RS81704A - Dipiridodiazepinoni kao inhibitori reverzne transkriptaze - Google Patents

Abstract

Prikazane su supstance formule I: pri čemu R2 je H, halogen, (C1-4)alkil, O(C1-4)alkil, NH(C1-4alkil) ili N(C1-4alkil)2; R4 je H ili CH3; R5 je H ili CH3; R12 je H, halogen, (C1-4)alkil, CF3, ili NO2; R13 je H, (C1-4)alkil, halogen, OH, ili NH2, pod uslovom da R12 i R13 nisu oba H; i R14 je COOR14a pri čemu R14a je H ili (C1-6)alkil; ili R14 je (C2-4)alkenil-COOR14a pri čemu R14a je kao što je ovde definisano; ili R14 je (C1-4)alkil-COOR14a pri čemu R14a je kao što je gore definisano; ili njena so ili njen pro-lek, korisni kao inhibitori reverzne transkriptaze HIV-a.

Description

DIPIRIDODIAZEPINONI KAO INHIBITORI REVERZNE TRANSKRIPTAZE

TEHNIČKA OBLAST PRONALASKA

Pronalazak se odnosi na nove supstance i njihove farmaceutski prihvatljive soli, njihovu primenu, bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvima, u lečenju ili profilaksi HIV infekcije, kao i na farmaceutske kompozicije koje uključuju ove supstance.

OSNOVA PRONALASKA

Bolest poznata kao sindrom stečene imunodeficijencije (AIDS) uzrokovana je humanim virusom imunodeficijencije (HIV), posebno sojem koji je označen kao HIV-1. Da bi moglo da dodje do umnožavanja virusa HIV u ćeliji domaćinu, mora do dođe do integrisanja informacija sadržanih u genomu virusa u DNK ćelije-domaćina. Kako je HIV retrovirus, njegova genetska informacija je sadržana u obliku RNK. Stoga ciklus replikacije HIV zahteva transkripciju virusnog genoma (RNK) u DNK, što je obrnuto od normalnog sleda događaja. Enzim, koji je odgovarajuće nazvan reverzna transkriptaza (RT), dovodi do transkripcije virusne DNK u RNK. Virion HlV-a uključuje, uz virusnu RNK, i kopiju reverzne transkriptaze.

Reverzna transkriptaza ima tri poznate enzimske uloge; deluje kao RNK-zavisna DNK polimeraza, kao ribonukleaza i kao DNK-zavisna DNK polimeraza. Delujući kao RNK-zavisna DNK polimeraza, RT vrši transkripciju virusne RNK u jednolančanu DNK kopiju. Delujući kao ribonukleaza, RT razgrađuje originalnu virusnu RNK, i oslobađa DNK upravo nastalu iz originalne DNK. Konačno, delujući kao DNK-zavisna DNK polimeraza, RT pravi drugi, komplementarni DNK lanac, koristeći prvi DNK lanac kao matricu. Oba lanca formiraju dvolančanu DNK, koja se integriše u genom ćelije-domaćina posredstvom još jednog enzima nazvanog integraza.

Supstance koje inhibiraju enzimsku funkciju reverzne transkriptaze HIV-1 inhibiraće replikaciju HIV-1 u zaraženim ćelijama. Takve supstance su korisne u prevenciji ili lečenju HIV-1 infekcije kod ljudi, kao što je pokazano za poznate inhibitore RT kao što su 3'-azido-3'-deoksitimidin (AZT), 2',3'-dideoksinozin (ddl), 2',3'-dideoksicitidin (ddC), d4T, 3TC, Nevirapine, Delavirdine, Efavirenz i Abacavir, koji su i najvažniji lekovi koji su do sada odobreni za upotrebu u terapiji AIDS-a.

Kao kod svake antivirusne terapije, korišćenje inhibitora RT u lečenju AIDS-a na kraju dovodi do toga da virus postane manje osetljiv na dati lek. Rezistencija (smanjena osetljivost) na ove lekove je posledica mutacija koje se dešavaju u segmentu za reverznu transkriptazupol gena.Karakterisano je nekoliko mutantnih sojeva HIV, i rezistencija na poznata terapijska sredstva je uzrokovana mutacijom u genu za RT. Neke od najčešće uočenih mutacija u kliničkoj praksi su: Y181C mutacija, u kojoj je tirozin (Y) na poziciji 181 zamenjen cisteinskim (C) ostatkom i K103N gde je lizin (K) na poziciji 103 zamenjen asparaginom (N). Druge mutacije, koje se javljaju sa povećanom učestalošću tokom terapije posnatim antivirusnom lekovima uključuju pojedinačne mutacije V106A, G190A, Y188C, i P236L i dvostruke mutacije K103N/Y181C, K103N/P225H, K103N/V108I, i K103N/L100I.

Kontinuirana primena antivirusnih sredstava u prevenciji HIV infekcije bez sumnje će dovesti do povećane pojave novih rezistentnih sojeva HlV-a. Stoga postoji neprekidna potreba za novim inhibitorima RT, sa različitim matricama efikasnosti prema različitim mutantnim sojevima-

Supstance triciklične strukture koje su inhibitori HIV-1, opisane su u U.S. Pat. No. 5,366,972. Drugi inhibitori reverzne transkriptaze HIV-1 su opisani u Hargrave et al., J. Med. Chem., 34, 2231 (1991).

U.S. Pat. No. 5,705,499 predlaže 8-arilalkil- i 8-arilheteroalkil-5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-B:2',3'-E][1,4]diazepine kao inhibitore RT. Za pomenute supstance je pokazano da poseduju izvesnu aktivnost prema divljem soju, kao i RT-mutantnim HIV-1 sojevima, posebno Y181C i ostalim sojevima sa jednom mutacijom, kao što je K103N, ali sa manjom efikasnošću.

WO 01/96338A1 i US patent 6,420,350 otkrivaju diazepinsku strukturu u kojoj su prisutni kvinolinski i kvinolin-N-oksid supstituenti kao inhibitori RT. Navedene supstance poseduju aktivnost prema divljem soju HlV-a, kao i prema jednostrukim i dvostrukim mutantima

REZIME PRONALASKA

Ovaj pronalazak predstavlja supstituisanu benzoevu kiselinu koja sadrži supstance koje su moćni inhibitori divljih( WT) isojeva HIV-1 sa dvostrukom RT mutacijom, posebno dvostrukom mutacijom K103N/Y181C.

U prvom aspektu ovog pronalaska, prikazana je supstanca formule I:

pri čemu

R<2>je H, halogen, (d-4)alkil, 0(d-4)alkil, NH(CMalkil) ili N(C1.4alkil)2;

R4 je H ili CH3;

R5je H ili CH3;

R<12>je H, halogen, (d-4)alkil, CF3, ili N02;

R<13>je H, (C1.4)alkil, halogen, OH, ili NH2, pod uslovom da R<12>i R13nisu oba H; i R<14>je COOR<143>pri čemu R14a je H ili (d-e)alkil; ili R<14>je (C2_4)alkenilCOOR14agde jeR14<a>kao što je ovde definisano; ili R<14>je (d-4)alkilCOOR14a pri čemu R14a je kao što je ovde definisano;

ili njena so ili njen pro-lek

Prema drugom aspektu ovog pronalaska, data je farmaceutska kompozicija za lečenje ili prevenciju HIV infekcije, koja uključuje supstancu formule I, kao što je ovde prikazana, ili njenu farmaceutski prihvatljivu so, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Prema trećem aspektu ovog pronalaska, prikazan je postupak za lečenje ili prevenciju HIV infekcije, koji podrazumeva primenu kod pacijenta HIV inhibitorne doze supstance formule I ili njene farmaceutski prihvatljve soli ili farmaceutske kompozicije, oba kao što su ovde definisana.

Prema četvrtom aspektu ovog pronalaska, prikazan je postupak za lečenje ili prevenciju HIV infekcije, koji uključuje primenu farmaceutske kompozicije koja uključuje supstancu formule I, kao što je ovde opisano, u kombinaciji sa antiretrovirusnim lekom.

Prema petom aspektu ovog pronalaska, prikazan je postupak za prevenciju perinatalne transmisije HIV infekcije sa majke na bebu, koji uključuje primenu supstance formule I, ili farmaceutske kompozicije, kao što je ovde opisano, kod majke pre porođaja.

Detaljan o<p>is<p>ronalaska

Definicije

Ukoliko nije drukčije navedeno, primenjene su sledeće definicije:

Kao što je ovde korišćeno, izrazi "(C1.2)alkil", "(C^) alkil" i "(C^alkil", bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim radikalom, treba da označavaju aciklične alkil radikale koji sadrže, pobrojano redom kojim su navedeni, do dva, četiri, ili šest atoma ugljenika. Primeri takvih radikala uključuju metil, etil, propil, butil, 1-metiletil, 1-metilpropil, 2-metilpropil, i 1,1-dimetiletil.

Kao što je ovde korišćeno, izraz "(C2_4) alkenil", bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim radikalom, treba da označava nezasićeni aciklični radikal koji sadrži dva do četiri atoma ugljenika.

Kao što je ovde korišćeno, izraz "halogen" označava atom halogena i uključuje fluor, hlor, brom i jod.

Kao što je ovde korišćeno, izraz "farmaceutaki prihvatljiva so" uključuje one izvedene iz farmaceutski prihvatljivih baza i netoksične. Primeri pogodnih baza uključuju holin, etanolamin i etilendiamin. Soli Na<+>, K<+>, i Ca<++>su takođe razmatrane kao mogući izbor u okvirima ovog pronalaska (videti takođe Pharmaceutical salts, Birge, S.M. et al., J. Pharm. Sci., (1977), 66, 1-19, uključeno ovde kao referenca).

Kao što je ovde korišćeno, izraz "pro-lek" se odnosi na farmaceutski prihvatljive derivate, i to one kod kojih proizvod nastao kao rezultat biotransformacije derivata predstavlja aktivan lek, kao što je definisano ujedinjenjima formule I. Primeri takvih derivata uključuju, ali se ne ograničavaju na estre i amide. (videti Goodman and Gilman in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9<th>ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1995, "Biotransformation of Drugs, p 11-16, uključeno ovde kao referenca).

Detaljanopis preporučenihprimera

Preporučeno, R2 je H, halogen, (C1.4)alkil, 0(C1.4)alkil ili N(C1.4alkil)2. Jednako preporučeno, R<2>je H, Cl, F, (C,.4)alkil, 0(CM)alkil, ili N(C1.4alkil)2- Posebno preporučeno R2 je H, Cl, F, CH3, OMe, ili OEt. Posebno preporučeno, R2 je H.

Preporučeno,R4 i R<5>nisu oba isto.

Posebno preporučeno, R<4>je H.

Posebno preporučeno, R5 je CH3.

Preporučeno, R12 je halogen, (C^alkil, CF3, ili N02. Posebno preporučeno, R12je Br, Cl, CH3ili CH3CH2. Posebno preporučeno, R12 je CH3ili CH3CH2.

Preporučeno, R13 je H, CH3, halogen, OH, ili NH2. Posebno preporučeno, R13 je H, CH3|ili OH. Najpreporučljivije, R13je H.

Preporučeno, R14je COOH, COOMe, (C2.4)alkenilCOOH , ili (C^alkilCOOH. Posebno preporučeno, R<14>je COOH, CH=CH-COOH, CH2COOH, ili CH2CH2COOH. Najpreporučljivije, R14 je COOH.

Supstance formule I su efikasni inhibitori kako divljeg soja HIV tako i dvostrukog mutanta enzima K103N/Y181C.

Supstance formule I poseduju inhibitornu aktivnost prema HIV-1 reverznoj transkriptazi. Kada se primenjuju u odgovarajućem režimu doziranja, korisne su u lečenju AIDS-a, poremećaja uzrokovanih AIDS-om( AIDS related complex- ARC) isrodnih poremećaja koji su asocirani sa HIV-1 infekcijom. Drugi aspekt pronalaska je, stoga, postupak za lečenje HIV-1 infekcije koji uključuje primenu, kod čoveka koji je inficiran virusom HIV-1, terapijski efikasne količine nove supstance formule I, kao što je gore opisano. Nezavisno od toga da li to nazovemo lečenjem ili profilaksom, supstanca može takođe biti upotrebljena da bi se sprečilo perinatalno prenošenje HIV-1 sa majke na bebu, davanjem supstance majci pre porođaja.

Supstance formule I mogu se davati u jednoj ili podeljenim dozama, oralnim ili parenteralnim putem. Odgovarajuće doziranje kod oralne primene supstance formule I bilo bi u opsegu od oko 0.5 mg do 3 g dnevno. Preporučeno doziranje kod oralne primene supstance formule I bilo bi u opsegu od oko 100 mg do 800 mg dnevno za pacijenta težine 70 kg. Kod parenteralnih formulacija, odgovarajuća jedinica za doziranje može sadržati od 0,1 do 250 mg pomenute supstance, preporučljivo 1 mg do 200 mg. Treba, naravno, naglasiti da će način doziranja varirati od pacijenta do pacijenta i da će doziranje za bilo kog određenog pacijenta zavisiti od procene kliničkog lekara, koji će kao kriterijum za određivanje odgovarajućeg doziranja koristiti telesnu težinu i stanje pacijenta, kao i odgovor pacijenta na lek.

Kada supstance ovog pronalaska treba primenjivati oralno, one mogu biti primenjene kao lekovi u obliku farmaceutskih preparata, koji ih sadrže u asocijaciji sa kompatiblnim farmaceutskim nosačem. Ovaj nosač može biti od inertnog organskog ili neorganskiog materijala pogodnog za oralnu primenu. Primeri ovakvih nosača su voda, želatin, talk, škrob, magnezijum stearat, gumarabika, biljna ulja, polialkilen-glikoli, vazelin i slični.

Supstance formule I mogu se koristiti u kombinaciji sa antiretrovirusnim lekom poznatim iskusnom stručnjaku, kao kombinovani preparat koristan pri istovremenoj, odvojenoj ili uzastopnoj primenu u lečenju ili prevenciji HIV infekcije kod pacijenta. Primeri antiretrovirusnih lekova koji se mogu koristiti u kombinovanoj terapiji sa supstancama formule I, uključuju, ali se ne ograničavaju na, nukleozidne / nukleotidne inhibitore reverzne transcriptaze (kao što su AZT i Tenofovir), ne-nukleozidne inhibitore reverzne transcriptaze (kao što je Nevirapine), inhibitore proteaza (kao što je Ritanovir), inhibitori viralne fuzije (kao što je T-20), antagonisti CCR5 (kao što je SCH-351125), antagonisti CXCR4 (kao što je AMD-3100), inhibitori integraze (kao što je L-870,810), inhibitori TAT, drugi lekovi u fazi istraživanja (kao što su PRO-542, BMS-806, TMC-114 ili AI-183), antifungalni ili antibakterijski agensi (kao što je fluconazole), i imunomodulatorni agensi (kao što je Levamisole). Pored toga, supstanca formule I može biti korišćena sa drugom supstancom formule I.

Farmaceutski preparati mogu biti pripremljeni na uobičajeni način i definitivni oblici za doziranje mogu biti čvrsti oblici za doziranje, na primer, tablete, dražeje, kapsule, i slično, ili tečni oblici za doziranje, na primer rastvori, suspenzije, emulzije i slično. Farmaceutski preparati mogu biti podvrgnuti uobičajenim farmaceutskim operacijama kao što je sterilizacija. Dalje, farmaceutski preparati mogu sadržati uobičajene adjuvante kao što su konzervansi, stabilizatori, emulgatori, korektori ukusa, agensi za vlaženje, puferi, soli za menjanje osmotskog pritiska i slično. Čvrsti materijali koji se mogu upotrebiti za nosač uključuju, na primer, škrob, laktozu, manitol, metil celulozu, mikrokristalnu celulozu, talk, siliku, dvobazni kalcijum fosfat, i polimere visoke molekulske težine (kao što je polietilen glikol).

Za parenteralnu primenu, supstanca formule I može biti primenjena u vidu vodenog ili ne-vodenog rastvora, suspenzije ili emulzije u farmaceutski prihvatljivom ulju ili smeša tečnosti, koja može sadržati bakteriostatske agense, antioksidanse, konzervanse, pufere ili druge rastvorene supstance koje rastvor treba da učine izotoničnim sa krvlju, agense za kondenzovanje, agense za dobijanje suspenzije ili druge farmaceutski prihvatljive aditive. Aditivi ovog tipa uključuju, na primer, tartaratni, citratni i acetatni pufer, etanol, propilen glikol, polietilen glikol, jedinjenja koja prave komplekse (kao što je EDTA), antioksidanse (kao što je natrijum bisulfit, natrijum metabisulfit, i askorbinska kisleina), polimere velike molekulske mase (kao što su tečni polietilenski oksidi) za regulisanje viskoznosti i derivate polietilena sorbitolskih anhidrida. Ukoliko je potrebno, mogu biti dodati i konzervansi, kao što je benzoeva kiselina, metil ili propil paraben, benzalkonijum hlorid i druga kvarternarna jedinjenja amonijaka.

Supstance ovog pronalaska mogu se primeniti i kao rastvori za nazalnu aplikaciju i mogu sadržati, pored supstanci ovog pronalaska, i pogodne pufere, korektore površinskog napona, mikrobne konzervanse, antioksidanse i sredstva za povećanje viskoznosti u vodenom nosaču. Primeri sredstava koja se koriste da povećaju viskoznost su polivinil alkohol, derivati celuloze, polivinilpirolidon, polisorbati ili glicerin. Mikrobni konzervansi koji se dodaju uključuju benzalkonijum hlorid, timerosal, hloro-butanol ili feniletil alkohol.

Dodatno, supstance sadržane u ovom pronalasku mogu biti primenjene i kao supozitorije.

Metodologija i sinteza

Supstancu ovog pronalaska može napraviti iskusan organski hemičar koji se bavi sintezom. Primeri reakcionih shema niže su prikazani u Shemama 1 do 4.

SupstituentiR2,R<4>, R5,R1<2>, R1\ R<13>, i R<14>su kao što su ovde definisani.

Ukratko, aromatična supstitucija (SNAR) supstance 1(i) sa Et-NH2daje intermedijer 1(ii). Nakon toga, halogenacija na poziciji 5 korišćenjem agensa za bromovanje (na primer, NBS ili brom) daje 1(iii). Zatvaranje prstena na 1(iii) preko bazom-posredovane reakcije SnAR daje triciklični intermedijer 1 (iv). Uvođenje R<2>supstituenta nastavlja se preko aromatične supstitucije hlora na C-2 u 1 (iv) čime nastaje supstanca intermedijera 1(v).

Redosled u shemi 2 je analogan onome opiasnom u J.M. Klunderef a/.; J. Med. Chem.1998, 41, 2960-71, i CL. Cywinera/.; J. Med. Chem.1998, 41, 2972-84. Ukratko, aromatičnom supstitucijom (SNAR) supstance 2(i) sa Et-NH2nastaje intermedijer 2(ii). Redukcija nitro grupe (na primer korišćenjem katalitičke hidrogenacije) dovodi do nastanka 2(iii). Bazom-posredovana reakcija kondenzacije 2(iii) sa, na primer, 5-bromo-2-hloro-3-piridinkarbonil hloridom, daje 2(iv). Zatvaranje prstena supstance 2(iv) nastavlja se preko bazom-posredovane reakcije SnAR da bi se dobio triciklični intermedijer 2(v). R<5>metil grupa u 2(vi) može biti uvedena alkilacijom poznatom stručnjaku uz korišćenje, na primer, metil jodida.

Ukratko, bazom posredovana reakcija kondenzacije između3(i)i3(ii)daje intermedijer3(iii).Aromatična supstitucija (SNAR) supstance3(iii)sa Et-NH2daje intermedijer3(iv).Zatvaranje prstena kod3(iv)nastavlja se preko bazom-posredovane SnAR reakcije i nastaje triciklični intermedijer, koji je alkilovan da bi se dobio intermedijer3(v).

Ukratko, bazom posredovana reakcija kondenzacije između4(i)i 3(ii) dajeintermedijer 4(ii).Aromatična supstitucija (SNAR) supstance4(ii)sa Et-NH2dajeintermedijer 4(iii).Zatvaranje prstena kod4(iii)nastavlja se preko bazom-posredovane SnAR reakcije da bi se dobila triciklična supstanca intermedijera1(v). Ukratko, unakrsno vezivanje bromo derivata 5(i), sintetisanog kao što je ovde opisano, sa alil cilindričnim reagensom u aprotičnom rastvaraču (npr. DMF) i u prisustvu katalizatora, formira C-8 supstituente 5(ii). Oksidacija dvostruke veze (npr. ozonolizom da bi se dobio ozonid), nakon koje sledi redukcija, dovodi do nastanka C-8 hidroksietil supstituenta 5(iii). Upotrebom reakcije Mitsunobu tipa, nafti! derivati 5(iv), 5(v) ili 5(vi) kada jeY=R1<4>sa izuzetkom COOH, kondenzovani su sa 5(iii) da bi se dobila supstanca formule I. Alternativno, kada je Y prekursor R<14>grupe, na primer COOCH3, reakcija Mitsunobu tipa može se koristiti da dođe do kondenzacije 5(iv) ili 5(v) sa 5(iii), i nakon toga Y mode biti hemijski konvertovano u supstituenteR1<4>, na<p>rimer saponifikacijom COOCH3da bi nastao COOH, na taj način dajući supstancu formule I.

Kao što je prethodno rečeno, supstance koje su prikazane u ovom pronalasku inhibiraju enzimsku aktivnost HIV-1 RT. Na osnovu testiranja ovih supstanci, kao što je niže opisano, poznato je da inhibiraju RNK-zavisnu DNK polimeraznu aktivnost HIV-1 RT. Poznato je da (podaci nisu prikazani) one takođe inhibiraju DNK-zavisnu DNK polimeraznu aktivnost HIV-1 RT. Korišćenjem niže opisanog Eseja za Reverznu Transkriptazu (RT), može se testirati sposobnost ovih supstanci da inhibiraju RNK-zavisnu DNK polimeraznu aktivnost HIV-1 RT. Određene specifične supstance, opisane u niže navedenim Primerima, testirane su na ovakav način. Rezultati ovih testiranja su prikazani u Tabeli 1 kao IC50 i EC50.

PRIMERI

Ovaj pronalazak je dalje detaljnije ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima. Sve reakcije su izvođene u atmosferi pod azotom ili argonom ukoliko drukčije nije navedeno. Temperature su date u stepenima Celzijusa. Procenti rastvora ili odnosi izražavaju odnos zapremine prema zapremini, ukoliko nije drukčije navedeno. Skraćenice ili simboli ovde korišćeni uključuju: DEAD: dietil azodikarboksilat;

DIAD: diizopropil azodikarboksilat;

DIEA: diizopropiletilamin;

DMAP: 4-(dimetilamino) piridin;

DMSO: dimetilsulfoksid;

DMF: dimetilformamid;

DCC: dicikloheksilkarbodiimid;

ES MS: elektron sprej masena spektrometrija;

Et: etil;

EtOH: etanol;

EtOAc: etil acetat;

Et20: dietil etar;

HPLC: tečna hromatografija visokih preformansi( high performance liquid

chromatography);

Pr. izopropil;

Me: metil;

MeOH: metanol;

MeCN: acetonitril;

NaHMDS: natrijum heksametildisilazid;

NBS: N-bromosukcinimid;

Ph: fenil;

TBE: tris-borat-EDTA;

TBTU: 2-(7/-/-benzotriazol-1-il)-N, N, N', N'-tetrametiluronium tetrafluoroborat;

TFA: trifluorosirćetna kiselina;

THF: tetrahidrofuran;

PFU: jedinice koje formiraju plak( plaque- forming units) ;

DEPC: dietil pirokarbonat;

DTT: ditiotreitol;

EDTA: etilendiamintetraacetat;

UMP. uridin 5'-monofosfat;

UTP: uridin 5'-trifosfat;

MES: 2-(n-morfolino)etansulfonska kiselina;

SDS-PAGE: natrijum dodecil sulfat-elektroforeza na gelu od poliakrilamida ; MVVCO: granična molekulska masa( molecular vveight cut- off) ;

Bis-Tris Propane: 1,3-Bis{tris(hidroksimetil)-metilamino}propan;

GSH: redukovani glutation;

OBG: n-Octil-p-D-glukozid.

Sinteze

Primeri koji slede ilustruju postupke za pripremu supstanci ovog pronalaska.

Primer 1:

Korak a:

Rastvoru 2-hloro-3-nitropiridina 1a (51 g, 325 mmol) u THF-u (650 mL) dodat je 2 M rastvor etilamina u THF-u (365 ml_, 731 mmol). Reakcija se odvijala preko noći na sobnoj temperaturi uz stalno mešanje. Reakciona smeša je sipana u vodu (-1.5 L) i tako dobijena čvrsta supstance profiltrirana i osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobila supstanca 1b (52 g).

Korak b:

Rastvor 2-(etilamino)-3-nitropiridina 1b (52 g) u MeOH (600 mL) je ostavljen preko noći na sobnoj temperaturi, uz stalno mešanje, pod vodonikom (1 atm.) u prisustvu 20% Pd(OH)2/C (10.4 g). Katalizator je uklonjen filtriranjem kroz dijatomejsku zemlju. Filtrat je ukoncentratovan pod sniženim pritiskom da bi se dobila supstanca 1c kao crna čvrsta supstanca (39 g, prinos 88% posle koraka a i b).

Korak c:

Ohlađenom rastvoru 3-amino-2-(etilamino)piridina1c(30.6 g, 223 mmol) u MeCN (740 mL) dodat je čvrst NaHC03(56.3 g, 669 mmol). Nakon 5 min, dodat je sirov 5-bromo-2-hloro-3-piridinkarbonil hlorid (pripremljen od 5-bromo-2-hidroksi-3-piridinkarboksilne kiseline i SOCI2(1 equiv., 223 mmol) [kao što je opisano u T. W. Geroet al.uSynth. Commun.1989, 19, 553-559 (koji je ovde uključen kao referenca) ali sa izostavljanjem vodenog rafinisanja]. Nakon 2 h, reakciona smeša je sipana preko leda/H20 (1.5 L) i tako dobijena čvrsta supstanca je filtrirana, isprana prvo H20 i zatim heksanom. Nakon sušenja preko noći, pod sniženim pritiskom, dobijena je supstanca1dkao čvrsta crna supstanca (54.9 g, prinos 69%).

Korak d:

Rastvoru 2-hloro-A/-{2-(etilamino)-3-piridinil}-5-bromo-3-piridinkarboksamida 1d (54.9 g, 154.4 mmol) u piridinu (308 mL) na 50 °C dodat je, kap po kap, 1 M rastvor NaHMDS u THF-u (355 mL, 355 mmol). Nakon 10 min, ostavljano je da se reakciona smeša ohladi do sobne temperature, a zatim je sipana preko ledene vode (2 L). Dobijena čvrsta supstanca je filtrirana, isprana vodom i zatim heksanom. Čvrsta supstanca je osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobila supstanca 1e (36 g, prinos 75% ) kao tamnozelena čvrsta supstanca.

Korak e:

Rastvoru 8-bromo-5,11-dihidro-11-etil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e] [1,4]diazepin-6-ona 1e (36.7 g, 115 mmol) u DMF-u (380 mL) dodat je NaH (3.5 g, 138 mmol), i smeša zagrejana na 50 °C tokom 30 min. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i tretirana sa Mel (14.3 mL, 230 mmol). Nakon 1.5 h, reakciona smeša je sipana preko ledene vode. Čvrsta supstanca je filtrirana, isprana vodom i zatim heksanom da bi se, nakon sušenja, dobila supstanca 1f (37.9 g, prinos 99%) kao tamnosiva čvrsta supstanca.

Korak f:

Aliltributiltin (30.7 mL, 99.0 mmol) i Pd(Ph3P)4(5.20 g, 4.50 mmol) su dodani u degasiran (N2je propušten kroz rastvor tokom 30 min) rastvor 8-bromo-5,11-dihidro-11-etil-5-metil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 1f (30.Og, 90.0 mmol) u DMF-u (450 mL) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana na 90 °C tokom 1.5 h, a zatim je ohlađena do sobne temperature i ukoncentrisana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (heksan: EtOAc, 8:2 do 7:3) da bi se dobila supstanca1g(22.19 g, prinos 84% ).

Korak g:

Mlaz mehurića ozonizovanog kiseonika je propuštan kroz hladan (-78 °C) rastvor 5,11-dihidro-11-etil-5-metil-8-(2-propenil)-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona1g(22.19 g, 75.4 mmol) u CH2CI2 (150 mL) i MeOH (150 mL) tokom 2.5 h. Zatim je mlaz mehurića N2propuštan kroz rastvor tokom 15 min, a onda je rastvoru dodat

čvrst NaBH4(4.99 g, 132 mmol). Potom je reakciona smeša ostavljena da se zagreje do sobne temperature. Nakon 1 h, dodat je zasićeni vodeni rastvor NH4CI (200 mL) i smeša ostavljena na sobnoj temperaturi, uz mešanje, tokom 2 h. Organski rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Ostatku su dodati voda (300 mL) i CHCI3(300 mL). Odvojene su faze i vodeni sloj je ekstrahovan pomoću CHCI3(3 * 300 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni (MgS04), filtrirani i ukoncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (EtOAc:CHCI3, 4:1) da bi se dobila supstanca 1h (16.1 g, prinos 72% ) kao bela čvrsta supstanca.

Primer 2:

Koraka:

Ledeno-hladan rastvor EtNH2(49.8 g, 1.10 mol) u toluolu (200 mL) dodavan je tokom 15 min ledeno-hladnom rastvoru 2,6-dihloro-3-nitropiridina2a(100.0 g, 0.52 mol) u toluolu (225 mL). Smeša je mešana na 0 °C tokom 45 min. Zatim su dodati voda (500 mL) i EtOAc (500 mL) i izdvojile su se faze. Organski sloj je uspešno ispran vodom (200 mL) i slanim rastvorom (200 mL), osušen (MgS04), filtriran i ukoncentrovan pod sniženim pritiskom. Čvrsti ostatak je rekristalisan od MeOH da bi se dobila supstanca2b(83.7 g, prinos 80%) u vidu žutih iglica.

Korakb:

Supstanca2c jepripremljena na način analogan Primeru I, korak b.

Korakc:

Rastvor 5-bromo-2-hloro-3-piridinkarbonil hlorida (30.0 g, 97.0 mmol) u MeCN (100 mL) je preko kanile dodavan rastvoru 3-amino-6-hloro-2-(etilamino)piridina 2c (16.6 g, 97.0 mmol) u MeCN (180 mL) koji sadrži čvrst NaHC03(14.2 g, 169 mmol) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Zatim je dodata voda (200 mL) i smeša mešana tokom 10 min. Nastala suspenzija je profiltrirana. Čvrsti ostatak je ispran vodom pa heksanom i osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobila supstanca2d(28.4 g, prinos 75% ).

Korak d:

1 M rastvor NaHMDS u THF-u (167.5 mL, 167.5 mmol) je polako dodavan rastvoru 5-bromo-2-hloro-A/-{2-(etilamino)-6-hloro-3-piridinil}-3-piridinkarboksamida2d(28.4 g, 72.8 mmol) u piridinu (146 mL) zagrejanom do 50 °C. Reakciona smeša je mešana na 50 °C tokom 1.5 h. Smeša je zatim sipana u smešu vode i leda (1 L) i, nakon 1 h, tako nastala suspenzija je filtrirana. Čvrsti ostatak je ispran vodom i osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobila supstanca2e(23.4 g, prinos 91 % ).

Korak e:

Čvrst NaH (60% uljana disperzija, 3.46 g, 86.1 mmol) je dodavan tokom 30 min rastvoru 8-bromo-2-hloro-5,11-dihidro-11-etil-6/-/-dipirido[3,2-b:2',3'-e] [1,4]diazepin-6-ona2e(23.4 g, 66.3 mmol) u DMF-u (220 mL) na 50 °C. Smeša je mešana na 50 °C tokom 1 h, a zatim je ostavljena da se ohladi to sobne temperature. Smeša je zatim sipana u vodu (1 L) i tako nastala suspenzija profiltrirana. Čvrsti ostatak je ispran prvo vodom a zatim heksanom a zatim osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobila supstanca2f(23.0 g, prinos 94%).

Korakf:

Aliltributiltin (21.3 mL, 68.7 mmol) i Pd(Ph3P)4(3.61 g, 3.12 mmol) su dodani degasiranom (N2propušten kroz rastvor tokom 30 min) rastvoru 8-bromo-2-hloro-5,11-dihidro-11-etil-5-metil-6/-/-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 2f (23.0 g,62.5 mmol) u DMF-u (312 mL). Smeša je zagrejana do 90 °C tokom 2 h. Smeša je ukoncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (heksan:EtOAc, 7:3) da bi se dobila supstanca2g(13.4 g, prinos 65%).

Korakg:

Ozonizovani kiseonik je uveden u hladan (-78 °C) rastvor 2-hloro-5,11 -dihidro-11-etil-5-metil-8-(2-propenil)-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e] [1,4]diazepin-6-ona2g(13.4 g, 40.7 mmol) u MeOH (102 mL) i CH2CI2(102 mL) do kompletnog nestanka alkena. Zatim je u rastvor uveden azot u vidu mehurića da bi se uklonio višak 03. Čvrst NaBH4(2.69 g, 71.1 mmol) je zatim dodavan u malim porcijama i smeša je ostavljena da se polako zagreje do sobne temperature. Nakon 1 h, dodat je zasićeni vodeni rastvor NH4CI (150 mL) i smeša mešana tokom 20 min. Organski rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom. Vodenom rastvoru je dodata voda (100 mL). Rastvor je ekstrahovan uz pomoć CHCI3(3 * 200 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni (MgS04), filtrirani i ukoncentrovani pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc:CHCI3, 4:1) da bi se dobila supstanca2h(10.4 g, prinos 77%).

Primer 3:

Korak a:

Smeši koncentrovane sumporne kiseline (600 mL) i pušeće azotne kiseline (90%, 400mL) u ledenom kupatilu (temperatura u kupatilu održavana je na 5-10 °C) kao po kap je dodavan 2,6-difluoropiridin 3a (200 g, 1.74 mol). Tako nastala smeša je ostavljena preko noći na sobnoj temperaturi uz neprestano mešanje. Smeša je sipana polako u 3 kg leda i ekstrahovana uz pomoć Et20 (2x2 L). Kombinovani organski slojevi su isprani vodenim 1.5 N NaOH (2 * 1 L), zatim vodenim zasićenim NaHC03(400 mL) ili dok pH ne dostigne vrednost oko 8-9. Organski slojevi su osušeni preko MgS04, filtrirani i ukoncentrovani pod sniženim pritiskom do konstantne mase (da bi se uklonio neizreagovani 2,6-difluoropiridin: 10-12%). Supstanca 3b je dobijena kao žuta tečnost (207.3 g, prinos 74%J.

Korak b:

Rastvoru 2,6-difluoro-3-nitropiridina 3b (45.7 g, 285 mmol) u THF-u (500 mL) na -40 °C dodavan je, kap po kap rastvor etilamina (25.7 g, 570 mmol) u THF-u (250 mL). Nakon 30 min, reakciona smeša je ukoncentrovana u uslovima pod sniženim pritiskom i ostatak rastvoren u EtOAc. Organska faza je isprana slanim rastvorom, osušena (MgS04), filtrirana i ukoncentrovana. Tako dobijena žuta čvrsta supstanca je prečišćena fleš hromatografijom (15% EtOAc u heksanu) da bi se dobila supstanca 3c (43.2 g, prinos 82%) kao žuta čvrsta supstanca.

Korak c:

Rastvor 2-etilamino-6-fluoro-3-nitropiridina 3c (43.2 g, 230 mmol) u THF-u (1 L) je ostavljen preko noći, uz stalno mešanje, na sobnoj temperaturi pod vodonikom (1 atm.) u prisustvu 20% Pd(OH)2/C (4.35 g). Katalizator je uklonjen filtracijom kroz dijatomejsku zemlju. Filtrat je ukoncentrovan pod sniženim pritiskom da bi se dobila supstanca 3d (36.3 g, prinos 95%) kao crna čvrsta supstanca.

Korak d:

Ohlađenom rastvoru (4 °C) 3-amino-2-etilamino-6-fluoropiridina 3d (31.0 g, 200 mmol) u MeCN (160 mL) dodat je čvrst NaHC03(50.4 g, 600 mmol). Nakon 15 min, dodat je rastvor 5-bromo-2-hloro-3-piridinkarbonil hlorida (1 equiv., 200 mmol) u MeCN (155 mL). Nakon 60 min ma sobnoj temperaturi, reakciona smeša je sipana u vodu (1.2 L) i mešana tokom 30 min. Tako nastala čvrsta supstanca je profiltrirana, osušena pod sniženim pritiskom na 50 °C preko noći. Supstanca 3e (73.7 g, prinos 99%) je dobijena kao crna čvrsta supstanca.

Korak e:

Rastvoru 2-hloro-A/-{2-(etilamino)-6-fluoro-3-piridinil}-5-bromo-3-piridinkarboksamida 3e (73.5 g, 216 mmol) u piridinu (435 mL) na 50 °C dodat je, kap po kap, 1 M rastvor NaHMDS u THF-u (520 mL, 520 mmol). Nakon 10 min, reakciona smeša je ostavljena da se ohladi do sobne temperature, a zatim je sipana preko ledene vode (2 L). Tako nastala čvrsta supstanca je filtrirana, isprana vodom pa heksanom. Čvrsta supstanca je osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobila supstanca3f(50.6 g, prinos 69%) kao tamnozelena čvrsta supstanca.

Korak f:

Rastvoru 8-bromo-5,11-dihidro-11-etil-2-fluoro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 3f (44 g, 130.5 mmol) u DMF-u (520 mL) dodat je NaH (4.28 g, 178 mmol), i smeša zagrejana do 50 °C tokom 30 min. Reakciona smeša je potom ohlađena do sobne temperature i tretirana sa Mel (24.4 mL, 522 mmol). Nakon 1.5 h, reakciona smeša je sipana preko ledene vode. Dobijena čvrsta supstanca je filtrirana, isprana vodom pa heksanom, osušena pod sniženom pritiskom da bi nastala supstanca 3g (43.2 g, prinos 94%) kao tamnosiva čvrsta supstanca.

Korakg:

Aliltributiltin (32.0 mL, 103.4 mmol) i Pd(Ph3P)4(5.43 g, 4.70 mmol) su dodati

degasiranom (N2kroz rastvor tokom 45 min) rastvoru 8-bromo-5,11 -dihidro-11 -etil-2-fluoro-5-metil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e] [1,4]diazepin-6-ona3g(33.0 g, 94.0 mmol) u DMF-u (470 mL). Dodatne količine Pd(Ph3)4(1.09 g, 0.94 mmol) su dodavane nakon 1, 2, 3, 4 i 5 h da bi se reakcija odigrala do kraja. Smeša je zagrevana do 90 °C tokom 6 h. Smeša je ukoncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (heksan:EtOAc, 8:2 to 7:3) da bi se dobila supstanca3h(22.4 g, prinos 76%).

Korak h:

Mlaz ozonizovanog kiseonika je u vidu mehurića propušten kroz hladan (-78 °C) rastvor 5,11-dihidro-11-etil-2-fluoro-5-metil-8-(2-propenil)-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona3h(22.38 g, 71.6 mmol) u CH2CI2(100 mL) i MeOH (100 mL) tokom 3 h. Zatim je kroz rastvor propušten mlaz N2u vidu mehurića tokom 15 min i zatim je rastvoru dodat čvrst NaBH4(5.05 g, 133 mmol). Reakciona smeša se spontano zagrejala do sobne temperature. Nakon 1 h, reakcionoj smeši je dodata dodatna količina NaBH4(1.62 g, 43.0 mmol). Posle još jednog sata, reakcionoj smeši je dodat zasićen vodeni rastvor NH4CI (150 mL) i smeša ostavljena 30 min na sobnoj temperaturi uz neprekidno mešanje. Organski rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom . Zatim je dodata voda (200 mL) i smeša ekstrahovana uz pomoć CHCI3(3 * 300 mL). Kombinovani organski slojevi su osušeni (MgS04), filtrirani i ukoncentrovani od sniženim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (EtOAc:CHCI3, 4:1) da bi se dobila supstanca31(19.7 g, prinos 72%) kao bela čvrsta supstanca.

Primer 4(unosi1003 and 1031)

Korak a:

Rastvoru 1.6 M n-BuLi u heksanu (6.22 mL, 9.95 mmol) brzo je dodat u hladan (-78

°C) rastvor supstance4a(0.87 g, 4.33 mmol) u THF-u (20 mL). Reakciona smeša je mešana tokom 10 min na -78 °C , ostavljena da se zagreje do 0 °C i održavana na 0 °C tokom 1 h. U reakcionu smešu je uveden mlaz C02tokom 10 min i rastvor učinjen kiselim dodavanjem vodenog 1.0 N rastvora HCI. Smeša je ekstrahovana uz pomoć EtOAc. Organski sloj je osušen (MgS04), filtriran i ukoncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prenešen u Et20 (20 mL) i tretiran viškom rastvora CH2N2u Et20(ca.0.6 M, 10 mL) tokom 10 min. Smeša je ukoncentrovana pod sniženim pritiskom i ostatak prečišćen fleš hromatografijom (heksan: EtOAc, 4:1 to 7:3) da bi se dobila supstanca4b(0.13 g, prinos 17%).

Korak b:

Rastvor DIAD (86 (iL, 0.44 mmol) u THF-u (2.0 mL) dodavan je tokom 30 min rastvoru1h(100 mg, 0.33 mmol),4b(60.0 mg, 0.33 mmol) i PPh3(114 mg, 0.44 mmol) u THF-u (10 mL) na 25 °C. Smeša je mešana tokom 1 h, a zatim ukoncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (heksan:EtOAc, 7:3 do 1:1) da bi se dobila supstanca1031(128 mg, prinos 83%).

Korakc:

Vodeni 1.0 N rastvor LiOH (1.52 mL, 1.52 mmol) dodat je rastvoru supstance 1031 (100 mg, 0.22 mmol) u THF-u (6 mL) i MeOH (2 mL). Reakciona smeša je ostavljena 24 h na 25 °C uz neprestano mešanje, a zatim zagrejana do refluksa tokom 1 h. Rastvor je učinjen kiselim dodavanjem vodenog 1.0 N rastvora HCI, a zatim ekstrahovan uz pomoć EtOAc. Organski sloj je ispran vodom (2 *) i slanom vodom, osušen (MgS04), filtriran i ukoncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je pulverizovan sa Et20/heksanom da bi se dobila supstanca 1003 (80 mg, prinos 83%) kao bela čvrsta supstanca. Smeša supstance 1003 (38.0 mg, 0.085 mmol) i vodenog 0.02 N rastvora NaOH (4.3 mL, 0.085 mmol) u MeCN (3 mL) je sonifikovana. Tako nastali rastvor je zamrznut i liofilizovan da bi se dobila odgovarajuća natrijumova so (37 mg, prinos 98%) kao bela čvrsta supstanca. Primer 5 (unosi 1019,102011028)

Korak a:

Rastvor DIAD (86 i^L, 0.44 mmol) u THF-u (2.0 mL) dodavan je tokom 2 h rastvoru supstance 3i (106 mg, 0.34 mmol),5a(56.0 mg, 0.34 mmol) i PPh3(114 mg, 0.44 mmol) u THF-u (7 mL) na 25 °C. Smeša je mešana tokom 1 h, a zatim ukoncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (heksan:EtOAc, 7:3 prema 1:1) da bi se dobila supstanca5b(115 mg, prinos 73%) kao bela čvrsta supstanca.

Korak b:

Vodeni 1.0 N rastvor LiOH (1.0 mL, 1.0 mmol) dodat je rastvoru supstance5b(100 mg, 0.21 mmol) u MeOH (6 mL). Reakciona smeša je ostavljena 24h na 25 °C uz neprestano mešanje. Rastvor je učinjen kiselim dodavanjem vodenog 1.0 N rastvora HCI, a zatim ekstrahovan uz pomoć EtOAc. Organski sloj je ispran vodom i slanim rastvorom, osušen (MgS04), filtriran i ukoncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (heksan:EtOAc:AcOH, 50:50:1) da bi se dobila prva supstanca1019(25 mg, prinos 25%) kao bela čvrsta supstanca, praćena supstancom1020(48 mg, prinos 50%) kao belom čvrstom supstancom. Odgovarajuće natrijumove soli su dobijene tretiranjem vodenim 0.02 N rastvorom NaOH.

Korak c:

Rastvor 1.0 M dimetilamina u THF-u (5.0 mL, 5.0 mmol) i vodeni 1.0 N rastvor LiOH (1.0 mL, 1.0 mmol) dodati su rastvoru supstance5b(50.0 mg, 0.11 mmol) u/-PrOH (3 mL). Reakciona smeša je zagrevana tokom 48 h do refluksa. Zatim joj je dodat vodeni 1.0 N rastvor HCI (2 mL) i smeša ekstrahovana uz pomoć EtOAc. Organski sloj je ispran vodom i slanim rastvorom, osušen (MgS04), filtriran i ukoncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (heksan:EtOAc:AcOH, 50:50:1) da bi se dobila supstanca1028(18 mg, prinos 35%) kao bela čvrsta supstanca. Odgovarajuća natrijumova soje dobijena tretiranjem vodenim 0.02 N rastvorom NaOH.

Primer 6 (unos 1014)

Koraka:

Rastvoru kiseline6a(1.00 g, 5.55 mmol) u CH2CI2(50 mL) dodat je oksalil hlorid (0.73 mL, 8.3 mmol) i DMF (100 uL). Reakciona smeša je mešana tokom 90 min i zatim je dodat EtOH (15 mL), i reakciona smeša mešana još jedan sat. Reakciona smeša je ukoncentrovana pod sniženim pritiskom, ostatak razblažen sa EtOAc i ispran prvo vodom, a zatim slanim rastvorom, osušen (MgS04), filtriran, i ukoncentrovan da bi se dobio estar6bkoji se koristi bez daljeg prečišćavanja.

Korakb:

Rastvoru estra6bu CH2CI2(50 mL) dodat je 1 M rastvor BBr3u CH2CI2(7.2 mL, 7.20 mmol). Nakon 3 h na sobnoj temperaturi, reakciona smeša je ohlađena do 0 °C i dodat je EtOH (5 mL). Reakciona smeša je mešana tokom 30 min na sobnoj temperaturi i zatim ukoncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je razblažen pomoću EtOAc i ispran prvo zasićenin vodenim rastvorom NaHC03, zatim vodom pa slanim rastvorom, osušen (MgS04), filtriran i ukoncentrovan do suvog. Ostatka je prečišćen fleš hromatografijom (heksan:EtOAc; 70:30) da bi se dobio fenol6c(802 mg, prinos 74 % u dva koraka) kao prozračna guma.

Korak c:

Rastvor DIAD (87uL, 0.44 mmol) u THF-u (2.0 mL) dodavan je tokom 2 h rastvoru supstance1h(100 mg, 0.33 mmol), Ph3P (104 mg, 0.44 mmol) i fenola6c(65 mg, 0.34 mmol) u THF-u (7.0 mL) na sobnoj temperaturi. Smeša je mešana tokom 4 h, a zatim ukoncentrovana pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (heksan:EtOAc; 30:70 do 50:50) da bi se dobila supstanca6d(46 mg, prinos 29%) kao bela pena.

Korak d:

Rastvoru estra6d(44 mg, 0.09 mmol) u smeši THF-a (3 mL) i MeOH (1 mL) dodat je vodeni 1 N rastvor LiOH (1.0 mL, 1.0 mmol). Nakon 4 h na sobnoj temperaturi, dodat je 1 N HCI (2 mL). Smeša je ekstrahovana pomoću EtOAc. Organski sloj je ispran vodom i slanim rastvorom, osušen (MgS04), filtriran i ukoncentrovan do suvog da bi se dobila supstanca1014(39 mg, prinos 93%) kao bela čvrsta supstanca. Odgovarajuća natrijumova so dobijena je tretiranjem sa 1 ekvivalentnom vodenog natrijum hidroksida, i tako nastali rastvor je liofilizovan da bi se dobila pahuljasta bela čvrsta supstanca.

ESEJI ZA REVERZNU TRANSCRIPTAZU(RT)

Teoretska osnova eseja;

Među enzimima za koje virus humane imunodeficijencije (Human Immunodeficiencv Virus, HIV-1) poseduje genetsku informaciju je i reverzna transkriptaza (1), nazvana tako zato što katališe transkripciju DNK kopije sa RNK matrice. Ova aktivnost se može kvantitativno izmeriti u enzimskom eseju bez ćelija i zasnova se na zapažanju da reverzna transkriptaza može da koristi sintetičku matricu poly r(C), čija je početnica biotinilizovani oligo d(G) da bi došlo do transkripcije radioaktivno obeleženog lanca DNK uz korišćenje 3H-dGTP kao supstrata. Dole opisani esej koristi enzim iz divljeg soja (koji je predominantni oblik enzima uočen kod pacijenata inficiranih HIV-1 virusom) i takođe može biti korišćen i kod mutantnih RT enzima (na primer,Y181C,dobijen topički-usmerenom mutagenezom, kod koje je tirozinski ostatak na kodonu 181 zamenjen cisteinskim ostatkom) u odgovarajućim uslovima eseja. Uz pomoć ovog eseja može se uraditi evaluacija efikasnosti supstanci u inhibiranju mutantnih enzima.

Materijali:

a) Pripremanje enzima

Neke mutante HIV-1 IIIB klona BH10 RT obezbedio je Dr. C.-K. Shih (Boehringer

Ingelheim Pharmaceuticals Inc., U.SA.) u vektoru pKK233-2 (Pharmacia). Ukratko, HIV RT klon pKRT2 koji sadrži samo RT p66 gen regulisan sistemomlac operon/ trc promoter dobijenje od Dr. W. Summersa (Univerzitet Yale) (2). Različite specifične supstitucije amino kiselina uvedene su u gen RT divljeg soja topički-usmerenom mutagenezom. Klonovi RT su subklonirani u pKK233-2 bakterijski vektor za ekspresiju. Obezbeđeni klonovi uključuju divlji soj (wt), Val106Ala, Tyr181Cys, Tyr188Cys, Tyr188Leu, Gly190Ala i Pro236Leu. Ostali su napravljeni za potrebe eseja, topički-usmerenom mutagenezom klonova pKK233-2 RT uključujući Lys103Asn, Lys103Asn/Tyr181Cys, Lys103Asn/Leu100lle, Lys103Asn/Pro225His, i Lys103AsnA/al108lle.

b) Prečišćavanje enzima

Prečišćavanje rekombinantne reverzne transkriptaze je urađeno korišćenjem

kombinacije prethodno opisanih postupaka (3). Jedna kolonija sa sveže ploče transformisanih JM109 ćelija je korišćena da bi se inicirao rast pre-kulture gajene o/n na

37°C. Ovom pre-kulturom inokulisano je dva litra medijuma za rast. Ekspresija gena za RT je indukovana pomoću IPTG (finalna koncentracijal mM) na OD60o~1.5 (5-6 h na 37°C), i fermentacija je nastavljena tokom još nekoliko sati na 37 °C. Nakon centrifugiranja, odbačeni su supernatanti, dok su ćelije prikupljene i čuvane na -80 °C do prečišćavanja. Ćelije su odmrznute na 4 °C preko noći i resuspendovane u puferu za liziranje (MES 50mM pH 6, EDTA 1mM, 10% v/v glicerol, 0.02% w/v OBG, 0.02% w/v natrijum azid). Potom je dodat lizozim i smeša inkubirana na ledu 40 minuta. Nakon homogenizacije korišćenjemDouncehomogenizera u prisustvu lizozima, i sonifikacije, ćelije su cetrifugirane tokom 30 minuta. Supernatant (S1) je izdvojen i sačuvan na 4°C, talog po centrifugiranju je resuspendovan u puferu za ekstrakciju (MES 50mM pH 6, KP0450 mM pH 6, KCI 100mM, 10% v/v glicerol, 0.02% w/v OBG, 0.02% w/v natrijum azid) i mešan tokom 30 minuta na 4°C. Ovako dobijena druga smeša je ponovo centrifugirana i izdvojen supernatant (S2). Gore navedena procedura je ponovljena još dva puta, uz čuvanje supernatanta S3 i S4, dok je poslednja ekstrakcija urađena preko noći (S5). Polimin P (finalna koncentracija 0.005%) je dodat kombinovanim supernatantima da bi se uklonile nukleinske kiseline. Ovaj rastvor je mešan tokom 75 minuta na 4 °C i centrifugiran 1 h. Supernatant (SS1) je istaložen na ledu 20% w/v amonijum sulfatom i mešan tokom 1 h na 4 °C. Smeša je potom centrifugirana i tako dobijen supernatant (SS2) istaložen dodatnim 40% w/v amonijum sulfatom (60% ukupno), mešan tokom 1 h i ponovo centrifugiran. Krajnji talog (P1) je ostavljen na 4 °C preko noći pre prečišćavanja koje je usledilo narednog dana. Svi koraci prečišćavanja su izvođeni na 4 °C, ukoliko nije drugačije navedeno.

Pelet (P1) je resuspendovan u MES 50mM pH 6, KP0410 mM pH 6, KCI 100mM, 10% v/v glicerol, 0.02% w/v OBG, 0.02% w/v natrijum azid. Suspenzija je dijalizirana preko noći nasuprot istog pufera, uz korišćenje 12-14kD MVVCO creva za dijalizu. Dijalizat je centrifugiran i supernatant filtriran kroz Millex-PF 0.8 um jedinicu za filtriranje. Filtrirani uzorak je nanešen na Hidroksi Apatit kolonu (zapremina kolone 30-mL) i opran istim puferom. Vezani enzim je eluiran pomoću -220 mL linearnog gradijenta od 10 do 300mM KP04u gore navedenom puferu. Frakcije koje su sadržale heterodimer p66/p51(kao što je određeno 8%SDS-PAGE i VVestern blot-om) prikupljene su za sledeću kolonu. Frakcije koje su sadržale RT razblažene su dva puta rastvorom Bis-Tris propan 50 mM pH 7.0, 0. 02% w/v OBG, 10% v/v glicerol, 0. 02% w/v natrijum azid i nanešene na colonu Hi-Trap Heparin Sepharose (zapremina kolone 5-mL ) i oprane istim puferom. Vezana RT je potom eluirana pomoću 75 mL linearnog gradijenta od 0 do 1 M amonijum sulfata u istom puferu. Frakcije koje su sadržavale RT su prikupljene prema SDS-PAGE i VVestern blot analizama. Koncentracija proteina u ovom objedinjenom uzorku određena je metodom po Bradford-u, korišćenjem BSA kao standarda. Konačni preparat enzima je dijaliziran u MES 50mM pH 6, KP04300 mM pH 6, KCI 175mM, 10% v/v glycerol, 0.02% w/v natrijum azida, alikvotiran i smrznut na -80° C.

PROCEDURA ESEJA:

Radiometrijski enzimski esej je prilagođen formatu mikrotitar ploče sa 96 otvora i koristi streptavidinska scintilaciona zrnca. Esej je niže ukratko opisan. Enzim RT iz HIV-1 je odmrznut i rastvoren na odgovarajući način u Tris/HCI 50 mM pH 7.8 koji sadrži NaCI 60mM, MgCI2heksahidrat 2mM, DTT 6mM, GSH 2mM i 0.02% w/v Chaps da bi se dobila koncentracija enzima~ 3nM enzima. U 30 uL ovog rastvora enzima dodato je 10 uL rastvora inhibitora (50 pM do 2.5 nM inhibitora u istom puferu za ovaj esej kao što je gore naveden, koji još sadrži 15% v/v DMSO). Ploča je pre-inkubirana tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi pre prelaska na sledeći korak. U ovom koraku pre-inkubacije, najviša koncentracija inhibitora je bila 12.5 uM, a najniža 0.62 nM, i koncentracija DMSO je bila 3.75% v/v. Zatim je dodavanjem 10 uL rastvora supstrata inicirana enzimska reakcija. Konačna reakciona smeša je sadržavala Tris/HCI 50 mM pH 7.8, NaCI 60 mM, MgCI2»6H20 2 mM, DTT 6 mM, GSH 2 mM, Chaps 0.02% w/v DMSO 3% v/v, Poly rC 179 nM, Biotin dGi518 nM, dGTP 288 nM,<3>H-dGTP 71 nM, i 1-2 nM enzima.

U inkubacionom koraku, najviša koncentracija inhibitora je bila 10 uM, a najniža 0.5 nM. Nakon dodavanja supstrata, ploča je pokrivena zaptivajućom plastičnom folijom i inkubirana 1 sat na 37°C u suvom termostatu. Zatiim je usledilo gašenje reakcije dodavanjem 75 uL EDTA 0.5M koji je sadržao 5mg/mL streptavidinskih scintilacionih zrnaca.

Ploča je mešana tokom 2 minuta na srednjoj brzini i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Zatim je dodato 75 uL 7 M rastvora cezijum hlorida, ploča mešana tokom 2 minuta na srednjoj brzini i ponovo inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Ploča je potom pokrivena zaptivajućom plastičnom folijom i izvršeno merenje scintilacije na čitaču scintilacije i luminiscencije za mikrotitar ploče (TopCount-NXT™ Microplate Scintillation & Luminescence Counter), (Packard). Čitanje scintilacije u svakom od otvora je trajalo 60 sekundi. U svakom redu, na krajevima su bili otvori koji su predstavljali šlepu probu i kontrolu.

Izračunavanje procenta inhibicije je urađeno prema formuli:

Korišćenjem gore opisanog eseja, supstanca ovog pronalaska je testirana na inhibiciju RT kod divljeg soja i mutantnih enzima. Rezultati su prijazani u Tabeli 4, kao IC50 (nM).

Da bi potvrdili sposobnost supstance da inhibira replikaciju HlV-a , testirana je takođe na kulturi humanih T-ćelija (Syncytia). Esej je opisan u daljem tekstu.

ELISA esej za procenu aktivnosti u kulturi ćelija

Testirana je i sposobnost supstance ovog pronalaska da inhibira replikaciju HlV-a u kulturi ćelija u eseju na ploči sa 96 otvora. Kompletan RPMI 1640, koji se sastoji od RPMI 1640 + 10% fetalnog seruma govečeta (FBS), 10 (.ig/ml gentamicina i 10 |_iM (3-merkaptoetanola korišćen je i za razblaženje supstance i kao medijum za rast ćelija. Ćelijska linija C8166T limfocita je inficirana, sa multiplicitetom infekcije od 0.001, virusima koji kodiraju reverznu transkriptazu divljeg soja, kao i mutantni enzim. Ćelije su potom inkubirane tri dana u prisustvu serijskih razblaženja supstance ovog pronalaska. Prikupljen je i pulovan supernatant iz osam paralelnih otvora i određena koncentracija ekstracelularnog p24 korišćenjem komercijalno dostupnog kita za određivanje HIV-1 p24 antigena (Beckman-Coulter<®>). Stepen inhibicije (% inhibicije) je izračunat preko sledeće jednačine:

Rezultati su prikazani u Tabeli 2, kao EC50(nM).

REFERENCE (UKLJUČENE OVDE KAO REFERENCE NA KOJE SE POZIVA)

1. Benn, S., et al. Science 230:949, 1985.

2. D'Aquila, R. T. and Summers, W. C. J. Acq. Imm. Def. Syn. 2:579, 1989. 3. a) VVarren, T. C. et al. Protein Expression & Purification 3:479, 1992; b) Kohlstaedt, L. A. Science 256(5065): 1783, 1992.

Claims (25)

1.Supstanca formule : pri čemu R2 je H, halogen, (d_4)alkil, 0(d_4)alkil, NH(d.4alkil) ili N(C1.4alkil)2; R4je H ili CH3; R<5>je H ili CH3, pod uslovom da R4 iR<5>nisu oba isto; R<12>je H, halogen, (d.4)alkil, CF3, ili N02; R<13>je H, (C1.4)alkil, halogen, OH, ili NH2, pod uslovom daR12i R<13>nisu oba H; i R<14>je COOR<14a>pri čemu R<14a>je H ili (C1.6)alkil; ili R<14>je (C2.4)alkenil-COOR<14a>pri čemu R14a je kao što je ovde definisano; ili R<14>je (d_4)alkil-COOR14a pri čemu R14a je kao što je gore definisano; ili njena so ili njen pro-lek.

2. Supstanca prema patentnom zahtevu 1, pri čemu R<2>je H, halogen, (d.4)alkil, 0(d.4)alkil ili N(d.4alkil)2 , i R4 iR<5>nisu oba isto.

3. Supstanca prema patentnom zahtevu 2, pri čemu R<2>je H, Cl, F, (d.4)alkil, 0(d_4)alkil, ili (N(d_4)alkil)2.

4. Supstanca prema patentnom zahtevu 3, pri čemu R<2>je H, Cl, F, CH3, OMe, ili OEt.

5. Supstanca prema patetnom zahtevu 4, pri čemu R<2>je H.

6. Supstanca prema patentnom zahtevu 1, pri čemu R<4>jeH.

7. Supstanca prema patentnom zahtevu 1, pri čemu R<5>je CH3.

8. Supstanca prema patentnom zahtevu 1, pri čemu R<12>je halogen, (Ci.4)alkil, CF3, ili N02.

9. Supstanca prema patentnom zahtevu 8, pri čemu R<12>je Br, Cl, CH3 ili CH3CH2.

10. Supstanca prema patentnom zahtevu 9, pri čemu R<12>je CH3 ili CH3CH2.

11. Supstanca prema patentnom zahtevu 1, pri čemu R<13>je H, CH3, halogen, OH, ili NH2.

12. Supstanca prema patentnom zahtevu 11, pri čemu R13 je H, CH3, or OH.

13. Supstanca prema patentnom zahtevu 12, pri čemu R13 je H.

14. Supstanca prema patentnom zahtevu 1, pri čemu R14je COOH, COOMe, (C2_4)alkenil-COOH, ili (C^alkil-COOH.

15. Supstanca prema patentnom zahtevu14,pri čemu R14 je COOH, CH=CH-COOH, CH2COOH, ili CH2CH2COOH.

16. Supstanca prema patentnom zahtevu 15, pri čemu R14 je COOH.

17. Supstanca formule (I) prema patentnom zahtevu 1: pri čemu R<2>je H, Cl, F, CH3, OMe ili OEt; R<4>je H; R<5>je CH3; R<12>je Br, Cl, CH3ili CH2CH3; R13 je H, CH3 ili OH; i R<14>je COOH, CH=CH-COOH, CH2COOH ili CH2CH2COOH; ili njena so ili njen pro-lek.

18. Supstanca prema patentnom zahtevu 17, pri čemu R2 je H; R<4>je H; R<5>je CH3; R12 je CH3ili CH3CH2; R13 je H; i R<14>je COOH; ili njena so ili njen pro-lek.

19. Farmaceutska kompozicija za lečenje ili prevenciju HIV infekcije, koja uključuje supstancu formule I, prema patentnom zahtevu 1, ili njene farmaceutski prihvatljive soli i farmaceutski prihvatljiv nosač.

20. Postupak za lečenje ili prevenciju HIV infekcije, koji uključuje primenu kod pacijenta HlV-inhibitorne količine supstance formule I, prema patentnom zahtevu 1, ili njene farmaceutski prihvatljive soli.

21. Postupak za lečenje ili prevenciju HIV infekcije, koji uključuje primenu kod pacijenta HlV-inhibitorne količine farmaceutske kompozicije, prema patentnom zahtevu 19, ili njene farmaceutski prihvatljive soli.

22. Postupak za lečenje ili prevenciju HIV infekcije, koji uključuje primenu supstance formule I, prema patentnom zahtevu 1, u kombinaciji sa antiretrovirusnim lekom.

23. Postupak za sprečavanje perinatalnog prenošenja HIV-1 sa majke na bebu, koji uključuje primenu supstance formule I, prema patentnom zahtevu 1, kod majke pre porođaja.

24. Upotreba supstance formule I prema patentnom zahtevu 1 ili njene farmaceutski prihvatljive soli, za pravljenje leka za lečenje ili prevenciju HIV infekcije.

25. Upotreba supstance formule I prema patentnom zahtevu 1 ili njene farmaceutski prihvatljive soli, za pravljenje leka za prevenciju perinatalnog prenošenja HIV-1 sa majke na bebu pre porođaja.