací a BamHI. Reakčná zmes bola nanesená na 0,8 % agarózový gél SeaPlaque GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME), po elektroforéze bol vyrezaný z gélu 2,9 kB SacI/BamHI fragment a DNA bola získaná z gélu s použitím GELase™ (Epicentre Technologies) s použitím Fast Protocol. Približne 5 pg transportného vektora pWHM3 (Vara et al., 1989, J Bacteriol 171:5872-5881) bolo natrávených pomocou Sací a BamHI. Okolo 0,5 pg 2,9 Kb inzertu a 0,5 pg natráveného pWHM3 bolo spolu zmiešané a inkubované cez noc s 1 jednotkou ligázy (New England Biolabs, Inc, Beverly, MA) pri teplote 15 °C v celkovom objeme 20 pl podľa inštrukcií dodávateľa. Po inkubácii bolo 5 pl ligačnej zmesi inkubovaných pri teplote 70 °C počas 10 minút, zmes bola ochladená na teplotu miestnosti a použitá na transformáciu kompetentných E. coli DH5a buniek (BRL) podľa inštrukcií dodávateľa. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicílín rezistentných transformantov a prítomnosť 2,9 kB Sac/BamHI inzertu bola potvrdená reštrikčnou

SK 288086 Β6 analýzou. Plazmid bol označený ako pSEl 19.

Protoplasty kmeňa 5. avermitilis 1100-SC38 (kmeň od spoločnosti Pfizer) boli pripravené a transformované pomocou pSEl 19, ako je opísané v časti 7.1.5 skôr. Kmeň 1100-SC38 je mutant, ktorý produkuje významne viacej cyklohexyl-B2 formy avermektínu v porovnaní s cyklohexyl-Bl formou avermektínu, keď je suplementovaný cyklohexán karboxylovou kyselinou (B2:B1 je zhruba 30:1). PSEl 19 použitý na transformáciu protoplastov S. avermitilis bol izolovaný buď z kmeňa E. coli GM2163 (získaný od dr. BJ Bachmanna, správca, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), kmeňa E. coli DM1 (BRL), alebo z kmeňa S. lividarts TK64. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa 1100-SC38 boli izolované a analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Transformanty kmeňa S. avermitilis 1100-SC38 obsahujúce pSE119 viedli na narušený pomer cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektínov, ktorý bol zhruba 3,7 : 1 (tabuľka 2).

Po zistení, že pSE119 je schopný modulovať pomery B2 : BI avermektínov u AveC mutantov bola sekvenovaná inzerovaná DNA. Približne 10 pg pSE119 bolo izolovaných pomocou izolačného kitu na plazmidovú DNA (Qiagen, Valencia, CA) podľa inštrukcií výrobcu, a sekvenovaných s použitím automatizovaného sekvenačného zariadenia ABI 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Sekvenačné údaje boli zoradené a editované s použitím programov Genetic Computer Group (GCG, Madison, WI). DNA sekvencie a aveC ORF sú prezentované na obrázku 1 (SEQ ID č. 1).

Nový plazmid, označený ako pSEl 18, bol skonštruovaný nasledujúcim spôsobom. Približne 5 pg pSE66 bolo natrávených pomocou Sphl a BamHI. Reakčná zmes bola nanesená na 0,8 % agarózový gél SeaPlaque GTG (FMC BioProducts), po elektroforéze bol vyrezaný z gélu 2,8 kB Sphl/BamHI fragment a DNA bola získaná z gélu s použitím GELase™ (Epicentre Technologies) za použitia Fast Protocol. Približne 5 pg transportného vektora pWHM3 bolo natrávených pomocou Sphl a BamHI. Okolo 0,5 pg 2,8 Kb inzertu a 0,5 pg natráveného pWHM3 bolo spolu zmiešané a inkubované cez noc s 1 jednotkou ligázy (New England Bioiabs) pri teplote 15 °C v celkovom objeme 20 pl podľa inštrukcií dodávateľa. Po inkubácii bolo 5 pl ligačnej zmesi inkubovaných pri teplote 70 °C počas 10 minút, zmes bola ochladená na teplotu miestnosti a použitá na transformáciu kompetentných E. coli DH5a buniek (BRL) podľa inštrukcií dodávateľa. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť 2,8 kB Sph/BamHI inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSEl 18. Inzerovaná DNA v pSEl 18 a pSEl 19 sa prekrývali približne 838 nukleotidmi (obrázok 4).

Protoplasty kmeňa 5. avermitilis 1100-SC38 boli transformované pomocou pSEl 18, ako je uvedené skôr. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa 1100-SC38 boli izolované a analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Transformanty kmeňa S. avermitilis 1100-SC38 obsahujúce pSE118 viedli na narušenie pomerov cyklohexyl-B2:cyklohexyl-Bl avermektínov v porovnaní s kmeňom 1100-SC38 (tabuľka 2).

PCR amplifikácia aveC génu z chromozomálnej DNA 5. avermitilis

Zhruba 1,2 Kb fragment obsahujúci aveC ORF bol izolovaný z chromozomálnej DNA pomocou PCR amplifikácie s použitím primérov označených na základe aveC nukleotidovej sekvencie získanej skôr. PCR priméry boli dodané spoločnosťou Genosys Biotechnologies Inc. (Texas). Pravostranný primér bol: 5'TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID č:6) a ľavostranný primér bol: 5'-CATGATCGCTGAACCGAG3' (SEQ ID č:7). PCR reakcia bola uskutočnená polymerázou Deep Vent™ (New England Biolabs) v pufri poskytnutom výrobcom a v prítomnosti 300 uM dNTP, 10 % glycerolu, 200 pmol každého priméru, 0,1 pg templátu a 2,5 jednotiek enzýmu vo finálnom objeme 100 pl s použitím termocykléra Perkin-Elmer Cetus. Termálny profil prvého cyklu bol 95 °C počas 5 minút (denaturačný krok), 60 °C počas 2 minút (chladiaci krok) a 72 °C počas 2 minút (rozširovací krok). Následných 24 cyklov malo rovnaký termálny profil s výnimkou toho, že denaturačný krok bol skrátený na 45 sekúnd a chladiaci krok bol skrátený na 1 minútu.

PCR produkt bol podrobený elektroforéze na 1 % agarózovom géli a bol detegovaný jeden DNA pásik s veľkosťou 1,2 Kb. Táto DNA bola purifikovaná z gélu a ligovaná s 25 ng linearizovaného, hrubého pCRBlunt vektora (Invitrogén) v 1 : 10 molámom vektor/inzert pomere podľa inštrukcií výrobcu. Ligačná zmes bola použitá na transformáciu One Shot™ Competent E. coli buniek (Invitrogén) podľa inštrukcií výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť inzertu s veľkosťou zhruba 1,2 Kb bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE179.

DNA inzertu z pSE179 bola izolovaná natrávením pomocou BamHI/Xbal, separovaná elektroforézou, purifikovaná z gélu a ligovaná s transportným vektorom pWHM3, ktorý bol natrávený pomocou BamHI/Xbal v celkovej koncentrácii DNA 1 pg v 1 : 5 molámom vektor/inzert pomere. Ligačná zmes bola použitá na transformáciu kompetentných E. coli DH5a buniek (BRL) podľa inštrukcií dodávateľa. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť zhruba 1,2 kB inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid, ktorý bol označený ako pSE186 (obrázok 2, ATCC 209604), bol transformovaný do E. coli DM1 a plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov.

Výsledky

2,9 Kb SacI/BamHI z pSEl 19 bol identifikovaný tak, že po transformácii do kmeňa S. avermitilis 110025

SK 288086 Β6

SC38 významne narušil pomer B2:B1 avermektínovej produkcie. Kmeň S. avermitilis 1100-SC38 má normálny pomer B2 : Bi zhruba 30 : 1, ale keď je transformovaný vektorom obsahujúcim 2,9 Kb SacI/BamHI fragment, pomer B2 : Bi avermektínov sa znížil na zhruba 3,7 : 1. Postfermentačná analýza kultúr transformantov potvrdila prítomnosť transformujúcej DNA.

2,9 Kb pSEl 19 fragment bol sekvenovaný a bol identifikovaný zhruba 0,9 Kb ORF (obrázok 1) SEQ ID č: 1), ktorý zahŕňa Pst/Sphl fragment, ktorý bol predtým inde mutovaný, aby produkoval len B2 produkty (Ikeda et al., 1995, skôr). Porovnanie tohto ORF, alebo jeho zodpovedajúceho odvodeného polypeptidu proti známym databázam (GénomBL, SWIS-PROT) nepreukázal silnú homológiu so známou DNA alebo proteínovou sekvenciou.

Tabuľka 2 uvádza fermentačnú anylýzu kmeňa 5. avermitilis 1100-SC38 transformovanej rôznymi plazmidmi.

Tabuľka 2

Kmeň 5. avermitilis (transformujúci plazmid)	Počet testovaných transformantov	Priemerný pomer B2:B1
1100-SC38 (žiadny)	9	30,66
1100-SC38 (pWHM3)	21	31,3
1100-SC38 (pSEl 19)	12	3,7
1100-SC38 (pSEl 19)	12	30,4
1100-SC38 (pSE185)	14	27,9

Príklad: Konštrukcia mutantov AveC S. avermitilis

Tento príklad opisuje konštrukciu niekoľkých rôznych mutantov AveC 5. avermitilis s použitím preparátov a metód tu opísaných. Všeobecný opis techník na zavedenie mutácií do génu Streptomyces je opísaný Kieserom a Hopwoodom, 1991, Meth Enzým 204:430-458. Detailnejší opis je poskytnutý Anzaiom et al 1988, J Antibiot XLI(2):226-233 a Stutzman-Engwallom et al., 1992, J. Bacteriol. 174(1):144-154. Tieto referencie sú týmto začlenené v celom svojom rozsahu.

Inaktivácia génu aveC S. avermitilis

AveC mutanty obsahujúce inaktivované aveC gény boli skonštruované s použitím niekoľkých metód, ako je detailne uvedené neskôr.

V prvej metóde bol 640 bp Sph/PstI fragment z aveC génu v pSEl 19 (plazmid opísaný v časti 7.1.9) nahradený génom ermE (na rezistenciu na erytromycín) zo Sacc. Eryhraea. Gén ermE bol izolovaný z pIJ4026 (poskytnutý ústavom John Innes Inštitúte, Norwich, Spojené kráľovstvo, pozri tiež Bibb et al., 1985, Gene 41:357-368) natrávením reštrikčným enzýmom pomocou Bg/II a EcoRI s následnou elektroforézou, a potom bol z gélu purifikovaný. Tento zhruba 1,7 Kb fragment bol ligovaný do pGEM72f (Promega), ktorý bol natrávený pomocou BamHI a EcoRI a ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E. coli DH5a buniek podľa inštrukcií výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť zhruba 1,7 Kb inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE27.

PSEl 18 (opísaný v časti 7.1.9.) bol natrávený pomocou Sphl a BamHI, natrávený produkt bol podrobený elektroforéze a zhruba 2,8 Kb Sphl/BamHI inzert bol purifikovaný z gélu. PSEl 19 bol natrávený pomocou PstI a EcoRI, natrávený produkt bol podrobený elektroforéze a zhruba 1,5 Kb Pstl/EcoRI inzert bol purifikovaný z gélu. Transportný vektor pWHM3 bol natrávený pomocou BamHI a EcoRI. PSE27 bol natrávený pomocou PstI a Sphl, natrávený produkt bol podrobený elektroforéze a zhruba 1,7 Kb Pstl/Sphl inzert bol purifikovaný z gélu. Všetky štyri fragmenty (to je zhruba 2,8 Kb, zhruba 1,5 Kb, zhruba 7,2 Kb, zhruba 1,7 Kb) boli spolu ligované v štvorcestnej ligácii. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek podľa inštrukcií výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE180 (obrázok 3, ATCC 209605).

PSE 180 bol transformovaný do 5. lividans TK64 a transformované kolónie boli identifikované pomocou rezistencie na tiostreptón a erytromycín. PSE 180 bol izolovaný zo 5. lividans a použitý na transformáciu protoplastov S. avermitilis. Boli identifikované štyri transformanty rezistentné na tiosterptón a protoplasty boli pripravené a umiestnené za neselektívnych podmienok do RM14 média. Po regenerácii protoplastov boli jednotlivé kolónie prehliadané na prítomnosť rezistencie na erytromycín a neprítomnosť rezistencie na tiostreptón, čo ukazuje na chromozomálnu integráciu inaktivovaného aveC génu a stratu voľného replikónu. Jeden Erm^r Tio^s transformant bol identifikovaný a označený ako kmeň SE 180-11, natrávený reštrikčnými enzýmami BamHI, HindlII, PstI, alebo Sphl, podrobený elektroforéze na_0,8 % agarózovom géli, prenesený na nylonové membrány a hybridizovaný s ermE próbou. Tieto analýzy preukázali, že chromozomálna integrácia génu ermE rezistencie a konkomitantná delécia 640 bp Pstl/Sphl fragmentu sa vyskytla v dôsledku dvojitého

SK 288086 Β6 crossoveru. HPLC analýza fermentačných produktov kmeňa SE 180-11 preukázala, že normálne avermektíny už neboli produkované (obrázok 5A).

V druhej metóde inaktivácie aveC génu bol 1,7 Kb erm gén odstránený z chromozómu kmeňa S. avermitilis SE 180-11 zanechávajúc 640 bp Pstl/Sphl deléciu v aveC géne. Plazmid na náhradu génu bol skonštruovaný nasledujúcim spôsobom: pSE180 bol čiastočne natrávený pomocou Xbal a zhruba 11,4 Kb fragment bol purifíkovaný z gélu. Pásik s velkosťou zhruba 11,4 Kb je bez 1,7 Kb génu na ermE rezistenciu. DNA bola potom ligovaná a transformovaná do E. coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid, ktorý bol označený ako pSE184, bol transformovaný do E. coli DM1 a plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov. Tento plazmid bol použitý na transformáciu protoplastov kmeňa S. avermitilis SE180-11. Protoplasty boli pripravené z transformantov kmeňa SE 180-11 rezistentných na tistreptón a boli umiestnené ako jednotlivé kolónie do RM14. Po zregenerovaní protoplastov boli jednotlivé kolónie prehliadané na neprítomnosť rezistencie na erytromycín aj tiostreptón, čo ukazuje na chromozomálnu integráciu inaktivovaného aveC génu a stratu voľného replikónu obsahujúceho ermE gén. Jeden Erm^s Tio^s transformant bol identifikovaný a označený ako SE184-1-13. Fermentačná analýza SE 184-1-13 preukázala, že normálne avermektíny už neboli produkované, a že SE 184-1-13 mal rovnaký fermentačný profil ako SE180-11.

V treťom spôsobe inaktivácie aveC génu bol do chromozomálneho aveC génu začlenený posun rámca pridaním dvoch báz G po C v nt pozícii 471 s použitím PCR, čím došlo na vytvorenie miesta BspEl. Prítomnosť vytvoreného miesta BspEl bola užitočná na detekciu náhrady génu. PCR produkty boli navrhnuté tak, aby došlo na začlenenie frameshift mutácie do aveC génu a tieto priméry boli dodané spoločnosťou Genosys Biotechnologies, Inc. Pravostranný primér mal sekvenciu: 5'- GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID č:8) a ľavostranný primér mal sekvenciu: 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3 (SEQ ID č:9). Podmienky PCR boli rovnaké, ako je opísané v časti 7.1.10. 666 bp PCR produkt bol natrávený pomocou Sphl za vzniku dvoch fragmentov s veľkosťou 278 bp a 388. Fragment s veľkosťou 388 bp bol purifíkovaný z gélu.

Plazmid na náhradu génu bol skonštruovaný nasledujúcim spôsobom: transportný vektor pWHM3 bol natrávený pomocou EcoRI a BamHI. pSEl 19 bol natrávený pomocou BamHI a Sphl, natrávená zmes bola podrobená elektroforéze a zhruba 840 bp fragment bol purifíkovaný z gélu. PSEl 19 bol natrávený pomocou EcoRI a XmnI, natrávená zmes bola podrobená elektroforéze a fragment s veľkosťou zhruba 1,7 Kb bol purifikovaný z gélu. Všetky štyri fragmenty (to je zhruba 7,2 Kb, zhruba 840 bp, zhruba 1,7 Kb a zhruba 388 bp) boli spolu ligované v štvorcestnej ligácii. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a DNA analýzou. Plazmid, ktorý bol označený ako pSE185, bol transmorfovaný do E. coli DM1 a plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov. Tento plazmid bol použitý na transformáciu protoplastov kmeňa 5. avermitilis 1100-S38. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa 11OO-SC38 boli izolované a analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. PSEl85 nenarušoval významné pomery B2 : BI avermektínov po transformácii do kemňaS. avermitilis 1100-SC38 (tabuľka 2).

PSEl85 bol použitý na transformáciu protoplastov 5. avermitilis na tvorbu frameshift mutácie v chromozomálnom aveC géne. Protoplasty boli pripravené z tiostreptón rezistentných transformantov a umiestnené ako jednotlivé kolónie do RM14. Po regenerácii protoplastov boli jednotlivé protoplasty prehliadané na rezistenciu na tiostreptón. Z tiostreptón senzitívnych kolónií bola izolovaná chromozomálna DNA, ktorá bola prehliadaná pomocou PCR na frameshift mutácie integrovanej do chromozómu. PCR priméry boli navrhnuté na základe aveC nukleotidovej sekvencie a boli dodané spoločnosťou Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Pravostranný primér mal sekvenciu: 5-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID č: 10) a ľavostranný primér mal sekvenciu: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID č:l 1). Podmienky PCR boli rovnaké, ako je opísané v časti 7.1.10. Získaný PCR produkt mal 543 bp, po natrávení pomocou Bsp boli pozorované tri fragmenty s veľkosťou 368 bp, 96 bp a 79 bp, čo ukazuje na chromozomálnu integráciu inaktivovaného aveC génu a stratu voľného replikónu.

Fermentačná analýza mutantov S. avermitilis obsahujúcich frameshift mutáciu v aveC géne preukázala, že normálne avermektíny už neboli produkované, a že tieto mutanty mali rovnaký fermentačný HPLC profil ako kmene SE180-11 a SE 184-1-13. Jeden Tio^s transformant bol identifikovaný a označený ako kmeň SE185-5a.

Navyše došlo na tvorbu mutácie v aveC géne, ktorá mení nt pozíciu 520 z G na A, ktorá vedie na zámenu kodónu kódujúceho tryptofan (W) v pozícii 116 za terminačný kodón. Kmeň S. avermitilis s touto mutáciou neprodukoval normálne avermektíny a mal rovnaký fermentačný profil ako kmene SE 180-11, SE 184-1- 13 a SE185-5a.

Navyše došlo na tvorbu mutácií v aveC géne, ktoré menia: (i) nt pozíciu 970 z G na A, čo mení aminokyselinu v pozícii 266 z glycínu (G) na aspartát (D), a (ii). nt pozíciu 996 z T na C, čo mení aminokyselinu v pozícii 275 z tyrosínu (Y) na histidín (H), Kmeň 5 avermitilis s týmito mutáciami (G256D/Y275H) neprodu27

SK 288086 Β6 koval normálne avermektíny a mal rovnaký fermentačný profil ako kmene SE 180-11, SE 184-1-13 a SE1855a.

Mutované kmene 5. avermitilis SE180-11, SE 184-1-13, SE185-5a a ďalšie tu poskytnuté s inaktiváciou aveC, poskytujú vyhľadávací nástroj na posúdenie dopadu iných mutácií aveC génu. PSE186, ktorý obsahuje divokú kópiu aveC génu, bol transformovaný do E. coli DM1 a plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov. Táto pSE186 DNA bola použitá na transformáciu protoplastov kmeňa 5. avermitilis SE 180-11. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE 180-11 boli izolované a bola určená prítomnosť rezistencie na erytromycín, a Tio^r Erm^r transformanty boli analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Prítomnosť funkčného aveC génu in trans bola schopná reštaurovať normálnu produkciu avermektínov v kmeni SE 180-11 (obrázok 5B).

Analýza mutácií v aveC géne, ktoré narušujú pomery tried B2 : B1

Ako je opísané skôr, bol kmeň S. avermitilis SE 180-11 obsahujúci neaktívny aveC gén komplementovaný transformáciou s plazmidom obsahujúcim funkčný aveC gén (pSE186). Kmeň SE 180-11 bol tiež využitý ako hostiteľský kmeň na charakterizáciu ďalších mutácií aveC génu, ako je opísané neskôr.

Chromozomálna DNA bola izolovaná z kmeňa 1100-SC38 a použitá ako templát na PCR amplifikáciu aveC génu. ORF s veľkosťou 1,2 Kb bol izolovaný PCR ampifikáciou s použitím primérov navrhnutých na základe aveC nukleotidovej sekvencie. Pravostranný primér mal sekvenciu SEQ ID č:6 a ľavostranný primér mal sekvenciu SEQ ID č:7 (pozri časť 7.1.10 skôr). Podmienky PCR a subklonovania boli rovnaké, ako je opísané v časti 7.1.10. Analýza DNA sekvencie ORF s velkosťou 1,2 Kb preukázala mutáciu v aveC géne, ktorá mení nt pozíciu 337 z C na T, čo mení aminokyselinu v pozícii 55 zo serínu (S) na fenylalanín (F). AveC gén obsahujúci mutáciu S55F bol subklonovaný do pWHM3 za vzniku plazmidu, ktorý bol označený ako pSE187, a ktorý bol použitý na transformáciu protoplastov kmeňa S. avermitilis SE180-11. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE 180-11 boli izolované, bola určená prítomnosť rezistencie na erytromycín a Tio^r Erm^r transformanty boli analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Prítomnosť aveC génu kódujúceho zámenu v aminokyselinovom rezíduu 55 (S55F) bola schopná reštaurovať pre kmeň SE 180-11 normálnu produkciu avermektínov (obr. 5C), ale cyklohexyl B2: cyklohexyl BI pomer bol zhruba 26 : 1 v porovnaní s kmeňom SE 180-11 transformovanom pomocou pSE186, ktorý mal pomer B2:B1 zhruba 1,6 : 1 (tabuľka 3), čo ukazuje, že jediná mutácia (S55F) moduluje množstvo produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-B 1.

Ďalšia mutácia v aveC géne bola identifikovaná, že mení nt pozíciu 862 z G na A, čo vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 230 z glycínu (G) na aspartát (D). Kmeň 5. avermitilis majúci túto mutáciu (G230D) produkuje avermektíny v pomere B2 : B1 zhruba 30:1.

Mutácie, ktoré redukujú B2 : B1 pomer

Niektoré mutácie boli konštruované, že znižujú množstvo cyklohexyl-Bl nasledujúcim spôsobom.

Mutácia v aveC géne bola identifikovaná, že mení nt pozíciu 588 z G na A, čo vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 139 z alanínu (A) na treonín (T). aveC gén obsahujúci A139T mutáciu bol subklonovaný do pWHM3 za vzniku plazmidu, ktorý bol označený pSE188, a ktorý bol použitý na transformáciu protoplastov kmeňa S. avermitilis SE180-11. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE180-11 boli izolované, bola určená prítomnosť rezistencie na erytromycín a Tio^r Erm^r transformanty boli analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Prítomnosť mutovaného aveC génu kódujúceho zámenu v aminokyselinovom rezíduu 139 (A139T) bola schopná reštaurovať pre kmeň SE180-11 normálnu produkciu avermektínov (obr. 5D), ale B2 : BI pomer bol zhruba 0,94 : 1, čo ukazuje, že táto mutácia znižuje množstvo produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl. Tento výsledok bol neočakávaný, pretože publikované výsledky, rovnako tak ako výsledky mutácií opísaných skôr, len demonštrovali buď inaktiváciu aveC génu, alebo zvýšenú produkciu B2 formy avermektínov vo vzťahu k BI forme (tabuľka 3).

Pretože A139T mutácia narušila pomer B2 : BI v prospešnejšom BI smere, bola skonštruovaná mutácia, ktorá kódovala treonín miesto serínu v aminokyselinovej pozícii 138. PSE186 bol teda natrávený pomocou EcoRI a klonovaný do pGEM3Zf (Promega), ktorý bol natrávený pomocou EcoRI. Plazmid, ktorý bol označený ako pSE186a, bol natrávený pomocou Apal a KpnI, DNA fragmenty boli separované na agarózovom géli a dva fragmenty s veľkosťou zhruba 3,8 Kb a 0,4 Kb boli purifikované z gélu. DNA inzert s veľkosťou zhruba 1,2 Kb z pSE186 bol použitý ako PCR templát na založenie zámeny jedinej bázy v nt pozícii 585. Boli navrhnuté PCR priméry na založenie mutácie v nt pozícii 585, ktoré boli dodané spoločnosťou Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Pravostranný primér mal sekvenciu: 5-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAG GCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID č: 12) a ľavostranný primér mal sekvenciu: 5'GGAACCGACCGCCGCCTGATACA-3' (SEQ ID č: 13). PCR reakcia bola uskutočnená s použitím genomického PCR kitu Advantage GC (Clonetech Laboratoties, Palo Alto, CA) v pufri poskytnutom výrobcom, v prítomnosti 200 uM dNTP, 200 pmol každého priméru, 50 ng templátovej DNA, 1,0 M GC-Melt a 1 jednotky KlenTaq Polymerase mix vo finálnom objeme 50 μϊ. Termálny profil prvého cyklu bol 94 °C počas 1 mi28 núty, nasledovaný 25 cyklami pri teplote 94 °C počas 30 sekúnd a 68 °C počas 2 minút a 1 cyklom pri teplote 68 °C počas 3 minút. PCR produkt s veľkosťou 295 bp bol natrávený pomocou Apal a KpnI, aby došlo na uvoľnenie 254 bp fragmentu, ktorý bol podrobený elektroforéze a purifikovaný z gélu. Všetky 3 fragmenty (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) boli spolu ligované v trojcestnej ligácii. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE198.

PSE198 bol natrávený pomocou EcoRI, klonovaný do pWHM3, ktorý bol natrávený pomocou EcoRI a transformovaný do E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a analýzou sekvencie DNA. Plazmidová DNA bola transformovaná do E.coli DM1, plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid, ktorý bol označený ako pSE190, bol použitý na transformáciu protoplastov kmeňa S. avermitilis SE180-11. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE180-11 boli izolované, bola určená prítomnosť rezistencie na erytromycín a Tio^r Erm^r transformanty boli analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Prítomnosť mutovaného aveC génu kódujúceho zámenu v aminokyselinovom rezíduu 138 (S138T) bola schopná reštaurovať pre kmeň SE 180-11 normálnu produkciu avermektínov, ale B2 : BI pomer bol zhruba 0,88 : 1, čo ukazuje, že táto mutácia znižuje množstvo produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-B 1 (tabuľka 3). Tento pomer B2 : BI je dokonca nižší ako pomer 0,94 : 1 pozorovaný pri mutácii A139T produkovanej transformáciou kmeňa SE180-11 pomocou pSE188, ako je opísané skôr.

Ďalšia mutácia bola skonštruovaná na účely začlenenia treonínu do aminokyselinových pozícií 138 aj 139. DNA inzert s veľkosťou zhruba 1,2 Kb z pSE186 bol použitý ako PCR templát. Boli navrhnuté PCR priméry na založenie mutácií v nt pozíciách 585 a 588, ktoré boli dodané spoločnosťou Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Pravostranný primér mal sekvenciu: S'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAA ATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID č: 14) a ľavostranný primér mal sekvenciu: 5'GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID č: 15). PCR reakcia bola uskutočnená s použitím podmienok opísaných skôr v tejto časti. PCR produkt s veľkosťou 449 bp bol natrávený pomocou Apal a KpnI, aby došlo na uvoľnenie 254 bp fragmentu, ktorý bol podrobený elektroforéze a purifikovaný z gélu, PSE186a bol natrávený pomocou Apal a KpnI, DNA fragmenty boli separované na agarózovom géli a dva fragmenty s veľkosťou zhruba 3,8 Kb a 0,4 Kb boli purifikované z gélu. Všetky 3 fragmenty (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) boli spolu ligované v trojcestnej ligácii. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE230.

PSE230 bol natrávený pomocou EcoRI, naklonovaný do pWHM3, ktorý bol natrávený pomocou EcoRI a transformovaný do E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a analýzou sekvencie DNA. Plazmidová DNA bola transformovaná do E.coli DM1, plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid, ktorý bol označený ako pSE231, bol použitý na transformáciu protoplastov kmeňa 5. avermitilis SE 180-11. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE 180-11 boli izolované, bola určená prítomnosť rezistencie na erytromycín a Tio^r Erm^r transformanty boli analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Prítomnosť mutovaného aveC génu kódujúceho S138T/A139T bola schopná reštaurovať pre kmeň SE180-11 normálnu produkciu avermektínov, ale B2 : BI pomer bol zhruba 0,84 : 1, čo ukazuje, že táto mutácia ďalej znižuje množstvo produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-B 1 (tabuľka 3) v porovnaní so znížením dosiahnutým transformáciou kmeňa SE 180-11 pomocou pSE188 alebo pSE199, ako je opísané skôr.

Ďalšia mutácia bola skonštruovaná na účely ďalšieho zníženia množstva produkovaného cyklohexyl B2 k cyklohexyl BI. Pretože S138T/A139T mutácia narušila pomer B2 : BI v prospešnejšom BI smere, bola skonštruovaná mutácia na účely začlenenia treonínu v aminokyselinovej pozícii 138 a fenylalanínu v aminokyselinovej pozícii 139. DNA inzert s veľkosťou zhruba 1,2 Kb z pSE186 bol použitý ako PCR templát. Boli navrhnuté PCR priméry na založenie mutácie v nt pozícii 585 (zámena T za A), 588 (zámena G za T) a 589 (zámena C za T), ktoré boli dodané spoločnosťou Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Pravostranný primér mal sekvenciu: 5'- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3' (SEQ ID č:25) a ľavostranný primér mal sekvenciu: 5'- GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID č: 15). PCR reakcia bola uskutočnená s použitím genomického PCR kitu Advatnage GC (Clonetech Laboratoties, Palo Alto, CA) v pufri poskytnutom výrobcom, v prítomnosti 200 uM dNTP, 200 pmol každého priméru, 50 ng templátovej DNA, 1,0 M GC-Melt a 1 jednotky Tth DNA Polymerázy vo finálnom objeme 50 μΐ. Termálny profil prvého cyklu bol 94 °C počas 1 minúty, nasledovaný 25 cyklami pri teplote 94 °C počas 30 sekúnd a 68 °C počas 2 minút a 1 cyklom pri teplote 68 °C počas 3 minút. PCR produkt s veľkosťou 449 bp bol natrávený pomocou Apal a KpnI, aby došlo na uvoľnenie 254 bp fragmentu, ktorý bol podrobený elektroforéze a purifikovaný z gélu. Všetky 3 fragmenty (zhruba 3,8 Kb, 0,4 Kb a 254 bp) boli spolu ligované v trojcestnej

SK 288086 Β6 ligácii. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid bol označený ako pSE238.

PSE238 bol natrávený pomocou EcoRI, naklonovaný do pWHM3, ktorý bol natrávený pomocou EcoRI a transformovaný do E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a analýzou sekvencie DNA. Plazmidová DNA bola transformovaná do E.coli DM1, plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Plazmid, ktorý bol označený ako pSE239, bol použitý na transformáciu protoplastov kmeňa S. avermitilis SE180-11. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE 180-11 boli izolované, bola určená prítomnosť rezistencie na erytromycín a Tio^r Erm^r transformanty boli analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Prítomnosť dvojito mutovaného aveC génu kódujúceho S138T/A139F bola schopná reštaurovať pre kmeň SE18011 normálnu produkciu avermektínov, ale B2 : BI pomer bol zhruba 0,75 : 1, čo ukazuje, že táto mutácia ďalej znižuje množstvo produkovaného cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-Bl (tabuľka 3) v porovnaní so znížením dosiahnutým transformáciou kmeňa SE180-11 pomocou pSE188, pSE199, alebo pSE231, ako je opísané skôr.

Tabuľka 3

Kmeň S. avermitilis (transformujúci plazmid)	n testovaných transformantov	Relatívny c B2	Relatívny c BI	Priemerný pomer B2:B1
SE180-11 (žiadny)	30	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	26	222	140	1,59
SE180-11 (pSE187)	12	283	11	26,3
SE180-11 (pSE188)	24	193	206	0,94
SE 180-11 (pSE199)	18	155	171	0,88
SE 180-11 (pSE231)	6	259	309	0,84
SE 180-11 (pSE239)	20	184	242	0,75

Ďalšie mutácie boli skonštruované na účely ďalšieho zníženia množstva produkovaného cyklohexyl B2 k cyklohexyl BI s použitím techniky DNA presúvania, ako je opísané v publikácii Stemmer, 1994, Náture 370:389-391 a Stemmer, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751, a ďalej v patentoch United States Patents 5605793, 5811238, 5830721 a 5837458.

DNA presúvacie plazmidy obsahujúce mutované aveC gény boli transformované do kompetentných dam dcm E.coli buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a použitá na transformáciu protoplastov kmeňa SE 180-11. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE 180-11 boli izolované a analyzované na produkciu avermektínov s pomerom cyklohexyl-B2: cyklohexyl-Bl 1 : 1 alebo menej. Bola určená DNA sekvencia plazmidovej DNA z SE 180-11 transformantov produkujúcich avermektíny s pomerom B2 : BI 1 : 1 alebo menej.

Bolo identifikovaných osem transformantov produkujúcich znížené množstvá cyklohexyl-B2 k cyklohexyl-B 1. Najnižší pomer B2 : B1 dosiahnutý medzi týmito transformantami bol 04 : 1 (tabuľka 4). Plazmidová DNA bola izolovaná z každého z ôsmich transformantov a bola určená DNA sekvencia na účely identifikácie mutácií v aveC géne. Mutácie sú nasledujúce.

PSE290 obsahuje 4 nukleotidové mutácie v nt pozícii 317 z T na A, v nt pozícii 353 z C na A, v nt pozícii 438 z G na A a v nt pozícii 1155 z T na A. Nukleotidová zámena v nt pozícii 317 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 48 z D na E a nukleotidová zámena v nt pozícii 438 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 89 z A na T. Pomer B2 : BI produkovaný bunkami nesúcimi tento plazmid bol 0,42 : 1 (tabuľka 4).

PSE291 obsahuje 4 nukleotidové mutácie v nt pozícii 272 z G na A, v nt pozícii 585 z T na A, v nt pozícii 588 z G na A a v nt pozícii 708 z G na A. Nukleotidová zámena v nt pozícii 585 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 138 z S na T, nukleotidová zámena v nt pozícii 588 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 139 z A na T a nukleotidová zámena v nt pozícii 708 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 179 z G na S. Pomer B2 : B1 produkovaný bunkami nesúcimi tento plazmid bol 0,57 : 1 (tabuľka 4).

PSE2 92 obsahuje rovnaké 4 nukleotidové mutácie ako pSE290. Pomer B2 : B1 produkovaný bunkami nesúcimi tento plazmid bol 0,40 : 1 (tabuľka 4).

PSE293 obsahuje 6 nukleotidových mutácií v nt pozícii 24 z A na G, v nt pozícii 286 z A na C, v nt pozícii 497 z T na C, v nt pozícii 554 z C na T, v nt pozícii 580 z T na C a v nt pozícii 886 z A na T. Nukleotidová zámena v nt pozícii 286 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 38 z Q na P, nukleotidová zámena v nt pozícii 580 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 136 z L na P a nukleotidová zámena v nt pozícii 886

SK 288086 Β6 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 238 z E na G. Pomer B2 : BI produkovaný bunkami nesúcimi tento plazmid bol 0,68 : 1 (tabuľka 4).

PSE294 obsahuje 6 nukleotidových mutácií v nt pozícii 469 z T na C, v nt pozícii 585 z T na A, v nt pozícii 588 z G na A, v nt pozícii 708 z G na A, v nt pozícii 833 z C na T a v nt pozícii 1184 z G na A. Navyše sú nukleotidy v pozíciách 173, 174 a 175 deletované. Nukleotidová zámena v nt pozícii 469 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 99 z F na S, nukleotidová zámena v nt pozícii 585 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 138 z S na T, nukleotidová zámena v nt pozícii 588 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 139 z A na T a nukleotidová zámena v nt pozícii 708 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 179 z G na S. Pomer B2 : BI produkovaný bunkami nesúcimi tento plazmid bol 0,53 : 1 (tabuľka 4).

PSE295 obsahuje 2 nukleotidové mutácie v nt pozícii 588 z G na A a v nt pozícii 856 z T na C. Nukleotidová zámena v nt pozícii 588 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 139 z A na T a nukleotidová zámena v nt pozícii 856 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 228 z M na T. Pomer B2 : B1 produkovaný bunkami nesúcimi tento plazmid bol 0,80 : 1 (tabuľka 4).

PSE296 obsahuje 5 nukleotidových mutácií v nt pozícii 155 z T na C, v nt pozícii 505 z G na T, v nt pozícii 1039 z C na T, v nt pozícii 1202 z C na T a v nt pozícii 1210 z T na C. Nukleotidová zámena v nt pozícii 505 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 111 z G na V a nukleotidová zámena v nt pozícii 1039 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 289 z P na L. Pomer B2 : BI produkovaný bunkami nesúcimi tento plazmid bol 0,73 : 1 (tabuľka 4).

PSE297 obsahuje 4 nukleotidové mutácie v nt pozícii 377 z G na T, v nt pozícii 588 z G na A, v nt pozícii 633 z A na G, v nt pozícii 1067 z A na T. Nukleotidová zámena v nt pozícii 588 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 139 z A na T, nukleotidová zámena v nt pozícii 633 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 154 z K na E, nukleotidová zámena v nt pozícii 1067 vedie na zámenu aminokyseliny v pozícii 298 z Q na H. Pomer B2:B1 produkovaný bunkami nesúcimi tento plazmid bol 0,67 : 1 (tabuľka 4).

Tabuľka 4

Kmeň S. avermitilis (transformujúci plazmid)	n testovaných transformantov	Relatívny c B2	Relatívny c BI	Priemerný pomer B2:B1
SE180-11 (žiadny)	4	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	4	0	0	0
SE180-11 (pSE290)	4	87	208	0,42
SE 180-11 (pSE2 91)	4	106	185	0,57
SE 180-11 (pSE2 92)	4	91	231	0,40
SE180-11 (pSE2 93)	4	123	180	0,68
SE 180-11 (pSE294)	4	68	129	0,53
SE180-11 (pSE2 95)	4	217	271	0,80
SE180-11 (pSE2 96)	1	135	186	0,73
SE180-11 (pSE297)	1	148	221	0,67

Konštrukcia 5'delečných mutantov

Ako je vysvetlené v časti 5.1 skôr, obsahuje nukleotidová sekvencia S. avermitilis uvedená na obrázku 1 (SEQ ID č: 1) štyri rôzne GTG kodóny v bp pozíciách 42, 174, 177 a 180, ktoré sú potenciálnymi štartovacími miestami. Táto časť opisuje konštrukciu mnohopočetných delécií 5' oblasti aveC ORF (obrázok 1, SEQ ID č: 1), aby sa definovalo, ktorý z týchto kodónov môže účinkovať ako štartovacie miesto v aveC ORF na expresiu proteínu.

Fragmenty aveC génu rôzne deletované na 5' konci boli izolované z chromozomálnej DNA S. avermitilis pomocou PCR amplifikácie. PCR priméry boli navrhnuté na základe aveC DNA sekvencie a boli dodané spoločnosťou Genosys Biotechnologies, Inc. Pravostranné priméry mali sekvenciu: 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQ ID č: 16) (D1F1), 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID č:17) (D1F2), 5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID č: 18) (D1F3) a 5' - TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQ ID č: 19) (D2F2). Ľavostranné priméry mali sekvenciu: 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID č:20), 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID č:21) a 5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID č:22). PCR reakcia bola uskutočnená, ako je opísané v časti 8,3 skôr.

PCR produkty boli separované elektroforeticky na 1 % agarózovom géli a boli detegované jednotlivé DNA bandy s veľkosťou buď zhruba 1,0 Kb, alebo 1,1 Kb. PCR produkty boli purifikované z gélu a ligované s 25 ng linearizovaného pCR2.1 vektora (Invitrogén) v 1 : 10 molámom vektor/inzert pomere podľa inštrukcií výrobcu. Ligačné zmesi boli použité na transformáciu One Shot™ kompetentných E. coli buniek (Invitrogén) podľa inštrukcií výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a analýzou sekvencie DNA. Tieto plazmidy boli označené ako pSE190 (získaný s primérom D1F1), pSE191 (získaný s primérom D1F2), pSE192 (získaný s primárom D1F3) a pSE193 (získaný s primérom D2F2).

DNA inzerty boli natrávené pomocou BamHI/Xbal, separované elktroforeticky na 1 % agarózovom géli, a oddelene ligované s transportným vektorom pWHM3, ktorý bol natrávený pomocou BamHI/Xbal v celkovej DNA koncentrácii 1 pg v 1 : 5 molámom vektor/inzert pomere. Ligačné zmesi boli použité na transformáciu kompetentných E. coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Tieto plazmidy, ktoré boli označené ako pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) a pSE197 (D2F2) boli každý oddelene transformované do kmeňa E. coli DM1, plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Táto DNA bola použitá na transformáciu protoplastov kmeňa 5. avermitilis SE180-11. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE180-11 boli izolované, bola určená prítomnosť rezistencie na erytromycín, a Tio^r Erm^r transformanty boli analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov na účely určenia, ktorá GTG miesta boli potrebné na aveC expresiu. Výsledky ukazujú, že GTG kodón v pozícii 42 môže byť eliminovaný bez ovplyvnenia aveC expresie, pretože pSE194, pSE195 a pSE196, z ktorých je každý bez GTG miesta v pozícii, ale každý obsahuje tri GTG miesta v pozíciách 174, 177 a 180, boli všetky schopné reštaurovať normálnu produkciu avermektínov po transformácii do SE180-11. Normálna produkcia avermektínov nebola reštaurovaná transformáciou kmeňa SE180-11 pomocou pSE197, ktorý je bez všetkých štyroch GTG miest (tabufka 5).

Tabuľka 5

Kmeň & avermitilis (transformujúci plazmid)	n testovaných transformantov	Relatívny c B2	Relatívny c BI	Priemerný pomer B2:B1
SE180-11 (žiadny)	6	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	6	0	0	0
SE 180-11 (pSE186)	6	241	152	1,58
SE180-11 (pSE194)	6	35	15	2,43
SE180-11 (pSE195)	6	74	38	1,97
SE180-11 (pSE196)	6	328	208	1,58
SE180-11 (pSE197)	6	0	0	0

Klonovanie aveC homológu zo 5. hygroscopicus a S. griseochromogenes

Predkladaný vynález umožňuje identifikovať a klonovať aveC homológne gény z iných avermektín alebo milbemycín produkujúcich druhov Streptomyces. Napríklad bola hybridizovaná s 1,2 Kb aveC próbou zo 5. avermitilis kozmidová knižnica genomickej DNA zo S. hygrosopicus (FERM BP-1901), ako je opísané skôr. Bolo identifikovaných niekoľko kozmidových klonov, ktoré silno hybridizujú. Chromozomálna DNA bola izolovaná z týchto kozmidov a bol identifikovaný 4,9 Kb KpnI fragment, ktorý hybridizoval s aveC próbou. Táto DNA bola sekvenovaná a bol identifikovaný ORF (SEQ ID č:3) majúci významnú homológiu s aveC ORF S. avermitilis. Aminokyselinová sekvencia (SEQ ID č:4) odvodená z aveC homológneho ORF S. hygroscopicus je uvedená na obrázku 6.

Navyše bola hybridizovaná s 1,2 Kb aveC próbou zo S. avermitilis kozmidová knižnica genomickej DNA zo S. griseochromogenes, ako je opísané skôr. Bolo identifikovaných niekoľko kozmidových klonov, ktoré silno hybridizujú. Chromozomálna DNA bola izolovaná z týchto kozmidov a bol identifikovaný 5,4 Kb PstI fragment, ktorý hybridizoval s aveC próbou. Táto DNA bola sekvenovaná a bol identifikovaný avec homológny čiastočný ORF majúci významnú homológii s aveC ORF 5. avermitilis. Odvodená čiastočná aminokyselinová sekvencia (SEQ ID č:5) je uvedená na obrázku 6.

DNA a aminokyselinová sekvenčná analýza aveC homológu zo S. hygroscopicus a S. griseochromogenes ukazujú, že tieto oblasti majú spoločnú významnú homológiu (zhruba 50 % sekvenčná identita na aminokyselinovej úrovni), tak proti sebe, ako aj s génovými produktami aveC ORF 5. avermitilis a AveC (obrázok 6).

Konštrukcia plazmidu s aveC génom za ermE promoterom

1,2 Kb aveC ORF z pSE186 bol subklonovaný v pSE34, čo je transportný vektor pWHM3 majúci 300 bp ermE promoter inzerovaný ako KpnI/BamHI fragment v KpnI/BamHI mieste pWHM3 (pozri Ward et al., 1986, Mol gen Genet 203:468-478). PSE186 bol natrávený pomocou BamHI a HindlII, natrávená zmes bola podrobená elektroforéze a 1,2 Kb fragment bol izolovaný z agarózového gélu a ligovaný s pSE34, ktorý bol natrávený pomocou BamHI a HindlII. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E. coli DH5a buniek podľa inštrukcií výrobcu. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť 1,2 Kb inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou. Tento plazmid, ktorý bol označený ako pSE189 bol transformovaný do kmeňa E. coli DM1 a plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistent32

SK 288086 Β6 ných transformantov. Protoplasty kmeňa 5. avermitilis 1100-SC38 boli transformované pomocou pSE189. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa 1100-SC38 boli izolované a analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov.

Transformanty kmeňa 1100-SC38 obsahujúce pSE189 mali narušené pomery produkovaných avermektín cyklohexyl- B2:avermektín-Bl (zhruba 3 : 1) v porovnaní s kmeňom 1100-SC38 (zhruba 34 : 1) a celková produkcia avermektínov sa zvýšila približne 2,4-krát v porovnaní s kmeňom 1100-SC38 transformovaným pomocou pSEl 19 (tabuľka 6).

PSE189 bola tiež transformovaná do protoplastov divokého typu kmeňa S. avermitilis. Tiostreptón rezistentné transformanty boli izolované a analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Celkové avermektíny produkované divokým typom 5. avermitilis transformovaným pomocou pSE 189 sa zvýšili približne 2,2 krát v porovnaní s divokým kmeňom S. avermitilis transformovaným pomocou pSE119 (tabuľka 6)·

Tabuľka 6

Kmeň S. avermitilis (transformujúci plazmid)	n testovaných transformantov	Relatívny B2	Relatívny BI	Relatívne celkové avermektíny	Priemerný pomer B2:B1
1100-SC38	6	155	4,8	176	33,9
1100-SC38 (pSEl 19)	9	239	50,3	357	4,7
1100-SC38 (pSE189)	16	546	166	849	3,3
Divoký typ	6	59	42	113	1,41
Divoký typ (pSEl 19)	6	248	151	481	1,64
Divoký typ (pSE189)	5	545	345	1,071	1,58

Chimerický plazmid obsahujúci sekvencie z aveC ORF S. avermitilis aj aveC homológy S. hygroscopicus Hybridný plazmid označený ako pSE350 bol skonštruovaný, aby obsahoval 564 bp časť aveC homológov

S. hygroscopicus nahradzujúce 564 homológnu časť aveC ORF S. avermitilis (obrázok 7) nasledujúcim spôsobom. PSE350 bol skonštruovaný s použitím BsaAI reštrikčného miesta, ktoré je konzervované v obidvoch sekvenciách (aveC pozícia 225) a KpnI reštrikčnom mieste, ktoré je prítomné v aveC géne S. avermitilis (aveC pozícia 810). KpnI miesto bolo začlenené do DNA S. hygroscopicus pomocou PCR s použitím pravostranného priméru 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEQ ID č:23) a ľavostranného priméru 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3' (SEQ ID č:24) (dodané spoločnosťou Genosys Biotechnolgies) s použitím PCR podmienok opísaných v časti 7.1.10 skôr. PCR produkt bol natrávený pomocou BsaAI a KpnI, fragmenty boli separované na 1 % agarózovom géli a 564 bp BsaAI/KpnI fragment bol izolovaný z gélu. pSE179 (opísaný v časti 7.1.10 skôr) bol natrávený pomocou KpnI a HindlII, fragmenty boli separované elektroforeticky na 1 % agarózovom géli a fragment s veľkosťou zhruba 4,5 Kb bol izolovaný z gélu. pSE179 bol natrávený pomocou HindlII a BsaAI, fragmenty boli separované elektroforeticky na 1 % agarózovom géli a BsaAI/HindIII fragment s veľkosťou zhruba 0,2 Kb bol izolovaný z gélu. HindlII/KpnI fragment s veľkosťou zhruba 4,5 Kb, BsaAI/HindlII fragment s veľkosťou zhruba 0,2 Kb a BsaAI/KpnI fragment s veľkosťou zhruba 564 bp zo S. hygroscopicus boli spolu ligované v trojcestnej ligácii a ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou s použitím KpnI a Aval. Plazmid bol natrávený pomocou HindlII a Xbal, aby došlo na uvoľnenie inzertu s veľkosťou 1,2 Kb, ktorý bol potom ligovaný s pWHM3, ktorý bol natrávený pomocou HindlII a Xbal. Ligačná zmes bola transformovaná do kompetentných E.coli DH5a buniek. Plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou s použitím HindlII a Aval. Plazmidová DNA bola transformovaná do E.coli DM1, plazmidová DNA bola izolovaná z ampicilín rezistentných transformantov a prítomnosť správneho inzertu bola potvrdená reštrikčnou analýzou a analýzou sekvencie DNA. Plazmid bol označený ako pSE35O a použitý na transformáciu protoplastov kmeňa SE18011 5. avermitilis. Tiostreptón rezistentné transformanty kmeňa SE 180-11 boli izolované, bola určená prítomnosť rezistencie na erytromycín, a Tio^r Erm^r transformanty boli analyzované HPLC analýzou fermentačných produktov. Výsledky ukazujú, že transformanty obsahujúce S. avermitilis/S. hygroscopicus hybridný plazmid majú priemerný B2 : BI pomer zhruba 109 : 1 (tabuľka 7).

SK 288086 Β6

Tabuľka 7

Kmeň S. avermitilis (transformujúci plazmid)	n testovaných transformantov	Relatívny c B2	Relatívny c BI	Priemerný pomer B2:B1
SEI 80-11 (žiadny)	8	0	0	0
SEI 80-11 (pWHM3)	8	0	0	0
SEI 80-11 (pSE350)	16	233	2	109

Uloženie biologického materiálu

Nasledujúci biologický materiál bol uložený v Americkej zbierke typových kultúr (ATCC), Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, 29. januára 1998 a boli mu priradené nasledujúce prístupové čísla:

Plazmid_Prístupové číslo

Plazmid pSE 180 209605

Plazmid pSE 186 209604

Všetky citované patenty, patentové prihlášky a publikácie sú týmto začlenené ako referencie v celej svojej šírke.

Predkladaný vynález nie je obmedzený rozsahom špecifických foriem vynálezu tu opísaných, ktoré sú zamýšľané ako jednotlivé ilustrácie jednotlivých aspektov vynálezu a funkčne ekvivalentné metódy a komponenty sú v rozsahu vynálezu. Rôzne modifikácie vynálezu, navyše tie, ktoré boli uvedené a opísané, budú skutočne zrejmé osobám pohybujúcim sa v odbore z predchádzajúceho opisu a sprievodných obrázkov. Takéto modifikácie sú považované za patriace do rozsahu priložených patentových nárokov.

Claims (71)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá je rovnaká ako aveC alela Streptomyces avermitilis, AveC Streptomyces avermitilis génový produkt kódujúca sekvencia plazmidu pSE186 podľa ATCC 209604, alebo nukleotidová sekvencia aveC ORF S. avermitilis podľa SEQ ID č. 1 alebo jej degenerovaný variant, pričom táto nukleotidová sekvencia ďalej obsahuje jednu alebo viacej mutácií, ktoré kódujú substitúciu aminokyseliny v jednom alebo viacerých aminokyselinových rezíduách, ktoré korešpondujú s aminokyselinovými pozíciami 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 289 alebo 298 sekvencie SEQ ID č. 2, takže bunky kmeňa 5. avermitilis ATCC 53692, v ktorých bola aveC alela divokého typu inaktivovaná, a ktoré exprimujú polynukleotidovú molekulu obsahujúcu mutovanú nukleotidovú sekvenciu, produkujú pomer triedy 2 : 1 cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektínov, ktorý je nižší ako pomer produkovaný bunkami kmeňa 5. avermitilis ATCC 53692, ktoré namiesto toho exprimujú len divoký typ aveC alely.
2. 2. Polynukleotidová molekula podľa nároku 1, kde pomer triedy 2 : 1 cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektínov je 0,8 : 1 alebo nižší.
3. 3. Polynukleotidová molekula podľa nároku 2, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov je 0,68 : 1 alebo menej.
4. 4. Polynukleotidová molekula podľa nároku 3, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov je 0,53 : 1 alebo menej.
5. 5. Polynukleotidová molekula podľa nároku 4, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov je 0,42 : 1 alebo menej.
6. 6. Polynukleotidová molekula podľa nároku 5, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov je 0,40 : 1 alebo menej.
7. 7. Polynukleotidová molekula podľa nároku 1, kde aminokyselinové substitúcie sú vybrané z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

   (a) aminokyselinové rezíduum Q v pozícii 38 nahradené P alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre P, (b) aminokyselinové rezíduum D v pozícii 48 nahradené E alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre E, (c) aminokyselinové rezíduum A v pozícii 89 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (d) aminokyselinové rezíduum F v pozícii 99 nahradené S alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre S, (e) aminokyselinové rezíduum G v pozícii 111 nahradené V alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre V, (f) aminokyselinové rezíduum L v pozícii 136 nahradené P alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre P, (g) aminokyselinové rezíduum S v pozícii 138 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (h) aminokyselinové rezíduum A v pozícii 139 nahradené T alebo F aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T alebo F, (i) aminokyselinové rezíduum K v pozícii 154 nahradené E alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre E, (j) aminokyselinové rezíduum G v pozícii 179 nahradené S alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre S, (k) aminokyselinové rezíduum M v pozícii 228 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (l) aminokyselinové rezíduum E v pozícii 238 nahradené D alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre D, (m) aminokyselinové rezíduum P v pozícii 289 nahradené L alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre L a (n) aminokyselinové rezíduum Q v pozícii 298 nahradené H alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre H.
8. 8. Polynukleotidová molekula podľa nároku 1, kde je mutovaná kombinácia aminokyselinových rezíduí, a kde je kombinácia vybraná z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

   (a) aminokyselinové rezíduá D48 a A89, (b) aminokyselinové rezíduá S138 a A13 9 a G179, (c) aminokyselinové rezíduá Q3 8, L136 a E238, (d) aminokyselinové rezíduá F99, S138, A139 a G179, (e) aminokyselinové rezíduá A139 a M228, (f) aminokyselinové rezíduá G111 a P289 a (g) aminokyselinové rezíduá A139, K154 a Q298.
9. 9. Polynukleotidová molekula podľa nároku 8, kde je kombinácia aminokyselinových substitúcií vybraná z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

   (a) D48E/A89T, (b) S138T/A139T/G179S, (c) Q38P/L136P/E238D, (d) F99S/S138T/A139T/G179S, (e) A139T/M228T, (f) G111V/P289L a (g) A139T/K154E/Q298H.
10. 10. Polynukleotidová molekula podľa nároku 9, kde mutácie v aveC sekvencií kódujúcej D48E/A89T zahŕňajú zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 317 SEQ ID č:l, a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 438 SEQ ID č: 1.
11. 11. Polynukleotidová molekula podľa nároku 10 ďalej zahŕňajúca zámenu bázy z C na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 353 SEQ ID č: 1, a zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 1155 SEQ ID č:l.
12. 12. Polynukleotidová molekula podľa nároku 9, kde mutácie v aveC sekvencií kódujúcej S138T/A139/G179S zahŕňajú zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 585 SEQ ID C:l, zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č:l a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 708 SEQ ID č: 1.
13. 13. Polynukleotidová molekula podľa nároku 12 ďalej zahŕňajúca zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 272 SEQ ID č:l.
14. 14. Polynukleotidová molekula podľa nároku 9, kde mutácie v aveC sekvencií kódujúcej Q38P/L136P/E238D zahŕňajú zámenu bázy z A na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 286 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 580 SEQ ID č: 1, a zámenu bázy z A na T v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 886 SEQ ID č: 1.
15. 15. Polynukleotidová molekula podľa nároku 14 ďalej zahŕňajúca zámenu bázy z A na G v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 24 SEQ ID C: 1, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 497 SEQ ID č:l, a zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 554 SEQ IDč:l.
16. 16. Polynukleotidová molekula podľa nároku 9, kde mutácie v aveC sekvencií kódujúcej F99S/S138T/A139T/G179S zahŕňajú deléciu 3 párov báz v nukleotidových pozíciách zodpovedajúcu nukleotidom 173, 174 a 175 SEQ ID č:l, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 469 SEQ ID č:l, zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 585 SEQ ID č:l,

    SK 288086 Β6 zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 708 SEQ ID č: 1.
17. 17. Polynukleotidová molekula podľa nároku 16 ďalej zahŕňajúca zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 833 SEQ ID č: 1, a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 1184 SEQ ID č:l.
18. 18. Polynukleotidová molekula podľa nároku 9, kde mutácie v aveC sekvencii kódujúcej A139T/M228T zahŕňajú zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č: 1, a zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 856 SEQ ID č: 1.
19. 19. Polynukleotidová molekula podľa nároku 9, kde mutácie v aveC sekvencii kódujúcej G111V/P289L zahŕňajú zámenu bázy z G na T v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 505 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 1039 SEQ ID č:l.
20. 20. Polynukleotidová molekula podľa nároku 19 ďalej zahŕňajúca zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 155 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 1202 SEQ ID č: 1, a zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 1210 SEQ IDč:l.
21. 21. Polynukleotidová molekula podľa nároku 9, kde mutácie v aveC sekvencii kódujúcej A139T/K154E/Q298H zahŕňajú zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č:l, zámenu bázy z A na G v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 633 SEQ ID č:l a zámenu bázy z A na T v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 1067 SEQ ID č: 1.
22. 22. Polynukleotidová molekula podľa nároku 21 ďalej zahŕňajúca zámenu bázy z G na T v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 377 SEQ ID č:l.
23. 23. Rekombinantný vektor obsahujúci polynukleotidovú molekulu podľa nároku 1.
24. 24. Hostiteľská bunka obsahujúca polynukleotidovú molekulu podľa nároku 1 alebo rekombinantný vektor podľa patentového nároku 23.
25. 25. Hostiteľská bunka podľa nároku 24, ktorou je bunka Streptomyces.
26. 26. Spôsob prípravy nového kmeňa S. avermitilis, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa mutáciu aveC alely v bunkách kmeňa S. avermitilis, a táto mutácia vedie k substitúcii rôznych aminokyselinových rezíduí v AveC génovom produkte v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozíciách zodpovedajúcich aminokyselinovým rezíduám 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 289 alebo 298 sekvencie SEQ ID č. 2, takže bunky kmeňa S. avermitilis ATCC 53692, v ktorých bola aveC alela mutovaná produkujú pomer triedy 2 : 1 cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektínov, ktorý je nižší ako pomer produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis ATCC 53692, ktorý exprimuje len divoký typ aveC alely.
27. 27. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,8 : 1 alebo menej.
28. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,68 : 1 alebo menej.
29. 29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa 5. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,53 : 1 alebo menej.
30. 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,42 : 1 alebo menej.
31. 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,40 : 1 alebo menej.
32. 32. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že aminokyselinové substitúcie sú vybrané z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

    (a) aminokyselinové rezíduum Q v pozícii 38 nahradené P alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre P, (b) aminokyselinové rezíduum D v pozícii 48 nahradené E alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre E, (c) aminokyselinové rezíduum A v pozícii 89 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (d) aminokyselinové rezíduum F v pozícii 99 nahradené S alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre S, (e) aminokyselinové rezíduum G v pozícii 111 nahradené V alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre V, (f) aminokyselinové rezíduum L v pozícii 136 nahradené P alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre P, (g) aminokyselinové rezíduum S v pozícii 138 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (h) aminokyselinové rezíduum A v pozícii 139 nahradené T alebo F aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T alebo F,

    SK 288086 Β6 (i) aminokyselinové rezíduum K v pozícii 154 nahradené E alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre E, (j) aminokyselinové rezíduum G v pozícii 179 nahradené S alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre S, (k) aminokyselinové rezíduum M v pozícii 228 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (l) aminokyselinové rezíduum E v pozícii 238 nahradené D alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre D, (m) aminokyselinové rezíduum P v pozícii 289 nahradené L alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre L a (n) aminokyselinové rezíduum Q v pozícii 298 nahradené H alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre H.
33. 33. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že avec alela je mutovaná, aby kódovala substitúcie kombinácií aminokyselinových pozíc, a kde je kombinácia vybraná z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

    (a) aminokyselinové rezíduá D48 a A89, (b) aminokyselinové rezíduá S138aA139aG179, (c) aminokyselinové rezíduá Q38, L136 a E238, (d) aminokyselinové rezíduá F99, S138, A139 a G179, (e) aminokyselinové rezíduá A139 a M228, (f) aminokyselinové rezíduá G111 a P289 a (g) aminokyselinové rezíduá A139, K.154 a Q298.
34. 34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že kombinácia aminokyselinových substitúcií je vybraná z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

    (a) D48E/A89T, (b) S138T/A139T/G179S, (c) Q38P/L136P/E238D, (d) F99S/S13 8T/A139T/G179S, (e) A139T/M228T, (f) G111V/P289L a (g) A139T/K154E/Q298H.
35. 35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že mutácie v aveC alele kódujúcej D48E/A89T zahŕňajú zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 317 SEQ ID č: 1, a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 438 SEQ IDč:l.
36. 36. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa zámenu bázy z C na A v nukleotidovej pozícii v aceC alele zodpovedajúcej nt pozícii 353 SEQ ID č:l a zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1155 SEQ ID č:l.
37. 37. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že mutácie v aveC sekvencii kódujúcej S138/A139/G179S zahŕňajú zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 585 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č:l a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 708 SEQ ID č:l.
38. 38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 272 SEQ ID č:l.
39. 39. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že mutácie v aveC sekvencii kódujúcej Q38P/L136P/E238D zahŕňajú zámenu bázy z A na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 286 SEQ ID č:l, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 580 SEQ ID č:l a zámenu bázy z A na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 886 SEQ ID č:l.
40. 40. Spôsob podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa zámenu bázy z A na G v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 24 SEQ ID č:l, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 497 SEQ ID č:l, a zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 554 SEQ ID č:l.
41. 41. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že mutácie v aveC sekvencii kódujúcej F99S/S138T/A139T/G179S zahŕňajú deléciu 3 párov báz v nukleotidových pozíciách v aveC alele zodpovedajúcej nukleotidom 173, 174 a 175 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 469 SEQ ID č:l, zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 585 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č:l a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpoveda37

    SK 288086 Β6 júcej nt pozícii 708 SEQ ID č: 1.
42. 42. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 833 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1184 SEQ ID č:l.
43. 43. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že mutácie v aveC sekvencií kódujúcej A139T/M228T zahŕňajú zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č:l a zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 856 SEQ ID č:l.
44. 44. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že mutácie v aveC sekvencií kódujúcej G111V/P289L zahŕňajú zámenu bázy z G na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 505 SEQ ID č:l, a zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1039 SEQ IDč:l.
45. 45. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 155 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1202 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1210 SEQ ID č: 1.
46. 46. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že mutácie v aveC sekvencií kódujúcej A139T/K154E/Q298H zahŕňajú zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z A na G v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 633 SEQ ID č:l a zámenu bázy z A na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1067 SEQ IDč:l.
47. 47. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa zámenu bázy z G na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 377 SEQ ID č:l.
48. 48. Bunka Streptomyces avermitilis s mutáciou aveC alely, ktorá kóduje aveC génový produkt majúci substitúciu v jednej alebo viacerých aminokyselinových pozíciách zodpovedajúcich aminokyselinovým rezíduám 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 289 alebo 298 sekvencie SEQ ID č. 2, kde bunka produkuje pomer triedy 2 : 1 cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektínov, ktorý je nižší ako pomer produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, ktorý exprimuje len divoký typ aveC alely.
49. 49. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 48, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa 5. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,8 : 1 alebo menej.
50. 50. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 49, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,68 : 1 alebo menej.
51. 51. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 50, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa 5. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,53 : 1 alebo menej.
52. 52. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 51, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,42 : 1 alebo menej.
53. 53. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 52, kde pomer triedy 2 : 1 avermektínov produkovaný bunkami kmeňa S. avermitilis, v ktorom bola aveC alela mutovaná je 0,40 : 1 alebo menej.
54. 54. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 48, kde aminokyselinové substitúcie sú vybrané z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

    (a) aminokyselinové rezíduum Q v pozícii 38 nahradené P alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre P, (b) aminokyselinové rezíduum D v pozícii 48 nahradené E alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre E, (c) aminokyselinové rezíduum A v pozícii 89 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (d) aminokyselinové rezíduum F v pozícii 99 nahradené S alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre S, (e) aminokyselinové rezíduum G v pozícii 111 nahradené V alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre V, (f) aminokyselinové rezíduum L v pozícii 136 nahradené P alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre P, (g) aminokyselinové rezíduum S v pozícii 138 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (h) aminokyselinové rezíduum A v pozícii 139 nahradené T alebo F aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T alebo F, (i) aminokyselinové rezíduum K v pozícii 154 nahradené E alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre E, (j) aminokyselinové rezíduum G v pozícii 179 nahradené S alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre S,

    SK 288086 Β6 (k) aminokyselinové rezíduum M v pozícii 228 nahradené T alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre T, (l) aminokyselinové rezíduum E v pozícii 238 nahradené D alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre D, (m) aminokyselinové rezíduum P v pozícii 289 nahradené L alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre L a (n) aminokyselinové rezíduum Q v pozícii 298 nahradené H alebo aminokyselinou, ktorá je konzervatívnou substitúciou pre H.
55. 55. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 48, kde avec alela je mutovaná, aby kódovala aminokyselinové substitúcie kombináciou aminokyselinových pozíc, a kde je kombinácia vybraná z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

    (a) aminokyselinové rezíduá D48 a A89, (b) aminokyselinové rezíduá S138 a A139 a G179, (c) aminokyselinové rezíduá Q38, L136 a E238, (d) aminokyselinové rezíduá F99, S138, A139 a G179, (e) aminokyselinové rezíduá A139 a M228, (f) aminokyselinové rezíduá G111 a P289 a (g) aminokyselinové rezíduá A139, K154 a Q298.
56. 56. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 55, kde je kombinácia aminokyselinových substitúcií vybraná z jednej alebo viacerých skupín obsahujúcich:

    (a) D48E/A89T, (b) S138T/A139T/G179S, (c) Q38P/L136P/E238D, (d) F99S/S138T/A139T/G179S, (e) A139T/M228T, (f) G111V/P289L a (g) A139T/K154E/Q298H.
57. 57. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 56, kde mutácie v aveC alele kódujúcej D48E/A89T zahŕňajú zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 317 SEQ ID č: 1, a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 438 SEQ ID č: 1.
58. 58. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 57, kde mutácie v aveC alele kódujúcej D48E/A89T ďalej zahŕňajú zámenu bázy z C na A v nukleotidovej pozícii v aceC alele zodpovedajúcej nt pozícii 353 SEQ ID č:l a zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1155 SEQ IDč:l.
59. 59. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 56, kde mutácie v aveC alele kódujúcej S138/A139/G179S zahŕňajú zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 585 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č:l a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 708 SEQ IDč:l.
60. 60. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 59, kde mutácie v aveC alele kódujúcej S138/A139/G179S ďalej zahŕňajú zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 272 SEQ ID č: 1.
61. 61. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 56, kde mutácie v aveC alele kódujúcej Q38P/L136P/E238D zahŕňajú zámenu bázy z A na C v nukleotidovej pozícii zodpovedajúcej nt pozícii 286 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 580 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z A na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 886 SEQ ID č:l.
62. 62. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 61, kde mutácie v aveC alele kódujúcej Q38P/L136P/E238D ďalej zahŕňajú zámenu bázy z A na G v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 24 SEQ ID č:l, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 497 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 554 SEQ IDč:l.
63. 63. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 56, kde mutácie v aveC alele kódujúcej F99S/S138T/A139T/G179S zahŕňajú deléciu 3 párov báz v nukleotidových pozíciách v aveC alele zodpovedajúcej nukleotidom 173, 174 a 175 SEQ 1D č:l, zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 469 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z T na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 585 SEQ ID č:l, zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 708 SEQ ID č:l.

    SK 288086 Β6
64. 64. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 63, kde mutácie v aveC alele kódujúcej F99S/S138T/A139T/G179S ďalej zahŕňajú zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 833 SEQ ID č:l a zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1184 SEQ ID č: 1.
65. 65. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 56, kde mutácie v aveC alele kódujúcej A139T/M228T zahŕňajú zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č:l a zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 856 SEQ ID č:l.
66. 66. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 56, kde mutácie v aveC alele kódujúcej Gl 11V/P289L zahŕňajú zámenu bázy z G na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 505 SEQ ID č:l a zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1039 SEQ ID č:l.
67. 67. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 66, kde mutácie v aveC alele kódujúcej Gl 11V/P289L ďalej zahŕňajú zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 155 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z C na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1202 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z T na C v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1210 SEQ ID č:l.
68. 68. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 56, kde mutácie v aveC alele kódujúcej A139T/K154E/Q298H zahŕňajú zámenu bázy z G na A v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 588 SEQ ID č: 1, zámenu bázy z A na G v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 633 SEQ ID č: 1 a zámenu bázy z A na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 1067 SEQ IDč:l.
69. 69. Bunka Streptomyces avermitilis podľa nároku 46, kde mutácie v aveC alele kódujúcej A139T/K154E/Q298H ďalej zahŕňajú zámenu bázy z G na T v nukleotidovej pozícii v aveC alele zodpovedajúcej nt pozícii 377 SEQ ID č: 1.
70. 70. Spôsob produkcie avermektínov s pomerom triedy 2 : 1 cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektínov, ktorý je nižší ako pomer produkovaný bunkami kmeňa 5. avermitilis ATCC 53692, ktoré exprimujú len divoký typ aveC alely, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu buniek podľa patentového nároku 48 v kultivačnom médiu za podmienok, ktoré umožňujú alebo indukujú produkciu avermektínov a získanie zmienených avermektínov z kultúry.
71. 71. Kompozícia cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektínov produkovaná bunkami kmeňa Streptomyces avermitilis, ktorý exprimuje mutovanú aveC alelu, ktorá kóduje génový produkt, ktorý vedie k zníženiu pomeru triedy 2 : 1 cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektínov produkovaného bunkami v porovnaní s bunkami rovnakého kmeňa 5. avermitilis, ktorý neexprimuje mutovanú aveC alelu, ale exprimuje len divoký typ aveC alely, pričom táto kompozícia zahŕňa cyklohexyl B2:cyklohexyl BI avermektíny v pomere 0,68 : 1 alebo menej v kultivačnom médiu, v ktorom boli bunky kultivované.