[go: up one dir, main page]

PL203818B1 - Cząsteczka polinukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarz Streptomyces, sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, komórka Streptomyces avermitilis, sposób wytwarzania awermektyn i kompozycja awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 - Google Patents

Cząsteczka polinukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarz Streptomyces, sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, komórka Streptomyces avermitilis, sposób wytwarzania awermektyn i kompozycja awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1

Info

Publication number
PL203818B1
PL203818B1 PL353874A PL35387400A PL203818B1 PL 203818 B1 PL203818 B1 PL 203818B1 PL 353874 A PL353874 A PL 353874A PL 35387400 A PL35387400 A PL 35387400A PL 203818 B1 PL203818 B1 PL 203818B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
nucleotide
amino acid
seq
avec
base change
Prior art date
Application number
PL353874A
Other languages
English (en)
Other versions
PL353874A1 (pl
Inventor
Yan Chen
Claes Gustafsson
Anke Krebber
Jeremy Stephen Minshull
Sun Ai Raillard
Kim Jonelle Stutzman-Engwall
Original Assignee
Pfizer Prod Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer Prod Inc filed Critical Pfizer Prod Inc
Publication of PL353874A1 publication Critical patent/PL353874A1/pl
Publication of PL203818B1 publication Critical patent/PL203818B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są cząsteczka polinukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarz Streptomyces, sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, komórka Streptomyces avermitilis, sposób wytwarzania awermektyn i kompozycja awermektyn cykloheksylo-B2: cykloheksylo-B1.
Awermektyny
Gatunki Streptomyces wytwarzają wiele różnych metabolitów wtórnych, włącznie z awermektynami, które obejmują osiem zbliżonych szesnastoczłonowych makrocyklicznych laktonów wykazujących silną aktywność przeciw robakom pasożytującym w jelitach i owadobójczą. Osiem odrębnych, ale zbliżonych związków określa się jako A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a i B2b. Szereg „a związków odnosi się do naturalnych awermektyn, w których podstawnikiem w pozycji C25 jest (S)-sec-butyl, a szereg „b odnosi się do tych zwi ą zków, w których podstawnikiem w pozycji C25 jest izopropyl. Oznaczenia „A i „B odnoszą się do awermektyn, w których podstawnikiem w pozycji C5 jest odpowiednio metoksyl i hydroksyl. Cyfra „1 odnosi się do awermektyn, w których podwójne wiązanie występuje w pozycji C22,23, a cyfra „2 odnosi się do awermektyn mających atom wodoru w pozycji C22 i hydroksyl w pozycji C23. Spośród zbliżonych awermektyn, typ B1 uważa się za wykazujący najbardziej skuteczną aktywność przeciwpasożytniczą i szkodnikobójczą i dlatego stanowi on najbardziej pożądaną w handlu awermektynę.
Awermektyny i ich wytwarzanie przez tlenową fermentację szczepów S. avermitilis opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki o numerach 4310519 i 4429042. Uwa ż a się , że biosynteza naturalnych awermektyn zaczyna się endogennie od tioestrowych analogów CoA kwasu izomasłowego i kwasu S-(+)-2-metylomasłowego.
Połączenie zarówno ulepszania szczepów poprzez losową mutagenezę, jak i stosowania egzogennie dostarczanych kwasów tłuszczowych doprowadziło do wydajnego wytwarzania analogów awermektyn. Mutanty S. avermitilis, które są defektywne pod względem dehydrogenazy 2-oksokwasów o rozgałęzionych łańcuchach (mutanty defektywne pod względem bkd) mogą wytwarzać awermektyny tylko wtedy, gdy do fermentacji wprowadza się dodatkowo kwasy tłuszczowe. Przeszukiwanie i izolowanie mutantów defektywnych pod względem aktywności dehydrogenazy 2-oksokwasów o rozgałęzionych łańcuchach (np. S. avermitilis ATCC 53567) opisano w EP 276103. Wynikiem fermentacji takich mutantów w obecności egzogennie dostarczanych kwasów tłuszczowych jest wytwarzanie czterech awermektyn odpowiadających wykorzystywanemu kwasowi tłuszczowemu. Zatem wynikiem wprowadzenia do fermentacji S. avermitilis (ATCC 53567) kwasu S-(+)-2-metylomasłowego jest wytwarzanie naturalnych awermektyn A1a, A2a, B1a i B2a, wynikiem wprowadzenia do fermentacji kwasu izomasłowego jest wytwarzanie naturalnych awermektyn A1b, A2b, B1b i B2b, a wynikiem wprowadzenia do fermentacji kwasu cyklopentanokarboksylowego jest wytwarzanie czterech nowych cyklopentyloawermektyn A1, A2, B1 i B2.
Jeśli wprowadza się inne kwasy tłuszczowe, wytwarzane są nowe awermektyny. Dzięki przeszukaniu ponad 800 potencjalnych prekursorów zidentyfikowano ponad 60 innych nowych awermektyn. (Patrz np. Dutton i in., 1991, J. Antibiot. 44: 357-365 oraz Banks i in., 1994, Roy. Soc. Chem. 147: 16-26). Ponadto, mutanty S. avermitilis defektywne pod względem aktywności 5-O-metylotransferazy wytwarzają zasadniczo tylko awermektyny będące analogami typu B. W konsekwencji, mutanty S. avermitilis pozbawione zarówno aktywności dehydrogenazy 2-oksokwasów o rozgałęzionych łańcuchach, jak i 5-O-metylotransferazy, wytwarzają tylko awermektyny B odpowiadające kwasowi tłuszczowemu wprowadzonemu do fermentacji. Zatem wynikiem suplementacji takich podwójnych mutantów kwasem S-(+)-metylomasłowym jest wytwarzanie tylko naturalnych awermektyn B1a i B2a, podczas gdy wynikiem suplementacji kwasem izomasłowym lub kwasem cyklopentanokarboksylowym jest wytwarzanie odpowiednio naturalnych awermektyn B1b i B2b lub nowych cyklopentyloawermektyn B1 i B2. Suplementacja podwójnie zmutowanego szczepu kwasem cykloheksanokarboksylowym jest korzystnym sposobem wytwarzania ważnej w handlu nowej awermektyny, cykloheksyloawermektyny B1 (doramektyny). Izolowanie i cechy charakterystyczne takich podwójnych mutantów, np. S. avermitilis (ATCC 53692), opisano w EP 276103.
Geny uczestniczące w biosyntezie awermektyn
W wielu przypadkach geny uczestniczące w wytwarzaniu metabolitów wtórnych i geny kodujące określony antybiotyk występują zgrupowane razem na chromosomie. Tak jest w przypadku np. zespołu genu syntazy poliketydowej Streptomyces (PKS) (patrz Hopwood i Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet.
PL 203 818 B1
24: 37-66). Zatem jedną ze strategii klonowania genów szlaku biosyntetycznego jest izolowanie genu oporności na lek, a następnie testowanie sąsiadujących regionów chromosomu pod względem innych genów związanych z biosyntezą określonego antybiotyku. Inną strategią klonowania genów uczestniczących w biosyntezie ważnych metabolitów jest komplementacja mutantów. Przykładowo, części biblioteki DNA z organizmu zdolnego do wytwarzania określonego metabolitu wprowadza się do nie wytwarzającego go mutanta i transformanty przeszukuje pod kątem wytwarzania metabolitu. Dodatkowo, do identyfikacji i klonowania genów szlaków biosyntetycznych stosuje się hybrydyzację z biblioteką sond otrzymanych z innych gatunków Streptomyces.
Geny uczestniczące w biosyntezie awermektyn (geny ave), podobnie jak geny wymagane do biosyntezy innych metabolitów wtórnych Streptomyces (np. PKS), występują zgrupowane na chromosomie. Liczne geny ave z powodzeniem sklonowano stosując wektory do komplementacji mutantów S. avermitilis o zablokowanej biosyntezie awermektyn. Klonowanie takich genów opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5252474. Ponadto, Ikeda i in., 1995, J. Antiblot., 48: 532-534, opisują położenie regionu chromosomalnego uczestniczącego w etapie dehydratacji C22,23 (aveC) we fragmencie BamHI o długości 4,82 Kb S. avermitilis, jak również mutacje genu aveC, których wynikiem jest utworzenie szczepu produkującego jeden składnik, B2a. Ponieważ z awermektyny B2a można wytwarzać chemicznie iwermektynę, silny związek przeciw robakom pasożytującym w jelitach, taki szczep produkują cy jeden skł adnik awermektyny B2a uważ any jest za szczególnie użyteczny do przemysłowej produkcji iwermektyny.
Identyfikacja mutacji w genie aveC, które minimalizują złożoność wytwarzania awermektyn, takich jak np. mutacji zmniejszających stosunek awermektyn B2:B1, powinna uprościć wytwarzanie i oczyszczanie waż nych w handlu awermektyn.
Przedmiotem wynalazku jest cząsteczka polinukleotydowa zawierająca sekwencję nukleotydów, która jest taka sama jak allel aveC Streptomyces avermitilis, sekwencja kodująca produkt genowy AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), lub sekwencja nukleotydów otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), bądź ich zdegenerowany wariant, ale która to sekwencja nukleotydów zawiera ponadto jedną mutację kodującą podstawienie aminokwasowe w resztach aminokwasowych odpowiadających pozycjom aminokwasów 38, 48, 89, 99, 111, 136, 154, 179, 228, 238, 289 lub 298 w SEQ ID NO: 2, tak że komórki szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zinaktywowano allel aveC typu dzikiego i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydowej zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydów, wytwarzają awermektyny o stosunku klas 2:1, który jest obniżony w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego.
W korzystnym rozwią zaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku awermektynami o stosunku klas 2:1 są awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1.
W korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,8:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,68:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,53:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,42:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,40:1 lub mniej.
W korzystnym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej według wynalazku sekwencja nukleotydów ponadto zawiera mutacje kodujące podstawienie aminokwasowe w jednej lub obu resztach aminokwasowych odpowiadających pozycjom aminokwasów 138 i 139 w SEQ ID NO: 2.
W innym korzystnym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku podstawienia aminokwasowe są wybrane z grupy obejmującej:
(a) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 38 resztą aminokwasową P;
(b) zastąpienie reszty aminokwasowej D w pozycji 48 resztą aminokwasową E;
(c) zastąpienie reszty aminokwasowej A w pozycji 89 resztą aminokwasową T;
(d) zastąpienie reszty aminokwasowej F w pozycji 99 resztą aminokwasową S;
(e) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 111 resztą aminokwasową V;
PL 203 818 B1 (f) zastąpienie reszty aminokwasowej L w pozycji 136 resztą aminokwasową P;
(g) zastąpienie reszty aminokwasowej K w pozycji 154 resztą aminokwasową E;
(h) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 179 resztą aminokwasową S;
(i) zastąpienie reszty aminokwasowej M w pozycji 228 resztą aminokwasową T;
(j) zastąpienie reszty aminokwasowej E w pozycji 238 resztą aminokwasową D;
(k) zastąpienie reszty aminokwasowej P w pozycji 289 resztą aminokwasową L oraz (l) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 298 resztą aminokwasową H.
W innym korzystnym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowe j według wynalazku jest zmutowana kombinacja reszt aminokwasowych, przy czym kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowi D48 i A89;
(b) reszty aminokwasowi S138, A139 i G179;
(c) reszty aminokwasowi Q38, L136 i E238;
(d) reszty aminokwasowi F99, S138, A139 i G179;
(e) reszty aminokwasowi A139 i M228;
(f) reszty aminokwasowi G111 i P289 oraz (g) reszty aminokwasowi A139, K154 i Q298.
W korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku kombinację podstawień aminokwasowych wybiera się z grupy obejmującej:
(a) D48E/A89T;
(b) S138T/A139T/G179S;
(c) Q38P/L136P/E238D;
(d) F99S/S138T/A139T/G179S;
(e) A139T/M228T;
(f) G111V/P289L i (g) A139T/K154E/Q298H.
W jeszcze korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym cząsteczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku mutacje w sekwencji aveC kodującej D48E/A89T obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 317 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadają cej pozycji nukleotydu 438 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku cząsteczka polinukleotydowa ponadto obejmuje zmianę zasady z C na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 353 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1155 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku mutacje w sekwencji aveC kodującej S138T/A139T/G179S obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku cząsteczka polinukleotydowa ponadto obejmuje zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 272 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku mutacje w sekwencji aveC kodującej Q38P/L136P/E238D obejmują zmianę zasady z A na C w pozycji nukleotydu odpowiadają cej pozycji nukleotydu 286 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 580 w SEQ ID NO:
oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 886 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku cząsteczka polinukleotydowa ponadto obejmuje zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 24 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 497 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 554 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku mutacje w sekwencji aveC kodującej F99S/S138T/A139T/G179S obejmują delecję 3 par zasad w pozycjach nukleotydów odpowiadających pozycjom nukleotydów 173, 174 i 175 w SEQ ID
PL 203 818 B1
NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 469 w SEQ
ID NO: 1, zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadają cej pozycji nukleotydu
588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwią zaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku cząsteczka polinukleotydowa ponadto obejmuje zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 833 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1184 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku mutacje w sekwencji aveC kodującej A139T/M228T obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 856 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku mutacje w sekwencji aveC kodującej G111V/P289L obejmują zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 505 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1039 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku cząsteczka polinukleotydowa ponadto obejmuje zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 155 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1202 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1210 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku mutacje w sekwencji aveC kodującej A139T/K154E/Q298H obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 633 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1067 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwią zaniu dotyczą cym czą steczki polinukleotydowej wedł ug wynalazku cząsteczka polinukleotydowa ponadto obejmuje zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 377 w SEQ ID NO: 1.
Wynalazek dotyczy także zrekombinowanego wektora zawierającego zdefiniowaną powyżej cząsteczkę polinukleotydową.
Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza Streptomyces zawierającej zdefiniowaną powyżej cząsteczkę polinukleotydową lub zdefiniowany powyżej zrekombinowany wektor.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, który charakteryzuje się tym, że mutuje się allel aveC w komórkach szczepu S. avermitilis, lub wprowadza się zmutowany allel aveC do komórki szczepu S. avermitilis, przy czym mutacja prowadzi do podstawienia w produkcie genowym aveC innej reszty aminokwasowej w jednej lub większej liczbie pozycji odpowiadających resztom aminokwasowym 38, 48, 89, 99, 111, 136, 139, 154, 179, 228, 238, 289 lub 298 w SEQ ID NO: 2, tak że komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC tak zmutowano, wytwarzają awermektyny o stosunku klas 2:1, który jest obniżony w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, z tym, że jeśli mutacja prowadzi do podstawienia tylko reszty aminokwasowej 139 lub następuje podwójna mutacja obejmująca resztę aminokwasową 139, to ta reszta aminokwasową 139 jest podstawiona przez F.
W korzystnym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku awermektynami o stosunku klas 2:1 są awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1.
W korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym sposobu według wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,8:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczą cym sposobu wedł ug wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,68:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczą cym sposobu według wynalazku stosunek klas
2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,53:1 lub mniej.
PL 203 818 B1
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczą cym sposobu według wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,42:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczą cym sposobu według wynalazku stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,40:1 lub mniej.
W korzystnym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku zmutowany allel aveC ponadto koduje resztę aminokwasową odpowiadającą pozycji aminokwasowej 138 w SEQ ID NO: 2.
W innym korzystnym rozwią zaniu dotyczącym sposobu wedł ug wynalazku podstawienia aminokwasowe są wybrane z grupy obejmującej:
(a) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 38 resztą aminokwasową P;
(b) zastąpienie reszty aminokwasowej D w pozycji 48 resztą aminokwasową E;
(c) zastąpienie reszty aminokwasowej A w pozycji 89 resztą aminokwasową T;
(d) zastąpienie reszty aminokwasowej F w pozycji 99 resztą aminokwasową S;
(e) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 111 resztą aminokwasową V;
(f) zastąpienie reszty aminokwasowej L w pozycji 136 resztą aminokwasową P;
(g) zastąpienie reszty aminokwasowej K w pozycji 154 resztą aminokwasową E;
(h) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 179 resztą aminokwasową S;
(i) zastąpienie reszty aminokwasowej M w pozycji 228 resztą aminokwasową T;
(j) zastąpienie reszty aminokwasowej E w pozycji 238 resztą aminokwasową D;
(k) zastąpienie reszty aminokwasowej P w pozycji 289 resztą aminokwasową L oraz (l) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 298 resztą aminokwasową H.
W innym korzystnym rozwią zaniu dotyczą cym sposobu wedł ug wynalazku allel aveC mutuje się tak, że koduje podstawienia aminokwasowe w kombinacji pozycji aminokwasów, przy czym taka kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe D48 i A89;
(b) reszty aminokwasowe Q38, L136 i E238;
(c) reszty aminokwasowe A139 i M228;
(d) reszty aminokwasowe G111 i P289 oraz (e) reszty aminokwasowe A139, K154 i Q298.
W korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku allel aveC mutuje się tak, że koduje podstawienia aminokwasowe w kombinacji pozycji aminokwasów, przy czym taka kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe S138, A139 i G179 oraz (b) reszty aminokwasowe F99, S138, A139 i G179.
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku kombinację podstawień aminokwasowych wybiera się z grupy obejmującej:
(a) D48E/A89T;
(b) Q38P/L136P/E238D;
(c) A139T/M228T;
(d) G111V/P289L i (e) A139T/K154E/Q298H.
W bardziej korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku kombinację podstawień aminokwasowych wybiera się z grupy obejmującej:
(a) S138T/A139T/G179S i (b) F99S/S138T/A139T/G179S.
W jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu wed ług wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym D48E/A89T obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 317 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 438 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku ponadto obejmuje on zmianę zasady z C na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 353 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1155 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku mutacje w allelu aveC kodują cym S138T/A139T/G179S obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotyPL 203 818 B1 du w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku ponadto obejmuje on zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 272 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym Q38P/L136P/E238D obejmują zmianę zasady z A na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 286 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 580 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 886 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku ponadto obejmuje on zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 24 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 497 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 554 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym F99S/S138T/A139T/G179S obejmują delecję 3 par zasad w pozycjach nukleotydów w allelu aveC odpowiadających pozycjom nukleotydów 173, 174 i 175 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 469 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku ponadto obejmuje on zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 833 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1184 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku mutacje w allelu aveC koduj ącym A139T/M228T obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 856 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku mutacje w allelu aveC kodują cym G111V/P289L obejmuj ą zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 505 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 1039 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku ponadto obejmuje on zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 155 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1202 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1210 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku mutacje w allelu aveC kodują cym A139T/K154E/Q298H obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 633 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1067 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym sposobu według wynalazku ponadto obejmuje on zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 377 w SEQ ID NO: 1.
Przedmiotem wynalazku jest także komórka Streptomyces avermitilis, mająca zmutowany allel aveC, który koduje produkt genowy aveC zawierający podstawienie w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasów odpowiadających resztom aminokwasowym 38, 48, 89, 99, 111, 136, 154, 179, 228, 238, 289 lub 298 w SEQ ID NO: 2, przy czym komórka wytwarza awermektyny o stosunku klas
PL 203 818 B1
2:1, który jest obniżony w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego.
W korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku awermektynami o stosunku
2:1 są awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1.
W korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym komórki wedł ug wynalazku wytwarza ona awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,8:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym komórki według wynalazku wytwarza ona awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,68:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku wytwarza ona awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,53:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku wytwarza ona awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,42:1 lub mniej.
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku wytwarza ona awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,40:1 lub mniej.
W korzystnym rozwią zaniu dotyczą cym komórki wedł ug wynalazku allel aveC ponadto koduje podstawienie aminokwasowe w jednej lub obu resztach aminokwasowych odpowiadających pozycjom aminokwasów 138 i 139 w SEQ ID NO: 2.
W innym korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku podstawienia aminokwasowe są wybrane z grupy obejmującej:
(a) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 38 resztą aminokwasową P;
(b) zastąpienie reszty aminokwasowej D w pozycji 48 resztą aminokwasową E;
(c) zastąpienie reszty aminokwasowej A w pozycji 89 resztą aminokwasową T;
(d) zastąpienie reszty aminokwasowej F w pozycji 99 resztą aminokwasową S;
(e) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 111 resztą aminokwasową V;
(f) zastąpienie reszty aminokwasowej L w pozycji 136 resztą aminokwasową P;
(g) zastąpienie reszty aminokwasowej K w pozycji 154 resztą aminokwasową E;
(h) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 179 resztą aminokwasowi S;
(i) zastąpienie reszty aminokwasowej M w pozycji 228 resztą aminokwasowi T;
(j) zastąpienie reszty aminokwasowej E w pozycji 238 resztą aminokwasową D;
(k) zastąpienie reszty aminokwasowej P w pozycji 289 resztą aminokwasową L oraz (i) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 298 resztą aminokwasową H.
W innym korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku allel aveC jest zmutowany tak, że koduje podstawienia aminokwasowe w kombinacji pozycji aminokwasów, przy czym taka kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe D48 i A89;
(b) reszty aminokwasowe Q38, L136 i E238;
(c) reszty aminokwasowe A139 i M228;
(d) reszty aminokwasowe G111 i P289 oraz (e) reszty aminokwasowe A139, K154 i Q298.
W korzystniejszym rozwią zaniu dotycz ą cym komórki wedł ug wynalazku allel aveC jest zmutowany tak, że koduje podstawienia aminokwasowe w kombinacji pozycji aminokwasów, przy czym taka kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe S138, A139 i G179 oraz (b) reszty aminokwasowe F99, S138, A139 i G179.
W innym korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku kombinacja podstawień aminokwasowych jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) D48E/A89T;
(b) Q38P/L136P/E238D;
(c) A139T/M228T;
(d) G111V/P289L i (e) A139T/K154E/Q298H.
W bardziej korzystniejszym rozwią zaniu dotyczą cym komórki wedł ug wynalazku kombinacja podstawień aminokwasowych jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) S138T/A139T/G179S i (b) F99S/S138T/A139T/G179S.
PL 203 818 B1
W jeszcze korzystniejszym rozwią zaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym D48E/A89T obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 317 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 438 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym D48E/A89T ponadto obejmują zmianę zasady z C na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 353 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1155 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym S138T/A139T/G179S obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym S138T/A139T/G179S ponadto obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 272 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodują cym Q38P/L136P/E238D obejmuj ą zmianę zasady z A na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 286 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 580 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 886 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym Q38P/L136P/E238D ponadto obejmują zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 24 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 497 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 554 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym F99S/S138T/A139T/G179S obejmują delecję 3 par zasad w pozycjach nukleotydów w allelu aveC odpowiadających pozycjom nukleotydów 173, 174 i 175 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 469 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym F99S/S138T/A139T/G179S ponadto obejmują zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 833 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1184 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC koduj ą cym A139T/M228T obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 856 w SEQ ID NO: 1.
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodują cym G111V/P289L obejmuj ą zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 505 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 1039 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym G111V/P289L ponadto obejmują zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 155 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadają cej pozycji nukleotydu 1202 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1210 w SEQ ID NO: 1.
PL 203 818 B1
W innym jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym A139T/K154E/Q298H obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 633 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1067 w SEQ ID NO: 1.
W szczególnie korzystnym rozwiązaniu dotyczącym komórki według wynalazku mutacje w allelu aveC kodującym A139T/K154E/Q298H ponadto obejmują zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 377 w SEQ ID NO: 1.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania awermektyn, który charakteryzuje się tym, że hoduje się w pożywkach hodowlanych zdefiniowane powyżej komórki Streptomyces avermitilis, w warunkach, które umożliwiają lub indukują wytwarzanie przez nie awermektyn, oraz odzyskuje się te awermektyny z hodowli.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest nowa kompozycja awermektyn cykloheksyloB2:cykloheksylo-B1 wytwarzanych przez powyżej określone komórki Streptomyces avermitilis, której cechą jest to, że zawiera awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 w stosunku 0,68:1 lub niższym w pożywce, w której hodowano komórki.
Figura 1 przedstawia sekwencję DNA (SEQ ID NO: 1) zawierającą otwartą ramkę odczytu aveC S. avermitilis oraz przewidywaną sekwencję aminokwasów (SEQ ID NO: 2).
Figura 2 przedstawia wektor plazmidowy pSE186 (ATCC 209604) zawierający pełną otwartą ramkę odczytu genu aveC S. avermitilis.
Figura 3 przedstawia wektor do zastępowania genu pSE180 (ATCC 209605) zawierający gen ermE Sacc. erythraea wstawiony do otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis.
Figura 4 przedstawia mapę restrykcyjną BamHI zespołu genu awermektynowej syntazy poliketydowej z S. avermitilis z pięcioma zidentyfikowanymi zachodzącymi na siebie klonami kosmidowymi (tj. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Wskazano również współzależność pSE118 i pSE119.
Figura 5 przedstawia analizę HPLC produktów fermentacji wytwarzanych przez szczepy S. avermitilis. Ocenę ilości w pikach prowadzono przez porównanie standardowych ilości cykloheksylo-B1. Czas retencji cykloheksylo-B2 wynosił 7,4-7,7 minuty, czas retencji cykloheksylo-B1 wynosił 11,9-12,3 minuty. Fig. 5A przedstawia szczep SE180-11 S. avermitilis o zinaktywowanej otwartej ramce odczytu aveC. Fig. 5B przedstawia szczep SE180-11 S. avermitilis stransformowany pSE186 (ATCC 209604). Fig. 5C przedstawia szczep SE180-11 S. avermitilis stransformowany pSE187. Fig. 5D przedstawia szczep SE180-11 S. avermitilis stransformowany pSE188.
Figura 6 przedstawia porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów kodowanych przez otwartą ramkę odczytu aveC S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), częściowej otwartej ramki odczytu homologu aveC z S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) i otwartą ramkę odczytu homologu aveC z S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4). Reszta waliny wyróżniona przez pogrubienie jest przypuszczalnym miejscem początku białka. Reszty konserwatywne przedstawiono wielkimi literami w przypadku homologii we wszystkich trzech sekwencjach, a małymi literami w przypadku homologii w 2 z 3 sekwencji. Sekwencje aminokwasów wykazują około 50% identyczności sekwencji.
Figura 7 przedstawia hybrydowy konstrukt plazmidowy zawierający fragment BsaAI/KpnI o długości 564 bp z genu homologu aveC S. hygroscopicus wstawiony w miejscu BsaAI/KpnI otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis.
Wynalazek dotyczy identyfikowania i charakteryzowania cząsteczek polinukleotydowych mających sekwencje nukleotydów, które kodują produkt genowy AveC ze Streptomyces avermitilis, konstruowania nowych szczepów S. avermitilis, które można stosować do przeszukiwania zmutowanych produktów genowych AveC pod kątem ich wpływu na wytwarzanie awermektyn, oraz, że odkrycia pewne zmutowane produkty genowe AveC mogą obniżać stosunek B2:B1 awermektyn wytwarzanych przez S. avermitilis. Przykładowo, w poniższych częściach wynalazek opisano dla cząsteczki polinukleotydowej mającej sekwencję nukleotydów, która jest taka sama jak sekwencja kodująca produkt genowy AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencja nukleotydów z otwartej ramki odczytu na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), oraz dla cząsteczek polinukleotydowych mających pochodzące od niej zmutowane sekwencje nukleotydów i ich zdegenerowane warianty. Jednakże zasady podane w wynalazku można analogicznie stosować wobec innych cząsteczek polinukleotydowych, włącznie z genami homologów aveC z innych gatunków Streptomyces, obejmujących między innymi S. hygroscopicus i S. griseochromogenes.
PL 203 818 B1
Cząsteczki polinukleotydowe kodujące produkt genowy AveC S. avermitilis
Wynalazek dostarcza wyizolowaną cząsteczkę polinukleotydową zawierającą pełną otwartą ramkę odczytu aveC S. avermitilis lub jej zasadniczą część, która to wyizolowana cząsteczka polinukleotydową pozbawiona jest następnej pełnej otwartej ramki odczytu, która położona jest za otwartą ramką odczytu aveC w chromosomie S. avermitilis in situ.
Wyizolowana cząsteczka polinukleotydowa według wynalazku zawiera sekwencję nukleotydów, która jest taka sama jak sekwencja kodująca produkt genowy AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), lub która jest taka sama, jak sekwencja nukleotydów otwartej ramki odczytu na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub ich zasadnicza część. W znaczeniu stosowanym w opisie, „zasadnicza część wyizolowanej cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydów kodującą produkt genowy AveC S. avermitilis oznacza wyizolowaną cząsteczkę polinukleotydową zawierającą co najmniej około 70% sekwencji pełnej otwartej ramki odczytu aveC przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), kodującą funkcjonalnie równoważny produkt genowy AveC. Pod tym względem, „funkcjonalnie równoważny produkt genowy AveC definiuje się jako produkt genowy, który, gdy ulega ekspresji w szczepie ATCC 53692 S. avermitilis, w którym zinaktywowano natywny allel aveC, powoduje wytwarzanie awermektyn zasadniczo w takim samym stosunku i ilości, jak wytwarzane przez szczep ATCC 53692 S. avermitilis, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko funkcjonalnego allelu aveC typu dzikiego, natywnego dla szczepu ATCC 53692 S. avermitilis.
Poza sekwencją nukleotydów otwartej ramki odczytu aveC, wyizolowana cząsteczka polinukleotydową według wynalazku może zawierać ponadto sekwencje nukleotydów, które naturalnie flankują gen aveC in situ w S. avermitilis, takie jak flankujące sekwencje nukleotydów przedstawione na fig. 1 (SEQ ID NO: 1).
Wynalazek dostarcza ponadto wyizolowaną cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydów z SEQ ID NO: 1 lub jej zdegenerowany wariant.
W znaczeniach stosowanym w opisie, określenia „cząsteczka polinukleotydowa, „sekwencja polinukleotydowa, „sekwencja kodująca i „otwarta ramka odczytu w zamierzeniu odnoszą się do cząsteczek zarówno DNA, jak i RNA, które mogą być albo jednoniciowe, albo dwuniciowe, i które po umieszczeniu pod kontrolą odpowiednich elementów regulujących mogą, w odpowiednim układzie ekspresyjnym komórki gospodarza, ulegać transkrypcji i translacji (DNA) lub transkrypcji (RNA) do produktu genowego AveC lub, jak opisano poniżej, do homologicznego do AveC produktu genowego bądź polipeptydu, który jest homologiczny do produktu genowego AveC lub homologicznego do AveC produktu genowego. Sekwencja kodująca może obejmować, ale nie ogranicza się do sekwencji prokariotycznych, sekwencji cDNA, sekwencji genomowego DNA oraz chemicznie zsyntetyzowanych sekwencji DNA i RNA.
Sekwencja nukleotydów przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) zawiera cztery różne kodony GTG w pozycjach 42, 174, 177 i 180 bp. Jak opisano w przykładzie 4 poniżej, skonstruowano kilka delecji w 5'-końcowym regionie otwartej ramki odczytu aveC (fig. 1; SEQ ID NO: 1) dla pomocy w ustaleniu, które z tych trzech kodonów mogą działać w otwartej ramce odczytu aveC jako miejsca początku ekspresji białka. Delecja pierwszego miejsca GTG w pozycji 42 bp nie wyeliminowała aktywności AveC. Dodatkowa delecja wszystkich z kodonów GTG w pozycjach 174, 177 i 180 bp łącznie wyeliminowała aktywność AveC, co wskazuje, że ten region jest konieczny do ekspresji białka. Wynalazek obejmuje zatem otwarte ramki odczytu aveC o zmiennej długości.
Wynalazek dostarcza ponadto cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydów, która jest homologiczna do sekwencji kodującej produkt genowy AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub do sekwencji nukleotydów otwartej ramki odczytu aveC przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), bądź ich zasadniczych części. Określenie „homologiczna, gdy stosuje się go w odniesieniu do cząsteczki polinukleotydowej, która jest homologiczna do sekwencji kodującej produkt genowy AveC S. avermitilis, oznacza cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencją nukleotydów, (a) która koduje taki sam produkt genowy AveC, jak sekwencja kodująca produkt genowy AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 20604), lub która koduje taki sam produkt genowy AveC, jak sekwencja nukleotydów otwartej ramki odczytu aveC przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), ale która zawiera jedną lub większą liczbę „milczących zmian w stosunku do sekwencji nukleotydów z powodu degeneracji kodu genetycznego (tj. wariant zdegenerowany); bą d ź (b) która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do cząsteczki polinukleotydowej mającej sekwencję nukleotydów, która koduje sekwencję aminokwasów kodowaną przez sekwencję kodującą produkt genowy AveC z plazmidu pSEl86 (ATCC 209604), lub która koduje sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1
PL 203 818 B1 (SEQ ID NO: 2), w warunkach o umiarkowanej surowości, tj. hybrydyzacji ze związanym z sączkiem DNA w 0,5 M NaHPO4, 7% sodowym siarczanie dodecylu (SDS), 1 mM EDTA w temperaturze 65°C oraz przemycia w 0,2 x SSC/0,1% SDS w temperaturze 42°C (patrz Ausubel i in. (red.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, tom I, Green Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., Nowy Jork, str. 2.10.3), oraz która koduje produkt genowy funkcjonalnie równoważny AveC, jak zdefiniowano powyżej. W korzystnym rozwiązaniu, homologiczna cząsteczka polinukleotydowa hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do sekwencji nukleotydów kodującej produkt genowy AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub z sekwencją komplementarną do sekwencji nukleotydów otwartej ramki odczytu ave, przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), bądź ich zasadniczych części, w warunkach o wysokiej surowości, tj. hybrydyzacji ze związanym z sączkiem DNA w 0,5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA w temperaturze 65°C oraz przemycia w 0,1 x SSC/0,1% SDS w temperaturze 68°C (Ausubel i in., powyżej) oraz koduje produkt genowy funkcjonalnie równoważny AveC, jak zdefiniowano powyżej.
Aktywność produktu genowego AveC i jego potencjalnych równoważników funkcjonalnych można określać przez analizę HPLC produktów fermentacji, jak opisano w przykładach poniżej. Polinukleotydowe cząsteczki mające sekwencje nukleotydowe, które kodują funkcjonalne równoważniki produktu genowego AveC S. avermitils obejmują naturalnie występujące geny aveC obecne w innych szczepach S. avermitilis, geny homologiczne do aveC obecne w innych gatunkach Streptomyces oraz zmutowane allele aveC, niezależnie od tego, czy są allelami występującymi naturalnie, czy otrzymanymi technikami inżynierii genetycznej.
Wynalazek dostarcza ponadto cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydów, która koduje polipeptyd mający sekwencję aminokwasów, która jest homologiczna do sekwencji aminokwasów kodowanej przez sekwencję kodującą produkt genowy AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), albo sekwencję aminokwasów z fig. 1 (SEQ ID NO: 2), bądź ich zasadnicze części. W znaczeniu stosowanym w opisie, „zasadnicza część sekwencji aminokwasów z fig. 1 (SEQ ID NO: 2) oznacza polipeptyd zawierający co najmniej około 70% sekwencji aminokwasów przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID: 2) i stanowiący funkcjonalnie równoważny produkt genowy AveC, jak zdefiniowano powyżej.
W znaczeniu stosowanym w opisie w odniesieniu do sekwencji aminokwasów, które są homologiczne do sekwencji aminokwasów produktu genowego AveC z S. avermitilis, termin „homologiczna odnosi się do polipeptydu, który pod innymi względami ma sekwencję aminokwasów z fig. 1 (SEQ ID NO: 2), ale w którym jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych konserwatywnie podstawiono innymi resztami aminokwasowymi, przy czym ta sekwencja aminokwasów wykazuje co najmniej około 70%, korzystniej co najmniej około 80%, a najkorzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji aminokwasów z polipeptydem kodowanym przez sekwencję kodującą produkt genowy AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję aminokwasów z fig. 1 (SEQ ID NO: 2), określonej przez którykolwiek ze standardowych algorytmów do oznaczania identyczności sekwencji aminokwasów, takich jak algorytm BLASTP (GENBANK, NCBI), i gdzie wynikiem takiego konserwatywnego podstawienia jest funkcjonalnie równoważny produkt genowy, jak zdefiniowano powyżej. Konserwatywne podstawienia aminokwasowe są dobrze znane w tej dziedzinie. Zasady dokonywania takich podstawień obejmują między innymi te opisane przez Dayhofa, M. D., 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Waszyngton, D.C., tom 5, sup. 3. Bardziej szczegółowo, konserwatywnymi podstawieniami aminokwasowymi są te, które generalnie zachodzą w obrębie rodziny aminokwasów, które są zbliżone pod względem kwasowości lub polarności. Aminokwasy kodowane genetycznie generalnie dzieli się na cztery grupy: (1) kwaśne = asparaginian, glutaminian, (2) zasadowe = lizyna, arginina, histydyna, (3) niepolarne = alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan oraz (4) nienaładowane polarne = glicyna, asparagina, glutamina, cysteina, seryna, treonina, tyrozyna. Fenyloalaninę, tryptofan i tyrozynę klasyfikuje się również łącznie jako aminokwasy aromatyczne. Jedno lub większa liczba zastąpień w obrębie którejkolwiek z poszczególnych grup, np. leucyny izoleucyną lub waliną lub asparaginianu glutaminianem lub treoniny seryną, bądź jakiejkolwiek innej reszty aminokwasowej strukturalnie zbliżoną resztą aminokwasową, np. resztą aminokwasową o podobnej kwasowości lub polarności lub o podobieństwie pewnej ich kombinacji, wywierać będzie generalnie nieznaczący wpływ na funkcję polipeptydu.
Wynalazek dostarcza ponadto wyizolowaną cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydów kodującą homologiczny do AveC produkt genowy. W znaczeniu stosowanym w opisie, „homologiczny do AveC produkt genowy definiuje się jako produkt genowy wykazują cy co
PL 203 818 B1 najmniej około 50% identyczności sekwencji aminokwasów do produktu genowego AveC S. avermitilis mającego sekwencję aminokwasów kodowaną przez sekwencję kodującą produkt genowy AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję aminokwasów przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO: 2), określonej przez którykolwiek ze standardowych algorytmów do oznaczania identyczności sekwencji aminokwasów, takich jak algorytm BLASTP (GENBANK, NCBI). W nieograniczającym rozwiązaniu, homologiczny do AveC produkt genowy pochodzi z S. hygroscopicus (opisanego w zgłoszeniu EP 0298423, depozyt FERM BP-1901) i zawiera sekwencję aminokwasów z SEQ ID NO: 4 lub jej zasadniczą część. „Zasadnicza część sekwencji aminokwasów z SEQ ID NO: 4 oznacza polipeptyd zawierający co najmniej około 70% sekwencji aminokwasów z SEQ ID NO: 4, który stanowi funkcjonalnie równoważny homologiczny do AveC produkt genowy. „Funkcjonalnie równoważny homologiczny do AveC produkt genowy definiuje się jako produkt genowy, wynikiem ekspresji którego w szczepie FERM-BP-1901 S. hygroscopicus, w którym zinaktywowano natywny allel homologu aveC, jest wytwarzanie milbemycyn zasadniczo w takim samym stosunku i w takiej samej ilości, jak wytwarzane przez szczep FERM BP-1901 S. hygroscopicus, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko funkcjonalnego allelu homologu aveC typu dzikiego, natywnego dla szczepu FERM BP-1901. W nieograniczają cym rozwią zaniu wynalazku, wyizolowana czą steczka polinukleotydowa, która koduje homologiczny do AveC produkt genowy S. hygroscopicus, zawiera sekwencję nukleotydów z SEQ ID NO: 3 lub jej zasadniczą część. Odnośnie tego, „zasadnicza część wyizolowanej cząsteczki polinukleotydu zawierającej sekwencję nukleotydów z SEQ ID NO: 3 oznacza wyizolowaną cząsteczkę polinukleotydową zawierającą co najmniej około 70% sekwencji nukleotydów z SEQ ID NO: 3, która koduje funkcjonalnie równoważny produkt genowy, jak zdefiniowano bezpośrednio powyżej.
Wynalazek dostarcza ponadto cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydów, która jest homologiczna do sekwencji nukleotydów S. hygroscopicus z SEQ ID NO: 3. Termin „homologiczna, gdy stosuje się go w odniesieniu do cząsteczki polinukleotydowej zawierającej sekwencję nukleotydów, która jest homologiczna do sekwencji kodującej homologiczny do AveC produkt genowy S. hygroscopicus z SEQ ID NO: 3, oznacza cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydów (a) która koduje taki sam produkt genowy, jak sekwencja nukleotydów z SEQ ID NO: 3, ale która obejmuje jedną lub większą liczbę milczących zmian sekwencji nukleotydów wynikających z degeneracji kodu genetycznego (tj. zdegenerowany wariant); lub (b) która hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do cząsteczki polinukleotydowej mającej sekwencję nukleotydów, która koduje sekwencję aminokwasów z SEQ ID NO: 4 w warunkach o umiarkowanej surowości, tj. hybrydyzacji ze związanym z sączkiem DNA w 0,5 M NaHPO4, 7% SDS, 1 mM EDTA w temperaturze 65°C oraz przemywania w 0,2 x SSC/0,1% SDS w temperaturze 42°C (patrz Ausubel i in., powyżej) oraz koduje produkt genowy funkcjonalnie równoważny AveC, jak zdefiniowano powyżej. W korzystnym rozwiązaniu, homologiczna cząsteczka polinukleotydowa hybrydyzuje z sekwencją komplementarną do sekwencji nukleotydów kodującej homologiczny do AveC produkt genowy z SEQ ID NO: 3 w warunkach o wysokiej surowości, tj. hybrydyzacji ze związanym z sączkiem DNA w 0,5 M NaHP04, 7% SDS, 1 mM EDTA w temperaturze 65°C oraz przemywania w 0,1 x SSC/0,1% SDS w temperaturze 68°C (Ausubel i in., powyż ej) oraz koduje funkcjonalnie równoważny produkt genowy homologiczny do AveC, jak zdefiniowano powyżej.
Wynalazek dostarcza ponadto cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydów, która koduje polipeptyd homologiczny do homologicznego do AveC produktu genowego S. hygroscopicus. W znaczeniu stosowanym w niniejszym opisie w odniesieniu do polipeptydów, które są homologiczne do homologicznego do AveC produktu genowego z S. hygroscopicus z SEQ ID NO: 4, określenie „homologiczny odnosi się do polipeptydu, który pod innymi względami ma sekwencję aminokwasów z SEQ ID NO: 4, ale w którym jedną lub większą liczbę reszt aminokwasowych konserwatywnie podstawiono innymi resztami aminokwasowymi, jak zdefiniowano powyżej, przy czym ta sekwencja aminokwasów wykazuje co najmniej około 70%, korzystniej co najmniej około 80%, a najkorzystniej co najmniej około 90% identyczności sekwencji aminokwasów z polipeptydem z SEQ ID NO: 4, określonej przez którykolwiek ze standardowych algorytmów do oznaczania identyczności sekwencji aminokwasów, takich jak algorytm BLASTP (GENBANK, NCBI), i gdzie wynikiem takiego konserwatywnego podstawienia jest funkcjonalnie równoważny homologiczny do AveC produkt genowy, jak zdefiniowano powyżej.
Wynalazek dostarcza ponadto oligonukleotydy, które hybrydyzują z cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydów z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO: 3, bądź z cząsteczką polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydów, która jest komplementarna do sekwencji nukleodydo14
PL 203 818 B1 wej z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub SEQ ID NO: 3. Takie oligonukleotydy mają długość co najmniej około 10 nukleotydów, a korzystnie długość od około 15 do około 30 nukleotydów, i hybrydyzują z jedną z wymienionych powyż ej cząsteczek polinukleotydowych w warunkach o wysokiej surowoś ci, tj. przemywania w 6 x SSC/0,5% pirofosforan sodu w temperaturze około 37°C dla oligonukleotydów o długości około 14 zasad, w temperaturze około 48°C dla oligonukleotydów o długości około 17 zasad, w temperaturze około 55°C dla oligonukleotydów o długości około 20 zasad i w temperaturze około 60°C dla oligonukleotydów o długości około 23 zasad. W korzystnym rozwiązaniu, oligonukleotydy są komplementarne do części jednej z wymienionych powyżej cząsteczek polinukleotydowych. Oligonukleotydy te są użyteczne do licznych celów, łącznie z kodowaniem lub działaniem jako cząsteczki antysensowne użyteczne w regulacji genów, bądź jako startery w amplifikacji cząsteczek polinukleotydowych kodujących aveC lub homologi aveC.
Dodatkowe geny homologiczne do aveC można identyfikować u innych gatunków lub szczepów Streptomyces stosując opisane w opisie cząsteczki polinukleotydowe lub oligonukleotydy w połączeniu ze znanymi technikami. Przykładowo, cząsteczkę oligonukleotydową zawierającą część sekwencji nukleotydów S. avermitilis z fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub część sekwencji nukleotydów z S. hygroscopicus z SEQ ID NO: 3 można wyznakować w sposób dostarczający wykrywanie i stosować do przeszukiwania biblioteki genomowej skonstruowanej z DNA pochodzącego z organizmu będącego przedmiotem zainteresowania. Surowość warunków hybrydyzacji wybiera się w oparciu o związek organizmu odniesienia, w tym przykładzie S. avermitilis lub S. hygroscopicus, z organizmem będącym przedmiotem zainteresowania. Wymagania dla warunków o różnej surowości są dobrze znane specjalistom w tej dziedzinie i warunki takie będą róż nić się w przewidywalny sposób zależnie od określonych organizmów, od których pochodzą biblioteka i wyznakowana sekwencja. Takie oligonukleotydy korzystnie mają długość co najmniej około 15 nukleotydów i obejmują np. te opisane poniżej w przykładach. Amplifikację homologicznych genów można prowadzić stosując te i inne oligonukleotydy dzięki wykorzystaniu standardowych technik, takich jak reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), chociaż można również stosować inne znane w tej dziedzinie techniki amplifikacji, np. reakcję łańcuchową ligazy.
Klony zidentyfikowane jako zawierające sekwencje nukleotydów homologów aveC można testować pod kątem ich zdolności do kodowania funkcjonalnego homologicznego do AveC produktu genowego. W tym celu klony można poddać analizie sekwencji dla zidentyfikowania odpowiedniej otwartej ramki odczytu, jak również sygnałów inicjacji i terminacji. Alternatywnie, lub dodatkowo, sklonowaną sekwencję DNA można wstawić do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, tj. wektora, który zawiera elementy konieczne do transkrypcji i translacji wstawionej sekwencji kodującej białko. Jak opisano poniżej, można zastosować którykolwiek z różnych układów gospodarz/wektor, obejmujących, ale nie ograniczających się do układów bakteryjnych, takich jak ekspresyjne wektory plazmidowe, bakteriofagowe lub kosmidowe. Odpowiednie komórki gospodarza stransformowane takimi wektorami zawierającymi potencjalne sekwencje kodujące homologi aveC można następnie analizować pod względem aktywności typu AveC stosując takie metody, jak analiza HPLC produktów fermentacji, jak opisano na przykład w przykładzie 2 poniżej.
Wytwarzanie i manipulowanie ujawnionymi w opisie cząsteczkami polinukleotydowymi pozostaje w zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie i można je prowadzić zgodnie z technikami rekombinacji opisanymi, np., w Maniatis i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel i in., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook i in., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, wyd. 2, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis i in. (red.), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; oraz Erlich (red.), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, Nowy Jork. Klony polinukleotydów kodujących produkty genowe AveC lub homologiczne do AveC produkty genowe można identyfikować stosując którąkolwiek z metod znanych w tej dziedzinie, obejmujących, ale nie ograniczających się do metod wymienionych w przykładzie 2 poniżej. Biblioteki genomowego DNA można przeszukiwać pod kątem sekwencji kodujących aveC i homologi aveC stosując takie techniki, jak metody wymienione w Benton i Davis, 1977, Science 196: 180, dla bibliotek bakteriofagowych oraz w Grunstein i Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961-3965 dla bibliotek plazmidowych. W tych doświadczeniach przeszukiwania jako sondy można stosować cząsteczki polinukleotydowe mające sekwencje nukleotydów, o których wiadomo, ż e zawierają sekwencje otwartej ramki odczytu aveC, jak obecne, np., w plazmidzie pSE186 (ATCC 209604) lub w plazmidzie pSE119 (opisanym w przykładzie 2 poniżej). Alternatywnie, można syntetyzować sondy oligonukleotydowe, które odpowiadają sekwencjom nukleotydów
PL 203 818 B1 przewidywanym na podstawie częściowych lub pełnych sekwencji aminokwasów oczyszczonego homologicznego do AveC produktu genowego.
Układy rekombinacyjne
1. Wektory klonujące i ekspresyjne
Wynalazek dostarcza ponadto zrekombinowane wektory klonujące i wektory ekspresyjne, które są użyteczne do klonowania lub ekspresji cząsteczek polinukleotydowych według wynalazku, zawierających np. otwartą ramkę odczytu aveC S. avermitilis lub jakiekolwiek otwarte ramki odczytu homologów aveC. W nieograniczającym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza plazmid pSE186 (ATCC 209604), który zawiera pełną otwartą ramkę odczytu genu aveC S. avermitilis.
Całość poniższego opisu dotyczącego otwartej ramki odczytu aveC z S. avermitilis lub polinukleotydowej cząsteczki zawierającej otwartą ramkę odczytu aveC z S. avermitilis, bądź ich części, lub produktu genowego AveC S. avermitilis, odnosi się również do homologów aveC i homologicznych do AveC produktów genowych, o ile wyraźnie nie wskazano lub nie wynika to z kontekstu.
Opracowano szereg różnych wektorów do stosowania w Streptomyces, włącznie między innymi z fagami, plazmidami o wysokiej liczbie kopii, plazmidami o niskiej liczbie kopii i wektorami wahadłowymi E. coli-Streptomyces, i każdy z nich można wykorzystywać do praktycznego stosowania wynalazku. Ze Streptomyces sklonowano także liczne leki oporności na leki i kilka z nich wprowadzono do wektorów jako markery selekcyjne. Przykłady obecnie wykorzystywanych wektorów do stosowania w Streptomyces przedstawiono, mię dzy innymi, w Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16: 169-170.
Zrekombinowane wektory według wynalazku, szczególnie wektory ekspresyjne, korzystnie konstruuje się w taki sposób, że sekwencja kodująca cząsteczki polinukleotydowej według wynalazku jest funkcyjnie połączona z jednym lub większą liczbą elementów regulujących koniecznych do transkrypcji i translacji sekwencji kodującej dla wytworzenia polipeptydu. W znaczeniu stosowanym w opisie, „element regulujący obejmuje, ale nie ogranicza się do sekwencji nukleotydów, które kodują promotory indukowalne i nieindukowalne, sekwencje wzmacniające, operatory i inne elementy znane w tej dziedzinie, które służą do kierowania i/lub regulacji ekspresji polinukleotydowych sekwencji kodujących. Również, w znaczeniu stosowanym w opisie, sekwencja kodująca jest „funkcyjnie połączona z jednym lub wię kszą liczbą elementów regulujących, jeś li elementy regulują ce skutecznie regulują i umożliwiają transkrypcję sekwencji kodującej lub translację jej mRNA, bą dź jedno i drugie.
Typowe wektory plazmidowe, które można konstruować tak, aby zawierały cząsteczkę polinukleotydową według wynalazku, obejmują, wśród wielu innych, pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) i wektor wahadłowy pWHM3 (Vara i in., 1989, J. Bact. 171: 5872-5881).
W nauce dobrze znane są metody konstruowania zrekombinowanych wektorów zawierających określone sekwencje kodujące funkcyjnie połączone z odpowiednimi elementami regulującymi, i można je wykorzystywać do praktycznego stosowania wynalazku. Metody te obejmują techniki rekombinacji in vitro, techniki syntezy oraz rekombinację genetyczną in vivo. Patrz np. techniki opisane w Maniatis i in., 1989, powyżej; Ausubel i in., 1989, powyżej, Sambrook i in., 1989, powyżej; Innis i in., 1995, powyżej oraz Erlich, 1992, powyżej.
Elementy regulujące tych wektorów mogą różnić się siłą działania i specyficznością. Zależnie od wykorzystywanego układu gospodarz/wektor, można stosować którykolwiek z licznych odpowiednich elementów regulujących transkrypcję i translację. Nieograniczające przykłady regionów regulujących transkrypcję lub promotorów dla bakterii obejmują promotor β-gal, promotor T7, promotor TAC, promotory lewy i prawy λ, promotory trp i lac, promotory fuzyjne trp-lac oraz, bardziej szczegółowo dla Streptomyces, promotory ermE, melC, tipA itd. W konkretnym rozwiązaniu opisanym w przykładzie 6 poniżej, utworzono wektor ekspresyjny, który zawierał otwartą ramkę odczytu aveC sklonowaną w sąsiedztwie silnego konstytutywnego promotora ermE z Saccharopolyspora erythraea. Wektorem stransformowano S. avermitilis i późniejsza analiza produktów fermentacji wskazywała na zwiększone miano wytwarzanych awermektyn w porównaniu z wytwarzaniem przez ten sam szczep, w którym zamiast tego zachodziła ekspresja allelu aveC typu dzikiego.
Do ekspresji białka fuzyjnego produktu genowego AveC można stosować wektory ekspresyjne dla białek fuzyjnych. Oczyszczone białko fuzyjne można stosować do indukcji antysurowic skierowanych przeciw produktowi genowemu AveC, do badania biochemicznych właściwości produktu genowego AveC, do tworzenia białek fuzyjnych AveC o różnych właściwościach biochemicznych lub dla ułatwienia identyfikacji lub oczyszczania ulegającego ekspresji produktu genowego AveC. Możliwe wektory ekspresyjne dla białek fuzyjnych obejmują, ale nie ograniczają się do wektorów zawierających
PL 203 818 B1 sekwencje, które kodują fuzje z β-galaktozydazą i trpE, fuzje z białkiem wiążącym maltozę, fuzje z transferazą S-glutationową oraz fuzje z polihistydyną (regiony nośnikowe). W alternatywnym rozwiązaniu, produkt genowy AveC lub jego część można poddawać fuzji z homologicznym do AveC produktem genowym, lub jego częścią, otrzymanymi z innego gatunku lub szczepu Streptomyces, takiego jak, np., S. hygroscopicus lub S. griseochromogenes. W określonym rozwiązaniu opisanym w przykładzie 7 poniżej i przedstawionym na fig. 7, skonstruowano chimeryczny plazmid, który zawiera region o długości 564 bp otwartej ramki odczytu homologu aveC S. hygroscopicus zastępujący homologiczny region o długości 564 bp otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis. Takimi wektorami hybrydowymi można transformować komórki S. avermitilis i testować w celu określenia ich wpływu np. na stosunek klas 2:1 wytwarzanych awermektyn.
Białka fuzyjne AveC można tak konstruować, aby zawierały region użyteczny w oczyszczaniu. Przykładowo, fuzje AveC-białko wiążące maltozę można oczyszczać stosując żywicę amylozową, białka fuzyjne AveC-transferaza S-glutationowa można oczyszczać stosując perełki agarozowe ze związanym glutationem, a fuzje AveC-polihistydyna można oczyszczać stosując żywicę z dwuwartościowym niklem. Alternatywnie, do oczyszczania białka fuzyjnego przez chromatografię powinowactwa można stosować przeciwciała skierowane przeciw białku lub peptydowi nośnikowemu. Przykładowo, sekwencję nukleotydów kodującą docelowy epitop przeciwciała monoklonalnego można wprowadzić technikami inżynierii genetycznej do wektora ekspresyjnego w umożliwiającym działanie połączeniu z elementami regulującymi i umiejscowić w taki sposób, aby ulegający ekspresji epitop tworzył fuzję z polipeptydem AveC. Przykładowo, sekwencję nukleotydów kodującą znacznik epitopowy FLAG™ (International Biotechnologies Inc.), który jest hydrofilowym znacznikiem peptydowym, można wstawić standardowymi technikami do wektora ekspresyjnego w miejscu odpowiadającym np. karboksylowemu końcowi polipeptydu AveC. Ulegający ekspresji produkt fuzyjny polipeptyd AveC-epitop FLAG™ można następnie wykrywać i oczyszczać na zasadzie powinowactwa stosując dostępne w handlu przeciwciała skierowane przeciw FLAG™.
Wektor ekspresyjny kodujący białko fuzyjne AveC można również konstruować tak, aby zawierało sekwencje polilinkerowe, które kodują miejsca specyficznie rozszczepiane przez proteazy, tak aby ulegający ekspresji polipeptyd AveC można było uwalniać z regionu nośnikowego lub partnera fuzyjnego przez traktowanie specyficzną proteazą. Przykładowo, wektor dla białka fuzyjnego może zawierać sekwencje DNA kodujące między innymi miejsca rozszczepiane przez trombinę lub czynnik Xa.
Stosując dobrze znane metody, do wektora ekspresyjnego można wprowadzić technikami inżynierii genetycznej sekwencję sygnałową położoną przed, i w jednej ramce odczytu, z otwartą ramką odczytu aveC, dla kierowania ulegającego ekspresji produktu genowego do właściwej lokalizacji lub wydzielania. Nieograniczające przykłady sekwencji sygnałowych obejmują między innymi te czynnika α, immunoglobulin, białek błony zewnętrznej, penicylinaz i receptorów komórek T.
Dla ułatwienia selekcji komórek gospodarza stransformowanych lub stransfekowanych klonującymi lub ekspresyjnymi wektorami według wynalazku, wektor można tak skonstruować, aby zawierał ponadto sekwencję kodującą produkt genu reporterowego lub inny marker selekcyjny. Taka sekwencja kodująca korzystnie jest funkcyjnie połączona z sekwencjami kodującymi elementy regulujące, jak opisano powyżej. Geny reporterowe, które są użyteczne w wynalazku, są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują między innymi te kodujące białko zielono fluoryzujące, lucyferazę, xylE i tyrozynazę. Sekwencje nukleotydów kodujące markery selekcyjne są dobrze znane w tej dziedzinie i obejmują te, które kodują produkty genowe nadające oporność na antybiotyki i antymetabolity, lub które spełniają wymagania auksotroficzne. Przykłady takich sekwencji obejmują, wśród wielu innych, te, które kodują oporność na erytromycynę, tiostrepton lub kanamycynę.
2. Transformowanie komórek gospodarza
Wynalazek dostarcza ponadto stransformowane komórki gospodarza zawierające cząsteczkę polinukleotydową lub zrekombinowany wektor według wynalazku oraz pochodzące od nich nowe szczepy lub linie komórkowe. Komórkami gospodarza użytecznymi w praktycznym stosowaniu wynalazku są korzystnie komórki Streptomyces, chociaż można również stosować inne komórki prokariotyczne lub eukariotyczne. Takie stransformowane komórki gospodarza zazwyczaj obejmują, ale nie ograniczają się do mikroorganizmów, takich jak między innymi bakterie stransformowane wektorami będącymi zrekombinowanym DNA bakteriofagowym, DNA plazmidowym lub DNA kosmidowym, bądź drożdże stransformowane zrekombinowanymi wektorami.
Cząsteczki polinukleotydowe według wynalazku w zamierzeniu działają w komórkach Streptomyces, ale można nimi transformować również inne komórki bakteryjne lub eukariotyczne, np. w celach
PL 203 818 B1 klonowania lub ekspresji. Zazwyczaj można stosować szczep E. coli, taki jak np. szczep DH5a, dostępny w American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (nr dostępu 31343) oraz w handlu (Stratagene). Korzystne eukariotyczne komórki gospodarza obejmują komórki drożdżowe, chociaż można również efektywnie wykorzystywać komórki ssaków lub komórki owadów.
Zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym według wynalazku korzystnie transfekuje się lub transformuje jedną lub większą liczbę komórek gospodarza z zasadniczo homogennej hodowli komórek. Wektor ekspresyjny generalnie wprowadza się do komórek gospodarza zgodnie ze znanymi technikami, takimi jak np. transformacja protoplastów, wytrącanie fosforanem wapnia, traktowanie chlorkiem wapnia, mikroiniekcja, elektroporacja, transfekcja przez kontakt ze zrekombinowanym wirusem, transfekcja za pośrednictwem liposomów, transfekcja z zastosowaniem DEAE-dekstranu, transdukcja, koniugacja lub bombardowanie mikropociskami. Selekcję transformantów można prowadzić stosując standardowe procedury, takie jak selekcja pod kątem komórek, w których zachodzi ekspresja markera selekcyjnego, np. oporności na antybiotyk, związanego ze zrekombinowanym wektorem, jak opisano powyżej.
Po wprowadzeniu wektora ekspresyjnego do komórki gospodarza, integrację i utrzymywanie sekwencji kodującej aveC albo w chromosomie komórki gospodarza, albo episomalne, można potwierdzać standardowymi technikami, np. przez analizę poprzez hybrydyzację Southerna, analizę z zastosowaniem enzymów restrykcyjnych, analizę PCR, włącznie z PCR z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (rt-PCR), bądź przez oznaczenie immunologiczne do wykrywania oczekiwanego produktu genowego. Komórki gospodarza, które zawierają i/lub w których zachodzi ekspresja zrekombinowanej sekwencji kodującej aveC, można identyfikować dzięki któremukolwiek z co najmniej czterech dobrze znanych w tej dziedzinie podejść ogólnych, obejmujących: (i) hybrydyzację DNA-DNA, DNA-RNA lub RNA-antysensowny RNA; (ii) wykrywanie obecności funkcji genów „markerowych; (iii) oceną poziomu transkrypcji, mierzonego jako ekspresja specyficznych dla aveC transkryptów mRNA w komórce gospodarza oraz (iv) wykrywanie obecności dojrzałego produktu białkowego, mierzonej np. w oznaczeniu immunologicznym lub dzięki obecności aktywności biologicznej AveC (np. wytwarzanie awermektyn w określonych stosunkach lub ilościach, wskazujących na aktywność AveC w np. komórkach gospodarza S. avermitilis.
3. Ekspresja i charakteryzowanie zrekombinowanego produktu genowego AveC
Po stabilnym wprowadzeniu sekwencji kodującej aveC do odpowiedniej komórki gospodarza, stransformowaną komórkę namnaża się klonalnie i otrzymane w wyniku komórki można hodować w warunkach sprzyjających maksymalnemu wytwarzaniu produktu genowego AveC. Takie warunki zazwyczaj obejmują hodowanie komórek do wysokiej gęstości. Jeśli wektor ekspresyjny zawiera indukowalny promotor, wykorzystuje się odpowiednie warunki indukcji, np. zmianę temperatury, wyczerpanie składników odżywczych, dodanie nieniezbędnych czynników indukujących (np. analogów węglowodanów, takich jak izopropylo-e-tiogalaktopiranozyd (IPTG)), nagromadzanie nadmiaru metabolicznych produktów ubocznych lub podobne, jakie są potrzebne do indukcji ekspresji.
Gdy ulegający ekspresji produkt genowy AveC zostaje zachowany w komórkach gospodarza, komórki zbiera się i poddaje lizie, po czym produkt wydziela się z lizatu i oczyszcza w znanych warunkach ekstrakcji, zapewniających ograniczenie do minimum degradacji białka, np. w temperaturze 4°C i/lub w obecności inhibitorów proteazy. Gdy ulegający ekspresji produkt genowy AveC jest wydzielany z komórek gospodarza, wyczerpaną pożywkę można po prostu zebrać i wydzielić z niej produkt.
Produkt genowy AveC można izolować lub zasadniczo oczyszczać z lizatów komórkowych lub pożywki hodowlanej, jak jest to właściwe, stosując standardowe metody obejmujące, ale nie ograniczające się do jakiejkolwiek kombinacji następujących metod: wytrącania siarczanem amonu, frakcjonowania pod względem wielkości, chromatografii jonowymiennej, HPLC, wirowania w gradiencie gęstości oraz chromatografii powinowactwa. Jeśli ulegający ekspresji produkt genowy AveC wykazuje aktywność biologiczną, wzrastającą czystość preparatu można monitorować na każdym etapie procedury oczyszczania dzięki stosowaniu odpowiedniego oznaczenia. Niezależnie od tego, czy ulegający ekspresji produkt genowy AveC wykazuje aktywność biologiczną, czy nie, można go wykrywać w oparciu o np. wielkość lub reaktywność z przeciwciałem specyficznym wobec AveC, bądź dzięki obecności znacznika fuzyjnego. W znaczeniu stosowanym w opisie, produkt genowy AveC jest „zasadniczo oczyszczony, jeśli produkt stanowi więcej niż około 20% wagowych białka w określonym preparacie. Również, w znaczeniu stosowanym w opisie, produkt genowy AveC jest „wyizolowany, jeśli produkt stanowi co najmniej około 80% wagowych białka w określonym preparacie.
PL 203 818 B1
Wynalazek dostarcza zatem otrzymany przez rekombinacyjną ekspresję, wyizolowany lub zasadniczo oczyszczony produkt genowy AveC S. avermitilis zawierający sekwencję aminokwasów kodowaną przez sekwencję kodującą produkt genowy AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub sekwencję aminokwasów z fig. 1 (SEQ ID NO: 2), bądź ich zasadnicze części, oraz ich homologi.
Wynalazek dostarcza ponadto rekombinacyjnie wyeksprymowany, wydzielony lub zasadniczo oczyszczony homologiczny produkt genowy AveC S. hygroscopicus, zawierający sekwencję aminokwasów z SEQ ID NO: 4 lub jej zasadniczą część, oraz jej homologi.
Wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie wytwarzania produktu genowego AveC, obejmującego hodowanie komórki gospodarza stransformowanej zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym, przy czym ten wektor zawiera cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydów kodującą produkt genowy AveC, która to cząsteczka polinukleotydowa jest funkcyjnie połączona z jednym lub większą liczbą elementów regulują cych, które kontrolują ekspresję czą steczki polinukleotydowej w komórce gospodarza, w warunkach sprzyjających wytwarzaniu zrekombinowanego produktu genowego AveC, oraz odzyskiwanie produktu genowego AveC z hodowli komórkowej.
Otrzymywany przez rekombinacyjną ekspresję produkt genowy AveC S. avermitilis jest użyteczny do licznych celów, obejmujących przeszukiwanie pod kątem związków, które zmieniają funkcję produktu genowego AveC i w ten sposób modulują biosyntezę awermektyn, oraz indukowanie przeciwciał skierowanych przeciw produktowi genowemu AveC.
Po otrzymaniu produktu genowego AveC o dostatecznej czystości, można go charakteryzować standardowymi metodami, obejmującymi SDS-PAGE, chromatografię sączenia molekularnego, analizę sekwencji aminokwasów, aktywność biologiczną wytwarzania odpowiednich produktów szlaku biosyntezy awermektyn itd. Przykładowo, sekwencję aminokwasów produktu genowego AveC można określać stosując standardowe techniki sekwencjonowania peptydów. Produkt genowy AveC można dalej charakteryzować stosując analizę hydrofilowości (patrz np. Hopp i Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824) lub analogiczne algorytmy komputerowe, w celu zidentyfikowania hydrofobowych i hydrofilwych regionów produktu genowego AveC.
Można prowadzić analizę struktury w celu zidentyfikowania regionów produktu genowego AveC, które przyjmują określone struktury drugorzędowe. Do mapowania i badania miejsc oddziaływania pomiędzy produktem genowym AveC a jego substratem można stosować metody biofizyczne, takie jak krystalograficzną dyfrakcję promieni X (Engstrom, 1974, Biohem. Exp. Biol. 11: 7-13), modelowanie komputerowe (Flatterick i Zoller (red.), 1986, w: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) oraz jądrowy rezonans magnetyczny (NMR). Informacje otrzymane w tych badaniach można wykorzystywać do wyboru nowych miejsc mutacji otwartej ramki odczytu aveC dla ułatwienia tworzenia nowych szczepów S. avermitilis, mających bardziej pożądane właściwości wytwarzania awermektyn.
Konstruowanie i stosowanie mutantów AveC
Jak podano powyżej, wynalazek dostarcza cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydów, która jest taka sama jak allel aveC S. avermitilis lub jego zdegenerowany wariant, bądź sekwencja kodująca produkt genowy AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub jej zdegenerowany wariant, bądź sekwencja nukleotydów otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej zdegenerowany wariant, ale która ponadto zawiera jedną lub większą liczbę mutacji, tak że komórki szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zinaktywowano allel aveC typu dzikiego, i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydowej zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydów lub jej zdegenerowany wariant, wytwarzają awermektyny w innym stosunku lub ilości niż wytwarzane przez komórki szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego.
Według wynalazku, takie cząsteczki polinukleotydowe można stosować do tworzenia nowych szczepów S. avermitilis, które wykazują wykrywalną zmianę w wytwarzaniu awermektyn w porównaniu z tym samym szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego. Takie cząsteczki oligonukleotydowe są użyteczne do tworzenia nowych szczepów S. avermitilis, które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z tym samym szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego. W korzystnym rozwiązaniu, takie cząsteczki polinukleotydowe są użyteczne do tworzenia nowych szczepów S. avermitilis, które wytwarzają zwiększone poziomy awermektyn w porównaniu z tym samym szczepem, w którym zamiast tego zachodzi ekspresja tylko pojedynczego allelu aveC typu dzikiego. W dalszym korzystnym
PL 203 818 B1 rozwiązaniu, takie cząsteczki polinukleotydowe są użyteczne do tworzenia nowych szczepów S. avermitilis, w których zinaktywowano gen aveC.
Mutacje allelu lub sekwencji kodującej aveC obejmują dowolne mutacje, które wprowadzają jedną lub większą liczbę delecji, addycji lub podstawień aminokwasowych w produkcie genowym AveC bądź, których wynikiem jest skrócenie produktu genowego AveC lub ich kombinacja, oraz które dają pożądany wynik. Takie zmutowane sekwencje allelu aveC w zamierzeniu obejmują również jakiekolwiek ich zdegenerowane warianty. Przykładowo, wynalazek dostarcza cząsteczki polinukleotydowe zawierające sekwencję nukleotydów allelu aveC lub jej zdegenerowany wariant, bądź sekwencję kodującą produkt genowy AveC z plazmidu pSE186 (ATCC 209604) lub jej zdegenerowany wariant, bądź sekwencję nukleotydów otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) lub jej zdegenerowany wariant, ale które ponadto zawierają jedną lub większą liczbę mutacji, które kodują podstawienie reszty aminokwasowej inną resztą aminokwasową w wybranych pozycjach produktu genowego AveC. W kilku niegraniczających rozwiązaniach, z których kilka przykładowo przedstawiono poniżej, takich podstawień aminokwasowych można dokonywać w którejkolwiek z pozycji aminokwasów produktu genowego AveC, które odpowiadają pozycjom aminokwasów 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 lub 298 2 SEQ ID NO: 2, bądź w pewnych ich kombinacjach.
Mutacje sekwencji kodującej aveC prowadzi się którąkolwiek z szeregu znanych metod, włącznie ze stosowaniem dopuszczającej błędy PCR lub mutagenezy kasetkowej. Przykładowo, mutagenezę ukierunkowaną oligonukleotydami można wykorzystać do zmiany sekwencji allelu lub otwartej ramki odczytu aveC w określony sposób, taki jak np. wprowadzenie jednego lub większej liczby miejsc restrykcyjnych lub kodonu terminacji do określonych regionów w allelu lub otwartej ramce odczytu aveC. Do tworzenia dużych bibliotek polinukleotydów mających sekwencje nukleotydów kodujące mutacje aveC można również stosować takie metody, jak te opisane w opisach patentowych US 5605793, US 5830721 i US 5837458, obejmujące losową fragmentację, powtarzane cykle mutagenezy i tasowanie nukleotydów.
Użyteczne mogą być ukierunkowane mutacje, szczególnie jeśli służą do zmiany jednej lub większej liczby konserwatywnych reszt aminokwasowych w produkcie genowym AveC. Przykładowo, porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów produktów genowych AveC i homologicznych do AveC produktów genowych z S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) i S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4), jak przedstawiono na fig. 6, wskazuje miejsca o znacznej konserwatywności reszt aminokwasowych wśród tych gatunków. Ukierunkowana mutageneza, która prowadzi do zmiany jednej lub większej liczby z tych konserwatywnych reszt aminokwasowych, może być szczególnie skuteczna w tworzeniu nowych zmutowanych szczepów, które wykazują pożądane zmiany w wytwarzaniu awermektyn.
Mutageneza losowa również może być użyteczna, i można ją prowadzić przez eksponowanie komórek S. avermitilis na promieniowanie ultrafioletowe lub promienie X, bądź mutageny chemiczne, takie jak N-metylo-N'-nitrozoguanidyna, metanosulfonian etylu, kwas azotawy lub iperyty azotowe. Dla zapoznania się z przeglądem technik mutagenezy patrz np. Ausubel, 1989, powyżej.
Po utworzeniu zmutowanych cząsteczek polinukleotydowych, przeszukuje się je w celu określenia, czy mogą one modulować biosyntezę awermektyn w S. avermitilis. W korzystnym rozwiązaniu, cząsteczkę polinukleotydową mającą zmutowaną sekwencję polinukleotydową testuje się przez komplementację szczepu S. avermitilis, w którym zinaktywowano gen aveC dla otrzymania tła genetycznego ujemnego pod względem aveC (aveC-). W nieograniczającym sposobie, zmutowaną cząsteczkę polinukleotydową funkcyjnie łączy się w plazmidzie ekspresyjnym z jednym lub większą liczbą elementów regulujących, który to plazmid korzystnie zawiera również jeden lub większą liczbę genów oporności na lek dla umożliwienia selekcji stransformowanych komórek. Wektorem tym transformuje się następnie, stosując znane techniki, komórki gospodarza aveC-, i stransformowane komórki selekcjonuje się i hoduje w odpowiednich pożywkach fermentacyjnych w warunkach, które umożliwiają lub indukują wytwarzanie awermektyn. Produkty fermentacji analizuje się następnie przez HPLC dla określenia zdolności zmutowanej cząsteczki polinukleotydowej do komplementacji komórki gospodarza. Kilka wektorów zawierających zmutowane cząsteczki polinukleotydowe zdolne do obniżania stosunku awermektyn B2:B2, obejmujących pSE188, pSE199, pSE231, pSE239 i od pSE290 do pSE297, przykładowo przedstawiono w przykładzie 3 poniżej (część 3.3).
Wynalazek znajduje zastosowanie w sposobach identyfikowania mutacji otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis zdolnych do zmieniania stosunku i/lub zmieniania ilości wytwarzanych awermektyn.
PL 203 818 B1
Wynalazek znajduje zastosowanie zatem w sposobie identyfikowania mutacji otwartej ramki odczytu aveC zdolnych do zmieniania stosunku klas 2:1 wytwarzanych awermektyn, obejmującym: (a) określanie stosunku klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zinaktywowano natywny dla nich allel aveC i do których wprowadzono cząsteczkę polinukleotydową zawierającą sekwencję nukleotydów kodującą zmutowany produkt genowy AveC i ulega ona ekspresji; (b) określanie stosunku klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, jak w etapie (a), ale w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego lub allelu aveC zawierającego sekwencję nukleotydów otwartej ramki odczytu z fig. 1 (SEQ ID NO: 1), albo sekwencję nukleotydów, która jest do nich homologiczna, oraz (c) porównanie stosunku klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis z etapu (a) ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis z etapu (b), tak że jeśli stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis w etapie (a) jest różny od stosunku klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis z etapu (b), to zidentyfikowano mutację otwartej ramki odczytu aveC zdolną do zmieniania stosunku klas 2:1 awermektyn. Mutacja obniża stosunek klas 2:1 awermektyn.
Ponadto wynalazek znajduje zastosowanie w sposobie identyfikowania mutacji otwartej ramki odczytu aveC lub konstruktów genetycznych zawierających otwartą ramkę odczytu aveC, zdolnych do zmieniania ilości wytwarzanych awermektyn, obejmującym: (a) określanie ilości awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zinaktywowano natywny dla nich allel aveC i do których wprowadzono czą steczkę polinukleotydową zawierają c ą sekwencję nukleotydów kodują cą zmutowany produkt genowy AveC lub zawierającą konstrukt genetyczny zawierający sekwencję nukleotydów kodującą produkt genowy AveC i ulegają one ekspresji; (b) określanie ilości awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, jak w etapie (a), ale w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego lub sekwencji nukleotydów, która jest do niego homologiczna, oraz (c) porównanie ilości awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis z etapu (a) z ilością awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis z etapu (b), tak że jeśli ilość awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis z etapu (a) jest różna od ilości awermektyn wytwarzanych przez komórki S. avermitilis z etapu (b), to zidentyfikowano mutację otwartej ramki odczytu aveC lub konstruktu genetycznego zdolną do zmieniania ilości awermektyn. Mutacja zwiększa ilość wytwarzanych awermektyn.
Każdy z wymienionych powyżej sposobów identyfikowania mutacji przeprowadza się stosując hodowlane pożywki fermentacyjne korzystnie wzbogacone w kwas cykloheksanokarboksylowy, chociaż można również stosować inne odpowiednie prekursory będące kwasami tłuszczowymi, takie jak którykolwiek z będących kwasami tłuszczowymi prekursorów wymienionych w tabeli 1.
Po zidentyfikowaniu zmutowanej cząsteczki polinukleotydowej, która w pożądanym kierunku moduluje wytwarzanie awermektyn, można określić położenie mutacji w sekwencji nukleotydów. Przykładowo, cząsteczkę polinukleotydową mającą sekwencję nukleotydów kodującą zmutowany produkt genowy AveC można wyizolować przez PCR i poddać analizie sekwencji DNA stosując znane metody. Dzięki porównaniu sekwencji DNA zmutowanego allelu aveC z tą allelu aveC typu dzikiego, można określić mutację(e) odpowiedzialne za zmianę w wytwarzaniu awermektyn. W konkretnych, ale nieograniczających rozwiązaniach wynalazku, produkty genowe AveC S. avermitilis zawierające albo pojedyncze podstawienia aminokwasowe którejkolwiek z reszt 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) lub 230 (G230D), albo podwójne podstawienia w pozycjach 138 (S138T) i 139 (A139T lub A139F), dawały takie zmiany funkcji produktu genowego AveC, że zmieniony był stosunek klas 2:1 wytwarzanych awermektyn (patrz przykład 3 poniżej), przy czym wymienione pozycje aminokwasów odpowiadają tym przedstawionym na fig. 1 (SEQ ID NO: 2). Ponadto, wykazano, że każda z poniższych siedmiu kombinacji mutacji skutecznie obniża stosunek klas 2:1 awermektyn: (1) D48E/A89T, (2) S138T/A139T/G179S, (3) Q38P/L136P/E238D, (4) F99S/S138T/A139T/G179S, (5) A139T/M228T, (6) G111V/P289L, (7) A139T/K154E/Q298H. W znaczeniu stosowanym w opisie, podane powyżej oznaczenia, takie jak A139T, wskazują pierwotną resztę aminokwasową oznaczoną kodem jednoliterowym, którą w tym przykładzie jest alanina (A), we wskazanej pozycji, którą w tym przykładzie jest pozycja 139 (w odniesieniu do SEQ ID NO: 2) polipeptydu, po czym podaje się resztę aminokwasową, która zastępuje pierwotną resztę aminokwasową, którą w tym przykładzie jest treonina (T). Zgodnie z tym, wynalazek obejmuje cząsteczki polinukleotydowe mające sekwencje nukleotydów, które kodują zmutowane produkty genowe AveC S. avermitilis zawierające podstawienia lub delecje aminokwasowe
PL 203 818 B1 w jednej lub wię kszej liczbie pozycji aminokwasów 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179,
228, 230, 238, 266, 275, 289 lub 298 (patrz fig. 1) lub jakąkolwiek ich kombinacje.
W korzystnym rozwią zaniu, takie mutacje kodują podstawienia aminokwasowe wybrane z jednej lub większej liczby grup obejmujących:
(a) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 38 resztą aminokwasową P lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla P, (b) zastąpienie reszty aminokwasowej D w pozycji 48 resztą aminokwasową E lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla E, (c) zastąpienie reszty aminokwasowej A w pozycji 89 resztą aminokwasową T lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla T, (d) zastąpienie reszty aminokwasowej F w pozycji 99 resztą aminokwasową S lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla S, (e) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 111 resztą aminokwasową V lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla V, (f) zastąpienie reszty aminokwasowej L w pozycji 136 resztą aminokwasową P lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla P, (g) zastąpienie reszty aminokwasowej S w pozycji 138 resztą aminokwasową T lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla T, (h) zastąpienie reszty aminokwasowej A w pozycji 139 resztą aminokwasową T bądź F lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla T bądź F, (i) zastąpienie reszty aminokwasowej K w pozycji 154 resztą aminokwasową E lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla E, (j) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 179 resztą aminokwasową S lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla S, (k) zastąpienie reszty aminokwasowej M w pozycji 228 resztą aminokwasową T lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla T, (l) zastąpienie reszty aminokwasowej E w pozycji 238 resztą aminokwasową D lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla D, (m) zastąpienie reszty aminokwasowej P w pozycji 289 resztą aminokwasową L lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla L, (n) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 298 resztą aminokwasową H lub resztą aminokwasową, która stanowi konserwatywne podstawienie dla H, przy czym konserwatywne podstawienia aminokwasowe są takie jak zdefiniowano powyżej w części dotyczącej cząsteczek polinukleotydowych kodujących produkt genowy AveC S. avermitilis.
W dalszym korzystnym rozwiązaniu, takie mutacje kodują kombinacje podstawień aminokwasowych, przy czym kombinacja podstawionych reszt aminokwasowych jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe S138 i A139, (b) reszty aminokwasowe D48 i A89, (c) reszty aminokwasowe S138, A139 i G179, (d) reszty aminokwasowe Q38, L136 i E238, (e) reszty aminokwasowe F99, S138, A139 i G179, (f) reszt aminokwasowych A139 i M228, (g) reszty aminokwasowe G111 i P289 oraz (h) reszty aminokwasowe A139, K154 i Q298.
W dalszym korzystnym rozwią zaniu, okreś lone kombinacj mutacji allelu aveC uż yteczne do skutecznego obniżania stosunku klas 2:1 awermektyn według wynalazku są wybrane z jednej lub większej liczby grup obejmujących:
(a) S138T/A139T, (b) S138T/A139F, (c) D48E/A89T, (d) S138T/A139T/G179S, (e) Q38P/L136P/E238D, (f) F99S/S138T/A139T/G179S, (g) A139T/M228T, (h) G111V/P289L i (i) A139T/K154E/Q289H.
PL 203 818 B1
Wynalazek dostarcza ponadto kompozycje do tworzenia nowych szczepów S. avermitilis, których komórki zawierają zmutowany allel aveC, którego wynikiem jest zmiana wytwarzania awermektyn. Przykładowo, wynalazek dostarcza zrekombinowane wektory, które można stosować do kierowania którejkolwiek z cząsteczek polinukleotydowych zawierających zmutowane sekwencje nukleotydów według wynalazku do miejsca genu aveC w chromosomie S. avermitilis w celu albo wstawienia, albo zastąpienia otwartej ramki odczytu aveC lub jej części przez rekombinację homologiczną. Zgodnie z wynalazkiem, jednakże, cząsteczka polinukleotydowa zawierająca dostarczaną z nią zmutowaną sekwencję nukleotydów według wynalazku może również działać modulująco na biosyntezę awermektyn po wstawieniu do chromosomu S. avermitilis w miejscu innym niż gen aveC lub gdy jest utrzymywana episomalnie w komórkach S. avermitilis. Zatem wynalazek dostarcza również wektory zawierające cząsteczkę polinukleotydową zawierającą zmutowaną sekwencję nukleotydów według wynalazku, które to wektory można stosować do wstawiania cząsteczki polinukleotydowej w miejscu chromosomu S. avermitilis innym niż gen aveC, lub utrzymywania jej episomalnie.
Wynalazek dostarcza wektory do zastępowania genów, które można stosować do wstawiania zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanego wariantu do komórek szczepu S. avermitilis, w ten sposób tworząc nowe szczepy S. avermitilis, których komórki wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego. Takie wektory do zastępowania genów można konstruować stosując zmutowane cząsteczki polinukleotydowe obecne w wektorach ekspresyjnych, takich jak np. pSE188, pSE199 i pSE231, które to wektory ekspresyjne przykładowo przedstawiono w przykładzie 3 poniżej.
W dalszym korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza wektory, które można stosować do wstawiania zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanego wariantu do komórek szczepu S. avermitilis w celu utworzenia nowych szczepów komórek, które wytwarzają zmienione ilości awermektyn w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego. W korzystnym rozwiązaniu ilość awermektyn wytwarzanych przez komórki zwiększa się. W konkretnym, ale nieograniczającym rozwiązaniu, taki wektor zawiera ponadto silny promotor, znany w tej dziedzinie, taki jak np. silny konstytutywny promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea, który jest umieszczony przed i funkcyjnie połączony z allelem aveC. Takim wektorem może być plazmid pSE189, opisany w przykładzie 11 poniżej, lub można go skonstruować stosując zmutowany allel aveC z plazmidu pSE189.
W dalszym korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza wektory do zastępowania genów, które są użyteczne do inaktywacji genu aveC w szczepie S. avermitilis typu dzikiego. W nieograniczającym rozwiązaniu, takie wektory do zastępowania genów można konstruować stosując zmutowaną cząsteczkę polinukleotydową obecną w plazmidzie pSE180 (ATCC (ATCC 209605), który przykładowo opisano w przykładzie 3 poniżej (część 3.1) (fig. 3). Wynalazek dostarcza ponadto wektory do zastępowania genów, które zawierają cząsteczkę polinukleotydową zawierającą lub składającą się z sekwencji nukleotydowych, które naturalnie flankują gen aveC w chromosomie S. avermitilis in situ, obejmujących np. te nukleotydowe sekwencje flankujące, które przedstawiono na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), które to wektory można stosować do deletowania otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis.
Wynalazek dostarcza ponadto sposoby tworzenia nowych szczepów S. avermitilis obejmujących komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC i które wytwarzają awermektyny w obniżonym stosunku i/lub zmienionej ilości w porównaniu z komórkami tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego. W korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób tworzenia nowych szczepów S. avermitilis obejmujących komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC i które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu z komórkami tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, obejmujący transformowanie komórek szczepu S. avermitilis wektorem, który zawiera zmutowany allel aveC kodujący produkt genowy, który obniża stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja ich zmutowango allelu aveC, w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, oraz selekcjonowanie stransformowanych komórek, które wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego. W korzystniejszym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób tworzenia nowego szczepu S. avermitilis, obejmujący
PL 203 818 B1 transformowanie komórek szczepu S. avermitilis wektorem zdolnym do wprowadzania mutacji allelu aveC takich komórek, gdzie wynikiem mutacji allelu aveC jest podstawienie w kodowanym produkcie genowym AveC innej reszty aminokwasowej w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasów odpowiadających resztom aminokwasowym 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 lub 298 w SEQ ID NO: 2, tak że komórki szczepu S. avermitilis, w których tak zmutowano allel aveC, wytwarzają awermektyny o stosunku klas 2:1, który jest niższy od stosunku awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, z tym, że jeśli mutacja prowadzi do podstawienia tylko reszty aminokwasowej 139 lub następuje podwójna mutacja obejmująca resztę aminokwasową 139, to ta reszta aminokwasową 139 jest podstawiona przez F.
W znaczeniu stosowanym w opisie, jeśli resztę aminokwasową kodowaną przez allel aveC w chromosomie S. avermitilis lub w wektorze bądź wyizolowanej cząsteczce polinukleotydowej według wynalazku określa się jako „odpowiadającą określonej reszcie aminokwasowej w SEQ ID NO: 2, lub jeśli podstawienie aminokwasowe określa się jako występujące w określonej pozycji „odpowiadającej tej reszcie aminokwasowej, której przypisano konkretny numer w SEQ ID NO: 2, to w zamierzeniu odnoszą się one do reszty aminokwasowej w tym samym względnym położeniu w produkcie genowym AveC, którą specjalista w tej dziedzinie może szybko określić dzięki odniesieniu do sekwencji aminokwasów przedstawionej w opisie jako SEQ ID NO: 2.
Wynalazek dostarcza ponadto sposoby tworzenia nowych szczepów, w których określone mutacje znajdujące się w kodującym je allelu aveC podaje się jako zmiany zasad w określonych pozycjach nukleotydów allelu aveC, „odpowiadających określonym pozycjom nukleotydów przedstawionym w SEQ ID NO: 1. Podobnie jak powyżej w odniesieniu do odpowiadających pozycji aminokwasów, gdzie pozycję nukleotydu w allelu aveC określa się jako „odpowiadającą określonej pozycji nukleotydu w SEQ ID NO: 1, w zamierzeniu odnosi się do nukleotydu w takim samym względnym położeniu w sekwencji nukleotydów aveC, które specjalista w tej dziedzinie może szybko określić dzięki odniesieniu do sekwencji nukleotydów przedstawionej w opisie jako SEQ ID NO: 1.
W dalszym korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis obejmujących komórki, które wytwarzają awermektyny w zmienionych ilościach, obejmujący transformowanie komórek szczepu S. avermitilis wektorem, który zawiera zmutowany allel aveC lub konstrukt genetyczny obejmujący allel aveC, wynikiem ekspresji którego jest zmieniona ilości awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub konstruktu genetycznego w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko pojedynczego allelu aveC typu dzikiego, i selekcjonowanie stransformowanych komórek, które wytwarzają awermektyny w zmienionej ilości w porównaniu z ilością awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko pojedynczego allelu aveC typu dzikiego. W korzystnym rozwiązaniu, ilość awermektyn wytwarzanych w stransformowanych komórkach jest zwiększona.
W dalszym korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza sposób wytwarzania nowych szczepów S. avermitilis, których komórki zawierają zinaktywowany allel aveC, obejmujący transformowanie komórek szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja jakiegokolwiek allelu aveC, wektorem, który inaktywuje allel aveC, oraz selekcjonowanie stransformowanych komórek, w których allel aveC został zinaktywowany. W korzystnym, ale nieograniczającym rozwiązaniu, komórki szczepu S. avermitilis transformuje się wektorem do zastępowania genu, który zawiera allel aveC zinaktywowany przez mutację lub przez zastąpienie części allelu aveC sekwencją genu heterologicznego, i selekcjonuje się stransformowane komórki, w których natywny dla nich allel aveC zastąpiono zinaktywowanym allelem aveC. Inaktywację allelu aveC można określać przez analizę HPLC produktów fermentacji, jak opisano poniżej. W konkretnym, ale nieograniczającym rozwiązaniu opisanym w przykładzie 3 poniżej (część 3.1), allel aveC inaktywuje się przez wstawienie genu ermE z Saccharopolyspora erythraea do otwartej ramki odczytu aveC.
Wynalazek dostarcza ponadto nowe szczepy S. avermitilis obejmujące komórki, które stransformowano którąkolwiek z cząsteczek polinukleotydowych lub wektorów według wynalazku. W korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza nowe szczepy S. avermitilis obejmujące komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanego wariantu w miejsce, lub dodatkowo do allelu aveC typu dzikiego, przy czym komórki nowego szczepu wytwarzają awermektyny o obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC
PL 203 818 B1 typu dzikiego. Takie nowe szczepy są użyteczne w wytwarzaniu na dużą skalę awermektyn pożądanych w handlu, takich jak doramektyna. W korzystniejszym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza komórki S. avermitilis zawierające którąkolwiek z wymienionych powyżej mutacji lub kombinacji mutacji allelu aveC w pozycjach nukleotydowych odpowiadających tym wymienionym powyżej lub inaczej kodujących którekolwiek z wymienionych powyżej podstawień aminokwasowych w produkcie genowym AveC. Chociaż takie mutacje mogą występować w takich komórkach w elemencie pozachromosomalnym, takim jak plazmid, korzystne jest, aby takie mutacje występowały w allelu aveC położonym w chromosomie S. avermitilis. W korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza szczep Streptomyces avermitilis obejmujący komórki mające mutację allelu aveC, który koduje produkt genowy AveC mający podstawienie w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasów odpowiadających resztom aminokwasowym 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 lub 298 w SEQ ID NO: 2, przy czym komórki wytwarzają awermektyny o stosunku klas 2:1, który jest różny od stosunku awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja allelu aveC typu dzikiego.
Głównym celem opisanych w opisie oznaczeń przeszukiwania jest identyfikacja zmutowanych alleli genu aveC, których ekspresja w komórkach S. avermitilis zmienia, a dokładniej obniża stosunek klas 2:1 wytwarzanych awermektyn. W korzystnym rozwiązaniu, stosunek B2:B1 awermektyn wytwarzanych przez komórki nowego szczepu S. avermitilis według wynalazku, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanego wariantu według wynalazku, wynosi około 1,6:1 lub mniej. W korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 1:1 lub mniej. W korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,84:1 lub mniej. W korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,80:1 lub mniej. W korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,75:1 lub mniej. W korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,73:1 lub mniej. W korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,68:1 lub mniej. W jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,67:1 lub mniej. W korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,57:1 lub mniej. W jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,53:1 lub mniej. W jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,42:1 lub mniej. W jeszcze korzystniejszym rozwiązaniu, stosunek wynosi około 0,40:1 lub mniej.
W opisanym poniżej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku niższym niż 1,6:1. W innym opisanym poniżej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszącym około 0,94:1. W dalszym innym opisanym poniżej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,88:1. W dalszym innym opisanym poniż ej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszącym około 0,84:1. W jeszcze dalszym innym opisanym poniżej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,75:1. W jeszcze dalszym innym opisanym poniż ej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,73:1. W jeszcze dalszym innym opisanym poniż ej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,68:1. W jeszcze dalszym innym opisanym poniż ej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,67:1. W jeszcze dalszym innym opisanym poniż ej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,57:1. W jeszcze dalszym innym opisanym poniż ej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,53:1. W jeszcze dalszym innym opisanym poniż ej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,42:1. W jeszcze dalszym innym opisanym poniż ej konkretnym rozwiązaniu, nowe komórki według wynalazku wytwarzają awermektyny cykloheksylo-B2 i cykloheksylo-B1 w stosunku wynoszą cym okoł o 0,40:1.
W dalszym korzystnym rozwią zaniu, wynalazek dostarcza nowe szczepy S. avermitilis obejmujące komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanego wariantu, bądź konstruktu genetycznego zawierającego allel aveC lub jego zdegenerowany wariant, w miejsce lub dodatkowo do allelu aveC typu dzikiego, przy czym komórki nowego szczepu wytwarzają
PL 203 818 B1 zmienioną ilość awermektyn w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego. W korzystnym rozwiązaniu, nowy szczep wytwarza zwiększoną ilość awermektyn. W nieograniczającym rozwiązaniu, konstrukt genetyczny zawiera ponadto silny promotor, taki jak silny konstytutywny promotor ermE z Saccharopolyspora erythraea, położony przed i jest funkcyjnie połączony z otwartą ramką odczytu aveC.
W dalszym korzystnym rozwiązaniu, wynalazek dostarcza nowe szczepy S. avermitilis obejmujące komórki, w których zinaktywowano gen aveC. Takie szczepy są użyteczne zarówno ze względu na inne spektrum wytwarzanych przez nie awermektyn w porównaniu ze szczepem typu dzikiego, jak i oznaczenia przeszukiwania przez komplementację, jak opisano poniżej, do określania, czy ukierunkowana lub losowa mutageneza genu aveC wpływa na wytwarzanie awermektyn. W konkretnym rozwiązaniu opisanym poniżej, komórki gospodarza S. avermitilis zmieniono technikami inżynierii genetycznej w taki sposób, aby zawierały zinaktywowany gen aveC. Przykładowo, szczep SE180-11, opisany w przykładach poniżej, utworzono stosując plazmid do zastępowania genu pSE180 (ATCC 209605) (fig. 3), który skonstruowano do inaktywacji genu aveC S. avermitilis przez wstawianie genu oporności ermE do regionu kodującego aveC.
Wynalazek dostarcza ponadto otrzymywane przez rekombinacyjną ekspresję, zmutowane produkty genowe AveC S. avermitilis kodowane przez którąkolwiek z wymienionych powyżej cząsteczek polinukleotydowych według wynalazku oraz sposoby ich przygotowywania.
Jak podano powyżej, wynalazek dostarcza ponadto sposób wytwarzania awermektyn, obejmujący hodowanie w pożywkach hodowlanych komórek szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC, który koduje produkt genowy obniżający stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC, w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, w warunkach, które umożliwiają lub indukują wytwarzanie przez nie awermektyn, oraz odzyskiwanie tych awermektyn z hodowli. Sposób ten dostarcza zwiększoną wydajność wytwarzania awermektyn wartościowych w handlu, takich jak doramektyna.
Wynalazek dostarcza ponadto sposób wytwarzania awermektyn, obejmujący hodowanie w pożywkach hodowlanych komórek szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub konstruktu genetycznego zawierającego allel aveC, której wynikiem jest wytwarzanie zmienionej ilości awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub konstruktu genetycznego, w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których nie zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub konstruktu genetycznego, ale w których zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, w warunkach, które umożliwiają lub indukują wytwarzanie przez nie awermektyn, oraz odzyskiwanie tych awermektyn z hodowli. W korzystnym rozwiązaniu, ilość awermektyn wytwarzanych w hodowli przez komórki, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC, zdegenerowanego wariantu lub konstruktu genetycznego, jest zwiększona.
Wynalazek dostarcza ponadto nową kompozycję awermektyn wytwarzanych przez szczep S. avermitilis, w którym zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub jego zdegenerowanego wariantu, które kodują produkt genowy obniżający stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których zachodzi ekspresja zmutowanego allelu aveC lub zdegenerowanego wariantu, w porównaniu z komórkami tego samego szczepu, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, przy czym awermektyny w nowej kompozycji wytwarzane są w obniżonym stosunku klas 2:1 w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego. Nowa kompozycja awermektyn może występować w postaci wytwarzanej w hodowli fermentacyjnej po wyczerpaniu składników odżywczych brzeczki, bądź można ją z niej odzyskiwać. Nową kompozycję awermektyn można oczyszczać lub zasadniczo oczyszczać z brzeczki znanymi biochemicznymi technikami oczyszczania, takimi jak wytrącanie siarczanem amonowym, dializa, frakcjonowanie pod względem wielkości, chromatografia jonowymienna, HPLC itp.
Zastosowania awermektyn
Awermektyny są wysoce aktywnymi środkami przeciwpasożytniczymi, szczególnie użytecznymi jako środki przeciw robakom pasożytującym w jelitach, pasożytom zewnętrznym, owadom i roztoczom. Związki awermektynowe wytwarzane zgodnie ze sposobami według wynalazku są użyteczne do któregokolwiek z tych celów. Przykładowo, związki awermektynowe wytwarzane według wynalazku użyteczne są do leczenia różnych chorób i stanów u ludzi, szczególnie jeśli te choroby lub stany
PL 203 818 B1 powodowane są przez zakażenia pasożytami, jak wiadomo w tej dziedzinie. Patrz, np. Ikeda i Omura,
1997, Chem. Rev. 97 (7): 2591-2609. Bardziej szczegółowo, związki awermektynowe wytwarzane według wynalazku są skuteczne w leczeniu szeregu różnych chorób i stanów powodowanych przez pasożyty wewnętrzne, takie jak pasożytnicze nicienie, które mogą zakażać ludzi, zwierzęta domowe, trzodę chlewną, owce, drób, konie lub bydło.
Bardziej szczegółowo, związki awermektynowe wytwarzane według wynalazku są skuteczne wobec nicieni, które zakażają ludzi, jak również tych, które zakażają różne gatunki zwierząt. Takie nicienie obejmują pasożyty układu pokarmowego, takie jak Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria i pasożyty, które występują we krwi lub innych tkankach bądź narządach, takie jak filarie i jelitowe stadia Strongyloides i Trichinella.
Związki awermektynowe wytwarzane według wynalazku są również użyteczne do leczenia między innymi zakażeń pasożytami zewnętrznymi, obejmujących np. inwazje stawonogów u ssaków i ptaków powodowane przez kleszcze, roztocza, wszy, pchły, muchy z rodziny plujkowatych, owady żądlące lub wędrujące larwy dwuskrzydłych, które mogą atakować bydło i konie.
Związki awermektynowe wytwarzane według wynalazku są również użyteczne jako środki owadobójcze przeciw szkodnikom domowym, takim jak między innymi np. karaluch, mól odzieżowy, mrzyk i mucha domowa, jak również będącym owadami szkodnikom magazynowanego ziarna i roślin uprawnych, obejmującym między innymi odżywiające się roślinami roztocza z rodziny przędziorkowatych, mszyce, gąsienice i prostoskrzydłe, takie jak szarańcze.
Zwierzęta, które można leczyć związkami awermektynowymi wytwarzanymi według wynalazku obejmują owce, bydło, konie, zwierzynę płową, kozy, trzodę chlewną, ptaki, włącznie z drobiem, oraz psy i koty.
Związek awermektynowy wytworzony według wynalazku podaje się w postaci odpowiedniej dla określonego zamierzonego zastosowania, określonego gatunku leczonego zwierzęcia żywiciela i zwalczanego pasożyta lub owada. Do stosowania jako środek przeciwpasożytniczy, związek awermektynowy wytworzony według wynalazku można podawać doustnie w postaci kapsułki, dużej pigułki, tabletki lub leku do podawania w płynie bądź, alternatywnie, można go podawać jako płyn do stosowania zewnętrznego lub przez iniekcję bądź jako wszczep. Takie postacie przygotowuje się w zwykły sposób zgodnie ze standardową praktyką weterynaryjną. Zatem kapsułki, duże pigułki lub tabletki można przygotowywać przez mieszanie składnika czynnego z odpowiednim silnie rozdrobnionym rozcieńczalnikiem lub nośnikiem, dodatkowo zawierającym czynnik rozdrabniający i/lub lepiszcze, takie jak skrobia, laktoza, talk, stearynian magnezowy itp. Postać do podawania w płynie można przygotowywać przez rozproszenie składnika czynnego w roztworze wodnym razem z czynnikiem dyspergującym lub zwilżającym, itp. Preparaty iniekcyjne można przygotowywać w formie jałowego roztworu, który może zawierać inne substancje, takie jak np. sole i/lub glukozę, w ilości wystarczającej do zapewnienia izotoniczności roztworu wobec krwi.
Takie preparaty będą różnić się pod względem wagi składnika czynnego zależnie od pacjenta, leczonego gatunku zwierzęcia żywiciela, ciężkości i rodzaju zakażenia oraz masy ciała żywiciela. Generalnie, do podawania doustnego wystarczająca będzie dawka składnika czynnego od około 0,001 do 10 mg na kg masy ciała pacjenta lub zwierzęcia, podawana jako pojedyncza dawka lub w dawkach podzielonych w ciągu od 1 do 5 dni. Jednakże, mogą wystąpić przypadki, w których wskazane są wyższe lub niższe zakresy dawek, określone np. przez lekarza lub weterynarza w oparciu o objawy kliniczne.
Alternatywnie, związek awermektynowy wytworzony według wynalazku można podawać w połączeniu z karmą zwierzęcą, i do tego celu można przygotowywać zatężony dodatek paszowy lub przedmieszkę do mieszania z normalną karmą dla zwierząt.
Do stosowania jako środek owadobójczy oraz do stosowania wobec szkodników rolniczych, związek awermektynowy wytworzony według wynalazku można stosować jako spray, pył, emulsję i podobne, zgodnie ze standardową praktyką rolniczą.
P r z y k ł a d 1: Fermentacja Streptomyces avermitilis i analiza stosunku klas B2:B1 awermektyn
Szczepy pozbawione aktywności zarówno dehydrogenazy 2-oksokwasów o rozgałęzionych łańcuchach, jak i 5-O-metylotransferazy, nie wytwarzają w ogóle awermektyn, jeśli pożywki fermentacyjnej nie uzupełniono o kwasy tłuszczowe. Przykład ten wykazuje, że w przypadku takich mutantów można otrzymać awermektyny o szerokim zakresie stosunków klas B2:B1, jeśli biosyntezę rozpoczyna się w obecności różnych kwasów tłuszczowych.
PL 203 818 B1
1.1. Materiały i metody
Streptomyces avermitilis ATCC 53692 przechowywano w temperaturze -70°C jako pełną brzeczkę przygotowaną w pożywce do wysiewania składającej się ze skrobi (Nadex, Laing National) 20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 g; Ardamine pH (Yeast Products Inc.) - 5 g; węglanu wapnia - 1 g. Końcową objętość doprowadzano do 1 litra wodą wodociągową, wartość pH doprowadzono do 7,2 i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.
Dwa ml rozmrożonej zawiesiny powyższego preparatu stosowano do inokulacji kolby zawierającej 50 ml tej samej pożywki. Po inkubacji w ciągu 48 godzin w temperaturze 28°C na wytrząsarce obrotowej przy 180 obrotach na minutę, 2 ml brzeczki stosowano do inokulacji kolby zawierającej 50 ml pożywki produkcyjnej składającej się ze skrobi - 80 g; węglanu wapnia - 7 g; Pharmamedia - 5 g; wodorofosforanu dipotasowego -1 g, siarczanu magnezu - 1 g; kwasu glutaminowego - 0,6 g; heptahydratu siarczanu żelaza(II) - 0,01 g; siarczanu cynku - 0,001 g; siarczanu manganu - 0,001 g. Końcową objętość doprowadzano do 1 litra wodą wodociągową, pH doprowadzano do 7,2 i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.
Różne substraty będące kwasami karboksylowymi (patrz tabela 1) rozpuszczano w metanolu i dodawano do brzeczki fermentacyjnej po 24 godzinach od inokulacji, do uzyskania końcowego stężenia 0,2 g/litr. Brzeczkę fermentacyjną inkubowano w ciągu 14 dni w temperaturze 28°C, następnie brzeczkę wirowano (2500 obrotów na minutę w ciągu 2 minut) i supernatant odrzucano. Osad grzybni wyekstrahowano acetonem (15 ml), następnie dichlorometanem (30 ml) i fazy organiczne oddzielono, sączono, a następnie odparowywano do sucha. Pozostałość rozpuszczano w metanolu (1 ml) i analizowano przez HPLC stosując chromatograf cieczowy Hewlett-Packard
1090A wyposażony w skanujący detektor z układem diod, nastawiony na długość fali 240 nm. Stosowaną kolumną była kolumna Beckman Ultrasphere C-18, 5 μm, 4,6 mm x 25 cm, utrzymywana w temperaturze 40°C. Na kolumnę wstrzykiwano 25 μl powyżej opisanego roztworu w metanolu. Elucję prowadzano stosując liniowy gradient metanol-woda w stosunkach od 80:20 do 95:5 w ciągu 40 minut z szybkością przepływu 0,85 ml/minutę. Do kalibracji odpowiedzi detektora stosowano dwa standardowe stężenia awermektyny cykloheksylo-B1 i mierzono powierzchnię pól pod krzywymi dla awermektyn B2 i B1.
1.2. Wyniki
Uzyskane w HPLC czasy retencji obserwowane dla awermektyn B2 i B1 oraz stosunki klas 2:1, przedstawiono w tabeli 1.
T a b e l a 1
Czas retencji HPLC (minuty) Stosunek
Substrat B2 B1 B2:B1
Kwas 4-tetrahydropiranokarboksyl owy 8,1 14,5 0,25
Kwas izomasłowy 10,8 18,9 0,5
Kwas furano-3-karboksylowy 7,6 14,6 0,62
Kwas S-(+)-2-metylomasłowy 12,8 21,6 1,0
Kwas cykloheksanokarboksylowy 16,9 26,0 1,6
Kwas 3-tiofenokarboksylowy 8,8 16,0 1,8
Kwas cyklopentanokarboksylowy 14,2 23,0 2,0
Kwas 3-trifluorometylomasłowy 10,9 18,8 3,9
Kwas 2-metylopentanowy 14,5 24,9 4,2
Kwas cykloheptanokarboksylowy 18,6 29,0 15,0
Dane przedstawione w tabeli 1 wykazują skrajnie szeroki zakres stosunków klas B2:B1 awermektyn, wskazując na znaczącą różnicę w wynikach dehydratacyjnej konwersji związków klasy 2 w związki klasy 1, w zależności od charakteru wyjściowej jednostki łańcucha bocznego kwasu tłuszczowego, którym uzupełniano pożywkę. Wskazuje to, że zmiany w stosunkach klas B2:B1 wynikające ze zmian w białku AveC mogą być specyficzne wobec konkretnych substratów. W konsekwencji, prze28
PL 203 818 B1 szukiwanie pod kątem mutantów wykazujących zmiany stosunku klas B2:B1 uzyskiwane dla konkretnego substratu, powinno się przeprowadzać w obecności tego substratu. W kolejnych, opisanych poniżej przykładach, jako substrat przy przeszukiwaniu stosowano kwas cykloheksanokarboksylowy.
Jednakże, substrat ten stosuje się jedynie dla przykładowego przedstawienia możliwości, i nie jest zamiarem ograniczanie stosowalności wynalazku.
P r z y k ł a d 2: Izolowanie genu aveC
W przykładzie opisano izolowanie i charakteryzowanie regionu chromosomu Streptomyces avermitilis, który koduje produkt genowy AveC. Jak wykazano poniżej, gen aveC zidentyfikowano jako zdolny do modyfikowania stosunku wytwarzanych awermektyn cykloheksylo-B2 do cykloheksylo-B1 (B2:B1).
2.1. Materiały i metody
2.1.1. Hodowla Streptomyces do izolowania DNA
Do hodowli Streptomyces stosowano następującą metodę. Pojedyncze kolonie S. avermitilis ATCC 31272 (izolat nr 2 z pojedynczej kolonii) wyizolowano na pożywce YPD-6 o 1/2 stężenia składników, zawierającej: ekstrakt drożdżowy Difco - 5 g; Bacto-pepton Difco - 5 g; dekstrozę - 2,5 g; MOPS - 5 g; Bacto-agar Difco - 15 g. Końcową objętość doprowadzono do 1 litra destylowaną H2O, pH doprowadzono do 7,0 i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.
Grzybnie wyhodowane w powyższej pożywce stosowano do inokulacji 10 ml pożywki TSB (bulion sojowo-tryptozowy Difco -30 g, w 1 litrze destylowanej H2O, autoklawowany w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut) w probówce o wymiarach 25 mm x 150 mm, którą utrzymywano, z mieszaniem, wytrząsaniem (300 obrotów na minutę) w temperaturze 28°C w ciągu 48-72 godzin.
2.1.2. Izolowanie chromosomalnego DNA ze Streptomyces
Próbki (0,25 ml lub 0,5 ml) grzybni wyhodowanej w sposób opisany powyżej umieszczono w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i komórki zatężono przez wirowanie przy 12000 x g w cią gu 60 sekund. Supernatant odrzucono i komórki ponownie zawieszono w 0,25 ml buforu TSE (20 ml 1,5 M sacharozy; 2,5 ml 1M Tris-HCl, pH 8,0; 2,5 ml 1M EDTA, pH 8,0 i 75 ml destylowanej H2O) zawierającego 2 mg/ml lizozymu. Próbki inkubowano, z wytrząsaniem, w temperaturze 37°C w cią gu 20 minut, umieszczono w urządzeniu do automatycznego izolowania kwasów nukleinowych AutoGen 540™ (Integrated Separation Systems, Natick, MA) i genomowy DNA izolowano stosując Cycle 159 (program urządzenia) zgodnie z instrukcjami producenta.
Alternatywnie, 5 ml grzybni umieszczono w probówce o wymiarach 17 mm x 100 mm, komórki zatężono przez wirowanie przy 3000 obrotów na minutę w ciągu 5 minut i usunięto supernatant. Komórki ponownie zawieszono w 1 ml buforu TSE, zatężono przez wirowanie przy 3000 obrotów na minutę w ciągu 5 minut i usunięto supernatant. Komórki ponownie zawieszono w 1 ml buforu TSE zawierającego 2 mg/ml lizozymu i inkubowano, z wytrząsaniem, w temperaturze 37°C w ciągu 3060 minut. Po inkubacji dodano 0,5 ml 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i komórki inkubowano w temperaturze 37°C do zajścia pełnej lizy. Lizat inkubowano w temperaturze 65°C w ciągu 10 minut, ochłodzono do temperatury pokojowej, rozdzielono do dwóch probówek Eppendorfa o pojemności 1,5 ml i wyekstrahowano jeden raz 0,5 ml mieszaniny fenol/chloroform (50% fenol zrównoważ ony uprzednio 0,5 M Tris, pH 8,0; 50% chloroform). Fazę wodną usunięto i wyekstrahowano 2 do 5 razy mieszaniną chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1). DNA wytrącono przez dodanie 1/10 objętości 3M octanu sodu, pH 4,8, inkubowano mieszaninę na lodzie w ciągu 10 minut, odwirowano mieszaninę przy 15000 obrotów na minutę w temperaturze 5°C w ciągu 10 minut, przeniesiono supernatant do czystej probówki, do której dodano 1 objętość izopropanolu. Mieszaninę supernatantu z izopropanolem inkubowano następnie na lodzie w ciągu 20 minut, odwirowano przy 15000 obrotów na minutę w ciągu 20 minut w temperaturze 5°C, supernatant usunięto, a osad DNA przemyto 1 raz 70% etanolem. Po wyschnięciu osadu DNA ponownie zawieszono w buforze TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0).
2.1.3. Izolowanie plazmidowego DNA ze Streptomyces
Próbkę (1,0 ml) grzybni umieszczano w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i komórki zatężano przez wirowanie przy 12000 x g w ciągu 60 sekund. Supernatant odrzucano, komórki ponownie zawieszano w 1,0 ml 10,3% sacharozy i zatężano przez wirowanie przy 12000 x g w ciągu 60 sekund i odrzucano supernatant. Następnie komórki ponownie zawieszano w 0,25 ml buforu TSE zawierającego 2 mg/ml lizozymu i inkubowano, z wytrząsaniem, w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut, umieszczano w urządzeniu do automatycznego izolowania kwasów nukleinowych AutoGen 540™. Plazmidowy DNA izolowano stosując Cycle 106 (program urządzenia) zgodnie z instrukcjami producenta.
PL 203 818 B1
Alternatywnie, 1,5 ml grzybni umieszczano w probówkach do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i komórki zatężano przez wirowanie przy 12000 x g w ciągu 60 sekund. Supernatant odrzucano, komórki ponownie zawieszano w 1,0 ml 10,3% sacharozy i zatężano przez wirowanie przy 12000 x g w ciągu 60 sekund i odrzucono supernatant. Komórki ponownie zawieszano w 0,5 ml buforu TSE zawierającego 2 mg/ml lizozymu i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 15-30 minut. Po inkubacji dodawano 0,25 ml zasadowego SDS (0,3N NaOH, 2% SDS) i komórki inkubowano w temperaturze 55°C w ciągu 15-30 minut lub dopóki roztwór nie stał się klarowny. Do roztworu DNA dodawano octanu sodu (0,1 ml, 3M, pH 4,8), a następnie inkubowano na lodzie w ciągu 10 minut. Próbki DNA wirowano przy 14000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 5°C. Supernatant przenoszono do czystej probówki, dodawano 0,2 ml mieszaniny fenol:chloroform (50% fenol:50% chloroform) i delikatnie mieszano. Roztwór DNA wirowano przy 14000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut w temperaturze 5°C i górną warstwę przenoszono do czystej probówki Eppendorfa. Dodawano izopropanolu (0,75 ml), roztwór delikatnie mieszano, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut. Roztwór DNA wirowano przy 14000 obrotów na minutę w ciągu 15 minut w temperaturze 5°C, supernatant usuwano, a osad DNA przemywano 70% etanolem, suszono i ponownie zawieszano w buforze TE.
2.1.4. Izolowanie plazmidowego DNA z E. coli
Pojedynczymi stransformowanymi koloniami E. coli zaszczepiano 5 ml pożywki Luria-Bertani (LB) (Bacto-Trypton -10 g, Bacto-ekstrakt drożdżowy - 5 g i NaCl - 10 g w 1 litrze destylowanej H2O, pH 7,0; autoklawowane w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut i uzupełnione o 100 μg/ml ampicyliny). Hodowlę inkubowano przez noc i próbkę o objętości 1 ml umieszczano w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Próbki hodowli umieszczano w urządzeniu do automatycznego izolowania kwasów nukleinowych AutoGen 540™ i plazmidowy DNA izolowano stosując Cycle 3 (program urządzenia) zgodnie z instrukcjami producenta.
2.1.5. Przygotowywanie i transformowanie protoplastów S. avermitilis
Pojedyncze kolonie S. avermitilis izolowano na YPD-6 o 1/2 stężenia składników. Grzybnie stosowano do inokulacji 10 ml pożywki TSB w probówce o wymiarach 25 x 150 mm, które następnie inkubowano, z wytrząsaniem (300 obrotów na minutę), w temperaturze 28°C w ciągu 48 godzin. Do inokulacji 50 ml pożywki YEME stosowano 1 ml grzybni. Pożywka YEME zawiera w 1 litrze: ekstrakt drożdżowy Difco - 3 g; Bacto-pepton Difco -5 g; ekstrakt słodowy Difco - 3 g; sacharozę - 300 g. Po autoklawowaniu w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut dodawano następujące składniki: 2,5 M MgCl2 x 6 H2O (osobno autoklawowany w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut) - 2 ml; oraz glicynę (20%) (wysterylizowaną przez sączenie) - 25 ml.
Grzybnie hodowano w temperaturze 30°C w ciągu 48-72 godzin i zbierano przez wirowanie w probówkach do wirowania o pojemności 50 ml (Falcon) przy 3000 obrotów na minutę w ciągu 20 minut. Supernatant odrzucano i grzybnie ponownie zawieszano w buforze P, który zawiera: sacharozę 205 g; K2SO4 -0,25 g; MgCl2 x 6 H2O - 2,02 g; H2O - 600 ml; K2PO4 (0,5%) -10 ml; roztwór mikroelementów* - 20 ml; CaCl2 x 2 H2O (3,68%) - 100 ml i bufor MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml. (*Roztwór mikroelementów zawiera na litr: ZnCl2 - 40 mg; FeCl3 x 6 H2O -200 mg; CuCl2 x 2 H2O - 10 mg; MnCl2 x 4 H2O - 10 mg; Na2B4O7 x 10 H2O - 10 mg; (NH4)6Mo7O24 x 4 H2O - 10 mg). pH doprowadzano do 6,5, końcową objętość doprowadzano do 1 litra i pożywkę sączono na gorąco przez sączek o średnicy porów 0,45 mikrona.
Grzybnię osadzano przy 3000 obrotów na minutę w ciągu 20 minut, supernatant odrzucano i grzybnie ponownie zawieszano w 20 ml buforu P zawierającego 2 mg/ml lizozymu. Grzybnie inkubowano, z wytrząsaniem, w temperaturze 35°C w ciągu 15 minut i sprawdzano mikroskopowo w celu określenia stopnia utworzenia protoplastów. Po zakończeniu tworzenia się protoplastów, protoplasty wirowano przy 8000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut. Supernatant usuwano, a protoplasty ponownie zawieszano w 10 ml buforu P. Protoplasty wirowano przy 8000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut, supernatant usuwano, protoplasty ponownie zawieszono w 2 ml buforu P, i w przybliżeniu 1 x 109 protoplastów rozdzielono do naczynek do zamrażania o pojemności 2 ml (Nalgene).
Naczynko zawierające 1 x 109 protoplastów wirowano przy 8000 obrotów na minutę w ciągu 10 minut, supernatant usuwano i protoplasty ponownie zawieszano w 0,1 ml buforu P. Do protoplastów dodawano od 2 do 5 μg transformującego DNA, a następnie natychmiast 0,5 ml roboczego buforu T. Podstawowy bufor T zawiera: PEG-1000 (Sigma) - 25 g; sacharozę - 2,5 g; H2O - 83 ml. pH doprowadzano do 8,8 stosując IN NaOH (wyjałowiony przez sączenie), podstawowy bufor T wyjaławiano przez sączenie i przechowywano w temperaturze 4°C. Roboczy bufor T, przygotowywany w dniu użycia,
PL 203 818 B1 zawierał podstawowy bufor T - 8,3 ml; K2PO4 (4 mM) - 1,0 ml; CaCl2 x 2 H2O (5 M) - 0,2 ml; oraz TES (1 M, pH 8) - 0,5 ml. Każdy składnik roboczego buforu T oddzielnie wyjaławiano przez sączenie.
W cią gu 20 sekund od dodania buforu T do protoplastów, dodawano również 1,0 ml buforu P i protoplasty wirowano przy 8000 obrotów na minutę w cią gu 10 minut. Supernatant odrzucano i protoplasty ponownie zawieszano w 0,1 ml buforu P. Protoplasty wysiewano następnie na płytki z pożywką RM14, która zawiera: sacharozę - 205 g; K2SO4 - 0,25 g; MgCl2 x 6 H2O -10,12 g; glukozę - 10 g; hydrolizat kazeiny Difco - 0,1 g; ekstrakt drożdżowy Difco - 5 g; pożywkę agarową z mąki owsianej Difco - 3 g; Bacto-agar Difco - 22 g; destylowana H2O -800 ml. Roztwór autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut. Po autoklawowaniu, dodawano następujące jałowe roztwory podstawowe: K2PO4 (0,5%) - 10 ml; CaCl2 x 2 H2O (5 M) - 5 ml; L-prolina (20%) - 15 ml; bufor MES (1,0 M, pH 6,5) - 10 ml; roztwór mikroelementów (taki sam jak powyżej) - 2 ml; roztwór podstawowy cykloheksoimidu (25 mg/ml) - 40 ml; i 1 N NaOH - 2 ml. Pożywkę RM14 rozlewano po 25 ml na płytkę i płytki suszono w ciągu 24 godzin przed użyciem.
Protoplasty inkubowano przy 95% wilgotności w temperaturze 30°C w ciągu 20-24 godzin.
W celu wyselekcjonowania transformantów opornych na tiostrepton, 1 ml buforu pokrywają cego, zawierającego 125 μg na ml tiostreptonu, rozprowadzano równomiernie na płytkach z pożywką regeneracyjną RM14. Bufor pokrywający zawiera na 100 ml: sacharozę - 10,3 g; roztwór mikroelementów (taki sam jak powyżej) - 0,2 ml; oraz MES (1 M, pH 6,5) - 1 ml. Protoplasty inkubowano przy 95% wilgotności w temperaturze 30°C w ciągu 7-14 dni, dopóki nie pojawiły się kolonie oporne na tiostrepton (Thior).
2.1.6. Transformowanie protoplastów Streptomyces lividans
W niektórych przypadkach do transformacji stosowano S. lividans TK64 (dostarczony przez John Innes Institute, Norwich, Wielka Brytania). Metody i pożywki do wzrostu, otrzymywania protoplastów i transformowania S. lividans opisano w Hopwood i in., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Wielka Brytania, i prowadzano je w sposób tam opisany. Plazmidowy DNA izolowano z transformantów S. lividans w sposób opisany w części 2.1.3. powyżej.
2.1.7. Analiza fermantacji szczepów S. avermitilis
Grzybnie S. avermitilis wyhodowane na pożywce YPD-6 o 1/2 stężenia składników w ciągu 4-7 dni stosowano do inokulacji probówek o wymiarach 24,4 x 152,4 mm (1 x 6 cali), zawierających 8 ml wcześniej utworzonej pożywki i 2 szklane perełki o średnicy 5 mm. Pożywka zawiera: skrobię rozpuszczalną (albo drobną, gotowaną skrobię, albo KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/litr; Pharmamedia - 15 g/litr; Ardamine pH - 5 g/litr (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaCO3 - 2 g/lir; 2 x bcfa („bcfa odnosi się kwasów tłuszczowych o rozgałęzionych łańcuchach) o stężeniu końcowym w pożywce 50 ppm kwasu 2-(+/-)-metylomasłowego, 60 ppm kwasu izomasłowego i 20 ppm kwasu izowalerianowego. Wartość pH doprowadzono do 7,2 i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.
Probówkę wytrząsano pod kątem 17° przy 215 obrotach na minutę w temperaturze 29°C w ciągu 3 dni. Próbkę hodowli zaszczepiającej o objętości 2 ml stosowano do inokulacji kolby Erlenmeyera o pojemności 300 ml, zawierającej 25 ml pożywki produkcyjnej, która zawiera: skrobię (albo drobną, gotowaną skrobię, albo KOSO) - 160 g/litr; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/litr; Ardamine pH - 10 g/litr; K2HPO4 - 2 g/litr; MgSO4 x 4 H2O - 2 g/litr; FeSO4 x 7 H2O -0,02 g/litr; MnCl2 - 0,002 g/litr; ZnSO4 x 7 H2O - 0,002 g/litr; CaCO3 - 14 g/litr; 2 x bcfa (jak powyżej); oraz kwas cykloheksanokarboksylowy (CHC) (przygotowany jako 20% roztwór o pH 7,0) - 800 ppm. Wartość pH doprowadzono do 6,9 i pożywkę autoklawowano w temperaturze 121°C w ciągu 25 minut.
Po inokulacji kolby inkubowano w temperaturze 29°C w ciągu 12 dni, wytrząsając przy 200 obrotach na minutę. Po inkubacji z kolby pobierano próbkę o objętości 2 ml, rozcieńczono 8 ml metanolu, mieszano i mieszaninę wirowano przy 1250 x g w ciągu 10 minut w celu usunięcia pozostałości komórkowych. Supernatant następnie oznaczano przez HPLC stosując kolumnę ODS Beckman Ultrasphere (25 cm x średnica wewnętrzna 4,6 mm) przy szybkości przepływu 0,75 ml/minutę i detekcję przez absorbancję przy długości fali 240 nm. Fazą ruchomą była mieszanina metanol/woda/acetonitryl w stosunkach 86/8,9/5,1.
2.1.8. Izolowanie genów PKS S. avermitilis
Przygotowano bibliotekę kosmidową chromosomalnego DNA S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) i hybrydyzowano z sondą ketosyntazy (KS) przygotowaną z fragmentu genu syntazy poliketydowej (PKS) Saccharopolyspora erythraea. Szczegółowy opis przygotowywania bibliotek kosmidowych można
PL 203 818 B1 znaleźć w Sambrook i in., 1989, powyżej. Szczegółowy opis przygotowywania bibliotek chromosomalnego DNA Streptomyces przedstawiono w Hopwood i in., 1985, powyżej. Klony kosmidowe zawierające regiony hybrydyzujące z sondą ketosyntazy zidentyfikowano przez hybrydyzację z fragmentem Ndel/Eco47III o długości 2,7 Kb z pEX26 (dostarczonego dzięki uprzejmości dr P. Leadlay, Cambridge, Wielka Brytania). Około 5 ng pEX26 strawiono stosując NdeI i Eco47III. Mieszaninę reakcyjną nałożono na 0,8% żel agarozowy Sea Plaque GTG (FMC BioProducts, Rockland, ME). Po elektroforezie z żelu wycięto fragment Ndel/Eco47III o długości 2,7 Kb i DNA odzyskano z żelu stosując GELase™ z Epicentre Technologies stosując Fast Protocol. Fragment Ndel/Eco47III o długości 2,7 Kb wyznakowano [a-32P]dCTP (5'-trifosforan deoksycytydyny, sól tetra(trietyloamonowa), [a-32P]-) (NEN-Dupont, Boston, MA) stosując BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Inc. Gaithersburg, MD) zgodnie z instrukcjami dostawcy. Typową reakcję prowadzano w objętości 0,05 ml. Po dodaniu μl buforu zatrzymującego, wyznakowany DNA oddzielano od niewłączonych nukleotydów stosując kolumnę G-25 Sephadex Quick Spin™ (Boehringer Mannheim) zgodnie z instrukcjami dostawcy.
Około 1800 klonów kosmidowych przeszukano przez hybrydyzację kolonijną. Zidentyfikowano 10 klonów, które silnie hybrydyzowały z sondą KS Sacc. erythraea. Kolonie E. coli zawierające kosmidowy DNA hodowano w płynnej pożywce LB i kosmidowy DNA wyizolowano z każdej hodowli w urządzeniu do automatycznego izolowania kwasów nukleinowych AutoGen 540™, stosując Cycle 3 (program urządzenia) zgodnie z instrukcjami producenta. Mapowanie endonukleazami restrykcyjnymi i analiza przez hybrydyzację z zastosowaniem Blottingu Southerna wykazały, że pięć klonów zawierało zachodzące na siebie regiony chromosomu. Przez analizę zachodzących na siebie kosmidów i hybrydyzacje skonstruowano genomową mapę restrykcyjną BamHI S. avermitilis pięciu kosmidów (tj. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) (fig. 4).
2.1.9. Identyfikowanie DNA, który moduluje stosunki klas B2:B1 awermektyn i identyfikowanie otwartej ramki odczytu aveC
Do sprawdzania zsubklonowanych fragmentów pochodzących z klonu kosmidowego pSE66 pod względem zdolności modulowania stosunku klas B2:B1 awermektyn w mutantach AveC stosowano następujące metody. pSE66 (5 μg) strawiono Sacl i SamHI. Mieszaninę reakcyjną nałożono na 0,8% żel agarozowy SeaPlaque™ GTG (FMC BioProducts), po elektroforezie z żelu wycięto fragment Sacl/SamHI o długości 2,9 Kb i DNA odzyskano z żelu stosując GELase™ (Epicentre Technologies), stosując Fast Protocol. Około 5 μg wektora wahadłowego pWHM3 (Vara i in., 1989, J. Bacteriol. 171: 5872-5881) strawiono SacI i SarnHI. Około 0,5 μg wstawki o długości 2,9 Kb i 0,5 μg strawionego pWHM3 zmieszano razem i inkubowano przez noc z 1 jednostką ligazy (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) w temperaturze 15°C, w całkowitej objętości 20 pi, zgodnie z instrukcjami dostawcy. Po inkubacji, 5 pl mieszaniny ligacyjnej inkubowano w temperaturze 70°C w ciągu 10 minut, ochłodzono do temperatury pokojowej i stosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli DH5a (BRL) zgodnie z instrukcjami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność wstawki SacI/SamHI o długości 2,9 Kb potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten oznaczono pSE119.
Przygotowano protoplasty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis (szczep wewnętrzny Pfizer) i stransformowano je pSE119 w sposób opisany w części 2.1.5 powyżej. Szczep 1100-SC-38 jest mutantem, który wytwarza znacznie więcej awermektyny w postaci cykloheksylo-B2 w porównaniu z awermektyną w postaci cykloheksylo-B1, jeśli stosuje się uzupełnianie pożywki kwasem cykloheksanokarboksylowym (B2:B1 około 30:1). pSE119 stosowany do transformacji protoplastów S. avermitilis wyizolowano albo ze szczepu GM2163 E. coli (otrzymanego od dr B.J. Bachmanna, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), albo ze szczepu DM1 E. coli (BRL), albo ze szczepu TK64 S. lividans. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu 1100-SC38 i produkty fermentacji analizowano przez HPLC. Transformanty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis zawierające pSE119 wytwarzały awermektyny o zmienionym stosunku klas cykloheksyloB2:cykloheksyloB1, wynoszącym około 3,7:1 (patrz tabela 2).
Po ustaleniu, że pSE119 jest zdolny do modulowania stosunków klas B2:B1 awermektyn w mutancie AveC, wstawkę DNA zsekwencjonowano. Stosując, zgodnie z instrukcjami producenta, zestaw do izolowania plazmidowego DNA (Qiagen, Valencia, CA), wyizolowano około 10 pg pSE119 i zsekwencjonowano stosując ABI 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA). Dane o sekwencjach składano i redagowano stosując programy Genetic Computer Group (GCG, Madison, WI). Sekwencję DNA i otwartą ramkę odczytu aveC przedstawiono na fig. 1 (SEQ ID NO: 1).
PL 203 818 B1
Nowy plazmid, oznaczony pSE118, skonstruowano w następujący sposób. Około 5 μg pSE66 strawiono SphI i BamHI. Mieszaninę reakcyjną nałożono na 0,8% żel agarozowy SeaPlaque™ GTG (FMC BioProducts), po elektroforezie wycięto z żelu fragment SphI/BamHI o długości 2,8 Kb i DNA odzyskano z żelu stosując GELase™ (Epicentre Technologies), stosując Fast Protocol. Około 5 μg wektora wahadłowego pWHM3 strawiono SphI i BamHI. Około 0,5 μg wstawki o długości 2,8 Kb i 0,5 μg strawionego pWHM3 zmieszano i inkubowano przez noc z 1 jednostką ligazy (New England Biolabs) w temperaturze 15°C, w całkowitej objętości 20 μ!, zgodnie z instrukcjami dostawcy. Po inkubacji, 5 μl mieszaniny ligacyjnej inkubowano w temperaturze 70°C w ciągu 10 minut, ochłodzono do temperatury pokojowej i zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli DH5a zgodnie z instrukcjami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność wstawki Sphl/BamHI o długości 2,8 Kb potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten oznaczono pSE118. Wstawki DNA w pSE118 i pSE119 zachodziły na siebie około 838 nukleotydami (fig. 4).
Protoplasty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis stransformowano pSE118 w sposób opisany powyżej. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu 1100-SC38 i produkty fermentacji analizowano przez HPLC. Transformanty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis zawierające pSE118 wytwarzały awermektyny o niezmienionym stosunku klas cykloheksyloB2:cykloheksyloB1 w porównaniu ze szczepem 1100-SC38 (patrz tabela 2).
2.1.10 Amplifikowanie przez PCR genu aveC z chromosomalnego DNA S. avermitilis
Z chromosomalnego DNA S. avermitilis wyizolowano fragment o długości około 1,2 Kb, zawierający otwartą ramkę odczytu aveC, stosując amplifikację przez PCR z wykorzystaniem starterów zaprojektowanych na podstawie sekwencji nukleotydów aveC, otrzymanej w sposób opisany powyżej. Startery PCR dostarczono z Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawostronny był następujący: 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO: 6); a starter lewostronny był następujący: 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO: 7). Reakcję PCR prowadzono stosując polimerazę Deep Vent™ (New England Biolabs) w buforze dostarczonym przez producenta i w obecności 300 μΜ dNTP, 10% glicerolu, 200 pmoli każdego ze starterów, 0,1 μg matrycy oraz 2,5 jednostek enzymu w końcowej objętości 100 μί, stosując urządzenie do cyklicznych zmian temperatury Perkin-Elmer Cetus. Profil temperatur w pierwszym cyklu był następujący: 95°C w ciągu 5 minut (etap denaturacji), 60°C w ciągu 2 minut (etap hybrydyzacji) i 72°C w ciągu 2 minut (etap wydłużania). Profil temperatur w następnych 24 cyklach był podobny, z tym wyjątkiem, że etap denaturacji skrócono do 45 sekund, a etap hybrydyzacji skrócono do 1 minuty.
Produkt PCR poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym i stwierdzono jeden prążek DNA odpowiadający długości około 1,2 Kb. Ten DNA oczyszczono z żelu i zligowano z 25 ng przeprowadzonego w postać liniową wektora o tępych końcach, pCR-Blunt (Invitrogen), przy stosunku molowym wektora do wstawki 1:10, zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaninę ligacyjną zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli One Shot™ (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność wstawki o długości około 1,2 Kb potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten oznaczono pSEl79.
Wstawkę DNA z pSE179 wyizolowano przez strawienie BamHI/XbaI, rozdzielono przez elektroforezę, oczyszczono z żelu i zligowano z wektorem wahadłowym pWHM3, który również strawiono BamHI/Xbal, przy całkowitym stężeniu DNA 1 μg przy stosunku molowym wektora do wstawki 1:5. Mieszaninę ligacyjną użyto do transformacji kompetentnych komórek E. coli DH5a zgodnie z instrukcjami producenta. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność wstawki o długości około 1,2 Kb potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmidem tym, oznaczonym pSE186 (fig. 2, ATCC 209604), stransformowano E. coli DM1 i z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA.
2.2. Wyniki
Stwierdzono, że fragment Sacl/BamHl o długości 2,9 Kb z pSE119, jeśli stransformuje się nim szczep 1100-SC38 S. avermitilis, znacząco zmienia stosunek klas B2:B1 wytwarzanych awermektyn. Stosunek klas B2:B1 dla szczepu 1100-CS38 S. avermitilis wynosi normalnie około 30:1, ale po stransformowaniu wektorem zawierającym fragment SacI/BamHl o długości 2,9 Kb stosunek klas B2:B1 awermektyn obniża się do około 3,7:1. Analiza hodowli transformatów po fermentacji potwierdziła obecność transformującego DNA.
Fragment pSE119 o długości 2,9 Kb zsekwencjonowano i zidentyfikowano otwartą ramkę odczytu o długości około 0,9 Kb (fig. 1) (SEQ ID NO: 1), która obejmuje fragment Pstl/SphI, który
PL 203 818 B1 uprzednio zmutowano tak, aby dawał tylko produkt B2 (Ikeda i in., 1995, powyżej). Porównanie tej otwartej ramki odczytu lub odpowiadającego jej przewidywanego polipeptydu ze znanymi bazami danych (GenEMBL, SWISS-PROT) nie wykazało żadnej silnej homologii do znanych sekwencji DNA lub białka.
Tabela 2 przedstawia analizę fermentacji szczepu 1100-SC38 S. avermitilis stransformowanego różnymi plazmidami.
T a b e l a 2
Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący) Liczba testowanych transformantów Średni stosunek B2:B1
1100-SC38(brak) 9 30,66
1100-SC38(pWHM3) 21 31,3
1100-SC38(pSE119) 12 3,7
1100-SC38 (pSE118) 12 30,4
1100-SC38(pSE185) 14 27,9
P r z y k ł a d 3: Konstruowanie mutantów AveC S. avermitilis
Przykład ten opisuje konstruowanie kilku różnych mutantów AveC S. avermitilis z zastosowaniem podłóż i metod opisanych powyżej. Ogólny opis technik wprowadzania mutacji do genu Streptomyces podano w Kieser i Hopwood, 1991, Meth. Enzym., 204: 430-458. Bardziej szczegółowego opisu dostarczają Anzali i in., 1988, J. Antibiot. XLI(2): 226-233 oraz Stutzman-Engwall i in., 1992, J. Bacteriol. 174(1): 144-154.
3.1. Inaktywowanie genu aveC S. avermitilis
Mutanty AveC zawierające zinaktywowane geny aveC skonstruowano stosując kilka sposobów, jak opisano szczegółowo poniżej.
Zgodnie z pierwszym sposobem, wewnętrzny fragment Sphl/Pstl o długości 640 bp genu aveC w pSE119 (plazmid opisany w przykładzie 2, części 2.1.9. powyżej) zastąpiono genem ermE (oporności na erytromycynę) z Sacc. erythraea. Gen ermE wyizolowano z pIJ4026 (dostarczonego przez John Innes Institute, Norwich, Wielka Brytania; patrz również Bibb i in., 1985, Gene 41: 357-368) przez trawienie enzymami restrykcyjnymi Bglll i EcoRI, a następnie elektroforezę i oczyszczanie z żelu.
Fragment ten, o długości około 1,7 Kb, zligowano z pGEM7Zf (Promega), który strawiono BamHI i EcoRI, i mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a zgodnie z instrukcjami producenta. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność wstawki o długości około 1,7 Kb potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten oznaczono pSE27.
pSE118 (opisany w przykładzie 2, części 2.1.9 powyżej) strawiono SphI i BamHI, produkty trawienia poddano elektroforezie i z żelu oczyszczono wstawkę SphI/BamHI o długości około 2,8 Kb. pSE119 strawiono Pstl i EcoRI, produkty trawienia poddano elektroforezie i z żelu oczyszczono wstawkę PstI/EcoRI o długości około 1,5 Kb. Wektor wahadłowy pWHM3 strawiono BamHI i EcoRI. pSE27 strawiono Pstl i SphI, produkty trawienia poddano elektroforezie i z żelu oczyszczono wstawkę Pstl/SphI o długości około 1,7 Kb. Wszystkie cztery fragmenty (tj. o długościach około 2,8 Kb, około 1,5 Kb, około 7,2 Kb i około 1,7 Kb) i zligowano razem przez czteroskładnikową ligację. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a zgodnie z instrukcjami producenta. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten oznaczono pSE180 (fig. 3; ATCC 209605).
pSE180 stransformowano S. lividans TK64 i stransformowane kolonie zidentyfikowano dzięki oporności na tiostrepton i erytromycynę. pSE180 wyizolowano z S. lividans i zastosowano do transformacji protoplastów S. avermitilis. Zidentyfikowano cztery transformanty S. avermitilis oporne na tiostrepton, przygotowano protoplasty i wysiano je na pożywkę RM14 w warunkach nieselekcyjnych. Po regeneracji protoplastów, pojedyncze kolonie przeszukiwano pod kątem występowania oporności na erytromycynę i braku oporności na tiostrepton, co wskazywałoby na włączenie do chromosomu zinaktywowanego genu aveC i utratę wolnego replikonu. Zidentyfikowano jednego transformanta ErmrThios i oznaczono go jako szczep SE180-11. Ze szczepu SE180-11 wyizolowano całkowity
PL 203 818 B1 chromosomalny DNA, strawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI, HindHl, Pstl lub SphI, rozdzielono przez elektroforezę w 0,8% żelu agarozowym, przeniesiono na membranę nylonową i hybrydyzowano z sondą ermE. Analizy te wykazały, że włączenie do chromosomu genu oporności ermE i jednoczesna delecja fragmentu Pstl/SphI o długości 640 bp zaszły dzięki podwójnemu zdarzeniu rekombinacji. Analiza przez HPLC produktów fermentacji szczepu SE180-11 wykazała, że normalne awermektyny nie były już wytwarzane (fig. 5A).
Zgodnie z drugim sposobem inaktywacji genu aveC, z chromosomu szczepu SE180-11 S. avermitilis usunięto gen ermeE o długości 1,7 Kb, pozostawiając w genie aveC delecję Pstl/SphI o długości 640 bp. Plazmid do zastępowania genu skonstruowano w następujący sposób: pSE180 strawiono częściowo Xbal i z żelu oczyszczono fragment o długości około 11,4 Kb. Prążek odpowiadający fragmentowi o długości około 11,4 Kb jest pozbawiony genu oporności ermE o długości 1,7 Kb. Następnie DNA zligowano i stransformowano nim komórki E. coli DH5a. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten, oznaczony pSE184, zastosowano do transformacji E. coli DM1 i z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA. Plazmidem tym stransformowano protoplasty szczepu SE180-11 S. avermitilis. Z opornych na tiostrepton transformantów szczepu SE180-11 przygotowano protoplasty i wysiano je tak, aby uzyskać pojedyncze kolonie na RM14. Po regeneracji protoplastów, pojedyncze kolonie przeszukano pod kątem braku zarówno oporności na erytromycynę, jak i oporności na tiostrepton, co wskazywałoby na włączenie do chromosomu zinaktywowanego genu aveC i utratę wolnego replikonu zawierającego gen ermE. Zidentyfikowano jednego transformanta ErmsThios i oznaczono go SE184-1-13. Analiza produktów fermentacji szczepu SE184-1-13 wykazała, że normalne awermektyny nie były już wytwarzane, oraz że SE184-1-13 wykazywał taki sam profil fermentacji stosując HPLC, jak SE180-11.
Zgodnie z trzecim sposobem inaktywacji genu aveC, do chromosomalnego genu aveC wprowadzono zmianę ramki odczytu przez dodanie, przy wykorzystaniu PCR, dwóch G po C w 471 pozycji nukleotydu, w ten sposób tworząc miejsce BspE1. Obecność wprowadzonego technikami inżynierii genetycznej miejsca BspE1 była użyteczna do wykrywania przypadków zastąpienia genu. Zaprojektowano startery do PCR do wprowadzenia mutacji zmiany ramki odczytu do genu aveC; dostarczyła je firma Genosys Biotechnologies, Inc. Starter prawostronny był następujący: 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO: 8); a starter lewostronny był następujący: 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 9). Warunki PCR były takie same jak opisano w przykładzie 2, części 2.1.10 powyżej. Produkt PCR o długości 666 bp strawiono SphI, otrzymując dwa fragmenty o długościach, odpowiednio, 278 bp i 388 bp. Fragment o długości 388 bp oczyszczono z żelu.
Plazmid do zastępowania genu skonstruowano w następujący sposób: wektor wahadłowy pWHM3 strawiono EcoRI i BamHI. pSE119 strawiono BamHI i SphI, produkt trawienia poddano elektroforezie i z żelu oczyszczono fragment o długości około 840 bp. pSE119 strawiono EcoRI i Xmnl, produkt trawienia poddano elektroforezie i oczyszczono z żelu fragment o długości około 1,7 Kb. Wszystkie cztery fragmenty (tj. o długościach około 7,2 Kb, około 840 bp, około 1,7 Kb, około 388 bp) i zligowano razem w czteroskładnikowej ligacji. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmidem tym, oznaczonym pSE185, stransformowano E. coli DM1 i z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA. Plazmid ten zastosowano to transformacji protoplastów szczepu 1100-SC38 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu 1100-SC38 i analizowano przez HPLC produkty ich fermentacji. pSE185 nie zmieniał znacząco stosunku klas B2:B1 awermektyn, jeśli stransformowano nim szczep 1100-SC38 S. avermitilis (tabela 2).
pSE185 zastosowano do transformacji protoplastów S. avermitilis w celu utworzenia mutacji zmiany ramki odczytu w chromosomalnym genie aveC. Z transformantów opornych na tiostrepton przygotowano protoplasty i wysiano na płytki z pożywką RM14, aby uzyskać pojedyncze kolonie. Po regeneracji protoplastów, pojedyncze kolonie przeszukano pod kątem braku oporności na tiostrepton. Z kolonii wrażliwych na tiostrepton wyizolowano chromosomalny DNA i przeszukano przez PCR pod kątem obecności włączonej do chromosomu mutacji zmieniającej ramkę odczytu. Startery do PCR zaprojektowano na podstawie sekwencji nukleotydów aveC; dostarczyła je firma Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawostronny był następujący : 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO: 10), a starter lewostronny był następujący: 5'-GAACCGACCGCCTGATAC-3' (SEQ ID NO: 11), a warunki PCR były takie same jak opisano w części 2.1.10 powyżej. Produkt PCR miał
PL 203 818 B1 długość 543 bp, a po strawieniu BspE1 obserwowano trzy fragmenty o długościach 368 bp, 96 bp i 79 bp, co wskazuje na włączenie do chromosomu zinaktywowanego genu aveC i utratę wolnego replikonu.
Analiza fermentacji mutantów S. avermitilis mających mutację zmiany ramki odczytu w genie aveC wykazała, że normalne awermektyny nie były już wytwarzane oraz że mutanty te wykazują taki sam profil fermentacji, jak szczepy SE180-11 i SE184-1-13. Zidentyfikowano jednego transformanta Thios i oznaczono go jako szczep SE185-5a.
Ponadto, utworzono mutację w genie aveC, która zmienia w pozycji nukleotydu 520 G na A, wynikiem czego jest zmiana ko-donu kodującego tryptofan (W) w pozycji 116 na kodon terminacji. Szczep S. avermitilis z taką mutacją nie wytwarzał już normalnych awermektyn i wykazywał taki sam profil fermentacji, jak szczepy SE180-11, SE184-1-13 i SE185-5a.
Ponadto, utworzono mutacje w genie aveC, które zmieniają zarówno: (i) pozycję nukleotydu 970 z G na A, co zmienia aminokwas w pozycji 266 z glicyny (G) na asparaginian (D), oraz (ii) pozycję nukleotydu 996 z T na C, co zmienia aminokwas w pozycji 275 z tyrozyny (Y) na histydynę (H). Szczep S. avermitilis z takimi mutacjami (G256D/Y275H) nie wytwarzał już normalnych awermektyn i wykazywał taki sam profil fermentacji, jak szczepy SE180-11, SE184-1-13 i SE185-5a.
Szczepy mutantów S. avermitilis ze zinaktywowanym aveC, SE180-11, SE-184-1-13, SE185-5a, oraz inne dostarczone wraz z nimi, stanowią narzędzia do przeszukiwania w celu oszacowywania działania innych mutacji w genie aveC. pSE186, który ma kopię typu dzikiego genu aveC, stransformowano E. coli DM1 i z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA. Ten DNA pSE186 zastosowano do transformacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano transformanty szczepu SE180-1 oporne na tiostrepton, określano występowanie oporności na erytromycynę i transformanty ThiorErmr analizowano pod kątem produktów fermentacji przez HPLC. Obecność funkcjonalnego genu aveC w pozycji trans była zdolna do przywracania normalnego wytwarzania awermektyn w szczepie SE180-11 (fig. 5B).
3.2. Analiza mutacji genu aveC, które zmieniają stosunek klas B2:B1
Jak opisano powyżej, szczep SE180-11 S. avermitilis zawierający zinaktywowany gen aveC, ulegał komplementacji w wyniku transformacji plazmidem zawierającym funkcjonalny gen aveC (pSE186). Szczep SE180-11 wykorzystano również do scharakteryzowania innych mutacji w genie aveC, jak opisano poniżej.
Ze szczepu 1100-SC38 wyizolowano chromosomalny DNA i zastosowano jako matrycę do amplifikacji genu aveC przez PCR. Otwartą ramkę odczytu o długości 1,2 Kb wyizolowano stosując ampifikację przez PCR z wykorzystaniem starterów zaprojektowanych na podstawie sekwencji nukleotydów aveC. Starterem prawostronnym była SEQ ID NO: 6, a starterem lewostronnym była SEQ ID NO: 7 (patrz przykład 2, część 2.1.10 powyżej). Warunki PCR i subklonowania były takie, jak opisano w przykładzie 2, części 2.1.10. Analiza sekwencji DNA otwartej ramki odczytu o długości 1,2 Kb wykazała mutację w genie aveC, która zmienia pozycję nukleotydu 337 z C na T, co zmienia aminokwas w pozycji 55 z seryny (S) na fenyloalaninę (F). Gen aveC zawierają cy mutację S55F zsubklonowano w pWHM3 tworzą c plazmid, który oznaczono pSE187, i który zastosowano do transformacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11, określano oporność na erytromycynę i transformanty Thior Ermr analizowano pod kątem produktów fermentacji stosując HPLC.
Obecność genu aveC kodującego zmianę reszty aminokwasowej w pozycji 55 (S55F) była zdolna do przywracania normalnego wytwarzania awermektyn przez szczep SE180-11 (fig. 5C); jednakże stosunek klas cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wynosił około 26:1, w porównaniu ze szczepem SE180-11 stransformowanym pSE186 wykazującym stosunek klas B2:B1 wynoszący około 1,6:1 (tabela 3), co wskazuje, że pojedyncza mutacja (S55F) moduluje ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1.
Zidentyfikowano inną mutację genu aveC, która zmienia pozycję nukleotydu 862 z G na A, co zmienia aminokwas w pozycji 230 z glicyny (G) na asparaginian (D). Szczep S. avermitilis mający taką mutację (G230D) wytwarza awermektyny o stosunku klas B2:B1 około 30:1.
3.3. Mutacje, które obniżają stosunek klas B2:B1
Kilka mutacji, które obniżają ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1, skonstruowano w następujący sposób.
Zidentyfikowano mutację genu aveC, która zmienia pozycję nukleotydu 588 z G na A, co zmienia aminokwas w pozycji 139 z alaniny (A) na treoninę (T). Gen aveC zawierający mutację A139T zsubklonowano w pWHM3, tworząc plazmid, który oznaczono pSE188 i który zastosowano do trans36
PL 203 818 B1 formacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu pSE180-11, określono występowanie oporności na erytromycynę i transformanty Thior Ermr analizowano pod kątem produktów fermentacji przez HPLC. Obecność zmutowanego genu aveC kodującego zmianę reszty aminokwasowej w pozycji 139 (A139T) była zdolna do przywrócenia wytwarzania awermektyn przez szczep SE180-11 (fig. 5D), jednakże, stosunek klas B2:B1 wynosił około 0,94:1, co wskazuje, że ta mutacja obniża ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1. Wynik ten był niespodziewany, ponieważ opublikowane wyniki, jak również wyniki mutacji opisanych powyżej, wykazywały jedynie albo inaktywację genu aveC, albo podwyższone wytwarzanie awermektyny w postaci B2 w stosunku do postaci B1 (tabela 3).
Ponieważ mutacja A139T zmieniała stosunek klas B2:B1 w korzystniejszym kierunku B1, skonstruowano mutację, która koduje treoninę zamiast seryny w 138 pozycji aminokwasu. Zatem pSE186 strawiono EcoRI i sklonowano w pGEM3Zf (Promega), uprzednio strawionym EcoRI. Plazmid ten, oznaczony pSE186a, strawiono Apal i KpnI, fragmenty DNA rozdzielono w żelu agarozowym i z żelu oczyszczono dwa fragmenty o długościach około 3,8 Kb i około 0,4 Kb. Wstawkę DNA o długości około 1,2 Kb z pSE186 zastosowano jako matrycę do PCR dla wprowadzenia pojedynczej zmiany zasady w pozycji nukleotydu 585. Zaprojektowano startery do PCR dla wprowadzenia mutacji w pozycji nukleotydu 585; dostarczyła je firma Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawostronny był następujący: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO: 12); a starter lewostronny był następujący:
5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO: 13). Reakcję PCR przeprowadzano stosując zestaw Advantage GC genomie PCR (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) w buforze dostarczonym przez producenta w obecności 200 μM dNTP, 200 pmoli każdego startera, 50 ng matrycy DNA, 1,0 M GC-Melt i 1 jednostki KlenTaq Polymerase Mix w końcowej objętości 50 gl. Profil temperatur w pierwszym cyklu był następujący: 94°C w ciągu 1 minuty; a następnie 25 cykli: 94°C w ciągu 30 sekund i 68°C w ciągu 2 minut; i 1 cykl: 68°C w ciągu 3 minut. Produkt PCR o długości 295 bp strawiono Apal i KpnI w celu uwolnienia fragmentu o długości 254 bp, który oddzielono przez elektroforezę i oczyszczono z żelu. Wszystkie trzy fragmenty (o długościach około 3,8 Kb, około 0,4 Kb i 254 bp) zligowano razem przez trójskładnikową ligację. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten oznaczono pSE198.
pSE198 strawiono EcoRI, sklonowano w pWHM3, który uprzednio strawiono EcoRI, i stransformowano nim komórki E. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną i analizę sekwencji DNA. Plazmidem tym stransformowano E. coli DM1, z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten, oznaczony pSE199, zastosowano do transformacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11, określano występowanie oporności na erytromycynę i transformanty Thior Ermr analizowano pod kątem produktów fermentacji przez HPLC. Obecność zmutowanego genu aveC kodującego zmianę reszty aminokwasowej w pozycji 138 (S138T) była zdolna do przywrócenia normalnego wytwarzania awermektyn przez szczep SE180-11, jednakże, stosunek klas B2:B1 wynosił 0,88:1, co wskazuje, że ta mutacja obniża ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1 (tabela 3). Ten stosunek B2:B1 był nawet niższy niż stosunek 0,94:1 obserwowany dla mutacji A139T utworzonej przez transformację szczepu SE180-11 pSE188, jak opisano powyżej.
Inną mutację skonstruowano dla wprowadzenia treoniny w dwóch pozycjach aminokwasów, 138 i 139. Wstawkę DNA o długości około 1,2 Kb z pSE186 wykorzystano jako matrycę do PCR. Startery do PCR zaprojektowano dla wprowadzenia mutacji w pozycjach nukleotydów 585 i 588; dostarczyła je firma Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawostronny był następujący:
5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID NO: 14); a starter lewostronny był następujący: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). Reakcję PCR przeprowadzano stosując warunki opisane bezpośrednio powyżej w tej części. Produkt PCR o długości 449 bp strawiono Apal i KpnI w celu uwolnienia fragmentu o długości 254 bp, który oddzielono przez elektroforezę i oczyszczono z żelu. pSE186a strawiono Apal i KpnI, fragmenty DNA rozdzielono w żelu agarozowym i z żelu oczyszczono dwa fragmenty o długościach około 3,8 Kb i około 0,4 Kb. Wszystkie trzy fragmenty (o długościach około 3,8 Kb, około 0,4 Kb i 254 bp) zligowano razem w trzyskładnikowej ligacji, i mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli
PL 203 818 B1
DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten oznaczono pSE230.
pSE230 strawiono EcoRI, sklonowano w pWHM3, który uprzednio strawiono EcoRI, i stransformowano nim komórki E. coli DH5a. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną i analizę sekwencji DNA. Tym plazmidowym DNA stransformowano E. coli DM1, z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten, oznaczony pSE231, zastosowano do transformacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11, określano występowanie oporności na erytromycynę i transformanty Thior Ermr analizowano przez fermentację. Obecność podwójnie zmutowanego genu aveC kodującego S138T/A139T była zdolna do przywrócenia normalnego wytwarzania awermektyn przez szczep SE180-11, jednakże, stosunek klas B2:B1 wynosił 0,84:1, co wskazuje, że ta mutacja dalej obniża ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1 (tabela 3), w większym stopniu, niż uzyskany przez transformację szczepu SE180-11 pSE188 lub pSE199, jak opisano powyżej.
W celu dalszego obniżenia ilości cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1 skonstruowano inną mutację. Ponieważ mutacje S138T/A139T zmieniają stosunek B2:B1 w korzystniejszym kierunku B1, skonstruowano mutację wprowadzającą treoninę w pozycji aminokwasu 138 i fenyloalaninę w pozycji aminokwasu 139. Jako matrycę do PCR wykorzystano wstawkę DNA o długości około 1,2 Kb z pSE186. Zaprojektowano startery do PCR dla wprowadzenia mutacji w pozycjach nukleotydów 585 (zmieniająca T na A), 588 (zmieniająca G na T) i 589 (zmieniająca C na T); dostarczyła je firma Genosys Biotechnologies, Inc. (Teksas). Starter prawostronny był następujący: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3' (SEQ ID NO: 25); a starter lewostronny był następujący: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). Reakcję PCR przeprowadzano stosując zestaw Advantage GC genomie PCR (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) w buforze dostarczonym przez producenta w obecności 200 μM dNTP, 200 pmoli każdego startera, 50 ng matrycy DNA, 1,1 mM octanu Mg, 1,0 M GC-Melt i 1 jednostki polimerazy DNA Tth w końcowej objętości 50 pl. Profil temperatur w pierwszym cyklu był następujący: 94°C w ciągu 1 minuty; a następnie 25 cykli: 94°C w ciągu 30 sekund i 68°C w ciągu 2 minut; i 1 cykl: 68°C w ciągu 3 minut. Produkt PCR o długości 449 bp strawiono Apal i KpnI w celu uwolnienia fragmentu 254 bp, który oddzielono przez elektroforezę i oczyszczono z żelu. Wszystkie trzy fragmenty (około 3,8 Kb, około 0,4 Kb i 254 bp) zligowano razem w trzyskładnikowej ligacji. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten oznaczono pSE238.
pSE238 strawiono EcoRI, sklonowano w pWHM3, który uprzednio strawiono EcoRI, i stransformowano nim komórki E. coli DH5a. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną i analizę sekwencji DNA. Tym plazmidowym DNA stransformowano E. coli DM1, z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmid ten, który oznaczono pSE239, zastosowano do transformacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11, określano obecność oporności na erytromycynę i transformanty Thior Ermr analizowano pod kątem produktów fermentacji przez HPLC. Obecność podwójnie zmutowanego genu aveC kodującego S138T/A139F była zdolna do przywrócenia normalnego wytwarzania awermektyn przez szczep SE180-11, jednakże, stosunek klas B2:B1 wynosił 0,75:1, co wskazuje, że ta mutacja dalej obniża ilość wytwarzanej cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1 (Tabela 3), w większym stopniu niż uzyskany przez transformację szczepu SE180-11 pSE188, pSE199 lub pSE231, jak opisano powyżej.
T a b e l a 3
Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący) Liczba testowanych transformantów Względne stężenie B2 Względne stężenie BI Średni stosunek B1:B2
1 2 3 4 5
SE 180-11 (brak) 30 0 0 0
SE 180-11 (pWHM3) 30 0 0 0
PL 203 818 B1 cd. tabeli 3
1 2 3 4 5
SE180-11 (pSE186) 26 222 140 1,59
SE 180-11 (pSE187) 12 283 11 26,3
SE180-11 (pSE188) 24 193 206 0,94
SE 180-11 (pSE199) 18 155 171 0,88
SE 180-11 (pSE231) 6 259 309 0,84
SE180-11 (pSE239) 20 184 242 0,75
W celu dalszego obniżenia ilości wytwarzanej awermektyny cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1, skonstruowano dodatkowe mutacje, stosując technikę tasowania DNA opisaną w Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 oraz Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; a ponadto w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych o numerach 5605793, 5811238, 5830721 i 5837458.
Plazmidami o tasowanym DNA, zawierającymi zmutowane geny aveC, stransformowano kompetentne komórki E. coli dam dcm. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i zastosowano go do transformacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11 i przeszukano je pod kątem wytwarzania awermektyn o stosunku klas cykloheksylo-B2:cykloweksylo-B1 równym 1:1 lub niższym. Określono sekwencję DNA plazmidowego DNA z transformantów SE188-11 wytwarzających awermektyny o stosunku klas B2:B1 równym 1:1 lub niższym.
Zidentyfikowano osiem transformantów, które wytwarzały obniżoną ilość cykloheksylo-B2 w stosunku do cykloheksylo-B1. Najniższym stosunkiem B2:B1 uzyskanym wśród tych transformantów był stosunek 0,4:1 (tabela 4). Z każdego z ośmiu transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i określono sekwencję DNA w celu zidentyfikowania mutacji w genie aveC. Mutacje były następujące.
pSE2 90 zawiera mutacje 4 nukleotydów, w pozycji nukleotydu 317 z T na A, w pozycji nukleotydu 353 z C na A, w pozycji nukleotydu 438 z G na A i w pozycji nukleotydu 1155 z T na A. Zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 317 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 48 z D na E, a zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 438 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 89 z A na T. Stosunek B2:B1 przy wytwarzaniu przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,42:1 (tabela 4).
pSE291 zawiera mutacje 4 nukleotydów, w pozycji nukleotydu 272 z G na A, w pozycji nukleotydu 585 z T na A, w pozycji nukleotydu 588 z G na A i w pozycji nukleotydu 708 z G na A. Zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 585 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 138 z S na T, zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 588 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 139 z A na T, a zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 708 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 179 z G na S. Stosunek B2:B1 przy wytwarzaniu przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,57:1 (tabela 4).
pSE292 zawiera takie same cztery mutacje nukleotydów jak pSE290. Stosunek B2:B1 przy wytwarzaniu przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,40:1 (tabela 4).
pSE293 zawiera mutacje 6 nukleotydów, w pozycji nukleotydu 24 z A na G, w pozycji nukleotydu 286 z A na C, w pozycji nukleotydu 497 z T na C, w pozycji nukleotydu 554 z C na T, w pozycji nukleotydu 580 z T na C i w pozycji nukleotydu 886 z A na T. Zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 286 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 38 z Q na P, zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 580 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 136 z L na P, a zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 886 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 238 z E na D. Stosunek B2:B1 przy wytwarzaniu przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,68:1 (tabela 4).
pSE294 zawiera mutacje 6 nukleotydów, w pozycji nukleotydu 469 z T na C, w pozycji nukleotydu 585 z T na A, w pozycji nukleotydu 588 z G na A, w pozycji nukleotydu 708 z G na A, w pozycji nukleotydu 833 z C na T i w pozycji nukleotydu 1184 z G na A. Dodatkowo, wydeletowano pozycje nukleotydów 173, 174 i 175. Zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 469 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 99 z F na S, zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 585 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 138 z S na T, zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 588 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 139 z A na T, a zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 708 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 179 z G na S. Stosunek B2:B1 przy wytwarzaniu przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,53:1 (tabela 4).
PL 203 818 B1 pSE295 zawiera mutacje 2 nukleotydów, w pozycji nukleotydu 588 z G na A i w pozycji nukleotydu 856 z T na C. Zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 588 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 139 z A na T, a zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 856 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 228 z M na T. Stosunek B2:B1 przy wytwarzaniu przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,80:1 (tabela 4).
pSE296 zawiera mutacje 5 nukleotydów, w pozycji nukleotydu 155 z T na C, w pozycji nukleotydu 505 z G na T, w pozycji nukleotydu 1039 z C na T, w pozycji nukleotydu 1202 z C na T i w pozycji nukleotydu 1210 z T na C. Zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 505 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 111 z G na V, a zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 1039 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 289 z P na L. Stosunek B2:B1 przy wytwarzaniu przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,73:1 (tabela 4).
pSE297 zawiera mutacje 4 nukleotydów, w pozycji nukleotydu 377 z G na T, w pozycji nukleotydu 588 z G na A, w pozycji nukleotydu 633 z A na G i w pozycji nukleotydu 1067 z A na T. Zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 588 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 139 z A na T, zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 633 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 154 z K na E, a zmiana nukleotydu w pozycji nukleotydu 1067 zmienia aminokwas w pozycji aminokwasu 298 z Q na H. Stosunek B2:B1 przy wytwarzaniu przez komórki zawierające ten plazmid wynosił 0,67:1 (tabela 4).
T a b e l a 4
Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący) Liczba testowanych transformantów Względne stężenie B2 Względne stężenie B1 Średni stosunek B1:B2
SE 180-11 (brak) 4 0 0 0
SE 180-11 (pWHM3) 4 0 0 0
SE 180-11 (pSE290) 4 87 208 0,42
SE180-11 (pSE291) 4 106 185 0,57
SE 180-11 (pSE292) 4 91 231 0,40
SE 180-11 (pSE293) 4 123 180 0,68
SE 180-11 (pSE294) 4 68 129 0,53
SE 180-11 (pSE295) 4 217 271 0,80
SE180-11 (pSE296) 1 135 186 0,73
SE 180-11 (pSE297) 1 148 221 0,67
P r z y k ł a d 4: Konstruowanie mutantów z 5'-końcowymi delecjami
Jak wyjaśniono powyżej w części dotyczącej cząsteczek polinukleotydowych kodujących produkt genowy AveC S. avermitilis, sekwencja nukleotydów S. avermitilis przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) zawiera cztery różne kodony GTG w pozycjach par zasad 42, 174, 177 i 180, które są potencjalnymi miejscami początku ekspresji. W tej części opisano konstruowanie kilku delecji 5'-końcowego regionu otwartej ramki odczytu aveC (fig. 1, SEQ ID NO: 1) dla ułatwienia określenia, które z tych kodonów mogą działać jako miejsca początku ekspresji białka w otwartej ramce odczytu aveC.
Fragmenty genu aveC z różnymi delecjami w końcu 5' wyizolowano z chromosomalnego DNA S. avermitilis przez amplifikację PCR. W oparciu o sekwencję DNA aveC zaprojektowano startery PCR; dostarczyła je firma Genosys Biotechnologies, Inc. Startery prawostronne były następujące:
5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQ ID NO: 16) (D1F1),
5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID NO: 17) (D1F2),
5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID NO: 18) (D1F3) i
5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQ ID NO: 19) (D2F2). Startery lewostronne były następujące: 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID NO: 20), 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 21) i
5' -AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID NO: 22). Reakcję PCR prowadzono w sposób opisany w przykładzie 3, części 3.3. powyżej .
Produkty PCR rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym i wykryto pojedyncze prążki DNA odpowiadające albo około 1,0 Kb, albo około 1,1 Kb. Produkty PCR oczyszczono z żelu
PL 203 818 B1 i zligowano z 25 ng przeprowadzonego w postać liniową wektora pCR2.1 (Invitrogen) przy stosunku molowym wektora do wstawki 1:10, zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli One Shot™ (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność wstawek potwierdzono przez analizę restrykcyjną i analizę sekwencji DNA. Plazmidy te oznaczono pSE190 (otrzymany z zastosowaniem startera D1F1), pSE191 (otrzymany z zastosowaniem startera D1F1), pSE192 (otrzymany z zastosowaniem startera D1F3) i pSE193 (otrzymany z zastosowaniem startera D2F2).
Każdą ze wstawek DNA strawiono BamHI/Xbal, rozdzielono przez elektroforezę, oczyszczono z żelu i oddzielnie zligowano z wektorem wahadłowym pWHM3, który wcześniej strawiono BamHl/XbaI przy stężeniu całkowitego DNA wynoszącym 1 μg i stosunku molowym wektora do wstawki 1:5. Mieszaniny ligacyjne zastosowano do transformacji kompetentnych komórek E. coli DH5a. Z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowe DNA i obecność wstawek potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmidami tymi, które oznaczono jako pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) i pSE197 (D2F2), stransformowano oddzielnie szczep E. coli DM1, plazmidowe DNA wyizolowano z transformantów opornych na ampicylinę i obecność właściwych wstawek potwierdzono przez analizę restrykcyjną. DNA te zastosowano do transformacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11, określono występowanie oporności na erytromycynę i transformanty Thior Ermr analizowano poprzez analizę HPLC produktów fermentacji w celu określenia, które miejsca GTG były konieczne do ekspresji aveC. Wyniki wskazują, że kodon GTG w pozycji 42 można wyeliminować bez wpływu na ekspresję aveC, ponieważ pSE194, pSE195 i pSE196, z których każdy pozbawiony był miejsca GTG w pozycji 42, ale zawierał trzy miejsca GTG w pozycjach 174, 177 i 180, były zdolne do przywracania normalnego wytwarzania awermektyn po stransformowaniu SE180-11. Transformacja szczepu SE180-11 pSE197, który pozbawiony był wszystkich czterech miejsc GTG, nie przywracała normalnego wytwarzania awermektyn (tabela 5).
T a b e l a 5
Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący) Liczba testowanych transformantów Względne stężenie B2 Względne stężenie B1 Średni stosunek B1:B2
SE 180-11 (brak) 6 0 0 0
SE 180-11 (pWHM3) 6 0 0 0
SE 180-11 (pSE186) 6 241 152 1,58
SE 180-11 (pSE194) 6 35 15 2,43
SE 180-11 (pSE195) 6 74 38 1,97
SE 180-11 (pSE196) 6 328 208 1,58
SE 180-11 (pSE197) 12 0 0 0
P r z y k ł a d 5: Klonowanie homologów aveC z S. hygroscopicus i S. griseochromogenes
Wynalazek umożliwia identyfikowanie i klonowanie genów homologicznych do aveC z innych wytwarzających awermektyny lub milbemycyny gatunków Streptomyces. Przykładowo, kosmidową bibliotekę genomowego DNA S. hygroscopicus (FERM BP-1901) hybrydyzowano z opisaną powyżej sondą aveC S. avermitilis o długości 1,2 Kb. Zidentyfikowano kilka klonów kosmidowych, które silnie hybrydyzowały. Z kosmidów tych wyizolowano chromosomalny DNA i zidentyfikowano fragment KpnI o długości 4,9 Kb, który hybrydyzował z sondą aveC. Zsekwencjonowano DNA i zidentyfikowano otwartą ramkę odczytu (SEQ ID NO: 3) wykazującą znaczącą homologię do otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis. Sekwencję aminokwasów (SEQ ID NO: 4) przewidzianą na podstawie otwartej ramki odczytu homologu aveC S. hygroscopicus przedstawiono na fig. 6.
Ponadto, kosmidową bibliotekę genomowego DNA S. griseochromogenes hybrydyzowano z opisaną powyżej sondą aveC S. avermitilis o długości 1,2 Kb. Zidentyfikowano kilka klonów kosmidowych, które silnie hybrydyzowały. Z kosmidów tych wyizolowano chromosomalny DNA i zidentyfikowano fragment Pstl o długości 5,4 Kb, który hybrydyzował z sondą aveC. Zsekwencjonowano ten
PL 203 818 B1
DNA i zidentyfikowano częściową otwartą ramkę odczytu wykazującą znaczącą homologię do otwartej ramki odczyt aveC S. avermitilis. Przewidzianą częściową sekwencję ami kwasów (SEQ ID NO: 5) przedstawiono na fig. 6.
Analiza sekwencji DNA i aminokwasowych homologów aveC z S. hygroscopicus i S. griseochromogenes wskazuje, że regiony te wykazują znaczącą homologię (około 50% identyczności sekwencji na poziomie aminokwasowym), zarówno wobec siebie wzajemnie, jak i wobec otwartej ramki odczytu aveC i produktu genowego AveC S. avermitilis (fig. 6)
P r z y k ł a d 6: Konstruowanie plazmidu z genem aveC za promotorem ermE
Otwartą ramkę odczytu aveC o długości 1,2 Kb z pSE186 zsubklonowano w pSE34, który jest wahadłowym wektorem pWHM3 mającym promotor ermE o długości 300 bp wstawiony w postaci fragmentu KpnI/BamHI w miejscu KpnI/BamHI pWHM3 (patrz Ward i in., 1986, Mol. Gen. Genet. 203: 468-478). pSE186 strawiono BamHI i Hindlll, produkty trawienia rozdzielono przez elektroforezę, z żelu agarozowego wyizolowano fragment o długości 1,2 Kb i zligowano go z pSE34 strawionym uprzednio SamHI i Hindlll. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a zgodnie z instrukcjami producenta. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność wstawki o długości 1,2 Kb potwierdzono przez analizę restrykcyjną. Plazmidem tym, który oznaczono pSE189, stransformowano E. coli DM1 i z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA. pSE189 stransformowano protoplasty szczepu 1100-SC38. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu 1100-SC38 i analizowano je przez analizę HPLC produktów fermentacji.
Transformanty szczepu 1100-SC38 S. avermitilis zawierające pSE189 były zmienione pod względem stosunków wytwarzanych awermektyn cykloheksylo-B2:awermektyn cykloheksylo-B1 (około 3:1) w porównaniu ze szczepem 1100-SC38 (około 34:1), a całkowite wytwarzanie awermektyn było zwiększone około 2,4-krotnie w porównaniu ze szczepem 1100-SC38 stransformowanym pSE119 (tabela 6).
pSE189 stransformowano również protoplasty szczepu S. avermitilis typu dzikiego. Wyizolowano transformanty oporne na tiostrepton i analizowano je przez analizę HPLC produktów fermentacji. Całkowite wytwarzanie awermektyn przez S. avermitilis typu dzikiego stransformowany pSE189 było zwiększone około 2,2-krotnie w porównaniu z S. avermitilis typu dzikiego stransformowanym pSE119 (tabela 6).
T a b e l a 6
Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący) Liczba testowanych transformantów Względne [B2] Względne [B1] Względna całkowita ilość awermektyn Średni stosunek B1:B2
1100-SC38 6 155 4,8 176 33,9
1100-SC38(pSE119) 9 239 50,3 357 4,7
1100-SC38(pSE189) 16 546 166 849 3,3
typ dziki 6 59 42 113 1,41
typ dziki (pSE 119) 6 248 151 481 1,64
typ dziki (pSE189) 5 545 345 1071 1,58
P r z y k ł a d 7: Chimeryczny plazmid zawierający sekwencje zarówno otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis, jak i homologu aveC S. hygroscopicus
Hybrydowy plazmid oznaczony pSE350, który zawiera część homologu aveC S. hygroscopicus o długości 564 bp zastępującą homologiczną część o długości 564 bp otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis (fig. 7) skonstruowano w następujący sposób. pSE350 skonstruowano wykorzystując miejsce restrykcyjne BsaAI, które jest zachowane w obu sekwencjach (pozycja 225 aveC) i miejsce restrykcyjne KpnI, które jest obecne w genie aveC S. avermitilis (pozycja 810 aveC). Do DNA S. hygroscopicus miejsce KpnI wprowadzono przez PCR, stosując prawostronny starter 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 23) i lewostronny starter 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 24) (dostarczone przez Genosys Biotechnologies) stosując warunki PCR opisane w przykładzie 2 powyżej (części 2.1.10). Produkt PCR strawiono BsaAI i KpnI, fragmenty rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym i z żelu wyizolowano fragment BsaAI/KpnI o długości 564 bp. pSE179
PL 203 818 B1 (opisany w przykładzie 2, części 2.1.10 powyżej) strawiono KpnI i Hindlll, fragmenty rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym i z żelu wyizolowano fragment o długości około 4,5 Kb. pSE179 strawiono Hindlll i BsaAI, fragmenty rozdzielono przez elektroforezę w 1% żelu agarozowym i z żelu wyizolowano fragment BsaAI/Hindlll o długości około 0,2 Kb. Fragment Hindlll/KpnI o długości około
4,5 Kb, fragment BsaAI/Hindlll o długości około 0,2 Kb i fragment BsaAI/KpnI o długości 564 bp z S. hygroscopicus zligowano ze sobą w trzyskł adnikowej ligacji i mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a. Z transformantów opornych na ampicylinę wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną z zastosowaniem KpnI i Aval. Plazmid strawiono Hindlll i Xbal w celu uwolnienia wstawki o długości 1,2 Kb, którą następnie zligowano z pWHM3 strawionym uprzednio Hindlll i Xbal. Mieszaniną ligacyjną stransformowano kompetentne komórki E. coli DH5a, z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną z zastosowaniem Hindlll i Aval. Plazmidowym DNA stransformowano E. coli DM1, z opornych na ampicylinę transformantów wyizolowano plazmidowy DNA i obecność właściwej wstawki potwierdzono przez analizę restrykcyjną i analizę sekwencji DNA. Plazmid ten oznaczono pSE350 i zastosowano do transformacji protoplastów szczepu SE180-11 S. avermitilis. Wyizolowano oporne na tiostrepton transformanty szczepu SE180-11, określono występowanie oporności na erytromycynę i transformanty Thior Ermr analizowano poprzez analizę HPLC produktów fermentacji. Wyniki wykazują, że transformanty zawierające plazmid hybrydowy S. avermitilis/S. hygroscopicus wykazują przeciętny stosunek B2:B1 wynoszący około 109:1 (tabela 7).
T a b e l a 7
Szczep S. avermitilis (plazmid transformujący) Liczba testowanych transformantów Względne stężenie B2 Względne stężenie B1 Średni stosunek B1:B2
SE 180-11 (brak) 8 0 0 0
SE 180-11 (pWHM3) 8 0 0 0
SE180-11 (pSE350) 16 233 2 109
Depozyt materiałów biologicznych
Następujące materiały biologiczne zdeponowano 29 stycznia 1998 r. w American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, Stany Zjednoczone Ameryki i przydzielono im następujące numery dostępu:
Plazmid Numer dostępu plazmid pSE180 209605 plazmid pSE186 209604
PL 203 818 B1 <110> PFIZER PRODUCTS INC.
<120> Cząsteczka polinukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarz Streptomyces, sposób wytwarzania nowego szczepu S. mermitilis, komórka Streptomyces mermitilis, sposób wytwarzania awermektyn i kompozycja awermektyn cyk!oheksylo-B2:cykIoheksylo-Bl <13 0> PCI065OA <140> FC10650A <141> 1999-08-12 <150> 60,148,645 <151> 1999-08-12 <160> 25 <170> Patentln Wersja 2.1 <210> 1 <211> 1229 <212> DNA <213> Streptomyces a r-j t j 5 <22 0>
<221> CDS <Z22> (174)..(1085) <400> 1
tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa gętęagacag cgtgaaccoa tccgagccgc 60
tcggcctgcc caacgaacgt cccgacogtc cgatgccacg etetcacccg 120
aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccc gtg Val 176
gtg gtg tgg gcc ggg gtc ęgc etę ctg ttt etę gee ctg cag gcg tac 2'24
Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gin Ala Tyr 5 10 ···'·· 15 gtg ttc age ege tgg gcg gcc gac ggt ęgc tac.cgg ctg atc gaa aca 272
Val Phe Ser Axg Trp Ala ALi Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu Thr
25 30 gcg ggc cag ggt cag ggc ęgc age aag gat acg ggg act acc gat gtg 320
Ala Gly Gin Gly Gin Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val
44 45
PL 203 818 B1 gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc acc gcc gcg gcg gcg tgg 368
Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys Ile Thr Ala Ala Ala Ala Trp 50 55 60 65 ctc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa ega cgg ctg ctg ttc gac gcc ctt 416
Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu
75 80 ctc ttc ctc ggg ctg ctg ttc gcg age tgg cag age ccg ctc atg aac 464
Leu Phe Leu Gly 85 ' Leu . Leu . Phe ' Ala Ser 90 Trp Gin Ser Pro Leu 95 Met Asn
tgg ttc cat tcc gtt ctc gtc tcc aac gcg agt gtg tgg ggc gcg gtg 512
Trp Phe His 100 Ser Val Leu Val Ser 105 Asn Ala Ser Val Trp 110 Gly Ala Val
ggt tcc tgg ggt ccg tat gtg ccc ggc tgg cag ggg gcg ggc ccg ggt 560
Gly Ser 115 Trp Gly Pro Tyr Val 120 Pro Gly Trp Gin Gly 125 Ala Gly Pro Gly
gcg gag gcg gaa atg ccg ctg gcg teg gcc tcc gtc tgc atg teg get 608
Ala 130 Glu Ala Glu Met Pro 135 Leu Ala Ser Ala Ser 140 Val Cys Met Ser Ala 145
ctg atc gtc acc gtg ctg tgc age aag gca ctg ggg tgg atc aag gcc 656
Leu Ile Val Thr Val 150 Leu Cys Ser Lys Ala 155 Leu Gly Trp Ile Lys 160 Ala
ege cgg ccg gca tgg cgg acc tgg cgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc ttc 704
Arg Arg Pro Ala 165 Trp Arg Thr Trp Arg 170 Leu Val Leu Ala Val 175 Phe Phe
atc ggc atc gtg ctc ggt ctg tcc gag ccg ctg ccg tcc gcc tcc ggg 752
Ile Gly Ile 180 Val Leu Gly Leu Ser 185 Glu Pro Leu Pro Ser 190 Ala Ser Gly
atc age gta tgg gcc aga gcg ctg ccc gag gtg acc ttg tgg agt ggc 800
Ile Ser 195 Val Trp Ala Arg Ala 200 Leu Pro Glu Val Thr 205 Leu Trp Ser Gly
gag tgg tac cag ttc ccc gtg tat cag gcg gtc ggt tcc ggc ctg gtc 848
Glu 210 Trp Tyr Gin Phe Pro 215 Val Tyr Gin Ala Val 220 Gly Ser Gly Leu Val 225
tgc tgc atg ctg ggc teg ctg ege ttc ttc ege gac gaa ege gat gag 896
Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu
23° 235 240
PL 203 818 B1
tcg Ser tgg gtg Trp Val gaa Glu 245 cgg gga gcc Arg Gly Ala tgg cgg ttg ccg caa cgg gca gcg Ala aac Asn 944
Trp Arg 250 Leu Pro Gin Arg Ala 255
tgg gcg cgt ttc ctc gcc gtg gtc ggt ggg gtg aat gcc gtg atg ttc 992
Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met Phe
260 265 270
ctc tac acc tgt ttc cat atc ctc ctg tcc ctc gtc ggt gga cag ccg 1040
Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gin Pro
275 280 285
ccc gac caa ctg ccg gac tcc ttc caa gcg ccg gcc gct tac tga 1085
Pro Asp Gin Leu Pro Asp Ser Phe Gin Ala Pro Ala Ala Tyr
290 295 300 gttcagggca ggtcggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145 ctttgtgcat gggtggacgg ggatcacgct cccatggcgg cgggctcctc cagacgcacc 1205 acactcctcg gttcagcgat catg 1229 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Streptomyces avermitilis <400> 2
Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gin Ala
1 5 10 15
Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu
20 25 30
Thr Ala Gly Gin Gly Gin Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp
35 40 45
Val Val Tyr Pro Val Ile Ser Val Val Cys He Thr Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala
65 70 75 80
Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala ser Trp Gin Ser Pro Leu Met
85 90 95
Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala
100 105 110
Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin Gly Ala Gly Pro
115 120 125
Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser
130 135 140
PL 203 818 B1
Ala Leu Ile Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp Ile Lys
145 150 155 160
Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe
165 170 175
Phe Ile Gly Ile Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser
180 185 190
Gly Ile Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser
195 200 205
Gly Glu Trp Tyr Gin Phe Pro Val Tyr Gin Ala Val Gly Ser Gly Leu
210 215 220
Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp
225 230 235 240
Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gin Arg Ala Ala
245 250 255
Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met
260 265 270
Phe Leu Tyr Thr Cys Phe His Ile Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gin
275 280 285
Pro Pro Asp Gin Leu Pro Asp Ser Phe Gin Ala Pro Ala Ala Tyr
290 295 300 <210> 3 <211> 1150 <212> DNA <213> Streptomyces hygroscopicus <220>
<221> CDS <222> (58)..(990) <400> 3 gtcgacgaag accggccgga ggccgtcggc cgggccgata ccgtacgcgg cctgcgg 57
gtg Val 1 ttc Phe acc Thr ctt Leu ccc Pro 5 gta Val aca ctg tgg gcg tgt gtc ggc Val Gly gcg Ala ctg Leu 15 gtg Val 105
Thr Leu Trp Ala 10 Cys
ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gcc gcc tgg ctc gcc gac agc ggc 153
Leu Gly Leu Gin Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly
20 25 30
tac cgc atc gag aag gcg tcc ccg gcc agg ggc ggt ggg gac tcg gag 201
Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu
35 40 45
cgg atc gcc gat gtg ctg atc ccg ctg ctg tcc gtg gtg gga gcg gtg 249
PL 203 818 B1
297
Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 gtc ctc gca gtg tgt ctg tac cgg agg tgt cgg gcc agg agg cgg ctg Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu
70 75 80
acg ttc gac gcg tcg ctc ttc atc ggg ctg ctg tcg gcc agt tgg cag 345
Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gin
85 90 95
agt ccc ttg atg aac tgg atc aat ccg gtg ctc gcg tea aac gtc aat 393
Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn
100
105
110
gtg ttc gga gcg gtg gcc tcg tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag 441
Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin
115 120 125
ggg gcg ggg gcg cac cag gag gcc gag ctg ccg ctg gcg acc ctg age 489
Gly Ala Gly Ala His Gin Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser
130
135
140 atc tgt atg acg gcc atg atg gcc gcc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160
537
ggt ctt gcc gcc gcc cgg tgg ccg cgg ctg ggg ccg ctc cgg ctg atc 585
Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile
165 170 175
gcg ctc ggc ttt ctg ctc gtc gtg ctc ctc gac atc gcc gag ccg ctg 633
Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu
180
185
190 gtg tcc ttc gcg ggc gtc tcc gtg tgg acg cgg gca gtg ccc gag ctg Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu
195 200 205 acc atc tgg agt ggg cac tgg tat cag ttc ccg ctg tat cag atg gtg Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gin Phe Pro Leu Tyr Gin Met Val
210 215 220 gct tcg gcg ctc ttc ggc gcc tct ttg ggg gcc gcg cgc cac ttt cgc Ala Ser Ala Leu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240
681
729
777 aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gcg gcc ctc eta ccg 825
PL 203 818 B1
Asn Arg Arg Gly Glu 245 Thr Cys Leu Glu Ser 250 Gly Ala Ala Leu Leu 255 Pro
gag ggc ccg agg cca tgg gtc cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873
Glu Gly Pro Arg 260 Pro Trp val Arg Leu 265 Leu Ala Val Val Gly 270 Gly Ala
aac atc agc atc gcc ctc tac acc ggc gca cac ggc gca cac atc ctg 921
Asn Ile Ser 275 Ile Ala Leu Tyr Thr 280 Gly Ala His Gly Ala 285 His .Ile Leu
ttc tcg ctg atg gac ggc gct ccc ccg gac cgg ctc ccc gaa ttc ttc 969
Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe
290 295 300 cgt ccg gcg gcc ggc tac tga gaccgccggc accacccacg tacccgatgt 1020
Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 gcgcgatgtg cctgatgcgc ctgatgtacc cggggtgtca tcggctcacc tgtggcgcct 1080 catgcggtga gcgctccgcc tcgtccttgt tccggctcct gggctccacg accatacgga 1140 gcggccgggg 1150 <210> 4 <Z11> 310 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 4
Val 1 Phe Thr Leu Pro 5 Val Thr Leu Trp Ala 10 Cys Val Gly Ala Leu 15 Val
Leu Gly Leu Gin Val Tyr Val Phe Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly
20 25 30
Tyr Arg Ile Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu
35 40 45
Arg Ile Ala Asp Val Leu Ile Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val
50 55 60
Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu
65 70 75 80
Thr Phe Asp Ala Ser Leu Phe Ile Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gin
85 90 95
Ser Pro Leu Met Asn Trp Ile Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn
100 105 110
Val Phe Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gin
115 120 125
PL 203 818 B1
Gly Ala 130 Gly Ala His Gin Glu 135 Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr 140 Leu Ser
Ile Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met
145 150 155 160
Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu Ile
165 170 175
Ala Leu Gly Phe Leu Leu Val Val Leu Leu Asp Ile Ala Glu Pro Leu
180 185 190
Val Ser Phe Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu
195 200 205
Thr Ile Trp Ser Gly His Trp Tyr Gin Phe Pro Leu Tyr Gin Met Val
210 215 220
Ala Ser Ala Łeu Phe Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg
225 230 235 240
Asń Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro
245 250 255
Glu Gly Pro Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala
260 265 270
Asn Ile Ser Ile Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His Ile Leu
275 280 285
Phe Ser Łeu Met Asp Gly Ala Pro Pro Asp Arg Leu Pro Glu Phe Phe
290 295 300
Arg Pro Ala Ala Gly Tyr
305 310 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptomyces griseochromogenes
<400> 5 Gin 15 Val
Val 1 Ile Gly Trp Ala 5 Ala Leu Gly Ala Val 10 Phe Leu Val Leu
Tyr Val Phe Ala Arg 20 Trp Thr Ala Asp 25 Gly Gly Tyr His Leu 30 Ala Asp
Val Ser Gly 35 Pro Asp Gly Arg Glu Pro 40 Gly His Arg Arg 45 Ile Ile Asp
Val Leu Leu 50 Pro Ala Leu Ser Met Ala 55 Gly Val Val Gly 60 Leu Ala Phe
Trp 65 Leu Val Arg Arg Trp 70 Arg Ala Glu Arg Arg 75 Leu Ser Phe Asp Ala 80
PL 203 818 B1
Leu Leu Phe Thr Gly 85 Val Leu Phe Ala Gly 90 Trp Leu Ser Pro Leu 95 Met
Asn Trp Phe His 100 Pro Val Leu Met Ala 105 Asn Thr His Val Trp 110 Gly Ala
Val Gly Ser 115 Trp Gly Pro Tyr Val 120 Pro Gly Trp Arg Gly 125 Leu Pro Pro
Gly Lys 130 Glu Ala Glu Leu Pro 135 Leu Val Thr Phe Ser 140 Leu Gly Ser Thr
Val 145 Leu Leu Gly Val Leu 150 Gly Cys Cys Gin Val 155 Met Ser Arg Val Arg 160
Glu Arg Trp Pro Gly 165 Val Arg Pro Trp Gin 170 Leu Val Gly Leu Ala 175 Phe
Leu Thr Ala Val 180 Ala Phe Asp Leu Ser 185 Glu Pro Phe Ile Ser 190 Phe Ala
Gly Val Ser 195 Val Trp Ala Arg Ala 200 Leu Pro Thr Val Thr 205 Leu Trp Arg
Gly Ala Trp Tyr . Arg . Ala Arg
210 215 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 6 tcacgaaacc ggacacac <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 7 catgatcgct gaaccgag <210> 8 <211> 20
PL 203 818 B1 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 8 ggttccggat gccgttctcg 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 9 aactccggtc gactcccctt c 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 10 .
gcaaggatac ggggactac 39 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 11 gaaccgaccg cctgatac 39 <210> 12 <211> 43 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 12 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gcccctggcg acg 43 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis
PL 203 818 B1 <400> 13 ggaaccgacc gcctgataca <210> 14 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 14 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgacc 46 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 15 ggaacatcac ggcattcacc <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 16 aacccatccg agccgctc 18 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 17 tcggcctgcc aacgaac <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 18 ccaacgaacg tgtagtag 18
PL 203 818 B1 <2l0> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 19 tgcaggcgta cgtgttcagc 20 <210> 20 <211> 17 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 20 catgatcgct gaaccga 17 <21O> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 21 catgatcgct gaaccgagga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 22 aggagtgtgg tgcgtctgga 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 23 cttcaggtgt acgtgttcg 19 <210> 24 <211> 18
PL 203 818 B1 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 24 gaactggtac cagtgccc 18 <210> 25 <211> 46 <212> DNA <213> Streptomyces avermitilis <400> 25 gggggcgggc ccgggtgcgg aggcggaaat gccgctggcg acgttc 46

Claims (80)

1. Cząsteczka polinukleotydowa zawierająca sekwencję nukleotydów, która jest taka sama jak allel aveC Streptomyces avermitilis, sekwencja kodująca produkt genowy AveC S. avermitilis z plazmidu pSE186 (ATCC 209604), lub sekwencja nukleotydów otwartej ramki odczytu aveC S. avermitilis przedstawiona na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), bądź ich zdegenerowany wariant, ale która to sekwencja nukleotydów zawiera ponadto jedną mutację kodującą podstawienie aminokwasowe w resztach aminokwasowych odpowiadających pozycjom aminokwasów 38, 48, 89, 99, 111, 136, 154, 179, 228, 238, 289 lub 298 w SEQ ID NO: 2, tak że komórki szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zinaktywowano allel aveC typu dzikiego i w których zachodzi ekspresja cząsteczki polinukleotydowej zawierającej zmutowaną sekwencję nukleotydów, wytwarzają awermektyny o stosunku klas 2:1, który jest obniżony w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu ATCC 53692 S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego.
2. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 1, gdzie awermektynami o stosunku klas 2:1 są awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1.
3. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 2, gdzie stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,8:1 lub mniej.
4. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 2, gdzie stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,68:1 lub mniej.
5. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 2, gdzie stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,53:1 lub mniej.
6. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 2, gdzie stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,42:1 lub mniej.
7. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 2, gdzie stosunek klas 2:1 awermektyn wynosi 0,40:1 lub mniej.
8. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 1, w której sekwencja nukleotydów ponadto zawiera mutacje kodujące podstawienie aminokwasowe w jednej lub obu resztach aminokwasowych odpowiadających pozycjom aminokwasów 138 i 139 w SEQ ID NO: 2.
9. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 2, gdzie podstawienia aminokwasowe są wybrane z grupy obejmującej:
(a) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 38 resztą aminokwasową P;
(b) zastąpienie reszty aminokwasowej D w pozycji 48 resztą aminokwasową E;
(c) zastąpienie reszty aminokwasowej A w pozycji 89 resztą aminokwasową T;
(d) zastąpienie reszty aminokwasowej F w pozycji 99 resztą aminokwasową S;
(e) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 111 resztą aminokwasową V;
(f) zastąpienie reszty aminokwasowej L w pozycji 136 resztą aminokwasową P;
PL 203 818 B1 (g) zastąpienie reszty aminokwasowej K w pozycji 154 resztą aminokwasową E;
(h) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 179 resztą aminokwasową S;
(i) zastąpienie reszty aminokwasowej M w pozycji 228 resztą aminokwasową T;
(j) zastąpienie reszty aminokwasowej E w pozycji 238 resztą aminokwasową D;
(k) zastąpienie reszty aminokwasowej P w pozycji 289 resztą aminokwasową L oraz (l) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 298 resztą aminokwasową H.
10. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 2, w której jest zmutowana kombinacja reszt aminokwasowych, przy czym kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe D48 i A89;
(b) reszty aminokwasowe S138, A139 i G179;
(c) reszty aminokwasowe Q38, L136 i E238;
(d) reszty aminokwasowe F99, S138, A139 i G179;
(e) reszty aminokwasowe A139 i M228;
(f) reszty aminokwasowe G111 i P289 oraz (g) reszty aminokwasowe A139, K154 i Q298.
11. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 10, gdzie kombinację podstawień aminokwasowych wybiera się z grupy obejmującej:
(a) D48E/A89T;
(b) S138T/A139T/G179S;
(c) Q38P/L136P/E238D;
(d) F99S/S138T/A139T/G179S;
(e) A139T/M228T;
(f) G111V/P289L i (g) A139T/K154E/Q298H.
12. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 11, w której mutacje w sekwencji aveC kodującej D48E/A89T obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 317 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 438 w SEQ ID NO: 1.
13. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 12, ponadto obejmująca zmianę zasady z C na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 353 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1155 w SEQ ID NO: 1.
14. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 11, w której mutacje w sekwencji aveC kodującej S138T/A139T/G179S obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
15. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 14, ponadto obejmująca zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 272 w SEQ ID NO: 1.
16. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 11, w której mutacje w sekwencji aveC kodującej Q38P/L136P/E238D obejmują zmianę zasady z A na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 286 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 580 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 886 w SEQ ID NO: 1.
17. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 16, ponadto obejmująca zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 24 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 497 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 554 w SEQ ID NO: 1.
18. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 11, w której mutacje w sekwencji aveC kodującej F99S/S138T/A139T/G179S obejmują delecję 3 par zasad w pozycjach nukleotydów odpowiadających pozycjom nukleotydów 173, 174 i 175 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 469 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
PL 203 818 B1
19. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 18, ponadto obejmująca zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 833 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1184 w SEQ ID NO: 1.
20. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 11, w której mutacje w sekwencji aveC kodującej A139T/M228T obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 856 w SEQ ID NO: 1.
21. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 11, w której mutacje w sekwencji aveC kodującej G111V/P289L obejmują zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 505 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1039 w SEQ ID NO: 1.
22. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 21, ponadto obejmująca zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 155 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1202 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1210 w SEQ ID NO: 1.
23. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 11, w której mutacje w sekwencji aveC kodującej A139T/K154E/Q298H obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 633 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 1067 w SEQ ID NO: 1.
24. Cząsteczka polinukleotydowa według zastrz. 23, ponadto obejmująca zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu odpowiadającej pozycji nukleotydu 377 w SEQ ID NO: 1.
25. Zrekombinowany wektor, znamienny tym, że zawiera cząsteczkę polinukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1.
26. Komórka gospodarz Streptomyces, znamienna tym, że zawiera cząsteczkę polinukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 1 lub zrekombinowany wektor zdefiniowany w zastrz. 25.
27. Sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, znamienny tym, że mutuje się allel aveC w komórkach szczepu S. avermitilis, lub wprowadza się zmutowany allel aveC do komórki szczepu S. avermitilis, przy czym mutacja prowadzi do podstawienia w produkcie genowym aveC innej reszty aminokwasowej w jednej lub większej liczbie pozycji odpowiadających resztom aminokwasowym 38, 48, 89, 99, 111, 136, 139, 154, 179, 228, 238, 289 lub 298 w SEQ ID NO: 2, tak że komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC tak zmutowano, wytwarzają awermektyny o stosunku klas 2:1, który jest obniżony w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego, z tym, że jeśli mutacja prowadzi do podstawienia tylko reszty aminokwasowej 139 lub następuje podwójna mutacja obejmująca resztę aminokwasową 139, to ta reszta aminokwasową 139 jest podstawiona przez F.
28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że awermektynami o stosunku klas 2:1 są awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1.
29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,8:1 lub mniej.
30. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,68:1 lub mniej.
31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,53:1 lub mniej.
32. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,42:1 lub mniej.
33. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że stosunek klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki szczepu S. avermitilis, w których allel aveC został tak zmutowany, wynosi 0,40:1 lub mniej.
34. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że zmutowany allel aveC ponadto koduje resztę aminokwasową odpowiadającą pozycji aminokwasowej 138 w SEQ ID NO: 2.
PL 203 818 B1
35. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że podstawienia aminokwasowe są wybrane z grupy obejmującej:
(a) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 38 resztą aminokwasową P;
(b) zastąpienie reszty aminokwasowej D w pozycji 48 resztą aminokwasową E;
(c) zastąpienie reszty aminokwasowej A w pozycji 89 resztą aminokwasową T;
(d) zastąpienie reszty aminokwasowej F w pozycji 99 resztą aminokwasową S;
(e) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 111 resztą aminokwasową V;
(f) zastąpienie reszty aminokwasowej L w pozycji 136 resztą aminokwasową P;
(g) zastąpienie reszty aminokwasowej K w pozycji 154 resztą aminokwasową E;
(h) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 179 resztą aminokwasową S;
(i) zastąpienie reszty aminokwasowej M w pozycji 228 resztą aminokwasową T;
(j) zastąpienie reszty aminokwasowej E w pozycji 238 resztą aminokwasową D;
(k) zastąpienie reszty aminokwasowej P w pozycji 289 resztą aminokwasową L oraz (l) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 298 resztą aminokwasową H.
36. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że allel aveC mutuje się tak, że koduje podstawienia aminokwasowe w kombinacji pozycji aminokwasów, przy czym taka kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe D48 i A89;
(b) reszty aminokwasowe Q38, L136 i E238;
(c) reszty aminokwasowe A139 i M228;
(d) reszty aminokwasowe G111 i P289 oraz (e) reszty aminokwasowe A139, K154 i Q298.
37. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że allel aveC mutuje się tak, że koduje podstawienia aminokwasowe w kombinacji pozycji aminokwasów, przy czym taka kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe S138, A139 i G179 oraz (b) reszty aminokwasowe F99, S138, A139 i G179.
38. Sposób według zastrz. 36, znamienny tym, że kombinację podstawień aminokwasowych wybiera się z grupy obejmującej:
(a) D48E/A89T;
(b) Q38P/L136P/E238D;
(c) A139T/M228T;
(d) G111V/P289L i (e) A139T/K154E/Q298H.
39. Sposób według zastrz. 37, znamienny tym, że kombinację podstawień aminokwasowych wybiera się z grupy obejmującej:
(a) S138T/A139T/G179S i (b) F99S/S138T/A139T/G179S.
40. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że mutacje w allelu aveC kodującym D48E/A89T obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 317 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 438 w SEQ ID NO: 1.
41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że ponadto obejmuje zmianę zasady z C na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 353 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1155 w SEQ ID NO: 1.
42. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że mutacje w allelu aveC kodującym S138T/A139T/G179S obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
43. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że ponadto obejmuje zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 272 w SEQ ID NO: 1.
44. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że mutacje w allelu aveC kodującym Q38P/L136P/E238D obejmują zmianę zasady z A na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 286 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu
PL 203 818 B1 aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 580 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 886 w SEQ ID NO: 1.
45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że ponadto obejmuje zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 24 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 497 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 554 w SEQ ID NO: 1.
46. Sposób według zastrz. 39, znamienny tym, że mutacje w allelu aveC kodującym F99S/S138T/A139T/G179S obejmują delecję 3 par zasad w pozycjach nukleotydów w allelu aveC odpowiadających pozycjom nukleotydów 173, 174 i 175 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 469 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
47. Sposób według zastrz. 46, znamienny tym, że ponadto obejmuje zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 833 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1184 w SEQ ID NO: 1.
48. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że mutacje w allelu aveC kodującym A139T/M228T obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 856 w SEQ ID NO: 1.
49. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że mutacje w allelu aveC kodującym G111V/P289L obejmują zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 505 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1039 w SEQ ID NO: 1.
50. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że ponadto obejmuje zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 155 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1202 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1210 w SEQ ID NO: 1.
51. Sposób według zastrz. 38, znamienny tym, że mutacje w allelu aveC kodującym A139T/K154E/Q298H obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 633 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1067 w SEQ ID NO: 1.
52. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że ponadto obejmuje zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 377 w SEQ ID NO: 1.
53. Komórka Streptomyces avermitilis, znamienna tym, że ma zmutowany allel aveC, który koduje produkt genowy aveC zawierający podstawienie w jednej lub większej liczbie pozycji aminokwasów odpowiadających resztom aminokwasowym 38, 48, 89, 99, 111, 136, 154, 179, 228, 238, 289 lub 298 w SEQ ID NO: 2, przy czym komórka wytwarza awermektyny o stosunku klas 2:1, który jest obniżony w porównaniu ze stosunkiem klas 2:1 awermektyn wytwarzanych przez komórki tego samego szczepu S. avermitilis, w których zamiast tego zachodzi ekspresja tylko allelu aveC typu dzikiego.
54. Komórka S. avermitilis według zastrz. 53, znamienna tym, że awermektynami o stosunku 2:1 są awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1.
55. Komórka S. avermitilis według zastrz. 54, znamienna tym, że wytwarza awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,8:1 lub mniej.
56. Komórka S. avermitilis według zastrz. 54, znamienna tym, że wytwarza awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,68:1 lub mniej.
57. Komórka S. avermitilis według zastrz. 54, znamienna tym, że wytwarza awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,53:1 lub mniej.
58. Komórka S. avermitilis według zastrz. 54, znamienna tym, że wytwarza awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,42:1 lub mniej.
PL 203 818 B1
59. Komórka S. avermitilis według zastrz. 54, znamienna tym, że wytwarza awermektyny o stosunku klas 2:1 wynoszącym 0,40:1 lub mniej.
60. Komórka S. avermitilis według zastrz. 53, znamienna tym, że allel aveC ponadto koduje podstawienie aminokwasowe w jednej lub obu resztach aminokwasowych odpowiadających pozycjom aminokwasów 138 i 139 w SEQ ID NO: 2.
61. Komórka S. avermitilis według zastrz. 54, znamienna tym, że podstawienia aminokwasowe są wybrane z grupy obejmującej:
(a) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 38 resztą aminokwasową P;
(b) zastąpienie reszty aminokwasowej D w pozycji 48 resztą aminokwasową E;
(c) zastąpienie reszty aminokwasowej A w pozycji 89 resztą aminokwasową T;
(d) zastąpienie reszty aminokwasowej F w pozycji 99 resztą aminokwasową S;
(e) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 111 resztą aminokwasową V;
(f) zastąpienie reszty aminokwasowej L w pozycji 136 resztą aminokwasową P;
(g) zastąpienie reszty aminokwasowej K w pozycji 154 resztą aminokwasową E;
(h) zastąpienie reszty aminokwasowej G w pozycji 179 resztą aminokwasową S;
(i) zastąpienie reszty aminokwasowej M w pozycji 228 resztą aminokwasową T;
(j) zastąpienie reszty aminokwasowej E w pozycji 238 resztą aminokwasową D;
(k) zastąpienie reszty aminokwasowej P w pozycji 289 resztą aminokwasową L oraz (l) zastąpienie reszty aminokwasowej Q w pozycji 298 resztą aminokwasową H.
62. Komórka S. avermitilis według zastrz. 54, znamienna tym, że allel aveC jest zmutowany tak, że koduje podstawienia aminokwasowe w kombinacji pozycji aminokwasów, przy czym taka kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe D48 i A89;
(b) reszty aminokwasowe Q38, L136 i E238;
(c) reszty aminokwasowe A139 i M228;
(d) reszty aminokwasowe G111 i P289 oraz (e) reszty aminokwasowe A139, K154 i Q298.
63. Komórka S. avermitilis według zastrz. 60, znamienna tym, że allel aveC jest zmutowany tak, że koduje podstawienia aminokwasowe w kombinacji pozycji aminokwasów, przy czym taka kombinacja jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) reszty aminokwasowe S138, A139 i G179 oraz (b) reszty aminokwasowe F99, S138, A139 i G179.
64. Komórka S. avermitilis według zastrz. 62, znamienna tym, że kombinacja podstawień aminokwasowych jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) D48E/A89T;
(b) Q38P/L136P/E238D;
(c) A139T/M228T;
(d) G111V/P289L i (e) A139T/K154E/Q298H.
65. Komórka S. avermitilis według zastrz. 63, znamienna tym, że kombinacja podstawień aminokwasowych jest wybrana z grupy obejmującej:
(a) S138T/A139T/G179S i (b) F99S/S138T/A139T/G179S.
66. Komórka S. avermitilis według zastrz. 64, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym D48E/A89T obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 317 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 438 w SEQ ID NO: 1.
67. Komórka S. avermitilis według zastrz. 66, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym D48E/A89T ponadto obejmują zmianę zasady z C na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 353 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1155 w SEQ ID NO: 1.
68. Komórka S. avermitilis według zastrz. 65, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym S138T/A139T/G179S obejmują zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
PL 203 818 B1
69. Komórka S. avermitilis według zastrz. 68, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym S138T/A139T/G179S ponadto obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 272 w SEQ ID NO: 1.
70. Komórka S. avermitilis według zastrz. 64, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym Q38P/L136P/E238D obejmują zmianę zasady z A na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 286 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 580 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 886 w SEQ ID NO: 1.
71. Komórka S. avermitilis według zastrz. 70, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym Q38P/L136P/E238D ponadto obejmują zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 24 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 497 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 554 w SEQ ID NO: 1.
72. Komórka S. avermitilis według zastrz. 65, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym F99S/S138T/A139T/G179S obejmują delecję 3 par zasad w pozycjach nukleotydów w allelu aveC odpowiadających pozycjom nukleotydów 173, 174 i 175 SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotyd allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 469 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z T na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 585 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 708 w SEQ ID NO: 1.
73. Komórka S. avermitilis według zastrz. 72, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym F99S/S138T/A139T/G179S ponadto obejmują zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 833 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1184 w SEQ ID NO: 1.
74. Komórka S. avermitilis według zastrz. 64, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym A139T/M228T obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 856 w SEQ ID NO: 1.
75. Komórka S. avermitilis według zastrz. 64, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym G111V/P289L obejmują zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 505 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1039 w SEQ ID NO: 1.
76. Komórka S. avermitilis według zastrz. 75, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym G111V/P289L ponadto obejmują zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 155 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z C na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1202 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z T na C w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1210 w SEQ ID NO: 1.
77. Komórka S. avermitilis według zastrz. 64, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym A139T/K154E/Q298H obejmują zmianę zasady z G na A w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 588 w SEQ ID NO: 1, zmianę zasady z A na G w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 633 w SEQ ID NO: 1 oraz zmianę zasady z A na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 1067 w SEQ ID NO: 1.
78. Komórka S. avermitilis według zastrz. 77, znamienna tym, że mutacje w allelu aveC kodującym A139T/K154E/Q298H ponadto obejmują zmianę zasady z G na T w pozycji nukleotydu w allelu aveC odpowiadającej pozycji nukleotydu 377 w SEQ ID NO: 1
79. Sposób wytwarzania awermektyn, znamienny tym, że hoduje się w pożywkach hodowlanych komórki Streptomyces avermitilis zdefiniowane w zastrz. 53-78, w warunkach, które umożliwiają lub indukują wytwarzanie przez nie awermektyn, oraz odzyskuje się te awermektyny z hodowli.
80. Kompozycja awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 wytwarzanych przez komórki Streptomyces avermitilis, określone w zastrz. 53, znamienna tym, że zawiera awermektyny cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 w stosunku 0,68:1 lub niższym w pożywce, w której hodowano komórki.
PL353874A 1999-08-12 2000-07-24 Cząsteczka polinukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarz Streptomyces, sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, komórka Streptomyces avermitilis, sposób wytwarzania awermektyn i kompozycja awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1 PL203818B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14864599P 1999-08-12 1999-08-12
PCT/IB2000/001017 WO2001012821A1 (en) 1999-08-12 2000-07-24 Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL353874A1 PL353874A1 (pl) 2003-12-01
PL203818B1 true PL203818B1 (pl) 2009-11-30

Family

ID=22526696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353874A PL203818B1 (pl) 1999-08-12 2000-07-24 Cząsteczka polinukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarz Streptomyces, sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, komórka Streptomyces avermitilis, sposób wytwarzania awermektyn i kompozycja awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1

Country Status (39)

Country Link
US (3) US6632673B1 (pl)
EP (1) EP1200606B1 (pl)
JP (1) JP3884651B2 (pl)
KR (1) KR100489856B1 (pl)
CN (1) CN1186446C (pl)
AP (1) AP2002002418A0 (pl)
AR (1) AR022646A1 (pl)
AT (1) ATE341632T1 (pl)
AU (1) AU778837B2 (pl)
BG (1) BG65902B1 (pl)
BR (1) BRPI0013119B8 (pl)
CA (1) CA2380872C (pl)
CO (1) CO5290295A1 (pl)
CY (1) CY1105778T1 (pl)
CZ (1) CZ304402B6 (pl)
DE (1) DE60031126T2 (pl)
DK (1) DK1200606T3 (pl)
EA (1) EA200200056A1 (pl)
ES (1) ES2272299T3 (pl)
GT (1) GT200000136A (pl)
HK (1) HK1046710B (pl)
HR (1) HRP20020130A2 (pl)
HU (1) HU230600B1 (pl)
IL (2) IL147563A0 (pl)
IS (1) IS6250A (pl)
MA (1) MA26813A1 (pl)
MX (1) MXPA02001513A (pl)
NO (1) NO20020664D0 (pl)
NZ (1) NZ516517A (pl)
OA (1) OA11998A (pl)
PA (1) PA8499501A1 (pl)
PE (1) PE20010690A1 (pl)
PL (1) PL203818B1 (pl)
PT (1) PT1200606E (pl)
SK (1) SK288086B6 (pl)
TN (1) TNSN00171A1 (pl)
UY (1) UY26286A1 (pl)
WO (1) WO2001012821A1 (pl)
ZA (1) ZA200201072B (pl)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HU230600B1 (hu) * 1999-08-12 2017-02-28 Zoetis Services Llc Az avermektinek B2:B1 arányát befolyásoló Streptomyces avermitilis gén
DE60326824D1 (de) * 2002-02-12 2009-05-07 Pfizer Prod Inc Streptomyces avermitilis gen zur regulierung des verhältnisses der b2:b1 avermectine
US7943160B2 (en) * 2002-05-09 2011-05-17 Scimetrics Limited Corp. Pest control methods
US9493744B2 (en) * 2012-06-20 2016-11-15 Genentech, Inc. Methods for viral inactivation and other adventitious agents
KR102657859B1 (ko) 2021-04-07 2024-04-16 윤재식 일체형 내화 소켓

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IN167980B (pl) * 1987-01-23 1991-01-19 Pfizer
US5238848A (en) 1987-01-23 1993-08-24 Pfizer Inc Cultures for production of avermectins
US5525506A (en) 1987-01-23 1996-06-11 Pfizer Inc. Process for production of avermectins and cultures therefor
US5234831A (en) 1987-01-23 1993-08-10 Pfizer Inc Cultures for production of B avermectins
ES2054822T3 (es) 1987-10-23 1994-08-16 Pfizer Procedimiento para la produccion de agliconas de avermectinas y sus cultivos.
US5240850A (en) 1987-10-23 1993-08-31 Pfizer Inc. Cultures for production of avermectin aglycones
ES2079436T3 (es) 1989-03-31 1996-01-16 Merck & Co Inc Clonacion de genes de streptomyces avermitilis para biosintesis de avermectinas y procedimientos para su uso.
US5252474A (en) 1989-03-31 1993-10-12 Merck & Co., Inc. Cloning genes from Streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
DK0711349T3 (da) 1993-07-30 2003-11-24 Pfizer Gener, der koder for forgrenet alfaketosyredehydrogenasekompleks fra Streptomyces avermitilis
FI942725A7 (fi) 1993-12-16 1995-06-17 Pfizer Haaraketjuista alfaketohappodenydrogenaasikompleksia koodaavia geenejä Streptomyces avermitiliksesta
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5837458A (en) 1994-02-17 1998-11-17 Maxygen, Inc. Methods and compositions for cellular and metabolic engineering
US6096548A (en) 1996-03-25 2000-08-01 Maxygen, Inc. Method for directing evolution of a virus
AU4503797A (en) 1996-09-27 1998-04-17 Maxygen, Inc. Methods for optimization of gene therapy by recursive sequence shuffling and selection
EP1717322B1 (en) 1997-01-17 2012-07-18 Codexis Mayflower Holdings, LLC Evolution of whole cells and organisms by recursive sequence recombination
US6596539B1 (en) 1997-10-31 2003-07-22 Maxygen, Inc. Modification of virus tropism and host range by viral genome shuffling
US6248579B1 (en) * 1998-02-13 2001-06-19 Pfizer Inc Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
HRP20000539A2 (en) * 1998-02-13 2001-04-30 Pfizer Prod Inc Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of b2:b1 avermectins
HU230600B1 (hu) * 1999-08-12 2017-02-28 Zoetis Services Llc Az avermektinek B2:B1 arányát befolyásoló Streptomyces avermitilis gén

Also Published As

Publication number Publication date
CA2380872C (en) 2007-11-27
SK288086B6 (sk) 2013-06-03
BG106479A (bg) 2002-10-31
AU778837B2 (en) 2004-12-23
BR0013119A (pt) 2002-04-23
AU5838600A (en) 2001-03-13
DE60031126D1 (de) 2006-11-16
IS6250A (is) 2002-01-25
JP3884651B2 (ja) 2007-02-21
HK1046710B (zh) 2005-05-13
CZ304402B6 (cs) 2014-04-16
IL147563A (en) 2009-06-15
JP2003507017A (ja) 2003-02-25
EP1200606B1 (en) 2006-10-04
OA11998A (en) 2006-04-18
NO20020664L (no) 2002-02-11
SK1392002A3 (en) 2002-12-03
MXPA02001513A (es) 2002-07-02
AP2002002418A0 (en) 2002-03-31
IL147563A0 (en) 2002-08-14
US20040009560A1 (en) 2004-01-15
ATE341632T1 (de) 2006-10-15
EP1200606A1 (en) 2002-05-02
HU230600B1 (hu) 2017-02-28
BR0013119B1 (pt) 2014-02-25
KR100489856B1 (ko) 2005-05-17
CO5290295A1 (es) 2003-06-27
CN1373809A (zh) 2002-10-09
UY26286A1 (es) 2001-03-16
US20030232415A1 (en) 2003-12-18
HUP0202487A3 (en) 2004-07-28
EA200200056A1 (ru) 2002-06-27
HUP0202487A2 (en) 2002-10-28
ZA200201072B (en) 2003-04-30
US7858340B2 (en) 2010-12-28
TNSN00171A1 (fr) 2005-11-10
DK1200606T3 (da) 2007-01-08
NZ516517A (en) 2003-10-31
PL353874A1 (pl) 2003-12-01
CN1186446C (zh) 2005-01-26
BG65902B1 (bg) 2010-04-30
AR022646A1 (es) 2002-09-04
KR20020029379A (ko) 2002-04-18
PA8499501A1 (es) 2001-12-14
HK1046710A1 (en) 2003-01-24
DE60031126T2 (de) 2007-02-08
WO2001012821A1 (en) 2001-02-22
HRP20020130A2 (en) 2003-06-30
ES2272299T3 (es) 2007-05-01
NO20020664D0 (no) 2002-02-11
PE20010690A1 (es) 2001-07-06
CA2380872A1 (en) 2001-02-22
PT1200606E (pt) 2006-12-29
US6632673B1 (en) 2003-10-14
BRPI0013119B8 (pt) 2021-05-25
MA26813A1 (fr) 2004-12-20
CY1105778T1 (el) 2011-02-02
CZ2002296A3 (cs) 2002-08-14
GT200000136A (es) 2002-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3688640B2 (ja) Ｂ２：Ｂ１アベルメクチン比率を支配するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ遺伝子
AU752343C (en) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
PL203818B1 (pl) Cząsteczka polinukleotydowa, zrekombinowany wektor, komórka gospodarz Streptomyces, sposób wytwarzania nowego szczepu S. avermitilis, komórka Streptomyces avermitilis, sposób wytwarzania awermektyn i kompozycja awermektyn cykloheksylo-B2:cykloheksylo-B1
KR100718378B1 (ko) Ｂ2:ｂ1 아베르멕틴의 비를 제어하는 스트렙토마이세스아베르미틸리스 유전자
AU779569B2 (en) Streptomyces avermitilis gene directing the ratio of B2:B1 avermectins
MXPA00007915A (en) I(streptomyces avermitilis) gene directing the ratio of b2:b1 avermectins

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification