RS63004B1 - Kristal pirido[3, 4-d]pirimidin derivata ili njegov solvat - Google Patents

Description

Opis pronalaska

Polje pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na kristale derivata pirido[3,4-d]pirimidina ili njihove solvate, koji imaju inhibitornu aktivnost prema ciklin-zavisnoj kinazi 4 i/ili ciklin-zavisnoj kinazi 6 (u daljem tekstu „CDK4/6“) i koji su korisni za prevenciju ili tretman reumatoidnog artritisa, arterioskleroze, plućne fibroze, cerebralnog infarkta i/ili raka.

Pozadina pronalaska

CDK4/6 inhibitori mogu da se koriste za lečenje različitih bolesti koje prouzrokuju abnormalan rast ćelija, uključujući rak, kardiovaskularni poremećaj, bolest bubrega, specifične infekcije i autoimune bolesti, a očekuje se da će biti delotvorni u lečenju reumatoidnog artritisa, arterioskleroze, plućne fibroze, moždanog infarkta i raka. Razlozi zašto se očekuje da zaustavljanje ćelijskog ciklusa i inhibicija rasta ćelija pomoću inhibicije CDK budu delotvorni u lečenju ovih stanja zasniva se na sledećem tehničkom otkriću.

Poznato je da reumatoidni artritis dovodi do nastanka panusa putem hiperproliferacije sinovijalnih ćelija. Objavljeno je da ova hiperproliferacija može da se smanji primenom inhibitora CDK4/6 kod posmatrane životinje (NPL 1). Kompleks CDK4-ciklin D reguliše proizvodnju MMP3 u sinovijalnim ćelijama dobijenim od pacijenta sa reumatoidnim artritisom. Negativna regulacija aktivnosti CDK4/6 inhibira ne samo proliferaciju, već i proizvodnju MMP3 (NPL 2).

Tako se očekuje da CDK4/6 inhibitori pokažu i inhibitorno dejstvo na proliferaciju sinovijalnih ćelija, i zaštitni efekat na hrskavicu kod reumatoidnog artritisa.

Indukcija ekspresije inhibitornog proteina ćelijskog ciklusa p21 adenovirusnim vektorom delotvorna je u modelu plućne fibroze kod miša (NPL 3).

Poznato je da koncentracija ciklina D/CDK4 raste u modelu moždanog infarkta kod pacova, što je u vezi sa neuronalnom smrću do koje dolazi usled ishemije. Stopa smrti neurona smanjuje se primenom flavopirodola, koji je neselektivni inhibitor CDK (NPL4).

Ciklin D-CDK4/6-INK4a-Rb put se često detektuje kod humanih kancera izazvanih abnormalnim vrednostima za bilo koji od faktora koji doprinosi rastu ćelija raka, kao što su gubitak funkcionalnog p16INK4a, preterana ekspresija ciklina D1, preterana ekspresija CDK4, ili gubitak funkcionalnog Rb (NPL 5). Takve abnormalnosti promovišu progresiju ćelijskog ciklusa iz G1 faze u S fazu, i taj put svakako igra važnu ulogu u onkogenoj transformaciji ili abnormalnom rastu ćelija kancera.

Inhibitori CDK4/6 mogu da budu naročito delotvorni kod tumora koji podrazumevaju abnormalnosti u genima koji aktiviraju CDK4/6 kinazu, kao što su kanceri kod kojih dolazi do translokacije ciklina D, kanceri koji podrazumevaju amplifikaciju ciklina D, kanceri koji podrazumevaju amplifikaciju ili preteranu ekspresiju CDK4 ili CDK6, i kanceri koji podrazumevaju inaktivaciju p16. Inhibitori CDK4/6 mogu da budu delotvorni u lečenju kancera koji podrazumevaju genetske abnormalnosti u ushodnoj regulaciji ciklina D, čija koncentracija raste usled defekata ushodnog regulatora.

Zapravo, mnoga jedinjenja koja inhibiraju CDK4/6 aktivnost su sintetisana i u struci objavljena, i takva jedinjenja su prošla kliničke testove za lečenje kancera, kao što je rak dojke (NPL 6).

Većinu akutnih i ozbiljnih toksičnih dejstava radioterapeutika i hemoterapeutika izazivaju dejstva na matične ćelije i progenitorske ćelije. Inhibitor CDK4/6 dovodi do privremenog zaustavljanja ćelijskog ciklusa kod hematopojetskih matičnih ćelija i progenitorskih ćelija i štiti ih od citotoksičnosti radioterapeutika ili hemoterapeutika. Nakon tretmana inhibitorom, hematopojetske matične i progenitorske ćelije (HSPC ćelije) vraćaju se iz privremenog dormantnog stanja i zatim funkcionišu normalno. Tako se očekuje da rezistencija na hemoterapeutike postignuta inhibitorom CDK4/6 obezbedi značajnu zaštitu koštane srži (NPL 7).

Stoga se očekuje da inhibitori CDK4/6 budu delotvorni u lečenju, npr. reumatoidnog artritisa, arterioskleroze, plućne fibroze, moždanog udara ili kancera, kao i u zaštiti koštane srži, naročito u lečenju reumatoidnog artritisa ili kancera i zaštiti koštane srži.

Inhibitori CDK, uključujući inhibitore CDK4/6, opisani su u PTL 1 i 2.

Spisak literature

Patentna literatura

[PTL 1] WO2003/062236A

[PTL 2] WO2010/020675A

Nepatentna literatura

[NPL 1] Taniguchi, K et al., Nature Medicine, tom 5, str.760-767 (1999)

[NPL 2] Nonomura Y et al., Arthritis & Rheumatology 2006, Jul; 54 (7): str.2074-83 [NPL 3] American Journal Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology, 2004, tom 286, str.L727-L733

[NPL 4] Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, tom 97, str.10254-10259

[NPL 5] Science, tom 254, str.1138-1146 (1991)

[NPL 6] Guha M, Nature Biotechnology 2013, Mar; 31 (3): str.187

[NPL 7] Journal of Clinical Investigation 2010; 120 (7): str.2528-2536

Kratak opis problema koji se rešava predmetnim pronalaskom

Cilj predmetnog pronalaska jeste da se obezbedi novi kristal derivata pirido[3,4-d]pirimidina ili njegov solvat koji pokazuje izvrsnu CDK4/6 inhibitornu aktivnost.

Način za rešavanje problema

Nakon sprovođenja detaljnih ispitivanja da bi se postigao opisani cilj, pronalazači predmetnog pronalaska su otkrili da derivati pirido[3,4-d]pirimidina sa specifičnim strukturama pokazuju izvrsnu inhibitornu aktivnost prema CDK4/6.

Pronalazači predmetnog pronalaska su takođe pronašli da neka od ovih jedinjenja mogu da formiraju kristale koji su hemijski stabilni i pogodni kao aktivni sastojci farmaceutskih preparata.

Tako se predmetni pronalazak odnosi na kristal jedinjenja predstavljenog formulom (I) ili njegov solvat, gde je navedeno jedinjenje predstavljeno formulom (I) izabrano iz grupe koja se sastoji od:

1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona;

1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina; i

(R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina.

U ovoj formuli, R<1>predstavlja atom vodonika ili C1-3alkil grupu, R<2>predstavlja atom vodonika ili okso grupu (u slučaju okso grupe, R<2>je vezan za piperazinski prsten preko dvogube veze), L predstavlja jednogubu vezu ili C1-3alkilen grupu a X predstavlja CH ili N; pod uslovom da je jedinjenje predstavljeno formulom (I) izabrano iz grupe koja se sastoji od:

1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona;

1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina; i

(R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina.

Efekat pronalaska

Predmetni pronalazak obezbeđuje kristal derivata pirido[3,4-d]pirimidina ili njegov solvat koji pokazuje izvrsnu inhibitornu aktivnost prema CDK4/6, i koji je koristan kao profilaktičko sredstvo ili sredstvo za lečenje, npr. reumatoidnog artritisa, arterioskleroze, plućne fibroze, moždanog infarkta i/ili raka.

Kristal prema predmetnom pronalasku može da se koristi kao aktivni farmaceutski sastojak u proizvodnji farmaceutskog proizvoda.

Kratak opis crteža

Slika 1 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala D 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)-piperazin-2-ona.

Slika 2 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala A 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)-piperazin-2-ona.

Slika 3 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala A 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)-piperazina.

Slika 4 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala B 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)-piperazina.

Slika 5 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala A (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina.

Slika 6 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala B 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)-piperazin-2-ona.

Slika 7 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala (kristal C) solvata 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona sa dimetil sulfoksidom.

Slika 8 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala I 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)-piperazin-2-ona.

Slika 9 prikazuje spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka kristala C 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)-piperazina.

Slika 10 prikazuje spektar infracrvene apsorpcije kristala D 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona.

Slika 11 prikazuje spektar infracrvene apsorpcije kristala A 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2- ona.

Slika 12 prikazuje spektar infracrvene apsorpcije) kristala (kristal C) solvata 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)-piperazin-2-ona sa dimetil sulfoksidom.

Slika 13 prikazuje spektar infracrvene apsorpcije kristala I 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona.

Slika 14 prikazuje spektar infracrvene apsorpcije kristala A 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina.

Slika 15 prikazuje spektar infracrvene apsorpcije kristala C 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina.

Slika 16 prikazuje spektar infracrvene apsorpcije kristala A (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina.

Slika 17-1 i slika 17-2 prikazuju NMR spektre (<13>C) čvrstog kristala D za kristal 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona. Slika 17-1 predstavlja spektar dobijen u programu rada na 6500 Hz, dok slika 17-2 predstavlja spektar dobijen u programu rada na 14000 Hz.

Slika 18 prikazuje NMR spektar (<15>N) čvrstog kristala D 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona.

Slika 19-1 i slika 19-2 prikazuju NMR spektre (<13>C) kristala A 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona. Slika 19-1 predstavlja spektar dobijen u programu rada na 6500 Hz, dok slika 19-2 predstavlja spektar dobijen u programu rada na 14000 Hz.

Slika 20 prikazuje NMR spektar (<15>N) čvrstog kristala A 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona.

Slike 21-1 i 21-2 prikazuju NMR spektar (<13>C) čvrstog kristala A 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina. Slika 21-1 predstavlja spektar dobijen u programu rada na 6500 Hz, dok slika 21-2 predstavlja spektar dobijen u programu rada na 14000 Hz.

Slika 22 prikazuje NMR spektar (<15>N) čvrstog kristala A 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina.

Slike 23-1 i 23-2 prikazuju NMR spektar (<13>C) čvrstog kristala A (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina.

Slika 23-1 predstavlja spektar dobijen u programu rada na 6500 Hz, dok slika 23-2 predstavlja spektar dobijen u programu rada na 14000 Hz.

Slika 24 prikazuje NMR spektar (<15>N) kristala A (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina.

Rešenja za realizaciju predmetnog pronalaska

Kristali prema predmetnom pronalasku karakterišu se pomoću spektrometrije difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka (XRD), diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC), infracrvene apsorpcione spektrometrije sa Furijeovom transformacijom (u daljem tekstu „spektar infracrvene apsorpcije“) i/ili NMR spektrometrije u čvrstom stanju. Spektri difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka (XRD) ovih kristala pokazuju specifične obrasce, gde svaki od ovih kristala ima specifične vrednosti pri difrakcionom uglu od 2θ. Ovi kristali takođe pokazuju specifično termičko ponašanje prilikom diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC). Spektri infracrvene apsorpcije ovih kristala pokazuju specifične obrasce, gde svaki od ovih kristala ima specifične infracrvene apsorpcione spektre sa tačno određenim talasnim brojem.<13>C NMR spektri ovih kristala u čvrstom stanju pokazuju specifične obrasce, pri čemu svaki od ovih kristala ima specifična hemijska pomeranja (ppm).<15>N NMR spektri ovih kristala u čvrstom stanju pokazuju specifične obrasce, pri čemu svaki od ovih kristala ima specifična hemijska pomeranja (ppm).

Iako predmetni pronalazak obuhvata bilo koji kristal jedinjenja predstavljenog formulom (I), opis koji sledi će biti usmeren ka rešenjima prema predmetnom pronalasku koja obuhvataju devet kristala sledeća tri jedinjenja:

– 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona (u daljem tekstu označen i kao „jedinjenje (a)“);

– 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina (u daljem tekstu označen i kao „jedinjenje (b)“); i

– (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido-[3,4-d]-pirimidin-2,8-diamina (u daljem tekstu označen i kao „jedinjenje (c)“).

Kristal D jedinjenja (a) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2θ = 6,3°, 6,6°, 11,6°, 16,9° i 20,0° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal D jedinjenja (a) pokazuje obrazac prikazan na slici 1, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

Kristal D jedinjenja (a) pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 277°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal D jedinjenja (a) pokazuje apsorpcione maksimume na talasnim brojevima od 703 cm<-1>, 896 cm<-1>i 3418 cm<-1>na karakterističnom infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom postupkom sa tabletom KBr. Kristal D jedinjenja (a) takođe pokazuje infracrveni apsorpcioni spektar prikazan na slici 10.

Kristal D jedinjenja (a) pokazuje hemijska pomeranja od 136,0 ppm, 111,2 ppm, 105,1 ppm, 101,8 ppm, 52,7 ppm, 49,6 ppm, 42,9 ppm, 23,8 ppm i 18,5 ppm na<13>C NMR spektru sa čvrstog uzorka. Kristal D jedinjenja (a) takođe pokazuje<13>C NMR spektar sa čvrstog uzorka prikazan na slici 17-1 (6500 Hz) i slici 17-2 (14000 Hz).

Kristal D jedinjenja (a) pokazuje hemijska pomeranja od 1248,6 ppm, 245,7 ppm, 229,2 ppm, 214,5 ppm, 174,3 ppm, 86,5 ppm, 54,7 ppm i -12,4 ppm na<15>N NMR spektru sa čvrstog uzorka. Kristal D jedinjenja (a) takođe pokazuje<15>N NMR spektar sa čvrstog uzorka prikazan na slici 18.

Kristal A jedinjenja (a) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2θ = 5,3°, 7,3°, 10,3°, 15,1° i 17,4° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal A jedinjenja (a) pokazuje obrazac prikazan na slici 2, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

Kristal A jedinjenja (a) pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 277°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal A jedinjenja (a) pokazuje apsorpcione maksimume na talasnim brojevima od 874 cm<-1>, 1330 cm<-1>i 3314 cm<-1>na karakterističnom infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom postupkom sa tabletom KBr. Kristal A jedinjenja (a) takođe pokazuje infracrveni apsorpcioni spektar prikazan na slici 11.

Kristal A jedinjenja (a) pokazuje hemijska pomeranja od 154,7 ppm, 138,8 ppm, 133,6 ppm, 113,2 pm, 101,6 ppm, 100,4 ppm, 67,4 ppm, 51,8 ppm, 26,6 ppm i 23,3 ppm na<13>C NMR spektru sa čvrstog uzorka. Kristal A jedinjenja (a) takođe pokazuje<13>C NMR spektar sa čvrstog uzorka prikazan na slici 19-1 (6500 Hz) i slici 19-2 (14000 Hz).

Kristal A jedinjenja (a) pokazuje hemijska pomeranja na 243,6 ppm, 86,7 ppm, 56,7 ppm i -12,4 ppm na<15>N NMR spektru sa čvrstog uzorka. Kristal A jedinjenja (a) takođe pokazuje<15>N NMR spektar sa čvrstog uzorka prikazan na slici 20.

Kristal B jedinjenja (a) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2 θ = 5,3°, 6,0°, 6,7°, 10,4° i 20,8° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal B jedinjenja (a) pokazuje obrazac prikazan na slici 6, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

Kristal B jedinjenja (a) pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 271°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal C jedinjenja (a) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2θ = 6,0°, 10,0°, 13,7°, 20,3° i 23.0° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal C jedinjenja (a) pokazuje obrazac prikazan na slici 7, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

Kristal C jedinjenja (a) pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 100°C i 278°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal C jedinjenja (a) pokazuje apsorpcione maksimume na talasnim brojevima od 840 cm<-1>, 904 cm<-1>, 1490 cm<-1>i 3281 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom postupkom sa tabletom KBr. Kristal C jedinjenja (a) takođe pokazuje infracrveni apsorpcioni spektar prikazan na slici 12.

Kristal I jedinjenja (a) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2 θ = 5,2°, 7,2°, 9,5°, 14,5°, 16,5°, 20,9°, 25,0° i 27,9° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal I jedinjenja (a) pokazuje obrazac prikazan na slici 8, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

Kristal I jedinjenja (a) pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 272°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal I jedinjenja (a) pokazuje apsorpcione maksimume na talasnim brojevima od 1081 cm<-1>i 1260 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom postupkom sa tabletom KBr. Kristal I jedinjenja (a) takođe pokazuje infracrveni apsorpcioni spektar prikazan na slici 13.

Kristal A jedinjenja (b) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2 = 5,2°, 7,6°, 8,4°, 10,5°, 15,2°, 16,9°, 20,1°, 21,0°, 23,3° i 26,6° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal A jedinjenja (b) pokazuje obrazac prikazan na slici 3, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

Kristal A jedinjenja (b) pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 225°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal A jedinjenja (b) pokazuje apsorpcione maksimume na talasnim brojevima od 1369 cm<-1>, 1424 cm<-1>, 1508 cm<-1>, 1545 cm<-1>i 1566 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom

1

spektru. Kristal A jedinjenja (b) takođe pokazuje infracrveni apsorpcioni spektar prikazan na slici 14.

Kristal A jedinjenja (b) pokazuje hemijska pomeranja od 163,4 ppm, 157,6 ppm, 155,5 ppm, 117,8 ppm, 82,2 ppm, 56,1 ppm i 42,3 ppm na<13>C NMR spektru sa čvrstog uzorka. Kristal A jedinjenja (b) takođe pokazuje<13>C NMR spektar sa čvrstog uzorka prikazan na slici 21-1 (6500 Hz) i slici 21-2 (14000 Hz).

Kristal A jedinjenja (b) pokazuje hemijska pomeranja na 311,7 ppm, 232,4 ppm, 168,5 ppm, 79,5 ppm, 53,3 ppm, 32,9 ppm i -4,3 ppm na<15>N NMR spektru sa čvrstog uzorka. Kristal A jedinjenja (b) takođe pokazuje<15>N NMR spektar sa čvrstog uzorka prikazan na slici 22.

Kristal B jedinjenja (b) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2 θ = 5,2°, 6,6°, 8,1°, 15,2°, 15,9°, 16,2°, 18,8°, 20,5°, 20,8° i 21,7° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal B jedinjenja (b) pokazuje obrazac prikazan na slici 4, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

Kristal B jedinjenja (b) pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 221°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal C jedinjenja (b) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2 θ = 5,2°, 7,6°, 8,4°, 10,0°, 10,5°, 11,9°, 15,2°, 17,0°, 20,9° i 21,2° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal C jedinjenja (b) pokazuje obrazac prikazan na slici 9, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal C jedinjenja (b) takođe pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 223°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal C jedinjenja (b) pokazuje apsorpcione maksimume na talasnim brojevima od 1369 cm<-1>, 1424 cm<-1>, 1507 cm<-1>, 1546 cm<-1>i 1566 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom postupkom sa tabletom KBr. Kristal C jedinjenja (b) takođe pokazuje infracrveni apsorpcioni spektar prikazan na slici 15.

Kristal A jedinjenja (c) pokazuje karakteristične maksimume na uglovima difrakcije 2 θ = 4,8°, 7,6°, 8,2°, 9,7°, 15,3°, 16,6°, 19,1°, 19,8°, 22,4° i 26,2° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristal A jedinjenja (c) pokazuje obrazac prikazan na slici 5, na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka.

Kristal A jedinjenja (c) pokazuje endotermni maksimum sa ekstrapoliranom temperaturom prelaza od 182°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC).

Kristal A jedinjenja (c) pokazuje apsorpcione maksimume na talasnim brojevima od 1115 cm<-1>, 1446 cm<-1>, 1508 cm<-1>, 1560 cm<-1>i 1601 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom postupkom sa tabletom KBr. Kristal A jedinjenja (c) takođe pokazuje infracrveni apsorpcioni spektar prikazan na slici 16.

Kristal A jedinjenja (c) pokazuje hemijska pomeranja na 161,3 ppm, 150,8 ppm, 138,9 ppm, 128,1 ppm, 109,8 ppm, 82,7 ppm, 47,6 ppm, 42,5 ppm, 41,5 ppm, 24,5 ppm i 21,7 ppm na<13>C NMR spektru sa čvrstog uzorka. Kristal A jedinjenja (c) takođe pokazuje<13>C NMR spektar sa čvrstog uzorka prikazan na slici 23-1 (6500 Hz) i slici 23-2 (14000 Hz).

Kristal A jedinjenja (c) pokazuje hemijska pomeranja na 242,8 ppm, 233,8 ppm, 219,0 ppm, 171,7 ppm, 86,9 ppm, 54,9 ppm, 11,3 ppm i -5,5 ppm na<15>N NMR spektru sa čvrstog uzorka. Kristal A jedinjenja (c) takođe pokazuje<15>N NMR spektar sa čvrstog uzorka prikazan na slici 24.

Izraz „karakteristični maksimumi“, kada se koristi u predmetnoj prijavi, označava maksimume koji se primarno uočavaju za, i koji su karakteristični za svaki od kristalnih polimorfa na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka. Kristali identifikovani difrakcionim uglovima navedenim u predmetnom pronalasku mogu da pokazuju i druge maksimume, osim karakterističnih maksimuma.

Položaj i relativni intenzitet svakog od maksimuma na difrakcionom uglu od 2θ na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka može donekle da varira u zavisnosti od mernih uslova. Shodno tome, identifikacija kristala treba da se zasniva na celokupnoj sličnosti oblika spektra, iako se svaka od vrednosti za 2θ pomalo razlikuje. Kristali u okviru intervala greške obuhvaćeni su obimom zaštite predmetnog pronalaska. Interval greške za vrednost 2θ može, na primer, da bude u opsegu od ±0,5° ili ±0,2°. Naime, kristali sa difrakcionim uglovima koji se nalaze u opsegu od ±0,2° do ±0,5° odgovarajuće vrednosti trebalo bi da budu obuhvaćeni obimom zaštite kristala prema predmetnom pronalasku.

Kristali obuhvaćeni intervalom greški koje potiču iz uslova spektrometrije X zraka sa sprašenog uzorka (npr. merni instrumenti) takođe su obuhvaćeni obimom zaštite predmetnog pronalaska.

Izraz „ekstrapolirana temperatura prelaza“ za neki maksimum u kontekstu diferencijalne skenirajuće kalorimetrije (DSC) označava temperaturu na kojoj počinje egzotermni ili endotermni maksimum, tj. temperaturu prelaza ka egzotermnoj ili endotermnoj reakciji koja se računa ekstrapolacijom. Egzotermni ili endotermni maksimum na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) može donekle da varira u zavisnosti od mernih uslova. Opseg greške može da bude, na primer, u okviru ±5°C ili ±2°C. Naime, kristali sa maksimumima u okviru od ±2°C do ±5°C od odgovarajuće vrednosti koja je navedena iznad obuhvaćeni su obimom zaštite kristala prema predmetnom pronalasku.

Uopšteno posmatrano, hemijska pomeranja na NMR spektru sa čvrstog uzorka takođe mogu da podrazumevaju greške. Interval greške za hemijska pomeranja može, na primer, da bude u opsegu od ± 0,25 ppm, a obično je u opsegu od ± 0,5 ppm. Naime, kristali sa hemijskim pomeranjem u opsegu od ± 0,25 ppm do ± 0,5° ppm odgovarajuće prethodno navedene vrednosti trebalo bi da budu obuhvaćeni obimom zaštite kristala prema predmetnom pronalasku. Razlike u, na primer, rotacionim frekvencijama i mernim instrumentima mogu da utiču na intenzitet ili pojavu/nestanak svakog od maksimuma.

Uopšteno posmatrano, apsorpcioni maksimumi na infracrvenom apsorpcionom spektru takođe mogu da podrazumevaju greške. Interval greške za apsorpcioni maksimum može, na primer, da bude u opsegu od ± 2 cm<-1>, a obično je u opsegu od ± 5 cm<-1>. Naime, kristali sa apsorpcionim maksimumima koji se nalaze u opsegu od ± 2 cm<-1>do ± 5 cm<-1>odgovarajuće vrednosti navedene iznad, trebalo bi da budu obuhvaćeni obimom zaštite kristala prema predmetnom pronalasku.

Uz to, za svaku spektrometriju difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju (DSC), infracrvenu apsorpcionu spektrometriju,<13>C NMR spektrometriju sa čvrstog uzorka i<15>N NMR spektrometriju sa čvrstog uzorka, iako može da postoji razlika između stvarno izmerene vrednosti referentnog standarda za svaki kristal (npr. kristal dobijen postupkom opisanim u primerima predmetnog opisa) i specifične vrednosti koja je gore navedena, takva razlika treba da se tumači kao greška u merenju. Naime, kristali sa difrakcionim uglovima, endotermnim ili egzotermnim maksimumima, infracrvenim apsorpcionim spektrima,<13>C NMR spektrima sa čvrstog uzorka ili<15>N NMR spektrima sa čvrstog uzorka, koji ostaju u opsegu greške izračunate kao što je gore navedeno obuhvaćeni su obimom zaštite kristala prema predmetnom pronalasku.

Primeri

U daljem tekstu su opisani primeri prema predmetnom pronalasku. Postupci za sintezu, prečišćavanje i kristalizaciju jedinjenja opisanih u primerima koji slede su samo rešenja za dobijanje kristala prema predmetnom pronalasku, čime kristal prema predmetnom pronalasku nije ograničen na kristale koji se dobiju postupcima sinteze, prečišćavanja i kristalizacije jedinjenja opisanim u primerima koji slede.

1

Struktura kristalnih jedinjenja u skladu sa primerima i novih jedinjenja izolovanih tokom sinteze određene su<1>H-NMR ili masenom spektrometrijom pomoću LC/MS (tečna hromatografija/masena spektrometrija).

<1>H-NMR je sniman uređajem JEOL JNM-ECZ400S (400MHz). Standardni uzorak bio je TMS (tetrametilsilan) (maksimum na 0,0 ppm) za CDCl3kao rastvarač, ili dimetil sulfoksid (maksimum na 2,49 ppm) za DMSO-d6. Kod 1H-NMR spektra (400 MHz, DMSO-d6, CD3OD, ili CDCl3), prikazano je hemijsko pomeranje (δ: ppm) i konstanta kuplovanja (J: Hz), gde s označava singlet, d označava dublet, t označava triplet, q označava kvartet, br s označava široki singlet, a m označava multiplet.

Rezultati LC/MS spektrometrije su prikazani kroz [M+H]<+>(uočena molekulska masa (Obs. MS), tj. proton [H]<+>se dodaje na molekulsku masu [M] jedinjenja).

Spektar difrakcije X zraka za svaki kristalni prah prema primerima sniman je pod sledećim uslovima: instrument: D8 DISCOVER sa ADDS CS proizvođača Bulker AXS Inc., izvor X zraka: Cu·Kα (talasna dužina: 1,541838 (10<-10>m)), napon cevi – jačina struje cevi: 40kv-40mA, grafitni monohromator sa ravnom pločom, strana sa pojavama, kolimator: ϕ300 μm, dvodimenzioni PSPC detektor, opseg skeniranja: 3 do 40°.

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC) uzoraka predstavljenih u primerima izvedena je pod sledećim uslovima: instrument: DSC 8000 proizvođača Perkin Elmer, brzina zagrevanja: 10°C/min, atmosfera: azot, postolje za uzorak: aluminijum, uzorkovanje: 0,1/sec, opseg skeniranja: 25 do 300°C.

IR apsorpcioni spektri (KBr) za svaki od primera snimljeni su u skladu sa procedurom sa tabletom kalijum bromida za IR apsorpcionu spektrometriju opisanom u opštim postupcima testiranja u Japanskoj farmakopeji pod sledećim uslovima: instrument: AVATAR320 Nicolet iS5 proizvođača Thermo Fisher Scientific, opseg skeniranja: 4000 do 400cm<-1>, rezolucija: 4cm<-1>, akumulativnih ciklusa: 16.

Snimanje NMR spektara sa čvrstih uzoraka predstavljenih u primerima izvedeno je pod sledećim uslovima: instrument: Bruker DSX300WB, merena jezgra:<13>C i<15>N, vreme ponavljanja pulsa: 5s, pulsni program rada: CP/MAS.

Primer 1

Primer 1 opisuje kristal D 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona (jedinjenje (a)).

U tekstu koji sledi opisana je sinteza jedinjenja (a). Sinteza jedinjenja (a)-1

Sintetisan je metil 5-brom-2-metiltiopirimidin-4-karboksilat (jedinjenje (a)-1).

Rastvor 5-brom-2-(metiltio)pirimidin-4-karboksilne kiseline (110 g, 0,44 mol) u metanolu (1,1 l) ohlađen je do 0°C uz mešanje, pa mu je dodat tionil hlorid (50 ml, 0,66 mol) u kapima. Rastvor je polako zagrevan do refluksa u toku četiri časa. Kraj reakcije je potvrđen pomoću LC/MS i TLC, pa je rastvor ohlađen do sobne temperature. Isparljiva komponenta je udaljena pod sniženim pritiskom, pa je ostatak rastvoren u etilacetatu (1 l). Rastvor je ispran 10% vodenim rastvorom natrijum karbonata (200 ml) tri puta, pa zasićenim vodenim rastvorom soli (200 ml) dva puta. Dobijena organska faza je osušena preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Nakon što je čvrsta komponenta odvojena ceđenjem, filtrat je koncentrovan. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do jedinjenja (a)-1 (88g, 75%).

Sinteza jedinjenja (a)-2

Sintetisano je jedinjenje (a)-2, 5-brom-2-metiltiopirimidin-4-karbaldehid.

1,7M rastvor jedinjenja (a)-1 (25 g, 95 mmol) u THF-u (tetrahidrofuran) (375 ml) ohlađen je uz mešanje do -78°C u struji azota. U rastvor je u kapima dodat diizobutilamonijum hidrid (84 ml, 143 mmol) u toluenu, pa je smeša mešana četiri časa na -78°C. Nakon što je potvrđeno da je reakcija završena pomoću TLC, dodat je metanol u kapima na -78°C da bi se reakcija zaustavila, pa je rastvor polako zagrejan do 0°C. Rastvor je razblažen etilacetatom i proceđen uz vakuum kroz Celit. Filtrat je ispran zasićenim vodenim rastvorom soli (200 ml) dva puta, pa je dobijena organska faza osušena preko anhidrovanog

1

magnezijum sulfata, nakon čega je čvrsta supstanca izdvojena filtracijom. Filtrat je koncentrovan kako bi se dobilo naslovno jedinjenje (25g, sirovo jedinjenje). Sirovo jedinjenje je korišćeno direktno u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza jedinjenja (a)-3

Sintetisano je jedinjenje (a)-3, (R)-3-(4-formil-2-metiltiopirimidin-5-il)-1-metil-2-propinil benzoat.

Rastvor PdCl2(PPh3)2Cl2(7,832 g, 11,2 mmol) i bakar jodida (2,12 g, 11,2 mmol) u 1,4-dioksanu (60 ml) je dezaerisan i barbotiran argonom. Dodat je diizopropiletilamin (25,29 ml, 145,1 mmol) na sobnoj temperaturi. Rastvor je mešan pet minuta na sobnoj temperaturi, pa mu je na sobnoj temperaturi dodat rastvor smeše (26,0 g, sirovi proizvod) jedinjenja (a)-2 i (5-brom-2-metiltiopirimidin-4-il)metoksimetanola u 1,4-dioksanu (50 ml). Rastvor (R)-1-metilpropargil benzoata (23,3 g, 133,9 mmol) u 1,4-dioksanu (55 ml) je zatim polako dodat u kapima, pa je rastvor mešan 16 časova na sobnoj temperaturi. Reakcija je praćena pomoću LC/MS. Nakon završetka reakcije, smeša je razblažena etilacetatom (400 ml), zatim proceđena kroz Celit. Celitni kolač je ispran etilacetatom. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Dobijeni sirovi proizvod je korišćen direktno u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza smeše jedinjenja (a)-2 i (5-brom-2-metiltiopirimidin-4-il)metoksimetanola biće opisana u referentnom primeru 1.

1

Referentni primer 1

Sinteza smeše jedinjenja (a)-2 i (5-brom-2-metiltiopirimidin-4-il)metoksimetanola

Rastvor jedinjenja (a)-2 (25 g, 95 mmol) u THF-u (375 ml) ohlađen je uz mešanje do -78°C u struji azota. Dodat je 1,7 M rastvor diizobutil aluminijum hidrida (84 ml, 143 mmol) u toluenu u kapima, pa je rastvor mešan četiri časa na -78°C. Nakon što je TLC-om potvrđeno da je reakcija završena, dodat je metanol u kapima na -78°C da bi se reakcija zaustavila. Rastvor je polako zagrejan na 0°C. Rastvor je razblažen etilacetatom i proceđen uz vakuum kroz Celit. Filtrat je ispran zasićenim vodenim rastvorom soli (200 ml) dva puta, pa je dobijena organska faza osušena preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Čvrsta komponenta je odvojena filtracijom. Filtrat je koncentrovan kako bi se dobila smeša (25 g, sirovo jedinjenje) naslovnog jedinjenja. Sirovi proizvod je korišćen direktno u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza jedinjenja (a)-4

Sintetisano je jedinjenje (a)-4, (R)-6-(1-(benzoiloksi)etil)-2-(metiltio)pirido[3,4-d]pirimidin-7-oksid.

U rastvor (260 ml) jedinjenja (a)-3 (26,0 g, 79,8 mmol) u etanolu na sobnoj temperaturi dodata je monohidrohloridna so hidroksiamina (8,31 g, 119,6 mmol) i natrijum acetat (9,81 g, 119,6 mmol), pa je smeša mešana na sobnoj temperaturi 16 časova. U rastvor je dodat etanol (250 ml), pa je na sobnoj temperaturi dodat kalijum karbonat (27,5 g, 199,4 mmol), te je smeša mešana tri časa na 50°C. Reakcija je praćena pomoću LC/MS. Nakon što

1

je reakcija završena, reakciona smeša je proceđena kroz Celit uz vakuum. Celitni kolač je ispran etilacetatom (1,0 l) i malom zapreminom metanola. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom, pa je organski sloj osušen preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Čvrsta komponenta je odvojena filtracijom. Dobijeni sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do jedinjenja (a)-4 (13,0g, 48%).

<1>H-NMR spektar jedinjenja (a)-4 je sledeći:<1>H-NMR(CDCl3) δ: 9.04 (1H, s), 8,79 (1H, s), 8,14 (2H, d, J=7,5Hz), 7,77-7,40 (4H, m), 6,66 (1H, q, J=6,3Hz), 2,65 (3H, s), 1,79 (3H, d, J=6,6Hz).

Sinteza jedinjenja (a)-5

Sintetisano je jedinjenje (a)-5, (R)-1-(8-hlor-2-(metiltio)pirido[3,4-d]pirimidin-6-il)etil benzoat.

U rastvor (130 ml) jedinjenja (a)-4 (8,0 g, 23,5 mmol) u dihlormetanu, na 0°C, u struji azota, dodat je tionil hlorid (51 ml, 704 mmol) u kapima. Rastvor je mešan 16 časova na sobnoj temperaturi. Reakcija je praćena pomoću hromatografije na tankom sloju (TLC). Nakon završetka reakcije, rastvor je koncentrovan pod sniženim pritiskom, pa je dobijena organska faza prečišćena hromatografijom na koloni aluminijum oksida kako bi se dobilo jedinjenje (a)-5 (3,2 g, 37%).

<1>H-NMR spektar jedinjenja (a)-5 je sledeći:<1>H-NMR(CDCl3) δ: 9,19 (1H, s), 8,16-8,12 (2H, m), 7,68 (1H, s), 7,64-7,58 (1H, m), 7,53-7,46 (2H, m), 6,27 (1H, q, J=6,8 Hz), 2,74 (3H, s), 1,81 (3H, d, J=6,4Hz).

1

Jedinjenje (a)-6

Sinteza jedinjenja (a)-6, (R)-1-(8-(izopropilamino)-2-(metiltio)pirido[3,4-d]pirimidin-6-il)etil benzoata.

Smeša jedinjenja (a)-5 (3,06 g, 8,5 mmol) i izopropilamina (18 ml) mešana je jedan čas na 80°C pa je rastvor ohlađen do sobne temperature. Rastvor je razblažen vodom i estrahovan etilacetatom. Dobijena organska faza je isprana vodenim rastvorom soli, pa osušena preko anhidrovanog natrijum sulfata. Rastvarač je udaljen, pa je sirovi proizvod prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do jedinjenja (a)-6 (1,78g, prinos 55%).

<1>H-NMR spektar jedinjenja (a)-6 je sledeći:<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 9,28 (1H, s), 8,08 (2H, d, J=7,4 Hz), 7,70 (1H, t, J=7,4 Hz), 7,57 (2H, t, J=7,7 Hz),7,05 (1H, d, J=8,0 Hz), 6,99 (1H, s), 5,34 (2H, s), 4,32 (1H, m), 2,66 (3H, s), 1,25 (6H, d, J=6,5 Hz).

Sinteza jedinjenja (a)-7

Sintetisano je jedinjenje (a)-7, (R)-1-(8-(izopropilamino)-2-(metilsulfonil)pirido[3,4-d]pirimidin-6-il)etil benzoat.

1

Okson (peroksimonokalijum sulfat) (5,72 g, 9,3 mmol) je dodat u rastvor jedinjenja (a)-6 (1,78 g, 4,7 mmol) u smeši rastvarača tetrahidrofurana (47 ml) i vode (47 ml) na 0°C, pa je smeša mešana na sobnoj temperaturi 18 časova. Rastvor je estrahovan etilacetatom. Organska faza je isprana vodom i osušena preko bezvodnog natrijum sulfata. Rastvarač je udaljen, pa je sirovi proizvod prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do jedinjenja (a)-7 (1,61g, prinos 87%). LC/MS: (M+H)<+>= 415,0

Sinteza jedinjenja (a)-8

Sintetisano je jedinjenje (a)-8, terc-butil 4-(6-nitropiridin-3-il)-3-oksopiperazin-1-karboksilat.

2-nitro-5-brompiridin (1,01, 5,0 mol), terc-butil 2-okso-4-piperazin-karboksilat (1,00, 5,0 mol) i cezijum karbonat (3,26 g, 10,0 mmol) su suspendovani u 1,4-dioksanu, pa je kroz suspenziju barbotiran gasoviti azot tokom 30 minuta. U suspenziju su dodati ksantfos (4,5’-bis(difenilfosfino)-9,9’-dimetilksanten) (246 mg, 0.43 mmol) i tris(dibenzilidenaceton)-dipaladijum (229 mg, 0,25 mmol), smeša je zagrevana do refluksa uz mešanje tokom dva časa. Rastvor je ohlađen do sobne temperature, pa su dodati voda i etilacetat. Rastvor je proceđen kroz Celit. Organski sloj filtrata je izdvojen, a vodena faza je estrahovana etilacetatom. Dobijene organske faze su spojene a potom osušene preko bezvodnog natrijum sulfata. Čvrsta komponenta je odvojena filtracijom, pa je dobijeni filtrat koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do jedinjenja (a)-8 (1,08g, 67%).

<1>H-NMR(CDCl3) δ: 8,67 (1H, d, J=2,4 Hz), 8,32 (1H, d, J=8,8 Hz), 8,15 (1H, dd, J=8,8, 2,4 Hz), 4,33 (2H, s), 3,93-3,83 (4H, m), 1,51 (9H, s).

2

Sinteza jedinjenja (a)-9

Sintetisano je jedinjenje (a)-9, terc-butil 4-(6-aminopiridin-3-il)-3-oksopiperazin-1-karboksilat.

Jedinjenje (a)-8 (1,08 g, 3,34 mmol) je rastvoreno u smeši etanola (45 ml) i THF-a (22 ml). U rastvor je dodat paladijum na uglju (108 mg), pa je smeša mešana 24 časa u atmosferi vodonika. Rastvor je proceđen kroz celit, pa je filtrat koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do jedinjenja (a)-9 (0,928g, 95%).

<1>H-NMR(CDCl3) δ: 7,99 (1H, d, J=2,4 Hz), 7,38 (1H, dd, J=8,8, 2,4 Hz), 6,53 (1H, d, J=8,8 Hz), 4,50 (2H, br s), 4,24 (2H, s), 3,78 (2H, t, J=5,1 Hz), 3,67 (2H, t, J=5,4 Hz), 1,50 (9H, s).

Sinteza jedinjenja (a)-10

Sintetisano je jedinjenje (a)-10, terc-butil (R)-4-(6-((6-(1-(benzoiloksi)etil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)piridin-3-il)-3-oksopiperazin-1-karboksilat.

Jedinjenje (a)-7 (62 mg, 0,15 mmol) i jedinjenje (a)-9 (88 mg, 0,30 mmol) su mešani u toluenu (0,375 ml) na 100°C šest dana. Rastvor je prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do naslovnog jedinjenja (a)-10 (0,0092g, 10%).

<1>H-NMR (DMSO) δ: 10,27 (1H, s), 9,27 (1H, s), 8,33 (2H, m), 8,07 (2H, m), 7,86 (1H, m), 7,70 (1H, m), 7,58 (3H, m), 7,00 (1H, s), 6,55 (1H, d), 5,98 (1H, q), 4,27 (1H, m), 4,11 (2H, s), 3,74 (4H, m), 1,68 (3H, d), 1,45 (9H, s), 1,30 (6H, m).

Sinteza i prečišćavanje jedinjenja (a)

Sintetisano je jedinjenje (a), 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido-[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-on.

U rastvor jedinjenja (a)-10 (9,2 mg, 0,15 mmol) u dihlormetanu (0,35 ml) na sobnoj temperaturi dodata je fluorsirćetna kiselina (0,15 ml) pa je rastvor mešan jedan čas. Nakon što je rastvor uparen do suva, dodati su tetrahidrofuran (0,15 ml) i metanol (0,15 ml) a potom i vodeni 4M rastvor litijum hidroksida (0,018 ml). Nakon reakcije, rastvor je neutralisan mravljom kiselinom, dobijena smeša je prečišćena hromatografijom u koloni silika gela kako bi se dobilo naslovno jedinjenje.

<1>H-NMR (DMSO) δ: 10,16 (1H, s), 9,26 (1H, s), 8,31 (1H, m), 8,29 (1H, s), 7,81 (1H, m), 7,00 (1H, s), 6,42 (1H, m), 5,18 (1H, d), 4,63 (1H, m), 4,27 (1H, m), 3,65 (2H, m), 3,41 (2H, s), 3,05 (2H, m), 1,39 (3H, d), 1,30 (6H, m).

Dobijanje kristala D jedinjenja (a)

Rastvor jedinjenja (a) prečišćen hromatografijom u koloni silika gela koncentrovan je dok se nisu istaložili kristali. Tako je dobijen kristal D jedinjenja (a).

Karakterizacija kristala D jedinjenja (a)

Na slici 1 prikazan je spektar difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 6,3°, 6,6°, 11,6°, 16,9° i 20,0° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 277°C.

Slika 10 prikazuje IR apsorpcioni spektar (Kbr) navedenog kristala. Apsorpcioni maksimumi su uočeni na 703 cm<-1>, 896 cm<-1>i 3418 cm<-1>(talasni broj).

Slike 17-1 i 17-2 prikazuju<13>C NMR spektar sa čvrstog uzorka ovog kristala. Slika 17-1 prikazuje program rada na 6500 Hz a slika 17-2 program rada na 14000 Hz. Maksimumi su uočeni na vrednostima 136,0 ppm, 111,2 ppm, 105,1 ppm, 101,8 ppm, 52,7 ppm, 49,6 ppm, 42,9 ppm, 23,8 ppm i 18,5 ppm (hemijska pomeranja).

Slika 18 prikazuje<15>N-NMR spektar navedenog kristala sa čvrstog uzorka. Maksimumi su uočeni na vrednostima 248,6 ppm, 245,7 ppm, 229,2 ppm, 214,5 ppm, 174,3 ppm, 86,5 ppm, 54,7 ppm i -12,4 ppm (hemijska pomeranja).

Primer 2

Primer 2 opisuje kristal A 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona (jedinjenje (a)).

Dobijanje kristala A jedinjenja (a)

Kristal A jedinjenja (a) dobijen je transformacijom kristala D jedinjenja (a) dobijenog u primeru 1.

Kristal D je suspendovan u 5- do 50-puta većoj zapremini etanola. Suspenzija je zagrevana uz mešanje šest časova, a zatim mešana na 0°C. Istaloženi precipitat je izdvojen filtracijom i osušen u kristale.

Iako nema ograničenja za zapreminu rastvarača, vreme zagrevanja, uslove mešanja, vreme ceđenja, ovi parametri mogu da utiču na prinos kristala, hemijsku čistoću, prečnik čestica i raspodelu dimenzija čestica. Poželjno je da ovi parametri budu prikladno određeni. Kristali se mogu izdvojiti bilo kojim uobičajenim procesom, na primer, spontanom

2

filtracijom, filtracijom pod pritiskom, filtracijom na vakuumu, sušenjem zagrevanjem ili sušanjem zagrevanjem pod sniženim pritiskom.

Karakterizacija kristala A jedinjenja (a)

Na slici 2 prikazan je spektar difrakcije X zraka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 5,3°, 7,3°, 10,3°, 15,1° i 17,4° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 277°C.

Slika 11 prikazuje IR apsorpcioni spektar (Kbr) navedenog kristala. Apsorpcioni maksimumi su uočeni na 874 cm<-1>, 1330 cm<-1>i 3314 cm<-1>(talasni broj).

Slike 19-1 i 19-2 prikazuju<13>C NMR spektar sa čvrstog uzorka ovog kristala. Slika 19-1 prikazuje program rada na 6500 Hz a slika 19-2 program rada na 14000 Hz. Maksimumi su uočeni na vrednostima 154,7 ppm, 138,8 ppm, 133,6 ppm, 113,2 pm, 101,6 ppm, 100,4 ppm, 67,4 ppm, 51,8 ppm, 26,6 ppm i 23,3 ppm (hemijska pomeranja).

Slika 20 prikazuje<15>N-NMR spektar navedenog kristala sa čvrstog uzorka. Maksimumi su uočeni na vrednostima 243,6 ppm, 86,7 ppm, 56,7 ppm i -12,4 ppm (hemijska pomeranja).

Primer 3

Primer 3 opisuje kristal B 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona (jedinjenje (a)).

Dobijanje kristala B jedinjenja (a)

Jedinjenje (a) je prečišćeno kao u primeru 1 osim što je rastvarač koji je korišćen za hromatografiju na koloni bio dihlormetan/metanol = 20/1 a rastvor jedinjenja (a) je koncentrovan dok se kristali nisu izdvojili. Tako je dobijen kristal B jedinjenja (a).

Na slici 6 prikazan je spektar difrakcije X zraka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 5,3°, 6,0°, 6,7°, 10,4° i 20,8° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 271°C.

Primer 4

Dobijanje kristala C jedinjenja (a)

Dimetil sulfoksid (5,4 ml) je dodat u kristal D (900 mg) jedinjenja (a) pa je smeša zagrejana na 70°C. Dobijeni rastvor je ohlađen do 40°C. Dodat je acetonitril (6,75 ml), ohlađen do 15°C a potom mešan dva časa. Čvrsta komponenta je odvojena filtracijom, isprana acetonitrilom (2,5 ml), te osušena pod sniženim pritiskom na 40°C kako bi se dobio adukt naslovnog jedinjenja (986 mg, 92%) sa dimetil sulfoksidom.

Karakterizacija kristala C jedinjenja (a)

Na slici 7 prikazan je spektar difrakcije X zraka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 6,0°, 10,0°, 13,7°, 20,3° i 23,0° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 100°C i 278°C.

Slika 12 prikazuje IR apsorpcioni spektar (Kbr) navedenog kristala. Apsorpcioni maksimumi su uočeni na 840 cm<-1>, 904 cm<-1>, 955 cm<-1>, 1490 cm<-1>i 3281 cm<-1>(talasni broj).

Primer 5

Dobijanje kristala I jedinjenja (a)

U kristal A (500 mg) jedinjenja (a) dodata je voda (10 ml) pa je smeša mešana četiri dana na sobnoj temperaturi. Dobijena čvrsta supstanca je izdvojena filtracijom i osušena na 30°C pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo naslovno jedinjenje (432 mg, 86%).

Karakterizacija kristala I jedinjenja (a)

Na slici 8 prikazan je spektar difrakcije X zraka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 5,2°, 7,2°, 9,5°, 14,5°, 16,5°, 20,9°, 25,0° i 27,9° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 272°C.

Slika 13 prikazuje IR apsorpcioni spektar (Kbr) navedenog kristala. Apsorpcioni maksimumi su uočeni na 1081 cm<-1>i 1260 cm<-1>(talasni broj).

Primer 6

Primer 6 opisuje kristal A 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazin-1-il(piperazina) (jedinjenje (b)).

U tekstu koji sledi opisana je sinteza jedinjenja (b).

2

Sinteza jedinjenja (b)-1

Sintetisano je jedinjenje (b)-1, (R)-N-izopropil-6-(1-metoksietil)-2-(metiltio)pirido-[3,4-d]pirimidin-8-amin.

Jedinjenje (b)-1 je sintetisano kao što je opisano za jedinjenja (a)-3, (a)-4, (a)-5 i (a)-6.

<1>H-NMR (DMSO-d6) δ: 9,27 (7H, s), 6,94 (1H, br s), 6,92 (1H, s), 4,30-4,23 (1H, m), 3,29 (3H, s), 2,66 (3H, s), 1,38 (3H, d, J=6,4 Hz), 1,32-1,25 (6H, m).

Sinteza jedinjenja (b)-2

Sintetisano je jedinjenje (b)-2, (R)-N-izopropil-6-(1-metoksietil)-2-(metilsulfonil)-pirido[3,4-d]pirimidin-8-amin.

U rastvor jedinjenja (b)-1 u smeši tetrahidrofurana (THF) i vode dodat je okson na 0°C, pa je smeša mešana 18 časova. Reakcioni proizvod estrahovan je etilacetatom. Organski sloj je ispran vodom i osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon što je rastvarač udaljen, sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do naslovnog jedinjenja (b)-2.

LC/MS: (M+H)<+>= 325,10

2

Sinteza jedinjenja (b)-3

Sintetisano je jedinjenje (b)-3, terc-butil 4-(6-hlorpiridazin-3-il)piperazin-1-karboksilat.

3,6-dihlorpiridazin (5,01 g, 33,6 mmol) i terc-butilpiperazin karboksilat (6,88 g, 37,0 mmol) rastvoreni su u DMF-u (50 ml). Dodat je trietilamin (11,7 ml, 50,4 mmol), pa je smeša mešana na 80<o>C preko noći. Rastvor je ohlađen do sobne temperature, pa je dodata voda. Proizvod je estrahovan smešom rastvarača (50,0 ml) dihlormetana i metanola (95:5) tri puta. Spojena organska faza osušena je preko anhidrovanog magnezijum sulfata, pa je čvrsta komponenta odvojena filtracijom. Filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je ispran dietiletrom dajući jedinjenje (b)-3 (7,0 g, 70%).

Sinteza jedinjenja (b)-4

Sintetisano je jedinjenje (b)-4, terc-butil 4-(6-((difenilmetilen)amino)piridazin-3-il)piperazin-1-karboksilat.

Jedinjenje (b)-3 (59,8 mg, 0,20 mmol), benzofenon imin (43,5 mg, 0,24 mmol), tris(dibenzilidenaceton)dipaladijum (9,2mg, 0,010mmol), BINAP (2,2’-bis(difenilfosfin)-1,1’-binaftil) (12,5 mg, 0,020 mmol), i cezijum karbonat (130,3 mg, 0,40 mmol) su suspendovani u toluenu (1,0 mL), pa je smeša mešana na 100°C preko noći. Nakon što je suspenzija ohlađena do sobne temperature, rastvor je proceđen kroz Celit, pa je celitni kolač

2

ispran etilacetatom. Dobijeni filtrat je ispran zasićenim vodenim rastvorom soli i osušen preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Nakon što je čvrsta komponenta odvojena filtracijom, dobijeni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom u koloni silika gela do naslovnog jedinjenja (b)-4 (67mg, 76%).

Sinteza jedinjenja (b)-5

Sintetisano je jedinjenje (b)-5, terc-butil 4-(6-aminopiridazin-3-il)piperazin-1-karboksilat.

Jedinjenje (b)-4 (67 mg, 0,151 mmol) je rastvoreno u THF-u (0,76 mL), pa je dodat vodeni rastvor limunske kiseline (0,378 ml, 0,755 mmol, 2 mol/L). Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcioni sistem je neutralisan zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (5 ml) pa je proizvod estrahovan etilacetatom (5 ml) dva puta. Organske faze su spojene a potom osušene preko anhidrovanog magnezijum sulfata. Nakon što je čvrsta komponenta odvojena filtracijom, dobijeni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je ispran terc-butil metiletrom (5 ml) dajući naslovno jedinjenje (b)-5 (0,30 g, 71%).

Sinteza jedinjenja koja su srodna primerima prema predmetnom pronalasku, tj. 6-aminopiridin-3-karbaldehida i terc-butil 4-[(6-aminopiridin-3-il)metil]piperazin-1-karboksilata će biti opisana u referentnim primerima koji slede.

2

Sinteza jedinjenja (b)-6

Sintetisano je jedinjenje (b)-6, terc-butil (R)-4-(6-((8-(izopropilamino)-6-(1-metoksietil)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)piridazin-3-il)piperazin-1-karboksilat.

Rastvor jedinjenja (a)-5 (708 mg, 2,2 mmol) i jedinjenja (b)-5 (732 mg, 2,6 mmol) sintetisanih u primeru 1 u toluenu (5,5 ml) mešan je tri dana na 100°C. Nakon hlađenja do sobne temperature, rastvor je razblažen etilacetatom (20 ml) i dihlormetanom (100 ml). Rastvor je ispran zasićenim rastvorom soli (90 ml) a potom zasićenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata (10 ml). Izolovana organska faza je uparena do suva, pa prečišćena preko kolone silika gela dajući naslovno jedinjenje (b)-6 (510 mg, 45%).

Sinteza jedinjenja (b)

Sintetisano je jedinjenje (b), 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido-[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazin-1-il(piperazin).

2

U rastvor jedinjenja (b)-6 (33,2 mg, 0,063 mmol) u dihlormetanu (0,44 ml) na sobnoj temperaturi dodata je fluorsirćetna kiselina (0,2 ml) pa je rastvor mešan jedan čas na sobnoj temperaturi. Rastvor je koncentrovan do suva, pa je proizvod prečišćen preparativnom HPLC kako bi se dobilo naslovno jedinjenje (23,8 mg, 88%).

<1>H-NMR (DMSO) δ: 10,24 (1H, s), 9,20 (1H, s), 8,16 (1H, d), 7,36 (1H, d), 6,86 (1H, s), 6,35 (1H, d), 6,42 (1H, m), 4,22 (2H, m), 3,43 (4H, m), 3,26 (4H, m), 2,81 (3H, m), 1,37 (3H, d), 1,26 (6H, m).

Dobijanje kristala A jedinjenja (b)

Sintetisana je so jedinjenja (b), prečišćenog preparativnom HPLC, sa trifluorsirćetnom kiselinom. TFA so je mućkana u smeši vode i dihlormetana. Podešena je pH vrednost vodene faze na blago alkalnu (pH 8 do 9) pomoću zasićenog vodenog rastvora natrijum hidrogen karbonata, pa je izolovana organska faza. Nakon što je organska faza isprana zasićenim vodenim rastvorom soli i osušena preko bezvodnog natrijum sulfata, rastvarač je udaljen da bi se dobio kristal A.

Karakterizacija kristala A jedinjenja (b)

Na slici 3 prikazan je spektar difrakcije X zraka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 5,2°, 7,6°, 8,4°, 10,5°, 15,2°, 16,9°, 20,1°, 21,0°, 23,3° i 26,6° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 225°C.

Slika 14 prikazuje IR apsorpcioni spektar (Kbr) navedenog kristala. Apsorpcioni maksimumi su uočeni na 1369 cm<-1>, 1424 cm<-1>, 1508 cm<-1>, 1545 cm<-1>i 1566 cm<-1>(talasni broj).

Slike 21-1 i 21-2 prikazuju<13>C NMR spektar sa čvrstog uzorka ovog kristala. Slika 21-1 prikazuje program rada na 6500 Hz a slika 21-2 program rada na 14000 Hz. Maksimumi su uočeni na vrednostima 63,4 ppm, 157,6 ppm, 155,5 ppm, 117,8 ppm, 82,2 ppm, 56,1 ppm i 42,3 ppm (hemijska pomeranja).

Slika 22 prikazuje<15>N-NMR spektar navedenog kristala sa čvrstog uzorka. Maksimumi su uočeni na vrednostima 311,7 ppm, 232,4 ppm, 168,5 ppm, 79,5 ppm, 53,3 ppm, 32,9 ppm i -4,3 ppm (hemijska pomeranja).

Primer 7

Primer 7 opisuje kristal B 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazin-1-il(piperazina) (jedinjenje (b)).

Dobijanje kristala B jedinjenja (b)

Tetrahidrofuran (0,15 ml) i metanol (0,15 ml) su dodati u TFA so koja je precipitirala tokom proizvodnje kristala A, pa je zatim dodat vodeni 4M rastvor litijum hidroksida (0,018 ml). Rastvor je neutralisan mravljom kiselinom, pa je proizvod prečišćen hromatografijom u koloni silika gela. Rastvor jedinjenja (b) je koncentrovan do precipitacije kristala. Tako je dobijen kristal B jedinjenja (b).

Karakterizacija kristala B jedinjenja (b)

Na slici 4 prikazan je spektar difrakcije X zraka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 5,2°, 6,6°, 8,1°, 15,2°, 15,9°, 16,2°, 18,8°, 20,5°, 20,8° i 21,7° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 221°C.

Primer 8

Dobijanje kristala C jedinjenja (b)

U kristal C (1,1 g) jedinjenja (b) dodat je etanol (11 ml) pa je smeša mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Dobijena čvrsta komponenta je izdvojena filtracijom i osušena na 40°C pod sniženim pritiskom kako bi se dobilo naslovno jedinjenje (945 mg, 86%).

Karakterizacija kristala C jedinjenja (b)

Na slici 9 prikazan je spektar difrakcije X zraka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 5,2°, 7,6°, 8,4°, 10,0°, 10,5°, 11,9°, 15,2°, 17,0°, 20,9° i 21,2° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 223°C.

Slika 15 prikazuje IR apsorpcioni spektar (Kbr) navedenog kristala. Apsorpcioni maksimumi su uočeni na 1369 cm<-1>, 1424 cm<-1>, 1507 cm<-1>, 1546 cm<-1>i 1566 cm<-1>(talasni broj).

1

Primer 9

Primer 9 opisuje kristal A (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina (jedinjenje (c)).

U tekstu koji sledi opisana je sinteza jedinjenja (c).

Sinteza jedinjenja (c)-1

Sintetisano je jedinjenje (c)-1, 6-aminopiridin-3-karbaldehid.

6-aminopiridin-3-karbonitril (1,9 g, 16 mmol) je rastvoren u THF-u (160 ml), pa je rastvor ohlađen uz mešanje na -78°C. U rastvor je polako dodat diizobutilaluminijum hidrid (106 ml, 1,5M rastvor u toluenu), u kapima, na -78°C, zatim je rastvor zagrejan uz mešanje do 20°C, pa mešan još dva časa. U rastvor je dodata voda s ledom (100 ml) da bi se zaustavila reakcija. Proizvod je estrahovan dihlormetanom (50 ml), tri puta. Nakon što su dobijene organske faze spojene, rastvor je ispran vodenim rastvorom soli (100 ml) i osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon što je čvrsta komponenta odvojena filtracijom, dobijeni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom silika gela do naslovnog jedinjenja (c)-1 (1,7 g). Sirovi proizvod je korišćen direktno u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

Sinteza jedinjenja (c)-2

Sintetisano je jedinjenje (c)-2, terc-butil 4-[(6-amino piridin-3-il)metil]piperazin-1-karboksilat.

2

6-aminopiridin-3-karbonitril (1,9 g, 16 mmol) je rastvoren u THF-u (160 ml), pa je smeša hlađena uz mešanje na -78°C. U rastvor je polako, u kapima, dodat diizobutilaluminijum hidrid (106,5 ml, 1,5 M rastvor u toluenu), na -78°C. Sistem je zagrevan uz mešanje do 20°C, pa onda mešan još dva časa. U rastvor je dodata voda s ledom (100 ml) da bi se zaustavila reakcija. Proizvod je estrahovan dihlormetanom (50 ml), tri puta. Nakon što su dobijene organske faze spojene, rastvor je jednom ispran vodenim rastvorom soli (100 ml) i osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon što je čvrsta komponenta odvojena filtracijom, dobijeni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom silika gela do sirovog naslovnog jedinjenja (1,7 g).

Dobijeni sirovi proizvod (1,7 g, 13,9 mmol) i terc-butil piperazin-1-karboksilat (3,2 g, 17,2 mmol) rastvoreni su u dihlormetanu (50 ml) pa je smeša mešana osam časova na sobnoj temperaturi. U rastvor je dodat natrijum triacetoksiborhidrid (8,84 g, 40,9 mmol) pa je smeša mešana na sobnoj temperaturi dva časa. Reakcija je praćena pomoću LC/MS. Nakon završetka reakcije, dodat je zasićeni vodeni rastvor natrijum karbonata (50 ml) da bi se reakcija zaustavila. Proizvod je estrahovan etilacetatom (50 ml), tri puta. Nakon što su dobijene organske faze spojene, rastvor je jednom ispran vodenim rastvorom soli (100 ml) i osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata. Nakon što je čvrsta komponenta odvojena filtracijom, dobijeni filtrat je koncentrovan pod sniženim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom silika gela do sirovog naslovnog jedinjenja (3,8 g, 81%).

Sinteza jedinjenja (c)-3

Sintetisano je jedinjenje (c)-3, terc-butil (R)-4-((6-((8-(izopropilamino)-6-(1-metoksietil)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)piridin-3-il)metil)piperazin-1-karboksilat.

Naslovno jedinjenje (c)-3 je sintetisano kao što je opisano za jedinjenje (b)-6 pomoću jedinjenja B-2 i C-2.

Sinteza jedinjenja (c)

Sinteza jedinjenja (c), (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina

Naslovno jedinjenje je dobijeno iz jedinjenja (c)-3 kao što je opisano za jedinjenje (a) u primeru 1.

<1>H-NMR (CDCl3) δ : 9,04 (1H, s), 8,34 (1H, d), 8,26 (1H, s), 7,74 (1H, dd), 6,84 (1H, s), 6,14 (1H, d), 4,41 (1H, m), 4,33 (1H, q), 3,49 (2H, s), 3,41 (3H, s), 2,91 (4H, m), 2,46 (4H, br), 1,50 (3H, d), 1,36 (6H, m).

Dobijanje kristala A jedinjenja (c)

Rastvor jedinjenja (c) prečišćen preparativnom HPLC koncentrovan je dok se nisu istaložili kristali. Tako je dobijen kristal A jedinjenja (c).

Karakterizacija kristala A jedinjenja (c)

Na slici 5 prikazan je spektar difrakcije X zraka za dobijeni kristal. Maksimumi su uočeni na 4,8°, 7,6°, 8,2°, 9,7°, 15,3°, 16,6°, 19,1°, 19,8°, 22,4° i 26,2° (difrakcioni ugao 2θ).

Kriva protoka toplote na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC) pokazala je endotermni maksimum na 182°C.

4

Slika 16 prikazuje IR apsorpcioni spektar (Kbr) navedenog kristala. Apsorpcioni maksimumi su uočeni na 1115 cm<-1>, 1446 cm<-1>, 1508 cm<-1>, 1560 cm<-1>i 1601 cm<-1>(talasni broj).

Slike 23-1 i 23-2 prikazuju<13>C NMR spektar sa čvrstog uzorka ovog kristala. Slika 23-1 prikazuje program rada na 6500 Hz a slika 23-2 program rada na 14000 Hz. Maksimumi su uočeni na vrednostima 161,3 ppm, 150,8 ppm, 138,9 ppm, 128,1 ppm, 109,8 ppm, 82,7 ppm, 47,6 ppm, 42,5 ppm, 41,5 ppm, 24,5 ppm i 21,7 ppm (hemijska pomeranja).

Slika 24 prikazuje<15>N-NMR spektar navedenog kristala sa čvrstog uzorka. Maksimumi su uočeni na vrednostima 242,8 ppm, 233,8 ppm, 219,0 ppm, 171,7 ppm, 86,9 ppm, 54,9 ppm, 11,3 ppm i -5,5 ppm (hemijska pomeranja).

Primer 10

Ocena inhibitorne aktivnosti prema humanoj CDK4/ciklin D3

Ispitana je inhibitorna aktivnost jedinjenja (a), (b) i (c) prema humanoj CDK4/ciklin D3.

Inhibitorna aktivnost prema humanoj CDK4/ciklin D3 za svako jedinjenje određivana je test kompletom (QS Assist CDK4/Cyclin D3 FP kit), proizvođača Carna Biosciences, Inc. Ovaj test može da odredi aktivnost kinaze koja podrazumeva određivanje promene u polarizaciji fluorescencije izazvane vezivanjem fluorescentnog supstrata koji fosforiluje kinaza za reagens za vezivanje IMAP, na osnovu IMAP tehnologije proizvođača Molecular Devices.

Test pufer (10x) sadržan u kompletu ili test pufer napravljen u laboratoriji, sa istim sastavom kao onaj u kompletu korišćeni su za pripremu rastvora uzoraka. Test pufer (10x) sadržan u kompletu je razblažen prečišćenom vodom deset puta, kako bi se pripremio test pufer. Test pufer sadrži 20 mM HEPES (pH 7,4), 0,01% Tween i 2 mM ditiotreitol. Ispitivano jedinjenje je rastvoreno u dimetil sulfoksidu (DMSO) do koncentracije koja je 100x finalna koncentracija, a zatim razblaženo test puferom na 25x, tako da je koncentracija rastvora ispitivanog jedinjenja bila četiri puta veća od finalne koncentracije. Rastvor ATP (5x)/supstrat/metal sadržan u kompletu razblažen je test puferom 5x pre upotrebe. CDK4/ciklin D3 sadržan u kompletu je razblažen test puferom u koncentraciju koja je dvostruko veća od finalne koncentracije, kako bi se dobio rastvor enzima (finalna koncentracija CDK4/ciklin D3 je 12,5 do 25 ng/polju). Pufer A za vezivanje IMAP (5x) i pufer B za vezivanje IMAP (5x) su, svaki za sebe, razblaženi prečišćenom vodom pet puta; puferi su pripremljeni tako da je odnos pufera A za vezivanje IMAP prema puferu B za vezivanje IMAP bio 85:15 pa je dodat reagens za vezivanje IMAP tako da bude 400x razblaženje za dobijanje reagensa za detekciju.

Rastvor ispitivanog jedinjenja (5 μl) i rastvor ATP/supstrat/metal (5 μl) dodati su u polja na ploči sa 384 polja. Nakon dodavanja rastvora enzima ili test pufera (10 μl), rastvor je promešan kako bi se pokrenula enzimska reakcija. Ukupna zapremina rastvora bila je 20 μl/polju, a reakcioni rastvor je sadržao 20 mM HEPES (pH 7,4), 0,01% Tween 20, 2 mM ditiotreitol, 100 nM FITC-obeleženog peptidnog supstrata (Carna Biosciences, Inc), 100 μM ATP, 1 mM magnezijum hlorid, 1% DMSO i 12,5 do 25 ng/polju CDK4/ciklina D3. Nakon što se reakcija odvijala 45 minuta na sobnoj temperaturi, u svako polje je dodat reagens za detekciju (60 μl), pa je reakcija nastavljena još 30 minuta na sobnoj temperaturi zaklonjena od svetlosti. Polarizacija fluorescencije je merena na talasnoj dužini ekscitacije od 485 nm i na talasnoj dužini detekcije od 535 nm na čitaču mikroploča.

Dodat je rastvor enzima, pa je određen procenat inhibicije enzimske aktivnosti za ispitivano jedinjenje, gde je enzimska aktivnost prilikom dodavanja DMSO umesto rastvora ispitivanog jedinjenja bila definisana kao 100%, a enzimska aktivnost kada je test pufer dodat umesto enzimskog rastvora a DMSO dodat umesto rastvora ispitivanog jedinjenja bila je definisana kao 0%. Procenat inhibicije je fitovan na krivu odgovora u funkciji doze kako bi se izračunala 50% inhibitorna koncentracija u odnosu na inhibiciju CDK4/ciklina D3.

Inhibitorna aktivnost IC50za svako jedinjenje, u odnosu na CDK4/ciklin D3 bila je manja od 10 nM.

Primer 11

Ocena inhibitorne aktivnosti prema humanoj CDK2/ciklin A2

Jedinjenja A, B i C su podvrgnuta ispitivanju inhibitorne aktivnosti prema humanoj CDK2/ciklin A2 pomoću test kompleta (QS S Assist CKD2/Cyclin A2_FP komplet) proizvođača Carna Biosciences, Inc. Ovaj test može da odredi aktivnost kinaze koja podrazumeva određivanje promene u polarizaciji fluorescencije izazvane vezivanjem fluorescentnog supstrata koji fosforiluje kinaza za reagens za vezivanje IMAP, na osnovu IMAP tehnologije proizvođača Molecular Devices.

Test pufer (10x) sadržan u kompletu je razblažen prečišćenom vodom deset puta, kako bi se pripremio test pufer, koji se koristi za pripremu svakog rastvora. Test pufer sadrži 20 mM HEPES (pH 7,4), 0,01% Tween i 2 mM ditiotreitol. Svako ispitivano jedinjenje je rastvoreno u dimetil sulfoksidu (DMSO) do koncentracije koja je 100x finalna koncentracija, a zatim razblaženo test puferom 25x, tako da je koncentracija rastvora ispitivanog jedinjenja bila četiri puta veća od finalne koncentracije, čime je dobijen rastvor ispitivanog jedinjenja. Rastvor ATP (5x)/supstrat/metal sadržan u kompletu razblažen je test puferom 5x pre upotrebe. CDK2/ciklin A2 sadržan u kompletu je razblažen test puferom u koncentraciju koja je dvostruko veća od finalne koncentracije, kako bi se dobio rastvor enzima (finalna koncentracija CDK2/ciklin A2 je 2,5 ng/polju). Pufer A za vezivanje IMAP (5x) je razblažen prečišćenom vodom pet puta pa je dodat reagens za vezivanje IMAP tako da bude 400x razblaženje za dobijanje reagensa za detekciju.

Rastvor ispitivanog jedinjenja (5 μl) i rastvor ATP/supstrat/metal (5 μl) dodati su u polja na ploči sa 384 polja. Nakon dodavanja rastvora enzima ili test pufera (10 μl), rastvor je promešan kako bi se pokrenula enzimska reakcija. Ukupna zapremina rastvora bila je 20 μl/polju, a reakcioni rastvor je sadržao 20 mM HEPES (pH 7,4), 0,01% Tween 20, 2 mM ditiotreitol, 100 nM FITC-obeleženog peptidnog supstrata (Carna Biosciences, Inc), 30 μM ATP, 5 mM magnezijum hlorid, 1% DMSO i 2,5 ng/polju CDK2/ciklina A2. Nakon što se reakcija odvijala 60 minuta na sobnoj temperaturi, u svako polje je dodat reagens za detekciju (60 μl), pa je reakcija nastavljena još 30 minuta na sobnoj temperaturi zaklonjena od svetlosti. Polarizacija fluorescencije je merena na talasnoj dužini ekscitacije od 485 nm i na talasnoj dužini detekcije od 535 nm na čitaču mikroploča.

Dodat je rastvor enzima, pa je određen procenat inhibicije enzimske aktivnosti za ispitivano jedinjenje, gde je enzimska aktivnost prilikom dodavanja DMSO umesto rastvora ispitivanog jedinjenja bila definisana kao 100%, a enzimska aktivnost kada je test pufer dodat umesto enzimskog rastvora a DMSO dodat umesto rastvora ispitivanog jedinjenja bila je definisana kao 0%. Procenat inhibicije je fitovan na krivu odgovora u funkciji doze kako bi se izračunala 50% inhibitorna koncentracija u odnosu na inhibiciju CDK2/ciklina A2.

Inhibitorna aktivnost IC50za svako jedinjenje, u odnosu na CDK4/ciklin D3 bila je manja od 100 nM.

Primer 12

Ocena inhibitorne aktivnosti prema humanoj CDK6/ciklin D3

Inhibitorna aktivnost prema CDK6/ciklinu D3 određivana je pomoću testa Off-chip Mobility Shift Assay (MSA). MSA test može da odredi kinaznu aktivnost koja se odnosi na razdvajanje proteina, putem razlike u mobilnosti tokom elektroforeze u zavisnosti od molekulske mase i naelektrisanja svakog proteina. Kinazna aktivnost je određena elektroforetskim razdvajanjem proteina sa različitim elektronegativnostima u zavisnosti od stepena fosforilacije kinazom.

Svaki rastvor je pripremljen sa test puferom koji sadrži 20 mM HEPES (pH 7,5), 0,01% Triton X-100 i 2 mM ditiotreitol. Svako ispitivano jedinjenje je rastvoreno u dimetil sulfoksidu (DMSO) do koncentracije koja je 100x finalna koncentracija, a zatim razblaženo test puferom 25x, tako da je koncentracija rastvora ispitivanog jedinjenja bila četiri puta veća od finalne koncentracije, čime je dobijen rastvor ispitivanog jedinjenja. Rastvor ATP/supstrat/metal je napravljen tako da je koncentracija rastvora bude četiri puta veća od finalne koncentracije. Enzimski rastvor je napravljen tako da je koncentracija rastvora bude dva puta veća od finalne koncentracije. Finalna koncentracija enzima pravilno je prilagođena na osnovu signala enzimske aktivnosti i inhibitorne aktivnosti jedinjenja koje služi kao pozitivna kontrola.

Rastvor ispitivanog jedinjenja (5 μl) i rastvor ATP/supstrat/metal (5 μl) dodati su u polja na ploči sa 384 polja. Nakon dodavanja rastvora enzima ili test pufera (10 μl), rastvor je promešan kako bi se pokrenula enzimska reakcija. Ukupna zapremina rastvora bila je 20 μl/polju, a reakcioni rastvor je sadržao 20 mM HEPES (pH 7,5), 0,01% Triton X-100, 2 mM ditiotreitol, 1000 nM obeleženog peptidnog supstrata (DYRKtide-F), 300 μM ATP, 5 mM magnezijum hlorid, 1% DMSO i CDK6/ciklin D3 željene koncentracije. Nakon što je reakcija trajala pet časova na sobnoj temperaturi, u svako polje dodat je pufer za zaustavljanje (QuickScout Screening Assist MSA, Carna Biosciences, Inc.) (60 μl) kako bi se prekinula reakcija. Supstratni peptid i fosforilovani peptid u rastvoru su razdvojeni i određivani pomoću LabChip 3000 (Caliper Lifesciences). Kinazna aktivnost je određivana kao udeo proizvoda (P/(P+S) gde je (S) maksimalna visina supstratnog peptida a (P) maksimalna visina fosforilovanog peptida.

Rastvor enzima je dodat, pa je određen procenat inhibicije enzimske aktivnosti za ispitivano jedinjenje, gde je enzimska aktivnost prilikom dodavanja DMSO umesto rastvora ispitivanog jedinjenja bila definisana kao 100%, a enzimska aktivnost kada je test pufer dodat umesto enzimskog rastvora a DMSO dodat umesto rastvora ispitivanog jedinjenja bila je definisana kao 0%. Procenat inhibicije je fitovan na krivu odgovora u funkciji doze kako bi se izračunala 50% inhibitorna koncentracija u odnosu na inhibiciju CDK6/ciklina D3.

Inhibitorna aktivnost IC50za svako jedinjenje, u odnosu na CDK6/ciklin D3 bila je manja od 10 nM.

Industrijska primenljivost

Kristal jedinjenja predstavljenog formulom (I) ili njegov gde je navedeno jedinjenje predstavljeno formulom (I) izabrano iz grupe koja se sastoji od:

1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona;

1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina; i

(R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina

može da se koristi kao aktivni sastojak za proizvodnju farmaceutskog preparata.

Claims (16)

1. Patentni zahtevi 1. Kristal jedinjenja predstavljenog formulom (I):

   naznačen time što R<1>predstavlja atom vodonika ili C1-3alkil grupu, R<2>predstavlja atom vodonika ili okso grupu, L predstavlja jednogubu vezu ili C1-3alkilen grupu a X predstavlja CH ili N; ili solvat takvog jedinjenja, gde je jedinjenje predstavljeno formulom (I) izabrano iz grupe koja se sastoji od: 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-ona; 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazina; i (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamina.
2. 2. Kristal prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je navedeno jedinjenje 1-(6-((6-((1R)-1-hidroksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridil)piperazin-2-on.
3. 3. Kristal prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 6,3°, 6,6°, 11,6°, 16,9° i 20,0° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje jednu ili veći broj od (i) do (iv): 4 (i) ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum na 277°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC). (ii) karakteristične apsorpcione maksimume sa talasnim brojevima 703 cm<-1>, 896 cm<-1>i 3418 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom KBr postupkom; (iii) karakteristične maksimume na 136,0 ppm, 111,2 ppm, 105,1 ppm, 101,8 ppm, 52,7 ppm, 49,6 ppm, 42,9 ppm, 23,8 ppm i 18,5 ppm na<13>C NMR spektru sa čvrstog uzorka; (iv) karakteristične maksimume na 248,6 ppm, 245,7 ppm, 229,2 ppm, 214,5 ppm, 174,3 ppm, 86,5 ppm, 54,7 ppm i -12,4 ppm na<15>N NMR spektru sa čvrstog uzorka.
4. 4. Kristal prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 5,3°, 7,3°, 10,3°, 15,1° i 17,4° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje jednu ili veći broj od (i) do (iv): (i) ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum na 277°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji (DSC). (ii) karakteristične apsorpcione maksimume sa talasnim brojevima 874 cm<-1>, 1330 cm<-1>i 3314 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom KBr postupkom; (iii) karakteristične maksimume na 154,7 ppm, 138,8 ppm, 133,6 ppm, 113,2 ppm, 101,6 ppm, 100,4 ppm, 67,4 ppm, 51,8 ppm, 26,6 ppm i 23,3 ppm na<13>C NMR spektru sa čvrstog uzorka; (iv) karakteristične maksimume na 243,6 ppm, 86,7 ppm, 56,7 ppm i -12,4 ppm na<15>N NMR spektru sa čvrstog uzorka.
5. 5. Kristal prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 5,3°, 6,0°, 6,7°, 10,4° i 20,8° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum od 271°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji.
6. 6. Kristal prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 6,0°, 10,0°, 13,7°, 20,3° i 23,0° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje jednu ili veći broj od (i) do (ii): (i) ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum na 100°C i 278°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji; (ii) karakteristične apsorpcione maksimume sa talasnim brojevima 840 cm<-1>, 904 cm<-1>, 955 cm<-1>, 1490 cm<-1>i 3281 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom KBr postupkom.
7. 7. Kristal prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 5,2°, 7,2°, 9,5°, 14,5°, 16,5°, 20,9°, 25,0° i 27,9° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje jednu ili veći broj od (i) do (ii): (i) ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum na 272°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji; (ii) karakteristične apsorpcione maksimume sa talasnim brojevima 1081 cm<-1>i 1260 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom KBr postupkom.
8. 8. Kristal prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što je navedeno jedinjenje 1-(6-((6-((1R)-1-metoksietil)-8-(izopropilamino)pirido[3,4-d]pirimidin-2-il)amino)-3-piridazil)piperazin.
9. 9. Kristal prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 5,2°, 7,6°, 8,4°, 10,5°, 15,2°, 16,9°, 20,1°, 21,0°, 23,3° i 26,6° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje jednu ili veći broj od (i) do (iv): (i) ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum na 225°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji; (ii) karakteristične apsorpcione maksimume sa talasnim brojevima 1369 cm<-1>, 1424 cm<-1>, 1508 cm<-1>, 1545 cm<-1>i 1566 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom KBr postupkom; (iii) karakteristične maksimume na 163,4 ppm, 157,6 ppm, 155,5 ppm, 117,8 ppm, 82,2 ppm, 56,1 ppm i 42,3 ppm na<13>C NMR spektru sa čvrstog uzorka; (iv) karakteristične maksimume na 311,7 ppm, 232,4 ppm, 168,5 ppm, 79,5 ppm, 53,3 ppm, 32,9 ppm i - 4,3 ppm na<15>N NMR spektru sa čvrstog uzorka.
10. 10. Kristal prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 5,2°, 6,6°, 8,1°, 15,2°, 15,9°, 16,2°, 18,8°, 20,5°, 20,8° i 21,7° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum od 221°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji.
11. 11. Kristal prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 5,2°, 7,6°, 8,4°, 10,0°, 10,5°, 11,9°, 15,2°, 17,0°, 20,9° i 21,2° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje jednu ili veći broj od (i) do (ii): (i) ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum na 223°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji; (ii) karakteristične apsorpcione maksimume sa talasnim brojevima 1369 cm<-1>, 1424 cm<-1>, 1507 cm<-1>, 1546 cm<-1>i 1566 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom KBr postupkom.
12. 12. Kristal prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što jedinjenje jeste (R)-N8-izopropil-6-(1-metoksietil)-N2-(5-(piperazin-1-ilmetil)piridin-2-il)pirido[3,4-d]pirimidin-2,8-diamin.
13. 13. Kristal prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što pokazuje maksimume na difrakcionim uglovima 2θ = 4,8°, 7,6°, 8,2°, 9,7°, 15,3°, 16,6°, 19,1°, 19,8°, 22,4° i 26,2° na spektru difrakcije X zraka sa sprašenog uzorka, a poželjno je da dalje pokazuje jednu ili veći broj od (i) do (iv): (i) ekstrapoliranu temperaturu prelaza za endotermni maksimum na 182°C na diferencijalnoj skenirajućoj kalorimetriji; (ii) karakteristične apsorpcione maksimume sa talasnim brojevima 1115 cm<-1>, 1446 cm<-1>, 1508 cm<-1>, 1560 cm<-1>i 1601 cm<-1>na infracrvenom apsorpcionom spektru dobijenom KBr postupkom; (iii) karakteristične maksimume na 161,3 ppm, 150,8 ppm, 138,9 ppm, 128,1 ppm, 109,8 ppm, 82,7 ppm, 47,6 ppm, 42,5 ppm, 41,5 ppm, 24,5 ppm i 21,7 ppm na<13>C NMR spektru sa čvrstog uzorka; (iv) karakteristične maksimume na 242,8 ppm, 233,8 ppm, 219,0 ppm, 171,7 ppm, 86,9 ppm, 54,9 ppm, 11,3 ppm i -5,5 ppm na<15>N NMR spektru sa čvrstog uzorka.
14. 14. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži kristal iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 13 i farmaceutski prihvatljiv nosilac.
15. 15. Farmaceutski preparat za upotrebu kao inhibitor CDK4/6, naznačen time što sadrži kristal iz bilo kog od patentnih zahteva 1 do 13 kao aktivni sastojak.
16. 16. Kristal prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13 za upotrebu u prevenciji ili lečenju reumatoidnog artritisa, arterioskleroze, plućne fibroze, moždanog udara i/ili kancera.