ES2321828T3 - Dipiridodiazepinonas en calidad de inhibidores de la transcriptasa inversa. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula I: **(Ver fórmula)** en la que R2 es H, halógeno, alquilo(C1 - 4), O(alquilo(C1 - 4)), NH(alquilo(C1 - 4)) o N(alquilo(C1 - 4))2; R4 es H o CH3; R5 es H o CH3, con la condición de R 4 y R 5 no son ambos iguales; R12 es H, halógeno, alquilo(C1 - 4), CF3 o NO2; R13 es H, alquilo(C1 - 4), halógeno, OH o NH2, con la condición de que R 12 y R 13 no son ambos H; y R14 es COOR14a , en el que R 14a es H o alquilo(C1 - 6); o R 14 es (alquenil (C2 - 4))COOR14a , en el que R14a es como se define en la presente; o R 14 es (alquil(C1 - 4))COOR14a , en el que R 14a es como se define anteriormente; o su sal.

Description

Dipiridodiazepinonas en calidad de inhibidores de la transcriptasa inversa.

Campo técnico de la invención

La invención se refiere a nuevos compuestos y sus sales farmacéuticamente aceptables, a su uso, tanto solos como en combinación con otros agentes terapéuticos, en el tratamiento o la profilaxis de la infección por HIV, y a composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos.

Antecedentes de la invención

La enfermedad conocida como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) está provocada por el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), en particular la cepa conocida como HIV-1. Para que el HIV sea replicado por una célula hospedante, la información del genoma vírico debe integrarse en el DNA de la célula hospedante. Sin embargo, el HIV es un retrovirus, lo cual significa que su información genética está en forma de RNA. Por tanto, el ciclo de replicación del HIV requiere una etapa de transcripción del genoma vírico (RNA) en DNA, que es lo contrario de la cadena de acontecimientos normal. Una enzima que se ha apodado, de forma apropiada, transcriptasa inversa (reverse transcriptase, RT) realiza la transcripción del RNA vírico en DNA. El virión de HIV incluye una copia de RT junto con el RNA vírico.

La transcriptasa inversa tiene tres funciones enzimáticas conocidas: actúa como una DNA-polimerasa dependiente de RNA, como una ribonucleasa, y como una DNA-polimerasa dependiente de DNA. Cuando actúa como una DNA-polimerasa dependiente de RNA, la RT transcribe una copia monocatenaria de DNA del RNA vírico. Cuando actúa como una ribonucleasa, la RT destruye el RNA vírico original y libera el DNA recién producido a partir del RNA original. Por último, cuando actúa como una DNA-polimerasa dependiente de DNA, la RT fabrica una segunda hebra de DNA complementaria, utilizando la primera hebra de DNA como molde. Los dos hebras forman un DNA bicatenario, que otra enzima, denominada integrasa, integra en el genoma de la célula hospedante.

Los compuestos que inhiben las funciones enzimáticas de la transcriptasa inversa de HIV-1 inhibirán la replicación del HIV-1 en células infectadas. Estos compuestos son útiles en la prevención o el tratamiento de una infección por HIV-1 en sujetos humanos, como se demuestra mediante inhibidores de RT conocidos, como 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (ddI), 2',3'-didesoxicitidina (ddC), d4T, 3TC, nevirapina, delavirdina, efavirenz y abacavir, los principales fármacos que hasta la fecha se han aprobado para su uso en el tratamiento del SIDA.

Al igual que con cualquiera terapia antivírica, el uso de inhibidores de la RT en el tratamiento del SIDA conduce, finalmente, a virus que son menos sensibles al fármaco aplicado. La resistencia (sensibilidad reducida) a estos fármacos es el resultado de mutaciones que se producen en el segmento de transcriptasa inversa del gen pol. Se han caracterizado varias cepas mutantes de HIV, y la resistencia a agentes terapéuticos conocidos es debida a mutaciones en el gen RT. Algunos de los mutantes que se observan más habitualmente en la observación clínica son el mutante Y181C, en el que se ha mutado una tirosina (Y) en el codón 181 a un resto cisteína (C), y el mutante K103N, en el que la lisina (K) en la posición 103 se ha sustituido por asparagina (N). Otros mutantes, que surgen con frecuencia creciente durante el tratamiento con antivíricos conocidos, incluyen los mutantes simples V106A, G190A, Y188C y P236L; y los mutantes dobles K103N/Y181C, K103N/P225H, K103N/V108I y K103N/L100I.

El uso continuado de compuestos antivíricos para evitar una infección por HIV sin duda provocará un mayor surgimiento de nuevas cepas resistentes de HIV. Por tanto, existe una necesidad real de nuevos inhibidores de la RT, con diferentes patrones de efectividad frente a los diversos mutantes.

En la patente de EEUU nº 5.366.972 se describen compuestos que tienen estructuras tricíclicas, que son inhibidores del HIV-1. Otros inhibidores de la transcriptasa inversa de HIV-1 se describen en Hargrave et al., J. Med. Chem. 34, 2231 (1991).

La patente de EEUU nº 5.706.499 propone 8-arilalquil- y 8-arilheteroalquil-5,11-dihidro-6H-dipirido[3,2-B:2',3'-E][1,4]diazepinas como inhibidores de la RT. Se demuestra que los ejemplos de los compuestos presentan cierta actividad contra la RT de HIV-1 de tipo salvaje y mutante, en particular Y181C y otros mutantes simples como K103N, aunque con menos eficacia.

El documento WO 01/96338A1 y la patente de EEUU nº 6.420.359 describen estructuras de diazepina que tienen sustituyentes quinoleína y quinolein-N-óxido, como inhibidores de la RT. Los ejemplos de los compuestos presentan actividad contra cepas de tipo salvaje, simples y dobles de HIV.

Sumario de la invención

La invención proporciona compuestos que contienen ácido benzoico sustituido que son inhibidores potentes de la RT de HIV-1 de cepas de tipo salvaje (TS) y mutantes dobles, en particular de la doble mutación K103N/Y181C.

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En un primer aspecto de la invención se proporciona un compuesto de fórmula I:

1

en la que

R^{2} es H, halógeno, alquilo(C_{1-4}), O(alquilo(C_{1-4})), NH(alquilo(C_{1-4})) o N(alquilo(C_{1-4}))_{2};

R^{4} es H o CH_{3};

R^{5} es H o CH_{3};

R^{12} es H, halógeno, alquilo(C_{1-4}), CF_{3} o NO_{2};

R^{13} es H, alquilo(C_{1-4}), halógeno, OH o NH_{2}, con la condición de que R^{12} y R^{13} no son ambos H; y

R^{14} es COOR^{14a}, en el que R^{14a} es H o alquilo(C_{1-6}); o R^{14} es (alquenil (C_{2-4}))COOR^{14a}, en el que R^{14a} es como se define en la presente; o R^{14} es (alquil(C_{1-4}))COOR^{14a}, en el que R^{14a} es como se define en la presente;

o su sal.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de la infección por HIV, que comprende un compuesto de fórmula I, como se describe en la presente, o su sal farmacéuticamente aceptable, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un método para el tratamiento o prevención de la infección por HIV, que comprende administrar a un paciente una cantidad inhibidora de HIV de un compuesto de fórmula I o su sal farmacéuticamente aceptable, o una composición farmacéutica, ambos definidos en la presente.

Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para tratar o prevenir una infección por HIV que comprende administrar una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula I, según se describe en la presente, junto con un fármaco antirretrovírico.

Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método para evitar la transmisión perinatal del HIV-1 desde la madre al bebé, que comprende administrar un compuesto de fórmula I o una composición farmacéutica, según se describe en la presente, a la madre antes del parto.

Descripción detallada de la invención Definiciones

Se aplican las siguientes definiciones, a menos que se indique lo contrario.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "alquilo(C_{1-2})", "alquilo(C_{1-4})" y "alquilo(C_{1-6})", tanto por sí solos como combinados con otro radical, significan radicales alquilo acíclicos que contienen hasta dos, cuatro o seis átomos de carbono, respectivamente. Los ejemplos de estos radicales incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, 1-metiletilo, 1-metilpropilo, 2-metilpropilo y 1,1-dimetiletilo.

Tal como se utiliza en la presente, el término "alquenilo(C_{2-4})", tanto por sí solo como combinado con otro radical, significa un radical acíclico insaturado que contiene de dos a cuatro átomos de carbono.

Tal como se utiliza en la presente, el término "halógeno" significa un átomo de halógeno e incluye flúor, cloro, bromo y yodo.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "sal farmacéuticamente aceptable" incluye las sales derivadas de bases farmacéuticamente aceptables y no tóxicas. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen colina, etanolamina y etilendiamina. Las sales de Na^{+}, K^{+} y Ca^{++} también se contemplan dentro del alcance de la invención (véase también "Pharmaceutical salts", Birge, S.M. et al., J. Pharm. Sci. (1977), 66, 1-19, que se incorpora en la presente como referencia).

Tal como se utiliza en la presente, el término "profármaco" se refiere a derivados farmacológicamente aceptables, de forma que el producto resultante de la biotransformación del derivado es el fármaco activo, como se define en los compuestos de fórmula I. Los ejemplos de estos derivados incluyen, pero no se limitan a ésteres y amidas (véase Goodman y Gilman, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 9ª edición, McGraw-Hill, Int. Ed., 1995, "Biotransformation of Drugs", pp. 11-16, que se incorpora en la presente como referencia).

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Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Preferiblemente, R^{2} es H, halógeno, alquilo(C_{1-4}), O(alquilo(C_{1-4})) o N(alquilo(C_{1-4}))_{2}. Más preferiblemente, R^{2} es H, Cl, F, alquilo(C_{1-4}), O(alquilo(C_{1-4})) o N(alquilo(C_{1-4}))_{2}. Aún más preferiblemente, R^{2} es H, Cl, F, CH_{3}, OMe u OEt. Lo más preferible, R^{2} es H.

Preferiblemente, R^{4} y R^{5} no son ambos iguales.

Más preferiblemente, R^{4} es H.

Más preferiblemente, R^{5} es CH_{3}.

Preferiblemente, R^{12} es halógeno, alquilo(C_{1-4})), CF_{3} o NO_{2}. Más preferiblemente, R^{12} es Br, Cl, CH_{3} o CH_{3}CH_{2}. Lo más preferible, R^{12} es CH_{3} o CH_{3}CH_{2}.

Preferiblemente, R^{13} es H, CH_{3}, halógeno, OH o NH_{2}. Más preferiblemente, R^{13} es H, CH_{3} u OH. Lo más preferible, R^{13} es H.

Preferiblemente, R^{14} es COOH, COOMe, (alquenil(C_{2-4}))COOH o (alquil(C_{1-4}))COOH. Más preferiblemente, R^{14} es COOH, CH=CH-COOH, CH_{2}COOH o CH_{2}CH_{2}COOH. Lo más preferible, R^{14} es COOH.

Los compuestos de fórmula I son inhibidores eficaces del HIV de tipo salvaje, y también inhiben la enzima del mutante doble K103N/Y181C.

Los compuestos de fórmula I poseen actividad inhibidora contra la transcriptasa inversa de HIV-1. Cuando se administran en formas de dosificación adecuadas, son útiles en el tratamiento de SIDA, ARC y trastornos relacionados asociados con la infección por HIV-1. Por tanto, otro aspecto de la invención es un método para tratar una infección por HIV-1 que comprende administrar a un ser humano infectado por HIV-1 una cantidad terapéuticamente eficaz de un nuevo compuesto de fórmula I, como se describe anteriormente. Tanto para tratamiento como para profilaxis, el compuesto también puede utilizarse para evitar la transmisión perinatal del HIV-1 desde la madre al bebé, mediante la administración a la madre antes del parto.

Los compuestos de fórmula I pueden administrarse en dosis únicas o divididas, mediante vía oral o parenteral. Una dosificación oral adecuada para un compuesto de fórmula I se encuentra en el intervalo desde aproximadamente 0,5 mg a 3 g diarios. Una dosificación oral preferida para un compuesto de fórmula I se encuentra en el intervalo desde aproximadamente 100 mg a 800 mg diarios para un paciente que pesa 70 kg. En las formulaciones parenterales, una unidad de dosificación adecuada puede contener desde 0,1 a 250 mg de dicho compuesto, preferiblemente 1 mg a 200 mg. Sin embargo debe entenderse que la administración de la dosificación de un paciente a otro varía, y la dosificación para cualquier paciente concreto depende del criterio del médico, que para fijar una dosificación apropiada debe utilizar los criterios de peso y trastorno del paciente, así como la respuesta del paciente al fármaco.

Cuando los compuestos de la presente invención se administran por vía oral, pueden administrarse como medicamentos en forma de preparaciones farmacéuticas, que los contienen junto con un material vehículo farmacéutico compatible. Este material vehículo puede ser un material vehículo orgánico o inorgánico inerte adecuado para la administración oral. Los ejemplos de estos materiales vehículo son agua, gelatina, talco, almidón, estearato de magnesio, goma arábiga, aceites vegetales, polialquilenglicoles, gelatina de petróleo y similares.

Los compuestos de fórmula I pueden utilizarse junto con un fármaco antirretrovírico conocido por los expertos en la técnica, como una preparación combinada útil para la administración simultánea, separada o secuencial, para tratar o prevenir una infección por HIV en un individuo. Los ejemplos de fármacos antirretrovíricos que pueden utilizarse en una terapia de combinación con los compuestos de fórmula I incluyen, pero no se limitan a inhibidores de la transcriptasa inversa nucleósidos/nucleótidos (como AZT y tenofovir), inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos (como nevirapina), inhibidores de proteasas (como ritanovir), inhibidores de la fusión vírica (como T-20), antagonistas de CCR5 (como SCH-351125), antagonistas de CXCR4 (como AMD-3100), inhibidores de integrasa (como L-870.810), inhibidores de TAT, otros fármacos de investigación (como PRO-542, BMS-806, TMC-114 o AI-183), agentes antifúngicos o antibacterianos (como fluconazol), y agentes inmunomoduladores (como levamisol). Además, un compuesto de fórmula I puede utilizarse con otro compuesto de fórmula I.

Las preparaciones farmacéuticas pueden prepararse de una manera convencional, y las formas de dosificación terminadas pueden ser formas de dosificación sólidas, por ejemplo comprimidos, grageas, cápsulas y similares, o formas de dosificación líquidas, por ejemplo disoluciones, suspensiones, emulsiones y similares. Las preparaciones farmacéuticas pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales como esterilización. Además, las preparaciones farmacéuticas pueden contener adyuvantes convencionales como conservantes, estabilizantes, emulsionantes, mejoradores del aroma, agentes humectantes, tampones, sales para variar la presión osmótica y similares. El material vehículo sólido que puede utilizarse incluye, por ejemplo, almidón, lactosa, manitol, metilcelulosa, celulosa microcristalina, talco, sílice, fosfato de calcio dibásico, y polímeros de alto peso molecular (como polietilenglicol).

Para un uso parenteral, un compuesto de fórmula I puede administrarse en una disolución, suspensión o emulsión acuosa o no acuosa, en un aceite farmacéuticamente aceptable o una mezcla de líquidos, que pueden contener agentes bacteriostáticos, antioxidantes, conservantes, tampones u otros solutos para hacer que la disolución sea isotónica con la sangre, agentes espesantes, agentes suspensores u otros aditivos farmacéuticamente aceptables. Los aditivos de este tipo incluyen, por ejemplo, tampones tartrato, citrato y acetato, etanol, propilenglicol, polietilenglicol, formadores de complejos (como EDTA), antioxidantes (como bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y ácido ascórbico), polímeros de alto peso molecular (como poli(óxido de etileno) líquido) para regular la viscosidad, y derivados polietilénicos de anhídridos de sorbitol. También pueden añadirse conservantes si es necesario, como ácido benzoico, metil- o propilparabeno, cloruro de benzalconio y otros compuestos de amonio cuaternario.

Los compuestos de esta invención también pueden administrarse como disoluciones para la aplicación nasal, y pueden contener, además de los compuestos de la invención, tampones adecuados, ajustadores de la tonicidad, conservantes microbianos, antioxidantes, y agentes para aumentar la viscosidad, en un vehículo acuoso. Los ejemplos de agentes utilizados para aumentar la viscosidad son poli(alcohol vinílico), derivados de celulosa, polivinilpirrolidona, polisorbatos o glicerina. Los conservantes microbianos añadidos pueden incluir cloruro de benzalconio, timerosal, clorobutanol o alcohol feniletílico.

Además, los compuestos de la invención pueden administrarse mediante supositorios.

Metodología y síntesis

El compuesto de la invención puede prepararse utilizando las técnicas de un químico orgánico sintético. En los esquemas 1 a 4 a continuación se muestran ejemplos de esquemas de reacción. Los sustituyentes R^{2}, R^{4}, R^{5}, R^{12}, R^{13} y R^{14} son como se definen en la presente.

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Esquema 1

Preparación de los intermedios en los que R^{4} es Me

2

Brevemente, la sustitución aromática (S_{N}AR) de 1(i) con Et-NH_{2} produce el intermedio 1(ii). Después, la halogenación de la posición 5 utilizando un agente de bromación (por ejemplo NBS o bromo) produce 1(iii). El cierre del anillo de 1(iii) mediante una reacción de S_{n}AR mediada por base forma el intermedio tricíclico 1(iv). La introducción del sustituyente R^{2} se realiza a través de una sustitución aromática del cloro C-2 en 1(iv), produciendo con ello el compuesto intermedio 1(v).

Esquema 2

Preparación de intermedios en los que R^{5} es Me

3

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La secuencia del esquema 2 es análoga a la descrita en J.M. Klunder et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 2960-2971, y C.L. Cywin et al., J. Med. Chem., 1998, 41, 2974-2984. Brevemente, la sustitución aromática (S_{N}AR) de 2(i) con Et-NH_{2} produce el intermedio 2(ii). La reducción del grupo nitro (por ejemplo, utilizando hidrogenación catalítica) produce 2(iii). Una reacción de condensación mediada por base de 2(iii) con, por ejemplo, cloruro de 5-bromo-2-cloro-3-piridincarbonilo, proporciona 2(iv). El cierre del anillo de 2(iv) se realiza a través de una reacción de S_{n}AR mediada por base, para formar el intermedio tricíclico 2(v). El grupo metilo R^{5} en 2(vi) puede introducirse mediante alquilación conocida en la técnica, utilizando, por ejemplo, yoduro de metilo.

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Esquema 3

Preparación de intermedios en los que R^{2} es alquilo C_{1-4}

4

Brevemente, una reacción de condensación mediada por base entre 3(i) y 3(ii) produce el intermedio 3(iii). Una sustitución aromática (S_{N}AR) de 3(iii) con Et-NH_{2} produce el intermedio 3(iv). El cierre del anillo 3(iv) se realiza a través de una reacción de S_{n}AR mediada por base, para formar un intermedio tricíclico, que se alquila para producir un compuesto intermedio 3(v).

Esquema 4

Vía alternativa para producir el compuesto en el que R^{4} es Me

5

Brevemente, una condensación mediada por base entre 4(i) y 3(ii) produce el intermedio 4(ii). Una sustitución aromática (S_{N}AR) de 4(ii) con Et-NH_{2} produce el intermedio 4(iii). El cierre del anillo 4(iii) se realiza a través de una reacción de S_{n}AR mediada por base, para formar un compuesto intermedio tricíclico 1(v).

Esquema 5

Introducción de los derivados de ácido benzoico

6

Brevemente, un acoplamiento cruzado del derivado de bromo 5(i), sintetizado como se describe en la presente, con un reactivo de alilestaño en un disolvente aprótico (por ejemplo DMF) y en presencia de un catalizador, forma sustituyentes C-8 5(ii). La oxidación del doble enlace (por ejemplo, mediante ozonolisis para producir un ozónido), seguido de una reducción, produce el sustituyente hidroxietilo C-8 5(iii). Utilizando una reacción de tipo Mitsunobu, se condensan los derivados de naftilo 5(iv), 5(v) o 5(vi), en los que Y es R^{14} con la excepción de COOH, con 5(iii) para producir un compuesto de fórmula I. Como alternativa, cuando Y es un grupo precursor de R^{14}, por ejemplo COOCH_{3}, puede utilizarse una reacción de tipo Mitsunobu para condensar 5(iv) o 5(v) con 5(iii), y después Y puede convertirse de forma química en sustituyentes R^{14}, por ejemplo mediante saponificación de COOCH_{3} para producir COOH, produciendo con ello un compuesto de fórmula I.

Como se ha indicado anteriormente, el compuesto que proporciona la invención inhibe la actividad enzimática de la RT de HIV-1. Basándose en los ensayos de estos compuestos, como se describe a continuación, se ha descubierto que inhiben la actividad DNA-polimerasa dependiente de RNA de la RT de HIV-1. Se ha descubierto (los datos no aparecen) que también inhiben la actividad DNA-polimerasa dependiente de DNA de la RT de HIV-1. Utilizando el ensayo de transcriptasa inversa (RT) descrito a continuación, un compuesto puede ensayarse para determinar su capacidad para inhibir la actividad DNA-polimerasa dependiente de RNA de la RT de HIV-1. De esta manera se ensayó cierto compuesto específico descrito en los ejemplos que aparecen a continuación. Los resultados de los ensayos aparecen en la tabla 1 como IC_{50} y EC_{50}.

Ejemplos

La presente invención se ilustra con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Todas las reacciones se realizan en una atmósfera de nitrógeno o argón, a menos que se indique lo contrario. Las temperaturas aparecen en grados Celsius. Los porcentajes o razones de disolución expresan una relación de volumen en volumen, a menos que se indique lo contrario.

Las abreviaturas o símbolos que se utilizan en la presente incluyen:

DEAD: azodicarboxilato de dietilo

DIAD: azodicarboxilato de diisopropilo

DIEA: diisopropiletilamina

DMAP: 4-(dimetilamino)piridina

DMSO: dimetilsulfóxido

DMF: dimetilformamida

DCC: diciclohexilcarbodiimida

ES MS: espectrometría de masas de electronebulización

Et: etilo

EtOH: etanol

EtOAc: acetato de etilo

Et_{2}O: éter dietílico

HPLC: cromatografía líquida de alta resolución

iPr: isopropilo

Me: metilo

MeOH: metanol

MeCN: acetonitrilo

NaHMDS: hexametildisilazida de sodio

NBS: N-bromosuccinimida

Ph: fenilo

TBE: tris-borato-EDTA

TBTU: tetrafluoroborato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio

TFA: ácido trifluoroacético

THF: tetrahidrofurano

PFU: unidades formadoras de placa

DEPC: pirocarbonato de dietilo

DTT: ditiotreitol

EDTA: tetraacetato de etilendiamina

UMP: uridina-5'-monofosfato

UTP: uridina-5'-trifosfato

MES: ácido 2-(n-morfolino)etansulfónico

SDS-PAGE: electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida

MWCO: límite de exclusión según peso molecular

Bis-Tris propano: 1,3-bis(tris(hidroximetil)metilamino)-propano

GSH: glutatión reducido

OBG: n-octil-\beta-D-glucósido

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Síntesis

Los siguientes ejemplos ilustran métodos para preparar los compuestos de la invención.

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Ejemplo 1

7

Etapa a

A una disolución de 2-cloro-3-nitropiridina 1a (51 g, 325 mmol) en THF (650 ml) se le añadió una disolución 2 M de etilamina en THF (365 ml, 731 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en agua (aproximadamente 1,5 l) y el sólido resultante se filtró y se secó bajo presión reducida para producir el compuesto 1b (52 g).

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Etapa b

Una disolución de 2-(etilamino)-3-nitropiridina 1b (52 g) en MeOH (600 ml) se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de hidrógeno (1 atm.) en presencia de Pd(OH)_{2} al 20%/C (10,4 g). El catalizador se eliminó mediante filtración a través de tierra de diatomeas. El filtrado se concentró bajo presión reducida para producir el compuesto 1c como un sólido negro (39 g, rendimiento 88% en las etapas a y b).

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Etapa c

A una disolución enfriada de 3-amino-2-(etilamino)piridina 1c (30,6 g, 223 mmol) en MeCN (740 ml) se le añadió NaHCO_{3} (56,3 g, 669 mmol). Después de 5 minutos se añadió cloruro de 5-bromo-2-cloro-3-piridincarbonilo bruto (preparado a partir de ácido 5-bromo-2-hidroxi-3-piridincarboxílico y SOCl_{2} (1 equiv., 223 mmol) [como se describe en T.W. Gero et al., en Synth. Commun., 1989, 19, 553-559 (incorporado en la presente como referencia) pero omitiendo el tratamiento acuoso]. Después de 2 horas, la mezcla de reacción se vertió sobre hielo/H_{2}O (1,5 l) y el sólido resultante se filtró, se enjuagó con H_{2}O y después con hexano. Después de secar bajo presión reducida durante la noche se obtuvo el compuesto 1d como un sólido negro (54,9 g, rendimiento 69%).

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Etapa d

A una disolución de 2-cloro-N-{2-(etilamino)-3-piridinil}-5-bromo-3-piridincarboxamida 1d (54,9 g, 154,4 mmol) en piridina (308 ml) a 50ºC se añadió gota a gota a una disolución 1 M de NaHMDS en THF (355 ml, 355 mmol). Después de 10 minutos, se dejó que la reacción se enfriase hasta la temperatura ambiente, y después se vertió sobre agua helada (2 l). El sólido resultante se filtró, se enjuagó con agua y después con hexano. El sólido se secó bajo presión reducida para producir el compuesto 1e (36 g, rendimiento 75%) como un sólido verde oscuro.

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Etapa e

A una disolución de 8-bromo-5,11-dihidro-11-etil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 1e (36,7 g, 115 mmol) en DMF (380 ml) se le añadió NaH (3,5 g, 138 mmol), y la mezcla se calentó hasta 50ºC durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se trató con MeI (14,3 ml, 230 mmol). Después de 1,5 horas, la mezcla de reacción se vertió sobre agua helada. El sólido se filtró, se lavó con agua y después con hexano para producir, después de secar, el compuesto 1f (37,9 g, rendimiento 99%) como un sólido gris oscuro.

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Etapa f

Se añadió aliltributilestaño (30,7 ml, 99,0 mmol) y Pd(Ph_{3}P)_{4} (5,20 g, 4,50 mmol) a una disolución desgasificada (N_{2} a través de una disolución durante 30 minutos) de 8-bromo-5,11-dihidro-11-etil-5-metil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 1f (30,0 g, 90,0 mmol) en DMF (450 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a 90ºC durante 1,5 horas, después se enfrió hasta la temperatura ambiente y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc, desde 8:2 a 7:3) para producir el compuesto 1g (22,19 g, rendimiento 84%).

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Etapa g

Una corriente de oxígeno ozonizado se burbujeó a través de una disolución fría (-78ºC) de 5,11-dihidro-11-etil-5-metil-8-(2-propenil)-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 1g (22,19 g, 75,4 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (150 ml) y MeOH (150 ml) durante 2,5 horas. Una corriente de N_{2} después se burbujeó a través de la disolución durante 15 minutos, y después se añadió a la disolución NaBH_{4} sólido (4,99 g, 132 mmol). Se dejó que la mezcla de reacción se calentase hasta la temperatura ambiente. Después de 1 hora se añadió NH_{4}Cl acuoso saturado (200 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Los disolventes orgánicos se eliminaron bajo presión reducida. Se añadió agua (300 ml) y CHCl_{3} (300 ml) al residuo. Las fases se separaron y la capa acuosa se extrajo con CHCl_{3} (3 x 300 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (EtOAc:CHCl_{3}, 4:1) para producir el compuesto 1h (16,1 g, rendimiento 72%) como un sólido blanco.

Ejemplo 2

8

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Etapa a

Una disolución enfriada en hielo de EtNH_{2} (49,8 g, 1,10 ml) en tolueno (200 ml) se añadió durante 15 minutos a una disolución enfriada en hielo de 2,6-dicloro-3-nitropiridina 2a (100,0 g, 0,52 mol) en tolueno (225 ml). La mezcla se agitó a 0ºC durante 45 minutos. Se añadió agua (500 ml) y EtOAc (500 ml), y las fases se separaron. La capa orgánica se lavó sucesivamente con agua (200 ml) y salmuera (200 ml), se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida. El sólido residual se recristalizó en MeOH para producir el compuesto 2b (83,7 g, rendimiento 80%) como agujas amarillas.

Etapa b

El compuesto 2c se preparó de una manera análoga al ejemplo 1, etapa b.

Etapa c

Una disolución de cloruro de 5-bromo-2-cloro-3-piridincarbonilo (30,0 g, 97,0 mmol) en MeCN (100 ml) se añadió mediante una cánula a una disolución de 3-amino-6-cloro-2-(etilamino)piridina 2c (16,6 g, 97,0 mmol) en MeCN (180 ml) que contiene NaHCO_{3} sólido (14,2 g, 169 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió agua (200 ml) y la mezcla se agitó durante 10 minutos. La suspensión resultante se filtró. El sólido se lavó con agua, después con hexano y se secó bajo presión reducida para producir el compuesto 2d (28,4 g, rendimiento 75%).

Etapa d

Una disolución 1 M de NaHMDS en THF (167,5 ml, 167,5 mmol) se añadió lentamente a una disolución de 5-bromo-2-cloro-N-{2-(etilamino)-6-cloro-3-piridinil}-3-piridincarboxamida 2d (28,4 g, 72,8 mmol) en piridina (146 ml) calentada hasta 50ºC. La mezcla de reacción se agitó a 50ºC durante 1,5 horas. La mezcla entonces se vertió en una mezcla de agua y hielo (1 l), y después de 1 hora la suspensión resultante se filtró. El sólido se lavó con agua y se secó bajo presión reducida para producir el compuesto 2e (23,4 g, rendimiento 91%).

Etapa e

Se añadió NaH sólido (dispersión en aceite al 60%, 3,46 g, 86,1 mmol) durante 30 minutos a una disolución de 8-bromo-2-cloro-5,11-dihidro-11-etil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 2e (23,4 g, 66,3 mmol) en DMF (220 ml) a 50ºC. La mezcla se agitó a 50ºC durante 1 hora, y después se dejó que se enfriase hasta la temperatura ambiente. La mezcla se vertió en agua (1 l) y la suspensión resultante se filtró. El sólido se lavó sucesivamente con agua y hexano, y después se secó bajo presión reducida para producir el compuesto 2f (23,0 g, rendimiento 94%).

Etapa f

Se añadió aliltributilestaño (21,3 ml, 68,7 mmol) en Pd(Ph_{3}P)_{4} (3,61 g, 3,12 mmol) a una disolución desgasificada (N_{2} a través de una disolución durante 30 minutos) de 8-bromo-2-cloro-5,11-dihidro-11-etil-5-metil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 2f (23,0 g, 62,5 mmol) en DMF (312 ml). La mezcla se calentó hasta 90ºC durante 2 horas. La mezcla se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc 7:3) para producir el compuesto 2g (13,4 g, rendimiento 65%).

Etapa g

Se introdujo oxígeno ozonizado en una disolución fría (-78ºC) de 2-cloro-5,11-dihidro-11-etil-5-metil-8-(2-propenil)-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 2g (13,4 g, 40,7 mmol) en MeOH (102 ml) y CH_{2}Cl_{2} (102 ml) hasta la desaparición completa del alqueno. Se burbujeó nitrógeno a través de la disolución para eliminar el exceso de O_{3}. Después se añadió NaBH_{4} sólido (2,69 g, 71,1 mmol) en pequeñas porciones y se dejó que la mezcla se calentase lentamente hasta la temperatura ambiente. Después de una hora se añadió NH_{4}Cl acuoso saturado (150 ml) y la mezcla se agitó durante 20 minutos. Los disolventes orgánicos se eliminaron bajo presión reducida. Se añadió agua (100 ml) a la disolución acuosa. La disolución se extrajo con CHCl_{3} (3 x 200 ml). La capas orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (EtOAc:CHCl_{3} 4:1) para producir el compuesto 2h (10,4 g, rendimiento 77%).

Ejemplo 3

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9

Etapa a

A una mezcla de ácido sulfúrico concentrado (600 ml) y ácido nítrico humeante (al 90%, 400 ml) en un baño de hielo (la temperatura interna se mantiene a 5-10ºC) se le añadió gota a gota 2,6-difluoropiridina 3a (200 g, 1,74 mol). La mezcla resultante se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se vertió lentamente sobre 3 kg de hielo y se extrajo con Et_{2}O (2 x 2 l). Las capas orgánicas reunidas se lavaron con NaOH 1,5 N acuoso (2 x 1 l), después con NaHCO_{3} acuoso saturado (400 ml) o hasta que el pH sea aproximadamente 8-9. Las capas orgánicas se secaron sobre MgSO_{4}, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida hasta alcanzar un peso constante (para eliminar la 2,6-difluoropiridina sin reaccionar: 10-12%). El compuesto 3b se obtuvo como un líquido amarillo
(207,3 g, rendimiento 74%).

Etapa b

A una disolución de 2,6-difluoro-3-nitropiridina 3b (45,7 g, 285 mmol) en THF (500 ml) a -40ºC se le añadió gota a gota una disolución de etilamina (25,7 g, 570 mmol) en THF (250 ml). Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró. El sólido amarillo resultante se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (EtOAc al 15% en hexano) para producir el compuesto 3c (43,2 g, rendimiento 82%) como un sólido amarillo.

Etapa c

Una disolución de 2-etilamino-6-fluoro-3-nitropiridina 3c (43,2 g, 230 mmol) en THF (1 l) se agitó durante la noche a temperatura ambiente bajo una atmósfera de hidrógeno (1 atm.) en presencia de Pd(OH)_{2} al 20%/C (4,35 g). El catalizador se eliminó mediante filtración a través de tierra de diatomeas. El filtrado se concentró bajo presión reducida para producir el compuesto 3d (36,3 g, rendimiento 95%) como un sólido negro.

Etapa d

A una disolución enfriada (4ºC) de 3-amino-2-etilamino-6-fluoropiridina 3d (31,0 g, 200 mmol) en MeCN (160 ml) se añadió NaHCO_{3} sólido (50,4 g, 600 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una disolución de cloruro de 5-bromo-2-cloro-3-piridincarbonilo (1 equiv., 200 mmol) en MeCN (155 ml). Después de 60 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió sobre agua (1,2 l) y se agitó durante 30 minutos. El sólido resultante se filtró, se secó bajo presión reducida a 50ºC durante la noche. El compuesto 3e (73,7 g, rendimiento 99%) se obtuvo como un sólido negro.

Etapa e

A una disolución de 2-cloro-N-{2-(etilamino)-6-cloro-3-piridinil}-5-bromo-3-piridincarboxamida 3e (73,5 g,
216 mmol) en piridina (435 ml) a 50ºC se le añadió gota a gota una disolución 1 M de NaHMDS en THF (520 ml, 520 mmol). Después de 10 minutos se dejó que la reacción se enfriase hasta la temperatura ambiente, después se vertió sobre agua helada (2 l). El sólido resultante se filtró, se enjuagó con agua y después hexano. El sólido se secó bajo presión reducida para producir el compuesto 3f (50,6 g, rendimiento 69%) como un sólido verde oscuro.

Etapa f

A una disolución de 8-bromo-5,11-dihidro-11-etil-2-fluoro-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 3f (44 g, 130,5 mmol) en DMF (520 ml) se la añadió NaH (4,28 g, 178 mmol), y la mezcla se calentó hasta 50ºC durante 30 minutos. La mezcla de reacción se enfrió hasta la temperatura ambiente y se trató con MeI (24,4 ml, 522 mmol). Después de 1,5 h, la mezcla de reacción se vertió sobre agua helada. El sólido se filtró, se lavó con agua y después con hexano, se secó bajo presión reducida para producir el compuesto 3g (43,2 g, rendimiento 94%) como un sólido gris oscuro.

Etapa g

Se añadió aliltributilestaño (32,0 ml, 103,4 mmol) y Pd(Ph_{3}P)_{4} (5,43 g, 4,70 mmol) a una disolución desgasificada (N_{2} a través de la disolución durante 45 minutos) de 8-bromo-5,11-dihidro-11-etil-2-fluoro-5-metil-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 3g (33,0 g, 94,0 mmol) en DMF (470 ml). Se añadió más cantidad de Pd(Ph_{3})_{4} (1,09 g, 0,94 mmol) después de 1, 2, 3, 4, y 5 horas para completar la reacción. La mezcla se calentó hasta 90ºC durante 6 horas. La mezcla se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc, desde 8:2 a 7:3) para producir el compuesto 3h (22,4 g, rendimiento 76%).

Etapa h

Una corriente de oxígeno ozonizado se burbujeó a través de una disolución fría (-78ºC) de 5,11-dihidro-11-etil-2-fluoro-5-metil-8-(2-propenil)-6H-dipirido[3,2-b:2',3'-e][1,4]diazepin-6-ona 3h (22,38 g, 71,6 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (100 ml) y MeOH (100 ml) durante 3 horas. Una corriente de N_{2} se burbujeó después a través de la disolución durante 15 minutos y después se añadió NaBH_{4} sólido (5,05 g, 133 mmol) a la disolución. La mezcla de reacción se dejó que se calentase hasta la temperatura ambiente. Después de 1 hora se añadió otra porción de NaBH_{4} (1,62 g,
43,0 mmol) a la mezcla de reacción. Después de otra hora se añadió NH_{4}Cl acuoso saturado (150 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los disolventes orgánicos se eliminaron bajo presión reducida. Se añadió agua (200 ml) y la mezcla se extrajo con CHCl_{3} (3 x 300 ml). Las capas orgánicas reunidas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se concentraron bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (EtOAc:CHCl_{3} 4:1) para producir el compuesto 3l (19,7 g, rendimiento 72%) como un sólido blanco.

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Ejemplo 4 Entradas 1003 y 1031

10

Etapa a

Una disolución de n-BuLi 1,6 M en hexano (6,22 ml, 9,95 mmol) se añadió rápidamente a una disolución fría (-78ºC) de 4a (0,87 g, 4,33 mmol) en THF (20 ml). La mezcla se agitó a -78ºC durante 10 minutos, se dejó que se calentase hasta 0ºC y se mantuvo a 0ºC durante 1 hora. Una corriente de CO_{2} se introdujo en la mezcla de reacción durante 10 minutos y la disolución se hizo ácida mediante la adición de una disolución de HCl 1,0 N acuoso. La mezcla se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se suspendió en Et_{2}O (20 ml) y se trató con una disolución de CH_{2}N_{2} en exceso en Et_{2}O (aproximadamente 0,6 M, 10 ml) durante 10 minutos. La mezcla se concentró bajo presión reducida y el residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc, desde 4:1 a 7:3) para producir 4b (0,13 g, rendimiento 17%).

Etapa b

Una disolución de DIAD (86 \mul, 0,44 mmol) en THF (2,0 ml) se añadió durante 30 minutos a una disolución de 1h (100 mg, 0,33 mmol), 4b (60,0 mg, 0,33 mmol) y PPh_{3} (114 mg, 0,44 mmol) en THF (10 ml) a 25ºC. La mezcla se agitó durante 1 h y después se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc, desde 7:1 a 1:1) para producir el compuesto 1031 (128 mg, rendimiento 83%).

Etapa c

Una disolución de LiOH 1,0 N acuoso (1,52 ml, 1,52 mmol) se añadió a una disolución del compuesto 1031 (100 mg, 0,22 mmol) en THF (6 ml) y MeOH (2 ml). La mezcla de reacción se agitó a 25ºC durante 24 horas, y después se calentó a reflujo durante 1 horas. La disolución se hizo ácida mediante la adición de una disolución de HCl 1,0 N y después se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua (2 x) y salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se trituró con Et_{2}O/hexano para producir el compuesto 1003 (80 mg, rendimiento 83%) como un sólido blanco. Una mezcla del compuesto 1003 (38,0 mg, 0,085 mmol) y una disolución de NaOH 0,02 N acuoso (4,3 ml, 0,065 mmol) en MeCN (3 ml) se sonicó. La disolución resultante se congeló y se liofilizó para producir la correspondiente sal sódica (37 mg, rendimiento 98%) como un sólido blanco.

Ejemplo 5 Entradas 1019, 1020 y 1028

11

Etapa a

Una disolución de DIAD (86 \mul, 0,44 mmol) en THF (2,0 ml) se añadió durante 2 horas a una disolución de 3i (106 mg, 0,34 mmol), 5a (56,0 mg, 0,34 mmol) y PPh_{3} (114 mg, 0,44 mmol) en THF (7 ml) a 25ºC. La mezcla se agitó durante 1 hora y después se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de re-
solución rápida (hexano:EtOAc, desde 7:3 a 1:1) para producir 5b (115 mg, rendimiento 73%) como un sólido blanco.

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Etapa b

Una disolución de LiOH 1,0 N acuoso (1,0 ml, 1,0 mmol) se añadió a una disolución de 5b (100 mg, 0,21 mmol) en MeOH (6 ml). La mezcla de reacción se agitó a 25ºC durante 24 horas. La disolución se hizo ácida mediante la adición de una disolución de HCl 1,0 N y después se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc:AcOH 50:50:1) para producir primero el compuesto 1019 (25 mg, rendimiento 25%) como un sólido blanco, seguido del compuesto 1020 (48 mg, rendimiento 50%) como un sólido blanco. Las correspondientes sales sódicas se obtuvieron mediante un tratamiento con NaOH 0,02 N acuoso.

Etapa c

Una disolución de dimetilamina 1,0 M en THF (5,0 ml, 5,0 mmol) y una disolución de LiOH 1,0 N acuoso (1,0 ml, 1,0 mmol) se añadieron a una disolución de 5b (50,0 mg, 0,11 mmol) en i-PrOH (3 ml). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 48 horas. Se añadió una disolución de HCl 1,0 N acuoso (2 ml) y la mezcla se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc:AcOH 50:50:1) para producir el compuesto 1028 (18 mg, rendimiento 35%) como un sólido blanco. La correspondiente sal sódica se obtuvo mediante un tratamiento con NaOH 0,02 N acuoso.

Ejemplo 6 Entrada 1014

12

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Etapa a

A una disolución del ácido 6a (1,00 g, 5,55 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se le añadió cloruro de oxalilo (0,73 ml, 8,3 mmol) y DMF (100 \mul). La reacción se agitó durante 90 minutos, después se añadió EtOH (15 ml), y la reacción se agitó durante otra hora más. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida, el residuo se diluyó con EtOAc, y se lavó sucesivamente con agua, salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró para producir el éster 6b, que se utilizó sin mayor purificación.

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Etapa b

A una disolución del éster 6b en CH_{2}Cl_{2} (50 ml) se le añadió una disolución 1 M de BBr_{3} en CH_{2}Cl_{2} (7,2 ml, 7,20 mmol). Después de 3 horas a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se enfrió hasta 0ºC y se añadió EtOH (5 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se concentró bajo presión reducida. El residuo se diluyó con EtOAc y se lavó sucesivamente con una disolución de NaHCO_{3} acuosa saturada, agua y salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró hasta la sequedad. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc 70:30) para producir el fenol 6c (802 mg, rendimiento 74 en 2 etapas) como una goma transparente.

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Etapa c

Una disolución de DIAD (87 \mul, 0,44 mmol) en THF (2,0 ml) se añadió durante 2 horas a una disolución de 1h (100 mg, 0,33 mmol), Ph_{3}P (104 mg, 0,44 mmol) y fenol 6c (65 mg, 0,34 mmol) en THF (7,0 ml) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante 4 horas, y después se concentró bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía de resolución rápida (hexano:EtOAc, desde 30:70 a 50:50) para producir el compuesto 6d (46 mg, rendimiento 29%) como una espuma blanca.

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Etapa d

A una disolución del éster 6d (44 mg, 0,09 mmol) en una mezcla de THF (3 ml) y MeOH (1 ml) se añadió una disolución de LiOH 1 N acuoso (1,0 ml, 1,0 mmol). Después de 4 horas a temperatura ambiente se añadió HCl 1 N (2 ml). La mezcla se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó (MgSO_{4}), se filtró y se concentró hasta la sequedad para producir el compuesto 1014 (39 mg, rendimiento 93%) como un sólido blanco. La correspondiente sal sódica se obtuvo mediante un tratamiento con 1 equivalente de hidróxido de sodio acuoso, y la disolución resultante se liofilizó para producir un sólido blanco velloso.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 1

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14

15

Ensayos de transcriptasa inversa (RT) Teoría del ensayo

Entre las enzimas que codifica el virus de la inmunodeficiencia human (HIV-1) se encuentra una transcriptasa inversa (1), que se denomina de esta manera porque transcribe una copia de DNA a partir de un molde de RNA. Esta actividad puede medirse de forma cuantitativa en un ensayo de enzimas exento de células, y está basado en la observación de que la transcriptasa inversa es capaz de utilizar un molde sintético poli r(C) cebado con un oligo biotinilado d(G) para transcribir una hebra de DNA marcada de forma radiactiva, utilizando 3H-dGTP como sustrato. El ensayo descrito a continuación utiliza la enzima de tipo salvaje (que es la forma predominante de la enzima observada en pacientes infectados con HIV-1), y también puede utilizarse con enzimas RT mutantes (por ejemplo, Y181C, preparada mediante mutagénesis dirigida a sitio en la que el resto tirosina en el codón 181 se sustituye por un resto cisteína) en condiciones de ensayo análogas. Este ensayo permite evaluar el compuesto para determinar su eficacia para inhibir las enzimas mutantes.

Materiales a) Preparación de la enzima

Algunos mutantes HIV-1 III B clon BH10 RT fueron suministrados por el doctor C.-K. Shih (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc., EEUU) en el vector pKK233-2 (Pharmacia). Brevemente, un HIV RT clon pKRT2 que contiene sólo el gen RT p66 regulado por el operón lac/promotor trc se obtuvo del doctor W. Summers (Yale University) (2). Se introdujo una diversidad de sustituciones de aminoácidos específicos en el gen RT de tipo salvaje mediante mutagénesis dirigida a sitio. Los clones RT se subclonaron en el vector de expresión bacteriano pKK233-2. Los clones que se suministran incluyen el tipo salvaje, Val106Ala, Tyr181Cys, Tyr188Cys, Tyr188Leu, Gly190Ala y Pro236Leu. Otros se prepararon in situ mediante mutagénesis dirigida a sitio de clones pKK233-2 RT que incluyen Lys103Asn, Lys103Asn/Tyr181Cys, Lys103Asn/Leu100Ile, Lys103Asn/Pro225His y Lys103Asn/Val108Ile.

b) Purificación de la enzima

La purificación de la transcriptasa inversa recombinante se realizó utilizando una combinación de métodos descritos previamente (3). Se utilizó una única colonia de placa fresca de células JM109 transformadas para iniciar el crecimiento de un precultivo cultivado o/n a 37ºC. Se inocularon dos litros de medio de crecimiento con este precultivo. A una OD_{600} de aproximadamente 1,5 (5-6 h a 37ºC). La expresión del gen RT se indujo con IPTG (1 mM final), y la fermentación se continuó durante unas pocas horas más a 37ºC. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se desecharon y los sedimentos celulares se reunieron y se almacenaron a -80ºC hasta la purificación. Las células se descongelaron a 4ºC durante la noche y se suspendieron en tampón de lisis (MES 50 mM, pH 6, EDTA 1 mM, glicerol al 10% v/v, OBG al 0,02% p/v, azida de sodio al 0,02% p/v). Se añadió lisozima y la mezcla se incubó sobre hielo durante 40 minutos. Después de la homogeneización utilizando un aparato Dounce en presencia de lisozima y sonicación, las células se centrifugaron durante 30 minutos. El sobrenadante (S1) se guardó y se almacenó a 4ºC. El sedimento centrifugado se resuspendió en tampón de extracción (MES 50 mM, pH 6, KPO_{4} 50 mM, pH 6, KCl 100 mM, glicerol al 10% v/v, OBG al 0,02% p/v, azida de sodio al 0,02% p/v) y se agitó durante 30 minutos a 4ºC. Esta segunda mezcla se centrifugó de nuevo y se guardó el sobrenadante (S2). El procedimiento anterior se repitió 2 veces más, se guardaron los sobrenadantes S3 y S4, y se realizó una última extracción durante la noche (S5). Se añadió Polymin P (al 0,005% final) a los sobrenadantes reunidos para eliminar los ácidos nucleicos. Esta disolución se agitó durante 75 minutos a 4ºC y se centrifugó durante 1 hora. El sobrenadante (SS1) se precipitó sobre hielo con sulfato de amonio al 20% p/v y se agitó durante 1 hora a 4ºC. La mezcla entonces se centrifugó y el sobrenadante resultante (SS2) se precipitó con más sulfato de amonio al 40% p/v (al 60% total), se agitó durante 1 hora y se volvió a centrifugar. El sedimento final (P1) se almacenó durante la noche a 4ºC antes de someterse a la purificación al día siguiente. Todas las etapas de la purificación se realizaron a 4ºC a menos que se indique lo contrario. El sedimento (P1) se resuspendió en MES 50 mM, pH 6, KPO_{4} 10 mM, pH 6, KCl 100 mM, glicerol al 10% v/v, OBG al 0,02% p/v, azida de sodio al 0,02% p/v. La suspensión se volvió a dializar contra el mismo tampón durante la noche utilizando tubos de diálisis MWCO de 12-14 kD. El dializado se centrifugó y el sobrenadante se filtró a través de unidades de filtro Millex-PF de 0,8 \mum. La muestra filtrada se cargó sobre una columna de hidroxiapatito (volumen de lecho 30 ml) y se lavó con el mismo tampón. La enzima unida se eluyó con aproximadamente 220 ml de un gradiente lineal de KPO_{4} 10 a 300 mM en el anterior tampón. Las fracciones que contienen el heterodímero p66/p51 (según se determina mediante SDS-PAGE al 8% y transferencia Western) se reunieron para la siguiente columna. Las fracciones que contienen RT se diluyeron dos veces con Bis-Tris propano 50 mM, pH 7,0, OBG al 0,02% p/v, glicerol al 10% v/v, azida de sodio al 0,02% p/v, y se cargaron en una columna Hi-Trap Heparin Sepharose (volumen de lecho 5 ml) y se lavaron con el mismo tampón. La RT unida después se eluyó con 75 ml de un gradiente lineal de sulfato de amonio desde 0 a 1 M en el mismo tampón. Las fracciones que contienen RT se reunieron según los resultados de los análisis SDS-PAGE y transferencia Western. La concentración de proteínas en esta reunión se determinó mediante el método de Bradford utilizando BSA como patrón. La preparación de enzimas final se dializó en MES 50 mM, pH 6, KPO_{4} 300 mM, pH 6, KCl 175 mM, glicerol al 10% v/v, azida de sodio al 0,02% p/v, se separó en partes alícuotas y se congeló
a -80ºC.

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Procedimiento de ensayo

El ensayo de enzimas radiométrico se ha adaptado a un formato de placa de microvaloración de 96 pocillos y utiliza esferas de proximidad de centelleo de estreptavidina. El ensayo se describe brevemente a continuación. La enzima RT de HIV-1 se descongeló y se diluyó de forma apropiada en Tris/HCl 50 mM, pH 7,8, que contiene NaCl 60 mM, MgCl_{2} hexahidratado 2 mM, DTT 6 mM, GSH 2 mM y Chaps al 0,02% p/v para producir enzima aproximadamente 3 nM. A 30 \mul de esta disolución enzimática se le añadieron 10 \mul de disolución de inhibidor (inhibidor desde 50 \muM a 2,5 nM en el mismo tampón de ensayo que antes, que contiene DMSO al 15% v/v). La placa se preincubó durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de realizar la siguiente etapa. En esta etapa de preincubación, la mayor y menor concentración de inhibidor es 12,5 \muM y 0,62 nM, respectivamente, y la concentración de DMSO es de 3,75% v/v. Después la reacción enzimática se inició mediante la adición de 10 \mul a la disolución de sustrato. La mezcla de reacción final contiene Tris/HCl 50 mM, pH 7,8, NaCl 60 mM, MgCl_{2}\cdot6H_{2}O 2 mM, DTT 6 mM, GSH 2 mM, Chaps al
0,02% p/v, DMSO al 3% v/v, poli rC 179 nM, biotina dG_{15} 18 nM, dGTP 288 nM, ^{3}H-dGTP 71 nM y enzima 1-2 nM.

En esta etapa de incubación, la mayor y menor concentración de inhibidor es 10 \muM y 0,5 nM, respectivamente. Después de la adición de los sustratos, la placa se cubrió con un sello de plástico y se incubó durante 1 hora a 37ºC en un incubador seco. Después la reacción se extinguió mediante la adición de 75 \mul de EDTA 0,5 M que contenía 5 mg/ml de esferas de proximidad de centello de estreptavidina.

La placa se agitó durante 2 minutos a velocidad media y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después se añadieron 75 \mul de una disolución de cloruro de cesio 7 M, la placa se agitó durante 2 minutos a velocidad media y se incubó de nuevo durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa después se cubrió con un sello de plástico y se contó utilizando un contador de luminiscencia y centelleo de microplacas TopCount-NXT^{TM} (Packard). Cada pocillo se contó durante 60 segundos. Cada fila contenía en sus extremos un blanco y un pocillo control.

El cálculo del porcentaje de inhibición es el siguiente:

16

Utilizando el anterior ensayo se ensayó un compuesto de la invención para determinar la inhibición de enzimas RT de tipo salvaje (TS) y mutantes. Los resultados aparecen en la tabla 4 como IC_{50} (nM).

Para confirmar la capacidad del compuesto para inhibir la replicación de HIV también se ensayó en el ensayo de cultivo de células T humanas (sincitios) descrito a continuación.

Ensayo ELISA para evaluar la actividad en un cultivo celular

El compuesto de la invención se ensayó para determinar su capacidad para inhibir la replicación de HIV en un cultivo celular en un ensayo con placa de 96 pocillos. Se utilizó RPMI 1640 completo, que consiste en RPMI 1640 + suero bovino fetal al 10%, gentamicina 10 \mug/ml y \beta-mercaptoetanol 10 \muM, para la dilución del compuesto, así como para medio de crecimiento celular. La línea celular de linfocitos T C8166 se infectó con una multiplicidad de infección de 0,001 con virus que codifican la transcriptasa inversa de tipo salvaje y mutante. Las células entonces se incuban durante tres días en presencia de diluciones en serie del compuesto de la invención. Se reunió el sobrenadante de ocho pocillos iguales, y se determinó la concentración de p24 extracelular utilizando un kit de ensayo de antígenos p24 de HIV-1 disponible en el mercado (Beckman-Coulter^{R}). El nivel de inhibición (porcentaje de inhibición) se calculó con la siguiente ecuación:

17

Los resultados aparecen en la tabla 2 como EC_{50} (nM).

Bibliografía (incorporada en la presente como referencia)

1. Benn, S. et al., Science, 230:949, 1985.

2. D'Aquila, R.T. y Summers, W.C., J. Acq. Imm. Def. Syn., 2:579, 1989.

3. a) Warren, T.C. et al., Protein Expression & Purification, 3:479, 1992; b) Kohlstaedt, L.A., Science, 256(5065): 1783, 1992.

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TABLA 2 Inhibición de cepas de tipo salvaje y mutante de RT para el compuesto de fórmula I

18

19

Leyendas de la tabla

IC_{50} y EC_{50}: A = >100 nM; B = 100 nM - 50 nM; C = <50 nM y NE = no ensayado.

Claims (22)

1. Un compuesto de fórmula I:

20

en la que

R^{2} es H, halógeno, alquilo(C_{1-4}), O(alquilo(C_{1-4})), NH(alquilo(C_{1-4})) o N(alquilo(C_{1-4}))_{2};

R^{4} es H o CH_{3};

R^{5} es H o CH_{3}, con la condición de R^{4} y R^{5} no son ambos iguales;

R^{12} es H, halógeno, alquilo(C_{1-4}), CF_{3} o NO_{2};

R^{13} es H, alquilo(C_{1-4}), halógeno, OH o NH_{2}, con la condición de que R^{12} y R^{13} no son ambos H; y

R^{14} es COOR^{14a}, en el que R^{14a} es H o alquilo(C_{1-6}); o R^{14} es (alquenil (C_{2-4}))COOR^{14a}, en el que R^{14a} es como se define en la presente; o R^{14} es (alquil(C_{1-4}))COOR^{14a}, en el que R^{14a} es como se define anteriormente;

o su sal.

2. El compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{2} es H, halógeno, alquilo(C_{1-4}), O(alquilo(C_{1-4})) o N(alquilo(C_{1-4}))_{2}, y R^{4} y R^{5} no son ambos iguales.

3. El compuesto según la reivindicación 2, en el que R^{2} es H, Cl, F, alquilo(C_{1-4}), O(alquilo(C_{1-4})) o N(alquilo(C_{1-4}))_{2}.

4. El compuesto según la reivindicación 3, en el que R^{2} es H, Cl, F, CH_{3}, OMe u OEt.

5. El compuesto según la reivindicación 4, en el que R^{2} es H.

6. El compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{4} es H.

7. El compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{5} es CH_{3}.

8. El compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{12} es halógeno, alquilo(C_{1-4})), CF_{3} o NO_{2}.

9. El compuesto según la reivindicación 8, en el que R^{12} es Br, Cl, CH_{3} o CH_{3}CH_{2}.

10. El compuesto según la reivindicación 9, en el que R^{12} es CH_{3} o CH_{3}CH_{2}.

11. El compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{13} es H, CH_{3}, halógeno, OH o NH_{2}.

12. El compuesto según la reivindicación 11, en el que R^{13} es H, CH_{3} u OH.

13. El compuesto según la reivindicación 12, en el que R^{13} es H.

14. El compuesto según la reivindicación 1, en el que R^{14} es COOH, COOMe, (alquenil(C_{2-4}))COOH o (alquil(C_{1-4}))COOH.

15. El compuesto según la reivindicación 14, en el que R^{14} es COOH, CH=CH-COOH, CH_{2}COOH o CH_{2}CH_{2}
COOH.

16. El compuesto según la reivindicación 15, en el que R^{14} es COOH.

17. Un compuesto de fórmula (I) según la reivindicación 1:

21

en la que

R^{2} es H, Cl, F, CH_{3}, OMe u OEt; R^{4} es H; R^{5} es CH_{3}; R^{12} es Br, Cl, CH_{3} o CH_{3}CH_{2}; R^{13} es H, CH_{3} u OH; y R^{14} es COOH, CH=CH-COOH, CH_{2}COOH o CH_{2}CH_{2}COOH; o su sal.

18. Un compuesto según la reivindicación 17, en el que R^{2} es H; R^{4} es H; R^{5} es CH_{3}; R^{12} es CH_{3} o CH_{3}CH_{2}; R^{13} es H; y R^{14} es COOH; o su sal.

19. Una composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de la infección por HIV, que comprende un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

20. Uso de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o su sal farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una infección por HIV, en combinación con un fármaco antirretrovírico.

21. Uso de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o su sal farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una infección por HIV.

22. Uso de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, o su sal farmacéuticamente aceptable, para la preparación de un medicamento para la prevención de la transmisión perinatal del HIV-1 desde la madre al bebé antes del parto.