RS60301B1

RS60301B1 - Kombinacija protiv regurgitacije za održavanje motiliteta creva

Info

Publication number: RS60301B1
Application number: RS20200569A
Authority: RS
Inventors: Jonathan Albert Margossian; Nicolas Pradeau
Original assignee: United Pharmaceuticals Sa
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2014-05-07
Publication date: 2020-07-31
Also published as: BR112015027976A2; CY1120718T1; EP3421092A1; ZA201508156B; CA2911086A1; RS57834B1; BR112015027976B1; ES2689135T3; JP2016522823A; SI3421092T1; US9642391B1; SI2999357T1; DK2999357T3; MX379151B; EP2999357A1; PL3421092T3; US9554587B2; ES2795668T3; CN105246356A; PH12015502543B1

Description

N-/2-HIDROKSI-3- (1-PIPERIDINIL) PR0P0KSI/PIRIDIN-1-0KSID-3-KARBOKSIIMIDOIL HLORID I NJEGOVA UPOTREBA U TRETIRANJU

INSULINSKE REZISTENCIJE

Halogenidni derivat 0-(3-piperidino-2-hiđroksi-1-propil) hidroksamske kiseline, njegova primena u tretiranju insulinske rezistencije, i farmaceutski preparat koji sadrži ov-aj derivat kao efikasno sredstvo

Tehnička oblast pronalaska

Pronalazak se odnosi na halogenidni derivat 0-(3-piperidin .-2-hiđroksi-l-propil) hidroksamske kiseline, njegovu farmaceutsku upotrebu i farmaceutske proizvode koji sadrže ovaj derivat kao aktivnu komponentu. Naime, pronalazak se odnosi na N-/2-hidroksi-3r-Cl-piperidinil)-propoksi/piridin^l-oksid-3*-karboksiimiđoil hloriđ, njegove stereoizomere, kao i na njegove adicione soli sa kiselinama. Osim toga, pronalazak se takodje odnosi na upotrebu ovih jedinjenja u tretiranju insulinske rezistencije i na farmaceutske proizvode koji sadrže ove derivate kao aktivnu komponentu. ;Osnova pronalaska ;Halogenidni derivati 0-(3-piperiđino-2-hiđroksi-1-propil) hidroksamske kiseline su već poznati iz Evropske ;Patentne Specifikacije No. 0 417 210 BI. Prema ovoj patentnoj specifikaciji, ova jedinjenja pokazuju selektivni beta blokirajuđi efekat i prema tome su pogodna za tretiranje đijabetične angiopatije, specifičnije dijabetične retinopatije i nefropatije. ;Prema PCT Publikaciji W0 98/06400, halogenidni derivati 0- (3^.piperidino-2-hidroksi-l-propil) hidroksamske kiseline i druga jedinjenja slične strukture su efikasna u zaštiti i regeneraciji vaskularnih endotelijalnih delija, ;i prema tome su pogodna aktivna sredstva za tretiranje bolesti izazvanih disfunkcijom endotelijuma. ;Efekat povećanja pratiočke ekspresije ("chaperon-expression increasing effect") nekoliko hidroksilamin derivata, medju ovima halogenida O- (3-piperidino^2r-hiđroksi-l^ propil) hidroksamske kiseline, i upotreba ovih jedinjenja u tretiranju bolesti povezanih sa funkcionisanjem pratioč-kog ("chaperon") sistema su poznati iz WO 97/16439. U ovoj patentnoj prijavi r 0^ C3^piperiđino^-2^hidroksi-lT-propil)-3-piridil hidroksamske kiseline hloridniN-oksidni derivati (izmeđju ostalih) su definisani i zastiđeni kao nova jedinjenja, medjutim, postupak proizvodnje je opisan samo za piperidin^N^-oksid i za jedinjenje koje sadrži N^-oksidne grupe i u piperidinskom i u piridinskom prstenu. Jedinjenje prema ovom pronalasku nije pomenuto u gornjoj prijavi. ;Insulinska rezistentnost je patološko stanje koje blokira efekte insulina. Ono je uglavnom vezano sa dijabetesom, mada je njegovo obrazovanje takodje moguće i nezavis-no. Usled insulinske rezistentnosti, telo ima potrebu za višim i sve višim koncentracijama insulina za metabolizam ugljenih hidrata, lipida i proteina, što dovodi do ekstremno visoke koncentracije insulina. Pokazano je da je dugotrajna visoka koncentracija insulina nezavisan kardio-cerebro-vaskularni rizični faktor. ;Smanjenje insulinske rezistencije je bitno u oba ;tipa dijabetesa: u slučaju dijabetesa tipa 2, ono je prisu- ;tno kao glavni etiološki faktor, dok je u slučaju dijabetesa tipa 1, insulinska rezistncija izazvana toksičnošđu glukoze kao i prekomernim količinama insulina primenjenih eksogeno za terapeutske svrhe. ;Nekoliko aktivnih sredstava je provereno za smanjenje insulinske rezistentnosti. Medju ovima, najznačajniji su insulinski senzibilizirajuđi proizvodi, najpoznatije sredst- ;vo otuda je troglitazon, član tiazolidin-dion grupe. ;(A.R.Saltiel i sarad., Diabetes 45/12/1996 str. 1661-1669, i S. Kumar i sarad., Diabetologia 1996/39/6 str. 707-709), ;Glavni efekat ovog jedinjenja je smanjenje insulinske rezisten^cije smanjenjem perifernih insulinskih. koncentracija i u osnovnom stanju i posle glukozne stimulacije. Kao rezultat, ono poboljša-va me±ab.olxzam ugljenih hidrata kao i koriguje niz patoloških devijac±ja koje se javljaju kao sekundarni efekat visokog insuli.nskog nivoa, kao što je hiperlipidemija i patološka hemostazija. Njegov krajnji pozitivan efekat je smanjenje kardiovaskularnog rizika. Nepogodnost je, međjutim, što može da izazove ozbiljne, uglavnom hepatotoksične sporedne efekte i stoga je njegova primena ograničena i zahteva posebnu pažnju. ;Pregled pronalaska ;Tokom proučavanja u oblasti halogeniđa 0-^ C3?-piperidino^ 2T-hiđroksiT-lT•propil) hidroksamske kiseline, izvršena su detaljna ispitivanja meleata hlorida 0-(3-piperidino-2-hidroksi-l-propil)-3-piridin hidroksamske kiseline, pozna-tog kao bimoklomol (."bimoclomol") i nadjeno je da je njegov najznačajniji efekat na patološkim konzekvencijama hronične neuropatije: Značajno poboljšava motornu i senzornu nervnu brzinu provodjenja deficijentnu kod dijabetesa, i takodje značajno utiđe na patološke devijacije koje se javljaju od autonomne neuropatije. Osim toge, i u eksperimentima na životinjama i fazi II testova kod ljudi, smanjuje patološko dijabetično urinarno albumin izlučiva-nje, i u testovima kod životinja smanjuje patološke histo-loške i elektrofiziološke promene koje se javljaju usled dijabetične retinopatije. Medjutim, u smanjenju insulinske rezistencije bimoklomol nije bio efikasan. ;Za sada, nisu dostupni medicinski proizvodi koji mogu da smanje insulinsku rezistenciju i istovremeno da efikasno izleče devijacije koje se javljaju iz sve tri hro^-nične dijabetične kompilacije. ;U traženju za pogodnom aktivnom materijalima, N-oksid derivati bimoklomola su testirani za biološku aktivnost. U preliminarnom testu proučavana je efikasnost tri N^-oksid. derivata bimoklomola na motornu i senzornu neuropatiju kod STZ dijabetičnih Wistar pacova, Efikasnost tri bimoklomolna N^oksid. derivata u poboljšavanju periferne motorne i senzorne nervne brzine provodjenja deficijentne izazvane sterptozotocin^indukovanim dijabetesom odredjena je postupkom detaljno opisanim u Eksperimentu 2. Rezultati su sumirani u sledeđoj tabeli, ;Kao što proizilazi iz gornjih rezultata, piridin N-oksid derivat Bimoklomola je ekvivalentan sa bimoklomo-lom dok ;j dva druga N-oksid derivata imaju značajno slabi^-ji efekat na motornu ± senzornu neuropatiju. Na osnovu ovog iskustva, istraživanja su nastavljena sa piridin N-oksid derivatom, naime sa N-/2-hidroksi-3-Cl-piperidinil) -1^-propoksi/piridin-l-oksid^karboksiimidoil hloridom. ;Naša istraživanja su dala neočekivani rezultat da N-/i:2^hidroksi^3- Cl-piperidinil) ^-propoksi/Vpiridin^-l^okšdid^ 3-kaboksiimidoil hlorid smanjuje periflernu insulinsku režis^-tentnost pored toga što pokazuje efekat jednak sa ili u nekim slučajevima veđi nego onaj bimoklomola u tretiranju gore pomenute tri glavne dijabetične - - 'komplikacije. ;S obzirom na ovu karakteristiku, jedinjenje je pogodno za tretiranje hronicnih dijabetičnih komplikacija, naročito retinopatije, neuropatije i nefropatije, i za simultano smanjenje periferne insulinske rezistencije, ali je tako- ;dje pogodno za tretiranje ne-dijabetične patološke insulinske rezistencije i bilo kojih patoloških stanja vezanih za ovo. ;Povoljne biološke osobine N-/2-hidroksi-3-Cl-piperidinil) -propok si/-pir idi n-1 -oksid-3-karboks i imido i 1 hlorida su potvrdjene pomoću sledeđih eksperimenata. Za ove testove upotrebijeni su maleat N-/2-hidroksi-3-Cl-pipe^ ridinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorida ili maleat pogodnog optički aktivnog jedinjenja kao test jedinjenja. u opisu eksperimenata, maleat racemskog jedinjenja naveden je kao Jedinjenje A, dok je maleat optički aktivnog stereoizomera uvek specifično naznačen. ;Eksperiment 1 ;Efekat tretiranja pcrnoću Jedinjenja A i Bimoklomola na metabolizam ugljenih hidrata kod gojaznih, insulin rezistentnih, hiper insulemičnih "Zucker fa/fa pacova" sa pogoršanom glukoznom tolerancijom, posle tretiranja u toku 2 meseca. ;Materijali i postupci ;U eksperimentima su upotrebljeni takozvani šećerni fa/fa pacovi ("Zucker fa/fa rats") (Charles River Laboratories Inc.). Kod monozigotičnih životinja,gojaznost, insulinska rezistencija, visoki nivo insulina u krvi, pogoršana glukozna tolerancija i hipertrigliceridemia nastaju od hipotalamične leptinske receptor mutacije, S obzirom na gornje karakteristike, ovo je prihvačeni model ranog tipe 2 dijabetesa . ;Životinje se stavljene u pojedinačne metaboličke kaveze u toku 24 sata na početku studije, i posle 1 ili 2 ;meseca tretiranja u toku 24 sata radi sakupljanja urina. ;Životinjama su davane ili test supstance ili fiziološki slani rastvor prinudnim uvodjenjem u stomak pomoću cevi jednom na dan izmedju nedelja 14-22. ;Biohemijski parametri krvi i urina su mereni pomo- ;ću Kodak Ectachem 700 automatskog analizatora. Nivo. ukup- ;nog proteina urina je odredjen spektrofotometrijski upotre-bom Bradford sredstva za bojenje (Hitachi U-3200) na 595 nm. Koncentracija insulina u serumu je odredjena pomoći RIA postupka, upotrebi java jući anti-insulin antitela pacova . ;Sistolični, dijastolični krvni pritisak i rad srca ;se mere jednom nedeljno na repovima pacova (takozvani postupak manžetne na repu) pomoću Letica 200 automatskog analizatora. Posle dva meseca tretiranja, odredjen je nivo glukozne tolerancije pomoću testa intraperitonealne glukozne tolerancije (2 g/kg) ip.). ;Rezultati: ;Bimoklomol primenjen u dnevnim dozama od 20 mg/kg p. os značajno smanjuje nivo glukoze u krvi kod životinja lišenih hrane, medjutim ne utiće na koncentraciju insulina kod životinje lišene hrane. U poredjenju sa prethodnim rezultatima, neočekivani rezultat je bio da Jedinjenje A primenjeno u dnevnim dozama od 20 mg/kg p.os značajno smanjuje iiiglukozu u krvi i kon- ? centracije insulina, ove poslednje za približno 50%, Rezultati su dati u Tabeli 1 i Slici 1. ;U toku testa intraperitonealne glukozne tolerancije, niti bimoklomol, niti Jedinjenje A utiđu na površine ispod krive glukoze u krvi (AUC). Medjutim , u slučaju AUC insulina postoji razlika izmedju dva jedinjenja: bimoklomol nije imao nikakav efekat, dok ga je Jedinjenje a značajno smanji^-lo, do istog nivoa kao kod mršave kontrole. Rezultati su dati u Tabeli 2 i Slici 2. ;Tabela sadrži vrednosti površine ispod krive (AUC) izmedju 0-60 minuta. ;Rezime: ;Jedinjenje A značajno smanjuje perifernu insulinsku reziš^tenciju, dok bimoklomol ne. ;Eksperiment 2 ;Efekat tretiranja pomoću Jedinjenja A:i Bimoklomola na patološke devijacije koje se javljaju od periferne neuropatije kod STZ dijabetičnih Wistar pacova, posle 1 meseca tretiranja. ;Materijali i postupci: ;U eksperimentima su upotrebljeni mužjaci Wistar pacova (Charles River Laboratories Inc.). Na početku eksperimenta, njihove težine su bile 340-370 g. Dijabetes je izazvan :><•»■' pomoću intravenske primene jedne 45 mg/kg doze streprozotocina (STZ, Sigma, St. Louis, MO) rastvorenog u fiziološkom slanom rastvoru. Razvoj dijabetesa je proveren posle 1 dana pomoću testa glukoze u krvi, prihvatajući vrednost preko 15 mmol/1. ;Test i referentne supstance se primenjuju p.os na životinje jednom dnevno. ;Za odredjivanje brzine nervne provodijivosti ;("nerve condustion velocitv") CNCV) u<p>otrebijen je postupah ;Stanley-a, modifikovan od strane De Konig-a i Gispen-a. Životinje su anestezirane pomoću simultane primene hiponorma ("Hvponorm) (1 mg/kg ip., Janssen, Tilburg, Danska) fluanisona (10 mg/ml), i fentanil citrata (0,2 mg/ml. Posle se, levi išijatikus i tibalni nervi stimu-lišu na standardnim tačkama. Supermaksimalni stimulus (kvadratni impuls, 0.03 ms) se upotrebljava sa platinskom elektrodom u obliku igle, preko Nihon-Kohden (model SEN-1104, Japan) stimulatora. Elektromiogram (EMG) prenet sa mišića tabana i intenziviran pomoću miografa (Elma-Schonander, Stokholm, Švedska) se dalje analizira pomoću Matlab za Windows (Mathwork Inc. UK) program. Stepen ;NCV oštećenja izazvanog dijabetesomje izražen u m/s. Efikasnost tretiranja je upotedjena sa ovim u oznakama procenta (%). Učinjena su statistička izračunavanja pomoću nesparenog t-testa/.i ili jednog-kriterijum ANOVA testa (zajedno sa Newman-Keuls post hoc testom). ;(Graphpad Instat, San Diego, CA) ;Rezultati: ;Bimoklomol primenjen jednom na dan u dozi od 20 mg/kg i Jedinjenje A primenjeno jednom na dan u dozi od 5 mg/kg značajno poboljšavaju motornu (MNGV) i senzornu (SNCV) brzinu nervne provodijivosti do istog značajnog stepena kod dijabetičnih životinja. Povećanje doze Jedinjenja A preko 10 mg/kg ne povećava efekat. Rezultati su dati uTabeli 3. ;Eksperiment 3 ;Efekat tretiranja pomoću Jedinjenja A i Bimoklomola na patološke, devijacije koji nastaju od dijabetične autonomne neuropatije kod STZ-dijabetičnih pacova, posle 1 meseca tretiranj a ;Materijali i postupci: ;U eksperimentima su apotrebljeni mužjaci VJ-jjstar pacova (Charles River Laboratories Inc.), na početku eksperimenta njihove težine su bile 340-370 g. Dijabetes je izazvan pomoću intravenske primene jedne doze od 45 mg/kg streptozotocina (STZ, Sigma, St. Louis, MO) rastvorenog u fiziološkom slanom rastvoru. Razvoji idi j abetesa je proveren posle 1 dana pomoću testa glukoze u krvi, prihva-tajući vrednost preko 15 mmola/1. ;Test i referentne supstance su primenjene p.os na životinje jednom na dan. ;Eksperimenti su izvedeni pod anestezijom postignu-tom primenom 60 mg/kg ip. pentobarbital natrijuma(Membutal, Sanofi, Phylaxia). Posle ovoga, intratarhealna tuba od poli-etilenske kanule je ubačena u fermoralnu arteriju i venu. Arterijski katetar je povezan sa transduktorom za pritisak za simultano merenje sistoličkog i diastoličkog krvnog pritiska Conlajn automatskog mernog i prosledjujućeg sistema, sa Haemosvs kompjuter programom) Posle 20 minuta od perioda uravnotežavanja, sledeće supstance se primenjuju intravenski: noradrenalin, 5 ;jg/kg iv. - izoproterenol 0.4p. g/ kgiv.*- N. vagus stimulacije (2 V, trajanje: 500 „i ;usec, kašnjenje 1 msec) . Efekti supstanci su beleženi u toku 10 minuta.

Rezultati:

Autonomna neuropatija je jedan od vodećih sluča-jeva iznenadne srčane smrti i u slučaju dijabetesa i u drugim bolestima (.na pr. bolesti jetre) Stoga su, svi proizvodi koji efikasno mogu da smanje patološke đevija^-cije nastale od autonomne neuropatije veoma važni.

U eksperimentima, dnevna jedna doza od 20 mg/kg bilo bimoklomola ili Jedinjenja A značajno smanjuje nekoliko patoloških devijacija nastalih od autonomne neu o-patij e.

Rezime i uporedjenje naših rezultata je prik ;zano u Tabeli 4.

Dvostruka strelica u Tabeli pokazuje da je test supstanca statistički efikasnija od one druge.

Eksperiment 4

Efekat tretiranja pomoću Jedinjenja A i Bimoklomola na patološke histološke promene izazvane ranom dijabetičnom retinopatijom kod STZ-đijabetičnih Wistar pacova, posle tretiranja 1 mesec

Materijali i postupci:

U eksperimentima su upotrebljeni mužjaci Wistar pacova (Charles River Laboratories Inc.), na početku eksperimen-

ta njihove težine su bile 340-370 g. Dijabetes je izazvan pomoću intravenske primene jedne doze od 45 mg/kg streptozotocina (STZ, Sigma, St. Louis, M6) rastvorenog u fizio^loškom slanom rastvoru. Razvoj dijabetesa je proveren poso-

le 1 dana pomoću testa glukoze u krvi, prihvatajući vrednost preko 15 mmola/1.

Test i referentne supstance su primenjene p.os na životinje jednom na dan.

Posle anestezijeCCalvpsovet, 125 mg/kg lp., Richter Rt., Madjarska) oči su izvadjene i fiksirane u 4% formalde-hidu rastvorenom u fosfatnom puferu CpH 7.4).

Docnije su one usadjene u parafin (Medim DDM, P800 , centar usadjivanja: Lignifer L-l20-92-014, sredstvo za bojenje: Shandon Eliott, Microtome: Leica SM 20.00. R, mikroskop: Jenaval Karl Zeiss Jena) Nekoliko sekcija očiju od 6; mikrona je pripremljeno, i upotrebljeno je hematoksilin/eozinCFluka)

i PAS (periodična kiselina^Schiff, Fluka) bojenje. Izvršeno je gvetlosno mikroskopsko odredjivanje na povećanju od 40x i 100x, Fotografije i slajd pozitivi su dobijeni sa reprezenta-tivnim uzorcima.

Histološko odredjivanje je izvršeno na kodiranim uzorcima, podela grupe je bila nepoznata istraživaču. Pato-loške devijacije retine su klasifikovane na skali od 0.^-20,

dok su one sočiva na skali od 0-3. ,: Statistička izračunavanja su izvršena sa Statistica 4.5 (SatSoft, USA) programom. Data vrednost za negativne slučajeve je bila 0.1. Takodje je pripremljen Box i Whisker plot grafikon.

Za svaku grupu u eksperimentu, srednje + SE (stan-dardna greška) vrednosti su izračunate, i izvršeno je upo-redjivanje pomoću ne-parametrijskim Mann-Whitney U-testom (Graphpad Instat, San Diego, CA).

Rezultati:

Svakodnevna jedna doza od 5 mg/kd Jedinjenja A i svakodnevna jedna doza od 20 mg kg bimoklomola značajno poboljšava diabetičnu retinopatiju izazvanu patološkim histološkim promenama. Jedinjenje A je bilo statistički efikasnije u poredjenju sa dijabetičnim, ne^tretiranim životinjama. Rezultati su dati u Tabeli 5.

Eksperiment 5

Efekat tretiranja pomoću Jedinjenja A i Bimoklomola

na patološki gubitak urinarnog proteina izazvanog đijabetičnom nefropatijom kod STZ-dijabetičnih Wistar pacova posle tretiranja 1 mesec

Materijali i postupci:

U eksperimentima su upotrebljeni mužjaci Wistar pacova

(Charles River Laboratories Inc.), na početku eksperimenta njihove težine su bile 340-370 g. Dijabetes je izazvan pomoću intravenske primene jedne doze od 45 mg/kg streptozotocina (STZ, Sigma, St Louis, MO) rastvorenog u fizio^loškom slanom rastvoru. Razvoj dijabetesa je proveren pos-

Test i referentne supstance su primenjene p.os na životinje jednom na dan.

Radi sakupljanja urina u periodu od 24 sati, životinje su stavljene u pojedinačne metabolične kaveze. Tokom ovog perioda davana im je voda et libitum (po želji) ali nije davana nikakva hrana. Ova poslednja mera je bila potrebna da bi se sprečila moguća kontaminacija sadržajem proteina u hrani. Urin je sakupljan u kalibrisanim staklenim posudama, u koje je stav-ljen timol kristal (Reanal 3135-1-08-38) da bi se sprečila bakterijska kontaminacija.

Pre merenja, uzorci urina su centrifugirani C2500

opm) i filtrirani kroz papirni filter (VThatman 1). Ako je potrebno, oni se lageruju na^20°C do merenja.

Sadržaj ukupnog proteina urina je odredjen pomoću Bradford postupka bojenja (Sigma B-6916, St. Louis, MO) ,

i intenzitet boje je odredjen pomoću spektrofotometrije (Hitachi-U-3200).

Rezultati:

Bimoklomol, primenjen u jednoj dnevnoj dozi od 20 mg/kg, značajno smanjenjeSTZ-dijabetesom izazvan^urinarni gubitak proteina. Jedinjenje A primenjeno u jednoj dnevnoj dozi od 10 mg/kg ne smanjuje značajno gubitak proteina. Medjutim, (+) enantiomer Jedinjenja A, primenjen u jednoj dnevnoj dozi od 5 mg/kg značajo smanjuje đij>abetični gubitak proteina. Rezultati su dati u Tabeli 6.

Eksperiment 6

Efekat Jedinjenja A i njegovih (+) i (-) enantiomera na patološke promene periferne neuropatije kod STZ-dijabetič-nih Wistar pacova posle 1 meseca tretiranja

Materijali i postupci: eksperimentalne životinje i svi postupci koji su primenjeni su isti kao što je opisano u Eksperimentu 2

Rezultati:

Jedinjenje A u jednoj dnevnoj dozi od 10 mg/kg i Jedinjenje A(+) u jednoj dnevnoj dozi od 5 mg/kg su ekviaktivni i zna-čajno poboljšavaju i defektivnu motornu (MNCV) i senzornu (SNCV)brzinu nervne provodijivosti deficijentnu kod dija-betičnih životinja. Nasuprot ovome, Jedinjenje A(-) nije imalo značajan poboljšavajući efekat na bilo koji parametar. Rezultati su prikazani u Tabeli 7.

Eksperiment 7

Efekat Jedinjenja A i njegovih AO) i AG-) enantiomera na patološke histološke promene rane dijebetične retinopatije kod STZ đijabetičnih pacova posle 2 meseca tretiranja Materijali i postupci: eksperimentalne životinje i svi primenjeni postupci su isti kao što je opisano u Eksperimentu 4

Rezultati:

A(+) enantiomer u jednoj dnevnoj dozi od 5 mg/kg značajno poboljšava i lentikularne i retinalne patološke histološke promene izazvane dijabetičnom retinopatijom posle 2 meseca tretiranja, dok efekat Jedinjenja A u jednoj dnevnoj dozi od 10 mg/kg nije bio značajan i A(-) enantiomer u jednoj dnevnoj dozi od 5 mg/kg nije bio efikasan. S obzirom samo na retinalne histološke promene, i Jedinjenje A i njegov A(+) enantiomer su bili efikasni, dok efekat A(-) enantiomera nije bio značajan. Rezultati su prikazani u Tabeli 8

Eksperiment 8

Efekti A(+) i A(-) enentiomera na in vivo insulinski zavisno preuzimanje glukoze kod dijetom izazvanog insulinski rezistentnog životinjskog modela

Materijali i postupci:

U eksperimentima su korišđeni mužjaci VJistar pacova (Charles River Laboratories Inc.) sa početnom telesnom težinom od 30.0-350 g.

Insulinska rezistencija je izazvana dijetetskom manipula-cijom: životinjama je davana visoko masna (high fat) (HF) dijeta u toku 3 nedelje. U HF dijeti odnos zasićenih masti je bio dominantan i davao je 70 % od ukupnog dnevnog dobijanja kalorija. A(+) i A(-) enantimeri su davani jednom dnevno u preventivnoj primeni u dozi od 20 mg/kg/dan.

Na kraju od 3 nedelje tretiranja ispitivani su sledeđi parametri: 1, ugljenohidratni i lipidni parametri iz seruma i 2. in vivo insulinom izazvano preuzimanje glukoze pomoću euglikemnog postupka učvršćivanja glukoze koji je trenutno najtačniji postupak za kvantitativno odredjivanje preuzi-manja glukoze (DeFronzo i sarad.,' American Journal odPhysiology, 1979/237/E214-223 strane),

Ukratko: koncentracija glukoze u krvi kod životinja lišava-nih hrane u različitim životinjskimgrupama mora da bude identična. Eksperimenti se izvode kod svesnih pacova koji se slobodno kreću, hronično kanuliranim pacovima: prvo je započeta infuzija insulina (6.4 mU/kg/min), praćena pomoću paralelnog toka kontinualne infuzije glukoze da bi se održale koncentracije glukoze u krvi u euglikemonoj oblasti. Posle stabilizacije, meri se količina infuzovane glukoze u toku peridga od 90 minuta Cbrzina infuzije glukoze(.glucose infusion rate) = GIR, mg/kg/min) koja je kvantitativni ■ parametar osetljivosti,

Rezultati:

A(+) i A(-) enantiomeri u dnevnoj dozi od 20 mg/kg/min nisu uticali na telesnu težinu i potrošnju hrane i nivoe glukoze u krvi kod pacova lišenih hrane. Nasuprot ovome, oba jedinjenja normalizuju HF dijetom izazvano lišavanje insulina i koncentracija triglicerida i takodje značajno smanjuju povećani sadržaj triglicerida u mišićima. Test učvršćivanja euglikemne glukoze potvrdio je da HF dijeta značajno potiskuje in vivo insulinom izazvano preuzimanje glukoze: kontrola: 26.7 + 0.68 mg/kg/min, HF dijeta: 15.0 + 0.39 mg/kg/min.Potisnuto preuzimanje glukoze izazvano insulinom se povećava pomoću oba enantiomera: HF+ A(+): 20.5 + 0.89. mg/kg/min i HF^ A(-): 19.7 + 1.38 mg/kg/min (značajno povećanje u oba slučaja na nivou od p < 0.01). Prema ovim rezultatima oba enantiomera povećavaju insulinom izazvano preuzimanje glukoze što se pokazuje iz nove pers-pektive smanjujućeg dejstva insulinske rezistencije jedinjenja prema pronalsku.

Eksperiment 9

Antiđijabetična aktivnost AC+) enantiomera u Zucker đijabetič-nim gojaznim pacovima posle hronične primene

Materijali i postupci:

Odabran je genetički dijabetični životinjski model i u eksperimentu su upotrebljeni Zucker dijabetični gojazni (ZDF) (Zucker Diabetic Fatty) pacovi. Ovaj model je dijabe-tična varijanta insulinske rezistencije, gojaznih. ali ne-dijabetičnih Zucker fa/fa životinjskog modela (videti Eksperiment 1). Kod ZDF pacova dijabetes se razvio na kraju 6-8 nedelja kojima prethodi faza insulinske rezistencije.

Efekat (A+) enantiomera je ispitivan u tretiranjima sa

dozom od 2 x 20.mg/kg/dan polazeći u ne-dijabetičnoj fazi, pri starosti od 7 nedelja i trajanju 6 nedelja.

Klinički hemijski parametri su mereni standerdnim postup-cima .

Koncentracije insulina u serumu su merene pomoću u skorije vreme razvijenom postupku (ELISA postupak, DRG International, Inc., U.S.A.).

Rezultati:

U ovom eksperimentu je otkriveno kao novi rezultat, da AC+) enantiomer ima jaku antidijabetičnu aktivnost kod dijabetič-nih životinja.

Rezultati dobijeni posle 3 i 5 nedelja tretiranja prikazani su u Tabeli 9.

Iako tretiranje sa A(+) enantiomerom nije normalizovalo koncentracije glukoze u krvi, kombinovani efekti jake antidijabetične aktivnosti i prethodno identifikovana značajna efikasnost izlečenja kod hfoničnih dijabetičnih komplikacija daju jedinjenju jedinstveni karakter. Terapeutska indicirana oblast A(+) enantiomera može znač-ajno da se proširi na bazi ove nove kombinovane efikasnosti.

Dalji eksperimenti su doveli do zaključka da jedinjenja prema ovom pronalasku, pored njihove efikasnosti kod pato-loških komplikacija dijabetesa su korisna u tretiranju drugih oštećenja perifernih nerava izazvanih dijabetesom. Ovaj zaključak je podržan rezultatima sledećeg neuro-regeneracionog eksperimenta.

Eksperiment 10

Terapeutski efekat Jedinjenja A i A(+) enantiomera na neuro-regeneraciju kod STZ-đijabetičnih Wistar pacova.

Materijali i postupci:

Eksperimenti su izvršeni na Vfistar pacovima sa telesnom težinom od 320-35O g. Dijabetes je izazvan i proveren kao što je opisano u Eksperimentu 2, Kod test životinja koje su bile dijabetične 3 nedelje levi nerv jjšijatikusa je povredjen zamrzavanjem a desna strana je korišćena kao ne-povredjena kontrola. Regeneracija je posmatrana beleženjem signala fleksor refleksa provociranih pomoću ozračivanja tabana koji su površine ispod krive (AUC) (areas under curve) elektromiograma prenetog sa prednjeg tibijalnog mišića.

Za stimulaciju i detekciju upotrebljen je Sistem opisan u ;Eksperimentu 2. x

Pojedinačne dnevne doze od 10 mg/kg Jedinjenja A i 5 mg/kg A(+) enantiomera su primenjivane 5 nedelja posle povređji-vanja zamrzavanjem.

Rezultati:

Na kraju perioda od 3 nedelje dijabetesa, pre povredjivanja zamrzavanjem razvila se senzor neuropatija i izazvala 23-25% smanjenje u AUC na obe noge. Nije uočena nikakva reakcija tokom 2 nedelje posle povredjivanja zamrzavanjem. Stepen neuroregeneracije je bio 63 % na 5 nedelja. Regeneracija je povećana do 73 % pomoću Jedinjenja A, A(.+ ) enantiomer je bio efikasan do stepena 93%. Neuroregene-racija od 83 % i samo 44 % ne-zamrznutih nerava je uočena kao rezultat tretiranja sa A(+) enantiomerom i odnosno Jedinjenjem A.Prema tome A( + ) enantiomer ima jak neuro-regenerativni efekat.

N-/2-hidroksi-3-Cl-piperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoiihlorid može da se dobije sledećim postupkom, koji nije poznat od ranije.

Prema oksidacionom postupku opisanom u WO 97/16349, derivat se oksidiše na azotovom atomu oba prstena, ili sa manje reagensa derivat oksidisan na alicikličnom prstenu može da se dobije iz hlorida 0- (3-piperidino-2-hidroksi-l-propil)-3-piridin hidroksamske kiseline, pošto je alicikli-čni azotov atom prvenstven u oksidacionoj reakciji. Regio-nalna selektivnost oksidacije je usmerena prema piridinskom prstenu radi dobijanja jedinjenja prema pronalasku, stoga je postupak modifikovan. Osnovna tačka modifikacije je ta, da se u cilju da se olakša selektivna oksidacija piridin-skog prstena, perkiselinska oksidacija izvodi u prisustvu jake kiseline, prvenstveno metan sulfo kiseline, koja protonizira aliciklični azot i tako sprečava njegdvu oksi-daciju; stoga oksidacija piridina postaje primarna. Kao oksidans, može da se upotrebi bilo koji tip perkiseline, prvenstveno persirćetna kiselina.

Optički antivni enantiomeri jedinjenja prema pronalasku se dpbijaju upotrebljavajući pogodneenantiomer optički aktivan kiselinski hloriđ 0-(3-piperidino-2-hidroksi-l-propilX-3-piridin hidroksamske kiseline kao polazni materijal, koji može da se dobije na primer prema EP 0 417 210 BI razdvajanjem racemskog jedinjenja. U toku reakcije, hiralnost molekula nije oštećena, i dobijeni proizvod ima istu optičku čistoću kao polazna supstanca.

Ako je poželjno, N-/2-hiđroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid koji je dobijen ili jedan od njegovih optički aktivnih enantio-

mera može da se transformiše u kiselinsku adicionu so sa mineralnom ili organskom kiselinom, pomoću poznatih postu-paka .

N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid, njegov optički aktivan (+) ili (-)enantiomer, smeša enantiomera u bilo kom odnosu, racemsko jedinjenje, osim toga, adicione soli sa kiselinama obrazovane iz bilo kojih gornjih jedinjenja sa mineralnim ili organskim kiselinama predstavljaju predmete ovog pronalaska. Svi mogući geometrijski oblici N-/2-hidroksi-3-Cl-piperidinil) -propoksi/-piridin-l-oksiđ-3-karboksiimiđoil hlorida spadaju u obim pronalaska. Izraz "stereoizomeri N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-piriđin-l-oksiđ-3-karboksiimidoil klorida" odnosi se nas. yemoguće optičke i geometrijske izomere jedinjenja.

Prema pronalasku, ova jedinjenja se primenjuju za tretiranje patološke insulinske rezistencije i za tretiranje i prevenciju patoloških stanja vezanih za ovo.

Specijalna realizacija pronalaska je da se ova jedinjenja upotrebljavaju za simultano tretiranje ili prevenciju hroničnih dijabetesom-izazvanih komplikacija, naročito retinopatije, neuropatije i nefropatije, i patološke insulinske rezistencije i patološk h stanja povezanih sa ovim.

Prema jednoj drugoj specijalnoj realizaciji pronalaska, N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid ili njegovi stereoizomeri ili njegove adicione soli sa kiselinama upotrebljavaju se u tretiranju patološke insuliske rezistencije i patoloških stanja vezanih sa ovim i za stimultano povećanje dijabetesom izazvanog patološki smanjene periferne neuroregeneracije.

Jedinjenja prema pronalaku mogu da se primene i u humanoj u i veterinarskoj terapiji.

Prema tome, predmet pronalaska takodje uključuje postupak za tretiranje patološke insulinske rezistencije i tretiranje i prevenciju patoloških stanja vezanih sa time,

i načina na koji se primenjuje na pacijente N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/piridin-l-oksiđ-3-karboksiimi-doil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera u obliku baze ili adicione soli sa kiselinom. Prvenstvena realizacija postupka prema pronalasku je kada se N-/2-hidroksi-3-Cl-piperidinil) -propoksi/-piridin-l-oksi-3-karboksiimidoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera, ili njegova adiciona so sa kiselinom primenjuje na pacijenta koji pati od dijabetične retinopatije, neuropatije ili nefropatije.

Prema jednoj drugoj specijalnoj realizaciji pronalaska N-/2-hiđroksi-3- (1-piperidinil) -propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera ili njegova adiciona so sa kiselinomsoprimenjuje na pacijenta u slučaju patološkog smanjenja nero-regeneracije izazvanog dijabetesom.

Doza jedinjenja zavisi od stanja i bolesti pacijenta, i dnevna doza je 0.1-40.0 mg/kg, prvenstveno 0,1^-100. mg/kg. U humanoj terapiji, oralna doza je prvenstveno 10-30.0. mg, u slučaju rektalne primene 1-15 mg, dok u slučaju pairenteralne primene 1-15 mg za odraslog pacijenta. Ove doze se prvenstveno primenjuju u oblicima jediničnih doza, koje mogu da se podele u 2-3 manje doze na dan u izvesnim slučajevima, naročito u oralnom tretiranju.

Prvenstveno se upotrebljava stereoizomer racemskog jedinjenja, najpogodnije (+) enantiomer. U ovom slučaju, manja količina aktivne komponente unutar gornjih granica je dovoljna za tretiranje.

Farmaceutski preparati pogodni za tretiranje su takodje predmet pronalaska. Ove farmaceutske kompozicije sadrže, pored uobičajenih pomodnih supstanci i nosača, N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-piridin-1-oksid-3-karboksiimidoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera, ili adicionu so jednog od gornjih, kao aktivne komponente .

Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu da se dobiju u obliku čvrstog ili tečnog preparata uglavnom upotrebijenog u humanoj ili veterinarskoj terapiji. Jednostavne ili obložene tablete, dražeje, granule, kapsule, rastvori ili sirupi mogu da se dobiju za oralnu primenu, supozitorije za rektalnu primenu, i liofiliziraič^ ili ne-liofilizirane injekcije ili infuzioni rastvori za parente-ralnu primenu. Oni mogu da se dobiju uobičajenim postupci-ma. Proizvod za oralnu upotrebu može da sadrži materijale za punjenje (punioce) kao što su mikrokristalna celuloza, škrob ili laktoza, maziva kao što su stearinska kiselina ili magnezijum stearat, materijale za oblaganje kao |^osušećer, materijale koji obrazuju film, kao što je hi.droksi metil celuloza, arome ili zasladjivaće kao što su metil-paraben ili saharin, ili supstance za bojenje. Supozitorije mogu da sadrže kakao buter ili polietilen glikol kao što su pomoćna sredstva, Parenteralni proizvodi mogu da sadrže pored efikasne supstance, slani rastvor, ili u izvesnim slučajevima supstance za dispergovanje i kvašenje kao što je propilen glikol

Pronalazak je dalje ilustrovan pomoću sledećih primera:'

Primer 1

Dobijanje N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/- piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid (Z)-2-butendioat

(1:1)

40.4 g (.0.136 mola) N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil) -propoksi/-3-piridin-karboksiimidoil hlorida se rastvori u smeši od 238 ml glacijalne sirđetne kiseline i 13.0 g (0.136 mola) metan sulfo kiseline. 61.5 ml (0.591 mola) 30 % rastvora vodonik peroksida se dodaje na 60°C. Rekciona smeša se meša na 60°C 3.5-4 sata. Rastvor se ohladi do 10°c, i zatim se u ovo dodaje 9.1 ^ml 0.5 M rastvora Na2S20^ . Iz ovog rastvora se predestiliše 315 ml smeše vode-sircetne kiseline, u ostatak se dodaje 250 ml 4 N NaOH rastvora CpH= 10.55) i mučka sa hloroformom. Hloroformska faza se pere sa vodom, suši, tretira sa drvenim ugljeni, i zatim uparava. U ostatak se dodaje voda, i ekstrahuje se sa izopropil etrom i zatim sa hloroformom, Hloroformska faza se suši, tretira sa drvenim ugljem, filtrira i uparava, Ostatak se rastvara u acetonu i transformiše u so sa maleinskom kiselinom. Talog se profiltrira, pere se sa acetonom i suši. Proizvod se kristališe iz ključalog etanola,

Prinos: 20 g (35%)

T.t.: 150.5-154.5°C

■"■H-NHR (rastvarač: DMSO; referenca: DMSO; V = 300. MHz) /ppm/: 8.55 (s, IH, 2-piriđin); 8,35 {~ đ f IH, 6-piridin) ;

7.6 8 Cd, IH, 4-piridin) ; 7.55 (m, IH 5-piridin) 6.0-0. Cs, 2H, CH=CH) ; 4,23-4.48 (m, 3H, Ctt-OH i NOCH2) ; 2.95-3.50. Cm, 6H, 3 x NCH2)?1 .20-1.90 Cm, 6H, piridin: 3 x CH2) .

<13>C-NMR Crastvarač: DMSO; referenca: DMSO; ^ =300 MRz) /ppm/: 167.6 C2C, 2 COOH) ; 141.0 (.2-piriđin); 136.8 C6-piridin); 136.4 (2C, CH=CH; 133.4 (CCL); 131,9- C3-piridin) ;

127.2 (4-piridin); 123.6 .(5-piridin); 77.9 (NOCH2) ;

63.6 (CH2N); 58.3 (CHOH) ; 52.0-55.0 (2C, piperidin; 2 x NCH2); 22.6, i 21.7 (3C, piperidin: 3 x CH2).

Primer 2

Dobijanje (+)-/R/-N-/2-hiđroksi-3-(tpiperiđinil)-propoksi/-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid (Z)-2-butendioat (1:1)

Postupak opisan u Primeru 1 je ponovljen sa tom razlikom što se umesto racemskog N-/2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi/-3-piridin-karboksiimidoil hlorida upotrebljeva njegov R enantiomer. Čist oblik jedinjenja se izoluje iz sirove baze kristalizacijom sa heksanom.

Prinos: 31 %

T.t.: 91- 93°C

IR (KBr, cm"<1>): 3167 (širok); 2840; 2710; 1575; 1480; 1443 (širok) 1293 (s); 1279 (s) ; 1093 ; 1053; 1043; 1023 Cs);

834 (s); 810, 688

Ako se želiy maleatna, so mož,e takodje da se dobije iz sirove ba,ze. u rastvoru acetona kao što je opisano u Primeru 1.

Prinos; 3 3 %

T.t.:l-32t0.--133,0°c

Gdnos enantiomera: 98/2 (HPLC merenje na hiralno^AGP 100 x 4 mm koloni)

1 13

H-NMRi C-r-NMR: isti kao spektri racemskog jedinjenja.

Primer 3

Dobi janje. (-) -/S/-N-/2-hiđroksi-3-(1-piperidinil) t-propoksi/-piridin-l~oksid-3-. karoksiimidoil hlorid (Z)-2-butendioata (1:1)

Postupak opisan u Primeru 1 se ponavlja sa tom razlikom še se mesto racemskog N-/2-hiđroksi-3-Cl-piperidinil)-propoksi/-3-piridin-karboksiimiđoil hlorida upotrebljava. S-enantiomer.

Prinos: 34 %

T.t.: 132.0-133.0°C.

Odnos enantiomera: 98/2 (HPLC merenje na hiralnoj AGP 100 x

4 mm koloni).

H NMR i l3C-NMR: isti kao spektri racemskog jedinjenja.

Primer 4

Fino samlevena aktivna komponenta se pomeša sa pomodnim materijalima, smeša se homogenizuje i granuliše. Granulat se zatim komprimuje u tablete.

Primer 5

Kapsule

Aktivna komponenta se pomeša sa pomodnim materijalima, smeša se homogenizuje i puni u želatinske kapsule.

Primer 6

Dražeje

Aktivna komponenta i polivinil pirolidon se rastva-raju u etanolu. Smeša laktoze i škroba krompira se pokvase ravnomerno sa rastvorom za granulisanjeaktivne komponente. Posle filtriranja, granule se suše na 50°C i prosejavaju. Dodaje se magnezijum stearat i presuje se u oblik tableta, koje se zatim prekrivaju oblogom od šećera i poliraju pomoću pčelinjeg voska.

Primer 7

Supoz itorij e

Kakao buter i supozitorijska masa se zagrevaju do 40°C, i aktivna komponenta se disperguje u stopljenoj masi, zatim ;se masa puni u supozitorijske kalupe.

Pr iTtipr Jg

Rastvor

Primer 9_ Injekcija

Rastvor se puni u ampule od 2 ml i zatim zatapa.

Pr imer 10

Infuzioni rastvor

500 ml infuzionog rastvora se dobija sa sledeđom kompozicijom:

Claims

1. N-{2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid, njegovi stereoizomeri, i adicione soli sa kiselinama

2. Upotreba N-{2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorida, njegovih stereoizomera, i adicionih soli sa kiselinama otuda, u proizvodnji leka za tretiranje patološke insulinske rezistencije, i za tretiranje patoloških stanja povezanih sa ovime.

3. Upotreba N-{2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-1-oksid-3-karboksiimidoil hlorida, njegovih stereoizomera, i adicionih soli sa kiselinama otuda, u proizvodnji leka za tretiranje i prevenciju dijabetesom izazvanih hroničnih komplikacija, naročito retinopatije, neuropatije i nefropatije, i/ili patološkog opadanja periferne neuroregeneracije izazvane dijabetesom.

4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži N-{2-hidroksi-3-(1-piperidinil)-propoksi}-piridin-l-oksid-3-karboksiimidoil hlorid ili jedan od njegovih stereoizomera ili adicionu so sa kiselinom otuda kao aktivnu komponentu u smeši sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim pomoćnim materijalom i nosačem koji se obično upotrebljavaju.