[go: up one dir, main page]

RS63964B1 - Rnk koja sadrži modifikovane nukleozide i postupci za njenu upotrebu - Google Patents

Rnk koja sadrži modifikovane nukleozide i postupci za njenu upotrebu

Info

Publication number
RS63964B1
RS63964B1 RS20230060A RSP20230060A RS63964B1 RS 63964 B1 RS63964 B1 RS 63964B1 RS 20230060 A RS20230060 A RS 20230060A RS P20230060 A RSP20230060 A RS P20230060A RS 63964 B1 RS63964 B1 RS 63964B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
rna
another embodiment
cell
mrna
dose
Prior art date
Application number
RS20230060A
Other languages
English (en)
Inventor
Katalin Kariko
Drew Weissman
Original Assignee
Univ Pennsylvania
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Pennsylvania filed Critical Univ Pennsylvania
Publication of RS63964B1 publication Critical patent/RS63964B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1816—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/50—Hydrolases (3) acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5), e.g. asparaginase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4712—Cystic fibrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
    • C12Y305/04004—Adenosine deaminase (3.5.4.4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/95—Protection of vectors from inactivation by agents such as antibodies or enzymes, e.g. using polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis pronalaska
Polje pronalaska
Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu Ψ ili m<1>Ψ (1-metilpseudouridina) u in vitro sintetisanom iRNK, oligoribonukleotidnom ili poliribonukleotidnom molekulu u cilju smanjenja imunogeničnosti navedenog in vitro sintetisanog iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula, gde takvo smanjenje imunogeničnosti navedenog in vitro sintetisanog iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ može da se detektuje najmanje sledećim postupkom, gde navedeni postupak podrazumeva korake: a) dovođenja u dodir mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ i, odvojeno, dovođenje u dodir mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži Ψ ili m<1>Ψ; i b) merenje količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 izlučene kao odgovor na kontakt mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ , i, odvojeno, merenje količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 izlučene kao odgovor na kontakt mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži Ψ ili m<1>Ψ, gde je količina IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 koja se izluči iz humane ili mišje dendritske ćelije u odgovor na navedeni kontakt sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ manja od odgovarajuće količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP- 1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 koja se izluči iz mišje ili humane dendritske ćelije u odgovor na takav kontakt sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži navedeni Ψ ili m<1>Ψ.
Pozadina pronalaska
Sva RNK koja se javlja u prirodi sintetiše se iz četiri osnovna ribonukleotida, ATP, CTP, UTP i GTP, ali neki od ugrađenih nukleozida se nakon transkripcije modifikuju u skoro svim vrstama RNK. U RNK je identifikovano skoro stotinu različitih modifikacija nukleozida (Rozenski, J, Crain, P, and McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197). Broj i priroda modifikacija variraju i zavise od vrste RNK, kao i od evolucionog nivoa organizma iz kog je RNK dobijena. Ribozomna RNK, koja je glavni sastojak ćelijske RNK, sadrži značajno više nukleozidnih modifikacija u sisarskim ćelijama nego u bakterijama. Humana rRNK, na primer, ima 10 puta više pseudouridina (Ψ) i 25 puta više 2'-O-metilovanih nukleozida od bakterijske rRNK, dok rRNK iz mitohondrija ima veoma malo modifikacija. Transportna RNK (tRNK) je podgrupa RNK sa najviše modifikacija. U sisarskoj tRNK, do 25% nukleozida je modifikovano, dok prokariotska tRNK sadrži značajno manje modifikacija. Bakterijska informaciona RNK (iRNK) ne sadrži modifikacije nukleozida, dok sisarska iRNK sadrži modifikovane nukleozide kao što su 5-metilcitidin (m<5>C), N<6>-metiladenozin (m<6>A), inozin i 2'-O-metilovani nukleozidi, uz N<7>-metilguanozin (m<7>G), koji je deo 5-terminalnog kraja. Uloga nukleozidnih modifikacija u pogledu imunostimulatornog potencijala, i u smislu efikasnosti translacije RNK, međutim, nije poznata.
US 2003/171253 A1 opisuje preparate i postupke za lečenje pacijenta od bolesti koja se odlikuje aberantnom programiranom ćelijskom smrću i/ili zapaljenjem, koji podrazumevaju uspostavljanje posredovanja u A20 funkciji kod pacijenta.
WO 99/33982 A2 opisuje humane polinukleotide i njihove varijante, polipeptide koje oni kodiraju i njihove varijante, gene koji odgovaraju ovim polinukleotidima i proteine koji se eksprimiraju iz tih gena.
WO 01/02608 A1 opisuje oligonukleotide koji obuhvataju i 2-aminoadenin i 5-supstituisane pirimidine.
Chui H.M.-P. et al., "Synthesis of helix 69 of Escherichia coli 23S rRNA containing its natural modified nucleosides, m3Ψ and Ψ ", Journal of Organic Chemistry, tom 67, br.25, str.
8847 - 8854, opisuje oligoribonukleotide koji sadrže modifikovane nukleozide.
Kratak opis pronalaska
Predmet pronalaska odgovara iznetom u priloženim patentnim zahtevima.
Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu Ψ ili m<1>Ψ (1-metilpseudouridina) u in vitro sintetisanom iRNK, oligoribonukleotidnom ili poliribonukleotidnom molekulu u cilju smanjenja imunogeničnosti navedenog in vitro sintetisanog iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula, gde takvo smanjenje imunogeničnosti navedenog in vitro sintetisanog iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ može da se detektuje najmanje sledećim postupkom, gde navedeni postupak podrazumeva korake: a) dovođenja u dodir mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ i, odvojeno, dovođenje u dodir mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži Ψ ili m<1>Ψ; i b) merenje količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 izlučene kao odgovor na kontakt mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ , i, odvojeno, merenje količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 izlučene kao odgovor na kontakt mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži Ψ ili m<1>Ψ, gde je količina IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 koja se izluči iz humane ili mišje dendritske ćelije u odgovor na navedeni kontakt sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ manja od odgovarajuće količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP- 1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 koja se izluči iz mišje ili humane dendritske ćelije u odgovor na takav kontakt sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži navedeni Ψ ili m<1>Ψ.
Predmetna prijava opisuje iRNK koja sadrži pseudouridinski ostatak.
Predmetna prijava opisuje molekul RNK koji kodira protein od interesa, gde navedeni molekul RNK sadrži pseudouridinski ostatak.
Predmetna prijava opisuje in vitro transkribovani molekul RNK koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid.
Predmetna prijava opisuje in vitro sintetisani oligoribonukleotid, koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, gde je modifikovani nukleozid m<5>C, m<5>U, m<6>A, s<2>U, Ψ ili 2'-O-metil-U.
Predmetna prijava opisuje vektor genske terapije koji sadrži in vitro sintetisani molekul poliribonukleotida, gde navedeni molekul poliribonukleotida sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid.
Predmetna prijava opisuje dvolančani molekul RNK (dsRNK) koji sadrži, kao deo svoje sekvence, pseudouridin ili modifikovani nukleozid, i dalje sadrži siRNK ili shRNK. U drugoj objavi, molekul dsRNK je duži od 50 nukleotida. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
Predmetna prijava opisuje postupak kojim se sisarska ćelija indukuje da proizvodi rekombinantni protein, koji podrazumeva dovođenje u dodir sisarske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom RNK koji kodira rekombinantni protein, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, čime se sisarska ćelija navodi da proizvodi rekombinantni protein.
Predmetna prijava opisuje postupak za lečenje anemije kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira eritropojetin, čime se leči anemija kod pacijenta.
Predmetna prijava opisuje postupak za lečenje vazospazma kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira inducibilnu azot oksid sintazu (iNOS), čime se leči vazospazam kod pacijenta.
Predmetna prijava opisuje postupak kojim se unapređuje stopa preživljavanja ćelije kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira protein termičkog šoka, čime se unapređuje stopa preživljavanja ćelije kod pacijenta.
Predmetna prijava opisuje postupak kojim se smanjuje incidencija ponovne stenoze krvnog suda nakon procedure povećavanja tog krvnog suda, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije krvnog suda sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani RNK molekul kodira protein termičkog šoka, čime se smanjuje incidencija ponovne stenoze kod pacijenta.
Predmetna prijava opisuje postupak kojim se povećava rast kose iz folikula dlake na koži glave pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije kože glave pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani RNK molekul kodira telomerazu ili imunosupresivni protein, čime se povećava rast kose iz folikula dlake.
Predmetna prijava opisuje postupak za indukciju ekspresije enzima sa antioksidantnom aktivnošću u ćeliji, koji podrazumeva dovođenje u dodir te ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani RNK molekul kodira taj enzim, čime se indukuje ekspresija enzima sa antioksidantnom aktivnošću u ćeliji.
Predmetna prijava opisuje postupak za lečenje cistične fibroze kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije tog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani RNK molekul kodira transmembranski regulator provodljivosti cistične fibroze (CFTR, eng. Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), čime se leči cistična fibroza kod pacijenta.
Predmetna prijava opisuje postupak za lečenje agamaglobulinemije povezane sa X hromozomom kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira Brutonovu tirozin kinazu, čime se leči X-vezana agamaglobulinemija.
Predmetna prijava opisuje postupak za lečenje ozbiljne kombinovane imunodeficijencije uzrokovane adenozin deaminazom (ADA SCID) kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira ADA, čime se leči ADA SCID.
Predmetna prijava opisuje postupak za proizvodnju rekombinantnog proteina, koji podrazumeva dovođenje u dodir in vitro translacionog aparata sa in vitro sintetisanim poliribonukleotidom, gde navedeni in vitro sintetisani poliribonukleotid sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, čime se dobija rekombinantni protein.
Predmetna prijava opisuje postupak za sintezu in vitro transkribovanog RNK molekula koji sadrži modifikovani nukleotid sa pseudouridinskim modifikovanim nukleozidom, koji podrazumeva dovođenje u dodir izolovane polimeraze sa smešom nemodifikovanih nukleotida i modifikovanog nukleotida.
Predmetna prijava opisuje in vitro aparat za transkripciju koji sadrži: nemodifikovani nukleotid, nukleotid koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, i polimerazu. U predmetnoj prijavi je opisan in vitro komplet za transkripciju koji sadrži: nemodifikovani nukleotid, nukleotid koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, i polimerazu.
Kratak opis slika
Slika 1. Produkcija TNF-α u MDDC ćelijama koje su transficirane prirodnom RNK, čime se dokazuje da su nemodifikovana in vitro sintetisana RNK i bakterijska i mitohondrijska RNK visoko imunogenične, dok su druge sisarske RNK slabo imunogenične. Humane MDCC ćelije su inkubirane samo sa lipofektinom®, ili u kompleksu sa R-848 (1 μg/ml), ili RNK (5 μg/l) iz 293 ćelija (ukupne, jedarne i citoplazmatske RNK), mišjih srčanih ćelija (poliA iRNK), mitohondrijalnom RNK humanih trombocita, goveđom tRNK, bakterijskom tRNK i ukupnom RNK (E. coli), sa ili bez digestije RNKazom. Nakon 8 časova, meren je TNF-α u supernatantima pomoću ELISE. Prikazane su srednje vrednosti ± SEM. Rezultati predstavljaju 3 nezavisna merenja.
Slika 2. TLR-zavisna aktivacija RNK pokazuje da m<6>A i s<2>U modifikacije blokiraju TLR3 signalizaciju, dok sve modifikacije blokiraju TLR7 i TLR8 signalizaciju, kao i da manje modifikovana bakterijska RNK i nemodifikovana in vitro transkribovana RNK aktivira sva tri TLR. (A) Alikvoti (1 µg) in vitro transkribovane RNK-1571 bez („nema“) ili sa modifikacijama nukleozida m<5>C, m<6>A, Ψ, m<5>U ili s<2>U analizirani su na denaturišućem agaroznom gelu, te obojeni etidijum bromidom i osvetljeni UV svetlom. (B) 293 ćelije koje eksprimiraju humane TLR3, TLR7, TLR8 i kontrolne vektore tretirane su samo lipofektinom®, kompleksom lipofektin®-R-848 (1 µg/ml) ili RNK (55 µg/ml). Obeleženi su modifikovani nukleozidi prisutni u RNK-730 i RNK-1571. Kao kontrolne ćelije korišćene su 293-ELAM-luc ćelije. (C) CpG ODN-2006 (5 μg/ml), LPS (1,0 µg/ml) i izolati RNK dobijeni su iz jetre pacova, mišije ćelijske linije (TUBO) i humane slezine (ukupne), humanih trombocita (mitohondrijska RNK) ili iz dva različita in vitro izvora. Kao kontrola su korišćene 293-hTLR9 ćelije. Nakon 8 časova, meren je IL-8 u supernatantima pomoću ELISE. Prikazane su srednje vrednosti ± SEM. Ćelijske linije koje sadrže siRNK usmerene ka hTLR3 označene su zvezdicom. Rezultati predstavljaju 3 nezavisna merenja.
Slika 3. Proizvodnja citokina u DC ćelijama transficiranim RNK pokazuje da sve modifikacije blokiraju aktivaciju DC generisanih citokinima, dok samo modifikacije uridina blokiraju aktivaciju DC dobijenih iz krvi. MDDC generisane pomoću GM-CSF/IL- 4 (A, C) ili GM-CSF/IFN-α MDDC (B), i primarne DC1 i DC2 (D) tretirane su tokom 8 do 16 h samo sa lipofektinom®, sa kompleksom lipofektin®-R-848 (1 µg/ml) ili RNK (5 µg/ml). Obeleženi su modifikovani nukleozidi prisutni u RNK-1571. TNF-α, IL-12(p70) i IFN-α su mereni u supernatantu pomoću ELISA testa. Prikazane su srednje vrednosti ± SEM. Rezultati predstavljaju 10 (A i C), 4 (B) i 6 (D) nezavisnih eksperimenata. E. Aktivacija DC pomoću RNK MDDC su tretirane 20 h samo lipofektinom® ili u kompleksu sa 1 µg/ml poli(I):(C) ili R-848 kao pozitivne kontrole (gornje polje) ili lipofektinom® u kompleksu sa naznačenom RNK (5 µg/ml; donje polje). Obeleženi su modifikovani nukleozidi prisutni u RNK-1886. TNF-α je meren u supernatantima pomoću ELISA testa. Ekspresija CD83, CD80 i HLADR određena je protočnom citometrijom.
Slika 4. Aktivacija DC pomoću RNK pokazuje da sve modifikacije inhibiraju aktivaciju DC. MDDC su tretirane tokom 20 h samo lipofektinom®, kompleksom lipofektin®-R-848 (1 µg/ml) ili RNK-1571, koja je modifikovana kao što je naznačeno (5 µg/ml). (A) Bojenje CD83 i HLA-DR. (B) Koncentracije TNF-α u supernatantima i srednja vrednost za fluorescenciju CD80 i CD86, kao odgovor na inkubaciju sa RNK. Zapremina medijuma je povećana 30 puta za protočnu citometriju, što je naznačeno zvezdicom. Rezultati predstavljaju 4 nezavisna eksperimenta.
Slika 5. RNK-1571 sa terminalnim nastavkom („kapicom“) koje sadrže različite količine (0, 1, 10, 50, 90, 99 i 100% modifikovanog nukleozida, u odnosu na odgovarajući nemodifikovani NTP) su transkribovane, te je otkriveno da modifikacija i samo nekoliko nukleozida dovodi do inhibicije aktivacije DC. A. Svi transkripti su digestovani do monofosfata i analizirani pomoću reverzno-fazne HPLC kako bi se odredila relativna količina ugrađenog modifikovanog nukleozida. Prikazani su reprezentativni profili za apsorbanciju koji su dobijeni pri naznačenim odnosima (Ψ:U). Vreme elucije je dato za 3'-monofosfate pseudouridina (Ψ), citidina (C), guanozina (G), uridina (U), 7-metilguanozina (m<7>G) i adenozina (A). (B) Sadržaj modifikovanog nukleozida u RNK-1571. Očekivani procenat m<6>A ili m<5>C u RNK-1571 izračunat je na osnovu relativne količine modifikovanog NTP u reakciji transkripcije i sastava nukleozida RNK-1571 (A: 505, U: 451, C: 273, G: 342). Vrednosti za izmereni sadržaj modifikovanih nukleozida određene su na osnovu kvantitativnog izračunavanja iz HPLC hromatograma. Primedbe: A: vrednosti (%) za m<6>ATP, ΨTP i m<5>CTP u odnosu na ATP, UTP i CTP, redom. B: vrednosti za m<6>A, Ψ i m<5>C monofosfate u odnosu na sve NMP. (C) MDDC su transficirane RNK-1571 sa kapicom lipofektin® kompleksa (5 μg/ml) koja sadrži naznačenu količinu m<6>A, Ψ ili m<5>C. Nakon 8 časova, meren je TNF-α u supernatantima. Podaci su prikazani kao relativna inhibicija TNF-α. Prikazane su srednje vrednosti ± SEM za 3 nezavisna eksperimenta.
Slika 6. Ekspresija TNF-α u DC transficiranim oligoribonukleotidima pokazuje da čak i samo jedan modifikovani nukleozid smanjuje aktivaciju DC. (A) Prikazane su sekvence oligoribonukleotida (ORN) koji su hemijski sintetisani (ORN1-4) ili transkribovani in vitro (ORN5-6). Istaknute su pozicije modifikovanih nukleozida Um (2'-O-metiluridina), m<5>C i Ψ.
Humane MDDC su transficirane samo lipofektinom® (podloga), R-848 (1 µg/ml) ili lipofektinom® u kompleksu sa RNK (5 µg/ml). Tamo gde je to naznačeno, ćelije su tretirane sa 2,5 μg/ml cikloheksimida (CHX). (B). Nakon 8 časova, meren je TNF-α u supernatantu. (C) RNK iz ćelija je analizirana pomoću Nortern blot analize. Prikazane su srednje vrednosti ± SEM koje predstavljaju 3 nezavisna eksperimenta.
Slika 7. A. ΨiRNK ne stimuliše proizvodnju proinflamatornih citokina in vivo. Uzorci seruma (6h nakon injekcije) analizirani su pomoću ELISA testa, te je otkriveno da je 3 μg nemodifikovane iRNK indukovalo višu koncentraciju IFN-α nego 3 μg Ψ-modifikovane iRNK (P < 0,001). Koncentracije IFN-α indukovane primenom 3 μg Ψ-modifikovane iRNK bile su slične onima koje se uoče kada se životinjama ubrizga nekompleksiran lipofektin. Vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SEM (standardna greška srednje vrednosti, prim. prev.) (n = 3 ili 5 životinja po grupi). B. Slični rezultati uočeni su sa TNF-α.
Slika 8. iRNK koja sadrži pseudouridin (Ψ) ne aktivira PKR. Ψ: pseudouridin. Kontrola: nemodifikovana RNK. m<5>C: iRNK sa m<5>C modifikacijom.
Slika 9. Povećana ekspresija luciferaze iz iRNK koja sadrži pseudouridin u lizatu zečijih retikulocita. LucY: iRNK sa pseudouridinskom modifikacijom; luc-C: nemodifikovana RNK. Podaci su prikazani normalizacijom luciferazne aktivnosti na luciferazu nemodifikovane RNK.
Slika 10. Povećana ekspresija renile iz iRNK koja sadrži pseudouridin u ćelijama gajenim u kulturi. A.293 ćelije. B. Mišje primarne, mišje dendritske ćelije dobijene iz kostne srži. Renilla-Y: iRNK sa pseudouridinskom modifikacijom; renillaC: nemodifikovana RNK. RNK je modifikovana sa m<5>C, m<6>A i m<5>U, kao što je naznačeno.
Slika 11. A. Aditivni efekat 3' i 5' elemenata na efikasnost translacije ΨiRNK.293 ćelije su transficirane sa konvencionalnom i ΨiRNK za luciferazu svitaca, sa 5' kapicom (capLuc), 3' poli-A repom dužine 50 nt (TEVlucA50), oba ili nijednim od ova dva elementa (capTEVlucA50 i Luc, redom). Ćelije su lizirane 4 časa kasnije, pa je merena aktivnost luciferaze u alikvotima (1/20 ukupnih lizata). B. ΨiRNK je stabilnija nego nemodifikovana iRNK. 293 ćelije transficirane sa capTEVLucAn koja sadrži nemodifikovane ili Ψ-modifikovane nukleozide lizirane su u naznačeno vreme nakon transfekcije. Alikvoti (1/20) lizata su testirani na aktivnost luciferaze. Standardne greške su premale da bi bile prikazane linijama greški. C. Ekspresija β-galaktozidaze je pojačana ukoliko se koristi ΨiRNK, u poređenju sa konvencionalnom iRNK.293 ćelije zasejane u ploče sa po 96 polja transficirane su sa iRNK kompleksiranim lipofektinom (0,25 μg/polju), koje kodiraju bakterijsku βgalaktozidazu (lacZ). Transkripti su imali kapice i 3' poli A repove koji su bili dugački ili 30 nt (caplacZ) ili oko 200 nt (caplacZ-An). Ispitani su konstrukti sa konvencionalnim U ili sa Ψ nukleozidima. Ćelije su fiksirane i obojene sa X-gal, 24 časa nakon transfekcije. Slike su snimljene invertnom mikroskopijom (uvećanje 40 i 100x), slikana su reprezentativna polja.
Slika 12. A. Ekspresija renile nakon intracerebralne injekcije modifikovane ili nemodifikovane iRNK koja je kodira. U korteks mozga pacova ubrizgane su injekcije na 8 mesta/životinji. U jednu hemisferu je ubrizgavana RNK koja kodira renilu, sa kapicom i pseudouridinskom modifikacijom (capRenilla-Y), dok je u suprotnu hemisferu ubrizgana RNK sa kapicom bez modifikovanih nukleozida (capRenilla-C). Prikazani su podaci za 2 životinje (6 mesta ubrizgavanja). BG; donja granica detekcije testa. B. Intravenska ΨiRNK se eksprimira u slezini. ΨiRNK kompleksirana sa lipofektinom (0,3 μg capTEVlucAn/mišu) data je injekcijom u repnu venu. Životinje su žrtvovane 2 i 4 časa nakon injekcije, pa je merena aktivnost luciferaze u alikvotima (1/10) organa homogenizovanih u puferu za lizu. Vrednosti predstavljaju aktivnosti luciferaze u celim organima. Ekspresija renile nakon i.v. injekcije iRNK u repnu venu miša. Podaci iz dva nezavisno izvedena eksperimenta dati su u levom i desnom polju. Jetre su izdvojene i homogenizovane, pa je merena aktivnost renile u alikvotima. C. ΨiRNK pokazuje veću stabilnost i translaciju in vivo. Miševima je data capTEVlucAn kompleksirana lipofektinom (0,3 μg/60μl/životinji) sa ili bez Ψ modifikacija. Životinje su žrtvovane 1, 4 i 24 časa nakon injekcije, pa su 1/2 njihovih slezina pripremljene za enzimska merenja luciferaze (levo polje) a druge polovine za RNK analize (desno polje). Aktivnosti luciferaze su merene u alikvotima (1/5) homogenata dobijenih od polovina slezina. Vrednosti na grafiku predstavljaju aktivnosti luciferaze u celoj jetri i prikazane su kao srednja vrednost ± SEM (n = 3 ili 4/tački). D. Ekspresija luciferaze iz svica nakon intratrahealne injekcije iRNK. capTEVluc-Y: RNK koja kodira luciferazu iz svica sa pseudouridinskom modifikacijom i sa kapicom. CapTEVluc-C: RNK bez modifikovanih nukleozida, sa kapicom.
Slika 13. Proizvodnja proteina zavisi od količine RNK koja se intravenski dopremi kod miševa. Naznačene količine nukleinskih kiselina kompleksiranih lipofektinom, capTEVlucAn iRNK sa ili bez Ψ elemenata i pCMVluc plazmidnih DNK u zapremini od 60 μl po životinji dati su miševima putem i.v. injekcije. Životinje kojima je ubrizgana iRNK ili plazmidna DNK su žrtvovane 6 i 24 časa nakon injekcije, pa je merena aktivnost luciferaze u alikvotima (1/10) slezina homogenizovanih u puferu za lizu. Prikazana je vrednost za svaku životinju, kratke horizontalne linije pokazuju srednju vrednost; N.D. nije moguće detektovati.
Slika 14. Ekspresija luciferaze iz svica nakon intratrahealnog dopremanja iRNK koja je kodira. iRNK je kompleksirana sa lipofektinom (ili PEI, kao što je naznačeno), pa je životinjama ubrizgano 0,3 μg iRNK koja kodira luciferazu svica sa ili bez Ψ modifikacije, te
1
su životinje žrtvovane 3 časa kasnije. Pluća su izdvojena i homogenizovana, pa je merena aktivnost luciferaze u liziranim organima.
Slika 15. ΨiRNK ne dovodi do indukcije medijatora zapaljenja nakon plućnog dopremanja. Indukcija TNF-α i IFN-α u serumu nakon intratrahealnog dopremanja iRNK ili ΨiRNK koja kodira luciferazu. Koncentracije TNF-α i IFN-α u serumu određene su ELISA testom 24 časa nakon dopremanja iRNK.
Detaljan opis pronalaska
Predmet pronalaska odgovara iznetom u priloženim patentnim zahtevima.
Predmetni pronalazak obezbeđuje upotrebu Ψ ili m<1>Ψ (1-metilpseudouridina) u in vitro sintetisanom iRNK, oligoribonukleotidnom ili poliribonukleotidnom molekulu u cilju smanjenja imunogeničnosti navedenog in vitro sintetisanog iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula, gde takvo smanjenje imunogeničnosti navedenog in vitro sintetisanog iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ može da se detektuje najmanje sledećim postupkom, gde navedeni postupak podrazumeva korake: a) dovođenja u dodir mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ i, odvojeno, dovođenje u dodir mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži Ψ ili m<1>Ψ; i i b) merenje količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 izlučene kao odgovor na kontakt mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ , i, odvojeno, merenje količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 izlučene kao odgovor na kontakt mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži Ψ ili m<1>Ψ, gde je količina IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 koja se izluči iz humane ili mišje dendritske ćelije u odgovor na navedeni kontakt sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ manja od odgovarajuće količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP- 1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 koja se izluči iz mišje ili humane dendritske ćelije u odgovor na takav kontakt sa in vitro sintetisanim molekulom iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida koji ne sadrži navedeni Ψ ili m<1>Ψ.
Prijava opisuje informacionu RNK koja sadrži pseudouridinski ostatak prema predmetnoj prijavi. U još jednom rešenju, informaciona RNK kodira protein od interesa.
Predmetna prijava opisuje molekul RNK koji kodira protein od interesa, gde navedeni molekul RNK sadrži pseudouridinski ostatak.
Predmetna prijava opisuje in vitro transkribovani molekul RNK koji sadrži pseudouridin.
Predmetna prijava opisuje in vitro transkribovani molekul RNK koji sadrži modifikovani nukleozid.
Predmetna prijava opisuje postupke za sintezu in vitro transkribovanih molekula RNK koji sadrže pseudouridin i(ili) modifikovane nukleozide.
Predmetna prijava opisuje molekul informacione RNK koji sadrži pseudouridinski ostatak.
U jednom rešenju, in vitro transkribovani molekul prema postupcima i preparatima u skladu sa predmetnom prijavom sintetiše se pomoću T7 fagne RNK polimeraze. U još jednom rešenju, takav molekul se sintetiše pomoću SP6 fagne RNK polimeraze. U još jednom rešenju, takav molekul se sintetiše pomoću T3 fagne RNK polimeraze. U još jednom rešenju, takav molekul se sintetiše pomoću polimeraze izabrane iz grupe koja se sastoji od prethodno navedenih polimeraza.
U još jednom rešenju, in vitro transkribovani molekul iRNK za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste oligoribonukleotid. U još jednom rešenju, in vitro transkribovani molekul iRNK za inventivnu upotrebu jeste poliribonukleotid. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
Predmetna prijava opisuje in vitro sintetisani oligoribonukleotid, koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, gde je modifikovani nukleozid m<5>C, m<5>U, m<6>A, s<2>U, Ψ ili 2'-O-metil-U.
Predmetna prijava opisuje in vitro sintetisani poliribonukleotid, koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, gde je modifikovani nukleozid m<5>C, m<5>U, m<6>A, s<2>U, Ψ ili 2'-O-metil-U.
U još jednoj objavi, in vitro sintetisani oligoribonukleotid ili poliribonukleotid jeste RNK oblika „kratke ukosnice“ (eng. short hairpin, kratka ukosnica, prim. prev.) (sh)RNK. U još jednoj objavi, in vitro sintetisani oligoribonukleotid jeste mala interferirajuća RNK (eng. small interfering RNA) (siRNK). U još jednom rešenju, in vitro sintetisani oligoribonukleotid jeste bilo koja druga vrsta oligoribonukleotida koja je u struci poznata. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
Navedeni molekuli iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku dalje podrazumevaju otvorene okvire čitanja koji kodiraju funkcionalan protein. U još jednom rešenju, RNK molekul, ili oligoribonukleotidni molekul funkcioniše bez kodiranja funkcionalnog proteina (npr. u transkripcionom utišavanju), kao RNzim, itd. Svaka od tih mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku dalje sadrži poli-A rep. U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu ne sadrži poli-A rep. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul dalje sadrži m<7>GpppG „kapicu“. U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu ne sadrži m<7>GpppG „kapicu“. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu dalje sadrži translacioni pojačivač nezavisan od kapice. U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu ne sadrži translacioni pojačivač nezavisan od kapice. U još jednom rešenju, translacioni pojačivač nezavisan od kapice jeste translacioni pojačivač nezavisan od kapice iz virusa nazubljenosti duvana (TEV, eng. tobacco etch virus). U još jednom rešenju, translacioni pojačivač nezavisan od kapice jeste bilo koji drugi translacioni pojačivač nezavisan od kapice koji je poznat u struci. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje vektor genske terapije koji sadrži in vitro sintetisani molekul poliribonukleotida, gde navedeni molekul poliribonukleotida sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid.
Navedeni molekuli iRNK, oligoribonukleotida ili poliribonukleotida za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku sadrže pseudouridin ili 1-metilpseudouridin. U još jednom rešenju, molekul iRNK ili oligoribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu sadrži modifikovani nukleozid. U još jednom rešenju, molekul iRNK ili oligoribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu jeste in vitro sintetisani RNK molekul ili oligoribonukleotid. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, izraz „pseudouridin“ se odnosi na m<1>acp<3>Ψ (1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil) pseudouridin. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na m<1>Ψ (1-metilpseudouridin). U još jednom rešenju, izraz se odnosi na Ψm (2'-O-metilpseudouridin). U još jednom rešenju, izraz se odnosi na m<5>D (5-metildihidrouridin). U još jednom rešenju, izraz
1
se odnosi na m<3>Ψ (3-metilpseudouridin). U još jednom rešenju, izraz se odnosi na pseudouridinski ostatak koji nije dalje modifikovan. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na monofosfat, difosfat ili trifosfat bilo kog od prethodno navedenih pseudouridina. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na bilo koje druge pseudouridine poznate u struci. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste terapeutski oligoribonukleotid.
Predmetna prijava opisuje postupak za dopremanje rekombinantnog proteina kod pacijenta, gde navedeni postupak podrazumeva korak dovođenja u dodir pacijenta sa RNK, oligoribonukleotidnim, poliribonukleotidnim molekulom ili vektorom genske terapije iz predmetne prijave čime se pacijentu doprema rekombinantni protein.
Predmetna prijava opisuje dvolančani molekul RNK (dsRNK) koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, i dalje sadrži siRNK ili shRNK (RNK oblika kratke ukosnice). U još jednom rešenju, molekul dsRNK je duži od 50 nukleotida. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, pseudouridin ili modifikovani nukleozid se nalazi unutar siRNK sekvence. U još jednom rešenju, pseudouridin ili modifikovani nukleozid se nalazi izvan siRNK sekvence. U još jednom rešenju, 1 ili veći broj pseudouridinskih i(ili) ostataka modifikovanih nukleozida prisutno je i unutar i izvan siRNK sekvence. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, siRNK ili shRNK sadržane su interno unutar dsRNK molekula. U još jednom rešenju, siRNK ili shRNK su sadržane na jednom kraju dsRNK molekula. U još jednom rešenju, jedan ili veći broj siRNK ili shRNK sadržano je na jednom kraju dsRNK molekula, dok je jedan ili veći broj sadržan u unutrašnjosti molekula. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, dužina iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula (npr. jednolančanog RNK (ssRNK) ili dsRNK molekula) za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku veća je od 30 nukleotida. U još jednom rešenju, molekul iRNK ili oligoribonukleotida je duži od 35 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 40 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 45 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 55 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 60 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 60 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 80 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 90 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 100 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 120 nukleotida.
U još jednom rešenju, dužina je najmanje 140 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 160 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 180 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 200 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 250 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 300 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 350 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 400 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 450 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 500 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 600 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 700 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 800 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 900 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 1000 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 1100 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 1200 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 1300 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 1400 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 1500 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 1600 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 1800 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 2000 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 2500 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 3000 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 4000 nukleotida. U još jednom rešenju, dužina je najmanje 5000 nukleotida. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, dsRNK molekul se proizvodi in vitro transkripcijom.
Prilikom in vitro transkripcije može se koristiti T7 fagna RNK polimeraza. Transkripcija in vitro može koristiti SP6 fagnu RNK polimerazu. Transkripcija in vitro može koristiti T3 fagnu RNK polimerazu. Transkripcija in vitro može koristiti RNK polimerazu odabranu iz grupe koja se sastoji od navedenih polimeraza. Transkripcija in vitro može koristiti bilo koju drugu RNK polimerazu koja je u struci poznata. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, dsRNK molekul može da bude prerađen dejstvom ćelijskih enzima tako da daje siRNK ili shRNK. U još jednom rešenju, ćelijski enzim je endonukleaza. U još jednom rešenju, ćelijski enzim je Dicer. Dicer je nukleaza iz familije RNKaza III koja pokreće RNK interferenciju (RNAi) i srodne pojave tako što generiše male RNK koje određuju specifičnost ovih puteva utišavanja gena (Bernstein E, Caudy AA et al, Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001;409(6818): 363-6). U još jednom rešenju, ćelijski enzim je bilo koji drugi ćelijski enzim za koji je u struci poznato da može da hidrolizuje dsRNK molekul. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
1
U još jednom rešenju, dsRNK molekul sadrži dve siRNK ili shRNK. U još jednom rešenju, dsRNK molekul sadrži tri siRNK ili shRNK. dsRNK molekul sadrži više od tri siRNK ili shRNK. U još jednom rešenju, siRNK i(ili) shRNK se oslobađaju iz dsRNK molekula pomoću ćelijskog enzima. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, predmetna prijava obezbeđuje postupak za unošenje siRNK ili shRNK u ćeliju, koji podrazumeva unošenje dsRNK molekula iz predmetne prijave, gde navedena ćelija obradi taj dsRNK molekul, dajući navedenu siRNK ili shRNK, čime se siRNK ili shRNK unose u ćeliju.
Nukleozid koji je modifikovan u iRNK, oligoribonukleotidnom ili poliribonukleotidnom molekulu za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste uridin. U još jednom rešenju, modifikovani nukleozid je citidin (C), uz uridin. U još jednom rešenju predmetnog pronalaska, modifikovani nukleozid je adenin (A). U još jednom rešenju predmetnog pronalaska, modifikovani nukleozid je guanin (G).
U još jednom rešenju, modifikovani nukleozid za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste pseudouridin ili 1-metilpseudouridin, i opciono m<5>C (5-metilcitidin). U još jednom primeru rešenja predmetnog pronalaska, modifikovani nukleozid m<5>U (5-metiluridin). U još jednom rešenju predmetnog pronalaska, modifikovani nukleozid m<6>A (N<6>-metiladenozin). U još jednom primeru rešenja predmetnog pronalaska, modifikovani nukleozid s<2>U (2-tiouridin). U još jednom primeru rešenja predmetnog pronalaska, modifikovani nukleozid je Ψ (pseudouridin). U još jednom primeru rešenja predmetnog pronalaska, modifikovani nukleozid Um (2’-O-metiluridin).
U drugim primerima rešenja predmetnog pronalaska, modifikovani nukleozid je m<1>A (1-metiladenozin); m<2>A (2-metiladenozin); Am (2’-O-metiladenozin); ms<2>m<6>A (2-metiltio-N<6>-metiladenozin); i<6>A (N<6>-izopenteniladenozin); ms<2>i<6>A (2-metiltio-N<6>-izopenteniladenozin); io<6>A (N<6>-(cis-hidroksiizopentenil)adenozin); ms<2>io<6>A (2-metiltio-N<6>-(cishidroksiizopentenil)adenozin); g<6>A (N<6>-glicinilkarbamoiladenozin); t<6>A (N<6>-treonilkarbamoiladenozin); ms<2>t<6>A (2-metiltio-N<6>-treonil karbamoiladenozin); m<6>t<6>A (N<6>-metil-N<6>-treonilkarbamoiladenozin); hn<6>A(N<6>-hidroksinorvalilkarbamoiladenozin); ms<2>hn<6>A (2-metiltio-N<6>-hidroksinorvalil karbamoiladenozin); Ar(p) (2’-O-riboziladenozin (fosfat)); I (inozin); m<1>I (1-metilinozin); m<1>Im (1,2’-O-dimetilinozin); m<3>C (3-metilcitidin); Cm (2’-O-metilcitidin); s<2>C (2-tiocitidin); ac<4>C (N<4>-acetilcitidin); f<5>C (5-formilcitidin); m<5>Cm (5,2’-O-dimetilcitidin); ac<4>Cm (N<4>-acetil-2’-O-metilcitidin); k<2>C (lizidin); m<1>G (1-metilguanozin); m<2>G (N<2>-metilguanozin); m<7>G (7-metilguanozin); Gm (2’-O-metilguanozin); m<22>G (N<2>,N<2>-
1
dimetilguanozin); m<2>Gm (N<2,2’>- O-dimetilguanozin); m<22>Gm (N<2>,N<2,2’>-O-trimetilguanozin); Gr(p) O-ribozilguanozin (fosfat)); yW (vibutozin); o<2>yW (peroksivibutozin); OHyW (hidroksivibutozin); OHyW∗ (nemodifikovani hidroksivibutozin); imG (viozin); mimG (metilviozin); Q (keozin); oQ (epoksikeozin); galQ (galactozil-keozin); manQ (manozilkeozin); preQ0 (7-cijano-7-deazaguanozin); preQ1 (7-aminometil-7-deazaguanozin); G+ (arheozin); D (dihidrouridin); m<5>Um (5,2’-O-dimetiluridin); s<4>U (4-tiouridin); m<5>s2U (5-metil-2-tiouridin); s<2>Um (2-tio-2’-O-metiluridin); acp<3>U (3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin); ho<5>U (5-hidroksiuridin); mo<5>U (5-metoksiuridin); cmo<5>U (uridin 5-oksisirćetna kiselina); mcmo<5>U (uridin metil estar 5-oksisirćetne kiseline); chm<5>U (5-(karboksihidroksimetil)uridin)); mchm<5>U (5-(karboksihidroksimetil)uridin metil estar); mcm<5>U (5-metoksikarbonilmetiluridin); mcm<5>Um (5-metoksikarbonilmetil-2’-O-metiluridin); mcm<5>s<2>U (5-metoksikarbonilmetil-2-tiouridin); nm<5>s<2>U (5-aminometil-2-tiouridin); mnm<5>U (5-metilaminometiluridin); mnm<5>s<2>U (5-metilaminometil-2-tiouridin); mnm<5>se<2>U (5-metilaminometil-2-selenouridin); ncm<5>U (5-karbamoilmetiluridin); ncm<5>Um (5-karbamoilmetil-2’-O-metiluridin); cmnm<5>U (5-karboksimetilaminometiluridin); cmnm<5>Um (5-karboksimetilaminometil-2’-O-metiluridin); cmnm<5>s<2>U (5-karboksimetilaminometil-2-tiouridin); m<6>2A (N<6>,N<6>-dimetiladenozin); Im O-metilinozin); m<4>C (N<4>-metilcitidin); m<4>Cm (N<4,2’>-O-dimetilcitidin); hm<5>C (5-hidroksimetilcitidin); m<3>U (3-metiluridin); cm<5>U (5-karboksimetiluridin); m<6>Am (N<6,2’>-O-dimetiladenozin); m<62>Am (N<6>,N<6>,O-2’-trimetiladenozin); m<2,7>G (N<2,7>-dimetilguanozin); m<2,2,7>G (N<2>,N<2,7>-trimetilguanozin); m<3>Um (3,2’-O-dimetiluridin); m<5>D (5-metildihidrouridin); f<5>Cm (5-formil-2’-O-metilcitidin); m<1>Gm (1,2’-O-dimetilguanozin); m<1>Am (1,2’-O-dimetiladenozin); τm<5>U (5-taurinometiluridin); τm<5>s<2>U (5-taurinometil-2-tiouridin)); imG-14 (4-demetilviozin); imG<2>(izoviozin); ili ac<6>A (N<6>-acetiladenozin).
U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku kao što je definisano u patentnim zahtevima sadrži kombinaciju 2 ili većeg broja gorenavedenih modifikacija. U još jednom rešenju, iRNK molekul ili oligoribonukleotidni molekul sadrži kombinaciju 3 ili više gorenavedenih modifikacija. U još jednom rešenju, iRNK molekul ili oligoribonukleotidni molekul sadrži kombinaciju više od 3 gorenavedene modifikacije. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, između 0,1% i 100% ostataka u iRNK, oligoribonukleotidnom ili poliribonukleotidnom molekulu za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku modifikovano je prisustvom pseudouridina. U još jednom rešenju, modifikovano je 0,1%
1
ostataka. U još jednom rešenju, 0,2%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,3%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,4%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,5%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,6%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,8%. U još jednom rešenju, taj udeo je 1%. U još jednom rešenju, taj udeo je 1,5%. U još jednom rešenju, taj udeo je 2%. U još jednom rešenju, taj udeo je 2,5%. U još jednom rešenju, taj udeo je 3%. U još jednom rešenju, taj udeo je 4%. U još jednom rešenju, taj udeo je 5%. U još jednom rešenju, taj udeo je 6%. U još jednom rešenju, taj udeo je 8%. U još jednom rešenju, taj udeo je 10%. U još jednom rešenju, taj udeo je 12%. U još jednom rešenju, taj udeo je 14%. U još jednom rešenju, taj udeo je 16%. U još jednom rešenju, taj udeo je 18%. U još jednom rešenju, taj udeo je 20%. U još jednom rešenju, taj udeo je 25%. U još jednom rešenju, taj udeo je 30%. U još jednom rešenju, taj udeo je 35%. U još jednom rešenju, taj udeo je 40%. U još jednom rešenju, taj udeo je 45%. U još jednom rešenju, taj udeo je 50%. U još jednom rešenju, taj udeo je 60%. U još jednom rešenju, taj udeo je 70%. U još jednom rešenju, taj udeo je 80%. U još jednom rešenju, taj udeo je 90%. U još jednom rešenju, taj udeo je 100%.
U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 5%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 3%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 1%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 2%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 4%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 6%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 8%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 10%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 12%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 15%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 20%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 30%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 40%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 50%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 60%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 70%.
U još jednom rešenju, 0,1% ostataka datog nukleotida (uridina, i opciono citidina) je modifikovano. U još jednom rešenju, taj udeo nukleotida je 0,2%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,3%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,4%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,5%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,6%. U još jednom rešenju, taj udeo je 0,8%. U još jednom rešenju, taj udeo je 1%. U još jednom rešenju, taj udeo je 1,5%. U još jednom rešenju, taj udeo je 2%. U još jednom rešenju, taj udeo je 2,5%. U još jednom rešenju, taj udeo je 3%. U još jednom rešenju, taj udeo je 4%. U još jednom rešenju, taj udeo je 5%. U još jednom rešenju, taj udeo je 6%. U još jednom rešenju, taj udeo je 8%. U još jednom rešenju, taj udeo je 10%. U još jednom rešenju, taj udeo je 12%. U još jednom rešenju, taj udeo je 14%. U još jednom rešenju, taj udeo je 16%. U još jednom rešenju, taj udeo je 18%. U još jednom rešenju, taj udeo je 20%. U još jednom rešenju, taj udeo je 25%. U još jednom rešenju, taj udeo je 30%. U još
1
jednom rešenju, taj udeo je 35%. U još jednom rešenju, taj udeo je 40%. U još jednom rešenju, taj udeo je 45%. U još jednom rešenju, taj udeo je 50%. U još jednom rešenju, taj udeo je 60%. U još jednom rešenju, taj udeo je 70%. U još jednom rešenju, taj udeo je 80%. U još jednom rešenju, taj udeo je 90%. U još jednom rešenju, taj udeo je 100%.
U još jednom rešenju, udeo datog nukleotida je manji od 8%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 10%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 5%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 3%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 1%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 2%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 4%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 6%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 12%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 15%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 20%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 30%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 40%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 50%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 60%. U još jednom rešenju, taj udeo je manji od 70%.
U još jednom rešenju, izrazi „ribonukleotid“, „oligoribonukleotid“ i „poliribonukleotid“ se odnose na niz od najmanje dve kombinacije baza-šećer-fosfat. Izraz obuhvata, u još jednom rešenju, jedinjenja koja sadrže nukleotide u kojima je ostatak šećera riboza. U još jednom rešenju, izraz obuhvata i RNK i RNK derivate u kojima je modifikovana kičma molekula. Izraz „nukleotidi“ se odnosi, u još jednom rešenju, na monomerne jedinice nukleinske kiseline i polimere. RNK za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste u obliku iRNK (informacione RNK). Upotreba siRNK i miRNK je opisana u literaturi (Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491-96 i reference koje su tamo navedene). Uz to, ovi oblici RNK mogu da budu jednolančani, dvolančani, trolančani ili četvorolančani. Izraz takođe obuhvata, u još jednom rešenju, veštačke nukleinske kiseline koje mogu da sadrže druge vrste „kičme“ ali iste baze. U još jednom rešenju, veštačka nukleinska kiselina je PNK (peptidna nukleinska kiselina). PNK sadrže peptidne kičme i nukleotidne baze i u stanju su da vežu, u još jednom rešenju, i DNK i RNK molekule. U još jednom rešenju, nukleotid je oksetanski modifikovan. U još jednom rešenju, nukleotid je modifikovan supstitucijom jedne ili većeg broja fosfodiestarskih veza fosforotioatnom vezom. U još jednom rešenju, veštačka nukleinska kiselina sadrži bilo koju drugu varijantu fosfatne kičme nativnih nukleinskih kiselina koje su poznate u struci. Upotreba fosfotioratnih nukleinskih kiselina i PNK poznata je stručnjacima u ovoj oblasti i opisana je, na primer, u Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57; i Raz NK et al Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84. Dobijanje i upotreba nukleinskih kiselina poznati su stručnjacima u ovoj oblasti i opisani, na primer, u Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, urednici i Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in
1
eukaryotic cells (2003) Purchio & G. C. Fareed. Svaki derivat nukleinske kiseline predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 25 nukleotida (nt). U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 24 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 23 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 22 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 21 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 20 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 19 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 18 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 17 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „oligoribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži manje od 16 nukleotida. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, izraz „poliribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži više od 25 nukleotida (nt). U još jednom rešenju, izraz „poliribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži više od 26 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz „poliribonukleotid“ se odnosi na niz koji sadrži više od 28 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 30 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 32 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 35 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 40 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 50 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 60 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 80 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 100 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 120 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 150 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 200 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 300 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 400 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 500 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 600 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 800 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 1000 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 1200 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 1400 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na
2
niz koji sadrži više od 1600 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 1800 nukleotida. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na niz koji sadrži više od 2000 nukleotida. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
Predmetna prijava opisuje postupak kojim se sisarska ćelija indukuje da proizvodi protein od interesa, koji podrazumeva dovođenje u dodir sisarske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom RNK koji kodira rekombinantni protein, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, čime se sisarska ćelija navodi da proizvodi navedeni protein od interesa. U još jednom rešenju, protein od interesa je rekombinantni protein. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
Izraz „kodira“ se, u još jednom rešenju, odnosi na molekul iRNK koji sadrži gen koji kodira protein od interesa. U još jednom rešenju, molekul iRNK sadrži otvoreni okvir čitanja koji kodira protein od interesa. U još jednom rešenju, takođe je kodiran i jedan ili više drugih proteina. U još jednom rešenju, protein od interesa je jedini protein koji je kodiran. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
Predmetna prijava opisuje postupak kojim se sisarska ćelija indukuje da proizvodi rekombinantni protein, koji podrazumeva dovođenje u dodir sisarske ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom RNK koji kodira rekombinantni protein, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK dalje sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, čime se sisarska ćelija navodi da proizvodi rekombinantni protein.
U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku u ćeliji prolazi kroz efikasniju translaciju od nemodifikovanog RNK molekula sa istom sekvencom. U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu pokazuju unapređenu sposobnost da podlegnu translaciji u ciljnoj ćeliji. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 2 puta, u odnosu na odgovarajući nemodifikovani molekul. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 3 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 5 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 7 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 10 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 15 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 20 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 50 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 100 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 200 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 500 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 1000 puta. U još jednom rešenju, translacija je uvećana faktorom od 2000 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 10-1000 puta.
U još jednom rešenju, taj faktor je 10-100 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 10-200 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 10-300 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 10-500 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 20-1000 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 30-1000 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 50-1000 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 100-1000 puta. U još jednom rešenju, taj faktor je 200-1000 puta. U još jednom rešenju, translacija je pojačana u drugom značajnom stepenu, ili opsegu stepeni. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
Postupci određivanja efikasnosti translacije su dobro poznati u struci i obuhvataju, na primer, merenje aktivnosti nekog reporterskog proteina [primeri u predmetnoj prijavi] ili zelenog fluorescentnog proteina [Wall AA, Phillips AM et al, Effective translation of the second cistron in two Drosophila dicistronic transcripts is determined by the absence of inframe AUG codons in the first cistron. J Biol Chem 2005;280(30): 27670-8], ili merenjem radioaktivnog obeleživača ugrađenog u protein dobijen translacijom (Ngosuwan J, Wang NM et al, Roles of cytosolic Hsp70 and Hsp40 molecular chaperones in post-translational translocation of presecretory proteins into the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 2003;278(9): 7034-42). Svaki postupak predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U ispitivanjima ekspresije koja su ovde opisana, merena je translacija iz RNK kompleksirane sa lipofektinom ® (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, SAD) koja je ubrizgana u repnu venu miševa. U lizatima slezine, RNK sa pseudouridinskom modifikacijom je značajno efikasnije translirana nego nemodifikovana RNK (slika 12B). Pod uslovima koji su ovde korišćeni, efikasnost postupaka prema predmetnom pronalasku zasnovanih na transfekciji pokazuje korelaciju sa sposobnošću reagensa za transfekciju da prodre u tkiva, čime se obezbeđuje objašnjenje zašto je ovaj efekat bio najviše naglašen u ćelijama slezine. Krvotok u slezini je otvoreni sistem, u kome sadržaj krvi dolazi u direktan dodir sa elementima crvene i bele pulpe, uključujući limfoidne ćelije.
U još jednom eksperimentu, sprovedeni su in vitro testovi fosforilacije pomoću rekombinantne humane PKR i njenog supstrata eIF2α u prisustvu iRNK koja kodira renilu, sa kapicom (0,5 i 0,05 ng/μl). iRNK koja sadrži pseudouridin (Ψ) nije aktivirala PKR, što je detektovano kao izostanak kako autofosforilacije PKR, tako i fosforilacije eIF2α, dok su RNK bez modifikacije nukleozida i RNK sa m<5>C modifikacijom aktivirale PKR. Poznato je da fosforilovani eIF2α blokira pokretanje translacije iRNK, stoga izostanak fosforilacije omogućava, u još jednom rešenju, pojačanu translaciju iRNK koja sadrži pseudouridin (Ψ).
U još jednom rešenju, pojačana translacija je u ćeliji (u odnosu na translaciju nemodifikovanog iRNK molekula iste sekvence u istoj ćeliji; primeri 10-11). U još jednom rešenju, pojačana translacija odvija se in vitro (npr. u in vitro smeši za translaciju ili lizatu retikulocita; primeri 10-11). U još jednom rešenju, unapređena translacija odvija se in vitro (primer 13). U svakom od ovih slučajeva, translacija je unapređena u odnosu na nemodifikovani molekul RNK iste sekvence, pod istim uslovima. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku značajno je manje imunogeničan nego nemodifikovani in vitro sintetisani RNK molekula sa istom sekvencom. U još jednom rešenju, modifikovani iRNK molekul je 2 puta manje imunogen od odgovarajućeg nemodifikovanog molekula. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 3 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 5 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 7 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 10 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 15 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 20 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 50 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 100 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 200 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 500 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 1000 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena faktorom od 2000 puta. U još jednom rešenju, imunogeničnost je smanjena nekim drugim faktorom.
U još jednom rešenju, „značajno manje imunogeničan“ se odnosi na smanjenje imunogeničnosti koje se može detektovati, kao što je navedeno u patentnim zahtevima. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na faktor smanjenja imunogeničnosti (npr. jedan od faktora smanjenja navedenih iznad). U još jednom rešenju, izraz se odnosi na smanjenje koje omogućava da se delotvorna količina iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku primeni bez pokretanja imunog odgovora koji je moguće detektovati. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na takvo smanjenje da je moguće da se iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul primenjuju više puta bez pokretanja imunog odgovora koje bi bilo dovoljno da se smanji ekspresija rekombinantnog proteina u nekoj meri koju je moguće detektovati. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na takvo smanjenje da je moguće da se iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul primenjuju više puta bez pokretanja imunog odgovora koje bi bilo dovoljno da se eliminiše ekspresija rekombinantnog proteina koju je moguće detektovati.
2
„Delotvorna količina“ iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku odnosi se, u još jednom rešenju, na količinu koja je dovoljna da dovede do terapeutskog dejstva. U još jednom rešenju, izraz se odnosi na količinu koja je dovoljna da dovede do ekspresije količine rekombinantnog proteina koju je moguće detektovati. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
Smanjenje imunogeničnosti iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku prikazano je u predmetnoj prijavi (primeri 1-8).
Postupci za određivanje imunogeničnosti su u struci dobro poznati i obuhvataju, npr. određivanje citokina (npr. IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α ili β, IL-6, IFN-β, ili IL-8; primeri u predmetnoj prijavi), određivanje ekspresije markera aktivacije DC (npr. CD83, HLA-DR, CD80 i CD86; primeri u predmetnoj prijavi), ili određivanje sposobnosti molekula da deluje kao adjuvans za adaptivni imuni odgovor.
U još jednom rešenju, relativna imunogeničnost modifikovanog nukleotida i odgovarajućeg nemodifikovanog nukleotida određuju se određivanjem količine modifikovanog nukleotida koja je potrebna da bi se pokrenuo jedan od prethodno navedenih odgovora, u istoj meri u kojoj ga pokreće data količina nemodifikovanog nukleotida. Na primer, ukoliko je potrebno dvaput više modifikovanog nukleotida da bi se dobio isti odgovor, onda je modifikovani nukleotid dvostruko manje imunogeničan od nemodifikovanog nukleotida.
U još jednom rešenju, relativna imunogeničnost modifikovanog nukleotida i odgovarajućeg nemodifikovanog nukleotida određuju se određivanjem količine citokina (npr. IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α ili β, IL-6, IFN-β, ili IL-8) koja se izluči kao odgovor na primenu modifikovanog nukleotida, u odnosu na istu količinu nemodifikovanog nukleotida. Na primer, ukoliko se izluči samo polovina količine citokina, onda je modifikovani nukleotid dvostruko manje imunogeničan od nemodifikovanog nukleotida. U još jednom rešenju, pre računanja imunogeničnosti u prethodno navedenim postupcima oduzima se početni nivo stimulacije.
U još jednom rešenju, upotreba prema predmetnom pronalasku dalje podrazumeva mešanje iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula sa reagensom za transfekciju pre koraka dovođenja u dodir. U još jednom rešenju, upotreba prema predmetnom pronalasku dalje podrazumeva primenu iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula zajedno sa reagensom za transfekciju. U još jednom rešenju, reagens za transfekciju je katjonski lipidni reagens (primer 3).
U još jednom rešenju, reagens za transfekciju je reagens za transfekciju na bazi lipida. U još jednom rešenju, reagens za transfekciju je reagens za transfekciju na bazi proteina. U još jednom rešenju, reagens za transfekciju je reagens za transfekciju na bazi polietilenimina. U još jednom rešenju, reagens za transfekciju je kalcijum fosfat. U još jednom rešenju, reagens za transfekciju je lipofektin® ili lipofektamin®. U još jednom rešenju, reagens za transfekciju je bilo koji drugi reagens za transfekciju koji je u struci poznat.
U još jednom rešenju, reagens za transfekciju gradi lipozom. Lipozomi, u još jednom rešenju, povećavaju unutarćelijsku stabilnost, povećavaju efikasnost unosa u ćeliju i unapređuju biološku aktivnost. U još jednom rešenju, lipozomi su šuplje sferične vezikule sačinjene od lipida, postavljenih na sličan način kao lipidi koji grade ćelijsku membranu. U još jednom rešenju, oni imaju interni vodeni prostor u kome se zarobljavaju jedinjenja rastvorljiva u vodi, čije se dimenzije kreću u opsegu od 0,05 do nekoliko mikrona u prečniku. U još jednom rešenju, lipozomi mogu da dopreme RNK u ćelije u biološki aktivnom obliku.
U još jednom rešenju, ciljna ćelija za upotrebe prema predmetnom pronalasku jeste antigen-prezentujuća ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je životinjska ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je dendritska ćelija (primer 11). U još jednom rešenju, navedena ćelija je nervna ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je moždana ćelija (primer 13). U još jednom rešenju, navedena ćelija je ćelija slezine. U još jednom rešenju, navedena ćelija je limfoidna ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je plućna ćelija (primer 13). U još jednom rešenju, navedena ćelija je ćelija kože. U još jednom rešenju, navedena ćelija je keratinocit. U još jednom rešenju, navedena ćelija je endotelijalna ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je astrocit, ćelija mikroglija, ili neuron (primer 13). U još jednom rešenju, navedena ćelija je alveolarna ćelija (primer 13). U još jednom rešenju, navedena ćelija je površinska alveolarna ćelija (primer 13). U još jednom rešenju, navedena ćelija je alveolarni makrofag. U još jednom rešenju, navedena ćelija je alveolarni pneumocit. U još jednom rešenju, navedena ćelija je vaskularna endotelijalna ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je mezenhimalna ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je epitelijalna ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je hematopojetska ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je ćelija epitela kolona. U još jednom rešenju, navedena ćelija je ćelija plućnog epitela. U još jednom rešenju, navedena ćelija je ćelija kostne srži.
U drugim rešenjima, ciljna ćelija je Klaudijusova ćelija, Hensenova ćelija, Merkelova ćelija, Milerova ćelija, Panetova ćelija, Purkinjeva ćelija, Švanova ćelija, Sertolijeva ćelija,
2
acidofilna ćelija, acinarna ćelija, adipoblast, adipocit, mrka ili bela alfa ćelija, amakrina ćelija, beta ćelija, kapsularna ćelija, cementocit, glavna ćelija, hondroblast, hondrocit, hromafinska ćelija, hromofobna ćelija, kortikotrof, delta ćelija, Langerhansova ćelija, folikularna dendritska ćelija, enterohromafinska ćelija, ependimocit, epitelijalna ćelija, bazalna ćelija, skvamocelarna ćelija, endotelijalna ćelija, prelazna ćelija, eritroblast, eritrocit, fibroblast, fibrocit, folikularna ćelija, germinalna ćelija, gamet, jajna ćelija, spermatozoon, oocit, primarni oocit, sekundarni oocit, spermatid, spermatocit, primani spermatocit, sekundarni spermatocit, germinalni epitelijum, džinovska ćelija, ćelija glija, astroblast, astrocit, oligodendroblast, oligodendrocit, glioblast, goblet ćelija, gonadotrof, ćelija granulosa, hemocitoblast, senzorna ćelija sa dlačicama, hepatoblast, hepatocit, hijalocit, intersticijalna ćelija, jukstaglomerularna ćelija, keratinocit, keratocit, lemalna ćelija, leukocit, granulocit, bazofil, eozinofil, neutrofil, limfoblast, B-limfoblast, T-limfoblast, limfocit, B-limfocit, T-limfocit, T-limfocit indukovan dejstvom ćelija pomagačica, Th1 T-limfocit, Th2 T-limfocit, ćelija prirodni ubica (NK ćelija), timocit, makrofag, Kupferova ćelija, alveolarni makrofag, penasta ćelija, histiocit, lutealna ćelija, limfocitična matična ćelija, limfoidna ćelija, limfoidna matična ćelija, makroglijalna ćelija, mamotrof, mastocit, meduloblast, megakarioblast, megakariocit, melanoblast, melanocit, mezengijalna ćelija, mezotelijalna ćelija, metamijelocit, monoblast, monocit, foveolarna ćelija, mišićna ćelija, ćelija srčanog mišića, ćelija skeletnog mišića, glatka mišićna ćelija, mijelocit, mijeloidna ćelija, mijeloidna matična ćelija, mioblast, mioepitelijalna ćelija, miofibrobast, neuroblast, neuroepitelijalna ćelija, neuron, odontoblast, osteoblast, osteoklast, osteocit, parijetalna ćelija, parafolikularna ćelija, paralutealna ćelija, peptična ćelija, pericit, mononuklearna ćelija periferne krvi, feohromocit, falangealna ćelija, pinealocit, pituicit, plazma ćelija, trombocit, podocit, proeritroblast, promonocit, promijeloblast, promijelocit, pronormoblast, retikulocit, retinalna pigmentna epitelijalna ćelija, retinoblast, mala ćelija, somatotrof, matična ćelija, sustentakularna ćelija, teloglijalna ćelija ili zimogena ćelija.
Različiti poremećaji mogu se lečiti primenom upotreba prema predmetnom pronalasku, uključujući, između ostalog, monogenetske poremećaje, zarazne bolesti, stečene poremećaje, kancer i slično. Primeri monogenetskih poremećaja obuhvataju deficijenciju ADA, cističnu fibrozu, familijalnu hiperholesterolemiju, hemofiliju, hroničnu granulomatoznu bolest, Dušenovu mišićnu distrofiju, Fankonijevu anemiju, srpastu anemiju, Gošeovu bolest, Hanterov sindrom, SCID povezan sa X hromozomom i slične. U još jednom rešenju, poremećaj koji se tretira ima veze sa jednim od proteina koji je ispod naveden.
2
U još jednom rešenju, rekombinantni protein koji kodira iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste ektonukleozidna trifosfat difosfohidrolaza.
U još jednom rešenju, rekombinantni protein jeste eritropojetin (EPO).
U drugim rešenjima, rekombinantni protein je ABCA4; ABCD3; ACADM; AGL; AGT; ALDH4A1; ALPL; AMPD1; APOA2; AVSD1; BRCD2; C1QA; C1QB; C1QG; C8A; C8B; CACNA1S; CCV; CD3Z; CDC2L1; CHML; CHS1; CIAS1; CLCNKB; CMD1A; CMH2; CMM; COL11A1; COL8A2; COL9A2; CPT2; CRB1; CSE; CSF3R; CTPA; CTSK; DBT; DIO1; DISC1; DPYD; EKV; ENO1; ENO1P; EPB41; EPHX1; F13B; F5; FCGR2A; FCGR2B; FCGR3A; FCHL; FH; FMO3; FMO4; FUCA1; FY; GALE; GBA; GFND; GJA8; GJB3; GLC3B; HF1; HMGCL; HPC1; HRD; HRPT2; HSD3B2; HSPG2; KCNQ4; KCS; KIF1B; LAMB3; LAMC2; LGMD1B; LMNA; LOR; MCKD1; MCL1; MPZ; MTHFR; MTR; MUTYH; MYOC; NB; NCF2; NEM1; NPHS2; NPPA; NRAS; NTRK1; OPTA2; PBX1; PCHC; PGD; PHA2A; PHGDH; PKLR; PKP1; PLA2G2A; PLOD; PPOX; PPT1; PRCC; PRG4; PSEN2; PTOS1; REN; RFX5; RHD; RMD1; RPE65; SCCD; SERPINC1; SJS1; SLC19A2; SLC2A1; SPG23; SPTA1; TAL1; TNFSF6; TNNT2; TPM3; TSHB; UMPK; UOX; UROD; USH2A; VMGLOM; VWS; WS2B; ABCB11; ABCG5; ABCG8; ACADL; ACP1; AGXT; AHHR; ALMS1; ALPP; ALS2; APOB; BDE; BDMR; BJS; BMPR2; CHRNA1; CMCWTD; CNGA3; COL3A1; COL4A3; COL4A4; COL6A3; CPS1; CRYGA; CRYGEP1; CYP1B1; CYP27A1; DBI; DES; DYSF; EDAR; EFEMP1; EIF2AK3; ERCC3; FSHR; GINGF; GLC1B; GPD2; GYPC; HADHA; HADHB; HOXD13; HPE2; IGKC; IHH; IRS1; ITGA6; KHK; KYNU; LCT; LHCGR; LSFC; MSH2; MSH6; NEB; NMTC; NPHP1; PAFAH1P1; PAX3; PAX8; PMS1; PNKD; PPH1; PROC; REG1A; SAG; SFTPB; SLC11A1; SLC3A1; SOS1; SPG4; SRD5A2; TCL4; TGFA; TMD; TPO; UGT1A@; UV24; WSS; XDH; ZAP70; ZFHX1B; ACAA1; AGS1; AGTR1; AHSG; AMT; ARMET; BBS3; BCHE; BCPM; BTD; CASR; CCR2; CCR5; CDL1; CMT2B; COL7A1; CP; CPO; CRV; CTNNB1; DEM; ETM1; FANCD2; FIH; FOXL2; GBE1; GLB1; GLC1C; GNAI2; GNAT1; GP9; GPX1; HGD; HRG; ITIH1; KNG; LPP; LRS1; MCCC1; MDS1; MHS4; MITF; MLH1; MYL3; MYMY; OPA1; P2RY12; PBXP1; PCCB; POU1F1; PPARG; PROS1; PTHR1; RCA1; RHO; SCA7; SCLC1; SCN5A; SI; SLC25A20; SLC2A2; TF; TGFBR2; THPO; THRB; TKT; TM4SF1; TRH; UMPS; UQCRC1; USH3A; VHL; WS2A; XPC; ZNF35; ADH1B; ADH1C; AFP; AGA; AIH2; ALB; ASMD; BFHD; CNGA1; CRBM; DCK; DSPP; DTDP2; ELONG; ENAM; ETFDH; EVC; F11; FABP2; FGA; FGB; FGFR3; FGG; FSHMD1A; GC; GNPTA; GNRHR; GYPA; HCA; HCL2; HD; HTN3; HVBS6; IDUA; IF; JPD; KIT; KLKB1; LQT4; MANBA;
2
MLLT2; MSX1; MTP; NR3C2; PBT; PDE6B; PEE1; PITX2; PKD2; QDPR; SGCB; SLC25A4; SNCA; SOD3; STATH; TAPVR1; TYS; WBS2; WFS1; WHCR; ADAMTS2; ADRB2; AMCN; AP3B1; APC; ARSB; B4GALT7; BHR1; C6; C7; CCAL2; CKN1; CMDJ; CRHBP; CSF1R; DHFR; DIAPH1; DTR; EOS; EPD; ERVR; F12; FBN2; GDNF; GHR; GLRA1; GM2A; HEXB; HSD17B4; ITGA2; KFS; LGMD1A; LOX; LTC4S; MAN2A1; MCC; MCCC2; MSH3; MSX2; NR3C1; PCSK1; PDE6A; PFBI; RASA1; SCZD1; SDHA; SGCD; SLC22A5; SLC26A2; SLC6A3; SM1; SMA@; SMN1; SMN2; SPINK5; TCOF1; TELAB1; TGFBI; ALDH5A1; ARG1; AS; ASSP2; BCKDHB; BF; C2; C4A; CDKN1A; COL10A1; COL11A2; CYP21A2; DYX2; EJM1; ELOVL4; EPM2A; ESR1; EYA4; F13A1; FANCE; GCLC; GJA1; GLYS1; GMPR; GSE; HCR; HFE; HLA-A; HLA-DPB1; HLA-DRA; HPFH; ICS1; IDDM1; IFNGR1; IGAD1; IGF2R; ISCW; LAMA2; LAP; LCA5; LPA; MCDR1; MOCS1; MUT; MYB; NEU1; NKS1; NYS2; OA3; ODDD; OFC1; PARK2; PBCA; PBCRA1; PDB1; PEX3; PEX6; PEX7; PKHD1; PLA2G7; PLG; POLH; PPAC; PSORS1; PUJO; RCD1; RDS; RHAG; RP14; RUNX2; RWS; SCA1; SCZD3; SIASD; SOD2; ST8; TAP1; TAP2; TFAP2B; TNDM; TNF; TPBG; TPMT; TULP1; WISP3; AASS; ABCB1; ABCB4; ACHE; AQP1; ASL; ASNS; AUTS1; BPGM; BRAF; C7orf2; CACNA2D1; CCM1; CD36; CFTR; CHORDOMA; CLCN1; CMH6; CMT2D; COL1A2; CRS; CYMD; DFNA5; DLD; DYT11; EEC1; ELN; ETV1; FKBP6; GCK; GHRHR; GHS; GLI3; GPDS1; GUSB; HLXB9; HOXA13; HPFH2; HRX; IAB; IMMP2L; KCNH2; LAMB1; LEP; MET; NCF1; NM; OGDH; OPN1SW; PEX1; PGAM2; PMS2; PON1; PPP1R3A; PRSS1; PTC; PTPN12; RP10; RP9; SERPINE1; SGCE; SHFM1; SHH; SLC26A3; SLC26A4; SLOS; SMAD1; TBXAS1; TWIST; ZWS1; ACHM3; ADRB3; ANK1; CA1; CA2; CCAL1; CLN8; CMT4A; CNGB3; COH1; CPP; CRH; CYP11B1; CYP11B2; DECR1; DPYS; DURS1; EBS1; ECA1; EGI; EXT1; EYA1; FGFR1; GNRH1; GSR; GULOP; HR; KCNQ3; KFM; KWE; LGCR; LPL; MCPH1; MOS; MYC; NAT1; NAT2; NBS1; PLAT; PLEC1; PRKDC; PXMP3; RP1; SCZD6; SFTPC; SGM1; SPG5A; STAR; TG; TRPS1; TTPA; VMD1; WRN; ABCA1; ABL1; ABO; ADAMTS13; AK1; ALAD; ALDH1A1; ALDOB; AMBP; AMCD1; ASS; BDMF; BSCL; C5; CDKN2A; CHAC; CLA1; CMD1B; COL5A1; CRAT; DBH; DNAI1; DYS; DYT1; ENG; FANCC; FBP1; FCMD; FRDA; GALT; GLDC; GNE; GSM1; GSN; HSD17B3; HSN1; IBM2; INVS; JBTS1; LALL; LCCS1; LCCS; LGMD2H; LMX1B; MLLT3; MROS; MSSE; NOTCH1; ORM1; PAPPA; PIP5K1B; PTCH; PTGS1; RLN1; RLN2; RMRP; ROR2; RPD1; SARDH; SPTLC1; STOM; TDFA; TEK; TMC1; TRIM32; TSC1; TYRP1; XPA; CACNB2; COL17A1; CUBN; CXCL12; CYP17; CYP2C19; CYP2C9; EGR2; EMX2; ERCC6; FGFR2; HK1; HPS1; IL2RA; LGI1; LIPA; MAT1A; MBL2; MKI67; MXI1;
2
NODAL; OAT; OATL3; PAX2; PCBD; PEO1; PHYH; PNLIP; PSAP; PTEN; RBP4; RDPA; RET; SFTPA1; SFTPD; SHFM3; SIAL; THC2; TLX1; TNFRSF6; UFS; UROS; AA; ABCC8; ACAT1; ALX4; AMPD3; ANC; APOA1; APOA4; APOC3; ATM; BSCL2; BWS; CALCA; CAT; CCND1; CD3E; CD3G; CD59; CDKN1C; CLN2; CNTF; CPT1A; CTSC; DDB1; DDB2; DHCR7; DLAT; DRD4; ECB2; ED4; EVR1; EXT2; F2; FSHB; FTH1; G6PT1; G6PT2; GIF; HBB; HBBP1; HBD; HBE1; HBG1; HBG2; HMBS; HND; HOMG2; HRAS; HVBS1; IDDM2; IGER; INS; JBS; KCNJ11; KCNJ1; KCNQ1; LDHA; LRP5; MEN1; MLL; MYBPC3; MYO7A; NNO1; OPPG; OPTB1; PAX6; PC; PDX1; PGL2; PGR; PORC; PTH; PTS; PVRL1; PYGM; RAG1; RAG2; ROM1; RRAS2; SAA1; SCA5; SCZD2; SDHD; SERPING1; SMPD1; TCIRG1; TCL2; TECTA; TH; TREH; TSG101; TYR; USH1C; VMD2; VRNI; WT1; WT2; ZNF145; A2M; AAAS; ACADS; ACLS; ACVRL1; ALDH2; AMHR2; AOM; AQP2; ATD; ATP2A2; BDC; C1R; CD4; CDK4; CNA1; COL2A1; CYP27B1; DRPLA; ENUR2; FEOM1; FGF23; FPF; GNB3; GNS; HAL; HBP1; HMGA2; HMN2; HPD; IGF1; KCNA1; KERA; KRAS2; KRT1; KRT2A; KRT3; KRT4; KRT5; KRT6A; KRT6B; KRTHB6; LDHB; LYZ; MGCT; MPE; MVK; MYL2; OAP; PAH; PPKB; PRB3; PTPN11; PXR1; RLS; RSN; SAS; SAX1; SCA2; SCNN1A; SMAL; SPPM; SPSMA; TBX3; TBX5; TCF1; TPI1; TSC3; ULR; VDR; VWF; ATP7B; BRCA2; BRCD1; CLN5; CPB2; ED2; EDNRB; ENUR1; ERCC5; F10; F7; GJB2; GJB6; IPF1; MBS1; MCOR; NYS4; PCCA; RB1; RHOK; SCZD7; SGCG; SLC10A2; SLC25A15; STARP1; ZNF198; ACHM1; ARVD1; BCH; CTAA1; DAD1; DFNB5; EML1; GALC; GCH1; IBGC1; IGH@; IGHC grupu; IGHG1; IGHM; IGHR; IV; LTBP2; MCOP; MJD; MNG1; MPD1; MPS3C; MYH6; MYH7; NP; NPC2; PABPN1; PSEN1; PYGL; RPGRIP1; SERPINA1; SERPINA3; SERPINA6; SLC7A7; SPG3A; SPTB; TCL1A; TGM1; TITF1; TMIP; TRA@; TSHR; USH1A; VP; ACCPN; AHO2; ANCR; B2M; BBS4; BLM; CAPN3; CDAN1; CDAN3; CLN6; CMH3; CYP19; CYP1A1; CYP1A2; DYX1; EPB42; ETFA; EYCL3; FAH; FBN1; FES; HCVS; HEXA; IVD; LCS1; LIPC; MYO5A; OCA2; OTSC1; PWCR; RLBP1; SLC12A1; SPG6; TPM1; UBE3A; WMS; ABCC6; ALDOA; APRT; ATP2A1; BBS2; CARD15; CATM; CDH1; CETP; CHST6; CLN3; CREBBP; CTH; CTM; CYBA; CYLD; DHS; DNASE1; DPEP1; ERCC4; FANCA; GALNS; GAN; HAGH; HBA1; HBA2; HBHR; HBQ1; HBZ; HBZP; HP; HSD11B2; IL4R; LIPB; MC1R; MEFV; MHC2TA; MLYCD; MMVP1; PHKB; PHKG2; PKD1; PKDTS; PMM2; PXE; SALL1; SCA4; SCNN1B; SCNN1G; SLC12A3; TAT; TSC2; VDI; WT3; ABR; ACACA; ACADVL; ACE; ALDH3A2; APOH; ASPA; AXIN2; BCL5; BHD; BLMH; BRCA1; CACD; CCA1; CCZS; CHRNB1; CHRNE; CMT1A; COL1A1; CORD5; CTNS; EPX; ERBB2; G6PC; GAA; GALK1; GCGR; GFAP; GH1; GH2; GP1BA; GPSC; GUCY2D;
2
ITGA2B; ITGB3; ITGB4; KRT10; KRT12; KRT13; KRT14; KRT14L1; KRT14L2; KRT14L3; KRT16; KRT16L1; KRT16L2; KRT17; KRT9; MAPT; MDB; MDCR; MGI; MHS2; MKS1; MPO; MYO15A; NAGLU; NAPB; NF1; NME1; P4HB; PAFAH1B1; PECAM1; PEX12; PHB; PMP22; PRKAR1A; PRKCA; PRKWNK4; PRP8; PRPF8; PTLAH; RARA; RCV1; RMSA1; RP17; RSS; SCN4A; SERPINF2; SGCA; SGSH; SHBG; SLC2A4; SLC4A1; SLC6A4; SMCR; SOST; SOX9; SSTR2; SYM1; SYNS1; TCF2; THRA; TIMP2; TOC; TOP2A; TP53; TRIM37; VBCH; ATP8B1; BCL2; CNSN; CORD1; CYB5; DCC; F5F8D; FECH; FEO; LAMA3; LCFS2; MADH4; MAFD1; MC2R; MCL; MYP2; NPC1; SPPK; TGFBRE; TGIF; TTR; AD2; AMH; APOC2; APOE; ATHS; BAX; BCKDHA; BCL3; BFIC; C3; CACNA1A; CCO; CEACAM5; COMP; CRX; DBA; DDU; DFNA4; DLL3; DM1; DMWD; E11S; ELA2; EPOR; ERCC2; ETFB; EXT3; EYCL1; FTL; FUT1; FUT2; FUT6; GAMT; GCDH; GPI; GUSM; HB1; HCL1; HHC2; HHC3; ICAM3; INSR; JAK3; KLK3; LDLR; LHB; LIG1; LOH19CR1; LYL1; MAN2B1; MCOLN1; MDRV; MLLT1; NOTCH3; NPHS1; OFC3; OPA3; PEPD; PRPF31; PRTN3; PRX; PSG1; PVR; RYR1; SLC5A5; SLC7A9; STK11; TBXA2R; TGFB1; TNNI3; TYROBP; ADA; AHCY; AVP; CDAN2; CDPD1; CHED1; CHED2; CHRNA4; CST3; EDN3; EEGV1; FTLL1; GDF5; GNAS; GSS; HNF4A; JAG1; KCNQ2; MKKS; NBIA1; PCK1; PI3; PPCD; PPGB; PRNP; THBD; TOP1; AIRE; APP; CBS; COL6A1; COL6A2; CSTB; DCR; DSCR1; FPDMM; HLCS; HPE1; ITGB2; KCNE1; KNO; PRSS7; RUNX1; SOD1; TAM; ADSL; ARSA; BCR; CECR; CHEK2; COMT; CRYBB2; CSF2RB; CTHM; CYP2D6; CYP2D7P1; DGCR; DIA1; EWSR1; GGT1; MGCR; MN1; NAGA; NF2; OGS2; PDGFB; PPARA; PRODH; SCO2; SCZD4; SERPIND1; SLC5A1; SOX10; TCN2; TIMP3; TST; VCF; ABCD1; ACTL1; ADFN; AGMX2; AHDS; AIC; AIED; AIH3; ALAS2; AMCD; AMELX; ANOP1; AR; ARAF1; ARSC2; ARSE; ARTS; ARX; ASAT; ASSP5; ATP7A; ATRX; AVPR2; BFLS; BGN; BTK; BZX; C1HR; CACNA1F; CALB3; CBBM; CCT; CDR1; CFNS; CGF1; CHM; CHR39C; CIDX; CLA2; CLCN5; CLS; CMTX2; CMTX3; CND; COD1; COD2; COL4A5; COL4A6; CPX; CVD1; CYBB; DCX; DFN2; DFN4; DFN6; DHOF; DIAPH2; DKC1; DMD; DSS; DYT3; EBM; EBP; ED1; ELK1; EMD; EVR2; F8; F9; FCP1; FDPSL5; FGD1; FGS1; FMR1; FMR2; G6PD; GABRA3; GATA1; GDI1; GDXY; GJB1; GK; GLA; GPC3; GRPR; GTD; GUST; HMS1; HPRT1; HPT; HTC2; HTR2C; HYR; IDS; IHG1; IL2RG; INDX; IP1; IP2; JMS; KAL1; KFSD; L1CAM; LAMP2; MAA; MAFD2; MAOA; MAOB; MCF2; MCS; MEAX; MECP2; MF4; MGC1; MIC5; MID1; MLLT7; MLS; MRSD; MRX14; MRX1; MRX20; MRX2; MRX3; MRX40; MRXA; MSD; MTM1; MYCL2; MYP1; NDP; NHS; NPHL1; NR0B1; NSX; NYS1; NYX; OA1; OASD; OCRL; ODT1; OFD1; OPA2; OPD1; OPEM; OPN1LW; OPN1MW; OTC; P3; PDHA1; PDR; PFC; PFKFB1; PGK1; PGK1P1; PGS; PHEX; PHKA1; PHKA2; PHP; PIGA; PLP1; POF1; POLA; POU3F4; PPMX; PRD; PRPS1; PRPS2; PRS; RCCP2; RENBP; RENS1; RP2; RP6; RPGR; RPS4X; RPS6KA3; RS1; S11; SDYS; SEDL; SERPINA7; SH2D1A; SHFM2; SLC25A5; SMAX2; SRPX; SRS; STS; SYN1; SYP; TAF1; TAZ; TBX22; TDD; TFE3; THAS; THC; TIMM8A; TIMP1; TKCR; TNFSF5; UBE1; UBE2A; WAS; WSN; WTS; WWS; XIC; XIST; XK; XM; XS; ZFX; ZIC3; ZNF261; ZNF41; ZNF6; AMELY; ASSP6; AZF1; AZF2; DAZ; GCY; RPS4Y; SMCY; SRY; ZFY; ABAT; AEZ; AFA; AFD1; ASAH1; ASD1; ASMT; CCAT; CECR9; CEPA; CLA3; CLN4; CSF2RA; CTS1; DF; DIH1; DWS; DYT2; DYT4; EBR3; ECT; EEF1A1L14; EYCL2; FANCB; GCSH; GCSL; GIP; GTS; HHG; HMI; HOAC; HOKPP2; HRPT1; HSD3B3; HTC1; HV1S; ICHQ; ICR1; ICR5; IL3RA; KAL2; KMS; KRT18; KSS; LCAT; LHON; LIMM; MANBB; MCPH2; MEB; MELAS; MIC2; MPFD; MS; MSS; MTATP6; MTCO1; MTCO3; MTCYB; MTND1; MTND2; MTND4; MTND5; MTND6; MTRNR1; MTRNR2; MTTE; MTTG; MTTI; MTTK; MTTL1; MTTL2; MTTN; MTTP; MTTS1; NAMSD; OCD1; OPD2; PCK2; PCLD; PCOS1; PFKM; PKD3; PRCA1; PRO1; PROP1; RBS; RFXAP; RP; SHOX; SLC25A6; SPG5B; STO; SUOX; THM; ili TTD.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za lečenje anemije kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira eritropojetin, čime se leči anemija kod pacijenta. U još jednom rešenju, in vitro sintetisani molekul RNK dalje sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave. U još jednom rešenju, navedena ćelija je ćelija potkožnog tkiva. U još jednom rešenju, navedena ćelija je ćelija pluća. U još jednom rešenju, navedena ćelija je fibroblast. U još jednom rešenju, navedena ćelija je limfocit. U još jednom rešenju, navedena ćelija je glatka mišićna ćelija. U još jednom rešenju, navedena ćelija je bilo koja druga vrsta ćelije koja je u struci poznata. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za lečenje vazospazma kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira inducibilnu azot oksid sintazu (iNOS), čime se leči vazospazam kod pacijenta.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak kojim se unapređuje stopa preživljavanja ćelije kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije sa in vitro
1
sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira protein termičkog šoka, čime se unapređuje stopa preživljavanja ćelije kod pacijenta.
U još jednom rešenju, ćelija čija se stopa preživljavanja unapređuje je ćelija pogođena ishemijom. U još jednom rešenju, navedena ćelija nije pogođena ishemijom. U još jednom rešenju, navedena ćelija je izložena ishemijskom okruženju. U još jednom rešenju, navedena ćelija je izložena stresu iz okruženja. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak kojim se smanjuje incidencija ponovne stenoze krvnog suda nakon procedure povećavanja tog krvnog suda, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije krvnog suda sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani RNK molekul kodira protein termičkog šoka, čime se smanjuje incidencija ponovne stenoze kod pacijenta.
U još jednom rešenju, navedena procedura je angioplastika. U još jednom rešenju, navedena procedura je bilo koja druga u struci poznata procedura kojom se proširuje krvni sud. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak kojim se povećava rast kose iz folikula dlake na koži glave pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije kože glave pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani RNK molekul kodira telomerazu ili imunosupresivni protein, čime se povećava rast kose iz folikula dlake.
U još jednom rešenju, navedeni imunosupresivni protein je α-menaloncit-stimulišući hormon (α-MSH). U još jednom rešenju, navedeni imunosupresivni protein je transformišući faktor rasta β 1 (TGF-β 1). U još jednom rešenju, navedeni imunosupresivni protein je insulinusličan faktor rasta I (IGF-I). U još jednom rešenju, navedeni imunosupresivni protein je bilo koji drugi imunosupresivni protein koji je u struci poznat. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za indukciju ekspresije enzima sa antioksidantnom aktivnošću u ćeliji, koji podrazumeva dovođenje u dodir te ćelije sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani RNK molekul kodira taj enzim, čime se indukuje ekspresija enzima sa antioksidantnom aktivnošću u ćeliji. U još jednom rešenju, navedeni enzim je katalaza. U još jednom rešenju, navedeni enzim je glutation peroksidaza. U još jednom rešenju, navedeni enzim je fosfolipid hidrokperoksid glutation peroksidaza. U još jednom rešenju, navedeni enzim je superoksid dizmutaza 1. U još jednom rešenju, navedeni enzim je superoksid dizmutaza 2. U još jednom rešenju, navedeni enzim je
2
bilo koji drugi enzim sa antioksidantnom aktivnošću koji je poznat u struci. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za lečenje cistične fibroze kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije tog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani RNK molekul kodira transmembranski regulator provodljivosti cistične fibroze (CFTR), čime se leči cistična fibroza kod pacijenta. U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za lečenje agamaglobulinemije povezane sa X hromozomom kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira Brutonovu tirozin kinazu, čime se leči X-vezana agamaglobulinemija.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za lečenje ozbiljne kombinovane imunodeficijencije uzrokovane adenozin deaminazom (ADA SCID) kod pacijenta, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira ADA, čime se leči ADA SCID. U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za smanjenje imunog odgovora kože i poboljšanje patologije kože, koji podrazumeva dovođenje u dodir ćelije datog pacijenta sa in vitro sintetisanim molekulom RNK, gde navedeni in vitro sintetisani molekul RNK kodira ekto-nukleozid trifosfat difosfohidrolazu, čime se smanjuje imuni odgovor kože i unapređuje patologija kože.
U još jednom rešenju, iRNK molekul ili ribonukleotidni molekul prema predmetnom pronalasku je enkapsuliran u nanočesticu. Postupci za pakovanje u nanočestice su dobro poznati u struci i opisani su, na primer, u Bose S, et al (Role of Nucleolin in Human Parainfluenza Virus Type 3 Infection of Human Lung Epithelial Cells. J. Virol.78:8146.2004); Dong Y et al. Poly(d,l-lactide-co-glycolide)/montmorillonite nanoparticles for oral delivery of anticancer drugs. Biomaterials 26:6068.2005); Lobenberg R. et al (Improved body distribution of 14C-labelled AZT bound to nanoparticles in rats determined by radioluminography. J Drug Target 5:171. 1998); Sakuma SR et al (Mucoadhesion of polystyrene nanoparticles having surface hydrophilic polymeric chains in the gastrointestinal tract. Int J Pharm 177:161.1999); Virovic L et al. Novel delivery methods for treatment of viral hepatitis: an update. Expert Opin Drug Deliv 2:707.2005); and Zimmermann E et al, Electrolyte- and pH-stabilities of aqueous solid lipid nanoparticle (SLN) dispersions in artificial gastrointestinal media. Eur J Pharm Biopharm 52:203.2001).
Za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku, moguća su različita rešenja opsega doza za jedinjenja za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku. U jednom rešenju, doza se kreće u opsegu od 1-10 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 2-10 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 3-10 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 5-10 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 2-20 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 3-20 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 5-20 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 10-20 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 3-40 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 5-40 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 10-40 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 20-40 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 5-50 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 10-50 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 20-50 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 1-100 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 2-100 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 3-100 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 5-100 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 10-100 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 20-100 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 40-100 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 60-100 µg/dan.
U još jednom rešenju, doza je 0,1 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 0,2 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 0,3 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 0,5 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 1 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 2 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 3 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 5 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 10 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 15 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 20 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 30 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 40 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 60 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 80 µg/dan. U još jednom rešenju, doza je 100 µg/dan.
U još jednom rešenju, doza je 10 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 20 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 30 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 40 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 60 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 80 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 100 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 150 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 200 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 300 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 400 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 600 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 800 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 1000 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 1,5 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 3 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 5 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 10 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 15 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 20 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 30 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 50 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 80 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 100 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 10-20 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 20-30 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 20-40 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 30-60 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 40-80
4
µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 50-100 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 50-150 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 100-200 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 200-300 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 300-400 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 400-600 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 500-800 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 800-1000 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 1000-1500 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 1500-2000 µg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2-3 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2-5 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2-10 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2-20 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2-30 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2-50 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2-80 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 2-100 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 3-10 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 3-20 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 3-30 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 3-50 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 3-80 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 3-100 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 5-10 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 5-20 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 5-30 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 5-50 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 5-80 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 5-100 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 10-20 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 10-30 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 10-50 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 10-80 mg/dozi. U još jednom rešenju, doza je 10-100 mg/dozi.
U još jednom rešenju, doza je dnevna doza. U još jednom rešenju, doza je nedeljna doza. U još jednom rešenju, doza je mesečna doza. U još jednom rešenju, doza je godišnja doza. U još jednom rešenju, doza je jedna u seriji definisanog broja doza. U još jednom rešenju, doza je pojedinačna doza koja se daje samo jedanput. Kao što je opisano ispod, u još jednom rešenju, prednost iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula za inventivnu upotrebu leži u njihovoj većoj snazi dejstva, što omogućava upotrebu manjih doza.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za proizvodnju rekombinantnog proteina, koji podrazumeva dovođenje u dodir in vitro translacionog aparata sa in vitro sintetisanim oligoribonukleotidom, gde navedeni in vitro sintetisani oligoribonukleotid sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, čime se dobija rekombinantni protein. U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za proizvodnju rekombinantnog proteina, koji podrazumeva dovođenje u dodir in vitro translacionog aparata sa in vitro transkribovanim RNK molekulom opisanim u predmetnoj prijavi, gde navedeni in vitro transkribovani RNK molekul sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, čime se dobija rekombinantni protein.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje in vitro aparat za transkripciju koji sadrži: nemodifikovani nukleotid, nukleotid koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, i polimerazu. U predmetnoj prijavi je opisan in vitro komplet za transkripciju koji sadrži: nemodifikovani nukleotid, nukleotid koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid, i polimerazu. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave. U još jednom rešenju, in vitro translacioni aparat sadrži lizat retikulocita. U još jednom rešenju, lizat retikulocita jeste lizat zečjih retikulocita.
U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje imunogeničnosti oligoribonukleotidnog molekula ili molekula iRNK, gde navedeni postupak podrazumeva korak zamene nukleotida u oligoribonukleotidnom molekulu ili molekulu iRNK modifikovanim nukleotidom koji sadrži modifikovani nukleozid ili pseudouridin, čime se smanjuje imunogeničnost oligoribonukleotidnog molekula ili molekula iRNK.
U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje imunogeničnosti vektora za gensku terapiju koji sadrži poliribonukleotidni molekul ili molekul iRNK, gde navedeni postupak podrazumeva korak zamene nukleotida u poliribonukleotidnom molekulu ili molekulu iRNK modifikovanim nukleotidom koji sadrži modifikovani nukleozid ili pseudouridin, čime se smanjuje imunogeničnost vektora za gensku terapiju.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za unapređenje in vitro translacije oligoribonukleotidnog molekula ili molekula RNK, gde navedeni postupak podrazumeva korak zamene nukleotida u oligoribonukleotidnom molekulu ili molekulu RNK modifikovanim nukleotidom koji sadrži modifikovani nukleozid ili pseudouridin, čime se unapređuje in vitro translacija oligoribonukleotidnog molekula ili molekula RNK. U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za unapređenje in vitro translacije vektora genske terapije koji sadrži poliribonukleotidni molekul ili molekul RNK, gde navedeni postupak podrazumeva korak zamene nukleotida u poliribonukleotidnom molekulu ili molekulu RNK modifikovanim nukleotidom koji sadrži modifikovani nukleozid ili pseudouridin, čime se unapređuje in vitro translacija vektora genske terapije.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za povećanje efikasnosti dopremanja rekombinantnog proteina putem vektora za gensku terapiju koji sadrži poliribonukleotidni molekul ili molekul RNK, gde navedeni postupak podrazumeva korak zamene nukleotida u poliribonukleotidnom molekulu ili molekulu RNK modifikovanim nukleotidom koji sadrži modifikovani nukleozid ili pseudouridin, čime se povećava efikasnost dopremanja rekombinantnog proteina putem vektora za gensku terapiju.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za povećanje in vitro stabilnosti vektora za gensku terapiju koji sadrži poliribonukleotidni molekul ili molekul RNK, gde navedeni postupak podrazumeva korak zamene nukleotida u poliribonukleotidnom molekulu ili molekulu RNK modifikovanim nukleotidom koji sadrži modifikovani nukleozid ili pseudouridin, čime se povećava stabilnost vektora za gensku terapiju in vitro.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za sintezu in vitro transkribovanog RNK molekula koji sadrži pseudouridinski nukleozid, koji podrazumeva dovođenje u dodir izolovane polimeraze sa smešom nemodifikovanih nukleotida i modifikovanog nukleotida (primeri 2 i 7).
U još jednom rešenju, postupci in vitro transkripcije prema predmetnom pronalasku koriste ekstrakte životinjskih ćelija. U još jednom rešenju, navedeni ekstrakt je iz retikulocita ili ćelija sa sličnom efikasnošću in vitro transkripcije. U još jednom rešenju, navedeni ekstrakt je iz bilo koje druge vrste ćelije koja je u struci poznata. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za unapređenje imunog odgovora na antigen, koji podrazumeva davanje antigena u kombinaciji sa mitohondrijalnom (mt)RNK (primeri 1 i 5). U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje sposobnosti RNK molekula da stimuliše dendritske ćelije (DC), koji podrazumeva modifikaciju nukleozida RNK molekula primenom predmetnog pronalaska (primeri).
U još jednom rešenju, navedena DC je DC1 ćelija. U još jednom rešenju, navedena DC je DC2 ćelija. U još jednom rešenju, DC je podtip DC1 ćelije ili DC2 ćelije. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje sposobnosti RNK molekula da stimuliše signalizaciju preko TLR3, koji podrazumeva modifikaciju nukleozida RNK molekula primenom predmetnog pronalaska. U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje sposobnosti RNK molekula da stimuliše signalizaciju preko TLR7, koji podrazumeva modifikaciju nukleozida RNK molekula primenom predmetnog pronalaska. U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje sposobnosti RNK molekula da stimuliše signalizaciju preko TLR8, koji podrazumeva modifikaciju nukleozida RNK molekula primenom predmetnog pronalaska. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, međunukleotidne veze u iRNK, oligoribonukleotidnom ili poliribonukleotidnom molekulu za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku su fosfodiestarske. U još jednom rešenju, međunukleotidne veze su dominantno fosfodiestarske.
U još jednom rešenju, većina međunukleotidnih veza su fosforotioatne. U još jednom rešenju, većina međunukleotidnih veza su fosfodiestarske. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetnog pronalaska.
U još jednom rešenju, procenat međunukleotidnih veza koje su fosfodiestarske je iznad 50%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 10%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 15%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 20%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 25%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 30%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 35%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 40%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 45%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 55%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 60%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 65%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 70%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 75%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 80%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 85%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 90%. U još jednom rešenju, taj procenat je iznad 95%.
U još jednom rešenju, inventivna upotreba prema predmetnom pronalasku podrazumeva povećanje broja, procenta ili učestalosti modifikovanih nukleozida u RNK molekulu radi smanjenja imunogeničnosti ili povećanja efikasnosti translacije. Kao što je ovde opisano, broj ostataka u molekulu iRNK, oligoribonukleotidnom ili poliribonukleotidnom molekulu određuje, u još jednom rešenju, red veličine uočenih efekata prema predmetnom pronalasku.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak kojim se u ćeliju pacijenta uvodi rekombinantni protein, koji podrazumeva dovođenje u dodir pacijenta sa in vitro transkribovanim molekulom RNK koji kodira rekombinantni protein, gde navedeni in vitro transkribovani molekul RNK dalje sadrži modifikovani nukleozid, čime se u ćeliju pacijenta uvodi rekombinantni protein.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za smanjenje proizvodnje TNF-α u odgovor na vektor genske terapije kod pacijenta, koji podrazumeva korak projektovanja vektora tako da sadrži pseudouridin ili modifikovanu nukleozidnu bazu, čime se smanjuje proizvodnja TNF-α u odgovor na vektor genske terapije kod pacijenta. U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za smanjenje proizvodnje IL-12 u odgovor na vektor genske terapije kod pacijenta, koji podrazumeva korak projektovanja vektora tako da sadrži pseudouridin ili modifikovanu nukleozidnu bazu, čime se smanjuje proizvodnja IL-12 u odgovor na vektor genske terapije kod pacijenta. U još jednom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje imunogeničnosti vektora genske terapije, koji podrazumeva uvođenje modifikovanog nukleozida u navedeni vektor genske terapije, čime se smanjuje imunogeničnost vektora genske terapije.
Kao što je ovde opisano, rezultati predmetnog pronalaska pokazuju da primarne DC imaju dodatni signalizacioni put za RNK koji prepoznaje RNK sa modifikovanim m<5>C i m<6>A, a čija se signalizacija inhibira modifikacijom U ostataka. U još jednom rešenju, prednost iRNK, oligoribonukleotidnih i poliribonukleotidnih molekula za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku jeste da se RNK ne ugrađuje u genom (za razliku od vektora na bazi DNK). U još jednom rešenju, prednost je da je translacija RNK, te stoga i pojava proizvoda koji ona kodira, trenutna. U još jednom rešenju, prednost je da količina proteina koja nastane iz iRNK može da se reguliše dopremanjem manje ili veće količine RNK. U još jednom rešenju, prednost je da bi ponavljano dopremanje nemodifikovane RNK moglo da dovede do autoimunih reakcija.
U još jednom rešenju, prednost je izostanak imunogeničnosti, čime se omogućava ponavljano dopremanje bez stvaranja zapaljenskih citokina.
U još jednom rešenju, stabilnost RNK se povećava ciruklarizacijom, čime se smanjuje degradacija dejstvom egzonukleaza.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za lečenje pacijenta sa bolešću koja podrazumeva imuni odgovor na sopstvene RNK molekule, a koji podrazumeva davanje antagonista TLR-3 molekula pacijentu, čime se kod pacijenta leči bolest koja podrazumeva imuni odgovor usmeren ka sopstvenim RNK molekulima.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za lečenje pacijenta sa bolešću koja podrazumeva imuni odgovor na sopstvene RNK molekule, a koji podrazumeva davanje antagonista TLR-7 molekula pacijentu, čime se kod pacijenta leči bolest koja podrazumeva imuni odgovor usmeren ka sopstvenim RNK molekulima.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje postupak za lečenje pacijenta sa bolešću koja podrazumeva imuni odgovor na sopstvene RNK molekule, a koji podrazumeva davanje antagonista TLR-8 molekula pacijentu, čime se kod pacijenta leči bolest koja podrazumeva imuni odgovor usmeren ka sopstvenim RNK molekulima.
U još jednom rešenju, bolest koja podrazumeva imuni odgovor na sopstvene RNK molekule jeste autoimuna bolest. U još jednom rešenju, ta bolest je sistemski lupus eritematozus (SLE). U još jednom rešenju, ta bolest je druga bolest poznata u struci, koja podrazumeva imuni odgovor na sopstveni RNK molekul. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje komplet koji sadrži reagens koji se koristi za izvođenje postupka prema predmetnom pronalasku. U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje komplet koji sadrži preparat, alat ili instrument prema predmetnom pronalasku.
U još jednom rešenju, predmetna prijava opisuje komplet za merenje ili ispitivanje signalizacije preko TLR3, TLR7 ili TLR8 receptora, kao što je opisano u primeru 4.
U još jednom rešenju, protokol tretmana koji opisuje predmetna prijava je terapeutski. U još jednom rešenju, taj protokol je profilaktički. Svaka od mogućnosti predstavlja odvojeno rešenje predmetne prijave. U jednom rešenju, izraz „dovođenje u dodir ćelije“ ili „dovođenje u dodir populacije“ odnosi se na način izlaganja, koji može biti neposredan ili posredan. U jednom postupku, takav kontakt podrazumeva direktno ubrizgavanje ćelije na bilo koji način koji je u struci poznat, kao što je pomoću mikroinjekcije. U još jednom rešenju, dopremanje u ćeliju je posredno, kao što je putem obezbeđenja podloge koja okružuje ćeliju, ili putem davanja pacijentu, ili bilo kojim drugim putem koji je u struci poznat. U još jednom rešenju, izraz „dovođenje u dodir“ znači da se molekul prema predmetnom pronalasku uvodi u pacijenta koji prima tretman, te se omogućava da taj molekul dođe u dodir sa ćelijom in vivo. Postupci za kvantitativno određivanje frekvencije retikulocita i za merenje biološke aktivnosti EPO su dobro poznati u struci i opisani su, na primer, u Ramos, AS et al (Biological evaluation of recombinant human erythropoietin in pharmaceutical products. Braz J Med Biol Res 36:1561).
Preparati za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku mogu, u još jednom rešenju, da se primenjuju kod pacijenta bilo kojim postupkom primene koji je poznat stručnjaku u ovoj oblasti, kao što su parenteralna primena, parakanceralna, transmukozalna, transdermalna, intramuskularna, intravenska, intradermalna, potkožna, intraperitonealna, intraventrikularna, intrakranijalna, intravaginalna ili intratumoralna primena.
U još jednom rešenju upotreba i preparata za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku, preparati se primenjuju oralno, pa su stoga formulisani u obliku koji je pogodan za oralnu primenu, tj. kao čvrsti ili tečni preparati. Pogodne čvrste oralne formulacije obuhvataju tablete, kapsule, pilule, granule, pelete i slično. Pogodne tečne oralne formulacije obuhvataju rastvore, suspenzije, disperzije, emulzije, ulja i slično. U još jednom rešenju prema predmetnom pronalasku, aktivni sastojak je formulisan u kapsuli. U skladu sa ovim rešenjem, preparat prema predmetnom pronalasku sadrži, uz aktivno jedinjenje i inertni nosilac ili diluent, i kapsulu od tvrdog želatina.
U drugim rešenjima, farmaceutski preparati se primenjuju intravenskom, intraarterijalnom ili intramuskularnom injekcijom tečnog preparata. Pogodne tečne formulacije
4
obuhvataju rastvore, suspenzije, disperzije, emulzije, ulja i slično. U još jednom rešenju, farmaceutski preparati se primenjuju intravenski i stoga su formulisani u obliku koji je pogodan za intravensku primenu. U još jednom rešenju, farmaceutski preparati se primenjuju intraarterijalno i stoga su formulisani u obliku koji je pogodan za intraarterijalnu primenu. U još jednom rešenju, farmaceutski preparati se primenjuju intramuskularno i stoga su formulisani u obliku koji je pogodan za intramuskularnu primenu.
U još jednom rešenju, farmaceutski preparati se primenjuju topijski i stoga su formulisani u obliku koji je pogodan za topijsku primenu. Pogodne topijske formulacije obuhvataju gelove, masti, kreme, losione, kapi i slične. Za topijsku primenu, preparati ili njihovi fiziološki podnošljivi derivati se pripremaju i nanose kao rastvori, suspenzije ili emulzije u fiziološki prihvatljivom razblaživaču sa ili bez farmaceutskog nosioca.
U još jednom rešenju, preparat se primenjuje kao supozitorija, na primer, kao rektalna supozitorija ili uretralna supozitorija. U još jednom rešenju, farmaceutski preparat se primenjuje potkožnom implantacijom peleta. U još jednom rešenju, pelet obezbeđuje kontrolisano otpuštanje sredstva tokom nekog vremenskog perioda. U još jednom rešenju, aktivno jedinjenje se doprema unutar vezikule, npr. unutar lipozoma (videti Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., u Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein & Fidler (urednici), Liss, New York, str. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., str.317-327; videti, generalno, ibid). U značenju u kom se koristi u predmetnoj prijavi, izraz „farmaceutski prihvatljivi nosioci ili razblaživači“ dobro je poznat stručnjacima u ovoj oblasti. U različitim rešenjima, nosilac ili razblaživač mogu da budu čvrsti nosilac ili razblaživač za čvrste formulacije, tečni nosilac ili razblaživač za tečne formulacije ili njihove smeše.
U još jednom rešenju, čvrsti nosioci/razblaživači obuhvataju, ali nisu ograničeni na gumu, skrob (npr. kukuruzni skrob, pregelirani skrob), šećer (npr. laktozu, manitol, saharozu, dekstrozu), celulozni materijal (npr. mikrokristalnu celulozu), akrilat (npr. polimetilakrilat), kalcijum karbonat, magnezijum oksid, talk ili njihove smeše. U drugim rešenjima, farmaceutski prihvatljivi nosioci za tečne formulacije mogu da budu vodeni ili nevodeni rastvori, suspenzije, emulzije ili ulja. Primeri nevodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol i organski estri pogodni za injekcije, kao što je etil oleat. Vodeni nosioci obuhvataju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući vodene rastvore soli i puferisane podloge. Primeri ulja su ulja poreklom iz nafte, životinjskog porekla, biljnog porekla ili sintetskog porekla, na primer, kikiriki ulje, sojino ulje, mineralno ulje, maslinovo ulje, suncokretovo ulje i ulje iz riblje jetre. Parenteralni nosioci (za potkožnu, intravensku, intraarterijalnu ili intramuskularnu injekciju) obuhvataju rastvore natrijum hlorida, Ringerove dekstroze, dekstroze i natrijum hlorida, laktatni Ringerov rastvor i fiksirana ulja. Intravenski nosioci obuhvataju sredstva za nadoknađivanje tečnosti i nutrijenata, sredstva za nadoknađivanje elektrolita kao što su ona u Ringerovoj dekstrozi, i slično. Primer su sterilne tečnosti kao što su voda i ulja, sa ili bez dodatka surfaktanta i drugih farmaceutski prihvatljivih adjuvanasa. Uopšteno posmatrano, voda, rastvor soli, vodeni rastvor dekstroze i srodni rastvori šećera, i glikoli kao što su propilen glikoli ili polietilen glikol su poželjni tečni nosioci, posebno za rastvore koji se primenjuju injekciono. Primeri ulja su ulja poreklom iz nafte, životinjskog porekla, biljnog porekla ili sintetskog porekla, na primer, kikiriki ulje, sojino ulje, mineralno ulje, maslinovo ulje, suncokretovo ulje i ulje iz riblje jetre.
U još jednom rešenju, preparati dalje sadrže vezivna sredstva (npr. gumu akacija, kukuruzni skrob, želatin, karbomer, etil celulozu, guar gumu, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metil celulozu, povidon), sredstava za dezintegraciju (npr. kukuruzni skrob, krompirov skrob, alginsku kiselinu, silicijum dioksid, krokskarmelozu natrijum, krospovidon, guar gumu, natrijum skrob glikolat), pufere (npr. Tris-HCl, acetatni, fosfatni) različitih pH i jonske snage, aditive kao što su albumin ili želatin kako bi se sprečila apsorpcija za površine, detergente (npr. Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, soli žučnih kiselina), inhibitore proteaza, surfaktante (npr. natrijum lauril sulfat), pojačivače permeacije, sredstva za solubilizaciju (npr. glicerol, polietilen glicerol), antioksidanse (npr. askorbinsku kiselinu, natrijum metabisulfit, butilovani hidroksianizol), stabilizatore (npr. hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metil celulozu), sredstva za povećanje viskoziteta (npr. karbomer, koloidni silicijum dioksid, etil celulozu, guar gumu), zaslađivače (npr. aspartam, limunsku kiselinu), konzervanse (npr. timerosal, benzil alkohol, parabene), lubrikanse (npr. stearinsku kiselinu, magnezijum stearat, polietilen glikol, natrijum lauril sulfat), sredstava za poboljšavanje protočnosti (npr. koloidni silicijum dioksid), sredstva za plastifikaciju (npr. dietil ftalat, trietil citrat), emulgatore (npr. karbomer, hidroksipropil celulozu, natrijum lauril sulfat), polimerne premaze (npr. poloksamere ili poloksamine), premaze i sredstva koja grade filmove (npr. etil celulozu, akrilate, polimetakrilate) i(ili) adjuvanse.
U još jednom rešenju, farmaceutski preparati za inventivnu upotrebu prema predmetnoj prijavi su preparati sa kontrolisanim otpuštanjem, tj. preparati kod kojih se jedinjenje otpušta tokom nekog vremenskog perioda nakon primene. Preparati sa kontrolisanim ili održavanim otpuštanjem obuhvataju formulacije u lipofilnim depoima (npr. masnim kiselinama, voskovima, uljima). U još jednom rešenju, preparat je preparat sa trenutnim otpuštanjem, tj. preparat kod kog se celokupna količina jedinjenja otpušta odmah nakon primene.
U još jednom rešenju, molekuli za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku su modifikovani kovalentnim vezivanjem polimera rastvornih u vodi, kao što su polietilen glikol, kopolimeri polietilen glikola i polipropilen glikola, karboksimetil celuloza, dekstran, polivinil alkohol, polivinilpirolidon ili poliprolin. Poznato je da modifikovana jedinjenja pokazuju značajno duži poluživot u krvi nakon intravenske injekcije, od odgovarajućih nemodifikovanih jedinjenja (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982; and Katre et al., 1987). Takve modifikacije takođe povećavaju, u još jednom rešenju, rastvorljivost jedinjenja u vodenom rastvoru, eliminišu agregaciju, unapređuju fizičku i hemijsku stabilnost jedinjenja i umnogome smanjuju imunogeničnost i reaktivnost jedinjenja. Kao posledica svega toga, željena in vivo biološka aktivnost može se postići primenom takvih adukta polimer-jedinjenje sa nižom učestalošću ili u manjim dozama nego što je to slučaj sa nemodifikovanim jedinjenjima.
Aktivni sastojak, u još jednom primeru, je formulisan u preparat u obliku neutralisane, farmaceutski prihvatljive soli. Farmaceutski prihvatljive soli obuhvataju adicione soli kiselina (formirane sa slobodnim amino grupama polipeptidnog molekula ili molekula antitela), koje se grade sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili sa organskim kiselinama kao što su sirćetna, oksalna, vinska, bademova i slične kiseline. Soli formirane iz slobodnih karboksilnih grupa takođe mogu da budu izvedene iz neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum, ili gvožđe hidroksidi, kao i iz organskih baza kao što su izopropilamin, trimetilamin, 2-etilamino etanol, histidin, prokain i slične.
Eksperimentalni deo
Primer 1: Molekuli RNK koji se javljaju u prirodi pokazuju diferencijalne sposobnosti za aktivaciju dendritskih ćelija
Materijal i eksperimentalni postupci
Plazmidi i reagensi
Plazmidi pT7T3D-MART-1 i pUNO-hTLR3 su nabavljeni od kompanija ATCC (Manassas, VA) i InvivoGen (San Diego, CA), redom. pTEVluc je nabavljena od dr Danijela Galija (UC Riverside), a sadrži pT7-TEV (vodeća sekvenca iz genomske RNK virusa nazubljenosti duvana)-luciferaza-A50, a opisana je u publikaciji Gallie, DR et al, 1995. Lider
4
sekvenca 5' kraja i poli(A) rep virusa nazubljenosti duvana su funkcionalno sinergistični regulatori translacije. Gen 165:233) pSVren je generisan iz p2luc (Grentzmann G, Ingram JA, et al, A dual-luciferase reporter system for studying recoding signals. RNA 1998;4(4): 479-86) uklanjanjem sekvence koja kodira luciferazu svica BAMHI i NotI digestijom, popunjavanjem krajeva i ponovnom ligacijom.
Humana TLR3-specifična siRNK, pTLR3-sh je konstruisana ubacivanjem sintetske shRNK koja kodira ODN sa homologijom sa humanim TLR3 dugačkom 20-nt (nt 703-722, red. br.: NM_003265) u plazmid pSilencer 4.1-CMV-neo (Ambion, Austin, TX). pCMV-hTLR3 je dobijen prvo kloniranjem hTLR3-specifičnog PCR proizvoda (nt 80-2887; red. br. NM_003265) u pCRII-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), a potom oslobađanjem Nhe I-Hind III isecanjem, pa potkloniranjem odgovarajućih mesta u pcDNA3.1 (Invitrogen). LPS (E. coli 055:B5) je nabavljena od Sigma Chemical Co, St. Louis, MO. CpG ODN- 2006 i R-848 su nabavljeni od InvivoGen.
Ćelije i ćelijske kulture
Humane embrionske 293 ćelije bubrega (ATCC) su gajene u DMEM podlozi uz suplementaciju glutamina (Invitrogen) i 10% FCS (Hyclone, Ogden, UT) (kompletna podloga). U svim slučajevima, u predmetnoj prijavi, oznaka „293 ćelije“ se odnosi na humane embrionske 293 ćelije bubrega (eng. human embryonic kidney (HEK) 293 cells).293-hTLR3 ćelijska linija je generisana transformacijom 293 ćelija pomoću pUNO-hTLR3. Ćelijske linije 293-hTLR7, 293-hTLR8 i 293-hTLR9 (InvivoGen) gajene su u kompletnoj podlozi uz suplementaciju blasticidinom (10 µg/ml) (Invivogen). Ćelijske linije 293-ELAM-luc i TLR7-293 (M. Lamphier, Eisai Research Institute, Andover MA), kao i TLR3-293 gajene su u kulturi, kao što je opisno (Kariko et al, 2004, mRNA is an endogenous ligand for Toll-like receptor 3. J Biol Chem 279: 12542-12550). Ćelijske linije 293, 293-hTLR7 i 293-hTLR8 su stabilno transficirane sa pTLR3-sh te selekcionisane pomoću G-418 (400 µg/ml) (Invitrogen). Neorezistentne kolonije su podvrgnute skriningu, pa su samo one koje nisu eksprimirale TLR3, što je utvrđeno kao izostanak sekrecije IL-8 u odgovor na poli(I):(C), korišćene u daljim ispitivanjima. Uzorci za leukoforezu su dobijeni od dobrovoljaca koji nisu inficirani HIV-om, kroz protokol sa odobrenjem IRB.
Generisanje mišjih DC
Mišje DC su generisane sakupljanjem ćelija kostne srži iz tibija i femura C57BL/6 miševa starih 6-8 nedelja, te liziranjem eritrocita. Ćelije su zasejane na ploče sa po 6 polja gustinom 10<6>ćelija po polju u 2 ml DMEM 10% FCS i 20 ng/ml muGM-CSF (R&D Systems). Trećeg dana, dodato je 2 ml sveže podloge sa muGM-CSF. Šestog dana, odvojeno je 2 ml podloge po polju, pa su ćelije centrifugirane i resuspendovane u svežoj podlozi sa muGM-CSF. Sedmog dana gajenja kulture, muDC ćelije su sakupljene i isprane.
Prirodna RNK
Mitohondrije su izolovane iz trombocita dobijenih iz Banke krvi Univerziteta u Pensilvaniji, pomoću procedure lize sa frakcionisanjem (Mitochondria isolation kit; Pierce, Rockford, IL). RNK je izolovana iz prečišćenih mitohondrijskih, citoplazmatskih i jedarnih frakcija 293 ćelija, nefrakcionisanih 293 ćelija, mišje TUBO ćelijske linije, i DH5alpha soja E. coli pomoću uređaja Master Blaster® (BioRad, Hercules, CA). Goveđa tRNK, pšenična tRNK, tRNK iz kvasca, tRNK E. coli, poli(A)+ iRNK iz mišjeg srca i poli(I):(C) su kupljeni od kompanije Sigma, ukupna RNK iz humane jetre i in vitro RNK od kompanije Ambion. Oligoribonukleotid-5'-monofosfati su sintetisani hemijski (Dharmacon, Lafayette, CO).
Alikvoti uzoraka RNK su inkubirani u prisustvu benzonaza nukleaze (1 U na 5 µl RNK koncentracije 1 mikrogram po mikrolitru (µg/µl) tokom 1 h) (Novagen, Madison, WI). Alikvoti RNK-730 su digestovani dejstvom alkalne fosfataze (New England Biolabs). Uzorci RNK su analizirani denaturišućom gel elektroforezom na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu, radi osiguranja kvaliteta. Testovi za LPS u preparatima RNK, izvedeni pomoću testa geliranja/zgrušavanja lizata amebocita limulusa, bili su negativni, uz osetljivost od 3 pikograma po mililitru (pg/ml) (University of Pennsylvania, Core Facility).
HPLC analiza
Nukleozid monofosfati su razdvojeni i vizuelizovani na HPLC. Da bi se izdvojili slobodni nukleozid 3'-monofosfati, alikvoti RNK od 5 µg su digestovani pomoću 0,1 U RNkaze T2 (Invitrogen) u 10 µl 50 mM NaOAc i 2 mM EDTA puferu (pH 4,5) preko noći, nakon čega su uzorci ubrizgani u HPLC uređaj Agilent 1100 sa Waters Symmetry C18 kolonom (Waters, Milford, MA). Protok je podešen na 1 ml/min, uz gradijent od 100% pufera A (30 mM KH2PO4i 10 mM tetraetilamonijum fosfata [PicA reagent, Waters], pH 6,0) do 30% pufera B (acetonitril), pa je hromatografija trajala 60 minuta. Nukleotidi su detektovani pomoću fotodiodnog niza na 254 nm. Njihovi identiteti su potvrđeni preko retencionog vremena i spektara.
Testovi dendritskih ćelija
Dendritske ćelije u pločama sa po 96 polja (približno 1,1 x 10<5>ćelija/polju) su tretirane sa R-848, lipofektinom®, ili kompleksom lipofektin®-RNK tokom 1 časa, a potom je podloga promenjena. Nakon 8 h (osim ako je drugačije naznačeno), ćelije su prikupljene, bilo za izolovanje RNK ili za protočnu citometriju, dok je prikupljena podloga u kojoj su gajene podvrgnuta ELISA testu na citokine. Koncentracije IL-12 (p70) (BD Biosciences Pharmingen,
4
San Diego, CA), IFN-α, TNF-α i IL-8 (Biosource International, Camarillo, CA) su merene u supernatantima pomoću sendvič ELISA testa. Kulture su gajene u triplikatu ili kvadriplikatu, a merene u duplikatu.
Nortern blot analiza
RNK je izolovana iz MDDC nakon 8h inkubacije, nakon tretmana koji je prethodno opisan. Tamo gde je to naznačeno, ćelije su tretirane cikloheksamidom, 2,5 µg/ml (Sigma) 30 minuta pre stimulacije, i tokom celog trajanja inkubacije. Uzorci RNK su obrađeni i analizirani Nortern blot analizom kao što je opisano (Kariko et al, 2004, ibid), pomoću proba sa humanim TNF-α i GAPDH izvedenih iz plazmida (pE4 i pHcGAP, redom), dobavljenih od ATCC.
Rezultati
Da bi se utvrdio imunostimulatorni potencijal različitih podtipova ćelijske RNK, RNK je izolovana iz različitih odvojenih delova ćelije (kompartmenta), tj. iz citoplazme, jedra i mitohondrija. Ove frakcije RNK, kao i ukupna RNK, tRNK i iRNK selektovana pomoću poli-A repa, sve dobijene iz sisara, kompleksirane su za lipofektin® i dodate u MDDC. Iako su sisarske ukupna, jedarna i citoplazmatska RNK sve stimulisale MDDC, što se vidi iz lučenja TNF-α koje se moglo detektovati, koncentracije TNF-α bile su mnogo niže od onih koje su indukovale in vitro sintetisane iRNK (slika 1). Štaviše, sisarska tRNK nije indukovala koncentracije TNF-α koje bi mogle da budu detektovane, dok je mitohondrijska (mt) RNK indukovala mnogo više TNF-α od drugih sisarskih podtipova RNK. Ukupna bakterijska RNK takođe se pokazala kao moćan aktivator MDDC; nasuprot tome, bakterijska tRNK je indukovala samo niske koncentracije TNF-α. tRNK iz drugih izvora (kvasac, pšenična klica, govedo) bile su nestimulatorne. Slični rezultati su primećeni i kada su testirane RNK iz drugih sisarskih izvora. Kada su uzorci RNK digestovani sa benzonazom, koja hidrolizuje ssRNK i dsRNK, RNK signalizacija unutar MDDC je prekinuta, što je potvrdilo da je do lučenja TNF-α došlo zbog RNK iz preparata. Aktivacioni potencijal ispitanih tipova RNK pokazao je inverznu korelaciju sa stepenom modifikacije nukleozida. Slični rezultati dobijeni su u eksperimentima opisanim u ovom primeru za obe vrste DC generisanih iz citokina.
Ovi rezultati ukazuju da stepen modifikacije nukleozida utiče na imunogeničnost RNK, pri čemu veći stepen modifikacije ima tendenciju da smanjuje imunogeničnost.
4
Primer 2: in vitro sinteza RNK molekula sa modifikovanim nukleozidima
Materijal i eksperimentalni postupci
In vitro transkribovana RNK
Uz primenu in vitro transkripcionih testova (MessageMachine i MegaScript kompleti; Ambion,) generisane su sledeće dugačke RNK, pomoću T7 RNK polimeraze (RNAP), kao što je opisano (Kariko et al, 1998, Phosphate-enhanced transfection of cationic lipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta 1369, 320-334) (napomena: imena obrazaca naznačena su u zagradama; broj u imenu RNK označava dužinu): RNA-1866 (Nde I-linearizovana pTEVluc) kodira luciferazu svitaca i 50 nt dugačak poli-A rep. RNA-1571 (Ssp I-linearizovana pSVren) kodira Renila luciferazu. RNA-730 (Hind III-linearizovana pT7T3D-MART-1) kodira humani antigen melanoma MART-1. RNA-713 (EcoR I-linearizovana pT7T3D-MART-1) odgovara antisens sekvenci MART-1, RNA-497 (Bgl II-linearizovana pCMVhTLR3) kodira parcijalni 5' fragment hTLR3. Sekvence RNK molekula su sledeće:
RNK-1866:
4
4
RNK-730:
4
Da bi se dobila modifikovana RNK, reakcija transkripcije je postavljena tako da su jedan ili dva osnovna NTP zamenjena odgovarajućim trifosfatnim derivatima modifikovanih nukleotida 5-metilcitidina, 5-metiluridina, 2-tiouridina, N<6>-metiladenozina ili pseudouridina (TriLink, San Diego, CA). U svakoj reakciji transkripcije, sva 4 nukleotida ili njihova derivata bila su prisutna u 7,5 milimolarnoj koncentraciji (mM). U odabranim eksperimentima, kao što je naznačeno, takođe je uključen i 6 mM m7GpppG analog kapice (New England BioLabs, Beverly, MA) kako bi se dobila RNK sa kapicom. ORN5 i ORN6 su generisani pomoću DNK oligodezoksinukleotidnih obrazaca i T7 RNAP (Silencer® siRNA construction kit, Ambion).
Rezultati
Kako bi se dalje ispitali efekti modifikacija nukleozida na imunogeničnost, razvijen je in vitro sistem za dobijanje RNK molekula sa pseudouridinom ili modifikovanim nukleotidima. Izvedene su reakcije in vitro transkripcije u kojima su 1 ili 2 od 4 nukleotid trifosfata (NTP) bila supstituisana odgovarajućim nukleozid-modifikovanim NTP. Transkribovano je nekoliko kompleta RNK sa različitim primarnim sekvencama, čije dužine su se kretale u opsegu od 0,7 do 1,9 kb, te koje su sadržale ili nijedan, 1 ili 2 tipa modifikovanih nukleozida. Modifikovane RNK nisu se mogle razlikovati od odgovarajućih nemodifikovanih molekula po mobilnosti u denaturišućoj gel elektroforezi, što je ukazalo na to da su bile intaktne i da nisu bile modifikovane na drugi način (slika 2A). Procedura je funkcionisala efikasno sa bilo kojom od fagnih polimeraza – T7, SP6 i T3, pa se stoga može generalizovati na širok opseg različitih RNK polimeraza.
Ovi rezultati obezbeđuju nov in vitro sistem za dobijanje RNK molekula sa modifikovanim nukleozidima.
Primer 3: In vitro transkribovana RNK stimuliše humane TLR3, dok modifikacije nukleozida smanjuju imunogeničnost RNK
Materijal i eksperimentalni postupci
Roditeljske 293, 293-hTLR7 i 293-hTLR8 ćelije, koje sve eksprimiraju TLR3-specifičnu siRNK, kao i 293-hTLR9, TLR3-293 ćelije zasejane su u ploče sa 96 polja (5 x 10<4>ćelija/polju) i gajene bez antibiotika. Narednog dana, ćelije su izložene dejstvu R-848 ili RNK kompleksirane sa lipofektinom® (Invitrogen) kao što je opisano (Kariko et al, 1998, ibid). RNK je uklonjena nakon sat vremena (h), pa su ćelije dalje inkubirane u kompletnoj podlozi 7h. Supernatanti su odvojeni radi merenja IL-8.
Rezultati
Da bi se utvrdilo da li modifikacija nukleozida utiče na aktivaciju TLR u kojoj posreduje RNK, humane embrionske ćelije bubrega 293 stabilno su transformisane tako da eksprimiraju humani TLR3. Ćelijske linije su tretirane sa RNK kompleksiranom lipofektinom®, pa je aktivacija TLR praćena kao što je naznačeno, preko oslobađanja interleukina (IL) 8. Ispitano je nekoliko različitih molekula RNK. Nemodifikovana, in vitro transkribovana RNK je izazvala visok nivo lučenja IL-8. RNK koja je sadržala m<6>A ili s<2>U nukleozidne modifikacije, nasuprot tome, nije dovela do sekrecije IL-8 koja bi mogla biti detektovana (slika 2B). Druge ispitane modifikacije nukleozida (tj. m<5>C, m<5>U, Ψ i m<5>C/Ψ) imale su manji efekat na stimulaciju TLR3 (slika 3B). „Ψ“ se odnosi na pseudouridin.
Dakle, modifikacije nukleozida kao što su m<6>A s<2>U, m<5>C, m<5>U i Ψ smanjuju imunogeničnost RNK, u kojoj posreduje signalizacija preko TLR3.
Primer 4: In vitro transkribovana RNK stimuliše humane TLR7 i TLR8, dok modifikacije nukleozida smanjuju imunogeničnost RNK
Da bi se ispitala mogućnost da 293 ćelije eksprimiraju endogeni TLR3 koji ometa ocenjivanje efekata RNK na specifične TLR receptore, ekspresija endogenog TLR3 je eliminisana iz 293-TLR8 ćelijske linije stabilnom transfekcijom ćelija plazmidom koji eksprimira kratku RNK oblika ukosnice (shRNK) specifičnu za TLR3 (takođe poznatu i kao siRNK). Ova ćelijska linija je korišćena za dalja ispitivanja, s obzirom da nije odgovarala na oligodezoksinukleotide (ODN) koji sadrže poli(I):(C), LPS i CpG, što ukazuje na odsustvo TLR3, TLR4 i TLR9, ali jeste odgovarala na R-848, poznati ligand humanog TLR8 (slika 2B). Kada su 293-hTLR8 ćelije koje eksprimiraju shRNK usmerenu ka TLR3 (293-hTLR8 shRNK-TLR3 ćelije) transficirane in vitro transkribovanom RNK, one su lučile velike količine IL-8. Nasuprot tome, RNK koja sadrži većinu nukleozidnih modifikacija (m<5>C, m<5>U, Ψ i m<5>C/Ψ, s<2>U) eliminisala je stimulaciju (nije bilo lučenja IL-8 većeg od onog prisutnog u negativnoj kontroli, tj. praznom vektoru). Modifikacija m<6>A je imala varijabilni efekat, u nekim slučajevima je eliminisala, a u drugim smanjivala oslobađanje IL-8 (slika 2B).
Rezultati ovog primera i prethodnog primera pokazuju da (a) RNK sa prirodnim fosfodiestarskim vezama između nukleotida (tj. in vitro transkribovana RNK) stimuliše humane TLR3, TLR7 i TLR8; i (b) nukleozidne modifikacije, kao što su m<6>A, m<5>C, m<5>U, s<2>U i Ψ, same ili u kombinaciji, smanjuju imunogeničnost RNK, koja se prikazuje kroz TLR3,
1
TLR7 i TLR8 signalizaciju. Uz to, ovi rezultati obezbeđuju nov sistem za proučavanje signalizacije specifičnih TLR receptora.
Primer 5: Modifikacije nukleozida smanjuju imunogeničnost RNK, u kojoj posreduju TLR7 i TLR8 signalizacija
Sledeća grupa eksperimenata ispitala je sposobnost RNK izolovane iz prirodnih izvora da stimuliše TLR3, TLR7 i TLR8. RNK iz različitih vrsta sisara transficirana je u 293 ćelijske linije koje eksprimiraju TLR3, TLR7 i TLR8 opisane u prethodnom primeru. Nijedan od uzoraka sisarske RNK nije doveo do lučenja IL-8 iznad nivoa negativne kontrole. Nasuprot tome, ukupna bakterijska RNK dobijena iz dva različita izvora iz E. coli dovela je do značajne sekrecije IL-8 u ćelijama transficiranim sa TLR3, TLR7 i TLR8, ali ne i sa TLR9 (slika 2C). Ni LPS ni nemetilovana DNK (CpG ODN) (potencijalni kontaminanti u izolatima RNK) nisu aktivirali ispitivane TLR3, TLR7 ili TLR8. Mitohondrijska RNK izolovana iz humanih trombocita stimulisala je humani TLR8, ali ne i TLR3 ili TLR7.
Ovi rezultati pokazuju da nemodifikovana in vitro transkribovana i bakterijska RNK aktiviraju TLR3, TLR7 i TLR8, dok mitohondrijska RNK stimuliše TLR8. Uz to, ovi rezultati potvrđuju nalaze da modifikacija nukleozida RNK smanjuje njihovu sposobnost da stimulišu TLR3, TLR7 i TLR8.
Primer 6: Modifikacija nukleozida smanjuje kapacitet RNK za indukciju sekrecije citokina i ekspresiju markera aktivacije u DC
Materijal i eksperimentalni postupci
Testovi stimulacije DC
Nakon 20 časova inkubacije sa RNK, DC su obojene CD83-fikoeritrinskim mAb (Research Diagnostics Inc, Flanders, NJ), HLA-DR-Cy5PE, i CD80 ili CD86-fluorescein izotiocijanatnim mAb i analizirane na protočnom citometru FACScalibur® uz upotrebu CellQuest® softvera (BD Biosciences). Supernatanti ćelijske kulture su sakupljeni nakon 20 h inkubacije i podvrgnuti ELISA testu na citokine. Koncentracije IL-12 (p70) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), IFN-α, TNF-α i (Biosource International, Camarillo, CA) su merene u supernatantima pomoću ELISA testa. Kulture su gajene u triplikatu ili kvadriplikatu, a svaki uzorak je meren u duplikatu.
2
Rezultati
Sledeći eksperimenti su ispitivali sposobnost RNK koja sadrži modifikovane ili nemodifikovane nukleozide da stimuliše MDCC generisane dejstvom citokina. Modifikacije nukleozida su smanjivale, na način koji je moguće pokazati reproducibilno, sposobnost RNK da indukuje lučenje TNF-α i IL-12 i iz GM-CSF/IL-4 generisanih MDDC i iz (GM-CSF)/INF-α generisanih MDDC, u najvećem broju slučajeva do nivoa koji nije ništa veći od nivoa koji pokazuje negativna kontrola (slike 3A i B). Rezultati su bili slični i kada su ispitivani drugi kompleti RNK sa istim modifikacijama baza ali sa različitim primarnim sekvencama i dužinama, kao i kad je RNK dalje modifikovana dodatkom 5' kapice i(ili) 3' poli-A repa, ili uklanjanjem 5' trifosfatnog ostatka. RNK različite dužine i sekvence dovodile su do indukcije različitih količina TNF-α iz DC, obično sa razlikom manjom od dva puta (slika 3C). Potom je test izveden sa primarnim DC1 i DC2. Primarne monocitoidne (DC1, BDCA1+) i plazmocitoidne (DC2, BDCA4+) DC su prečišćene iz periferne krvi. Obe vrste ćelija su proizvodile TNF-α kada su izložene dejstvu R-848, ali je samo DC1 odgovarala na poli(I):(C), i to u maloj meri, uključujući odsustvo TLR3 aktivnosti kod DC2. Transfekcija in vitro transkripta dovela je do sekrecije TNF-α i u DC1 i u DC2, dok transkripti sa m<5>U, Ψ ili s<2>U modifikacijama nisu bili stimulatorni (slika 3D). Nasuprot DC generisanim dejstvom citokina, m<5>C i m<6>A modifikacije RNK nisu smanjivale njen stimulatorni kapacitet u primarnim DC1 i DC2. Transkripti sa dvostrukom m<6>A/Ψ modifikacijom nisu dovodili do stimulacije, dok je smeša RNK molekula sa pojedinačnom modifikacijom (m<6>A+Ψ) dovodila do snažne indukcije citokina. Tako je uridinska modifikacija imala dominantno supresivno dejstvo na RNK molekul in cis u primarnim DC. Ovi rezultati bili su konzistentni za sve ispitane donore.
Ovi nalazi pokazuju da in vitro transkribovana RNK stimuliše proizvodnju citokina u DC. Uz to, s obzirom da DC2 ne eksprimiraju TLR3 ili TLR8, a m<5>C i m<6>A modifikacije RNK smanjuju njen stimulatorni kapacitet za TLR7, ovi nalazi ukazuju da primarne DC imaju dodatni entitet sa RNK signalizaciju koji prepoznaje RNK sa m<5>C i m<6>A modifikacijama i čija signalizacija je inhibirana modifikacijom U ostataka.
Kao dodatni indikatori imunogeničnosti, ekspresija CD80, CD83, CD86 i MHC molekula klase II na ćelijskoj površini, kao i lučenje TNF-α mereni su pomoću FACS analize MDDC tretiranih sa RNK-1571 i njenim modifikovanim verzijama. Modifikacija RNK pseudouridinom i modifikovanim nukleozidima (m<5>C, m<6>A, s<2>U i m<6>A/Ψ) smanjivala je ove markere (slika 4), potvrđujući prethodne nalaze.
Konačno, kapacitet RNK da indukuje sazrevanje DC i lučenje citokina zavisi od podtipa DC i od karakteristika nukleozidnih modifikacija prisutnih unutar te RNK. Veća količina modifikacija smanjuje imunogeničnost RNK.
Primer 7: Supresija imune stimulacije posredstvom RNK proporcionalna je broju modifikovanih nukleozida prisutnih unutar te RNK
Materijal i eksperimentalni postupci
Humane DC
Četiri DC generisane iz citokina, monocita, prečišćene su iz PBMC diskontinualnim Perkolijevim centrifugiranjem u gradijentu. Frakcija niske gustine (obogaćena monocitima) je očišćena od B, T i NK ćelija pomoću magnetnih granula (Dynal, Lake Success, NY) specifičnih za CD2, CD16, CD19 i CD56, čime su dobijeni visokoprečišćeni monociti, što je utvrđeno protočnom citometrijom uz upotrebu anti-CD 14 (>95%) ili anti-CD11c (>98%) mAb.
Da bi se generisale nezrele DC, prečišćeni monociti su gajeni u kulturi u AIM V podlozi bez seruma (Life Technologies), uz suplementaciju GM-CSF (50 ng/ml) IL-4 (100 ng/ml) (R & D Systems, Minneapolis, MN) u AIM V podlozi (Invitrogen) za dobijanje DC izvedenih iz monocita (MDDC) kao što je opisano (Weissman, D et al, 2000. J Immunol 165: 4710-4717). DC su takođe generisane tretmanom sa GM-CSF (50 ng/ml) IFN-α (1000 U/ml) (R & D Systems) kako bi se dobile IFN-α MDDC (Santini et al., 2000. Type I interferon as a powerful adjuvant for monocyte-derived dendritic cell development and activity in vitro and in Hu-PBL-SCID mice. J Exp Med 191: 1777-178).
Primarne mijeloidne i plazmacitoidne DC (DC1 i DC2) su dobijene iz periferne krvi pomoću BDCA-1 i BDCA-4 kompleta za izolovanje ćelija (Miltenyi Biotec Auburn, CA), redom.
Rezultati
Većina RNK sa modifikovanim nukleozidima koja je korišćena do sad sadržala je jednu vrstu modifikacije, koja se javljala u približno 25% svih nukleotida u RNK (npr. sve uridinske baze). Da bi se definisala minimalna učestalost konkretnih modifikovanih nukleozida koja je dovoljna da se smanji imunogeničnost pod uslovima koji su ovde korišćeni, generisani su molekuli RNK sa ograničenim brojem modifikovanih nukleozida. U prvoj grupi eksperimenata, RNK je transkribovana in vitro u prisustvu različitih odnosa m<6>A, Ψ ili m<5>C i
4
njihovih odgovarajućih nemodifikovanih NTP. Očekivano je da stepen ugradnje modifikovani nukleozid fosfata u RNK bude proporcionalan odnosu u reakcionoj smeši za transkripciju, s obzirom da RNK prinosi dobijeni pomoću T7 RNAP pokazuju da taj enzim koristi NTP sa m<6>A, Ψ ili m<5>C modifikacijama skoro podjednako efikasno kao i osnovne NTP. Da bi se potvrdio ovaj očekivani rezultat, RNK koja je transkribovana u prisustvu UTP: Ψ u odnosu 50:50 je digestovana i pronađeno je da sadrži UMP i Ψ u približnom odnosu od 50:50 (slika 5A).
RNK molekuli sa sve većim sadržajem modifikovanih nukleozida transficirani su u MDDC, nakon čega je ocenjivano lučenje TNF-α. Svaka modifikacija (m<6>A, Ψ i m<5>C) je inhibirala lučenje TNF-α proporcionalno udelu modifikovanih baza. Čak i najmanje količine modifikovanih baza koje su ispitivane (0,2-0,4%, što odgovara 3-6 modifikovanih nukleozida na molekul od 1571 nt) bile su dovoljne da merljivo inhibiraju sekreciju citokina (slika 5B). RNK sa 1,7-3,2% modifikovanih nukleozida (14-29 modifikacija po molekulu) pokazivala je 50% smanjenje indukcije ekspresije TNF-α. U 293 ćelijama koje eksprimiraju TLR, bio je potreban veći procenat (2,5%) modifikovanog nukleozida da bi se inhibirala signalizacija u kojoj posreduje RNK.
Stoga, pseudouridin i modifikovani nukleozidi smanjuju imunogeničnost RNK molekula, čak i kad su prisutni u malom udelu u odnosu na druge ostatke.
U dodatnim eksperimentima, sintetisani su 21-merni oligoribonukleotidi (ORN) sa fosfodiestarskim vezama između nukleotida, u kojima su modifikovani nukleozidi (m<5>C, Ψ ili 2'-O-metil-U (Um)) supstituisani u konkretnim pozicijama (slika 6A). Iako su nemodifikovani ORN indukovali lučenje TNF-α, ovaj efekat je nestajao u prisustvu čak i samo jednog modifikovanog nukleozida (slika 6B). Slični rezultati dobijeni su za 293 ćelije transformisane sa TLR-7 i TLR-8, koje eksprimiraju siRNK usmerenu ka TLR3.
Prethodni rezultati su potvrđeni merenjem koncentracija TNF-α iRNK u MDDC pomoću Nortern blot testa, u kome su korišćeni i prethodno opisani 21-merni ORN (ORN1) i 31-merni in vitro sintetisani transkripti (ORN5 i ORN6). Kako bi se signal amplifikovao, u neke uzorke je dodat cikloheksimid, koji blokira razgradnju izabranih iRNK, kao što je naznačeno na slici. Nemodifikovani ORN su povećavali koncentracije TNF-α iRNK, dok su ORN koji sadrže čak i samo jedan modifikovani nukleozid bili značajno manje stimulatorni; ORN2-Um je pokazao najveće smanjenje proizvodnje TNF-α (slika 6C).
Slični rezultati su primećeni u mišjim RAW ćelijama nalik makrofagima i u humanim DC.
Kao zaključak, svaka od ispitanih modifikacija (m<6>A, m<5>C, m<5>U, s<2>U, Ψ i 2'-O-metil) je suprimirala imunološku stimulaciju u kojoj posreduje RNK, čak i kad je bila prisutna u malom udelu ostataka. Kada je udeo modifikovanih nukleozida povećan, primećena je dalja supresija.
Primer 8: Pseudouridinska modifikacija RNK smanjuje njenu imunogeničnost in vivo
Da bi se utvrdio efekat pseudouridinske modifikacije na imunogeničnost RNK in vivo, 0,25µg RNK je kompleksirano za lipofektin® i ubrizgano u miševe intrarahealno; miševi su iskrvareni 24 časa kasnije, pa je iz uzoraka seruma određivana koncentracija TNF-α i IFN-α. iRNK sa pseudouridinskom modifikacijom i kapicom dovodila je do značajno manje koncentracije TNF-α i IFN-α iRNK nego što je to bilo slučaj sa nemodifikovanom iRNK (slike 7A-B).
Ovi rezultati donose dodatne dokaze da je iRNK sa pseudouridinskom modifikacijom značajno manje imunogenična in vivo od nemodifikovane RNK.
Primer 9: RNK koja sadrži pseudouridin pokazuje smanjenu sposobnost aktivacije PRK
Materijal i eksperimentalni postupci
Testovi fosforilacije PKR
Alikvoti aktivne PKR agaroze (Upstate) su inkubirani u prisustvu koktela magnezijum/ATP (Upstate), kinaznog pufera i [gama<32>P] ATP smeše, te RNK molekula tokom 30 minuta na 30°C. Ispitivane su nemodifikovana RNK i RNK sa nukleozidnom modifikacijom (m<5>C, pseudouridin, m<6>A, m<5>U), kao i dsRNK. Dodata je humana rekombinantna eIF2α (BioSource), pa su uzorci dalje inkubirani 5 minuta na 30°C. Reakcija je zaustavljena dodavanjem NuPage LDS pufera za uzorak sa reagenskom za redukciju (Invitrogen), zatim je ostavljena da se denaturiše 10 minuta na 70°, pa je smeša analizirana na 10% PAGE. Gelovi su osušeni pa je urađena ekspozicija na film. Kao pozitivna kontrola je korišćen heparin (1 U/µl), aktivator PKR.
Rezultati
Da bi se utvrdilo da li iRNK koja sadrži pseudouridin aktivira protein kinazu zavisnu od dsRNK (PKR), sprovedeni su in vitro testovi fosforilacije pomoću rekombinantne humane PKR i njenog supstrata eIF2α (eukariotskog faktora inicijacije 2 alfa) u prisustvu iRNK koja kodira renilu, sa kapicom (0,5 i 0,05 ng/μl). iRNK koja sadrži pseudouridin (Ψ) nije aktivirala PKR, što je detektovano kao izostanak kako autofosforilacije PKR, tako i fosforilacije eIF2α, dok su RNK bez modifikacije nukleozida i RNK sa m<5>C modifikacijom aktivirale PKR (slika 8). Stoga, pseudouridinska modifikacija smanjuje imunogeničnost RNK.
Primer 10: Pojačana translacija proteina iz RNK koja sadrži pseudouridin i m<5>C in vitro
Materijal i eksperimentalni postupci
In vitro translacija iRNK u lizatu zečijih retikulocita
In vitro translacija je izvedena u lizatu zečijih retikulocita (Promega, Madison, WI). Alikvotu lizata od 9 µl dodato je 1 µl (1 µg) iRNK, pa je smeša inkubirana 60 min na 30°C. Alikvot od 1 µl je uzet za analizu pomoću sistema za testiranje sa luciferazom svica i renile (Promega, Madison WI), i LUMAT LB 950 luminometra (Berthold/EG&G Wallac, Gaithersburg, MD) uz vreme merenja od 10 sekundi.
Rezultati
Da bi se utvrdio efekat pseudouridinske modifikacije na efikasnost translacije RNK in vitro (0,1 µg/µl) iRNK modifikovane pseudouridinom bez kapice, koja kodira luciferazu iz svica, inkubirano je u lizatu zečjih retikulocita 1h na 30°C, pa je određivana aktivnost luciferaze. iRNK koja sadrži pseudouridin je translirana više nego dvostruko efikasnije od RNK bez pseudouridina u lizatu zečijih retikulocita, ali ne u pšeničnom ekstraktu ili u lizatu E. coli (slika 9), što ukazuje da pseudouridinska modifikacija povećava efikasnost translacije RNK. Slični rezultati dobijeni su sa RNK sa m<5>C modifikacijom. Kada je u iRNK koja sadrži pseudouridin dodat i poliA rep, uočeno je dodatno desetostruko povećanje efikasnosti translacije (primer 10).
Dakle, pseudouridinska i m<5>C modifikacija povećavaju efikasnost translacije RNK, dok dodatak poliA repa na iRNK koja sadrži pseudouridin dodatno povećava efikasnost translacije.
Primer 11: Unapređena translacija proteina iz RNK koja sadrži pseudouridin u ćelijama gajenim u kulturi
Materijal i eksperimentalni postupci
Testovi translacije u ćelijama
Ploče sa po 96 polja su zasejane sa 5 x 10<4>ćelija po polju, 1 dan pre transfekcije. Kompleksi lipofektin®-iRNK su sastavljeni i dodati direktno u monoslojeve ćelija, nakon uklanjanja podloge (0,2 µg iRNK – 0,8 µg lipofektina u 50 µl po polju). Ćelije su inkubirane sa smešom za transfekciju 1 h na 37°C, u inkubatoru sa 5% CO2, pa je smeša zamenjena svežom, prethodno zagrejanom podlogom koja sadrži 10% FCS, nakon čega su ćelije analizirane kao što je opisano u prethodnom primeru.
Rezultati
Da bi se utvrdio efekat pseudouridinske modifikacije na translaciju RNK u ćelijama gajenim u kulturi, 293 ćelije su transficirane sa in vitro transkribovanom iRNK sa modifikovanim nukleozidima i kapicom, koja kodira reporterski protein – renilu. Ćelije su lizirane 3 h nakon početka transfekcije, pa su merene koncentracije renile pomoću enzimskih testova. U 293 ćelijama, DNK sa pseudouridinskom i m<5>C modifikacijom podlegale su translaciji skoro 10 puta i 4 puta efikasnije, redom, nego nemodifikovana iRNK (slika 10A).
Zatim je eksperiment izveden sa primarnim, mišjim DC izvedenim iz kostne srži, u ovom slučaju uz lizu ćelija 3 h i 8 h nakon transfekcije. RNK koja je sadržala pseudouridinsku modifikaciju translirana je 15-30 puta efikasnije od nemodifikovane RNK (slika 10B).
Slični rezultati ekspresije dobijeni su i kada su korišćene humane DC i druge primarne ćelije i određene ćelijske linije, uključujući i CHO i mišje RAW ćelije nalik na makrofage. U svim tipovima ćelija, pseudouridinska modifikacija je proizvela najveće pojačanje od svih ispitanih modifikacija.
Dakle, pseudouridinska modifikacija je pojačavala efikasnost translacije RNK u svim ispitanim tipovima ćelija, uključujući različite vrste i profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija i neprofesionalnih antigen-prezentujućih ćelija, što pruža dodatne dokaze o tome da pseudouridinska modifikacija unapređuje efikasnost translacije RNK.
Primer 12: 5' i 3' elementi dalje unapređuju translaciju ΨiRNK u ćelijama sisara
Da bi se ispitali efekti dodatnih strukturnih elemenata RNK na unapređenje translacije putem pseudouridinske modifikacije, sintetisan je komplet ΨiRNK koje kodiraju luciferazu svica, a koje su sadržale kombinacije sledećih modifikacija: 1) jedinstvenu 5' netransliranu sekvencu (TEV, pojačivač translacije nezavisan od kapice), 2) kapicu i 3) poli-A rep. Ocenjivana je sposobnost ovih modifikacija da unaprede translaciju TiRNK ili konvencionalne iRNK (slika 11A). Ovi strukturni elementi aditivno su pojačavali translacionu efikasnost i za konvencionalnu i za ΨiRNK, pri čemu je ΨiRNK pokazivala veću proizvodnju proteina iz svih konstrukta.
Sposobnost ekspresije proteina iz najefikasnijeg ΨiRNK konstrukta za luciferazu svica, capTEVlucA50 (koji sadrži TEV, cap i produženi poli(A) rep) zatim je ispitana tokom 24 časa u 293 ćelijama (slika 11B). ΨiRNK je dala više proteina u svakoj vremenskoj tački koja je ispitivana i obezbedila je uporniju ekspresiju luciferaze nego ekvivalentni konvencionalni iRNK konstrukti, što ukazuje da Ψ modifikacije stabilizuju iRNK.
Da bi se ispitalo da li Ψ modifikacije iRNK unapređuju efikasnost translacije u sisarskim ćelijama in situ, caplacZ-ΨiRNK konstrukti, sa ili bez produženih poliA repova (An) koji kodiraju β-galaktozidazu (lacZ) su generisani i korišćeni za transfekciju 293 ćelija.24 časa nakon dopremanja iRNK, pomoću X-gal vizuelizacije su detektovana značajna povećanja koncentracije β-galaktozidaze, i za caplacZ i za caplacZ-An, u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim (konvencionalnim) transkriptima (slika 11C). Ovaj trend je uočen i kada je analiziran broj ćelija koje eksprimiraju koncentracije β-galaktozidaze koje se mogu detektovati, kao i kada je ispitivana jačina signala u pojedinačnim ćelijama.
Primer 13: Unapređena translacija proteina iz RNK koja sadrži pseudouridin in vivo
Materijal i eksperimentalni postupci
Intracerebralne injekcije RNK
Sve procedure izvođene na životinjama bile su u skladu sa NIH Smernicama za držanje i korišćenje laboratorijskih životinja (NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals) i uz odobrenje Insititucionalne komisije za držanje i korišćenje životinja. Mužjaci Wistar pacova (Charles River Laboratories, Washington, MA) su anestezirani intraperitonealnom injekcijom natrijum pentobarbitala (60 mg/kg telesne mase). Glave su postavljene u stereotaksični okvir, pa je načinjeno osam podjednako udaljenih otvora prečnika 1,5 mm bilateralno [koordinate u odnosu na bregmu: anteriorno/posteriorno 3, 0, -3, -6 mm; lateralno ±2,5 mm], pri čemu je dura ostala intaktna. Intracerebralne injekcije date su pomoću šprica od 25 µl (Hamilton, Reno, NV) sa sterilnom iglom promera 30 od 1 inča (Beckton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) koja je fiksirana na držač velikih sondi i streotaktički držač. Kako bi se izbeglo zadržavanje vazduha u špricu, postolje za iglu je napunjeno sa 55 µl kompleksa pre nego što je igla pričvršćena, pa je ostatak uzorka uvučen kroz iglu. Dubina injekcije (2 mm) je određena u odnosu na površinu dure, pri čemu je 4 µl kompleksa (32 ng iRNK) dato pojedinačnom, brzom bolus infuzijom. Nakon 3 časa, pacovi su eutanazirani halotanom, pa su mozgovi uklonjeni u ohlađeni rastvor soli sa fosfatnim puferom.
Injekcija RNK u repnu venu miša
U repnu venu ženki BALB/c miševa (Charles River Laboratories) ubrizgano je, bolus injekcijama, po 60 µl RNK kompleksirane sa lipofektinom® (0,26 µg). Organi su uklonjeni i homogenizovani u puferu za lizu sa luciferazom ili renilom, u kivetama za mikrocentrifugu, uz upotrebu tučka. Homogenati su centrifugirani, pa su supernatanti analizirani kako bi se odredila aktivnost.
Dopremanje RNK u pluća
Ženke BALB/c miševa su anestezirane pomoću ketamina (100 mg/kg) i ksilazina (20 mg/kg). U koži, neposredno uz traheju, napravljeni su mali rezovi. Kada je traheja ogoljena, u traheju je uneseno 50 µl RNK kompleksirane lipofektinom® (0,2 µg) ka plućima. Rezovi su zatvoreni, pa su životinje ostavljene da se oporave. Nakon što je prošlo 3 časa od dopremanja RNK, miševi su žrtvovani cervikalnom dislokacijom, pluća su izdvojena, homogenizovana u puferu za lizu sa luciferazom ili renilom (250 µl) i određivana je aktivnost. U različitoj grupi životinja, prikupljeni su uzorci krvi (100 µl/životinji) iz repne vene, koagulirani su i centrifugirani. Frakcije seruma su korišćene za određivanje koncentracija TNF i IFNα pomoću ELISA testa, kao što je opisano u primerima iznad, uz primenu antitela specifičnih za miševe.
Rezultati
Kako bi se odredio efekat pseudouridinske modifikacije na translaciju RNK in vivo, u svaku od hemisfera korteksa mozga pacova ubrizgana je ili pseudouridinski modifikovana RNK koja kodira renilu, sa kapicom, ili nemodifikovana RNK, pa je merena translacija RNK. RNK sa pseudouridinskom modifikacijom je značajno efikasnije translirana nego nemodifikovana RNK (slika 12A).
Zatim su izvedena ispitivanja ekspresije kod miševa. Odabrana je iRNK koja kodira luciferazu svica jer nijedan endogeni sisarski enzim ne pravi interferenciju kod njene detekcije. Transkripti (nemodifikovani i ΨiRNK) su konstruisani sa kapicom, TEV (capTEVA50) i produženim (~200 nt) poli(A) repovima. Miševima je intravenski (i.v.) ubrizgano po 0,25 µg RNK kompleksirane lipofektinom® u repnu venu. Nekoliko organa je ispitano na prisustvo aktivnosti luciferaze kako bi se odredilo optimalno mesto za merenje. Primena 0,3 µg capTEVlucAn ΨmRNK dovela je do visoke ekspresije luciferaze u slezini i umerene ekspresije u kostnoj srži, ali do neznatne ekspresije u plućima, jetri, srcu, bubregu ili mozgu (slika 12B). U narednim ispitivanjima, proučavane su slezine.
Zatim je poređena efikasnost translacije konvencionalnih i ΨiRNK (0,015 mg/kg; 0,3 µg/životinji intravenski) u eksperimentima sa protokom vremena. Aktivnost luciferaze lako se mogla detektovati nakon 1 h, dostizala je maksimum nakon 4 h i opadala je do 24 h nakon primene, bilo da je reč o konvencionalnoj ili ΨiRNK, ali je u svakom trenutku bila veća kod životinja kojima je data ΨiRNK (slika 12C, levo polje). Do trenutka 24h nakon primene, samo životinje kojima je ubrizgana ΨiRNK pokazivale su aktivnost luciferaze u slezini koju je bilo moguće detektovati (4 puta veću od pozadinske). Sličan obrazac ekspresije (u smislu poređenja modifikovane i nemodifikovane RNK) dobijen je i kada je iRNK koja kodira Renilla luciferazu (capRen sa ili bez Ψ modifikacija) ubrizgana životinjama umesto luciferaze iz svitaca, ili kada su izolovani mišji splenociti izloženi dejstvu iRNK u kulturi. U sledećem eksperimentu, 0,25 µg iRNK-lipofektin® kompleksa dopremljeno je u pluća miša intrarahealnom injekcijom. RNK sa pseudouridinskom modifikacijom i kapicom translirana je efikasnije nego RNK sa kapicom bez pseudouridinske modifikacije (slika 12D).
Dakle, pseudouridinska modifikacija povećava efikasnost translacije RNK in vitro u ćelijama gajenim u kulturi, kao i in vivo, u više životinjskih modela i u više puteva primene, čime pokazuje svoju široku primenljivost kao sredstvo povećanja efikasnosti translacije RNK.
Primer 14: Pseudouridinska modifikacija pojačava stabilnost RNK in vivo
Nortern blot analize RNK iz slezine 1 i 4 časa nakon injekcije, kod životinja iz prethodnog eksperimenta otkrile su da je primenjenu iRNK bilo lako detektovati, u intaktnom i delimično degradiranom obliku (slika 12C, desno polje). Nasuprot tome, nakon 24 h, nemodifikovana capTEVlucAn iRNK bila je ispod nivoa detekcije, dok je capTEVlucAn ΨiRNK, iako delimično degradiranu, i dalje bilo jasno moguće detektovati. Dakle, ΨiRNK je stabilnija in vivo od kontrolne iRNK.
1
Da bi se ispitalo da li proizvodnja proteina in vivo kvantitativno zavisi od koncentracije intravenski dopremljene iRNK, iRNK su date miševima u dozi od 0,015-0,150 mg/kg (0,3-3,0 µg capTEVlucAn po životinji), pa su njihove slezine analizirane 6 časova kasnije kao što je objašnjeno iznad. Ekspresija luciferaze kvantitativno je korelirala sa količinom ubrizgane RNK (slika 13) pri svakoj koncentraciji.
Ovi rezultati potvrđuju rezultate primera 12, pokazujući da je ΨiRNK stabilnija od nemodifikovane RNK. Dalje, imunogeničnost ΨiRNK je bila manja od nemodifikovane RNK, kao što je prethodno opisano (slika 7 i slika 12C, desno polje).
Ukratko sažimajući primere 13 i 14, 3 prednosti ΨiRNK u poređenju sa konvencionalnom iRNK (unapređena translacija, veća stabilnost i smanjena imunogeničnost), koje su primećene in vitro, takođe su primećene in vivo.
Primer 15: ΨiRNK primenjena putem respiratornog trakta ponaša se slično kao intravenski primenjena iRNK
Kako bi se ispitala sposobnost ΨiRNK za inhalacionu primenu, iRNK kompleksirana sa lipofektinom® ili PEI, koja kodira luciferazu iz svica, data je miševima intrarahealnim putem primene, tako što je igla postavljena u dušnik pa je rastvor iRNK unesen u pluća prskanjem. Slično kao i kod intravenskog dopremanja, značajno veća ekspresija luciferaze primećena je kod ΨiRNK u poređenju sa nemodifikovanom iRNK (slika 14), iako je kod intratrahealnog puta primene sintetisano značajno manje proteina u poređenju sa intravenskim putem primene. Nemodifikovana iRNK primenjena intratrahealnim putem dovedena je u vezu sa značajno većim koncentracijama zapaljenskih citokina (IFN-α i TNF-α) u poređenju sa kontrolama koje su primile nosilac, dok to nije bilo slučaj sa ΨiRNK (slika 15). Dakle, ΨiRNK se može dopremiti inhalacijom bez aktivacije urođenog imunog odgovora.
Primer 16: Dopremanje EPO-ΨiRNK u 293 ćelije
ΨiRNK je generisana iz plazmida koji sadrži cDNK za humani EPO. Nakon što je 0,25 µg EPO-ΨiRNK transficirano u 10<6>293 ćelija gajenih u kulturi, proizvedeno je više od 600 mU/ml EPO proteina. Dakle, modifikovani molekuli RNK prema predmetnom pronalasku su efikasni u dopremanju rekombinantnih proteina u ćelije.
2
Primer 17: Dobijanje unapređenih ΨiRNK konstrukta koji kodiraju EPO
Materijal i eksperimentalni postupci
Sekvenca koja kodira EPO klonirana je pomoću tehnike restrikcionih enzima kako bi se dobila 2 nova plazmida, pTEVEPO i pT7TS-EPO, koja se koriste kao obrasci za dobijanje EPO-ΨiRNK. EPO-ΨiRNK se dobija iz ovih obrazaca in vitro transkripcijom (kompleti MessageMachine® i MegaScript®; Ambion) pomoću T7 RNK polimeraze (RNAP), uz inkorporaciju nukleozida pri ekvimolarnim (7,5 mM) koncentracijama. Da bi se inkorporirale nukleozidne modifikacije, Ψ trifosfat (TriLink, San Diego, CA) menja UTP u reakciji transkripcije. Da bi se osiguralo postavljanje kapice na ΨiRNK, dodaje se i nerevrzibilni analog kapice, 6 mM 3’-O-Me-m7GpppG (New England BioLabs, Beverly, MA). ΨiRNK molekuli dobijaju poli(A) repove u reakciji ~1,5 µg/µl RNK, 5 mM ATP, i 60 U/µl poli(A) polimeraze iz kvasca (USB, Cleveland, OH) uz mešanje na 30°C tokom 3 do 24 h. Kvalitet ΨiRNK se ocenjuje elektroforezom na denaturišućem agaroznom gelu. Takođe se izvode testovi na LPS u preparatima iRNK pomoću testa geliranja/zgrušavanja lizata amebocita limulusa, sa osetljivošću od 3 pg/ml.
Rezultati
Proksimalni 3' netranslirani region (3'UTR) EPO-ΨiRNK ima očuvan stabilišući element dužine ~90 nt, bogat pirimidinom, iz nascentne EPO iRNK, koji stabilizuje EPO iRNK specifičnom asocijacijom sa ubikvitinskim proteinom, eritropojetinskim iRNK-vezujućim proteinom (ERBP). Da bi se maksimalno stabilizovala EPO-ΨiRNK, u EPO plazmid se uvode dve promene kojima se unapređuje stabilnost i efikasnost translacije transkribovane iRNK: 1) 5' UTR sekvenca virusa nazubljenosti duvana (TEV) se uvodi ushodno od sekvence koja kodira EPO, kako bi se dobio pTEV-EPO; 2) genereiše se plazmid, pT7TS-EPO, u kome se na bočnim stranama EPO cDNK nalaze sekvence koje odgovaraju 5' i 3' UTR β-globina.
Uz to, dužina poli(A) repa se produžava tokom dobijanja ΨiRNK iz ovih plazmidnih obrazaca, tako što se produžava vreme inkubacije reakcije sa poli(A) polimerazom. Duži poli(A) rep smanjuje stopu degradacije ΨiRNK tokom translacije.
Ova unapređenja dovode do bolje efikasnosti translacije in vivo, čime se smanjuje terapeutska doza proizvoda.
Primer 18: In vitro analiza dobijanja proteina iz EPO iRNK konstrukta
Materijal i eksperimentalni postupci
Dobijanje humanih ćelija
Humane embrionske 293 ćelije bubrega (ATCC) su gajene u DMEM podlozi uz suplementaciju glutamina (Invitrogen) i 10% FCS (Hyclone, Ogden, UT) (kompletna podloga). Uzorci za leukoforezu su dobijeni od dobrovoljaca koji nisu inficirani HIV-om, kroz protokol sa odobrenjem IRB. DC se dobijaju kao što je prethodno opisano, i gaje u kulturi u AIM V® podlozi (Invitrogen) sa GM-CSF (50 ng/ml) IL-4 (100 ng/ml) (R & D Systems).
Mišje ćelije slezine i DC se dobijaju u skladu sa objavljenim procedurama. Ukratko, slezine iz BALB/c miševa se uklanjaju i usitnjavaju pomoću forcepsa u kompletnoj podlozi. Fragmenti tkiva se podvrgavaju gravitacionoj sedimentaciji, pa se suspenzija pojedinačnih ćelija ispira i lizira pomoću AKC pufera za lizu (Sigma). Mišje DC se dobijaju iz ćelija kostne srži iz tibija i femura BALB/c miševa starih 6-9 nedelja. Ćelije se gaje u DMEM koja sadrži 10% FCS (Invitrogen) i 50 ng/ml muGM-CSF (R&D), pa se koriste sedmog dana.
Transfekcija ćelija i detekcija EPO i prozapaljenskih citokina
Transfekcija se izvodi pomoću lipofektina u prisustvu fosfatnog pufera, delotvornog metoda dopremanja za spleničnu i in vitro ćelijsku ekspresiju. EPO-ΨiRNK (0,25 µg/polju; 100.000 ćelija) se dodaje u svaki tip ćelija, u triplikatu, tokom 1 časa, nakon čega se supernatant zameni svežom podlogom. Nakon 24 časa, supernatant se odvoji za merenje EPO, IFN-α ili β i TNF-α pomoću ELISA.
Rezultati
Da bi se ocenio uticaj jedinstvenih UTR na pojačanje translacione efikasnosti ΨiRNK, EPO-ΨiRNK koja sadrži, ili ne sadrži, svako od poboljšanja (5' TEV element, βglobin, 5' i 3' UTR) sa dugačkim poli(A) repovima ispitivano je na in vitro sintezu proteina i in vitro imunu aktivaciju, pri čemu je kao kontrola korišćena EPO iRNK sa konvencionalnim nukleozidima. Efikasnost sinteze proteina iz svake od iRNK je ocenjivana u sisarskim ćelijskim linijama (HEK 293, CHO), humanim i mišjim primarnim DC, i ćelijama slezine za svaku iRNK. Meri se ukupni EPO proizveden u svim ćelijskim tipovima i imunoegničnost (prozapaljenski citokini iz supernatanta) u primarnim ćelijama. Onaj iRNK konstrukt koji pokaže optimalnu kombinaciju visoke proizvodnje EPO (u 1 ili više ćelijskih tipova) i slabo pokretanje lučenja citokina koristi se u daljim ispitivanjima. Unapređenja u smislu 5' i 3' UTR
4
EPO-ΨiRNK i dužih poli(A) repova dovode do procenjenog unapređenja efikasnosti translacije od 2-10 puta, bez povećanja imunogeničnosti.
Primer 19: Karakterizacija proizvodnje EPO i biološkog odgovora na EPO-ΨiRNK in vivo
Materijal i eksperimentalni postupci
Primena EPO-ΨiRNK kod miševa
Sve životinjske studije opisane u predmetnoj prijavi izvođene su u skladu sa NIH Smernicama za držanje i korišćenje laboratorijskih životinja i uz odobrenje Insititucionalne komisije za držanje i korišćenje životinja Univerziteta u Pensilvaniji. Ženke BALB/c miševa (n=5 po eksperimentalnoj grupi; 6 nedelja, 18-23 g; Charles River Laboratories) anestezirane su pomoću 3,5% halotana u smeši N2O i O2, nakon čega je halotan smanjen do 1% i anestezija održavana preko nosne maske. Telesna temperatura životinje se tokom cele procedure održava pomoću grejnog jastučeta podešenog na 37°C. EPO-ΨiRNK-lipofektin kompleksi (konstruisani mešanjem različitih količina nuklenske kiseline sa 1 µl lipofektina u finalnoj zapremini od 60 µl) ubrizgani su u lateralnu repnu venu. Uzorci krvi uzimani su 3 puta dnevno 3 dana nakon injekcije iRNK, tokom ispitivanja vremenskog toka, u jednoj optimalnoj vremenskoj tački tokom studija odgovora na dozu, i svakodnevno od drugog do šestog dana u studijama retikulocitoze.
Određivanje retikulocita protočnom citometrijom
Uzorci cele krvi obojeni su reagensom Retic-COUNT (BD Diagnostics) pa su beleženi podaci pomoću FACScan protočnog citometra. Eritrociti (RBC, eng. red blood cells) su odabrani pomoću svojstava rasipanja ka napred i u stranu, te analizirani na svojstvo unosa boje tiazol narandžasto. Ćelije obojene reagensom Retic-COUNT detektuju se fluorescencijom, a retikulociti se izražavaju kao procenat od ukupnog broja eritrocita. Najmanje 50.000 pojedinačnih pojava izbrojano je po uzorku.
Rezultati
Da bi se optimizovala proizvodnja biološki funkcionalnog humanog EPO proteina (hEPO) u odgovor na iRNK koja kodira EPO, sprovedena su sledeća ispitivanja:
Ispitivanje proizvodnje EPO u toku vremena nakon pojedinačne injekcije EPO-ΨiRNK. Nakon intravenske primene 1 µg EPO-ΨiRNK, hEPO je serijski određivan, od 1 do 96h nakon primene EPO-ΨiRNK, pomoću ELISA testa, kako bi se odredio poluživot EPO proteina u serumu. Ovaj poluživot je proizvod kako poluživota EPO proteina, tako i funkcionalnog poluživota EPO-ΨiRNK. Dobijena optimalna tačka za merenje EPO proteina nakon primene EPO-ΨiRNK koristi se u narednim ispitivanjima.
Ispitivanje zavisnosti odgovora od doze za proizvodnju EPO nakon pojedinačne injekcije EPO-ΨiRNK. Da bi se utvrdila korelacija između količine EPO proteina koji se sintetiše i količine EPO-ΨiRNK koja se primeni, date su rastuće koncentracije EPO-ΨiRNK (0,01 do 1 µg/životinji), pa je EPO meren u optimalnoj vremenskoj tački.
Odnos između proizvodnje hEPO i retikulocitoze. Da bi se izmerio efekat EPO-ΨiRNK na pojavu koja pokazuje biološku korelaciju sa EPO aktivnošću, koristi se protočna citometrija da bi se utvrdila učestalost retikulocita u krvi. Protočna citometrija ima koeficijent varijacije od < 3%. Miševima se daje pojedinačna doza EPO-ΨiRNK, pa se uzimaju uzorci krvi svaki dan, od drugog do šestog dana. Zatim se određuje odnos između doze EPO-ΨiRNK i učestalosti retikulocita u vremenskoj tački u kojoj je retikulocitoza maksimalna. Doza EPO-ΨiRNK koja dovodi do najmanje 5% povećanja broja retikulocita korišćena je u narednim ispitivanjima. Dobijene su procenjene koncentracije hEPO u serumu miševa od 50 mU/ml i(ili) povećanja u učestalosti retikulocita od 5%.
Primer 20: Merenje imunog odgovora na EPO-ΨiRNK in vivo
Materijal i eksperimentalni postupci
Detekcija citokina u plazmi
Uzorci seruma dobijenih iz krvi uzete u različitim vremenskim tačkama tokom, i sedam dana nakon primene iRNK kompleksirane lipofektinom analizirane su na prisustvo mišjeg INF-α, TNF-α i IL-12 pomoću ELISA testova.
Nortern blot analiza
Alikvoti (2,0 µg) RNK uzoraka izolovanih iz slezine se razdvoje denaturišućom gel elektroforezom na 1,4% agarozi, prenesu na naelektrisane membrane (Schleicher & Schuell) i hibridizuju u uređaju MiracleHyb® (Stratagene). Membrane se testiraju probama na prisustvo TNF-α, nishodnih IFN signalnih molekula (npr. IRF7, IL-12 p35 i p40, kao i GAPDH) i drugih markera imune aktivacije. Specifičnost svih proba potvrđuje se sekvenciranjem. Da bi se membrane testirale probama, 50 ng DNK se obeleži pomoću Redivue[α-<32>P] dCTP® (Amersham) uz komplet za obeležavanje sa slučajno odabranim prajmerima (Roche).
Hibridizovane membrane se snime na Kodak BioMax MS film pomoću MS zaslona za intenziviranje na -70°C.
Histopatologija
Slezine iz miševa tretiranih ΨiRNK, pozitivnih i negativnih kontrola se prikupe, fiksiraju, diseciraju, oboje hematoksilinom i eozinom, te ih pregleda veterinar-patolog na prisustvo znaka imune aktivacije.
Rezultati
Da bi se potvrdila smanjena imunogeničnost RNK molekula prema predmetnom pronalasku, miševi (n = 5) primaju dnevne doze EPO-ΨiRNK tokom 7 dana, nakon čega se pregledaju na prisustvo neželjenih događaja u kojima posreduje imuni sistem, na šta ukazuju parametri citokina u serumu, ekspresija iRNK koje kodiraju zapaljenske proteine u slezini, kao i patološki pregled. Maksimalne primenjene doze su 3 µg ili 5 x delotvorna pojedinačna doza, kao što je određeno iznad. Nemodifikovana iRNK i sam lipofektin® korišćeni su kao pozitivna i negativna kontrola, redom.
Ova ispitivanja potvrđuju smanjenu imunogeničnost RNK molekula prema predmetnom pronalasku.
Primer 21: Dalje unapređenje postupaka dopremanja EPO-ΨiRNK
Kompleksiranje nanočestica
Rastvori polimera i ΨiRNK se mešaju, kako bi se dobili kompleksi. Različiti uslovi formulacije se ispituju i optimizuju: (1) Sub-122 nm polietilenimin (PEI)/iRNK kompleksi se dobijaju dodavanjem 25 zapremina iRNK na 1 zapreminu PEI u vodi, bez mešanja, tokom 15 minuta. (2) Poli-L-lizin – polietilen glikol (PLL-PEG) nalik štapićima, sa prosečnim dimenzijama 12x150 nm, sintetišu se sporim dodavanjem 9 zapremina iRNK u 1 zapreminu CK30-PEG10k u acetatnom kontrajonskom puferu, uz vorteksiranje. (3) Za sintezu biološki razgaradljivih polimernih genskih nosilaca, kopolimer poliaspartat anhidrida i etilen glikola (PAE) se sintetiše polikondenzacijom uz otvaranje prstena N-(benziloksikarbonil)-L-aspartat anhidrida i etilen glikola. Nakon toga se uklanja zaštita sa bočne aminske grupe asparaginske kiseline, koja se potom protonuje zakišeljavanjem vodonik hloridom i kondenzuje sa iRNK. (4) Za najnoviju generaciju nanočestica, alkivot štok rastvora CK30PEG10k u obliku amonijum acetata (1,25 ml, 6,4 mg/ml) se doda u silikonizovane Ependorf kivete. Potom se u CK30PEG10k polako doda iRNK (2,5 mg u 11,25 ml H2O bez RNKaze) u toku 1-2 minuta. Nakon 15 minuta, rastvor se razblaži 1:2 sa H2O bez RNKaze.
Intratrahealno dopremanje
Miševi se anesteziraju 3% halotanom (70% N2O 30% O2) u anestetskoj komori, pa se anestezija održava 1% halotanom (70% N2O 30% O2) tokom operacije, preko nosne maske. Traheja se ogoli, nakon čega se 50 µl rastvora ubaci, zajedno sa 150 µl vazduha, u pluća preko traheje, pomoću Hamiltonovog šprica od 250 µl (Hamilton, Reno, NV) sa 27G 1/2" iglom.
Rezultati
Da bi se unapredila efikasnost dopremanja i ekspresije ΨiRNK primenjene intrarahealnim putem (i.t.), ΨiRNK se enkapsulira u nanočestice. Pakovanje u nanočestice podrazumeva kondenzaciju i enkapsulaciju DNK (na primer) u čestice koje su manje od pore nuklearne membrane pomoću hemijskih sredstava kao što su poli-L-lizin i polietilen glikol. RNK se pakuje u 4 različite formulacije nanočestica (PEI, PLL, PAE i CK30PEG10k), nakon čega se efikasnost ΨiRNK dopremanja poredi za ΨiRNK koja kodira luciferazu (Luc-ΨiRNK). Kinetika dopremanja i ispitivanje odgovora u zavisnosti od doze se potom karakterišu pomoću EPO-ΨiRNK.
Primer 22: Sprečavanje ponovnog suženja (restenoze) dopremanjem rekombinantne modifikovane iRNK koja kodira proteine termičkog šoka u karotidnu arteriju
Materijal i eksperimentalni postupci
Dizajn eksperimenta
RNK se primenjuje u karotidnu arteriju pacova intraarterijalnom injekcijom oko vremena angioplastike balonom, nakon koje se ponovo uspostavlja cirkulacija. Pacovi se žrtvuju 3 h nakon injekcije, delovi karotidne arterije se isecaju, ćelije vaskularnog endotela se prikupljaju i homogenizuju pa se određuje luciferazna aktivnost kao što je prethodno opisano u primerima iznad.
Rezultati
RNK sa pseudouridinskom modifikacijom koja kodira luciferaju daje se pacovima u karotidne arterije.3 časa nakon toga, RNK koja kodira luciferazu može se detektovati na mestu dopremanja, ali ne i na mestima u neposrednoj okolini.
Zatim se ovaj protokol koristi za sprečavanje ponovne stenoze krvnog suda nakon angioplastike balonom u životinjskim modelima restenoze, dopremanjem modifikovane RNK koja kodira protein termičkog šoka, npr. HSP70; faktor rasta (npr. faktor rasta izveden iz trombocita (PDGF), vaskularni endotelijalni faktor rasta (V-EGF), ili faktor rasta nalik insulin (IGF)); ili protein koji smanjuje ekspresiju ili deluje kao antagonista signalizacciji faktora rasta. Primena modifikovane RNK smanjuje incidenciju restenoze.
Primer 23: Tretman cistične fibroze dopremanjem modifikovanih iRNK molekula koji kodiraju CFTR u respiratorni epitel
RNK koja sadrži pseudouridinsku ili nukleozidnu modifikaciju se doprema, kao što je opisano u primeru 13, u pluća životinja u životinjskom modelu cistične fibroze, pa se ocenjuje njeno dejstvo na bolest, kao što je opisano u Scholte BJ, et al (Animal models of cystic fibrosis. J Cyst Fibros 2004; 3 Suppl 2: 183-90) ili Copreni E, et al, Lentivirus-mediated gene transfer to the respiratory epithelium: a promising approach to gene therapy of cystic fibrosis. Gene Ther 2004;11 Suppl 1: S67-75). Primena RNK poboljšava stanje kod cistične fibroze. U dodatnim eksperimentima, modifikovani molekuli iRNK prema predmetnom pronalasku koriste se za dopremanje drugih rekombinantnih proteina sa terapeutskom vrednošću u pluća, na primer, putem inhalatora koji doprema RNK.
Primer 24: Tretman XLA dopremanjem modifikovanih molekula iRNK koji kodiraju ADA u hematopojetske ćelije
RNK koja sadrži pseudouridinsku ili nukleozidnu modifikaciju a koja kodira ADA doprema se u hematopojetske ćelije u životinjskom modelu X-povezane agamaglobulinemije, pa se ocenjuje njeno dejstvo na bolest, kao što je opisano u Tanaka M, Gunawan F, et al, Inhibition of heart transplant injury and graft coronary artery disease after prolonged organ ischemia by selective protein kinase C regulators. J Thorac Cardiovasc Surg 2005;129(5): 1160-7) ili Zonta S, Lovisetto F, et al, Ureteroneocystostomy in a swine model of kidney transplantation: a new technique. J Surg Res. 2005 Apr;124(2):250-5). Pronađeno je da primena RNK poboljšava XLA.
Primer 25: Sprečavanje odbacivanja organa dopremanjem modifikovanih molekula iRNK koji kodiraju imunomodulatorne proteine na mesto transplantacije
RNK koja sadrži pseudouridinsku ili nukleozidnu modifikaciju a koja kodira citokin, hemokin ili interferon (npr. IL-4, IL- 13, IL-10, ili TGF-β) se doprema na mesto transplantacije organa u životinjskom modelu odbacivanja transplantata, pa se ocenjuje njeno dejstvo na pojavu odbacivanja, kao što je opisano u Yu PW, Tabuchi R S et al, Sustained correction of B-cell development and function in a murine model of X-linked agammaglobulinemia (XLA) using retroviral-mediated gene transfer. Blood. 2004104(5): 1281-90) ili Satoh M, Mizutani A et al, X-linked immunodeficient mice spontaneously produce lupus-related anti-RNA helicase A autoantibodies, but are resistant to pristane-induced lupus. Int Immunol 2003, 15(9):1117-24). Primena mRNK smanjuje incidenciju odbacivanja transplanta.
Primer 26: Tretman Niman-Pikove bolesti, mukopolisaharidoze i drugih urođenih metaboličkih grešaka dopremanjem iRNK u telesna tkiva
RNK koja sadrži pseudouridinsku ili nukleozidnu modifikaciju a koja kodira sfingomijelinazu doprema se u pluća, mozak ili druga tkiva u životinjskim modelima Niman-Pikove bolesti tipa A i B, pa se ocenjuje njeno dejstvo na bolest kao što je opisano u Passini MA, Macauley SL, et al, AAV vector-mediated correction of brain pathology in a mouse model of Niemann-Pick A disease. Gene Ther 2005;11( 5): 754-62) ili Buccoliero R, Ginzburg L, et al, Elevation of lung surfactant phosphatidylcholine in mouse models of Sandhoff and of Niemann-Pick A disease. J Inherit Metab Dis 2004;27(5): 641-8). Pronađeno je da primena RNK poboljšava stanje kod bolesti.
RNK koja sadrži pseudouridinsku ili nukleozidnu modifikaciju a koja kodira alfa-L-iduronidazu, iduronat-2-sulfatazu, ili neki srodni enzim doprema se u tkiva u životinjskom modelu mukopolisaharidoze, pa se ocenjuje njeno dejstvo na bolest kao što je opisano u Simonaro CM, D’Angelo M, et al, Joint and bone disease in mucopolysaccharidoses VI and VII: identification of new therapeutic targets and biomarkers using animal models. Pediatr Res 2005;57(5 Pt 1): 701-7) ili McGlynn R, Dobrenis K, et al, Differential subcellular localization of cholesterol, gangliosides, and glycosaminoglycans in murine models of mucopolysaccharide storage disorders. J Comp Neurol 200420;480(4): 415-26). Primena RNK poboljšava stanje kod bolesti.
U dodatnim eksperimentima, modifikovani molekuli iRNK za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku koriste se za obezbeđivanje faktora koagulacije (npr. kod hemofiličara).
U dodatnim eksperimentima, modifikovani molekuli iRNK za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku koriste se za obezbeđivanje kisele-b-glukozidaze za lečenje Gošeove bolesti.
U dodatnim eksperimentima, modifikovani molekuli iRNK za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku koriste se za obezbeđivanje alfa-galaktozidaze A za tretman Fabrijeve bolesti.
U dodatnim eksperimentima, modifikovani molekuli iRNK za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku koriste se za obezbeđivanje citokina za tretman infektivnih bolesti.
U dodatnim eksperimentima, modifikovani molekuli iRNK za inventivnu upotrebu prema predmetnom pronalasku koriste se za ispravku drugih urođenih grešaka metabolizma, primenom iRNK molekula koji kodiraju, npr. ABCA4; ABCD3; ACADM; AGL; AGT; ALDH4A1; ALPL; AMPD1; APOA2; AVSD1; BRCD2; C1QA; C1QB; C1QG; C8A; C8B; CACNA1S; CCV; CD3Z; CDC2L1; CHML; CHS1; CIAS1; CLCNKB; CMD1A; CMH2; CMM; COL11A1; COL8A2; COL9A2; CPT2; CRB1; CSE; CSF3R; CTPA; CTSK; DBT; DIO1; DISCI; DPYD; EKV; ENO1; ENO1P; EPB41; EPHX1; F13B; F5; FCGR2A; FCGR2B; FCGR3A; FCHL; FH; FM03; FM04; FUCA1; FY; GALE; GBA; GFND; GJA8; GJB3; GLC3B; HF1; HMGCL; HPC1; HRD; HRPT2; HSD3B2; HSPG2; KCNQ4; KCS; KIF1B; LAMB3; LAMC2; LGMD1B; LMNA; LOR; MCKD1; MCL1; MPZ; MTHFR; MTR; MUTYH; MYOC; NB; NCF2; NEM1; NPHS2; NPPA; NRAS; NTRK1; OPTA2; PBX1; PCHC; PGD; PHA2A; PHGDH; PKLR; PKP1; PLA2G2A; PLOD; PPOX; PPT1; PRCC; PRG4; PSEN2; PTOS1; REN; RFX5; RHD; RMD1; RPE65; SCCD; SERPINC1; SJS1; SLC19A2; SLC2A1; SPG23; SPTA1; TALI; TNFSF6; TNNT2; TPM3; TSHB; UMPK; UOX; UROD; USH2A; VMGLOM; VWS; WS2B; ABCB11; ABCG5; ABCG8; ACADL; ACP1; AGXT; AHHR; ALMS1; ALPP; ALS2; APOB; BDE; BDMR; BJS; BMPR2; CHRNA1; CMCWTD; CNGA3; COL3A1; COL4A3; COL4A4; COL6A3; CPS1; CRYGA; CRYGEP1; CYP1B1; CYP27A1; DBI; DES; DYSF; EDAR; EFEMP1; EIF2AK3; ERCC3; FSHR; GINGF; GLC1B; GPD2; GYPC; HADHA; HADHB; HOXD13; HPE2; IGKC; IHH; IRS1; ITGA6; KHK; KYNU; LCT; LHCGR; LSFC; MSH2; MSH6; NEB; NMTC; NPHP1;
1
PAFAH1P1; PAX3; PAX8; PMS1; PNKD; PPH1; PROC; REG1A; SAG; SFTPB; SLC11A1; SLC3A1; SOS1; SPG4; SRD5A2; TCL4; TGFA; TMD; TPO; UGT1A@; UV24; WSS; XDH; ZAP70; ZFHX1B; ACAA1; AGS1; AGTR1; AHSG; AMT; ARMET; BBS3; BCHE; BCPM; BTD; CASR; CCR2; CCR5; CDL1; CMT2B; COL7A1; CP; CPO; CRV; CTNNB1; DEM; ETM1; FANCD2; FIH; FOXL2; GBE1; GLB1; GLC1C; GNAI2; GNAT1; GP9; GPX1; HGD; HRG; ITIH1; KNG; LPP; LRS1; MCCC1; MDS1; MHS4; MITF; MLH1; MYL3; MYMY; OPA1; P2RY12; PBXP1; PCCB; POU1F1; PPARG; PROS1; PTHR1; RCA1; RHO; SCA7; SCLC1; SCN5A; SI; SLC25A20; SLC2A2; TF; TGFBR2; THPO; THRB; TKT; TM4SF1; TRH; UMPS; UQCRC1; USH3A; VHL; WS2A; XPC; ZNF35; ADH1B; ADH1C; AFP; AGA; AIH2; ALB; ASMD; BFHD; CNGA1; CRBM; DCK; DSPP; DTDP2; ELONG; ENAM; ETFDH; EVC; F11; FABP2; FGA; FGB; FGFR3; FGG; FSHMD1A; GC; GNPTA; GNRHR; GYPA; HCA; HCL2; HD; HTN3; HVBS6; IDUA; IF; JPD; KIT; KLKB1; LQT4; MANBA; MLLT2; MSX1; MTP; NR3C2; PBT; PDE6B; PEE1; PITX2; PKD2; QDPR; SGCB; SLC25A4; SNCA; SOD3; STATH; TAPVR1; TYS; WBS2; WFS1; WHCR; ADAMTS2; ADRB2; AMCN; AP3B1; APC; ARSB; B4GALT7; BHR1; C6; C7; CCAL2; CKN1; CMDJ; CRHBP; CSF1R; DHFR; DIAPH1; DTR; EOS; EPD; ERVR; F12; FBN2; GDNF; GHR; GLRA1; GM2A; HEXB; HSD17B4; ITGA2; KFS; LGMD1A; LOX; LTC4S; MAN2A1; MCC; MCCC2; MSH3; MSX2; NR3C1; PCSK1; PDE6A; PFBI; RASA1; SCZD1; SDHA; SGCD; SLC22A5; SLC26A2; SLC6A3; SM1; SMA@; SMN1; SMN2; SPINK5; TCOF1; TELAB1; TGFBI; ALDH5A1; ARG1; AS; ASSP2; BCKDHB; BF; C2; C4A; CDKN1A; COL10A1; COL11A2; CYP21A2; DYX2; EJM1; ELOVL4; EPM2A; ESR1; EYA4; F13A1; FANCE; GCLC; GJA1; GLYS1; GMPR; GSE; HCR; HFE; HLA-A; HLA-DPB1; HLA-DRA; HPFH; ICS1; IDDM1; IFNGR1; IGAD1; IGF2R; ISCW; LAMA2; LAP; LCA5; LPA; MCDR1; MOCS1; MUT; MYB; NEU1; NKS1; NYS2; OA3; ODDD; OFC1; PARK2; PBCA; PBCRA1; PDB1; PEX3; PEX6; PEX7; PKHD1; PLA2G7; PLG; POLH; PPAC; PSORS1; PUJO; RCD1; RDS; RHAG; RP14; RUNX2; RWS; SCA1; SCZD3; SIASD; SOD2; ST8; TAP1; TAP2; TFAP2B; TNDM; TNF; TPBG; TPMT; TULP1; WISP3; AASS; ABCB1; ABCB4; ACHE; AQP1; ASL; ASNS; AUTS1; BPGM; BRAF; C7orf2; CACNA2D1; CCM1; CD36; CFTR; CHORDOMA; CLCN1; CMH6; CMT2D; COL1A2; CRS; CYMD; DFNA5; DLD; DYT11; EEC1; ELN; ETV1; FKBP6; GCK; GHRHR; GHS; GLI3; GPDS1; GUSB; HLXB9; HOXA13; HPFH2; HRX; IAB; IMMP2L; KCNH2; LAMB1; LEP; MET; NCF1; NM; OGDH; OPN1SW; PEX1; PGAM2; PMS2; PON1; PPP1R3A; PRSS1; PTC; PTPN12; RP10; RP9; SERPINE1; SGCE; SHFM1; SHH; SLC26A3; SLC26A4; SLOS; SMAD1; TBXAS1; TWIST; ZWS1; ACHM3; ADRB3; ANK1; CA1; CA2; CCAL1; CLN8; CMT4A;
2
CNGB3; COH1; CPP; CRH; CYP11B1; CYP11B2; DECR1; DPYS; DURS1; EBS1; ECA1; EGI; EXT1; EYA1; FGFR1; GNRH1; GSR; GULOP; HR; KCNQ3; KFM; KWE; LGCR; LPL; MCPH1; MOS; MYC; NAT1; NAT2; NBS1; PLAT; PLEC1; PRKDC; PXMP3; RP1; SCZD6; SFTPC; SGM1; SPG5A; STAR; TG; TRPS1; TTPA; VMD1; WRN; ABCA1; ABL1; ABO; ADAMTS13; AK1; ALAD; ALDH1A1; ALDOB; AMBP; AMCD1; ASS; BDMF; BSCL; C5; CDKN2A; CHAC; CLA1; CMD1B; COL5A1; CRAT; DBH; DNAI1; DYS; DYT1; ENG; FANCC; FBP1; FCMD; FRDA; GALT; GLDC; GNE; GSM1; GSN; HSD17B3; HSN1; IBM2; INVS; JBTS1; LALL; LCCS1; LCCS; LGMD2H; LMX1B; MLLT3; MROS; MSSE; NOTCH1; ORM1; PAPPA; PIP5K1B; PTCH; PTGS1; RLN1; RLN2; RMRP; ROR2; RPD1; SARDH; SPTLC1; STOM; TDFA; TEK; TMC1; TRIM32; TSC1; TYRP1; XPA; CACNB2; COL17A1; CUBN; CXCL12; CYP17; CYP2C19; CYP2C9; EGR2; EMX2; ERCC6; FGFR2; HK1; HPS1; IL2RA; LGI1; LIPA; MAT1A; MBL2; MKI67; MXI1; NODAL; OAT; OATL3; PAX2; PCBD; PEO1; PHYH; PNLIP; PSAP; PTEN; RBP4; RDPA; RET; SFTPA1; SFTPD; SHFM3; SIAL; THC2; TLX1; TNFRSF6; UFS; UROS; AA; ABCC8; ACAT1; ALX4; AMPD3; ANC; APOA1; APOA4; APOC3; ATM; BSCL2; BWS; CALCA; CAT; CCND1; CD3E; CD3G; CD59; CDKN1C; CLN2; CNTF; CPT1A; CTSC; DDB1; DDB2; DHCR7; DLAT; DRD4; ECB2; ED4; EVR1; EXT2; F2; FSHB; FTH1; G6PT1; G6PT2; GIF; HBB; HBBP1; HBD; HBE1; HBG1; HBG2; HMBS; HND; HOMG2; HRAS; HVBS1; IDDM2; IGER; INS; JBS; KCNJ11; KCNJ1; KCNQ1; LDHA; LRP5; MEN1; MLL; MYBPC3; MY07A; NNO1; OPPG; OPTB1; PAX6; PC; PDX1; PGL2; PGR; PORC; PTH; PTS; PVRL1; PYGM; RAG1; RAG2; ROM1; RRAS2; SAA1; SCA5; SCZD2; SDHD; SERPING1; SMPD1; TCIRG1; TCL2; TECTA; TH; TREH; TSG101; TYR; USH1C; VMD2; VRNI; WT1; WT2; ZNF145; A2M; AAAS; ACADS; ACLS; ACVRL1; ALDH2; AMHR2; AOM; AQP2; ATD; ATP2A2; BDC; C1R; CD4; CDK4; CNA1; COL2A1; CYP27B1; DRPLA; ENUR2; FEOM1; FGF23; FPF; GNB3; GNS; HAL; HBP1; HMGA2; HMN2; HPD; IGF1; KCNA1; KERA; KRAS2; KRT1; KRT2A; KRT3; KRT4; KRT5; KRT6A; KRT6B; KRTHB6; LDHB; LYZ; MGCT; MPE; MVK; MYL2; OAP; PAH; PPKB; PRB3; PTPN11; PXR1; RLS; RSN; SAS; SAX1; SCA2; SCNN1A; SMAL; SPPM; SPSMA; TBX3; TBX5; TCF1; TPI1; TSC3; ULR; VDR; VWF; ATP7B; BRCA2; BRCD1; CLN5; CPB2; ED2; EDNRB; ENUR1; ERCC5; F10; F7; GJB2; GJB6; IPF1; MBS1; MCOR; NYS4; PCCA; RB1; RHOK; SCZD7; SGCG; SLC10A2; SLC25A15; STARP1; ZNF198; ACHM1; ARVD1; BCH; CTAA1; DAD1; DFNB5; EML1; GALC; GCH1; IBGC1; IGH@; IGHC grupu; IGHG1; IGHM; IGHR; IV; LTBP2; MCOP; MJD; MNG1; MPD1; MPS3C; MYH6; MYH7; NP; NPC2; PABPN1; PSEN1; PYGL; RPGRIP1; SERPINA1; SERPINA3; SERPINA6; SLC7A7; SPG3A; SPTB; TCL1A; TGM1; TITF1; TMIP; TRA@; TSHR; USH1A; VP; ACCPN; AH02; ANCR; B2M; BBS4; BLM; CAPN3; CDAN1; CDAN3; CLN6; CMH3; CYP19; CYP1A1; CYP1A2; DYX1; EPB42; ETFA; EYCL3; FAH; FBN1; FES; HCVS; HEXA; IVD; LCS1; LIPC; MYO5A; OCA2; OTSC1; PWCR; RLBP1; SLC12A1; SPG6; TPM1; UBE3A; WMS; ABCC6; ALDOA; APRT; ATP2A1; BBS2; CARD15; CATM; CDH1; CETP; CHST6; CLN3; CREBBP; CTH; CTM; CYBA; CYLD; DHS; DNASE1; DPEP1; ERCC4; FANCA; GALNS; GAN; HAGH; HBA1; HBA2; HBHR; HBQ1; HBZ; HBZP; HP; HSD11B2; IL4R; LIPB; MC1R; MEFV; MHC2TA; MLYCD; MMVP1; PHKB; PHKG2; PKD1; PKDTS; PMM2; PXE; SALL1; SCA4; SCNN1B; SCNN1G; SLC12A3; TAT; TSC2; VDI; WT3; ABR; ACACA; ACADVL; ACE; ALDH3A2; APOH; ASPA; AXIN2; BCL5; BHD; BLMH; BRCA1; CACD; CCA1; CCZS; CHRNB1; CHRNE; CMT1A; COL1A1; CORD5; CTNS; EPX; ERBB2; G6PC; GAA; GALK1; GCGR; GFAP; GH1; GH2; GP1BA; GPSC; GUCY2D; ITGA2B; ITGB3; ITGB4; KRT10; KRT12; KRT13; KRT14; KRT14L1; KRT14L2; KRT14L3; KRT16; KRT16L1; KRT16L2; KRT17; KRT9; MAPT; MDB; MDCR; MGI; MHS2; MKS1; MPO; MYO15A; NAGLU; NAPB; NF1; NME1; P4HB; PAFAH1B1; PECAM1; PEX12; PHB; PMP22; PRKAR1A; PRKCA; PRKWNK4; PRP8; PRPF8; PTLAH; RARA; RCV1; RMSA1; RP17; RSS; SCN4A; SERPINF2; SGCA; SGSH; SHBG; SLC2A4; SLC4A1; SLC6A4; SMCR; SOST; SOX9; SSTR2; SYM1; SYNS1; TCF2; THRA; TIMP2; TOC; TOP2A; TP53; TRIM37; VBCH; ATP8B1; BCL2; CNSN; CORD1; CYB5; DCC; F5F8D; FECH; FEO; LAMA3; LCFS2; MADH4; MAFD1; MC2R; MCL; MYP2; NPC1; SPPK; TGFBRE; TGIF; TTR; AD2; AMH; APOC2; APOE; ATHS; BAX; BCKDHA; BCL3; BFIC; C3; CACNA1A; CCO; CEACAM5; COMP; CRX; DBA; DDU; DFNA4; DLL3; DM1; DMWD; E11S; ELA2; EPOR; ERCC2; ETFB; EXT3; EYCL1; FTL; FUT1; FUT2; FUT6; GAMT; GCDH; GPI; GUSM; HB1; HCL1; HHC2; HHC3; ICAM3; INSR; JAK3; KLK3; LDLR; LHB; LIG1; LOH19CR1; LYL1; MAN2B1; MCOLN1; MDRV; MLLT1; NOTCH3; NPHS1; OFC3; OPA3; PEPD; PRPF31; PRTN3; PRX; PSG1; PVR; RYR1; SLC5A5; SLC7A9; STK11; TBXA2R; TGFB1; TNNI3; TYROBP; ADA; AHCY; AVP; CDAN2; CDPD1; CHED1; CHED2; CHRNA4; CST3; EDN3; EEGV1; FTLL1; GDF5; GNAS; GSS; HNF4A; JAG1; KCNQ2; MKKS; NBIA1; PCK1; PI3; PPCD; PPGB; PRNP; THBD; TOP1; AIRE; APP; CBS; COL6A1; COL6A2; CSTB; DCR; DSCR1; FPDMM; HLCS; HPE1; ITGB2; KCNE1; KNO; PRSS7; RUNX1; SOD1; TAM; ADSL; ARSA; BCR; CECR; CHEK2; COMT; CRYBB2; CSF2RB; CTHM; CYP2D6; CYP2D7P1; DGCR; DIA1; EWSR1; GGT1; MGCR; MN1; NAGA; NF2; OGS2; PDGFB; PPARA; PRODH; SCO2; SCZD4; SERPIND1; SLC5A1; SOX10; TCN2; TIMP3; TST; VCF; ABCD1; ACTL1; ADFN;
4
AGMX2; AHDS; AIC; AIED; AIH3; ALAS2; AMCD; AMELX; ANOP1; AR; ARAF1; ARSC2; ARSE; ARTS; ARX; ASAT; ASSP5; ATP7A; ATRX; AVPR2; BFLS; BGN; BTK; BZX; C1HR; CACNA1F; CALB3; CBBM; CCT; CDR1; CFNS; CGF1; CHM; CHR39C; CIDX; CLA2; CLCN5; CLS; CMTX2; CMTX3; CND; COD1; COD2; COL4A5; COL4A6; CPX; CVD1; CYBB; DCX; DFN2; DFN4; DFN6; DHOF; DIAPH2; DKC1; DMD; DSS; DYT3; EBM; EBP; ED1; ELK1; EMD; EVR2; F8; F9; FCP1; FDPSL5; FGD1; FGS1; FMR1; FMR2; G6PD; GABRA3; GATA1; GDI1; GDXY; GJB1; GK; GLA; GPC3; GRPR; GTD; GUST; HMS1; HPRT1; HPT; HTC2; HTR2C; HYR; IDS; IHG1; IL2RG; INDX; IP1 ; IP2; JMS; KAL1; KFSD; L1CAM; LAMP2; MAA; MAFD2; MAOA; MAOB; MCF2; MCS; MEAX; MECP2; MF4; MGC1; MIC5; MIDI; MLLT7; MLS; MRSD; MRX14; MRX1; MRX20; MRX2; MRX3; MRX40; MRXA; MSD; MTM1; MYCL2; MYP1; NDP; NHS; NPHL1; NR0B1; NSX; NYS1; NYX; OA1; OASD; OCRL; ODT1; OFD1; OPA2; OPD1; OPEM; OPN1LW; OPN1MW; OTC; P3; PDHA1; PDR; PFC; PFKFB1; PGK1; PGK1P1; PGS; PHEX; PHKA1; PHKA2; PHP; PIGA; PLP1; POF1; POLA; POU3F4; PPMX; PRD; PRPS1; PRPS2; PRS; RCCP2; RENBP; RENS1; RP2; RP6; RPGR; RPS4X; RPS6KA3; RS1; S11; SDYS; SEDL; SERPINA7; SH2D1A; SHFM2; SLC25A5; SMAX2; SRPX; SRS; STS; SYN1; SYP; TAF1; TAZ; TBX22; TDD; TFE3; THAS; THC; TIMM8A; TIMP1; TKCR; TNFSF5; UBE1; UBE2A; WAS; WSN; WTS; WWS; XIC; XIST; XK; XM; XS; ZFX; ZIC3; ZNF261; ZNF41; ZNF6; AMELY; ASSP6; AZF1; AZF2; DAZ; GCY; RPS4Y; SMCY; SRY; ZFY; ABAT; AEZ; AFA; AFD1; ASAH1; ASD1; ASMT; CCAT; CECR9; CEPA; CLA3; CLN4; CSF2RA; CTS1; DF; DIH1; DWS; DYT2; DYT4; EBR3; ECT; EEF1A1L14; EYCL2; FANCB; GCSH; GCSL; GIP; GTS; HHG; HMI; HOAC; HOKPP2; HRPT1; HSD3B3; HTC1; HV1S; ICHQ; ICR1; ICR5; IL3RA; KAL2; KMS; KRT18; KSS; LCAT; LHON; LIMM; MANBB; MCPH2; MEB; MELAS; MIC2; MPFD; MS; MSS; MTATP6; MTCO1; MTC03; MTCYB; MTND1; MTND2; MTND4; MTND5; MTND6; MTRNR1; MTRNR2; MTTE; MTTG; MTTI; MTTK; MTTL1; MTTL2; MTTN; MTTP; MTTS1; NAMSD; OCD1; OPD2; PCK2; PCLD; PCOS1; PFKM; PKD3; PRCA1; PRO1; PROP1; RBS; RFXAP; RP; SHOX; SLC25A6; SPG5B; STO; SUOX; THM; ili TTD.
Primer 27: Tretman vazospazma dopremanjem modifikovanih iRNK koji kodiraju iNOS u tkiva u organizmu
RNK koja sadrži pseudouridinsku ili nukleozidnu modifikaciju a koja kodira inducibilnu azot oksid sintazu (iNOS) doprema se u vaskularni endotel u životinjskom modelu vazospazma (npr. subarahnoidnog krvarenja), pa se ocenjuje njeno dejstvo na bolest kao što je opisano u Pradilla G, Wang PP, et al, Prevention of vasospasm by anti-CD11/CD18 monoclonal antibody therapy following subarachnoid hemorrhage in rabbits. J Neurosurg 2004;101(1): 88-92) ili Park S, Yamaguchi M, et al, Neurovascular protection reduces early brain injury after subarachnoid hemorrhage. Stroke 2004;35(10): 2412-7). Primena RNK poboljšava stanje kod bolesti.
Primer 28: Ponovno uspostavljanje rasta kose dopremanjem modifikovane RNK koja kodira imunosupresivni protein
RNK koja sadrži pseudouridinsku ili nukleozidnu modifikaciju a koja kodira telomerazu ili imunosupresivni protein (npr. α- MSH, TGF-β1 ili IGF-I) se doprema u folikule dlaka životinja korišćenih u životinjskom modelu gubitka kose ili ćelavljenja, pa se ocenjuje njeno dejstvo na rast kose kao što je opisano u Jiang J, Tsuboi R, et al, Topical application of ketoconazole stimulates hair growth in C3H/HeN mice. J Dermatol 2005;32(4): 243-7) ili McElwee KJ, Freyschmidt-Paul P, et al, Transfer of CD8(+) cells induces localized hair loss whereas CD4(+)/CD25(-) cells promote systemic alopecia areata and CD4(+)/CD25(+) cells blockade disease onset in the C3H/HeJ mouse model. J Invest Dermatol 2005; 124(5): 947-57). Primena RNK vraća rast kose.
Primer 29: Sinteza in vitro transkribovanog RNK molekula sa izmenjenim nukleozidima koji sadrži siRNK
Dvolančani molekul RNK (dsRNK) koji sadrži pseudouridin ili modifikovani nukleozid i dodatno sadrži malu interferirajuću RNK (siRNK) ili kratku RNK oblika kratke ukosnice (shRNK) sintetisan je prema sledećoj proceduri: komplementarni RNK lanci sa željenom sekvencom koja sadrži uridin ili 1 ili više modifikovanih nukleozida sintetisani su in vitro transkripcijom (npr. pomoću T7, SP6 ili T3 fagne RNK polimeraze) kao što je opisano u primeru 2. Molekuli dsRNK pokazuju smanjenu imunogeničnost. U drugim eksperimentima, dsRNK molekuli su dizajnirani tako da dejstvom drugih enzima daju željene siRNK ili shRNK. Zbog toga što se molekuli dsRNK od nekoliko stotina nukleotida lako sintetišu, svaki dsRNK može takođe da bude osmišljen tako da sadrži nekoliko siRNK ili shRNK molekula, kako bi se olakšalo dopremanje više siRNK ili shRNK u jednu ciljnu ćeliju.
Primer 30: Upotreba in vitro transkribovanog RNK molekula sa izmenjenim nukleozidima za dopremanje siRNK
Molekul dsRNK iz prethodnog primera je kompleksiran sa reagensom za transfekciju (npr. katjonski reagens za transfekciju, reagens za transfekciju na bazi lipida, reagens za transfekciju na bazi proteina, reagens za transfekciju na bazi polietilenimina, ili kalcijum fosfat) i dopremljen u ciljnu ćeliju. Enzimi unutar, ili na površini ciljne ćelije degradiraju dsRNK do željenih siRNK ili shRNK molekula. Ovaj postupak delotvorno utišava (zaustavlja) transkripciju jednog ili više ćelijskih gena koji odgovaraju sekvencama siRNK ili shRNK.
Primer 31: Ispitivanje dejstva dodatnih modifikacija nukleozida na imunogeničnost RNK i efikasnost translacije
U in vitro transkribovanu RNK uvedene su dodatne nukleozidne modifikacije, pomoću postupaka opisanih iznad u primerima 2 i 7, pa su ispitana njihova dejstva na imunogeničnost i efikasnost translacije, kao što je opisano u primerima 1-8 i 9-15, redom. Pronađeno je da određene dodatne modifikacije smanjuju imunogeničnost i unapređuju translaciju. Ove modifikacije su dodatna rešenja inventivne upotrebe prema predmetnom pronalasku.
Modifikacije koje su ispitane obuhvataju, npr. m<1>A; m<2>A; Am; ms<2>m<6>A; i<6>A; ms<2>i<6>A; io<6>A; ms<2>io<6>A; g<6>A; t<6>A; ms<2>t<6>A; m<6>t<6>A; hn<6>A; ms<2>hn<6>A; Ar(p); I; m<1>I; m<1>Im; m<3>C; Cm; s<2>C; ac<4>C; f<5>C; m<5>Cm; ac<4>Cm; k<2>C; m<1>G; m<2>G; m<7>G; Gm; m<22>G; m<2>Gm; m<22>Gm; Gr(p); yW; o<2>yW; OHyW; OHyW∗; imG; mimG; Q; oQ; galQ; manQ; preQ<0>; preQ<1>; G+; D; m5Um; m<1>Ψ; Ψm; s<4>U; m<5>s<2>U; s<2>Um; acp<3>U; ho<5>U; mo<5>U; cmo<5>U; mcmo<5>U; chm<5>U; mchm<5>U; mcm<5>U; mcm<5>Um; mcm<5>s<2>U; nm<5>s<2>U; mnm<5>U; mnm<5>s<2>U; mnm<5>se<2>U; ncm<5>U; ncm<5>Um; cmnm<5>U; cmnm<5>Um; cmnm<5>s<2>U; m<62>A; Im; m<4>C; m<4>Cm; hm<5>C; m<3>U; m<1>acp<3>Ψ; cm<5>U; m<6>Am; m<62>Am; m<2.7>G; m<2,2,7>G; m<3>Um; m<5>D; m<3>Ψ; f<5>Cm; m<1>Gm; m<1>Am; τm<5>U; τm<5>s<2>U; imG<-14>; imG<2>; i ac<6>A.

Claims (3)

Patentni zahtevi
1. Upotreba Ψ ili m<1>Ψ (1-metilpseudouridina) u in vitro sintetisanom iRNK, oligoribonukleotidnom ili poliribonukleotidnom molekulu u cilju smanjenja imunogeničnosti navedenog in vitro sintetisanog iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula, naznačena time što takvo smanjenje imunogeničnosti navedenog in vitro sintetisanog iRNK, oligoribonukleotidnog ili poliribonukleotidnog molekula koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ može da se detektuje najmanje sledećim postupkom, gde navedeni postupak podrazumeva korake:
a) dovođenja u dodir mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim iRNK, oligoribonukleotidnim ili poliribonukleotidnim molekulom koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ i, odvojeno, dovođenje u dodir mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim iRNK, oligoribonukleotidnim ili poliribonukleotidnim molekulom koji ne sadrži Ψ ili m<1>Ψ; i
b) merenja količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 izlučene kao odgovor na kontakt mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim iRNK, oligoribonukleotidnim ili poliribonukleotidnim molekulom koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ , i, odvojeno, merenje količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 izlučene kao odgovor na kontakt mišje ili humane dendritske ćelije sa in vitro sintetisanim iRNK, oligoribonukleotidnim ili poliribonukleotidnim molekulom koji ne sadrži Ψ ili m<1>Ψ, gde je količina IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 koja se izluči iz humane ili mišje dendritske ćelije u odgovor na navedeni kontakt sa in vitro sintetisanim iRNK, oligoribonukleotidnim ili poliribonukleotidnim molekulom koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ manja od odgovarajuće količine IL-12, IFN-α, TNF-α, RANTES, MIP- 1α, MIP-1β, IL-6, IFN-β ili IL-8 koja se izluči iz mišje ili humane dendritske ćelije u odgovor na takav kontakt sa odgovarajućim in vitro sintetisanim iRNK, oligoribonukleotidnim ili poliribonukleotidnim molekulom koji ne sadrži navedeni Ψ ili m<1>Ψ.
2. Upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što navedeni in vitro sintetisani iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul koji sadrži Ψ ili m<1>Ψ dalje sadrži m<5>C (5-metilcitidin).
3. Upotreba prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačena time što navedeni in vitro sintetisani iRNK, oligoribonukleotidni ili poliribonukleotidni molekul kodira rekombinantni protein izabran iz grupe koja se sastoji od eritropojetina (EPO); enzima kojeg je moguće detektovati izabranog iz grupe koja se sastoji od luciferaze svica, renila luciferaze, bakterijske beta-galaktozidaze (lacZ) i zelenog fluorescentnog proteina (GFP); transkripcionog faktora izabranog iz grupe koja se sastoji od MYC i SRY i MCOP; faktora rasta ili citokina izabranog iz grupe koja se sastoji od faktora rasta izvedenog iz trombocita (PDGF), faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF), transformišućeg faktora rasta beta 1 (TGF-beta1), faktora rasta nalik insulinu (IGF), alfa-melanocit stimulišućeg hormona (alfa-MSH); faktora rasta nalik insulinu I (IGF-I); IL-4; IL-13 i IL-10; inducibilne azot oksid sintaze (iNOS); proteina termičkog šoka; regulatora transmembranske provodljivosti kod cistične fibroze (CFTR); enzima sa antioksidaznom aktivnošću izabranom iz grupe koja se sastoji od katalaze, fosfolipid hidroperoksid glutation peroksidaze, superoksid dizmutaze 1 i superoksid dizmutaze 2; Bartonove tirozin kinaze; adenozin deaminaze; ekto-nukleozid trifosfat difosfohidrolaze; ABCA4; ABCD3; ACADM; AGL; AGT; ALDH4A1; ALPL; AMPD1; APOA2; AVSD1; BRCD2; C1QA; C1QB; C1QG; C8A; C8B; CACNA1S; CCV; CD3Z; CDC2L1; CHML; CHS1; CIAS1; CLCNKB; CMD1A; CMH2; CMM; COL11A1; COL8A2; COL9A2; CPT2; CRB1; CSE; CSF3R; CTPA; CTSK; DBT; DIO1; DISC1; DPYD; EKV; ENO1; ENO1P; EPB41; EPHX1; F13B; F5; FCGR2A; FCGR2B; FCGR3A; FCHL; FH; FMO3; FMO4; FUCA1; FY; GALE; GBA; GFND; GJA8; GJB3; GLC3B; HF1; HMGCL; HPC1; HRD; HRPT2; HSD3B2; HSPG2; KCNQ4; KCS; KIF1B; LAMB3; LAMC2; LGMD1B; LMNA; LOR; MCKD1; MCL1; MPZ; MTHFR; MTR; MUTYH; MYOC; NB; NCF2; NEM1; NPHS2; NPPA; NRAS; NTRK1; OPTA2; PBX1; PCHC; PGD; PHA2A; PHGDH; PKLR; PKP1; PLA2G2A; PLOD; PPOX; PPTO; PRCC; PRG4; PSEN2; PTOS1; REN; RFX5; RHD; RMD1; RPE65; SCCD; SERPINC1; SJS1; SLC19A2; SLC2A1; SPG23; SPTA1; TAL1; TNFSF6; TNNT2; TPM3; TSHB; UMPK; UOX; UROD; USH2A; VMGLOM; VWS; WS2B; ABCB11; ABCG5; ABCG8; ACADL; ACP1; AGXT; AHHR; ALMS1; ALPP; ALS2; APOB; BDE; BDMR; BJS; BMPR2; CHRNA1; CMCWTD; CNGA3; COL3A1; COLAA3; COL4A4; COL6A3; CPS1; CRYGA; CRYGEP1; CYP1B1; CYP27A1; DBI; DES; DYSF; EDAR; EFEMP1; EIF2AK3; ERCC3; FSHR; GINGF; GLC1B; GPD2; GYPC; HADHA; HADHB; HOXD13; HPE2; IGKC; IHH; IRS1; ITGA6; KHK; KYNU; LCT; LHCGR; LSFC; MSH2; MSH6; NEB; NMTC; NPHP1; PAFAH1P1; PAX3; PAX8; PMS1; PNKD; PPH1; PROC; REG1A; SAG; SFTPB; SLC11A1; SLC3A1; SOS1; SPG4; SRD5A2; TCL4; TGFA; TMD; TPO; UGT1A@; UV24; WSS; XDH; ZAP70; ZFHX1B; ACAA1; AGS1; AGTR1; AHSG; AMT; ARMET; BBS3; BCHE; BCPM; BTD; CASR; CCR2; CCR5; CDL1; CMT2B; COL7A1; CP; CPO; CRV; CTNNB1; DEM; ETM1; FANCD2; FIH; FOXL2; GBE1; GLB1; GLCLC; GNAI2; GNAT1; GP9; GPX1; HGD; HRG; ITIH1; KNG; LPP; LRS1; MCCC1; MDS1; MHS4; MITF; MLH1; MYL3; MYMY; OPA1; P2RY12; PBXP1; PCCB; POU1F1; PPARG; PROS1; PTHR1; RCA1; RHO; SCA7; SCLC1; SCN5A; SI; SLC25A20; SLC2A2; TF; TGFBR2; THPO; THRB; TKT; TM4SF1; TRH; UMPS; UQCRC1; USH3A; VHL; WS2A; XPC; ZNF35; ADH1B; ADH1C; AFP; AGA; AIH2; ALB; ASMD; BFHD; CNGA1; CRBM; DCK; DSPP; DTDP2; ELONG; ENAM; ETFDH; EVC; F11; FABP2; FGA; FGB; FGFR3; FGG; FSHMD1A; GC; GNPTA; GNRHR; GYPA; HCA; HCL2; HD; HTN3; HVBS6; IDUA; IF; JPD; KIT; KLKB1; LQT4; MANBA; MLLT2; MSX1; MTP; NR3C2; PBT; PDE6B; PEE1; PITX2; PKD2; QDPR; SGCB; SLC25A4; SNCA; SOD3; STATH; TAPVR1; TYS; WBS2; WFS1; WHCR; ADAMTS2; ADRB2; AMCN; AP3B1; APC; ARSB; B4GALT7; BHR1; C6; C7; CCAL2; CKN1; CMDJ; CRHBP; CSF1R; DHFR; DIAPH1; DTR; EOS; EPD; ERVR; F12; FBN2; GDNF; GHR; GLRA1; GM2A; HEXB; HSD17B4; ITGA2; KFS; LGMDLA; LOX; LTC4S; MAN2A1; MCC; MCCC2; MSH3; MSX2; NR3C1; PCSK1; PDE6A; PFBI; RASA1; SCZD1; SDHA; SGCD; SLC22A5; SLC26A2; SLC6A3; SM1; SMA@; SMN1; SMN2; SPINK5; TCOF1; TELAB1; TGFBI; ALDH5A1; ARG1; AS; ASSP2; BCKDHB; BF; C2; C4A; CDKN1A; COL10A1; COL11A2; CYP21A2; DYX2; EJM1; ELOVL4; EPM2A; ESR1; EYA4; F13A1; FANCE; GCLC; GJA1; GLYS1; GMPR; GSE; HCR; HFE; HLA-A; HLA-DPB1; HLA-DRA; HPFH; ICS1; IDDM1; IFNGR1; IGAD1; IGF2R; ISCW; LAMA2; LAP; LCA5; LPA; MCDR1; MOCS1; MUT; MYB; NEU1; NKS1; NYS2; OA3; ODDD; OFC0; PARK2; PBCA; PBCRA1; PDB1; PEX3; PEX6; PEX7; PKHD1; PLA2G7; PLG; POLH; PPAC; PSORS1; PUJO; RCD1; RDS; RHAG; RP14; RUNX2; RWS; SCA1; SCZD3; SIASD; SOD2; ST8; TAP1; TAP2; TFAP2B; TNDM; TNF; TPBG; TPMT; TULP1; WISP3; AASS; ABCB1; ABCB4; ACHE; AQP1; ASL; ASNS; AUTS1; BPGM; BRAF; C7orf2; CACNA2D1; CCM1; CD36; CFTR; CHORDOMA; CLCN1; CMH6; CMT2D; COL1A2; CRS; CYMD; DFNA5; DLD; DYT11; EEC1; ELN; ETV1; FKBP6; GCK; GHRHR; GHS; GLI3; GPDS1; GUSB; HLXB9; HOXA13; HPFH2; HRX; IAB; IMMP2L; KCNH2; LAMBI; LEP; MET; NCF1; NM; OGDH; OPN1SW; PEX1; PGAM2; PMS2; PON1; PPP1R3A; PRSS1; PTC; PTPN12; RP10; RP9; SERPINE1; SGCE; SHFM1; SHH; SLC26A3; SLC26A4; SLOS; SMAD1; TBXAS1; TWIST; ZWS1; ACHM3; ADRB3; ANK1; CA1; CA2; CCAL1; CLN8; CMT4A; CNGB3; COH1; CPP; CRH; CYP11B1; CYP11B2; DECR1; DPYS; DURS1; EBS1; ECA1; EGI; EXT1; EYA1; FGFR1; GNRH1; GSR; GULOP; HR; KCNQ3; KFM; KWE; LGCR; LPL; MCPH1; MOS; MYC; NAT1; NAT2; NBS1; PLAT; PLEC1; PRKDC; PXMP3; RP1; SCZD6; SFTPC; SGM1; SPG5A; STAR; TG; TRPS1; TTPA; VMD1; WRN; ABCA1; ABL1; ABO; ADAMTS13; AK1; ALAD; ALDH1A1; ALDOB; AMBP; AMCD1; ASS; BDMF; BSCL; C5; CDKN2A; CHAC; CLA1; CMD1B; COL5A1; CRAT; DBH; DNAI1; DYS; DYT1; ENG; FANCC; FBP1; FCMD; FRDA; GALT; GLDC; GNE; GSM1; GSN; HSD17B3; HSN1; IBM2; INVS; JBTS1; LALL; LCCS1; LCCS; LGMD2H; LMX1B; MLLT3; MROS; MSSE; NOTCH1; ORM1; PAPPA; PIP5K1B; PTCH; PTGS1; RLN1; RLN2; RMRP; ROR2; RPD1; SARDH; SPTLC1; STOM; TDFA; TEK; TMC1; TRIM32; TSC1; TYRP1; XPA; CACNB2; COL17A1; CUBN; CXCL12; CYP17; CYP2C19; CYP2C9; EGR2; EMX2; ERCC6; FGFR2; HK1; HPS1; IL2RA; LGI1; LIPA; MAT1A; MBL2; MKI67; MXI1; NODAL; OAT; OATL3; PAX2; PCBD; PEO1; PHYH; PNLIP; PSAP; PTEN; RBP4; RDPA; RET; SFTPA1; SFTPD; SHFM3; SIAL; THC2; TLX1; TNFRSF6; UFS; UROS; AA; ABCC8; ACAT1; ALX4; AMPD3; ANC; APOAL; APOA4; APOC3; ATM; BSCL2; BWS; CALCA; CAT; CCND1; CD3E; CD3G; CD59; CDKNLC; CLN2; CNTF; CPT1A; CTSC; DDB1; DDB2; DHCR7; DLAT; DRD4; ECB2; ED4; EVR1; EXT2; F2; FSHB; FTH1; G6PT1; G6PT2; GIF; HBB; HBBP1; HBD; HBE1; HBG1; HBG2; HMBS; HND; HOMG2; HRAS; HVBS1; IDDM2; IGER; INS; JBS; KCNJ11; KCNJ1; KCNQ1; LDHA; LRP5; MEN1; MLL; MYBPC3; MYO7A; NNO1; OPPG; OPTB1; PAX6; PC; PDX1; PGL2; PGR; PORC; PTH; PTS; PVRL1; PYGM; RAG1; RAG2; ROM1; RRAS2; SAA1; SCA5; SCZD2; SDHD; SERPING1; SMPD1; TCIRG1; TCL2; TECTA; TH; TREH; TSG101; TYR; USH1C; VMD2; VRNI; WT1; WT2; ZNF145; A2M; AAAS; ACADS; ACLS; ACVRL1; ALDH2; AMHR2; AOM; AQP2; ATD;
1
ATP2A2; BDC; CIR; CD4; CDK4; CNA1; COL2A1; CYP27B1; DRPLA; ENUR2; FEOM1; FGF23; FPF; GNB3; GNS; HAL; HBP1; HMGA2; HMN2; HPD; IGF1; KCNA1; KERA; KRAS2; KRT1; KRT2A; KRT3; KRT4; KRT5; KRT6A; KRT6B; KRTHB6; LDHB; LYZ; MGCT; MPE; MVK; MYL2; OAP; PAH; PPKB; PRB3; PTPN11; PXR1; RLS; RSN; SAS; SAX1; SCA2; SCNN1A; SMAL; SPPM; SPSMA; TBX3; TBX5; TCF1; TPI1; TSC3; ULR; VDR; VWF; ATP7B; BRCA2; BRCD1; CLN5; CPB2; ED2; EDNRB; ENUR1; ERCC5; F10; F7; GJB2; GJB6; IPF1; MBS1; MCOR; NYS4; PCCA; RB1; RHOK; SCZD7; SGCG; SLC10A2; SLC25A15; STARP1; ZNF198; ACHM1; ARVD1; BCH; CTAA1; DAD1; DFNB5; EML1; GALC; GCH1; IBGC1; IGH@; IGHC grupe; IGHG1; IGHM; IGHR; IV; LTBP2; MJD; MNG1; MPD1; MPS3C; MYH6; MYH7; NP; NPC2; PABPN1; PSEN1; PYGL; RPGRIP1; SERPINA1; SERPINA3; SERPINA6; SLC7A7; SPG3A; SPTB; TCL1A; TGM1; TITF1; TMIP; TRA@; TSHR; USHLA; VP; ACCPN; AHO2; ANCR; B2M; BBS4; BLM; CAPN3; CDAN1; CDAN3; CLN6; CMH3; CYP19; CYP1A1; CYP1A2; DYX1; EPB42; ETFA; EYCL3; FAH; FBN1; FES; HCVS; HEXA; IVD; LCS1; LIPC; MY05A; OCA2; OTSC1; PWCR; RLBP1; SLC12A1; SPG6; TPM1; UBE3A; WMS; ABCC6; ALDOA; APRT; ATP2A1; BBS2; CARD15; CATM; CDH1; CETP; CHST6; CLN3; CREBBP; CTH; CTM; CYBA; CYLD; DHS; DNASE1; DPEP1; ERCC4; FANCA; GALNS; GAN; HAGH; HBA1; HBA2; HBHR; HBQ1; HBZ; HBZP; HP; HSD11B2; IL4R; LIPB; MC1R; MEFV; MHC2TA; MLYCD; MMVP1; PHKB; PHKG2; PKD1; PKDTS; PMM2; PXE; SALL1; SCA4; SCNN1B; SCNN1G; SLC12A3; TAT; TSC2; VDI; WT3; ABR; ACACA; ACADVL; ACE; ALDH3A2; APOH; ASPA; AXIN2; BCL5; BHD; BLMH; BRCA1; CACD; CCA1; CCZS; CHRNB1; CHRNE; CMT1A; COL1A1; CORD5; CTNS; EPX; ERBB2; G6PC; GAA; GALK1; GCGR; GFAP; GH1; GH2; GP1BA; GPSC; GUCY2D; ITGA2B; ITGB3; ITGB4; KRT10; KRT12; KRT13; KRT14; KRT14L1; KRT14L2; KRT14L3; KRT16; KRT16L1; KRT16L2; KRT17; KRT9; MAPT; MDB; MDCR; MGI; MHS2; MKS1; MPO; MYO15A; NAGLU; NAPB; NF1; NME1; P4HB; PAFAH1B1; PECAM1; PEX12; PHB; PMP22; PRKAR1A; PRKCA; PRKWNK4; PRP8; PRPF8; PTLAH; RARA; RCV1; RMSA1; RP17; RSS; SCN4A; SERPINF2; SGCA; SGSH; SHBG; SLC2A4; SLC4A1; SLC6A4; SMCR; SOST; SOX9; SSTR2; SYM1; SYNS1; TCF2; THRA; TIMP2; TOC; TOP2A; TP53; TRIM37; VBCH; ATP8B1; BCL2; CNSN; CORD1; CYB5; DCC; F5F8D; FECH; FEO; LAMA3; LCFS2; MADH4; MAFD1; MC2R; MCL; MYP2; NPC1; SPPK; TGFBRE; TGIF; TTR; AD2; AMH; APOC2;
2
APOE; ATHS; BAX; BCKDHA; BCL3; BFIC; C3; CACNA1A; CCO; CEACAM5; COMP; CRX; DBA; DDU; DFNA4; DLL3; DM1; DMWD; E11S; ELA2; EPOR; ERCC2; ETFB; EXT3; EYCL1; FTL; FUT1; FUT2; FUT6; GAMT; GCDH; GPI; GUSM; HB1; HCL1; HHC2; HHC3; ICAM3; INSR; JAK3; KLK3; LDLR; LHB; LIG1; LOH19CR1; LYL1; MAN2B1; MCOLN1; MDRV; MLLT1; NOTCH3; NPHS1; OFC3; OPA3; PEPD; PRPF31; PRTN3; PRX; PSG1; PVR; RYR1; SLC5A5; SLC7A9; STK11; TBXA2R; TGFB1; TNNI3; TYROBP; ADA; AHCY; AVP; CDAN2; CDPD1; CHED1; CHED2; CHRNA4; CST3; EDN3; EEGV1; FTLL1; GDF5; GNAS; GSS; HNF4A; JAG1; KCNQ2; MKKS; NBIA1; PCK1; PI3; PPCD; PPGB; PRNP; THBD; TOP1; AIRE; APP; CBS; COL6A1; COL6A2; CSTB; DCR; DSCR1; FPDMM; HLCS; HPE1; ITGB2; KCNE1; KNO; PRSS7; RUNX1; SOD1; TAM; ADSL; ARSA; BCR; CECR; CHEK2; COMT; CRYBB2; CSF2RB; CTHM; CYP2D6; CYP2D7P1; DGCR; DIA1; EWSR1; GGT1; MGCR; MN1; NAGA; NE2; OGS2; PDGFB; PPARA; PRODH; SCO2; SCZD4; SERPIND1; SLC5A1; SOX10; TCN2; TIMP3; TST; VCF; ABCD1; ACTL1; ADFN; AGMX2; AHDS; AIC; AIED; AIH3; ALAS2; AMCD; AMELX; ANOP1; AR; ARAF1; ARSC2; ARSE; ARTS; ARX; ASAT; ASSP5; ATP7A; ATRX; AVPR2; BFLS; BGN; BTK; BZX; C1HR; CACNA1F; CALB3; CBBM; CCT; CDR1; CFNS; CGF1; CHM; CHR39c; CIDX; CLA2; CLCN5; CLS; CMTX2; CMTX3; CND; COD1; COD2; COL4A5; COL4A6; CPX; CVD1; CYBB; DCX; DFN2; DFN4; DFN6; DHOF; DIAPH2; DKC1; DMD; DSS; DYT3; EBM; EBP; ED1; ELK1; EMD; EVR2; F8; F9; FCP1; FDPSL5; FGD1; FGS1; FMR1; FMR2; G6PD; GABRA3; GATA1; GDI1; GDXY; GJB1; GK; GLA; GPC3; GRPR; GTD; GUST; HMS1; HPRT1; HPT; HTC2; HTR2c; HYR; IDS; IHG1; IL2RG; INDX; IP1; IP2; JMS; KAL1; KFSD; L1CAM; LAMP2; MAA; MAFD2; MAOA; MAOB; MCF2; MCS; MEAX; MECP2; MF4; MGC1; MIC5; MID1; MLLT7; MLS; MRSD; MRX14; MRX1; MRX20; MRX2; MRX3; MRX40; MRXA; MSD; MTM1; MYCL2; MYP1; NDP; NHS; NPHL1; NROB1; NSX; NYS1; NYX; OA1; OASD; OCRL; ODT1; OFD1; OPA2; OPD1; OPEM; OPN1LW; OPN1MW; OTC; P3; PDHA1; PDR; PFC; PFKFB1; PGK1; PGK1P1; PGS; PHEX; PHKA1; PHKA2; PHP; PIGA; PLP1; POF1; POLA; POU3F4; PPMX; PRD; PRPS1; PRPS2; PRS; RCCP2; RENBP; RENS1; RP2; RP6; RPGR; RPS4X; RPS6KA3; RS1; S11; SDYS; SEDL; SERPINA7; SH2D1A; SHFM2; SLC25A5; SMAX2; SRPX; SRS; STS; SYN1; SYP; TAF1; TAZ; TBX22; TDD; TFE3; THAS; THC; TIMM8A; TIM1; TKCR; TNFSF5; UBE1; UBE2A; WAS; WSN; WTS; WWS; XIC; XIST; XK; XM; XS; ZFX; ZIC3; ZNF261; ZNF41; ZNF6; AMELY; ASSP6; AZF1; AZF2; DAZ; GCY; RPS4Y; SMCY; ZFY; ABAT; AEZ; AFA; AFD1; ASAH1; ASD1; ASMT; CCAT; CECR9; CEPA; CLA3; CLN4; CSF2RA; CTS1; DF; DIH1; DWS; DYT2; DYT4; EBR3; ECT; EEF1A1L14; EYCL2; FANCB; GCSH; GCSL; GIP; GTS; HHG; HMI; HOAC; HOKPP2; HRPT1; HSD3B3; HTC1; HV1S; ICHQ; ICR1; ICR5; IL3RA; KAL2; KMS; KRT18; KSS; LCAT; LHON; LIMM; MANBB; MCPH2; MEB; MELAS; MIC2; MPFD; MS; MSS; MTATP6; MTCO1; MTC03; MTCYB; MTND1; MTND2; MTND4; MTND5; MTND6; MTRNR1; MTRNR2; MTTE; MTTG; MTTI; MTTK; MTTL1; MTTL2; MTTN; MTTP; MTTS1; NAMSD; OCD1; OPD2; PCK2; PCLD; PCOS1; PFKM; PKD3; PRCA1; PRO1; PROP1; RBS; RFXAP; RP; SHOX; SLC25A6; SPG5B; STO; SUOX; THM; i TTD.
4
RS20230060A 2005-08-23 2006-08-21 Rnk koja sadrži modifikovane nukleozide i postupci za njenu upotrebu RS63964B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US71016405P 2005-08-23 2005-08-23
EP19168984.3A EP3611266B1 (en) 2005-08-23 2006-08-21 Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63964B1 true RS63964B1 (sr) 2023-03-31

Family

ID=37772217

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230060A RS63964B1 (sr) 2005-08-23 2006-08-21 Rnk koja sadrži modifikovane nukleozide i postupci za njenu upotrebu

Country Status (13)

Country Link
US (10) US8278036B2 (sr)
EP (6) EP4174179B1 (sr)
DK (1) DK2578685T3 (sr)
ES (2) ES2937245T3 (sr)
HR (1) HRP20230113T3 (sr)
HU (1) HUE043492T2 (sr)
LT (1) LT2578685T (sr)
PL (1) PL2578685T3 (sr)
PT (1) PT2578685T (sr)
RS (1) RS63964B1 (sr)
SI (1) SI3611266T1 (sr)
TR (1) TR201909609T4 (sr)
WO (1) WO2007024708A2 (sr)

Families Citing this family (548)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2340499T3 (es) 2001-06-05 2010-06-04 Curevac Gmbh Arnm de antigeno tumoral estabilizado con un contenido de g/c aumentado.
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10347710B4 (de) 2003-10-14 2006-03-30 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Rekombinante Impfstoffe und deren Verwendung
EP4174179B1 (en) 2005-08-23 2025-05-07 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
US20070054873A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Glucocorticoid modulation of nucleic acid-mediated immune stimulation
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
CN101346393B (zh) 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
US7915399B2 (en) * 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
JP5876637B2 (ja) * 2006-10-18 2016-03-02 マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド ニックまたはギャップの入った核酸分子およびそれらの使用
DE102006051516A1 (de) * 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
DE102007001370A1 (de) * 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
JP2010519907A (ja) * 2007-03-02 2010-06-10 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｖｅｇｆファミリー遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
JP2010519912A (ja) * 2007-03-02 2010-06-10 エムディーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｒａｓ遺伝子の発現を抑制するための核酸化合物およびその使用
CA2679757A1 (en) * 2007-03-02 2008-09-12 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting erbb family gene expression and uses thereof
WO2009046739A1 (en) * 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
WO2009127230A1 (en) * 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
WO2010088927A1 (en) * 2009-02-09 2010-08-12 Curevac Gmbh Use of pei for the improvement of endosomal release and expression of transfected nucleic acids, complexed with cationic or polycationic compounds
WO2010123501A1 (en) * 2009-04-22 2010-10-28 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
US10837020B2 (en) 2009-04-22 2020-11-17 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long RNA molecules
CA2766907A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
DK2459231T3 (en) 2009-07-31 2016-09-05 Ethris Gmbh RNA with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
DE102009050308A1 (de) 2009-10-22 2011-05-05 Ludwig-Maximilians-Universität München RNA mit einer Kombination aus unmodifizierten und modifizierten Nucleotiden zur Proteinexpression
WO2011026185A1 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Murdoch Childrens Research Institute An assay for monitoring a neurological condition
ES2666559T3 (es) 2009-12-01 2018-05-07 Translate Bio, Inc. Entrega del mrna para la aumentación de proteínas y enzimas en enfermedades genéticas humanas
AU2015215938B2 (en) * 2009-12-07 2018-01-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
KR102171849B1 (ko) * 2009-12-07 2020-10-30 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 세포 리프로그래밍을 위한 정제된 변형 ｒｎａ를 포함하는 ｒｎａ 제제
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
WO2011130624A2 (en) * 2010-04-16 2011-10-20 Immune Disease Institute, Inc. Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof
PT2591114T (pt) 2010-07-06 2016-08-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Imunização de mamíferos de grande porte com doses baixas de arn
EP2590676B1 (en) 2010-07-06 2016-08-17 GlaxoSmithKline Biologicals SA Virion-like delivery particles for self-replicating rna molecules
LT3243526T (lt) 2010-07-06 2020-02-10 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Rnr pristatymas, skirtas keleto imuninio atsako paleidimui
BR112013000244A2 (pt) 2010-07-06 2016-05-17 Novartis Ag lipossomas com lipídeos apresentando pka vantajoso para administração de rna
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
EP4066857B1 (en) 2010-08-31 2022-12-21 GlaxoSmithKline Biologicals SA Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
CN104531812A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
EP3520813B1 (en) 2010-10-11 2023-04-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen delivery platforms
WO2012075040A2 (en) 2010-11-30 2012-06-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA FOR USE IN TREATMENT OF HUMAN GENETIC DISEASES
US8710200B2 (en) * 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
EP3460064B8 (en) * 2011-04-03 2024-03-20 The General Hospital Corporation d/b/a Massachusetts General Hospital Efficient protein expression in vivo using modified rna (mod-rna)
WO2012158736A1 (en) * 2011-05-17 2012-11-22 modeRNA Therapeutics Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
RU2670745C9 (ru) 2011-05-24 2018-12-13 Бионтех Рна Фармасьютикалс Гмбх Индивидуализированные противоопухолевые вакцины
BR112013031553A2 (pt) * 2011-06-08 2020-11-10 Shire Human Genetic Therapies, Inc. composições, mrna que codifica para uma hgla e seu uso, uso de pelo menos uma molécula de mrna e um veículo de transferência e uso de um mrna que codifica para proteína exógena
US11896636B2 (en) 2011-07-06 2024-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combination compositions and uses thereof
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
BR112014007852B1 (pt) * 2011-10-03 2021-11-03 Moderna Therapeutics, Inc Polinucleotídeo isolado modificado e composição farmacêutica
WO2013078199A2 (en) * 2011-11-23 2013-05-30 Children's Medical Center Corporation Methods for enhanced in vivo delivery of synthetic, modified rnas
US8497124B2 (en) 2011-12-05 2013-07-30 Factor Bioscience Inc. Methods and products for reprogramming cells to a less differentiated state
JP6073916B2 (ja) 2011-12-05 2017-02-01 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 細胞に形質移入するための方法および製品
ES2921724T1 (es) 2011-12-07 2022-08-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lípidos biodegradables para la administración de agentes activos
PL2791160T3 (pl) 2011-12-16 2022-06-20 Modernatx, Inc. Kompozycje zmodyfikowanego mrna
JP2015510495A (ja) * 2011-12-21 2015-04-09 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 器官または器官移植片の生存可能性または寿命を延長する方法
EP2798064B1 (en) 2011-12-30 2016-08-31 Cellscript, Llc Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
MX362981B (es) 2012-03-27 2019-02-28 Curevac Ag Moleculas artificiales de acido nucleico para la expresion mejorada de proteina o peptido.
ES2660129T3 (es) * 2012-03-27 2018-03-20 Curevac Ag Moléculas de ácido nucleico artificiales que comprenden un 5'UTR-TOP
US10501512B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
AU2013243949A1 (en) * 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
HK1206779A1 (en) * 2012-04-02 2016-01-15 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
JP2015519375A (ja) 2012-05-31 2015-07-09 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｐｄ−ｌ１に結合する抗原結合蛋白質
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
CA2873274C (en) 2012-06-08 2021-06-01 Ethris Gmbh Pulmonary delivery of messenger rna
CA2876155C (en) 2012-06-08 2022-12-13 Ethris Gmbh Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
US9512456B2 (en) 2012-08-14 2016-12-06 Modernatx, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of RNA
MX2015002917A (es) 2012-09-07 2015-06-03 Genentech Inc Metodos y composiciones para producir hepatocitos inducidos.
JOP20200308A1 (ar) 2012-09-07 2017-06-16 Novartis Ag جزيئات إرتباط il-18
AU2013337651B2 (en) 2012-11-01 2018-12-13 Factor Bioscience Inc. Methods and products for expressing proteins in cells
DK2922554T3 (en) 2012-11-26 2022-05-23 Modernatx Inc Terminalt modificeret rna
EP2925348B1 (en) 2012-11-28 2019-03-06 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Individualized vaccines for cancer
EP2929035A1 (en) * 2012-12-07 2015-10-14 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipidic nanoparticles for mrna delivering
US20150315541A1 (en) * 2012-12-13 2015-11-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
AU2013374345A1 (en) * 2013-01-17 2015-08-06 Moderna Therapeutics, Inc. Signal-sensor polynucleotides for the alteration of cellular phenotypes
MA38322B1 (fr) 2013-02-08 2018-09-28 Novartis Ag Anticorps anti-il-17a et leur utilisation dans le traitement de troubles auto-immuns et inflammatoires
AU2014218667A1 (en) 2013-02-22 2015-10-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compounds, compositions, methods, and kits relating to telomere extension
EP2968391A1 (en) * 2013-03-13 2016-01-20 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
EP4446413A3 (en) 2013-03-14 2024-12-18 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
WO2014153052A2 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cftr mrna compositions and related methods and uses
EP2971010B1 (en) 2013-03-14 2020-06-10 ModernaTX, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US20160030527A1 (en) * 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and Methods for Treatment of Stroke
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
US10077439B2 (en) 2013-03-15 2018-09-18 Modernatx, Inc. Removal of DNA fragments in mRNA production process
US9957515B2 (en) 2013-03-15 2018-05-01 Cibus Us Llc Methods and compositions for targeted gene modification
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
US9828582B2 (en) 2013-03-19 2017-11-28 Duke University Compositions and methods for the induction and tuning of gene expression
DE102013005361A1 (de) * 2013-03-28 2014-10-02 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Polyribonucleotid
CN115261411A (zh) 2013-04-04 2022-11-01 哈佛学院校长同事会 利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的治疗性用途
WO2014180490A1 (en) 2013-05-10 2014-11-13 Biontech Ag Predicting immunogenicity of t cell epitopes
CA2912665C (en) * 2013-05-15 2021-03-02 Robert Kruse Intracellular translation of circular rna
EP3013964B1 (en) 2013-06-28 2020-05-06 ethris GmbH Compositions for introducing rna into cells
PT3019619T (pt) 2013-07-11 2021-11-11 Modernatx Inc Composições que compreendem polinucleótidos sintéticos que codificam proteínas relacionadas com crispr e sgarn sintéticos e métodos de utilização
JP6516672B2 (ja) 2013-07-26 2019-05-22 京都府公立大学法人 骨芽細胞及びその調製方法
US20160194625A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015051214A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
DE102013111099B4 (de) * 2013-10-08 2023-11-30 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Permanente Genkorrektur mittels nukleotidmodifizierter messenger RNA
ES2707966T3 (es) 2013-10-22 2019-04-08 Translate Bio Inc Terapia de ARNm para la deficiencia en síntesis de argininosuccinato
CN105658242A (zh) 2013-10-22 2016-06-08 夏尔人类遗传性治疗公司 用于苯丙酮尿症的mrna疗法
AU2014340155B2 (en) * 2013-10-22 2018-11-01 Massachusetts Institute Of Technology Lipid formulations for delivery of messenger RNA
WO2015065505A1 (en) * 2013-10-29 2015-05-07 Duke University Use of cyp27a1 inhibitors, statin, or lxr antagonists alone or in combination with conventional therapy for the treatment of breast cancer
WO2015062738A1 (en) 2013-11-01 2015-05-07 Curevac Gmbh Modified rna with decreased immunostimulatory properties
EP3062798B1 (en) 2013-11-01 2020-05-06 CureVac AG Modified rna with decreased immunostimulatory properties
US10801070B2 (en) 2013-11-25 2020-10-13 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
WO2015095351A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag LEPTIN mRNA COMPOSITIONS AND FORMULATIONS
AU2014368898B2 (en) 2013-12-20 2020-06-11 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Combination therapy with neoantigen vaccine
US11254951B2 (en) 2014-12-30 2022-02-22 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
KR102399799B1 (ko) 2013-12-30 2022-05-18 큐어백 아게 인공 핵산 분자
CA2927254C (en) 2013-12-30 2023-10-24 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules
KR102726294B1 (ko) 2014-01-31 2024-11-06 팩터 바이오사이언스 인크. 핵산 제조 및 송달을 위한 방법 및 산물
WO2015127439A1 (en) 2014-02-24 2015-08-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration
EP3110954A1 (en) 2014-02-26 2017-01-04 Ethris GmbH Compositions for gastrointestinal administration of rna
HRP20240186T1 (hr) 2014-03-14 2024-05-10 Cibus Us Llc Postupci i kompozicije za povećanje efikasnosti ciljane modifikacije gena korištenjem reparacije gena posredovane oligonukleotidima
US11179478B2 (en) * 2014-04-01 2021-11-23 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Capped and uncapped RNA molecules and block copolymers for intracellular delivery of RNA
PL3981437T3 (pl) 2014-04-23 2025-02-24 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
CN106164248B (zh) 2014-04-25 2019-10-15 川斯勒佰尔公司 信使rna的纯化方法
CN106659731A (zh) 2014-05-30 2017-05-10 夏尔人类遗传性治疗公司 用于递送核酸的可生物降解脂质
MX382298B (es) 2014-06-10 2025-03-12 Curevac Mfg Gmbh Métodos y medios para aumentar la producción de arn.
GB201410693D0 (en) 2014-06-16 2014-07-30 Univ Southampton Splicing modulation
EP3157573A4 (en) 2014-06-19 2018-02-21 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
JP6599373B2 (ja) 2014-06-24 2019-10-30 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド 核酸の送達のための立体化学的に濃縮した組成物
US20170291939A1 (en) 2014-06-25 2017-10-12 Novartis Ag Antibodies specific for il-17a fused to hyaluronan binding peptide tags
EP3160938B1 (en) 2014-06-25 2020-09-16 Acuitas Therapeutics Inc. Novel lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
EP3169335B8 (en) 2014-07-16 2019-10-09 ModernaTX, Inc. Circular polynucleotides
AU2015289583A1 (en) 2014-07-16 2017-02-02 Modernatx, Inc. Chimeric polynucleotides
WO2016014846A1 (en) * 2014-07-23 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
KR102617137B1 (ko) 2014-09-15 2023-12-27 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 히스톤 h3-리신 트리메틸화를 제거함으로써 체세포 핵 이식(scnt) 효율을 증가시키는 방법 및 조성물
KR20170083534A (ko) 2014-09-19 2017-07-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 키메라 항원 수용체
WO2016045732A1 (en) 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
SG11201702682PA (en) 2014-10-03 2017-04-27 Cold Spring Harbor Lab Targeted augmentation of nuclear gene output
US20160130567A1 (en) 2014-11-02 2016-05-12 Arcturus Therapeutics, Inc. Messenger una molecules and uses thereof
MX2017005834A (es) 2014-11-05 2017-11-17 Voyager Therapeutics Inc Polinucleotidos aad para el tratamiento de la enfermedad de parkinson.
EP3461904A1 (en) 2014-11-10 2019-04-03 ModernaTX, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
WO2016077123A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Moderna Therapeutics, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
DE202015009961U1 (de) 2014-12-12 2022-01-25 Curevac Ag Artifizielle Nukleinsäuremoleküle für eine verbesserte Proteinexpression
US10993997B2 (en) 2014-12-19 2021-05-04 The Broad Institute, Inc. Methods for profiling the t cell repertoire
EP3034539A1 (en) 2014-12-19 2016-06-22 Ethris GmbH Compositions for introducing nucleic acid into cells
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
US10676726B2 (en) 2015-02-09 2020-06-09 Duke University Compositions and methods for epigenome editing
WO2016128060A1 (en) 2015-02-12 2016-08-18 Biontech Ag Predicting t cell epitopes useful for vaccination
EP3543339A1 (en) 2015-02-13 2019-09-25 Factor Bioscience Inc. Nucleic acid products and methods of administration thereof
WO2016176330A1 (en) * 2015-04-27 2016-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleoside-modified rna for inducing an adaptive immune response
PE20180670A1 (es) 2015-05-20 2018-04-19 Broad Inst Inc Neoantigenos compartidos
ES2960429T3 (es) 2015-05-29 2024-03-04 Curevac Mfg Gmbh Método para producir y purificar ARN, que comprende al menos una etapa de filtración de flujo tangencial
TW202241500A (zh) 2015-06-09 2022-11-01 美商博德研究所有限公司 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法
AU2016285852B2 (en) 2015-06-29 2020-12-17 Acuitas Therapeutics Inc. Lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
US11136585B2 (en) 2015-06-30 2021-10-05 Ethris Gmbh UTRs increasing the translation efficiency of RNA molecules
US10584343B2 (en) * 2015-07-16 2020-03-10 Cornell University Methods of enhancing translation ability of RNA molecules, treatments, and kits
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
HK1256498A1 (zh) 2015-07-30 2019-09-27 Modernatx, Inc. 聚肽表位 rna
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
AU2016324463B2 (en) 2015-09-17 2022-10-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
ES2810701T5 (es) 2015-10-05 2024-07-11 Modernatx Inc Procedimientos para la administración terapéutica de medicamentos de ácido ribonucleico mensajero
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
US10196639B2 (en) 2015-10-09 2019-02-05 University Of Southampton Modulation of gene expression and screening for deregulated protein expression
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
WO2017066797A1 (en) 2015-10-16 2017-04-20 Modernatx, Inc. Trinucleotide mrna cap analogs
EP3362460A1 (en) * 2015-10-16 2018-08-22 Modernatx, Inc. Mrna cap analogs and methods of mrna capping
EP4086269A1 (en) 2015-10-16 2022-11-09 ModernaTX, Inc. Mrna cap analogs with modified phosphate linkage
WO2017070624A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Tropical disease vaccines
MA46080A (fr) 2015-10-22 2019-07-10 Modernatx Inc Vaccins à base d'acide nucléique contre le virus varicelle-zona (vzv)
EP4349404A3 (en) 2015-10-22 2024-06-19 ModernaTX, Inc. Respiratory virus vaccines
MA46316A (fr) 2015-10-22 2021-03-24 Modernatx Inc Vaccin contre le cytomégalovirus humain
FI3368507T3 (fi) 2015-10-28 2023-03-21 Acuitas Therapeutics Inc Uusia lipidejä ja lipidinanopartikkeliformulaatioita nukleiinihappojen annostelemiseksi
EA201891317A3 (ru) 2015-11-30 2019-04-30 Дьюк Юниверсити Терапевтические мишени для коррекции гена дистрофина человека с помощью редактирования генов и способы их применения
US20210108252A1 (en) 2015-12-09 2021-04-15 Novartis Ag Label-free analysis of rna capping efficiency using rnase h, probes and liquid chromatography/mass spectrometry
WO2017100551A1 (en) 2015-12-09 2017-06-15 Alexion Pharmaceuticals, Inc. HETEROLOGOUS UTR SEQUENCES FOR ENHANCED mRNA EXPRESSION
MA43415A (fr) * 2015-12-09 2018-10-17 Modernatx Inc Arnm modifié codant pour une uridine diphosphate glucuronosyltransférase et utilisations associées
LT3386484T (lt) 2015-12-10 2022-06-10 Modernatx, Inc. Gydomųjų medžiagų sudėtis ir pristatymo metodai
JP7049248B2 (ja) 2015-12-14 2022-04-06 コールド スプリング ハーバー ラボラトリー 常染色体優性精神遅滞－５とドラベ症候群の処置のためのアンチセンスオリゴマー
US11096956B2 (en) 2015-12-14 2021-08-24 Stoke Therapeutics, Inc. Antisense oligomers and uses thereof
WO2017106799A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Modernatx, Inc. POLYNUCLEOTIDES ENCODING METHYLMALONYL-CoA MUTASE
EP3405579A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
CA3014036A1 (en) 2016-02-09 2017-08-17 Cibus Us Llc Methods and compositions for increasing efficiency of targeted gene modification using oligonucleotide-mediated gene repair
WO2017151623A1 (en) 2016-03-01 2017-09-08 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable activated polymers for therapeutic delivery
WO2017152146A2 (en) 2016-03-03 2017-09-08 Duke University Compositions and methods for inducing hiv-1 antibodies
US11318197B2 (en) 2016-03-03 2022-05-03 Duke University Compositions and methods for inducing HIV-1 antibodies
US11377656B2 (en) * 2016-03-10 2022-07-05 Novartis Ag Chemically modified messenger RNA's
BR112018069823A2 (pt) 2016-03-31 2019-04-09 Ethris Gmbh molécula de dna, vetor, célula hospedeira, composição, molécula de rna, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica, kit, e, uso de uma utr
WO2017173354A2 (en) * 2016-04-01 2017-10-05 University Of Iowa Research Foundation METABOLICALLY STABILIZED DOUBLE STRANDED mRNA
WO2017180587A2 (en) 2016-04-11 2017-10-19 Obsidian Therapeutics, Inc. Regulated biocircuit systems
US20190127713A1 (en) 2016-04-13 2019-05-02 Duke University Crispr/cas9-based repressors for silencing gene targets in vivo and methods of use
US20190167811A1 (en) 2016-04-13 2019-06-06 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
EP3446119A1 (en) 2016-04-18 2019-02-27 The Broad Institute Inc. Improved hla epitope prediction
SG11201809381XA (en) 2016-05-18 2018-12-28 Modernatx Inc Polynucleotides encoding interleukin-12 (il12) and uses thereof
EP3458108A4 (en) 2016-05-18 2020-04-22 ModernaTX, Inc. POLYNUCLEOTIDES ENCODING A CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR FOR THE TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS
JP7088911B2 (ja) 2016-05-18 2022-06-21 モデルナティエックス インコーポレイテッド リラキシンをコードするポリヌクレオチド
EP3458106A4 (en) 2016-05-18 2020-03-18 Modernatx, Inc. POLYNUCLEOTIDS FOR CODING LIPOPROTEIN LIPASE FOR TREATING HYPERLIPIDEMIA
WO2017201342A1 (en) 2016-05-18 2017-11-23 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding jagged1 for the treatment of alagille syndrome
AU2017272337C1 (en) 2016-06-03 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
US12385034B2 (en) 2016-06-24 2025-08-12 Modernatx, Inc. Methods and apparatus for filtration
KR101916652B1 (ko) 2016-06-29 2018-11-08 올릭스 주식회사 작은 간섭 rna의 rna 간섭효과 증진용 화합물 및 이의 용도
US10927383B2 (en) 2016-06-30 2021-02-23 Ethris Gmbh Cas9 mRNAs
MX2019000205A (es) 2016-07-07 2019-09-23 Rubius Therapeutics Inc Composiciones y metodos relacionados con sistemas celulares terapeuticos que expresan arn exogeno.
JP7490211B2 (ja) 2016-07-19 2024-05-27 デューク ユニバーシティ Ｃｐｆ１に基づくゲノム編集の治療適用
JP2019528284A (ja) 2016-08-17 2019-10-10 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 核酸産物およびその投与方法
AU2017326423B2 (en) 2016-09-14 2023-11-09 Modernatx, Inc. High purity RNA compositions and methods for preparation thereof
EP3519428A4 (en) 2016-10-03 2020-07-08 Duke University METHODS OF IDENTIFYING IMMUNOGENS BY TARGETING IMPROBABLE MUTATIONS
US10662416B2 (en) 2016-10-14 2020-05-26 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases specific for recognition sequences in the hepatitis B virus genome
EP3528821A4 (en) 2016-10-21 2020-07-01 ModernaTX, Inc. HUMAN CYTOMEGALOVIRUS VACCINE
CN110114368B (zh) 2016-10-24 2024-08-02 奥睿尼斯生物科学私人有限公司 靶向突变干扰素-γ及其用途
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
WO2018081638A1 (en) 2016-10-27 2018-05-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleoside-modified rna for inducing an adaptive immune response
WO2018081788A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Cornell University Methods of enhancing translation ability and stability of rna molecules, treatments, and kits
MX2019005470A (es) 2016-11-10 2019-11-21 Translate Bio Inc Formulación de nanopartículas lipídicas basadas en ice mejorada para el suministro de arnm.
US10925958B2 (en) 2016-11-11 2021-02-23 Modernatx, Inc. Influenza vaccine
EP3555289A1 (en) 2016-12-13 2019-10-23 ModernaTX, Inc. Rna affinity purification
US11241490B2 (en) 2017-01-11 2022-02-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleoside-modified RNA for inducing an immune response against zika virus
CN110325210A (zh) 2017-01-11 2019-10-11 小利兰·斯坦福大学托管委员会 Rspo替代物分子
US11549149B2 (en) 2017-01-24 2023-01-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
WO2018140821A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Surrozen, Inc. Tissue-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof
SG11201906969PA (en) 2017-02-01 2019-08-27 Modernatx Inc Immunomodulatory therapeutic mrna compositions encoding activating oncogene mutation peptides
JP7586579B2 (ja) 2017-02-06 2024-11-19 オリオンズ バイオサイエンス インコーポレイテッド 標的化改変型インターフェロン及びその使用
EP3577133A1 (en) 2017-02-06 2019-12-11 Orionis Biosciences NV Targeted chimeric proteins and uses thereof
US11591600B2 (en) 2017-02-10 2023-02-28 OliX Pharmaceuticals. Inc. Long double-stranded RNA for RNA interference
EP3585886B1 (en) 2017-02-27 2023-11-22 Translate Bio, Inc. Large scale synthesis of messenger rna
MX2019010155A (es) 2017-02-27 2020-12-10 Translate Bio Inc Arnm de cftr optimizado por codón novedoso.
WO2018160592A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Arcturus Therapeutics, Inc. Translatable molecules and synthesis thereof
TW202428301A (zh) 2017-02-28 2024-07-16 法商賽諾菲公司 治療性rna
CA3055200A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunotherapy
US11576961B2 (en) 2017-03-15 2023-02-14 Modernatx, Inc. Broad spectrum influenza virus vaccine
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS Vaccine
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
EP3595676A4 (en) 2017-03-17 2021-05-05 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZOONOSES
US11905525B2 (en) 2017-04-05 2024-02-20 Modernatx, Inc. Reduction of elimination of immune responses to non-intravenous, e.g., subcutaneously administered therapeutic proteins
WO2018188730A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna for treatment of autoimmune diseases
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
JP7464954B2 (ja) 2017-04-27 2024-04-10 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア Ｃ型肝炎ウイルスに対するヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ－脂質ナノ粒子系統ワクチン
IL301115A (en) 2017-04-28 2023-05-01 Acuitas Therapeutics Inc Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
IL315224A (en) 2017-05-08 2024-10-01 Gritstone Bio Inc Neoantigen alphavirus vectors
WO2018213476A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
CA3063907A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Therapeutics for glycogen storage disease type iii
CA3066569A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
WO2018224166A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Methods for predicting the usefulness of disease specific amino acid modifications for immunotherapy
WO2018231990A2 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US20200268666A1 (en) * 2017-06-14 2020-08-27 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding coagulation factor viii
JOP20190269A1 (ar) 2017-06-15 2019-11-20 Voyager Therapeutics Inc بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
US10034951B1 (en) 2017-06-21 2018-07-31 New England Biolabs, Inc. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
EP3424524B1 (en) * 2017-07-04 2024-12-11 CureVac SE Cancer rna-vaccine
US11628227B2 (en) * 2017-07-05 2023-04-18 Wisconsin Alumni Research Foundation Mineral coated microparticles for gene delivery in chronic wound therapy
WO2019018765A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Modernatx, Inc. MODIFIED mRNA ENCODING PROPIONYL-COA-CARBOXYLASE AND USES THEREOF
EP3658672A1 (en) * 2017-07-24 2020-06-03 Modernatx, Inc. Modified mrna encoding a glucose-6-phosphatase and uses thereof
CA3073020A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
US11542225B2 (en) 2017-08-17 2023-01-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2019036000A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
CN111246854A (zh) 2017-08-17 2020-06-05 宾夕法尼亚大学理事会 编码单纯疱疹病毒糖蛋白的修饰mrna疫苗及其用途
WO2019036685A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Modernatx, Inc. METHODS FOR HPLC ANALYSIS
EP3668971B8 (en) 2017-08-18 2024-05-29 ModernaTX, Inc. Rna polymerase variants
EP3668977A4 (en) 2017-08-18 2021-04-21 Modernatx, Inc. HPLC ANALYTICAL PROCESSES
KR102318434B1 (ko) 2017-08-25 2021-11-01 스톡 테라퓨틱스, 인크. 병태 및 질환 치료용 안티센스 올리고머
WO2019046809A1 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Modernatx, Inc. METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES
WO2019055807A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS
WO2019070730A1 (en) 2017-10-02 2019-04-11 Duke University MOSAIC ENVELOPES OF HIV-1 TO INDUCE ADCC RESPONSES
WO2019087113A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Novartis Ag Synthetic rnas and methods of use
US11939601B2 (en) 2017-11-22 2024-03-26 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding phenylalanine hydroxylase for the treatment of phenylketonuria
JP7423522B2 (ja) 2017-11-22 2024-01-29 モダーナティエックス・インコーポレイテッド 尿素サイクル異常症の治療のためのオルニチントランスカルバミラーゼをコードするポリヌクレオチド
US20200325532A1 (en) 2017-12-15 2020-10-15 Novartis Ag Polya tail length analysis of rna by mass spectrometry
MX2020007077A (es) 2018-01-04 2020-10-28 Iconic Therapeutics Inc Anticuerpos anti-factor tisular, conjugados anticuerpo-farmaco y metodos relacionados.
CN118830491A (zh) 2018-01-09 2024-10-25 希博斯美国有限公司 防碎基因和突变
EP3740580A4 (en) 2018-01-19 2021-10-20 Duke University GENOME ENGINEERING WITH CRISPR-CAS SYSTEMS IN EUKARYONTS
EP3743448A4 (en) 2018-01-26 2021-11-03 Orionis Biosciences, Inc. XCR1 BINDING AGENTS AND USES THEREOF
EP3746090A4 (en) 2018-01-29 2021-11-17 ModernaTX, Inc. RSV RNA Vaccines
EP3749295A4 (en) 2018-02-05 2022-04-27 Orionis Biosciences, Inc. FIBROBLAST BINDING AGENTS AND USES THEREOF
JP7779653B2 (ja) 2018-02-07 2025-12-03 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療用タンパク質送達のための方法および組成物
US12522821B2 (en) 2018-02-13 2026-01-13 Ethris Gmbh Polyribonucleotide containing deuterated nucleotides
WO2019178296A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Transient cellular reprogramming for reversal of cell aging
ES2955408T3 (es) 2018-04-12 2023-11-30 Prec Biosciences Inc Nucleasas modificadas genéticamente optimizadas que tienen especificidad para el gen de la región constante alfa del receptor de linfocitos t humanos
TW201945388A (zh) 2018-04-12 2019-12-01 美商精密生物科學公司 對b型肝炎病毒基因體中之識別序列具有特異性之最佳化之經工程化巨核酸酶
KR20210021943A (ko) 2018-04-25 2021-03-02 에트리스 게엠베하 미립자 제형용 동결 방지제
US12060558B2 (en) 2018-05-04 2024-08-13 Stoke Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treatment of cholesteryl ester storage disease
EP3790980A4 (en) 2018-05-06 2022-03-23 Emendobio Inc. DIFFERENTIAL KNOCKOUT OF AN ALLEL OF A HETEROZYGOUS ELAN GENE
EP3794126A1 (en) 2018-05-15 2021-03-24 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of parkinson's disease
KR20250140631A (ko) 2018-05-17 2025-09-25 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-cd63 항체, 콘쥬게이트, 및 이의 용도
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
CN108956566B (zh) * 2018-07-06 2020-10-02 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 基于切刻内切酶和杂交链式反应双重放大的上转换荧光检测多氯联苯试剂盒及检测方法
WO2020014271A1 (en) 2018-07-09 2020-01-16 Surrozen, Inc. Tissue-specific wnt signal enhancing molecules and uses
KR20210060480A (ko) 2018-08-24 2021-05-26 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 전령 rna의 정제 방법
MX2021003015A (es) * 2018-09-13 2021-07-15 Modernatx Inc Polinucleotidos que codifican glucosa-6-fosfatasa para el tratamiento de la glucogenosis.
JP2022500443A (ja) * 2018-09-13 2022-01-04 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 進行性家族性肝内胆汁うっ滞障害を処置するための修飾ｍＲＮＡ
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
JP7640452B2 (ja) 2018-09-19 2025-03-05 モデルナティエックス インコーポレイテッド 高純度ｐｅｇ脂質及びそれらの使用
CA3113651A1 (en) 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
IL322436A (en) 2018-09-21 2025-09-01 Acuitas Therapeutics Inc Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes
US20220152225A1 (en) * 2018-09-27 2022-05-19 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding arginase 1 for the treatment of arginase deficiency
EP3856762A1 (en) 2018-09-28 2021-08-04 Voyager Therapeutics, Inc. Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof
EP3860650A4 (en) 2018-10-01 2022-06-29 Duke University Hiv-1 envelope stabilizing mutations
US20210382068A1 (en) 2018-10-02 2021-12-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
US20210386788A1 (en) 2018-10-24 2021-12-16 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
CA3120647A1 (en) 2018-11-21 2020-05-28 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of nebulized mrna encoding cftr
HUE064076T2 (hu) 2018-12-06 2024-02-28 Arcturus Therapeutics Inc Készítmények és módszerek az ornitin-transzkarbamiláz hiányának kezelésére
CN111303283A (zh) 2018-12-12 2020-06-19 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗il-17a抗体及其应用
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
WO2020132659A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Precision Biosciences, Inc. Genetic modification of the hydroxyacid oxidase 1 gene for treatment of primary hyperoxaluria
CN113474328B (zh) 2019-01-11 2025-07-11 爱康泰生治疗公司 用于脂质纳米颗粒递送活性剂的脂质
WO2020163379A1 (en) 2019-02-05 2020-08-13 Emendobio Inc. Crispr compositions and methods for promoting gene editing of ribosomal protein s19 (rps19) gene
WO2020168466A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 Stemirna Therapeutics Co., Ltd. Modified nucleoside and synthetic methods thereof
US11851694B1 (en) 2019-02-20 2023-12-26 Modernatx, Inc. High fidelity in vitro transcription
CN113795579A (zh) 2019-02-20 2021-12-14 摩登纳特斯有限公司 用于共转录加帽的rna聚合酶变体
EP3938507A4 (en) 2019-03-11 2023-02-22 ModernaTX, Inc. PROCEDURE FOR IN VITRO FED BATCH TRANSCRIPTION
US12070495B2 (en) 2019-03-15 2024-08-27 Modernatx, Inc. HIV RNA vaccines
WO2020198403A2 (en) * 2019-03-25 2020-10-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions comprising modified circular polyribonucleotides and uses thereof
JP7286796B2 (ja) 2019-04-03 2023-06-05 プレシジョン バイオサイエンシズ，インク． マイクロｒｎａ適合ｓｈｒｎａ（ｓｈｒｎａｍｉｒ）を含む遺伝子改変免疫細胞
WO2020206231A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Precision Biosciences, Inc. Methods of preparing populations of genetically-modified immune cells
US20230190819A1 (en) * 2019-05-11 2023-06-22 Youngsuk Yi Compositions and methods containing exosomes
IL288283B2 (en) 2019-05-30 2025-05-01 Gritstone Bio Inc Modified adenovirus
CN114450265B (zh) 2019-07-03 2024-12-24 菲克特生物科学股份有限公司 阳离子脂质及其用途
AU2020314129A1 (en) 2019-07-15 2022-02-24 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-tigit antibodies and application thereof
US20220273715A1 (en) 2019-07-25 2022-09-01 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus
US10501404B1 (en) 2019-07-30 2019-12-10 Factor Bioscience Inc. Cationic lipids and transfection methods
WO2021030268A2 (en) 2019-08-09 2021-02-18 Nutcracker Therapeutics, Inc. Microfluidic apparatus and methods of use thereof
CN112390838A (zh) * 2019-08-14 2021-02-23 斯微(上海)生物科技有限公司 一种改性核苷及其合成方法
KR20220047319A (ko) * 2019-08-14 2022-04-15 큐어백 아게 감소된 면역자극 특성을 갖는 rna 조합물 및 조성물
DE102019122014A1 (de) 2019-08-15 2021-02-18 Technische Universität Darmstadt Reduktion der Knochenresorption, insbesondere bei chronischen Gelenkerkrankungen
JP2022544825A (ja) 2019-08-20 2022-10-21 プレシジョン バイオサイエンシズ，インク． 細胞免疫療法のためのリンパ球枯渇投与レジメン
MX2022003394A (es) 2019-09-20 2022-06-22 Translate Bio Inc Arnm que codifica cftr manipulado.
US12394502B2 (en) 2019-10-02 2025-08-19 The General Hospital Corporation Method for predicting HLA-binding peptides using protein structural features
WO2021072172A1 (en) 2019-10-09 2021-04-15 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger rna
EP4048316A1 (en) 2019-10-21 2022-08-31 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger rna
PH12022550992A1 (en) 2019-10-24 2023-09-25 Novago Therapeutics Ag Novel anti-nogo-a antibodies
US20220411479A1 (en) 2019-10-30 2022-12-29 Precision Biosciences, Inc. Cd20 chimeric antigen receptors and methods of use for immunotherapy
WO2021113765A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the hepatitis b virus genome
US20230036065A1 (en) 2019-12-06 2023-02-02 Precision Biosciences, Inc. Methods for cancer immunotherapy
WO2021127394A2 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Translate Bio, Inc. Rectal delivery of messenger rna
CA3165388A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
IL294290A (en) 2019-12-31 2022-08-01 Elixirgen Therapeutics Inc Transient temperature-based delivery of nucleic acids and proteins to cells and tissues
WO2021142245A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Translate Bio, Inc. Compounds, pharmaceutical compositions and methods for modulating expression of muc5b in lung cells and tissues
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
CN115443338A (zh) 2020-02-10 2022-12-06 翻译生物公司 用于信使rna纯化的方法和组合物
CA3171495A1 (en) 2020-02-18 2021-08-26 Translate Bio, Inc. Improved processes for in vitro transcription of messenger rna
CN113444169B (zh) 2020-02-24 2021-12-28 中国科学院微生物研究所 新型冠状病毒的人源单克隆抗体及其应用
CA3173035A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Translate Bio, Inc. Improved processes of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
CA3169889A1 (en) 2020-03-03 2021-09-10 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
EP4132478A1 (en) 2020-04-09 2023-02-15 Finncure Oy Mimetic nanoparticles for preventing the spreading and lowering the infection rate of novel coronaviruses
US12194157B2 (en) 2020-04-09 2025-01-14 Finncure Oy Carrier for targeted delivery to a host
IL297419B2 (en) 2020-04-22 2025-02-01 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2021226463A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
MX2022013985A (es) 2020-05-07 2023-04-05 Translate Bio Inc Generacion de secuencias de nucleotidos optimizadas.
US20240342269A1 (en) 2020-05-07 2024-10-17 Translate Bio, Inc. Optimized nucleotide sequences encoding sars-cov-2 antigens
EP4146342A1 (en) 2020-05-07 2023-03-15 Translate Bio, Inc. Improved compositions for cftr mrna therapy
WO2021231259A1 (en) 2020-05-11 2021-11-18 Precision Biosciences, Inc. Self-limiting viral vectors encoding nucleases
IL298063A (en) 2020-05-11 2023-01-01 Stoke Therapeutics Inc opa1 antisense oligomers for the treatment of conditions and diseases
US20230193230A1 (en) 2020-05-12 2023-06-22 Precision Biosciences, Inc. Treatment of retinitis pigmentosa using improved engineered meganucleases
WO2021229502A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Crispr Therapeutics Ag Messenger rna encoding cas9 for use in genome-editing systems
JP2023526284A (ja) 2020-05-15 2023-06-21 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド ｍＲＮＡ送達のための脂質ナノ粒子製剤
WO2021245184A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Neurimmune Ag HUMAN ANTIBODIES AGAINST SEVERE ACUTE RESPIRATORY SYNDROME CORONAVIRUS-2 (SARS-CoV-2)
EP4179112A4 (en) 2020-07-13 2024-11-20 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Systems and methods to assess rna stability
EP4180457A4 (en) 2020-07-13 2024-08-07 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. ANTI-CLDN-18.2 ANTIBODIES AND USE THEREOF
EP4182297B1 (en) 2020-07-16 2025-09-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
WO2022017428A1 (zh) 2020-07-21 2022-01-27 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗ctla-4抗体及其用途
IL300246A (en) 2020-08-05 2023-03-01 Dragonfly Therapeutics Inc Antibodies directed to EGFR and their use
EP4192496A4 (en) 2020-08-06 2025-01-01 Gritstone bio, Inc. MULTIEPITOP VACCINE CASSETTES
EP4192958A4 (en) * 2020-08-07 2024-08-28 The Hong Kong University of Science and Technology COMPOSITIONS AND METHODS FOR INCREASING PROTEIN EXPRESSION
US20260028412A1 (en) 2020-08-10 2026-01-29 Precision Biosciences, Inc. Antibodies and fragments specific for b-cell maturation antigen and uses thereof
US20240011003A1 (en) 2020-08-21 2024-01-11 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the transthyretin gene
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
US12419948B2 (en) 2020-08-31 2025-09-23 The Broad Institute, Inc. Immunogenic compositions and use thereof
WO2022047427A2 (en) 2020-08-31 2022-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and methods for producing rna constructs with increased translation and stability
JP2023544197A (ja) 2020-10-06 2023-10-20 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド 脂質ナノ粒子の改善された方法および製剤
WO2022076547A1 (en) 2020-10-07 2022-04-14 Precision Biosciences, Inc. Lipid nanoparticle compositions
WO2022081548A1 (en) 2020-10-12 2022-04-21 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing ice-based lipid nanoparticles
IL301973A (en) 2020-10-12 2023-06-01 Translate Bio Inc Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
US20230233706A1 (en) * 2020-10-13 2023-07-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania In vivo targeting of CD4+-T cells for mRNA therapeutics
US12458604B2 (en) 2020-10-14 2025-11-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of lipid nanoparticle manufacture and compositions derived therefrom
CN116438298A (zh) 2020-10-15 2023-07-14 翻译生物公司 信使rna的大规模合成
CN117177766A (zh) 2020-10-26 2023-12-05 佩奇大学 疫苗平台
GB202017649D0 (en) 2020-11-09 2020-12-23 Autolus Ltd Polypeptide
EP4240326A1 (en) 2020-11-09 2023-09-13 Translate Bio, Inc. Improved compositions for delivery of codon-optimized mrna
KR20250099412A (ko) 2020-11-12 2025-07-01 프리시젼 바이오사이언시스 인코포레이티드 디스트로핀 유전자 내의 인식 서열에 대해 특이성을 갖는 조작된 메가뉴클레아제
AU2021379770A1 (en) 2020-11-16 2023-06-22 Surrozen Operating, Inc. Liver-specific wnt signal enhancing molecules and uses thereof
WO2022106860A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Pécsi Tudományegyetem Recombinant peptides for use in therapy
MX2023006056A (es) 2020-11-25 2023-06-06 Akagera Medicines Inc Nanoparticulas lipidicas para suministro de acidos nucleicos y metodos de uso de las mismas.
AU2021386737A1 (en) 2020-11-25 2023-07-13 Translate Bio, Inc. Stable liquid lipid nanoparticle formulations
CA3205569A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 CureVac SE Rna vaccine against sars-cov-2 variants
WO2022150616A1 (en) 2021-01-08 2022-07-14 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases having specificity for a recognition sequence in the hydroxyacid oxidase 1 gene
US12329811B2 (en) 2021-01-11 2025-06-17 Modernatx, Inc. Seasonal RNA influenza virus vaccines
EP4277929A1 (en) 2021-01-14 2023-11-22 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies
US20250127811A1 (en) 2021-01-28 2025-04-24 Precision Biosciences, Inc. Modulation of tgf beta signaling in genetically-modified eukaryotic cells
EP4284335A1 (en) 2021-02-01 2023-12-06 RegenxBio Inc. Gene therapy for neuronal ceroid lipofuscinoses
EP4292611A4 (en) 2021-02-09 2025-06-25 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. ANTI-CD112R ANTIBODIES AND USE THEREOF
US20240226337A9 (en) * 2021-02-16 2024-07-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and Methods to Enhance RNA Stability and Translation and Uses Thereof
CA3208070A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Matthias Schneider Humanized antibodies against irhom2
US20220323553A1 (en) * 2021-03-08 2022-10-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Epigenomic editing and reactivation of targets for the treatment of Fragile X syndrome
CA3213299A1 (en) 2021-03-22 2022-09-29 Recode Therapeutics, Inc. Compositions and methods for targeted delivery to cells
EP4313115A1 (en) 2021-03-25 2024-02-07 Translate Bio, Inc. Optimized nucleotide sequences encoding the extracellular domain of human ace2 protein or a portion thereof
WO2022207652A1 (en) 2021-03-29 2022-10-06 Scirhom Gmbh Methods of treatment using protein binders to irhom2 epitopes
WO2022214664A1 (en) 2021-04-09 2022-10-13 Philogen S.P.A. Improved interferon-gamma mutant
JP2024515668A (ja) 2021-04-19 2024-04-10 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド Ｍｒｎａの送達のための改善された組成物
CA3173051A1 (en) 2021-04-22 2022-10-22 Precision Biosciences, Inc. Engineered meganucleases that target human mitochondrial genomes
KR20240010467A (ko) 2021-04-22 2024-01-23 프리시젼 바이오사이언시스 인코포레이티드 인간 미토콘드리아 게놈을 표적화하는 조작된 메가뉴클레아제
EP4330427A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 Translate Bio, Inc. Methods for measuring poly a tail length
WO2022232514A1 (en) * 2021-04-30 2022-11-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for targeting lipid nanoparticle therapeutics to stem cells
CA3214286A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Nikhil Dhar Modified ribonucleic acids and uses thereof
WO2022234003A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Avacta Life Sciences Limited Cd33 binding polypeptides with stefin a protein
US20220363937A1 (en) 2021-05-14 2022-11-17 Armstrong World Industries, Inc. Stabilization of antimicrobial coatings
WO2022261206A1 (en) 2021-06-09 2022-12-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Gene combination as a broad spectrum antiviral
EP4362920A1 (en) 2021-07-01 2024-05-08 Translate Bio, Inc. Compositions for delivery of mrna
AU2022301302A1 (en) 2021-07-01 2024-01-25 Indapta Therapeutics, Inc. Engineered natural killer (nk) cells and related methods
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
EP4377460A1 (en) 2021-07-30 2024-06-05 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
WO2023023487A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Translate Bio, Inc. Screening codon-optimized nucleotide sequences
US20250114439A1 (en) 2021-08-18 2025-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania mRNA VACCINES AGAINST TICK SALIVARY PROTEINS, AND METHODS OF USING SAME
EP4393515A1 (en) 2021-08-26 2024-07-03 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-cldn-18.2 antibody-drug conjugate and use thereof
US20250243277A1 (en) 2021-10-07 2025-07-31 Avacta Life Sciences Limited Pd-l1 binding affimers
EP4412711A1 (en) 2021-10-07 2024-08-14 Avacta Life Sciences Limited Serum half-life extended pd-l1 binding polypeptides
US20240408235A1 (en) 2021-10-19 2024-12-12 Precision Biosciences, Inc. Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
US20250228973A1 (en) 2021-10-19 2025-07-17 Precision Biosciences, Inc. Gene editing methods for treating alpha-1 antitrypsin (aat) deficiency
US20240417805A1 (en) 2021-10-21 2024-12-19 Curevac Netherlands B.V. Cancer neoantigens
EP4285933A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
WO2023067124A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
AU2022369405A1 (en) 2021-10-22 2024-05-09 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4401789A1 (en) 2021-10-22 2024-07-24 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4169578A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4285932A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4186528A1 (en) 2021-11-30 2023-05-31 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4401788A1 (en) 2021-10-22 2024-07-24 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4286004A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4169534A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
JP2024540978A (ja) 2021-10-22 2024-11-06 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア オリゴ糖化合物及び複合体
EP4286003A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4286394A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4169579A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4169580A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
WO2023081767A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Precision Biosciences, Inc. Methods for immunotherapy
WO2023083434A1 (en) * 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Rna encoding peptidoglycan hydrolase and use thereof for treating bacterial infection
EP4429713A1 (en) 2021-11-10 2024-09-18 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
US12186387B2 (en) 2021-11-29 2025-01-07 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023107954A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibodies targeting 5t4 and uses thereof
WO2023114943A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
US12529047B1 (en) 2021-12-21 2026-01-20 Modernatx, Inc. mRNA quantification methods
EP4202045A1 (en) 2021-12-22 2023-06-28 Universität Hamburg Synthetic transfer rna with modified nucleotides
WO2023133579A1 (en) 2022-01-10 2023-07-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Bbb-targeted gaa delivered as gene therapy treats cns and muscle in pompe disease model mice
US20250154275A1 (en) 2022-01-20 2025-05-15 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-cd3 and anti-cd20 bispecific antibody and use thereof
CN118660708A (zh) 2022-01-25 2024-09-17 公益财团法人川崎市产业振兴财团 用于经皮给药的含有rna的组合物和该组合物的给药方法
US20250122271A1 (en) 2022-01-28 2025-04-17 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-dkk1 antibody, pharmaceutical composition thereof, and use thereof
CA3246194A1 (en) 2022-03-24 2023-09-28 Nature's Toolbox, Inc. PROCESSES AND COMPOSITIONS FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF PSEUDOURIDIN TRIPHOSPHATE
EP4509529A1 (en) 2022-04-12 2025-02-19 Riken Antibody used to treat coronavirus infection
CN115873836B (zh) 2022-04-29 2024-01-23 武汉合生科技有限公司 一种橙花叔醇合成酶及应用
WO2023218243A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Avacta Life Sciences Limited Lag-3/pd-l1 binding fusion proteins
TW202400652A (zh) 2022-05-25 2024-01-01 大陸商映恩生物製藥（蘇州）有限公司 抗ｂｄｃａ２抗體及其用途
KR20250031230A (ko) 2022-05-25 2025-03-06 아카제라 메디신즈, 인크. 핵산 전달을 위한 지질 나노입자 및 이의 사용 방법
JP2025518221A (ja) 2022-05-30 2025-06-12 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア 核酸の送達のための複合体
WO2023240074A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of pcsk9
WO2023240076A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of pcsk9
IL317874A (en) 2022-06-24 2025-02-01 Tune Therapeutics Inc Compounds, systems and methods for reducing low density lipoproteins through targeted gene suppression
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CN120051297A (zh) 2022-06-30 2025-05-27 因达普塔治疗公司 工程化自然杀伤(nk)细胞与抗体疗法的组合及相关方法
WO2024015729A1 (en) 2022-07-11 2024-01-18 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Regulatory system for expression of a gene of interest in a target cell and method of use thereof
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024023246A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Philogen S.P.A. Antibody binding to pd1
WO2024033362A1 (en) 2022-08-08 2024-02-15 Atb Therapeutics Humanized antibodies against cd79b
EP4570913A1 (en) 2022-08-11 2025-06-18 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-cgrp antibody and use
AU2023325407A1 (en) 2022-08-19 2025-02-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for regulation of hepatitis b virus through targeted gene repression
WO2024054020A1 (ko) 2022-09-07 2024-03-14 아이진 주식회사 변형핵산 함유 mrna의 체내 전달용 조성물
JP2025531268A (ja) 2022-09-19 2025-09-19 チューン セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞機能を調節するための組成物、システム、および方法
KR20250069553A (ko) 2022-09-20 2025-05-19 비스테라, 인크. C3b-항체를 이용하는 보체 매개 질환 및 장애의 치료
WO2024061352A1 (zh) 2022-09-23 2024-03-28 广州凌腾生物医药有限公司 分离的抗原结合蛋白及其应用
CN120583964A (zh) 2022-09-26 2025-09-02 生物技术欧洲股份公司 核酸复合物及其用途
WO2024086827A2 (en) 2022-10-20 2024-04-25 Repertoire Immune Medicines, Inc. Cd8 t cell targeted il2
EP4605010A1 (en) 2022-10-21 2025-08-27 BioNTech SE Nucleic acid complexes and uses thereof
DE202023106198U1 (de) 2022-10-28 2024-03-21 CureVac SE Impfstoff auf Nukleinsäurebasis
JP2025538523A (ja) 2022-11-21 2025-11-28 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａの乾燥粉末製剤の組成物及びその使用方法
CN120239710A (zh) 2022-11-22 2025-07-01 上海宏成药业有限公司 抗ccr8抗体及其用途
JP2026500282A (ja) 2022-12-15 2026-01-06 サノフィ パスツール インコーポレイテッド インフルエンザウイルス様粒子をコードするｍＲＮＡ
CN120475991A (zh) 2022-12-20 2025-08-12 赛诺菲巴斯德有限公司 鼻病毒mRNA疫苗
WO2024133884A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Sanofi Optimized tailing of messenger rna
CN120435314A (zh) 2022-12-29 2025-08-05 波普瓦克斯私人有限公司 多靶疫苗和治疗剂
WO2024141784A2 (en) 2022-12-29 2024-07-04 Popvax Private Limited Broadly protective betacoronavirus vaccines and compositions
IL321936A (en) 2023-01-05 2025-09-01 Prec Biosciences Inc Optimized engineered meganucleases with specificity for the human T-cell receptor alpha constant region gene
WO2024151975A1 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Igor Lednev Detecting degradation of a polynucleotide by raman spectroscopy
JP2026501855A (ja) 2023-01-20 2026-01-16 アストラゼネカ・アクチエボラーグ ワクチン
CN120957744A (zh) 2023-01-20 2025-11-14 阿斯利康(瑞典)有限公司 核酸分子
EP4658809A1 (en) 2023-01-31 2025-12-10 Seqirus Inc. Capping assay
WO2024163678A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Fusion proteins and systems for targeted activation of frataxin (fxn) and related methods
WO2024163683A2 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Tune Therapeutics, Inc. Systems, compositions, and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2) and x-inactive specific transcript (xist)
WO2024169990A1 (zh) 2023-02-13 2024-08-22 浙江大学绍兴研究院 双特异性抗体及其应用
WO2024170684A1 (en) 2023-02-15 2024-08-22 Sanofi Screening codon-optimized nucleotide sequences
CN120858173A (zh) 2023-03-07 2025-10-28 赛诺菲巴斯德有限公司 用kp34聚合酶制造信使rna
AU2024242151A1 (en) 2023-03-29 2025-09-25 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of lpa
WO2024206620A1 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Scribe Therapeutics Inc. Messenger rna encoding casx
TW202444914A (zh) 2023-03-29 2024-11-16 美商斯奎柏治療公司 抑制子融合蛋白系統
TW202444906A (zh) 2023-03-29 2024-11-16 美商斯奎柏治療公司 用於靶向pcsk9之組合物及方法
CN120957707A (zh) 2023-04-17 2025-11-14 赛诺菲巴斯德有限公司 可复溶干粉配制品及其使用方法
KR20260008117A (ko) 2023-05-08 2026-01-15 머크 샤프 앤드 돔 엘엘씨 노로바이러스 vp1 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도
US12311033B2 (en) 2023-05-31 2025-05-27 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
US12531162B1 (en) * 2023-05-31 2026-01-20 Northeastern University Multi-dimensional phenotypic space for genotype to phenotype mapping and intelligent design of cancer drug therapies using a deep learning net
WO2025006799A1 (en) 2023-06-27 2025-01-02 Capstan Therapeutics, Inc. Extracorporeal and ex vivo engineering of select cell populations from peripheral blood
WO2025003760A1 (en) 2023-06-28 2025-01-02 Sanofi Sterol analogs in lipid nanoparticle formulations
WO2025012671A1 (en) 2023-07-07 2025-01-16 Institute National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Sars-cov-2 5'utr sequences and linkage thereof to coding sequences
WO2025029835A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating il-2 gene expression
WO2025029840A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for multiplexed activation and repression of t cell gene expression
WO2025027089A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 BioNTech SE Ionizable thiolipids and uses thereof
WO2025026545A1 (en) 2023-08-01 2025-02-06 BioNTech SE Ionizable thioplipids and uses thereof
WO2025030103A1 (en) 2023-08-03 2025-02-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna compositions encoding herpes simplex virus glycoprotein b antigens and uses thereof
WO2025030134A1 (en) 2023-08-03 2025-02-06 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna compositions encoding herpes simplex virus glycoprotein e and/or glycoprotein i antigens and uses thereof
WO2025038494A1 (en) 2023-08-11 2025-02-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for lymphoid cell differentiation using targeted gene activation
WO2025059073A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Tune Therapeutics, Inc. Epigenetic editing methods and systems for differentiating stem cells
WO2025059215A1 (en) 2023-09-12 2025-03-20 Aadigen, Llc Methods and compositions for treating or preventing cancer
WO2025072383A1 (en) 2023-09-25 2025-04-03 The Broad Institute, Inc. Viral open reading frames, uses thereof, and methods of detecting the same
WO2025072293A1 (en) 2023-09-27 2025-04-03 Scribe Therapeutics Inc. Optimized mrnas encoding casx proteins
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025076127A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025097055A2 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of t cells in immunotherapy
US20250144234A1 (en) 2023-11-02 2025-05-08 Capstan Therapeutics Inc. RNA for In vivo Transfection with Increased Expression
WO2025101946A1 (en) 2023-11-08 2025-05-15 Precision Biosciences, Inc. Polypeptide linkers for use in engineered meganucleases
WO2025104351A1 (en) 2023-11-17 2025-05-22 Sanofi Pasteur Inc. Hplc-based assays for detecting multiple mrna constructs
WO2025124711A1 (en) 2023-12-13 2025-06-19 BioNTech SE Glycolipid compositions
WO2025129201A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 Capstan Therapeutics, Inc. Humanized anti-cd8 antibodies and uses thereof
WO2025129157A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treatment of canavan disease
WO2025129158A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineered arc delivery vesicles and uses thereof
TW202525287A (zh) 2023-12-21 2025-07-01 德商拜恩技術運輸科技有限責任公司 可離子化脂質
WO2025133951A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Genevant Sciences Gmbh Ionizable lipids suitable for lipid nanoparticles
WO2025134066A1 (en) 2023-12-21 2025-06-26 Biontech Delivery Technologies Gmbh Ionizable lipids
WO2025144938A1 (en) 2023-12-26 2025-07-03 Emmune, Inc. Systems for nucleic acid transfer
WO2025141200A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Sanofi Pasteur Inc. Modified rna polymerases
WO2025179294A2 (en) 2024-02-22 2025-08-28 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025184125A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Korro Bio, Inc. Lambda n-based compositions and methods for nucleic acids editing
WO2025188687A1 (en) 2024-03-04 2025-09-12 Beam Therapeutics Inc. Stable rna compositions with stem loop, and methods thereof
EP4613860A1 (en) 2024-03-07 2025-09-10 Technische Universität Darmstadt Inhibitors of mir-574-5p for use in intra-articular treatment of osteoarthritis and other related arthritic diseases
WO2025194138A1 (en) 2024-03-14 2025-09-18 Tessera Therapeutics, Inc. St1cas9 compositions and methods for modulating a genome
WO2025210521A1 (en) 2024-04-04 2025-10-09 Genevant Sciences Gmbh Lipid nanoparticles for stimulating t cells
WO2025210520A1 (en) 2024-04-04 2025-10-09 Genevant Sciences Gmbh Lipid nanoparticles for inducing an immunological response
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025231432A1 (en) * 2024-05-03 2025-11-06 Caribou Biosciences, Inc. In vivo gene editing with crispr systems
WO2025240940A1 (en) 2024-05-17 2025-11-20 Scribe Therapeutics Inc. Compositions and methods for the targeting of apolipoprotein c3
WO2025255393A1 (en) 2024-06-06 2025-12-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Herpes simplex virus antigen binding agents for mitigation of herpes simplex virus associated disease
WO2025260068A1 (en) 2024-06-14 2025-12-18 Tune Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulation for delivery of nucleic acids to cells
WO2025262460A1 (en) 2024-06-21 2025-12-26 BioNTech SE Lipid compositions for nucleic acid delivery
WO2026015647A1 (en) 2024-07-09 2026-01-15 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for cell differentiation using targeted gene activation of dll4 and/or vcam1
WO2026017917A1 (en) * 2024-07-19 2026-01-22 Ethris Gmbh Rnas with reduced ribosomal frameshift expression products
WO2026022677A1 (en) 2024-07-22 2026-01-29 Genevant Sciences Gmbh Permanently charged cationic lipids
WO2026022656A2 (en) 2024-07-22 2026-01-29 Genevant Sciences Gmbh Lipid particle formulations with permanently charged cationic lipids

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
WO1996017954A1 (en) * 1994-12-08 1996-06-13 Pabio Chemical labelling of objects
AU4412096A (en) * 1994-12-13 1996-07-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of arthritic conditions, induction of graft tolerance and reversal of immune responses
US5824497A (en) 1995-02-10 1998-10-20 Mcmaster University High efficiency translation of mRNA molecules
AU9319398A (en) * 1997-09-19 1999-04-05 Sequitur, Inc. Sense mrna therapy
US6127535A (en) * 1997-11-05 2000-10-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside triphosphates and their incorporation into oligonucleotides
WO1999033982A2 (en) * 1997-12-23 1999-07-08 Chiron Corporation Human genes and gene expression products i
US6066625A (en) 1998-02-03 2000-05-23 Methylgene, Inc. Optimized antisense oligonucleotides complementary to DNA methyltransferase sequences
AU2023400A (en) * 1998-11-12 2000-05-29 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for inhibiting angiogenesis using trna and fragments thereof
WO2001002608A1 (en) * 1999-07-06 2001-01-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides incorporating both 2-aminoadenine and 5-substituted pyrimidines
US20040086880A1 (en) * 1999-07-20 2004-05-06 Sampson Jeffrey R Method of producing nucleic acid molecules with reduced secondary structure
WO2003044194A1 (en) * 2001-11-16 2003-05-30 Proteonova, Inc. Selection and evolution of nucleic acids and polypeptides
US20040229271A1 (en) * 2000-05-19 2004-11-18 Williams Richard B. Compositions and methods for the identification and selection of nucleic acids and polypeptides
SE0003002D0 (sv) * 2000-08-22 2000-08-22 Primert Ab New sequences
FR2822164B1 (fr) 2001-03-19 2004-06-18 Centre Nat Rech Scient Polypeptides derives des arn polymerases, et leurs utilisations
US20030171253A1 (en) * 2001-04-19 2003-09-11 Averil Ma Methods and compositions relating to modulation of A20
US20050137155A1 (en) * 2001-05-18 2005-06-23 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated treatment of Parkinson disease using short interfering nucleic acid (siNA)
ES2340499T3 (es) 2001-06-05 2010-06-04 Curevac Gmbh Arnm de antigeno tumoral estabilizado con un contenido de g/c aumentado.
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US9567591B2 (en) 2003-05-15 2017-02-14 Mello Biotechnology, Inc. Generation of human embryonic stem-like cells using intronic RNA
GB0316089D0 (en) 2003-07-09 2003-08-13 Xo Bioscience Ltd Differentiation method
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
JP2007513631A (ja) * 2003-12-12 2007-05-31 プロテオノヴァ、 インコーポレイテッド 核酸およびポリペプチドを選択する系ならびに方法
EP1766035B1 (en) 2004-06-07 2011-12-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
EP1773857A4 (en) 2004-07-02 2009-05-13 Protiva Biotherapeutics Inc THE IMMUNE SYSTEM STIMULATING SIRNA MOLECULES AND APPLICATIONS THEREOF
DE102005023170A1 (de) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
EP4174179B1 (en) 2005-08-23 2025-05-07 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
US20070087437A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Jifan Hu Methods for rejuvenating cells in vitro and in vivo
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
CA2649325C (en) 2006-04-14 2019-01-08 Epicentre Technologies Corporation Kits and methods for generating 5' capped rna
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
WO2008151058A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 The General Hospital Corporation Methods of generating pluripotent cells from somatic cells
CA2707436C (en) 2007-06-29 2014-01-28 Epicentre Technologies Corporation Copy dna and sense rna
EP2072618A1 (en) 2007-12-14 2009-06-24 Johannes Gutenberg-Universität Mainz Use of RNA for reprogramming somatic cells
GB0801215D0 (en) 2008-01-23 2008-02-27 Univ Sheffield Cell re-programming
US20100330677A1 (en) 2008-02-11 2010-12-30 Cambridge Enterprise Limited Improved Reprogramming of Mammalian Cells, and Cells Obtained
AU2009238175C1 (en) 2008-04-15 2023-11-30 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
US8669048B2 (en) 2008-06-24 2014-03-11 Parkinson's Institute Pluripotent cell lines and methods of use thereof
GB0905507D0 (en) 2009-03-31 2009-05-13 Dow Corning Organopol Ysiloxane Compositions Containing An Active Material
WO2010123501A1 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Massachusetts Institute Of Technology Innate immune suppression enables repeated delivery of long rna molecules
DK2459231T3 (en) 2009-07-31 2016-09-05 Ethris Gmbh RNA with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
KR102171849B1 (ko) 2009-12-07 2020-10-30 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 세포 리프로그래밍을 위한 정제된 변형 ｒｎａ를 포함하는 ｒｎａ 제제
US20130189741A1 (en) 2009-12-07 2013-07-25 Cellscript, Inc. Compositions and methods for reprogramming mammalian cells
WO2011130624A2 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Immune Disease Institute, Inc. Sustained polypeptide expression from synthetic, modified rnas and uses thereof
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
US8765414B2 (en) 2011-03-15 2014-07-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University GPCR fusion protein containing an N-terminal autonomously folding stable domain, and crystals of the same
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
WO2013003475A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Cellscript, Inc. Inhibition of innate immune response
EP2798064B1 (en) 2011-12-30 2016-08-31 Cellscript, Llc Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect

Also Published As

Publication number Publication date
EP4599852A2 (en) 2025-08-13
EP1979364A2 (en) 2008-10-15
US20090286852A1 (en) 2009-11-19
US20170043037A1 (en) 2017-02-16
US20130111615A1 (en) 2013-05-02
ES2735531T3 (es) 2019-12-19
EP4174179A3 (en) 2023-09-27
WO2007024708A2 (en) 2007-03-01
US8278036B2 (en) 2012-10-02
EP4174179B1 (en) 2025-05-07
HRP20230113T3 (hr) 2023-03-17
PT2578685T (pt) 2019-07-10
WO2007024708A3 (en) 2007-09-13
ES2937245T3 (es) 2023-03-27
EP4332227A1 (en) 2024-03-06
US20130197068A1 (en) 2013-08-01
EP1979364A4 (en) 2010-10-27
EP3611266B1 (en) 2022-11-09
US8748089B2 (en) 2014-06-10
US20150038558A1 (en) 2015-02-05
EP4174179A2 (en) 2023-05-03
US20230052009A1 (en) 2023-02-16
LT2578685T (lt) 2019-06-10
HUE043492T2 (hu) 2019-08-28
US20150315572A1 (en) 2015-11-05
US8835108B2 (en) 2014-09-16
US20240226335A9 (en) 2024-07-11
EP2578685A2 (en) 2013-04-10
DK2578685T3 (da) 2019-06-03
US20240131194A1 (en) 2024-04-25
EP2578685B1 (en) 2019-04-17
TR201909609T4 (tr) 2019-07-22
SI3611266T1 (sl) 2023-02-28
US8691966B2 (en) 2014-04-08
EP3611266A1 (en) 2020-02-19
US20200030460A1 (en) 2020-01-30
US9371511B2 (en) 2016-06-21
US20130261172A1 (en) 2013-10-03
EP4332227B1 (en) 2026-02-11
PL2578685T3 (pl) 2020-01-31
US9750824B2 (en) 2017-09-05
EP2578685A3 (en) 2013-07-24
US10232055B2 (en) 2019-03-19
US11801314B2 (en) 2023-10-31
US11389547B2 (en) 2022-07-19
EP4599852A3 (en) 2026-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11801314B2 (en) RNA containing modified nucleosides and methods of use thereof
US12054734B2 (en) Purification and purity assessment of RNA molecules synthesized with modified nucleosides
KR102505097B1 (ko) 세포 리프로그래밍을 위한 정제된 변형 ｒｎａ를 포함하는 ｒｎａ 제제
EP3426775A1 (en) Chemically modified messenger rna&#39;s
HK40093833A (en) Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
HK40093833B (en) Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
HK40109789A (en) Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
HK40022229B (en) Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
HK40022229A (en) Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
HK1183899B (en) Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
HK1183899A (en) Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof