BG106479A

BG106479A - Streptomyces avermitilis ген насочващ отношениетов2:в1 авермектини

Info

Publication number: BG106479A
Application number: BG106479A
Authority: BG
Inventors: Yan Chen; Claes Gustafsson; Anke Krebber; Jeremy Minshull; Sun RAILLARD; Kim Stutzman-Engwall
Original assignee: Pfizer Products Inc.
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 2002-03-05
Publication date: 2002-10-31
Also published as: NO20020664D0; NZ516517A; TNSN00171A1; MXPA02001513A; GT200000136A; HK1046710B; US20030232415A1; SK288086B6; UY26286A1; MA26813A1; CZ2002296A3; IL147563A; CN1373809A; AP2002002418A0; JP3884651B2; CO5290295A1; KR20020029379A; KR100489856B1; US7858340B2; CA2380872C

Abstract

Изобретението се отнася до полинуклеотидни молекули, съдържащи нуклеотидни последователности, кодиращи aveC генен продукт. Полинуклеотидните молекулимогат да бъдат използвани с цел да променят отношението или количеството на клас 2:1 авермектини, произведени във ферментационни култури от S. avermitilis. Изобретението се отнася и до вектори, клетки-гостоприемници и мутантни щамове на S. avermitilis, при които aveC генът е инактивиран или мутирантака, че да променя отношението или количеството на клас 2:1 произведени авермектини.

Description

STREPTOMYCES AVERMITILIS ГЕН

НАСОЧВАЩ ОТНОШЕНИЕТО НА В2:В1 АВЕРМЕКТИНИ

2094/02 PC

1. ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящето изобретение е насочено към препарати и методи за произвеждане на авермектини и първично е свързано със здравето на животните. По-специално, настоящето изобретение се отнася за полинуклеотидни молекули, съдържащи нуклеотидни последвателности, кодиращи един AveC генен продукт, който може да бъде използуван да модулира отношението на клас 2:1 авермектини, произведени чрез ферментация на култури от Streptomyces avermitilis и за препарати и методи за подбор на такива полинуклеотидни молекули. По-нататък настоящето изобретение се отнася за вектори, трансформирани клетки гостоприемници и нови мутантни щамове от S.avermitilis, в които aveC генът е мутиран така, че да модулира отношението на клас 2:1 произведени авермектини.

2. ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

2.1. Авермектини

Видовете Streptomyces произвеждат голямо разнообразие от вторични метаболити, включително авермектини, които обхващат една серия от осем свързани шестнадесет-членни макроциклични лактони, притежаващи мощна противохелминтна и инсектицидна активност. Осемте различни, но близко свързани съединения са означени като А1а, А1Ь, А2а, А2Ь, В1а, В1Ь, В2а и В2Ь. Сериите “а” съединения се отнасят за природен авермектин, където заместителят в позиция С25 е (8)-сек-бутил и “Ь” сериите се отнасят за такива съединения, където заместителят в позиция С25 е изопропил. Обозначенията “А” и “В” се отнасят за авермектини, където заместителят в позиция С5 е съответно метокси и хидрокси.

·· ···· ·· ····

Номерацията “1” се отнася за авермектини, кьдето една двойна връзка се намира в 022,23 позиция и номерацията “2” се отнася за авермектини, притежаващи един водород в позиция С22 и една хидрокси в позиция С23. Измежду сродните авермектини, В1 типът авермектин е разпознат, като притежаващ най-ефективната антипаразитна и пестицидна активност и следователно е търговски най-желаният авермектин.

Авермектините и тяхното производство чрез аеробна ферментация на щамове от S.avermitilis, са описани в United States Patents 4,310,519 и 4,429,042. Биосинтезата на природни © авермектини се счита, че е инициирана ендогенно от СоА тиоестерните аналози на изомаслена киселина и 8-(+)-2-метил маслена киселина.

Подобрение от комбинация на два щама чрез случайна мутагенеза и използуването на екзогенно доставени мастни киселини, води до ефективно производство на авермектинови аналози. Мутанти на S.avermitilis, които са дефицитни на разклонена-верига 2-оксо кисела дехидрогеназа (bkd дефицитни мутанти) могат само да произвеждат авермектини когато ферментациите са допълнени с мастни киселини. Подбор и изолиране на дефицитни на разклоненаО верига дехидрогеназна активност (например, S.avermitilis, АТСС 53567) са описани в European Patent (EP) 276103. Ферментация на такива муантанти в присъствие на екзогенно доставени мастни киселини, има за резултат получаване само на четирите авермектини, съответствуващи на използуваните мастни киселини. Така, допълвайки ферментации на S.avermitilis (АТСС 53567) със S-(+)метилмаслена киселина, има за резултат получаване на природните А1а, А2а, В1а и В2а; допълвайки ферментациите с изомаслена киселина се получават природните авермектини А1Ь, А2Ь, В1Ь и В2Ь; и допълвайки ферментациите с циклопентанкарбоксилова киселина ϊΜύΜΜί ·· ···· ·· ···· ·« ·· • · · ·· · · · · · ····· ·· · ·· · • · · · · · β · 9 · · · • · · · · ·· · · · · ···· има за резултат получаване на четирите нови циклопентилавермектини А1, А2, В1 и В2.

Ако добавката е с други мастни киселини, получават се нови авермектини. Чрез подбор на повече от 800 потенциални предшественици, са идентифицирани повече от 60 други нови авермектини. (Виж например, Dutton et al., 1991, J.Antibiot. 44:357-365; и Banks et al., 1994, Roy.Soc.Chem. 147:16-26). В допълнение, мутанти на S.avermitilis, дефицитни на 5-О-метилтрансферазна активност, произвеждат по същество само В аналог авермектините. Следователно, S.avermitilis мутанти, които нямат разклонена-верига © 2-оксо кисела дехидрогеназна и 5-О-метилтрансферазна активност, произвеждат само В авермектините, които съответствуват на използуваните мастни киселини като добавка при ферментацията. Така, допълвайки такива двойни мутанти със 8-(+)-2-метилмаслена киселина се получават само природните авермектини В1а и В2а, докато допълването с изомаслена киселина или циклопентанкарбоксилова киселина води до получаване на природните авермектини В1Ь и В2Ь или съответно на новите цикпопентил В1 и В2 авермектини. Допълване на двойно мутантния щам с циклохексан карбоксилова киселина, е предпочитан метод за производство на О търговски важният нов авермектин циклохексилавермектин В1 (дорамектин). Изолирането и характеристиките на такива двойни мутанти, например S.avermitilis (АТСС 53692), са описани в ЕР 276103.

2.2. Гени участвуващи в биосинтеза на авермектин

В много случаи, гени участвуващи в получаване на вторични метаболити и гени кодиращи даден антибиотик, са открити заедно групирани в хромозомата. Такъв е случаят например, със Streptomyces поликетид синтаза генното групиране (PKS) (виж

Hopwood and Sherman, 1990, Ann.Rev.Genet. 24:37-66). Така, една стратегия за клониране на гени в биосинтетичен път, е била да се изолира резистентен към лекарство ген и след това да се тестират съседни области на хромозомата за други гени, свързани с биосинтезата на този даден антибиотик. Друга стратегия за клониране на гени, включени в биосинтезата на важни метаболити е комплементация на мутанти. Например, части от ДНК библиотека на даден организъм, способни да произвеждат определени метаболити, са въвеждани в не-произвеждащи мутанти и трансформанти, подбрани за произвеждане на метаболитите. В допълнение, © хибридизация на библиотека, като се използуват сонди, произхождащи от други видове Streptomyces, са използувани за идентифициране и клониране на гени при биосинтетичните пътища.

Гени участвуващи в биосинтезата на авермекгин (ave гени), като гените необходими за биосинтеза на други вторични метаболити на Streptomyces (например, PKS), са открити групирани в хромозомата. Известен брой ave гени успешно са клонирани, като са използувани вектори комплементарни на S.avermitilis мутанти, блокирани при авермектин биосинтеза. Клонирането на такива гени е описано в U.S.Patent 5,252,474. В допълнение, Ikeda et al., 1995, 0 J.Antibiot. 48:532-534, описва локализацията на хромозомна област, включваща 022,23 дехидриращия етап (aveC) спрямо един 4.82 КЬ BamHl фрагмент на S.avermitilis, както и мутации в aveC гена, което има за резултат получаването на единствен компонент В2а производител. Тъй като авермекгин, едно мощно противохелминтно съединение, може да бъде получен химически от авермектин В2а, такъв единствен компонент производител на авермекгин В2а, се разглежда като особено полезен за търговско производство на авермекгин.

·· ·♦♦· ·· ···· »С ·· • · · · · · · · ♦ · • · · · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ··· ·· ·· ·· ····

Идентифицирането на мутации в aveC гена, които минимализират сложността на авермектин производството, като например, мутации, които намаляват В2:В1 отношението на авермектини, би опростило производството и пречистването на търговски важни авермектини.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, съдържащата цялата aveC ORF на S.avermitilis или значителна част от нея, която изолирана полинуклеотидна Q молекула няма следващата пълна ORF (отворена рамка за четене) , която е локализирана след aveC ORF in situ в S.avermitilis хромозомата. Изолираната полинуклеотидна молекула на настоящето изобретение предпочитано съдържа нуклеотидна последователност, която е същата като S.avermitilis AveC генен продукг-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или която е същата като нуклеоидната последователност на aveC ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), или значителна част от нея. Настоящото изобретение по-нататък предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидната последоф вателносг на SEQ ID N0:1 или нейин дегенериран вариант.

Настоящето изобретение по-нататък предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на S. avermitilis AveC генен продукткодиращага последователност на плазмид pSE186 (АТТС 209604), или на нуклеотидната последователност на aveC ORF, представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), или значителна част от нея.

По-нататък настоящето изобретение предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, включваща нуклеотидна последователност, кодираща един AveC хомолог генен продукт. В ·· ···· ·· ft··* предпочитано изпълнение, изолираната полинуклеотидна молекула, съдържа нуклеотидна последователност, кодираща AveC хомолог генен продукт от S.hygroscopicus, който хомоложен генен продукт съдържа аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4 или значителна част от нея. В едно предпочитано изпълнение, изолираната полинуклеотидна молекула на настоящето изобретение, която кодира S.hygroscopicus AveC хомолог генен продукт съдържа нуклеотидната последователност на SEQ ID N0:3 или значителна част от нея.

По-нататък настоящето изобретение предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на S.hygroscopicus нуклеотидната последователност на SEQ ID N0:3. Настоящето изобретение понататък предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, който е хомоложен на S.hygroscopicus AveC хомолог генен продукт, притежаващ аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4.

Настоящето изобретение по-нататък предоставя олигонуклеотиди, които хибридизират с полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или SEQ ID N0:3, или с полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е комплементарна на нуклеотиднтата последователност във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или SEQ ID N0:3.

По-нататък настоящето изобретение предоставя рекомбинан-тни клониращи вектори и експресионни на вектори, които са полезни при клониране или експресия на полинуклеотид на настоящето изобретение, включително полинуклеотидни молекули съдържащи aveC ORF на S.avermitilis или един aveC хомолог ORF. В • · · · · · • · ·«·· • · едно неограничаващо изпълнение, настоящето изобретение предоставя плазмид pSE186 (АТСС 209604), който съдържа цялата ORF на aveC гена от S.avermitilis. Настоящето изобретение предоставя освен това трансформирани клетки гостоприемници, съдържащи полинуклео-тидна молекула или рекомбинантен вектор на изобретението и техни нови производни щамове или клетъчни линии.

Настоящето изобретение предоставя по-нататък рекомбинантно експресиран AveC генен продукт или AveC хомолог генен продукт, или съществена част от него, който е съществено пречистен или изолиран, както и техни хомолози. Настоящето изобретение понататък предоставя метод за произвеждане на рекомбинантен AveC генен продукт, характеризиращ се с това че се култивира клетка гостоприемник, трансформирана с рекомбинантен експресионен вектор, споменатият рекомбинантен експресионен вектор включва полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, кодираща един AveC генен продукт или AveC хомолог генен продукт, която полинуклеотидна молекула е оперативно свързана с един или повече регулаторни елементи, които контролират експресията на полинуклеотидната молекула в клетката гостоприемник, в условия насочващи произвеждането на рекомбинантен AveC генен продукт или AveC хомолог генен продукт и добиване на AveC генния продукт или AveC хомолог генен продукт от клетъчната култура.

Настоящето изобретение по-нататък предоставя полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, която от друга страна е същата както S.avermitilis AveC алела или AveC генен продукг-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТТС 20904), или негов дегенериран вариант, или нуклеотидната последователност на aveC ORF на S.avermitilis, както е представено на ФИГУРА 1(SEQ ID N0:1) или негов дегенериран • · ··♦· • · вариант, но който по-нататък съдържа една или повече мутации, така че клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, при които дивия-тип aveC алел е инактивиран и които експресират полинуклеотидната молекула, съдържаща мутантната нуклеотидна последователност, произвеждат различно отношение или количество авермектини, в сравнение с произведените от клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. Съгласно настоящето изобретение, такива полинуклеотидни молекули могат да бъдат използувани да произвеждат нови щамове S.avermitilis, които проявяват забележима промяна в производството на авермектин, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само дивия- тип aveC алел. В едно предпочитано изпълнение, такива полинуклеотидни молекули са полезни за получаване нови щамове на S.avermitilis, които произвеждат авермектини в редуциран клас 2:1 отношение, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В следващо предпочитано изпълнение, такива полинуклеотидни молекули са полезни за получаване на нови щамове от S.avermitilis, които произвеждат повишени нива авермектини в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само единствен див-тип aveC алел. В следващо предпочитано изпълнение, такива полинуклеотидни молекули са полезни за получаване на нови щамове S.avermitilis, при които aveC генът е инакгивиран.

Настоящето изобретение предоставя методи за идентифициране мутанти на aveC ORF на S.avermitilis, способни да променят отношението и/или количеството на произведените авермектини. В предпочитано изпълнение, настоящето изобретение предоставя метод за идентифициране мутации на aveC ORF, способни да променят клас 2:1 отношението на произведените авермектини, характеризиращ се с това, че: (а) се определя клас 2:1 отношението ·· ·♦·· ·« ·»«· ·· ·· ··· · · 9 9 9 99

9 9 99 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 Q 9 9 9 99 • 9 · · 9 9^ 9 9 99

999 99 99 999999 авермектини, произведени с клетки на един щам от S.avermitilis, в който присъщият aveC алелът е инактивиран и в който полинуклеотидната молекула, съдържаща една нуклеотидна последователност, кодираща мутантен AveC генен продукт, е въведена и експресирана; (Ь) се определя клас 2:1 отношението авермектини, произведени от клетките на същия щам на S.avermitilis както в етап (а), но който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел или ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), или нуклеотидна последователност, която е хомоложна на него; и (с) се сравнява клас 2:1 отношението на авермектини, произведени с S.avermitilis клетки в етап (а) с клас 2:1 отношението авермектини, произведени със S.avermitilis клетки от етап (Ь); така че ако клас 2:1 отношението на авермектини, произведени от S.avermitilis клетки на етап (а) е различно от клас 2:1 отношението на авермектини, произведени от S.avermitilis клетки на етап (Ь), тогава е идентифицирана една мутация на aveC ORF, способна да променя клас 2:1 отношението на авермектини. В едно предпочитано изпълнение, клас 2:1 отношението на авермектини е редуцирано от мутацията.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за идентифициране мутации на aveC ORF или генетични конструкти, съдържащи aveC ORF, способни да променят количеството произведени авермектини, характеризиращ се с това, че : (а) се определя количеството произведени авермектини от клетки на един щам S.avermitilis, в който присъщият aveC алел е инактивиран, и в който полинуклеотидна молекула съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща мутантен AveC генен продукт или съдържаща генетичен конструкг, включващ нуклеотидна последователност, кодираща AveC генен продукт, е въведена и е експресирана; (Ь) се определя количеството авермектини, получени от клетки на същия щам от S.avermitilis както в етап (а), но който

9999 #9 9999 999 • 99 99 9 9 9 ·9

99999 99 9 9 >9 • · 999 91Й9 99 99 • 9 · 9 9 9 ^XV9 9 99 •9 999 99 99 999999 вместо това експресира само единствен aveC алел, притежаващ нуклеотидната последователност на ORF от ФИГУРА 1(SEQ ID N0:1) или нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нея; и (с) се сравнява количеството авермектини получени от клетки на S.avermitilis от етап (а) с количеството авермектини, получено от клетки на S.avermitilis на етап (Ь); така че ако количеството авермектини, получено от клетки на S.avermitilis на етап (а) е различно от количеството авермектини, получено от клетки на S.avermitilis на етап (Ь), тогава е идентифицирана една мутация на aveC ORF или генетичен конструкт, способен да променя количеството авермектини. В предпочитано изпълнение, клас 2:1 отношението на авермектини е редуцирано от мутацията.

По-нататък настоящето изобретение предоставя рекомбинантни вектори, които са полезни за получаване на нови щамове S.avermitilis, които имат променено производство на авермектин. Например, настоящото изобретение предоставя вектори, които могат да бъдат използувани да прицелват всяка от полинуклеотидните молекули, съдържащи мутантните нуклеотидни последователности на настоящото изобретение, на мястото на aveC гена на S.avermitilis хромозомата, за да вмъкнат или заменят aveC алела или ORF или част от тях с хомоложна рекомбинация. Съгласно настоящото изобретение обаче, полинуклеотидна молекула съдържаща мутантна нуклеотидна последователност на настоящото изобретение предоставена тук, може също да функционира като модулира биосинтезата на авермектин, когато е включена чрез инсерция в хромозомата на S.avermitilis, на място различно от aveC гена, или когато е подържан епизомно в S.avermitilis клетки. Така, настоящото изобретение предоставя също вектори, включващи полинуклеотидна молекула, съдържаща мутантна нуклеотидна последователност на настоящото изобретение, които вектори могат да бъдат използувани ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· · · · · · ····· · · · ·· · : : : ·: : .п: ·: : .· ·· ··· ·· «· ·· 9999 да включат чрез инсерция полинуклеотидната молекула на място в S.avermitilis хромозомата, различно от aveC гена или да бъде подържана епизомно. В предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя вектори за генна замяна, които могат да бъдат използувани да включват чрез инсерция мутантен aveC алел в хромозомата на S.avermitilis, за да се създадат нови щамове от клетки, които произвеждат авермектини в един редуциран клас 2:1 отношение, сравнени с клетките на същия щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел.

По-нататък, настоящото изобретение предоставя методи за ® получаване на тови щамове от S.avermitilis, характеризиращи се с това, че клетки, които експресират мутантен aveC алел и които произвеждат променено отношение и/или количества авермектини, са сравнени с клетки на същия щам от S.avermitilis, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове от S.avermitilis, характеризиращ се с това, че клетки, които експресират мутантен aveC алел и които произвеждат променено клас 2:1 отношение авермектини, са сравнени с клетки на същия щам от S.avermitilis, които вместо това експресират само дивия-тип aveC $ алел, включващ трансформиращи клетки от един щам на S.avermitilis с вектор, който носи мутантен aveC алел, кодиращ генен продукт, който променя клас 2:1 отношението на авермектини, произведени от клетки на един щам S.avermitilis, експресиращи мутантен алел, сравнени с клетки от същия щам, които вместо тава експресират само дивия-тип aveC алел и подбирайки трансформирани клетки, които произвеждат авермектини в един променен клас 2:1 отношение, сравнени с клас 2:1 отношението, получено от клетки на щама, който вместо това експресират дивия-тип aveC алел. В предпочитано • · • · ·· • · изпълнение, клас 2:1 отношението на получени авермектини е редуцирано в клетките на новия щам.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове S.avermitilis, характеризиращ се с това, че клетки, които произвеждат променени количества авермекгин, включващи трансформиращи клетки на един щам от S.avermitilis с вектор, който носи мутантен aveC алел или генетичен конструкт, съдържащ aveC алела, експресията, на който има за резултат променено количество авермектини, произведени от клетки на щам от S.avermitilis, ® експресиращи мутантния aveC алел или генетичен конструкт, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел и подбирайки трансформирани клетки, които произвеждат авермектини в променено количество в сравнение с количеството авермектини, получено от клетките на щама, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, количеството получени авермектини е повишено в клетки от новия щам.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове Q S.avermitilis, клетките на които съдържат инактивиран aveC алел, характеризиращ се с това, че се трансформират клетки на един щам от S.avermitilis, които експресират който и да е aveC алел с вектор, който инактивира aveC алела и се отбират трансформирани клетки, в които aveC алелът е инактивиран.

По-нататък, настоящото изобретение предоставя нови щамове от S.avermitilis , включващи клетки, които са трансформирани с всяка от полинуклеотидните молекули или вектори, съдържащи мугантна нуклеотидна последователност на настоящото изобретение. В предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя • · · « ··· ·· · ···· ····· · · · · · · j · j · · j в; ·: : _e· ·· ··· ·· ·· ·· ···· нови щамове от S.avermitilis, включващи клетки, които експресират мутантен aveC алел на мястото на, или в допълнение на дивия-тип aveC алел, където клетките на новия щам произвеждат авермектини в един променен клас 2:1 отношение, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. В попредпочитано изпълнение, клетките на новия щам произвеждат авермектини в редуциран клас 2:1 отношение, в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. Такива нови щамове са полезни при производството в голям мащаб на търговски търсени авермектини като дорамекгин.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя нови щамове от S.avermitilis, включващи клетки, които експресират мутантен aveC алел или генетичен конструкт, съдържащ aveC алела, на мястото на, или в допълнение на, присъщия му aveC алел, което води до производство от клетките на променено количество авермектини, в сравнение с количеството авермектини, произведено от клетки от същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, новите клетки произвеждат повишено количество авермектини.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя нови щамове от S.avermitilis, включващи клетки, при които aveC генът е инактивиран. Такива щамове са полезни поради различния спектър от авермектини, които те произвеждат в сравнение с дивия-тип щам, и при комплементационни тестове за отбор, както е описано тук, за определяне дали прицелна или случайна мутагенеза на aveC гена, повлиява производството на авермектин.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя процес за производство на авермектини, характеризиращ се с това, че се

култивират клетки от един щам на S.avermitilis, които клетки експресират мутантен aveC алел, който кодира генен продукт, променящ клас 2:1 отношението на авермектини, произведени от клетки на щам S.avermitilis, експресиращ мутантиия aveC алел, в сравнение с клетки на същия щам, които не експресират мутантния aveC алел, но вместо това експресират само дивия-тип aveC алел, в среда за култивиране, при условия позволяващи или индуциращи от това производството на аермектини и добиване на споменатите авермектини от културата. В предпочитано изпълнение, клас 2:1 отношението на авермектини, произведени от клетки експресиращи мутацията, е редуцирано. Този процес осигурява повишена ефективност на производството на търговски значими авермектини, като дорамектин.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя процес за производство на авермектини, характеризиращ се с това, че се култивират клетки от един щам на S.avermitilis, които клетки експресират мутантен aveC алел или генетичен конструкг, съдържащ aveC алел, което води до получаване на променено количество авермектини, произведени от клетки на щам S.avermitilis, експресиращи мутантния aveC алел или генетичен конструкт, в сравнение с клетки на същия щам, които не експресират мутантния aveC алел или генетичен конструкт, но вместо това експресират само дивия-тип aveC алел, в среда за култивиране при условия позволяващи или индуциращи това производството на авермектини и добиване на споменатите авермектини от културата. В предпочитано изпълнение, количеството авермектини произведено от клетки, експресиращи мутацията или генетичен конструкт, е повишено.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя нови препарати авермектини, произведени от щам на S.avermitilis, експресиращ мутантен aveC алел на настоящото изобретение, където • · · ·· · ···· ····· ·« · · · · ·· · · · · 15* · · · · ·· ··· ·· ·· е· ···· авермектините са произведени в редуциран клас 2:1 отношение, в сравнение с клас 2:1 отношението на авермектини, произведени от клетки на същия щам от S.avermitilis, които не експресират мугантния aveC алел, но вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. Новият авермектин препарат може да бъде представен като получен във ферментационна културелна течност, или може да бъде добит от нея и може частично или значително за бъде пречистен от нея.

4. КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

ФИГУРА 1. ДНК последователност (SEQ ID N0:1) включваща

S.avermitilis aveC ORF и произлизаща от нея аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:2).

ФИГУРА 2. Плазмиден вектор pSE186 (АТСС 209604), съдържащ целия ORF на aveC гена от S.avermitilis.

ФИГУРА 3. Заместващ ген вектор pSE180 (АТСС 209605), съдържащ егтЕ гена на Sacc.erythraea, въведен чрез инсерция в aveC ORF на S.avermitilis.

ФИГУРА 4. BamHI рестрикционна карта на авермектин поликетид синтаза генно групиране от S.avermitilis, с пет идентифицирани припокриващи се космидни клона ( т.е. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Указана е също взаимозависимостта HapSE118 npSE119.

ФИГУРА 5. HPLC анализ на ферментационните продукти, произведени с S.avermitilis щамове. Количественото определяне на максимума е изпълнено, чрез сравнение със стандартни количества циклохексил В1. Циклохексил В2 ретенционното време е 7.4-7.7 минути; циклохексил В1 ретенционното време е 11.9-12.3 минути. ФИГ. 5А. S.avermitilis щам SE180-11 с инактивиран aveC ORF. ФИГ.5В. S.avermitilis щам SE180-11, трансформиран с pSE187. ФИГ. 5D. S.avermitilis щам SE180-11, трансформиран с pSE188.

• ···

ФИГУРА 6. Сравнение на производни аминокиселинни последователности, кодирани от aveC ORF на S.avermitilis (SEQ ID N0:2), на aveC хомолог частична ORF от S.griseochromogenes (SEQ ID NO: 5), и aveC хомолога ORF от S.hygroscopicus (SEQ ID N0:4). Валиновият остатък представен подсилено, е предполагаемото начално място за белтъка. Консервативни остатъци са представени с главни букви за хомология във всичките три последователности и с малки букви за хомология в 2 от 3-те последователности. Аминокиселинните последователности съдържат около 50% идентичност на последователността.

® ФИГУРА 7. Хибриден плазмиден конструкг, съдържащ 564 Ьр (базови двойки) BsaM/Kpn\ фрагмент от S.hygroscopicus aveC хомолог ген, въведен чрез инсерция в BsaMIKpnl мястото в S.avermitilis aveC ORF.

5. ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящото изобретение се отнася за идентифициране и характеристика на полинуклеотидни молекули, притежаващи нуклеотидни последователности, които кодират AveC генен продукт от Streptomyces avermitilis, за конструриране на нови щамове от ф S.avermitilis, които могат да бъдат използувани за подбор на мутантни AveC генни продукти, за техния ефект върху произвеждането на авермектин и за откритието, че някои мутантни AveC генни продукти, могат да намаляват отношението В2:В1 авермектини, произведени от S.avermitilis. Като пример, изобретението е описано в разделите подолу за полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е същата като S.avermitilis AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или нуклеотидната последователност на ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) и за полинуклеотидни молекули, притежаващи • · · · • » мутантни нуклеотидни последователности, производни от тях и техни дегенерирани варианти. Обаче, принципите представени в настоящото изобретение, могат да бъдат аналогично приложени към други полинуклеотидни молекули, включително aveC хомолог гени от други видове Streptomyces, включително например, S.hygroscopicus и S.griseochrOmogenes, измежду други.

5.1. Полинуклеотидни молекули кодиращи S.avermitilis AveC генния продукт

Настоящото изобретение предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща пълната aveC ORF на S.avermitilis или значителна част от нея, която полинуклеотиидна молекула няма следвата ORF, която е локализирана след aveC ORF in situ в S.avermitilis хромозомата.

Изолираната полинуклеотидна молекула на настоящото изобретение предпочитано съдържа нуклеотидна последователност, която е същата като S.avermitilis AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или която е същата като нуклеотидната последователност на ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или съществена част от нея. Както тук е използувана “съществена част” от изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност кодираща S.avermitilis AveC генен продукт, означава изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща най-малко 70% от цялата aveC ORF последователност представена във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), и която кодира функционално еквивалентен AveC генен продукт. В това отношение, “функционално еквивалентен” AveC генен продукт е определен като генен продукт, който когато е експресиран в S.avermitilis щам АТСС 53692, в който естественият aveC алел е инакгивиран, има за резултат производството на съществено същото отношение и • · · · · · ·♦ ···· • · количество авермектини както произведеното от S.avermitilis щам АТСС 53692, който вместо това експресира само дивия-тип, функционален aveC, естествен за S.avermitilis щам АТСС 53692.

В допълнение към нуклеотидната последователност на aveC ORF, изолираната полинуклеотидна молекула на настоящото изобретение, може по-нататък да съдържа нуклеотидни последователности, които естествено ограничават aveC гена in situ в S.avermitilis, такива като тези ограничаващи нуклеотидни последователности, представени на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1).

Настоящото изобретение по-нататък предоставя изолирана ® полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидната последователност на SEQ ID N0:1, или неин дегенериран вариант.

Както тук са използувани, термините “полинуклеотидна молекула”, “полинуклеотидна последователност”, “кодираща последователност”, “отворена рамка за четене” и “ORF” са предиведин да се отнасят за ДНК и РНК молекули, които могат да бъдат едноверижни или двуверижни, и които могат да бъдат транскрибирани (презаписани) и транслирани (преведени) (ДНК), или преведени (РНК), в AveC генен продукт, както е описано по-долу, в AveC хомолог генен продукт, или в полипептид, който е хомоложен Q на AveC генен продукт или на AveC хомолог генен продукт, в подходяща клетъчна експресионна система-гостоприемник, когато се постави под контрола на съответни регулаторни елементи. Една кодираща последователност може да включва, но не се ограничава, до прокариотни последователности, кДНК последователности, геномни ДНК последователности и химически синтезирани ДНК и РНК последователности.

Нуклеотидната последователност представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) включва четири различни GTG кодони в позиции базови двойки (Ьр) 42, 174, 177 и 180. Както е описано в Раздел 9 по• · · · · · ·· ···· • · ··· · · · · · • · · · · · 19* · · · · ·· ··· ·· ·· ·· ···· долу, множествени делеции на 5’областта от aveC ORF (ФИГУРА 1; SEQ ID N0:1) са конструирани, за да помогнат да се определи кой от тези кодони може да функционира в aveC ORF като начални места за белтъчна експресия. Делеция на първото GTG място при Ьр 42 не елиминира AveC активността. Допълнителна делеция на всички от GTG кодоните в позиции Ьр 174, 177 и 180 заедно елиминира AveC активност, което показва, че тази област е необходима за белтъчна експресия. Така, настоящото изобретение обхваща различна дължина aveC ORFs.

По-нататък, настоящото изообретение предоставя полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на S.avermitilis AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или на нуклеотидната последователност на aveC ORF, представена във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или съществена част от нея. Терминът “хомоложен”, когато е използуван да се отнася за полинуклеотидна молекула, която е хомоложна на S.avermitilis AveC генен продукткодираща последователност, означава полинуклеотидна молекула притежаваща нуклеотидна последователност: (а) която кодира същия AveC генен продукт както S.avermitilis AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или която кодира същия AveC генен продукт, както нуклеотидната последователност на aveC ORF, представена във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), но която включва една или повече затихнали (silent) промени на нуклеотидната последователност, съответно на дегенерирането на генетичния код (т.е. един дегенериран вариант); или (Ь) която хибридизира с комплемента на полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която кодира аминокиселината последователност, кодирана от AveC генен продукткодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604) ·· ···· ·· ···· или която кодира аминокиселинната последователност представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) при условия на умерена строгост, т.е. хибридизация с филтър-свързана ДНК в 0.5 М NaHPO₄, 7% натриев додецил сулфат (SDS), 1mM EDTA на 65°С и измиване в 0.2xSSC/0.1% SDS на 42°С (виж Ausbuel et al. (eds.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol.l, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p.2.10.3), и кодира функционално еквивалентен AveC генен продукт, както е определено по-горе. В предпочитано изпълнение, хомоложната полинуклеотидна молекула хибридизира с комплентарната на AveC генен продукг® кодиращата нуклеотидна последователност от плазмид pSE186 (АТСС 209604) или с комплементарната на нуклеотидната последователностт на aveC ORF, представена във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или същствена част от нея при условия на висока строгост, т.е. хибридизация с филтър-свързана ДНК в 0.5 М NaHPO4, 7% SDS, 1mM EDTA на 65°С и измиване в 0.1 xSSC/0.1% SDS на 68°С (Ausubel et al., 1989 по-горе) и кодира функционално еквивалентен AveC генен продукт, както е определено по-горе.

Активността на един AveC генен продукт и на потенциални негови функционални еквиваленти, може да бъде определена с 9 HPLC анализ на ферментационните продукти, както е описано в примерите по-долу. Полинуклеотидни молекули притежаващи нуклеотидни последователности, които кодират функционални еквиваленти на S.avermitilis AveC генния продукт включват природно срещащи се aveC гени, представени в други щамове S.avermitilis, aveC хомолог гени в други видове на Streptomyces, и мутантни aveC алели, природно срещащи се или генно инженерно създадени.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, която кодира полипептид, притежаващ аминокиселинна последователност,

която е хомоложна на аминокиселинната последователност, кодирана от AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или аминокиселинната последователност от ФИГУРА , (SEQ ID N0:2) или съществена част от нея. Както тук е използувана “съществена част” от аминокиселинната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2), означава полинуклеотид, съдържащ най-малко около 70% от аминокиселинната последователност представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2) и която съставлява функционално еквивалентен AveC генен продукт, както е определено по-горе.

® Както тук е използувано да се отнася за аминокиселинни последователности, които са хомоложни на аминокиселинната последователност на AveC генен продукт от S.avermitilis, терминът “хомоложен” се отнася за полипептид, който от друга страна притежава аминокиселинната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2), но в който един или повече аминокиселинни остатъци са консервативно заменени с различен аминокиселинен остатък, където споменатата аминокиселинна последователност има най-малко 70%, по-предпочитано най-малко около 80% и най-предпочитано поне около 90% идентичност на аминокиселинната последователност с Q полипептида, кодиран от AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604) или аминокиселинната последователност от Фигура 1 (SEQ ID N0:2), както е определено с всякакъв стандартен алгоритъм за идентичност на аминокиселинна последователност, като BLASTP алгоритъм (GENBANK, NCBI) и където такива консервативни замени имат като резултат функционално еквивалентен генен продукт, както е определено по-горе. Консервативни аминокиселинни замени са добре известни в тази област. Правила за извършване на такива замени, включват тези описани от Dayhof, M.D., 1978, Nat.Biomed.Res.Found., ·· «··· ·· ···» · ·· ··· ·· ····· ····· · · · ··· • · · · · · · · ·· • · · · · · · ·· ·· ··· ·· ·· ·· ····

Washington, D.C., Vol.5, Sup. 3, измежду други. По-специално, консервативни аминокиселинни замени са тези, които общо стават в рамките на семейство от аминокиселини, които са свързани в киселинността или полярността. Генетично кодирани аминокиселини общо са разделени на четири групи: (1) кисели = аспартата, глутамат; (2) основни = лизин, аргинин, хистидин; (3) не-полярни = аланин, валин, левцин, изолевцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) не-заредени полярни = глицин, аспаргин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин са класифицирани свързано като ароматни аминокиселини. Една или повече замени в рамките на всяка отделна група, например, на левцин с изолевцин или валин, или на аспартат с глутамат, или на треонин със серин, или на всеки друг аминокиселинен остатък със структурно свързан аминокиселинен остатък, например, аминокиселинен остатък с подобна киселинност или полярност, или със сходство в някои техни комбинации, ще имат общо незначим ефект върху функцията на полипептида.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща aveC хомолог генен продукт. Както тук е използуван, “AveC хомолог генен продукт” е определен като генен продукт, притежаващ най-малко около 50% идентичност на аминокиселинната последователност с един AveC генен продукт на S.avermitilis, съдържащ аминокиселинната последователност, кодирана от AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или аминокиселинната последователност представена на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2), както е определена със стандартен алгоритъм за идентичност на аминокиселинна последователност, като BLASTP алгоритъм (GENBANK, NCBI). В едно неограничаващо изпълнение, AveC •· · · ♦· • · ·· ···· • · • ··· • 4 • · · · · · · • · · · · · • · · · · *23· · * · ·· ··· ·· ·· ·· ···· хомолог генният продукт е от S.hygroscopicus, (описано в ЕР application 0298423; deposit FERM ВР-1901) и включва аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4, или съществена част от нея. “Съществена част” на аминокиселинната последователност от SEQ ID N0:4, означава полипептид, съдържащ най-малко около 70% от аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4, и който съставлява функционално еквивалентен AveC хомолог генен продукт. “Функционално еквивалентен” AveC хомолог генен продукт е определен като генен продукт, който когато е експресиран в S.hygroscopicus щам FREM ВР-1901, в който нативният aveC хомолог алел е инактивиран, има като резултат производството на същото по същество отношение и количество от милбемицини (milbemycins) каквито се произвеждат от S.hygroscopicus щам FERM ВР-1901, експресиращ вместо това само дивия-тип, функционален aveC хомолог алел, присъщ на S.hygroscopicus щам FERM ВР-1901. В едно неограничаващо изпълнение, изолираната полинуклеотидна молекула на настоящото изобретение, която кодира S.hygroscopicus AveC хомолог генен продукт, включва нуклеотидната последователност от SEQ ID N0:3 или съществена част от нея. В това отношение, “съществена част” от изолираната полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидната последователност от SEQ ID N0:3, означава изолирана полинуклеотидна молекула, съдържаща най-малко около 70% от нуклеотидната последователност на SEQ ID N0:3 и която кодира функционално еквевалентен AveC хомолог генен продукт, както е дефинирано непосредствено по-горе.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, която е хомоложна на S.hydroscopicus нуклеотидната последователност от SEQ ID N0:3. Терминът “хомоложен” когато е използуван да се отнася за полинуклеотидна молекула, съдържаща ·· ···♦ ·· 9999 · 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 99 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 J A 9 9 9 · • · · · · · 9 9 9 9

999 99 99 99 9999 нуклеотидна последователност, която е хомоложна на S.hydroscopicus AveC хомолог генен продукг-кодиращата последователност от SEQ ID N0:3, означава полинуклеотидна молекула притежаваща нуклеотидна последователност: (а) която кодира същия генен продукт, както нуклеотидната последователност от SEQ ID N0:3, но която включва една или повече заглъхващи промени на нуклеотидната последователност съответно на дегенерацията на генетичния код (т.е. един дегенериран вариант); или (Ь) която хибридизира с комплементарната на полинуклеотидната молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която кодира © аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4, при условия на “умерена строгост”, т.е. хибридизация с филтър-свързана ДНК в 0.5 М NaHPO₄, 7% SDS, 1mM EDTA на 65°С и измиване с 0.2xSSC/0.1% SDS на 42°С (виж Ausubel et al., по-горе) и кодира функционално еквивалентен AveC хомолог генен продукт, както е определено погоре. В едно предпочитано изпълнение, хомоложната полинуклеотидна молекула хибридизира с комплементарната на AveC хомолог генен продукг-кодиращата нуклеотидна последователност на SEQ ID N0:3, в условия на “висока строгост”, т.е. хибридизация с филтър-свързана ДНК в 0.5М NaHP0₄, 7% SDS, © 1mM EDTA на 65°С и измиване в 0.1xSSG/0.1% SDS на 68°С (Ausubel et al., 1989, по-горе) и кодира функционално еквивалентен AveC хомолог генен продукт, както е определено по-горе.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя полинуклеотидна молекула, съдържаща една нуклеотидна последова-телност, която кодира полипептид, който е хомоложен на

S.hygroscopicus AveC хомолог генен продукт. Както тук е използувано да се отнася за полипептиди, които са хомолжни на AveC хомолог генния продукт на SEQ ID N0:4 от S.hygroscopicus, терминът “хомоложен” се отнася за полипептид, който от друга страна има

·· ···· аминокиселинната последователност на SEQ ID N0:4, но в която един или повече аминокиселинни остатъци са консервативно заменени с различен аминокиселинен остатък, както е определено по-горе, където споменатата аминокиселинна последователност има най-малко около 70%, по-предпочитано най-малко около 80% и найпредпочитано най-малко около 90% идентичност на аминокиселинната последователност с полипептида от SEQ ID N0:4, както е определена с всеки стандартен алгоритъм за идентичност на аминокиселинна последователност, като BLASTP алгоритъм (GENBANK, NCBI), и където такава консервативна замяна има за ® резултат функционално еквивалентен AveC хомолог генен продукт, както е определено по-горе.

По-нататък настоящото изобретение предоставя олигонуклеотиди, които хибридизират с полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или SEQ ID N0:3, или с полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, която е комплеменарна на нуклеотидната поледователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или SEQ ID N0:3. Такива олигонуклеотиди са най-малко с дължина около 10 нуклеотида, и предпочитано от около 15 до около 30 нуклеотида С дължина и хибридизират с една от гореспоменатите полинклеотидни молекули при условия на “висока строгост”, т.е. измиване в 6xSSC/0.5% натриев пирофосфат на ~ 37°С за ~14-базови олига, на ~48°С за ~17-базови олига, на ~55°С за ~20-базови олига и на ~60°С за ~23-базови олига. В предпочитано изпълнение, олигонуклеотидите са комплементарни на една част от една от гореспоменатите полинуклеотидни молекули. Тези олигонуклеотиди са полезни за различни цели, включително да кодират или действуват като антисенз молекули, полезни в генната регуулация, или като праймери • · · · · · • · • ··· • · ····

при амплификация на aveC или aveC хомолог-кодиращи полинуклеотидни молекули.

Допълнителни aveC хомолог гени могат да бъдат идентифицирани в други видове или щамове на Streptomyces, като се използуват полинуклеотидните молекули или олигонукпеотиди, представени тук във връзка с известни техники. Например, една олигонуклеотидна молекула съдържаща част от S.avermitilis нуклеотидната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или част от S.hygroscopicus нуклеотидната последователност на SEQ ID N0:3 може да бъде откриваемо белязана и използувана за подбор на © геномна библиотека, конструирана от ДНК, произхождаща от организъм, който е от интерес. Строгостта на условията за хибридизация е избрана въз основа на взаимозависимостта на референтния организъм, в този пример S.avermitilis или S.hygroscopicus, спрямо организъма, който е от интерес. Изисквания за различни условия на строгост са добре известни на специалиста в тази област, и такива условия могат да варират предвиждайки в зависимост от спецификите на организмите, от които произхожда библиотеката и белязаните последователности. Такива олигонуклеотиди предпочитано са с около 15 дължина и включват, © например тези описани в примерите по-долу. Амплификация на хомолог гени може да бъде изпълнена, като се използуват тези и други олигонукпеотиди, прилагайки стандартни техники като полимеразна верижна реакция (PCR), въпреки че могат да бъдат използувани други техники за амплификация, известни в тази област, например, лигазна верижна реакция.

Клонове идентифицирани като съдържащи aveC хомолог нуклеотидни последователности, могат да бъдат тестирани за способност да кодират функционален AveC хомолог генен продукт. За тази цел, клоновете могат да бъдат подложени на секвениращ • · ·· ···· ···· · ·· ······· ····· ·· · ♦ · · • · · · · · ο*· * · · · « · · · · · Z4 · · · ·· ··· ·· ·« ·· ·«·· анализ, за да се идентифицира подходяща рамка за четене, както и иницииращите и завършващите сигнали. Алтернативно или допълнително, клонираната ДНК последователност може да бъде включена чрез инсерция в подходящ експресионен вектор, т.е. вектор, който съдържа необходимите елементи за транскрипция и превеждане на включената белтък-кодираща последователност. Може да бъде използувана всяка система от едно разнообразие на гостоприемник/вектор системи , както е описано по-долу, включително, но неограничаващо до бактериални системи като плазмидни, бакториофагни или космидни експресионни вектори. © Подходящи клетки гостоприемници, трасформирани с такива вектори, съдържащи потенциални aveC хомолог кодиращи последователности, могат след това да бъдат анализирани за AveC-тип активност, като се използуват методи, като HPLC анализ на ферментационните продукти, както е описано, например в Раздел 7, по-долу.

Получаване и манипулации на полинуклеотидните молекули, представени тук, са във възможностите на специалиста в тази област и могат да бъдат проведени съгласно описаните рекомбинантни техники, например в Maniatis, et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Hharbor Laboratory Press, Cold Spring O Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Clod Spring Harbor, NY; Innis et al (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; и Erlich (ed),1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, всяка от тях е включена тук чрез цитат. Полинуклеотидни клонове, кодиращи AveC генни продукти или AveC хомолог генни продукти, могат да бъдат идентифицирани като се използува всеки метод, известен в тази област, включително, но неограничаващо методите представени в

4·4· • 4 ···· • ·

444 ·· ··

4 4 4 4 ·· • 4 4 4 44 • 4 DO* 4 4 44

4 4 4 44

44 44>444

Раздел 7, по-долу. Геномни ДНК библиотеки, могат да бъдат отбрани за aveC или aveC хомолог кодиращи последователности, като се използуват техники, като методите представени в Benton and Davis, 1977, Science 196:180, за бакгериофагни библиотеки и в Grunstein and Hogness, 1975, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 72:3961-3965, за плазмидни библиотеки. Полинуклеотидни молекули, притежаващи нуклеотидни послдователности, известни че включват aveC ORF, както е представен, например в плазмид pSE186 (АТСС 209604) или в плазмид pSE119 (описан в Раздел 7, по-долу), могат да бъдат използувани като сонди в тези експерименти за подбор. ® Алтернативно, могат да бъдат синтезирани олигонуклеотидни сонди, които съответствуват на нуклеотидните последователности, произлизащи от частични или завършени аминокиселинни последователности на пречистения AveC хомолог генен продукт.

5.2. Рекомбинантни системи

5.2.1. Клонираши и експресионни вектори

Настоящото изобретение по-нататък предоставя рекомбинантни клониращи вектори и експресионни вектори, които са полезни при клониране или експресиране на полинуклеотидни молекули на 0 настоящото изобретение, включващи например, aveC ORF от S.avermitilis или всеки aveC хомолог ORFs. В неограничаващо изпълнение, настоящото изобретение предоставя плазмид pSE 186 (АТСС 209604), който съдържа цялата ORF на aveC от S.avermitilis.

Цялото следващо описание отнасящо се до aveC ORF от

S.avermitilis, или полинуклеотидна молекула, съдържаща aveC ORF от S.avermitilis или части от него, или S.avermitilis AveC генен продукт, също се отнася за aveC хомолози или AveC хомолог генни продукти, ако не е указано изрично или от контекста.

Разработени са множество различни вектори за специфична употреба при Streptomyces, включително фаги, висококопийни плазмиди, нискокопийни плазмиди и E.coli-Streptomyces векторисовалка, извежду другите и всеки от тях може да бъде използуван за приложение в настоящото изобретение. Известен брой резистентни към лекарства гени, също са клонирани от Streptomyces и някои от тези гени са включени във вектори като селективни маркери. Представени са примери за съвременни вектори за употреба при Streptomyces, измежду други източници, в Hutchinson, 1980, Applied Biochem.Biotech. 16:169-190.

Ф Рекомбинантни вектори на настоящото изобретение, поспециално експресионни вектори, предпочитано са конструирани, така, че кодиращата последователност за полинуклеотидната молекула на изобретението е оперативно свързана с един или повече регулаторни елементи, необходими за транскрипцията и транслацията на кодиращата последователност за произвеждане на полипептид. Както тук е използуван, терминът “регулаторен елемент” включва, но не се ограничава до нуклеотидни последователности, които кодират индуцируеми и не-индуцируеми промотори, енхенсери, оператори и други елементи, известни в тази област, които служат да Q движат и/или регулират експресията на полинуклеотид кодиращи последова-телности. Също, както тук е използувано, кодиращата последователност е в “оперативна връзка” с един или повече регулаторни елементи, където регулаторните елементи, ефективно регулират и правят възможно презаписването на кодиращата последователност или превеждането на нейните мРНК, или и двете.

Типични плазмидни вектори, които могат да бъдат инженерно манипулирани така че да съдържат полинуклеотидна молекула на настоящото изобретение, включват pCR-Blunt, pCR2.1 ·« ···· • · · • · ··· • · · • · 9 ··· ·· ···<

999 е · ·· • 99

99

999999 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) и векторът совалка pWHM3 (Vara et al., 1989, J.Bad. 171:5872-5881), измежду много други.

Добре известни в тази област са методи за конструиране на рекомбинантни вектори, съдържащи определени кодиращи последователности в оперативна връзка с подходящи регулаторни елементи и те могат да бъдат използувани за приложение на настоящото изобретение. Тези методи включват in vitro рекомбинантни техники, синтетични техники и in vivo генетична рекомбинация. Виж, например техниките описани в Maniatis et al., 1989, по-горе; Ausubel et al., 1989, по-горе; Sambrook et al., 1989, no® rope; Innis et al., 1995, по-горе; и Erlich, 1992, no-rope.

Регулаторните елементи на тези вектори могат да варират по сила и специфичност. В зависимост от използуваната система гостоприемник/вектор, могат да бъдат използувани всеки от известен брой подходящи транскрипционни и транслационни елементи. Неограничаващи примери за транскрипционни регулаторни области или промотори за бактерии, включват β-gal промотора, Т7 промотора, ТАС промотора, λ ляв и десен промотори, trp и lac промотори, trp-lac слети промотори и по-специално за Streptomyces, промоторите егтЕ, melC и tipA и т.н. В едно специфично изпълнение, описано в Раздел © 11 по-долу, е създаден експресионен вектор, който съдържа aveC

ORF, клониран в съседство със силния конститутивен егтЕ промотор от Saccharopolyspora erythraea. Векторът е трансформиран в S.avermitilis и последващ HPLC анализ на ферментационни продукти показва повишен тигър на произведени авермектини, в сравнение с производството със същия щам, но който вместо това експресира дивия-тип aveC алел.

Слети белтъчни експресионни вектори могат да бъдат използувани да експресират един AveC генен продукг-слет (фузионен) белтък. Пречистеният слет белтък може да бъде ··· ·· · ···· ····· ·· · ·· ·

9 9 9 9 9 α*| · · * * ·· · 9 · 9 J*. 9 9 9

999 99 99 99 9999 използуван за създаване на антисеруми срещу AveC генен продукт, за изучаване биохимичните свойства на AveC генния продукт, за генно инженерно създаване на AveC слети белтъци с различни биохимични активности или да помагат при идентификацията, или пречистване на експресирания AveC генен продукт. Възможни слет белтък експресионни вектори включват, но не се ограничават до вектори, съдържащи последователности, които кодират βгалактозидаза и trpE фузии (сливания), малтоза-свързващи белтъчни фузии, глутатион-8-трансфераза фузии и полихистидин фузии (области носители). В едно алтернативно изпълнение, AveC генен ® продукт или част от него, може да бъде слет с AveC хомолог генен продукт, или част от него, произхождащ от други видове или щам на Streptomyces, като например, S.hygroscopicus или

S.griseochromogenes. В едно специално изпълнение, описано в Раздел 12, по-долу, и представено във ФИГУРА 7, е конструиран химерен плазмид, който съдържа една 564 Ьр област от S.hygroscopicus aveC хомолог ORF, чрез заместване на една хомоложна 564Ьр област от S.avermitilis aveC ORF. Такива хибридни вектори могат да бъдат трансформирани в клетки на S.avermitilis и тестирани за определяне техния ефект, например върху отношението © на клас 2:1 произведен авермектин.

AveC слети белтъци могат да бъдат генно инженерно манипулирани да съдържат област полезна за пречистване. Например, AveC-малтоза-свързващ белтък фузии могат да бъдат пречистени като се използува амилозна смола; АуеС-глутатион-Бтрансфераза слети (фузионни) белтъци могат да бъдат пречистени използувайки глутатион-агароза bead зърна; AveC-полихистидин фузиите могат да бъдат пречистени като се използува двувалентна никелова смола. Алтернативно, антитела срещу белтък носител или пептид, могат да бъдат използувани за пречистване на слет белтък с it · · · · • ·· • ·· · · • ·· · • ·· • · · · · • · • «•I

• « · е

афинитетна хроматография. Например, нуклеотидна последователност кодираща прицелен епитоп на моноклонално антитяло, може да бъде генно инженерно манипулирана в експресионния вектор в оперативна връзка с регулаторни елементи и разположена така, че експресираният епитоп да е слет с AveC полипептид. Например, нуклеотидна последователност, кодираща FLAG™ епитоп tag (International Biotechnologies Inc.), който е хидрофилен маркерен пептид, може да бъде включена чрез инсерция със стандартни техники, в експресионния вектор на място съответствуващо, например на карбоксилния край на AveC полипептида. © Експресираният AveC полипептид-FLAG™ епитоп фузионен продукт, може да бъде открит и афинитетно пречистен, използувайки антиFLAG™ антитела, които са търговски достъпни.

Експресионният вектор, кодиращ AveC слетия белтък, може също генно инженерно да бъде манипулиран, да съдържа полилинкерни последователности, които кодират специфични места за протеазно срязване, така че експресираният AveC полипетид може да бъде освободен от областта носител или фузионния участник, чрез третиране със специфична протеаза. Например, слетият белтъчен вектор може да включва ДНК последователности, Q кодиращи тромбин или фактор Ха места на срязване, измежду другите.

Една сигнална последователност пред и в рамката за четене с aveC ORF, може да бъде инженерно манипулирана в експресионния вектор, с познати методи да насочи придвижването и секрецията на експресирания генен продукт. He-ограничаващи примери за сигнални последователности, включват такива от а фактор, имуноглобулини, белтъци на външната мембрана, пеницилаза и Т-клетъчни рецептори, измежду други.

•« ···· · · · · · · · · · · ··· ·· ····· ····· ·· · ··· • · · · · · -5-} · · ·· • · * · · · ЗЛ · ·· ·· ·«· «· ♦ · ·· ···*

За да помогне при отбора на клетки гостоприемници, трансформирани или трансфекгирани с клониращи или експресионни вектори на настоящото изобретение, векторът може инженерно да бъде манипулиран, по-нататък да включва кодираща последователност за репортерен генен продукт или друг подбран маркер. Такава кодираща последователност предпочитано е в оперативна връзка с регулаторния елемент, кодиращ последователности, както е описано по-горе. Репортерни гени, които са полезни за изобретението, са добре известни в тази област и включват такива, които кодират зелен флуоресцентен белтък, © луцифераза, ху/Е и тирозиназа. Нуклеотидни последователности, кодиращи подбрани маркери, са добре известни в тази област и включват тези, които кодират генни продукти, придаващи резистентност към антибиотици или антиметаболити, или които придават ауксотрофно изискване. Примери за такива последователности включват такива, които кодират резистентност към еритромицин, тиострептон или канамицин, измежду много други.

5.2.2. Трансформиране на клетки гостоприемници

Настоящото изобретение по-нататък предоставя трансфорО мирани клетки гостоприемници, съдържащи полинуклеотидна молекула или рекомбинантен вектор на изобретението и нови щамове или клетъчни линии произходащи от тях. Клетки гостоприемници полезни за практиката на изобретението, предпочитано са Streptomyces клетки, въпреки че могат да бъдат използувани и други прокариотни клетки или еукариотни клетки. Такива трансформирани клетки гостоприемници, обикновено включват, но не се ограничават до микроорганизми, като бактерии трансформирани с рекомбинантна бакгериофагна ДНК, плазмидни ДНК или космидни ДНК вектори, или дрожди трансформирани с рекомбинантни вектори, измежду други.

« ·

Полинуклеотидните молекули на настоящото изобретение са предвидени да функционират в клетки от Streptomyces, но могат също да бъдат трансформирани в други бактериални или еукариотни клетки, например за целите на кпониране или експресия. Обикновено може да бъде използуван един щам E.coli като например, DH5a щама, на разположение от American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (Accession No. 31343) и от търговски източници (Stratagene). Предпочитани еукариотни клетки гостоприемници включват дрождени клетки, въпреки че могат също ефективно да бъдат използувани клетки от бозайници или насекоми.

® Рекомбинантният експресионен вектор на изобретението, предпочитано е трансформиран или трансфектиран в една или повече клетки гостоприемници от по същество хомогенна клетъчна култура. Експресионният вектор общо е въведен в клетки гостоприемници, в съответствие с известни техники, като например чрез протопластна трансформация, утаяване скапциев фосфат, третиране с калциев хлорид, микроинжектиране, елекгропорация, трансфекция чрез контакт с рекомбиниран вирус, липозомномедиирана трансфекция, DEAE-декстран трансфекция, трансдукция, конюгация или микропрожектилно бомбардиране. Може да бъде © направен отбор на трансформанти със стандартни процедури, като чрез отбор за клетки експресиращи подбран маркер, например, резистентност към антибиотик, свързан с рекомбинантния вектор, както е описано по-горе.

Веднаж въведен експресионният вектор в клетката гостоприемник, интеграцията и подържането на aveC кодиращата последователност в хромозома на клетката гостоприемник или епизомно, могат да бъдат потвърдени със стандартни техники, например със Southern хибридизационен анализ, рестрикционен ензимен анализ, PCR анализ, включително обратна транскриптаза • · · · • · « ·

9

• · 4

(reverse transcriptase) PCR (rt-PCR) или c имунологичен тест, за откриване на очакван генен продукт. Клетки гостоприемници съдържащи и/или експресиращи рекомбинантната aveC кодираща последователност, могат да бъдат идентифицирани с най-малко четири общи подхода, които са добре известни в тази област, включващи: (i) ДНК-ДНК, ДНК-РНК или РНК-антисенз РНК хибридизация; (ii) откриване наличието на “маркерни” генни функции;

(iii) определяне нивото на транскрипция, измерено чрез експресията на aveC-специфични мРНК транскрипти в клетката гостоприемник; и (iv) откриване наличието на зрял полипептиден продукт, измерен например, чрез имуно тест или по наличието на AveC биологична активност (например, произвеждането на специфични отношения и количества авермектини, показателни за AveC активност в например, S.avermitilis клетки гостоприемници).

5.2.3. Експресия и характеризиране на на оекомбинантен AveC генен продукт

Веднаж стабилно въведена aveC кодиращата последователност в подходяща клетка гостоприемник, трансформираната клетка гостоприемник клонално е размножена и получените клетки могат да бъдат култивирани в условия, водещи до максимално производство на AveC генен продукт. Такива условия обикновено включват клетки растящи до висока плътност. Когато експресионният вектор съдържа индуцируем промотор, подходящи индукционни условия като например температурна промяна, изчерпване на хранителни източници, добавка на неподходящи индуктори (например, аналози на въглехидрати, като изопропил-З-О-тиогалактопиранозид (IPTG)), натрупване излишек от метаболитни странични продукти или подобни, са използувани като необходими да индуцират експресия.

· ft · · » ftft ft ·*·

Там където експресираният AveC генен продукт е задържан вътре в клетките гостоприемници, клетките са събирани и лизирани и изолираният продукт е пречистен от лизата при условия на екстракция, известни в тази област, за намаляване белтъчната деградация, като например при 4°С или в присъствието на протеазни инхибитори, или и двете. Там където експресираният AveC генен продукт е секретиран от клетките гостоприемници, изтощената хранителна среда може просто да бъде събрана и продуктът да бъде изолиран от нея.

Експресираният AveC генен продукт може да бъде изолиран © или съществено пречистен от клетъчни лизати или среда за култивиране, както е подходящо, като се използуват стандартни методи, включително, но не ограничено, като всяка комбинация от следните методи: утаяване с амониев сулфат, фракциониране в зависимост от големината, йонообменна хроматография, HPLC, плътностно центрофугиране и афинитетна хроматография. Там където експресираният AveC генен продукт проявява биологична активност, повишена чистота на препаата може да бъде контролирана на всеки етап от процедурата на пречистване, като се прилагат съответни тестове. Дали проявява или не проявява С биологична активност експресираният AveC генен продукт, може да бъде открито въз основа например на големина, реактивност с антитяло, което от друга страна е специфично за AveC, или по наличието на фузионен tag. Както тук е използувано, AveC генен продукт е “съществено пречистен”, когато продуктът съставлява повече от около 20% тегловни от белтъка в дадения препарат. Също, както тук е използувано, AveC генен продукт е “изолиран” когато продуктът съставлява най-малко от около 80% тегловни от белтъка в даден препарат.

• · ····

Така настоящото изобретение предоставя рекомбинантноекспресиран изолиран или съществено пречистен S.avermitilis AveC генен продукт, включващ аминокиселинната последователност, кодирана от AveC генен продукт-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 209604), или аминокиселинната последователност от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2), или съществена част от нея и техни хомолози.

По-нататък настоящото изобретение предоставя рекомбинантно-експресиран, изолиран или съществено пречистен S.hygroscopicus AveC хомолог генен продукт, включващ аминоФ киселинната последователност на SEQ ID N0:4 или съществена част от нея и нейни хомолози.

По-нататък настоящото изобретение предоставя метод за получаване на AveC генен продукт, характеризиращ се с това, че се култивира клетка гостоприемник, трансформирана с рекомбинантен експресионен вектор, споменатият вектор съдържащ полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, кодираща AveC генен продукт, която полинуклеотидна молекула е оперативно свързана с един или повече регулаторни елементи, които контролират експресия на полинуклеотидната молекула в клетката ф гостоприемник, в условия водещи до получаване на рекомбинантния AveC генен продукт и добиване на AveC генния продукт от клетъчната култура.

Рекомбинантно експресираният S.avermitilis AveC генен продукт е полезен за различни цели, включително за отбор на съединения, които променят функцията на AveC генен продукт и при това модулират биосинтезата на авермектин, и за създаване на антитела, насочени срещу AveC генния продукт.

Веднаж получен AveC генен продукт със задоволителна чистота, може да бъде характеризиран със стандартни методи, ·· ·♦·» • · ·· ···· включващи SDS-PAGE, гелово проникваща хроматография, анализ на аминокиселинна последователност, биологична активност при получаване на съответни продукти на авермекгин биосинтетичния път и т.н. Например, аминокиселинната последователност на AveC генен продукт може да бъде определена като се използуват стандартни пептидни техники на секвениране. По-нататък AveC генният може да бъде характеризиран като се използува анализ за хидрофилност (виж например, Hopp and Woods, 1981, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:3824) или аналогови програмни алгоритми, за идентифициране хидрофобни и хидрофилни области на AveC ® генен продукт. Може да бъде проведен структурен анализ за идентифициране области от AveC генния продукт, които приемат специфични вторични структури. Биофизични методи като Х-лъчева кристалография (Engstrom, 1974, Biochem.Exp.Biol. 11: 7-13), компютерно моделиране (Fletterick and Zoller (eds), 1986, в: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harboor, NY), и ядрен магнитен резонанс (NMR) могат да бъдат използувани за картиране и изучаване местата на взаимодействие между AveC генен продукт и неговия субстрат. Информация получена от тези проучвания може да бъде използувана О за подбор на нови места за мутация в aveC ORF, която да помогне за развитие на нови щамове на S.avermitilis, притежаващи по-желани характеристики за производството на авермекгин.

5.3. Конструиране и употреба на AveC мутанти

Настоящото изобретение предоставя полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, която от друга страна е същата като S.avermitilis aveC алела, или негов дегенериран вариант, или AveC генен продукт-кодиращата последователност от плазмид pSE 186 (АТСС 209604), или негов дегенериран вариант, или • · · · · · « · нуклеотидната последователност от aveC ORF от S.avermitilis както е представено на ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), или негов дегенериран вариант, но който по-нататък включва една или повече мутации, така че тези клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, в който дивия-тип aveC алел е инактивиран и който експресира полинуклеотидната молекула, съдържаща мутантната нуклеотидна последователност или нейн дегенериран вариант, произвежда различно отношение или количество авермектини, които са произведени от клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел.

Съгласно настоящото изобретение, такива полинуклеотидни молекули могат да бъдат използувани за получаване на нови щамове на S.avermitilis, които проявяват откриваема промяна в произвеждането на авермекти, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В предпочитаано изпълнение, такива полинуклеотидни молекули са полезни за създаване нови щамове на S.avermitilis, които произвеждат авермектини в редуциран клас 2:1 отношение, в сравнение със същия щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В следващо препочитано изпълнение, такива полинуклеотидни • молекули са полезни за получаване нови щамове от S.avermitilis, които произвеждат повишени нива авермектини, сравнени със същия щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В следващо предпочитано изпълнение, такива полинуклеотидни молекули са полезни за получаване на нови щамове от S.avermitilis, в които aveC генът е инактивиран.

Мутации на aveC алела или кодиращата последователност, включват всякакви мутации, които въвеждат една или повече делеции, добавяния или замени в AveC генния продукт, или които водят до скъсяване на AveC генния продукт, или която и да е негова

9999 99 999999

9 9 9 9 9 99

99999 99 999

9 99 9 9 9 4Q· · комбинация и това води до желания резултат. Такива мутантни aveC алелни последователности също са предвидени да включват всякакви техни дегенерирани варианти. Например, настоящото изобретение предоставя полинуклеотидни молекули, съдържащи нуклеотидната последователност на aveC алела, или негов дегенериран вариант, или AveC генен продукг-кодиращата последователност на плазмид pSE 186 (АТСС 209604), или неин дегенериран вариант, или нуклеотидната последоватеелност на aveC ORF от S.avermitilis както е представено във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1) или неин дегенериран вариант, но която по-нататък съдържа една или повече мутации, която кодира замяната на един аминокиселинен остатък с друг аминокиселинен остатък в избрана позиция в AveC генния продукт. В някои не-ограничаващи изпълнения, някои от които са дадени за пример по-долу, такива замени могат да бъдат направени в аминокиселинни позиции на AveC генния продукт, които съответствуват на аминокиселинните позиции 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 от SEQ ID N0:2 или някои негови комбинации.

Мутации на aveC кодиращата последователност са изпълнени с който и да е от разнообразието известни методи, включително с прилагане на податлива на грешки PCR или с касетъчна мутагенеза. Например, олигонуклеотид-насочена мутагенеза може да се приложи за промяна последователността от aveC алела или ORF по определен начин, като например, за въвеждане на едно или повече рестрикционни места, или завършващ кодон, в специфични области в рамките на aveC алела или ORF. Методи като тези описани в U.S.Patent 5,605,793, U.S.Patent 5,830,721 и U.S.Patent 5,837,458, които включват случайно фрагментиране, повторни цикли на мутагенеза и нуклеотидно усукване (shuffling), могат също да бъдат използувани за създаване • · •е · · · · на големи библиотеки от полинуклеотиди, притежаващи нуклеотидни последователности, кодиращи aveC мутации.

Прицелни мутации могат да бъдат полезни, по-специално там където те служат да променят един или повече консервирани аминокиселинни остатъци в AveC генния продукт. Например, сравнението на производни аминокиселинни последователности на AveC генни продукти и AveC хомолог генни продукти от S.avermitilis (SEQ ID N0:2), S.griseochromogenes (SEQ ID N0:5) и S.hygroscopicus (SEQ ID N0:4), както са представени във фигура 6, показва места на значимо консервиране на аминокиселинни остатъци между тези ® видове. Прицелна мутагенеза, която води до промяна в един или повече от тези консервирани аминокиселинни остатъци, може да бъде особено ефективна при получаване на нови мутантни щамове, които проявяват желани промени в производството на авермектин.

Случайна мутагенеза може също да бъде полезна и може да бъде изпълнена, като клетки на S.avermitilis се подложат на ултравиолетово олъчване или Х-лъчи, или химични мутагени като Nметил-№-нитрозогуанидин, етил метан сулфонат, азотиста киселина или nitrogen mustards. Виж, например Ausubel, 1989, по-горе за обзор на техники за мутагенеза.

Q Веднъж създадени мутантни полинуклеотидни молекули, те са отбрани за определяне дали те могат да модулират биосинтезата на авермектин в S.avermitilis. В предпочитано изпълнение, полинуклеотидна молекула притежаваща мутантна нуклеотидна последователност се тестира чрез комплементиране с един щам от S.avermitilis, в който aveC генът е инактивиран за получаване aveC отрицателна (aveC') среда. В един не-ограничаващ метод, мутантната полинуклеотидна молекула е снадена в експресионен плазмид в оперативна връзка с един или повече регулаторни елементи, който плазмид предпочитано съдържа един или повече ·· ··♦· ·♦ ··<· ····· · · · · · · • · · · · · лф · · · · • ο · · · ♦ · · · ·· ··· ·· ·· ·· ♦ ··· резистентни към лекарства гени, което да позволи подбор на трансформирани клетки. Този вектор след това е трансформиран в aveC-клетки гостоприемници, като са използувани известни техники, и трансфоримрани клетки са отбрани и култивирани в подходящи ферментационни среди, в условия разрешаващи или индуциращи производство на авермектин. След това ферментационните продукти са анализирани с HPLC за определяне способността на мутантната полинуклеотидна молекула да комплементира клетката гостоприемник. В Раздел 8.3 по-долу, са дадени за пример няколко вектори, носещи мутантни полинуклеотидни молекули, способни да © редуцират В2:В1 отношението на авермектини, включително pSE 188, pSE199, pSE231, pSE239 и pSE290 до pSE297.

Настоящото изобретение предоставя методи за идентифициране мутации на S.avermitilis aveC ORF, способни да променят отношението и/или количеството произведени авермектини. В предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за идентифициране мутации на aveC ORF, способни да променят клас 2:1 отношението произведени авермектини, характеризиращ се с това, че: (а) се определя клас 2:1 отношението авермектини произведени от клетки на един щам S.avermitilis, в който ф aveC алелът присъщ на него, е инактивиран и в който една полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща мутантен AveC генен продукт, е включена и е експресирана; (Ь) се определя клас 2:1 отношението авермектини произведени от клетки на същия щам S.avermitilis както в етап (а), но който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел или един aveC алел, притежаващ нуклеотидната последователност на ORF от ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), или нуклеотидна последователност, която е хомоложна на нея; и (с) се сравнява клас 2:1 отношението на авермектини произведени от S.avermitilis клетки от етап (а) с клас 2:1 отношението на авермектини произведени от S.avermitilis клетки от етап (Ь); така че ако клас 2:1 отношението авермектини произведени с S.avermitilis клетки от етап (а) е различно от клас 2:1 отношението авермектини произведени от S.avermitilis клетки от етап (Ь), тогава е идентифицирана мутация на aveC ORF, способна да променя клас 2:1 отношението на авермектини. В предпочитано изпълнение, клас 2:1 отношението на авермектини е намалено чрез мутацията.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за идентифициране мутации на aveC ORF или генетични конструкти съдържащи aveC ORF, способен да променя количеството произведени авермектини, характеризиращ се с това, че: (а) се определя количеството авермектини произведени от клетки на един щам S.avermitilis, в който присъщия му aveC алел е инактивиран и в който една полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща мутантен AveC генен продукт, или съдържащ генетичен конструкт, включващ нуклеотидна последователност, кодираща AveC генен продукт, е въведена и се експресира; (Ь) се определя количеството авермектини произведени от клетки на същия щам S.avermitilis както в етап (а), но който вместо това експресира само див-тип aveC алел или нуклеотидна последователност, която е хомоложна на него; и (с) се сравнява количеството авермектини произведени от S.avermitilis клетки на етап (а) с количеството авермектини произведени от S.avermitilis клетки на етап (Ь); така че ако количеството произведени авермектини от S.avermitilis клетки на етап (а) е различно от количеството авермектини произведени от S.avermitilis клетки на етап (Ь), тогава е идентифицирана мутация на aveC ORF или генетичен конструкт, способен да променя количеството авермектини. В едно предпочитано изпълнение, количеството произведени авермектини е нараснало чрез мутацията.

··

·· ····

Всеки от гореспоменатите методи за идентифициране на мутации, може да бъде изпълнен като се използуват ферментационни среди за култивиране, предпочитано допълнени с циклохексан карбоксилова киселина, въпреки че могат също да бъдат използувани други подходящи предшественици на мастни киселини, като всеки от предшествениците на мастни киселини изброени в ТАБЛИЦА 1.

След като е идентифицирана мутантна полинуклеотидна молекула, която модулира производството на авермектин в желана посока, може да бъда определена локализацията на мутацията в нуклеотидната последователност. Например, полинуклеотидна молекула, притежаваща нуклеотидна последователност, кодираща мутантен AveC генен продукт, може да бъде изолирана с PCR и подложена на ДНК секвениращ анализ, като се използуват известни методи. Сравнявайки ДНК последователността на мутантния aveC алел, с тази на дивия-тип aveC алел, може да бъда определена мутацията(и) отговорна за промяната производството на авермектин. В специфични, но не-ограничаващи изпълнения на настоящото изобретение, S.avermitilis AveC генни продукти, съдържащи единични аминокиселинни замени при всеки от остатъци 55(S55F), 138 (S138T), 139 (А139Т) или 230 (G230D) или двойни замени в позиции 138 (S138T) и 139 (А139Т или A139F), предизвикват промени във функцията на AveC генен продукт, така че отношението на клас 2:1 произведени авермектини, е променено (виж Раздел 8, по-долу), където изброените аминокиселинни позиции съответствуват на тези представени във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:2). В допълнение е показано за всяка от следните седем комбинации на мутации, че редуцира ефективно клас 2:1 отношението на авермектини: (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4)

F99S/S138T/A139T/G179S; (5) А139Т/М228Т; (6) G111V/P289L;

(7) A139T/K154E/Q289H. Както тук е използувано, гореспоменатите ·· ··♦♦ • ·· ·· ·· • ·· • ·· ·· ··· ·· ···* обозначения, като А139Т, показват, че оригиналният аминокиселинен остатък с единично буквено обозначение, което в този пример е аланин (А), в указаната позиция, която в този пример е позиция 139 (отнасяща се до SEQ ID N0:2) на полипептида, последван от амиинокиселинния остатък, който заменя оригиналния аминокиселинен остатък, който в този пример е треонин (Т). Съответно, полинуклеотидни молекули, притежаващи нуклеотидни последователности, които кодират мутантни S.avermitilis AveC генни продукти, включващи аминокиселинни замени или делеции в една или повече аминокиселинни позиции 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, • 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 (виж ФИГУРА 1), или всяка тяхна комбинация, са обхванати от настоящото изобретение.

В предпочитано изпълнение, такива мутации кодират аминокиселинни замени, подбрани една или повече от група, състояща се от:

(a) аминокиселинен остатък Q в позиция 38, заменен с Р или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Р;

(b) аминокиселинен остатък D в позиция 48, заменен с Е или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за © Е;

(c) аминокиселинен остатък А в позиция 89, заменен с Т или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Т;

(d) аминокиселинен остатък F в позиция 99, заменен със S или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за S;

(e) аминокиселинен остатък G в позиция 111, заменен с V или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за V;

• ft ft··· ·· ···· ··· ft · ft ft··· ft···· ·· · ·· · • · · · · · 46· · · · *· ··· ·· ·· ·· ···· (f) аминокиселинен остатък L в позиция 136, заменен с Р или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Р;

(д) аминокиселинен остатък S в позиция 138, заменен с Т или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Т;

(h) аминокиселинен остатък А в позиция 139, заменен с Т или F, или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Т или F;

(i) аминокиселинен остатък К в позиция 154, заменен с Е или

Ф с аминокиселина, която е една консервативна замяна за

Е;

(j) аминокиселинен остатък G в позиция 179, заменен със S или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за S;

(k) аминокиселинен остатък М в позиция 228, заменен с Т или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Т;

(l) аминокиселинен остатък Е в позиция 238, заменен с D или с аминокиселина, която е една консервативна замяна

СЗ за D;

(т) аминокиселинен остатък Р в позиция 289, заменен с L или с аминокиселина, което е една консервативна замяна за L; и (п) аминокиселинен остатък Q в позиция 298, заменен с Н или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Н;

където консервативните аминокиселинни замени са както е определено в Раздел 5.1.

ft ft • ft ft··· ft ft • ft ft··· ·« • · · · · · · • · · · · · • · 4W · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ····

В следващо предпочитано изпълнение, такива мутации кодират комбинация от аминокиселинни замени, където комбинацията от заменени аминокиселинни остатъци е подбрана от група, състояща се от:

(a) аминокиселинни остатъци S138 и А139;

(b) аминокиселинни остатъци D48 и А89;

(c) аминокиселинни остатъци S138, А139 и G179;

(d) аминокиселинни остатъци Q38, L136 и Е238;

(e) аминокиселинни остатъци F99, S138, А139 и G179;

(f) аминокиселинни остатъци А139 и М228;

В следващо предпочитано изпълнение, специфични комбинации от мутации в aveC апела, полезни за ефективно редуциране на клас 2:1 отношението на авермектини, съгласно настоящото изобретение, са подбрани от една или повече от групата състояща се от:

(a) S138T/A139T (b) S138T/A139F (c) D48E/A89T;

U (d) S138T/A139T/G179S;

(e) Q38P/L136P/E238D;

(f) F99S/S138T/A139T/G179S;

(g) А139Т/М228Т;

(h) G111V/P289L; и (i) A139T/K154E/Q298H.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя препарати за получаване нови щамове S.avermitilis, клетките на които съдържат мутантен aveC алел, което води до промени в производството на авермектин. Например, настоящото изобретение предоставя ·· ···· ·

• ··· • · • · • е ··· • 4 ·· да • · • · • · ···· бъдат използувани да молекули, съдържащи на настоящото ·· ··«· • · ·· · · рекомбинантни вектори, които могат прицелват всяка от полинуклеотидните мутантни нуклеотидни последователности изобретение, към мястото на aveC гена на S.avermitilis хромозомата, за да вмъкнат във или да заменят aveC ORF или част от него, чрез хомоложна рекомбинация. Съгласно настоящото изобретение, обаче, полинуклеотидна молекула, съдържаща мутантна нуклеотидна последователност на настоящото изобретение предоставена тук, може също да функционира като модулира биосинтезата на авермектин, когато е включена в хромозомата на S.avermitilis на място, различно от това на aveC гена, или когато е подържана епизомно в клетки на S.avermitilis. Така, настоящото изобретение предоставя също вектори, съдържащи полинуклеотидна молекула, включваща мутантна нуклеотидна последователност на настоящото изобретение, които вектори могат да бъдат използувани да вмъкнат полинуклеотидната молекула на място в хромозомата на S.avermitilis, което е различно от това на aveC гена, или да бъде подържана епизомно.

В едно предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя ген заменящи вектори, които могат да бъдат използувани да вмъкнат чрез инсерция мутантен aveC алел или дегенериран негов вариант в клетки на щам от S.avermitilis, при което се създават нови щамове S.avermitilis, клетките на които произвеждат авермектини в променен клас 2:1 отношение, в сравнение с клетки на същия щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, клас 2:1 отношението произведени авермектини от клетките е редуцирано. Могат да бъдат конструирани такива ген заместващи вектори, като се използуват мутантни полинуклеотидни молекули, присъствуващи в експресионни вектори, ·· ···· ·· ··♦· ·· ·· ··· · · « · · · · 9 · 999 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 4Q · · ·· • · · · · · ~“^9 9 99

999 99 99 999999 предоставени тук, като например, pSE188, pSE199 и pSE231, които експресионни вектори са дадени за примери в Раздел 8, по-долу.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя вектори, които могат да бъдат използувани да въведат чрез инсерция мутантен aveC алел или негов дегенериран вариант, в клетки на щам от S.avermitilis, за създаване на нови щамове клетки, които произвеждат променени количества авермектини, в сравнение с клетки от същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, количеството авермектини произведени от клетките е повишено. В специфично, но не-ограничаващо изпълнение, такъв вектор понататък включва силен промотор, какьвто е известен на специалистите в тази област, като например, силният конститутивен егтЕ промотор от Saccharopolyspora erythraea, който е разположен преди и в оперативна връзка с aveC алела. Такъв вектор може да бъде плазмид pSE189, описан в Пример 11, по-долу, или може да бъде конструиран, като се използува мутантния aveC алел от плазмид pSE189.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя ген заместващи вектори, които са полезни за инакгивиране aveC гена в дивия-тип щам S.avermitilis. В едно неограничаващо изпълнение, такива ген заместващи вектори, могат да бъдат конструирани като се използува мутантна полинуклеотидна молекула, присъствуваща в плазмид pSE180 (АТСС 209604), която е дадена за пример в Раздел 8.1, по-долу (ФИГУРА 3). Настоящото изобретение по-нататък предоставя ген заместващи вектори, които съдържат полинуклеотидна молекула, включваща или състояща се от нуклеотидии последователности, които по природа ограничават aveC гена in situ в S.avermitilis хромозомата, включвайки например, онези ограничаващи нуклеотидни последователности, които са представени ·· ···· • · ·· 9 999 9 · ·· • · « · » · · ····· ·· · ·· · ·· ·«· · 50 · · · ♦ • · · · · * · · ·

999 99 99 99 999· във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), които вектори могат да бъдат използувани да делетират S.avermitilis aveC ORF.

По-нататък настоящото изобретение предоставя методи за получаване на нови щамове S.avermitilis, характеризиращи се с това, че клетки, които експресират мутантни aveC алели, произвеждат променено отношение и/или количество авермектини, в сравнение с клетки от същия щам S.avermitilis, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване нови щамове S.avermitilis, характеризиращ се с това, че клетки, които експресират мутантен aveC алел и които произвеждат променено клас 2:1 отношение авермектини, сравнени с клетки от същия щам S.avermitilis, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел, включващ трансформиращи клетки от щам на S.avermitilis с вектор, който носи мутантен aveC алел, кодиращ генен продукт, който променя клас 2:1 отношението на авермектини получени от клетки на щам S.avermitilis, експресиращи мутантния aveC алел, сравнени с клетки от същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел и подбирайки трансформирани клетки, които произвеждат авермектини в едно променено клас 2:1 отношение, сравнени с клас 2:1 отношението, произведено от клетки на същия щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В по-предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нов щам S.avermitilis, характеризиращ се с това, че се трансформират клетки от един щам на S.avermitilis с вектор, способен да въвежда мутация в aveC апела на такива клетки, където мутацията на aveC алела води до заместване в кодирания AveC генен продукт на различен аминокиселинен остатък, в една или повече аминокиселинни позиции, съответствуващи на аминокиселинните остатъци 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, ·· ····

9

999 ·· ····

99

99999

179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 на SEQ ID N0:2, така че клетки на S.avermitilis щам, в които aveC алелът е мутиран така, че да произвежда клас 2:1 отношение авермектини, което е различно от отношението, получено от клетки на същия S.avermitilis щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, промененото клас 2:1 отношение на авермектини е редуцирано.

Както тук е използувано, когато аминокиселинен остатък, кодиран от един aveC алел в S.avermitilis хромозомата, или във вектор, или изолирана полинуклеотидна молекула на настоящото Ф изобретение, се определя като “съответствуващ на” даден аминокиселинен остатък от SEQ ID N0:2 или където една аминокиселинна замяна се определя като появяваща се в дадена позиция съответствуваща на” специфично номериран аминокиселинен остатък от SEQ ID NP:2, това е предвидено да се отнася за аминокиселинен остатък в същото относително местонахождение в AveC генния продукт, който специалистът в тази област, може бързо да определи по отношение на аминокиселината последователност, представена тук като SEQ ID N0:2.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя методи за ф получаване на нови щамове, където специфични мутации в aveC алела, кодиращ определени мутации, са изброени като базови промени в специфични нуклеотидни позиции в aveC алела, “съответствуващи на определени нуклеотидни позиции, както е показано в SEQ ID N0:1. Както по-горе, с оглед съответствуващи аминокиселинни позиции, където нуклеотидната позиция в aveC алела е определена като “съответствуваща на” дадена нуклеотидна позиция в SEQ ID N0:1, е предвидено да се отнася за нуклеотид в същата относителна локализация в aveC нуклеотидната последователност, която специалистът в дадената област може ·· »··· • 9 ·· ···· • · • ··· • · · • · « • · ·♦··<<< • · · · · · ·· ·♦♦ ·♦ ·· бързо да определи, по отношение на нуклеотидната последователност, представена тук като SEQ ID N0:1.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове S.avermitilis, характеризиращ се с това, че клетки, които произвеждат

променени количества авермектин, включващ трансформиращи клетки от един щам на S.avermitilis, с вектор, който носи мутантен aveC алел или генетичен конструкт, съдържащ aveC алела, експресията, на който води до промяна на количеството произведени авермектини от клетки на един щам S.avermitilis, експресиращи мутантния aveC алел или генетичен конструкт, сравнени с клетки на същия щам, които вместо това експресират само единичен див-тип aveC алел, и подбор на трансформирани клетки, които произвеждат авермектини в променено количество, сравнени с количеството произведени авермектини от клетки на щама, които вместо това експресират само единствения див-тип aveC алел. В едно предпочитано изпълнение, количеството произведени авермектини в трансформираните клетки е повишено.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя метод за получаване на нови щамове S.avermitilis, клетките на които включват един инактивиран aveC алел, включващ трансформиращи клетки на един щам S.avermitilis, които експресират всеки aveC алел с вектор, който инакгивира aveC алела и подбор на трасформирани клетки, в които aveC алелът е инактивиран. В предпочитано, но не-ограничаващо изпълнение, клетки от един щам S.avermitilis са трасформирани с ген заменящ вектор, който носи aveC алел, който е инактивиран чрез мутация или чрез замяна на част от aveC алела с хетороложна генна последователност, и са отбрани трансформирани клетки, в които aveC алелът, който е присъщ на нея, е заменен с инактивиран aveC • 9 • · · · « ·

алел. Инактивиране на aveC алел може да бъде определено с HPLC анализ на ферментационни продукти, както е описано по-долу. В специфично, но не-ограничаващо изпълнение, описано в Раздел 8.1 по-долу, aveC алелът е инактивиран чрез инсерция на егтЕ ген от Saccharopolyspora erythraea в aveC ORF.

По-нататък, настоящото изобретение предоставя нови щамове S.avermitilis, включващи клетки, които са трасформирани с всяка от полинуклеотидните молекули или вектори на настоящото изобретение. В предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя нови щамове S.avermitilis, включващи клетки, които © експресират мутантен aveC алел или негов дегенираран вариант, на мястото на, или в допълнение на, дивия-тип aveC алел, където клетките на новия щам произвеждат авермектини в едино променено клас 2:1 отношение, сравнени с клас 2:1 отношението на авермектини произведени от клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, промененото клас 2:1 отношение, произведено от новите клетки е редуцирано. Такива нови щамове са полезни при производство в голям мащаб на търговски желани авермектини като дорамекгин. В по-предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя ф клетки на S.averrmitilis, включващи всяка от горепосочените мутации или комбинации от мутации в aveC алела в нуклеотидни позиции, съответствуващи на тези, представени тук по-горе или които от друга страна кодират всяка от горепосочените аминокиселинни замествания в AveC генния продукт. Въпреки че такива мутации могат да присъствуват в такива клетки върху един екстрахромозомен елемент, като един плазмид, предпочита се такива мутации да присъствуват в aveC алела, локализиран в хоромозомата на S.avermitilis. В предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя един щам S.avermitilis, включващ клетки с мутация в aveC • · ··· ·· · · · · · ····· ·· · · · · ·· ···· 44« · *· • · · · · · Jr* · ·· ·· ··· ·· ·· ··9999 алела, който кодира AveC генен продукт, притежаващ замяна в една или повече амиинокиселинни позиции, съответствуващи на аминокиселинни остатъци 38, 48, 55, 89, 99 ,111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 или 298 на SEQ ID N0:2, където клетката произвежда клас 2:1 отношение авермектини, което е различно от отношението произведено от клетка на същия щам S.avermitilis, който експресира дивия-тип aveC алел.

Действително е, че тестовете за подбор, описани тук, за идентифициране мутантни алели на aveC гена, експресията на които в S.avermitilis клетки, променя и по-специално, намалява отношението ф на клас 2:1 произведени авермектини. В предпочитано изпълнение, отношението В2:В1 авермектини, произведени от клетки на нов щам S.avermitilis на настоящото изобретение, експресиращи мутантен aveC алел или негов дегенериран вариант, на настоящото изобретение е около 1.6:1 или по-малко. В по-предпочитано изпълнение, отношението е около 1:1 или по-малко. В попредпочитано изпълнение, отношението е около 0.84:1 или по-малко. В по-предпочитано изпълнение, отношението е около 0.80:1 или помалко. В по-предпочитано изпълнение, отношението е около 0.75:1 или по-малко. В по-предпочитано изпълнение отношението е около 0 0.73:1 или по-малко. В по-предпочитано изпълнение, отношението е около 0.68:1 или по-малко. В по-предпочитано изпълнение, отношението е около 0.67:1 или по-малко. В по-предпочитано изпълнение, отношението е около 0.57:1 или по-малко. В още попредпочитано изпълнение, отношението е около 0.53:1 или по-малко. В още по-предпочитано изпълнение, отношението е около 0.42:1 или по-малко. В още по-предпочитано изпълнение, отношението е около 0.40:1 или по-малко.

В специфично изпълнение описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил В2:циклохексил

• · · ·

• I

В1 авермектини в отношение по-малко от 1.6:1. В друго специфично изпълнение, описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил В2: циклохексил В1 авермектини в отно-шение около 0.94:1. В следващо различно специфично изпълнение, описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил В2: циклохексил В1 авермектини в отно-шение около 0.88:1. В следващо различно специфично изпълнение, описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил 2: циклохексил В1 авермектини в отношение около 0.84:1. В едно следващо различно Ц специфично изпълнение, описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил 2:цклохексил В1 авермектини в отношение около 0.75:1. В следващо различно специфично изпълнение описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил 2: циклохексил В1 авермектини в отношение около 0.73:1. В следващо различно специфично изпълнение описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил 2: циклохексил В1 авермектини в отношение около 0.68:1. В още по-следващо различно специфично изпълнение описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение q произвеждат циклохексил 2: циклохексил В1 авермектини в отношение около 0.67:1. В още по-следващо различно специфично изпълнение описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил 2: циклохексил В1 авермектини в отношение около 0.57:1. В още по-следващо различно специфично изпълнение описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил 2:циклохексил В1 авермектини в отношение около 0.53:1. В още по-следващо различно специфично изпълнение описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил 2: циклохексил В1 авермектини в

Ο • ·· • ·9 9 · • ·· • ·· • 999 · • · 9 999

отношение около 0.42:1. В още по-следващо различно специфично изпълнение описано по-долу, нови клетки на настоящото изобретение произвеждат циклохексил 2:циклохексил В1 авермектини в отношение около 0.40:1.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя нови щамове S.avermitilis включващи клетки, които експресират мутантен aveC алел или негов дегенериран вариант, или генетичен конструкт, съдържащ aveC алела или негов дегенериран вариант, на мястото на , или в допълнение на, дивия-тип aveC алел, където клетките на новия щам произвеждат променено © количество авермектини, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. В предпочитано изпълнение, новият щам произвежда повишено количество авермектини. В не-ограничаващо изпълнение, генетичният конструкт по-нататък съдържа силен промотор, като силния конститутивен егтЕ промотор от Saccharopolyspora erythraea, пред и в оперативна връзка с aveC ORF.

В следващо предпочитано изпълнение, настоящото изобретение предоставя нови щамове S.avermitilis, включващи клетки, в които aveC генът е инактивиран. Такива щамове са полезни за ф различния спектър авермектини, които те произвеждат, в сравнение с дивия-тип щам, и в комплементационни тестове за отбор, както тук е описано, за определяне дали прицелна или случайна мутагенеза на aveC гена засяга производството на авермектин. В едно специфично изпълнение, описано по-долу, S.avermitilis клетки гостоприемници, са манипулирани генно инженерно, да съдържат инактивиран aveC ген. Например, щам SE180-11, описан в примери по-долу, е създаден като е използуван ген заменящ плазмид pSE180 (АТСС 209604) (ФИГУРА 3), който е конструиран да инактивира S.avermitilis aveC гена чрез инсерция на егтЕ резистентен ген в aveC кодиращата област.

9 9999

• · . 51

Настоящото изобретение по-нататък предоставя рекомбинантно експресирани мутантни S.avermitilis AveC генни продукти, кодирани от всяка от госреспоменатите полинуклеотидни молекули на изобретението и методи за получаване на същите.

Настоящото изобретение предоставя по-нататък процес за производство на авермектини, характеризиращ се с това, че се култивират клетки на щам S.avermitilis, които клетки експресират мутантен aveC алел, кодиращ генен продукт, който променя клас 2:1 отношението на авермектини, произведени от клетки на щам S.avermitilis, експресиращи мутантния aveC алел, в сравнение с клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел, в среди за култивиране и в условия разрешаващи или индуциращи от това производството на авермектини и добиване на споменатите авермектини от културата. В предпочитано изпълнение, клас 2:1 отношението авермектини, произведени в културата от клетки експресиращи мутантния aveC алел, е редуцирано. Този процес осигурява повишена ефикасност при производството на търговски значими авермектини като дорамектин.

Настоящото изобретение по-нататък предоставя процес за производство на авермектини, характеризиращ се с това, че се култивират клетки на един щам S.avermitilis, които клетки експресират мутантен aveC алел или генетичен конструкт, включващ един aveC алел, което води до производството на променено количество авермектини, произведени от клетки на щам S.avermitilis, експресиращ мутантния aveC алел или генетичен конструкт, сравнени с клетки на същия щам, които не експресират мутантния aveC алел или генетичен конструкт, но вместо това експресират само дивия-тип aveC алел, в среди за култивиране в условия разрешаващи или индуциращи от това производството на авермектини и добиване на споменатите авермектини от културата. В предпочитано изпълнение,

• ·

количеството авермектини произведени в култура от клетки, експресиращи мутантния aveC алел, дегенериран вариант или генетичен конструкт, е повишено.

По-нататък настоящото изобретение предоставя нов състав от авермектини, произведен от щам на S.avermitilis, експресиращ мутантен aveC алел или негов дегенериран вариант, кодиращ генен продукт, който редуцира клас 2:1 отношението авермектини, произведени от клетки на щам на S.avermitilis, експресиращи мутантния aveC алел или дегенериран вариант, сравнени с клетки на същия щам, които вместо това експресират само дивия-тип aveC © алел, където авермектините в новия състав са произведени в редуцирано клас 2:1 отношение, в сравнение с клас 2:1 отношението авермектини, произведени от клетки на същия щам S.avermitilis, които вместо това експресират само дивия-тип aveC алел. Новият авермектин състав може да бъде представен като произведен в изтощена ферментационна течност на културата или може да бъде добит от нея. Новият авермектин състав, може да бъде частично или съществено пречистен от културелната течност с известни биохимични техники за пречистване, като утаяване с амониев сулфат, диализа, фракциониране в зависимост от големината, йонообменна ф хроматография, HPLC и т.н.

5.4. Употреба на авермектини

Авермектини са високо активни противопаразитни агенти, притежаващи специална употреба като противохелминтни, ектопаразитициди, инсектициди и акарициди. Авермектин съединения, произведени съгласно методите на настоящото изобретение са полезни за всяка от тези цели. Например, авермектин съединения, произведени съгласно настоящото изобретение, са полезни за третиране на различни заболявания или състояния у хора, ·♦ ···· ·· ···· ····· ·· · ·· · • · · · · · 59» · · · ·· ··· ·· ·· ·· ···· по-специално където тези заболявания или състояния са предизвикани от паразитни инфекции, известни в тази област. Виж например, Ikeda and Omura, 1997, Chem.Rev. 97(7):2591-2609. Поспециално, авермектин съединения, получени съгласно настоящото изобретение, са ефективни при третиране на различни заболявания или състояния, предизвикани от ендопаразити, като паразитни нематоди, които могат да инфектират хора, домашни животни, сине, овци, птици, коне или едър рогат добитък.

По-специално, авермектин съединения получени съгласно настоящото изобретение, са ефективни срещу нематоди, които инфектират хората, както и такива, които инфектират различни видове животни. Такива нематоди включват стомашно-чревни паразити като Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria и паразити, които се откриват в кръвта или други тъкани или органи, като нишковидни червеи и Strongyloides и Trichinella в състояния отделени от червата .

Авермектин съединенията, получени съгласно настоящото изобретение също са полезни за третиране на ектопаразитни инфекции, включващи например, навлизане на артроподи (arthropods) у бозайници и птици, състояния предизвикани от кърлежи, въшки, червеи, бълхи, мухи месарки, щипещи насекоми, или мигриращи двукрили (dipterous) ларви, които могат да засягат едър рогат добитък и коне.

Съединенията на авермектин, получени съгласно настоящото изобретение, са полезни като инсектициди срещу домашни вредители като например, хлебарки, молци, бръмбари и домашни мухи, както и насекоми вредители на складирано зърно и селскостопански растения, които вредители включват паяци, кърлежи, листни въшки, гъсеници и правокрили (orthopterans), като скакалци и др.

·· ···· ·· ····

Животни, които могат да бъдат третирани със съединения на авермекгин, получени съгласно настоящото изобретение включват овци, едър рогат добитък, коне, елени, кози, свине, птици, включително домашни птици, кучета и котки.

Съединение на авермекгин, получено съгласно настоящото изобретение, е въведено в комбинация подходяща за специфично предвиденото приложение, за отделните видове животни гостоприемници, които ще бъдат третирани и участвуващия паразит или насекомо. За употреба като паразитицид, едно съединение на авермекгин, получено съгласно настоящото изобретение, може да ф бъде въведено орално във формата на капсула, болус, таблетка или течна доза или алтернативно, може да бъде въведено като вливане, или с инжекция или като имплант. Такива комбинации се изготвят с конвенционални методи, съответно на стандартната ветеринарна практика. Така, капсули, болуси (пилюли) или таблетки могат да бъдат изготвени чрез смесване на активната съставка с подходящ финно разпределен разредител или носител, допълнително съдържащ дезинтегриращ агент и /или свързващо вещество като нишесте, лактоза, талк, магнезиев стеарат и др. Една доза от комбинация може да бъде изготвена чрез диспергиране на активната ф съставка във воден разтвор, заедно с разпръскващ или овлажняващ агент и т.н. инжекгируеми комбинации могат да бъдат изготвени във формата на стерилен разтвор, който може да съдържа други вещества като например, достатъчно соли и/или глюкоза, за да се получи изотоничен с кръвта разтвор.

Такива комбинации могат да варират по отношение теглото на активната съставка, в зависимост от пациента, или вида домашно животно, което ще бъде третирано, тежестта и типа на инфекцията и телесното тегло на гостоприемника. Общо, за орално приложение доза от активно съединение от около 0.001 до 10mg за kg телесно ·· ···· ·· ···· • * · · ··· ·· · · · · · ····· ·· · ·· · • · · · · · 61. · · · ·· ... ·· ·· ·· ···· тегло на пациент или животно, като единична доза или в разпределени дози за период от 1 до 5 дни би била достатъчна. Обаче, може да има случаи, когато са показани по-високи или пониски дозировки, както е определено например, от лекаря или ветеринарния лекар, въз основа на клинични симптоми.

Като алтернатива, авермекгин съединението, получено съгласно настоящото изобретение, може да бъде въведено в комбинация с храна за животни, за тази цел концентрирана хранителна добавка или предварителна смес, може да бъде приготвена за смесване с нормалната животинска храна.

® За употреба като инсектицид и за третиране на селскостопански вредители, едно съединение на авермекгин, получено съгласно настоящото изобретение, може да бъде приложено като спрей, прах, емулсия и подобни съответно на стандартната земеделска практика.

6. ПРИМЕР: ФЕРМЕНТАЦИЯ НА STREPTOMYCES AVERMITILIS И В2:В1 АВЕРМЕКТИН АНАЛИЗ Щамове които нямат разклонена-верига 2-оксо кисела дехидрогеназна и 5-О-трансферазна активности, не произвеждат Q авермектини ако ферментационната среда не е допълнена с мастни киселини. Този пример демонстрира, че при такива мутанти могат да бъдат получени авермектини с широк диапазон В2:В1 отношения, когато биосинтезата е инициирана в присъствие на различни мастни киселини.

6.1. Материали и методи

Streptomyces avermitilis АТСС 53692 са съхранявани на -70°С като цял бульон, изготвен в среда за посявка състояща се от:

нишесте (Nadex, Laing National) -20g; Pharmamedia (Trader’s Protein,

Memphis, TN) - 15g; Ardamine pH (Yeast Producrs Inc.) - 5 g; калциев ·· ···· ·· ···· ·* ·· • · · · · · ···· • · ··· ·· · ·· · • · · · · · ζτΛ 9 9· 9 9 9 · · · · OZ· · · · ·· ··· ·· ·· ·· ♦··· карбонат - 1д. Крайният обем е довеждан до 1 литър с чешмяна вода, pH е нагласяно на 7.2 и средата е автоклавирана на 121 °C за 25 минути.

Два ml от размразената суспензия на горния препарат, са използувани за инокулиране на шише за култивиране, съдържащо 50ml от същата среда. След 48 часа инкубация на 28°С във въртяща клатачка на 180 оборота в минута, 2 ml от бульона са използувани за инокулиране на шише за култивиране съдържащо 50 ml среда за производство, състояща се от: нишесте - 80д; калциев карбонат - 7д; Pharmamedia - 5 д; двукалиев хидроген фосфат - 1д; магнезиев © сулфат - 1 д; глутаминова киселина - 0.6 д; феросулфат хептахидрат - 0.01 д; цинков сулфат - 0.001 д; манганов сулфат - 0.001 д. Крайният обем е доведен до 1 литър с чешмяна вода, pH е нагласено на 7.2 и средата е автоклавирана на 121 °C за 25 минути.

Различни субстрати от карбоксиловата киселина (виж Таблица 1) са разтворени в метанол и са добавени към ферментационния бульон 24 часа след инокулацията, за получаване крайна концентрация от 0.2д/литър. Ферментационният бульон е инкубиран за 14 дни на 28°С, след това бульонът е центрофугиран (2,500 об.мин. за 2 мин.) и надстоящата течност е отстранена. Q Мицелната утайка е екстрахирана с ацетон (15ml), след това с дихлорметан (30ml) и органичната фаза е отделена, филтрувана и изпарена до сухо. Остатъкът е разтворен в метанол (1ml) и е анализиран с HPLC, с Hewlett-Packard 1090 течен хроматограф, снабден със сканиращ diod-array detector set на 240nm. Използувана е Beckman Ultrasphere С-18, 5pm, 4.6 mm x 25 cm колона, подържана на 40°C. В колоната са инжектирани 25μΙ от горния метанолов разтвор. Елюирането е изпълнено с линеен градиент метанол-вода от 80:20 до 95:5 за 40 минути при 0.85/ml минута. Използувани са две стандартни концентрции на циклохексил В1 за калибриране на ·· ···· ·· ···· ·* ·· • · · ·· · ···· • · ··· · · · · · · детекторния отговор и е измервана^:площта ^:под кривата за В2 и В1 авермектини.

	6.2. Резултати
HPLC	ретенционните времена, наблюдавани за В2 и В1

авермектини, и 2:1 отношенията, са представени в ТАБЛИЦА 1.

ТАБЛИЦА 1

	HPLC ретенционно Време (мин.)	Отношение
Субстрат	В2	В1	В2:В1
4-тетрахидропиран ф карбоксилова киселина	8.1	14.5	0.25
Изомаслена киселина	10.8	18.9	0.5
З-Фуроева киселина	7.6	14.6	0.62
8-(+)-2-метилмаслена к-на	12.8	21.6	1.0
Циклохексанкарбоксилова киселина	16.9	26.0	1.6
3-Т иофенкарбоксилова киселина	8.8	16.0	1.8
Циклопентанкарбоксилова киселина	14.2	23.0	2.0
3-Т рифлуорометилмаслена киселина	10.9	18.8	3.9
2-Метилпентаноева к-на	14.5	24.9	4.2
ф Циклопентанкарбоксилова киселина	18.6	29.0	15.0

Данните представени в ТАБЛИЦА 1, демонстрират извънредно широк диапазон на В2:В1 отношения на авермектиновия продукт, показвайки значителна разлика в резултатите от дехидриращо превръщане на клас 2 съединения в клас 1 съединения, в зависимост от природата на добавената мастнокиселинна странична верига стартерна единица. Това показва, че промени в ·· ···· • · · • · е : :.64 ·♦ · ·

В2:В1 отношения, които са резултат от изменения на AveC белтъка, могат да бъдат специфични за определени субстрати. Следователно, подбор на мутанти, проявяващи промени в В2:В1 отношението, получени с определен субстрат, трябва да бъде направен в присъствие на тези субстрати. Следващите примери описани по-долу, използуват циклохексанкарбоксилова киселина като субстрат за подбор. Обаче, този субстрат е използуван само за да даде за пример потенциала, и не е предвиден да ограничава приложимостта на настоящото изобретение.

ф 7. ПРИМЕР: ИЗОЛИРАНЕ НА aveC ГЕНА

Този пример описва изолирането и характеризирането на участък от Streptomyces avermitilis хромозомата, който кодира AveC генния продукт. Както е представено по-долу, aveC генът е идентифициран като способен да модифицира отношението на циклохексил-В2 към циклохексил-В1 (В2:В1) произведени авермектини.

7.1. Материали и методи

7.1.1. Растеж на Streptomyces за изолиране на ДНК © Приложен е следния метод за развитие на Streptomyces.

Единични колонии на S.avermitilis АТСС 31272 (единична колония изолат #2) са изолирани върху сила YPD-6 съдържаща: Difco Yeast Extract - 5g; Difco Bacto-peptone - 5 g; декстроза-2.5 g; MOPS 5g; Difco Bacto agar -15 g. Крайният обем е допълнен до 1 литър с вода, pH е нагласено на 7.0 и средата е автоклавирана на 121 °C за 25 минути.

Мицелите развити в горната среда са използувани за инокулиране на 10ml TBS среда (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g, в 1 литър дестилирана вода, автоклавирани на 121°С за 25 минути) в • 4 · ··· • · · ♦ · · ··· · · е · · · · ····· · · · ·· · • · · · · ·65· · · · ·· ··· ·· ·· ·· ····

25mm x 150 mm епруветка, която е разклащана (ЗООоб.мин.) на 28°С за 48-72 часа.

7.1.2. Изолиране на хромозомна ДНК от Streptomyces

Порции (0.25ml или 0.5ml) от ми цел и, култивирани както е описано по-горе, са поставени за 1.5ml микроепруветки и клетките са концентрирани с центрофугиране на 12,000 х g за 60 секунди. Надстоящата течност е отстранена и клетките са ресуспендирани в 0.25 ml TSE буфер (20ml 1.5М захароза, 2.5 ml 1 Μ Трис-HCI, pH 8.0,

2.5 ml 1M EDTA, pH 8.0 и 75 ml dH₂O), съдържащ 2 mg/ml лизозим. Ф Пробите са инкубрани на 37°С за 20 минути с разклащане, нанесени са на AutoGen 540™ автоматизиран инструмент за изолиране на нуклеинови киселини (Integrated Separation Systems, Natick, МА) и изолиране на геномна ДНК като е използувана Cycle 159 (програма на оборудването) съгласно инструкциите на производителя.

Алтернативно, 5 ml мицели са поставени в 17 mm х 100 mm епруветка, клетките са концентрирани чрез центрофугиране на 3000 об.мин. за 5 минути и настоящата течност е отстранена. Клетките са ресуспендирани в 1ml TSE буфер, концентрирани са чрез центрофугиране на 3000 об.мин. за 5 минути и настоящата течност е 0 отстранена. Клетките са ресуспендирани в 1ml TSE буфер, съдържащ 2mg/ml лизозим и са инкубирани на 37°С при разклащане, за 30-60 минути. След инкубация е добавен 0.5 ml 10% натриев додецил сулфат (SDS) и клетките са инкубирани на 37°С до пълно лизиране. Лизатът е инкубиран на 65°С за 10 минути, охладен е до стайна температура, разделен е в две епендорфки и е екстрахиран 1 х с 0.5 ml фенол/хрлороформ (50% фенол предварително наситен с 0.5 М Трие, pH 8.0; 50% хлороформ). Водната маса е отстранена и екстрахирана 2 до 5х с хлороформ:изоамилов алкохол(24:1). ДНК е утаена чрез добавка на 1/10 обем 3 М натриев ацетат pH 4.8, като

4····· • ·· • ·· ·· • ··

99

9999 9 ·· ···· сместа е инкубирана на лед за 10 минути, сместа е центрофугирана на 15,000 об.мин. при 5°С за 10 минути, надстоящата течност е отделена в чиста епруветка и е добавен един обем изопропанол. Сместа от надстояща течност плюс изопропанол е инкубирана на лед за 20 минути, центрофугирана е на 15,000 об.мин. за 20 минути на 5°С, настоящата течност е отстранена и утайката от ДНК е измита 1 х със 70% етанол. След изсушаване на утайката, ДНК е ресуспендирана в ТЕ буфер (ЮтМ Трие, 1тМ EDTA, pH 8.0).

7.1.3. Изолиране на плазмидна ДНК от Streptomvces ф Порция (1т1) от мицели е поставена в 1.5 ml микроцентрофужна епруветка и клетките са концентрирани чрез центрофугиране на 12,000 об.мин. за 60 минути. Надстоящата течност е отстранена, клетките са ресуспендирани в 1.0 ml 10.3% захароза, концентрирани са чрез центрофугиране на 12,000 х g за 60 секунди и надстоящата течност е отстранена. След това клетките са ресуспендирани в 0.25 ml TSE буфер, съдържащ 2mg/ml лизозим и са инкубирани на 37°С за 20 минути при разклащане, след което са нанесени в AutoGen 540™ инструмент за автоматично изолиране на нуклеинови киселини. Плазмидна ДНК е изолирана като е ф използувана Cycle 106 (програма на оборудването) съгласно инструкциите на производителя.

Алтернативно, 1.5 ml мицели са поставени в 1.5 ml микроцентрофужни епруветки и клетките са концентрирани чрез центрофугиране на 12,000 х g за 60 секунди. Надстоящата течност е отстранена и клетките са ресуспендирани в 1.0 ml 10.3% захароза, концентрирани са чрез центрофугиране на 12,000 х g за 60 секунди и надстоящата течност е отстранена. Клетките са ресуспендирани в 0.5 ml TSE буфер, съдържащ 2 mg/ml лизозим и са инкубирани на 37°С за 15-30 минути. След инкубация, са добавени 0.25 ml алкален SDS (0.3 ···· • 4

444

4444 • fl •4 4

4 44

44

4«4444

N NaOH, 2% SDS) и клетките са инкубирани на 55°С за 15-30 минути докато разтворът се избистри. Към разтвора с ДНК е добавен натриев ацетат (0.1 ml, ЗМ, pH 8.4), след което е инкубиран на лед за 10 минути. ДНК пробите са центрофугирани на 14,000 об.мин. за 10 минути на 5°С. Надстоящата течност е прехвърлена в чиста епруветка, добавени са 0.2 ml фенол:хлороформ (50% фенол:50% хлороформ) и сместа е разбъркана внимателно. ДНК разтворът е центрофугиран на 14,000 об.мин. за 10 мин. на 5°С и горният слой е прехвърлен в чиста епендорфка. Добавен е изопропанол (0.75 ml) и разтворът е разбъркан внимателно, след което е иинкубиран на © стайна температура за 20 минути. ДНК разтворът е центрофугиран на 14,000 об.мин. за 15 минути на 5°С, надстоящата течност е отстранена и утайката от ДНК е измита със 70% етанол, изсушена е и е ресуспендирана в ТЕ буфер.

7.1.4. Изолиране на плазмидна ДНК от E.coli

Единична трансформирана E.coli колония е инокулирана в 5ml Luria-Bertani (LB) среда (Bacto-Trypton - 10g, Bact-yeast екстракт 5g, и NaCI -10g в 1 литър дестилирана вода, pH 7.0, автоклавирана на 121 °C за 25 минути и допълнена с 100тд/ц1ампицилин). Културата е инкубирана за една нощ и порция от 1 ml е поставена в 1.5 ml микроцентрофужна епруветка. Пробите от културата са нанесени на AutoGen 540™ инструмент за автоматично изолиране на нуклеинови киселини и е изолирана плазмидна ДНК като е използувана Cycle 3 (програма на оборудването), съгласно инструкциите на производителя.

7.1.5. Получаване и трансформация на

S.avermitilis протопласти

• · · · ·· «· ···· ·« ·* • · · ·· · ···* ····· · · · · · · • · · · · · 68· · · · ·· ··· ·· ·· ·· ····

Изолирани са единични колонии от S.avermitilis на % сила YPD-6. Използувани са мицели за инокулиране на 10ml TBS среда в 25 тт х 150 тт епруветка, които след това са инкубирани с разклащане (300 об.мин.) на 28°С за 48 часа. Използуван е 1ml мицели за инокулиране на 50 ml YEME среда. YEME средата съдържа в 1 литър: Difco Yeast Extract - 3g; Difco Bacto-peptone - 5 g; Difco Malt екстракт - 3g; захароза - 300 g. След автоклвиране на 121 °C за 25 минути, са добавени следните съставки: 2.5М MgCI₂.6H₂O (отделно автоклавиран на 121°С за 25 минути) - 2ml; и глицин (20%) (стерилизиран с филтър) - 25 ml.

Мицелите са поставени да растат на 30°С за 48-72 часа и са отделени чрез центрофугиране в 50 ml центрофужна епруветка (Falcon) на 3000 об.мин. за 20 мин. Надстоящата течност е отстранена и мицелите са ресуспендирани в Р буфер, който съдържа: захароза - 205g; K₂SO₄ - 0.25д; МдС1₂.6Н₂О - 2.02д; Н₂О - 600 ml; К₂РО₄ (0.5%) - 10 ml; разтвор на микроелементи* -20ml; СаС1₂.2Н₂О (3.68%) - 100 ml; и MES буфер (1.0 М, pH 6.5) -10 ml. (*Разтвор на микроелементи съдържа в 1 литър: ZnCI₂ - 40mg; FeCl3.6H₂O - 200 mg; CuCI₂ .2H₂O - 10mg; MnCI₂ . 4H₂O - 10 mg; Na₂B₄O₇ .10H₂O 10mg; (ΝΗ₄)βΜθ7θ₂₄.4H₂O -10mg). pH е нагласявано на 6.5, крайният обем е доведен до 1 литър и средата е филтрувана гореща през 0.45 микрона филтър.

Мицелите са утаени на 3000 об.мин. за 20 минути, надстоящата течност е отстраннена и мицелите са ресуспендирани в 20 ml Р буфер, съдържащ 2 mg/ml лизозим. Мицелите са инкубирани на 35°С за 15 минути при разклащане и са контролирани микроскопски за определяне степента на образуване протопласти. Когато образуването на протопласти е пълно, протопластите се центрофугират на 8000 об.мин. за 10 минути. Супернатантата е отстранена и протопластите са ресуспендирани в 10 ml Р буфер.

• · · · · ♦ • · · · · ·

Протопластите са центрофугирани на 8000 об.мин. за 10 минути, надстоящата течност е отстранена, протопластите са ресуспендирани в 2 ml Р буфер и приблизително 1 х 10⁹ протопласти са разпределени в 2.0 ml криогенни епруветки (Nalgene).

Епруветка съдържаща 1 х 10⁹ протопласти е центрофугирана на 8000 об.мин. за 10 минути, надстоящата течност е отстранена и протопластите са ресуспендирани в 0.1 ml Р буфер. Добавени са 2 до 5 цд трансформираща ДНК към протопластите, непосредствено последвана от добавка на 0.5 ml работен Т буфер. Т буфер съдържа: PEG-1000 (Sigma) -25 g; захароза -2.5 g; Н₂О -83 ml. pH е нагласено © на 8.8 с 1N NaOH (стерилизирана с филтър) и Т основен буфер е стерилизиран с филтър и съхраняван на 4°С. Работен Т буфер, изготвен същия ден когато се използува, е Т основен буфер - 8.3 ml; К₂РО₄ (4mM) - 1.0 ml; CaCI₂.2H₂O (5М) - 0.2 ml; и TES (1М, pH 8) 0.5 ml. Всеки компонент на работния Т буфер е отделно стерилизиран с филтър.

В рамките на 20 секунди от добавянето на Т буфер към протопластите, е добавен 1.0 ml Р буфер и протопластите са центрофугирани на 8000 об.мин. за 10 мин. Надстоящата течност е отстранена и протопластите са ресуспендирани в 0.1 ml Р буфер. © След това протопластите са посети на RM14 среда, съдържаща: захароза - 205g; K₂SO₄ - 0.25д; МдС1₂ .6Н₂О -10.12 д; глюкоза -10д; Difco Casamino Acids - 0.1д; Difco Yeast Extract - 5g; Difco Oatmeal Agar - 3g; Difco Bacto Agar - 22g; dH₂O - 800 ml. Разтворът e автоклавиран на 121°C за 25 минути. След автоклавиране, са добавени стерилни основни разтвори: К₂РО₄ (0.5%) -10ml; СаС1₂.2Н₂О (5М) - 5ml; L-пролин (20%) - 15ml; MES буфер (1.0 М, pH 6.5) 10т1) разтвор на микроелементи (същият както по-горе) - 2ml; циклохексимид основен р-р (25 mg/ml) - 40 ml; и 1N NaOH - 2ml.

Разпределени са порции от 25 ml RM14 среда на платка и платките са изсушени 24 часа преди употреба.

Протопластите са инкубирани при 95% влажност на 30°С за 20-24 часа. За подбор на тиострептон резистентни трансформанти, 1ml от буфер за покриване, съдържащ 125 цд за ml тиострептон, е нанесен равномерно върху RM14 регенерационните платки. Буферът за покриване съдържа в 100 ml: захароза -10.3 д; разтвор на микроелементи (същия както по-горе) - 0.2 ml; и MES (1М, pH 6.5) 1ml. Протопластите са инкубирани при 95% влажност на 30°С за 7-14 дни докато тиострептон резистентни (Thio¹) колонии станат видими.

7.1.6. Тронсформиране на Streptomyces lividans протопласти

S.lividans ТК64 (предоставен от John Innes Institute, Norwich, U.K.) в някои случаи е използуван за трансформирания. Методи и препарати за растеж, образуване на протопласти и трансформиране на S.lividans са описани в Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, U.K. и са изпълнени както е описано там. Плазмидна ДНК е изолирана от S.lividans трансформанти, както е описано в Раздел

7.1.3, по-горе.

7.1.7. Ферментационен анализ на S.avermitilis щамове

S.avermitilis мицели, развити върху % сила YPD-6 за 4-7 дни, са инокулирани в 1 х 6 инча епруветки, съдържащи 8 ml от предварително направената среда и 5 mm стъклени зърна. Предварително изготвената среда съдържа: разтворимо нишесте ( или финно кипяно нишесте или KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/L; Pharmamedia -15g/L; Ardamine pH - 5g/L (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaCO₃ - 2g/L; 2x bcfa (“bcfa” се отнася за разклонена верига мастни киселини), съдържащ в крайна концентрация в средата • * · · · · • · · · · · • · • · ··· ·· · ···· ····· ··· ·· · • · · · · · 7r · · · · • · · · · · ΊΙ ··· ·· ··· · · ·· ·· ····

50ppm 2-(+/-)-метил маслена киселина, 60ppm изомаслена киселина и 20 ррт изо-валерианова киселина. pH е нагласяно на 7.2 и средата е автоклавирана на 121°С за 25 минути.

Епруветката е разклащана при 17°С ъгъл и 215 об.мин. на 29°С за 3 дни. Порция от 2 ml от посятата култура е използувана за инокулиране на 300ml Erlenmeyer колба, съдържаща 25 ml среда за производство, която включва: (финно кипено нишесте или KOSO) 160 g/L; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) -10 g/L; Ardamine pH -10g/L; K₂HPO₄ - 2 g/L; MgSO₄.4H₂O - 2 g/L; FeSO₄. 7H₂O - 0.02 g/L; MnCI₂ - 0.002 g/L; ZnSO₄.7H₂O - 0.002 g/L; CaCO₃ - 14 g/L; 2x bcfa ® (както по-горе); и циклохексан карбоксилова киселина (СНС) (изготвена като 20% разтвор при pH 7.0) - 800 ppm. pH е нагласено на

6.9 и средата е автоклавирана на 121 °C за 25 минути.

След инокулация, колбата е инкубирана на 29°С за 12 дни при разклащане 200 об.мин. След инкубация, проба от 2ml е изваждана от колбата, разредена е с 8 ml метанол, разбъркана е и сместа е центрофугирана на 1,250 х g за 10 минути за утаяване на остатъците. След това надстоящата течност е анализирана с HPLC като е използуната Beckman Ultrasphere ODS колона (25 cm х 4.6 mm ID (вътрешен диаметър) със скорост на протичане 0.75 ml/мин. и Ф детекция по абсорбция при 240 nm. Подвижната фаза е 86/8.9/5.1 метанол/вода/ацетонитрил.

7.1.8. Изолиране на S.avermitilis PKS гени

Космидна библиотека на S.avermitilis (АТСС 31272, SC-2) хромозомна ДНК е изготвена и хибридизирана с кетосинтаза (KS) сонда, изготвена от фрагмент на Saccharopolyspora erythraea поликетид синтаза (PKS) ген. Подробно описание за изготвяне на космидни библиотеки, може да бъде намерено в Sambrook et al., 1989, по-горе. Подборно описание за получаване на Streptomyces ·· ···· ·· ···· ·· ·· • · · ·· ····· ····· ·· · ·· · • · · · · · · ·· · · • · · · · · /2»· · · ·· ··· ·· ·· ·· ···· хромозомни ДНК библиотеки е представено в Hopwood et al., 1985, по-горе. Космидни клонове, съдържащи кетосинтаза-хибридизиращи области, са идентифицирани чрез хибридизация с един 2.7 КЬ Nde\IEco47\\\ фрагмент от рЕХ26 (любезно предоставен от Dr. P.Leadlay, Cambridge, UK). Приблизително 5ng pEX26 са хидролизирани като са използувани Λ/del и Есо47Ш. Реакционната смес е нанесена върху 0.8% SeaPlaque GTG агарозен гел (FMC BioProducts, Rockland, МЕ). След електрофореза 2.7 Kb Nde\IEco47\\\ фрагментът е изрязан от гела и ДНК е отделена от гела като е използувана GELase™ от Epicentre Technologies и е приложен бързия протокол. Фрагментът 2.7Kb Nde\IEco47\\\ е белязан с [a-³²P]dCTP (дезоксицитидин 5’-трифосфат, тетра(триетиламониева) сол, [alpha-³²P]-) (NEN-Dupont, Boston, МА) като е използувана BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) следвайки инструкциите на доставчика. Типична реакция е изпълнена с 0.05 ml обем. След добавка на 5 μΙ стоп буфер, белязаната ДНК е отделена от невключените нуклеотиди като е използувана G-25 Sephadex Quick Spin™ колона (Boehringer Mannheim) следвайки инструкциите на доставчика.

Приблизително 1,800 космидни клона са подбрани с © колонийна хибридизация. Идентифицирани са десет клона, които силно хибридизират със Sacc.erythraea KS сонда. E.coli колонии, съдържащи космидна ДНК са култивирани в LB течна среда и от всяка култура е изолирана космидна ДНК в AutoGen 540™ инструмент за автоматично изолиране на нуклеинови киселини, като е използувана Cycle3 (програма на оборудването), съгласно инструкциите на производителя. Рестрикционно ендонуклеазно картиране и Southern blot хибридизационни анализи разкриват, че пет от колониите съдържат припокриващи се хромозомни области. Конструирана е S.avermitilis геномна BamHI рестрикционна карта на петте космида

9

(т.е. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) чрез анализ на припокриващи се космиди и хибридизации (ФИГУРА 4).

7.1.9. Идентифициране на ДНК, която модулира авермектин В2:В1 отношения и идентифициране на aveC ORF

Използувани са следните методи за тестиране на субклонирани фрагменти, произлизащи от pSE66 космидния клон, за тяхната способност да модулират авермектин В2:В1 отношения в AveC мутанти. PSE66 (5рд) е хидролизиран със Sacl и BamHI. © Реакционната смес е нанесена на 0.8% SeaPlaque™ GTG агарозен гел (FMC BioProducts), след електрофореза от гела е изрязан 2.9 КЬ Sacl/BamHI фрагмент и ДНК е отделена от гела като е използувана GELase™ (Epicentre Technologies) прилагайки бърз протокол. Приблизително 5рд от вектор-совалка pWHM3 (Vara et al., 1989,

J.Bacteriol. 171:5872-5881) са хидролизирани със Sacl и BamHI. Около 0.5 pg 2.9 Kb инсерт и 0.5 pg хидролизиран pWHM3 са смесени заедно и са инкубирани за една нощ с 1 единица лигаза (New Engldnd Biolabs, Inc., Beverly, МА) на 15°C в общ обем 20 pl, съответно инструкциите на доставчика. След инкубацияа, 5 pl от лигиращата © смес са инкубирани на 70°С за 10 минути, охладени са до стайна температура и са използувани за трансформиране на компетентни E.coli DH5a (BRL), съответно инструкциите на производителя. Плазмидна ДНК е изолирана от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на 2.9Kb Sacl/BamHI инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид е означен като PSE119.

Протопласти от S.avermitilis щам 1100-SC38 (Pfizer собствен щам) са получени и трансформирани с pSE119 както е описано в

Раздел 7.1.5, по-горе. Щам 1100-SC38 е мутант, който произвежда

значително повече авермекгин циклохексил-В2 формата в сравнение с авермекгин циклохексил-В1 формата, когато е допълнен с циклохексан карбоксилова киселина (В2:В1 от около 30:1). PSE119 използуван да трансформира S.avermitilis протопласти, е изолиран от E.coli щам GM2163 (получен от Dr.B.J.Bachmann, Curator, E.coli Genetic Stock Center, Yale University), E.coli щам DM1 (BRL), или S.lividans щам TK64. Изолирани са тиострептон резистентни трансформанти на щам 1100-SC38 и са анализирани с HPLC анализ на ферментационни продукти. Трансформанти на S.avermitilis щам 1100-SC38, съдържащи pSE119, произвеждат променено отношение © на авермектин циклохексил-В2:циклохексил-В1 от около 3.7:1 (ТАБЛИЦА 2).

След като е установено, че pSE119 е способен да модулира авермектин В2:В1 отношенията в един AveC мутант, включената ДНК е секвенирана. Изолирани са приблизително Юцд pSE119 като е използуван кит за изолиране на плазмидна ДНК (Quiagen, Valencia, СА), следвайки инструкциите на производителя и са секвенирани като е използуван ABI 373А Automated DNA Sequencer (Автоматичен ДНК секвенатор) (Perkin Elmer, Foster City, СА). Данни от секвениране са обединени и редактирани като е използувана Генетична Q Компютерна Група програми (Genetic Computer Group programs) (GCG, Madison, Wl). ДНК последователността и aveC ORF ca представени във ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1).

Конструиран е нов плазмид, обозначен като pSE118 както следва. Приблизително 5цд pSE66 са хидролизирани със Sph\ и

BamHl. Реакционната смес е нанесена на 0.8% SeaPlaque агарозен гел (FMC BioProducts), един 2.8 Kb SphVBamHl фрагмент е изрязан от гела след електрофореза и ДНК е отделена от гела като е използувана GELase™ (Epicentre Technologis) прилагайки бърз протокол. Приблизително 5 цд вектор совалка pWHM3 са ·· ···· ·· ···· · ·· ··· ·· · · · ·· ····· · · · · ·· • · · · · · чл · · ·· • · · · · · 1-9 9 99

999 99 99 999999 хидролизирани със Sph\ и BamHI. Около 0.5 pg от 2.8 КЬ инсерта и

0.5 pg от хидролизирания pWHM3 са смесени заедно и са инкубирани за една нощ с 1 единица лигаза (New England Biolabs) на 15°С в общ обем 20 pl, съгласно инструкциите на доставчика. След инкубация, 5pl от лигиращата смес са инкубирани на 70°С за 10 минути, охладени са до стайна температура и са използувани да трансформират компетентни E.coli DH5a клетки, съгласно инструкциите на производителя. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на 2.8 Kb Sph\/BamH\ инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид е © обозначен като pSE118. Включената ДНК в pSE118 и pSE119 се припокрива с приблизително 838 нуклеотиди (ФИГУРА 4).

Протопласти от S.avermitilis щам 1100-SC38 са трансформирани с pSE118 както по-горе. Тиострептон резистентни трансформанти на щам 1100-SC38 са изолирани и анализирани с HPLC анализ на ферментационни продукти. Трансформанти от S.avermitilis щам 1100-SC38, съдържащи pSE118 не са променени в отношенията авермектин циклохексил-В2:авермектин циклохексилВ1, сравнени със щам 1100-SC38 (ТАБЛИЦА2).

О 7.1 .10. PCR амплификация на aveC гена от

S.avermitilis хромозомна ДНК

Изолиран е фрагмент ~1.2 КЬ съдържащ aveC ORF, от S.avermitilis хромозомна ДНК с PCR амплификация, като са използувани праймери ( зачатъци) планирани въз основа на aveC нуклеотидната последователност получена по-горе. PCR праймерите са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Дясно ориентираният праймер е: 5’-TCACGAAACCGGACACAC-3’ (SEQ ID N06); и ляво ориентираният праймер е: 5’CATGATCGCTGAACCGAG-3’ (SEQ ID N0:7). PCR реакцията е • · ··· ·· ····· ····· ·· · · ·· • · · · · · — л · · ·· • · · · · · /сь · ·· ·· ··· ·· ·· ·· ···· изпълнена с Deep Vent™ полимераза (New England Biolabs) в буфер предоставен от производителя и в присъствие на ЗООрМ dNTP, 10% глицерол, 200pmol от всеки праймер, 0.1 pg матрица и 2.5 единици ензим, в краен обем 100р1, като е използуван Perkin-Elmer Cetus thermal cycler. Термалният профил на първия цикъл е 95°С за 5 минути (денатуриращ етап), 60°С за 2 минути (спойващ етап) и 72°С за 2 минути (удължаващ етап). Последващите 24 цикъла имат сходен термален профил, с изключение на това, че денатуриращият етап е скъсен до 45 секунди и спойващия етап е скъсен до 1 минута.

PCR продуктът е подложен на електрофореза в 1% агарозен ® гел и е открита единична ДНК ивица от ~1.2 kb. Тази ДНК е пречистена от гела и е лигирана с 25ng линеаризиран, с подравнени краища pCR-Blunt вектор (Invitrogen) в 1:10 моларно вектор-към инсерт отношение, следвайки инструкциите на производителя. Сместа за лигиране е използувана да трансформира One Shot™ компетентни E.coli клетки (Invitrogen), следвайки инструкциите на производителя. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на ~1.2 КЬ инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид е обозначен като PSE179.

Ф Включената чрез инсерция ДНК от pSE179 е изолирана чрез хидролиза с BamHI/Xbal, отделена е с електрофореза, пречистена е от гела и е лигирана с вектор совалка pWHM3, който също е хидролизиран с ВатН\/ХЬа\, в обща ДНК концентрация от 1 pg в 1:5 моларно вектор-спрямо инсерт отношение. Сместа за лигиране е използувана да трансформира компетентни E.coli DH5a клетки, съгласно инструкциите на производителя. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на ~1.2 КЬ инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид, който е обозначен като pSE186 (ФИГУРА 2, АТСС 209604) е

. 71 • · трансформиран в E.coli DM1 и плазмидна ДНК е изолирана от ампицилин резистентни тарнсформанти.

7.2. Резултати

Един 2.9 Kb Sacl/BamHI фрагмент от pSE119 е идентифициран, който когато е трансформиран в S.avermitilis щам 1100-SC38, значително променя отношението В2:В1 произведен авермектин. S.avermitilis щам 1100-SC38 обикновено има В2:В1 отношение около 30:1, но когато са трансформирани с вектор съдържащ 2.9 КЬ Sacl/BamHI фрагмент, отношението В2:В1 авермектин намалява до около 3.7:1. Пост-ферментационен анализ на култури от трансформанти, потвърждава наличието на трансформираща ДНК.

Фрагментът 2.9 Kb pSE119 е секвениран и е идентифицирана ~0.9 Kb ORF (ФИГУРА 1) (SEQ ID N0:1), която обхваща PstllSphl фрагмент, който предварително другаде е мутиран да произвежда само В2 продукти (Ikeda et al., 1995, по-горе). Сравнението на тази ORF или на нейния съответен производен полипептид с известни данни (GenEMBL, SWISS-PROT), не показва някаква силна хомология с известни ДНК или белтъчни последователности.

ТАБЛИЦА 2 представя ферментационния анализ на S.avermitilis щам 1100-SC38 трансформиран с различни плазмиди.

ТАБЛИЦА 2

S.avermitilis щам (трансформиращ плазмид)	Ио.трансформанти тестирани	Avg. В2:В1 отношение
1100-SC38 (няма)	9	30.66
1100-SC38 (pWHM3)	21	31.3
1100-SC38 (pSE119)	12	3.7
1100-SC38 (pSE118)	12	30.4
1100-SC38 (pSE185)	14	27.9

·· ···· ·· ····

8. ПРИМЕР: КОНСТРУИРАНЕ НА

S.AVERMITILIS AveC МУТАНТИ

Този пример описва конструиране на няколко различни S.avermitilis AveC мутанти, като се използуват препаратите и методите описани по-горе. Общо описание на техниките за въвеждане мутации в даден ген в Streptomyces е дадено от Kierser and Hopwood, 1991, Meth.Enzym. 204:430-458. По-детайлно описание е предоставено от Anzai et al., 1988, J.Antibiot. XLI(2):226-233, и от Stutzman-Engwall et al., 1992, J.Bacteriol. 174 (1):144-154. Тези литературни данни са включени тук чрез цитат в тяхната цялост.

8.1. Инакгивиране на S.avermitilis aveC гена

AveC мутанти, сдържащи инактивирани aveC гени са конструирани като са използувани няколко методи, както е изложено в подробности по-долу.

В първия метод, един 640 Ьр (базови двойки) Sphl/Pst\ фрагмент, вътрешен спрямо aveC гена в pSE119 (плазмид описан в Раздел 7.1.9., по-горе), е заменен с ermE ген (за еритромицин резистентност) от Sacc.erythraea. Генът ermE е изолиран от plJ4026 (предоставен от The John Innes Institute, Norwich, U.K.; виж също Bibb et al., 1985, Gene 41:357-368) чрез хидролиза c рестрикционните ензими BglW и EcoRI, последвана от електрофореза и пречистване от гела. Този ~1.7 КЬ фрагмент е лигиран в pGEM7Zf (Promega), който е хидролизиран с BamHI и EcoRI и лигиращата смес е трансформирана в компетентни E.coli DH5a клетки, следвайки инструкциите на производителя. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на ~1.7 КЬ ·· ···· • · · · инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид е обозначен като pSE27.

PSE118 (описан в Раздел 7.1.9., по-горе) е хидролизиран със Sph\ и Ba/nHI, хидролизатът е електрофорезиран и ~2.8 КЬ SphVBamHl инсертьт е пречистен от гела. pSE119 е хидролизиран с Pstl и EcoRI, хидролизатът е електрофорезиран и *1.5 Kb Pstl/EcoRI инсертьт е пречистен от гела. Вектор совалка pWHM3 е хидролизиран с BamHI и EcoRI. pSE27 е хидролизиран с Pstl и Sph\, хидролизатът е електрофорезиран и *1.7 Kb PstVSph\ инсертьт е пречистен от гела. Всичките четири фрагменти (н.е. *2.8 КЬ, *1.5 КЬ, • *7.2 КЬ, *1.7 КЬ) са лигирани заедно с 4-пътно лигиране. Сместа за лигиране е трансформирана в компетентни E.coli DH5a клетки, следвайки инструкциите на производителя. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на коректен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид е обозначен като pSE180( ФИГУРА 3; АТСС 209604).

pSE180 е трансформиран в S.lividans ТК64 и са идентифицирани трансформирани колонии по резистентност към тиострептон и еритромицин. Изолиран е pSE180 от S.lividans и е използуван да трансформира S.avermitilis протопласти. ф Идентифицирани са четири тиострептон резистентни S.avermitilis трнсформанти и протопласти са получени и посяти в не-селективни условия в RM14 среда. След като протопластите са регенерирали, са подбрани единични колонии за наличие на резистентност към еритромицин и отсъствие на тиострептон резистентност, което показва хромозомно интегриране на инактивирания aveC ген и загуба на свободния репликон. Идентифициран е един Erm^r Thio^sтрансформант и е обозначен като щам SE18011. Тотална хромозомна ДНК е изолирана от щам SE180-11, хидролизирана е с рестрикционни ензими BamHI, HindlW, Pstl или Sph\, анализирана е с • ft електрофореза в 0.8% агарозен гел, прехвърлена е на найлонови мембрани и е хибридизирана с егтЕ сонда. Тези анализи показват, че хромозомна интеграция на егтЕ ген на резистентност и придружаващо делетиране на 640 bp PstUSph\ фрагмент, се появява чрез двойно кръстосано събитие (double crossover event). HPLC анализ на ферментационни продукти от щам SE18011 показва, че нормални авермектини не са повече произвеждани (ФИГУРА 5А).

Във втори метод за инакгивиране на aveC гена, 1.7КЬ егтЕ генът е отстранен от хромозомата на S.avermitilis щам SE180-11, оставяйки една 640bp PstX/SphX делеция в aveC гена. Конструиран е ® един ген заместващ плазмид както следва: pSE180 е хидролизиран частично с Xbal и е пречистен един ~11.4 КЬ фрагмент е от гела. Ивицата ~11.4 КЬ няма 1.7КЬ егтЕ резистентност гена. След това ДНК е лигирана и трансформирана в E.coli DH5a клетки. Плазмидна ДНК е изолирана от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на коректен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид, който е обозначен като pSE184 е трансформиран в E.coli DM1 и е изолирана плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти. Този плазмид е използуван да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-11. Протопласти са получени О от тиострептон резистентни трансформанти от щам SE180-11 и са посяти като единични колонии на RM14. След като протопластите регенерират, са подбрани единични колонии за отсъствие на резистентност към еритромицин и тиострептон резистентност, което показва хромозомна интеграция на инактивирания aveC ген и загуба на свободен репликон, съдържащ егтЕ гена. Идентифициран е един Erm^s Thio^s трансформант и е обозначен като SE184-1-13. Ферментационен анализ на SE184-1-13 показва, че не се получават нормални авермектини и че SE184-1-13 има същия ферментационен профил както SE180-11.

9999 •9 9999

9

99 9

9

9 99

99

9 99

99

99999

При трети метод за инактивиране на aveC гена е въведено едно преместване на рамката в хромозомния aveC ген чрез добавяне две G’s след С при nt позиция 471, използувайки PCR, при което се създава BspEl място. Наличието на инженерно създаденото BspEl място е полезно за откриване събитие на генна замяна. PCR праймерите са предвидени да въведат една мутация в преместването на рамката в aveC гена и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. Десно-ориентираният праймер е:

5’-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3’ (SEQ ID N0:8) и лявоориентираният праймер е: 5’-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3’(SEQ ® ID N0:9). PCR условията са както е описано в Раздел 7.1.10 по-горе.

PCR 666 Ьр продуктът е хидролизиран със Sph\ за получаване на два фрагмента от 278 Ьр и 388 Ьр, съответно. Фрагментът 388 Ьр е пречистен от гела.

Ген заместващият плазмид е конструиран както следва: вектор совалка pWHM3 е хидролизиран с EcoRI и BamHl. pSE119 е хидролизиран с BamHl и Sph\, хидролизатът е елекгрофорезиран и ~840Ьр фрагментът е пречистен от гела. pSE119 е хидролизиран с EcoRI и Хтп\, хидролизатът е анализиран с електрофореза и ~1.7 КЬ фрагмент е пречистен от гел. Всички (четири фрагменти (т.е. ~7.2 КЬ, © ~840 Ьр, ~1.7 КЬ и 388 Ьр) са лигирани в 4-пътно лигиране. Сместа за лигирне е трансформирана в компетентни E.coli DH5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ и ДНК секвениращ анализ. Този плазмид, който е обозначен като pSE185, е трансформиран в E.coli DM1 и плазмидна ДНК е изолирана от ампицилин резистентни трансформанти. Този плазмид е използуван да трансформира протопласти от S.avermitilis щам 1100-SC38. Тиострептон резистентни трансформанти от щам 1100-SC38 са отделени и анализирани с ··· ·· · ···· ····· · · · ·· · • · ··· · Ο*)** * · • · · · · · oat ♦ · · ·· ··· ·· ·· ·· ····

HPLC анализ на ферментационни продукти. pSE185 не променя значимо В2:В1 авермекгин отношенията, когато е трансформиран в S.avermitilis щам 1100-SC38 (ТАБЛИЦА 2).

pSE185 е използуван да трансформира протопласти от S.avermitilis, да създаде една мутация на преместване на рамката в хромозомата на aveC гена. Протопласти са получени от тиострептон резистентни трансформанти и са посети като единични колонии върху RM14. След като протопластите са регенерирани, са подбрани единични колонии за отсъствие на тиострептон резистентност. Изолирана е хромозомна ДНК от тиострептон чувствителни колонии и ® е направен отбор с PCR за наличието мутация на преместването на рамката интегрирана в хромозомата. PCR праймерите са планирани въз основа на aveC нуклеотидната последователност и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Дясно ориентираният PCR праймер е: 5’-GCAAGGATACGGGGACTAC-3’ (SEQ ID N0:10) и ляво ориентираният PCR праймер е: 5’-GAACCGACCGCCTGATAC-3’ (SEQ ID N0:11) и PCR условията са както е описано в Раздел 7.1.10 погоре. Полученият PCR продукт е 543 Ьр и когато е хидролизиран с BspE1, се наблюдават три фрагмента от 368 Ьр, 96 Ьр и 79 Ьр, което показва хромозомна интеграция на инактивирания aveC ген и загуба на свободния репликон.

Ферментационен анализ на S.avermitilis мутанти, съдържащи мутацията на преместване на рамката в aveC гена, показва, че не се произвеждат повече нормални авермектини и че тези мутанти имат същия фарментационен HPLC профил както щамове SE180-11 и SE184-1-13. Идентифициран е един Thio^s трансформант и е обозначен като щам SE 185-5а.

Допълнително е произведена една мутация в aveC гена, която променя nt позиция 520 от G в А, което води до промяна в кодона, кодиращ триптофан (W) в позиция 116 спрямо един • · · · · · • · · · · · завършващ кодон. S.avermitilis щам с тази мутация не произвежда нормални авермектини и има същия ферментационен профил както щамове SE180-11, SE184-1-13 и SE185-5a.

Допълнително са произведени мутации в aveC гена, които променят: (i) nt позиция 970 от G в А, което променя аминокиселината в позиция 266 от един глицин (G) в един аспартат (D) и (ii) nt позиция 966 от Т в С, което променя аминокиселината в позиция 275 от тирозин (Y) в хистидин (Н). S.avermitilis щам с тези мутации (G256D/Y275H) не произвежда нормални авермектини и има същия ферментационен профил както щамове SE180-11, SE184-1-13 и • SE185-5a.

S.avermitilis aveC инакгивиращ мутант щамовете SE180-11, SE184-1-13, SE185-5a и други тук предоставени, осигуряват средства за подбор, за да се определи влиянието на други мутации в aveC гена. pSE186, който съдържа див-тип копие на aveC гена, е трансформиран в E.coli DM1 и е изолирана плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти. ДНК от pSE186 е използувана да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-11. Изолирани са тиострептон резистентни трансформанти от щам SE180-11, определено е наличието на резистетност към ф еритромицин и Thi^r Erm^r трансформанти са анализирани с HPLC анализ на ферментационни продукти. Наличието на функционален aveC ген in trans е в състояние да възстанови нормалното производство но авермектини от щам SE180-11 (ФИГУРА 5В).

8.2. Анализ на мутации в aveC гена, които променят клас В2:В1 отношения

Както е описано по-горе, S.avermitilis щам SE180-11, съдържащ неактивен aveC ген е допълнен чрез трансформация с плазмид, съдържащ функционален aveC ген (pSE186). Щам SE180-11 • · · · · ·

също е използуван като щам гостоприемник, за характеризиране на други мутации в aveC гена, както е описано по-долу.

Изолирана е хромозомна ДНК от щам 1100-SC38 и е използувана като матрица за PCR амплификация на aveC гена. Изолирана е 1.2 Kb ORF с PCR амплификация, като са използвани праймери планирани на базата на aveC нуклеотидната последователност. Дясно ориентираният праймер е SEQ ID N0:6 и ляво ориентираният праймер е SEQ ID N0:7 (виж Раздел 7.1.10 по-горе). Условията на PCR и субклонирането са описани в Раздел 7.1.10. Анализ на ДНК последователността на 1.2 Kb ORF показва една ® мутация в aveC гена, която променя nt позиция 337 от С в Т, което променя аминокиселината в позиция 55 от серин (S) във фенилаланин (F). Генът aveC, съдържащ S55F мутацията е субклониран в pWHM3, за да произвежда плазмид, който е обозначен като pSE187 и който е използуван да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-11. Изолирани са тиострептон резистентни трансформанти на щам SE180-11, определено е наличието на резистентност към еритромицин и Thio^r Erm^r трансформанти са анализирани с HPLC анализ на ферментационните продукти. Наличието на aveC гена, кодиращ промяна на аминокиселинния © остатък 55 (S55F), е в състояние да възстанови нормалното производство на авермектин на щам SE180-11 (Фиг.5С); обаче циклохексил В2:циклохексил В1 отношението е около 26:1, в сравнение със щам SE180-11 трансформиран с pSE186, който има отношение В2:В1 от около 1.6:1 (ТАБЛИЦА 3), което показва, че единична мутация (S55F) модулира количеството циклохексил-В2 произведен спрямо циклохексил-В1.

Идентифицирана е друга мутация в aveC гена, която променя nt позиция 862 от G в А, която променя аминокиселината в позиция 230 от глицин (G) в аспартат (А). Един S.avermitilis щам , • · · · · · • · · · · е « · • ·

притежаващ тази мутация (G230D), произвежда авермектини в В2:В1 отношение от около 30:1.

8.3. Мутации, които редуцират В2:В1 отношението

Конструирани са няколко мутации, които редуцират количеството произведен цикпохексил-В2, спрямо циклохексил-В 1, както следва.

Идентифицирана е една мутация в aveC гена, която променя nt позиция 588 от G в А, която променя аминокиселината в позиция 139 от аланин (А) в треонин (Т). Генът aveC, съдържащ А139Т мутацията е субклониран в pWHM3, за получаване на плазмид, който е обозначен като pSE188 и който е използуван за трансформиране на протопласти от S.avemitilis щам SE180-11. Изолирани са резистентни трансформанти но щам SE180-11, определено е наличието на резистентност към еритромицин и Thio^r ЕптГ трансформанти са анализирани с HPLC анализ на ферментационните продукти. Наличието на мутантен aveC ген, кодиращ една промяна на аминокиселинен остатък 139 (А139Т) е в състояние да възстанови производството на авермекгин на щам SE180-11 (ФИГУРА 5D); обаче В2:В1 отношението е около 0.94:1, което показва, че тази мутация редуцира количеството произведен циклохиксил-В2 спрямо циклохексил В1. Този резултат е неочакван, тъй като публикувани резултати, както и резултати от мутации описани по-горе, демонстрират само инакгивиране на aveC гена или повишено производство на В2 формата на авермекгин спрямо В1 (ТАБЛИЦА 3).

Тъй като А139Т мутацията променя В2:В1 отношенията в поблагоприятното В1 направление, конструирана е мутация, която кодира треонин вместо един серин в аминокиселинна позиция 138. Така, pSE186 е хидролизиран с EcoRI и е клониран в pGEM3Zf (Promega), който е хидролизиран с EcoRI. Този плазмид, който е •· 9 99 9 • · обозначен като pSE186a, е хидролизиран с Ара\ и Крп\, ДНК фрагментите са разделени в агарозен гел и два фрагмента ~3,8 КЬ и ~0.4 КЬ са пречистени от гела. ДНК ~1.2 КЬ инсертът от pSE186 е използуван като PCR матрица за вмъкване на единична базова промяна при nt позиция 585. PCR праймерите са предвидени да въведат мутация в nt позиция 585 и са доставени от Genosys Bioctechnologies, Inc. (Texas). Дясно ориентираният PCR праймер е : 5’GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3’ (SEQ ID N0:12); и ляво ориентираният PCR праймер е : 5’• GGAACCGACCGCCTGATACA-3’ (SEQ ID N0:13). PCR реакцията е изпълнена като е използуван Advantage GC genomic PCR kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, СА) в буфер предоставен от производителя, съдържащ 200μΜ dNTPs, 200pmol от всеки праймер, 50 ng матрица ДНК, 1.0 М GC-Melt и 1 единица KlenTaq Polymerase Mix в краен обем 50 μΙ. Термалният профил на първия цикъл е 94°С за 1 мин.; последван от 25 цикъла на 94°С за 30 секунди и 68°С за 2 мин.; и 1 цикъл на 68°С за 3 мин. Един PCR продукт от 295 Ьр е хидролизиран с Ара\ и Крп\ за освобождаване на 254 Ьр фрагмент, който е отделен с електрофореза и е пречистен от гела. Всичките три фрагмента (~3.8 © КЬ, ~4 КЬ и 254 Ьр) са лигирани заедно в 3-пътно лигиране. Сместа за лигиране е трансформирана в компетентни E.coli DH5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни мутанти и наличието на точен инсерт е потвърдено чрез рестрикционен анализ. Този плазмид е обозначен като pSE198.

pSE198 е хидролизиран с EcoRI, клониран е в pWHM3, който е хидролизиран с EcoRI и е трансформиран в E.coli DF5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ и ДНК секвениращ анализ. Тази плазмидна • · · · • · • ·

ДНК е трансформирана в E.coli DM1, изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този палзмид, който е обозначен като pSE199, е използуван да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-11. Изолирани са тиострептон резистентни трансформанти на щам SE180-11, определено е наличието на еритромицин резистентност и Thio^r Erm^r трансформанти са анализирани с HPLC анализ на ферментационните продукти. Наличието на мутантен aveC ген, кодиращ промяна при аминокиселинен остатък 138 (S138T), е способно да възстанови © нормалното авермекгин производство на щам SE180-11; обаче, В2:В1 е 0.88:1, което показва, че тази мутация намалява количеството произведен циклохексил-В2 спрямо циклохексил-В1 (ТАБЛИЦА 3). Това В2:В1 отношение е дори по-ниско в сравнение с 0.94:1 отношението, наблюдавано с А139Т мутацията, получена чрез трансформация на щам SE180-11 с pSE188, описана по-горе.

Конструирана е друга мутация, която да вмъкне един треонин на две аминокиселинни позиции 138 и 139. ДНК инсерт ~1.2 КЬ от pSE186 е използуван като PCR матрица. PCR праймерите са предвидени да въведат мутации в nt позиции 585 и 588 и са Q доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Дясно ориентираният PCR праймер е: 5’GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3’ (SEQ ID N0:14); и ляво ориентираният PCR праймер е: 5’-GGAACATCACGGCATTCACC-3’ (SEQ ID N0:15). PCR реакцията е изпълнена като са използувани условията описани непосредствено по-горе в този Раздел. PCR продуктът от 449 Ьр е хидролизиран с Ара! и Крп\ за освобождаване на един 254 Ьр фрагмент, който е отделен с електрофореза и пречистен от гела. pSE186a е хидролизиран с Ара\ и Крп\, ДНК фрагментите са • · · · · · ·« ··♦· « « • · разделени на агарозен гел и два фрагмента от ~3.8 КЬ и ~0.4 КЬ са пречистени от гела. Всичките три фрагмента (~3.8 КЬ, ~0.4 КЬ и 254 Ьр) са лигирани заедно в 3-пътно лигиране и лигиращата смес е трансформирана в компетентни E.coli DH5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти, и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид е обозначен като pSE230.

pSE230 е хидролизиран с EcoRI, клониран е в pWHM3, който е хидролизиран с EcoRI и трансформиран в E.coli DH5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни ® трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ и ДНК секвениращ анализ. Тази плазмидна ДНК е трансформирана в E.coli DM1, изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид, който е обозначен като pSE231, е използуван да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-11. Изолирани са тиострептон резистентни трансформанти на SE180-11, установено еналичието на еритромицин резистентност и Thio^r Erm^r трансформанти са анализирани чрез ферментация. Наличието на двойно мутантен aveC ген, кодиращ С S138T/A139T е в състояние да възстанови нормално производство на авермекгин в щам SE180-11; обаче В2:В1 отношението е 0.84:1, което показва, че тази мутация по-нататък намалява количеството произведен циклохексил-В2 спрямо циклохексил-В1 (ТАБЛИЦА 3), повече от намаленията осигурени чрез трансформиране на щам SE180-11 с pSE188 или pSE199, както е описано по-горе.

Конструирана е друга мутация, която по-нататък да намали количеството произведен циклохексил-В2 спрямо циклохексил В-1. Поради това, че S138T/A139T мутациите променят В2:В1 отношения в по-благоприятното В1 направление, конструирана е една мутация, ·· 9999

9999 · · · 9 · 9 99·· · • 9 е 999 Q0 »99 ··· ·· ·· ·♦·· която да вмъкне един треонин в аминокиселинна позиция 138 и един фенилаланин в аминокиселинна позиция 139. ДНК инсертът ~1.2 КЬ от pSE186 е използуван като PCR матрица. PCR праймери са предвидени да вмъкват мутации в nt позиции 585 (променяйки G в Т) и 589 (променяйки С в Т) и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). Дясно ориентираният PCR праймер е: 5’GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTT С-3’ (SEQ ID N0:25) и ляво ориентираният PCR праймер е: 5’-GGAACATCACGGCATTCACC-3’ (SEQ ID N0:15). PCR реакцията е проведена като е използуван Advantage GC genomic PCR kit (Clontech ® Laboratories, Palo Alto.CA) в буфер предоставен от производителя, включващ 200μΜ dNTPs, 200 pmol от всеки праймер, 50ng ДНК матрица, 1.1 mM Mg ацетат, 1.0 М GC-Melt и 1 единица Tth DNA Polymerase в краен обем 50μΙ. Термалният профил на първия цикъл е 94°С за 1 мин.; последван от 25 цикъла на 94°С за 30 сек. и 68°С за 2 мин.; и 1 цикъл на 68°С за 3 мин. Един PCR продукт от 449 Ьр е хидролизиран с Apal и Kpnl за отделяне на 254 Ьр фрагмент, който е анализиран с електрофореза и пречистен от гела. Всичките три фрагмента (~3.8 КЬ, ~0.4 КЬ и 254 Ьр) са лигирани заедно в 3-пътно лигиране. Лигиращата течност е трансформирана в компетентни © E.coli DH5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид е обозначен като PSE238.

pSE238 е ходролизиран с EcoRI, клониран е в pWHM3, който е хидролизиран с EcoRI и е трансформиран в E.coli DH5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистеентни трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ и ДНК секвениращ анализ. Тази плазмидна ДНК е трансформирана в E.coli DM1, изолирана е плазмидна ДНК от ·· ···· • · ···· «4·· ··· ·· · · · ·· • ···· · · лл* * :. * • · ··· · 90 · · · ·· ·· · ··· * · ·· ·· ··· ·· ·· ·· ···· ампицилин резистентни трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид, който е обозначен като pSE239, е използуван да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-11. Изолирани са тиострептон резистентни трансформанти на щам SE180-11, определено е наличието на резистентност към еритромицин и Thio^r Егт^г трансформанти са анализирани с HPLC анализ на ферментационни продукти. Наличието на двойно мутантен aveC ген, кодиращ S138T/A139T е в състояние да възстанови нормално производство на авермектини в щам SE180-11; обаче В2:В1 отношението е 0.75:1, което показва, че ф тази мутация по-нататък намалява количеството произведен циклохексил-В2 спрямо циклохексил-В1 (ТАБЛИЦА 3), повече от намаленията осигурени чрез трансформиране на щам SE180-11 с pSE188, pSE199 или pSE231, както е описано по-горе.

ТАБЛИЦА 3

S.avwmHills щам (трансформиращ плазмид)	No. трансформанти тестирани	относително B2 Cone.	относително ду« I
В1 Cone.	В2:В1 \| отношение
SE18O-11 (попе)	30	0	0	0
SE 180-11 (pWHM3)	30	0	0	0
SE180-11 (pSE186)	26	222	140	1.59
SE180-11 (pSE187)	12	283	11	26.3
SE 180-11 (pSE188)	24	193	206	0.94
SEI 80-11 (pSE199)	18	155	171	0.88
SE 180-11 (pSE231)	6	259	309	0.84
SE 180-11 (pSE239) .	20	184	242	0.75

Конструирани са допълнителни мутации, които по-нататък да редуцират количеството произведен циклохексил-В2 спрямо циклохексил-В1, като е използувана техника на ДНК преместване

·· ···· • · ····

(DNA shuffling) както е описано от Stemmer, 1994, Nature 370&389-391; и Stemmer, 1994, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751; и понататък описано в United States Patents 5605793, 5811238, 583072 и 5837458.

ДНК shuffled (разместени) плазмиди, съдържащи мутантни aveC гени, са трансформирани в компетентни dam dem E.coli клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от резистентни към ампицилин трансформанти и е използувана да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-11. Изолирани са резистентни към тиострептон трансформанти на щам SE180-11 и са подбрани за ® производно на авермектини с циклохексил-В2: циклохексил В1 отношение от 1:1 или по-малко. Определена е ДНК последователността на плазмидна ДНК от SE180-11 трансформанти, произвеждащи авермектини с В2:В1 отношение 1:1 или по-малко.

Идентифицирани са осем трансформанти, които произвеждат намалени количества циклохексил-В2 спрямо циклохексил-В1. Най-ниското В2:В1 отношение постигнато измежду тези трансформанти е 0.4:1 (ТАБЛИЦА 4). Изолирана е ДНК от всеки от осемте трансформанти и е определена ДНК последователността, за идентифициране мутациите в aveC гена. Мутациите са както Q следва.

pSE290 съдържа четири нуклеотидни мутации в nt позиция 317 от Т в А, в nt позиция 353 от С в А, в nt позиция 438 от G в А, и в nt позиция 1155 от Т в А. Нуклеотидната промяна в nt 317 променя аминокиселината в АА позиция 48 от D в Е и нуклеотидната промяна в nt позиция 438, променя аминокиселината в АА позиция 89 от А в Т. В2:В1 отношението, получено от клетки носещи този плазмид е 0.42:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE 291 съдържа 4 нуклеотидни мутации в nt позиция 272 от G в А, в nt позиция 585 от Т в А, в nt позиция 588 от G м А и в nt • · ···· ·· ···· ··· ·· · · » · · ····· ·· · · · · • · · · · · Q9· · · · · • · · · · · · · ·· ··· ·· ·· ······ позиция 708 от G в А. Нуклеотидната промяна в nt позиция 585 променя аминокиселината в АА позиция 138 от S в Т, нуклеотидната промяна в nt позиция 588 променя аминокиселината в АА позиция 139 от А в Т и нуклеотидната промяна в nt позиция 708 променя аминокиселината в АА позиция 179 от G в S. В2:В, отношението получено от клетки носещи този плазмид е 0.57:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE292 съдържа същите четири нуклеотидни мутации като pSE290. В2:В1 отношението получено от клетки носещи този плазмид е 0.40:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE293 съдържа 6 нуклеотидни мутации в nt 24 от А в G, в nt ® позиция 286 от А в С, в nt позиция 497 от Т в С, в nt позиция 554 от С в Т, в nt позиция 580 от Т в С и в nt позиция 886 от А в Т. Нуклеотидната промяна в nt позиция 286, променя аминокиселината в АА позиция 38 от Q в Р, нуклеотидната промяна в nt позиция 580, променя аминокиселината в АА позиция 136 от L до Р, и нуклеотидната промяна в nt позиция 886 променя аминокиселината в АА позиция 238 от Е в D. В2:В1 отношението получено от клетки носещи този ензим е 0.68:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE294 съдържа 6 нуклеотидни мутации в nt 469 от Т в С, в nt позиция 585 от Т в А, в nt позиция 588 от G в А, в nt позиция 708 от ф G в А, в nt позиция 833 от С в Т и в nt позиция 1184 от G в А. В допълнение, nts в позиции 173, 174 и 175 са делетирани. Нуклеотидната промяна в nt позиция 469 променя аминокиселината в АА позиция 99 от F в S, нуклеотидната промяна в nt позиция 585 променя аминокиселината в АА позиция 138 от S в Т, нуклеотидната промяна в nt позиция 588 променя аминокиселината в АА позиция 139 от А в Т и нуклеотидната промяна в nt позиция 708 променя аминокиселината от АА позиция 179 от G в S. В2:В1 отношението получено от клетки носещи този плазмид е 0.53:1 (ТАБЛИЦА 4).

ίΜΜ»'

9999 99 9999 · ··

9 9 9 9 9 9 9 9 9 : : ···· · i J93 *· · i j ·* ·· · 0 9 9 · ···

99 9 9 9 9 9 9 9 9999 pSE295 съдържа 2 нуклеотидни мутации в nt 588 от G в А и в nt 856 от Т в С. Нуклеотидната промяна в nt позиция 588 променя аминокиселината в АА позиция 139 от D в Т и нуклеотидната промяна в nt позиция 856 променя аминокиселината в АА позиция 228 от М в Т. В2:В1 отношението получено от клетки носещи този плозмид е 0.80:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE296 съдържа 5 нуклеотидни мутации в nt позиция 155 от Т в С, в nt позиция 505 от G в Т, в nt позиция 1039 от С в Т, в nt позиция 1202 от С в Т и в nt позиция 1210 от Т в С. Нуклеотидната промяна в nt позиция 505 променя аминокиселината в АА позиция 111 ф от G в V и нуклеотидната промянав nt позиция 1039 променя аминокиселината в АА позиция 289 от Р в L. В2:В1 отношението получено от клетки носещи този плазмид е 0.73:1 (ТАБЛИЦА 4).

pSE297 съдържа 4 нуклеотидни мутации в nt позиция 377 от G в Т, в nt позиция 588 от G в А, в nt позиция 633 от А в G и в nt позиция 1067 от А в Т. Нуклеотидната промяна в nt позиция 588 променя аминокиселината в АА позиция 139 от А в Т, нуклеотидната промяна в nt позиция 633 променя аминокиселината в АА позиция 154 от К в Е и нуклеотидната промяна в nt позиция 1067 променя аминокиселината в АА позиция 298 от Q в Н. В2:В1 отношението получено от клетки носещи този плазмид е 0.67:1 (ТАБЛИЦА 4).

ТАБЛИЦА 4

S. щам (трансформиращ плазмид)	No. трансформанти третирани	Относително B2 Cone.	Относително B1 Cone.	Avg. В2:В1 отношение]
SE180-11 (попе)	4	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	4	0	0	0
SE180-11 (PSE290)	4	87	208	0.42
SE180-11 (pSE291)	4	106	185	0.57
SE180-11 (pSE292)	4	91	231	0.40
SE180-11 (pSE293)	4	123	180	0.68
SE180-11 (pSE294)	4	68	129	0.53
SE 180-11 (pSE295)	4	217	271	0.80

• · · ·

SE180-11 (pSE296)	1	135	188	0.73
SE 180-11 (pSE297)	1	148	221	0.67

9. ПРИМЕР: КОНСТРУИРАНЕ НА 5’ ДЕЛЕЦИОННИ МУТАНТИ

Както е обяснено в Раздел 5.1, по-горе, S.avermitilis нуклеотидната последователност, представена във ФИГУРА 1 (SEQ ® ID N0:1) включва четири различни GTG кодони в Ьр позиции 42, 174, 177 и 180, които са потенциални стартови места. Този раздел описва конструирането на множествени делеции на 5’-областта на aveC ORF (ФИГУРА 1; SEQ ID N0:1), за да се помогне да се определи кои от тези кодони могат да функционират като стартови места в aveC ORF за белтъчна експресия.

Фрагменти от aveC гена различно делегирани в 5’края, са изолирани от S.avermitilis хромозомна ДНК с PCR амплификация. PCR праймерите са предвидени въз основа на aveC ДНК последователността и са доставени от Genosys Biotechnologies, Inc. Дясно О ориентираните праймери са 5’-AACCCATCCGAGCCGCTC-3’ (SEQ ID N0:17) (D1F1), 5’-TCGGCCTGCCAACGAAC-3’(SEQ ID N0:17) (D1F2); 5’-CCAACGAACGTGTAGTAG-3’ (SEQ ID N0:18) (D1F3); и 5’TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3’ (SEQ ID NP:19) (D2F2). Ляво ориентираните праймери са 5’CATGATCGCTGAACCGA-3’ (SEQ ID N0:20); 5-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3’ (SEQ ID N0:21); и 5’-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3’ (SEQ ID NO: 22). PCR реакцията e проведена както е описано в Раздел 8.3, по-горе.

PCR продуктите са разделени с електрофореза в 1% агарозен гел и са открити единични ДНК ивици от ~1.0 КЬ или ~1.1 •· 9 9 99

9

Kb. PCR продуктите са пречистени от гела и са лигирани с 25 ng линеаризиран pCR2.1 вектор (Invitrogen) в 1:10 моларно векторинсерт отношение, следвайки инструкциите на производителя. Смесите за лигиране са използувани да трансформират One Shot™ Competent E.coli клетки (Invitrogen), следвайки инструкциите на производителя. Изолирана е плазмидна ДНК от ампиицилин резистетни трансформанти и наличието на инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ и ДНК секвениращ анализ. Тези плазмиди са обозначени като pSE190 (получен с праймер D1F1), pSE191 (получен с праймер D1F2), pSE192 (получен с праймер D1F3) и pSE193 (получен с праймер D2F2).

Всяка от включените ДНКи е хидролизирана с BamHI/Xbal, разделена е с електрофореза, пречистена е от гела и отделно лигирана с вектор совалка pWHM3, който е хидролизиран с BamHUXbal в тотална концентрация на ДНК от 1цд в 1:5 моларно вектор-към-инсерт отношение. Смесите за лигиране са използувани да трансформират компетентни E.coli DH5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Тези плазмиди, които са обозначени като pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) и pSE197 (D2F2) са трансформирани всеки поотделно в E.coli щам DM1, изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Тази ДНК е използувана да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-11. Изолирани са резистентни към тиострептон трансформанти на щам SE180-11, определено е наличието на резистентност към еритромицин и Thio^rErm^r трансформанти са анализирани с HPLC анализ на ферментационни продукти, за определяне кои GTG места са необходими за aveC експресия. Резултатите показват, че GTG

• ft ft··· • · ft ·· ft • ft ·· ft·· ·· ft ft··· • · · ·· · Д, · ·· · ·· · · · 96 ···· · • · · · · · · · · · ····· ·· ·· ······ кодона в позиция 42 може да бъде елиминиран без да се засяга aveC експресията, тъй като pSE194, pSE195 и pSE196, у всеки от които липсва GTG мястото в позиция 42, но всички от които съдържат трите GTG места в позиции 174, 177 и 180, са способни да възстановят нормалното производство на авремекгин, когато са трансформирани в SE180-11. Нормалното производство на авермектин не е възстановено, когато щам SE180-11 е трансформиран с pSE197, в който липсват всичките четири GTG места (ТАБЛИЦА 5).

ТАБЛИЦА5

S. tvemHIUx «train (трансформиращ плазмид)	No. трансформанти тестирани	относитепнсотносително	Avg. В2:В1 отношение
В2Сопс.	В1-Сопс.
SE180-11 (попе)	6	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	6	0	0	0
SE180-11 (PSE186)	6	241	152	1.58
SE180-11 (pSE194)	6	35	15	2.43
SE180-11 (pSE195)	6	74	38	1.97
SE180-11 (pSE196)	6	328	208	1.58
SE180-11 (pSE197)	12	0	0	0

10. ПРИМЕР: КЛОНИРАНЕ НА aveC ХОМОЛОЗИ ОТ S.HYGROSCOPICUS и S.GRISEOCHROMOGENES Настоящото изобретение позволява aveC хомолог гени от други авермектин- или милбемицин-произвеждащи видове на Streptomyces да бъдат идентифицирани и клонирани. Например, космидна библиотека от S.hygroscopicus (FERM ВР-1901) геномна ДНК, е хибридизирана с 1.2 Kb aveC сонда от S.avermitilis . описана a

·· ···· ·· ···· · ·· • · · ·· · ··«· ····· · · · · · · • · · · · ·97· · · · • »•44 ·· ·· 4» ··· · по-горе. Идентифицирани са няколко космидни клона, които силно хибридизират. Изолирана е хромозомна ДНК от тези космиди и е идентифициран един 4.9 Kb Kpnl фрагмент, който хибридизира с aveC сондата. Тази ДНК е секвенирана и е идентифицирана една ORF (SEQ ID N0:3), притежаваща значителна хомология с aveC ORF от S.avermitilis. Една аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:4) произлизаща от S.hygroscopicus aveC хомолог ORF е представена във ФИГУРА 6.

В допълнение, една космидна библиотека от S.griseochromogenes геномна ДНК е хибридизирана с 1.2 Kb aveC ® сонда от S.avermitilis, описана по-горе. Идентифицирани са няколко космидни клона, които силно хибридизират. Изолирана е хромозомна ДНК от тези космиди и е идентифициран един 5.4 КЬ PsH фрагмент, който хибридизира с aveC сонда. Тази ДНК е секвенирана и е идентифицирана една aveC хомолог частична ORF, притежаваща значителна хомология с aveC ORF на S.avermitilis. Една производна частична аминокиселинна последователност (SEQ ID N0:5) е представена на ФИГУРА 6.

Анализ на ДНК и аминокиселинна последователност на aveC хомолози на S.hygroscopicus и S.griseochromogenes показва, че тези Ф области споделят значителна хомология (~50%идентичност на последователността на аминокиселинно ниво) едина с друга и с S.avermitilis aveC ORF и AveC генен продукт (ФИГУРА 6).

11. ПРИМЕР: КОНСТРУИРАНЕ НА ПЛАЗМИД С aveC ГЕН СЛЕД егтЕ ПРОМОТОРА

Субклонирана е 1.2 Kb aveC ORF от pSE186 в pSE34, който е векторът совалка pWHM3, притежаващ 300 Ьр егтЕ промотор включен чрез инсерция като един KpnVBamHl фрагмент в Крп\1ВатН\ мястото на pWHM3 (виж Ward et al., 1986, Mol.Gen.Genet. 203:468-

• 4

478). pSE186 е хидролизиран c BamH\ и H/ndlll, хидролизатът e разделен c електрофореза, изолиран е 1.2 Kb фрагмент от агарозния гел и е лигиран с pSE34, който е хидролизиран с BarnHI и H/ndlll. Сместа за лигиране е трансформирана в компетентни E.coli DH5a клетки, съответно инструкциите на производителя. Изолирана е плазмидна ДНК от ампицилин резистентни трансформанти и наличието на 1.2 КЬ инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ. Този плазмид, който е обозначен като pSE189, е трансформиран в E.coli DM1 и плазмидна ДНК е изолирана от резистентни към ампицилин транформанти. Протопласти от S.avermitilis щам 1100ф SC38 са трансформирани с pSE189. Изолирани са резистентни към тиострептон трансформанти на щам 1100-SC38 и са анализирани с HPLC анализ на ферментационните продукти.

S.avermitilis щам 1100-SC38 трансформанти, съдържащи pSE189 са променени в отношенията на произведени авермекгин циклохексил-В2:авермекгин циклохексил-В 1 (около 3:1) в сравнение със щам 1100-SC38 (около 34:1) и общо авермекгин производството е повишено приблизително 2.4-кратно в сравнение със щам 1100-SC38, трансформиран с pSE119 (ТАБЛИЦА 6).

pSE189 също е трансформиран в протопласти на див-тип q S.avermitilis щам. Изолирани са трансформанти резистентни към тиострептон и са анализирани с HPLC анализ на ферментационни продукти. Общо произведените авермектини с S.avermitilis див-тип, трансформиран с pSE189, са повишени приблизително 2.2-кратно, сравнени с див-тип S.avermitilis трансформиран с pSE119 (ТАБЛИЦА 6).

ТАБЛИЦА6

S. avermitilis щам (трансформиращ плазмид)	No. Трансформанти тесгирани	относително [B21	относително [B1J	--—!-RelativeToranHH Avg.
Avermectins	В2:В1 отношение
1100-SC38	6	155	4.8	176	33.9
1100-SC38 (pSE119)	9	239	50.3	357	4.7

• ·· • · · ·· •· • · · · · • · е • · · ’ ί ?? ί ο · · ·

S. avermitilis щам (трансформиращ плазмид)	No. Трансформанти тестирани	относително [B2]	Relative [В1]	относително тотални , Avermectins	Avg. B2:B1 отношение
1100-SC38 (pSE189)	16	546	166	849	3.3
wild type	6	59	42	113	1.41
wild type (pSE119)	6	248	151	481	1.64
wild type (pSE189)	5	545	345	1,071	1.58

12. ПРИМЕР: ХИМЕРЕН ПЛАЗМИД СЪДЪРЖАЩ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ ОТ S.AVERMITILIS aveC ORF и S.HYGROSCOPICUS aveC ХОМОЛОГ

Конструиран е хибриден плазмид обозначен като pSE350, ф който съдържа един 564 Ьр участък от S.hygroscopicus aveC хомолог, заместващ 564 Ьр хомоложен участък от S.avermitilis aveC ORF (ФИГУРА 7), както следва. pSE350 е конструиран като е използувано BsaAl рестрикционно място, което е консервирано в двете последователности (aveC позиция 225) и едно Крп\ рестрикционно място, което е налице в S.avermitilis aveC гена (aveC позиция 810). Крп\ мястото е въведено в S.hygroscopicus ДНК с PCR, като е използуван дясно ориентирания праймер

5’-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3’ (SEQ ID N0:23) и ляво ориентираният праймер 5’-GAACTGGTACCAGTGCCC-3’ (SEQ ID « · · · · · ·· ···· • ·

N0:24) (доставени от Genosys Biotechnologies), като са използувани PCR условия, описани в Раздел 7.1.10, по-горе. PCR продуктът е хидролизиран с BsaAl и ΚρηΙ, фрагментите са разделени с електрофореза в 1% агарозен гел и 564 bp BsaMiKpnl фрагментът е изолиран от гела. pSE179 (описан в Раздел 7.1.10, по-горе) е хидролизиран с ΚρηΙ и H/ndlll, фрагментите са разделени с електрофореза в 1% агарозен гел и е изолиран един ~4.5 КЬ фрагмент от гела. pSE179 е хидролизиран с Hind\\\ и BsaAl, фрагментите са разделени с електрофореза в 1% агарозен гел и е изолиран един ~0.2 Kb BsaMiHindlll фрагмент, изолиран от гела.

® Фрагментът ~4.5 Kb HindWIIKpnl, ~0.2 Kb BsaAI/H/ndlll фрагментът и

564 bp BsaMIKpnl фрагментът от S.hygroscopicus са лигирани заедно в 3-пътно лигиране и лигиращата смес е трансформирана в компетентни E.coli DH5a клетки. Изолирана е плазмидна ДНК от резистентни към ампицилин трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ, използувайки Крп\ и Aval. Този плазмид е хидролизиран с Hind\\\ и ХЬа\ за отделяне на

I. 2КЬ инсерт, лигиран с pWHM3, който е хидролизиран с Hindis и ХЬа\. Сместа за лигиране е трансформирана в компетентни E.coli

DH5a клетки, изолирана е плазмидна ДНК от резистентни към О ампицилин трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ, като са използувани H/ndlll и Aval. Тази плазмидна ДНК е трансформирана в E.coli DM1, изолирана е ДНК от резистентни към ампицилин трансформанти и наличието на точен инсерт е потвърдено с рестрикционен анализ и ДНК секвениращ анализ. Този плазмид е обозначен като pSE350 и е използуван да трансформира протопласти от S.avermitilis щам SE180-

II. Изолирани са резистентни към тиострептон трансформанти на щам SE180-11, определено е наличието на резистентност към еритромицин и Thio^r Erm^r трансформанти са анализирани с HPLC

• · · ·

анализ на ферментационни продукти. Резултатите показват, че трансформанти съдържащи S.avermitilis/S.hygroscopicus хибриден плазмид имат средно В2:В1 отношение около 109:1 (ТАБЛИЦА 7).

ТАБЛИЦА 7

S. avwmltin» Щам (трансформиращ плазмид)	No. Трансформанти тестирани	Relative В2Сопс.	Relative В1 Сопс.	Avg. В2:В1 отношение
SE180-11 (попе)	8	0	0	0
SE180-11 (pWHM3)	8	0	0	0
SE180-11 (pSE350)	16	‘233	2	109

ДЕПОЗИТ НА БИОЛОГИЧНИ МАТЕРИАЛИ

Следният биологичен материал е вложен в American Type Culture Collection (АТСС) на 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, на 29 януари 1998 и е определен със следните ключови номера:

Плазмид

Плазмид pSE180

Плазмид pSE186

Ключов №

209605

209604

Всички патенти, патентни заявки и публикации, цитирани погоре са включени тук чрез цитат в тяхната цялост.

Настоящото изобретение не е ограничено в обсега на специфичните изпъления описани тук, които са предвидени като единични илюстрации на отделните аспекти на изобретението и функционално еквивалентни методи и компоненти са в обсега на изобретението. Наистина , различни модификации на изобретението,

·· ···· ·· ···· ·* ·« ··· ·· · · · · · ····· ·· · ·· ·

в допълнение на тези показани и описани тук, ще бъдат очевидни за специалистите в тази област от горното описание и придружаващите фигури. Такива модификации са предвидени да попадат в обсега на приложените претенции.

Claims

1. Полинуклеотидна молекула, съдържаща нуклеотидна последователност, която от друга страна е същата като Streptomyces avermitilis aveC алела, S.avermitilis AveC генен продукг-кодиращата последователност на плазмид pSE186 (АТСС 109604) или нуклеотидната последователност на aveC ORF на S.avermitilis, както е представена ФИГУРА 1 (SEQ ID N0:1), или негов дегенериран вариант, но която нуклеотидна последователност, по-нататък включва една или повече ф мутации, кодиращи едно аминокиселинно заместване при един или повече аминокиселинни остатъци, съответствуващи на аминокиселинна позиция 38, 48, 89, 99, 111, 136, 154, 179, 228, 238, 289 или 298 на SEQ ID N0:2, така че клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, в който дивият-тип aveC алел е инакгивиран и който експресира полинуклеотидната молекула, съдържаща мутантната нуклеотидна последователност, произвеждат клас 2:1 отношение авермектини, което е различно от отношението получено от клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел.

2. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 1, където клас 2:1 авермектините са циклохексил В2:циклохексил В1 авермектини.

3. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 2, където различният клас 2:1 отношение на авермектини е редуцирано отношение, сравнено с клас 2:1 отношението, получено от клетки на S.avermitilis щам АТСС 53692, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел.

4. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 3, където отношението на клас 2:1 авермектини е около 0.8:1 или помалко.

5. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 3, където отношението на клас 2:1 авермектини е около 0.68:1 или помалко.

6. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 3, където отношението на клас 2:1 авермектини е около 0.53:1 или помалко.

7. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 3, където отношението на клас 2:1 авермектини е около 0.42:1 или помалко.

8. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 3, където отношението на клас 2:1 авермектини е около 0.40:1 или помалко.

9. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 1, където нуклеотидната последователност по-нататък съдържа една или повече мутации, кодиращи една аминокиселинна замяна при един или двата аминокиселинни остатъци, съответствуващи на аминокиселинни позиции 138 и 139 на SEQ ID N0:2.

10. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 2, където аминокиселинните замени са подбрани от една или повече от групата състояща се от:

• ·· · • · · · ·· • ···· · ·· • · · · · ·<

• · · · ·· log ·· ··· ·· · · (a) аминокиселинен остатък Q в позиция 38, заменен с Р или от аминокиселина, която е една консервативна замяна за Р;

(b) аминокиселинен остатък D в позиция 48, заменен с Е или с аминокиселина, което е консервативна замяна за Е;

(c) аминокиселинен остатък А в позиция 89, заменен с Т или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Т;

(d) аминокиселинен остатък F в позиция 99, заменен със S или с аминокиселина, която е консервативна замяна за S;

(e) аминокиселинен остатъкG в позиция 111, заменен eV или с аминокиселина, която е консервативна замяна за V;

(f) аминокиселинен остатък L в позиция 136, заменен с Р или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Р;

(д) аминокиселинан остатък К в позиция 154, заменен с Е или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Е;

(h) аминокиселинен остатък G в позиция 179, заменен с S или с аминокиселина, която е консервативна замяна за S;

(i) аминокиселинан остатък М в позиция 228, заменен с Т или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Т;

(j) аминокиселинен остатък Е в позиция 238, заменен с D аминокиселина, което е консервативна замяна за D;

(k) аминокиселинен остатък Р в позиция 289, заменен с L аминокиселина, която е консервативна замяна за L; и (l) аминокиселинен остатък Q в позиция 298, заменен с Н аминокиселина, която е консервативна замяна за Н.

11. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 2, където комбинация от аминокиселинни остатъци е мутирана и където комбинацията е подбрана от една или повече от групата състояща се от:

(а) аминокиселинни остатъци D48 и А89;

ИЛИ c или c или c ft ft ft ft·· ft (b) аминокиселинни остатъци S138, A139 и G179;

(c) аминокиселинни остатъци Q38, L136 и Е238;

(d) аминокиселинни остатъци F99, S138, А139 и G179;

(e) аминокиселинни остатъци А139 и М228;

(f) аминокиселинни остатъци А111 и Р289; и (д) аминокиселинни остътъци А139.К154 и Q298.

12. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 11, където комбинацията от аминокиселинни замени е подбрана от една или повече от групата състояща се от:

• (a) D48E/A89T;

(b) S138T/A139T/G179S;

(c) Q38P/L136P/E238D;

(d) F99S/S138T/A139T/G179S;

(e) А139Т/М228Т;

(f) G111V/P289L; и (g) A139T/K154E/Q298H.

13. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 12, където мутациите в aveC последователността, кодираща D48E/A89T включват базова промяна от Т в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 317 на SEQ ID N0:1 и базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 438 на SEQ ID N0:1.

14. Полинуклеотидната молекула съгласно претенция 13, понататък съдържа една базова промяна от С в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 353 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в А в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 1155 на SEQ ID N0:1.

Μ·*

15. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 12, където мутациите в aveC последователността, кодираща S138T/A139T/G179S , включва една базова промяна от Т в А в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 585 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 708 на SEQ ID N0:1.

16. Полинуклеотидната молекула съгласно претенция 15, понататък включва базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 272 на SEQ ID N0:1.

17. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 12, където мутациите в aveC последователността, кодираща Q38P/L136P/E238D включва една базова промяна от А в С в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 286 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 580 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от А в Т в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 886 на SEQ ID N0:1.

18. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 17, включваща по-нататък базова промяна от А в G в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 24 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция, съответствуваща на nt 497 на SEQ ID N0:1, и една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 554 на SEQ ID N0:1.

19. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 12, където мутациите в aveC последователността, кодираща F99S/S138T/A139T/G179S включва една 3 базова чифтна делеция в нуклеотидни позиции, съответствуващи на nts 173, 174 и 175 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 469 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 585 на SEQ ID N0: 1, една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt © 588 на SEQ ID N0:1, и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 708 на SEQ ID N0:1.

20. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 19, включваща по-нататък една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 833 на SEQ ID N0:1, и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 1184 на SEQ ID N0:1.

©

21. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 12, където мутациите в aveC последователността, кодираща А139Т/М228Т, включва една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 856 на SEQ ID N0:1.

22. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 12, където мутациите в aveC последователността, кодираща G111V/P289L включва една базова промяна от G в Т в нуклеотидна позиция

ΊΟ» съответствуваща на nt 505 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 1039 на SEQ ID N0:1.

23. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 22, включваща по-нататък една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 155 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 1202 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt • 1210 на SEQ ID N0:1.

24. Полинуклеотидна молекула съгласно претенция 12, където мутациите в aveC последователността, кодираща A139T/K154E/Q298H включва една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от А в G в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 633 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от А в Т в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 1067 на SEQ ID N0:1.

25. Полинуклеотидна последователност съгласно претеция 24, включнаща по-нататък една базова промяна от G в Т в нуклеотидна позиция съответствуваща на nt 377 на SEQ ID N0:1.

26. Рекомбинантен вектор съдържащ полинуклеотидната молекула съгласно претенция 1.

♦· ···· • · · • · ·

27. Клетка гостоприемник съдържаща полинуклеотидната молекула съгласно претенция 1 или рекомбинантен вектор съгласно претенция 26.

28. Клетка гостоприемник съгласно претенция 27, която е Streptomyces клетка.

29. Метод за получаване на нов щам от S.avermitilis, характеризиращ се с това, че се мутира aveC алела в клетки на щам от S.avermitilis, която мутация има за резултат заместване Ф в AveC генния продукт на различен аминокиселинен остатък в една или повече аминокиселиинни позиции, съответствуващи на аминокиселинни остатъци 38, 48, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 238, 289 или 298 на SEQ ID NO: 2, така че клетки на S.avermitilis щама, в който aveC апелът е мутиран да произвежда един клас 2:1 отношение на авермектини, което е различно от отношението получено с клетки на същия S.avermitilis щам, който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел.

30. Метод съгласно претенция 29, където клес 2:1 авермектини са циклохексил В2 : циклохексил В1 авермектини.

31. Метод съгласно претенция 30, където различният клас 2:1 отношение авермектини е едно редуцирано отношение.

32. Метод съгласно претенция 31, където отношението на клас 2:1 авермектини, произведени от клетки на S.avermitilis щама, в който aveC апелът е мутиран така, че е около 0.8:1 или по малко.

·· ···· « · • ··· ·· ···· • · • · · · · · · • · · · · · ·· · » · · ···· · • · · · · ·11« · · · ·· ··· · rr¹ ·· ····

33. Метод съгласно претенция 31, където отношението на клас 2:1 авермектини, произведени от клетки на S.avermitilis щама, в който aveC алелът е мутиран така, че е около 0.68:1 или помалко.

34. Метод съгласно претенция 31, където отношението на клас 2:1 авермектини, произведени от клетки на S.avermitilis щама, в който aveC алелът е мутиран така, че е около 0.53:1 или помалко.

•

35. Метод съгласно претенция 31, където отношението на клас 2:1 авермектини, произведени от клетки на S.avermitilis щама, в който aveC алелът е така мутиран, че е около 0.42:1 или помалко.

36. Метод съгласно претенция 31, където отношението на клас 2:1 авермектини произведени от клетки на S.avermitilis щама, в който aveC алелът е мутиран така, че е около 0.40:1 или помалко.

37. Метод съгласно претенция 31, по-нататък характеризиращ се с това, че се въвеждат една или повече мутации в aveC алела, който кодира една аминокиселинна замяна в един или двата аминокиселинни остатъци, съответствуващи на аминокиселинни позиции 138 и 139 на SEQ ID NO: 2.

38. Метод съгласно претенция 30, където аминокиселинните замени са подбрани от една или повече от групите състоящи се от:

• е ♦ · · · • · • · (a) аминокиселинен остатък Q в позиция 38 заменен с Р или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Р;

(b) аминокиселинен остатък D в позиция 48, заменен с Е или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Е;

(d) аминокиселинен остатък F в позиция 99, заменен с S или с аминокиселина, която е консервативна замяна за S;

(e) аминокиселинен остатък G в позиция 111, заменен с V или с аминокиселина, която е консервативна замяна за V;

(f) аминокиселинен остатък L в позици 136, заменен с Р или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Р;

(д) аминокиселинен остатък К в позиция 154, заменен с Е или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Е;

(i) аминокиселинен остатък М в позиция 228, заменен с Т или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Т;

(j) аминокиселинен остатък Е в позиция 238, заменен с D или с аминокиселина, която е консервативна замяна за D;

(k) аминокиселинен остъгьк Р в позиция 289, заменен с L или с аминокиселина, която е консервативна замяна за L; и (l) аминокиселинен остатък Q в позиция 298, заменен с Н или с аминокиселина, която е консервативна замяна за Н.

39. Метод съгласно претенция 30, където aveC алелът е мутиран да кодира аминокиселинни замествания в една комбинация от аминокиселинни позиции и където комбинацията е подбрана от една или повече от групата състояща се от:

(а) аминокиселинни остатъци D48 и А89;

• · · · ♦ · · • · · • · · · · · (b) аминокиселинни остатъци S138, А139 и G179;

(c) аминокиселинни остатъци Q38, L136 и Е238;

(d) аминокиселинни остатъци F99, S138, А139 и G179;

(e) аминокиселинни остатъци А139 и М228;

(f) аминокиселинни остатъци G111 и Р289; и (д) аминокиселинни остатъци А139, К154 и Q298.

40. Метод съгласно претенция 39, където комбинацията от аминокиселинни замествания е подбрана от една или повече от групата състояща се от:

• (a) D48E/A89T;

(b) S138T/A139T/G179S;

(c) Q38P/L136/E238D;

(d) F99S/S138T/A139T/G179S;

(e) А139Т/М228Т;

(f) G111V/P289L; и (g) A139T/K154E/Q298H.

41. Метод съгласно претенция 40, където мутациите в aveC алела, кодиращ D48E/A89T включват една базова замяна от Т в А в ф нуклеотидна позиция в aveC алела, съотвтствуваща на nt 317 на SEQ ID N0:1, и една базова замяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 438 на SEQ ID N0:1.

42. Метод съгласно претенция 41, характеризиращ се по-нататък с това, че се въвежда една базова промяна от С в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 353 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в А в нуклеотидна • · ···« позиция в aveC апела, съответствуваща на nt 1155 на SEQ ID N0:1.

43. Метод съгласно претенция 40, където мутациите в aveC апела, кодиращ S138T/A139T/G179S включват една базова промяна от Т в А в позиция в ауеСалела, съответствуваща на nt 585 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 708 на SEQ ID N0:1.

44. Метод съгласно претенция 43, по-нататък характеризиращ се с това, че се въвежда една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC, съответствуваща на nt 272 на SEQIDN0:1.

45. Метод съгласно претенция 40, където мутациите в aveC алела, кодиращ Q38P/L136P/E238D включват една базова промяна от А в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 286 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в © нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 580 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от А в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела съответствуваща на nt 886 на SEQ ID N0:1.

46. Метод съгласно претенция 45, по-нататък характеризиращ се с това, че се въвежда една базова промяна от А в G в нуклеотидна позиция в aveC алел, съответствуваща на nt 24 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 497 на SEQ ID • · · · · ·

N0:1 и една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на 554 на SEQ ID N0:1.

47. Метод съгласно претенция 40, където мутациите в aveC алела, кодиращ F99S/S138T/A139T/G179S включват 3 базов чифт делеция в нуклеотидни позиции в aveC алела, съответствуващи на nts 173, 174 и 175 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 469 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в А в нукеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 585 © на SEQ ID N0:1, една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 708 на SEQ ID N0:1.

48. Метод съгласно претенция 47, по-нататък характеризиращ се с това, че се въвежда една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 833 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1184 на SEQ ID ф N0:1.

49. Метод съгласно претенция 40, където мутациите в aveC алела, кодиращ А139Т/М228Т включват една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 856 на SEQ ID N0:1.

• · · · · · • · ···· • <

• · · · · · · · · · ····· · · · ·· · • · ··· ·,,«·· · · • · · · · ·11® · · · ····· · · ·· ······

50. Метод съгласно претенция 40, където мутациите в aveC алела, кодиращ G111V/P289L включват една базова промяна от G в Т в нуклеотидна позиция на aveC алела, съответствуваща на nt 505 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1039 на SEQ ID N0:1.

51. Метод съгласно претенция 50, по-нататък характеризиращ се с това, че се въвежда една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 156 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1202 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуващ на nt 1210 на SEQ ID N0:1.

52. Метод съгласно претенция 40, където мутациите в aveC алела, кодиращ A139T/K154E/Q289H включват една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от А в G в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 633 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от А в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1067 на SEQ ID N0:1.

53. Метод съгласно претенция 52, по-нататък характеризиращ се с това, че се въвежда една базова промяна от G в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствунаща на nt 377 на SEQ ID N0:1.

♦♦ 99·9 • ··· « ·

54. Streptomyces avermitilis клетка, притежаваща мутантен aveC алел, кодиращ AveC генен продукт, който има една или повече аминокисеинни позиции, съответствуващи на аминокиселинен остатък 38, 48, 89, 99, 111, 136, 154, 179, 228, 238, 289 или 298 на SEQ ID N0:2, където клетката произвежда клас 2:1 отношение на авермектини, което е различно от отношението получено с клетка на същия S.avermitilis щам, но който вместо това експресира само дивия-тип aveC алел.

55. S.avermitilis клетка съгласно претенция 54, където класът 2:1 авермектини са циклохексил В2:циклохексил В1 авермектини.

56. S.avermitilis клетка съгласно претенция 55, където различното клас 2:1 отношение на авермектини е редуцирано отношение.

57. S.avermitilis клетка съгласно претенция 56, която произвежда отношение на клас 2:1 авермектии от около 0.8:1 или по-малко.

58. S.avermitilis клетка съгласно претенция 56, която произвежда отношение на клас 2:1 авермектини от около 0.68:1 или помалко.

59. S.avermitilis клетка съгласно претенция 56, която произвежда отношение на клас 2:1 авермектини от около 0.53:1 или помалко.

60. S.avermitilis клетка съгласно претенция 56, която произвежда отношение на клас 2:1 авермектини от около 0.42:1 или по- малко.

·· ···· • · • · ····

61. S.avermitilis клетка съгласно претенция 56, която произвежда отношение на клас 2:1 авермектини от около 0.40:1 или помалко.

62. S.avermitilis клетка съгласно претенция 55, в която aveC алелът по-нататък кодира аминокиселинна замяна в един или двата аминокиселиинни остатъци, съответствуващи на аминокиселинни позиции 138 и 139 на SEQ ID N0:2.

63. S.avermitilis клетка съгласно претенция 55, където

Ф аминокииселинните замени са подбрани от една или повече от групата състояща се от:

(b) аминокиселинен остатък D в позиция 48, заменен с Е или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Е;

(c) аминоккиселинен остатък А в позиция 89, заменен с Т или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Т;

(d) аминокиселинен остатък F в позиция 99, заменен с S или с ф аминокиселина, която е една консервативна замяна за S;

(f) аминокиселинен остатък L в позиция 136, заменен с Р или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Р;

(д) аминокиселинен остатък К в позиция 154, заменен с Е или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Е;

(h) аминокиселинен остатък G в позиция 179, заменен с S или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за S;

·· ···· ·”·· · · · · ·· · ··········· • · · · · · ···♦ ·

·..··.!» (i) аминокиселинен остатък М в позиция 228, заменен с Т или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Т;

(j) аминокиселинен остатък Е в позиция 238, заменен с D или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за D;

(k) аминокиселинен остатък Р в позиция 289, заменен с L или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за L; и (l) аминокиселинен остатък Q в позиция 298, заменен с Н или с аминокиселина, която е една консервативна замяна за Н.

64. S.avermitilis клетка съгласно претенция 55, където aveC алелът е мутиран да кодира аминокиселинни замени в комбинация от аминокиселинни позиции и където комбинацията е подбрана от една или повече от групата състояща се от:

(a) аминокиселинни остатъци D48 и А89;

(b) аминокиселинни остатъци S138, А139 и G179;

(c) аминокиселинни остатъци Q38, L136 и Е238;

(d) аминокиселинни остатъци F99, S138, А139 и G179;

(e) аминокиселинни остатъци S139 и М228;

(f) аминокиселинни остатъци G111 и Р 289; и (д) аминокиселинни остатъци А139, К154 и Q298.

65. S.avermitilis клетка съгласно претенция 64, където комбинацията от аминокиселинни замени е подбрана от една или повече от групата състояща се от:

(a) D48E/A89T;

(b) S138T/A139T/G179S;

(c) Q38P/L136P/E238D;

(d) F99S/S138T/A139T/G179S;

(е) А139Т/М228Т;

(f) G111V/P289L; и • · ···· ····· ·· · ·· · • · · · · · -лл· · · · · • · · · · 420· · · · ·· ··· ·· ·♦ ·· ···· (g) A139T/K154E/Q298H.

66. S.avermitilis клетка съгласно претенция 65, където мутациите в aveC алела, кодиращ D48E/A89T включва една базова промяна от Т в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 317 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 438 на SEQ ID N0:1.

67. S.avermitilis клетка съгласно претенция 66, където мутациите в aveC алела, кодиращ D48E/A89T по-нататък включват една базова промяна от С в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 353 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1155 на SEQ ID N0:1.

68. S.avermitilis клетка съгласно претенция 65, където мутациите в aveC алела, кодиращ S138T/A139T/G179S включват една базова промяна от Т в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 585 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 708 на SEQ ID N0:1.

69. S.avermitilis клетка съгласно претенция 68, където мутациите в aveC алела, кодиращ S138T/A139T/G179S по-нататък включват една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуващ на nt 272 на SEQ ID N0:1.

·· ····

70. S.avermitilis клетка съгласно претенция 65, където мутациите в aveC алела, кодиращ Q38P/L136P/E238D включват една базова промяна от А в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 286 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 580 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от А в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 886 на SEQ ID N0:1.

71. S.avermitilis клетката съгласно претенция 70, където мутациите • в aveC алела, кодиращ Q38P/L136P/E238D по-нататък включват една базова промяна от А в G в нуклеотиидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 24 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 497 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 554 на SEQ ID N0:1.

72. S.avermitilis клетка съгласно претенция 65, където мутациите в aveC алела, кодиращ F99S/S138T/G179S включват една три

0 базов чифт делеция в нуклеотидни позиции в aveC алела, съответствуваща на nts 173, 174 и 175 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 469 на SEQ ID N0:1, една базова замяна от Т в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 585 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 708 на SEQ ID N0:1.

ft··· ft ·· • ft ft ft ft ft ft ft ft .122 · : : .· •ft ·· ft···

73. S.avermitilis клетка съгласно претенция 72, където мутациите в aveC алела, кодиращ F99S/S138T/A139T/G179S по-нататък включват една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 833 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1184 на SEQ ID N0:1.

74. S.avermitilis клетка съгласно претенция 65, където мутациите в

aveC алела, кодиращ А139Т/М228Т включват една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела,

съответствуваща на nt 856 на SEQ ID N0:1.

75. S.avermitilis клетка съгласно претенция 65, където мутациите в aveC алела, кодиращ G111V/P289L включват една базова промяна от G в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 505 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1039 на SEQ ID N0:1.

76. S.avermitilis клетка съгласно претенция 75, където мутациите в aveC алела, кодиращ G111V/P289L по-нататък включват една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 155 на SEQID N0:1, една базова промяна от С в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1202 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от Т в С в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1210 на SEQ ID N0:1.

П. S.avermitilis клетка съгласно претенция 65, където мутациите в aveC алела кодиращ A139T/K154E/Q298H включват една базова промяна от G в А в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 588 на SEQ ID N0:1, една базова промяна от А в G в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 633 на SEQ ID N0:1 и една базова промяна от А в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела, съответствуваща на nt 1067 на SEQ ID N0:1.

78. S.avermitilis клетка съгласно претенция 77, където мутациите в aveC алела кодиращ A139T/K154E/Q298H по-нататък включват една базова промяна от G в Т в нуклеотидна позиция в aveC алела съответствуваща на nt 377 на SEQ ID N0:1.

79. Процес за получаване на авермектини характеризиращ се с това, че се култивират клетките съгласно претенция 55 в среда за култивиране, в условия които разрешават или индуцират получаването от това на авермектини и добиване на споменатите авермектини от културата.

80. Състав от циклохексил В2:циклохексил В1 авермектини, получен от клетки на Streptomyces avermitilis, съдържащ циклохексил В2:циклохексил В1 авермектините в отношение от около 0.68:1 или по-малко в среда за култивиране, в която клетките са култивирани.

81. Състав от циклохексил Н2:циклохексил В1 авермектини, получени от клетки на един щам Streptomyces avermitilis, които експресират мутантен aveC алел, кодиращ генен продукт, което ·· ···· ·♦ ·♦·· • ·· ·· · води до редуциране на клас 2:1 отношението на циклохексил В2:циклохексил В1 авермектини, получени от клетките, в сравнение с клетки на същия щам S.avermitilis, които не експресират мутантния aveC алел, но вместо това експресират само дивия-тип aveC алел, който състав съдържа циклохексил В2:циклохексил В1 авермектини в отношение от около 0.68:1 или по-малко в средата за култивиране, в която клетките са култивирани.