SK11582001A3

SK11582001A3 - Chlorid n-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]pyridín-1-oxid- 3-karboximidoylu a jeho použitie na liečenie inzulínovej rezistencie

Info

Publication number: SK11582001A3
Application number: SK1158-2001A
Authority: SK
Inventors: M�Ria K�Rthy; Katalin B�R�; K�Roly Nagy; L�Szl� �R�Gdi; Zita Cs�Kai; Jen Szilbereky; Tam�S Mogyor�Si; Magdolna T�R�K; Andr�S Kom�Romi; Ede M�Rv�Nyos; Mih�Ly Barab�S; Mih�Lyn� Kardos; Zolt�N Nagy; L�Szl� Kor�Nyi; Melinda Nagy
Original assignee: Biorex Kutat� �S Fejleszt� Rt.
Priority date: 1999-02-26
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2001-12-03
Also published as: CA2360451C; HRP20010584B1; AU779096B2; BR0008969A; PT1163224E; ZA200106488B; CA2360451A1; WO2000050403A1; ATE237590T1; JP4689838B2; CZ20013053A3; NO20014103D0; NO20014103L; IL144866A0; HUP9900475D0; EP1163224B1; AU3182400A; NO319793B1; SK287063B6; DK1163224T3

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka halidového derivátu 0—(3piperidino-2-hydroxy-l-propyl) kyseliny hydroxymovej, jeho farmaceutického použitia a farmaceutických výrobkov obsahujúcich tento derivát ako aktívnu zložku. Menovite sa vynález týka chloridu N- [2-hydroxy-3-(1-piperid.inyl) propoxy]pyridínl-oxid-3-karboximidoylu, jeho stereoizomérov, rovnako ako aj ich kyslých adičných solí. Ďalej sa vynález týka použitia týchto zlúčenín pre liečenie inzulínovej rezistencie a farmaceutických výrobkov obsahujúcich tieto deriváty ako aktívnu zložku.

Doterajší stav techniky

Halidové deriváty 0-(3-piperidino-2-hydroxy-l-propyl) hydroxymovej kyseliny sú dobre známe z Európskej patentovej špecifikácie č. 0 417 210 BI. Podlá tejto patentovej špecifikácie vykazujú tieto zlúčeniny selektívny beta blokátorový účinok a sú tak vhodné pre liečenie diabetickej angiopatie, predovšetkým diabetickej retinopatie a nefropatie.

Podlá PCT publikácie WO 98/06400, halidové deriváty 0(3-piperidino-2-hydroxy-l-propyl)hydroxymovej kyseliny a iné zlúčeniny podobnej štruktúry sú účinné pre ochranu a regeneráciu cievnych endoteliálnych buniek, a sú aktívnymi látkami pre liečenie ochorení spôsobených dysfunkciou endotelu.

WO 97/16439 popisuje stimulačný účinok chaperónovej expresie mnohých derivátov hydroxylamínu, medzi nimi halidy O-(3-piperidino-2-hydroxy-l-propyl) hydroxymovej kyseliny. Dobre je známe použitie týchto zlúčenín pre liečenie ochorení spojených s funkciou chaperónového systému. V tejto patentovej žiadosti sú definované a nárokované, medzi inými, Noxid deriváty 0-(3-piperidino-2-hydroxy-l-propyl)-3-pyridyl hydroxymovej kyseliny (okrem iných) ako nové zlúčeniny, avšak príprava je popísaná len pre piperidin-N-oxid a pre zlúčeniny obsahujúce N-oxidové skupiny v piperidínovom alebo pyridínovom kruhu. Zlúčenina predkladaného vynálezu nie je uvedená vo vyššie spomínanej patentovej žiadosti.

Inzulínová rezistencia je patologický stav, pri ktorom je znížený účinok inzulínu. Všeobecne tento stav je spojený s diabetom, hoci môže existovať nezávisle na diabete. V dôsledku inzulínovej rezistencie telo potrebuje vyššie a vyššie koncentrácie inzulínu pre kontrolu metabolizmu cukrov, lipidov a proteínov, čo vedie k extrémne vysokým koncentráciám inzulínu. Bolo dokázané, že dlhotrvajúce vysoké koncentrácie inzulínu sú nezávislým rizikovým faktorom pre srdcovo-mozgocievnych ochorení.

Zníženie inzulínovej rezistencie je dôležité pri oboch typoch diabetu: v prípade diabetu typu 2, je prítomný ako hlavný etiologický faktor, kým v prípade diabetu 1, inzulínová rezistencia je spôsobená toxicitou glukózy rovnako ako nadmerným množstvom exogénne podávaného inzulínu pre terapeutické účely.

Pre redukovanie inzulínovej rezistencie sa používa mnoho aktívnych látok. Medzi nimi sú najvýznamnejšie výrobky, ktoré zvyšujú citlivosť voči inzulínu. Najznámejšou takouto látkou je troglitazon, patriaci do tiazolidin-dion skupiny (A. R. Saltiel a spol., Diabetes 45/12/1996 str. 1661-1669, a S. Kumar a spol., Diabetológia 1996/39/6 str. 701-709). Hlavným účinkom tejto zlúčeniny je zníženie inzulínovej rezistencie spôsobené poklesom periférnych koncentrácií inzulínu za bazálneho stavu a aj po stimulácii glukózou. Výsledkom je zlep·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · · ··· · · · · ····· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ··· šenie metabolizmu cukrov a rovnako tiež zlepšenie mnohých patologických odchyliek spôsobených sekundárnym účinkom vysokých hladín inzulínu, akými sú hyperlipidémia a patologická hemostáza. Jeho jednoznačný pozitívny účinok je v znížení kardiovaskulárneho rizika. Nevýhodou je však to, že môže spôsobiť vážne vedľajšie účinky, hlavne poškodenie pečene, a preto je jeho používanie obmedzené a vyžaduje si veľkú pozornosť.

Podstata vynálezu

Štúdie s halidovými derivátmi 0-(3-piperidino-2-hydroxy1-propyl) hydroxymovej kyseliny, podrobné skúšky chloridu maleinanu 0-(3-piperidino-2-hydroxy-l-propyl)-3-pyridín hydroxymovej kyseliny, známy ako Bimoclomol, ukázali, že jeho najvýznamnejší účinok je v pôsobení na patologické následky chronickej neuropatie: významne zlepšuje motorickú a senzorickú vodivosť nervových dráh, ktoré sú znížené pri diabete; má priaznivé účinky na patologické odchýlky autonómnej neuropatie. Ďalej, v pokusoch na zvieratách a u ľudí v II fáze skúšok, sa ukázalo, že znižuje patologické diabetické vylučovanie albumínu močom a v skúškach u zvierat sa ukázalo, že znižuje patologické histologické a elektrofyziologické zmeny spôsobené diabetickou retinopatiou. Avšak Bimoclomol nebol nenížil inzulínovú rezistenciu.

V súčasnosti neexistujú žiadne prípravky, ktoré by znižovali inzulínovú rezistenciu a súčasne účinne liečili odchýlky spôsobené tromi komplikáciami chronického diabetu.

Pri výskume týkajúcom sa vhodných aktívnych látok, bola testovaná biologická aktivita N-oxid derivátov Bimiclomolu. V predbežnej skúške boli sledované účinky troch N-oxid derivátov Bimoclomolu na motorickú a senzorickú neuropatiu u STZ diabetických Wistar potkanov. Spôsobom, ktorý bude podrobne ·· ·· ·· ·· ·· ···· · e · · ·· ··· · · · · ·· • · · · · · ··· · · · ····· ··· ···· ·· ·· ·· ·· • ο ·· · popísaný v Pokuse 2, sa zistila účinnosť troch N-oxid derivátov Bimoclomolu v zmysle zlepšenia zníženej rýchlosti periférnej motorickej a senzorickej vodivosti nervov u STZ diabetu. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

SKUPINA	n	Zlepšenie rýchlosti vodivosti (%) v nervových dráhach
		motorická aktivita (MNCV)	senzorická aktivita (SNCV)
Bimoclomol 20 mg/kg	7	72,4	66, 9
pyridín N-oxid derivát Bimoclomolu, 5 mg/kg	8	66,5	63,4
piperidín N-oxid derivát Bimoclomolu, 5 mg/kg	8	34,7*	27,3**
dvojitý N-oxid derivát Bimoclomolu, 5 mg/kg	8	25, 9*	29,1*

*p < 0,05 oproti Bimoclomolu **p < 0,01 oproti Bimoclomolu

Z vyššie uvedených výsledkov sa zdá, že pyridín N-oxid derivát Bimoclomolu je rovnocenný Bimoclomolu, kým dva ďalšie deriváty N-oxidu majú významne slabší účinok na motorickú a senzorickú neuropatiu. Na základe skúsenosti sa pokračovalo v pokusoch s derivátom pyridín N-oxidu Bimoclomolu, menovite chloridom N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-1-propoxy]-pyridínl-oxid-3-karboximydoyu.

Náš výskum poskytol neočakávaný výsledok. Zistilo sa, že chlorid N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-1oxid-3-karboximidoylu znižuje periférnu inzulínovú rezistenciu a okrem toho vykazuje účinok rovnajúci sa, alebo v niek5 ·· torých prípadoch väčší ako Bimoclomol, pri liečení vyššie uvedených troch hlavných diabetických komplikácií. Pre tieto vlastnosti je zlúčenina vhodná pre liečenie chronických diabetických komplikácií, predovšetkým retinopatie, neuropatie a nefropatie, súčasne vykazuje zníženie periférnej inzulínovej rezistencie. Je však tiež vhodný pre liečenie nediabetickej patologickej inzulínovej rezistencie a na ňu sa vzťahujúcich akýchkoľvek patologických stavov.

Výhodné biologické vlastnosti chloridu N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu boli dokázané nasledujúcimi pokusmi. V týchto skúškach boli použité zlúčeniny maleinanu N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy] -pyridín-l-oxid-3-karboximidoyl chloridu alebo maleinanu vhodnej opticky aktívnej zlúčeniny. V popise pokusov je maleinan racemickej zlúčeniny označený ako Zlúčenina A, kým maleinan opticky aktívneho stereoizoméru je vždy špecificky označený.

Pokus 1

Účinok podávania zlúčeniny A a Bimoclomolu na metabolizmus cukrov u obéznych, inzulínorezistentných Zucker fa/fa potkanov s poškodenou glukózovou toleranciou, 2-mesačné podávanie

Materiál a metódy:

V pokusoch boli použité Zucker fa/fa potkany (Charles River Laboratories Inc.). U monozygotných zvierat je prítomná obezita, inzulínová rezistencia, vysoká hladina inzulínu, glukózová intolerancia a hypertriglyceridémia výsledkom mutácie hypotalamického receptora pre leptín. V dôsledku uvedených vlastností, sú takéto zvieratá považované za prijateľný model skorého diabetu 2. typu.

• · ··

Na začiatku pokusu boli zvieratá individuálne umiestnené do metabolických klietok na 24 hodín a po jednom alebo dvoch mesiacoch liečenia opäť na 24 hodín. V metabolických klietkach sa zbieral moč.

Zvieratá dostávali buď testovanú látku alebo fyziologický roztok sondou jedenkrát denne v týždňoch 14 až 22.

Biochemické parametre krvi a moča boli hodnotené Kodak Ectachem 700 automatickým analyzátorom. Celkový obsah proteínov v moči bol stanovený spektrofotometricky pomocou Bradfordového farbenia (Hitachi U-3200) pri vlnovej dĺžke 595 nm. Koncentrácia inzulínu v sére bola stanovená pomocou RIA metódy, za použitia anti-potkaních protilátok.

Systolický, diastolický tlak krvi a srdcová rýchlosť boli merané týždenne na chvoste potkanov (takzvanou „tail cuff method) použitím Leica 200 automatickým analyzátorom. Po dvoch mesiacoch podávania bola meraná glukózová tolerancia intraperitoneálnym glukózovým tolerančným testom (2 g/kg ip.) Výsledky:

Bimoclomol podávaný denne v dávke 20 mg/kg per os významne znížil hladinu glukózy na lacno, avšak neovplyvnil koncentráciu inzulínu na lacno.

V porovnaní s predchádzajúcimi hodnotami, sa neočakávane zistilo, že Zlúčenina A podávaná denne v dávke 20 mg/kg per os, významne znížila tak hladiny glukózy ako aj inzulínu na lačno, pokles inzulínu bol približne 50 %. Výsledky sú uvedené v Tabuľke 1 a na Obrázku 1.

	··	• ·	··	• · ·
• ·	•	•	• ·	• ·	• ·	• v
•	• ·		• ·	• ·	• ·	•
•	•	•	• · ·	M· ·	• ·	•
•	•	•	• ·	•	• ·	•
····	··		··	··	··	• · ·

Tabuľka 1

Účinok Zlúčeniny A a Bimoclomolu na koncentrácie krvnej glukózy a inzulínu na lacno.

	GLUKÓZA (mmol/1) (priemer ±SE)	INZULÍN (ng/ml) (priemer ±SE
Štíhle kontroly	7,19710,315***	3,727+0,302***
Obézne kontroly	9,77410,342	22,88213,790
Zlúčenina A	8,26710,436 **	11,17611,955 **
Bimoclomol	8,179+0,316***	29,36219,211

**p < 0,001, ***p < 0,0001, porovnanie voči obéznym kontrolám

V priebehu intraperitoneálneho glukózového tolerančného testu, ani Bimoclomol a ani Zlúčenina A neovlyvnili plochu pod glukózovou krivkou (AUC). Avšak v prípade AUC pre inzulín, bol prítomný rozdiel medzi dvoma zlúčeninami: Bimoclomol nemal žiaden účinok, kým Zlúčenina A znížila plochu pod krivkou významne, na rovnakú úroveň aká bola zaznamenaná pre štíhle kontrolné zvieratá. Výsledky sú uvedené v Tabuľke 2 a na Obrázku 2.

Tabuľka obsahuje hodnoty plochy pod krivkou (AUC) medzi 0 až 60 minútou.

• · ··

Tabuľka 2

Účinok 2-mesačného podávania Bimoclomolu a Zlúčeniny A na glukózovú toleranciu u obéznych, inzulinorezistentných, hyperinzulinemických Zucker fa/fa potkanov s poškodenou glukózovou toleranciou

	GLUKÓZA v krvi (AUC) (priemeriSE)	INZULÍN (AUC) (priemer+SE)
Štíhle kontroly	823,69±60,66***	599,49±86,76***
Obézne kontroly	1417,00±159,88	1986,34±213,84
Zlúčenina A	1418,40±194,57	790,35±166,08***
Bimoclomol	1286,86+131,59	2337,71±590,49

***p < 0,0001, porovnanie voči obéznym kontrolám

Záver:

Zlúčenina A významne znižuje periférnu inzulínovú rezistenciu, zatiaľ čo Bimoclomol nemá takýto účinok.

Pokus 2

Účinok 1-mesačného podávania Zlúčeniny A a Bimoclomolu na patologické odchýlky vyvolané periférnou neuropatiu u STZdiabetických Wistar potkanov

Materiál a metódy:

V pokusoch boli použité potkany, samci kmeňa Wistar (Charles River Laboratories, Inc). Na začiatku pokusu mali zvieratá hmotnosť 340 až 370 g. Diabetes bol navodený intravenóznym podaním jednej dávky streptozotocínu (STZ, Sigma, St. Louis, MO) v množstve 45 mg/kg, rozpusteného vo fyziolo9

··	• e	··
• ·	• ·	•
•	··	•
•	• ·	• ·
•	• ·	•
····	··	··

• e • · · · · • · · · · • ··· · * · • · · · ·· ·· ·· gíckom roztoku. Prítomnosť diabetu bola overená nasledujúci deň stanovením glukózy v krvi, akceptovala sa hodnota vyššia ako 15 mmol/1.

Skúška a testované látky boli podávané zvieratám per os, jedenkrát denne.

Pri hodnotení rýchlosti vodivosti nervov (NCV), bola použitá metóda podlá Stanleyho, modifikovaná De Konigom a Gispenom. Zvieratá boli anestezované súčasným podaním Hyponormu (1 mg/kg ip., Janssen, Tilburg, Dánsko), fluanisonu (10 mg/ml) a fenyl citrátu (0,2 mg/ml) . Potom boli v štandardných bodoch stimulované lavý ischiadický a lavý tibiálny nerv. Supramaximálna stimulácia (štvorcový impulz, 0,03 ms) bola vyvolaná platinovou ihlovou elektródou pomocou NihonKohden (model SEN-1104, Japonsko) stimulátora. Elektromyogram (EMG) z jedného svalu a zosilnený myografom (Elma-Schonander, Štokholm, Švédsko) bol potom analyzovaný programom Metlab pre Windows (Mathwork Inc., UK). Rozsah NCV poškodenia spôsobeného diabetom bol vyjadrený v m/s. Účinnosť liečenia bola porovnaná v tomto vyjadrení percentuálne (%). Pre štatistické hodnotenie bol použitý nepárový T-test, alebo jednocestná ANOVA (spolu s Newman-Keuls post hoc testom), (Graphpad Instat, San Diago, CA).

Výsledky:

Bimoclomol podávaný denne v jednej dávke 20 mg/kg a Zlúčenina A podávaná denne v jednej dávke 5 mg/kg významne zlepšili rýchlosť motorickej (MNCV) a senzorickej (SNCV) vodivosti nervov u diabetických zvierat. Použitie vyššej dávky ako 10 mg/kg Zlúčeniny A nespôsobilo zvýšenie účinku. Výsledky sú uvedené v Tabuľke 3.

• · • ·

Tabulka 3

Účinok podávania Zlúčeniny A a Bimoclomolu na rýchlosť zníženej vodivosti nervov (NCV) u STZ-diabetických (STZ-DB) Wistar potkanov

	Rýchlosť vodivosti nervov (NCV)
MNCV m/s	SNCV m/s zlepšenie %
Kontrola	60,9±0,2	62,3+0,3
STZ-DB kontrola	43,7±0,2	44,7+0,2
STZ-DB+Bimoclomol	57,4±0,2***	79,7%	58,5±0,6***	77, 9%
20 mg/kg
STZ-DB+Zlúčenina A	57,4±0,3***	79,5%	58,4±0,3***	77,6%
5 mg/kg
10 mg/kg	59,2±0,3***	90,4%	60,4±0,4***	89, 0
20 mg/kg	59,l±0,3***	89, 8%	60,l±0,3***	87,4%

***p < 0,001

Pokus 3

Účinok 1-mesačného podávania Zlúčeniny A a Bimoclomolu na patologické odchýlky pri diabetickej autonómnej neuropatii u STZ-diabetických Wistar potkanoch

Materiál a metódy:

V pokusoch boli použité potkany kmeňa Wistar (Charles River Laboratories Inc.), samci s počiatočnou hmotnosťou 340 až 370 g. Diabetes bol vyvolaný intravenóznym podaním jednej dávky streptozotocínu v dávke 45 mg/kg (STZ, Sigma, St. Louis, MO) rozpustenom vo fyziologickom roztoku. Prítomnosť diabetu bola skontrolovaná nasledujúci deň po podaní hodnotením glukózy v krvi, akceptovali sa hodnoty vyššie ako 15 mmol/1.

Testované a porovnávacie látky boli podávané potkanom denne per os.

Pokusy boli uskutočnené v celkovej anestéze potkanov navodenej intraperitoneálnym podaním 60 mg/kg pentobarbitálu sodného (Nembutal, Sanofi, Phylaxia). Intratracheálna hadička alebo polyetylénová kanyla bola vsunutá do femorálnej artérie a vény. Arteriálny katéter bol napojený na simultánny merač systolického a diastolického krvného tlaku (online automatické meranie hodnotené Haemosys počítačovým programom). Po 20 minútovej vyrovnávacej perióde boli intravenózne podané nasledujúce látky: noradrenalin, 5 pg/kg, i.v.; izoproterenol 0,4 pg/kg, i.v.; stimulácia n. vagus (2 V, trvanie: 500 psek, posun: 1 msek). Účinky látok boli zaznamenávané počas 10 minút.

Výsledky:

Autonómna neuropatia je jednou z hlavných pričiň spôsobujúcich náhle srdcové úmrtie u diabetikov a iných ochorení (napríklad ochorení pečene). Preto sú veľmi dôležité všetky látky, ktoré môžu účinne znižovať patologické odchýlky autonómnej neuropatie.

V pokusoch denná jedna dávka 20 mg/kg Bimoclomolu alebo Zlúčeniny A významne znižovala ťažké patologické odchýlky autonómneho neuropatologického pôvodu.

Tabuľka 4 zaznamenáva výsledky a porovnania.

Dve šipky v Tabuľke znamenajú, že testovaná látka je štatisticky viac účinná ako iná látka.

·· ·· ·· ·· ·· · • ·· · · ·· · · · · · ·* · · · · · ··· · · · · ····· · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ···

Tabulka 4

Diabetické zmeny	Bimoclomol	Zlúčenina A
Systemická arteriálna hypotenzia	ΐ	_n
Strata hmotnosti	Ť	ŤŤ
Hypertrofia ľavej srdcovej predsiene	Tt	t
Zníženie odpovede na Na indukovaný arteriálny tlak	Ť	Ťt
Zníženie IS indukovanej systémovej arteriálnej hypotenzie	t	-
Zníženie IS indukovaného pozitívneho chronotropného účinku	Ť	ŤŤ
Zvýšenie negatívneho chronotropného účinku na stimuláciu n. vagus	Ť	T
Zníženie hypotenzie po stimulácii n. vagus	Ť	ΐ

NA: noradrenalín Ť: úprava

IS: izoproterenol neúčinné

Pokus 4

Účinok 1-mesačného podávania zlúčeniny A a Bimoclomolu na patologické histologické zmeny vyvolané diabetickou retinopatiou u STZ-diabetických Wistar potkanov

Materiál a metódy:

V pokusoch boli použité potkany kmeňa Wistar, (Charles

• ·	• ·	··	• ·	• ·	•
• ·	• ·	• ·	• ·	• ·	• ·
•	··	• ·	• ·	• ·	•
•	• ·	• · ·	···	• · ·	•
•	• ·	• ·	•	• ·	•
····	··	··	··	··	• · ·

River Laboratories Inc.), samci s počiatočnou hmotnosťou 340 až 370 g. Diabetes bol vyvolaný intravenóznym podaním jednej dávky streptozotocinu (STZ, Sigma, St. Louis, MO) v dávke 45 mg/kg, ktorý bol rozpustený vo fyziologickom roztoku. Prítomnosť diabetu bola overená nasledujúci deň stanovením glukózy v krvi, akceptované boli hodnoty vyššie ako 15 mmol/1.

Skúšané a kontrolné látky boli podávané zvieratám per os jedenkrát denne.

Po anenstéze (Calypsovet, 125 mg/kg, intraperitoneálne, Richter Rt., Maďarsko), boli oči vylúpnuté a fixované v 4 % formaldehyde rozpustenom vo fosfátovom pufri (pH: 7,4).

Potom boli oči ponorené do parafínu (Medim DDM P800, Lignifer L-120-92-014, farbivo: Shandon Eliott, Microtome: Leica SM 2000 R, mikroskop: Jenaval Karí Zeiss, Jena, Nemecko). Pripravilo sa niekoľko rezov očí v hrúbke 6 mikrónov a ako farbivá sa použili hematoxilyn/eozin (Fluka) a PAS (kyslý Shiff, Fluka). Rezy sa hodnotili pod svetelným mikroskopom pri zväčšení 40x a lOOx. Z reprezentačných vzoriek boli urobené fotografie a diapozitívy.

Histologické hodnotenie sa uskutočnilo u označených vzoriek, označenie skupiny bolo neznáme pre histológa. Patologické odchýlky v retine boli označené stupnicou 0 až 20, kým zmeny na šošovke boli hodnotené stupnicou v rozsahu 0 až 3.

Pre štatistické hodnotenie bol použitý Statistica 4,5 (SatSoft, USA) program. Hodnota pre negatívne prípady bola 0,1. Bol vyhotovený Box a Whisker graf.

Pre každú skupinu v pokuse boli vypočítané priemerné hodnoty ± SE (štandardná chyba priemeru), a porovnanie medzi skupinami bolo uskutočnené pomocou neparametrického MannWhitney U-testu (Graphpad Instat, San Diego, CA).

• ·	··		• ·	··	• ·
• ·		•	• ·	• ·	• ·
•	• ·		• e	• ·	• ·
•	•	•	• · ·	···	• β ·
•	•	•	• ·	•	• ·
····	··		··	··	··

Výsledky:

Denné podávanie jednej dávky 5 mg/kg Zlúčeniny A a denné podávanie jednej dávky 20 mg/kg Bimoclomolu významne zlepšilo po 1 mesiaci diabetickú retinopatiu vyvolanú patologickými histologickými zmenami. Z týchto dvoch zlúčenín bola Zlúčenina A štatisticky viac účinná v porovnaní s diabetickými, neliečenými zvieratami. Výsledky sú uvedené v Tabuľke 5.

Tabuľka 5

Účinok podávania Zlúčeniny A a Bimoclomolu na patologické histologické zmeny spôsobené STZ diabetickou retinopatiou

skupina	HODNOTY
Priemer ± SE	Zlepšenie %
Kontrola	1,785+0,342	100
STZ diabetes	10,571±l,962
STZ diabetes+ 20 mg/kg Bimoclomolu	5,185±1,019*	61,3
STZ diabetes+ 5 mg/kg Zlúčenina A	4,028+0,961**	74,5

*p < 0,05, **p < 0.01, porovnanie voči diabetickým, neliečeným zvieratám.

Pokus 5

Účinok 1-mesačného podávania Zlúčeniny A a Bimoclomolu na patologickú stratu bielkovín močom spôsobenú diabetickou nefropatiou u STZ diabetických Wistar potkanov

Materiál a metódy:

V pokusoch boli použité potkany kmeňa Wistar, (Charles ·· ·· ·· • · · · • ·· • · · • · · ···· ·· ···· • · ·· • · ·· • ·· ··· • ·· ···· ·· •· •· • ·· •· ···

River Laboratories Inc.), samci s počiatočnou hmotnosťou 340 až 370 g. Diabetes bol vyvolaný intravenóznym podaním jednej dávky streptozotocinu (STZ, Sigma, St. Louis, MO) v dávke 45 b mg/kg, ktorý bol rozpustený vo fyziologickom roztoku. Prítomnosť diabetu bola overená nasledujúci deň stanovením glukózy v krvi, akceptované boli hodnoty vyššie ako 15 mmol/1.

Testované a kontrolné látky boli podávané zvieratám per os jedenkrát denne.

Zbieranie 24 hodinového moča bolo uskutočnené tak, že zvieratá boli umiestnené jednotlivo do metabolických klietok. Zvieratá príjmali vodu ad libitum, ale neprijmali potravu. Deprivácia potravy bola potrebná aby sa tým predišlo možnej kontaminácii obsahom proteínov v potrave. Moč bol zbieraný do kalibrovaných nádobiek, do ktorých boli pridané kryštály Tymolu (Reanal 3135-1-08-38), aby sa tak zabránilo bakteriálnej kontaminácii.

Pred meraním bol moč centrifugovaný (2 500 rpm) a prefiltrovaný cez filtračný papier (Whatman 1). V prípade potreby boli vzorky moča uskladnené pri -20 °C až kým neboli analyzované.

Celkový obsah proteínov bol stanovený kolorimetrickou metódou podľa Bradforda (Sigma B-6916, St. Louis, MO) a intenzita zafarbenia bola hodnotená spektrofotometricky (Hitachi-U-3200).

• Výsledky:

Bimoclomol, podávaný denne v jednej dávke 20 mg/kg, významne znížil stratu proteínov v moči, ktorá bola zvýšená u STZ-diabetických potkanov. Zlúčenina A, podávaná denne v jednej dávke 10 mg/kg, štatisticky nevýznamné znížila stratu proteínov. Avšak (+) enantiomér Zlúčeniny A, podávaný denne v jednej dávke 5 mg/kg významne znížil diabetickú stratu proteínov. Výsledky sú uvedené v Tabuľke 6.

		··	··	·· ··	•
	• ·	• · · ·	• · · ·	• ·
	•	··	• ·	• · 0 ·	•
16	•	• * e · ·	··· · · ·	•
•	• · ··	• · ··	• · · ·· ·«	• ···

Tabulka 6

Účinok podávania (+) enantioméru Zlúčeniny A a Bimoclomolu na stratu proteínov močom spôsobenú diabetickou nefropatiou u STZ-diabetických Wistar potkanov

Skupina	24-hodinová strata proteínov močom (mg/24 h) Priemer ± SE
1. STZ-diabetes	8,302 ± 2,40
STZ-diabetes + Bimoclomol, 20 mg/kg	3,66 ± 1,39* *p < 0.05
2. STZ-diabetes	13,03 ±2,63
STZ-diabetes + Zlúčenina A, 10 mg/kg	12,06 ± 1,70
STZ-diabetes 4- (+) enantiomér Zlúčeniny A, 5 mg/kg	5,61 ± 1,08* *p < 0,02

Pokus 6

Účinok 1-mesačného podávania Zlúčeniny A a jej (+) a (-) enantiomérov na patologické zmeny periférnej neuropatie u STZ diabetických Wistar potkanoch

Materiál a metódy:

Pokusné zvieratá a všetky použité metódy sú rovnaké ako bolo popísané v Pokuse 2.

Výsledky:

Zlúčenina podávaná denne v jednej dávke 10 mg/kg a

Zlúčenina A(+) podávaná denne v jednej dávke 5 mg/mg boli ·· rovnako účinné a významne zvýšili motorickú aktivitu (MNCV) a rýchlosť senzorickej vodivosti nervov u diabetických zvierat. Naproti tomu Zlúčenina A(-) nevykazovala významné zlepšenie na žiaden zo sledovaných parametrov. Výsledky sú uvedené v Tabuľke 7.

Tabulka 7

Účinky Zlúčeniny A a jej A(+) a A(-) enantiomérov na zníženú rýchlosť vodivosti nervov (NCV) u STZ diabetických Wistar potkanov

Skupina	Rýchlosť vodivosti nervov
MNCV	SNCV
m/s	zlepšenie %	m/s	zlepšenie %
Kontroly	62,7 ±	0,4	64,9 ±	0,7
STZ-DB kontroly	46,9 ±	0,9	48,4 ±	1,0
STZ-DB + Zlúčenina A
10 mg/kg	59,3 ±	0,3*** 78,9	61,4 ±	0,7*** 79,2
STZ-DB + Zlúčenina A
(+)·, 5 mg/kg	58,1 ±	0,5*** 71,3	59,7 +	0,5*** 68,5
STZ-DB + A(-)
5 mg/kg	53,1 ±	0,7*** 39,4	54,1 ±	0,9*** 34,9

*** p <0,001 oproti neliečeným STZ-diabetickým zvieratám

Pokus 7

Účinky 2-mesačného podávania zlúčeniny A a jej A(+) a A(-) enantiomérov na patologicko histologické zmeny diabetickej retinopatie u STZ diabetických potkanov ··

Materiál a metódy:

Pokusné zvieratá a všetky použité metódy sú rovnaké ako bolo popísané v Pokuse 4.

Výsledky:

Po dvoch mesiacoch podávania A( + ) enantioméru v jednej dennej dávke 5 mg/kg sa významne zlepšili lentikulárne a aj retinálne histologické zmeny spôsobené diabetickou retinopatiou, kým účinok Zlúčeniny A v jednej dennej dávke 10 mg/kg nemal významné účinky a A (-) enantiomér v jednej dennej dávke 5 mg/kg nevykazoval účinok. Čo sa týka histologických zmien na retine, Zlúčenina A a jej A( + ) enantiomér boli účinné a účinok A(-) enantioméru nebol štatisticky významný.

• Výsledky sú uvedené v Tabuľke 8.

Tabuľka 8

Účinky Zlúčeniny A a jej A(+) a A(-) enantiomérov na histologické zmeny diabetickej retinopatie u STZ diabetických potkanov

Skupina	Hodnotenie
	lentikulárne+retinálne	retinálne
	priemer+SE	zlepšenie%	priemeriSE	zlepšenie%
kontroly	0,56 ± 0,36	100	0,46 ± 0,36	100
STZ-DB	6,69 ± 0,76		4,38 ± 0,68
STZ-DB+A 10 mg/kg	4,55 ± 0,69	34,7	1,80±0,75*	65,8
STZ-DB+A(+) 5 mg/kg	4,05 + 0,8*	42,9	1,68±0,63**	68,9
STZ-DB+A(-) 5 mg/kg	6,02 ± 1,09	10,3	3,53±1,07	21,7

*ρ < 0,05 v porovnaní s neliečenými diabetickými zvieratami **p < 0,01 v porovnaní s neliečenými diabetickými zvieratami

Pokus 8

Účinky A(+) a A(-) enantiomérov na in vivo vychytávanie glukózy stimulované inzulínom u zvierat s inzulínovou rezistenciou vyvolanou u zvierat diétou

Materiál a metódy:

V pokusoch boli použité potkany kmeňa Wistar (Charles River Inc.), samce, s počiatočnou hmotnosťou 300 až 350 g.

Inzulínová rezistencia bola navodená zmenou diétneho režimu: zvieratá príjmali vysokotukovú diétu (HF) v priebehu 3 týždňov. Vo vysokotukovej diéte prevládali nasýtené tuky a predstavovali 70 % celkového denného kalorického príjmu. A( + ) a A(-) enantioméry boli podávané denne v dávke 20 mg/kg/deň.

Na konci troch týždňov podávania boli vyhodnotené nasledujúce parametre: 1. hodnoty cukrov a lipidov v sére a 2. in vivo inzulin-stimulované vychytávanie glukózy metódou euglykemického glukózového zámku, ktorá je bežne považovaná za najpresnejšiu metódu pre kvantitatívne hodnotenie vychytávania glukózy (DeFronzo a spol., Američan Journal of Physiology, 1979/237/E214-233). V krátkosti: koncentrácia glukózy na lačno u zvierat z rôznych skupín musí byť rovnaká. Pokusy boli realizované na bdelých zvieratách s voľným pohybom a s chronickou kanylou: najprv bola zahájená infúzia inzulínu (6,4 mU/kg/min), po ktorej nasledovala a kontinuálna infúzia glukózy tak, aby sa zachovali koncentrácie glukózy v krvi v euglykemických hodnotách. Po stabilizácii bolo hodnotené množstvo infundovanej glukózy v priebehu 90 minút (rýchlosť glukózovej infúzie = GIR, mg/kg/min), čo je kvantitatívnym vyjadrením citlivosti na inzulín.

·· ·· ·*

Výsledky:

A(+) a A(-) enantioméry podávané v jednej dennej dávke 20 mg/kg/min neovplyvnili telesnú hmotnosť a príjem potravy a hladiny krvnej glukózy na lacno.

Naproti tomu obe zlúčeniny normalizovali zvýšené hladiny inzulínu a koncentráciu triglyceridov vyvolané príjmom vysokotukovej diéty a rovnako významne znížili obsah triglyceridov vo svaloch. Skúška pomocou euglykemického glukózového zámku ukázala, že vysokotuková diéta významne znížila inzu‘ línom stimulované vychytávanie glukózy: kontroly: 26,7 ± 0,68 mg/kg/min, HF diéta: 15,0 ± 0,39 mg/kg/min.

Takéto zníženie inzulínom stimulovaného vychytávania glukózy je zvýšené podávaním oboch enantiomérov: HF+A(+): 20,5±0,89 mg/kg/min a HF+A(-): 19,7 ±1,38 mg/kg/min (významné zvýšenie v oboch prípadoch je na úrovni p < 0,01).

Podía týchto výsledkov oba enantioméry zvýšili vychytávanie glukózy stimulované inzulínom, čím zlepšili inzulínovú rezistenciu.

Pokus 9 * Antidiabetická aktivita chronického podávania A(+) enantioméru u Zucker Diabetic Fatty potkanov

Materiál a metódy:

Zvolil sa genetický model diabetu zvierat a v pokusoch boli použité Zucker Diabetic Fatty (ZDF) potkany. Tento model je diabetickým modelom inzulínovej rezistencie obéznych, nediabetických Zucker fa/fa zvierat (pozri Pokus 1) . U ZDF potkanoch sa vyvinul diabetes vo veku 6 až 8 týždňov, ktorému predchádzala prítomnosť inzulínovej rezistencie.

• e		··		··	99	99	•
• ·	•		•	9	9	9 9	9	•	99
•		• ·		9 ·	9 9	9	•	9
•	•		• ·	• 9	999 ·	• ·	9
•	•		•	9	9	•	• ·	9
····		··		99	99	··	999

Hodnotil sa účinok A(+) enantioméru po podávaní množstva 2 x 20 mg/kg/deň počínajúc v nediabetickej fáze a vo veku 7 týždňov; podávanie pokračovalo nasledujúcich 6 týždňov.

Klinické parametre boli stanovené štandardnými metódami. Koncentrácie inzulínu v sére boli merané nedávno vyvinutou metódou (ELISA, DRG International, Inc., USA).

Výsledky:

V týchto pokusoch sa získal nový výsledok, že A(+) anantiomér má silnú antidiabetickú aktivitu u diabetických zvierat.

Výsledky dosiahnuté po 3 a 5 mesiacoch podávania sú . uvedené v Tabuľke 9.

Tabuľka 9

Koncentrácie glukózy v sére (mmol/1), nasýtený stav

Skupina	3 týždne	5 týždňov
Kontroly	6,23 ± 0,08	5,87 ± 0,08
ZDF	18,56 ± 1,94	21,28 ± 1,65
ZDF+A(+) 2x20 mg/kg	10,82 ± 1,36*	13,25 ± 0,76**

*p < 0,02, **p < 0,005 porovnanie voči neliečeným ZDF zvieratám

Hoci podávanie A(+) enantioméru neupravovalo koncentráciu glukózy v krvi, kombinované účinky silnej antidiabetickej • · aktivity a už v minulosti známej liečivej účinnosti na komplikácie chronického diabetu, dávajú tejto zlúčenine výnimočné vlastnosti.

Na základe nového kombinovaného účinku môže byť významne rozšírená terapeutická indikačná skupina pre používanie A (+) enantioméru.

Ďalšie pokusy viedli k záveru, že zlúčeniny podlá vynálezu, okrem ich účinkov na patologické komplikácie diabetu, sú vhodné pre liečenie poškodených periférnych nervov spôsobené diabetom. Tento záver je podporovaný výsledkami v nasledujúcom pokuse zameranom na regeneráciu nervov.

Pokus 10

Terapeutický účinok Zlúčeniny A a jej A(+) enantioméru na regeneráciu nervov u STZ-diabetických Wistar potkanov

Materiál a metódy:

V pokusoch sa použili Wistar potkany telesnej hmotnosti 320 až 350 g. Diabetes bol indukovaný a skontrolovaný tak, ako je popísané v Príklade 2. U pokusných diabetických zvierat (diabetes trval 3 týždne) bol poškodený lavý ischiadický nerv mrazením, nerv na pravej strane bol použitý ako nepoškodená kontrola. Pozorovaná regenerácia sa hodnotila zaznamenávaním signálov flexor reflexov vyvolaných dráždením predného tibiálneho nervu, a ktorá bola vyjadrená plochou pod krivkou (AUC) elektromyogramu. Pre stimuláciu a hodnotenie bol použitý systém popísaný v Pokuse 2.

Jedna dávka denne 10 mg/kg Zlúčeniny A a 5 mg/kg A(+) enantioméru bola podávaná počas 5 týždňov po poranení mrazením.

Výsledky:

Na konci 3-týždne trvajúceho diabetu, pred poranením mrazom, sa vyvinula senzorická neuropatia a spôsobila 23 až 25 % pokles AUC na oboch nohách. Po 2 týždňoch od poranenia mrazom sa nepozorovala žiadna odpoveď. V piatom týždni bola prítomná neuroregenerácia v rozsahu 63 %. Regenerácia bola zvýšená na 73 % podávaním Zlúčeniny A, A(+) enantiomér mal účinnosť až 93 %. Ako výsledok podávania A(+) enantioméru sa pozorovala 83 % neuroregeneráci a len 44 % regenerácia nervov po podávaní Zlúčeniny A u zvierat nepoškodených mrazením. Znamená to, že A(+) enantiomér má silný neuroprotektívny účinok.

N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid3-karboximidoyl chlorid môže byť pripravený nasledovným postupom, ktorý dosiaľ nie je známy.

Podľa oxidačného postupu popísaného v WO 97/16349, derivát oxidovaný na atóme dusíka v oboch kruhoch, alebo tiež menším množstvom reagentu, derivát oxidovaný na alicyklickom kruhu môže byť pripravený z chloridu 0-(3-piperidino-2hydroxy-l-propyl)-3-pyridín hydroxymovej kyseliny, keďže atóm alicyklického dusíka je prednostne oxidovaný. Výber miesta oxidácie má byť taký, aby bol nasmerovaný na pyridínový kruh pre tvorbu zlúčeniny podľa vynálezu, preto bol postup modifikovaný. Hlavným bodom modifikácie je uľahčenie selektívnej oxidácie pyridínového kruhu Oxidácia peroctovej kyseliny sa uskutoční v prítomnosti silnej kyseliny, výhodne metansulfónovej kyseliny, ktorá protonuje alicyklický dusík a tým zabraňuje jeho oxidácii; preto sa stáva oxidácia pyridinu primárnou. Ako oxidačné činidlo môže byť použitá akákoľvek perkyselina, výhodne kyselina peroctová.

Opticky aktívne enantioméry zlúčeniny podľa vynálezu sa pripravia použitím vhodného opticky aktívneho enantioméru ·· ·· ·· • · · · · · • ·· · · • · · · · · • · · · · ···· ·· ·· ·· ··

• ·	• ·	• ·
• ·	• ·	•
···	• · ·	•
•	• ·	•
··	··	·· ·

chloridu 0-(3-piperidino-2-hydroxy-l-propyl)-3-pyridín hydroximovej kyseliny ako východzieho materiálu, ktorý môže byť pripravený, napríklad, podía EP 0 417 210 BI, rozpustením racemickej zlúčeniny. V priebehu reakcie nie je poškodená chirálna vlastnosť a výsledný výrobok má rovnakú optickú čistotu ako východzia látka.

Keď je potrebné, získaný chlorid N-[2-hydroxy-3-(1piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu, alebo jeden z jeho opticky aktívnych enatiomérov, môžu byť známymi spôsobmi premenené na adičnú kyslú sol pomocou minerálnej alebo organickej kyseliny.

N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridin-l-oxid3-karboximidoyl chlorid, jeho opticky aktívny (+) alebo (-) enantiomér, zmes enantiomérov v akomkoľvek pomere, a racemická zlúčenina, ďalej adičné soli kyseliny vytvorené s ktoroukolvek vyššie uvedenou zlúčeninou s minerálnou alebo organickou kyselinou, predstavujú predmet predkladaného vynálezu. Predmetom vynálezu sú všetky možné geometrické izomérne formy chloridu N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]‘ pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu. Výraz „stereoizoméry chloridu N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid3-karboximidoylu sa týkajú všetkých možných optických a geometrických izomérov zlúčeniny.

Podía vynálezu sa tieto zlúčeniny používajú pre liečenie patologickej inzulínovej rezistencie a pre liečenie a prevenciu patologických stavov spojených s inzulínovou rezistenciou.

Výhoda uskutočnenia predkladaného vynálezu je v tom, že zlúčeniny sa používajú pre simultánne liečenie alebo prevenciu chronickým diabetom navodených komplikácií, predovšetkým neuropatie a nefropatie, a patologickej inzulínovej rezistencie a tiež patologických stavov spojených s inzulínovou rezistenciou.

·· ·· ·· ·· ·· ··· · · · · · • ·· · · · · ·

····

Podlá výhodného uskutočnenia vynálezu chlorid N—[2—— hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu, alebo jeho stereoizoméry alebo adičné soli kyselín sa používajú pre liečenie patologickej inzulínovej rezistencie a s ňou spojených patologických stavov, súčasne sa zvyšuje diabetom indukovaný patologický pokles periférnej neuroregenerácie.

Zlúčeniny podlá vynálezu môžu byť použité pre liečenie ľudí aj zvierat.

Predmet vynálezu preto zahrňuje spôsob liečenia patologickej inzulínovej rezistencie, liečenie a prevenciu patolo• gických stavov spojených s inzulínovou rezistenciou, keď je pacientom podávaný chlorid N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu, alebo jeden z jeho stereoizomérov vo forme zásady alebo adičnej soli kyseliny. Výhodné uskutočnenie postupu podlá vynálezu je, keď chlorid N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridin-l-oxid-3-karboximidoylu alebo jeden z jeho streoizomérov, alebo jeho adičnej sú tiež soli s kyselinou, je podávaný pacientovi s diabetickou retinopatiou, neuropatiou alebo nefropatiou.

Podlá iného špecifického uskutočnenia vynálezu je chlorid N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridin-l-ozid-3_k karboximidoylu, alebo jeden z jeho stereoizomérov, alebo jeho adičná sol kyseliny, podávaná pacientovi v prípade patologického poklesu neuroregenerácie spôsobenej diabetom.

Dávka zlúčenín závisí na stave a chorobe pacienta, denná dávka je 0,1 až 400 mg/kg, výhodne 0,1 až 100 mg/kg. V ľudskej terapii, je orálna dávka výhodne 10 až 300 mg, v prípade rektálneho podávania 1 až 15 mg, kým pri parenterálnom podaní je to dávka 1 až 15 mg pre dospelého pacienta.

·· ·· ·· ·· ···· · · ·· • ·· · · ·· • · · · · · ···· • · · ·· · ···· ·· ·· ··

Tieto dávky sú výhodne podávané vo forme jednej dávky, ktorá môže byť v niektorých prípadoch rozdelená do 2 až 3 menších dávok cez deň, predovšetkým pri podávaní per os.

Výhodne sa používa stereoizomér racemickej zlúčeniny, najvýhodnejšie (+) enantiomér. V tomto prípade je pre liečenie dostatočné menšie množstvo aktívnej zložky.

Predmetom vynálezu sú tiež farmaceutické prípravky vhodné pre liečenie. Tieto farmaceutické kompozície, okrem bežných doplnkových látok a nosičov obsahujú ako aktívnu zložku obsahujú chlorid N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu alebo jeden z jeho stereoizomérov, alebo niektorú jeho adičnú soľ kyseliny.

Farmaceutické kompozície podľa vynálezu môžu byť pripravené vo forme pevných alebo kvapalných prípravkov používaných pri liečení ľudí a zvierat. Môžu byť pripravené potiahnuté tablety, granuly, kapsule, roztoky alebo sirupy, čipky pre rektálne podávanie, a pre parenterálne podanie lyofilizované alebo nelyofilizované injekcie alebo infúzne roztoky, ktoré môžu byť pripravené bežnými spôsobmi. Výrobky pre perorálne používanie môžu obsahovať plnivá ako mikrokryštalická celulóza, škrob alebo laktóza; mazivá, ako kyselina steárová alebo stearát horečnatý; pokrývači materiál, ako cukor; film vytvárajúci materiál, ako hydroxymetylcelulóza; sladidlá a vonné látky, ako metylparabén alebo sacharín, alebo farbiace látky. Čipky môžu obsahovať kakaové maslo alebo polyetylénglykol. Parenterálne výrobky môžu obsahovať, okrem účinnej látky, soľný roztok, alebo v niektorých prípadoch dispergačné látky, ako je propylénglykol.

Vynález je ďalej znázornený nasledovnými príkladmi.

·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · · · · ··· ···· · · • · · · · · ··· · · · ····· ··· ···· ·· ·· ·· ·· ·

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava chlorid N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu (Z)-2-butendioat (1:1)

40,4 g (0,136 mol) N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-pyridin-karboximidoyl chloridu bolo rozpustených v zmesi 238 ml ladovej kyseliny octovej a 13,0 g (0,136 mol) kyseliny metansulfónovej. Pridalo sa 61,5 ml (0,591 mol) 30 % peroxidu vodíka pri teplote 60 °C. Reakčná zmes bola miešaná pri teplote 60 °C počas 3,5 až 4 hodín. Roztok bol ochladený na 10 °C a potom bolo pridaných 91 ml roztoku 0,5 M Na₂S₂O₅. Z roztoku bolo oddestilovaných 315 ml zmesi voda-kyselina octová, do ktorej bolo pridaných 250 ml 4 N NaOH, aby pH roztoku bolo 10,55. Potom nasledovalo pretrepávanie s chloroformom. Chloroformová fáza bola premytá vodou, vysušená, pridalo sa čierne uhlie a chloroform bol odparený. K zvyšku bola pridaná voda, roztok bol extrahovaný izopropyl éterom a potom chloroformom. Chloroformová fáza bola vysušená, pridalo sa čierne uhlie, potom bola prefiltrovaná a odparená. Zvyšok bol rozpustený v acetóne a premenený na soľ pôsobením kyseliny maleinovej. Zrazenina bola prefiltrovaná, premytá

acetónom a vysušená, z vriaceho etanolu.	Výsledný	produkt	bol	kryštalizovaný
Výťažok: 20 g (35%)
Bod topenia: 150,5 až	154,5 °C
¹H-NMR (rozpúšťadlo:	DMSO; porovnanie:	DMSO;	v = 300	MHz)
[ppm]: 8,55 (s, 1H, 2-	-pyridín);	8,35 (d,	1H, 6-	-pyridín);	7,68

(d, 1H, 4-pyridin) ; 7,55 (m, 1H, 5-pyridín) ; 6,00 (s, 2H,

CH=CH); 4,23-4,48 (m, 3H, CH-OH a NOCH₂) ; 2,95-3,50 (m, 6H, 3 x NCH₂) ; 1,20-1, 90 (m, 6H, piperidín: 3 x CH₂) .

·· ·· ·· • ·· · • · · · · ·· ·· • · • · • · · · ···· ·· ·· ¹³C-NMR (rozpúšťadlo: DMSO; porovnanie: DMSO; v = 300 MHz) [ppm]: 167,6 (2C, 2COOH); 141,0 (2-pyridín); 136,8 (6pyridin); 136,4 (2C, CH=CH); 133,4 (CC1) ; 131,9 (3-pyridín); 127,2 (4-pyridín); 123,6 (5-pyridin); 77,96 (NOCH₂) ; 63,6 (CH₂N) ; 58,3 (CHOH); 52,0-55, 0 (2C, pyridin: 2 x NCH₂) ; 22,6 a 21,7 (3C, pyridin: 3 x CH₂) .

Príklad 2

Príprava chloridu (+)-/R/-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu (Z)-2-butendiolátu (1:1)

Zopakoval sa postup popísaný v Príklade 1 s tým rozdielom, že namiesto racemického chloridu N-[2-hydroxy-3(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridin karboximidoylu bol použitý jeho R enantiomér. Čistá forma bola izolovaná kryštalizáciou z hexánu surovej zásady.

Výťažok: 31 %

Bod topenia: 91 až 93 °C

IR (KBr, cm^-1): 3167 (br); 2840; 2710; 1575; 1560; 1480; 1443 (br); 1293 (s); 1279 (s); 1093; 1053; 1043; 1023 (s); 834 (s); 810; 688

Podlá potreby môže byť tiež pripravená sol maleinanu zo surovej bázy v acetónovom roztoku, ako je popísané v Príklade 1.

Výťažok: 33 %

Bod topenia: 132,0 až 133,0 °C

Pomer enantiomérov: 98/2 (HPLC meranie na Chiral AGP 100 x 4 mm kolóne).

^-NMR a ¹³C-NMR: rovnaké ako spektrum racemickej zlúčeniny.

··

Príklad 3

Príprava chloridu (-)-/S/-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu (Z)-2-butendioátu (1:1)

Použil sa postup z Príkladu 1 s tým rozdielom, že namiesto racemického chloridu N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-3-pyridin-karboximidoylu bol použitý S enantiomér.

Výťažok: 34 %

Bod topenia: 132,0 - 133,0 °C

Pomer enantiomérov: 98/2 (HPLC meranie na Chiral AGP 100 x 4 mm kolóne).

¹H-NMR a ¹³C-NMR: rovnaké ako spektrum racemick.ej zlúčeniny.

Príklad 4

Tableta (+)-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-

-karboximidoyl chlorid	20,0 mg
kukuričný škrob	100,0 mg
laktóza	95,0 mg
talok	4,5 mg
stearát horečnatý	0,5 mg

Jemne pomletá aktívna zložka bola zmiešaná s doplnkovým materiálom, zmes bola homogenizovaná a granulovaná. Granulát bol potom zlisovaný do tabliet.

• ·

Príklad 5
Kapsule
(+)-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-
-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-
-karboximidoyl chlorid maleinan	20, 0	mg
mikrokryštalická celulóza	99, 0	mg
amorfný oxid kremičitý	1, o	mg

h*

Aktívna zložka bola zmiešaná s doplnkovým materiálom, zmes bola homogenizovaná a naplnená do želatínových toboliek.

Príklad 6

Dražé

N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridin-l-oxid-3-

-karboximidoyl chlorid maleinan	25,0 mg
laktóza	82,5 mg
zemiakový škrob	33,0 mg
polyvinylpyrolidon	4,0 mg
stearát horečnatý	0,5 mg

Aktivna zložka a polyvinyl pyrolidon boli rozpustené v etanole. Zmes laktózy a zemiakového škrobu boli navlhčené granulačným roztokom aktívnej zložky. Po prefiltrovaní bol granulát vysušený pri 50 °C. Pridal sa stearát horečnatý a zmes bola lisovaná za tvorby tabliet, ktoré boli potom pokryté cukrovou vrstvou a vyleštené pridaním včelieho vosku.

··

Príklad 7
	^čiP^ky (+)-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoyl chlorid	4,0	mg
A	kakaové maslo	3, 5	g
	pevný tuk 50 hmota pre čipky	15, 0	g

Kakaové maslo a čipková hmota boli zahriate na 40 °C.

Aktívna zložka bola dispergovaná v roztopenej zmesi, potom bola zmes naplnená do tvárnic pre čipky.

Príklad 8

Roztok (+)-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoyl chlorid hydrochlorid sorbitol sacharín sodný redestilovaná voda

q.s. ad

Príklad 9

Injekcie ( + )-N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl) -propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoyl chlorid maleinan apyrogénny fyziologický roztok, sterilný

500,0 mg

10, 0 g

0,05 g

100 ml mg

q.s.ad 2,0 ml

Roztok bol naliaty do dvoch ampuliek a potom boli ampule zatavené.

·· ·· ·· β · · ·· • ·· · • ·· · · • ·· · ···· ·· ·· ·· ·· • · e · ·· • · · ·· • ··· ·· • · · • ·· ·

Príklad 10

Infúzny roztok

Bolo pripravených 500 ml infúzneho roztoku s obsahom:

N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoyl chlorid maleinan 20,0 mg apyrogénny fyziologický roztok, sterilný q.s ad 500 ml

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Chlorid N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]• pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu, jeho stereoizoméry a jeho adičné kyslé soli.
2. Použitie chloridu N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu, jeho stereoizomérov a jeho kyslých adičných solí, pre liečenie patologickej inzulínovej rezistencie a pre liečenie patologických stavov spojených s inzulínovou rezistenciou.
3. Použitie chloridu N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)propoxy]-pyridin-l-oxid-3-karboximidoylu, jeho stereoizomérov _v a jeho kyslých adičných solí, pre liečenie patologickej inzulínovej rezistencie a pre liečenie patologických stavov spojených s inzulínovou rezistenciou, simultánnym liečením a prevenciou chronickým diabetom navodených komplikácii, predovšetkým retinopatie, neuropatie a nefropatie a/alebo simultánnym znížením patologicky zníženej neuroregenerácie spôsobenej diabetom.
4. Spôsob liečenia patologickej inzulínovej rezistencie a patologických stavov spojených s inzulínovou rezistenciou, vyznačujúci sa tým, že pacientovi je podávaný chlorid N-[2-hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]pyridin-l-oxid-3-karboximidoylu alebo jeden z jeho stereoizomérov vo forme zásaditej alebo kyslej soli.
5. Spôsob podľa nároku 4, vyznačujúci sa tým, že pacientovi s diabetickou retinopatiou, neuropatiou a/alebo nefropatiou je podávaný chlorid N-[2-hydroxy-3-(1piperidinyl)-propoxy]-pyridín-l-oxid-3-karboximidoylu alebo jeden z jeho stereoizomérov vo forme zásaditej alebo kyslej soli.

·· ·· ·« ·· ·· • • · • · • · • · • · ·· • ·· • · • · • · • • • · · • · ··· • · · • o • · • · • • · • • o·· ·· ·· ·· ·· ···
6. Spôsob podľa nároku 4,vyznač ujúci sa tým, že pacientovi s patologicky zníženou neuroregeneráciou spôsobenou diabetom je podávaný chlorid N-[2-hydroxy-3-(1piperidinyl)-propoxy]-pyridin-l-oxid-3-karboximidoylu alebo jeden z jeho stereoizomérov vo forme zásaditej alebo kyslej soli.
7. Farmaceutická kompozícia obsahujúca chlorid N—[2 — hydroxy-3-(1-piperidinyl)-propoxy]-pyridin-l-oxid-3-karboximidoylu alebo jeden z jeho stereoizomérov, alebo kyslú adičnú soľ ako aktívnu zložku v zmesi najmenej jednej farmaceutický prijateľnej doplnkovej zložky a všeobecne používaného nosiča.