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CN1318420C - 二吡啶并二氮杂䓬酮类反转录酶抑制剂 - Google Patents

二吡啶并二氮杂䓬酮类反转录酶抑制剂 Download PDF

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CN1318420C
CN1318420C CNB038064634A CN03806463A CN1318420C CN 1318420 C CN1318420 C CN 1318420C CN B038064634 A CNB038064634 A CN B038064634A CN 03806463 A CN03806463 A CN 03806463A CN 1318420 C CN1318420 C CN 1318420C
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Abstract

本发明公开了可用作HIV反转录酶抑制剂的式I化合物或其盐或前药，其中R<sup>2</sup>为H、卤素、(C<sub>1-4</sub>)烷基、O(C<sub>1-4</sub>)烷基、HN(C<sub>1-4</sub>烷基)或N(C<sub>1-4</sub>烷基)<sub>2</sub>；R<sup>4</sup>为H或CH<sub>3</sub>；R<sup>5</sup>为H或CH<sub>3</sub>；R<sup>12</sup>为H、卤素、(C<sub>1-4</sub>)烷基、CF<sub>3</sub>或NO<sub>2</sub>；R<sup>13</sup>为H、(C<sub>1-4</sub>)烷基、卤素、OH或NH<sub>2</sub>，条件是R<sup>12</sup>与R<sup>13</sup>不都为H；及R<sup>14</sup>为COOR<sup>14a</sup>，其中R<sup>14a</sup>为H或(C<sub>1-6</sub>)烷基；或R<sup>14</sup>为(C<sub>2-4</sub>)烯基-COOR<sup>14a</sup>，其中R<sup>14a</sup>如文中定义；或R<sup>14</sup>为(C<sub>1-4</sub>)烷基-COOR<sup>14a</sup>，其中R<sup>14a</sup>的定义同上。

Description

二吡啶并二氮杂䓬酮类反转录酶抑制剂
技术领域
本发明涉及新颖化合物及其可药用盐、其在治疗或预防HIV感染中的应用(单独使用或与其他治疗药物组合使用)及包含这些化合物的药物组合物。
背景技术
被称为获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的疾病是由人类免疫缺陷病毒(HIV)，尤其是被称为HIV-1株引起的。为使HIV可被宿主细胞复制，病毒基因组的信息必须整合入宿主细胞的DNA中。然而，HIV是一种反转录病毒，意味着遗传信息为RNA形式。因此HIV复制循环需要将病毒基因组(RNA)转录为DNA的步骤，此过程为正常事件链的逆转。已被适当命名为反转录酶(RT)的酶可将病毒RNA转录为DNA。HIV病毒颗粒包括RT拷贝及病毒RNA。
已知反转录酶具有三种酶功能：其可作为RNA依赖性DNA聚合酶、核糖核酸酶及DNA依赖性DNA聚合酶。作为RNA依赖性DNA聚合酶时，RT可将病毒RNA转录为单链DNA拷贝。作为核糖核酸酶时，RT可破坏初始病毒RNA，并将刚从初始RNA产生的DNA游离出来。最后，作为DNA依赖性DNA聚合酶时，RT可以第一DNA链为模板制造出第二股互补的DNA链。该两股将形成双链DNA，该双链DNA通过另一种称作整合酶的酶整合入宿主细胞基因组中。
抑制HIV-1反转录酶的酶功能的化合物将抑制受感染细胞中HIV-1的复制。这些化合物可用于预防或治疗人类的HIV-1感染，这些预防或治疗效果已公知的多种RT抑制剂例如3′-叠氮-3′-脱氧胸苷(AZT)、2′，3′-二脱氧肌苷(ddI)、2′，3′-二脱氧胞苷(ddC)、d4T、3TC、奈韦拉平、地拉韦啶、依法韦仑及阿巴卡韦所证实，这些抑制剂为迄今被批准用于治疗AIDS的主要药物。
正如任一抗病毒的治疗，利用RT抑制剂治疗AIDS最终导致病毒对所给药物敏感变低。对这些药物的抗性(敏感性降低)起因于pol基因的反转录酶片段中发生突变。几种HIV突变株的特征业已被鉴定，且对已知治疗药物的抗性归因于RT基因中的突变。临床中某些最为常见的突变体为：Y181C突变体，其中密码子181上的酪氨酸(Y)突变为半胱氨酸(C)残基；及K103N，其中103位上的赖氨酸(K)由天冬酰胺(N)替代。在利用已知的抗病毒药进行治疗期间，出现频率愈来愈高的其他突变体包括：单突变体V106A、G190A、Y188C及P236L；以及双突变体K103N/Y181C、K103N/P225H、K103N/V108I及K103N/L100I。
持续使用抗病毒化合物来预防HIV感染必然将导致更多新HIV抗性株的出现。因此，需要对抗各种突变体、具有不同作用模式的新型RT抑制剂。
作为HIV-1抑制剂的具三环结构的化合物在第5,366,972号美国专利中被述及。其他HIV-1反转录酶抑制剂在Hargrave等人的J.Med.Chem.，34，2231(1991)中被记载。
第5,705,499号美国专利提出8-芳烷基-及8-芳杂烷基-5，11-二氢-6H-二吡啶并[3，2-B：2′，3′-E][1，4]二氮杂为RT抑制剂。这些例示的化合物显示具有一定程度的对抗野生型HIV-1RT及突变HIV-1RT(尤其是Y181C)的活性，亦可对抗其他单突变体(虽作用较小)，例如K103N。
WO01/96338A1及美国专利6,420,359公开了具喹啉及喹啉-N-氧化物取代基的二氮杂结构化合物物为RT抑制剂。所例示的化合物具有抗HIVWT、单突变株及双突变株的活性。
发明概述
本发明提供一种含取代苯甲酸的化合物，其为野生型(WT)HIV-1RT及HIV-1RT的双突变株(尤其是双突变株K103N/Y181C)的有效抑制剂。
本发明的第一方面是提供一种式I化合物：
其中，
R2为H、卤素、(C1-4)烷基、O(C1-4)烷基、HN(C1-4烷基)或N(C1-4烷基)2；
R4为H或CH3；
R5为H或CH3；
R12为H、卤素、(C1-4)烷基、CF3或NO2；
R13为H、(C1-4)烷基、卤素、OH或NH2，条件是R12与R13不都为H；以及
R14为COOR14a，其中R14a为H或(C1-6)烷基；或R14为(C2-4)烯基-COOR14a，其中R14a如本文中定义；或R14为(C1-4)烷基-COOR14a，其中R14a如本文中定义；
或其盐或前药。
本发明的第二方面是提供一种用于治疗或预防HIV感染的药物组合物，其包含如本说明书所述的式I化合物，或其可药用盐，及可药用载体。
本发明的第三方面是提供一种治疗或预防HIV感染的方法，其包括对患者施用HIV抑制量的式I化合物或其可药用盐，或药物组合物(二者皆如本说明书的定义)。
本发明的第四方面是提供一种治疗或预防HIV感染的方法，其包括将包含这里定义的式I化合物的药物组合物与抗反转录病毒药物组合给药。
本发明的第五方面是提供一种预防从母亲至婴儿的围产期HIV-1传染的方法，其包括在母亲分娩前施用这里记载的式I化合物或药物组合物。
发明详述
定义
除非另有说明，否则适用下列定义：
本文中所用术语“(C1-2)烷基”、“(C1-4)烷基”及“(C1-6)烷基”(无论单独出现或与另一基团组合出现)分别意指最多包含两个、四个或六个碳原子的无环的烷基。这些基团的实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、1-甲基乙基、1-甲基丙基、2-甲基丙基及1，1-二甲基乙基。
本文所用术语“(C2-4)烯基”(无论其单独出现或与另一基团组合出现)意指包含两个至四个碳原子的不饱和无环基团。
本文所用术语“卤素”意指卤素原子并包括氟、氯、溴及碘。
本文所用术语“可药用盐”包括衍生自可药用碱且无毒性的盐。适当的碱的实例包括胆碱、乙醇胺及乙二胺。Na+、K+及Ca++盐亦被包括在本发明的范围内(另参见Pharmaceutical salts(药物盐)，Birge，S.M.等人，J.Pharm.Sci.，(1977)， 66，1-19，这里引入作为参考)。
本文所用术语“前药”是指可药用衍生物，由衍生物所得的生物转化产物是式I化合物所定义的活性药物。这些衍生物的实例包括(但不限于)酯与酰胺(参见Goodman及Gilman在The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第9期，McGraw-Hill，Int.Ed.1995，“Biotransformation ofDrugs(药物的生物转化)”，p11-16，这里引入作为参考)。
优选实施方案的详细说明
优选地，R2为H、卤素、(C1-4)烷基、O(C1-4)烷基或N(C1-4)烷基)2。更优选地，R2为H、Cl、F、(C1-4)烷基、O(C1-4)烷基或N(C1-4)烷基)2。更优选地，R2为H、Cl、F、CH3、OMe或OEt。最优选地，R2为H。
优选地，R4及R5不相同。
更优选地，R4为H。
更优选地，R5为CH3。
优选地，R12为卤素、(C1-4)烷基、CF3或NO2。更优选地，R12为Br、Cl、CH3或CH3CH2。最优选地，R12为CH3或CH3CH2。
优选地，R13为H、CH3、卤素、OH或NH2。更优选地，R13为H、CH3或OH。最优选地，R13为H。
优选地，R14为COOH、COOMe、(C2-4)烯基COOH或(C1-4)烷基COOH。更优选地，R14为COOH、CH＝CH-COOH、CH2COOH或CH2CH2COOH。最优选地，R14为COOH。
式I化合物为野生型HIV的有效抑制剂并可抑制双突变体酶K103N/Y181C。
式I化合物对HIV-1反转录酶具有抑制性活性。当以适当剂型给药时，这些化合物用于治疗AIDS、ARC及与HIV-1感染相关的其他病症。因此本发明的另一方面是一种治疗HIV-1感染的方法，包括对感染HIV-1的人施用治疗有效剂量的上述新颖式I化合物。无论被称为治疗或预防，该化合物亦可通过对分娩前母亲给药来防止从母亲至婴儿的围产期HIV-1传染。
这些式I化合物可通过口服或经肠胃外给药方式一次给药或分次给药。式I化合物的适当口服剂量介于约0.5毫克/天与3克/天之间。对于体重为70公斤的患者而言，式I化合物的口服剂量优选介于约100毫克/天与800毫克/天之间。在肠胃外给药制剂中，适当的剂量单位可包含0.1至250毫克所述化合物，优选为1毫克至200毫克。但是应该理解不同患者的给药剂量不同，任一特定患者的给药剂量取决于临床医师的诊断，该临床医师将依据患者的体重及状况及其对药物的反应确定适当给药剂量。
若本发明的化合物通过口服方式给药，则其可以药物制剂形式作为药物给药，这些药物制剂包含这些化合物以及与其可配伍的药用载体。这些载体物质可为适于口服的惰性有机或无机载体物质。这些载体物质的实例为水、明胶、滑石粉、淀粉、硬脂酸镁、阿拉伯胶、植物油、聚链烷二醇、凡士林等。
这些式I化合物可与本技术领域的普通技术人员熟悉的抗反转录病毒药物组合使用，可供同时、单独或依次给药的组合制剂以用于治疗或预防个体的HIV感染。可与式I化合物用于组合治疗的抗反转录病毒药物的实例包括(但不限于)：核苷/核苷酸反转录酶抑制剂(例如AZT及替诺福韦)、非核苷类反转录酶抑制剂(例如奈韦拉平)、蛋白酶抑制剂(例如Ritanovir))、病毒融合抑制剂(例如T-20)、CCR5拮抗剂(例如SCH-351125)、CXCR4拮抗剂(例如AMD03100)、整合酶抑制剂(例如L-870，810)、TAT抑制剂、其他研制中的药物(例如PRO-542、BMS-806、TMC-114或AI-183)、抗真菌剂或抗细菌剂(例如氟康唑)及免疫调节剂(例如左旋咪唑)。此外，一种式I化合物可与另一种式I化合物组合使用。
这些药物制剂可通过常规方式加以制备，所制成的剂型可为固态剂型，例如片剂、糖衣片、胶囊等；或液态剂型，例如溶液、混悬剂、乳剂等。这些药物制剂可进行常规的制药操作，例如灭菌。此外，这些药物制剂可包含常规佐剂，例如防腐剂、稳定剂、乳化剂、调味剂、润湿剂、缓冲剂、用于改变渗透压的盐等。可应用的固态载体物质包括，例如淀粉、乳糖、甘露醇、甲基纤维素、微晶纤维素、滑石粉、二氧化硅、磷酸氢钙及高分子量聚合物(例如聚乙二醇)。
进行肠胃外应用的时候，化学式I化合物可以水溶液，或在药物可接受油中的非水性溶液、悬浮液或乳液，或混合液体的形式施药，这些液体可包含抑菌剂、抗氧化剂、防腐剂、缓冲剂或其他使溶液与血液等渗的溶质、增稠剂、助悬剂或其它可药用添加剂。这种类型的添加剂包括，例如酒石酸盐、柠檬酸盐及醋酸盐缓冲液、乙醇、丙二醇、聚乙二醇、螯合物形成剂(例如EDTA)、抗氧化剂(例如亚硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠及抗坏血酸)、用于调节粘度的高分子量聚合物(例如液态聚氧化乙烯)以及山梨醇酐的聚乙烯衍生物。必要时亦可加入防腐剂，例如苯甲酸、对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、苯扎氯铵及其他季铵化合物。
本发明的化合物亦可作为经鼻用药溶液施用，除本发明的这些化合物外，还包含溶于水媒剂中的适当缓冲剂、渗透压调节剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂及增粘剂。用于增加粘度的试剂实例为聚乙烯醇、纤维素衍生物、聚乙烯吡咯烷酮、聚山梨酸酯或甘油。所添加的抗微生物防腐剂可包括苯扎氯铵、硫柳汞、氯丁醇或苯乙醇。
另外，本发明所提供的化合物可以栓剂形式用药。
方法及合成
本发明的化合物可利用有机合成化学工作者所熟知的技术制备。示范性的反应流程如下图1至图4所示。取代基R2、R4、R5、R12、R13及R14如本文中定义。
流程1：中间体(其中R4为甲基)的制备
简言之，用乙胺进行1(i)的芳环取代(SNAR)生成中间体1(ii)。然后，利用溴化剂(例如NBS或溴)卤化第5位生成1(iii)。通过由碱参与的SnAR反应使1(iii)闭环，从而生成三环中间体1(iv)。由1(iv)中C-2氯的芳环取代反应引入R2取代基，从而生成中间体化合物1(v)。
流程2：中间体(其中R5为甲基)的制备
流程2的反应顺序与J.M.Klunder等人的J.Med.Chem.1998，41，2960-71及C.L Cywin等人的J.Med.Chem.1998，41，2972-84中所述的反应顺序类似。简述之，由用乙胺进行2(i)的芳环取代(SNAR)生成中间体2(ii)。硝基的环原反应(例如利用催化加氢反应)生成2(iii)。碱参与的2(iii)与，例如5-溴-2-氯-3-吡啶基羰基氯的缩合反应生成2(iv)。通过碱参与的SnAR反应使2(iv)闭环，生成三环中间体2(v)。2(vi)中的R5甲基可利用本技术领域已知的烷基化反应例如碘甲烷引入。
流程3：中间体(其中R2为C1-4烷基)的制备
Figure C0380646300111
简言之，3(i)与3(ii)之间碱参与的缩合反应将生成中间体3(iii)。用乙胺进行的3(iii)的芳环取代(SNAR)生成中间体3(iv)。由碱参与的SnAR反应使3(iv)闭环，进而形成三环中间体，对该三环中间体进行烷基化生成中间体化合物3(v)。
流程4：化合物(其中R4为甲基)的另一种制备方法
Figure C0380646300112
简言之，4(i)与3(ii)之间的碱参与的缩合反应生成中间体4(ii)。乙胺进行的4(ii)的芳环取代((SNAR)生成中间体4(iii)。碱参与的SnAR反应使4(iii)闭环，进而形成三环中间体化合物1(v)。
流程5：苯甲酸衍生物的引入
简言之，如本文所述合成的溴衍生物5(i)与烯丙基锡试剂在非质子溶剂(例如DMF)中且在催化剂存在下发生交联偶合反应，将形成具C-8取代基的5(ii)。氧化双键(例如由臭氧分解生成臭氧化物)，然后进行还原反应，生成含C-8羟乙基取代基的5(iii)。当Y为R14时(COOH除外)，通过Mitsunobu型反应将萘衍生物5(iv)、5(v)或5(vi)与5(iii)缩合，进而生成式I化合物。或者，当Y为R14基团前体例如COOCH3时，可通过Mitsunobu型反应将5(iv)或5(v)与5(iii)缩合，然后，Y可以化学方式转化成R14取代基，例如通过COOCH3的皂化反应生成COOH，从而得到式I化合物。
如前所述，本发明所提供的化合物可抑制HIV-1 RT的酶活性。基于下述对这些化合物的检测，可知这些化合物抑制HIV-1 RT的RNA依赖性DNA聚合酶的活性。可知(数据未显示)这些化合物亦抑制HIV-1 RT的DNA依赖性DNA聚合酶的活性。利用下述反转录酶(RT)分析法可检测化合物抑制HIV-1 RT的RNA依赖性DNA聚合酶活性的能力。下述实施例中所述的某些特定化合物按照这种方式进行检测。该检测结果在表2中以IC50及EC50形式列出。
实施例
本发明通过下列非限制性实施例进行详细说明。除非另有说明，所有反应均在氮气或氩气气氛中进行。温度均以摄氏温度表示。除非另有说明，溶液百分比或比率均表示体积-体积关系。
本文中所用缩略语或符号包括：
DEAD：偶氮二甲酸二乙酯；
DIAD：偶氮二甲酸二异丙酯；
DIEA：二异丙基乙胺；
DMAP：4-(二甲胺基)吡啶；
DMSO：二甲基亚砜；
DMF：二甲基甲酰胺；
DCC：二环己基碳二亚胺；
ESMS：电喷雾质谱法；
Et：乙基；
EtOH：乙醇；
EtOAc：醋酸乙酯；
Et2O：乙醚；
HPLC：高效液相色谱法；
iPr：异丙基；
Me：甲基；
MeOH：甲醇；
MeCN：乙腈；
NaHMDS：六甲基二甲硅基氨基钠；
NBS：N-溴代丁二酰亚胺；
Ph：苯基；
TBE：三硼酸盐-EDTA；
TBTU：2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′N′-四甲基脲四氟硼酸盐；
TFA：三氟醋酸；
THF：四氢呋喃；
PFU：噬斑形成单位；
DEPC：焦碳酸二乙酯；
DTT：二硫苏糖醇；
EDTA：乙二胺四乙酸盐；
UMP：尿苷5′-单磷酸；
UTP：尿苷5′-三磷酸；
MES：2-(n-吗啉代)乙磺酸；
SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法；
MWCO：分子量截断；
Bis-Tris Propane：1，3-双{三(羟甲基)-甲胺基}丙烷；
GSH：还原谷胱甘肽；
OBG：n-正辛基-β-D-葡萄糖苷。
合成方法
下列实例例示说明本发明化合物的制备方法。
实施例1：
Figure C0380646300141
步骤a：
将2M乙胺的THF溶液(365毫升，731毫摩尔)加至2-氯-3-硝基吡啶1a(51克，325毫摩尔)溶于THF(650毫升)的溶液中。将反应物在室温下搅拌过夜。将得到的反应混合液倒入水(约1.5升)中，滤出生成的固体并在减压下干燥，得到化合物1b(52克)。
步骤b：
在20％的Pd(OH)2/C(10.4克)存在下，将2-(乙胺基)-3-硝基吡啶1b(52克)溶于MeOH(600毫升)的溶液在氢气中(1大气压)及在室温下搅拌过夜。催化剂通过硅藻土过滤去除。将滤液减压浓缩，得到黑色固体的化合物1c(39克，步骤a与b的总收率为88％)。
步骤c：
将固体NaHCO3(56.3克，669毫摩尔)加入到冷却的3-胺基-2-(乙胺基)吡啶1c(30.6克，223毫摩尔)在MeCN(740毫升)的溶液中。5分钟后，加入粗制5-溴-2-氯-3-吡啶基羰基氯(由5-溴-2-羟基-3-吡啶基羧酸及SOCl2制得)(1当量，223毫摩尔)[如T.W.Gero等人在Synth.Commun.1989，19，553-559中所述(将其引入作为参考)，但略去水溶液的后处理]。2小时后，将反应混合液倒入冰/水(1.5升)中，过滤出所生成的固体，并依次用水及己烷洗涤。在减压下干燥过夜后，得到黑色固体的化合物1d(54.9克，收率为69％)。
步骤d：
在50℃下，向2-氯-N-{2-(乙胺基)-3-吡啶基}-5-溴-3-吡啶基甲酰胺1d(54.9克，154.4毫摩尔)的吡啶(308毫升)溶液，滴加1MNaHMDS的THF溶液(355毫升，355毫摩尔)。10分钟后，将反应溶液冷却至室温，然后倒入冰水中(2升)。过滤出所生成的固体，并用水然后用己烷洗涤。在减压下干燥过夜后，得到暗绿色固体的化合物1e(36克，收率为75％)。
步骤e：
将NaH(3.5克，138毫摩尔)加至8-溴-5，11-二氢-11-乙基-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮1e(36.7克，115毫摩尔)的DMF(380毫升)溶液中，并将混合液在50℃加热30分钟。将反应混合液冷却至室温并用MeI(14.3毫升，230毫摩尔)处理。1.5小时后，将此反应混合液倒入冰水中。过滤出所生成的固体，并且水然后用己烷洗涤，经干燥后得到暗灰色固体的化合物1f(37.9克，收率为99％)。
步骤f：
将烯丙基三丁基锡(30.7毫升，99.0毫摩尔)及Pd(Ph3P)4(5.20克，4.50毫摩尔)加至脱气的8-溴-5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮1f(30.0克，90.0毫摩尔)的DMF(450毫升)溶液中(向溶液中通入30分钟氮气)。将此混合液在90℃搅拌1.5小时，然后将其冷却至室温并减压浓缩。所得的残余物经快速层析法纯化(己烷与EtOAc的比介于8∶2与7∶3之间)，得到化合物1g(22.19克，收率为84％)。
步骤g：
将臭氧化的氧气流鼓泡通入5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-(2-丙烯基)-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮1g(22.19克，75.4毫摩尔)溶于CH2Cl2(150毫升)及MeOH(150毫升)的冷(-78℃)溶液中，时间为2.5小时。然后在此溶液中通入15分钟氮气流，随后加入固体NaBH4(4.99克，132毫摩尔)。让此反应混合物温热至室温。1小时后，加入饱和NH4Cl水溶液(200毫升)并在室温下将此混合物搅拌2小时。在减压下去除有机溶剂。将水(300毫升)及CHCl3(300毫升)加入至残余物中。将各相分离，水层用CHCl3(3×300毫升)萃取。将合并的有机层干燥(MgSO4)、过滤并减压浓缩。通过快速层析法(EtOAc∶CHCl3为4∶1)将所得的残余物纯化，得到白色固体的化合物1h(16.1克，收率为72％)。
实施例2：
步骤a：
用15分钟将EtNH2(49.8克，1.10摩尔)溶于甲苯(200毫升)的冰冷溶液加至2，6-二氯-3-硝基吡啶2a(100.0克，0.52摩尔)溶于甲苯(225毫升)的冰冷溶液中。在0℃下将该混合物搅拌45分钟。加入水(500毫升)及EtOAc(500毫升)并将各相分离。依次用水(200毫升)及盐水(200毫升)洗涤有机层并将其干燥(MgSO4)、过滤并减压浓缩。使所得的残余固体在MeOH中重结晶，得到黄色针状的化合物2b(83.7克，收率为80％)。
步骤b：
化合物2c按与实施例1的步骤b类似的方式制备。
步骤c：
在室温下，通过套管将5-溴-2-氯-3-吡啶基羰基氯(30.0克，97.0毫摩尔)溶于MeCN(100毫升)的溶液加入到3-胺基-6-氯-2-(乙胺基)吡啶2c(16.6克，97.0毫摩尔)溶于含固体NaHCO3(14.2克，169毫摩尔)的MeCN(180毫升)的溶液中。将此混合液在室温下搅拌1小时。加入水(200毫升)并将该混合物搅拌10分钟。过滤所生成的悬浮液。将所得的固体先用水然后用己烷洗涤并在减压下干燥，得到化合物2d(28.4克，收率为75％)。
步骤d：
将1M NaHMDS的THF溶液(167.5毫升，167.5毫摩尔)缓慢地加至5-溴-2-氯-N-{2-(乙胺基)-6-氯-3-吡啶基}-3-吡啶基甲酰胺2d(28.4克，72.8毫摩尔)溶于吡啶(146毫升)的溶液中，并加热至50℃。将反应混合液在50℃搅拌1.5小时。然后将该混合液倒入冰水混合液(1升)中，1小时后，过滤所生成的悬浮液。用水洗涤所得的固体并在减压下干燥，得到化合物2e(23.4克，收率为91％)。
步骤e：
在50℃，用30分钟将固体NaH(60％油分散体，3.46克，86.1毫摩尔)加至8-溴-2-氯-5，11-二氢-11-乙基-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮2e(23.4克，66.3毫摩尔)溶于DMF(220毫升)的溶液中。将此混合液在50℃下搅拌1小时，然后冷却至室温。将该混合液倒入水(1升)中并过滤所生成的悬浮液。依次用水及己烷洗涤所得固体并在减压下干燥，得到化合物2f(23.0克，收率为94％)。
步骤f：
将烯丙基三丁基锡(21.3毫升，68.7毫摩尔)及Pd(Ph3P)4(3.61克，3.12毫摩尔)加至脱气的8-溴-2-氯-5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮2f(23.0克，62.5毫摩尔)溶于DMF(312毫升)的溶液(向溶液中通入30分钟氮气)中。将此混合液加热至90℃并保持2小时。将其减压浓缩。通过快速层析法(己烷∶EtOAc为7∶3)纯化所得的残余物，得到化合物2g(13.4克，收率为65％)。
步骤g：
将臭氧化的氧气通入冷(-78℃)的2-氯-5，11-二氢-11-乙基-5-甲基-8-(2-丙烯基)-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮2g(13.4克，40.7毫摩尔)溶于MeOH(102毫升)及CH2Cl2(102毫升)溶液中，直至烯完全消失。在该溶液中通入氮气以去除过量臭氧。然后，将固体NaBH4(2.69克，71.1毫摩尔)分成小份加入，并将该溶液缓慢加热至室温。1小时后，加入饱和NH4Cl水溶液(150毫升)并将此混合液搅拌20分钟。在减压下将其中的有机溶剂去除。将水(100毫升)加至此水溶液中。用CHCl3(3×200毫升)萃取此溶液。将合并的有机层干燥(MgSO4)、过滤并减压浓缩。通过快速层析法(EtOAc∶CHCl3为4∶1)将所得残余物纯化，得到化合物2h(10.4克，收率为77％)。
实施例3：
步骤a：
将2，6-二氟吡啶3a(200克，1.74摩尔)滴加至在冰浴中(其内部温度保持在5-10℃)的浓硫酸(600毫升)与发烟硝酸(90％，400毫升)的混合液中。将所得的混合液在室温下搅拌过夜。将混合液缓慢倒入3公斤冰中并用Et2O(2×2升)萃取。将合并的有机层用1.5N NaOH(2×1升)洗涤，然后用饱和的NHCO3水溶液(400毫升)洗涤，或直至使pH值介于8-9之间为止。将有机层用MgSO4干燥，然后过滤及减压浓缩，直至恒重(以去除未反应的2，6-二氟吡啶：10-12％)为止。得到黄色液体的化合物3b(207.3克，收率为74％)。
步骤b：
在-40℃下，将乙胺(25.7克，570毫摩尔)溶于THF(250毫升)的溶液滴加至2，6-二氟-3-硝基吡啶3b(45.7克，285毫摩尔)溶于THF(500毫升)的溶液中。30分钟后，减压浓缩此反应混合液且使所得的残余物溶解于EtOAc中。有机相用盐水洗涤并干燥(MgSO4)、过滤及浓缩。所得的黄色固体通过快速层析法(15％EtOAc/己烷)纯化，得到黄色固体状的化合物3c(43.2克，收率为82％)。
步骤c：
在20％Pd(OH)2/C(4.35克)存在下，将2-乙胺基-6-氟-3-硝基吡啶3c(43.2克，230毫摩尔)溶于THF(1升)的溶液在室温下及氢气中(1大气压)搅拌过夜。催化剂通过硅藻土过滤去除。减压浓缩该滤液，得到黑色固体的化合物3d(36.3克，收率为95％)。
步骤d：
将固体NaHCO3(50.4克，600毫摩尔)加至3-胺基-2-乙胺基-6-氟吡啶3d(31.0克，200毫摩尔)溶于MeCN(160毫升)的冷溶液(4℃)中。15分钟后，加入5-溴-2-氯-3-吡啶羰基氯(1当量，200毫摩尔)溶于MeCN(155毫升)的溶液。在室温下反应60分钟后，将此反应混合液倒入水(1.2升)中并搅拌30分钟。过滤出所生成的固体并在50℃减压干燥过夜。得到黑色固体的化合物3e(73.7克，收率为99％)。
步骤e：
在50℃下，将1M NaHMDS的THF溶液(520毫升，520毫摩尔)滴加至2-氯-N-{2-(乙胺基)-6-氟-3-吡啶基}-5-溴-3-吡啶甲酰胺3e(73.5克，216毫摩尔)溶于吡啶(435毫升)的溶液中。10分钟后，反应溶液冷却至室温，然后将其倒入冰水(2升)中。将生成的固体过滤并先用水然后用己烷洗涤。在减压下干燥所得的固体，得到暗绿色固体的化合物3f(50.6克，收率为69％)。
步骤f：
将NaH(4.28克，178毫摩尔)加至8-溴-5，11-二氢-11-乙基-2-氟-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮3f(44克，130.5毫摩尔)溶于DMF(520毫升)的溶液中，并将此混合液50℃加热30分钟。然后将反应混合液冷却至室温并用MeI(24.4毫升，522毫摩尔)处理。1.5小时后，将此反应混合物倒入冰水中。过滤出所生成的固体，先用水然后用己烷洗涤，并在减压下干燥，得到黑灰色固体的化合物3g(43.2克，收率为94％)。
步骤g：
将烯丙基三丁基锡(32.0毫升，103.4毫摩尔)及Pd(Ph3P)4(5.43克，4.70毫摩尔)加至8-溴-5，11-二氢-11-乙基-2-氟-5-甲基-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮3g(33.0克，94.0毫摩尔)溶于DMF(470毫升)且经脱气的溶液(向溶液中通入45分钟氮气)中。分别于1、2、3、4及5小时后进一步加入Pd(Ph3P)4(1.09克，0.94毫摩尔)，以完成该反应。将此混合液加热至90℃并保持6小时。减压浓缩该混合物。通过快速层析法(己烷∶EtOAc为8∶2至7∶3)纯化所得残余物，得到化合物3h(22.4克，收率为76％)。
步骤h：
将臭氧化的氧气气流通入5，11-二氢-11-乙基-2-氟-5-甲基-8-(2-丙烯基)-6H-二吡啶并[3，2-b：2′，3′-e][1，4]二氮杂-6-酮3h(22.38克，71.6毫摩尔)溶于CH2Cl2(100毫升)及MeOH(100毫升)的冷(-78℃)溶液中，时间为3小时。然后在此溶液中通入15分钟氮气气流，随后加入固体NaBH4(5.05克，133毫摩尔)。将此反应混合物加热至室温。1小时后，向此反应混合物中进一步加入NaBH4(1.62克，43.0毫摩尔)。再经1小时后，在其中加入饱和的NH4Cl水溶液(150毫升)，并将此混合液在室温下搅拌30分钟。在减压下去除有机溶剂。加入水(200毫升)并用CHCl3(3×300毫升)萃取此混合液。将合并的有机层干燥(MgSO4)、过滤并减压浓缩。通过快速层析法(EtOAc∶CHCl3为4∶1)纯化所得残余物，得到白色固体的化合物3I(19.7克，收率为72％)。
实施例4(化合物编号为1003及1031)：
Figure C0380646300221
步骤a：
将1.6M正丁基锂的己烷溶液(6.22毫升，9.95毫摩尔)快速加至4a(0.87克，4.33毫摩尔)溶于THF(20毫升)的冷(-78℃)溶液中。将此混合液在-78℃下搅拌10分钟，然后温热至0℃并在此温度下维持1小时。将CO2气流通入此反应混合液中10分钟，并加入1.0N HCl溶液使此溶液呈酸性。用EtOAc萃取此溶液。将有机层干燥(MgSO4)、过滤并减压浓缩。将所得残余物溶解在Et2O(20毫升)中并用过量CH2N2溶于Et2O的溶液(约0.6M，10毫升)处理10分钟。减压浓缩此混合液并通过快速层析法(己烷∶EtOAc为4∶1至7∶3)纯化所得残余物，得到4b(0.13克，收率为17％)。
步骤b：
在25℃下，用30分钟将DIAD(86微升，0.44毫摩尔)溶于THF(2.0毫升)的溶液加至1h(100毫克，0.33毫摩尔)、4b(60.0毫克，0.33毫摩尔)及PPh3(114毫克，0.44毫摩尔)溶于THF(10毫升)的溶液中。将此混合液搅拌1小时，然后减压浓缩。通过快速层析法(己烷∶EtOAc为7∶3至1∶1)纯化所得残余物，得到化合物1031(128毫克，收率为83％)。
步骤c：
将1.0N的氢氧化锂水溶液(1.52毫升，1.52毫摩尔)加至化合物1031(100毫克，0.22毫摩尔)溶于THF(6毫升)及MeOH(2毫升)的溶液中。将此反应混合物在25℃下搅拌24小时，然后加热回流1小时。加入1.0N HCl水溶液使此溶液呈酸性，然后用EtOAc萃取。将有机层用水(2×)及盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)、过滤并减压浓缩。将残余物用Et2O/己烷研磨，得到为白色固体的化合物1003(80毫克，收率为83％)。将化合物1003(38.0毫克，0.085毫摩尔)与0.02N NaOH水溶液(4.3毫升，0.085毫摩尔)的混合物在MeCN(3毫升)中进行超音波处理。将所得溶液冷冻干燥，得到白色固体的相应钠盐(37毫克，收率为98％)。
实施例5(化合物编号为1019、1020及1028)：
步骤a：
在25℃下，用2小时将DIAD(86微升，0.44毫摩尔)溶于THF(2.0毫升)的溶液加至3i(106毫克，0.34毫摩尔)、5a(56.0毫克，0.34毫摩尔)及PPh3(114毫克，0.44毫摩尔)溶于THF(7毫升)的溶液中。将此混合液搅拌1小时，然后减压浓缩。通过快速层析法(己烷∶EtOAc为7∶3至1∶1)纯化残余物，得到白色固体的5b(115毫克，收率为73％)。
步骤b：
将1.0N氢氧化锂水溶液(1.0毫升，1.0毫摩尔)加至5b(100毫克，0.21毫摩尔)在MeOH(6毫升)中的溶液中。在25℃下将此反应混合液搅拌24小时，加入1.0N HCl水溶液使此溶液呈酸性，然后用EtOAc萃取。用水及盐水洗涤有机层，并对其加以干燥(MgSO4)、过滤并减压浓缩。所得残余物通过快速层析法(己烷∶EtOAc∶AcOH为50∶50∶1)纯化，先得到白色固体的第一化合物1019(25毫克，收率为25％)，然后得到白色固体的化合物1020(48毫克，收率为50％)。其相应的钠盐用0.02N NaOH水溶液处理得到。
步骤c：
将1.0M二甲胺的THF溶液(5.0毫升，5.0毫摩尔)及1.0N氢氧化锂水溶液(1.0毫升，1.0毫摩尔)加至5b(50.0毫克，0.11毫摩尔)溶于i-PrOH(3毫升)的溶液中。将反应混合液加热回流48小时。在此混合液中加入1.0N的HCl水溶液(2毫升)并用EtOAc萃取。用水及盐水洗涤有机层，并干燥(MgSO4)、过滤并减压浓缩。通过快速层析法(己烷∶EtOAc∶AcOH为50∶50∶1)纯化所得残余物，得到白色固体的化合物1028(18毫克，收率为35％)。其相应的钠盐用0.02N NaOH处理得到。
实施例6(化合物编号为1014)：
Figure C0380646300241
步骤a：
向酸6a(1.00克，5.55毫摩尔)溶于CH2Cl2(50毫升)的溶液中加入草酰氯(0.73毫升，8.3毫摩尔)及DMF(100微升)。将反应混合液搅拌90分钟，然后加入EtOH(15毫升)，并将所得的反应混合液再搅拌1小时。减压浓缩反应混合液，用EtOAc稀释所得的残余物并依次用水及盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)、过滤及浓缩，得到酯6b，其无需进一步纯化即可使用。
步骤b：
向酯6b溶于CH2Cl2的溶液(50毫升)中加入1M BBr3的二氯甲烷溶液(7.2毫升，7.20毫摩尔)中。在室温下反应3小时后，将此反应混合液冷却至0℃并加入EtOH(5毫升)。在室温下将此反应混合液搅拌30分钟，然后减压浓缩。用EtOAc稀释残余物，并依次用NaHCO3饱和水溶液、水及盐水洗涤，然后干燥(MgSO4)、过滤并浓缩至干。通过快速层析法纯化所得残余物(己烷∶EtOAc为70∶30)，生成透明胶状的酚6c(802毫克，两步骤的总收率为74％)。
步骤c：
在室温下，用2小时将DIAD(87微升，0.44毫摩尔)溶于THF(2.0毫升)的溶液加至1h(100毫克，0.33毫摩尔)、Ph3P(104毫克，0.44毫摩尔)及酚6c(65毫克，0.34毫摩尔)溶于THF(7.0毫升)的溶液中。将此混合液搅拌4小时，然后减压浓缩。通过快速层析法(己烷∶EtOAc为30∶70至50∶50)纯化所得残余物，得到白色泡沫的化合物6d(46毫克，收率为29％)。
步骤d：
向酯6d(44毫克，0.09毫摩尔)溶于THF(3毫升)与MeOH(1毫升)的混合液的溶液中，加入1N氢氧化锂水溶液(1.0毫升，1.0毫摩尔)。在室温下4小时后，加入1N HCl(2毫升)。用EtOAc萃取此混合液。有机层用水及盐水洗涤，并进行干燥(MgSO4)、过滤及浓缩，得到白色固体的化合物1014(39毫克，收率为93％)。其相应的钠盐通过1当量的氢氧化钠水溶液处理、并对所得溶液冻干得到蓬松状白色固体而得到。
表1
    化合物编号     R2   R4     R5     R12     R13     R14     MS(ES1)m/z(MH)+
    1001     H   H     Me     Me     Me     COOH     447
    1002     H   H     Me     Me     H     COOH     433
    1003     H   H     Me     Et     H     COOH     447
    1004     H   H     Me     Me     OH     COOH     449
    1005     H   H     Me     Br     H     COOH     497/499
    1006     H   H     Me     Me     H     CHMeCOOH     461
    1007     Cl   H     Me     Me     H     CH2CH2COOH     495/497
    1008     H   H     Me     Me     H     CH2CH2COOH     461
    1009     Cl   H     Me     Me     H     CH＝CHCOOH     493/495
    1010     H   H     Me     Me     H     CH＝CHCOOH     459
    1011     H   H     Me     Cl     H     CH2COOH     467/469
    1012     H   H     Me     Br     H     CH2COOH     511/513
    1013     H   H     Me     Me     Me     CH2COOH     461
    1014     H   H     Me     Me     H     CH2COOH     447
    1015     Cl   H     Me     Me     H     COOH     467/469
    1016     Cl   Me     H     Me     H     COOH     467/469
    1017     Me   H     Me     Me     H     COOH     447
    1018     H   Me     H     Me     H     COOH     433
    1019     OMe   H     Me     Me     H     COOH     463
    1020     F   H     Me     Me     H     COOH     451
    1021     OEt   H     Me     Me     H     COOH     477
    1022   H     H     Me     NO2     H     COOH     464
    1023   H     H     Me     Cl     H     COOH     453/455
    1024   H     H     Me     Cl     NH2     COOH     434
    1025   H     H     Me     H     F     COOH     437
    1026   H     H     Me     H     Cl     COOH     453/455
    1027   H     H     Me     CF3     H     COOH     487
    1028   N(Me)2     H     Me     Me     H     COOH     476
    1029   H     H     H     Me     H     COOH     419
    1030   H     H     Me     Me     H     COOMe     447
    1031   H     H     Me     Et     H     COOMe     461
    1032   H     H     Me     Cl     H     COOMe     467/469
    1033   H     H     Me     CF3     H     COOMe     501
    1034   OEt     H     Me     Me     H     COOMe     491
    1035   H     H     Me     H     F     COOMe     451
反转录酶(RT)测定
测定原理
反转录酶(1)为人类免疫缺陷病毒(HIV-1)所编码的众多酶中的一种，该酶之所以如此命名乃因其可自RNA模板转录DNA拷贝。此活性可在无细胞的酶测定法定量，并基于观测在使用合成模板聚r(C)及以生物素化寡d(G)引物下，反转录酶利用3H-dGTP底物转录放射性标记的DNA链的能力而评定。下述测定法利用野生型酶(其为HIV-1感染的患者中所观测到酶的主要形式)，且亦可在类似测定条件下利用突变RT酶(例如Y181C，其通过定点诱变加以制备，其中密码子181的酪胺酸残基被半胱胺酸残基替换)。通过此测定法可测定化合物对抑制突变酶的功效。
材料：
a)酶的制备
HIV-1 IIIB克隆BH10 RT突变体由Dr.C.-K.Shih(Boehringer IngelheimPharmaceuticals Inc.，U.S.A.)以载体pKK233-2(Pharmacia)的方式提供。简言之，仅包含由乳糖操纵子/trc启动子调节的RT p66基因的HIV RT克隆pKRT2从Dr.w Summers(耶鲁大学)处获得(2)。各种具体的氨基酸取代通过定点突变引入到野生型RT基因中。将RT克隆亚克隆至pKK233-2细菌表现载体中。所提供的克隆包括野生型、Vall06Ala、Tyr181Cys、Tyr188Cys、Tyr188Leu、Gly190Ala及Pro236Leu。其他通过对pKK233-2 RT克隆体自行进行定点突变而制得，其包括Lys103Asn、Lys103Asn/Tyr181Cys、Lys103Asn/Leu100lle、Lys103Asn/Pro225His及Lys103Asn/Val108lle。
b)酶的纯化
重组反转录酶的纯化通过前述方法的组合实施(3)。在37℃下，使用取自转化的JM109细胞的新鲜平板的单一菌落进行预培养。将该预培养的菌种接种至2升的生长培养基中。在OD600～1.5下(在37℃下进行5-6小时)，用IPTG(最终为1毫摩尔/升)诱发RT基因表达，且使发酵在37℃下再持续若干小时。经离心后，去除上清液，将细胞沉淀收集起来并在-80℃下存储，以备纯化。将细胞在4℃下解冻过夜并使之悬浮于裂解缓冲液(MES：50mM，pH6；EDTA：1mM；10％v/v甘油；0.02％w/vOBG；0.02％w/v叠氮化钠)中。加入溶菌酶并将此混合液在冰浴中孵育40分钟。在溶菌酶存在下用Dounce匀浆并用超音波处理后，将细胞离心30分钟。收集上清液(S1)并在4℃储存。将离心后所得沉淀再悬浮于萃取缓冲液(MES：50mM，pH6；KPO4：50mM，pH6；KCl：100mM；10％v/v甘油；0.02％w/v OBG；0.02％w/v叠氮化钠)中并在4℃搅拌30分钟。将此第二混合液离心并收集所得上清液(S2)。重复上述步骤2次以上，收集到上清液S3与S4，最后再进行过夜萃取(S5)。将Polymin P(终浓度为0.005％)加入合并的上清液中以去除核酸。将该溶液在4℃搅拌75分钟并离心1小时。在冰上用20％w/v硫酸铵使所述上清液(SS1)沉淀并在4℃搅拌1小时。然后将此混合液离心，另加入40％w/v硫酸铵(总浓度为60％)沉淀生成的上清液(SS2)，搅拌1小时并再次离心。第二天进行纯化前，将最终得到的沉淀(P1)在4℃存放过夜。除非另有规定，所有纯化步骤均在4℃进行。将沉淀(P1)重新悬浮于含MES，50mM，pH6；KPO4，10mM，pH6；KCl，100mM；10％v/v甘油；0.02w/v OBG；以及0.02w/v叠氮化钠的缓冲液中。利用12-14kD MWCO透析袋使此悬浮液相对于相同的缓冲液进行过夜透析。将透析液离心并通过Millex-PF 0.8微米的过滤设备过滤所得上清液，将滤出的样品加载至羟基磷灰石柱(30毫升柱床体积)上并用相同缓冲液洗脱，用220毫升含有10～300mM线性梯度的KPO4的相同缓冲液将结合的酶洗脱。收集含p66/p51杂二聚体的部分(通过8％的SDS-PAGE及蛋白印迹法测定)，进行下一步纯化。含RT的部分用含Bis-Tris丙烷(50mM，pH7.0)、OBG(0.02％w/v)、甘油(10％v/v)及叠氮化钠(0.02％w/v)的溶液稀释2倍，然后将其加载至Hi-Trap Hepparin Sepharose柱(5毫升柱床体积)上并用相同缓冲液洗脱。之后用75毫升含呈0～1M线性梯度的硫酸铵的相同缓冲液将结合的RT洗脱。依据SDS-PAGE及蛋白印迹分析收集含有RT的部分。该收集物中的蛋白质浓度以BSA为标准品通过Bradford方法测定。将最终酶制剂在含MES(50mM，pH6)、KPO4(300mM，pH6)、KCl(175mM)、甘油(10％v/v)及叠氮化钠(0.02％w/v)的溶液中透析、然后进行等分并在-80℃冷冻。
测定步骤：
放射性酶测定法修改成适于96孔微量滴定板形式并利用链亲和素闪烁邻近小球实施。此测定法将在下文进行简要描述。将HIV-1 RT酶解冻并用含NaCl(60mM)、氯化镁六水合物(2mM)、DTT(6mM)、GSH(2mM)及Chaps(0.02％w/v)的Tris/HCl(50mM，pH7.8)适当稀释，得到约3nM的酶。向30微升该酶溶液中加入10微升抑制剂溶液(50μM至2.5nM抑制剂溶于上述的相同测定缓冲液中，其中包含15％v/vDMSO)。在进行下一步骤之前，先在室温下将此微量滴定板预孵育15分钟。在此预孵育步骤中，抑制剂的最高浓度与最低浓度分别为12.5μM与0.62nM，DMSO的浓度为3.75％v/v。然后加入10微升底物溶液引发酶反应。最终的反应混合液含有Tris/HCl(50mM，pH7.8)、NaCL(60mM)、硫酸镁六水合物(2mM)、DTT(6mM)、GSH(2mM)、Chaps(0.02％w/v)、DMSO(3％v/v)、Poly rC(179nM)、生物素dG15(18nM)、dGTP(288nM)、3H-dGTP(71nM)及酶(1-2nM)。
在该培养步骤中，抑制剂的最高浓度及最低浓度分别为10μM及0.5nM。加入底物后，用塑封覆盖微量滴定板并在37℃下置于干燥培养箱中培养1小时。然后加入75微升含5毫克/毫升的链亲和素邻近小球的EDTA(0.5摩尔/升)终止反应。
以中等速度将微量滴定板晃动2分钟并在室温下孵育1小时。然后加入75微升7M的氯化铯溶液，以中等速度将微量滴定板晃动2分钟并在室温下进一步孵育1小时。然后用塑封覆盖微量滴定板并利用TopCount-NXTTM微量板闪烁荧光计数器(Packard)进行计数。对每一孔均计数60秒。每排的末端包含一空白孔及一对照孔。
抑制百分率计算方法如下：
利用上述测定法检测本发明的化合物对RT野生型(WT)及突变酶的抑制作用。测定结果在表2中以IC50(nM)形式列出。
为确认该化合物对HIV复制的抑制能力，亦在下述人T细胞培养(Syncytia)测定中进行检测。
用于测定细胞培养中的活性的ELISA测定法
在96孔板测定中，检测了本发明的化合物对细胞培养中HIV复制的抑制能力。用完全RPMI1640(由RPMI 1640+10％胎牛血清、10微克/毫升的庆大霉素及10μM β-巯基乙醇组成)稀释化合物及细胞生长培养基。将T淋巴细胞系C8166通过编码野生型及突变反转录酶的病毒以0.001的感染率多次感染。然后，在本发明化合物的一系列稀释存在下将细胞培养三天。收集八个相同加样孔中的上清液，并使用市售HIV-1 p24抗原测定试剂盒(Bechman-Coulter)测定细胞外p24的浓度。抑制水平(抑制百分率)通过下述公式计算：
Figure C0380646300302
这些检测结果在表2中以EC50(nM)形式列出。
参考文献(以引用方式并入本文中)
1.Benn，S.等人，Science230：949，1985。
2.D′Aquila，R.T.及Summers，W.C.J.Acq.Imm.Def.Syn.2：579，1989。
3.a)Warren，T.C.等人，Protein Expression & Purification3：479，1992；b)Kohlstaedt，L.A.Science 256(5065)：1783，1992。
表2
式I化合物对野生型及RT突变株的抑制作用
  编号     IC50(WT)(nM)     IC50K103N/Y181C(nM)     EC50(WT)(nM)     EC50K103N/Y181C(nM)
  1001     C     A     C     C
  1002     C     A     C     C
  1003     C     A     C     C
  1004     C     A     C     A
  1005     C     A     C     C
  1006     C     A     NT     NT
  1007     C     B     C     B
  1008     C     A     C     A
  1009     C     C     C     C
  1010     C     C     C     C
  1011     C     A     NT     NT
  1012     C     A     NT     NT
  1013     C     A     NT     NT
  1014     C     A     C     A
  1015     C     B     C     C
  1016     C     A     NT     NT
  1017     C     A     C     C
  1018     C     A     C     C
  1019     C     A     C     C
  1020     C     A     C     C
  1021     C     A     NT     NT
  1022     B     A     B     A
  1023     B     A     C     A
  1024     C     A     NT     NT
  1025     B     NT     NT     NT
  1026     B     NT     NT     NT
  1027     B     A     NT     NT
  1028     C     A     NT     NT
  1029     C     A     C     NT
  1030     C     C     C     C
  1031     C     C     NT     NT
  1032     C     C     NT     NT
  1033     C     A     NT     NT
  1034     C     B     NT     NT
  1035     C     A     NT     NT
表中符号说明：
IC50及EC50：A＝＞100nM；B＝100nm-50nM；C＝＜50nM；及NT＝未检测

Claims (23)

1.一种式I化合物：
Figure C038064630002C1
其中，
R2为H、卤素、(C1-4)烷基、O(C1-4)烷基、HN(C1-4烷基)或N(C1-4烷基)2；
R4为H或CH3；
R5为H或CH3，条件是R4及R5不相同；
R12为H、卤素、(C1-4)烷基、CF3或NO2；
R13为H、(C1-4)烷基、卤素、OH或NH2，条件是R12与R13不同时为H；及
R14为COOR14a，其中R14a为H或(C1-6)烷基；或R14为(C2-4)烯基-COOR14a，其中R14a定义同上；或R14为(C1-4)烷基-COOR14a，其中R14a定义同上，
或其盐。
2.如权利要求1的化合物，其中R2为H、卤素、(C1-4)烷基、O(C1-4)烷基或N(C1-4烷基)2，且R4与R5不相同。
3.如权利要求2的化合物，其中R2为H、Cl、F、(C1-4)烷基、O(C1-4)烷基或N(C1-4烷基)2。
4.如权利要求3的化合物，其中R2为H、Cl、F、CH3、OMe或OEt。
5.如权利要求4的化合物，其中R2为H。
6.如权利要求1的化合物，其中R4为H。
7.如权利要求1的化合物，其中R5为CH3。
8.如权利要求1的化合物，其中R12为卤素、(C1-4)烷基、CF3或NO2。
9.如权利要求8的化合物，其中R12为Br、Cl、CH3或CH3CH2。
10.如权利要求9的化合物，其中R12为CH3或CH3CH2。
11.如权利要求1的化合物，其中R13为H、CH3、卤素、OH或NH2。
12.如权利要求11的化合物，其中R13为H、CH3或OH。
13.如权利要求12的化合物，其中R13为H。
14.如权利要求1的化合物，其中R14为COOH、COOMe、(C2-4)烯基-COOH或(C1-4)烷基-COOH。
15.如权利要求14的化合物，其中R14为COOH、CH＝CH-COOH、CH2COOH或CH2CH2COOH。
16.如权利要求15的化合物，其中R14为COOH。
17.如权利要求1的式I化合物：
Figure C038064630003C1
其中，
R2为H、Cl、F、CH3、OMe或OEt；R4为H；R5为CH3；R12为Br、Cl、CH3或CH2CH3；R13为H、CH3或OH；及R14为COOH、CH＝CH-COOH、CH2COOH或CH2CH2COOH；
或其盐。
18.如权利要求17的化合物，其中R2为H；R4为H；R5为CH3；R12为CH3或CH3CH2；R13为H；且R14为COOH；或其盐。
19.一种用于治疗或预防HIV感染的药物组合物，其包含权利要求1的式I化合物或其的可药用盐，以及可药用载体。
20.权利要求19的药物组合物或其可药用盐在制备用于治疗或预防HIV感染的药物中的用途。
21.权利要求1的式I化合物或其可药用盐在制备用于治疗或预防HIV感染的药物中的用途。
22.权利要求21的用途，其中所述的药物与抗反转录病毒药物组合给药。
23.权利要求1的式I化合物或其可药用盐在制备用于治疗或预防分娩前从母亲至婴儿的围产期HIV-1传染的药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1610782A1 (en) * 2003-03-27 2006-01-04 Boehringer Ingelheim International GmbH Antiviral combination of a dipyridodiazepinone and a further antiretroviral compound

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0767172A1 (en) * 1995-10-06 1997-04-09 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. 8-Arylalkyl- and 8-arylheteroalkyl-5, 11-dihydro-6H-dipyrido-[3,2-b:2', 3'-e][1,4]diazepines and their use in the prevention or treatment of HIV infection
WO2001096338A1 (en) * 2000-06-16 2001-12-20 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
WO2002076982A2 (en) * 2001-03-22 2002-10-03 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
WO2003011862A1 (en) * 2001-07-30 2003-02-13 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0767172A1 (en) * 1995-10-06 1997-04-09 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. 8-Arylalkyl- and 8-arylheteroalkyl-5, 11-dihydro-6H-dipyrido-[3,2-b:2', 3'-e][1,4]diazepines and their use in the prevention or treatment of HIV infection
US5705499A (en) * 1995-10-06 1998-01-06 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. 8-arylalkyl- and 8-arylheteroalkyl-5,11-dihydro-6H-dipyrido 3,2-B:2',3'-e! 1!diazepines and their use in the treatment of HIV-1 infection
WO2001096338A1 (en) * 2000-06-16 2001-12-20 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
WO2002076982A2 (en) * 2001-03-22 2002-10-03 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors
WO2003011862A1 (en) * 2001-07-30 2003-02-13 Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
novel nonnucleoside inhibitors of hiv-1reversetranscriptase.7.8-arylethyldipyridodiazepinones aspotentbroad-spectrum inhibitors of wild-type and mutantenzymes j.m.klumder et al,j.med.chem.,Vol.41 No.16 1998 *
novel nonnucleoside inhibitors ofhiv-1reversetranscriptase.8.8.-aryloxymethyl-and8-arylthiomethyldipyridodiazepinones c.l.cywin et al,j.med.chem.,Vol.41 No.16 1998 *

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