TW202444906A - 用於靶向pcsk9之組合物及方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供可用於抑制前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin Type 9； PCSK9)基因之基因抑制子系統，其包含融合蛋白，諸如包含催化失效(catalytically-dead) 2類V型CRISPR蛋白之融合蛋白，及引導核酸(gRNA)。本發明亦提供製造此等系統之方法，及使用此等系統抑制 PCSK9轉錄之方法。

Description

用於靶向PCSK9之組合物及方法

在哺乳動物中，膽固醇經由乳化在脂蛋白內輸送。脂蛋白粒子係基於其密度分類：低密度脂蛋白(LDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)及乳糜微粒。表面LDL受體在膽固醇吸收期間內化。具有充足膽固醇之細胞將阻斷其LDL受體合成，以防止LDL粒子中新的膽固醇吸收。相反，當細胞缺乏膽固醇時，促成LDL受體合成。當該過程不受調控時，過量LDL粒子將在血液中行進而不經LDL受體攝取。血液中之LDL粒子經氧化且由巨噬細胞吸收，巨噬細胞隨後充血且形成泡沫細胞。此等泡沫細胞可截留在血管壁中，且造成動脈粥樣硬化斑塊形成，而其為心臟病發作、中風及其他嚴重醫學問題之主要原因之一。

肝蛋白前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin Type 9，PCSK9)係一種在LDL粒子之內吞作用期間結合於低密度脂蛋白受體(LDL-R)的分泌型、球狀、自活化絲胺酸蛋白酶，防止LDL-R再循環至細胞表面，導致LDL-膽固醇清除降低。PCSK9結合至LDL-R (經由EGF-A域)，防止受體-配位體複合物之構形變化，取而代之將LDL-R重新引導至溶酶體。因為低密度脂蛋白粒子(LDL)之受體通常在細胞外流體內每粒子傳輸數千個脂肪分子(包括膽固醇)，所以阻斷或抑制PCSK9之功能以增強LDL膽固醇之LDL-R介導清除可降低LDL粒子濃度。PCSK9主要在肝臟、腸、腎臟及中樞神經系統中表現，但亦在動脈壁中(諸如內皮平滑肌細胞及巨噬細胞中)高度表現，具有可調節血管穩態及動脈粥樣硬化之局部效應。

PCSK9係前蛋白轉化酶(PC)家族之成員，且在約2%至3%具有家族性高膽固醇血症(FH)之個體中會發生基因突變(Sepideh Mikaeeli, S.等人, Functional analysis of natural PCSK9 mutants in modern and archaic humans. FEBS J. 2019年8月6日. doi: 10.1111/febs.15036)。研究人員已鑑別出引起遺傳性高膽固醇(高膽固醇血症(hypercholesterolemia))的若干PCSK9突變。此等突變改變PCSK9蛋白質中之單一胺基酸。研究人員將造成高膽固醇血症之突變描述為「功能獲得型(gain-of-function)」，因為其似乎會增強PCSK9蛋白之活性或給予蛋白質一種新的非典型功能(Blesa, S.等人, A New PCSK9 Gene Promoter Variant Affects Gene Expression and Causes Autosomal Dominant Hypercholesterolemia. J. Clin. Endocrinol. & Metab. 93:3577(2008))。過度活化的PCSK9蛋白實質上減少肝細胞表面上低密度脂蛋白受體的數目。由於自血液中移除低密度脂蛋白的受體減少，PCSK9基因中具有功能獲得型突變的人血液中具有極高的膽固醇水平。體染色體顯性高膽固醇血症(ADH)係一種遺傳性病症，其特徵為低密度脂蛋白(LDL)-膽固醇水平升高，導致過早患心血管疾病之高風險。在不同群體中，已鑑別出PCSK9中約10種突變為疾病之病因。PCSK9中導致高膽固醇血症之所有已知突變均導致此蛋白酶之酶活性增加(Bleasa, S., 2008)。此外，PCSK9中之突變可能導致體染色體顯性家族性低-β-脂蛋白血症，其可能導致肝脂肪變性、肝硬化及其他病症。

CRISPR/Cas系統之出現及此等極小系統之可程式化性質有助於其用作用於基因體操縱及工程改造之通用技術。然而，歸因於需要修飾大量細胞以調節膽固醇水平，當前在活體內產生PCSK9保護性變異體及功能喪失型突變體之方法已經無效。其他問題涉及可能由基因體編輯引起之脫靶效應、基因體不穩定性或致癌修飾，以及缺乏用於抑制子蛋白系統之安全遞送模式。另外，在某些疾病適應症中，基因緘默化或抑制優於基因編輯。使CRISPR核酸酶(諸如Cas9及CasX無催化活性)之能力已得到證實(WO2020247882A1及US20200087641A1，以引用的方式併入本文中)，其使得此等系統成為產生具有能夠緘默化基因的抑制子域的融合蛋白的有吸引力的平台。儘管已描述某些抑制子系統，但仍需要另外的已最佳化及/或提供優於早幾代基因抑制子系統的改良(例如基於Cas9的用於各種治療、診斷及研究應用中之彼等改良)的基因抑制子系統。因此，仍需要調節PCSK9之經改良組合物及方法。

本發明提供包含或編碼融合蛋白之系統，該等融合蛋白包含用於前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型( PCSK9)基因目標核酸序列之抑制及/或表觀遺傳修飾的DNA結合域及所連接抑制子域。在一些態樣中，融合蛋白包含：DNA結合蛋白，其包含催化失效CRISPR蛋白，諸如2類V型CRISPR蛋白；及引導核酸，其包含與 PCSK9基因目標核酸序列互補之靶向序列。蛋白質及引導核酸可經修飾以被動進入目標細胞且適用於多種用於抑制 PCSK9之方法，該等方法亦有提供。本揭示亦提供編碼或囊封融合蛋白及引導核酸組分之載體及脂質奈米粒子(LNP)，以將系統遞送至細胞用於轉錄抑制PCSK9目標核酸序列。本揭示亦提供用於修飾 PCSK9基因目標核酸序列之方法。本揭示亦提供用於治療患有PCSK9相關疾病之個體的方法。在一些實施例中，組合物及方法在患有代謝病症之個體中具有效用，該代謝病症諸如(但不限於)家族性高膽固醇血症、家族性低-β-脂蛋白血症或膽固醇水平升高。

在其他態樣中，本文提供包含PCRK9抑制子系統之系統，或包含或編碼PCSK9抑制子系統之載體，其用於製造治療有需要個體之PCSK9相關疾病的藥劑。

本發明之某些實施例之其他特徵及優勢將在實施例及其圖式之以下描述中以及根據申請專利範圍而變得更加顯而易見。 參考文獻併入

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同各個別公開案、專利或專利申請案經特定且個別地指示以引用的方式併入一般。揭示CasX變異體及gRNA變異體及其遞送方法的WO 2020/247882、WO 2020/247883、WO 2021/113772、WO2022/120095、WO 2022/125843、WO 2022/261150、WO 2022/261149、WO 2023/049872、WO 2023/049742及WO 2023/240162之內容以及揭示修飾PCSK9之組合物及方法的WO2021/142342的內容特此以全文引用之方式併入。

相關申請之交互引用

本申請案主張2023年3月29日申請之美國臨時申請案第63/492,978號及2023年6月2日申請之美國臨時申請案第63/505,888號之優先權及權益，該等臨時申請案各自之內容以全文引用之方式併入本文中。 電子序列表之引用

電子序列表(SCRB_058_02TW_SeqList_ST26.xml；大小：141,865,746個位元組；且創建日期：2024年3月22日)之內容以全文引用之方式併入本文中。

雖然本文中已經顯示及描述例示性實施例，但熟習此項技術者將顯而易知此等實施例僅藉助於實例提供。熟習此項技術者將在不脫離本發明之精神的情況下想到眾多變化、改變及取代。因此，應理解，本文中具體描述之實施例的各種替代方案可用於實踐本揭示之實施例。

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與一般熟習本揭示所屬領域者通常所理解相同的含義。儘管類似或等效於本文所描述之彼等方法及材料的方法及材料可用於實踐或測試本發明實施例，但在下文描述適合之方法及材料。在有衝突之情況下，將以專利說明書(包括定義)為準。另外，該等材料、方法及實例僅為說明性的且不意欲為限制性的。熟習此項技術者現將在不脫離本揭示及申請專利範圍之精神的情況下想到眾多變化、改變及取代。 定義

除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「宿主細胞」包括兩個或更多個此類宿主細胞，提及「dCasX蛋白」包括一或多個dCasX蛋白，提及「核酸序列」包括一或多個核酸序列，及類似情況。

如本文所使用，術語「約」係一般熟習此項技術者所理解的且在一定程度上可取決於使用其之上下文而變化。若使用一般熟習此項技術者並不清楚的術語，考慮到使用術語「約」之情形，則「約」將意謂特定術語至多加或減10%。

熟習此項技術者應理解，出於任何及所有目的，本文所揭示之所有範圍亦包括其任何及所有可能的子範圍及子範圍組合。另外，熟習此項技術者應理解，範圍包括每一個別成員。因此，例如，具有1至3個成員之群組係指具有1、2或3個成員之群組。類似地，具有1至5個成員之群組係指具有1、2、3、4或5個成員之群組，以此類推。

術語「其組合」包括該術語所指之要素之每一可能組合。

如本文所使用，術語「例示性」係指實例或說明，且並不意欲暗示任何偏好或值。

如本文所使用，術語「CasX蛋白」係指一個蛋白質家族，包括例如所有天然存在之CasX蛋白(「參考CasX」)，以及具有序列修飾之CasX蛋白，例如dCasX，其相對於作為其來源之CasX蛋白具有一或多個經改良特徵，下文對其進行更全面的描述。

術語「聚核苷酸」及「核酸」在本文中可互換使用，係指任何長度之核苷酸(核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸)之聚合形式。因此，術語「聚核苷酸」及「核酸」涵蓋單股DNA；雙股DNA；多股DNA；單股RNA；雙股RNA；多股RNA；基因體DNA；cDNA；DNA-RNA混成物；及包含嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、經化學或生物化學修飾、非天然或衍生之核苷酸鹼基的聚合物。

「可雜合」或「互補」可互換使用，意謂核酸(例如RNA、DNA)包含使其能夠在溫度及溶液離子強度之適當活體外及/或活體內條件下以序列特異性、反向平行方式(亦即，核酸特異性結合於互補核酸)與另一核酸非共價結合(亦即形成沃森-克裏克(Watson-Crick)鹼基對及/或G/U鹼基對)、「黏接」或「雜合」的核苷酸序列。應理解，聚核苷酸序列不必與其可特異性雜合之目標核酸100%互補；其可與目標核酸具有至少約70%、至少約80%或至少約90%、或至少約95%序列一致性且仍與該目標核酸雜合。此外，聚核苷酸可在一或多個區段上雜合以使得中間或相鄰區段不參與雜合事件(例如環結構或髮夾結構、『凸起(bulge)』、『泡狀結構(bubble)』及其類似物)。因此，熟習此項技術者應瞭解，雖然序列內之個別鹼基可不與另一序列互補，但序列整體仍視為互補的。

出於本發明之目的，「基因」包括編碼基因產物(例如蛋白質、RNA)之DNA區域，以及調節基因產物生產之所有DNA區域，無論此類調節序列是否鄰近編碼序列及/或轉錄序列。因此，基因可包括輔助元件序列，其包括但未必限於啟動子序列、終止子、轉譯調節序列(諸如核糖體結合位點及內部核糖體進入位點)、強化子、沉默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附著位點及基因座控制區。編碼序列編碼轉錄後或轉錄及轉譯後之基因產物；本揭示案之編碼序列可包含片段且未必含有全長開讀框。基因可包括經轉錄之股以及含有反密碼子之互補股兩者。

術語「下游」係指位於參考核苷酸序列之3'之核苷酸序列。在某些實施例中，下游核苷酸序列係關於轉錄起始點之後的序列。舉例而言，基因之轉譯起始密碼子位於轉錄起始位點下游。

術語「上游」係指位於參考核苷酸序列之5'之核苷酸序列。在某些實施例中，上游核苷酸序列與位於編碼區或轉錄起始點之5'側上之序列相關。舉例而言，大部分啟動子位於轉錄起始位點上游。

關於聚核苷酸或胺基酸序列之術語「鄰近」係指聚核苷酸或多肽中相互緊靠或鄰接的序列。熟練技術人員應瞭解，兩個序列可視為彼此鄰近且仍涵蓋有限量之插入序列，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸或胺基酸。

術語「調節元件」在本文中可與術語「調節序列」互換使用，且意欲包括啟動子、強化子及其他表現調節元件。應理解，適當調控元件之選擇將視待表現之經編碼組分(例如蛋白質或RNA)而定或取決於核酸是否包含多個需要不同聚合酶或不欲表現為融合蛋白之組分。

術語「輔助元件」在本文中可與術語「輔助序列」互換使用，且意欲包括增強核酸表現、核酸運輸或者mRNA或蛋白質功能之編碼及非編碼序列，且尤其包括聚腺苷酸化信號(poly(A)信號)、強化子元件、內含子、轉錄後調控元件(PTRE)、核定位信號(NLS)、脫胺酶、DNA醣苷酶抑制劑、另外的啟動子、刺激CRISPR介導之同源定向修復之因子(例如呈順式或反式)、自裂解序列及融合域(例如與CRISPR蛋白融合之融合域)。應理解，適當的一或多個輔助元件之選擇將視待表現之編碼組分(例如蛋白質或RNA)而定或取決於核酸是否包含需要不同聚合酶或不欲表現為融合蛋白之多個組分。

術語「啟動子」係指含有轉錄起始位點及另外的促進聚合酶結合及轉錄之序列的DNA序列。例示性真核啟動子包括諸如TATA盒之元件及/或B識別元件(BRE)，且幫助或促進相關可轉錄聚核苷酸序列及/或基因(或轉殖基因)之轉錄及表現。啟動子可以合成方式產生或可衍生自已知或天然存在之啟動子序列或另一啟動子序列。啟動子可在待轉錄之基因近端或遠端。啟動子亦可包括嵌合啟動子，其包括兩個或更多個異源序列之組合以賦予某些特性。本揭示之啟動子可包括與本文已知或提供之其他啟動子序列在組成上類似，但與其不相同的啟動子序列之變異體。啟動子可根據與相關編碼或可轉錄序列或可操作地連接於啟動子之基因(諸如組成性、發育性、組織特異性、誘導性基因等)之表現模式相關的準則分類。啟動子亦可根據其強度分類。如啟動子之上下文中所用，「強度」係指藉由啟動子控制之基因的轉錄速率。「強」啟動子意謂轉錄速率較高，而「弱」啟動子意謂轉錄速率相對較低。

本發明之啟動子可為聚合酶II (Pol II)啟動子。聚合酶II轉錄所有蛋白質編碼及許多非編碼基因。代表性Pol II啟動子包括核心啟動子，該核心啟動子為圍繞轉錄起始位點約100個鹼基對之序列，且充當Pol II聚合酶及相關通用轉錄因子之結合平台。啟動子可含有一或多個核心啟動子元件，諸如TATA盒、BRE、引發劑(INR)、模體十元件(MTE)、下游核心啟動子元件(DPE)、下游核心元件(DCE)，儘管缺乏此等元件之核心啟動子為此項技術中已知的。所有Pol III啟動子均設想在本揭示之範疇內。

本揭示之啟動子可為聚合酶III (Pol III)啟動子。Pol III轉錄DNA以合成小核糖體RNA，諸如5S rRNA、tRNA及其他小RNA。代表性Pol III啟動子使用內部控制序列(基因之轉錄片段內的序列)來支援轉錄，但有時亦使用諸如TATA盒之上游元件。所有Pol III啟動子均設想在本揭示之範疇內。

術語「強化子」係指當與稱為轉錄因子之特異性蛋白質結合時，調節相關基因之表現的調節DNA序列。強化子可位於基因之內含子中，或基因編碼序列之5'或3'中。強化子可在基因近端(亦即，在啟動子之數十或數百個鹼基對(bp)內)，或可位於基因遠端(亦即，與啟動子相距數千個bp、數十萬個bp或甚至數百萬個bp)。單一基因可藉由超過一個強化子調控，設想該等超個一種強化子均在本揭示之範疇內。

如本文所用，「轉錄後調節元件(PTRE)」，諸如肝炎PTRE，係指當轉錄時產生能夠展現轉錄後活性以增強或促進與其可操作地連接之相關基因表現的三級結構的DNA序列。

「可操作地連接」意謂兩個或更多個組分(諸如序列元件)之併接，其中該等組分經排列使得兩個組分正常地起作用且使該等組分中之至少一者可介導施加於其他組分(例如啟動子及編碼序列)中之至少一者的功能。熟習此項技術者應瞭解，兩個組件無需以物理方式連接以可操作地連接。

在本發明之上下文中且就基因而言，「抑制(repress)」、「抑制(repression)」、「抑制(repressing)」、「轉錄抑制(transcriptional repression)」「阻抑基因表現(inhibition of gene expression)」、「下調(downregulation)」及「緘默化(silencing)」在本文中可互換使用，指代對基因或其部分之轉錄的抑制或阻斷。因此，基因之抑制可使得基因產物之產生減少。減少轉錄之基因抑制過程之實例包括但不限於抑制轉錄起始複合物之形成的過程、降低轉錄起始速率的過程、降低轉錄延伸速率的過程、降低轉錄持續力的過程及拮抗轉錄活化(例如藉由阻斷轉錄活化因子之結合)的過程。基因抑制可構成例如活化防止以及低於現有量之表現抑制。轉錄抑制包括基因轉錄之可逆及不可逆失效兩者；後者可由基因之表觀基因修飾引起。

「抑制子(repressor)」或「抑制子域(repressor domain)」可互換使用以指代多肽因子，其充當阻抑、抑制或阻斷DNA轉錄，引起基因表現之抑制的DNA上之調控元件。在本發明之上下文中，抑制子域與DNA結合蛋白之連接可在結合於目標核酸時防止自啟動子轉錄或以其他方式阻抑基因表現。不希望受理論所束縛，認為轉錄抑制子可藉由多種機制起作用，包括藉由位阻以物理方式阻斷RNA聚合酶通路、改變聚合酶之轉譯後修飾狀態、修改新生RNA之表觀遺傳狀態、經由甲基化改變DNA之表觀遺傳狀態、經由組蛋白去乙醯化或調節核小體重塑改變DNA之表觀遺傳狀態或防止強化子-啟動子相互作用，從而引起基因緘默化或基因表現量降低。

「長期抑制子融合蛋白」或「LTRP」在本文中可與「抑制子融合蛋白」互換使用且係指包含DNA結合蛋白(或蛋白質之DNA結合域)與一或多個域融合之融合蛋白，其能夠抑制目標核酸序列之轉錄。視情況，本揭示之長期抑制子融合蛋白可含有額外元件，諸如融合蛋白之域中之任一者之間的連接子、核定位信號、核輸出信號以及賦予長期抑制子融合蛋白額外活性之額外蛋白域。

如本文所使用，「LTRP:gRNA系統」係用於轉錄抑制之系統且包含：長期抑制子融合蛋白，該抑制子融合蛋白包含催化失效之CRISPR蛋白及一或多個所連接抑制子域；以及結合至催化失效之CRISPR蛋白的引導核酸(gRNA)。為了清楚起見，該系統亦包括可用於產生該系統之長期抑制子融合蛋白及gRNA組分的任何編碼DNA、RNA或載體及其類似物。

如本文所使用，「催化失效DNA結合蛋白」係指能夠結合DNA但無法切割或裂解DNA之蛋白質或蛋白質域。如本文所用，「催化失效CRISPR蛋白」係指缺乏核酸內切酶活性的CRISPR蛋白。熟習此項技術者應瞭解，CRISPR蛋白可為催化失效的，且仍能夠執行額外蛋白質功能，諸如DNA結合。類似地，「催化失效CasX」係指缺乏核酸內切酶活性但仍能夠執行額外蛋白質功能(諸如DNA結合)的CasX蛋白。

如本文所用，「重組(Recombinant)」意謂特定核酸(DNA或RNA)為選殖、限制及/或連接步驟之各種組合的產物，產生具有與天然系統中發現之內源核酸可區分之結構性編碼或非編碼序列的構築體。一般而言，編碼結構性編碼序列之DNA序列可自cDNA片段及短寡核苷酸連接子或自一系列合成寡核苷酸組裝，以提供能夠自細胞中或無細胞轉錄及轉譯系統中所含之重組轉錄單元表現的合成核酸。此等序列可呈未被內部非轉譯序列或內含子(其通常存在於真核基因中)間斷之開讀框形式提供。包含相關序列之基因體DNA亦可用於形成重組基因或轉錄單元。非轉譯DNA之序列可存在於開讀框之5'或3'，其中此等序列不干擾編碼區之操縱或表現，且可實際上用於藉由各種機制調節所需產物之產生(參見上文之「強化子」及「啟動子」)。

術語「重組聚核苷酸」或「重組核酸」係指一種非天然存在，例如藉由經由人工干預將序列之兩個其他分離區段人工組合而製得。此人工組合通常藉由化學合成手段或藉由人工操縱核酸之分離區段，例如藉由基因工程改造技術來實現。通常進行此類操作以用編碼密碼子或保守胺基酸，同時典型地引入或移除序列識別位點之冗餘密碼子來替代密碼子。或者，進行該操作以將具有所需功能之核酸區段連接在一起以產生所需功能組合。此人工組合通常藉由化學合成手段或藉由人工操縱核酸之分離區段，例如藉由基因工程改造技術來實現。

類似地，術語「重組多肽」或「重組蛋白」係指並非天然存在之多肽或蛋白質，例如藉由經由人工干預將胺基序列之兩個其他分離區段人工組合而製得。因此，例如，包含異源胺基酸序列之蛋白質係重組的。

如本文所用，「脂質奈米粒子」或「LNP」係指具有至少一個奈米尺寸(例如1至1,000 nm)的粒子，其包含一或多種脂質(例如陽離子型脂質、非陽離子型脂質、輔助磷脂及經PEG修飾之脂質)以及膽固醇。LNP之特定組分在下文加以更全面地描述。脂質奈米粒子可包括在調配物中，該調配物可用於將活性劑或治療劑，諸如核酸(例如mRNA)遞送至所關注之目標部位(例如細胞、組織、器官、腫瘤及其類似者)。本揭示之脂質奈米粒子可包含核酸。此等脂質奈米粒子通常包含中性脂質、帶電脂質、類固醇及聚合物結合脂質。活性劑或治療劑(諸如核酸)可囊封於脂質奈米粒子之脂質部分或由脂質奈米粒子之一些或全部脂質部分包封的水性空間中，從而保護其免於受酶降解或由宿主生物體或細胞之機制誘導之其他不合需要的影響，例如不良免疫反應。

如本文所用，「經脂質囊封」係指提供活性劑或治療劑，諸如核酸(例如mRNA、gRNA或mRNA與gRNA兩者)，同時完全囊封、部分囊封或兩者之脂質奈米粒子。核酸(例如mRNA)可完全囊封於脂質奈米粒子中。

如本文所用，「脂蛋白」(諸如VLDL、LDL及HDL)係指於血清、血漿及淋巴中發現且對於脂質轉運至關重要的一組蛋白質。各脂蛋白之化學組成不同，例如因為HDL具有較高比例之蛋白質比脂質，而VLDL具有較低比例之蛋白質比脂質。

如本文所用，「動脈粥樣硬化」意謂影響大型及中型動脈之動脈硬化且以脂肪沉積物之存在為特徵。脂肪沉積物稱為「動脈粥樣化斑」或「斑塊」，其主要由膽固醇及其他脂肪、鈣及瘢痕組織組成，且破壞動脈內膜。

如本文所用，「冠狀動脈心臟病(CHD)」意謂向心臟供應血液及氧氣之小血管變窄，其通常由動脈粥樣硬化導致。

如本文所用，「血脂異常」係指脂質及/或脂蛋白代謝病症，包括脂質及/或脂蛋白過度產生或缺乏。血脂異常可體現為脂質(諸如乳糜微粒、膽固醇及三酸甘油酯)以及脂蛋白(諸如低密度脂蛋白(LDL)膽固醇)的升高。

如本文所用，「高密度脂蛋白-C」或「HDL-C」意謂與高密度脂蛋白粒子相關之膽固醇。血清(或血漿)中HDL-C之濃度通常以mg/dL或nmol/L定量。「血清HDL-C」及「血漿HDL-C」分別意謂血清及血漿中之HDL-C。

如本文所用，「低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)」意謂低密度脂蛋白粒子中攜帶的膽固醇。血清(或血漿)中LDL-C之濃度通常以mg/dL或nmol/L定量。「血清LDL-C」及「血漿LDL-C」分別意謂血清及血漿中之LDL-C。

如本文所用，「高膽固醇血症」意謂以膽固醇或循環(血漿)膽固醇、LDL-膽固醇及VLDL-膽固醇升高為特徵之病狀，符合國家膽固醇教育計劃(NCEP)專家組報導中關於治療成人高膽固醇的偵測、評定的指導方針(參見，Arch. Int. Med. 148: 36 (1988))。

如本文所用，「高脂血症(hyperlipidemia)」或「高血脂病(hyperlipemia)」為以血清脂質或循環(血漿)脂質升高為特徵之病狀。此病狀表現出異常高濃度之脂肪。循環血液中之脂質部分為膽固醇、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、乳糜微粒及三酸甘油酯。高脂血症之弗雷德裏克森(Fredrickson)分類法係基於藉由電泳或超速離心所量測的TG及富含膽固醇之脂蛋白粒子之圖案，且常用於表徵高脂血症(諸如高三酸甘油酯血症)之主要病因。

如本文所用，「三酸甘油酯」或「TG」意謂由甘油與三種脂肪酸分子組合組成之脂質或中性脂肪。

如本文所用，「高三酸甘油酯血症(hypertriglyceridemia)」意謂以三酸甘油酯水平升高為特徵之病狀。其病因包括主要(亦即遺傳病因)及次要(其他潛在病因，諸如糖尿病、代謝症候群/胰島素抗性、肥胖、缺乏運動、吸菸、過量飲酒及碳水化合物極高的飲食)因素，或最常見為兩者之組合。

如本文所用，「糖尿病(diabetes mellitus)」或「糖尿病(diabetes)」係以無序代謝及異常高血糖(高血糖症)為特徵之症候群，其由胰島素水平不足或胰島素敏感性降低引起。特徵症狀為由高血糖水平導致過量尿液產生(多尿(polyuria))；視圖彌補排尿增加而引起過度口渴以及液體攝入量增加(多飲(polydipsia))；由於高血糖對眼睛光學的影響而導致視力模糊；不明原因的體重減輕；以及嗜睡。

如本文所用，「糖尿病血脂異常」或「2型糖尿病伴血脂異常」意謂以2型糖尿病、HDL-C降低、三酸甘油酯(TG)升高及較小密集LDL粒子升高為特徵之病狀。

如本文所用，術語「接觸」意謂在兩個或更多個實體之間建立實體連接。舉例而言，使目標核酸與引導核酸接觸意謂使目標核酸與引導核酸共用實體連接；例如，若該等序列共用序列相似性，則可雜合。

「解離常數」或「K _d」可互換使用且意謂配位體「L」與蛋白質「P」之間的親和力；亦即，配位體與特定蛋白質結合之緊密程度。其可使用式K _d=[L][P]/[LP]計算，其中[P]、[L]及[LP]分別表示蛋白質、配位體及複合物之莫耳濃度。

如本文所用，術語「減弱(knock-down)」係指基因或其基因產物之表現減少。由於基因減弱，蛋白質活性或功能可衰減或蛋白質水平可降低或被消除。

聚核苷酸或多肽與另一聚核苷酸或多肽具有某一「序列相似性」或「序列一致性」百分比意謂，進行比對時相同的及比較兩個序列時在相同相對位置的鹼基或胺基酸之百分比。序列相似性(有時稱為相似性百分比、一致性百分比或同源性)可以多種不同方式確定。為確定序列相似性，可使用此項技術中已知之方法及電腦程式比對序列，該等方法及電腦程式包括BLAST，其可在全球資訊網內在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST處獲得。核酸內之核酸序列之特定伸長段之間的互補性百分比可使用任何便利方法確定。例示性方法包括BLAST程式(基本局部比對搜尋工具及PowerBLAST程式(Altschul等人, J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410；Zhang及Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656)或藉由使用Gap程式(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix第8版, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)，例如使用預設設定，其使用Smith及Waterman之演算法(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)。

術語「多肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用，且係指任何長度之胺基酸之聚合形式，其可包括編碼及非編碼胺基酸、化學或生物化學修飾或衍生之胺基酸及具有經修飾肽主鏈之多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源胺基酸序列之融合蛋白。

「載體」或「表現載體」係一種複製子，諸如質體、噬菌體、病毒或黏質體，其可包括另一DNA區段，亦即表現卡匣，以便引起細胞中其他DNA區段之複製或表現。

應用於核酸、多肽、細胞或生物體的如本文所用之術語「天然存在的(naturally-occurring)」或「未修飾(unmodified)」或「野生型(wild type)」係指自然界中發現之核酸、多肽、細胞或生物體。

如本文所用，相比於野生型或參考胺基酸序列或野生型或參考核苷酸序列，「突變」係指一或多個胺基酸或核苷酸的插入、缺失、取代、複製或倒置。

如本文所用，術語「經分離(isolated)」意在描述處於與聚核苷酸、多肽或細胞天然存在之環境不同的環境中的聚核苷酸、多肽或細胞。經分離之遺傳修飾宿主細胞可存在於遺傳修飾宿主細胞之混合群體中。

如本文所用之「宿主細胞」表示真核細胞、原核細胞或來自以單細胞實體形式培養之多細胞生物體(例如細胞株)的細胞，該等真核或原核細胞用作核酸(例如AAV載體)之接受體，且包括已藉由核酸遺傳修飾之原始細胞之子代。應理解，單一細胞之後代可歸因於天然、意外或有意突變而不一定與原始親本細胞具有完全相同之形態或基因體或總DNA互補序列。「重組宿主細胞」(亦稱為「經遺傳修飾之宿主細胞」)為已引入異源核酸(例如AAV載體)的宿主細胞。

術語「保守胺基酸取代」係指蛋白質中具有類似側鏈之胺基酸殘基之互換性。舉例而言，具有脂族側鏈之胺基酸之群組由甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸組成；具有脂族羥基側鏈之胺基酸之群組由絲胺酸及蘇胺酸組成；具有含醯胺側鏈之胺基酸之群組由天冬醯胺及麩醯胺酸組成；具有芳族側鏈之胺基酸之群組由苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸組成；具有鹼性側鏈之胺基酸之群組由離胺酸、精胺酸及組胺酸組成；且具有含硫側鏈之胺基酸之群組由半胱胺酸及甲硫胺酸組成。例示性保守胺基酸取代群組為：纈胺酸-白胺酸-異白胺酸、苯丙胺酸-酪胺酸、離胺酸-精胺酸、丙胺酸-纈胺酸及天冬醯胺-麩醯胺酸。

如本文所用，「治療(treatment)」或「治療(treating)」在本文中可互換使用，且係指獲得有益或所需結果(包括但不限於治療益處及/或預防益處)之方法。治療益處意謂根除或減輕所治療之潛在病症或疾病。治療益處亦可藉由根除或減輕一或多種症狀或改善與潛在疾病相關之一或多個臨床參數，使得儘管個體仍可能罹患潛在病症，但在個體中觀測到改善來實現。

如本文所用，術語「治療有效量(therapeutically effective amount)」及「治療有效劑量(therapeutically effective dose)」係指當以一個或重複劑量向個體(諸如人類或實驗動物)投與時能夠對疾病狀態或病狀之任何症狀、態樣、所量測參數或特徵具有任何可偵測、有益作用的單獨或作為組合物之一部分的藥物或生物製劑之量。該作用不需要絕對有益。

如本文所用，「投與」意謂向個體給予一劑量之化合物(例如本揭示之組合物)或組合物(例如醫藥組合物)的方法。

「個體」係哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴養動物、非人類靈長類動物、人類、狗、兔、小鼠、大鼠及其他嚙齒動物。

術語「低密度脂蛋白(LDL)」係指密集最小(重量體積比粒子較小)至密集最大(重量體積比粒子較大)之五大類脂蛋白之一：乳糜微粒、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)、中等密度脂蛋白(IDL)及高密度脂蛋白(HDL)。脂蛋白在細胞外流體中將脂質(脂肪)轉移至身體周圍，從而促進脂肪經由受體介導之內吞作用轉移至細胞體。LDL粒子之直徑為約220至275埃。

「低密度脂蛋白(LDL)受體」係指介導富含膽固醇之LDL粒子的內吞作用的839個胺基酸之受體蛋白(移除21-胺基酸信號肽之後)。其係一種細胞表面受體，其識別在乳糜微粒殘餘物及VLDL殘餘物(IDL)中發現之去輔基蛋白B100及apoE蛋白，從而引起LDL-膽固醇之結合及內吞作用。此過程發生於所有有核細胞中，但主要發生在肝臟中，其自循環移除大致70%之LDL。人類LDLR基因在NCBI資料庫(ncbi.nlm.nih.gov)中經部分描述為參考序列NG_009060.1，其以引用之方式併入本文中。

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用的程度如同各個別公開案、專利或專利申請案經特定及個別地指示以引用的方式併入一般。 I. 一般方法

除非另外規定，否則本發明之實踐採用免疫學、生物化學、化學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、基因體學及重組DNA之習知技術，其可見於諸如以下之標準教科書：Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版(Sambrook等人, Harbor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology, 第4版(Ausubel等人編, John Wiley & Sons 1999)；Protein Methods (Bollag等人, John Wiley & Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner等人編, Academic Press 1999)；Viral Vectors (Kaplift及Loewy編, Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual (I. Lefkovits編, Academic Press 1997)；及Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle及Griffiths, John Wiley & Sons 1998)，該等文獻之揭示內容以引用的方式併入本文中。

在提供值範圍時，應理解包括端點且涵蓋彼範圍之上限與下限之間的各中介值(除非上下文另有明確指示，否則至下限單位之十分之一)及彼所陳述範圍內之任何其他所陳述值或中介值。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括在較小範圍內且亦涵蓋在所陳述範圍內，受制於任何特定排除之限值。在所述範圍包括限制中之一或兩者之情況下，亦包括排除彼等所包括之限值之任一者或兩者的範圍。

除非另作定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本揭示所屬技術者通常所瞭解之含義相同的含義。本文所提及之全部公開案均以引用之方式併入本文中，以揭示及描述與所引用之公開案相關的方法及/或材料。

應瞭解，為了清楚起見而在獨立實施例之上下文中描述的本揭示之某些特徵亦可組合地提供於單一實施例中。在其他情況下，為簡潔起見而在單個實施例之上下文中描述的本揭示之各種特徵亦可分開地或以任何適合之子組合提供。希望關於本揭示的實施例之所有組合特定地由本揭示涵蓋且在本文中揭示，如同個別地且明確地揭示每一組合一般。另外，各種實施例及其要素之所有子組合亦由本揭示特定涵蓋且在本文中揭示，如同個別地且明確地在本文中揭示每一此類子組合一般。 II. 用於 PCSK9基因之表觀遺傳修飾及抑制之系統

在第一態樣中，本揭示提供包含或編碼長期抑制子融合蛋白(「LTRP」)之系統，該融合蛋白包含能夠結合經靶向用於轉錄抑制、緘默化及/或表觀遺傳修飾之 PCSK9基因之目標核酸序列的DNA結合蛋白及抑制子域。本揭示亦提供包含或編碼LTRP之系統。在一些情況下，該系統經設計以抑制真核細胞中具有突變之 P CSK9基因的轉錄。

如本文所用，「系統」可與「組合物」互換使用。本揭示亦提供編碼本文所提供之系統的核酸。本文亦提供製造該等系統之方法，以及使用該等系統之方法，包括基因抑制及/或表觀遺傳修飾之方法及治療PCSK9相關疾病之方法。為了清楚起見，術語「系統」亦包括可用於產生該系統之抑制子融合蛋白及gRNA組分的任何編碼DNA、RNA或載體及其類似物。

在一些實施例中，用於本發明之長期抑制子融合蛋白之DNA結合蛋白包含鋅指(ZF)或TALE (轉錄活化因子樣效應物)蛋白或其DNA結合域，在本文中亦稱為DNA結合蛋白，其結合目標核酸但不裂解目標核酸。TALE之DNA結合域包含33-34個胺基酸(aa)長的可定製單體之串聯陣列，其理論上可按照一個重複序列結合一個鹼基對的識別碼組裝以識別任何基因序列(Jain, S.等人，TALE outperforms Cas9 in editing heterochromatin target sites. Nat. Commun. 12:606 (2021))。TALE結合DNA之特異性係由兩個多晶型胺基酸引起，所謂的重複序列可變雙殘基(repeat variable diresidue，RVD)位於重複單元之位置12及13處。藉由重新排列重複序列，可任意改變TALE的DNA結合特異性。鋅指蛋白為轉錄因子，其中各鋅指識別DNA之3至4個鹼基。藉由混合及匹配此等鋅指模組，ZF可針對待靶向之序列進行定製。能夠結合 PCSK9基因之例示性ZF描述於WO2018049009A2中。

在一些實施例中，用於長期抑制子融合蛋白之DNA結合蛋白為催化失效之1類或2類CRISPR蛋白。催化失效之CRISPR蛋白在此項技術中亦稱為「無催化活性」CRISPR蛋白。在一個實施例中，2類II型蛋白為催化失效之Cas9。在另一實施例中，2類CRISPR蛋白係選自由II型、V型或VI型蛋白質組成之群。在一個實施例中，2類V型蛋白係選自由以下組成之群：Cas12a (Cpf1)、Cas12b (C2c1)、Cas12c (C2c3)、Cas12d (CasY)、Cas12e (CasX)、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j、Cas12k、Cas14及/或CasΦ，在各情況下如本文所描述均藉由特異性突變使其呈現催化失效。基於CRISPR之系統進一步包含引導核酸，例如引導核糖核酸(gRNA)，其具有與由融合蛋白(CRISPR蛋白質及所連接抑制子域)與gRNA之複合物結合及受該複合物抑制的 PCSK9基因之目標序列互補的靶向序列。

在一些實施例中，本揭示提供包含或編碼長期抑制子融合蛋白及引導核糖核酸(gRNA)之系統，以及編碼長期抑制子融合蛋白及/或gRNA之核酸，該融合蛋白包含催化失效CasX CRISPR核酸酶蛋白及所連接抑制子域，該引導核糖核酸包含與經靶向用於轉錄抑制、緘默化或下調之 PCSK9基因之目標核酸序列互補的靶向序列。在一些實施例中，該系統包含本揭示之呈基因抑制子對(「LTRP:gRNA系統」)形式的長期抑制子融合蛋白及gRNA，該長期抑制子融合蛋白及gRNA能夠形成核糖核蛋白(RNP)複合物且結合 PCSK9目標核酸。在其他情況下，本揭示提供編碼長期抑制子融合蛋白及gRNA之核酸的系統。在又其他情況下，本揭示提供gRNA及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA的系統，其用於本文所描述之某些粒子調配物(例如LNP)。

本文亦提供製造長期抑制子融合蛋白及gRNA之方法，以及使用LTRP:gRNA系統之方法，包括 PCSK9基因之基因抑制及/或表觀遺傳修飾之方法及治療 PCSK9相關疾病或病症之方法。LTRP:gRNA系統及其特徵之DNA結合蛋白(例如dCasX)及所連接抑制子域及gRNA組分，以及使用該等系統用於 PCSK9基因之抑制、下調或緘默化之系統的遞送模式及方法在下文中更全面地描述。

在一些實施例中，本揭示提供經特定設計以抑制或緘默化 PCSK9基因之轉錄的系統。在一些情況下，系統經設計以抑制真核細胞中具有功能獲得型突變之 PCSK9基因之轉錄。在一些情況下，系統經設計以抑制真核細胞中之野生型 PCSK9基因的轉錄。在替代方案中，系統經設計以抑制真核細胞中 PCSK9基因之突變型對偶基因之轉錄。一般而言， PCSK9基因之任何部分均可使用本文所提供之可程式化系統及方法靶向，本文對此進行更全面的描述。

PCSK9基因編碼前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(「PCSK9」)，其為一種結合於低密度脂蛋白粒子(LDL)之受體以將LDL轉運至細胞中的蛋白質。 PCSK9基因涵蓋橫跨人類基因體(GRCh38/hg38)之chr1:55,039,476-55,064,853的序列(符號係指1號染色體(chr1))，自1號染色體上的55,039,476 bp起始至55,064,853 bp (Homo sapiens Updated Annotation Release 109.20190905, GRCh38.p13) (NCBI)。人類 PCSK9基因在NCBI資料庫(ncbi.nlm.nih.gov)中經部分描述為參考序列NG_009061.1，其以引用之方式併入本文中。 PCSK9基因座具有12個外顯子，其產生編碼692-胺基酸蛋白質之3636 bp的mRNA，該蛋白質在其合成之後經歷自催化裂解反應，該反應剪切前域，從而產生具有540個胺基酸之活化蛋白質。前域仍連接至催化及抵抗素樣域，此可能係因為前域充當伴護蛋白且促進摺疊及分泌(Seidah, NG等人, Proc Natl Acad Sci USA 100(3):928 (2003))。分泌性前蛋白轉化酶神經細胞凋亡調節之轉化酶1 (NARC-1)：肝臟再生及神經元分化(The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-1): liver regeneration and neuronal differentiation，Seidah NG等人)。此蛋白質，亦稱為神經細胞凋亡調節之轉化酶，係一種屬於枯草桿菌酶之蛋白酶K亞家族的絲胺酸蛋白酶。

人類PCSK9基因(HGNC:20001)編碼具有以下序列之蛋白質(Q8NBP7)： 。 III. 用於抑制子系統之催化失效之蛋白

在一些實施例中，用於本揭示之長期抑制子融合蛋白之DNA結合蛋白為可結合但不裂解 PCSK9目標核酸之鋅指(ZF)或TALE (轉錄活化因子樣效應物)蛋白。

在一些實施例中，DNA結合蛋白為催化失效之1類或2類CRISPR蛋白。在一些實施例中，DNA結合蛋白為2類II型CRISPR蛋白。在一個實施例中，2類II型蛋白為催化失效之Cas9。在另一實施例中，2類CRISPR蛋白係選自由II型、V型或VI型蛋白質組成之群。在一個實施例中，2類CRISPR V型蛋白係選自由以下組成之群：Cas12a (Cpf1)、Cas12b (C2c1)、Cas12c (C2c3)、Cas12d (CasY)、Cas12e (CasX)、Cas12f、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12j、Cas12k、Cas14及/或CasΦ，在各情況下如本文所描述均藉由特異性突變使其呈現催化失效。在另一實施例中，2類V型CRISPR蛋白係催化失效之CasX蛋白。

本揭示之CasX蛋白(包括dCasX)包含以下域：非目標股結合(NTSB)域、目標股負載(target strand loading，TSL)域、螺旋狀I域、螺旋狀II域、寡核苷酸結合域(OBD)及RuvC域，且在一些情況下，域可進一步分成子域，如表1中所列出。

在本揭示之上下文中，用於該等系統中的CasX係催化失效的(dCasX)；藉由在RuvC序列中之選定位置處引入突變實現，其描述如下。 a.參考CasX蛋白

本揭示提供天然存在之CasX蛋白(在本文中稱為「參考CasX蛋白」)，其隨後經修飾以產生本揭示之經工程改造之dCasX。舉例而言，參考CasX蛋白可與天然存在之原核生物分離，諸如δ變形菌綱( Deltaproteobacteria)、浮黴菌門( Planctomycetes)或宋氏菌暫定種屬( Candidatus Sungbacteria species)。參考CasX蛋白(在本文中可互換地稱為參考CasX多肽)為2類V型CRISPR/Cas核酸內切酶，其屬於與引導RNA相互作用以形成核糖核蛋白(RNP)複合物之蛋白質之CasX (可互換地稱為Cas12e)家族。

在一些情況下，參考CasX蛋白係分離自或來源於δ變形菌綱，且包含SEQ ID NO: 1之序列。

在一些情況下，參考CasX蛋白係分離自或來源於浮黴菌門，且包含SEQ ID NO: 2之序列。

在一些情況下，參考CasX蛋白係分離自或來源於宋氏菌暫定種，且包含SEQ ID NO: 3之序列。 b. 催化失效之 1 類 或 2 類 CRISPR 蛋白

在長期抑制子融合蛋白及包含本揭示之長期抑制子融合蛋白的基因抑制子系統中，催化失效1類或2類CRISPR蛋白係催化失效的，因為其無法裂解DNA，但在與引導RNA (gRNA)複合時保留結合目標核酸之能力。本揭示提供1類或2類CRISPR蛋白的催化失效變異體，其中該等催化失效變異體在選定域中包含多個修飾。本揭示提供催化失效之CasX變異體(在本文中可互換稱為「dCasX變異體」或「dCasX變異體蛋白」)，其中相對於包含SEQ ID NO: 1至3之序列之參考CasX蛋白之催化失效之版本，催化失效之CasX變異體在RuvC域中包含多個修飾(參見上文所述)。在一些實施例中，催化失效之參考CasX蛋白相對於SEQ ID NO: 1包含殘基672、769及/或935處之取代。在一些實施例中，催化失效之參考CasX蛋白相對於SEQ ID NO: 1包含D672A、E769A及/或D935A取代。在其他實施例中，催化失效之參考CasX蛋白相對於SEQ ID NO: 2包含胺基酸659、756及/或922處之取代。在一些實施例中，催化失效之參考CasX蛋白相對於SEQ ID NO: 2包含D659A、E756A及/或D922A取代。本揭示之dCasX之例示性RuvC域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸661-824及935-986、或SEQ ID NO: 2之胺基酸648-812及922-978，相對於該RuvC裂解域序列具有一或多個胺基酸修飾，其中與參考dCasX相比，dCasX變異體展現一或多個經改良特徵。在其他實施例中，催化失效之CasX變異體蛋白包含參考CasX蛋白之全部或部分RuvC域之缺失。應理解，相同前述取代或缺失可類似地引入此項技術中已知之CasX變異體中，產生dCasX變異體(關於例示性序列，參見例如WO2022120095A1以及US11,560,555，其以引用的方式併入本文中)。

在一些實施例中，與包含參考dCasX蛋白及類似的所連接抑制子域的長期抑制子融合蛋白相比，包含dCasX變異體及所連接抑制子域的長期抑制子融合蛋白展現至少一個經改良特徵。與包含參考dCasX蛋白之長期抑制子融合蛋白相比改良包含dCasX變異體蛋白及所連接抑制子域的長期抑制子融合蛋白的一或多個功能或特徵的所有dCasX變異體被設想為在本揭示之範疇內。在一些實施例中，修飾為參考dCasX 之一或多個胺基酸之突變(除使得dCasX催化失效之彼等胺基酸以外)。舉例而言，相對於參考dCasX蛋白序列，dCasX變異體可包含一或多個胺基酸取代、插入、缺失或交換域，或其任何組合。任何胺基酸可在本文所描述之取代中經任何其他胺基酸取代。取代可為保守取代(例如鹼性胺基酸經另一鹼性胺基酸取代)。取代可為非保守取代(例如鹼性胺基酸經酸性胺基酸取代或反之亦然)。舉例而言，參考dCasX蛋白中之脯胺酸可經以下中之任一者取代以產生本揭示之dCasX變異體蛋白：精胺酸、組胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、酪胺酸或纈胺酸。在一些實施例中，與參考dCasX相比，dCasX變異體展現經改良之特徵。dCasX變異體實施例的例示性改良之特徵包括但不限於：變異體摺疊改良、對目標核酸之結合親和力增加、在目標核酸之轉錄抑制及/或結合中利用較大範圍PAM序列之能力改良、目標DNA展開改良、目標股負載增加、DNA非目標股之結合增加、蛋白質穩定性改良、與gRNA形成複合物之能力增加、對gRNA之結合親和力增加、蛋白質:gRNA (RNP)複合物穩定性改良，以及在連接抑制子域情況下且複合成RNP時抑制子活性增加、抑制子對目標核酸之特異性改良、脫靶抑制減少、可被有效抑制及/或表觀遺傳修飾之真核基因體的百分比增加。在一些實施例中，dCasX變異體之經改良特徵相對於參考dCasX蛋白改良至少約1.1至約100,000倍。在一些實施例中，dCasX變異體之經改良特徵相對於參考dCasX蛋白改良至少約1.1至約10,000倍、改良至少約1.1至約1,000倍、改良至少約1.1至約500倍、改良至少約1.1至約400倍、改良至少約1.1至約300倍、改良至少約1.1至約200倍、改良至少約1.1至約100倍、改良至少約1.1至約50倍、改良至少約1.1至約40倍、改良至少約1.1至約30倍、改良至少約1.1至約20倍、改良至少約1.1至約10倍、改良至少約1.1至約9倍、改良至少約1.1至約8倍、改良至少約1.1至約7倍、改良至少約1.1至約6倍、改良至少約1.1至約5倍、改良至少約1.1至約4倍、改良至少約1.1至約3倍、改良至少約1.1至約2倍、改良至少約1.1至約1.5倍、改良至少約1.5至約3倍、改良至少約1.5至約4倍、改良至少約1.5至約5倍、改良至少約1.5至約10倍、改良至少約5至約10倍、改良至少約10至約20倍、改良至少10至約30倍、改良至少10至約50倍或改良至少10至約100倍。在一些實施例中，dCasX變異體之經改良特徵相對於參考dCasX蛋白改良至少約10至約1000倍。關於經改良特徵之額外揭示內容描述於下文中。

在其他實施例中，修飾為參考dCasX之一或多個域經來自不同CasX之一或多個域取代。在一些實施例中，插入包括插入來自不同CasX蛋白之域的部分或全部。突變可置於在dCasX變異體之任何一或多個域中，且可包括例如一或多個域之部分或全部的缺失，或任何域中之一或多個胺基酸取代、缺失或插入。dCasX蛋白之域包括非目標股結合(NTSB)域、目標股負載(TSL)域、螺旋狀I域、螺旋狀II域、寡核苷酸結合域(OBD)及RuvC DNA裂解域，其可進一步包含下文所描述之子域。

在一些實施例中，dCasX變異體蛋白包含800至1100個胺基酸或900至1000個胺基酸。

與可比分析系統中的包含參考dCasX蛋白之融合蛋白及gRNA的RNP相比，本揭示的包含dCasX變異體及所連接抑制子域的長期抑制子融合蛋白在利用且結合至PAM TC模體(包括選自TTC、ATC、GTC或CTC之PAM序列)的情況下與gRNA複合為RNP時有效結合目標核酸之能力增強。在前述內容中，PAM序列位於距與gRNA之靶向序列具有一致性之原間隔子之非目標股5'至少1個核苷酸處。

在一些實施例中，本揭示的包含含有dCasX變異體及所連接抑制子域之長期抑制子融合蛋白及gRNA的RNP在20 pM或更小濃度下能夠以至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之效率結合雙股DNA目標。在一個實施例中，與可比分析系統中的包含含有參考dCasX蛋白及所連接抑制子域之可比長期抑制子融合蛋白及gRNA的RNP相比，包含dCasX變異體及所連接抑制子域之長期抑制子融合蛋白及gRNA變異體的RNP展現出對目標核酸中目標序列之更大結合，其中目標核酸之PAM序列為TTC。在另一實施例中，與可比分析系統中的包含含有參考dCasX蛋白及所連接抑制子域之可比長期抑制子融合蛋白及gRNA的RNP相比，包含dCasX變異體及所連接抑制子域之長期抑制子融合蛋白及gRNA變異體的RNP展現出對目標核酸中目標序列之更大結合親和力，其中目標核酸之PAM序列為ATC。在另一實施例中，與可比分析系統中的包含含有參考dCasX蛋白及所連接抑制子域之可比長期抑制子融合蛋白及gRNA的RNP相比，包含dCasX變異體及所連接抑制子域之長期抑制子融合蛋白及gRNA變異體的RNP展現出對目標核酸中目標序列之更大結合親和力，其中目標核酸之PAM序列為CTC。在另一實施例中，與可比分析系統中的包含含有參考dCasX蛋白及所連接抑制子域之可比長期抑制子融合蛋白及gRNA的RNP相比，包含dCasX變異體及所連接抑制子域之長期抑制子融合蛋白及gRNA變異體的RNP展現出對目標核酸中目標序列之更大結合親和力，其中目標核酸之PAM序列為GTC。在其他實施例中，與可比分析系統中的包含含有參考dCasX蛋白及所連接抑制子域之可比抑制子融合蛋白及gRNA的RNP相比，包含dCasX變異體及所連接抑制子域之抑制子融合蛋白及gRNA的RNP展現出對目標核酸中目標序列之更大結合親和力，其中目標核酸之PAM序列為GTC、TTC、ATC或CTC。在前述實施例中，與參考dCasX蛋白(自SEQ ID NO: 1-3修飾)中之任一者與所連接抑制子域及表8之SEQ ID NO: 1731-1743的gRNA的RNP對一或多個PAM序列之結合親和力相比，對該等PAM序列之增加的結合親和力大至少1.5倍或更多。 c.具有來自多個來源蛋白質之域的dCasX變異體蛋白

在某些實施例中，本揭示提供一種用於長期抑制子融合蛋白之嵌合dCasX變異體蛋白。

如本文所用，「嵌合dCasX」蛋白係指含有至少兩個來自不同來源之域的催化失效CasX蛋白以及含有至少一個本身為嵌合形式之域的催化失效CasX蛋白。因此，在一些實施例中，嵌合dCasX蛋白係包括至少兩個分離自或來源於不同來源之域，諸如來自兩種不同的天然存在之CasX蛋白(例如來自兩種不同的CasX參考蛋白)之域的嵌合dCasX蛋白。在其他實施例中，嵌合dCasX蛋白係含有至少一個呈嵌合域形式之域的蛋白質，例如在一些實施例中，一部分域包含來自不同CasX蛋白(來自參考CasX蛋白或另一dCasX蛋白)之取代。

在一些實施例中，至少一個嵌合域可為本文所描述之NTSB、TSL、螺旋狀I、螺旋狀II、OBD或RuvC域中之任一者。在諸如螺旋形I、RuvC及OBD之分裂或非連續域之情況下，非連續域之一部分可經來自任何其他來源之對應部分置換。在一些實施例中，來源於SEQ ID NO: 2之dCasX之螺旋狀I-II域(有時稱為螺旋I-a)經來自SEQ ID NO: 1之對應螺旋狀I-II序列置換，得到嵌合dCasX蛋白。

在一些實施例中，來源於SEQ ID NO: 2之dCasX的螺旋狀I-II域及NTSB域經來自SEQ ID NO: 1之對應螺旋I-II及NTSB序列置換，得到嵌合dCasX蛋白。

嵌合dCasX變異體蛋白可包含來自SEQ ID NO: 2之CasX蛋白的NTSB、TSL、螺旋狀I-I、螺旋狀I-II、螺旋狀II、OBD-I及OBD-II域，及來自SEQ ID NO: 1之CasX蛋白的RuvC-I及/或RuvC-II域，或反之亦然，其中引入突變或其他序列改變以產生相對於參考dCasX蛋白具有變異體之改良特性的催化失效變異體。作為前述內容之實例，嵌合RuvC域包含SEQ ID NO: 1之胺基酸660至823及SEQ ID NO: 2之胺基酸921至978。作為前述內容之替代實例，嵌合RuvC域包含SEQ ID NO: 2之胺基酸647至810及SEQ ID NO: 1之胺基酸934至986。在一特定實施例中，用於長期抑制子融合蛋白之dCasX包含來自SEQ ID NO:1之NTSB域及螺旋狀I-II域以及來自SEQ ID NO:2之螺旋狀I-I域；後者為嵌合域，應理解，dCasX變異體在選定位置具有額外胺基酸變化(相對於參考序列)，且所得嵌合dCasX蛋白相對於參考dCasX蛋白質具有經改良特徵。表2中具有來自SEQ ID NO:1之NTSB域及螺旋狀I-II域以及來自SEQ ID NO:2之螺旋狀I-I域的序列包括dCasX 491 (SEQ ID NO: 4)、515 (SEQ ID NO: 6)、516 (SEQ ID NO: 7)、518-520 (SEQ ID NO: 9-11)、522-527 (SEQ ID NO: 12-17)、532 (SEQ ID NO: 22)、593 (SEQ ID NO: 25)、676 (SEQ ID NO: 28，在NTSB域中具有L169K取代)及812 (SEQ ID NO: 29)。SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 2之參考CasX蛋白中之CasX域之座標提供於下表1中。熟習此項技術者應理解，下表1中指示之域邊界為近似的，且其邊界與下表中給出之邊界相差1、2或3個胺基酸的蛋白質片段可具有與下文所描述之域相同的活性。 表 1 ： 參考 CasX 蛋白中之域座標

域名稱	SEQ ID NO: 1 中之座標*	SEQ ID NO: 2 中之座標*
OBD-I	1-55	1-57
螺旋狀I-I	56-99	58-101
NTSB	100-190	102-191
螺旋狀I-II	191-331	192-332
螺旋狀II	332-508	333-500
OBD-II	509-659	501-646
RuvC-I	660-823	647-810
TSL	824-933	811-920
RuvC-II	934-986	921-978

*胺基酸位置

在一些實施例中，用於本揭示之長期抑制子融合蛋白中之dCasX變異體蛋白包含選自由表2中所闡述之SEQ ID NO: 4至29組成之群的序列，其中該序列包含RuvC域，其包含一或多個使RuvC域之裂解活性不活化之突變。在其他實施例中，用於本揭示之長期抑制子融合蛋白中之dCasX變異體蛋白包含與表2中所闡述之SEQ ID NO: 4至29之序列至少約70%一致、至少約75%一致、至少約80%一致、至少約81%一致、至少約82%一致、至少約83%一致、至少約84%一致、至少約85%一致、至少約86%一致、至少約86%一致、至少約87%一致、至少約88%一致、至少約89%一致、至少約89%一致、至少約90%一致、至少約91%一致、至少約92%一致、至少約93%一致、至少約94%一致、至少約95%一致、至少約96%一致、至少約97%一致、至少約98%一致、至少約99%一致或至少約99.5%一致的序列。在一些實施例中，dCasX變異體蛋白包含RuvC域，其包含一或多個使該RuvC域之裂解活性不活化之突變。在一些實施例中，包含dCasX之長期抑制子融合蛋白保留與gRNA形成RNP之能力。在一特定實施例中，用於本揭示之基因抑制子系統之長期抑制子融合蛋白中的dCasX變異體蛋白包含SEQ ID NO: 4之序列(dCasX 491)。在另一特定實施例中，用於本揭示之基因抑制子系統之長期抑制子融合蛋白中的dCasX變異體蛋白包含SEQ ID NO: 6之序列(dCasX 515)。在另一特定實施例中，用於本揭示之基因抑制子系統之長期抑制子融合蛋白中的dCasX變異體蛋白包含SEQ ID NO: 29之序列(dCasX 812)。 表 2 ： dCasX 變異序列

SEQ ID NO	dCasX	胺基酸序列
4	dCasX491	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
5	dCasX514	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTIHTSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
6	dCasX515	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
7	dCasX516	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNHNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
8	dCasX517	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGAPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
9	dCasX518	RQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
10	dCasX519	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHIQLRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
11	dCasX520	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTTQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
12	dCasX522	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKRSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
13	dCasX523	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTYPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
14	dCasX524	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTIHSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
15	dCasX525	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAATQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
16	dCasX526	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAAKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
17	dCasX527	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
18	dCasX528	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASYPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
19	dCasX529	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASNPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
20	dCasX530	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGWGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
21	dCasX531	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGYGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
22	dCasX532	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
23	dCasX533	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASYPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
24	dCasX535	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
25	dCasX593	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRWWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
26	dCasX668	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
27	dCasX672	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLIKLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
28	dCasX676	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTRGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLIKLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASSPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
29	dCasX812	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKKFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLPSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV

d.對gRNA之親和力

在一些實施例中，包含dCasX及所連接抑制子域之長期抑制子融合蛋白對gRNA之親和力相對於包含參考dCasX蛋白及對應的所連接抑制子域的可比長期抑制子融合蛋白有所改良，從而形成核糖核蛋白複合物(RNP)。長期抑制子融合蛋白對gRNA之親和力增加可例如使得產生RNP複合物之K _d較低，其在一些情況下可引起更穩定的RNP複合物形成。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白對gRNA之K _d相對於參考dCasX蛋白及所連接抑制子域增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約60倍、至少約70倍、至少約80倍、至少約90倍或至少約100倍。在一些實施例中，與包含SEQ ID NO: 2之參考CasX蛋白之催化失效變異體的對應抑制子融合蛋白相比，包含dCasX變異體之長期抑制子融合蛋白對gRNA之結合親和力增加約1.1至約10倍。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白對gRNA之親和力增加使核糖核蛋白複合物在遞送至哺乳動物細胞(包括在活體內遞送至個體)時之穩定性增加。在遞送至個體時，此增加之穩定性可影響複合物在個體細胞中之功能及效用，以及使得血液中之藥物動力學特性有所改良。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之親和力增加及由此引起的核糖核蛋白複合物之穩定性增加允許將較低劑量之長期抑制子融合蛋白遞送至個體或細胞，同時仍具有所需活性；例如活體內或活體外基因抑制及/或表觀遺傳修飾。可使用此項技術中已知的活體外分析來評定形成RNP且使其保持穩定形式之能力的提高。

在一些實施例中，當長期抑制子融合蛋白及gRNA兩者均保留在RNP複合物中時，長期抑制子融合蛋白之dCasX變異體蛋白對gRNA之更高親和力(更緊密結合)允許更大量的轉錄抑制及/或表觀遺傳修飾事件。轉錄抑制事件之增加可使用本文所描述之分析來評定。

量測長期抑制子融合蛋白對gRNA之結合親和力的方法包括使用經純化之長期抑制子融合蛋白及gRNA進行的活體外方法。若gRNA或長期抑制子融合蛋白經螢光團標誌，則可藉由螢光偏振量測長期抑制子融合蛋白之結合親和力。或者或另外，可藉由生物層干涉術、電泳遷移率變動分析(electrophoretic mobility shift assay；EMSA)或過濾結合來量測結合親和力。定量RNA結合蛋白(諸如本揭示之dCasX蛋白)對特定gRNA (諸如參考gRNA及其變異體)之絕對親和力的額外標準技術包括但不限於等溫量熱法(isothermal calorimetry；ITC)及表面電漿子共振(surface plasmon resonance；SPR)。 e.對目標核酸序列之改良特異性

在一些實施例中，包含dCasX變異體蛋白及所連接抑制子域的長期抑制子融合蛋白對與gRNA之靶向序列互補之目標核酸序列之特異性相對於連接有抑制子域之參考dCasX蛋白有所改良。如本文所用，「特異性」，有時稱為「目標特異性」，係指CRISPR/Cas系統核糖核蛋白複合物結合與目標核酸序列類似但不一致的脫靶序列的程度；例如具有較高特異性程度之含有RNP之長期抑制子融合蛋白將展現相對於連接有抑制子域之參考dCasX之RNP減少的序列脫靶甲基化。長期抑制子融合蛋白之特異性及潛在有害脫靶效應之減少可有助於達成用於哺乳動物個體之可接受治療指數。不希望受理論所束縛，螺旋狀I及II域中之胺基酸變化可增加長期抑制子融合蛋白對目標核酸股之特異性，且可由此增加長期抑制子融合蛋白對目標核酸總體之特異性。在一些實施例中，增加長期抑制子融合蛋白對目標核酸之特異性之胺基酸改變亦可使得長期抑制子融合蛋白對DNA之親和力降低，但組合物之總體益處及安全性提高。 f.具有異源蛋白之抑制子融合蛋白

在本揭示之範疇內亦考慮長期抑制子融合蛋白，其包含與用於本揭示之系統之長期抑制子融合蛋白融合的異源蛋白。此包括長期抑制子融合蛋白，其包含與異源蛋白質或其域之N端或C端融合。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白與一或多種具有不同所關注活性之蛋白質或其域融合。

在一些情況下，供與長期抑制子融合蛋白一起使用之異源多肽(融合搭配物)提供次細胞定位，亦即異源多肽含有次細胞定位序列(例如用於靶向至細胞核之核定位信號(NLS)；保持融合蛋白在細胞核之外的序列，例如核輸出序列(NES)；保持融合蛋白保留於細胞質中之序列；用於靶向至粒線體之粒線體定位信號；用於靶向至葉綠體之葉綠體定位信號；ER保留信號；及其類似物)。

在一些情況下，長期抑制子融合蛋白包括核定位信號(NLS) (與NLS融合)。在一些情況下，長期抑制子融合蛋白與2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個、或5個或更多個、6個或更多個、7個或更多個、8個或更多個NLS融合。在一些情況下，一或多個NLS (2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個NLS)定位於長期抑制子融合蛋白之N端及/或C端處或附近(例如相距20個胺基酸之範圍內)。在一些情況下，一或多個NLS (2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或者5個或更多個NLS)定位於長期抑制子融合蛋白之N端處或附近(例如相距20個胺基酸之範圍內)。在一些情況下，一或多個NLS (2個或更多個、3個或更多個、4個或更多個或者5個或更多個NLS)定位於長期抑制子融合蛋白之C端處或附近(例如相距20個胺基酸之範圍內)。在一些情況下，一或多個NLS (3個或更多個、4個或更多個或5個或更多個NLS)定位於長期抑制子融合蛋白之N端及/或C端處或附近(例如相距20個胺基酸之範圍內)。在一些情況下，單個NLS定位於長期抑制子融合蛋白之N端且單個NLS定位於C端。一般熟習技術者應瞭解，位於蛋白質N端或C端或其附近之NLS可在相距N端或C端之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸之範圍內。在一些實施例中，連接至dCasX或長期抑制子融合蛋白之N端之NLS與連接至C端之NLS相同。在其他實施例中，連接至dCasX或長期抑制子融合蛋白之N端的NLS與連接至C端的NLS不同。具有NLS之長期抑制子融合蛋白之代表性組態示於圖61中。在一些實施例中，適合在本揭示之系統中與長期抑制子融合蛋白一起使用的NLS包含與來源於以下之序列具有至少約85%、至少約90%或至少約95%一致性或與其一致的序列：SV40病毒大型T抗原之NLS，具有胺基酸序列PKKKRKV (SEQ ID NO: 30)；來自核質蛋白之NLS (例如核質蛋白二分NLS，具有序列KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 31))；具有胺基酸序列PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 32)或RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 33)之c-MYC NLS。在一些實施例中，連接至長期抑制子融合蛋白之N端的NLS及短肽連接子係序列PKKKRKVSR (SEQ ID NO: 34)。在一些實施例中，連接至長期抑制子融合蛋白之N端的NLS及短肽連接子係序列PKKKRKVSRVNGSGSGGG (SEQ ID NO: 3298)。在一些實施例中，連接至長期抑制子融合蛋白之C端的NLS及短肽連接子係序列TSPKKKRKV (SEQ ID NO: 3273)。在一些實施例中，連接至長期抑制子融合蛋白之N端之NLS選自由表3中所闡述之N端序列組成之群。在一些實施例中，NLS包含選自由SEQ ID NO: 30至97、3273及3298組成之群的序列。在一些實施例中，NLS包含選自由SEQ ID NO: 34至97組成之群的序列。在一些實施例中，連接至長期抑制子融合蛋白之C端之NLS選自由表4中所闡述之C端序列組成之群。在一些實施例中，適合在本揭示之系統中與長期抑制子融合蛋白一起使用的NLS包括與表3或表4之一或多個序列具有至少約80%、至少約90%或至少約95%一致性或與其一致的序列。一般熟習此項技術者應瞭解，表3及表4中所闡述之NLS序列中之任一者可融合至或接近於本文所描述之長期抑制子融合蛋白之N端或C端。 表 3 ： N 端 NLS 胺基酸序列

NLS 胺基酸序列 *	SEQ ID NO
PKKKRKVSR	34
PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVSR	35
PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVSR	36
PAAKRVKLDSR	37
PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDSR	38
PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDSR	39
PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDSR	40
KRPAATKKAGQAKKKKSR	41
KRPAATKKAGQAKKKKGGS KRPAATKKAGQAKKKKSR	42
PAAKRVKLDGGS PKKKRKVSR	43
PAAKKKKLDGGS PKKKRKVSR	44
PAAKKKKLDSR	45
PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDSR	46
PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDGGS PAAKKKKLDSR	47
PAKRARRGYKCSR	48
PAKRARRGYKCGS PAKRARRGYKCSR	49
PRRKREESR	50
PYRGRKESR	51
PLRKRPRRSR	52
PLRKRPRRGS PLRKRPRRSR	53
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVGGS	54
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVPPPPG	55
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVGIHGVPAAPG	56
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVGGGSGGGSPG	57
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVPGGGSGGGSPG	58
PAAKRVKLDGG KRTADGSEFESPKKKRKVAEAAAKEAAAKEAAAKAPG	59
PAAKRVKLDGGS PKKKRKVGGS	60
PAAKRVKLDPPP PKKKRKVPG	61
PAAKRVKLDPG	62
PAAKRVKLDGGGSGGGSGGGS	63
PAAKRVKLDPPP	64
PAAKRVKLDGGGSGGGSGGGSPPP	65
PKKKRKVPPP	66
PKKKRKVGGS	67

* 粗體殘基為NLS殘基，而非粗體殘基為連接子。 表 4 ： C 端 NLS 胺基酸序列

NLS 胺基酸序列	SEQ ID NO
GS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKV	68
GS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKVGGS PKKKRKV	69
GS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLD	70
GS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLDGGS PAAKRVKLD	71
GS KRPAATKKAGQAKKKK	72
KRPAATKKAGQAKKKKGGS KRPAATKKAGQAKKKK	73
GS KLGPRKATGRWGS	74
GS KRKGSPERGERKRHWGS	75
GS PKKKRKVGSGS KRPAATKKAGQAKKKKLE	76
GP KRTADSQHSTPPKTKRKVEFE PKKKRKV	77
GGGSGGGS KRTADSQHSTPPKTKRKVEFE PKKKRKV	78
AEAAAKEAAAKEAAAKA KRTADSQHSTPPKTKRKVEFE PKKKRKV	79
GPPKKKRKVGGS KRTADSQHSTPPKTKRKVEFE PKKKRKV	80
GPAEAAAKEAAAKEAAAKA PAAKRVKLD	81
GPGGGSGGGSGGGS PAAKRVKLD	82
GP PAAKRVKLD	83
VGS KRPAATKKAGQAKKKK	84
TGGGPGGGAAAGSGS PKKKRKVGSGS KRPAATKKAGQAKKKKLE	85
TGGGPGGGAAAGSGS PKKKRKVGSGS	86
PPP PKKKRKVPPP	87
GGS PKKKRKVPPP	88
PPP PKKKRKV	89
GGS PKKKRKV	90
GGS PKKKRKVGGSGGSGGS	91
GGS PKKKRKVGGSPKKKRKV	92
GGSGGSGGS PKKKRKVGGS PKKKRKV	93
VGGGSGGGSGGGS PAAKRVKLD	94
VPPP PAAKRVKLD	95
VPPPGGGSGGGSGGGS PAAKRVKLD	96
VGS PAAKRVKLD	97

在一些實施例中，一或多個NLS係藉由視情況存在之連接子肽連接至長期抑制子融合蛋白或相鄰NLS。在一些實施例中，連接子肽係選自由以下組成之群：SR、GS、GP、TS、VGS、GGS、(G)n (SEQ ID NO: 98)、(GS)n (SEQ ID NO: 99)、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 100)、(GGSGGS)n (SEQ ID NO: 101)、(GGGS)n (SEQ ID NO: 102)、GGSG (SEQ ID NO: 103)、GGSGG (SEQ ID NO: 104)、GSGSG (SEQ ID NO: 105)、GSGGG (SEQ ID NO: 106)、GGGSG (SEQ ID NO: 107)、GSSSG (SEQ ID NO: 108)、GPGP (SEQ ID NO: 109)、GGP、PPP、VPPP、PPAPPA (SEQ ID NO: 110)、PPPG (SEQ ID NO: 111)、PPPGPPP (SEQ ID NO: 112)、PPP(GGGS)n (SEQ ID NO: 113)、(GGGS)nPPP (SEQ ID NO: 114)、AEAAAKEAAAKEAAAKA (SEQ ID NO: 115)、VPPPGGGSGGGSGGGS (SEQ ID NO: 116)、TGGGPGGGAAAGSGS (SEQ ID NO: 117)、GGGSGGGSGGGSPPP (SEQ ID NO: 118)、TPPKTKRKVEFE (SEQ ID NO: 119)、GGSGGGS (SEQ ID NO: 120)、GSGSGGG (SEQ ID NO: 121)、SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH (SEQ ID NO: 122)、GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGP GTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE (SEQ ID NO: 123)及GGSGGG (SEQ ID NO: 124)，其中n為1至5。

一般而言，NLS (或多個NLS)具有足夠強度以驅動長期抑制子融合蛋白在真核細胞之細胞核中積聚。可藉由任何適合之技術進行細胞核中之積聚的偵測。舉例而言，可偵測標記物可與長期抑制子融合蛋白融合，由此可觀測其在細胞內之位置。亦可自細胞分離細胞核，可隨後藉由任何適合用於偵測蛋白質之方法，諸如免疫組織化學、西方墨點法或酶活性分析來分析其內容物。亦可間接地確定細胞核中之積聚。 IV. 長期抑制子域融合蛋白

本揭示提供包含DNA結合蛋白連接至多個抑制子域之長期融合蛋白之系統，其中該系統能夠結合至PCSK9目標核酸且抑制PCSK9基因之轉錄，包括藉由目標核酸之表觀遺傳修飾進行抑制。用於融合蛋白之例示性DNA結合蛋白包括鋅指(ZF)、TALE(轉錄活化因子樣效應物)蛋白質及催化失效CRISPR蛋白。

在一些實施例中，本揭示提供長期抑制子融合蛋白之系統，該等長期抑制子融合蛋白當與包含與 PCSK9之目標核酸序列互補之靶向序列的引導核糖核酸(gRNA)複合時包含催化失效CRISPR蛋白(諸如dCasX)連接至多個抑制子域，其中該系統能夠結合至 PCSK9之目標核酸且抑制或緘默化 PCSK9基因之轉錄。減少轉錄之基因抑制過程之實例包括但不限於抑制轉錄起始複合物之形成的過程、降低轉錄起始速率的過程、降低轉錄延伸速率的過程、降低轉錄持續力的過程及拮抗轉錄活化(例如藉由阻斷轉錄活化因子之結合)的過程。基因抑制可構成例如活化防止以及低於現有量之表現抑制。轉錄抑制包括基因轉錄之可逆及不可逆失效兩者；後者可由目標核酸之表觀遺傳修飾引起。

在能夠抑制或緘默化基因的抑制子域當中，Krüppel相關盒(KRAB)抑制子域在人類基因體系統中最為有效(Alerasool, N., 等人. An efficient KRAB domain for CRISPRi applications. Nat. Methods 17:1093 (2020))。KRAB樣域存在於大致400個基於人類鋅指蛋白之轉錄因子中，其在所連接dCasX與目標核酸結合時能夠募集額外的抑制子域，諸如但不限於Trim28 (亦稱為Kap1或Tif1-β)，該等抑制子域又與諸如CBX5/HP1α及SETDB1之染色質調控因子組裝蛋白質複合物從而誘導基因轉錄抑制，但該抑制亦有時間限制的。適用於本揭示之系統的KRAB域之代表性非限制性實例包括ZIM3 (SEQ ID NO: 129)及ZNF10 (SEQ ID NO: 128)。本揭示提供來自人類來源之額外抑制子域，以及來自非人類來源且具有明顯不同序列的抑制子域(在本文中稱為「RD1」)，已發現該等抑制子域當併入本文所描述的長期抑制子融合蛋白構築體實施例中時會引起相較於ZIM3及ZNF10增強之轉錄抑制。

在一些實施例中，本揭示提供如此系統，在該等系統中，藉由使用LTRP:gRNA系統賦予之修飾係表觀遺傳修飾，且因此， PCSK9基因緘默化可藉由除所編輯DNA複製外的機制遺傳。如本文所用，「表觀遺傳修飾」意謂對DNA或與DNA相關之組蛋白之修飾，而非DNA序列本身之變化(例如取代、缺失或重排)，其中修飾為藉由系統之組分直接修飾或藉由募集一或多種額外細胞組分間接修飾，但其中DNA目標核酸序列本身未經編輯以改變序列。舉例而言，DNA甲基轉移酶3A (DNMT3A) (或其催化域)直接藉由DNA甲基化而修飾DNA，而KRAB募集充當強效轉錄抑制子之KAP-1/TIF1β輔抑制子複合物且可進一步募集與DNA甲基化及抑制染色質形成相關的因子，諸如異染色質蛋白1 (HP1)、組蛋白去乙醯酶及組蛋白甲基轉移酶(Ying, Y.等人, The Krüppel-associated box repressor domain induces reversible and irreversible regulation of endogenous mouse genes by mediating different chromatin states. Nucleic Acids Res. 43(3): 1549 (2015))。此外，無催化活性DNMT3L輔因子連同細胞之內源性DNMT1有助於在DNA複製之後建立可遺傳甲基化模式。已知DNMT3A之ATRX-DNMT3-DNMT3L域(ADD)具有兩種關鍵功能：1)其藉由充當甲基轉移酶自動抑制域來變構調節DNMT3A之催化活性，及2)其與離胺酸(K)4處未甲基化之組蛋白H3尾部特異性相互作用，導致與K4處未甲基化之染色質H3尾部結合的DNA優先甲基化(Zhang, Y.等人，Chromatin methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3a/3L is guided by interaction of the ADD domain with the histone H3 tail. Nucleic Acids Research 38:4246 (2010))。在一些實施例中，與其他方面相同但缺乏ADD域之LTRP相比較時，包括的ADD域在併入LTRP中時增強所靶向基因之轉錄抑制。在其他實施例中，與其他方面相同但缺乏ADD域之LTRP相比較時，包括的ADD域增強所靶向基因之轉錄抑制的特異性。前述內容之支持資料提供於實例中以及以引用方式併入本文中的WO2023049742A2中。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含DNA結合蛋白連接至第一、第二及第三抑制子域，其中抑制子域中之每一者不同且融合蛋白能夠結合至 PCKS9目標核酸。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含DNA結合蛋白連接至第一、第二、第三及第四抑制子域，其中該等抑制子域中之每一者係不同的。在前述實施例中之任一者中，融合蛋白能夠在DNA結合域包含催化失效CRISPR蛋白時與該系統的結合至目標核酸之gRNA形成RNP。

在一些實施例中，DNA結合蛋白包含可結合但不裂解目標核酸之TALE。在一些實施例中，DNA結合蛋白包含經修飾以結合但不裂解目標核酸之鋅指蛋白。在一些實施例中，DNA結合蛋白包含催化失效CRISPR蛋白，其可與gRNA複合以形成可結合但不裂解目標核酸之RNP。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含催化失效CRISPR蛋白序列、第一抑制子域(下文中稱為「RD1」)、作為第二域的來自DNMT3A蛋白之DNMT3A催化域(下文中稱為「DNMT3A」)及作為第三域的來自DNMT3L蛋白之DNMT3L相互作用域(下文中稱為「DNMT3L」)。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含催化失效CRISPR蛋白序列、RD1、作為第二域之DNMT3A、作為第三域之DNMT3L，及作為第四域的來自DNMT3A蛋白之ATRX-DNMT3-DNMT3L域(下文中稱為「ADD」)。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含dCasX且進一步包含第一及第二NLS以及一或多個本文所描述之連接子肽。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白能夠與結合至目標核酸之gRNA形成RNP。已發現，當在長期抑制子融合蛋白中相對於dCasX以選定方向組態前述域時，當與具有與 PCSK9基因之限定區域互補的靶向序列的gRNA複合時，前述域的使用可導致 PCSK9目標核酸的明顯表觀遺傳修飾，且抑制子域的組合會同步發揮作用，從而視組態而定，對目標基因之轉錄緘默化產生累加或協同作用。

本文提供長期抑制子融合蛋白構築體中使用之組分的代表性胺基酸序列。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4至29組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4至29組成之群的序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之dCasX包含SEQ ID NO: 4之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性的序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之dCasX包含SEQ ID NO: 4之序列。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之RD1包含選自由SEQ ID NO: 128至1726組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之RD1包含選自由SEQ ID NO: 128至1726組成之群的序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之RD1包含選自由SEQ ID NO: 128或SEQ ID NO: 129組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之RD1包含選自由SEQ ID NO: 128或SEQ ID NO: 129組成之群的序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含選自由SEQ ID NO: 130至1726組成之群的序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含選自由SEQ ID NO: 130至1726組成之群的序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含選自由SEQ ID NO: 130至224組成之群的序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含選自由SEQ ID NO: 130至224組成之群的序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含選自由SEQ ID NO: 130至138組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性的序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含選自由SEQ ID NO: 130至138組成之群的序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 135之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 131之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 135之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 130之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 130之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 131之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 132之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 133之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 134之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 135之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 136之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 137之序列。在另一實施例中，長期抑制子融合蛋白之第一抑制子域(RD1)包含SEQ ID NO: 138之序列。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之第二抑制子域為DNMT3A，其包含SEQ ID NO:126之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之第二抑制子域包含SEQ ID NO: 126之序列。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之第三抑制子域為DNMT3L，其包含SEQ ID NO: 127之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之視情況存在之第四抑制子域為ADD，其包含SEQ ID NO: 125之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白之視情況存在之第四抑制子域包含SEQ ID NO: 125之序列。在一些實施例中，ADD之C端連接至DNMT3A之N端。已發現與缺乏ADD之長期抑制子融合蛋白相比，將ADD添加至包含RD1、DNMT3A及DNMT3L之長期抑制子融合蛋白中可極大地增強或增加目標核酸之長期抑制及/或表觀遺傳修飾，以及抑制之特異性。有關包含ADD之長期抑制子融合蛋白的經改良之抑制及特異性的例示性資料呈現於實例中且描述於以引用方式併入本文中的WO2023049742A2中。在一些實施例中，融合蛋白包含一或多個選自由SEQ ID NO: 98至124、3278至3289組成之群的連接子肽(例示性序列示於表5及58中)及一或多個包含選自由SEQ ID NO: 30至97、32998及3299組成之群的序列的NLS。包含ADD之長期抑制子融合蛋白之例示性組態呈現於圖61中。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含DNMT3A、DNMT3L、DNA結合蛋白及RD1。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含ADD、DNMT3A、DNMT3L、DNA結合蛋白及RD1。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端、C端或兩者處包含NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在DNMT3A與DNMT3L之間、DNMT3L與DNA結合蛋白之間及/或DNA結合蛋白與RD1之間包含一或多個連接子。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含DNA結合蛋白、RD1、DNMT3A及DNMT3L。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含DNA結合蛋白、RD1及ADD、DNMT3A及DNMT3L。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端包含NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在RD1與DNMT3A之間包含NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端、C端或兩者處包含NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端NLS與DNA結合蛋白之間、DNA結合蛋白與RD1之間、RD1與DNMT3A或視情況存在之ADD之間及/或DNMT3A與DNMT3A之間包含一或多個連接子。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含DNA結合蛋白、DNMT3A、DNMT3L及RD1。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含DNA結合蛋白、ADD、DNMT3A、DNMT3L及RD1。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端、C端或兩者處包含NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端NLS與DNA結合蛋白之間、DNA結合蛋白與DNMT3A或視情況存在之ADD之間、DNT3A與DNMT3L之間及/或DNMT3L與RD1之間包含一或多個連接子。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含RD1、DNMT3A、DNMT3L及DNA結合蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含RD1、ADD、DNMT3A、DNMT3L及DNA結合蛋白。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端、C端或兩者處包含NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在RD1與DNMT3A或視情況存在之ADD之間、DNMT3A與DNMT3L之間、DNMT3L與DNA結合蛋白之間及/或DNA結合蛋白與C端NLS之間包含一或多個連接子。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含DNMT3A、DNMT3L、RD1及DNA結合蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含ADD、DNMT3A、DNMT3L、RD1及DNA結合蛋白。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端、C端或兩者處包含NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在DNMT3A與DNMT3L之間、DNTM3L與RD1之間、RD1與DNA結合蛋白之間及/或DNA結合蛋白與C端NLS之間包含一或多個連接子。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含DNMT3A、DNMT3L、RD1、DNA結合蛋白及第二RD1。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白自N端至C端包含ADD、DNMT3A、DNMT3L、RD1、DNA結合蛋白及第二RD1。在前述內容之一個實施例中，第二RD1的序列可與第一RD1一致。在前述內容之另一實施例中，第二RD1的序列可與第一RD1不同。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在N端、C端或兩者處包含NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白在DNMT3A與DNMT3L之間、DNMT3L與RD1之間、RD1與DNA結合蛋白之間、DNA結合蛋白與第二RD1之間及/或第二RD1與C端NLS之間包含一或多個連接子。

在一些情況下，長期抑制子融合蛋白亦包含一或多個NLS。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含以下N端至C端組態：NLS-ADD-DNMT3A-DNMT3L-DNA結合蛋白-RD1-NLS、NLS-DNA結合蛋白-RD1-NLS-ADD-DNMT3A-DNMT3L、NLS- DNA結合蛋白-ADD-DNMT3A-DNMT3L-RD1-NLS)、NLS-RD1-ADD-DNMT3A-DNMT3L-DNA結合蛋白-NLS、NLS-ADD-DNMT3A-DNMT3L-RD1-DNA結合蛋白-NLS或NLS-ADD-DNMT3A-DNMT3L-RD1-DNA結合蛋白-RD1-NLS。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白能夠結合至 PCSK9基因且抑制或緘默化 PCSK9基因之轉錄。

在長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，一或多個連接子肽可插入長期抑制子融合蛋白之任何兩個相鄰域之間。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含以下N端至C端組態：NLS-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子1-連接子3A-DNA結合蛋白-連接子3B-RD1-NLS (組態1)。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含以下N端至C端組態：NLS-連接子3A-DNA結合蛋白-連接子3B-RD1-NLS-連接子1-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L (組態2) 在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含以下N端至C端組態：NLS-連接子3A-DNA結合蛋白-連接子1-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子3B-RD1-NLS (組態3)。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含以下N端至C端組態：NLS-RD1-連接子3A-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子1-DNA結合蛋白-連接子3B-NLS (組態4)。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含以下N端至C端組態：NLS-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子3A-RD1-連接子1-DNA結合蛋白-連接子3B-NLS (組態5)。在一些實施例中，呈前述組態之DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。該等組態之示意圖描繪於圖61中。在具有組態1至5之LTRP的一些實施例中，NLS可包含選自由SEQ ID NO: 30至97、3298及3299 (表3及4)組成之群的序列，連接子序列可包含獨立地選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 98至124、3278至3289 (表5及58中所示之代表性連接子)。在一些實施例中，NLS可包含SEQ ID NO: 30之序列，且連接子序列可包含獨立地選自由SEQ ID NO: 120及122至124組成之群的序列。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為選自由SEQ ID NO: 4至29組成之群的dCasX序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，第二抑制子域為DNMT3A域，其包含SEQ ID NO: 126之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，第三抑制子為DNMT3L域，其包含SEQ ID NO: 127之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，第四抑制子為ADD域，其包含SEQ ID NO: 125之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白能夠結合至 PCSK9基因目標核酸且抑制或緘默化 PCSK9基因目標核酸。

在一些實施例中，本揭示提供一種包含長期抑制子融合蛋白之系統，該長期抑制子融合蛋白包含兩個RD1域、第二抑制子域、第三抑制子域及第四抑制子域可操作地連接至DNA結合蛋白，例如鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，DNA結合蛋白包含催化失效CasX，其包含選自由SEQ ID NO: 4至29組成之群的序列或與其具有至少70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性的序列。在一些實施例中，兩個RD1之序列係一致的。在其他實施例中，兩個RD1包含不同序列。在一些實施例中，兩個RD1位於DNA結合蛋白之N端。在一些實施例中，兩個RD1位於DNA結合蛋白之C端。在一些實施例中，一個RD1位於DNA結合蛋白之N端且一個RD1位於DNA結合蛋白之C端。

在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含兩個RD1。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含以下N端至C端組態：NLS-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子3A-a RD1a-連接子1-DNA結合蛋白-連接子3B-RD1a-連接子4-NLS (組態6a)，其中RD1a序列一致(參見圖61中長期抑制子融合蛋白之示意圖)。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含以下N端至C端組態：NLS-ADD-DNMT3A-連接子2-DNMT3L-連接子3A-a RD1a-連接子1-DNA結合蛋白-連接子3B-RD1b-連接子4-NLS (組態6b)，其中RD1a序列與RD1b序列不同(參見圖61中長期抑制子融合蛋白之示意圖)。在一些實施例中，DNA結合蛋白可為鋅指、TALE或催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，該段落之長期抑制子蛋白質實施例能夠結合至 PCSK9基因之表現且抑制或靜默 PCSK9基因之表現。

在一些實施例中，本揭示提供一種具有組態6a之長期抑制子融合蛋白，其中兩個RD1序列一致。在組態6a長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，DNA結合蛋白包含具有SEQ ID NO: 4之序列或與其具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列的dCasX，RD1a之第一及第二複本包含選自由SEQ ID NO: 130至1726組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列，第二抑制子域為包含SEQ ID NO: 126之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列的DNMT3A， 第三抑制子為包含SEQ ID NO: 127之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列變異體的DNMT3L， 第四抑制子為包含SEQ ID NO: 125之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列的ADD，該等NLS包含獨立地選自由SEQ ID NO: 30至97 (表3及表4)組成之群的序列， L1連接子包含SEQ ID NO: 123之序列，L2連接子包含SEQ ID NO: 122之序列，L3A連接子包含SEQ ID NO: 124之序列，L3B連接子包含SEQ ID NO: 120之序列，且L4連接子包含SEQ ID NO: 3288或SEQ ID NO: 3289之序列。在具有組態6a之長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，連接子序列係獨立地選自由SEQ ID NO: 98至124、3278至3289 (表5及58中所示之例示性序列)組成之群。在具有組態6a之長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本一致，RD1中之各者包含選自由SEQ ID NO: 130、131及135組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%一致性之序列。組態6a之示意圖示於圖61中。在一些實施例中，具有組態6a之長期抑制子融合蛋白能夠與本揭示之gRNA形成RNP且能夠結合至基因目標核酸且抑制或緘默化該基因目標核酸。

在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中兩個RD1序列係一致的，DNA結合蛋白包含具有SEQ ID NO: 4之序列或與其具有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列的dCasX，第一抑制子域(RD1a)之第一複本包含選自由SEQ ID NO: 130至1726組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性之序列，第一抑制子域(RD1b)之第二複本包含選自由SEQ ID NO: 130至1726組成之群的不同序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列， 第二抑制子域為包含SEQ ID NO: 126之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列的DNMT3A，第三抑制子為包含SEQ ID NO: 127之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列變異體的DNMT3L， 第四抑制子為包含SEQ ID NO: 125之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列的ADD，該等NLS包含獨立地選自由表3及4之SEQ ID NO: 30至97組成之群的序列， L1連接子包含SEQ ID NO: 123之序列，L2連接子包含SEQ ID NO: 122之序列，L3A連接子包含SEQ ID NO: 124之序列，L3B連接子包含SEQ ID NO: 120之序列，且L4連接子包含SEQ ID NO: 3288或SEQ ID NO: 3289之序列。在具有組態6b之長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，連接子序列係選自由SEQ ID NO: 98至124、3278至3289 (表5及58中所示之例示性序列)組成之群。在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本不同，RD1a包含SEQ ID NO: 130之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性之序列，且RD1b包含SEQ ID NO: 131之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性之序列。在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本不同，RD1a包含SEQ ID NO: 130之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性之序列， 且RD1b包含SEQ ID NO: 135之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性之序列。在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本不同，RD1a包含SEQ ID NO: 131之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列，且RD1b包含SEQ ID NO: 130之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列。在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本不同，RD1a包含SEQ ID NO: 131之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列，且RD1b包含SEQ ID NO: 135之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列。在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本不同，RD1a包含SEQ ID NO: 135之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列，且RD1b包含SEQ ID NO: 130之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列。在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本不同，RD1a包含SEQ ID NO: 135之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列，且RD1b包含SEQ ID NO: 131之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性的序列。在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本不同，RD1a及Rd1b獨立地選自由SEQ ID NO:132至134及136至138之序列組成之群。在組態6b長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，其中RD1之兩個複本不同，RD1a及Rd1b獨立地選自由SEQ ID NO: 130、131及135之序列組成之群。組態6b之示意圖示於圖61中。在一些實施例中，長期抑制子融合蛋白能夠與本揭示之gRNA形成RNP且能夠結合至基因目標核酸且抑制或緘默化該基因目標核酸。 表 5 ： 長期抑制子融合蛋白之例示性連接子胺基酸序列

連接子位置	連接子集合#	胺基酸序列	SEQ ID NO
L1	基線/原始	GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE	123
	集合85	ASPAAPAPASPAAPAPSAPAA	3278
	集合43	GSGGSGGSGGSPVPSTPPTPSPSTPPTP	3279
集合36	PPTPSPSPVPSTPPTNSSSTPPTPS	3280
集合1	ASAAAPAAASAAASAPSAAAA	3281
集合66	AASPAAPSAPPAAASP	3282
L2	基線/原始	SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH	122
L3A	基線/原始	GGSGGG	124
集合85	IRAHGD	3283
集合43	AFPAAPAPA	3284
集合36	GSGNSSGSGGS	3285
集合1	ASAAAPAAA	3286
集合66	PPTP	3287
L3B	基線/原始	GGSGGGS	120
L4v1	基線/原始	GSGS	3288
L4v2	基線/原始	GSGSGSG	3289

在包含dCasX及視情況存在之ADD且以組態1進行組態之長期抑制子融合蛋白之一些實施例中，該長期抑制子蛋白包含選自由SEQ ID NO: 22836至22855組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%一致性之序列。在包含dCasX及視情況存在之ADD且以組態1進行組態之長期抑制子融合蛋白的一些實施例中，該長期抑制子蛋白包含選自由SEQ ID NO: 22836至22855組成之群的序列。在包含dCasX及視情況存在之ADD且以組態1進行組態之長期抑制子融合蛋白的一些實施例中，該長期抑制子蛋白包含選自由SEQ ID NO: 22838及22847組成之群的序列。在包含dCasX及視情況存在之ADD且以組態1進行組態之長期抑制子融合蛋白的一些實施例中，該長期抑制子蛋白包含選自由SEQ ID NO: 22839及22848組成之群的序列。在包含dCasX及視情況存在之ADD且以組態1進行組態之長期抑制子融合蛋白的一些實施例中，該長期抑制子蛋白包含選自由SEQ ID NO: 22840及22849組成之群的序列。

在包含DNA結合蛋白且以選自由前述組態1、組態2、組態3、組態4、組態5、組態6a及組態6b組成之群的組態進行組態之系統的一些實施例中，長期抑制子融合蛋白包含dCasX且能夠與具有與細胞中之 PCSK9目標核酸互補之靶向序列的gRNA複合形成RNP，且在將RNP與細胞中之 PCSK9目標核酸結合後，目標核酸經表觀遺傳修飾且 PCSK9基因之轉錄受到抑制。在一些實施例中， PCSK9基因之轉錄被抑制至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少99%。在一些實施例中， PCSK9基因之轉錄抑制在細胞群體中至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、或至少約80%或更多的細胞中。在一些實施例中，當與未處理之細胞或用包含非靶向間隔子之可比系統處理之細胞相比較時，在活體外分析(包括基於細胞之分析)中分析轉錄抑制。在一些實施例中，在獲自個體之細胞中活體內分析轉錄抑制，在該個體中投與長期抑制子融合蛋白及具有與細胞中之基因之P CSK9目標核酸互補之靶向序列的gRNA；呈蛋白質及gRNA或呈核酸(例如gRNA及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA)形式，其中該個體係選自由小鼠、大鼠、豬、非人類靈長類動物及人類組成之群。

最佳地，PCSK9基因抑制導致基因表現之完全抑制，使得無法偵測到基因產物。然而，熟練技術人員應瞭解，不完全抑制對於多種應用仍然為有用的且所期望的。在一些實施例中，當在活體外分析(包括基於細胞之分析)中進行分析時，藉由系統之實施例抑制PCSK9基因之轉錄持續至少約8小時、至少約1天、至少約7天、至少2週、至少約3週、至少約1個月或至少約2個月。在一些實施例中，當以治療有效劑量投與包含本揭示之系統之組合物時，由系統組合物抑制 PCSK9基因之轉錄在個體之靶向細胞中持續至少約7天、至少2週、至少約3週、至少約1個月、至少約2個月、至少約3個月、至少約4個月、至少約5個月或至少約6個月。在一些實施例中，個體係選自由小鼠、大鼠、豬、非人類靈長類動物及人類組成之群。在一些實施例中，當用於該等實施例之LTRP:gRNA系統中時，使用組態1、4、5及6之LTRP導致細胞中的脫靶甲基化或脫靶活性小於約10%、小於約9%、小於約8%、小於約7%、小於約6%、小於約5%、小於約4%、小於約3%、小於約2%、小於約1%、小於0.5%或小於0.1%。

在一些實施例中，用該等實施例之LTRP:gRNA系統處理之細胞中的 PCSK9基因之轉錄抑制係可遺傳的且經過一或多次細胞分裂仍穩定。在一些實施例中，轉錄抑制經過1、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100次或者更多次細胞分裂仍穩定。 V. 編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA組合物

在另一態樣中，本揭示係關於信使RNA (mRNA)組合物，其包含各個組分之序列，以及本揭示之長期抑制子域融合蛋白構築體的mRNA序列。在一些實施例中，當用於表現長期抑制子融合蛋白時，mRNA組合物在基因(例如 PCSK9基因)之轉錄抑制及表觀遺傳修飾方面具有效用。在一些情況下，mRNA係設計用於某些遞送調配物；例如奈米粒子，諸如合成奈米粒子或脂質奈米粒子(LNP)。本揭示亦提供用以設計組合物所使用之mRNA之mRNA序列的方法。在一些情況下，編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA可在奈米粒子(諸如LNP)中與包含與 PCSK9基因之序列互補之靶向序列的gRNA共同調配。在藉由LNP遞送至目標細胞後，長期抑制子域融合蛋白係自mRNA表現且可與gRNA複合為能夠結合 PCSK9目標核酸之RNP。在其他情況下，編碼長期抑制子域融合蛋白mRNA及gRNA可調配於獨立奈米粒子中且分開或以混合物形式遞送。

在一些實施例中，本揭示之mRNA組合物已經修飾以相對於編碼相同長期抑制子蛋白質之未經修飾之mRNA產生一或多個經改良特徵，且因此可對基於mRNA之遞送的功效具有積極影響。與未經修飾之mRNA相比較，本文所描述之mRNA的例示性經改良特徵包括但不限於在遞送至細胞後改良之表現、降低之免疫原性、增加之穩定性及增強之可製造性。在一些情況下，對mRNA之修飾產生相對於未經修飾之mRNA改良至少約1.1至約100,000倍之經改良特徵。在一些實施例中，經修飾mRNA之經改良特徵係相對於未經修飾之mRNA改良至少約1.1至約10,000倍、改良至少約1.1至約1,000倍、改良至少約1.1至約500倍、改良至少約1.1至約400倍、改良至少約1.1至約300倍、改良至少約1.1至約200倍、改良至少約1.1至約100倍、改良至少約1.1至約50倍、改良至少約1.1至約40倍、改良至少約1.1至約30倍、改良至少約1.1至約20倍、改良至少約1.1至約10倍、改良至少約1.1至約9倍、改良至少約1.1至約8倍、改良至少約1.1至約7倍、改良至少約1.1至約6倍、改良至少約1.1至約5倍、改良至少約1.1至約4倍、改良至少約1.1至約3倍、改良至少約1.1至約2倍、改良至少約1.1至約1.5倍、改良至少約1.5至約3倍、改良至少約1.5至約4倍、改良至少約1.5至約5倍、改良至少約1.5至約10倍、改良至少約5至約10倍、改良至少約10至約20倍、改良至少10至約30倍、改良至少10至約50倍或改良至少10至約100倍。在一些實施例中，經修飾mRNA之經改良特徵係相對於未經修飾之mRNA改良至少約10至約1000倍。

編碼序列及非轉譯區(UTR)之最佳化在遞送編碼所關注蛋白質之mRNA時可能適用，與將轉錄成mRNA之DNA模板相反。DNA模板壽命長，可以複製，且能在其生命週期中產生許多RNA轉錄物。對於DNA模板而言，轉錄效率及前mRNA加工為蛋白質表現量之主要決定因素。相比之下，mRNA一般具有短得多的半衰期，約數小時，因為其易受細胞質降解影響，且本身無法產生更多複本。因此，mRNA穩定性及轉譯效率可為用於基於mRNA之遞送的蛋白質表現量之關鍵決定因素，且因此，可增強決定mRNA穩定性及轉譯效率的UTR及編碼序列之特定序列以改良基於mRNA之遞送的功效。 a.5'帽

在本揭示之mRNA之一些實施例中，mRNA包含連接於本文所描述之任一實施例之mRNA序列的5' UTR之5'的5'帽。在一些實施例中，5'帽為7-甲基鳥苷酸帽。在一些實施例中，5'帽包含m7G(5')ppp(5')mAG。在其他實施例中，5'帽包含m7G(5′)ppp (5′(A,G(5′)ppp(5′)A或G(5′)ppp(5′)G。例示性帽係此項技術中已知的，且描述於例如WO 2017/053297中，該案之內容以引用的方式併入本文中。 b.5'非轉譯區(UTR)

mRNA分子之5' UTR可為mRNA之穩定性及其如何有效轉譯成蛋白質的關鍵決定因素。具體而言，5' UTR結合5'帽結構充當轉譯起始前複合物以及可對轉譯產生積極或消極影響之額外調控蛋白的結合位點及募集平台。5' UTR內之結構可藉由募集起始因子或其他蛋白質或RNA因子來增強轉譯，藉由物理阻斷核糖體結合及掃描來減少轉譯，且藉由影響水解及核酸酶消化兩者來促進mRNA之穩定性。

用於本揭示之mRNA中的例示性5' UTR序列提供於表6中。表6列出RNA序列及具有N1-甲基假尿苷取代尿苷之RNA序列。 表 6 ： 5' UTR 序列

SEQ ID NO	核酸序列 *	描述
22787	AAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGA	5' UTR之RNA序列
3300	AAAmΨAAGAGAGAAAAGAAGAGmΨAAGAAGAAAmΨAmΨAAGA	5' UTR之經N1-甲基假尿苷取代之RNA序列

*『mψ』=N1-甲基-假尿苷

在一些實施例中，5' UTR包含SEQ ID NO: 22787之序列或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%一致性之序列。在一些實施例中，5' UTR包含SEQ ID NO: 22787之序列。在一些實施例中，5' UTR由SEQ ID NO: 22787之序列組成。在一些實施例中，5' UTR包含SEQ ID NO: 3300之序列或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%一致性之序列。在一些實施例中，5' UTR包含SEQ ID NO: 3300之序列。在一些實施例中，5' UTR由SEQ ID NO: 3300之序列組成。 c.3' UTR

3' UTR序列可影響mRNA穩定性及轉譯效率，且因此可決定次細胞定位及組織特異性表現。影響此等特性之因素包括微小RNA結合位點、募集一系列RNA結合蛋白的富含AU之元件、Pumilio結合元件及RNA結合蛋白之其他結合位點。雖然已知許多此等與3' UTR之相互作用負面地影響穩定性或表現，但有一些可增強轉譯。3' UTR序列之效應可因為微小RNA及RNA結合蛋白之差異表現而具有高度細胞類型特異性，此提供工程改造治療性mRNA之組織特異性表現的機會。在一些實施例中，用於本揭示之mRNA的3' UTR係小鼠3' UTR。在一些實施例中，3' UTR係表7之小鼠 HBA基因3' UTR。

本揭示之例示性3' UTR序列提供於表7中。表7列出RNA序列及具有N1-甲基假尿苷取代尿苷之RNA序列。 表 7 ： 3' UTR 序列

SEQ ID NO	核酸序列*	描述
3125	GCUGCCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAG	3' UTR之RNA序列
3310	GCmΨGCCmΨmΨCmΨGCGGGGCmΨmΨGCCmΨmΨCmΨGGCCAmΨGCCCmΨmΨCmΨmΨCmΨCmΨCCCmΨmΨGCACCmΨGmΨACCmΨCmΨmΨGGmΨCmΨmΨmΨGAAmΨAAAGCCmΨGAGmΨAGGAAG	3' UTR之經N1-甲基假尿苷取代之RNA序列

*『mψ』=N1-甲基-假尿苷

在一些實施例中，3' UTR包含SEQ ID NO: 3125之序列或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%一致性之序列。在一些實施例中，3' UTR包含SEQ ID NO: 3125之序列。在一些實施例中，3' UTR由SEQ ID NO: 3125之序列組成。在一些實施例中，3' UTR包含SEQ ID NO: 3310之序列或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約95%一致性之序列。在一些實施例中，3' UTR包含SEQ ID NO: 3310之序列。在一些實施例中，3' UTR由SEQ ID NO: 3310之序列組成。 d.聚腺苷酸序列

在mRNA序列中包括3' 聚腺苷酸尾可有助於mRNA之穩定性及轉譯效率。一般而言，較長的聚腺苷酸尾與增加之mRNA穩定性相關，由此允許其轉譯且促進高蛋白質表現。

在一些實施例中，本揭示之mRNA包含具有至少約40個、至少約50個、至少約60個、至少約70個、至少約80個、至少約90個、至少約100個、至少約110個、至少約120個、至少約130個、至少約140個、至少約150個、至少約160個、至少約170個、至少約180個、至少約185個或至少約190個腺嘌呤核苷酸的聚腺苷酸序列。在一些實施例中，本揭示之mRNA之聚腺苷酸序列包含80個腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，聚腺苷酸序列包含AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 3057)之核酸序列。在一些實施例中，聚腺苷酸序列包含AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID NO: 3307)之核酸序列。 e.對mRNA之序列修飾

在一些實施例中，本揭示之mRNA序列係藉由使用一或多個參數對編碼長期抑制子蛋白之序列進行密碼子最佳化而修飾，以增強在目標細胞中之表現。此等參數之非限制性實例包括人類宿主細胞中之密碼子使用(例如，利用密碼子適應指數(CAI))、最小化稀有密碼子、利用源自旨在用作治療劑之生物製劑的密碼子使用表、利用mRNA穩定性指數，或減少GC含量。密碼子最佳化之方法及各種生物體中之密碼子使用係此項技術中已知的。參見例如www.genscript.com/tools/codon-frequency-table。

在一些實施例中，本文提供用於長期抑制子蛋白構築體之mRNA序列，其經密碼子最佳化以在人類細胞中表現。在其他情況下，可使用各種天然存在或經修飾之核苷來產生根據本揭示之經修飾mRNA。在一些實施例中，mRNA為以下或包含以下：天然核苷(例如腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷)；核苷類似物(例如2-胺基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤、假尿苷(例如N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷)；經化學修飾之鹼基；經生物修飾之鹼基(例如甲基化鹼基)；插入鹼基；經修飾之糖(例如2′-氟核糖、核糖、2′-去氧核糖、阿拉伯糖及己醣)；及/或經修飾之磷酸酯基(例如硫代磷酸酯及5′-N-胺基亞磷酸酯鍵聯)。在一些實施例中，mRNA包含一或多個非標準核苷酸殘基。非標準核苷酸殘基可包括例如5-甲基-胞苷(「5 mC」)、假尿苷(「ψU」)及/或2-硫代-尿苷(「2sU」)。在一特定實施例中，本揭示之mRNA之一或多個或者所有尿苷殘基經1-甲基-假尿苷置換。在一些實施例中，本揭示之mRNA的所有尿苷殘基均經1-甲基-假尿苷置換。關於此種殘基及其併入mRNA中之論述，參見例如美國專利第8,278,036號或WO2011012316，其以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，mRNA序列之至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約99%或100%的尿苷核苷經N1-甲基假尿苷置換。

在一些實施例中，藉由密碼子最佳化及/或取代序列中之經修飾核苷酸對mRNA的修飾產生相對於未經修飾之mRNA改良至少約1.1至約100,000倍的經改良特徵。在一些實施例中，經修飾mRNA之經改良特徵係相對於未經修飾之mRNA改良至少約1.1至約10,000倍、改良至少約1.1至約1,000倍、改良至少約1.1至約500倍、改良至少約1.1至約400倍、改良至少約1.1至約300倍、改良至少約1.1至約200倍、改良至少約1.1至約100倍、改良至少約1.1至約50倍、改良至少約1.1至約40倍、改良至少約1.1至約30倍、改良至少約1.1至約20倍、改良至少約1.1至約10倍、改良至少約1.1至約9倍、改良至少約1.1至約8倍、改良至少約1.1至約7倍、改良至少約1.1至約6倍、改良至少約1.1至約5倍、改良至少約1.1至約4倍、改良至少約1.1至約3倍、改良至少約1.1至約2倍、改良至少約1.1至約1.5倍、改良至少約1.5至約3倍、改良至少約1.5至約4倍、改良至少約1.5至約5倍、改良至少約1.5至約10倍、改良至少約5至約10倍、改良至少約10至約20倍、改良至少10至約30倍、改良至少10至約50倍或改良至少10至約100倍。在一些實施例中，經修飾mRNA之經改良特徵係相對於未經修飾之mRNA改良至少約10至約1000倍。 f.LTRP mRNA組分序列

本揭示提供mRNA，其包含編碼本揭示之長期抑制子融合蛋白中所用組分的序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼DNA結合蛋白之序列，該等DNA結合蛋白包括TALE、ZF及催化失效CRISPR蛋白。在一些實施例中，mRNA包含編碼dCasX 515 (SEQ ID NO: 6)之SEQ ID NO: 3274之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼dCasX 812 (SEQ ID NO: 29)之SEQ ID NO: 3276之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼dCasX 491 (SEQ ID NO: 4)之SEQ ID NO: 3275之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼dCasX 676 (SEQ ID NO: 28)之SEQ ID NO: 22736之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。

在一些實施例中，編碼dCasX 491 (SEQ ID NO: 4)之mRNA的序列具有假尿苷核苷置換序列(SEQ ID NO: 22729)中之一或多個或者所有尿苷。在一些實施例中，編碼dCasX 515 (SEQ ID NO: 6)之mRNA的序列具有假尿苷核苷置換序列(SEQ ID NO: 22728)中之一或多個或者所有尿苷。在一些實施例中，編碼dCasX 676 (SEQ ID NO:28)之mRNA的序列具有假尿苷核苷置換序列中之一或多個或者所有尿苷。在一些實施例中，編碼dCasX 812 (SEQ ID NO:29)之mRNA的序列具有假尿苷核苷置換序列(SEQ ID NO: 22730或22731)中之一或多個或者所有尿苷。

在一些實施例中，本揭示提供編碼RD1域之mRNA序列。在一些實施例中，編碼RD1之mRNA之序列包含選自由SEQ ID NO: 3120、22804及3334至6527組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%或至少約95%一致性之序列。在一些實施例中，編碼RD1之mRNA之序列包含選自由SEQ ID NO: 3120、22804及3334至6527組成之群的序列。在另一個實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含選自由SEQ ID NO: 3334至3342及4931至4939組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含選自由SEQ ID NO: 3334至3342及4931至4939組成之群的序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3334或SEQ ID NO: 4931之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3334或SEQ ID NO: 4931之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3335或SEQ ID NO: 4932之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3335或SEQ ID NO: 4932之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3336或SEQ ID NO: 4933之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3336或SEQ ID NO: 4933之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3337或SEQ ID NO: 4934之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3337或SEQ ID NO: 4934之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3338或SEQ ID NO: 4935之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3338或SEQ ID NO: 4935之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3339或SEQ ID NO: 4936之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3339或SEQ ID NO: 4936之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3340或SEQ ID NO: 4937之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3340或SEQ ID NO: 4937之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3341或SEQ ID NO: 4938之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在另一實施例中，編碼RD1之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3341或SEQ ID NO: 4938之序列。

在一些實施例中，mRNA包含編碼第二抑制子域之序列。在一些實施例中，第二抑制子域包含DNMT3A。在一些實施例中，編碼DNMT3A之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3128或SEQ ID NO: 3331之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，編碼DNMT3A之mRNA序列包含SEQ ID NO: 3128或SEQ ID NO: 3331之序列。

在一些實施例中，mRNA包含編碼第三抑制子域之序列。在一些實施例中，第三抑制子域包含DNMT3L。在一些實施例中，編碼DNMT3L之mRNA序列包含序列SEQ ID NO: 3119或SEQ ID NO: 3332之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，編碼DNMT3L之mRNA之序列包含序列SEQ ID NO: 3119或SEQ ID NO: 3332。

在一些實施例中，mRNA包含編碼第四抑制子域之序列。在一些實施例中，第四抑制子域包含ADD。在一些實施例中，編碼ADD之mRNA之序列包含SEQ ID NO: 3296或SEQ ID NO: 22726之序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，編碼ADD之mRNA之序列包含SEQ ID NO: 3296或SEQ ID NO: 22726之序列。

在一些實施例中，本揭示之mRNA包含Kozak序列。在一些實施例中，Kozak序列包含GCCACCAUGG (SEQ ID NO: 22805)。在一些實施例中，本揭示之mRNA包含Kozak序列及在NLS上游之兩個鹼基(用以在NLS上游產生甲硫胺酸及丙胺酸)。在一些實施例中，mRNA在5' UTR與編碼NLS之序列之間包含序列GCCACCAUGGCC (SEQ ID NO: 22806)。

在另一實施例中，mRNA包含NLS。在一些實施例中，編碼NLS之序列包含選自由SEQ ID NO: 3291及SEQ ID NO: 22807組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%或至少約90%一致性之序列。在另一實施例中，mRNA包含選自由SEQ ID NO: 3291及SEQ ID NO: 22807組成之群的序列。在另一實施例(例如其中長期抑制子蛋白包含超過一個NLS之彼等實施例)中，mRNA包含兩個或更多個獨立地選自由SEQ ID NO: 3291及SEQ ID NO: 22807組成之群的序列。

在一些實施例中，mRNA包含編碼長期抑制子融合蛋白之連接子的序列。在一些實施例中，編碼連接子之序列包含選自由SEQ ID NO: 3312至3327及22808至22828組成之群的序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%一致性之序列。在一些實施例中，編碼連接子之序列包含選自由SEQ ID NO: 3312至3327及22808至22828組成之群的序列。在一些實施例(例如其中長期抑制子融合蛋白包含超過一個連接子之彼等實施例)中，編碼連接子之序列獨立地選自由SEQ ID NO: 3312至3327及22808至22828組成之群或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%一致性之序列。

在一些實施例中，mRNA包含編碼本文所提供之組態之長期抑制子融合蛋白的序列。在一些實施例中，mRNA編碼組態1之長期抑制子融合蛋白，且mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9741至11347、14628至16233及17841至19446組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9741至11347、14628至16233及17841至19446組成之群的序列。

在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且包含編碼RD1之序列，該RD1包含SEQ ID NO: 130之序列。在一些實施例中，mRNA包含序列SEQ ID NO: 6531、9744、14630或17843之序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6531、9744、14630或17843之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且包含編碼SEQ ID NO: 131之RD1之序列。在一些實施例中，mRNA包含序列SEQ ID NO: 6529、9742、14628或17841之序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6529、9742、14628或17841之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且mRNA包含編碼SEQ ID NO: 132之RD1之序列。在一些實施例中，mRNA包含序列SEQ ID NO: 6535、9748、14634或17847之序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6535、9748、14634或17847之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且包含編碼SEQ ID NO: 133之RD1之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6536、9749、14635或17848之序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6536、9749、14635或17848之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且mRNA包含編碼SEQ ID NO: 134之RD1之序列。在一些實施例中，mRNA包含序列SEQ ID NO: 6534、9747、14633或17846之序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6534、9747、14633或17846之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且包含編碼SEQ ID NO: 135之RD1之序列。在一些實施例中，mRNA包含序列SEQ ID NO: 6530、9743、14629或17842之序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6530、9743、14629或17842之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且包含編碼SEQ ID NO: 136之RD1之序列。在一些實施例中，mRNA包含序列SEQ ID NO: 6537、9750、14636或17849之序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6537、9750、14636或17849之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且包含編碼SEQ ID NO: 137之RD1之序列。在一些實施例中，mRNA包含序列SEQ ID NO: 6533、9746、14632或17845之序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6533、9746、14632或17845之序列。在一些實施例中，mRNA包含編碼組態1之長期抑制子融合蛋白的序列，且包含編碼SEQ ID NO: 138之RD1之序列。在一些實施例中，mRNA包含序列SEQ ID NO: 6532、9745、14631或17844之序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含SEQ ID NO: 6532、9745、14631或17844之序列。

本揭示提供一種編碼組態5之長期抑制子融合蛋白的mRNA。在一些實施例中，mRNA包含選自由SEQ ID NO: 8135至9740、11348至12953、16234至17839及19447至21052組成之群的序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含選自由SEQ ID NO: 8135至9740、11348至12953、16234至17839及19447至21052組成之群的序列。

本揭示提供一種編碼組態6a之長期抑制子融合蛋白之mRNA，其中所編碼之RD1係一致的。在一些實施例中，mRNA包含選自由SEQ ID NO:  12954至14553及21053至22652組成之群的序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含選自由SEQ ID NO: 12954至14553及21053至22652組成之群的序列。

本揭示提供一種編碼組態6b之長期抑制子融合蛋白之mRNA，其中所編碼之RD1係不同的。在一些實施例中，mRNA包含選自由SEQ ID NO: 14554至14626及22653至22725組成之群的序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，mRNA包含選自由SEQ ID NO: 14554至14626及22653至22725組成之群的序列。

在編碼本揭示之LTRP:gRNA系統之長期抑制子融合蛋白之mRNA之一些實施例中，在將系統遞送至靶向細胞後，表現mRNA且長期抑制子融合蛋白能夠與gRNA複合且結合目標DNA，引起細胞中 PCSK9基因之轉錄之抑制或緘默化。 VI. 系統之引導核酸

在另一態樣中，本發明係關於特異性設計之引導核糖核酸(gRNA)，其包含支架及與 PCSK9基因之目標核酸序列互補(且因此能夠與其雜合)的連接靶向序列。本文所描述之gRNA可與長期抑制子蛋白及包含其之系統一起使用，以抑制真核細胞中 PCSK9目標核酸之轉錄。如本文所用，術語「gRNA」涵蓋天然存在之分子及gRNA變異體，包括包含來自不同gRNA之域的嵌合gRNA變異體。本揭示之gRNA包含支架及連接至該支架之3'末端的靶向序列，該靶向序列與細胞之目標核酸互補。

在一些實施例中，包含編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA之系統在dCasX蛋白在經轉染細胞中表現後包含dCasX蛋白及一或多個gRNA，與gRNA一起形成核糖核蛋白(RNP)複合物，其可靶向且結合細胞之目標核酸序列中的特定位置。gRNA藉由包括具有與目標核酸序列之序列互補之核苷酸序列的靶向序列(或「間隔子」)對複合物提供目標特異性，而該系統之長期抑制子融合蛋白提供位點特異性活性，諸如目標基因之結合及抑制，該目標基因係藉助於目標核酸序列與gRNA之締合而被引導至該目標核酸序列內之目標位點(例如在目標位點處穩定)。

用於PCSK9目標核酸之抑制及/或表觀遺傳修飾的gRNA以及mRNA及gRNA之調配物的實施例描述於下文中。 a.參考gRNA及gRNA變異體

如本文所使用，「參考gRNA」係指包含天然存在之gRNA之野生型序列的CRISPR引導核糖核酸。在一些實施例中，可對本揭示之gRNA支架進行一或多種突變誘發方法，諸如WO2023235818A2、WO2022120095A1及WO2020247882A1 (以引用之方式併入本文中)中所描述的突變誘發方法，該等方法可包括深度突變演變(DME)、深度突變掃描(DMS)、易錯PCR、卡匣突變誘發、隨機突變誘發、交錯延伸PCR、基因改組、域交換或化學修飾，以便產生一或多個gRNA變異體，其特性相對於經修飾之gRNA支架增強或變化。衍生出gRNA變異體之gRNA支架的活性可用作比較gRNA變異體之活性的基準，藉此量測gRNA支架之功能或其他特徵之改良。

表8提供參考gRNA tracr及支架序列之序列。在一些實施例中，本揭示提供gRNA變異體，其中gRNA具有包含相對於表8之SEQ ID NO: 1731至1743中任一者之參考gRNA序列具有一或多個核苷酸修飾之序列的支架。 表 8 ： 參考 gRNA tracr 及支架序列

SEQ ID NO.	核苷酸序列
1731	ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAACCGAUAAGUAAAACGCAUCAAAG
1732	UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGCAUCAAAG
1733	ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA
1734	ACAUCUGGCGCGUUUAUUCCAUUACUUUGGAGCCAGUCCCAGCGACUAUGUCGUAUGGACGAAGCGCUUAUUUAUCGG
1735	UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGAGA
1736	UACUGGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGG
1737	GUUUACACACUCCCUCUCAUAGGGU
1738	GUUUACACACUCCCUCUCAUGAGGU
1739	UUUUACAUACCCCCUCUCAUGGGAU
1740	GUUUACACACUCCCUCUCAUGGGGG
1741	CCAGCGACUAUGUCGUAUGG
1742	GCGCUUAUUUAUCGGAGAGAAAUCCGAUAAAUAAGAAGC
1743	GGCGCUUUUAUCUCAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAUGGGUAAAGCGCUUAUUUAUCGGA

b.gRNA域及其功能

本揭示之系統的gRNA包含兩個片段：靶向序列及蛋白質結合片段。gRNA之靶向區段包括與目標核酸序列(例如雙股目標DNA、目標ssRNA、目標ssDNA之股等)內之特定序列(目標位點)互補(且因此與其雜合)的核苷酸序列(可互換地稱為間隔子、靶向子或靶向序列)，下文對其進行更全面的描述。gRNA之靶向序列能夠結合至目標核酸序列(在本揭示之上下文中包括編碼序列、編碼序列之互補序列、非編碼序列)且結合至輔助元件。gRNA之蛋白質結合區段(或「活化因子」或「蛋白質結合序列」)與dCasX蛋白相互作用(例如與其結合)成為複合物，從而形成RNP (下文對其進行更全面的描述)。如本文所用，「支架」係指除靶向序列之外的用於引導之所有部分，其包含若干區，下文對其進行更全面的描述。CasX gRNA (野生型及變異體)之特性及特徵描述於以引用的方式併入本文中的WO2020247882A1、US20220220508A1及WO2022120095A1中。

就參考gRNA而言，gRNA作為雙引導RNA (dgRNA)天然存在，其中靶向子部分及活化因子部分各具有雙螺旋形成區段，該靶向子部分及該活化因子部分彼此具有互補性且彼此雜合以形成雙股雙螺旋體(用於gRNA之dsRNA雙螺旋體)。本文所使用之術語「靶向子(targeter)」或「靶向子RNA (targeter RNA)」係指CasX雙引導RNA之crRNA樣分子(crRNA:「CRISPR RNA」) (且因此指當「活化因子」及「靶向子」連接在一起(例如藉由插入核苷酸)時，CasX單引導RNA之crRNA樣分子)。crRNA具有與tracrRNA黏接之5'區，其後是靶向序列之核苷酸。就用於本揭示之系統中之gRNA而言，支架經設計以使得活化因子部分及目標部分彼此共價連接(而非彼此雜合)且包含單分子，且可稱為「單分子gRNA (single-molecule gRNA)」、「單引導RNA (single guide RNA)」、「單分子引導RNA (single-molecule guide RNA)」、「獨分子引導RNA (one-molecule guide RNA)」或「sgRNA」。用於系統之本揭示之gRNA變異體為所有單分子型式。

總體而言，本揭示之經組裝之gRNA包含不同的結構化區或域：RNA三螺旋體、支架莖環、延伸莖環、假結及靶向序列，在本揭示之實施例中，該靶向序列與目標核酸之序列互補且位於gRNA之3'末端上。RNA三螺旋體、支架莖環、假結及延伸莖環連同橋接三聯體部分之非結構化三聯體環一起稱為gRNA之「支架」。在一些情況下，支架莖進一步包含泡。在其他情況下，支架進一步包含三螺旋體環區。在其他情況下，支架進一步包含5'非結構化區。在一些實施例中，用於LTRP:gRNA系統中的本揭示之gRNA支架包含支架莖環，其具有CCAGCGACUAUGUCGUAGUGG (SEQ ID NO: 1822)之序列或與其具有至少1個、2個、3個、4個或5個錯配之序列。

結構化域中之各者有助於建立引導物之整體RNA摺疊且保留引導物之功能；尤其是與dCasX蛋白恰當地複合之能力。舉例而言，引導支架莖與dCasX蛋白之螺旋狀I域相互作用，而三螺旋體、三螺旋體環及假結莖內之殘基與dCasX蛋白之OBD相互作用。總之，此等相互作用賦予該引導物與LTRP結合且與LTRP形成保留穩定性之RNP的能力，而間隔子(或靶向序列)導引且限定RNP結合DNA之特定序列的特異性。

LTRP之dCasX蛋白對目標核酸序列(例如，基因體DNA)的位點特異性結合可以發生在藉由gRNA之靶向序列與目標核酸序列之間的鹼基配對互補性確定之一或多個位置(例如， PCSK9目標核酸之序列)。因此，舉例而言，本揭示之gRNA具有與鄰近與TC 原間隔子相鄰模體(PAM)模體或PAM序列(諸如ATC、CTC、GTC或TTC)互補之序列的目標核酸互補且因此可與該目標核酸雜合的序列。因為引導序列之靶向序列與目標核酸序列之序列雜合，所以只要考慮PAM序列之位置，靶向序列可由使用者修飾以與特異性目標核酸序列雜合。在一些實施例中，為設計靶向序列，目標核酸包含位於靶向序列之5'的PAM序列，該PAM序列具有至少一個單核苷酸將PAM與目標核酸中的第一核苷酸(其與靶向序列之第一核苷酸互補)分開。此特徵將本文所描述之系統與Cas9系統相區別，且使得當與Cas9系統相比較時，本揭示之系統能夠修飾DNA序列中的不同位置。在一些實施例中，PAM位於目標區域之非靶向股上，亦即，與目標核酸互補之股上。在一些實施例中，gRNA之靶向序列與距ATC PAM序列一個核苷酸的 PCSK9目標核酸序列互補。在一些實施例中，gRNA之靶向序列與距CTC PAM序列一個核苷酸的 PCSK9目標核酸序列互補。在一些實施例中，gRNA之靶向序列與距GTC PAM序列一個核苷酸的 PCSK9目標核酸序列互補。在一些實施例中，gRNA之靶向序列與距TTC PAM序列一個核苷酸的 PCSK9目標核酸序列互補。藉由選擇gRNA之靶向序列，可使用本文所描述之LTRP:gRNA系統抑制目標核酸序列之限定區或將目標核酸內之特定位置歸在一起之序列。在一些實施例中，gRNA之靶向序列具有在15至22個連續核苷酸。在一些實施例中，靶向序列具有15、16、17、18、19、20、21或22個連續核苷酸。在一些實施例中，靶向序列由22個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由21個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由20個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由19個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由18個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由17個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由16個連續核苷酸組成。在一些實施例中，靶向序列由15個連續核苷酸組成。藉由選擇gRNA之靶向序列，可使用本文所描述之LTRP:gRNA系統對 PCSK9目標核酸序列之限定區進行抑制及/或表觀遺傳修飾。

本揭示之基因抑制子系統可設計成靶向尋求轉錄抑制的 PCSK9基因或 PCSK9基因區之任何區或接近該基因或基因區之任何區。當要抑制整個基因時，本發明考慮設計具有與涵蓋或接近轉錄起始位點(TSS)之序列互補的靶向序列的引導物。視啟動子序列及起始受質濃度而定，TSS選擇發生在啟動子區內的不同位置。核心啟動子充當用於轉錄機制之結合平台，其包含Pol II及其相關通用轉錄因子(general transcription factor；GTF) (Haberle, V.等人Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation (Nat Rev Mol Cell Biol. 19(10):621 (2018))。已提出TSS選擇之變化性涉及DNA『蜷縮(scrunching)』及『反蜷縮』，其標誌為：(i) RNA聚合酶前邊緣而非後邊緣相對於DNA之正向及反向移動，及(ii)轉錄泡之膨脹及收縮。在一些實施例中，LTRP:gRNA系統之RNP所結合的目標核酸序列處於 PCSK9基因中轉錄起始位點(TSS)之1.5千鹼基(kb)內。在一些實施例中，該系統之RNP所結合的目標核酸序列處於 PCSK9基因之TSS上游20鹼基對(bp)、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp、1 kb或1.5 kb內。在一些實施例中，該系統之RNP所結合的目標核酸序列處於 PCSK9基因之TSS下游20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp、1 kb或1.5 kb內。在一些實施例中，該系統之RNP所結合的目標核酸序列處於 PCSK9基因之上游1.5 kb至下游1.5、上游1 kb至下游1 kb、上游500 bp至下游500 bp、或上游300 bp至下游300 bp、或上游100 bp至下游100 bp內。在一些實施例中，該系統之RNP所結合的目標核酸序列處於 PCSK9基因之強化子的20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp、1 kb或1.5 kb內。在一些實施例中，該系統之RNP所結合的目標核酸序列處於 PCSK9基因之3'至5'非轉譯區之1 kb內。在其他實施例中，該系統之RNP所結合的目標核酸序列處於 PCSK9基因之開讀框內，包括內含子(若存在)。在一些實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之外顯子的序列互補。在一特定實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之外顯子1的序列互補。在其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之內含子之序列互補。在其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之內含子-外顯子接合點的序列互補。在其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之調控元件的序列互補。在其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之基因間區的序列互補。在其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之外顯子、內含子及/或調控元件之接合點的序列互補。在靶向序列與調控元件之序列互補之彼等情況下，此等調控元件包括但不限於啟動子區、強化子區、基因間區、5'非轉譯區(5' UTR)、3'非轉譯區(3' UTR)、保守元件及包含順式調控元件之區域。啟動子區意欲涵蓋編碼序列之起始點之5 kb內的核苷酸，或在基因強化子元件或保守元件的情況下，可與 PCSK9基因之編碼序列相距數千bp、數十萬bp或甚至數百萬bp。在前述內容中，目標為其中目標之編碼 PCSK9基因意欲被抑制以使得 PCSK9基因產物在細胞中不表現或表現量較低的彼等目標。在一些實施例中，在本揭示之系統之RNP結合於目標核酸之結合位置後，該系統能夠抑制在RNP之結合位置5'的 PCSK9基因之轉錄。在其他實施例中，在該系統之RNP結合於目標核酸之結合位置後，該系統能夠抑制在RNP之結合位置3'的 PCSK9基因之轉錄。

在一些實施例中，目標核酸包含位於靶向序列之5'的PAM序列，該PAM序列具有至少一個單核苷酸將PAM與靶向序列之第一個核苷酸分開。在一些實施例中，PAM位於目標區之非靶向股上，亦即與目標核酸互補之股上，且如下表9中所示，其代表用於連接至本揭示之gRNA支架之PCSK9目標核酸的靶向序列；例如gRNA 174 (SEQ ID NO: 1744)、235 (SEQ ID NO: 1745)、316 (SEQ ID NO: 1746)或經化學修飾之型式。在一些實施例中，PAM序列為TTC。

在一些實施例中，gRNA之靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1824至2544、2672、2675、2694及2714組成之群的序列，如表9中所闡述。在一些實施例中，gRNA之靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1824至1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714組成之群的序列。在一些實施例中，gRNA之靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1834、1849、1853、1855至1858、1860、1862、1863、1867、1869、1870、1872、1874及1875組成之群的序列。在一些實施例中，gRNA之靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1855、1867及1869組成之群的序列。在一特定實施例中，gRNA之靶向序列由SEQ ID NO: 1855之序列組成。在另一特定實施例中，gRNA之靶向序列由SEQ ID NO: 1867之序列組成。在另一特定實施例中，gRNA之靶向序列由SEQ ID NO: 1869之序列組成。在一些實施例中，前述靶向序列連接至gRNA 174 (SEQ ID NO: 1744)、235 (SEQ ID NO: 1745)或316 (SEQ ID NO: 1746)或其化學修飾型式之gRNA支架。 表 9 ： 使用長期抑制子融合蛋白對 PCSK9 具有特異性之靶向序列

靶向序列	RNA序列	SEQ ID	PAM序列
TG-06-342	AAUUACAGGCAACAGGAAGG	1824	TTC
TG-06-343	CCCCAUGUAAGAGAGGAAGU	1825	TTC
TG-06-344	CAGUUUCUGCCUCGCCGCGG	1826	TTC
TG-06-345	GCCUCGCCGCGGCACAGGUG	1827	TTC
TG-06-346	CCCACCUGUGCCGCGGCGAG	1828	TTC
TG-06-347	CUCCUUCACCCACCUGUGCC	1829	TTC
TG-06-348	AGGCAUUCACUCCUUCACCC	1830	TTC
TG-06-349	CUGUGCCUGGUGCAGUUCCC	1831	TTC
TG-06-350	GUGUCAUAAAGAAAUUGCCU	1832	TTC
TG-06-351	UUAUGACACAGAACUCAUGC	1833	TTC
TG-06-001	GAGGAGGACGGCCUGGCCGA	1834	TTC
TG-06-002	ACCGCUGCGCCAAGGUGCGG	1835	TTC
TG-06-004	GCCAGGCCGUCCUCCUCGGA	1836	TTC
TG-06-005	GUGCUCGGGUGCUUCGGCCA	1837	TTC
TG-06-117	ACUUUGUUUGCAAAGACCUC	1838	TTC
TG-06-118	GAGUGAAAUGGCCUGCUCUG	1839	TTC
TG-06-119	GAGCAGGCCAUUUCACUCGG	1840	TTC
TG-06-120	CUCGGAAUCUGCUGUGCAUC	1841	TTC
TG-06-121	GGAAGGGCUGUCGAUACUGG	1842	TTC
TG-06-123	UCCCAGUAUCGACAGCCCUU	1843	TTC
TG-06-124	CAGUAUCGACAGCCCUUCCA	1844	TTC
TG-06-125	AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU	1845	TTC
TG-06-128	AGAAAUCAACUGGACAAGCA	1846	TTC
TG-06-131	UGAACAUGGUGUGUAAAAGG	1847	TTC
TG-06-132	AGAAGAUUCAAUUUGCAAAG	1848	TTC
TG-06-133	AUGGUAGGCACAAGCUCAGC	1849	TTC
TG-06-134	GAAUUCUAUGGUAGGCACAA	1850	TTC
TG-06-135	GGAAAGCUGAGCUUGUGCCU	1851	TTC
TG-06-138	AGGGAUUUAUACUACAAAGA	1852	TTC
TG-06-139	AGGAGCAGCUAGUUGGUAAG	1853	TTC
TG-06-140	AAACUUAGCCUGGACCCCCU	1854	TTC
TG-06-141	ACUGGCCUUAACCUGGCAGC	1855	TTC
TG-06-142	UUCCACUGGCCUUAACCUGG	1856	TTC
TG-06-143	GAAUCAAUCCUACUGUGGAC	1857	TTC
TG-06-144	GUGGGCAGCGAGGAGUCCAC	1858	TTC
TG-06-145	UGGGUCCACCUUGUCUCCUG	1859	TTC
TG-06-146	GAAGUCUCACUGGUCAGCAG	1860	TTC
TG-06-147	GUGUUUCCUGGGUCCACCUU	1861	TTC
TG-06-149	AGCCCAGUUAGGAUUUGGGA	1862	TTC
TG-06-150	UCCCUCUGCGCGUAAUCUGA	1863	TTC
TG-06-151	CUCUGCGCGUAAUCUGACGC	1864	TTC
TG-06-152	GCCUCGCCCUCCCCAAACAG	1865	TTC
TG-06-153	GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG	1866	TTC
TG-06-154	AGGGUGUGGGUGCUUGACGC	1867	TTC
TG-06-155	GCAGCGACGUCGAGGCGCUC	1868	TTC
TG-06-157	GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU	1869	TTC
TG-06-158	GGAGCAGGGCGCGUGAAGGG	1870	TTC
TG-06-159	GCGCGCCCCUUCACGCGCCC	1871	TTC
TG-06-160	CGCGCCCUGCUCCUGAACUU	1872	TTC
TG-06-161	GCUCCUGCACAGUCCUCCCC	1873	TTC
TG-06-167	CACUGAAUAGCGCAGCCGCA	1874	TTC
TG-06-168	GUGGGAAGGUUCGCGGGGUU	1875	TTC
TG-06-169	CGGGGUUGGGAGACCCGGAG	1876	TTC
TG-06-170	UCGGCCUCCGGGUCUCCCAA	1877	TTC
TG-06-171	CAGUACGUUCCAGGCAUUCA	1878	TTC
TG-06-449	GCUGAAACAGAUGGAAUACU	1879	TTC
TG-06-249	AAACCAAAUCGGAACCCACU	1880	TTC
TG-06-386	UGUUGCCUGUAAUUGGAAUU	1881	TTC
TG-06-122	CCUUUGUUUCUUCCCAGUAU	1883	TTC
TG-06-127	UCCUCCUGCCUGGUACACAA	1884	TTC
TG-06-137	GAAUGUACCUAUAUGACGUC	1885	TTC
TG-06-431	CCCCGGCCUCCCAUCCCUAC	1886	TTC
TG-06-433	CUUGGCACGAUCUUGGGGAC	1887	TTC
TG-06-445	GAUUUGGUUUGGAAAACAUG	1888	TTC
TG-06-446	CUCCAGGCCCUCCACCCUCC	1889	TTC
TG-06-447	CACCCCGCCCCUGUCUCGGG	1890	TTC
TG-06-355	CCAACCUCAGAAACUUGGAG	1891	TTC
TG-06-356	GAGGUUGGAGAAGGUAGCCA	1892	TTC
TG-06-359	AUCUACUCAUUCAGUCUAUG	1893	TTC
TG-06-360	CCUCAUAGACUGAAUGAGUA	1894	TTC
TG-06-361	GUCUAUGAGGGGAAGGCAAU	1895	TTC
TG-06-362	AGCCAUUGCCUUCCCCUCAU	1896	TTC
TG-06-363	UCCCUCUAAAAAUGCCACUU	1897	TTC
TG-06-364	CUUCACCCCACAAGCAUCCU	1899	TTC
TG-06-365	UGAGUUAUUCUUUCCCUUCA	1900	TTC
TG-06-366	GGGCAGAGGGGACCAUCCUC	1901	TTC
TG-06-367	UCCUUCAGGGCAGAGGGGAC	1902	TTC
TG-06-368	CCUCCUGCCUUCCUCCUUCA	1903	TTC
TG-06-369	GGGGCCUCCCCUCCACCACA	1904	TTC
TG-06-370	GACUUACCCUGAUUGCUGGU	1905	TTC
TG-06-371	CCCACACCCUGGCCAGCAAA	1906	TTC
TG-06-372	CAAAUGGGUUCCCCCACACC	1907	TTC
TG-06-373	CCCUCUUCUCAAAUGGGUUC	1908	TTC
TG-06-374	UUUGGGCAACUUAUGGGAGG	1909	TTC
TG-06-375	UCCCUCACCAAUUACCCCUC	1910	TTC
TG-06-376	CAUCCCAUAUCCUCCACUGC	1911	TTC
TG-06-377	AUCUGUCGCAGAGCCCAGGG	1912	TTC
TG-06-378	GAGGGAGGUGGGGGAGGAAG	1913	TTC
TG-06-379	UCCCCCACCUCCCUCAGAAC	1914	TTC
TG-06-380	UGGGCCUGGGGACAUCCAUG	1915	TTC
TG-06-381	UCAUUCUCUGGGUGCACGGU	1916	TTC
TG-06-382	CUGGGUGCACGGUAACGACC	1917	TTC
TG-06-383	CUGCUGCUCCCCUUUGGGAC	1918	TTC
TG-06-384	UGCUCCAGGGGAGGCCUUUG	1919	TTC
TG-06-385	UCAUCAAAGGCCUCCCCUGG	1920	TTC
TG-06-450	UCGGCUGAAACAGAUGGAAU	1921	TTC
TG-06-451	AUCUGUUUCAGCCGAAGAAA	1922	TTC
TG-06-452	UUUCUUCGGCUGAAACAGAU	1923	TTC
TG-06-453	GCCGAAGAAAAGAACCAGCU	1924	TTC
TG-06-454	CCCCUGCCCCUUCAGCUGGU	1925	TTC
TG-06-455	CGAGGCCCAUUGGCGUCCUU	1926	TTC
TG-06-456	CUGCCUGAGUCCUAAAGGAC	1927	TTC
TG-06-457	CACAGCCUGAGGGCCAGAAG	1928	TTC
TG-06-458	GGCCCUCAGGCUGUGGGAAG	1929	TTC
TG-06-459	UCCCGGGGCGAGACCACUAG	1930	TTC
TG-06-460	CGGGGCGAGACCACUAGCUU	1931	TTC
TG-06-461	AAGUAUUACCAGCCCAGGAC	1932	TTC
TG-06-462	GUGUCCCCCAGCUUGGAGUC	1933	TTC
TG-06-463	UCUCACUAGCUGUGGUGCUU	1934	TTC
TG-06-464	CUCAUGGUCAACAGAACUUU	1937	TTC
TG-06-465	GUUGACCAUGAGUGAACUUA	1938	TTC
TG-06-466	CCUCUGCCCCAGGAGCUGUG	1939	TTC
TG-06-467	GCCACUCACAGCUGCCUGCC	1940	TTC
TG-06-468	GUCUGAGUGUGCUGGGUGGC	1941	TTC
TG-06-469	UUGUUCCCUGAGCCUUUGAC	1942	TTC
TG-06-470	CUGAGCCUUUGACUUUCUCG	1943	TTC
TG-06-471	CGAGGGAUGUUGUGGGGUUG	1944	TTC
TG-06-472	UAUCCUGGCCACAACCCCAC	1945	TTC
TG-06-473	AGUUACCACUGCUCCAAAAC	1946	TTC
TG-06-474	GGAAAUAGUGAGUACCCCAU	1947	TTC
TG-06-475	GGUGGUCAUACAGCCUCUGC	1948	TTC
TG-06-476	ACCAGAGAAGAAACAUCCUC	1949	TTC
TG-06-477	AAACUUCCACCAGAGAAGAA	1950	TTC
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c.gRNA修飾

在另一態樣中，本發明係關於gRNA (本文中有時稱為gRNA變異體)，其包含相對於衍生gRNA之參考gRNA的修飾。gRNA可用於本文所描述之長期基因抑制子融合蛋白系統中。在一些實施例中，用於本揭示之系統中的gRNA變異體相對於本揭示之gRNA序列包含一或多個核苷酸取代、插入、缺失或交換或置換域，其使特徵改良。修飾及交換區或域之例示性區域包括RNA三螺旋體、假結、支架莖環及延伸莖環。在一些實施例中，本揭示之gRNA變異體包含來自不同gRNA之至少一第一交換區，產生嵌合gRNA。此類嵌合gRNA之代表性實例係引導物316 (SEQ ID NO: 1746)，其中gRNA支架235 (SEQ ID NO:1745)之延伸莖環經gRNA支架174 (SEQ ID NO: 1744)之延伸莖環置換，其中所得316變異體仍能夠與長期抑制子融合蛋白形成RNP且當在活體外或活體內分析中在可比條件下評定時，展現與親本235相比經改良之特徵。

當將gRNA支架變異體與作為其來源之gRNA支架相比較時具有一或多種經改良功能、特徵或添加一或多種新功能，同時保持能夠與長期抑制子融合蛋白複合且將核糖核蛋白引導至RNP與 PCSK9目標核酸之複合物中的功能特性的所有gRNA均設想處於本發明之範疇內。在一些實施例中，gRNA具有選自由以下組成之群之經改良特徵：假結莖穩定性增加、三螺旋體區穩定性增加、支架莖穩定性增加、延伸莖穩定性、脫靶摺疊中間物減少、與長期抑制子融合蛋白的結合親和力增加，以及與長期抑制子融合蛋白複合時之抑制活性增加，或其任何組合。在一些情況下，在活體外分析(包括各實例之分析)中評定經改良特徵。在其他情況下，活體內評定經改良特徵。

表10提供本揭示之例示性gRNA變異體支架序列，其用作gRNA支架或用於產生用於本揭示之LTRP:gRNA系統之gRNA。在一些實施例中，用於系統之gRNA變異體支架包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746組成之群的序列或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列，其中該gRNA變異體仍能夠與本揭示之長期抑制子融合蛋白形成RNP。在一些實施例中，用於系統之gRNA變異體支架包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746組成之群的序列。在一些實施例中，用於系統之gRNA變異體支架包含SEQ ID NO: 1744。在一些實施例中，用於系統之gRNA變異體支架包含SEQ ID NO: 1745。在一些實施例中，用於系統之gRNA變異體支架包含SEQ ID NO: 1746。應理解，在其中載體包含gRNA之DNA編碼序列的彼等實施例中，胸腺嘧啶(T)鹼基可取代本文所描述之gRNA序列實施例中之任一者的尿嘧啶(U)鹼基。類似地，本文所揭示之任何RNA序列可由尿嘧啶鹼基經胸腺嘧啶取代之DNA編碼。在一些實施例中，本揭示提供下文所描述的經化學修飾之表10的gRNA變異體。在一些實施例中，gRNA包含有包含SEQ ID NO:1744至1746之序列的支架，且經化學修飾。 表 10 ： gRNA 支架序列

SEQ ID NO:	支架變異體ID	核苷酸序列
1744	174	ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAG
1745	235	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAG
1746	316	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAG

考慮用於本揭示之系統中的額外gRNA變異體係選自由SEQ ID NO: 1747至1821組成之群。在一些實施例中，gRNA包含有包含SEQ ID NO: 1747至1821之序列的支架，且經化學修飾。

引導支架可藉由包括重組方式或固相RNA合成的若干方法製造。然而，當使用固相RNA合成時，支架的長度會影響可製造性，更長的長度會導致製造成本增加、純度及產率降低以及合成失敗率較高。為了用於粒子調配物，諸如脂質奈米粒子(LNP)調配物，支架之固相RNA合成較佳，以便產生商業開發所需的數量。雖然先前實驗已將gRNA支架235 (SEQ ID NO: 1745)鑑別為相對於gRNA支架174 (SEQ ID NO: 1744)具有增強之特性，但其增加之長度(在核苷酸中)使其在LNP調配物中之用途由於合成製造限制而不太理想。因此，尋求替代序列。在一些實施例中，本揭示提供gRNA變異體支架，其與作為其來源之gRNA支架相比具有經改良之可製造性。在一些實施例中，本揭示提供gRNA，其中gRNA支架及所連接靶向序列具有小於約115個核苷酸、小於約110個核苷酸或小於約100個核苷酸之序列。在一特定實施例中，316 gRNA支架(SEQ ID NO:1746)與作為其來源之235支架相比具有更短的序列。設計316 gRNA支架，其中支架235序列藉由域交換進行修飾，其中支架174之延伸莖環置換235支架之延伸莖環，產生嵌合gRNA支架316，其具有序列ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAG (SEQ ID NO: 1746)，該序列具有89個核苷酸，與gRNA支架235之99個核苷酸形成比較。所得316支架具有的其他優勢在於，延伸莖環不含CpG模體；一種賦予引起免疫反應之可能性減少的增強之特性。在一些實施例中，316支架之較短序列長度賦予在以合成方式產生具有正確及完整序列之引導物的能力方面的較高保真度之改良，以及增強的成功併入LNP之能力。在一些實施例中，本揭示提供下文所描述的經化學修飾之gRNA 316變異體。 d.經化學修飾之gRNA

在一些實施例中，gRNA具有一或多種化學修飾。在一些實施例中，化學修飾為將2'O-甲基添加至序列之一或多個核苷酸。在一些實施例中，化學修飾係該序列之兩個或更多個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵之取代。在一些實施例中，化學修飾係在gRNA各末端上兩個或更多個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵之取代。在一些實施例中，gRNA包含位於距gRNA之5'末端、3'末端或兩個末端1、2、3或4個核苷酸處之兩個或更多個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵之取代。在一些實施例中，gRNA包含將2'O-甲基添加至gRNA之一或多個核苷酸。在一些實施例中，位於距gRNA之5'末端、3'末端或兩個末端1、2、3或4個核苷酸處之一或多個核苷酸係藉由添加2'O-甲基來修飾。在一些實施例中，支架之5'末端之前1、2或3個核苷酸(亦即在gRNA 174、235及316之情況下的A、C及U)係藉由添加2'O-甲基來修飾且經修飾之核苷酸中之各者係藉由硫代磷酸酯鍵連接至鄰接核苷酸。類似地，連接至支架之3'末端之靶向序列之3'末端的最後1、2或3個核苷酸經類似地修飾。在一些實施例中，本揭示提供具有化學修飾之gRNA，該等化學修飾係選自由表22中所闡述之SEQ ID NO: 2948至2956、2958至2966及2968至2976之序列組成之群或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在任何前述內容中，該序列之3'末端上之20個核苷酸經與 PCSK9目標核酸序列互補之靶向序列置換，視情況，該靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714組成之群，但包括gRNA之3'末端上之化學修飾。在一些實施例中，該序列之3'末端上之20個核苷酸經與 PCSK9目標核酸序列互補之靶向序列置換，該靶向序列選自由SEQ ID NO: 1834、1849、1853、1855至1858、1860、1862、1863、1867、1869、1870、1872、1874及1875組成之群，但包括gRNA之3'末端上之化學修飾。在一些實施例中，該序列之3'末端上之20個核苷酸經與 PCSK9目標核酸序列互補之靶向序列置換，該靶向序列選自由SEQ ID NO: 1855、1867及1869組成之群，但包括gRNA之3'末端上之化學修飾。在一些實施例中，具有化學修飾之gRNA包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 2948至2956、2958至2966及2968至2976之序列，其中3'末端上之20個核苷酸經靶向序列置換，該靶向序列選自由SEQ ID NO: 1824至1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714組成之群，但具有3'末端上之化學修飾。在一些實施例中，經化學修飾之gRNA包含SEQ ID NO: 2968之序列，其中3'末端上之20個核苷酸經靶向序列置換，該靶向序列選自由SEQ ID NO: 1824-1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714組成之群，但具有3'末端上之化學修飾。在一些實施例中，經化學修飾之gRNA包含SEQ ID NO: 2968之序列，其中3'末端上之20個核苷酸經靶向序列置換，該靶向序列選自由SEQ ID NO: 1855、1867及1869組成之群，但具有3'末端上之化學修飾。在一些實施例中，經修飾之gRNA包含選自由SEQ ID NO: 22780至22803組成之群的序列。在一些實施例中，經修飾之gRNA包含選自由SEQ ID NO: 22788至22790組成之群的序列。gRNA變異體174、235及316之結構的示意圖分別顯示於圖7至圖9，且gRNA變異體235及316之經化學修飾型式顯示於圖10至圖14中。在一些實施例中，與沒有化學修飾之gRNA相比，具有化學修飾之gRNA展現經改良之穩定性。 e.與抑制子融合蛋白形成複合物

在目標細胞中遞送或表現系統之組件後，gRNA變異體能夠與長期抑制子融合蛋白複合為RNP且結合至 PCSK9基因之目標核酸。在一些實施例中，當與參考gRNA相比時，gRNA變異體具有與長期抑制子融合蛋白形成RNP複合物之經改良能力。在一些實施例中，改良核糖核蛋白複合物形成可提高組裝功能性RNP之效率。在一些實施例中，大於90%、大於93%、大於95%、大於96%、大於97%、大於98%或大於99%的包含gRNA變異體及其靶向序列以及本揭示之長期抑制子融合蛋白之RNP勝任用於目標核酸之基因抑制。 VII. 聚核苷酸及載體

本發明提供編碼長期抑制子融合蛋白質及/或gRNA之聚核苷酸，其在 PCSK9基因之抑制及表觀遺傳修飾方面具有效用。本揭示提供編碼mRNA之聚核苷酸，例如編碼相應mRNA之DNA聚核苷酸，該mRNA編碼長期抑制子融合蛋白。

本揭示之長期抑制子融合蛋白或編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA可使用此項技術中已知之習知方法，藉由活體外合成來製備。各種商業合成裝置為可用的，例如Applied Biosystems,Inc., Beckman之自動化合成器等。天然存在之胺基酸或核苷酸(適當時)可藉由使用合成器經非天然胺基酸或核苷酸取代。製備之特定次序及方式將由便利性、經濟因素、所需之純度及其類似者確定。gRNA亦可以合成方式產生；例如藉由使用此項技術中已知之T7 RNA聚合酶系統產生。

長期抑制子融合蛋白及/或gRNA亦可藉由使用此項技術中已知之標準重組以重組方式產生編碼本文所描述之任一實施例的長期抑制子融合蛋白或gRNA之聚核苷酸序列，且將編碼基因併入適合於宿主細胞之表現載體中來製備。為了產生本文所描述之任一實施例之經編碼長期抑制子融合蛋白及/或gRNA，該等方法包括用包含編碼聚核苷酸之表現載體轉化適當宿主細胞，及在引起或允許所得的本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白或gRNA在經轉化宿主細胞中表現或轉錄的條件下培養宿主細胞，藉由本文所描述之方法或藉由此項技術中已知或如實例中所描述之標準純化方法回收。使用分子生物學中之標準重組技術製造本揭示之聚核苷酸及表現載體。

本揭示之長期抑制子融合蛋白及/或gRNA亦可根據習知重組合成方法分離及純化。可製備表現宿主之溶胞物，且使用高效液相層析(HPLC)、排阻層析、凝膠電泳、親和力層析或其他純化技術純化溶胞物。在多數情況下，相對於涉及產物製備及其純化方法之污染物，所使用之組合物將佔所需產物的50重量%或更大，更通常75重量%或更大，較佳95重量%或更大，且出於治療目的，通常99.5重量%或更大。通常，百分比將按總蛋白質計。因此，在一些情況下，本揭示之長期抑制子融合蛋白或gRNA的純度為至少80%、純度為至少85%、純度為至少90%、純度為至少95%、純度為至少98%或純度為至少99% (例如不含污染物或其他大分子等)。

另外，本揭示提供載體，其包含編碼本文所描述之長期抑制子融合蛋白及gRNA的聚核苷酸。在一些情況下，當以抑制子融合蛋白及gRNA或RNP形式遞送系統時，利用載體進行LTRP:gRNA系統之CasX及gRNA組分的表現及回收。在其他情況下，如下文更充分描述，利用載體將編碼聚核苷酸遞送至目標細胞以抑制及/或表觀遺傳修飾目標核酸。在一些實施例中，將編碼長期抑制子融合蛋白及gRNA之序列在相同載體上進行模板化。在一些實施例中，將編碼長期抑制子融合蛋白及gRNA之序列在不同載體上進行模板化。適合的載體描述於例如WO2023235818A2、WO2022120095A1及WO2020247882A1中，各案以引用之方式併入本文中。如WO2023235818A2 WO2022120095A1及WO2020247882A1中所描述，取決於所用宿主/載體系統，表現載體中可使用多種適合的轉錄及轉譯控制元件中之任一者，包括持續型及誘導型啟動子、轉錄強化子元件、轉錄終止子等。

本揭示提供編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白的聚核苷酸序列。在一些實施例中，本揭示提供用於載體中之編碼長期抑制子融合蛋白之DNA序列。在一些實施例中，本揭示提供編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白之mRNA序列，其用於遞送至細胞之粒子系統中。在一些實施例中，本揭示提供一種編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白的mRNA序列，其用於遞送至細胞之LNP粒子調配物中。在一特定實施例中，本揭示提供gRNA及編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白的mRNA序列，其用於遞送至細胞之LNP粒子調配物中。在一些實施例中，本揭示提供編碼本文所描述之任一實施例之gRNA變異體之經分離聚核苷酸序列，該RNA變異體具有與 PCSK9目標核酸序列互補的連接靶向序列。

在一些實施例中，本揭示係關於產生編碼本文所描述之任一實施例的長期抑制子融合蛋白或gRNA (包括其變異體)之聚核苷酸序列的方法，以及表現由該等聚核苷酸序列轉錄之蛋白質或RNA的方法。一般而言，該等方法包括產生編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白或gRNA的聚核苷酸序列及將編碼基因併入表現載體中。在一些實施例中，載體經設計用於轉導細胞以抑制及/或表觀遺傳修飾 PCSK9目標核酸。此等載體可包括反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、單純疱疹病毒(HSV)載體、質體、微環、奈米質體、DNA載體及RNA載體。在其他實施例中，表現載體經設計用於在無細胞系統或宿主細胞中產生長期抑制子融合蛋白、編碼該長期抑制子融合蛋白之mRNA、或gRNA。為了在宿主細胞中產生本文所描述之任一實施例的經編碼長期抑制子融合蛋白或gRNA，該等方法包括用包含編碼聚核苷酸之表現載體轉化適當宿主細胞，及在使得或允許所得的本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白或gRNA在經轉化之宿主細胞中表現或轉錄之條件下培養宿主細胞，由此產生長期抑制子融合蛋白或gRNA，其係藉由本文所描述之方法(例如以下實例中描述之方法)或藉由此項技術中已知之標準純化方法回收。使用分子生物學中之標準重組技術製造本揭示之聚核苷酸及表現載體。

根據本揭示，編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白或gRNA的核酸序列係用於生成導引在適當宿主細胞中表現之重組DNA分子。若干選殖策略適合於進行本揭示，其中有許多係用於生成構築體，該構築體包含編碼本揭示之長期抑制子融合蛋白或gRNA或者其互補序列的基因。在一些實施例中，使用選殖策略產生編碼構築體之基因，該構築體包含編碼長期抑制子融合蛋白或gRNA之核苷酸。在一些實施例中，使用基因(例如作為載體之一部分)轉化宿主細胞以表現該基因，例如表現長期抑制子融合蛋白或gRNA。

在一種方法中，首先製備構築體，該構築體含有編碼長期抑制子融合蛋白或gRNA之DNA序列。製備此類構築體之例示性方法描述於實例中。隨後使用構築體產生適用於轉化宿主細胞(諸如原核或真核宿主細胞)以在長期抑制子融合蛋白或gRNA之情況下表現及回收蛋白質構築體的表現載體。必要時，宿主細胞為大腸桿菌( E.coli)。在其他實施例中，宿主細胞為真核細胞。真核宿主細胞可選自幼倉鼠腎纖維母細胞(BHK)細胞、人類胚胎腎293 (HEK293)細胞、人類胚胎腎293T (HEK293T)細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞、融合瘤細胞、NIH3T3細胞、CV-1 (猿猴) SV40遺傳物質來源(COS)細胞、希拉細胞(HeLa)、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、酵母細胞，或此項技術中已知適合於產生重組產物的其他真核細胞。用於產生表現載體、轉化宿主細胞以及表現及回收長期抑制子融合蛋白或gRNA之例示性方法描述於實例中。

編碼長期抑制子融合蛋白或gRNA構築體之基因可分一或多個步驟，以完全合成方式或藉由合成法結合酶法(諸如限制酶介導之選殖、PCR及重疊延伸)製備，包括實例中更全面描述之方法。本文所揭示之方法可用於例如將編碼各種組分之聚核苷酸的序列接合至所需序列之基因中。編碼多肽組合物之基因係使用基因合成之標準技術自寡核苷酸組裝。

在一些實施例中，編碼長期抑制子融合蛋白之核苷酸序列經密碼子最佳化。此類型最佳化可能需要編碼核苷酸序列之突變來模仿預期宿主生物體或細胞之密碼子偏好，同時編碼相同蛋白。因此，密碼子可改變，但經編碼之蛋白質保持不變。舉例而言，若長期抑制子融合蛋白之既定目標細胞係人類細胞，則可使用人類密碼子最佳化之編碼長期抑制子融合蛋白之核苷酸序列。作為另一非限制性實例，若既定宿主細胞係小鼠細胞，則可生成小鼠密碼子最佳化之編碼長期抑制子融合蛋白之核苷酸序列。基因設計可使用使適合於用於產生長期抑制子融合蛋白或gRNA之宿主細胞之密碼子使用及胺基酸組成最佳化的演算法進行。在一種本揭示方法中，編碼構築體之組分的聚核苷酸庫產生且接著組裝，如上文所述。隨後組裝所得基因，且所得基因用於轉化宿主細胞且產生及回收長期抑制子融合蛋白或gRNA組合物以評估其特性或用於修飾本文所描述之 PCSK9目標核酸。

在一些實施例中，編碼gRNA之核苷酸序列可操作地連接於控制元件，例如轉錄控制元件，諸如啟動子。在一些實施例中，編碼長期抑制子融合蛋白之核苷酸序列可操作地連接於控制元件，例如轉錄控制元件，諸如啟動子。在一些情況下，啟動子為持續型活性啟動子。在一些情況下，啟動子為可調節啟動子。在一些情況下，啟動子為誘導型啟動子。在一些情況下，啟動子為組織特異性啟動子。在一些情況下，啟動子為細胞類型特異性啟動子。在一些情況下，轉錄控制元件(例如啟動子)在所靶向細胞類型或所靶向細胞群體中起作用。舉例而言，在一些情況下，轉錄控制元件可在真核細胞，例如肝細胞或肝竇內皮細胞中起作用。

可操作地連接於編碼本揭示之長期抑制子融合蛋白之聚核苷酸的Pol II啟動子的非限制性實例包括但不限於：EF-1α、EF-1α核心啟動子、Jens Tornoe (JeT)、巨細胞病毒(CMV)啟動子、CMV即刻早期(CMVIE)啟動子、CMV強化子、單純疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期及晚期猿猴病毒40 (SV40)、SV40強化子、來自反轉錄病毒之長末端重複序列(LTR)、小鼠金屬硫蛋白-I、腺病毒主要晚期啟動子(Ad MLP)、CMV啟動子全長啟動子、最小CMV啟動子、雞β-肌動蛋白啟動子(CBA)、CBA雜合體(CBh)、雞β-肌動蛋白啟動子與巨細胞病毒強化子(CB7)、雞β-肌動蛋白啟動子與兔β-球蛋白剪接接受體部位融合物(CAG)、勞氏肉瘤病毒(rous sarcoma virus，RSV)啟動子、HIV-Ltr啟動子、hPGK啟動子、HSV TK啟動子、7SK啟動子、Mini-TK啟動子、賦予神經元特異性表現之人類突觸蛋白I (SYN)啟動子、β-肌動蛋白啟動子、超核心啟動子1 (SCP1)、 用於在神經元中選擇性表現之Mecp2啟動子、最小IL-2啟動子、勞氏肉瘤病毒強化子/啟動子(單一)、脾病灶形成病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、TBG啟動子、人類甲狀腺素結合球蛋白基因的啟動子(肝特異性)、PGK啟動子、人類泛素C啟動子(UBC)、UCOE啟動子(HNRPA2B1-CBX3之啟動子)、合成CAG啟動子、組蛋白H2啟動子、組蛋白H3啟動子、U1a1小核RNA啟動子(226 nt)、U1a1小核RNA啟動子(226 nt)、U1b2小核RNA啟動子(246 nt) 26、GUSB啟動子、CBh啟動子、視紫質(Rho)啟動子、易緘默化的脾病灶形成病毒(SFFV)啟動子、人類H1啟動子(H1)、 POL1啟動子、TTR最小強化子/啟動子、b-驅動蛋白啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒長末端重複序列(LTR)啟動子、人類真核生物起始因子4A (EIF4A1)啟動子、ROSA26啟動子、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子、tRNA啟動子及前述各者之截短型式及序列變異體。在一特定實施例中，pol II啟動子為EF-1α，其中該啟動子增強轉染效率、轉殖基因轉錄或CRISPR核酸酶之表現、表現陽性純系之比例及游離型載體在長期培養中之拷貝數。

可操作地連接於編碼本揭示之gRNA變異體之聚核苷酸的Pol III啟動子的非限制性實例包括但不限於：U6、微型U6、U6截短啟動子、7SK及H1變異體、BiH1 (雙向H1啟動子)、BiU6、Bi7SK、BiH1 (雙向U6、7SK及H1啟動子)、大猩猩U6、恆河猴U6、人類7SK、人類H1啟動子，以及其等之截短型式及序列變異體。在前述實施例中，pol III啟動子增強gRNA之轉錄。在一特定實施例中，Pol III啟動子為U6，其中該啟動子增強gRNA之表現。有關使用此等啟動子之實驗詳情及資料提供於實例中。

適當載體及啟動子之選擇完全符合一般技術者之水平，因為其與控制表現相關。表現載體亦可含有用於轉譯起始之核糖體結合位點及轉錄終止子。表現載體亦可包括用於擴增表現之適當的序列。表現載體亦可包括編碼蛋白質標籤(例如6×His標籤、紅血球凝集素標籤、螢光蛋白等)之核苷酸序列，該等蛋白質標籤可與長期抑制子融合蛋白融合，由此產生用於純化或偵測之嵌合蛋白。

本揭示之重組表現載體亦可包含促進本揭示之蛋白質及gRNA之穩固表現的元件。舉例而言，重組表現載體可包括聚腺苷酸化信號(聚腺苷酸)、內含子序列或轉錄後調控元件(諸如土拔鼠肝炎轉錄後調控元件(WPRE))中之一或多者。例示性聚腺苷酸序列包括hGH 聚腺苷酸信號(短)、HSV TK 聚腺苷酸信號、合成聚腺苷酸化信號、在兩個60 A伸長段之間具有SphI限制位點的分裂聚腺苷酸序列(SEQ ID NO: 3307)、SV40 聚腺苷酸信號、β-球蛋白聚腺苷酸信號及其等之類似者。一般熟習此項技術者將能夠選擇將包括在本文所描述之重組表現載體中之適合元件。

編碼長期抑制子融合蛋白或gRNA序列之聚核苷酸可個別選殖至表現載體中。適當載體及啟動子之選擇完全符合一般技術者之水平，因為其與控制表現相關，例如用於抑制PCSK9基因之表現及/或表觀遺傳修飾。表現載體亦可含有用於轉譯起始之核糖體結合位點以及轉錄終止子。表現載體亦可包括用於擴增表現之適當的序列。

核酸序列係藉由多種程序插入至載體中。一般而言，DNA係使用此項技術中已知之技術插入至適當的限制性核酸內切酶位點中。載體組分一般包括但不限於以下中之一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。含有此等組分中之一或多者之適合之載體的構築採用熟習此項技術者已知之標準接合技術。此等技術為此項技術中熟知且詳盡描述於科學及專利文獻中。各種載體為公開可用的。載體可例如呈可便利地經受重組DNA程序之質體、黏質體、病毒粒子或噬菌體形式，且載體之選擇將通常取決於其所引入之宿主細胞。因此，載體可為自主複製載體，亦即，以染色體外實體形式存在之載體，其複製獨立於染色體複製，例如質體。或者，載體可為當引入宿主細胞中時整合至宿主細胞基因體中且連同其已整合之染色體進行複製之載體。在引入適合宿主細胞中後，即可使用此項技術中已知之任何核酸或蛋白質分析來測定長期抑制子融合蛋白或gRNA之表現。舉例而言，可使用與聚核苷酸之任何區域互補之探針，藉由習知雜交分析(例如北方墨點分析)、擴增程序(例如RT-PCR)、SAGE (美國專利第5,695,937號)及基於陣列之技術(參見例如美國專利第5,405,783號、第5,412,087號及第5,445,934號)偵測及/或定量長期抑制子融合蛋白之轉錄mRNA的存在。

在一些實施例中，載體係經產生用於長期抑制子融合蛋白之轉錄以及所得編碼mRNA之表現及回收。在一些實施例中，mRNA係使用PCR產物或線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶藉由活體外轉錄(IVT)來產生，其中質體含有T7啟動子。若使用PCR產物，則編碼候選mRNA之DNA序列將選殖至含有T7啟動子之質體中，其中質體DNA模板將經線性化，且隨後用於進行IVT反應以表現mRNA。此等載體之生成及mRNA之產生及回收的例示性方法提供於以下實例中。 VIII. 用於遞送LTRP:gRNA系統之粒子

在另一態樣中，本揭示提供用於向細胞或個體遞送LTRP:gRNA系統以用於 PCSK9基因之轉錄抑制或緘默化的粒子組合物。設想在本揭示之範疇內的粒子包括但不限於奈米粒子，諸如合成奈米粒子、聚合物奈米粒子、脂質奈米粒子、病毒粒子及病毒樣粒子。本揭示之粒子可囊封有效負載，諸如本文所描述之gRNA變異體視情況與編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白的mRNA的組合。或者或另外，例如當締合成核糖核蛋白(RNP)複合物時，本揭示之粒子可囊封gRNA變異體及長期抑制子融合蛋白之有效負載。在一些實施例中，該等粒子係合成奈米粒子，其囊封gRNA變異體及編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白的mRNA的有效負載。在一些實施例中，合成奈米粒子包含可生物降解的聚合物奈米粒子(PNP)。在一些實施例中，用於產生可生物降解的聚合物奈米粒子(PNP)之材料包括聚丙交酯、聚(乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)及聚(氰基丙烯酸異己酯)、聚麩胺酸(PGA)、聚(ɛ-己內酯) (PCL)、環糊精及作為最常用於合成PNP之聚合物的天然聚合物，例如幾丁聚醣、白蛋白、明膠及海藻酸鹽。(Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 3:16023; doi:10.1038 (2016))。在其他實施例中，該等粒子係脂質奈米粒子，其囊封gRNA變異體及編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白的mRNA，下文對其進行更全面的描述。在其他實施例中，該等粒子係脂質奈米粒子(LNP)，其將gRNA變異體及編碼本文所描述之任一實施例的長期抑制子融合蛋白之mRNA分開囊封於不同粒子中，該不同粒子經共同調配為混合物以供投與，下文對其進行更全面的描述。在其他實施例中，該等粒子係脂質奈米粒子，其將gRNA變異體及編碼任一實施例之長期抑制子融合蛋白的mRNA分開囊封，且該兩種類型之粒子係分開投與。 a.脂質奈米粒子(LNP)

在另一態樣中，本揭示提供用於向細胞或向個體遞送本揭示之LTRP:gRNA系統以用於轉錄抑制 PCSK9基因之脂質奈米粒子(LNP)。在一些實施例中，本揭示之LNP為組織特異性或器官(例如，肝臟)特異性的，具有極佳生物相容性，且可高效遞送系統，且因此可有效地用於 PCSK9基因之轉錄抑制。

本揭示進一步提供包含複數個本文所描述之LNP之LNP組合物及醫藥組合物。

在其原生形式中，核酸聚合物在生物流體中一般不穩定且無法穿透進入目標細胞之細胞質中，因此需要遞送系統。已證明脂質奈米粒子(LNP)適用於保護核酸及將核酸遞送至組織及細胞。此外，與DNA載體相比，在LNP中使用mRNA編碼長期抑制子融合蛋白將消除不期望之基因體整合的可能性。此外，mRNA有效地轉染有絲分裂及非有絲分裂細胞，因為其在細胞質區室中發揮其功能而不需要進入細胞核。因此，以LNP作為遞送平台將提供額外優勢，即能夠將編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA與gRNA兩者共同調配至單一LNP粒子中。

因此，在各種實施例中，本揭示涵蓋脂質奈米粒子及組合物，其可用於達成多種目的，包括活體外及活體內遞送所囊封或締合(例如複合)之治療劑(諸如核酸)至細胞。在某些實施例中，本揭示涵蓋治療或預防有需要個體之疾病或病症的方法，其藉由使個體與脂質奈米粒子接觸來進行，該脂質奈米粒子囊封適合治療劑或與其締合，該適合治療劑透過組合物中使用之一或多種脂質組分之間的各種物理、化學或靜電相互作用而複合以製得LNP。在一些實施例中，適合的治療劑包含本文所描述之LTRP:gRNA系統。

在某些實施例中，脂質奈米粒子適用於遞送核酸，包括例如本揭示之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA變異體。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6528至14626 (未經修飾之mRNA)及14627至22725 (經N1-甲基-假尿苷修飾之mRNA)組成之群的編碼長期抑制子融合蛋白的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6528至8134、9741至11347、14628至16233及17840至19446組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537、9742至9750、14628、14636及17841至17849組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537、9742至9750、14628、14636及17841至17849組成之群的序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6531、9744、14630及17843組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6531、9744、14630及17843組成之群的序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529、9742、14628及17841組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529、9742、14628及17841組成之群的序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6530、9743、14629及17842組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6530、9743、14629及17842組成之群的序列。在一些實施例中，LNP包含gRNA，該gRNA包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746、2948至2956、2958至2966及2968至2974組成之群的支架序列，及與 PCSK9基因之序列互補的所連接靶向序列(在SEQ ID NO: 2948至2956、2958至2966及2968至2974之情況下，3'末端上之20個非靶向核苷酸經與 PCSK9基因之序列互補但保留了3'末端上之化學修飾之靶向序列置換)。在一些實施例中，LNP包含gRNA，該gRNA包含選自由SEQ ID NO: 2278至22803組成之群的序列。在一些實施例中，LNP包含gRNA，該gRNA包含選自由SEQ ID NO: 2278至22790組成之群的序列。在一些實施例中，本揭示提供LNP，其中gRNA及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA係併入單一LNP粒子中。在其他實施例中，本揭示提供LNP，其中gRNA及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA併入至LNP之單獨群體中，該等群體可按不同比率一起調配以供投與。

本揭示之脂質奈米粒子及脂質奈米粒子組合物可用於藉由使細胞與包含一或多種本文所描述之可離子化脂質的脂質奈米粒子接觸而在活體外及活體內抑制所需蛋白質之表現，其中該脂質奈米粒子囊封與經表現以產生所需蛋白質(例如編碼長期抑制子融合蛋白質之信使RNA)之核酸或與該核酸締合。在一些實施例中，脂質奈米粒子及組合物活可用於藉由使細胞與包含一或多種本文所描述之陽離子型脂質的脂質奈米粒子接觸在活體外及活體內抑制目標基因表現，其中該脂質奈米粒子囊封本揭示之LTRP:gRNA系統中的一或多個核酸或與該一或多個核酸締合。本揭示之實施例之脂質奈米粒子及組合物亦可單獨或以組合形式用於共同遞送不同核酸(例如，mRNA及質體DNA)，諸如可適用於提供需要不同核酸(例如，編碼適合的基因抑制子或酶之mRNA及用於靶向基因之gRNA)之共定位的作用。

在一些實施例中，本文所描述之LNP及LNP組合物包括至少一種陽離子型脂質、至少一種結合脂質、至少一種類固醇或其衍生物、至少一種額外脂質或其任何組合。或者，本揭示之脂質組合物可包括可離子化脂質，諸如可離子化陽離子型脂質、輔助脂質(通常為磷脂)、膽固醇及聚乙二醇-脂質結合物(PEG-脂質)，以藉由例如降低血漿蛋白之吸收比以及在奈米粒子上形成水合層來改良生物環境中之膠態穩定性。此等脂質組合物可在50:10:37-39:1.5-2.5或20-50:8-65:25-40:1-2.5之典型莫耳比下調配，其中進行變化以調節個別特性。

本揭示之LNP及LNP組合物經組態以在活體外及活體內保護本揭示之系統之經囊封有效負載且將該經囊封有效負載遞送至組織及細胞。本文中進一步詳細描述本揭示之LNP及LNP組合物之各種實施例。 陽離子型脂質

在一些實施例中，本揭示之LNP及LNP組合物包括至少一種陽離子型脂質。術語「陽離子型脂質」係指具有淨正電荷之脂質物種。在一些實施例中，陽離子型脂質係在所選pH (諸如生理pH)下具有淨正電荷之可離子化陽離子型脂質。在一些實施例中，可離子化陽離子型脂質之pKa小於約7，使得LNP及LNP組合物在相對較低的pH下達成有效負載的有效囊封。在一些實施例中，陽離子型脂質之pKa為5至8、5.5至7.5、6至7或6.5至7。在一些實施例中，陽離子型脂質可在低於陽離子型脂質之pKa之pH下質子化，且在高於該pKa之pH下，其可為實質上中性的。LNP及LNP組合物可在活體內安全地遞送至目標器官(例如肝、肺、心臟、脾，以及腫瘤)及/或目標細胞(肝細胞、LSEC、心臟細胞、癌細胞等)，且在內吞作用後展現正電荷以透過與胞內體膜之陰離子型蛋白的靜電相互作用而釋放所囊封的有效負載。

利用永久陽離子型脂質的早期LNP調配使得LNP具有陽性表面電荷且被吞噬細胞快速清除，已證實該等陽性表面電荷在活體內具有毒性。藉由變成帶有三級胺(尤其pKa ＜7之三級胺)的可離子化陽離子型脂質，使得LNP藉由與mRNA之磷酸酯主鏈之負電荷進行靜電相互作用而實現在低pH下之有效囊封核酸聚合物，其在生理pH值下亦產生很大程度上中性之系統，因此緩解與永久帶電陽離子型脂質相關的問題。

如本文所用，「可離子化脂質(ionizable lipid)」意謂容易質子化之含胺脂質，且例如其可為電荷狀態視周圍pH而改變的脂質。可離子化脂質可在低於陽離子型脂質之pKa之pH下質子化(帶正電)，且在高於該pKa之pH下，其可為實質上中性的。在一個實例中，LNP可包含質子化可離子化脂質及/或顯示中性之可離子化脂質。在一些實施例中，LNP之pKa為5至8、5.5至7.5、6至7或6.5至7。LNP之pKa可影響目標細胞或器官中LNP之核酸有效負載的活體內穩定性及釋放。在一些實施例中，具有前述pKa範圍之LNP可在活體內安全地遞送至目標器官(例如肝、肺、心臟、脾以及腫瘤)及/或目標細胞(肝細胞、LSEC、心臟細胞、癌細胞等)，且在內吞作用後展現正電荷以透過與胞內體膜之陰離子型蛋白質的靜電相互作用而釋放所囊封的有效負載。

可離子化脂質為通常具有類似於脂質之特徵的可離子化化合物，且經由與核酸(例如本揭示之mRNA)的靜電相互作用，可發揮將核酸有效負載高效地囊封於LNP內的作用。

根據可離子化脂質中所含之胺及尾基之類型，LNP之(i)核酸囊封效率、(ii) PDI (多分散性指數)及/或(iii)對構成器官之組織及/或細胞(例如肝細胞或肝中之肝竇內皮細胞)的核酸遞送效率可不同。在某些實施例中，可離子化脂質係可離子化陽離子型脂質，且其佔粒子中存在之總脂質的約46 mol%至約66 mol%。

包括含胺之可離子化脂質的LNP可具有一或多個種類的以下特徵：(1)高效地囊封核酸之能力；(2)所製備粒子之大小均勻(或具有低PDI值)；及/或(3)對諸如肝、肺、心臟、脾、骨髓之器官以及腫瘤，及/或構成此等器官之細胞(例如肝細胞、LSEC、心臟細胞、癌細胞等)的極佳核酸遞送效率。

在特定實施例中，陽離子型脂質形式在經由靜電相互作用進行核酸囊封及藉由破壞胞內體膜進行細胞內釋放兩方面發揮重要作用。核酸有效負載藉由其與帶正電之陽離子型脂質形成之離子相互作用囊封於LNP內。用於本揭示之LNP中的陽離子型脂質組分之非限制性實例係選自DLin-MC3-DMA (4-(二甲基胺基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯)、DLin-KC2-DMA (2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷)及TNT (1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮)及TT (N1,N3,N5-參(2-胺基乙基)苯-1,3,5-三甲醯胺)。用於本揭示之LNP中之輔助脂質的非限制性實例係選自DSPC (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)、POPC (2-油醯基-1-軟脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼)及DOPE (1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸基-(1'-rac-甘油)、DOPG、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DLPC)、鞘脂以及神經醯胺。針對LNP之穩定性、循環及尺寸，膽固醇及PEG-DMG ((R)-2,3-雙(十八烷氧基)丙基-1-(甲氧基聚乙二醇2000)胺基甲酸酯)、PEG-DSG (1,2-二硬脂醯基-rac-甘油-3-甲基聚氧基乙二醇2000)或DSPE-PEG2k (1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[胺基(聚乙二醇)-2000])係本揭示之LNP中使用的組分。

在一些實施例中，本揭示之LNP中之陽離子型脂質包含三級胺。在一些實施例中，三級胺包括藉由醚鍵連接至三級胺之N的烷基鏈。在一些實施例中，烷基鏈包含具有0至3個雙鍵之C12-C30烷基鏈。在一些實施例中，烷基鏈包含C16-C22烷基鏈。在一些實施例中，烷基鏈包含C18烷基鏈。多種陽離子型脂質及相關類似物已描述於美國專利公開案第20060083780號、第20060240554號、第20110117125號、第20190336608號、第20190381180號及第20200121809號；美國專利第5,208,036號；第5,264,618號；第5,279,833號；第5,283,185號；第5,753,613號；第5,785,992號；第9,738,593號；第10,106,490號；第10,166,298號；第10,221,127號；及第11,219,634號；以及PCT公開案第WO 96/10390號，各案揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

在一些實施例中，本揭示之LNP中之陽離子型脂質可包含例如一或多種可離子化陽離子型脂質，其中該可離子化陽離子型脂質為二烷基脂質。在其他實施例中，可離子化陽離子型脂質為三烷基脂質。

在一些實施例中，本揭示之LNP中的陽離子型脂質係選自1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二次亞麻氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亞油基-4-(3-二甲胺基丙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C3-DMA)、2,2-二亞油基-4-(4-二甲胺基丁基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-C4-DMA)、2,2-二亞油基-5-二甲胺基甲基-[1,3]-二㗁烷(DLin-K6-DMA)、2,2-二亞油基-4-N-甲基哌𠯤并-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-MPZ)、2,2-二亞油基-4-二甲胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin-K-DMA)、1,2-二亞油基胺甲醯基氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亞油基氧基-3-(二甲胺基)乙醯氧基丙烷(DLin-DAC)、1,2-二亞油基氧基-3-(N-𠰌啉基)丙烷(DLin-MA)、1,2-二亞油醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinDAP)、1,2-二亞油基硫基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-S-DMA)、1-亞油醯基-2-亞油氧基-3-二甲基胺基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亞油氧基-3-三甲基胺基丙烷氯化鹽(DLin-TMA.Cl)、1,2-二亞油醯基-3-三甲基胺基丙烷氯化鹽(DLin-TAP.Cl)、1,2-二亞油氧基-3-(N-甲基哌𠯤基)丙烷(DLin-MPZ)、3-(N,N-二亞油基胺基)-1,2-丙二醇(DLinAP)、3-(N,N-二油烯基胺基)-1,2-丙二醇(DOAP)、1,2-二亞油基側氧基-3-(2-N,N-二甲胺基)乙氧基丙烷(DLin-EG-DMA)、氯化N,N-二油基-N,N-二甲銨(DODAC)、1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DODMA)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DSDMA)、氯化N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲銨(DOTMA)、溴化N,N-二硬脂基-N,N-二甲銨(DDAB)、氯化N-(1-(2,3-二油醯氧基)丙基)-N,N,N-三甲銨(DOTAP)、3-(N-(N′,N′-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、溴化N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基銨(DMRIE)、2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙銨三氟乙酸鹽(DOSPA)、二(十八烷基)醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲基胺基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順式,順式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5′-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧雜戊烯氧基)-3-二甲基-1-(順式,順式-9′,1-2′-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N′-二油烯基胺基甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、1,2-N,N′-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)及前述各者之任何組合。

在一些實施例中，本揭示之LNP中之陽離子型脂質係選自4-(二甲基胺基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亞油基-4-(2-二甲胺基乙基)-[1,3]-二氧雜環戊烷(DLin- KC2-DMA)、(1,3,5-三𠯤烷-2,4,6-三酮) (TNT)、N1,N3,N5-參(2-胺基乙基)苯-1,3,5-三甲醯胺(TT)及前述各者之任何組合。

在一些實施例中，本揭示之LNP中之N/P比(來自陽離子型/可離子化脂質的氮與來自核酸的磷酸酯)在約3:1至7:1、或約4:1至6:1範圍內，或為3:1，或為4:1，或為5:1，或為6:1，或為7:1。 結合脂質

在一些實施例中，本揭示之LNP及LNP組合物包括至少一種結合脂質。在一些實施例中，結合脂質可選自聚乙二醇(PEG)-脂質結合物、聚醯胺(ATTA)-脂質結合物、陽離子-聚合物-脂質結合物(CPL)及前述各者之任何組合。在一些情況下，結合脂質可阻抑本揭示之LNP的聚集。

在一些實施例中，本揭示之LNP之結合脂質包含聚乙二醇化脂質。術語「聚乙二醇(PEG)-脂質結合物」、「聚乙二醇化脂質」、「脂質-PEG結合物」、「脂質-PEG」、「PEG-脂質」、「PEG-脂質」或「脂質-PEG」在本文中可互換使用且係指連接至聚乙二醇(PEG)聚合物(其為親水性聚合物)的脂質。聚乙二醇化脂質促成LNP及LNP組合物之穩定性且減少LNP之聚集。

由於PEG-脂質可形成表面脂質，所以LNP之尺寸可容易藉由改變表面(PEG)脂質與核心(可離子化陽離子)脂質之比例來改變。在一些實施例中，本揭示之PEG-脂質可在約1 mol%至5 mol%之間變化以修改粒子特性，諸如尺寸、穩定性及循環時間。

脂質-PEG結合物促成LNP內之奈米粒子在血清中的粒子穩定性，且起到預防奈米粒子之間的聚集的作用。另外，脂質-PEG結合物可保護核酸，諸如編碼本揭示之長期抑制子融合蛋白之mRNA或本揭示之gRNA免於在核酸之活體內遞送期間降解酶且增強核酸之活體內穩定性，並且增加囊封於奈米粒子中之所遞送核酸之半衰期。PEG-脂質結合物之實例包括但不限於PEG-DAG結合物、PEG-DAA結合物及其等之混合物。在某些實施例中，PEG-脂質結合物係選自由以下組成之群組：PEG-二醯基甘油(PEG-DAG)結合物、PEG-二烷氧基丙基(PEG-DAA)結合物、PEG-磷脂結合物、PEG-神經醯胺(PEG-Cer)結合物及其等之混合物。

在一些實施例中，本揭示之LNP之聚乙二醇化脂質係選自PEG-神經醯胺、PEG-二醯基甘油、PEG -二烷基氧基丙基、PEG-二烷氧基丙基胺基甲酸酯、PEG-磷脂醯乙醇胺、PEG-磷脂、PEG-丁二酸二醯基甘油及前述各者之任何組合。

在一些實施例中，本揭示之LNP之聚乙二醇化脂質為PEG-二烷氧基丙基。在一些實施例中，聚乙二醇化脂質係選自PEG-二癸氧基丙基(C10)、PEG-二月桂氧基丙基(C12)、PEG-二肉豆蔻氧基丙基(C14)、PEG-二軟脂氧基丙基(C16)、PEG-二硬脂醯氧基丙基(C18)及前述各者之任何組合。

在其他實施例中，本揭示之LNP的脂質-PEG結合物可為結合至磷脂之PEG，諸如磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)；結合至神經醯胺之PEG (PEG-CER、神經醯胺-PEG結合物、神經醯胺-PEG)；膽固醇或結合至其衍生物之PEG；PEG-c-DOMG；PEG-DMG；PEG-DLPE；PEG-DMPE；PEG-DPPC；PEG-DSPE (DSPE-PEG)及其等之混合物，且例如，可為C16-PEG2000神經醯胺(N-軟脂醯基-神經鞘胺醇-1-{丁二醯基[甲氧基(聚乙二醇)2000]})、DMG-PEG 2000、14:0 PEG2000 PE。

在一些實施例中，本揭示之LNP之聚乙二醇化脂質係選自1-(單甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻醯基甘油、4-O-(2′,3′-二(十四醯氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)胺基甲酸酯、2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)胺基甲酸酯，及前述各者之任何組合。

在一些實施例中，本揭示之LNP的聚乙二醇化脂質係選自mPEG2000-1,2-二-O-烷基-sn3-胺甲醯基甘油酯(PEG-C-DOMG)、1-[8′-(1,2-二肉豆蔻醯基-3-丙氧基)-甲醯胺基-3′,6′-二氧雜辛基]胺甲醯基-w-甲基-聚(乙二醇)(2 KPEG-DMG)及前述各者之任何組合。

在一些實施例中，PEG直接連接至聚乙二醇化脂質之脂質。在其他實施例中，PEG藉由選自無酯連接子部分或含酯連接子部分之連接子部分連接至聚乙二醇化脂質之脂質。無酯連接子部分之非限制性實例包括醯胺基(-C(O)NH-)、胺基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、胺基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、丁二醯基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、丁二醯胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚、二硫化物及其等之組合。舉例而言，連接子可含有胺基甲酸酯連接子部分及醯胺基連接子部分。含酯連接子部分之非限制性實例包括碳酸酯(-OC(O)O-)、丁二醯基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其等之組合。

本文所描述之本揭示之LNP之聚乙二醇化脂質的PEG部分可具有在約550道爾頓至約10,000道爾頓範圍內之平均分子量。在某些實施例中，PEG部分具有約750道爾頓至約5,000道爾頓、約1,000道爾頓至約4,000道爾頓、約1,500道爾頓至約3,000道爾頓、約750道爾頓至約3,000道爾頓、或約1750道爾頓至約2,000道爾頓之平均分子量。

在一些實施例中，結合脂質(例如，聚乙二醇化脂質)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的約1 mol%至約60 mol%、約2 mol%至約50 mol%、約5 mol%至約40 mol%或約5 mol%至約20 mol%。在某些實施例中，結合脂質佔粒子中存在之總脂質的約0.5 mol%至約3 mol%。

在額外實施例中，結合脂質(例如，聚乙二醇化脂質)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的至少約1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60 mol%，或前述任一者之中間範圍。

對於本揭示之LNP之脂質-PEG結合物中之脂質，可使用(但不限於)能夠結合於聚乙二醇之任何脂質，且亦可使用作為LNP之其他元件的磷脂及/或膽固醇。在一些實施例中，脂質-PEG結合物中之脂質可為神經醯胺、二肉豆蔻醯基甘油(DMG)、丁二醯基-二醯基甘油(s-DAG)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)或膽固醇，但不限於此。

在本揭示之LNP的脂質-PEG結合物中，PEG可直接結合至脂質或經由連接子部分連接至脂質。可使用適合於使PEG結合至脂質的任何連接子部分，且其例如包括無酯連接子部分及含酯連接子部分。無酯連接子部分包括醯胺基(-C(O)NH-)、胺基(-NR-)、羰基(-C(O)-)、胺基甲酸酯(-NHC(O)O-)、脲(-NHC(O)NH-)、二硫化物(-S-S-)、醚(-O-)、丁二醯基(-(O)CCH2CH2C(O)-)、丁二醯胺基(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、醚、二硫化物及其等之組合(例如含有胺基甲酸酯連接子部分及醯胺基連接子部分兩者的連接子)，但不限於此。含酯連接子部分包括例如碳酸酯(-OC(O)O-)、丁二醯基、磷酸酯(-O-(O)POH-O-)、磺酸酯及其組合，但不限於此。 類固醇

在一些實施例中，本揭示之LNP及LNP組合物包括至少一種類固醇或其衍生物。在一些實施例中，類固醇包含膽固醇。在一些實施例中，LNP及LNP組合物包含選自膽甾烷醇、膽甾烷酮、膽甾烯酮、糞甾醇、膽固醇基-2′-羥基乙基醚、膽固醇基-4′-羥基丁基醚及前述各者之任何組合的膽固醇衍生物。

在一些實施例中，本揭示之LNP的類固醇(例如膽固醇)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的約1 mol%至約60 mol%、約2 mol%至約50 mol%、約5 mol%至約40 mol%或約5 mol%至約20 mol%。在其他實施例中，本揭示之LNP之類固醇(例如膽固醇)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的至少約1 mol%、2 mol%、5 mol%、10 mol%、15 mol%、20 mol%、25 mol%、30 mol%、35 mol%、40 mol%、45 mol%、50 mol%、55 mol%或60 mol%，或前述任一者之中間範圍。 額外脂質

在一些態樣中，本揭示之LNP及LNP組合物包括至少一種額外脂質。在一些實施例中，額外脂質為選自陰離子型脂質、中性脂質或兩者之非陽離子型脂質。在一些實施例中，額外脂質包含至少一種磷脂。在一些實施例中，磷脂係選自陰離子型磷脂、中性磷脂或兩者。LNP及LNP組合物之要素的磷脂可起到覆蓋及保護由LNP中之陽離子型脂質與核酸之相互作用形成之LNP核心的作用，且可藉由結合於目標細胞之磷脂雙層而有助於在細胞內遞送核酸期間的細胞膜滲透及胞內體逃逸。可促進LNP與細胞之融合的磷脂可包括但不限於選自以下所描述之群的磷脂中之任一者。

在一些實施例中，LNP及LNP組合物包含選自(但不限於)以下之至少一種磷脂：二軟脂醯基-磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基-磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二油醯基-磷脂醯膽鹼(DOPC)、二油醯基-磷脂醯甘油(DOPG)、軟脂醯油醯基-磷脂醯膽鹼(POPC)、軟脂醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、軟脂醯油醯基-磷脂醯甘油(POPG)、二軟脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二軟脂醯基-磷脂醯甘油(DPPG)、二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、單甲基-磷脂醯乙醇胺、二甲基-磷脂醯乙醇胺、二反油醯基-磷脂醯乙醇胺(DEPE)、硬脂醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)、蛋磷脂醯膽鹼(EPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷酸基-L-絲胺酸] (DOPS)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-[磷酸基-L-絲胺酸]，以及前述各者之任何組合。在一個實例中，包含DOPE之LNP可有效進行mRNA遞送(藥物遞送功效極佳)。

在一些實施例中，本揭示之LNP的額外脂質(例如磷脂)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的約1 mol%至約60 mol%、約2 mol%至約50 mol%、約5 mol%至約40 mol%或約5 mol%至約20 mol%。在其他實施例中，本揭示之LNP的額外脂質(例如磷脂)佔LNP及/或LNP組合物中存在之總脂質的至少約1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60 mol%，或前述任一者之中間範圍。

應瞭解，LNP及/或LNP組合物中所存在之總脂質包含陽離子型脂質或可離子化離子脂質、結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)、類固醇(例如膽固醇)及額外脂質(例如磷脂)之組合。

LNP及/或LNP組合物可藉由以下方式製備：將總脂質(或其一部分)溶解於有機溶劑(例如乙醇)中，隨後經由微混合器與溶解於酸性緩衝液(例如pH 4)中之有效負載(例如系統之核酸)混合。在此pH下，陽離子型脂質帶正電且與帶負電核酸聚合物相互作用。接著，當對中性緩衝液透析時，將含有核酸之所得奈米結構轉化為中性LNP，接著可移除有機溶劑(例如乙醇)且將LNP更換至生理學相關緩衝液中。因此形成之LNP及/或LNP組合物具有不同電子密集奈米結構化核心，其中陽離子型脂質在囊封的有效載荷周圍組織成反向微胞，與傳統雙層脂質體結構相反。在另一實施例中，LNP可與核酸形成泡樣結構，該等核酸沿非電子緻密脂質核心位於水袋中。 b.脂質奈米粒子特性

在一些實施例中，LNP及/或LNP組合物包含約50 mol%至約85 mol%陽離子型脂質或可離子化陽離子型脂質、約0.5 mol%至約10 mol%結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)、約0.5 mol%至約10 mol%類固醇(例如膽固醇)及約5 mol%至約50 mol%額外脂質(例如磷脂)。在一些實施例中，LNP及/或LNP組合物包含約50 mol%至約85 mol%陽離子型脂質或可離子化陽離子型脂質、約0.5 mol%至約5 mol%結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)、約0.5 mol%至約5 mol%類固醇(例如膽固醇)及約5 mol%至約20 mol%額外脂質(例如磷脂)。

在一些實施例中，本揭示之LNP及/或LNP組合物以20至50:10至30:30至60:0.5至5之莫耳比，以25至45:10至25:40至50:0.5至3之莫耳比，以25至45:10至20:40至55:0.5至3之莫耳比，或以25至45:10至20:40至55:1.0至1.5之莫耳比包含陽離子型脂質:額外脂質(例如磷脂):類固醇(例如膽固醇):結合脂質(例如聚乙二醇化脂質)。

在一些實施例中，本揭示之LNP及/或LNP組合物之總脂質:有效負載比(質量/質量)為約1至約100。在一些實施例中，總脂質:有效負載比為約1至約50、約2至約25、約3至約20、約4至約15或約5至約10。在一些實施例中，總脂質:有效負載比為約5至約15，例如約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或前述任一者之中間範圍。

在某些實施例中，本揭示之LNP包含約5:1至約15:1之總脂質:核酸質量比。在一些實施例中，LNP中包含的陽離子型脂質與核酸之重量比可為1至20:1、1至15:1、1至10:1、5至20:1、5至15:1、5至10:1、7.5至20:1、7.5至15:1或7.5至10:1。

在一些實施例中，本揭示之LNP可包含20至50重量份之陽離子型脂質、10至30重量份之磷脂、20至60重量份(或20至60重量份)之膽固醇及0.1至10重量份(或0.25至10重量份、0.5至5重量份)之脂質-PEG結合物。或者，LNP可包含以總奈米粒子重量計20至50重量%之陽離子型脂質、10至30重量%之磷脂、20至60重量% (或30至60重量%)之膽固醇及0.1至10重量% (或0.25至10重量%、0.5至5重量%)之脂質-PEG結合物。作為另一替代方案，LNP可包含以總奈米粒子重量計25至50重量%之陽離子型脂質、10至20重量%之磷脂、35至55重量%之膽固醇及0.1至10重量% (或0.25至10重量%、0.5至5重量%)之脂質-PEG結合物。

在一些實施例中，本揭示之LNP的平均直徑為約20至200 nm、20至180 nm、20至170 nm、20至150 nm、20至120 nm、20至100 nm、20至90 nm、30至200 nm、30至180 nm、30至170 nm、30至150 nm、30至120 nm、30至100 nm、30至90 nm、40至200 nm、40至180 nm、40至170 nm、40至150 nm、40至120 nm、40至100 nm、40至90 nm、40至80 nm、40至70 nm、50至200 nm、50至180 nm、50至170 nm、50至150 nm、50至120 nm、50至100 nm、50至90 nm、60至200 nm、60至180 nm、60至170 nm、60至150 nm、60至120 nm、60至100 nm、60至90 nm、70至200 nm、70至180 nm、70至170 nm、70至150 nm、70至120 nm、70至100 nm、70至90 nm、80至200 nm、80至180 nm、80至170 nm、80至150 nm、80至120 nm、80至100 nm、80至90 nm、90至200 nm、90至180 nm、90至170 nm、90至150 nm、90至120 nm或90至100 nm，或前述任一者之中間範圍。

在一些實施例中，本揭示之LNP及/或LNP組合物在酸性pH下具有正電荷且可透過由有效負載(例如治療劑)之負電荷產生之靜電電荷囊封有效負載(例如治療劑，諸如LTRP:gRNA系統，或編碼其之聚核苷酸)。術語「囊封」係指環繞有效負載(例如治療劑)且在生理條件下包埋有效負載(例如治療劑)以形成LNP的脂質之混合物。如本文所用之術語「囊封效率」係經LNP囊封之有效負載(例如治療劑)的量除以用於將有效負載(例如治療劑)裝載至LNP中之有效負載(例如治療劑)的總量。LNP及/或LNP組合物之囊封效率可為70%或更大、75%或更大、80%或更大、85%或更大、90%或更大、91%或更大、92%或更大、94%或更大，或95%或更大。在其他實施例中，LNP及/或LNP組合物之囊封效率為約80%至99%、約85%至98%、約88%至95%、約90%至95%，或有效負載(例如，系統之核酸)可完全囊封在LNP組合物之脂質部分內，由此保護其免被酶降解。在一些實施例中，在37℃下將LNP及/或LNP組合物暴露於核酸酶至少約20、30、45或60分鐘或至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36小時之後，有效負載(例如治療劑)實質上不降解。在一些實施例中，有效負載(例如系統之核酸)與LNP及/或LNP組合物之脂質部分複合。本揭示之LNP及/或LNP組合物對哺乳動物(諸如人類)無毒。

術語「經完全囊封」指示LNP及/或LNP組合物中之有效負載(例如系統之核酸)在暴露於使游離DNA、RNA或蛋白質顯著降解的條件後不會顯著降解。在完全囊封之系統中，LNP及/或LNP組合物中小於約25%、更佳小於約10%且最佳小於約5%的有效負載(例如系統之核酸)係在將降解100%未囊封有效負載之條件下降解。「經完全囊封」亦指示LNP及/或LNP組合物係血清穩定的，且在活體內投與後不分解成其組分部分。

在一些實施例中，囊封有有效負載(例如治療劑)之LNP及/或LNP組合物之量為約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%，或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或前述任一者之中間範圍。

在一些實施例中，囊封於LNP及/或LNP組合物內之有效負載(例如核酸)的量為約30%至約100%、約40%至約100%、約50%至約100%、約60%至約100%、約70%至約100%、約80%至約100%、約90%至約100%、約30%至約95%、約40%至約95%、約50%至約95%、約60%至約95%%、約70%至約95%、約80%至約95%、約85%至約95%、約90%至約95%、約30%至約90%、約40%至約90%、約50%至約90%、約60%至約90%、約70%至約90%、約80%至約90%、或至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或前述任一者之中間範圍。

在一些實施例中，本揭示之核酸，諸如編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA，可提供於溶液中以與脂質溶液混合，使得該等核酸可囊封於脂質奈米粒子中。適合核酸溶液可為含有以各種濃度囊封之核酸的任何水溶液。舉例而言，適合的核酸溶液可含有濃度為或大於約0.01 mg/ml、0.05 mg/ml、0.06 mg/ml、0.07 mg/ml、0.08 mg/ml、0.09 mg/ml、0.1 mg/ml、0.15 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml、1.25 mg/ml、1.5 mg/ml、1.75 mg/ml或2.0 mg/ml之一或多種核酸。在一些實施例中，核酸包含編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA，且適合之mRNA溶液可含有濃度在約0.01至2.0 mg/ml、0.01至1.5 mg/ml、0.01至1.25 mg/ml、0.01至1.0 mg/ml、0.01至0.9 mg/ml、0.01至0.8 mg/ml、0.01至0.7 mg/ml、0.01至0.6 mg/ml、0.01至0.5 mg/ml、0.01至0.4 mg/ml、0.01至0.3 mg/ml、0.01至0.2 mg/ml、0.01至0.1 mg/ml、0.05至1.0 mg/ml、0.05至0.9 mg/ml、0.05至0.8 mg/ml、0.05至0.7 mg/ml、0.05至0.6 mg/ml、0.05至0.5 mg/ml、0.05至0.4 mg/ml、0.05至0.3 mg/ml、0.05至0.2 mg/ml、0.05至0.1 mg/ml、0.1至1.0 mg/ml、0.2至0.9 mg/ml、0.3至0.8 mg/ml、0.4至0.7 mg/ml或0.5至0.6 mg/ml範圍內之mRNA。在一些實施例中，適合的mRNA溶液可含有以下濃度之mRNA：至多約5.0 mg/ml、4.0 mg/ml、3.0 mg/ml、2.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.9 mg/ml、0.8 mg/ml、0.7 mg/ml、0.6 mg/ml、0.5 mg/ml、0.4 mg/ml、0.3 mg/ml、0.2 mg/ml、0.1 mg/ml、0.05 mg/ml、0.04 mg/ml、0.03 mg/ml、0.02 mg/ml、0.01 mg/ml或0.05 mg/ml。在一些實施例中，適合之gRNA溶液可含有以下濃度之gRNA：至多約5.0 mg/ml、4.0 mg/ml、3.0 mg/ml、2.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.9 mg/ml、0.8 mg/ml、0.7 mg/ml、0.6 mg/ml、0.5 mg/ml、0.4 mg/ml、0.3 mg/ml、0.2 mg/ml、0.1 mg/ml、0.05 mg/ml、0.04 mg/ml、0.03 mg/ml、0.02 mg/ml、0.01 mg/ml或0.05 mg/ml。

在一些實施例中，LNP之平均直徑可為20nm至200nm、20至180nm、20nm至170nm、20nm至150nm、20nm至120nm、20nm至100nm、20nm至90nm、30nm至200nm、30至180nm、30nm至170nm、30nm至150nm、30nm至120nm、30nm至100nm、30nm至90nm、40nm至200nm、40至180nm、40nm至170nm、40nm至150nm、40nm至120nm、40nm至100nm、40nm至90nm、40nm至80nm、40nm至70nm、50nm至200nm、50至180nm、50nm至170nm、50nm至150nm、50nm至120nm、50nm至100nm、50nm至90nm、60nm至200nm、60至180nm、60nm至170nm、60nm至150nm、60nm至120nm、60nm至100nm、60nm至90nm、70nm至200nm、70至180nm、70nm至170nm、70nm至150nm、70nm至120nm、70nm至100nm、70nm至90nm、80nm至200nm、80至180nm、80nm至170nm、80nm至150nm、80nm至120nm、80nm至100nm、80nm至90nm、90nm至200nm、90至180nm、90nm至170nm、90nm至150nm、90nm至120nm或90nm至100nm，以便容易引入肝組織、肝細胞及/或LSEC (肝竇內皮細胞)中。可設定LNP之尺寸以容易引入至器官或組織中，包括但不限於肝、肺、心臟、脾，以及引入至腫瘤。當LNP之尺寸小於以上範圍時，可能難以維持穩定性，因為LNP之表面積過度增加，且因此遞送至目標組織及/或藥物作用可能減少。LNP可特異性地靶向肝臟組織。不希望受理論所束縛，認為LNP可用於遞送治療劑之一種機制係透過模擬天然脂蛋白之代謝行為，且因此LNP可透過肝臟進行之脂質代謝過程有效地遞送至個體。在治療劑遞送至肝細胞及/或LSEC (肝竇內皮細胞)期間，自肝竇內腔通向肝細胞及LSEC之孔壁的直徑在哺乳動物中為約140 nm且在人類中為約100 nm，因此當相比於直徑在上述範圍外之LNP時，用於遞送具有直徑在上述範圍內之LNP的治療劑組合物對肝細胞及LSEC可具有極佳遞送效率。

根據一個實例，LNP組合物之LNP可包含在上述範圍內或莫耳比為20至50:10至30:30至60:0.5至5，莫耳比為25至45:10至25:40至50:0.5至3，莫耳比為25至45:10至20:40至55:0.5至3，或莫耳比為25至45:10至20:40至55:1.0至1.5的陽離子型脂質:磷脂:膽固醇:脂質-PEG結合物。包含以上範圍內之莫耳比之組分的LNP可具有對目標器官之細胞具有特異性的治療劑之極佳遞送效率。

在某些態樣中，藉由顯示5至8、5.5至7.5、6至7或6.5至7之pKa，LNP在酸性pH條件下展現正電荷，且可藉由易於經由與治療劑(諸如顯示負電荷之核酸)之靜電相互作用而與核酸形成複合物，高效地囊封核酸。在此類情況下，LNP可有效地用作用於細胞內或活體內遞送治療劑(例如核酸)之組合物。

在本文中，「囊封(encapsulate)」或「囊封(encapsulation)」係指併入治療劑有效遞送，亦即藉由粒子表面環繞治療劑及/或將治療劑嵌入於粒子內部。囊封效率意謂囊封於LNP中之治療劑的含量相對於用於製備LNP之總治療劑含量。

組合物之核酸囊封於LNP中可為組合物中70%或更多、75%或更多、80%或更多、85%或更多、90%或更多、91%或更多、92%或更多、94%或更多、或95%或更多之LNP囊封核酸。在一些實施例中，組合物之核酸囊封於LNP中使得組合物中80%至99%之間、80%至97%之間、80%至95%之間、85%至95%之間、87%至95%之間、90%至95%之間、91%或更高至95%或更低、91%或更高至94%或更低、超過91%至95%或更低、92%至99%、92%至97%之間或92%至95%之間的LNP囊封核酸。在一些實施例中，本揭示之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA完全囊封於LNP中。

藉由LNP遞送核酸的目標器官包括但不限於肝臟、肺、心臟、脾臟以及腫瘤。根據一個實例之LNP為肝臟組織特異性的且具有極佳生物相容性，且可高效地遞送組合物之核酸，因此其可有效地用於相關技術領域，諸如脂質奈米粒子介導之基因療法。在一特定實施例中，藉由根據一個實例之LNP遞送核酸的目標細胞可為活體內肝細胞及/或LSEC。在其他實施例中，本揭示提供經調配用於遞送各實施例之核酸至離體細胞的LNP。

本揭示提供一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含：複數個LNP，其包含核酸，諸如本文所描述的編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA變異體；及醫藥學上可接受之載劑。

在某些實施例中，包含核酸之LNP具有電子緻密核心。

本揭示提供包含一或多種核酸之LNP，其包含：(a)本文所描述之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA變異體；(b)一或多種陽離子型脂質或可離子化陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約50 mol%至約85 mol%；(c)一或多種非陽離子型脂質，其佔LNP中存在之總脂質的約13 mol%至約49.5 mol%；及(d)一或多種抑制LNP聚集之結合脂質，其佔粒子中存在之總脂質的約0.5 mol%至約2 mol%。在另一實施例中，本揭示提供包含一或多種核酸之LNP，其包含：(a)本文所描述之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA變異體；(b)一或多種陽離子型脂質或可離子化陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約22 mol%至約85 mol%；(c)一或多種非陽離子型脂質/磷脂，其佔LNP中存在之總脂質的約10 mol%至約70 mol%；(d) 15 mol%至約50 mol%固醇，及(e)該粒子中1 mol %至約5 mol %脂質-PEG或脂質-PEG-肽。在某些實施例中，長期抑制子融合蛋白mRNA及gRNA可存在於相同核酸-脂質粒子中，或其可存在於不同核酸-脂質粒子中。

本揭示提供包含一或多種核酸之LNP，其包含：(a)編碼本文所描述之長期抑制子融合蛋白之mRNA；(b)陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約52 mol%至約62 mol%；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其佔LNP中存在之總脂質的約36 mol%至約47 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，其佔LNP中存在之總脂質的約1 mol%至約2 mol%。在特定實施例中，調配物為四組分系統，其包含約1.4 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約57.1 mol%陽離子型脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約7.1 mol% DPPC (或DSPC)及約34.3 mol%膽固醇(或其衍生物)。在一些實施例中，LNP包含編碼本文所描述之CasX的mRNA及gRNA。

在其他實施例中，包含一或多種核酸之LNP包含：(a)本文所描述之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA；(b)陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約46.5 mol%至約66.5 mol%；(c)膽固醇或其衍生物，其佔LNP中存在之總脂質的約31.5 mol%至約42.5 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，其佔LNP中存在之總脂質的約1 mol%至約2 mol%。在特定實施例中，調配物為三組分系統，其不含磷脂且包含約1.5 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約61.5 mol%陽離子型脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽及約36.9 mol%膽固醇(或其衍生物)。在一些實施例中，LNP包含編碼本文所描述之CasX的mRNA及gRNA。

額外調配物描述於PCT公開案第WO 2009/127060 號以及美國專利公開案第US 2011/0071208 A1號及第US 2011/0076335 A1號中，該等案之揭示內容以全文引用的方式併入本文中。

在其他實施例中，包含一或多種核酸之LNP包含：(a)本文所描述之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA；(b)一或多種陽離子型脂質或可離子化陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約2 mol%至約50 mol%；(c)一或多種非陽離子型脂質或可離子化陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約5 mol%至約90 mol%；及(d)一或多種抑制粒子聚集之結合脂質，其佔LNP中存在之總脂質的約0.5 mol%至約20 mol%。在一些實施例中，LNP包含編碼本文所描述之CasX的mRNA及gRNA。

在其他實施例中，包含一或多種核酸之LNP包含：(a)本文所描述之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA；(b)陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約30 mol%至約50 mol%；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其佔LNP中存在之總脂質的約47 mol%至約69 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，其佔LNP中存在之總脂質的約1 mol%至約3 mol%。在特定實施例中，調配物為四組分系統，其包含約2 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG2000-C-DMA)、約40 mol%陽離子型脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約10 mol% DPPC (或DSPC)及約48 mol%膽固醇(或其衍生物)。在一些實施例中，LNP包含編碼本文所描述之CasX的mRNA及gRNA。

在其他實施例中，包含一或多種核酸之LNP包含：(a)本文所描述之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA；(b)一或多種陽離子型脂質或可離子化陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約50 mol%至約65 mol%；(c)一或多種非陽離子型脂質或可離子化陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約25 mol%至約45 mol%；及(d)一或多種抑制粒子聚集之結合脂質，其佔LNP中存在之總脂質的約5 mol%至約10 mol%。

在其他實施例中，包含一或多種核酸之LNP包含：(a)本文所描述之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA；(b)陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約50 mol%至約60 mol%；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其佔LNP中存在之總脂質的約35 mol%至約45 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，其佔LNP中存在之總脂質的約5 mol%至約10 mol%。在一些實施例中，LNP包含編碼本文所描述之CasX的mRNA及gRNA。

在某些實施例中，調配物中之非陽離子型脂質混合物包含： (i)佔LNP中存在之總脂質的約10 mol%至約70 mol%的磷脂；(ii)佔LNP中存在之總脂質的約15 mol%至約50 mol%的膽固醇或其衍生物；及1至5%脂質-PEG或脂質-PEG-肽。在特定實施例中，調配物為四組分系統，其包含約7 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG750-C-DMA)、約54 mol%陽離子型脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽、約7 mol% DPPC (或DSPC)及約32 mol%膽固醇(或其衍生物)。

在其他實施例中，包含一或多種核酸之LNP包含： (a)本文所描述之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA；(b)陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約55 mol%至約65 mol%；(c)膽固醇或其衍生物，其佔LNP中存在之總脂質的約30 mol%至約40 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，其佔LNP中存在之總脂質的約5 mol%至約10 mol%。在特定實施例中，調配物為三組分系統，其不含磷脂且包含約7 mol% PEG-脂質結合物(例如PEG750-C-DMA)、約58 mol%陽離子型脂質(例如DLin-K-C2-DMA)或其鹽及約35 mol%膽固醇(或其衍生物)。在一些實施例中，LNP包含編碼本文所描述之CasX的mRNA及gRNA。

在其他實施例中，包含一或多種核酸之LNP包含：(a)本文所描述之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及/或gRNA；(b)陽離子型脂質或其鹽，其佔LNP中存在之總脂質的約48 mol%至約62 mol%；(c)磷脂與膽固醇或其衍生物之混合物，其中磷脂佔LNP中存在之總脂質的約7 mol%至約17 mol%，且其中膽固醇或其衍生物佔LNP中存在之總脂質的約25 mol%至約40 mol%；及(d) PEG-脂質結合物，其佔LNP中存在之總脂質的約0.5 mol%至約3.0 mol%。在一些實施例中，LNP包含編碼本文所描述之CasX的mRNA及gRNA。 IX. 用於抑制PCSK9目標核酸之方法

在另一態樣中，本揭示係關於抑制或緘默化細胞群體中 PCSK9基因之目標核酸序列之轉錄的方法。在一些實施例中，該方法包含使群體之細胞與本揭示之LTRP:gRNA系統在個體中活體外、離體或活體內接觸。本文所提供之系統的可程式化性質允許精確靶向以在 PCSK9基因之目標核酸中之一或多個預定關注區域處達成所需效應。在一些實施例中，可能需要抑制或緘默化細胞中包含引起個體之PCSK9相關疾病或病症之突變的基因。

在一些實施例中，該方法包含向細胞中引入本揭示之長期抑制子融合蛋白及一或多個具有與目標核酸互補之靶向序列的gRNA，其中該長期抑制子融合蛋白能夠與該gRNA複合形成RNP，且其中該RNP能夠結合目標核酸且抑制或緘默化細胞中 PCSK9基因之轉錄(應理解，額外細胞因子可經募集且參與抑制)。在一些實施例中，該方法包含向細胞中引入編碼本揭示之長期融合抑制子蛋白質之mRNA及具有與 PCSK9目標核酸互補之靶向序列的一或多個gRNA，其中長期抑制子融合蛋白質被表現，能夠與gRNA複合以形成RNP，且其中RNP能夠結合目標核酸且抑制或緘默化細胞中 PCSK9基因之轉錄。在一些實施例中，編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA可共調配於奈米粒子中以遞送至群體之細胞。在一些實施例中，編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及gRNA可調配於單獨的奈米粒子中以遞送至群體之細胞。在一些實施例中，奈米粒子係脂質奈米粒子(LNP)，如本文所描述。

在基因轉錄抑制方法之一些實施例中，本揭示之LTRP:gRNA系統可經設計以靶向尋求轉錄抑制之PCSK9基因或基因區域之任何區域或其附近。當要抑制整個 PCSK9基因時，本揭示考慮使用具有與涵蓋或接近轉錄起始位點(TSS)之序列互補之靶向序列的引導物。核心啟動子用作轉錄機構之結合平台，該轉錄機構包含Pol II及其相關通用轉錄因子(GTF) (Haberle, V.等人Eukaryotic core promoters and the functional basis of transcription initiation (Nat Rev Mol Cell Biol. 19(10):621 (2018))。已提出TSS選擇之變化性涉及DNA『蜷縮』及『反蜷縮』，其標誌為：(i) RNA聚合酶前邊緣而非後邊緣相對於DNA之正向及反向移動，及(ii)轉錄泡之膨脹及收縮。在一些實施例中，LTRP:gRNA系統之gRNA之靶向序列與位於 PCSK9基因中之轉錄起始位點(TSS)之1 kb內的目標核酸序列互補。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統之gRNA的靶向序列與位於 PCSK9基因之TSS上游20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp、1 kb或1.5 kb內的目標核酸序列互補。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統之gRNA的靶向序列與位於 PCSK9基因之TSS下游20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp、1 kb或1.5 kb內的目標核酸序列互補。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統之gRNA的靶向序列與位於 PCSK9基因之TSS上游700 bp至下游700 bp、上游500 bp至下游500 bp、上游300 bp至下游300 bp或上游100 bp至下游100 bp內的目標核酸序列互補。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統之gRNA的靶向序列與位於 PCSK9基因之強化子20 bp、50 bp、100 bp、150 bp、200 bp、250 bp、500 bp或1 kb內的目標核酸序列互補。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統之gRNA的靶向序列與位於 PCSK9基因之3'至5'非轉譯區1 kb內的目標核酸序列互補。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統之gRNA的靶向序列與位於 PCSK9基因之開讀框內的目標核酸序列互補。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之外顯子的目標核酸序列互補。在一特定實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之外顯子1的目標核酸序列互補。在該方法之其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之內含子之目標核酸序列互補。在該方法之其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之內含子-外顯子接合點的目標核酸序列互補。在該方法之其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之調控元件的目標核酸序列互補。在該方法之其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之基因間區的序列互補。在該方法之其他實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之外顯子、內含子或調控元件之接合點互補。在靶向序列與調控元件互補之情況下，此等調控元件包括但不限於啟動子區、強化子區、基因間區、5'非轉譯區(5' UTR)、3'非轉譯區(3' UTR)、保守元件及包含順式調控元件之區域。在該方法之一些實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之強化子之1 kb內的基因目標核酸序列互補。在該方法之一些實施例中，本揭示之系統之gRNA的靶向序列與 PCSK9基因之3'非轉譯區內的基因目標核酸序列互補。啟動子區意欲涵蓋編碼序列之起始點之5 kb內的核苷酸，或在基因強化子元件或保守元件的情況下，可與 PCSK9基因之編碼序列相距數千bp、數十萬bp或甚至數百萬bp。在前述內容中，目標為其中目標之編碼 PCSK9基因既定被抑制以使得基因產物在細胞中不表現或表現量較低的彼等目標。在一些實施例中，在本揭示之系統之RNP結合於目標核酸之結合位置後，該系統能夠抑制在RNP之結合位置5'的 PCSK9基因之轉錄。在其他實施例中，在系統之RNP結合於目標核酸之結合位置後，該系統能夠抑制在RNP之結合位置3'的 PCSK9基因之轉錄。

本揭示提供轉錄抑制或緘默化細胞群體中之 PCSK9目標基因的方法。在一些實施例中，用於轉錄抑制或緘默化 PCSK9基因之方法包含使細胞群體與LTRP:gRNA系統接觸，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至14626 (未經修飾之mRNA)及14628至22725 (經N1-甲基-假尿苷修飾之mRNA)組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與LTRP:gRNA系統接觸，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9742至11347、14628至16233及17840至19446組成之群的序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與LTRP:gRNA系統接觸，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9742至11347、14628至16233及17840至19446組成之群的序列。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與LTRP:gRNA系統接觸，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及9742至9750組成之群的序列或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%一致性之序列。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與LTRP:gRNA系統接觸，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及9742至9750組成之群的序列。在一些實施例中，mRNA包含連接至編碼LTRP之mRNA序列之5' UTR的5'的5'帽序列，視情況其中該5'帽具有選自由以下組成之群的核酸序列：m7G(5')ppp(5')mAG、m7G(5′)ppp (5′(A,G(5′)ppp(5′)A及G(5′)ppp(5′)G。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與LTRP:gRNA系統接觸，該LTRP:gRNA系統包含gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列，且該gRNA包含與 PCSK9基因之目標核酸互補的所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 1744之序列及所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含gRNA，其包含SEQ ID NO: 1745之序列及所連接靶向序列。在一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至2544、2672、2675、2694及2714組成之群。在一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714組成之群。在一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1834、1849、1853、1855、1856、1857、1858、1860、1862、1863、1867、1869、1870、1872、1874及1875。在一些實施例中，靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1855、1867及1869組成之群。

在轉錄抑制或緘默化細胞群體中之 PCSK9目標基因之方法的一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含含有序列SEQ ID NO: 1746及所連接靶向序列之gRNA變異體。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含含有一或多個化學修飾之gRNA變異體，包括如下gRNA變異體，其包含選自由SEQ ID NO: 2948至2956、2958至2966及2968至2976組成之群的序列及與取代所列序列之gRNA之3'末端上的20個核苷酸的 PCSK9目標核酸互補之靶向序列。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含有包含SEQ ID NO: 1746之序列且具有化學修飾之gRNA變異體，其視情況包含選自由SEQ ID NO: 2968至2976組成之群的序列，及與取代所列序列之gRNA之3'末端上20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在該方法之一個實施例中，LTRP:gRNA系統包含有包含SEQ ID NO: 1746之序列且具有化學修飾之gRNA變異體，其視情況包含SEQ ID NO: 2968之序列，及與取代所列序列之gRNA之3'末端上20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在一些實施例中，經修飾之gRNA包含選自由SEQ ID NO: 22788至22803組成之群的序列。在一些實施例中，經修飾之gRNA包含選自由SEQ ID NO: 22788至22790組成之群的序列。

在一些實施例中，用於轉錄抑制或緘默化細胞群體中之 PCSK9基因之方法包含使細胞與包含gRNA變異體及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA的LNP接觸。在該方法之一些實施例中，LNP包含選自由SEQ ID NO: 6529至14626及14628至22725組成之群的mRNA序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含有包含選自由SEQ ID NO: 6529至14626及14628至22725組成之群的序列的mRNA。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9742至11347、14628至16233及17840至19446之序列組成之群的mRNA或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列的LNP接觸。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與包含含有選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9742至11347、14628至16233及17840至19446之序列組成之群的序列的mRNA之LNP接觸。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及9742至9750之序列組成之群的mRNA或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%一致性之序列的LNP接觸。在一些實施例中，該方法包含使細胞群體與包含有包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及9742至9750之序列組成之群的序列的mRNA之LNP接觸。在一些實施例中，mRNA進一步包含連接至編碼LTRP之mRNA序列之5' UTR的5'的5'帽序列，視情況其中該5'帽具有選自由以下組成之群的核酸序列：m7G(5')ppp(5')mAG、m7G(5′)ppp (5′(A,G(5′)ppp(5′)A及G(5′)ppp(5′)G。在一些實施例中，mRNA包含5' UTR、3' UTR及/或聚腺苷酸序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含gRNA，該gRNA包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列，且該gRNA包含與 PCSK9基因之目標核酸互補之靶向序列。在方法之一些實施例中，LNP包含具有所連接靶向序列之gRNA變異體174 (SEQ ID NO: 1744)。在該方法之一些實施例中，LNP包含有包含SEQ ID NO: 1745之序列及所連接靶向序列的gRNA。在該方法之一些實施例中，LNP包含有包含SEQ ID NO: 1746之序列及所連接靶向序列的gRNA。在該方法之一些實施例中，LNP包含具有化學修飾之gRNA變異體，其視情況包含SEQ ID NO: 2948至2956、2958至2966及2968至2976之序列，及與取代所列序列之gRNA之3'末端上20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含具有化學修飾之gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 2968至2976組成之群的序列，及與取代所列序列之gRNA之3'末端上20個核苷酸之目標核酸互補的靶向序列。在該方法之一特定實施例中，LNP包含具有化學修飾之gRNA，其包含SEQ ID NO: 2968之序列及與取代所列序列之gRNA之3'末端上20個核苷酸之目標核酸互補的靶向序列。在一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至2544、2672、2675、2694及2714組成之群。在一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1824至1879、1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714。在一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由以下組成之群：SEQ ID NO: 1834、1849、1853、1855、1856、1857、1858、1860、1862、1863、1867、1869、1870、1872、1874及1875。在一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1855、1867及1869組成之群。在該方法之一些實施例中，LNP包含有包含選自由SEQ ID NO: 22788至22803組成之群的序列的經化學修飾之gRNA。在一些實施例中，LNP包含有包含選自由SEQ ID NO: 22788至22790組成之群的序列的經化學修飾之gRNA。

在用於轉錄抑制或緘默化 PCSK9基因之方法的一些實施例中，使細胞群體與實施例之LTRP:gRNA系統接觸使得至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%或至少約80%或更多的細胞之 PCSK9目標核酸受到抑制。在該方法之一些實施例中，群體之細胞中之 PCSK9基因經抑制或緘默化，使得與 PCSK9基因尚未靶向之細胞相比，PCSK9蛋白之表現減少至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。在該方法之一些實施例中，群體之細胞之抑制發生於活體外。在該方法之一些實施例中，群體之細胞之抑制係離體發生。在該方法之一些實施例中，細胞係選自由以下組成之群：嚙齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、靈長類動物細胞及非人類靈長類動物細胞。在該方法之一些實施例中，細胞為人類細胞。

在該方法之一些實施例中，抑制係在將細胞引入個體中之前活體外發生於細胞內部。在一些實施例中，細胞對於個體而言為自體或同種異體的。在該方法之一些實施例中，細胞之抑制係活體內發生於個體中。本文所描述之系統及方法可用於各種與疾病相關之細胞，例如肝臟細胞、腸細胞、腎臟細胞、中樞神經系統細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞或動脈壁細胞，其中 PCSK9基因待受到抑制或緘默化。因此，此方法可用於在患有PCSK9相關病症之個體中應用，該病症諸如(但不限於)體染色體顯性高膽固醇血症(ADH)、高膽固醇血症、總膽固醇水平升高、高脂質血症、低密度脂蛋白(LDL)水平升高、LDL-膽固醇水平升高、高密度脂蛋白水平降低、肝臟脂肪變性、冠心病、缺血、中風、周邊血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、肥胖症、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、神經退化、老年性黃斑部病變(AMD)或其等之組合。

本揭示提供一種用於逆轉由LTRP:gRNA系統引起之抑制的方法。在該方法之一些實施例中，抑制可藉由使用DNMT抑制劑逆轉。在該方法之一些實施例中，抑制可藉由使用DNMT之胞苷類似物抑制劑逆轉。在一些實施例中，抑制可藉由使用選自由以下組成之群的抑制劑逆轉：阿紮胞苷(azacytidine)、地西他濱(decitabine)、氯法拉濱(clofarabine)及澤布拉林(zebularine)。在該方法之一些實施例中，其中抑制之逆轉係在用本揭示之系統治療之個體中發生，該方法包含投與治療有效劑量之DNMT抑制劑。 X. 治療方法

在另一態樣中，本發明係關於使用本揭示之LTRP:gRNA系統治療有需要個體之PCSK9相關疾病或病症之方法。本揭示提供治療有需要個體之PCSK9相關病症之方法，該病症包括(但不限於)體染色體顯性高膽固醇血症(ADH)、高膽固醇血症、總膽固醇水平升高、低密度脂蛋白(LDL)水平升高、高密度脂蛋白水平降低、肝臟脂肪變性、動脈粥樣硬化性心血管疾病及冠狀動脈疾病、缺血、中風、周邊血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高血壓、肥胖症、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、神經退化、老年性黃斑部病變(AMD)或其等之組合。在一些實施例中，本揭示之方法可藉由向個體投與治療有效劑量之本揭示之組合物來預防、治療及/或減輕個體之PCSK9相關病症。在一些實施例中，向個體投與之組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

本文所描述之方法可用於處理個體中與疾病相關之多種細胞(例如肝臟細胞、腸細胞、腎臟細胞、中樞神經系統細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞或動脈壁細胞)，其中 PCSK9基因將被抑制或緘默化。

在一些實施例中，可能需要減少或消除包含突變之個體中的PCSK9蛋白之基因的表現，例如導致高膽固醇血症或家族性或體染色體顯性高膽固醇血症之顯性突變。在一些情況下，個體之 PCSK9基因之一個或兩個對偶基因包含突變。在一些情況下，PCSK9相關疾病或病症突變為功能獲得型突變，包括但不限於編碼選自由以下組成之群的胺基酸取代的突變：相對於SEQ ID NO: 1823之序列的S127R、D129G、F216L、D374H及D374Y。在其他情況下，PCSK9相關病症突變為功能喪失型突變，包括但不限於編碼選自由以下組成之群的胺基酸取代的突變：相對於SEQ ID NO: 1823之序列的R46L、G106R、Y142X、N157K、R237W及C679X。在一些實施例中，可能需要減少或消除膽固醇水平升高之個體中PCSK9蛋白之表現，該膽固醇水平升高並非 PCSK9基因突變之結果。

在一些實施例中，本揭示提供治療有需要個體之PCSK9相關疾病或病症的方法，其包含抑制或緘默化個體之細胞中之 PCSK9基因，該方法包含使該等細胞與治療有效劑量之以下接觸：i) LTRP: gRNA系統，其包含本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白及gRNA；ii)編碼本文所描述之任一實施例之長期抑制子融合蛋白及gRNA之核酸；iii)LNP或合成奈米粒子，其包含本文所描述之任一實施例之gRNA及編碼之長期抑制子融合蛋白之mRNA；iv)包含gRNA之LNP或合成奈米粒子，及包含本文所描述之任一實施例之編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA的LNP或合成奈米粒子；或v) i)至iv)中之兩者或更多者之組合，其中該gRNA所靶向之細胞之目標核酸序列係由長期抑制子融合蛋白抑制或緘默化。

在一些實施例中，本揭示提供一種治療有需要個體之PCSK9相關疾病或病症的方法，其包含投與治療有效劑量之LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至14626及14628至22725之序列組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，本揭示提供一種治療有需要個體之PCSK9相關疾病或病症的方法，其包含投與治療有效劑量之LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至14626及14628至22725之序列組成之群的序列。在一些實施例中，該方法包含投與治療有效劑量之LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9741至11347、14628至16233及17840至19446之序列組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，該方法包含投與治療有效劑量之LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9741至11347、14628至16233及17840至19446之序列組成之群的序列。在一些實施例中，該方法包含投與治療有效劑量之LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及9742至9750之序列組成之群的序列，或與其具有至少約80%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在一些實施例中，該方法包含投與治療有效劑量之LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及9742至9750之序列組成之群的序列。在一些實施例中，mRNA進一步包含連接至編碼LTRP之mRNA序列之5' UTR的5'的5'帽序列，視情況其中該5'帽具有選自由以下組成之群的核酸序列：m7G(5')ppp(5')mAG、m7G(5′)ppp (5′(A,G(5′)ppp(5′)A及G(5′)ppp(5′)G。在一些實施例中，mRNA包含5' UTR、3'UTR、聚腺苷酸或其等之組合。

在治療有需要個體之PCSK9相關疾病或病症之方法的一些實施例中，該方法包含投與治療有效劑量之LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含：gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列，且該gRNA包含與 PCSK9基因之目標核酸互補之所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 1744之序列及所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 1745之序列及所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 1746之序列及所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含具有化學修飾之gRNA變異體，其視情況包含選自由SEQ ID NO: 2948至2956、2958至2966及2968至2976組成之群的序列，及與取代所列序列之gRNA之3'末端上20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含有包含具有化學修飾之SEQ ID NO: 1746之序列的gRNA變異體，其視情況包含選自由SEQ ID NO: 2968至2976組成之群的序列，及與取代所列序列之gRNA之3'末端上20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在該方法之一些實施例中，LTRP:gRNA系統包含有包含具有化學修飾之SEQ ID NO: 1746之序列的gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 2968之序列，及與取代所列序列之gRNA之3'末端上20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在一些實施例中，經化學修飾之gRNA包含選自由SEQ ID NO: 22788至22803組成之群的序列。在該方法之一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至2544、2672、2675、2694及2714組成之群。在該方法之一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至1879、1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714組成之群。在該方法之一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1834、1849、1853、1855、1856、1857、1858、1860、1862、1863、1867、1869、1870、1872、1874及1875組成之群。在該方法之一些實施例中，靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1855、1867及1869組成之群。在一些實施例中，經化學修飾之gRNA包含選自由SEQ ID NO: 22788至22790組成之群的序列。

在治療有需要個體之PCSK9相關疾病或病症之方法的一些實施例中，該方法包含投與治療有效劑量之LNP，該LNP包含LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含具有與 PCSK9基因之目標核酸互補之所連接靶向序列之gRNA及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA。在該方法之一些實施例中，LNP包含mRNA，該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529至14626及14628至22725組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含有包含選自由SEQ ID NO: 6529至14626及14628至22725組成之群的序列的mRNA。在該方法之一些實施例中，LNP包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9741至11347、14628至16233及17840至19446組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含有包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134、9741至11347、14628至16233及17840至19446組成之群的序列的mRNA。在該方法之一些實施例中，LNP包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及9742至9750組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含有包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及9742至9750組成之群的序列的mRNA。在一些實施例中，mRNA進一步包含連接至編碼LTRP之mRNA序列之5' UTR的5'的5'帽序列，視情況其中該5'帽具有選自由以下組成之群的核酸序列：m7G(5')ppp(5')mAG、m7G(5′)ppp (5′(A,G(5′)ppp(5′)A 及G(5′)ppp(5′)G。在一些實施例中，mRNA包含5' UTR、3'UTR、聚腺苷酸或其等之組合。

在一些實施例中，用於 PCSK9基因之轉錄抑制或緘默化之方法包含向個體投與治療有效劑量之LNP，該LNP包含LTRP:gRNA系統，該LTRP:gRNA系統包含：gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746組成之群的序列或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列，且該gRNA包含與 PCSK9基因之目標核酸互補之所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 1744之序列及所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 1745之序列及所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 1746之序列及所連接靶向序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含具有化學修飾之gRNA變異體，其視情況包含選自由SEQ ID NO: 2948至2956、2958至2966及2968至2976組成之群的序列，及與取代所列序列之gRNA的3'末端上之20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在該方法之一些實施例中，LNP包含具有化學修飾之gRNA變異體316，其包含選自由SEQ ID NO: 2968至2976組成之群的序列及與取代所列序列之gRNA的3'末端上之20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在該方法之一個實施例中，LNP包含具有化學修飾之gRNA變異體，其包含SEQ ID NO: 2968之序列及與取代所列序列之gRNA的3'末端上之20個核苷酸之 PCSK9目標核酸互補的靶向序列。在該方法之一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至2544、2672、2675、2694及2714組成之群。在該方法之一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至1879、1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714組成之群。在該方法之一些實施例中，gRNA之靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1834、1849、1853、1855、1856、1857、1858、1860、1862、1863、1867、1869、1870、1872、1874及1875組成之群。在該方法之一些實施例中，靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1855、1867及1869組成之群。在一些實施例中，LNP包含經修飾之gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 22788至22803組成之群的序列。在一些實施例中，LNP包含經修飾之gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 22788至22790組成之群的序列。

在治療有需要個體之PCSK9相關疾病或病症之方法之一些實施例中，該方法導致所靶向器官之至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或更多的細胞中 PCSK9基因之轉錄抑制或緘默化。在該方法之一些實施例中，所靶向器官之細胞中P CSK9基因經抑制，使得PCSK9蛋白質之表現相較於未處理細胞減少至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。經治療個體之細胞可為選自由以下組成之群的細胞：嚙齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞、靈長類動物細胞及非人類靈長類動物細胞。在一些實施例中，經治療個體之真核生物細胞為人類細胞。在一些實施例中，細胞為涉及產生LDL之細胞，包括但不限於肝細胞、或腸細胞、腎臟細胞、中樞神經系統細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、視網膜細胞，或動脈壁(諸如內皮)之細胞。在一些實施例中，細胞為眼細胞。在治療個體之PCSK9相關病症之方法的一些實施例中，個體係選自由小鼠、大鼠、豬、非人類靈長類動物及人類組成之群。

多種治療策略可用於治療患有PCSK9相關病症之個體的方法中。在一些實施例中，本揭示提供治療患有PCSK9相關病症之個體的方法，該方法包含根據包含一或多個連續劑量之治療方案，使用治療有效劑量向該個體投與LTRP:gRNA組合物。在治療方案之一些實施例中，治療有效劑量之組合物係以單次劑量投與。在治療方案之其他實施例中，治療有效劑量係經至少兩週、或至少一個月、或至少兩個月、或至少三個月、或至少四個月、或至少五個月、或至少六個月之時段以兩個或更多個劑量向個體投與。在治療方案之一些實施例中，有效劑量係藉由選自由靜脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌肉內、皮下、眼內及經口途徑組成之群的途徑投與。

在治療方法之一些實施例中，向患有PCSK9相關疾病或病症之個體投與治療有效量之LTRP:gRNA模態(包括包含gRNA及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA的LNP)引起潛在PCSK9相關病症或病症之預防或減輕，使得在個體中觀測到改善，儘管該個體仍可罹患潛在病症。在一些實施例中，投與治療有效量之LTRP:gRNA模態使得至少一個臨床相關終點改善，該至少一個臨床相關終點包括但不限於：LDL-膽固醇相對於基線變化、斑塊動脈粥瘤體積減少、冠狀動脈斑塊減少、動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)減少、心臟血管死亡、非致命心肌梗塞、缺血性中風、非致命中風、冠狀動脈血管再形成、不穩定型心絞痛，或視力。在一些實施例中，投與治療有效量之LTRP:gRNA模態使得至少兩個臨床相關終點改善。在一些實施例中，個體係選自小鼠、大鼠、豬、犬、非人類靈長類動物及人類。

在一些實施例中，治療方法進一步包含投與化學治療劑，其中該藥劑有效降低LDL水平。此類藥劑包括但不限於史他汀(statins)、菸酸、纖維酸酯或抗PCSK9抗體藥物。在一些實施例中，治療個體之PCSK9相關疾病或病症之方法包含用增加肝LDL受體(LDLR)表現之治療劑來預治療個體。在一些實施例中，治療劑為PCSK9抑制劑，諸如單株抗體、基於核酸之藥劑或小分子。例示性治療劑包括但不限於依羅庫單抗(evolocumab)、因利司然(inclisiran)、阿利庫單抗(alirocumab)或MK-0616。不希望受理論或機制束縛，咸信用PCSK9抑制劑預治療可引起肝LDL受體(LDLR)表現增加，其又可促進隨後向個體投與之包含CasX:gRNA組合物之LNP的吸收。藉由增加LNP之肝細胞吸收，預期將增強 PCSK9基因之編輯以使得可獲得PCSK9相關病症之改善。

自用於分析之經治療個體獲得樣本(諸如體液或組織)以測定治療之有效性的方法及製備樣本以允許分析之方法為熟習此項技術者所熟知。RNA及蛋白質水平之分析方法在上文論述且為熟習此項技術者所熟知。治療作用亦可藉由利用此項技術中已知之常規臨床方法量測自與一或多種本揭示之化合物接觸之動物收集的前述流體、組織或器官中之目標基因表現相關之生物標記物來評定。PCSK9病症之生物標記物包括但不限於PCSK9水平、低密度脂蛋白(LDL-膽固醇)、脂蛋白元B、非HDL膽固醇、三酸甘油酯及脂蛋白a、可溶性CD40配位體、骨橋蛋白(OPN)、骨保護素(OPG)、基質金屬蛋白酶(MMP)及骨髓過氧化酶(MPOP)，其中標記物之濃度係與已知生理學上正常濃度或未患PCSK9病症之個體中的濃度相比。

存在表現PCSK9之突變形式之若干小鼠模型且適合於評估治療方法。PCSK9相關病症之轉殖基因小鼠模型包括具有hPCSK9之基因敲入小鼠模型(Carreras, A. In vivogenome and base editing of a human PCSK9 knock-in hypercholesterolemic mouse model. MC Biology 17:4 (2019); Herbert B.等人Increased secretion of lipoproteins in transgenic mice expressing human D374Y PCSK9 under physiological genetic control. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 30(7):1333 (2010))。 XI. 組合物、醫藥組合物、套組及製品

在一些實施例中，本揭示提供包含以下之組合物： i)本揭示之長期抑制子融合蛋白及包含與 PCSK9基因之序列互補之靶向序列的gRNA；ii)一或多種編碼i)之長期抑制子融合蛋白及gRNA之核酸；iii)包含gRNA及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA之LNP或合成奈米粒子，或iv)包含gRNA之LNP或合成奈米粒子及包含編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA的LNP或合成奈米粒子。

在一些實施例中，本揭示提供包含以下之醫藥組合物：i)本揭示之任一實施例之長期抑制子融合蛋白及包含與 PCSK9基因之序列互補之靶向序列的gRNA；ii)一或多種編碼i)之長期抑制子融合蛋白及gRNA之核酸；iii)包含gRNA及編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA之LNP或合成奈米粒子，或iv)包含gRNA之LNP或合成奈米粒子，及包含編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA以及一或多種醫藥學上適合之賦形劑、緩衝劑、稀釋劑或載劑之LNP或合成奈米粒子。在一些實施例中，醫藥組合物經調配以用於選自由靜脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌肉內、皮下、眼內及經口途徑組成之群的投與途徑。在一個實施例中，醫藥組合物呈液體形式或冷凍形式。在另一實施例中，醫藥組合物在用於單次注射之預填充注射器中。在另一實施例中，醫藥組合物呈固體形式，例如醫藥組合物經凍乾。

賦形劑可包括鹽、等張劑、血清蛋白、緩衝劑或其他pH控制劑、抗氧化劑、增稠劑、不帶電聚合物、防腐劑或低溫保護劑。本揭示之組合物中使用之賦形劑可進一步包括等張劑及緩衝劑或其他pH控制劑。可添加此等賦形劑以達到較佳pH值範圍(約6.0至8.0)及容積滲透濃度(約50至400 mmol/L)。適合緩衝劑之實例係乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽及磺酸化有機分子緩衝劑。此等緩衝劑可以0.01至1.0% (w/v)之濃度存在於組合物中。等張劑可選自此項技術中已知之試劑中之任一者，例如甘露糖醇、右旋糖、葡萄糖及氯化鈉，或其他電解質。在一些實施例中，等張劑可為葡萄糖或氯化鈉。等張劑之用量可使組合物具有與引入該組合物之生物環境之滲透壓相同或類似的滲透壓。組合物中等張劑之濃度將取決於所用特定等張劑之性質且可在約0.1%至10%範圍內。當使用葡萄糖時，其較佳以1至5% w/v，更尤其5% w/v之濃度使用。當等張劑為氯化鈉時，其較佳以至多1% w/v，尤其0.9% w/v之量使用。本揭示之組合物可進一步含有防腐劑。防腐劑之實例包括聚六亞甲基-雙胍、苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、穩定之氧氯複合物(諸如稱為Purite®之複合物)、乙酸苯汞、氯丁醇、山梨酸、氯己定(chlorhexidine)、苯甲醇、對羥苯甲酸酯及硫柳汞。通常，此等防腐劑係以約0.001至1.0%之濃度存在。此外，本揭示之組合物亦可含有低溫保存劑。較佳低溫防腐劑為葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、山梨糖醇、膠態二氧化矽、分子量較佳低於100,000 g/mol之聚葡萄糖、甘油及分子量低於100,000 g/mol之聚乙二醇或其混合物。最佳為葡萄糖、海藻糖及聚乙二醇。通常，此等低溫防腐劑以約0.01%至10%之濃度存在。

適用於投與之額外醫藥調配物適用於本文所揭示之方法及組合物中(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences (1990)第18版, Mack Publishing Co., Easton, Pa.; Remington's Pharmaceutical Sciences (2023)第23版, Elsevier Publishing; The Merck Index (1996)第12版，Merck Publishing Group, Whitehouse, N.J.；及Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993))。

在其他實施例中，本文提供套組，其包含本文所描述的LTRP:gRNA系統、聚核苷酸、載體及LNP調配物。在其他實施例中，本文提供套組，其包含長期抑制子融合蛋白及包含與 PCSK9基因之序列互補之靶向序列的本揭示之任一實施例的一個或複數個CasX gRNA。在某些實施例中，本文提供套組，其包含編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及包含與 PCSK9基因目標核酸序列之序列互補之靶向序列的本揭示之任一實施例的一個或複數個gRNA。

在一些實施例中，本文提供套組，其包含囊封編碼長期抑制子融合蛋白之mRNA及包含與 PCSK9基因之序列互補之靶向序列的本揭示之任一實施例的一個或複數個gRNA的LNP調配物。在一些實施例中，mRNA進一步包含連接至mRNA序列之5' UTR的5'的5'帽序列，其中該5'帽具有選自由以下組成之群的核酸序列：m7G(5')ppp(5')mAG、m7G(5′)ppp (5′(A,G(5′)ppp(5′)A 及G(5′)ppp(5′)G。在一些實施例中，套組包含有包含mRNA之第一LNP調配物及包含gRNA之第二LNP調配物。在一些實施例中，mRNA及gRNA囊封於單一LNP調配物中。

在例示性實施例中，本揭示之套組包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6528至14626及14627至22725組成之群的編碼長期抑制子融合蛋白之序列；及gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746及2947至2976組成之群的序列及與 PCSK9基因中之目標核酸互補之連接靶向序列。在一些實施例中，靶向序列係選自由SEQ ID NO: 1824至1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714組成之群。在一些實施例中，本揭示之套組包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6528至14626及14627至22725組成之群的編碼長期抑制子融合蛋白之序列；及經修飾之gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 2278至22803組成之群的序列。在一些實施例中，本揭示之套組包含mRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 6528至14626及14627至22725組成之群的編碼長期抑制子融合蛋白之序列；及經修飾之gRNA，其包含選自由SEQ ID NO: 2278至22790組成之群的序列。

在一些實施例中，套組包含載體，該載體包含編碼本揭示之長期抑制子融合蛋白及gRNA之序列。

在一些實施例中，套組進一步包含緩衝劑、核酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、脂質體、治療劑、標記、標記顯現試劑、使用說明書或前述之任何組合。在一些實施例中，套組進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。

在一些實施例中，套組進一步包含適合容器(例如管、小瓶或盤)。

在一些實施例中，套組包含用於基因抑制應用之適當對照組合物，及使用說明書。

在一些實施例中，本揭示提供用於治療患有PCSK9相關疾病之個體的組合物。在一些實施例中，本揭示提供長期抑制子融合蛋白及gRNA之組合物，其係用於製造用於治療個體之疾病的藥劑。在一些實施例中，本揭示提供包含長期抑制子融合蛋白及gRNA之LNP組合物，其用於製造用於治療個體之疾病的藥劑。

以下實例僅為說明性的且不意欲以任何方式限制本揭示之任何態樣。 實例 實例 1 ： 評估間隔子當與 LTRP5-ADD 分子配對時在人類肝細胞中實現 PCSK9 基因座之抑制

進行實驗以證明多個具有TTC識別模體的間隔子在與含有ADD域的呈組態5之LTRP分子(LTRP5；圖解於圖1)配對時可誘導持久抑制人類細胞中治療相關內源基因座。特定地，在人類Huh7細胞中進行最初概念驗證實驗，以評估展現對非人類靈長類動物(NHP)基因體之序列保守性的間隔子的子集，以識別用於測試未來活體內NHP研究中之主導間隔子。 材料及方法：

用於與含有ADD域之LTRP5分子進行實驗測試之 PCSK9靶向間隔子的計算選擇：

為確定整個人類 PCSK9基因座中之潛在LTRP特異性間隔子，將目標搜尋區域定義為在轉錄起始位點(TSS)上游5 KB起始至轉錄終止位點下游5 KB。基於TTC PAM之可用性確定間隔子；因此，在整個目標 PCSK9基因座中識別出總共1,121個TTC間隔子。隨後此等間隔子在功能上藉由基於彼等定位套疊關鍵基因體特徵而註釋，亦即確定推定之間隔子是否靶向啟動子區內之外顯子、內含子或候選順式-調節元件(cCRE)，及/或與基因變異(例如SNP)之共同位點重疊。為了縮小且確定用於實驗篩選的初始間隔子群組，對所提取的間隔子進行一組過濾準則。首先，藉由移除含有多至一個與中靶(on-target)位點的鹼基對錯配之脫靶(off-target)位點的間隔子來排除非特異性間隔子。此外，排除含有以下單核苷酸重複序列之間隔子：長度超過四個鹼基對(bp)之胸腺嘧啶核苷酸重複序列，或長度超過5 bp之腺嘌呤、鳥嘌呤或胞嘧啶核苷酸重複序列。接著，自此過濾集合排除在間隔子之最後四個核苷酸中具有超過一個含有錯配之脫靶位點之間隔子。最後，排除以在TSS上游＞2KB且在轉錄終止位點下游＞2KB為目標之間隔子。此產生722個TTC間隔子之經過濾集合(SEQ ID NO: 1824至2545)。自此722間隔子之經過濾集合中，選擇TSS-近端(在TSS之上游及下游1100 bp內)之間隔子用於實驗評估，使得鑑別出67個TTC間隔子。另外兩個間隔子TG-06-354及TG-06-352位於1100 bp臨限值窗口之外，亦被選擇包括在其中。所得69個TTC間隔子之序列示於表11中。 表 11 ： 靶向人類 PCSK9 基因座之 69 個 TTC 間隔子之 RNA 序列。粗體間隔子係人類與非人類靈長類動物基因體之間具有序列一致性 (sequence consensus) 的間隔子且在此實例中進行評定

間隔子ID	間隔子RNA 序列	SEQ ID NO:
TG-06-342	AAUUACAGGCAACAGGAAGG	1824
TG-06-343	CCCCAUGUAAGAGAGGAAGU	1825
TG-06-344	CAGUUUCUGCCUCGCCGCGG	1826
TG-06-345	GCCUCGCCGCGGCACAGGUG	1827
TG-06-346	CCCACCUGUGCCGCGGCGAG	1828
TG-06-347	CUCCUUCACCCACCUGUGCC	1829
TG-06-348	AGGCAUUCACUCCUUCACCC	1830
TG-06-349	CUGUGCCUGGUGCAGUUCCC	1831
TG-06-350	GUGUCAUAAAGAAAUUGCCU	1832
TG-06-351	UUAUGACACAGAACUCAUGC	1833
TG-06-001	GAGGAGGACGGCCUGGCCGA	1834
TG-06-002	ACCGCUGCGCCAAGGUGCGG	1835
TG-06-004	GCCAGGCCGUCCUCCUCGGA	1836
TG-06-005	GUGCUCGGGUGCUUCGGCCA	1837
TG-06-117	ACUUUGUUUGCAAAGACCUC	1838
TG-06-118	GAGUGAAAUGGCCUGCUCUG	1839
TG-06-119	GAGCAGGCCAUUUCACUCGG	1840
TG-06-120	CUCGGAAUCUGCUGUGCAUC	1841
TG-06-121	GGAAGGGCUGUCGAUACUGG	1842
TG-06-123	UCCCAGUAUCGACAGCCCUU	1843
TG-06-124	CAGUAUCGACAGCCCUUCCA	1844
TG-06-125	AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU	1845
TG-06-128	AGAAAUCAACUGGACAAGCA	1846
TG-06-131	UGAACAUGGUGUGUAAAAGG	1847
TG-06-132	AGAAGAUUCAAUUUGCAAAG	1848
TG-06-133	AUGGUAGGCACAAGCUCAGC	1849
TG-06-134	GAAUUCUAUGGUAGGCACAA	1850
TG-06-135	GGAAAGCUGAGCUUGUGCCU	1851
TG-06-138	AGGGAUUUAUACUACAAAGA	1852
TG-06-139	AGGAGCAGCUAGUUGGUAAG	1853
TG-06-140	AAACUUAGCCUGGACCCCCU	1854
TG-06-141	ACUGGCCUUAACCUGGCAGC	1855
TG-06-142	UUCCACUGGCCUUAACCUGG	1856
TG-06-143	GAAUCAAUCCUACUGUGGAC	1857
TG-06-144	GUGGGCAGCGAGGAGUCCAC	1858
TG-06-145	UGGGUCCACCUUGUCUCCUG	1859
TG-06-146	GAAGUCUCACUGGUCAGCAG	1860
TG-06-147	GUGUUUCCUGGGUCCACCUU	1861
TG-06-149	AGCCCAGUUAGGAUUUGGGA	1862
TG-06-150	UCCCUCUGCGCGUAAUCUGA	1863
TG-06-151	CUCUGCGCGUAAUCUGACGC	1864
TG-06-152	GCCUCGCCCUCCCCAAACAG	1865
TG-06-153	GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG	1866
TG-06-154	AGGGUGUGGGUGCUUGACGC	1867
TG-06-155	GCAGCGACGUCGAGGCGCUC	1868
TG-06-157	GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU	1869
TG-06-158	GGAGCAGGGCGCGUGAAGGG	1870
TG-06-159	GCGCGCCCCUUCACGCGCCC	1871
TG-06-160	CGCGCCCUGCUCCUGAACUU	1872
TG-06-161	GCUCCUGCACAGUCCUCCCC	1873
TG-06-167	CACUGAAUAGCGCAGCCGCA	1874
TG-06-168	GUGGGAAGGUUCGCGGGGUU	1875
TG-06-169	CGGGGUUGGGAGACCCGGAG	1876
TG-06-170	UCGGCCUCCGGGUCUCCCAA	1877
TG-06-171	CAGUACGUUCCAGGCAUUCA	1878
TG-06-172	GCUGAAACAGAUGGAAUACU	1879
TG-06-249	AAACCAAAUCGGAACCCACU	1880
HS-6-147	UGUUGCCUGUAAUUGGAAUU	1881
HS-6-149	CCUUCCUGUUGCCUGUAAUU	1882
TG-06-122	CCUUUGUUUCUUCCCAGUAU	1883
TG-06-127	UCCUCCUGCCUGGUACACAA	1884
TG-06-137	GAAUGUACCUAUAUGACGUC	1885
TG-06-188	CCCCGGCCUCCCAUCCCUAC	1886
TG-06-243	CUUGGCACGAUCUUGGGGAC	1887
TG-06-250	GAUUUGGUUUGGAAAACAUG	1888
TG-06-251	CUCCAGGCCCUCCACCCUCC	1889
HS-6-159	CACCCCGCCCCUGUCUCGGG	1890
TG-06-354	CCCCUGCCCCUUCAGCUGGU	1925
TG-06-352	UCCCUCACCAAUUACCCCUC	1910

評定PCSK9分泌水平以選擇對非人類靈長類動物基因體具有序列保守性之 PCSK9靶向間隔子：

在經鑑別的69個TTC間隔子中，首先測試展現人類與非人類靈長類動物基因體之間的序列保守性的15個間隔子(表11中之粗體間隔子)以評定其對PCSK9分泌水平之影響。

編碼以下分子之mRNA係藉由內部活體外轉錄(IVT)生成，該內部活體外轉錄係利用CleanCap® AG及N1-甲基-假尿苷進行。隨後，IVT反應受到DNA酶消化及管柱上oligodT純化影響：1)催化活性CasX 676 (如實例2中所描述)、2) dXR1(與ZIM3-KRAB域融合的dCasX)，及3) LTRP5-ADD-ZIM3 (含有ADD域及ZIM3-KRAB域的LTRP5)  CasX 676之DNA及mRNA序列顯示於表19及20中；dXR1之DNA及mRNA序列顯示於表12及13中；LTRP5-ZIM3-ADD之DNA及mRNA序列顯示於表15及16中。

含有靶向 PCSK9基因座之NHP保守間隔子(表11中的粗體間隔子)之gRNA係使用gRNA支架316設計且以化學方式合成。此外， B2M靶向gRNA用作非靶向對照，而間隔子TG-06-138 (亦稱為間隔子6.138；SEQ ID NO: 1852)用於與dXR1配對，且間隔子TG-06-001 (亦稱為間隔子6.1；SEQ ID NO: 1834)用於與CasX 676配對。鑒於並非NHP保守間隔子的間隔子TG-06-157 (亦稱為間隔子6.157；SEQ ID NO: 1869)在持續抑制 PCSK9基因座方面展現出的功效，包括該間隔子作為陽性對照，其顯示於下文實例2中。

為評定PCSK9分泌，用編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及具有支架316及靶向 B2M或 PCSK9基因座之間隔子的gRNA轉染所接種之Huh7細胞。在轉染後6天、18天及36天收集培養基上清液，以藉由ELISA評定PCSK9分泌水平。PCSK9分泌水平係以總細胞計數標準化。作為額外對照，亦量測自含有未經處理之初始細胞之孔收集之培養基上清液中的PCSK9分泌。

在第二個實驗中，使用LTRP5-ADD-ZIM3及具有支架316及靶向B2M或PCSK9基因座之間隔子的gRNA，將來自前一實驗的前16個間隔子經脂質體轉染至初代人類肝細胞(PHH) 中，且在脂質體轉染後6天收集上清液。

將Lonza批次31 (1輪)或271 (2輪)細胞接種至96孔盤中，且使用MessengerMax試劑與高(150 ng)或中等(75 ng)劑量的mRNA+gRNA進行共脂質體轉染。將細胞在培養物保持六天，然後藉由分泌蛋白ELISA及轉錄物RT-qPCR評定PCSK9減弱，總共3輪獨立篩選。收集中等劑量mRNA/gRNA脂質體轉染用於擴增子亞硫酸氫鹽定序。細胞增殖六天，然後對含有34個CpG二核苷酸之PCSK9 TSS近端區(上游約200 bp至下游約150 bp)進行DNA提取及擴增子亞硫酸氫鹽定序。藉由PCSK9轉錄物RT-qPCR (如實例16中所描述)及上清液PCSK9 HTRF ELISA (如實例16中所描述)確認減弱。亦提取總RNA用於RNA-seq以評定特異性。

在第三個實驗中評定抑制之耐久性。將HuH7用高劑量之LTRP5-ADD-ZIM3及具有支架316及靶向B2M或PCSK9基因座之間隔子(代表上述實驗中的11個活性最強的靶向序列)的gRNA在6個重複孔中進行脂質體轉染，每2週使用PCSK9上清液ELISA讀出使細胞在培養物中增殖。在第1週分割的複製盤將n自6增加至12，以供後續讀出。 結果：

在三個時間點對經編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA以及靶向 PCSK9基因座的NHP保守gRNA轉染的Huh7細胞的標準化PCSK9分泌水平的定量顯示於圖2中。資料表明，當與對照條件(亦即初始的未經處理之細胞、經dXR1處理之細胞及經非靶向對照處理之細胞)相比時，使用大部分NHP保守間隔子與LTRP5-ADD-ZIM3引起持續抑制直至轉染後36天(使用靶向B2M基因座之間隔子7.37)。具體而言，與使用間隔子6.1與CasX 676配對所觀測到的PCSK9分泌水平相比較，使用TSS近端間隔子TG-06-147、TG-06-167、TG-06-133、TG-06-146及TG-06-154與LTRP5-ADD-ZIM3配對引起類似或進一步降低的持續抑制水平(圖2)。有趣的是，使用TG-06-352 (其經定位超出此處稱為「TSS-近端」之1100 bp臨限值窗口)亦產生有效抑制(圖2)。類似於實例2中觀測到的發現，用LTRP5-ADD-ZIM3與間隔子6.157處理引起分泌PCSK9水平之持續抑制，而用dXR1及間隔子6.138處理則引起暫態抑制。此外，用三種mRNA分子中之任一者與靶向 B2M基因座之間隔子7.37處理不影響PCSK9分泌(圖2)。

藉由RT-qPCR及ELISA對前16個間隔子序列評定的活性水平證明TG-06-154、TG-06-141及TG-06-157係活性最強之間隔子(表17)。靶向序列TG-06-154藉由ELISA在各輪次及劑量中表現出最高的平均分泌蛋白減弱。PCSK9靶向間隔子引發約40至60%的平均CpG甲基化，但展現出較低的平均CpG甲基化的靶向間隔子TG-06-146及TG-06-142除外(表17)。

抑制之特異性及持久性係定量於表18中。用LTRP5-ADD-ZIM3以及靶向序列TG-06-133、TG-06-139、TG-06-158及TG-06-160進行處理表明，脫靶差異表現基因之數目增加，而靶向序列TG-06-141、TG-06-144、TG-06-154及TG-06-157展現不超過1個差異性表現之脫靶基因。藉由自第1週至第9週的PCSK9減少百分比變化量測之持久性表明，PCSK9靶向間隔子在9週內將抑制維持在初始抑制的約30%之內，但靶向間隔子TG-06-001、TG-06-139及TG-06-150除外(表18)。

此等結果證明遞送編碼具有ADD域的LTRP分子之mRNA與適當的 PCSK9靶向gRNA可引起人類細胞中內源性目標基因座之持續抑制。此外，此等實驗顯示，與非人類靈長類動物物種具有共同序列之若干人類間隔子由於靶向治療相關基因座而實現強表型作用，其支持在利用非人類靈長類動物模型進行臨床前功效研究中此等所選間隔子的潛在用途。 表 12 ： 此實例之實驗 #1 中評定之 dXR1 及 LTRP1-ZIM3 mRNA 分子之編碼序列 *

dXR 或LTRP ID	組分	DNA 序列	SEQ ID NO:
dXR1 (經密碼子最佳化)	5'UTR	AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC	3047
START 密碼子+ NLS + 連接子	ATGGCCCCTAAGAAGAAGCGTAAAGTGAGCCGGGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGCC	3048
dCasX491	CAGGAGATTAAACGGATCAACAAGATCAGAAGAAGACTTGTGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCATGAAAACCCTGCTGGTTAGAGTGATGACACCCGATCTGAGAGAGCGGCTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCTGAAAATATCCCCCAGCCCATCAGCAATACATCTAGAGCCAACCTGAATAAGCTGCTGACCGATTACACCGAAATGAAGAAGGCGATCCTGCATGTGTACTGGGAAGAGTTCCAGAAGGACCCTGTGGGCCTGATGAGCCGGGTGGCCCAGCCTGCCAGCAAGAAGATCGATCAGAACAAGCTGAAACCTGAGATGGACGAGAAGGGCAACCTGACCACCGCCGGCTTTGCCTGCTCTCAGTGTGGCCAGCCCCTGTTCGTGTACAAGCTGGAGCAGGTGTCTGAGAAGGGCAAGGCTTACACCAACTACTTCGGACGGTGCAATGTGGCCGAGCACGAAAAGCTGATCCTGCTGGCCCAGCTGAAGCCCGAGAAGGATAGCGACGAAGCCGTGACATATAGCCTGGGAAAGTTTGGGCAGAGGGCCCTGGATTTCTACAGCATTCATGTGACCAAGGAGTCCACCCACCCCGTGAAGCCCCTGGCCCAGATCGCCGGAAACAGATACGCCTCCGGACCTGTGGGAAAGGCCCTGAGCGACGCATGTATGGGCACAATCGCCTCCTTCCTGTCTAAGTACCAGGACATCATCATCGAACACCAGAAGGTGGTGAAGGGCAACCAGAAGAGACTGGAGAGCCTGCGGGAGCTGGCCGGCAAGGAAAACCTGGAATACCCTAGCGTGACCCTGCCACCTCAGCCTCACACCAAGGAGGGCGTTGATGCCTACAACGAAGTGATCGCCCGGGTGCGAATGTGGGTGAACCTGAACCTGTGGCAGAAGCTGAAGCTAAGCAGAGATGATGCCAAGCCTCTGCTGAGACTGAAGGGATTCCCTTCCTTTCCTCTGGTCGAGAGACAGGCCAACGAAGTGGACTGGTGGGACATGGTGTGTAACGTGAAGAAGCTGATCAACGAGAAAAAGGAGGATGGCAAGGTGTTTTGGCAGAATCTGGCTGGCTACAAGAGACAGGAAGCCCTGAGACCATACCTGAGCAGCGAGGAAGATCGGAAGAAGGGAAAGAAATTCGCTCGGTACCAGCTGGGCGACCTGCTGCTGCACCTGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACTGGGGAAAGGTGTACGACGAGGCCTGGGAGCGGATTGACAAGAAAGTGGAAGGCCTGAGCAAGCACATCAAGCTGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCTGACCGACTGGCTGCGGGCTAAGGCCAGCTTCGTGATCGAGGGCCTGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGTTCTGCAGATGCGAGCTGAAGCTGCAGAAGTGGTACGGGGACCTGCGGGGAAAGCCCTTCGCCATCGAAGCCGAGAACAGCATCCTGGACATCAGCGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGTGCCTTCATCTGGCAGAAGGACGGCGTGAAGAAGCTGAACCTGTACCTGATCATCAACTACTTCAAGGGCGGCAAGCTGCGGTTCAAGAAGATCAAACCTGAAGCCTTCGAAGCCAACAGATTCTACACCGTGATCAACAAAAAGAGCGGCGAGATCGTGCCCATGGAGGTGAACTTCAACTTCGACGACCCCAACCTGATCATCCTGCCTCTGGCCTTTGGCAAGAGACAGGGCAGAGAATTCATCTGGAACGACCTGCTGTCCCTGGAAACCGGCAGCCTGAAGCTGGCCAACGGAAGAGTGATCGAGAAGACACTGTACAACAGAAGAACCCGGCAGGATGAGCCTGCCCTGTTCGTGGCCCTGACCTTCGAGCGGCGGGAGGTCCTGGACTCCTCCAATATCAAACCAATGAACCTGATCGGCGTGGCAAGAGGCGAAAACATCCCCGCCGTGATCGCCCTGACCGACCCCGAGGGCTGCCCACTGAGCCGGTTTAAGGATAGCCTGGGAAACCCAACCCACATCCTGAGAATCGGCGAGAGCTATAAGGAGAAGCAGCGGACCATCCAGGCCAAGAAGGAGGTGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCTACAGCCGGAAGTACGCCAGCAAAGCCAAGAATCTGGCAGACGATATGGTGAGAAACACCGCTAGAGATCTGCTGTACTACGCCGTGACCCAGGATGCCATGCTGATCTTCGCCAACCTGAGCCGGGGCTTCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCTTCATGGCCGAGAGACAGTACACACGGATGGAGGACTGGCTGACCGCCAAGCTGGCCTACGAGGGCCTGAGCAAGACCTACCTGTCCAAGACACTGGCCCAGTACACCTCCAAGACATGCAGCAACTGTGGGTTTACCATCACCAGCGCCGACTACGACAGGGTGCTGGAGAAGCTGAAGAAGACAGCAACAGGCTGGATGACCACAATTAACGGCAAGGAGCTGAAGGTGGAGGGCCAGATTACCTACTACAACAGATACAAGAGACAGAACGTAGTCAAGGACCTGTCCGTCGAGCTGGATAGACTGAGCGAAGAATCTGTGAACAACGACATCTCCTCCTGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCTCTGAGCCTCCTGAAGAAAAGATTCTCCCATAGACCCGTGCAGGAGAAGTTCGTGTGCCTGAACTGCGGCTTCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCTGAACATCGCCAGATCCTGGCTGTTCCTGCGGAGCCAGGAGTACAAGAAATACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGATAAGAGAGCCTTCGTCGAGACCTGGCAGTCCTTTTACCGGAAGAAGCTTAAGGAGGTGTGGAAACCTGCCGTG	3049
連接子+ 緩衝序列	CGGTCTGGCGGATCTGGCGGAGGCTCCACAAGC	3050
ZIM3-KRAB	ATGAACAACTCCCAGGGCAGAGTGACCTTCGAGGACGTGACCGTGAATTTTACACAGGGAGAGTGGCAGAGACTGAACCCCGAGCAGAGAAACCTGTACCGGGATGTGATGCTGGAAAACTACAGCAATCTGGTGTCCGTGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCTGACGTGATCCTGCGTCTGGAGCAGGGCAAGGAACCCTGGCTGGAGGAGGAGGAGGTGCTGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACATCGGCGGACAGATCTGGAAGCCTAAGGACGTGAAAGAAAGCCTG	3051
緩衝序列 + NLS	ACCAGCCCCAAGAAAAAGAGAAAAGTC	3052
標誌	GACTACAAGGATGACGATGACAAGGACTACAAGGATGACGACGACAAG	3053
STOP 密碼子+ 緩衝序列	TAATAGATAAGCGGCCGCTTAATTAA	3054
3'UTR	GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG	3055
緩衝序列	TCTAG	3056
聚腺苷酸尾	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3057
LTRP1 (經密碼子最佳化)	5'UTR	AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC	3047
START 密碼子+ NLS + 緩衝序列 + 連接子	ATGGCCCCTAAGAAGAAGCGTAAAGTGAGCCGGGTGAACGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGC	3058
START 密碼子+ DNMT3A催化域	ATGAACCACGACCAGGAGTTCGACCCCCCTAAGGTGTACCCTCCCGTCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCATCCGGGTCCTGAGCCTGTTCGATGGCATCGCCACCGGTCTGCTGGTGCTGAAGGACCTGGGCATCCAGGTGGATAGGTACATTGCCTCCGAGGTGTGCGAGGACTCCATCACCGTGGGAATGGTGCGTCATCAGGGCAAGATCATGTACGTGGGCGACGTGCGGAGCGTGACACAGAAGCATATCCAGGAGTGGGGCCCTTTCGACCTGGTGATCGGCGGCAGCCCTTGCAATGACCTGAGCATCGTGAACCCAGCCCGGAAGGGCCTGTACGAGGGAACCGGCAGACTGTTCTTCGAGTTTTACAGACTGCTGCACGACGCCCGGCCTAAGGAAGGCGACGACCGGCCCTTCTTTTGGCTGTTCGAGAATGTGGTGGCCATGGGAGTCAGCGACAAGCGGGATATTAGCCGGTTCCTGGAGAGCAACCCCGTGATGATCGATGCCAAGGAAGTGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGATACTTCTGGGGCAATCTGCCTGGCATGAACAGACCCCTGGCCAGCACCGTGAACGACAAGCTGGAGCTGCAGGAGTGCCTGGAGCACGGCCGGATCGCCAAGTTCAGCAAGGTGAGAACCATCACCACCCGAAGCAACAGCATCAAACAAGGCAAGGACCAGCACTTTCCTGTGTTCATGAACGAGAAGGAGGACATCCTGTGGTGTACCGAGATGGAGAGAGTGTTCGGGTTCCCAGTCCACTACACAGATGTCAGCAACATGTCTAGACTGGCCAGACAGAGACTGCTGGGAAGAAGCTGGTCCGTCCCTGTGATCAGACACCTGTTCGCCCCTCTGAAGGAGTACTTCGCCTGCGTG	3059
連接子	AGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCTTCTCTAGCGGCCTGGTGCCACTGTCCCTGAGAGGGAGCCAC	3060
DNMT3L相互作用域	ATGGGCCCCATGGAGATCTACAAAACCGTGAGCGCCTGGAAGCGGCAGCCTGTGCGCGTGCTGAGCCTGTTTCGGAATATCGATAAAGTCCTGAAAAGCCTGGGATTCCTGGAGAGCGGCTCTGGCTCCGGCGGTGGCACCCTGAAGTACGTGGAGGATGTGACAAACGTGGTCAGACGGGATGTGGAGAAGTGGGGCCCCTTCGATCTGGTGTACGGCAGCACCCAACCCCTGGGCAGCTCTTGTGACCGGTGCCCTGGCTGGTACATGTTTCAGTTCCACCGGATCCTGCAGTACGCCCTGCCGAGACAGGAGTCCCAGCGGCCATTCTTTTGGATTTTCATGGACAACTTGCTGCTGACCGAGGATGACCAGGAAACTACCACTCGGTTCCTGCAGACCGAAGCCGTGACCCTGCAGGACGTGAGAGGCCGGGACTACCAGAACGCCATGCGGGTGTGGTCCAACATCCCTGGACTGAAAAGCAAGCACGCACCTCTGACCCCTAAAGAAGAGGAGTACCTGCAGGCCCAGGTGCGGAGCAGAAGCAAGCTGGACGCCCCTAAGGTGGATCTGCTGGTGAAGAATTGCCTCCTGCCCCTGAGAGAGTACTTCAAGTATTTCAGCCAGAATAGTCTGCCCCTG	3061
連接子	GGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCTCCTCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCTCCCCAACCTCTACCGAGGAGGGCACCTCTGAGTCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCTGGCACCTCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCTGCCGGCAGCCCCACCTCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCTAGTGAGGGCGGCTCTGGCGGCGGCAGCGCC	3062
dCasX491	CAGGAGATTAAACGGATCAACAAGATCAGAAGAAGACTTGTGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCATGAAAACCCTGCTGGTTAGAGTGATGACACCCGATCTGAGAGAGCGGCTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCTGAAAATATCCCCCAGCCCATCAGCAATACATCTAGAGCCAACCTGAATAAGCTGCTGACCGATTACACCGAAATGAAGAAGGCGATCCTGCATGTGTACTGGGAAGAGTTCCAGAAGGACCCTGTGGGCCTGATGAGCCGGGTGGCCCAGCCTGCCAGCAAGAAGATCGATCAGAACAAGCTGAAACCTGAGATGGACGAGAAGGGCAACCTGACCACCGCCGGCTTTGCCTGCTCTCAGTGTGGCCAGCCCCTGTTCGTGTACAAGCTGGAGCAGGTGTCTGAGAAGGGCAAGGCTTACACCAACTACTTCGGACGGTGCAATGTGGCCGAGCACGAAAAGCTGATCCTGCTGGCCCAGCTGAAGCCCGAGAAGGATAGCGACGAAGCCGTGACATATAGCCTGGGAAAGTTTGGGCAGAGGGCCCTGGATTTCTACAGCATTCATGTGACCAAGGAGTCCACCCACCCCGTGAAGCCCCTGGCCCAGATCGCCGGAAACAGATACGCCTCCGGACCTGTGGGAAAGGCCCTGAGCGACGCATGTATGGGCACAATCGCCTCCTTCCTGTCTAAGTACCAGGACATCATCATCGAACACCAGAAGGTGGTGAAGGGCAACCAGAAGAGACTGGAGAGCCTGCGGGAGCTGGCCGGCAAGGAAAACCTGGAATACCCTAGCGTGACCCTGCCACCTCAGCCTCACACCAAGGAGGGCGTTGATGCCTACAACGAAGTGATCGCCCGGGTGCGAATGTGGGTGAACCTGAACCTGTGGCAGAAGCTGAAGCTAAGCAGAGATGATGCCAAGCCTCTGCTGAGACTGAAGGGATTCCCTTCCTTTCCTCTGGTCGAGAGACAGGCCAACGAAGTGGACTGGTGGGACATGGTGTGTAACGTGAAGAAGCTGATCAACGAGAAAAAGGAGGATGGCAAGGTGTTTTGGCAGAATCTGGCTGGCTACAAGAGACAGGAAGCCCTGAGACCATACCTGAGCAGCGAGGAAGATCGGAAGAAGGGAAAGAAATTCGCTCGGTACCAGCTGGGCGACCTGCTGCTGCACCTGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACTGGGGAAAGGTGTACGACGAGGCCTGGGAGCGGATTGACAAGAAAGTGGAAGGCCTGAGCAAGCACATCAAGCTGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCTGACCGACTGGCTGCGGGCTAAGGCCAGCTTCGTGATCGAGGGCCTGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGTTCTGCAGATGCGAGCTGAAGCTGCAGAAGTGGTACGGGGACCTGCGGGGAAAGCCCTTCGCCATCGAAGCCGAGAACAGCATCCTGGACATCAGCGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGTGCCTTCATCTGGCAGAAGGACGGCGTGAAGAAGCTGAACCTGTACCTGATCATCAACTACTTCAAGGGCGGCAAGCTGCGGTTCAAGAAGATCAAACCTGAAGCCTTCGAAGCCAACAGATTCTACACCGTGATCAACAAAAAGAGCGGCGAGATCGTGCCCATGGAGGTGAACTTCAACTTCGACGACCCCAACCTGATCATCCTGCCTCTGGCCTTTGGCAAGAGACAGGGCAGAGAATTCATCTGGAACGACCTGCTGTCCCTGGAAACCGGCAGCCTGAAGCTGGCCAACGGAAGAGTGATCGAGAAGACACTGTACAACAGAAGAACCCGGCAGGATGAGCCTGCCCTGTTCGTGGCCCTGACCTTCGAGCGGCGGGAGGTCCTGGACTCCTCCAATATCAAACCAATGAACCTGATCGGCGTGGCAAGAGGCGAAAACATCCCCGCCGTGATCGCCCTGACCGACCCCGAGGGCTGCCCACTGAGCCGGTTTAAGGATAGCCTGGGAAACCCAACCCACATCCTGAGAATCGGCGAGAGCTATAAGGAGAAGCAGCGGACCATCCAGGCCAAGAAGGAGGTGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCTACAGCCGGAAGTACGCCAGCAAAGCCAAGAATCTGGCAGACGATATGGTGAGAAACACCGCTAGAGATCTGCTGTACTACGCCGTGACCCAGGATGCCATGCTGATCTTCGCCAACCTGAGCCGGGGCTTCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCTTCATGGCCGAGAGACAGTACACACGGATGGAGGACTGGCTGACCGCCAAGCTGGCCTACGAGGGCCTGAGCAAGACCTACCTGTCCAAGACACTGGCCCAGTACACCTCCAAGACATGCAGCAACTGTGGGTTTACCATCACCAGCGCCGACTACGACAGGGTGCTGGAGAAGCTGAAGAAGACAGCAACAGGCTGGATGACCACAATTAACGGCAAGGAGCTGAAGGTGGAGGGCCAGATTACCTACTACAACAGATACAAGAGACAGAACGTAGTCAAGGACCTGTCCGTCGAGCTGGATAGACTGAGCGAAGAATCTGTGAACAACGACATCTCCTCCTGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCTCTGAGCCTCCTGAAGAAAAGATTCTCCCATAGACCCGTGCAGGAGAAGTTCGTGTGCCTGAACTGCGGCTTCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCTGAACATCGCCAGATCCTGGCTGTTCCTGCGGAGCCAGGAGTACAAGAAATACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGATAAGAGAGCCTTCGTCGAGACCTGGCAGTCCTTTTACCGGAAGAAGCTTAAGGAGGTGTGGAAACCTGCCGTG	3049
連接子	CGGTCTGGCGGATCTGGCGGAGGCTCCACAAGC	3050
ZIM3-KRAB	ATGAACAACTCCCAGGGCAGAGTGACCTTCGAGGACGTGACCGTGAATTTTACACAGGGAGAGTGGCAGAGACTGAACCCCGAGCAGAGAAACCTGTACCGGGATGTGATGCTGGAAAACTACAGCAATCTGGTGTCCGTGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCTGACGTGATCCTGCGTCTGGAGCAGGGCAAGGAACCCTGGCTGGAGGAGGAGGAGGTGCTGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACATCGGCGGACAGATCTGGAAGCCTAAGGACGTGAAAGAAAGCCTG	3051
緩衝序列 + NLS	ACCAGCCCCAAGAAAAAGAGAAAAGTC	3052
標誌	GACTACAAGGATGACGATGACAAGGACTACAAGGATGACGACGACAAG	3053
STOP 密碼子+ 緩衝序列	TAATAGATAAGCGGCCGCTTAATTAA	3054
3'UTR	GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG	3055
緩衝序列	TCTAG	3056
聚腺苷酸尾	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3057

*各組分以在構築體內之5'至3'次序列出 表 13 ： 此實例之實驗 #1 中評定之 dXR1 及 LTRP1-ZIM3 mRNA 分子之全長 RNA 序列 。修飾『 mψ 』 = N1- 甲基 - 假尿苷

dXR 或LTRP ID	RNA 序列	SEQ ID NO:
dXR1	AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψAAGAAGAAGCGmψAAAGmψGAGCCGGGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCGCCCAGGAGAmψmψAAACGGAmψCAACAAGAmψCAGAAGAAGACmψmψGmψGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψGGmψmψAGAGmψGAmψGACACCCGAmψCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAAAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAAmψACAmψCmψAGAGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGAmψmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCGAmψCCmψGCAmψGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAGGACCCmψGmψGGGCCmψGAmψGAGCCGGGmψGGCCCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAACCmψGAGAmψGGACGAGAAGGGCAACCmψGACCACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCCCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAGCAGGmψGmψCmψGAGAAGGGCAAGGCmψmψACACCAACmψACmψmψCGGACGGmψGCAAmψGmψGGCCGAGCACGAAAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCCGAGAAGGAmψAGCGACGAAGCCGmψGACAmψAmψAGCCmψGGGAAAGmψmψmψGGGCAGAGGGCCCmψGGAmψmψmψCmψACAGCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAGmψCCACCCACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCCCAGAmψCGCCGGAAACAGAmψACGCCmψCCGGACCmψGmψGGGAAAGGCCCmψGAGCGACGCAmψGmψAmψGGGCACAAmψCGCCmψCCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAACACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGGGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAAmψACCCmψAGCGmψGACCCmψGCCACCmψCAGCCmψCACACCAAGGAGGGCGmψmψGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGAAmψGmψGGGmψGAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψAAGCAGAGAmψGAmψGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGAmψmψCCCmψmψCCmψmψmψCCmψCmψGGmψCGAGAGACAGGCCAACGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAAAAGGAGGAmψGGCAAGGmψGmψmψmψmψGGCAGAAmψCmψGGCmψGGCmψACAAGAGACAGGAAGCCCmψGAGACCAmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGAmψCGGAAGAAGGGAAAGAAAmψmψCGCmψCGGmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGAAAGGmψGmψACGACGAGGCCmψGGGAGCGGAmψmψGACAAGAAAGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGCGGGCmψAAGGCCAGCmψmψCGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGGGACCmψGCGGGGAAAGCCCmψmψCGCCAmψCGAAGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGmψGCCmψmψCAmψCmψGGCAGAAGGACGGCGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψACmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCmψGAAGCCmψmψCGAAGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGAGCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAGGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψmψGGCAAGAGACAGGGCAGAGAAmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCCCmψGGAAACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGAAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGAAGAACCCGGCAGGAmψGAGCCmψGCCCmψGmψmψCGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGCGGCGGGAGGmψCCmψGGACmψCCmψCCAAmψAmψCAAACCAAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCAAGAGGCGAAAACAmψCCCCGCCGmψGAmψCGCCCmψGACCGACCCCGAGGGCmψGCCCACmψGAGCCGGmψmψmψAAGGAmψAGCCmψGGGAAACCCAACCCACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψAmψAAGGAGAAGCAGCGGACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCmψACAGCCGGAAGmψACGCCAGCAAAGCCAAGAAmψCmψGGCAGACGAmψAmψGGmψGAGAAACACCGCmψAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACCCAGGAmψGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCCAACCmψGAGCCGGGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACACGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACACmψGGCCCAGmψACACCmψCCAAGACAmψGCAGCAACmψGmψGGGmψmψmψACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGGGmψGCmψGGAGAAGCmψGAAGAAGACAGCAACAGGCmψGGAmψGACCACAAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψmψACCmψACmψACAACAGAmψACAAGAGACAGAACGmψAGmψCAAGGACCmψGmψCCGmψCGAGCmψGGAmψAGACmψGAGCGAAGAAmψCmψGmψGAACAACGACAmψCmψCCmψCCmψGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCmψCmψGAGCCmψCCmψGAAGAAAAGAmψmψCmψCCCAmψAGACCCGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCAGAmψCCmψGGCmψGmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAAmψACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGAmψAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGmψCCmψmψmψmψACCGGAAGAAGCmψmψAAGGAGGmψGmψGGAAACCmψGCCGmψGCGGmψCmψGGCGGAmψCmψGGCGGAGGCmψCCACAAGCAmψGAACAACmψCCCAGGGCAGAGmψGACCmψmψCGAGGACGmψGACCGmψGAAmψmψmψmψACACAGGGAGAGmψGGCAGAGACmψGAACCCCGAGCAGAGAAACCmψGmψACCGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAAAACmψACAGCAAmψCmψGGmψGmψCCGmψGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCmψGACGmψGAmψCCmψGCGmψCmψGGAGCAGGGCAAGGAACCCmψGGCmψGGAGGAGGAGGAGGmψGCmψGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAmψCGGCGGACAGAmψCmψGGAAGCCmψAAGGACGmψGAAAGAAAGCCmψGACCAGCCCCAAGAAAAAGAGAAAAGmψCGACmψACAAGGAmψGACGAmψGACAAGGACmψACAAGGAmψGACGACGACAAGmψAAmψAGAmψAAGCGGCCGCmψmψAAmψmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψcmψagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa	3063
LTRP1	AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψAAGAAGAAGCGmψAAAGmψGAGCCGGGmψGAACGGCAGCGGCAGCGGCGGCGGCAmψGAACCACGACCAGGAGmψmψCGACCCCCCmψAAGGmψGmψACCCmψCCCGmψCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCAmψCCGGGmψCCmψGAGCCmψGmψmψCGAmψGGCAmψCGCCACCGGmψCmψGCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAGGmψGGAmψAGGmψACAmψmψGCCmψCCGAGGmψGmψGCGAGGACmψCCAmψCACCGmψGGGAAmψGGmψGCGmψCAmψCAGGGCAAGAmψCAmψGmψACGmψGGGCGACGmψGCGGAGCGmψGACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCmψmψmψCGACCmψGGmψGAmψCGGCGGCAGCCCmψmψGCAAmψGACCmψGAGCAmψCGmψGAACCCAGCCCGGAAGGGCCmψGmψACGAGGGAACCGGCAGACmψGmψmψCmψmψCGAGmψmψmψmψACAGACmψGCmψGCACGACGCCCGGCCmψAAGGAAGGCGACGACCGGCCCmψmψCmψmψmψmψGGCmψGmψmψCGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGAGmψCAGCGACAAGCGGGAmψAmψmψAGCCGGmψmψCCmψGGAGAGCAACCCCGmψGAmψGAmψCGAmψGCCAAGGAAGmψGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGAmψACmψmψCmψGGGGCAAmψCmψGCCmψGGCAmψGAACAGACCCCmψGGCCAGCACCGmψGAACGACAAGCmψGGAGCmψGCAGGAGmψGCCmψGGAGCACGGCCGGAmψCGCCAAGmψmψCAGCAAGGmψGAGAACCAmψCACCACCCGAAGCAACAGCAmψCAAACAAGGCAAGGACCAGCACmψmψmψCCmψGmψGmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGmψACCGAGAmψGGAGAGAGmψGmψmψCGGGmψmψCCCAGmψCCACmψACACAGAmψGmψCAGCAACAmψGmψCmψAGACmψGGCCAGACAGAGACmψGCmψGGGAAGAAGCmψGGmψCCGmψCCCmψGmψGAmψCAGACACCmψGmψmψCGCCCCmψCmψGAAGGAGmψACmψmψCGCCmψGCGmψGAGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCmψmψCmψCmψAGCGGCCmψGGmψGCCACmψGmψCCCmψGAGAGGGAGCCACAmψGGGCCCCAmψGGAGAmψCmψACAAAACCGmψGAGCGCCmψGGAAGCGGCAGCCmψGmψGCGCGmψGCmψGAGCCmψGmψmψmψCGGAAmψAmψCGAmψAAAGmψCCmψGAAAAGCCmψGGGAmψmψCCmψGGAGAGCGGCmψCmψGGCmψCCGGCGGmψGGCACCCmψGAAGmψACGmψGGAGGAmψGmψGACAAACGmψGGmψCAGACGGGAmψGmψGGAGAAGmψGGGGCCCCmψmψCGAmψCmψGGmψGmψACGGCAGCACCCAACCCCmψGGGCAGCmψCmψmψGmψGACCGGmψGCCCmψGGCmψGGmψACAmψGmψmψmψCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψACGCCCmψGCCGAGACAGGAGmψCCCAGCGGCCAmψmψCmψmψmψmψGGAmψmψmψmψCAmψGGACAACmψmψGCmψGCmψGACCGAGGAmψGACCAGGAAACmψACCACmψCGGmψmψCCmψGCAGACCGAAGCCGmψGACCCmψGCAGGACGmψGAGAGGCCGGGACmψACCAGAACGCCAmψGCGGGmψGmψGGmψCCAACAmψCCCmψGGACmψGAAAAGCAAGCACGCACCmψCmψGACCCCmψAAAGAAGAGGAGmψACCmψGCAGGCCCAGGmψGCGGAGCAGAAGCAAGCmψGGACGCCCCmψAAGGmψGGAmψCmψGCmψGGmψGAAGAAmψmψGCCmψCCmψGCCCCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψCAGCCAGAAmψAGmψCmψGCCCCmψGGGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCmψCCmψCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCmψCCCCAACCmψCmψACCGAGGAGGGCACCmψCmψGAGmψCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCmψGGCACCmψCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCmψGCCGGCAGCCCCACCmψCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCmψAGmψGAGGGCGGCmψCmψGGCGGCGGCAGCGCCCAGGAGAmψmψAAACGGAmψCAACAAGAmψCAGAAGAAGACmψmψGmψGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψGGmψmψAGAGmψGAmψGACACCCGAmψCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAAAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAAmψACAmψCmψAGAGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGAmψmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCGAmψCCmψGCAmψGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAGGACCCmψGmψGGGCCmψGAmψGAGCCGGGmψGGCCCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAACCmψGAGAmψGGACGAGAAGGGCAACCmψGACCACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCCCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAGCAGGmψGmψCmψGAGAAGGGCAAGGCmψmψACACCAACmψACmψmψCGGACGGmψGCAAmψGmψGGCCGAGCACGAAAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCCGAGAAGGAmψAGCGACGAAGCCGmψGACAmψAmψAGCCmψGGGAAAGmψmψmψGGGCAGAGGGCCCmψGGAmψmψmψCmψACAGCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAGmψCCACCCACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCCCAGAmψCGCCGGAAACAGAmψACGCCmψCCGGACCmψGmψGGGAAAGGCCCmψGAGCGACGCAmψGmψAmψGGGCACAAmψCGCCmψCCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAACACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGGGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAAmψACCCmψAGCGmψGACCCmψGCCACCmψCAGCCmψCACACCAAGGAGGGCGmψmψGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGAAmψGmψGGGmψGAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψAAGCAGAGAmψGAmψGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGAmψmψCCCmψmψCCmψmψmψCCmψCmψGGmψCGAGAGACAGGCCAACGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAAAAGGAGGAmψGGCAAGGmψGmψmψmψmψGGCAGAAmψCmψGGCmψGGCmψACAAGAGACAGGAAGCCCmψGAGACCAmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGAmψCGGAAGAAGGGAAAGAAAmψmψCGCmψCGGmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGAAAGGmψGmψACGACGAGGCCmψGGGAGCGGAmψmψGACAAGAAAGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGCGGGCmψAAGGCCAGCmψmψCGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGGGACCmψGCGGGGAAAGCCCmψmψCGCCAmψCGAAGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGmψGCCmψmψCAmψCmψGGCAGAAGGACGGCGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψACmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCmψGAAGCCmψmψCGAAGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGAGCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAGGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψmψGGCAAGAGACAGGGCAGAGAAmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCCCmψGGAAACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGAAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGAAGAACCCGGCAGGAmψGAGCCmψGCCCmψGmψmψCGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGCGGCGGGAGGmψCCmψGGACmψCCmψCCAAmψAmψCAAACCAAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCAAGAGGCGAAAACAmψCCCCGCCGmψGAmψCGCCCmψGACCGACCCCGAGGGCmψGCCCACmψGAGCCGGmψmψmψAAGGAmψAGCCmψGGGAAACCCAACCCACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψAmψAAGGAGAAGCAGCGGACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCmψACAGCCGGAAGmψACGCCAGCAAAGCCAAGAAmψCmψGGCAGACGAmψAmψGGmψGAGAAACACCGCmψAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACCCAGGAmψGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCCAACCmψGAGCCGGGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACACGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACACmψGGCCCAGmψACACCmψCCAAGACAmψGCAGCAACmψGmψGGGmψmψmψACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGGGmψGCmψGGAGAAGCmψGAAGAAGACAGCAACAGGCmψGGAmψGACCACAAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψmψACCmψACmψACAACAGAmψACAAGAGACAGAACGmψAGmψCAAGGACCmψGmψCCGmψCGAGCmψGGAmψAGACmψGAGCGAAGAAmψCmψGmψGAACAACGACAmψCmψCCmψCCmψGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCmψCmψGAGCCmψCCmψGAAGAAAAGAmψmψCmψCCCAmψAGACCCGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCAGAmψCCmψGGCmψGmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAAmψACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGAmψAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGmψCCmψmψmψmψACCGGAAGAAGCmψmψAAGGAGGmψGmψGGAAACCmψGCCGmψGCGGmψCmψGGCGGAmψCmψGGCGGAGGCmψCCACAAGCAmψGAACAACmψCCCAGGGCAGAGmψGACCmψmψCGAGGACGmψGACCGmψGAAmψmψmψmψACACAGGGAGAGmψGGCAGAGACmψGAACCCCGAGCAGAGAAACCmψGmψACCGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAAAACmψACAGCAAmψCmψGGmψGmψCCGmψGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCmψGACGmψGAmψCCmψGCGmψCmψGGAGCAGGGCAAGGAACCCmψGGCmψGGAGGAGGAGGAGGmψGCmψGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAmψCGGCGGACAGAmψCmψGGAAGCCmψAAGGACGmψGAAAGAAAGCCmψGACCAGCCCCAAGAAAAAGAGAAAAGmψCGACmψACAAGGAmψGACGAmψGACAAGGACmψACAAGGAmψGACGACGACAAGmψAAmψAGAmψAAGCGGCCGCmψmψAAmψmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψcmψagaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa	3064

表 14 ： 此實例之實驗 #1 中評定之 dXR1 及 LTRP1-ZIM3 分子之全長蛋白序列

dXR 或LTRP ID	AA 序列	SEQ ID NO:
dXR1	MAPKKKRKVSRGGSGGGSAQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSMNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLTSPKKKRKV	3065
LTRP1	MAPKKKRKVSRVNGSGSGGGMNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGGSGGGSAQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSMNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLTSPKKKRKV	3066

表 15 ： 此實例中評定之 LTRP5-ZIM3 及 LTRP5-ZIM3-ADD mRNA 分子之編碼 DNA 及 RNA 序列 *

LTRP 分子	組分	DNA 序列	SEQ ID NO	RNA 序列	SEQ ID NO
LTRP5-ZIM3	5'UTR	AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC	3047	AAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC	3115
START 密碼子+ NLS + 連接子	ATGGCCCCTAAGAAGAAGCGTAAAGTGAGCCGG	3104	AUGGCCCCUAAGAAGAAGCGUAAAGUGAGCCGG	3116
START 密碼子+ DNMT3A催化域	參見表 12 中之序列	3059	AUGAACCACGACCAGGAGUUCGACCCCCCUAAGGUGUACCCUCCCGUCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCAUCCGGGUCCUGAGCCUGUUCGAUGGCAUCGCCACCGGUCUGCUGGUGCUGAAGGACCUGGGCAUCCAGGUGGAUAGGUACAUUGCCUCCGAGGUGUGCGAGGACUCCAUCACCGUGGGAAUGGUGCGUCAUCAGGGCAAGAUCAUGUACGUGGGCGACGUGCGGAGCGUGACACAGAAGCAUAUCCAGGAGUGGGGCCCUUUCGACCUGGUGAUCGGCGGCAGCCCUUGCAAUGACCUGAGCAUCGUGAACCCAGCCCGGAAGGGCCUGUACGAGGGAACCGGCAGACUGUUCUUCGAGUUUUACAGACUGCUGCACGACGCCCGGCCUAAGGAAGGCGACGACCGGCCCUUCUUUUGGCUGUUCGAGAAUGUGGUGGCCAUGGGAGUCAGCGACAAGCGGGAUAUUAGCCGGUUCCUGGAGAGCAACCCCGUGAUGAUCGAUGCCAAGGAAGUGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGAUACUUCUGGGGCAAUCUGCCUGGCAUGAACAGACCCCUGGCCAGCACCGUGAACGACAAGCUGGAGCUGCAGGAGUGCCUGGAGCACGGCCGGAUCGCCAAGUUCAGCAAGGUGAGAACCAUCACCACCCGAAGCAACAGCAUCAAACAAGGCAAGGACCAGCACUUUCCUGUGUUCAUGAACGAGAAGGAGGACAUCCUGUGGUGUACCGAGAUGGAGAGAGUGUUCGGGUUCCCAGUCCACUACACAGAUGUCAGCAACAUGUCUAGACUGGCCAGACAGAGACUGCUGGGAAGAAGCUGGUCCGUCCCUGUGAUCAGACACCUGUUCGCCCCUCUGAAGGAGUACUUCGCCUGCGUG	3117
連接子	AGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCTTCTCTAGCGGCCTGGTGCCACTGTCCCTGAGAGGGAGCCAC	3060	AGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCUUCUCUAGCGGCCUGGUGCCACUGUCCCUGAGAGGGAGCCAC	3118
DNMT3L相互作用域	參見表 12 中之序列	3061	AUGGGCCCCAUGGAGAUCUACAAAACCGUGAGCGCCUGGAAGCGGCAGCCUGUGCGCGUGCUGAGCCUGUUUCGGAAUAUCGAUAAAGUCCUGAAAAGCCUGGGAUUCCUGGAGAGCGGCUCUGGCUCCGGCGGUGGCACCCUGAAGUACGUGGAGGAUGUGACAAACGUGGUCAGACGGGAUGUGGAGAAGUGGGGCCCCUUCGAUCUGGUGUACGGCAGCACCCAACCCCUGGGCAGCUCUUGUGACCGGUGCCCUGGCUGGUACAUGUUUCAGUUCCACCGGAUCCUGCAGUACGCCCUGCCGAGACAGGAGUCCCAGCGGCCAUUCUUUUGGAUUUUCAUGGACAACUUGCUGCUGACCGAGGAUGACCAGGAAACUACCACUCGGUUCCUGCAGACCGAAGCCGUGACCCUGCAGGACGUGAGAGGCCGGGACUACCAGAACGCCAUGCGGGUGUGGUCCAACAUCCCUGGACUGAAAAGCAAGCACGCACCUCUGACCCCUAAAGAAGAGGAGUACCUGCAGGCCCAGGUGCGGAGCAGAAGCAAGCUGGACGCCCCUAAGGUGGAUCUGCUGGUGAAGAAUUGCCUCCUGCCCCUGAGAGAGUACUUCAAGUAUUUCAGCCAGAAUAGUCUGCCCCUG	3119
連接子	GGAGGCAGCGGCGGCGGC	3105	GGAGGCAGCGGCGGCGGC	3105
ZIM3-KRAB	參見表 12 中之序列	3051	AUGAACAACUCCCAGGGCAGAGUGACCUUCGAGGACGUGACCGUGAAUUUUACACAGGGAGAGUGGCAGAGACUGAACCCCGAGCAGAGAAACCUGUACCGGGAUGUGAUGCUGGAAAACUACAGCAAUCUGGUGUCCGUGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCUGACGUGAUCCUGCGUCUGGAGCAGGGCAAGGAACCCUGGCUGGAGGAGGAGGAGGUGCUGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAUCGGCGGACAGAUCUGGAAGCCUAAGGACGUGAAAGAAAGCCUG	3120
連接子	GGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCTCCTCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCTCCCCAACCTCTACCGAGGAGGGCACCTCTGAGTCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCTGGCACCTCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCTGCCGGCAGCCCCACCTCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCTAGTGAG	3106	GGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCUCCUCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCUCCCCAACCUCUACCGAGGAGGGCACCUCUGAGUCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCUGGCACCUCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCUGCCGGCAGCCCCACCUCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCUAGUGAG	3121
dCasX491	參見表 12 中之序列	3049	CAGGAGAUUAAACGGAUCAACAAGAUCAGAAGAAGACUUGUGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAUGAAAACCCUGCUGGUUAGAGUGAUGACACCCGAUCUGAGAGAGCGGCUGGAAAACCUGAGAAAGAAGCCUGAAAAUAUCCCCCAGCCCAUCAGCAAUACAUCUAGAGCCAACCUGAAUAAGCUGCUGACCGAUUACACCGAAAUGAAGAAGGCGAUCCUGCAUGUGUACUGGGAAGAGUUCCAGAAGGACCCUGUGGGCCUGAUGAGCCGGGUGGCCCAGCCUGCCAGCAAGAAGAUCGAUCAGAACAAGCUGAAACCUGAGAUGGACGAGAAGGGCAACCUGACCACCGCCGGCUUUGCCUGCUCUCAGUGUGGCCAGCCCCUGUUCGUGUACAAGCUGGAGCAGGUGUCUGAGAAGGGCAAGGCUUACACCAACUACUUCGGACGGUGCAAUGUGGCCGAGCACGAAAAGCUGAUCCUGCUGGCCCAGCUGAAGCCCGAGAAGGAUAGCGACGAAGCCGUGACAUAUAGCCUGGGAAAGUUUGGGCAGAGGGCCCUGGAUUUCUACAGCAUUCAUGUGACCAAGGAGUCCACCCACCCCGUGAAGCCCCUGGCCCAGAUCGCCGGAAACAGAUACGCCUCCGGACCUGUGGGAAAGGCCCUGAGCGACGCAUGUAUGGGCACAAUCGCCUCCUUCCUGUCUAAGUACCAGGACAUCAUCAUCGAACACCAGAAGGUGGUGAAGGGCAACCAGAAGAGACUGGAGAGCCUGCGGGAGCUGGCCGGCAAGGAAAACCUGGAAUACCCUAGCGUGACCCUGCCACCUCAGCCUCACACCAAGGAGGGCGUUGAUGCCUACAACGAAGUGAUCGCCCGGGUGCGAAUGUGGGUGAACCUGAACCUGUGGCAGAAGCUGAAGCUAAGCAGAGAUGAUGCCAAGCCUCUGCUGAGACUGAAGGGAUUCCCUUCCUUUCCUCUGGUCGAGAGACAGGCCAACGAAGUGGACUGGUGGGACAUGGUGUGUAACGUGAAGAAGCUGAUCAACGAGAAAAAGGAGGAUGGCAAGGUGUUUUGGCAGAAUCUGGCUGGCUACAAGAGACAGGAAGCCCUGAGACCAUACCUGAGCAGCGAGGAAGAUCGGAAGAAGGGAAAGAAAUUCGCUCGGUACCAGCUGGGCGACCUGCUGCUGCACCUGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACUGGGGAAAGGUGUACGACGAGGCCUGGGAGCGGAUUGACAAGAAAGUGGAAGGCCUGAGCAAGCACAUCAAGCUGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCUGACCGACUGGCUGCGGGCUAAGGCCAGCUUCGUGAUCGAGGGCCUGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGUUCUGCAGAUGCGAGCUGAAGCUGCAGAAGUGGUACGGGGACCUGCGGGGAAAGCCCUUCGCCAUCGAAGCCGAGAACAGCAUCCUGGACAUCAGCGGCUUCAGCAAGCAGUACAACUGUGCCUUCAUCUGGCAGAAGGACGGCGUGAAGAAGCUGAACCUGUACCUGAUCAUCAACUACUUCAAGGGCGGCAAGCUGCGGUUCAAGAAGAUCAAACCUGAAGCCUUCGAAGCCAACAGAUUCUACACCGUGAUCAACAAAAAGAGCGGCGAGAUCGUGCCCAUGGAGGUGAACUUCAACUUCGACGACCCCAACCUGAUCAUCCUGCCUCUGGCCUUUGGCAAGAGACAGGGCAGAGAAUUCAUCUGGAACGACCUGCUGUCCCUGGAAACCGGCAGCCUGAAGCUGGCCAACGGAAGAGUGAUCGAGAAGACACUGUACAACAGAAGAACCCGGCAGGAUGAGCCUGCCCUGUUCGUGGCCCUGACCUUCGAGCGGCGGGAGGUCCUGGACUCCUCCAAUAUCAAACCAAUGAACCUGAUCGGCGUGGCAAGAGGCGAAAACAUCCCCGCCGUGAUCGCCCUGACCGACCCCGAGGGCUGCCCACUGAGCCGGUUUAAGGAUAGCCUGGGAAACCCAACCCACAUCCUGAGAAUCGGCGAGAGCUAUAAGGAGAAGCAGCGGACCAUCCAGGCCAAGAAGGAGGUGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCUACAGCCGGAAGUACGCCAGCAAAGCCAAGAAUCUGGCAGACGAUAUGGUGAGAAACACCGCUAGAGAUCUGCUGUACUACGCCGUGACCCAGGAUGCCAUGCUGAUCUUCGCCAACCUGAGCCGGGGCUUCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCUUCAUGGCCGAGAGACAGUACACACGGAUGGAGGACUGGCUGACCGCCAAGCUGGCCUACGAGGGCCUGAGCAAGACCUACCUGUCCAAGACACUGGCCCAGUACACCUCCAAGACAUGCAGCAACUGUGGGUUUACCAUCACCAGCGCCGACUACGACAGGGUGCUGGAGAAGCUGAAGAAGACAGCAACAGGCUGGAUGACCACAAUUAACGGCAAGGAGCUGAAGGUGGAGGGCCAGAUUACCUACUACAACAGAUACAAGAGACAGAACGUAGUCAAGGACCUGUCCGUCGAGCUGGAUAGACUGAGCGAAGAAUCUGUGAACAACGACAUCUCCUCCUGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCUCUGAGCCUCCUGAAGAAAAGAUUCUCCCAUAGACCCGUGCAGGAGAAGUUCGUGUGCCUGAACUGCGGCUUCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCUGAACAUCGCCAGAUCCUGGCUGUUCCUGCGGAGCCAGGAGUACAAGAAAUACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGAUAAGAGAGCCUUCGUCGAGACCUGGCAGUCCUUUUACCGGAAGAAGCUUAAGGAGGUGUGGAAACCUGCCGUG	3122
緩衝液 + 連接子	CGGTCTGGCGGATCTGGCGGAGGCTCCACCAGC	3107	CGGUCUGGCGGAUCUGGCGGAGGCUCCACCAGC	3123
NLS + STOP 密碼子+ 緩衝序列	CCCAAGAAAAAGAGAAAAGTCTAATAGATAA	3108	CCCAAGAAAAAGAGAAAAGUCUAAUAGAUAA	3124
3'UTR	GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG	3055	GCUGCCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGCACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAG	3125
緩衝序列	TCTAG	3056	UCUAG	3126
聚腺苷酸尾	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3109	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3109
LTRP5-ADD-ZIM3	5'UTR	參見以上序列	3047	參見以上序列	3115
START 密碼子+ NLS + 連接子	參見以上序列	3104	參見以上序列	3116
START 密碼子+ DNMT3A ADD域	ATGGAACGCCTCGTCTACGAGGTGCGGCAGAAGTGCAGAAACATCGAGGACATCTGCATCTCCTGCGGATCTCTGAACGTGACCCTGGAGCACCCACTGTTCATCGGCGGCATGTGCCAGAACTGTAAAAACTGTTTTCTGGAGTGTGCCTATCAATACGACGATGACGGCTACCAGAGCTACTGCACCATCTGTTGCGGCGGAAGAGAGGTGCTGATGTGTGGAAATAACAACTGCTGCCGGTGCTTCTGCGTGGAATGCGTGGACCTGCTGGTGGGCCCCGGCGCCGCCCAGGCCGCTATTAAGGAAGATCCTTGGAACTGCTACATGTGCGGCCACAAGGGCACATACGGCCTGCTGAGACGGAGAGAGGACTGGCCTAGCAGACTGCAGATGTTCTTCGCCAAT	3111	AUGGAACGCCUCGUCUACGAGGUGCGGCAGAAGUGCAGAAACAUCGAGGACAUCUGCAUCUCCUGCGGAUCUCUGAACGUGACCCUGGAGCACCCACUGUUCAUCGGCGGCAUGUGCCAGAACUGUAAAAACUGUUUUCUGGAGUGUGCCUAUCAAUACGACGAUGACGGCUACCAGAGCUACUGCACCAUCUGUUGCGGCGGAAGAGAGGUGCUGAUGUGUGGAAAUAACAACUGCUGCCGGUGCUUCUGCGUGGAAUGCGUGGACCUGCUGGUGGGCCCCGGCGCCGCCCAGGCCGCUAUUAAGGAAGAUCCUUGGAACUGCUACAUGUGCGGCCACAAGGGCACAUACGGCCUGCUGAGACGGAGAGAGGACUGGCCUAGCAGACUGCAGAUGUUCUUCGCCAAU	3127
DNMT3A催化域	AACCACGACCAGGAGTTCGACCCCCCTAAGGTGTACCCTCCCGTCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCATCCGGGTCCTGAGCCTGTTCGATGGCATCGCCACCGGTCTGCTGGTGCTGAAGGACCTGGGCATCCAGGTGGATAGGTACATTGCCTCCGAGGTGTGCGAGGACTCCATCACCGTGGGAATGGTGCGTCATCAGGGCAAGATCATGTACGTGGGCGACGTGCGGAGCGTGACACAGAAGCATATCCAGGAGTGGGGCCCTTTCGACCTGGTGATCGGCGGCAGCCCTTGCAATGACCTGAGCATCGTGAACCCAGCCCGGAAGGGCCTGTACGAGGGAACCGGCAGACTGTTCTTCGAGTTTTACAGACTGCTGCACGACGCCCGGCCTAAGGAAGGCGACGACCGGCCCTTCTTTTGGCTGTTCGAGAATGTGGTGGCCATGGGAGTCAGCGACAAGCGGGATATTAGCCGGTTCCTGGAGAGCAACCCCGTGATGATCGATGCCAAGGAAGTGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGATACTTCTGGGGCAATCTGCCTGGCATGAACAGACCCCTGGCCAGCACCGTGAACGACAAGCTGGAGCTGCAGGAGTGCCTGGAGCACGGCCGGATCGCCAAGTTCAGCAAGGTGAGAACCATCACCACCCGAAGCAACAGCATCAAACAAGGCAAGGACCAGCACTTTCCTGTGTTCATGAACGAGAAGGAGGACATCCTGTGGTGTACCGAGATGGAGAGAGTGTTCGGGTTCCCAGTCCACTACACAGATGTCAGCAACATGTCTAGACTGGCCAGACAGAGACTGCTGGGAAGAAGCTGGTCCGTCCCTGTGATCAGACACCTGTTCGCCCCTCTGAAGGAGTACTTCGCCTGCGTG	3112	AACCACGACCAGGAGUUCGACCCCCCUAAGGUGUACCCUCCCGUCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCAUCCGGGUCCUGAGCCUGUUCGAUGGCAUCGCCACCGGUCUGCUGGUGCUGAAGGACCUGGGCAUCCAGGUGGAUAGGUACAUUGCCUCCGAGGUGUGCGAGGACUCCAUCACCGUGGGAAUGGUGCGUCAUCAGGGCAAGAUCAUGUACGUGGGCGACGUGCGGAGCGUGACACAGAAGCAUAUCCAGGAGUGGGGCCCUUUCGACCUGGUGAUCGGCGGCAGCCCUUGCAAUGACCUGAGCAUCGUGAACCCAGCCCGGAAGGGCCUGUACGAGGGAACCGGCAGACUGUUCUUCGAGUUUUACAGACUGCUGCACGACGCCCGGCCUAAGGAAGGCGACGACCGGCCCUUCUUUUGGCUGUUCGAGAAUGUGGUGGCCAUGGGAGUCAGCGACAAGCGGGAUAUUAGCCGGUUCCUGGAGAGCAACCCCGUGAUGAUCGAUGCCAAGGAAGUGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGAUACUUCUGGGGCAAUCUGCCUGGCAUGAACAGACCCCUGGCCAGCACCGUGAACGACAAGCUGGAGCUGCAGGAGUGCCUGGAGCACGGCCGGAUCGCCAAGUUCAGCAAGGUGAGAACCAUCACCACCCGAAGCAACAGCAUCAAACAAGGCAAGGACCAGCACUUUCCUGUGUUCAUGAACGAGAAGGAGGACAUCCUGUGGUGUACCGAGAUGGAGAGAGUGUUCGGGUUCCCAGUCCACUACACAGAUGUCAGCAACAUGUCUAGACUGGCCAGACAGAGACUGCUGGGAAGAAGCUGGUCCGUCCCUGUGAUCAGACACCUGUUCGCCCCUCUGAAGGAGUACUUCGCCUGCGUG	3128
連接子	參見以上序列	3060	參見以上序列	3118
DNMT3L相互作用域	參見以上序列	3061	參見以上序列	3119
連接子	參見以上序列	3105	參見以上序列	3105
ZIM3-KRAB	參見表 12 中之序列	3051	參見以上序列	3120
連接子	參見以上序列	3106	參見以上序列	3121
dCasX491	參見以上序列	3049	參見以上序列	3122
緩衝液 + 連接子	參見以上序列	3107	參見以上序列	3123
NLS + STOP 密碼子+ 緩衝序列	參見以上序列	3108	參見以上序列	3124
3'UTR	參見以上序列	3055	參見以上序列	3125
緩衝序列	參見以上序列	3056	參見以上序列	3126
聚腺苷酸尾	參見以上序列	3109	參見以上序列	3109

*各組分以在構築體內之5'至3'次序列出 表 16 ： 此實例中評定之 LTRP5-ZIM3 及 LTRP5-ZIM3-ADD mRNA 分子之全長 RNA 序列。 修飾『 mψ 』 = N1- 甲基 - 假尿苷

LTRP 分子	RNA 序列	SEQ ID NO
LTRP5-ZIM3	AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψAAGAAGAAGCGmψAAAGmψGAGCCGGAmψGAACCACGACCAGGAGmψmψCGACCCCCCmψAAGGmψGmψACCCmψCCCGmψCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCAmψCCGGGmψCCmψGAGCCmψGmψmψCGAmψGGCAmψCGCCACCGGmψCmψGCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAGGmψGGAmψAGGmψACAmψmψGCCmψCCGAGGmψGmψGCGAGGACmψCCAmψCACCGmψGGGAAmψGGmψGCGmψCAmψCAGGGCAAGAmψCAmψGmψACGmψGGGCGACGmψGCGGAGCGmψGACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCmψmψmψCGACCmψGGmψGAmψCGGCGGCAGCCCmψmψGCAAmψGACCmψGAGCAmψCGmψGAACCCAGCCCGGAAGGGCCmψGmψACGAGGGAACCGGCAGACmψGmψmψCmψmψCGAGmψmψmψmψACAGACmψGCmψGCACGACGCCCGGCCmψAAGGAAGGCGACGACCGGCCCmψmψCmψmψmψmψGGCmψGmψmψCGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGAGmψCAGCGACAAGCGGGAmψAmψmψAGCCGGmψmψCCmψGGAGAGCAACCCCGmψGAmψGAmψCGAmψGCCAAGGAAGmψGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGAmψACmψmψCmψGGGGCAAmψCmψGCCmψGGCAmψGAACAGACCCCmψGGCCAGCACCGmψGAACGACAAGCmψGGAGCmψGCAGGAGmψGCCmψGGAGCACGGCCGGAmψCGCCAAGmψmψCAGCAAGGmψGAGAACCAmψCACCACCCGAAGCAACAGCAmψCAAACAAGGCAAGGACCAGCACmψmψmψCCmψGmψGmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGmψACCGAGAmψGGAGAGAGmψGmψmψCGGGmψmψCCCAGmψCCACmψACACAGAmψGmψCAGCAACAmψGmψCmψAGACmψGGCCAGACAGAGACmψGCmψGGGAAGAAGCmψGGmψCCGmψCCCmψGmψGAmψCAGACACCmψGmψmψCGCCCCmψCmψGAAGGAGmψACmψmψCGCCmψGCGmψGAGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCmψmψCmψCmψAGCGGCCmψGGmψGCCACmψGmψCCCmψGAGAGGGAGCCACAmψGGGCCCCAmψGGAGAmψCmψACAAAACCGmψGAGCGCCmψGGAAGCGGCAGCCmψGmψGCGCGmψGCmψGAGCCmψGmψmψmψCGGAAmψAmψCGAmψAAAGmψCCmψGAAAAGCCmψGGGAmψmψCCmψGGAGAGCGGCmψCmψGGCmψCCGGCGGmψGGCACCCmψGAAGmψACGmψGGAGGAmψGmψGACAAACGmψGGmψCAGACGGGAmψGmψGGAGAAGmψGGGGCCCCmψmψCGAmψCmψGGmψGmψACGGCAGCACCCAACCCCmψGGGCAGCmψCmψmψGmψGACCGGmψGCCCmψGGCmψGGmψACAmψGmψmψmψCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψACGCCCmψGCCGAGACAGGAGmψCCCAGCGGCCAmψmψCmψmψmψmψGGAmψmψmψmψCAmψGGACAACmψmψGCmψGCmψGACCGAGGAmψGACCAGGAAACmψACCACmψCGGmψmψCCmψGCAGACCGAAGCCGmψGACCCmψGCAGGACGmψGAGAGGCCGGGACmψACCAGAACGCCAmψGCGGGmψGmψGGmψCCAACAmψCCCmψGGACmψGAAAAGCAAGCACGCACCmψCmψGACCCCmψAAAGAAGAGGAGmψACCmψGCAGGCCCAGGmψGCGGAGCAGAAGCAAGCmψGGACGCCCCmψAAGGmψGGAmψCmψGCmψGGmψGAAGAAmψmψGCCmψCCmψGCCCCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψCAGCCAGAAmψAGmψCmψGCCCCmψGGGAGGCAGCGGCGGCGGCAmψGAACAACmψCCCAGGGCAGAGmψGACCmψmψCGAGGACGmψGACCGmψGAAmψmψmψmψACACAGGGAGAGmψGGCAGAGACmψGAACCCCGAGCAGAGAAACCmψGmψACCGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAAAACmψACAGCAAmψCmψGGmψGmψCCGmψGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCmψGACGmψGAmψCCmψGCGmψCmψGGAGCAGGGCAAGGAACCCmψGGCmψGGAGGAGGAGGAGGmψGCmψGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAmψCGGCGGACAGAmψCmψGGAAGCCmψAAGGACGmψGAAAGAAAGCCmψGGGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCmψCCmψCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCmψCCCCAACCmψCmψACCGAGGAGGGCACCmψCmψGAGmψCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCmψGGCACCmψCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCmψGCCGGCAGCCCCACCmψCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCmψAGmψGAGCAGGAGAmψmψAAACGGAmψCAACAAGAmψCAGAAGAAGACmψmψGmψGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψGGmψmψAGAGmψGAmψGACACCCGAmψCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAAAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAAmψACAmψCmψAGAGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGAmψmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCGAmψCCmψGCAmψGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAGGACCCmψGmψGGGCCmψGAmψGAGCCGGGmψGGCCCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAACCmψGAGAmψGGACGAGAAGGGCAACCmψGACCACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCCCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAGCAGGmψGmψCmψGAGAAGGGCAAGGCmψmψACACCAACmψACmψmψCGGACGGmψGCAAmψGmψGGCCGAGCACGAAAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCCGAGAAGGAmψAGCGACGAAGCCGmψGACAmψAmψAGCCmψGGGAAAGmψmψmψGGGCAGAGGGCCCmψGGAmψmψmψCmψACAGCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAGmψCCACCCACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCCCAGAmψCGCCGGAAACAGAmψACGCCmψCCGGACCmψGmψGGGAAAGGCCCmψGAGCGACGCAmψGmψAmψGGGCACAAmψCGCCmψCCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAACACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGGGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAAmψACCCmψAGCGmψGACCCmψGCCACCmψCAGCCmψCACACCAAGGAGGGCGmψmψGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGAAmψGmψGGGmψGAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψAAGCAGAGAmψGAmψGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGAmψmψCCCmψmψCCmψmψmψCCmψCmψGGmψCGAGAGACAGGCCAACGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAAAAGGAGGAmψGGCAAGGmψGmψmψmψmψGGCAGAAmψCmψGGCmψGGCmψACAAGAGACAGGAAGCCCmψGAGACCAmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGAmψCGGAAGAAGGGAAAGAAAmψmψCGCmψCGGmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGAAAGGmψGmψACGACGAGGCCmψGGGAGCGGAmψmψGACAAGAAAGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGCGGGCmψAAGGCCAGCmψmψCGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGGGACCmψGCGGGGAAAGCCCmψmψCGCCAmψCGAAGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGmψGCCmψmψCAmψCmψGGCAGAAGGACGGCGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψACmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCmψGAAGCCmψmψCGAAGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGAGCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAGGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψmψGGCAAGAGACAGGGCAGAGAAmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCCCmψGGAAACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGAAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGAAGAACCCGGCAGGAmψGAGCCmψGCCCmψGmψmψCGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGCGGCGGGAGGmψCCmψGGACmψCCmψCCAAmψAmψCAAACCAAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCAAGAGGCGAAAACAmψCCCCGCCGmψGAmψCGCCCmψGACCGACCCCGAGGGCmψGCCCACmψGAGCCGGmψmψmψAAGGAmψAGCCmψGGGAAACCCAACCCACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψAmψAAGGAGAAGCAGCGGACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCmψACAGCCGGAAGmψACGCCAGCAAAGCCAAGAAmψCmψGGCAGACGAmψAmψGGmψGAGAAACACCGCmψAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACCCAGGAmψGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCCAACCmψGAGCCGGGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACACGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACACmψGGCCCAGmψACACCmψCCAAGACAmψGCAGCAACmψGmψGGGmψmψmψACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGGGmψGCmψGGAGAAGCmψGAAGAAGACAGCAACAGGCmψGGAmψGACCACAAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψmψACCmψACmψACAACAGAmψACAAGAGACAGAACGmψAGmψCAAGGACCmψGmψCCGmψCGAGCmψGGAmψAGACmψGAGCGAAGAAmψCmψGmψGAACAACGACAmψCmψCCmψCCmψGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCmψCmψGAGCCmψCCmψGAAGAAAAGAmψmψCmψCCCAmψAGACCCGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCAGAmψCCmψGGCmψGmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAAmψACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGAmψAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGmψCCmψmψmψmψACCGGAAGAAGCmψmψAAGGAGGmψGmψGGAAACCmψGCCGmψGCGGmψCmψGGCGGAmψCmψGGCGGAGGCmψCCACCAGCCCCAAGAAAAAGAGAAAAGmψCmψAAmψAGAmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψCmψAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3129
LTRP5-ADD-ZIM3	AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψAAGAAGAAGCGmψAAAGmψGAGCCGGAmψGGAACGCCmψCGmψCmψACGAGGmψGCGGCAGAAGmψGCAGAAACAmψCGAGGACAmψCmψGCAmψCmψCCmψGCGGAmψCmψCmψGAACGmψGACCCmψGGAGCACCCACmψGmψmψCAmψCGGCGGCAmψGmψGCCAGAACmψGmψAAAAACmψGmψmψmψmψCmψGGAGmψGmψGCCmψAmψCAAmψACGACGAmψGACGGCmψACCAGAGCmψACmψGCACCAmψCmψGmψmψGCGGCGGAAGAGAGGmψGCmψGAmψGmψGmψGGAAAmψAACAACmψGCmψGCCGGmψGCmψmψCmψGCGmψGGAAmψGCGmψGGACCmψGCmψGGmψGGGCCCCGGCGCCGCCCAGGCCGCmψAmψmψAAGGAAGAmψCCmψmψGGAACmψGCmψACAmψGmψGCGGCCACAAGGGCACAmψACGGCCmψGCmψGAGACGGAGAGAGGACmψGGCCmψAGCAGACmψGCAGAmψGmψmψCmψmψCGCCAAmψAACCACGACCAGGAGmψmψCGACCCCCCmψAAGGmψGmψACCCmψCCCGmψCCCCGCCGAGAAGAGAAAGCCCAmψCCGGGmψCCmψGAGCCmψGmψmψCGAmψGGCAmψCGCCACCGGmψCmψGCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAGGmψGGAmψAGGmψACAmψmψGCCmψCCGAGGmψGmψGCGAGGACmψCCAmψCACCGmψGGGAAmψGGmψGCGmψCAmψCAGGGCAAGAmψCAmψGmψACGmψGGGCGACGmψGCGGAGCGmψGACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCmψmψmψCGACCmψGGmψGAmψCGGCGGCAGCCCmψmψGCAAmψGACCmψGAGCAmψCGmψGAACCCAGCCCGGAAGGGCCmψGmψACGAGGGAACCGGCAGACmψGmψmψCmψmψCGAGmψmψmψmψACAGACmψGCmψGCACGACGCCCGGCCmψAAGGAAGGCGACGACCGGCCCmψmψCmψmψmψmψGGCmψGmψmψCGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGAGmψCAGCGACAAGCGGGAmψAmψmψAGCCGGmψmψCCmψGGAGAGCAACCCCGmψGAmψGAmψCGAmψGCCAAGGAAGmψGAGCGCCGCCCACCGGGCCAGAmψACmψmψCmψGGGGCAAmψCmψGCCmψGGCAmψGAACAGACCCCmψGGCCAGCACCGmψGAACGACAAGCmψGGAGCmψGCAGGAGmψGCCmψGGAGCACGGCCGGAmψCGCCAAGmψmψCAGCAAGGmψGAGAACCAmψCACCACCCGAAGCAACAGCAmψCAAACAAGGCAAGGACCAGCACmψmψmψCCmψGmψGmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGmψACCGAGAmψGGAGAGAGmψGmψmψCGGGmψmψCCCAGmψCCACmψACACAGAmψGmψCAGCAACAmψGmψCmψAGACmψGGCCAGACAGAGACmψGCmψGGGAAGAAGCmψGGmψCCGmψCCCmψGmψGAmψCAGACACCmψGmψmψCGCCCCmψCmψGAAGGAGmψACmψmψCGCCmψGCGmψGAGCAGCGGCAACAGCAACGCCAACAGCCGGGGCCCCAGCmψmψCmψCmψAGCGGCCmψGGmψGCCACmψGmψCCCmψGAGAGGGAGCCACAmψGGGCCCCAmψGGAGAmψCmψACAAAACCGmψGAGCGCCmψGGAAGCGGCAGCCmψGmψGCGCGmψGCmψGAGCCmψGmψmψmψCGGAAmψAmψCGAmψAAAGmψCCmψGAAAAGCCmψGGGAmψmψCCmψGGAGAGCGGCmψCmψGGCmψCCGGCGGmψGGCACCCmψGAAGmψACGmψGGAGGAmψGmψGACAAACGmψGGmψCAGACGGGAmψGmψGGAGAAGmψGGGGCCCCmψmψCGAmψCmψGGmψGmψACGGCAGCACCCAACCCCmψGGGCAGCmψCmψmψGmψGACCGGmψGCCCmψGGCmψGGmψACAmψGmψmψmψCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψACGCCCmψGCCGAGACAGGAGmψCCCAGCGGCCAmψmψCmψmψmψmψGGAmψmψmψmψCAmψGGACAACmψmψGCmψGCmψGACCGAGGAmψGACCAGGAAACmψACCACmψCGGmψmψCCmψGCAGACCGAAGCCGmψGACCCmψGCAGGACGmψGAGAGGCCGGGACmψACCAGAACGCCAmψGCGGGmψGmψGGmψCCAACAmψCCCmψGGACmψGAAAAGCAAGCACGCACCmψCmψGACCCCmψAAAGAAGAGGAGmψACCmψGCAGGCCCAGGmψGCGGAGCAGAAGCAAGCmψGGACGCCCCmψAAGGmψGGAmψCmψGCmψGGmψGAAGAAmψmψGCCmψCCmψGCCCCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψCAGCCAGAAmψAGmψCmψGCCCCmψGGGAGGCAGCGGCGGCGGCAmψGAACAACmψCCCAGGGCAGAGmψGACCmψmψCGAGGACGmψGACCGmψGAAmψmψmψmψACACAGGGAGAGmψGGCAGAGACmψGAACCCCGAGCAGAGAAACCmψGmψACCGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAAAACmψACAGCAAmψCmψGGmψGmψCCGmψGGGCCAGGGCGAGACCACAAAGCCmψGACGmψGAmψCCmψGCGmψCmψGGAGCAGGGCAAGGAACCCmψGGCmψGGAGGAGGAGGAGGmψGCmψGGGAAGCGGACGGGCCGAGAAGAACGGCGACAmψCGGCGGACAGAmψCmψGGAAGCCmψAAGGACGmψGAAAGAAAGCCmψGGGCGGCCCAAGCAGCGGCGCCCCmψCCmψCCCAGCGGCGGCAGCCCAGCCGGCmψCCCCAACCmψCmψACCGAGGAGGGCACCmψCmψGAGmψCCGCCACCCCCGAGAGCGGCCCmψGGCACCmψCCACCGAGCCCAGCGAGGGCAGCGCACCCGGCAGCCCmψGCCGGCAGCCCCACCmψCCACAGAGGAGGGAACCAGCACCGAGCCCAGCGAAGGCAGCGCCCCAGGCACCAGCACCGAGCCmψAGmψGAGCAGGAGAmψmψAAACGGAmψCAACAAGAmψCAGAAGAAGACmψmψGmψGAAAGACAGCAACACCAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψGGmψmψAGAGmψGAmψGACACCCGAmψCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAAAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAAmψACAmψCmψAGAGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGAmψmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCGAmψCCmψGCAmψGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAGGACCCmψGmψGGGCCmψGAmψGAGCCGGGmψGGCCCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAACCmψGAGAmψGGACGAGAAGGGCAACCmψGACCACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCCCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAGCAGGmψGmψCmψGAGAAGGGCAAGGCmψmψACACCAACmψACmψmψCGGACGGmψGCAAmψGmψGGCCGAGCACGAAAAGCmψGAmψCCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCCGAGAAGGAmψAGCGACGAAGCCGmψGACAmψAmψAGCCmψGGGAAAGmψmψmψGGGCAGAGGGCCCmψGGAmψmψmψCmψACAGCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAGmψCCACCCACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCCCAGAmψCGCCGGAAACAGAmψACGCCmψCCGGACCmψGmψGGGAAAGGCCCmψGAGCGACGCAmψGmψAmψGGGCACAAmψCGCCmψCCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAACACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGGGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAAmψACCCmψAGCGmψGACCCmψGCCACCmψCAGCCmψCACACCAAGGAGGGCGmψmψGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGAAmψGmψGGGmψGAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψAAGCAGAGAmψGAmψGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGAmψmψCCCmψmψCCmψmψmψCCmψCmψGGmψCGAGAGACAGGCCAACGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAAAAGGAGGAmψGGCAAGGmψGmψmψmψmψGGCAGAAmψCmψGGCmψGGCmψACAAGAGACAGGAAGCCCmψGAGACCAmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGAmψCGGAAGAAGGGAAAGAAAmψmψCGCmψCGGmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGAAAGGmψGmψACGACGAGGCCmψGGGAGCGGAmψmψGACAAGAAAGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAAGAGGAACGGAGAAGCGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGCGGGCmψAAGGCCAGCmψmψCGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGGGACCmψGCGGGGAAAGCCCmψmψCGCCAmψCGAAGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGmψGCCmψmψCAmψCmψGGCAGAAGGACGGCGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψACmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCmψGAAGCCmψmψCGAAGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGAGCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAGGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψmψGGCAAGAGACAGGGCAGAGAAmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCCCmψGGAAACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGAAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGAAGAACCCGGCAGGAmψGAGCCmψGCCCmψGmψmψCGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGCGGCGGGAGGmψCCmψGGACmψCCmψCCAAmψAmψCAAACCAAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCAAGAGGCGAAAACAmψCCCCGCCGmψGAmψCGCCCmψGACCGACCCCGAGGGCmψGCCCACmψGAGCCGGmψmψmψAAGGAmψAGCCmψGGGAAACCCAACCCACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψAmψAAGGAGAAGCAGCGGACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGAGAGCCGGCGGCmψACAGCCGGAAGmψACGCCAGCAAAGCCAAGAAmψCmψGGCAGACGAmψAmψGGmψGAGAAACACCGCmψAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACCCAGGAmψGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCCAACCmψGAGCCGGGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGCGGACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACACGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACACmψGGCCCAGmψACACCmψCCAAGACAmψGCAGCAACmψGmψGGGmψmψmψACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGGGmψGCmψGGAGAAGCmψGAAGAAGACAGCAACAGGCmψGGAmψGACCACAAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψmψACCmψACmψACAACAGAmψACAAGAGACAGAACGmψAGmψCAAGGACCmψGmψCCGmψCGAGCmψGGAmψAGACmψGAGCGAAGAAmψCmψGmψGAACAACGACAmψCmψCCmψCCmψGGACAAAGGGCAGAAGCGGAGAAGCmψCmψGAGCCmψCCmψGAAGAAAAGAmψmψCmψCCCAmψAGACCCGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCAGCCGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCAGAmψCCmψGGCmψGmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAAmψACCAGACAAACAAGACAACCGGCAACACCGAmψAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGmψCCmψmψmψmψACCGGAAGAAGCmψmψAAGGAGGmψGmψGGAAACCmψGCCGmψGCGGmψCmψGGCGGAmψCmψGGCGGAGGCmψCCACCAGCCCCAAGAAAAAGAGAAAAGmψCmψAAmψAGAmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψCmψAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3130

表 17 ： 藉由 ELISA 、 RT-qPCR 測定之前 16 個間隔子活性及平均 CpG 甲基化百分比 (mCpG)

間隔子ID	ELISA 減少%	RT-qPCR 減少%	平均% mCpG
TG-06-001	-54.60	-53.66	59.00
TG-06-133	-26.60	-58.51	42.90
TG-06-139	-51.50	-63.03	55.90
TG-06-141	-53.70	-58.85	53.70
TG-06-142	-18.50	-31.76	28.40
TG-06-143	-27.20	-51.60	46.10
TG-06-144	-28.10	-41.68	54.70
TG-06-146	-22.10	-45.31	31.00
TG-06-149	-57.50	-42.07	56.90
TG-06-150	-56.30	-55.68	56.40
TG-06-154	-66.50	-55.28	45.50
TG-06-157	-55.60	-52.86	54.40
TG-06-158	-56.50	-57.04	49.40
TG-06-160	-42.00	-54.91	57.30
TG-06-167	-37.80	-50.29	46.00
TG-06-168	-39.90	-50.34	48.80
初始	N/A	N/A	6.70
NT	N/A	N/A	1.50

表 18 ： 藉由硫酸氫鹽定序及 RNA-seq 測定之前 16 個間隔子持久性及特異性

間隔子ID	第9 週 與第1 週 的Δ%PCSK9	脫靶差異表現基因#
TG-06-154	-22.30	0
TG-06-157	-28.30	1
TG-06-001	-63.50	2
TG-06-141	-10.80	1
TG-06-149	-26.70	0
TG-06-158	0.40	376
TG-06-150	-35.50	2
TG-06-160	-23.50	18
TG-06-139	-34.90	24
TG-06-144	-21.30	0
TG-06-133	-29.40	6

實例 2 ： 證明編碼含有 ADD 域之 LTRP 之 mRNA 可誘導多個人類細胞株源中內源性基因座之抑制

進行實驗以證明當作為與靶向gRNA共轉染之mRNA遞送時，編碼含有ADD域之LTRP之mRNA可誘導各種人類細胞株中內源性目標基因座的長期抑制。 材料及方法 mRNA之產生：

編碼以下分子之mRNA係遵循如實例1中所描述之類似方法由IVT產生：1)催化活性CasX 676，2) dXR1，及3) LTRP5-ADD-ZIM3。編碼此等分子之序列除使用公開可用之密碼子最佳化工具及調整諸如GC含量之參數外，亦使用密碼子利用率表進行密碼子最佳化。編碼催化活性CasX 676之DNA及mRNA序列分別顯示於表19及表20中。編碼dXR1之DNA及mRNA序列分別顯示於表12及表13中。編碼LTRP5-ZIM3-ADD之DNA及mRNA序列分別顯示於表15及表16中。 表 19 ： 此實例中評定之催化活性 CasX 676 mRNA 分子之編碼序列 *

CasX mRNA ID	組分(ID)	描述	DNA 序列	SEQ ID NO:
CasX 676 mRNA	5'UTR	TriLink	AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC	3047
START 密碼子+ c-MYC NLS		ATGGCCCCTGCTGCCAAGAGAGTGAAGCTGGATAGCAGA	3133
CasX 676		CAGGAGATCAAGCGGATTAATAAAATTCGGAGAAGACTGGTGAAGGATTCTAACACAAAGAAGGCTGGCAAGACACGGGGCCCTATGAAGACACTGCTGGTGAGAGTGATGACACCCGACCTGAGAGAAAGACTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCTGAGAATATCCCCCAGCCCATCAGCAACACAAGCCGGGCCAACCTGAATAAGCTGCTGACCGACTACACCGAAATGAAGAAGGCCATCCTGCACGTGTATTGGGAAGAGTTCCAGAAAGACCCAGTCGGCCTGATGAGCAGAGTGGCTCAGCCTGCCAGCAAGAAGATCGATCAGAACAAGCTGAAGCCCGAAATGGACGAGAAGGGGAACCTGACAACCGCCGGCTTTGCCTGTAGCCAGTGCGGCCAGCCCCTGTTTGTGTACAAACTGGAACAGGTGAGCGAAAAGGGCAAGGCTTACACGAATTACTTCGGCAGATGCAACGTGGCCGAGCACGAGAAGCTGATCAAGCTGGCCCAGCTGAAGCCTGAGAAGGATAGCGATGAGGCAGTGACATATTCCCTGGGCAAGTTCGGACAGCGGGCCCTGGATTTTTATTCCATTCATGTGACCAAGGAATCCACCCACCCCGTCAAGCCTCTTGCCCAAATTGCCGGCAACAGATACGCCTCCAGCCCCGTGGGCAAGGCCCTGAGCGACGCCTGTATGGGCACCATCGCCAGCTTCCTGTCTAAGTACCAGGACATTATCATCGAGCACCAGAAGGTGGTGAAGGGCAACCAGAAGAGACTGGAGAGCCTGCGCGAGCTGGCCGGCAAGGAAAACCTGGAGTATCCTAGCGTGACCCTGCCTCCTCAGCCTCATACAAAGGAGGGCGTGGATGCCTACAACGAAGTGATCGCCCGGGTGCGGATGTGGGTGAACCTGAATCTGTGGCAGAAGCTGAAGCTGTCTAGAGACGACGCCAAGCCCCTGCTGAGACTGAAGGGCTTCCCCAGCTTCCCTCTGGTGGAGAGACAGGCAAATGAAGTGGACTGGTGGGACATGGTGTGTAACGTGAAGAAGCTGATCAATGAGAAGAAGGAGGACGGCAAAGTGTTCTGGCAGAATCTGGCCGGCTACAAGCGTCAGGAGGCCCTGCGGCCCTACCTGAGCAGCGAGGAAGACAGAAAGAAGGGCAAGAAGTTCGCCCGGTATCAGCTGGGGGACCTGCTGCTGCACCTCGAGAAGAAGCACGGCGAAGACTGGGGGAAGGTGTACGATGAGGCCTGGGAGCGGATCGATAAGAAGGTGGAGGGCCTGAGCAAGCACATCAAGCTGGAGGAGGAACGGAGATCTGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCTGACCGACTGGCTGAGAGCCAAGGCCAGCTTCGTCATCGAGGGGCTGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGTTCTGCCGGTGCGAACTGAAGCTGCAGAAGTGGTACGGAGATCTGAGAGGCAAACCTTTCGCCATCGAGGCCGAGAACAGCATCCTGGACATCAGCGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGCGCCTTTATTTGGCAGAAGGACGGAGTGAAGAAGCTGAACCTGTACCTGATCATCAACTATTTCAAGGGCGGCAAGCTGAGATTCAAGAAGATCAAGCCTGAAGCCTTCGAGGCCAACAGATTCTACACCGTGATTAACAAGAAAAGCGGAGAGATCGTGCCAATGGAAGTGAACTTCAACTTCGACGACCCTAACCTGATCATCCTGCCCCTGGCATTTGGCAAGCGGCAGGGCAGAGAGTTCATCTGGAACGACCTGCTGTCTCTGGAGACCGGCAGCCTGAAGCTGGCCAACGGCAGAGTGATCGAGAAGACACTGTACAACAGACGAACCAGACAAGACGAGCCCGCCCTGTTTGTGGCCCTGACCTTCGAGAGAAGAGAGGTGCTGGACAGCAGCAATATCAAGCCTATGAACCTGATCGGCGTGGACCGGGGCGAGAACATCCCTGCCGTGATCGCCCTTACCGACCCCGAGGGATGCCCTCTGAGCCGGTTTAAAGACAGCCTGGGCAACCCTACCCACATCCTGAGAATTGGCGAGTCCTACAAGGAGAAGCAGAGAACCATCCAGGCCAAGAAGGAGGTGGAGCAGCGGCGGGCTGGCGGCTACTCCCGGAAGTACGCCAGCAAGGCCAAGAACCTGGCCGACGACATGGTTAGAAATACCGCCAGAGACCTCCTGTACTACGCTGTGACCCAGGACGCCATGCTGATCTTCGAGAACCTGAGCAGAGGCTTCGGCAGACAGGGCAAGAGAACCTTCATGGCCGAGAGACAGTACACCCGGATGGAGGACTGGCTGACCGCCAAGCTGGCCTACGAGGGCCTGCCCTCTAAGACCTACCTGTCCAAGACCTTGGCACAGTACACCAGCAAGACATGCTCTAACTGCGGCTTCACAATCACGAGCGCCGACTACGACCGGGTGCTGGAGAAACTGAAGAAGACCGCCACAGGCTGGATGACCACCATTAACGGCAAGGAGCTGAAGGTGGAGGGCCAGATCACCTACTACAACAGGTACAAACGGCAGAACGTGGTGAAGGACCTGAGCGTGGAACTGGATAGACTGAGCGAGGAAAGCGTAAACAATGACATCAGCAGCTGGACCAAGGGCCGGAGCGGCGAGGCCCTGAGCCTGCTGAAGAAGAGATTCTCCCACAGACCAGTGCAGGAGAAGTTCGTGTGTCTGAACTGCGGCTTCGAGACCCACGCCGACGAGCAAGCCGCCCTGAACATCGCCCGGTCTTGGCTTTTCCTGCGGAGCCAGGAGTACAAGAAGTACCAGACAAACAAGACCACAGGCAACACAGACAAGAGAGCCTTCGTCGAGACCTGGCAGAGCTTCTACAGAAAGAAGCTGAAGGAGGTGTGGAAGCCTGCCGTG	3134
c-MYC NLS + STOP 密碼子		GGAAGCCCCGCTGCCAAGAGAGTGAAGCTGGACTAATAGATAA	3135
3'UTR	小鼠HBA	GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG	3055
XbaI限制位點(部分)		TCTAG	3056
聚腺苷酸尾		AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3057

*各組分以在構築體內之5'至3'次序列出 表 20 ： 在此實例中評定之催化活性 CasX 676 mRNA 分子之全長 RNA 序列。 修飾『 mψ 』 = N1- 甲基 - 假尿苷

CasX mRNA	RNA 序列	SEQ ID NO:
CasX 676 mRNA	AAAmψAAGAGAGAAAAGAAGAGmψAAGAAGAAAmψAmψAAGAGCCACCAmψGGCCCCmψGCmψGCCAAGAGAGmψGAAGCmψGGAmψAGCAGACAGGAGAmψCAAGCGGAmψmψAAmψAAAAmψmψCGGAGAAGACmψGGmψGAAGGAmψmψCmψAACACAAAGAAGGCmψGGCAAGACACGGGGCCCmψAmψGAAGACACmψGCmψGGmψGAGAGmψGAmψGACACCCGACCmψGAGAGAAAGACmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCmψGAGAAmψAmψCCCCCAGCCCAmψCAGCAACACAAGCCGGGCCAACCmψGAAmψAAGCmψGCmψGACCGACmψACACCGAAAmψGAAGAAGGCCAmψCCmψGCACGmψGmψAmψmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAAGACCCAGmψCGGCCmψGAmψGAGCAGAGmψGGCmψCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGAmψCAGAACAAGCmψGAAGCCCGAAAmψGGACGAGAAGGGGAACCmψGACAACCGCCGGCmψmψmψGCCmψGmψAGCCAGmψGCGGCCAGCCCCmψGmψmψmψGmψGmψACAAACmψGGAACAGGmψGAGCGAAAAGGGCAAGGCmψmψACACGAAmψmψACmψmψCGGCAGAmψGCAACGmψGGCCGAGCACGAGAAGCmψGAmψCAAGCmψGGCCCAGCmψGAAGCCmψGAGAAGGAmψAGCGAmψGAGGCAGmψGACAmψAmψmψCCCmψGGGCAAGmψmψCGGACAGCGGGCCCmψGGAmψmψmψmψmψAmψmψCCAmψmψCAmψGmψGACCAAGGAAmψCCACCCACCCCGmψCAAGCCmψCmψmψGCCCAAAmψmψGCCGGCAACAGAmψACGCCmψCCAGCCCCGmψGGGCAAGGCCCmψGAGCGACGCCmψGmψAmψGGGCACCAmψCGCCAGCmψmψCCmψGmψCmψAAGmψACCAGGACAmψmψAmψCAmψCGAGCACCAGAAGGmψGGmψGAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAGAGCCmψGCGCGAGCmψGGCCGGCAAGGAAAACCmψGGAGmψAmψCCmψAGCGmψGACCCmψGCCmψCCmψCAGCCmψCAmψACAAAGGAGGGCGmψGGAmψGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCCGGGmψGCGGAmψGmψGGGmψGAACCmψGAAmψCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAGCmψGmψCmψAGAGACGACGCCAAGCCCCmψGCmψGAGACmψGAAGGGCmψmψCCCCAGCmψmψCCCmψCmψGGmψGGAGAGACAGGCAAAmψGAAGmψGGACmψGGmψGGGACAmψGGmψGmψGmψAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAAmψGAGAAGAAGGAGGACGGCAAAGmψGmψmψCmψGGCAGAAmψCmψGGCCGGCmψACAAGCGmψCAGGAGGCCCmψGCGGCCCmψACCmψGAGCAGCGAGGAAGACAGAAAGAAGGGCAAGAAGmψmψCGCCCGGmψAmψCAGCmψGGGGGACCmψGCmψGCmψGCACCmψCGAGAAGAAGCACGGCGAAGACmψGGGGGAAGGmψGmψACGAmψGAGGCCmψGGGAGCGGAmψCGAmψAAGAAGGmψGGAGGGCCmψGAGCAAGCACAmψCAAGCmψGGAGGAGGAACGGAGAmψCmψGAGGACGCCCAGAGCAAGGCCGCCCmψGACCGACmψGGCmψGAGAGCCAAGGCCAGCmψmψCGmψCAmψCGAGGGGCmψGAAGGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCCGGmψGCGAACmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGAGAmψCmψGAGAGGCAAACCmψmψmψCGCCAmψCGAGGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGCGCCmψmψmψAmψmψmψGGCAGAAGGACGGAGmψGAAGAAGCmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAACmψAmψmψmψCAAGGGCGGCAAGCmψGAGAmψmψCAAGAAGAmψCAAGCCmψGAAGCCmψmψCGAGGCCAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψmψAACAAGAAAAGCGGAGAGAmψCGmψGCCAAmψGGAAGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCmψAACCmψGAmψCAmψCCmψGCCCCmψGGCAmψmψmψGGCAAGCGGCAGGGCAGAGAGmψmψCAmψCmψGGAACGACCmψGCmψGmψCmψCmψGGAGACCGGCAGCCmψGAAGCmψGGCCAACGGCAGAGmψGAmψCGAGAAGACACmψGmψACAACAGACGAACCAGACAAGACGAGCCCGCCCmψGmψmψmψGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGAGAAGAGAGGmψGCmψGGACAGCAGCAAmψAmψCAAGCCmψAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGACCGGGGCGAGAACAmψCCCmψGCCGmψGAmψCGCCCmψmψACCGACCCCGAGGGAmψGCCCmψCmψGAGCCGGmψmψmψAAAGACAGCCmψGGGCAACCCmψACCCACAmψCCmψGAGAAmψmψGGCGAGmψCCmψACAAGGAGAAGCAGAGAACCAmψCCAGGCCAAGAAGGAGGmψGGAGCAGCGGCGGGCmψGGCGGCmψACmψCCCGGAAGmψACGCCAGCAAGGCCAAGAACCmψGGCCGACGACAmψGGmψmψAGAAAmψACCGCCAGAGACCmψCCmψGmψACmψACGCmψGmψGACCCAGGACGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGAGAACCmψGAGCAGAGGCmψmψCGGCAGACAGGGCAAGAGAACCmψmψCAmψGGCCGAGAGACAGmψACACCCGGAmψGGAGGACmψGGCmψGACCGCCAAGCmψGGCCmψACGAGGGCCmψGCCCmψCmψAAGACCmψACCmψGmψCCAAGACCmψmψGGCACAGmψACACCAGCAAGACAmψGCmψCmψAACmψGCGGCmψmψCACAAmψCACGAGCGCCGACmψACGACCGGGmψGCmψGGAGAAACmψGAAGAAGACCGCCACAGGCmψGGAmψGACCACCAmψmψAACGGCAAGGAGCmψGAAGGmψGGAGGGCCAGAmψCACCmψACmψACAACAGGmψACAAACGGCAGAACGmψGGmψGAAGGACCmψGAGCGmψGGAACmψGGAmψAGACmψGAGCGAGGAAAGCGmψAAACAAmψGACAmψCAGCAGCmψGGACCAAGGGCCGGAGCGGCGAGGCCCmψGAGCCmψGCmψGAAGAAGAGAmψmψCmψCCCACAGACCAGmψGCAGGAGAAGmψmψCGmψGmψGmψCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACCCACGCCGACGAGCAAGCCGCCCmψGAACAmψCGCCCGGmψCmψmψGGCmψmψmψmψCCmψGCGGAGCCAGGAGmψACAAGAAGmψACCAGACAAACAAGACCACAGGCAACACAGACAAGAGAGCCmψmψCGmψCGAGACCmψGGCAGAGCmψmψCmψACAGAAAGAAGCmψGAAGGAGGmψGmψGGAAGCCmψGCCGmψGGGAAGCCCCGCmψGCCAAGAGAGmψGAAGCmψGGACmψAAmψAGAmψAAGCmψGCCmψmψCmψGCGGGGCmψmψGCCmψmψCmψGGCCAmψGCCCmψmψCmψmψCmψCmψCCCmψmψGCACCmψGmψACCmψCmψmψGGmψCmψmψmψGAAmψAAAGCCmψGAGmψAGGAAGmψCmψAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3136

gRNA之合成：

靶向人類P CSK9基因座之gRNA係使用gRNA支架316設計且以化學方式合成。此外， B2M靶向gRNA係用作實驗對照。此實例中評定之靶向間隔子的序列列於表21中。 表 21 ： 此實例中評定之間隔子之序列

間隔子ID	目標	靶向間隔子序列(RNA)	SEQ ID NO
7.37	人類 B2M	GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG	3137
6.1	人類 PCSK9	GAGGAGGACGGCCUGGCCGA	1834
6.125	人類 PCSK9	AGAAAGAGCAAGCCUCAUGU	1845
6.138	人類 PCSK9	AGGGAUUUAUACUACAAAGA	1852
6.153	人類 PCSK9	GUUAAUGUUUAAUCAGAUAG	1866
6.157	人類 PCSK9	GGGUCUGAGCCUGGAGGAGU	1869
6.172	人類 PCSK9	GCUGAAACAGAUGGAAUACU	1879
6.181	人類 PCSK9	UCAUCUGCACUCGUGGCCAC	2228

將mRNA及gRNA轉染至HepG2細胞、Hep3B細胞及Huh7細胞中，且進行ELISA以評定PCSK9分泌：

在此實驗中使用以下三種人類肝細胞癌細胞株：HepG2細胞、Hep3B細胞及Huh7細胞。每孔接種各細胞株之約15,000個細胞；次日，用編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及具有支架316及靶向 B2M或 PCSK9基因座之間隔子的gRNA轉染所接種細胞(特定間隔子及序列參見表21)。轉染後4天收集培養基上清液以藉由ELISA評定PCSK9分泌水平，且將PCSK9分泌水平以總細胞計數標準化且示於圖3至圖5。繼續培養經處理之Huh7細胞，且轉染後14及27天收集培養基上清液用於藉由ELISA量測PCSK9分泌。作為額外實驗對照，亦量測自含有未經處理之初始細胞之孔收集的培養基上清液中之PCSK9分泌。 結果：

用編碼催化活性CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3之mRNA及靶向 B2M或 PCSK9基因座之gRNA轉染HepG2細胞、Hep3B細胞及Huh7細胞，且量測所分泌PCSK9水平。在轉染後4天，各條件之標準化PCSK9分泌水平之定量描繪於圖3至圖5中。資料表明在Huh7細胞中觀測到藉由CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3對PCSK9分泌之最高效的減弱，而HepG2細胞對所分泌PCSK9水平未展現出有效的減弱(圖3至圖5)。同時，Hep3B細胞總體上展現低PCSK9分泌水平，說明在所用細胞株中，Hep3B細胞株最不適於誘導及展現PCSK9抑制(圖3至圖5)。

轉染後，繼續培養經處理之Huh7細胞直至第27天，且在第14天及第27天量測PCSK9分泌。圖6中之條形圖示出在第4天、第14天及第27天時間點PCSK9抑制之定量結果，該等結果顯示為相對於在第4天時間點偵測到的初始對照的水平的PCSK9基因減弱。資料表明用具有間隔子6.138及6.157之gRNA處理具有LTRP5-ADD-ZIM3之Huh7細胞引起PCSK9分泌之最有效抑制，且此抑制持續至轉染後第27天(圖6)。類似地，在用催化活性CasX 676及間隔子6.1處理Huh7細胞時觀測到持續基因減弱。雖然用dXR1及間隔子6.138處理在第4天引起初始強力抑制，但此抑制效應為暫態的，因為PCSK9分泌水平在轉染後第14天及第27天返回至基線水平(圖6)。如所預期，在此時程實驗期間，用三個mRNA分子中之任一者與靶向 B2M基因座之間隔子7.37處理並不影響PCSK9分泌水平。

此等實驗證明使用具有ADD域之LTRP分子與適當的靶向間隔子可引起各種人類細胞株中內源性目標基因座之長期緘默化。此等發現亦表明具有ADD域之LTRP分子可作為mRNA與靶向gRNA共同遞送至細胞以誘導抑制。 實例 3 ： 經修飾之 gRNA 之設計及其在活體外及活體內與 CasX mRNA 一起遞送時在改良編輯方面的評定

進行實驗以鑑別新gRNA變異體序列，且證明此等gRNA變異體之化學修飾增強CasX:gRNA系統在活體外與CasX mRNA一起遞送時之編輯效率。 材料及方法： gRNA之合成：

此實例中測試之所有gRNA係以經化學方式合成且來源於gRNA支架174、235及316。gRNA支架174、235及316之序列及其化學修飾概況列於表22中。所得gRNA之序列(包括靶向 PCSK9、 B2M或 ROSA26之間隔子)及其在此實例中所分析之化學修飾概況列於表23中。gRNA支架變異體174、235及316之結構的示意圖分別顯示於圖7至圖9中，且gRNA變異體之化學修飾之位點示意性地顯示於圖10、圖11、圖12、圖13及圖14中。 表 22 ： gRNA 支架序列及其不同化學修飾概況 ( 由型式編號表示 ) ， 其中「 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 」係間隔子預留位置。化學修飾 ： *= 硫代磷酸酯鍵 ； m=2'OMe 修飾

gRNA 支架( 型式))	gRNA 序列	SEQ ID NO:
174 (v0)	ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN	2947
174 (v1)	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2948
174 (v2)	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU	2949
174 (v3)	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmUmUmAmUmCmUmGmAmUUACUUUGmAmGmAmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUmCmAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2950
174 (v4)	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUUUmAmUmCmUmGmAmUUACUUUGmAmGmAmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2951
174 (v5)	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2952
174 (v6)	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2953
174 (v7)	mA*mC*mU*GGmCGmCmUUUUAmUmCUGAUUACUUUGmAmGAGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2954
174 (v8)	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2955
174 (v9)	mA*mC*mU*GGmCmGCmUUUUAmUmCUGAUUACUUUGmAmGAGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAAAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2956
235 (v0)	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN	2957
235 (v1)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2958
235 (v2)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU	2959
235 (v3)	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2960
235 (v4)	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2961
235 (v5)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2962
235 (v6)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNmN*mN*mN	2963
235 (v7)	mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2964
235 (v8)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2965
235 (v9)	mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2966
316 (v0)	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN	2967
316 (v1)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2968
316 (v2)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN*mU*mU*mU	2969
316 (v3)	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUmCmAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2970
316 (v4)	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2971
316 (v5)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2972
316 (v6)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2973
316 (v7)	mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2974
316 (v8)	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2975
316 (v9)	mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGNNNNNNNNNNNNNNNNN*mN*mN*mN	2976

表 23 ： gRNA 之序列及其在此實例中分析之不同化學修飾概況 ( 由型式編號表示 ) 。化學修飾 ： *= 硫代磷酸酯鍵 ； m=2'OMe 修飾

gRNA ID(支架變異體-間隔子)	目標	gRNA 序列	SEQ ID NO:
174-6.7 (v0)	人類 PCSK9	ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA	3145
174-6.7 (v1)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA	3074
174-6.8 (v0)	人類 PCSK9	ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA	3146
174-6.8 (v1)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA	3147
174-7.9 (v0)	人類 B2M	ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGUGUAGUACAAGAGAUAGAA	3148
174-7.9 (v1)	人類 B2M	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGUGUAGUACAAGAGAUAmG*mA*mA	3149
316-6.7 (v0)	人類 PCSK9	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA	3150
316-6.7 (v1’)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA	3151
316-6.8 (v0)	人類 PCSK9	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA	3152
316-6.8 (v1’)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA	3153
316-7.9 (v0)	人類 B2M	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGGUGUAGUACAAGAGAUAGAA	3154
316-7.9 (v1’)	人類 B2M	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGGUGUAGUACAAGAGAUAmG*mA*mA	3155
174-7.37 (v0)	人類 B2M	ACUGGCGCUUUUAUCUgAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAgUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGGCCGAGAUGUCUCGCUC	3156
174-7.37 (v1*)	人類 B2M	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUgAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAgUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGGGCCGAGAUGUCUCG*mC*mU*mC	3157
235-6.7 (v0)	人類 PCSK9	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGA	3158
235-6.7 (v1)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA	3159
235-6.7 (v2)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAAGAU*mU*mU*mU	3160
235-6.7 (v3)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA	3161
235-6.7 (v4)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA	3162
235-6.7 (v5)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA	3163
235-6.7 (v6)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUCCUGGCUUCCUGGUGAmA*mG*mA	3164
235-6.8 (v0)	人類 PCSK9	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA	3165
235-6.8 (v1)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA	3166
235-6.8 (v2)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCCGCUUACGGACUUCGGUCCGUAAGAGGCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAUGA*mU*mU*mU	3167
235-6.8 (v3)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCmUmUmCmUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUmCmAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA	3168
235-6.8 (v4)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*mGmGmCmGmCUUCUmAmUmCmUmGmAmUUACUCUGmAmGmCmGmCmCmAmUmCmAmCmCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGmGmGmUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCmAmUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA	3169
235-6.8 (v5)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA	3170
235-6.8 (v6)	人類 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUmAmAmAmGmCmCmGmCmUmUmAmCmGmGmAmCmUmUmCmGmGmUmCmCmGmUmAmAmGmAmGmGmCAUCAGAGUGGCUUCCUGGUGAAGAmU*mG*mA	3171
316-27.107 (v0)	小鼠 PCSK9	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAGAUG	3172
316-27.107 (v1)	小鼠 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG	3173
316-27.107 (v7)	小鼠 PCSK9	mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG	3174
316-27.107 (v8)	小鼠 PCSK9	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCmAmUmCmAmCCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGmGmUmAmAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCmAmUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAAG*mA*mU*mG	3175
316-27.107 (v9*)	小鼠 PCSK9	mA*mC*mU*GGmCGmCmUUCUAmUmCUGAUUACUCUGmAmGCGCCAUCACCAGCmGmAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGCUGGCUUCUUGGUGAA*mG*mA*mU*mG	3176
174-35.2 (v0)	ROSA26	ACUGGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU	3177
174-35.2 (v2)	ROSA26	mA*mC*mU*GGCGCUUUUAUCUGAUUACUUUGAGAGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAAAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU*mU*mU*mU	3178
316-35.2 (v0)	ROSA26	ACUGGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGUCUU	3179
316-35.2 (v1)	ROSA26	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGACUAUGUCGUAGUGGGUAAAGCUCCCUCUUCGGAGGGAGCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGU*mC*mU*mU	3180
316-35.2 (v5)	ROSA26	mA*mC*mU*GGCGCUUCUAUCUGAUUACUCUGAGCGCCAUCACCAGCGAmCmUAUmGmUmCmGUAGUGGGUAAAmGmCmUmCmCmCmUmCmUmUmCmGmGmAmGmGmGmAmGmCAUCAGAGAGAAGAUGGGCGGGAGU*mC*mU*mU	3181

注意，標註有v1'設計之gRNA在gRNA之3'末端上少含一個硫代磷酸酯鍵。標註有v1*之gRNA在gRNA之3'末端上多含一個硫代磷酸酯鍵。標註有v9*之gRNA在gRNA之3'末端上多含一個硫代磷酸酯鍵。 gRNA活性之生物化學表徵：

在5'末端上具有螢光部分之目標DNA寡核苷酸為市售購買的(列於表24中之序列)。藉由將寡核苷酸以1:1比率混合於1×裂解緩衝液(20 mM Tris HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM TCEP、5%甘油、10 mM MgCl ₂)中，隨後加熱至95℃持續10分鐘，且接著使溶液冷卻至室溫來形成雙股DNA (dsDNA)目標。將CasX核糖核蛋白(RNP)在1×裂解緩衝液中用CasX 491及指定gRNA重構，最終濃度為1 µM且指定gRNA過量1.2倍。使RNP在37℃下形成，保持10分鐘。

測定gRNA支架之各種結構及化學修飾對CasX 491 RNP之裂解率的影響。用200 nM之最終RNP濃度及10 nM之最終目標濃度製備裂解反應，且反應係在16℃下進行且藉由添加經標記之目標DNA受質起始(表24)。在0.25、0.5、1、2、5及10分鐘獲取反應的等分試樣且藉由添加相等體積之95%甲醯胺及20 mM EDTA來淬滅。使樣本在95℃變性10分鐘且在10%脲-PAGE凝膠上解析。將凝膠在Typhoon ^TM雷射-掃描儀平台上成像且使用ImageQuant ^TMTL 8.2影像分析軟體(Cytiva ^TM)定量。針對各CasX:gRNA組合測定非目標股裂解之表觀一級速率常數(k _{裂解 ­})。

為了確定由各gRNA形成之勝任型分率，製備具有100 nM之最終RNP濃度及100 nM之最終目標濃度的裂解反應。反應係在37℃下進行且藉由添加經標記之目標受質來起始(表24)。在0.5、1、2、5、10及30分鐘獲取等分試樣且藉由添加相等體積之95%甲醯胺及25 mM EDTA來淬滅。藉由在95℃加熱10分鐘使樣本變性且在10%脲-PAGE凝膠上解析。如上對凝膠進行成像及定量。假定CasX在分析條件下充當單次周轉酶，由以下觀測結果所指示：低於化學計算量的酶即使在延長時間標度下仍無法裂解超過化學計算量的目標受質，反而將接近與存在之酶之量成比例的平穩段。因此，在長時間標度上藉由等莫耳量之RNP裂解的目標受質之分率將指示恰當地形成且對裂解具有活性的RNP分率。用兩相速率模型擬合裂解跡線，因為裂解反應在此濃度方案下明顯偏離單相。確定各擬合之平穩段且以各RNP之活性分率報導於表27中。 表 24 ： 用於 gRNA 活性之生物化學表徵的在 5' 末端上具有螢光部分之目標 DNA 受質寡核苷酸的序列。 /700/ = IRDye700; /800/ = IRDye800

DNA 受質	序列
6.7/6.8目標上股 (SEQ ID NO: 3182)	/700/catgtcttccatggccttcttcctggcttcctggtgaagatgagtggcgacctgctggag
6.7/6.8目標下股 (SEQ ID NO: 3183)	/800/ctccagcaggtcgccactcatcttcaccaggaagccaggaagaaggccatggaagacatg

CasX mRNA之活體外轉錄：

藉由PCR，使用含有T7啟動子之正向引子，隨後用瓊脂糖凝膠提取適當大小的DNA來產生用於活體外轉錄之編碼CasX 491的DNA模板(關於編碼序列參見表25)。在各活體外轉錄反應中使用最終濃度為25 ng/µL之模板DNA，該活體外轉錄反應係按照製造商推薦之方案略加修改後進行。在37℃下用CleanCap® AG及N1-甲基-假尿苷進行2至3小時之活體外轉錄反應培育之後，對模板DNA進行DNA酶消化且使用Zymo RNA miniprep套組進行基於管柱之純化。按照製造商的方案使用大腸桿菌聚腺苷酸聚合酶添加聚腺苷酸尾，隨後如上所陳述進行基於管柱之純化。將加聚腺苷酸尾的經活體外轉錄之RNA在不含RNA酶之水中溶離，在Agilent TapeStation上分析其完整性，且快速冷凍，隨後儲存於-80℃。 表 25 ： 此實例中評定之 CasX mRNA 分子之編碼序列 *

CasX 491 mRNA ID	組分(ID)	DNA 序列	SEQ ID NO:
CasX 491 mRNA #1	5'UTR	GACCGGCCGCCACC	3082
START 密碼子+ c-MYC NLS + 連接子	ATGGCCCCAGCGGCCAAACGGGTGAAGCTGGACTCTAGA	3184
CasX 491	CAAGAGATCAAGAGAATCAACAAGATCAGAAGGAGACTGGTCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCATGAAAACCCTGCTCGTCAGAGTGATGACCCCTGACCTGAGAGAGCGGCTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCCGAGAACATCCCTCAGCCTATCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCTGAACAAGCTGCTGACCGACTACACCGAGATGAAGAAAGCCATCCTGCACGTGTACTGGGAAGAGTTCCAGAAAGACCCCGTGGGCCTGATGAGCAGAGTTGCTCAGCCTGCCAGCAAGAAGATCGACCAGAACAAGCTGAAGCCCGAGATGGACGAGAAGGGCAATCTGACCACAGCCGGCTTTGCCTGCTCTCAGTGTGGCCAGCCTCTGTTCGTGTACAAGCTGGAACAGGTGTCCGAGAAAGGCAAGGCCTACACCAACTACTTCGGCAGATGTAACGTGGCCGAGCACGAGAAGCTGATTCTGCTGGCCCAGCTGAAACCTGAGAAGGACTCTGATGAGGCCGTGACCTACAGCCTGGGCAAGTTTGGACAGAGAGCCCTGGACTTCTACAGCATCCACGTGACCAAAGAAAGCACACACCCCGTGAAGCCCCTGGCTCAGATCGCCGGCAATAGATACGCCTCTGGACCTGTGGGCAAAGCCCTGTCCGATGCCTGCATGGGAACAATCGCCAGCTTCCTGAGCAAGTACCAGGACATCATCATCGAGCACCAGAAGGTGGTCAAGGGCAACCAGAAGAGACTGGAAAGCCTGAGGGAGCTGGCCGGCAAAGAGAACCTGGAATACCCCAGCGTGACCCTGCCTCCTCAGCCTCACACAAAAGAAGGCGTGGACGCCTACAACGAAGTGATCGCCAGAGTGAGAATGTGGGTCAACCTGAACCTGTGGCAGAAGCTGAAACTGTCCAGGGACGACGCCAAGCCTCTGCTGAGACTGAAGGGCTTCCCTAGCTTCCCTCTGGTGGAAAGACAGGCCAATGAAGTGGATTGGTGGGACATGGTCTGCAACGTGAAGAAGCTGATCAACGAGAAGAAAGAGGATGGCAAGGTTTTCTGGCAGAACCTGGCCGGCTACAAGAGACAAGAAGCCCTGAGGCCTTACCTGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGTTCGCCAGATACCAGCTGGGCGACCTGCTGCTGCACCTGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACTGGGGCAAAGTGTACGATGAGGCCTGGGAGAGAATCGACAAGAAGGTGGAAGGCCTGAGCAAGCACATTAAGCTGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAATCTAAAGCCGCTCTGACCGATTGGCTGAGAGCCAAGGCCAGCTTTGTGATCGAGGGCCTGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGTTCTGCAGATGCGAGCTGAAGCTGCAGAAGTGGTACGGCGATCTGAGAGGCAAGCCCTTCGCCATTGAGGCCGAGAACAGCATCCTGGACATCAGCGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGCGCCTTCATTTGGCAGAAAGACGGCGTCAAGAAACTGAACCTGTACCTGATCATCAATTACTTCAAAGGCGGCAAGCTGCGGTTCAAGAAGATCAAACCCGAGGCCTTCGAGGCTAACAGATTCTACACCGTGATCAACAAAAAGTCCGGCGAGATCGTGCCCATGGAAGTGAACTTCAACTTCGACGACCCCAACCTGATTATCCTGCCTCTGGCCTTCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGTTCATCTGGAACGATCTGCTGAGCCTGGAAACCGGCTCTCTGAAGCTGGCCAATGGCAGAGTGATCGAGAAAACCCTGTACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCTGCTCTGTTTGTGGCCCTGACCTTCGAGAGAAGAGAGGTGCTGGACAGCAGCAACATCAAGCCCATGAACCTGATCGGCGTGGACCGGGGCGAGAATATCCCTGCTGTGATCGCCCTGACAGACCCTGAAGGATGCCCACTGAGCAGATTCAAGGACTCCCTGGGCAACCCTACACACATCCTGAGAATCGGCGAGAGCTACAAAGAGAAGCAGAGGACAATCCAGGCCAAGAAAGAGGTGGAACAGCGCAGAGCCGGCGGATACTCTAGGAAGTACGCCAGCAAGGCCAAGAATCTGGCCGACGACATGGTCCGAAACACCGCCAGAGATCTGCTGTACTACGCCGTGACACAGGACGCCATGCTGATCTTCGAGAATCTGAGCAGAGGCTTCGGCCGGCAGGGCAAGAGAACCTTTATGGCCGAGAGGCAGTACACCAGAATGGAAGATTGGCTCACAGCTAAACTGGCCTACGAGGGACTGAGCAAGACCTACCTGTCCAAAACACTGGCCCAGTATACCTCCAAGACCTGCAGCAATTGCGGCTTCACCATCACCAGCGCCGACTACGACAGAGTGCTGGAAAAGCTCAAGAAAACCGCCACCGGCTGGATGACCACCATCAACGGCAAAGAGCTGAAGGTTGAGGGCCAGATCACCTACTACAACAGGTACAAGAGGCAGAACGTCGTGAAGGATCTGAGCGTGGAACTGGACAGACTGAGCGAAGAGAGCGTGAACAACGACATCAGCAGCTGGACAAAGGGCAGATCAGGCGAGGCTCTGAGCCTGCTGAAGAAGAGGTTTAGCCACAGACCTGTGCAAGAGAAGTTCGTGTGCCTGAACTGCGGCTTCGAGACACACGCCGATGAACAGGCTGCCCTGAACATTGCCAGAAGCTGGCTGTTCCTGAGAAGCCAAGAGTACAAGAAGTACCAGACCAACAAGACCACCGGCAACACCGACAAGAGGGCCTTTGTGGAAACCTGGCAGAGCTTCTACAGAAAAAAGCTGAAAGAAGTCTGGAAGCCCGCCGTG	3185
連接子+ c-MYC NLS	GGCTCCCCCGCCGCGAAGCGAGTGAAACTGGACGGATCCGGC	3186
P2A mScarlet + STOP 密碼子	GCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGATGGTATCAAAGGGTGAGGCGGTCATTAAGGAATTCATGCGGTTCAAAGTTCACATGGAGGGGAGTATGAATGGTCACGAATTTGAGATCGAGGGTGAGGGAGAGGGTAGACCTTACGAAGGCACCCAGACAGCAAAACTCAAAGTCACTAAGGGCGGCCCACTCCCTTTCTCATGGGATATACTGAGTCCTCAATTTATGTATGGCTCCCGGGCCTTTATCAAGCATCCAGCCGACATACCCGATTACTATAAACAGTCATTCCCCGAGGGATTCAAATGGGAGAGAGTGATGAATTTTGAAGACGGGGGTGCCGTGACCGTAACTCAAGATACCTCTTTGGAAGATGGTACCCTCATTTACAAGGTTAAGCTTAGAGGAACTAATTTCCCACCAGACGGACCCGTTATGCAGAAAAAAACCATGGGTTGGGAGGCTAGCACCGAACGGCTGTATCCAGAGGATGGAGTTTTGAAAGGTGATATTAAGATGGCCCTGCGCCTGAAAGACGGAGGGCGGTACCTCGCAGATTTCAAAACTACCTACAAAGCTAAGAAACCGGTCCAAATGCCGGGTGCTTATAACGTCGATAGGAAGCTGGATATAACATCACACAACGAAGACTATACGGTTGTCGAACAGTATGAGCGATCTGAGGGGAGGCACAGCACGGGCGGGATGGATGAGCTTTACAAGTGA	3187
CasX 676 mRNA #2	5'UTR	AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC	3047
START 密碼子+ c-MYC NLS	ATGGCCCCTGCTGCCAAGAGAGTGAAGCTGGATAGCAGA	3133
CasX 676	參見表 19 中之序列	3134
c-MYC NLS + STOP 密碼子	GGAAGCCCCGCTGCCAAGAGAGTGAAGCTGGACTAATAGATAA	3135
3'UTR	GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG	3055
XbaI限制位點(部分)	TCTAG	3056
聚腺苷酸尾	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3057

*各組分以在構築體內之5'至3'次序列出 經由轉染活體外遞送gRNA及CasX mRNA：

與使用具有支架變異體316之 PCSK9靶向gRNA之條件相比，針對使用CasX 491 mRNA與具有支架變異體174之 PCSK9靶向gRNA共同遞送的條件來評定 PCSK9基因座之編輯以及後續對分泌之PCSK9水平的影響。使用脂染胺將100 ng編碼CasX 491與P2A及mScarlet螢光蛋白的活體外轉錄之mRNA與gRNA 174-6.7、174-6.8、316-6.7及316-6.8之型式1 (v1)一起轉染至HepG2細胞中(參見表23)。更換培養基後，在轉染後28小時收集以下各物：1)收集經轉染細胞，以藉由次世代定序(next generation sequencing；NGS)評定在PCSK9基因座處之編輯；及2)收集培養基上清液以藉由ELISA量測所分泌之PCSK9蛋白質水平。對於藉由NGS進行編輯分析，用一組靶向PCSK9基因座之引子自所提取之200 ng gDNA中擴增出擴增子，且經處理用於定序(描述如下)。亦按照製造商說明書，使用來自CISBio的基於螢光共振能量轉移之免疫分析來分析培養基上清液中所分泌之PCSK9水平。此處，使用支架174及靶向內源性 B2M(β-2-微球蛋白)基因座之間隔子7.37 (v0；參見表23)的gRNA用作非靶向(NT)對照。此等結果顯示於圖15中。

為比較 B2M靶向gRNA之未經修飾之型式0 (v0)及經化學修飾型式1 (v1)的編輯效力，96孔盤每孔接種約6E4個HepG2肝細胞。24小時後，使用脂染胺與100 ng編碼CasX 491之活體外轉錄mRNA及不同劑量(1、5或50 ng)之含有支架變異體174及間隔子7.37之 B2M靶向gRNA之v0或v1型共轉染所接種細胞(參見表23)。轉染後六天，收集細胞，用於經由B2M依賴性HLA蛋白之免疫染色，接著使用Attune ^TMNxT流式細胞儀進行流動式細胞測量術來分析B2M蛋白表現。此等結果顯示於圖16中。

評定經化學修飾之 PCSK9靶向gRNA的v1至v6變異體(表23)對編輯效力的影響及後續對分泌之PCSK9水平的影響。簡言之，使用脂染胺將100 ng編碼CasX變異體491及P2A及mScarlet螢光蛋白的活體外轉錄之mRNA與50 ng指定經化學修飾之gRNA轉染至HepG2細胞中。更換培養基後，在轉染後28小時收集以下各物：1)如上文所描述，收集經轉染細胞，以藉由NGS評定在 PCSK9基因座處之編輯；及2)如上文所描述，收集培養基上清液以藉由ELISA量測所分泌之PCSK9蛋白質水平。此處， B2M靶向gRNA用作非靶向對照。此等結果顯示於表28中。 NGS處理及分析：

按照製造商說明書使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus套組提取來自所收集細胞之基因體DNA (gDNA)。藉由用一組靶向人類 PCSK9基因座之引子擴增所提取之約50至200 ng gDNA的所關注區域來形成目標擴增子。此等基因特異性引子在5′末端含有額外序列以引入Illumina讀段1及2序列。此外，其含有充當獨特分子識別符(UMI)之16核苷酸隨機序列。使用Fragment Analyzer DNA分析儀套組(Agilent，dsDNA 35-1500 bp)評定擴增子之品質及定量。根據製造商說明書，在Illumina MiSeq™上對擴增子進行定序。藉由修整品質及銜接子序列且將讀段1及讀段2合併為單個插入序列來處理原始fastq定序檔案；接著藉由CRISPResso2 (v 2.0.29)程式來分析插入序列。確定在間隔子之3'末端周圍的窗口中經修飾之讀段的百分比。對於各者，CasX分子之活性經定量為此窗口內任何地方含有插入、取代及/或缺失之讀段的總百分比。 脂質奈米粒子(LNP)之調配：

按照製造商之指南，使用GenVoy-ILM ^TM脂質在Precision NanoSystems Inc. (PNI) Ignite ^TMBenchtop系統上將CasX mRNA及gRNA囊封至LNP中。GenVoy-ILM ^TM脂質係由PNI製造，其組成為呈50:10:37.5:2.5 mol%的可離子化脂質:DSPC:膽固醇:穩定劑。

簡言之，為了調配LNP，將相等質量比之CasX mRNA及gRNA稀釋於PNI調配緩衝液(pH 4.0)中。將GenVoy-ILM ^TM以1:1稀釋於無水乙醇中。使用預定N/P比進行mRNA/gRNA共同調配。將RNA及脂質在PNI Ignite ^TMBenchtop系統上以預定流動速率比(RNA:Genvoy-ILM ^TM)穿過PNI層流濾筒。調配後，將LNP稀釋於PBS (pH 7.4)中，以降低乙醇濃度且提高pH，由此提高粒子之穩定性。藉由在4℃下使用10k Slide-A-Lyzer™滲析卡匣(Thermo Scientific™)滲析透析至PBS (pH 7.4)中來達成mRNA/sgRNA-LNP之緩衝液交換。滲析之後，將mRNA/gRNA-LNP使用100 kDa Amicon®-Ultra離心過濾器(Millipore)濃縮至＞ 0.5 mg/mL，隨後過濾滅菌。在Stunner (Unchained Labs)上分析所調配LNP以測定其直徑及多分散性指數(PDI)。藉由RiboGreen ^TM分析，使用Invitrogen之Quant-iT ^TMRiboGreen ^TMRNA分析套組測定囊封效率及RNA濃度。在本文所描述之各個實驗中使用LNP將CasX mRNA及gRNA遞送至目標細胞及組織。 活體外遞送囊封CasX mRNA及靶向gRNA之LNP：

於96孔盤中每孔接種約50,000個HepG2細胞，該等細胞在含有10% FBS及1%青黴素鏈黴素(PenStrep)之DMEM/F-12培養基中培養。次日，用變化濃度之LNP處理所接種之細胞，LNP以250 ng起始，按六個2倍連續稀釋製備。調配此等LNP以囊封CasX 491 mRNA及併入支架變異體174或316與間隔子7.9之靶向 B2M的gRNA (v1；參見表23)。在LNP處理之後24小時更換培養基，且再培養細胞六天，然後收集細胞用來提取gDNA，以用於藉由NGS評定在B2M基因座處之編輯，及經由HLA免疫染色，隨後使用Attune NxT流式細胞儀進行流動式細胞測量術來分析B2M蛋白質表現。簡言之，對於編輯評定，用靶向人類 B2M基因座之引子自所提取之200 ng gDNA中擴增出擴增子，且使用如下所述之方法藉由NGS處理。此等分析之結果顯示於圖17及圖18中。

在96孔盤中每孔接種約20,000個小鼠Hepa1-6細胞。次日，用變化濃度之LNP處理所接種之細胞，LNP以1000 ng起始，按八個2倍連續稀釋製備。調配此等LNP以囊封CasX 676 mRNA #2 (參見表25)及併入支架變異體316與間隔子35.2之靶向 ROSA26的gRNA (v1或v5；參見表23)。在用LNP處理後24小時更換培養基，且再培養細胞七天，然後收集細胞用來提取gDNA，以用於藉由NGS評定在 ROSA26基因座處之編輯。簡言之，用靶向小鼠 ROSA26基因座之引子自所提取之gDNA中擴增出擴增子，且使用如下所述類似方法藉由NGS處理。此實驗之結果顯示於圖19中。 活體內遞送囊封CasX mRNA及靶向gRNA之LNP：

為評定活體內使用v1及v5支架316之作用，使用1:1的mRNA:gRNA質量比將CasX 676 mRNA #2 (參見表25)以及使用支架316與間隔子35.2之靶向 ROSA26的gRNA (v1或v5；參見表23)囊封在同一LNP內。將所調配LNP經緩衝液交換為PBS以用於活體內注射。簡言之，將LNP經由後眼眶竇經靜脈內投與至4週齡C57BL/6小鼠中。在注射之後觀測小鼠五分鐘以確保其自麻醉恢復，隨後置放於飼養籠中。初始的未注射之動物用作實驗對照。投與後六天，將小鼠處死，且按照製造商說明書使用Zymo Research Quick DNA/RNA Miniprep套組收集肝臟組織以用於提取gDNA。隨後用一組靶向小鼠 ROSA26基因座之引子自所提取之gDNA中擴增出目標擴增子，且使用如下文所述之類似方法處理以藉由NGS評定編輯。此實驗之結果顯示於圖20中。

為了比較活體內使用v7、v8及v9之支架316對 PCSK9基因座之編輯的影響，對於各gRNA，使用1:1的mRNA:gRNA質量比將CasX 676 mRNA #1 (關於序列參見表26)以及使用支架316與間隔子27.107之 PCSK9靶向gRNA (v1、v7、v8或v9；參見表23)囊封在同一LNP內。如以上所描述，將LNP經後眼眶投與至6週齡C57BL/6小鼠中，且注射後七天將小鼠處死以收集肝臟組織用來提取gDNA，以用於藉由NGS評定 PCSK9基因座處之編輯。此實驗之結果顯示於圖21中。 表 26 ： CasX 676 mRNA #1 分子之編碼序列

CasX ID	組分(ID)	描述	DNA 序列	SEQ ID NO:
CasX 676 mRNA #1	5'UTR	hHBA	ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC	3188
START 密碼子+ c-MYC NLS		ATGGCCCCTGCTGCCAAGAGAGTGAAGCTGGATAGCAGA	3133
CasX 676		參見表19 中之序列	3134
c-MYC NLS + STOP 密碼子		GGAAGCCCCGCTGCCAAGAGAGTGAAGCTGGACTAATAGATAA	3135
3'UTR	hHBA	GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA	3189
聚腺苷酸尾		AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3057

*各組分以在構築體內之5'至3'次序列出 結果： 評定各種化學修飾對 gRNA 活性之影響：

涉及Cas9之若干研究已證明，對gRNA進行化學修飾可顯著改良與Cas9 mRNA一起遞送時的編輯活性。在將Cas9 mRNA及gRNA遞送至目標細胞中之後，未受保護之gRNA在mRNA轉譯過程期間易降解。添加化學修飾(諸如2'O-甲基(2'OMe)基團及硫代磷酸酯鍵)可降低gRNA對細胞RNA酶之易感性，但亦有可能破壞gRNA摺疊及其與CRISPR-Cas蛋白質之相互作用。鑒於CasX與Cas9以及其各別gRNA之間缺乏結構類似性，必須從頭設計及驗證適當化學修飾概況。使用來自δ變形菌綱之野生型CasX之公開結構(PDB編碼6NY1、6NY2及6NY3)作為參考物，選擇似乎可能適合於修飾之殘基。然而，公開之結構為野生型CasX直系同源物及gRNA的結構，與用作本文呈現之經工程改造的變異體之基礎的物種有所不同，且其亦缺乏有把握地確定蛋白質側鏈與RNA主鏈之間的相互作用的解析度。此等限制為確定哪些核苷酸可安全地進行修飾帶來極大的不確定性。因此，設計六種化學修飾概況(表示為型式)用於初始測試，且此六種概況繪示於圖10及圖11中。v1概況經設計為簡單的末端保護結構，其中前三個及後三個核苷酸經2'OMe及硫代磷酸酯鍵修飾。在v2概況中，添加3'UUU尾以模擬用於細胞轉錄系統中之終止序列，且將經修飾之核苷酸移動至參與目標識別之間隔子區之外。v3概況包括如同v1中之末端保護，以及在基於結構分析被鑑別為潛在可修飾之所有核苷酸上添加2'OMe修飾。v4概況係基於v3進行建模，但移除三螺旋體區域中之所有修飾，因為根據預測此結構對RNA螺旋結構及主鏈可撓性之任何擾動均更敏感。v5概況維持支架莖及延伸莖區中之化學修飾，而v6概況僅具有延伸莖中之修飾。延伸莖係RNP中完全暴露於溶劑之區域，且其能夠經其他髮夾結構置換且因此可能對化學修飾相對不敏感。

首先相對於未經修飾之gRNA (v0)，評定經最低程度修飾之v1 gRNA，以確定當gRNA與CasX mRNA共同遞送至目標細胞時此類化學修飾對編輯之潛在益處。將具有間隔子7.37的經修飾(v1)及未經修飾(v0)之 B2M靶向gRNA與CasX mRNA共轉染至HepG2細胞中，且藉由流動式細胞測量術偵測B2M依賴性HLA複合物表面呈現之損失來量測 B2M基因座處的編輯(圖16)。資料表明，與在多個劑量之v0 gRNA下所觀測到的水平相比，使用v1 gRNA導致的B2M表現損失要大得多，由此證實gRNA之末端修飾在遞送CasX mRNA及gRNA後增加CasX介導之編輯活性。

使用利用支架變異體235及間隔子6.7及6.8的 PCSK9靶向gRNA評定較廣泛gRNA化學修飾概況集合，以確定額外化學修飾是否將能夠支持活性RNP之形成。進行上文所描述之活體外裂解分析以測定具有各種化學修飾概況之此等經工程改造的gRNA的k _裂解及分率能力。自此等活體外裂解分析之結果顯示於表27中。資料表明具有v3概況之gRNA不展現活性，表明添加一些化學修飾會顯著干擾RNP形成或活性。添加v4化學修飾引起過量RNP條件中之合理裂解率，但展現極低的分率能力。v3與v4修飾之間的差異證實，三螺旋體區域之修飾阻止任何活性RNP形成，此歸因於gRNA無法正常摺疊或gRNA-蛋白質相互作用遭到破壞。由附加v4修飾引起的分率能力降低表明，雖然gRNA能夠與CasX蛋白成功組裝形成裂解勝任型RNP，但絕大部分gRNA摺疊錯誤，或附加的化學修飾降低gRNA對CasX蛋白之親和力，且阻礙RNP之形成效率。應用v5或v6概況產生的勝任型分率與使用v1及v2修飾之反應獲得的勝任型分率相當，但略低於後者。當v5與v6 gRNA之間的k _裂解值相對一致時，v5與v6 gRNA之k _裂解值均幾乎為v1及v2 gRNA的一半。考慮到在經修飾之延伸莖中，gRNA與CasX蛋白之間缺乏預期的相互作用，v6 gRNA之k _裂解值降低尤其出人意料。然而，對於v5及v6 gRNA兩者，由2'OMe修飾引起之gRNA可撓性降低可能阻抑有效裂解所需之RNP結構變化，或包括2'OMe基團可能對參與CasX蛋白相互作用之髮夾的經修飾初始鹼基對產生負面影響。 表 27 ： 對具有使用支架 235 及含有指示化學修飾概況 ( 由型式編號表示 ) 之各種 PCSK9 靶向 gRNA 的 CasX RNP 所評定之裂解活性之參數

gRNA(支架變異體-間隔子，型式編號)	k 裂解(min -1)	分率能力
235-6.7, v1	0.901	0.398
235-6.8, v1	1.36	0.398
235-6.7, v2	0.454	0.386
235-6.8, v2	2.03	0.361
235-6.7, v3	0	0
235-6.8, v3	0	0
235-6.7, v4	0.434	0.031
235-6.8, v4	0.257	0.005
235-6.7, v5	0.506	0.313
235-6.8, v5	0.680	0.388
235-6.7, v6	0.462	0.346
235-6.8, v6	0.715	0.325

隨後在基於細胞之分析中評定基於支架235的經化學修飾之 PCSK9靶向gRNA的編輯。使用脂染胺將CasX mRNA及經化學修飾之 PCSK9靶向gRNA共轉染至HepG2細胞中。藉由NGS測定的在PCSK9基因座處之插入/缺失率及藉由ELISA測定之分泌之PCSK9水平來量測編輯水平，且資料顯示於表28中。資料表明，使用v3及v4 gRNA引起 PCSK9基因座處之最低程度的編輯活性，與來自表27中所示之生物化學活體外裂解分析之發現一致。同時，使用v5及v6 gRNA引起藉由插入/缺失率及PCSK9分泌量測的編輯水平略微低於使用v1及v2 gRNA達到的水平(表28)。具體而言，結果顯示，使用具有末端修飾之v1及v2 gRNA在 PCSK9基因座產生約80-85%編輯，表明向gRNA末端添加化學修飾足以實現CasX之有效編輯。儘管資料表明使用v5及v6 gRNA產生活體外有效編輯，但在轉染單次劑量之gRNA的此實驗中使用v1 gRNA觀測到編輯接近飽和水平。因此，單次劑量的使用使得清楚評定化學修飾對引導限制條件下之編輯的影響具有挑戰性。因此，選擇概況v1及v5進行進一步測試，因為v1含有最簡單的修飾概況，且v5為修飾最重之概況，其在活體外應用顯示出穩健活性(表27及表28)。 表 28 ：在經 CasX 491 mRNA 及使用支架 235 及間隔子 6.7 或 6.8 之各種經化學修飾之 PCSK9 靶向 gRNA 共轉染的 HepG2 細胞中，藉由 NGS 測定的在 PCSK9 基因座處之插入 / 缺失率及藉由 ELISA 測定的分泌之 PCSK9 水平所量測的編輯水平

實驗條件	插入/ 缺失率( 編輯分率)	分泌之PCSK9 (ng/mL)
平均值	標準偏差	平均值	標準偏差
僅CasX mRNA	0.0021	0.003	52	14
235-6.7, v1	0.83	0.0058	18	5.7
235-6.7, v2	0.79	0.0071	21	4
235-6.7, v3	0.024	0.02	48	19
235-6.7, v4	0.12	0.006	34	5.5
235-6.7, v5	0.73	0.023	21	9
235-6.7, v6	0.75	0.0069	22	8.8
235-6.8, v1	0.85	0.017	16	4.4
235-6.8, v2	0.83	0.0028	20	1.5
235-6.8, v3	0.023	0.0027	39	2.7
235-6.8, v4	0.088	0.0086	42	10
235-6.8, v5	0.77	0.017	19	1.6
235-6.8, v6	0.78	0.014	24	6.9
非靶向對照	0.0019	0.0026	42	12

在另一基於細胞之分析中進一步測試v1及v5概況以評定其對編輯效率之影響。LNP經調配以共囊封CasX 676 mRNA #2以及使用新設計之gRNA支架316的v1及v5型經化學修飾之 ROSA26靶向gRNA (在下面小節中將進一步描述)。「v5」概括略經修飾以應用於316支架。在接近延伸莖之5'的非鹼基配對之區域中移除三個2'OMe修飾以將修飾限制於兩個莖環區。用多種劑量之所得LNP處理Hepa1-6肝細胞且在處理後八天收集以評定 ROSA26 基因座處之編輯，其量測為藉由NGS偵測之插入/缺失率(圖19)。資料表明，與藉由v1對應物達成之水平相比，用遞送v5型 ROSA26靶向gRNA的LNP進行處理在整個劑量範圍內引起明顯較低的編輯水平(圖19)。對於圖19中使用v5 gRNA所觀測到的相對活性相對於表28中觀測到的差異，可能有若干種解釋。第一及最可能的解釋為表28中所示的用於實現編輯之單次劑量過高，無法準確量測使用v5 gRNA與v1 gRNA之間的活性差異。亦有可能為在v5之316型式中之莖環模體外移除了修飾，對引導活性產生不利地影響。儘管此等修飾有可能提供比由莖環修飾賦予之活動代價更重要的穩定性益處，但鑒於迄今為止修飾水平的增加導致活性的降低，其似乎不太可能。最後一種可能的解釋為v5概況中之修飾可透過經修飾之核苷酸主鏈與LNP之可離子化脂質之間的差異性相互作用而對LNP調配物或行為產生負面影響，從而可能導致內化後更低效的gRNA囊封或更低效的gRNA釋放。

進一步在活體內測試共囊封CasX mRNA #2以及基於支架316的v1及v5型經化學修飾之 ROSA26靶向gRNA的LNP。圖20顯示編輯分析之結果，以 ROSA26基因座處之插入/缺失率量測的編輯百分比表示。資料表明在活體內LNP遞送之更相關測試條件下，相比於使用v1 gRNA達成之編輯，使用v5 gRNA達成之編輯降低約5倍。此等發現支持表27中對於v5 gRNA在生物化學上觀測到之裂解率降低，表明v5修飾已干擾CasX活性之一些態樣。鑒於在v5及v6概況(表27)中偵測到活性之一致降低，編輯降低可歸因於延伸莖區中之修飾。儘管gRNA之延伸莖與CasX蛋白具有最小相互作用，但在第一鹼基對處添加2'OMe基團有可能破壞CasX蛋白-gRNA相互作用，或破壞延伸莖與假結及三螺旋體區域相接處的複雜RNA摺疊。更具體而言，包括2'OMe基團可能不利地影響gRNA延伸莖之基礎鹼基對及CasX蛋白之殘基R49、K50及K51。最後，CasX之結構研究表明有效DNA裂解需要gRNA之可撓性(Liu J,等人，CasX enzymes comprise a distinct family of RNA-guided genome editors. Nature566:218-223 (2019); Tsuchida CA,等人，Chimeric CRISPR-CasX enzymes and guide RNAs for improved genome editing activity. Mol Cell82(6): 1199-1209 (2022))。因此，在整個延伸莖中添加2'OMe基團可能會加強更剛性的A-形式螺旋結構，且阻止有效裂解所需的gRNA可撓性。此外，可能的係，v5及v6概況中之支架莖中的額外修飾可能對活性不利，但鑒於v5與v6概況之間的比較有限，因此當前並不清楚此情況。

設計額外修飾概況，旨在增強gRNA穩定性同時減輕對RNP裂解活性之不良作用。使用最近公開之浮黴菌門之野生型CasX結構(PDB編碼7WAY、7WAZ、7WB0、7WB1)，其與所評定之經工程改造之CasX變異體具有更高同源性，設計gRNA之額外化學修飾概況且繪示於圖12中。此等概況示出在新設計之gRNA支架變異體中添加2'OMe基團及硫代磷酸酯鍵，其描述於隨後小節中。此等新gRNA化學修飾概況係基於在表28中觀測到之使用v5 gRNA顯示足夠編輯活性的初始資料設計的，該資料表明對延伸莖及支架莖區之修飾不會對活性產生不利影響。v7概況經設計以在整個gRNA結構中可能可修飾之殘基處包括2'OMe，但鑒於之前在v3概況中觀測到添加此類修飾會產生顯著負面影響，排除三螺旋體區域。亦設計更保守性概況v8及v9，如圖12中所示。對於v8構築體，移除假結及三螺旋體環區之修飾，但保留支架莖、延伸莖及其側接單股區以及5'及3'端的修飾。對於v9概況，移除側接莖環之單股區的修飾，但保留莖環本身以及假結、三螺旋環以及5'及3'端的修飾。在 PCSK9基因座處對新設計之gRNA支架變異體316之額外化學修飾概況v7、v8及v9 (下文將進一步討論)進行活體內評定。活體內編輯分析之結果示於圖21中，其定量為在 PCSK9基因座處以NGS偵測到之插入/缺失率量測的編輯百分比。儘管總體上偵測到低編輯效率，但資料表明，與使用v1 gRNA所達成的插入/缺失率相比，使用v7、v8及v9 gRNA在 PCSK9基因座處產生更低的編輯水平(圖21)。不希望受理論束縛，鑒於圖19至圖20中之發現顯示利用v5 gRNA達成之編輯活性較低，故v7、v8及v9概況類似地展現出相對較低的編輯活性亦不足為奇。如圖12中所示出，v7、v8及v9概況包括整個延伸莖區之修飾，該等修飾可能干擾RNP活性。 使用活體外裂解分析比較 gRNA 支架變異體 174 及 316 ：

先前工作已確定，在多種遞送條件下，gRNA支架變異體235為表現最好的支架變異體。然而，相對於包括支架174 (當使用20 bp間隔子時，為109 bp)之gRNA，支架235之長度較長(當使用20 bp間隔子時，為119 bp)，增加固相RNA合成之困難，此將導致製造成本增加、純度及產率降低以及合成失敗率較高。為解決此等問題但同時保留使用支架變異體235之經改良活性，主要在支架235序列之基礎上設計嵌合gRNA支架，但將支架235之延伸莖環置換為支架變異體174的較短延長莖環(圖7至圖9)。所得嵌合支架被命名為支架316，其與支架174及靶向 PCSK9之間隔子6.7及6.8以及靶向 B2M之間隔子7.9平行合成，具有v1化學修飾概況，在所有gRNA的前三個及後三個核苷酸上均有2'OMe及硫代磷酸酯鍵(參見表23)。之所以選擇支架174而非支架235作為比較物，此係因為支架174係先前表徵最佳的支架，其長度與變異體316相同。

評定具有支架174及316以及間隔子6.7及6.8之gRNA的活體外裂解活性。在RNP相對於匹配dsDNA目標過量20倍之情況下進行裂解分析。對全部四種引導物之裂解率進行定量，且結果顯示於表29中。資料表明，在間隔子6.7之情形下，使用支架174或316產生類似裂解率，其中支架316引起之裂解略快於支架174所達成之裂解。在間隔子6.8之情形下，裂解活性差異更明顯：使用支架316之CasX RNP對DNA的裂解幾乎係使用支架174之CasX RNP的兩倍(表29)。

亦用等莫耳量之RNP及DNA目標歷經較長時間過程進行分析，以評定預期RNP中具有裂解活性的分率。因為CasX RNP在所測試之時間標度內基本上單次周轉，且預期所用濃度實質上高於DNA-結合反應之K _D，所以裂解DNA之量應近似活性RNP之量。對於間隔子6.7或6.8，併入支架316之CasX RNP之活性分率比使用支架174之CasX RNP之活性分率高25至30% (表29)。此等資料表明，使用支架316之更高分率gRNA經適當摺疊以與CasX蛋白締合，或使用支架316之gRNA能夠與CasX蛋白更大程度地締合。相比於支架174，支架316攜帶突變，預期使正確gRNA摺疊所需的假結及三螺旋體結構穩定。特定言之，與gRNA結構中其他地方發現之簡單髮夾相比，此等模體更可能發生錯誤摺疊，因此該等模體的穩定性增加可導致摺疊為活性構形之gRNA的分率略高。 表29 ： 對具有含有支架變異體 174 或 316 以及型式 1 (v1) 化學修飾概況之 gRNA 的 CasX RNP 所評定之裂解活性的參數。

gRNA(支架變異體-間隔子)	K 裂解(min -1)	分率能力
174-6.7, v1	0.236	0.194
174-6.8, v1	0.142	0.165
316-6.7, v1	0.264	0.244
316-6.8, v1	0.272	0.213

基於細胞之分析中gRNA支架變異體174及316之比較：

在基於細胞之分析中使用與變異體316相比之gRNA支架變異體174進行編輯評定。將CasX 491 mRNA及使用間隔子6.7及6.8之 PCSK9靶向gRNA的型式1 (v1)經脂質體轉染至HepG2細胞中。轉染後28小時收集經處理細胞以藉由NGS分析PCSK9基因座處之編輯水平及藉由ELISA分析分泌之PCSK9水平，且資料呈現於圖15中。資料表明，與使用 B2M靶向gRNA的非靶向對照相比，使用 PCSK9靶向gRNA中之任一者均在PCSK9基因座處產生高效編輯，且顯著減少PCSK9分泌。結果亦顯示，支架316之使用在 PCSK9基因座處產生的編輯比使用支架174所觀測到的編輯更有效(與支架174相比，使用支架316達成之編輯率提高約10個百分比點)。此發現進一步由ELISA結果支持，使得與使用支架174所達成的分泌相比，使用支架316能更有效地減少PCSK9分泌。

亦在編輯分析中評定支架變異體174及316，其中LNP經調配以共同囊封CasX 491 mRNA及含有支架變異體之 B2M靶向gRNA。用各種劑量之所得LNP處理HepG2細胞，且在處理後七天收集，以評定B2M基因座處之編輯(藉由NGS偵測到之插入/缺失率量測(圖17))及B2M依賴性HLA複合物表面呈現的損失(藉由流動式細胞測量術所偵測(圖18))。來自兩種分析之結果表明，與以各劑量之遞送使用支架174之gRNA的LNP相比，用遞送使用支架316之 B2M靶向gRNA的LNP處理在B2M基因座處引起較高的編輯效力(圖17及圖18)。具體言之，在250 ng之最高劑量下，使用支架316產生之編輯水平比使用支架174獲得之水平高接近兩倍。與自活體外裂解分析觀測到的活性之相對適度差異相比，在使用支架316與使用支架174時編輯功效之此實質性增加可歸因於LNP調配期間gRNA結構及摺疊的不穩定。在LNP調配期間低pH條件及陽離子型脂質之締合會不利地影響gRNA結構之部分且引起展開。因此，gRNA有必要在遞送後在細胞質中快速再摺疊，以便與CasX蛋白結合形成RNP且避免RNA酶降解。與支架174相比，支架316中增加穩定性的突變可對支持gRNA在LNP遞送之後在細胞質中之適當再摺疊中提供實質性益處，而在生物化學實驗之前針對gRNA進行有意摺疊方案可能降低此等突變之影響。 實例 4 ： 設計且評定密碼子最佳化之 CasX mRNA 與靶向 gRNA 一起活體外遞送時的編輯效率

mRNA序列及相關修飾可對基於mRNA之遞送的功效具有顯著影響。經修飾之核苷酸，包括編碼5'帽結構之彼等核苷酸，為mRNA穩定性、可轉譯性及免疫原性之重要決定因素。此處，對於所有設計及測試之CasX mRNA均使用「帽1」結構，其包括5' m7G，以5'-5'三磷酸酯鍵連接至一個帶有2'OMe修飾的起始核苷酸。此結構與缺少2'OMe修飾之「帽0」結構類似，此結構促進高效轉譯，且相比於「帽0」結構具有降低的免疫原性。此外，預期使用經修飾核鹼基會降低mRNA之免疫原性。此處，N1-甲基-假尿苷用於取代所有活體外轉錄反應之尿苷核糖苷，因為公開之研究已表明，N1-甲基-假尿苷實質上增強mRNA效能且降低mRNA免疫原性。預期修飾會潛在地藉由避免活化RIG-I (其為雙股RNA之主要胞溶質感測器，係活體外轉錄mRNA之常見摻雜物)來使活體內免疫原性降低且提高轉譯速率。

亦將研聚腺苷酸尾之最佳化。聚腺苷酸尾對於轉譯及mRNA穩定性為必需的，其中較長尾部與較長mRNA半衰期相關。聚腺苷酸化可用聚腺苷酸聚合酶以轉錄方式進行，但此產生可變尾部長度且向mRNA生產過程添加步驟。由於具有含有120A尾部模板之質體的構築體在大腸桿菌中繁殖時不穩定，常常導致殖株的尾部長度顯著降低，因此使用含有80A尾部模板的質體進行mRNA生產，且以IIS型限制位點終止，以便進行徑流轉錄。亦選殖在兩條60A伸長段之間具有SphI限制位點的替代質體，因為已公開的研究證明類似構築體在大腸桿菌次選殖及擴增期間更穩定，且在哺乳動物細胞中產生具有等效活性的mRNA。將使用活體外編輯分析，在整個CasX mRNA及gRNA劑量範圍內比較此等替代型式的活性，以測定對編輯活性之後續影響。本文所描述之聚腺苷酸尾之序列列於表30中。

編碼5'及3' UTR之序列以及用於CasX蛋白編碼序列之密碼子有助於轉譯之有效性。UTR係基於先前表徵為具有高mRNA穩定性之基因(例如編碼ɑ-球蛋白、β-球蛋白的基因)，以及預期或先前證明在肝臟中尤其充分表現的基因(亦即編碼下列蛋白的基因：白蛋白、補體3及細胞色素P450 2E1)而選自標註的人類基因轉錄物。來自此等各種基因之5'及3' UTR之序列列於表30中。對於3' UTR，亦測試個別3' UTR之串接。將此等構築體選殖至含有T7啟動子、CasX變異體515或676及聚腺苷酸尾之質體中。為分離個別5'及3' UTR之影響，將各UTR分別選殖入含有3'或5' ɑ-球蛋白UTR的構築體中。進行IVT且將其藉由結合至聚(dT)珠粒進行純化，以捕捉全長轉錄物。所得mRNA最初將藉由使用一範圍內的劑量與 B2M靶向gRNA共轉染至HepG2細胞中來評定。將藉由HLA-免疫染色及流動式細胞測量術測定編輯效率。轉染後六天，收集細胞，用於經由B2M依賴性HLA蛋白之免疫染色，接著使用Attune ^TMNxT流式細胞儀進行流動式細胞測量術來分析B2M蛋白表現。效能最佳之個別UTR將組合成各種組態，調配成LNP，且在初代人類肝細胞及小鼠中測試。

亦正在探索替代性密碼子最佳化。除用於其他遞送模態之CasX密碼子最佳化以外，藉由基於核糖體蛋白密碼子的使用來構建密碼子使用表且重新平衡CasX密碼子使用情況以進行匹配，來設計新型式。除了潛在改良轉譯速率之外，此亦有效地引起尿嘧啶鹼基之耗竭，從而可降低免疫原性。此密碼子最佳化亦用於產生mRNA。已利用各種可用的密碼子最佳化工具設計額外的密碼子使用，視需要調節設定以達成一範圍內的GC含量水平。將在用於測試上文所描述之UTR的類似實驗設計下測試此等密碼子最佳化，且前導密碼子最佳化之CasX候選物將與前導UTR候選物組合以產生新CasX前導物以供進一步驗證。 表 30 ： 用於產生及最佳化 CasX mRNA 之指定元件之編碼 DNA 序列的清單

描述	編碼序列	SEQ ID NO:
聚腺苷酸尾
A 80	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3057
A 120	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3198
A 60SphIA 60	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3199
5' UTR
ɑ-球蛋白	ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC	3200
β-球蛋白	ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACA	3201
白蛋白	CTAGCTTTTCTCTTCTGTCAACCCCACACGCCTTT	3202
細胞色素 P450 2E1 (CYP2E1)	CTCCCGGGCTGGCAGCAGGGCCCCAGC	3203
補體3 (C3)	ACTCCTCCCCATCCTCTCCCTCTGTCCCTCTGTCCCTCTGACCCTGCACTGTCCC	3204
3' UTR
ɑ-球蛋白	GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA	3189
白蛋白	CATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGTACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTGTTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACTCTTCTAAGTTATGGATTATAAACATTCAAAATAATATTTTGACATTATGATAATTCTGAATAAAAGAACAAAAACCA	3205
白蛋白(截短)	GCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTAGATCT	3206
β-球蛋白	GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA	3207
ɑ-球蛋白 + β-球蛋白	GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAA	3208
β-球蛋白 + ɑ-球蛋白	GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCA	3209

實例 5 ： LTRP mRNA 及靶向 gRNA 經由 LNP 進行 LTRP 遞送以達成活體外目標基因座之抑制

進行實驗以評定在基於細胞之分析中遞送囊封LTRP mRNA及靶向gRNA之脂質奈米粒子(LNP)是否會誘導目標內源性基因座之持久抑制。 材料及方法： LTRP mRNA之產生：

編碼LTRP分子之mRNA由IVT產生，如先前實例1中所描述。根據實例1中簡要描述的，對編碼LTRP分子之序列進行密碼子最佳化。編碼LTRP mRNA之DNA序列的實例列於表12及表31中，其中相應mRNA序列列於表13及表32中。

如上文在實例2中所描述來合成靶向gRNA (例如靶向內源性 B2M基因座)。 LNP調配物：

為了調配LNP，將相等質量比之XR或LTRP mRNA及gRNA稀釋於PNI調配緩衝液(pH 4.0)中。將GenVoy-ILM ^TM以1:1稀釋於無水乙醇中。使用預定N/P比產生mRNA/gRNA共調配物。使RNA及脂質在PNI Ignite™ Benchtop系統上以預定流動速率比穿過PNI層流濾筒。調配後，將LNP於PBS (pH 7.4)中稀釋，以降低乙醇濃度且增加pH，由此增加粒子之穩定性。藉由在4℃使用10k Slide-A-Lyzer™滲析卡匣(Thermo Scientific™)隔夜滲析至PBS (pH 7.4)中來達成mRNA/sgRNA-LNP之緩衝液交換。滲析之後，使用100 kDa Amicon®-Ultra離心過濾器(Millipore)將mRNA/gRNA-LNP濃縮至＞0.5 mg/mL，且接著過濾滅菌。在Stunner (Unchained Labs)上分析所調配LNP以測定其直徑及多分散性指數(PDI)。藉由RiboGreen™分析，使用Invitrogen之Quant-iT™ RiboGreen™ RNA分析套組測定囊封效率及RNA濃度。 將囊封LTRP mRNA及靶向gRNA之LNP遞送至小鼠肝臟Hepa1-6細胞中：

將Hepa1-6細胞接種於96孔盤中。次日，用不同濃度之LNP處理所接種之細胞，LNP係以250 ng起始，於六次2倍連續稀釋中製備。調配此等LNP以囊封LTRP mRNA及 B2M靶向gRNA。在LNP處理之後24小時更換培養基，並培養細胞，隨後在多個時間點(例如在處理後7天、14天、21天、28天及56天)收集細胞進行gDNA提取以藉由NGS對 B2M基因座進行編輯評定且進行亞硫酸氫鹽定序以評定 VEGFA基因座處之脫靶甲基化。 亞硫酸氫鹽定序以評定藉由目標基因座處之脫靶甲基化水平量測的LTRP特異性：

為測定B2M基因座處之脫靶甲基化水平，按照製造商說明書使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus套組自所收集細胞提取gDNA。隨後按照製造之方案使用EZ DNA Methylation ^TM套組(Zymo)對所提取gDNA進行亞硫酸氫鹽轉化，將所有非甲基化胞嘧啶轉化成尿嘧啶。隨後使用次世代定序(NGS)對所得的經亞硫酸氫鹽處理之DNA進行定序，以測定 B2M及 VEGFA基因座處之脫靶甲基化水平。 NGS處理及分析：

利用對所關注的經亞硫酸氫鹽轉化之目標位置(人類 B2M及 VEGFA基因座)具特異性的一組引子，經由PCR自100 ng經亞硫酸氫鹽處理之DNA擴增目標擴增子。此等基因特異性引子在5′末端含有額外序列以引入Illumina ^TM銜接子。利用Cytiva Sera-Mag Select DNA淨化套組來純化經擴增DNA產物。使用Fragment Analyzer DNA分析套組(Agilent，dsDNA 35-1500 bp)評定擴增子之品質及定量。根據製造商說明書，在Illumina ^TMMiseq ^TM上對擴增子進行定序。使用Bismark亞硫酸氫鹽讀段定位程式(Bisulfite Read Mapper)及甲基化調用程式(Methylation caller)處理定序之原始fastq檔案。亞硫酸氫鹽處理之DNA之PCR擴增將所有尿嘧啶核苷酸轉化成胸腺嘧啶，且PCR產物之定序將決定胞嘧啶至胸腺嘧啶轉化速率，呈由各LTRP分子介導的 B2M及 VEGFA基因座處之潛在脫靶甲基化水平的讀數形式。

預期此實驗的結果顯示，LTRP mRNA及靶向gRNA可共同囊封於待遞送至目標細胞之LNP內以誘導目標內源性基因座之可遺傳緘默化。 表 31 ： 此實例之實驗 #2 中評定之 LTRP1-ZIM3 及 LTRP5-ZIM3 mRNA 分子之編碼序列 *

LTRP ID	組分	DNA 序列	SEQ ID NO:
LTRP1 - ZIM3-KRAB	5'UTR	GACCGGCCGCCACC	3082
起始密碼子+ NLS + 連接子	ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCTCTAGAGTTAACGGATCAGGCTCTGGAGGTGGA	3083
起始密碼子+ DNMT3A催化域	ATGAACCATGACCAGGAATTTGACCCCCCAAAGGTTTACCCACCTGTGCCAGCTGAGAAGAGGAAGCCCATCCGCGTGCTGTCTCTCTTTGATGGGATTGCTACAGGGCTCCTGGTGCTGAAGGACCTGGGCATCCAAGTGGACCGCTACATCGCCTCCGAGGTGTGTGAGGACTCCATCACGGTGGGCATGGTGCGGCACCAGGGAAAGATCATGTACGTCGGGGACGTCCGCAGCGTCACACAGAAGCATATCCAGGAGTGGGGCCCATTCGACCTGGTGATTGGAGGCAGTCCCTGCAACGACCTCTCCATTGTCAACCCTGCCCGCAAGGGACTTTATGAGGGTACTGGCCGCCTCTTCTTTGAGTTCTACCGCCTCCTGCATGATGCGCGGCCCAAGGAGGGAGATGATCGCCCCTTCTTCTGGCTCTTTGAGAATGTGGTGGCCATGGGCGTTAGTGACAAGAGGGACATCTCGCGATTTCTTGAGTCTAACCCCGTGATGATTGACGCCAAAGAAGTGTCTGCTGCACACAGGGCCCGTTACTTCTGGGGTAACCTTCCTGGCATGAACAGGCCTTTGGCATCCACTGTGAATGATAAGCTGGAGCTGCAAGAGTGTCTGGAGCACGGCAGAATAGCCAAGTTCAGCAAAGTGAGGACCATTACCACCAGGTCAAACTCTATAAAGCAGGGCAAAGACCAGCATTTCCCCGTCTTCATGAACGAGAAGGAGGACATCCTGTGGTGCACTGAAATGGAAAGGGTGTTTGGCTTCCCCGTCCACTACACAGACGTGTCCAACATGAGCCGCTTGGCGAGGCAGAGACTGCTGGGCCGGTCGTGGAGCGTGCCGGTCATCCGCCACCTCTTCGCTCCGCTGAAGGAATATTTTGCTTGTGTG	3084
連接子	TCTAGCGGCAATAGTAACGCTAACAGCCGCGGGCCGAGCTTCAGCAGCGGCCTGGTGCCGTTAAGCTTGCGCGGCAGCCAT	3085
DNMT3L相互作用域	ATGGGCCCTATGGAGATATACAAGACAGTGTCTGCATGGAAGAGACAGCCAGTGCGGGTACTGAGCCTCTTCAGAAACATCGACAAGGTACTAAAGAGTTTGGGCTTCTTGGAAAGCGGTTCTGGTTCTGGGGGAGGAACGCTGAAGTACGTGGAAGATGTCACAAATGTCGTGAGGAGGGACGTGGAGAAATGGGGCCCCTTTGACCTGGTGTACGGCTCGACGCAGCCCCTAGGCAGCTCTTGTGATCGCTGTCCCGGCTGGTACATGTTCCAGTTCCACCGGATCCTGCAGTATGCGCTGCCTCGCCAGGAGAGTCAGCGGCCCTTCTTCTGGATATTCATGGACAATCTGCTGCTGACTGAGGATGACCAAGAGACAACTACCCGCTTCCTTCAGACAGAGGCTGTGACCCTCCAGGATGTCCGTGGCAGAGACTACCAGAATGCTATGCGGGTGTGGAGCAACATTCCAGGGCTGAAGAGCAAGCATGCGCCCCTGACCCCAAAGGAAGAAGAGTATCTGCAAGCCCAAGTCAGAAGCAGGAGCAAGCTGGACGCCCCGAAAGTTGACCTCCTGGTGAAGAACTGCCTTCTCCCGCTGAGAGAGTACTTCAAGTATTTTTCTCAAAACTCACTTCCTCTT	3086
連接子	GGAGGGCCGAGCTCTGGCGCACCCCCACCAAGTGGAGGGTCTCCTGCCGGGTCCCCAACATCTACTGAAGAAGGCACCAGCGAATCCGCAACGCCCGAGTCAGGCCCTGGTACCTCCACAGAACCATCTGAAGGTAGTGCGCCTGGTTCCCCAGCTGGAAGCCCTACTTCCACCGAAGAAGGCACGTCAACCGAACCAAGTGAAGGATCTGCCCCTGGGACCAGCACTGAACCATCTGAG	3087
連接子+ 緩衝液	GGCGGTTCCGGCGGAGGAAGCGCT	3088
dCasX491	CAAGAGATCAAGAGAATCAACAAGATCAGAAGGAGACTGGTCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCATGAAAACCCTGCTCGTCAGAGTGATGACCCCTGACCTGAGAGAGCGGCTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCCGAGAACATCCCTCAGCCTATCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCTGAACAAGCTGCTGACCGACTACACCGAGATGAAGAAAGCCATCCTGCACGTGTACTGGGAAGAGTTCCAGAAAGACCCCGTGGGCCTGATGAGCAGAGTTGCTCAGCCTGCCAGCAAGAAGATCGACCAGAACAAGCTGAAGCCCGAGATGGACGAGAAGGGCAATCTGACCACAGCCGGCTTTGCCTGCTCTCAGTGTGGCCAGCCTCTGTTCGTGTACAAGCTGGAACAGGTGTCCGAGAAAGGCAAGGCCTACACCAACTACTTCGGCAGATGTAACGTGGCCGAGCACGAGAAGCTGATTCTGCTGGCCCAGCTGAAACCTGAGAAGGACTCTGATGAGGCCGTGACCTACAGCCTGGGCAAGTTTGGACAGAGAGCCCTGGACTTCTACAGCATCCACGTGACCAAAGAAAGCACACACCCCGTGAAGCCCCTGGCTCAGATCGCCGGCAATAGATACGCCTCTGGACCTGTGGGCAAAGCCCTGTCCGATGCCTGCATGGGAACAATCGCCAGCTTCCTGAGCAAGTACCAGGACATCATCATCGAGCACCAGAAGGTGGTCAAGGGCAACCAGAAGAGACTGGAAAGCCTGAGGGAGCTGGCCGGCAAAGAGAACCTGGAATACCCCAGCGTGACCCTGCCTCCTCAGCCTCACACAAAAGAAGGCGTGGACGCCTACAACGAAGTGATCGCCAGAGTGAGAATGTGGGTCAACCTGAACCTGTGGCAGAAGCTGAAACTGTCCAGGGACGACGCCAAGCCTCTGCTGAGACTGAAGGGCTTCCCTAGCTTCCCTCTGGTGGAAAGACAGGCCAATGAAGTGGATTGGTGGGACATGGTCTGCAACGTGAAGAAGCTGATCAACGAGAAGAAAGAGGATGGCAAGGTTTTCTGGCAGAACCTGGCCGGCTACAAGAGACAAGAAGCCCTGAGGCCTTACCTGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGTTCGCCAGATACCAGCTGGGCGACCTGCTGCTGCACCTGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACTGGGGCAAAGTGTACGATGAGGCCTGGGAGAGAATCGACAAGAAGGTGGAAGGCCTGAGCAAGCACATTAAGCTGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAATCTAAAGCCGCTCTGACCGATTGGCTGAGAGCCAAGGCCAGCTTTGTGATCGAGGGCCTGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGTTCTGCAGATGCGAGCTGAAGCTGCAGAAGTGGTACGGCGATCTGAGAGGCAAGCCCTTCGCCATTGAGGCCGAGAACAGCATCCTGGACATCAGCGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGCGCCTTCATTTGGCAGAAAGACGGCGTCAAGAAACTGAACCTGTACCTGATCATCAATTACTTCAAAGGCGGCAAGCTGCGGTTCAAGAAGATCAAACCCGAGGCCTTCGAGGCTAACAGATTCTACACCGTGATCAACAAAAAGTCCGGCGAGATCGTGCCCATGGAAGTGAACTTCAACTTCGACGACCCCAACCTGATTATCCTGCCTCTGGCCTTCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGTTCATCTGGAACGATCTGCTGAGCCTGGAAACCGGCTCTCTGAAGCTGGCCAATGGCAGAGTGATCGAGAAAACCCTGTACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCTGCTCTGTTTGTGGCCCTGACCTTCGAGAGAAGAGAGGTGCTGGACAGCAGCAACATCAAGCCCATGAACCTGATCGGCGTGGCCCGGGGCGAGAATATCCCTGCTGTGATCGCCCTGACAGACCCTGAAGGATGCCCACTGAGCAGATTCAAGGACTCCCTGGGCAACCCTACACACATCCTGAGAATCGGCGAGAGCTACAAAGAGAAGCAGAGGACAATCCAGGCCAAGAAAGAGGTGGAACAGAGAAGAGCCGGCGGATACTCTAGGAAGTACGCCAGCAAGGCCAAGAATCTGGCCGACGACATGGTCCGAAACACCGCCAGAGATCTGCTGTACTACGCCGTGACACAGGACGCCATGCTGATCTTCGCGAATCTGAGCAGAGGCTTCGGCCGGCAGGGCAAGAGAACCTTTATGGCCGAGAGGCAGTACACCAGAATGGAAGATTGGCTCACAGCTAAACTGGCCTACGAGGGACTGAGCAAGACCTACCTGTCCAAAACACTGGCCCAGTATACCTCCAAGACCTGCAGCAATTGCGGCTTCACCATCACCAGCGCCGACTACGACAGAGTGCTGGAAAAGCTCAAGAAAACCGCCACCGGCTGGATGACCACCATCAACGGCAAAGAGCTGAAGGTTGAGGGCCAGATCACCTACTACAACAGGTACAAGAGGCAGAACGTCGTGAAGGATCTGAGCGTGGAACTGGACAGACTGAGCGAAGAGAGCGTGAACAACGACATCAGCAGCTGGACAAAGGGCAGATCAGGCGAGGCTCTGAGCCTGCTGAAGAAGAGGTTTAGCCACAGACCTGTGCAAGAGAAGTTCGTGTGCCTGAACTGCGGCTTCGAGACACACGCCGCTGAACAGGCTGCCCTGAACATTGCCAGAAGCTGGCTGTTCCTGAGAAGCCAAGAGTACAAGAAGTACCAGACCAACAAGACCACCGGCAACACCGACAAGAGGGCCTTTGTGGAAACCTGGCAGAGCTTCTACAGAAAAAAGCTGAAAGAAGTCTGGAAGCCCGCCGTG	3089
連接子+ 緩衝液	CGATCGGGCGGTTCCGGCGGAGGTTCCACTAGT	3090
ZIM3-KRAB	ATGAACAATTCCCAGGGAAGAGTGACCTTCGAGGATGTCACTGTGAACTTCACCCAGGGGGAGTGGCAGCGGCTGAATCCCGAACAGAGAAACTTGTACAGGGATGTGATGCTGGAGAATTACAGCAACCTTGTCTCTGTGGGACAAGGGGAAACCACCAAACCCGATGTGATCTTGAGGTTGGAACAAGGAAAGGAGCCATGGTTGGAGGAAGAGGAAGTGCTGGGAAGTGGCCGTGCAGAAAAAAATGGGGACATTGGAGGGCAGATTTGGAAGCCAAAGGATGTGAAAGAGAGTCTC	3091
緩衝液 + NLS	ACTAGTCCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA	3092
標誌	GATTACAAAGATGACGATGACAAAGACTACAAGGATGATGATGATAAG	3093
緩衝液	GGATCCGGCTG	3094
聚腺苷酸尾	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3095
LTRP5 - ZIM3-KRAB	5'UTR	GACCGGCCGCCACC	3082
起始密碼子+ NLS + 緩衝液	ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCTCTAGA	3096
起始密碼子+ DNMT3A催化域	ATGAACCATGACCAGGAATTTGACCCCCCAAAGGTTTACCCACCTGTGCCAGCTGAGAAGAGGAAGCCCATCCGCGTGCTGTCTCTCTTTGATGGGATTGCTACAGGGCTCCTGGTGCTGAAGGACCTGGGCATCCAAGTGGACCGCTACATCGCCTCCGAGGTGTGTGAGGACTCCATCACGGTGGGCATGGTGCGGCACCAGGGAAAGATCATGTACGTCGGGGACGTCCGCAGCGTCACACAGAAGCATATCCAGGAGTGGGGCCCATTCGACCTGGTGATTGGAGGCAGTCCCTGCAACGACCTCTCCATTGTCAACCCTGCCCGCAAGGGACTTTATGAGGGTACTGGCCGCCTCTTCTTTGAGTTCTACCGCCTCCTGCATGATGCGCGGCCCAAGGAGGGAGATGATCGCCCCTTCTTCTGGCTCTTTGAGAATGTGGTGGCCATGGGCGTTAGTGACAAGAGGGACATCTCGCGATTTCTTGAGTCTAACCCCGTGATGATTGACGCCAAAGAAGTGTCTGCTGCACACAGGGCCCGTTACTTCTGGGGTAACCTTCCTGGCATGAACAGGCCTTTGGCATCCACTGTGAATGATAAGCTGGAGCTGCAAGAGTGTCTGGAGCACGGCAGAATAGCCAAGTTCAGCAAAGTGAGGACCATTACCACCAGGTCAAACTCTATAAAGCAGGGCAAAGACCAGCATTTCCCCGTCTTCATGAACGAGAAGGAGGACATCCTGTGGTGCACTGAAATGGAAAGGGTGTTTGGCTTCCCCGTCCACTACACAGACGTGTCCAACATGAGCCGCTTGGCGAGGCAGAGACTGCTGGGCCGGTCGTGGAGCGTGCCGGTCATCCGCCACCTCTTCGCTCCGCTGAAGGAATATTTTGCTTGTGTG	3084
連接子	TCTAGCGGCAATAGTAACGCTAACAGCCGCGGGCCGAGCTTCAGCAGCGGCCTGGTGCCGTTAAGCTTGCGCGGCAGCCAT	3085
DNMT3L相互作用域	ATGGGCCCTATGGAGATATACAAGACAGTGTCTGCATGGAAGAGACAGCCAGTGCGGGTACTGAGCCTCTTCAGAAACATCGACAAGGTACTAAAGAGTTTGGGCTTCTTGGAAAGCGGTTCTGGTTCTGGGGGAGGAACGCTGAAGTACGTGGAAGATGTCACAAATGTCGTGAGGAGGGACGTGGAGAAATGGGGCCCCTTTGACCTGGTGTACGGCTCGACGCAGCCCCTAGGCAGCTCTTGTGATCGCTGTCCCGGCTGGTACATGTTCCAGTTCCACCGGATCCTGCAGTATGCGCTGCCTCGCCAGGAGAGTCAGCGGCCCTTCTTCTGGATATTCATGGACAATCTGCTGCTGACTGAGGATGACCAAGAGACAACTACCCGCTTCCTTCAGACAGAGGCTGTGACCCTCCAGGATGTCCGTGGCAGAGACTACCAGAATGCTATGCGGGTGTGGAGCAACATTCCAGGGCTGAAGAGCAAGCATGCGCCCCTGACCCCAAAGGAAGAAGAGTATCTGCAAGCCCAAGTCAGAAGCAGGAGCAAGCTGGACGCCCCGAAAGTTGACCTCCTGGTGAAGAACTGCCTTCTCCCGCTGAGAGAGTACTTCAAGTATTTTTCTCAAAACTCACTTCCTCTT	3086
連接子	GGCGGTTCCGGCGGAGGA	3097
ZIM3-KRAB	ATGAACAATTCCCAGGGAAGAGTGACCTTCGAGGATGTCACTGTGAACTTCACCCAGGGGGAGTGGCAGCGGCTGAATCCCGAACAGAGAAACTTGTACAGGGATGTGATGCTGGAGAATTACAGCAACCTTGTCTCTGTGGGACAAGGGGAAACCACCAAACCCGATGTGATCTTGAGGTTGGAACAAGGAAAGGAGCCATGGTTGGAGGAAGAGGAAGTGCTGGGAAGTGGCCGTGCAGAAAAAAATGGGGACATTGGAGGGCAGATTTGGAAGCCAAAGGATGTGAAAGAGAGTCTC	3091
連接子	GGAGGGCCGAGCTCTGGCGCACCCCCACCAAGTGGAGGGTCTCCTGCCGGGTCCCCAACATCTACTGAAGAAGGCACCAGCGAATCCGCAACGCCCGAGTCAGGCCCTGGTACCTCCACAGAACCATCTGAAGGTAGTGCGCCTGGTTCCCCAGCTGGAAGCCCTACTTCCACCGAAGAAGGCACGTCAACCGAACCAAGTGAAGGATCTGCCCCTGGGACCAGCACTGAACCATCTGAG	3087
dCasX491	CAAGAGATCAAGAGAATCAACAAGATCAGAAGGAGACTGGTCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCATGAAAACCCTGCTCGTCAGAGTGATGACCCCTGACCTGAGAGAGCGGCTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCCGAGAACATCCCTCAGCCTATCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCTGAACAAGCTGCTGACCGACTACACCGAGATGAAGAAAGCCATCCTGCACGTGTACTGGGAAGAGTTCCAGAAAGACCCCGTGGGCCTGATGAGCAGAGTTGCTCAGCCTGCCAGCAAGAAGATCGACCAGAACAAGCTGAAGCCCGAGATGGACGAGAAGGGCAATCTGACCACAGCCGGCTTTGCCTGCTCTCAGTGTGGCCAGCCTCTGTTCGTGTACAAGCTGGAACAGGTGTCCGAGAAAGGCAAGGCCTACACCAACTACTTCGGCAGATGTAACGTGGCCGAGCACGAGAAGCTGATTCTGCTGGCCCAGCTGAAACCTGAGAAGGACTCTGATGAGGCCGTGACCTACAGCCTGGGCAAGTTTGGACAGAGAGCCCTGGACTTCTACAGCATCCACGTGACCAAAGAAAGCACACACCCCGTGAAGCCCCTGGCTCAGATCGCCGGCAATAGATACGCCTCTGGACCTGTGGGCAAAGCCCTGTCCGATGCCTGCATGGGAACAATCGCCAGCTTCCTGAGCAAGTACCAGGACATCATCATCGAGCACCAGAAGGTGGTCAAGGGCAACCAGAAGAGACTGGAAAGCCTGAGGGAGCTGGCCGGCAAAGAGAACCTGGAATACCCCAGCGTGACCCTGCCTCCTCAGCCTCACACAAAAGAAGGCGTGGACGCCTACAACGAAGTGATCGCCAGAGTGAGAATGTGGGTCAACCTGAACCTGTGGCAGAAGCTGAAACTGTCCAGGGACGACGCCAAGCCTCTGCTGAGACTGAAGGGCTTCCCTAGCTTCCCTCTGGTGGAAAGACAGGCCAATGAAGTGGATTGGTGGGACATGGTCTGCAACGTGAAGAAGCTGATCAACGAGAAGAAAGAGGATGGCAAGGTTTTCTGGCAGAACCTGGCCGGCTACAAGAGACAAGAAGCCCTGAGGCCTTACCTGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGTTCGCCAGATACCAGCTGGGCGACCTGCTGCTGCACCTGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACTGGGGCAAAGTGTACGATGAGGCCTGGGAGAGAATCGACAAGAAGGTGGAAGGCCTGAGCAAGCACATTAAGCTGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAATCTAAAGCCGCTCTGACCGATTGGCTGAGAGCCAAGGCCAGCTTTGTGATCGAGGGCCTGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGTTCTGCAGATGCGAGCTGAAGCTGCAGAAGTGGTACGGCGATCTGAGAGGCAAGCCCTTCGCCATTGAGGCCGAGAACAGCATCCTGGACATCAGCGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGCGCCTTCATTTGGCAGAAAGACGGCGTCAAGAAACTGAACCTGTACCTGATCATCAATTACTTCAAAGGCGGCAAGCTGCGGTTCAAGAAGATCAAACCCGAGGCCTTCGAGGCTAACAGATTCTACACCGTGATCAACAAAAAGTCCGGCGAGATCGTGCCCATGGAAGTGAACTTCAACTTCGACGACCCCAACCTGATTATCCTGCCTCTGGCCTTCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGTTCATCTGGAACGATCTGCTGAGCCTGGAAACCGGCTCTCTGAAGCTGGCCAATGGCAGAGTGATCGAGAAAACCCTGTACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCTGCTCTGTTTGTGGCCCTGACCTTCGAGAGAAGAGAGGTGCTGGACAGCAGCAACATCAAGCCCATGAACCTGATCGGCGTGGCCCGGGGCGAGAATATCCCTGCTGTGATCGCCCTGACAGACCCTGAAGGATGCCCACTGAGCAGATTCAAGGACTCCCTGGGCAACCCTACACACATCCTGAGAATCGGCGAGAGCTACAAAGAGAAGCAGAGGACAATCCAGGCCAAGAAAGAGGTGGAACAGAGAAGAGCCGGCGGATACTCTAGGAAGTACGCCAGCAAGGCCAAGAATCTGGCCGACGACATGGTCCGAAACACCGCCAGAGATCTGCTGTACTACGCCGTGACACAGGACGCCATGCTGATCTTCGCGAATCTGAGCAGAGGCTTCGGCCGGCAGGGCAAGAGAACCTTTATGGCCGAGAGGCAGTACACCAGAATGGAAGATTGGCTCACAGCTAAACTGGCCTACGAGGGACTGAGCAAGACCTACCTGTCCAAAACACTGGCCCAGTATACCTCCAAGACCTGCAGCAATTGCGGCTTCACCATCACCAGCGCCGACTACGACAGAGTGCTGGAAAAGCTCAAGAAAACCGCCACCGGCTGGATGACCACCATCAACGGCAAAGAGCTGAAGGTTGAGGGCCAGATCACCTACTACAACAGGTACAAGAGGCAGAACGTCGTGAAGGATCTGAGCGTGGAACTGGACAGACTGAGCGAAGAGAGCGTGAACAACGACATCAGCAGCTGGACAAAGGGCAGATCAGGCGAGGCTCTGAGCCTGCTGAAGAAGAGGTTTAGCCACAGACCTGTGCAAGAGAAGTTCGTGTGCCTGAACTGCGGCTTCGAGACACACGCCGCTGAACAGGCTGCCCTGAACATTGCCAGAAGCTGGCTGTTCCTGAGAAGCCAAGAGTACAAGAAGTACCAGACCAACAAGACCACCGGCAACACCGACAAGAGGGCCTTTGTGGAAACCTGGCAGAGCTTCTACAGAAAAAAGCTGAAAGAAGTCTGGAAGCCCGCCGTG	3089
連接子+ 緩衝液	CGATCGGGCGGTTCCGGCGGAGGTTCCACTAGT	3090
NLS	CCAAAAAAGAAGAGAAAGGTA	3098
標誌	GATTACAAAGATGACGATGACAAAGACTACAAGGATGATGATGATAAG	3093
緩衝液	GGATCCGGCTG	3094
聚腺苷酸尾	AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3095

*各組分以在構築體內之5'至3'次序列出 表 32 ： 此實例之實驗 #2 中評定之 LTRP1-ZIM3 及 LTRP5-ZIM3 mRNA 分子之全長 RNA 序列。 修飾『 mψ 』 = N1- 甲基 - 假尿苷

LTRP ID	RNA 序列	SEQ ID NO:
LTRP1 - ZIM3-KRAB	GACCGGCCGCCACCAmψGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGmψCmψCmψAGAGmψmψAACGGAmψCAGGCmψCmψGGAGGmψGGAAmψGAACCAmψGACCAGGAAmψmψmψGACCCCCCAAAGGmψmψmψACCCACCmψGmψGCCAGCmψGAGAAGAGGAAGCCCAmψCCGCGmψGCmψGmψCmψCmψCmψmψmψGAmψGGGAmψmψGCmψACAGGGCmψCCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAAGmψGGACCGCmψACAmψCGCCmψCCGAGGmψGmψGmψGAGGACmψCCAmψCACGGmψGGGCAmψGGmψGCGGCACCAGGGAAAGAmψCAmψGmψACGmψCGGGGACGmψCCGCAGCGmψCACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCAmψmψCGACCmψGGmψGAmψmψGGAGGCAGmψCCCmψGCAACGACCmψCmψCCAmψmψGmψCAACCCmψGCCCGCAAGGGACmψmψmψAmψGAGGGmψACmψGGCCGCCmψCmψmψCmψmψmψGAGmψmψCmψACCGCCmψCCmψGCAmψGAmψGCGCGGCCCAAGGAGGGAGAmψGAmψCGCCCCmψmψCmψmψCmψGGCmψCmψmψmψGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGCGmψmψAGmψGACAAGAGGGACAmψCmψCGCGAmψmψmψCmψmψGAGmψCmψAACCCCGmψGAmψGAmψmψGACGCCAAAGAAGmψGmψCmψGCmψGCACACAGGGCCCGmψmψACmψmψCmψGGGGmψAACCmψmψCCmψGGCAmψGAACAGGCCmψmψmψGGCAmψCCACmψGmψGAAmψGAmψAAGCmψGGAGCmψGCAAGAGmψGmψCmψGGAGCACGGCAGAAmψAGCCAAGmψmψCAGCAAAGmψGAGGACCAmψmψACCACCAGGmψCAAACmψCmψAmψAAAGCAGGGCAAAGACCAGCAmψmψmψCCCCGmψCmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGCACmψGAAAmψGGAAAGGGmψGmψmψmψGGCmψmψCCCCGmψCCACmψACACAGACGmψGmψCCAACAmψGAGCCGCmψmψGGCGAGGCAGAGACmψGCmψGGGCCGGmψCGmψGGAGCGmψGCCGGmψCAmψCCGCCACCmψCmψmψCGCmψCCGCmψGAAGGAAmψAmψmψmψmψGCmψmψGmψGmψGmψCmψAGCGGCAAmψAGmψAACGCmψAACAGCCGCGGGCCGAGCmψmψCAGCAGCGGCCmψGGmψGCCGmψmψAAGCmψmψGCGCGGCAGCCAmψAmψGGGCCCmψAmψGGAGAmψAmψACAAGACAGmψGmψCmψGCAmψGGAAGAGACAGCCAGmψGCGGGmψACmψGAGCCmψCmψmψCAGAAACAmψCGACAAGGmψACmψAAAGAGmψmψmψGGGCmψmψCmψmψGGAAAGCGGmψmψCmψGGmψmψCmψGGGGGAGGAACGCmψGAAGmψACGmψGGAAGAmψGmψCACAAAmψGmψCGmψGAGGAGGGACGmψGGAGAAAmψGGGGCCCCmψmψmψGACCmψGGmψGmψACGGCmψCGACGCAGCCCCmψAGGCAGCmψCmψmψGmψGAmψCGCmψGmψCCCGGCmψGGmψACAmψGmψmψCCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψAmψGCGCmψGCCmψCGCCAGGAGAGmψCAGCGGCCCmψmψCmψmψCmψGGAmψAmψmψCAmψGGACAAmψCmψGCmψGCmψGACmψGAGGAmψGACCAAGAGACAACmψACCCGCmψmψCCmψmψCAGACAGAGGCmψGmψGACCCmψCCAGGAmψGmψCCGmψGGCAGAGACmψACCAGAAmψGCmψAmψGCGGGmψGmψGGAGCAACAmψmψCCAGGGCmψGAAGAGCAAGCAmψGCGCCCCmψGACCCCAAAGGAAGAAGAGmψAmψCmψGCAAGCCCAAGmψCAGAAGCAGGAGCAAGCmψGGACGCCCCGAAAGmψmψGACCmψCCmψGGmψGAAGAACmψGCCmψmψCmψCCCGCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψmψmψCmψCAAAACmψCACmψmψCCmψCmψmψGGAGGGCCGAGCmψCmψGGCGCACCCCCACCAAGmψGGAGGGmψCmψCCmψGCCGGGmψCCCCAACAmψCmψACmψGAAGAAGGCACCAGCGAAmψCCGCAACGCCCGAGmψCAGGCCCmψGGmψACCmψCCACAGAACCAmψCmψGAAGGmψAGmψGCGCCmψGGmψmψCCCCAGCmψGGAAGCCCmψACmψmψCCACCGAAGAAGGCACGmψCAACCGAACCAAGmψGAAGGAmψCmψGCCCCmψGGGACCAGCACmψGAACCAmψCmψGAGGGCGGmψmψCCGGCGGAGGAAGCGCmψCAAGAGAmψCAAGAGAAmψCAACAAGAmψCAGAAGGAGACmψGGmψCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψCGmψCAGAGmψGAmψGACCCCmψGACCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCCGAGAACAmψCCCmψCAGCCmψAmψCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCmψGAACAAGCmψGCmψGACCGACmψACACCGAGAmψGAAGAAAGCCAmψCCmψGCACGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAAGACCCCGmψGGGCCmψGAmψGAGCAGAGmψmψGCmψCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGACCAGAACAAGCmψGAAGCCCGAGAmψGGACGAGAAGGGCAAmψCmψGACCACAGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCmψCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAACAGGmψGmψCCGAGAAAGGCAAGGCCmψACACCAACmψACmψmψCGGCAGAmψGmψAACGmψGGCCGAGCACGAGAAGCmψGAmψmψCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAACCmψGAGAAGGACmψCmψGAmψGAGGCCGmψGACCmψACAGCCmψGGGCAAGmψmψmψGGACAGAGAGCCCmψGGACmψmψCmψACAGCAmψCCACGmψGACCAAAGAAAGCACACACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCmψCAGAmψCGCCGGCAAmψAGAmψACGCCmψCmψGGACCmψGmψGGGCAAAGCCCmψGmψCCGAmψGCCmψGCAmψGGGAACAAmψCGCCAGCmψmψCCmψGAGCAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAGCACCAGAAGGmψGGmψCAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAAAGCCmψGAGGGAGCmψGGCCGGCAAAGAGAACCmψGGAAmψACCCCAGCGmψGACCCmψGCCmψCCmψCAGCCmψCACACAAAAGAAGGCGmψGGACGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCAGAGmψGAGAAmψGmψGGGmψCAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAACmψGmψCCAGGGACGACGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGCmψmψCCCmψAGCmψmψCCCmψCmψGGmψGGAAAGACAGGCCAAmψGAAGmψGGAmψmψGGmψGGGACAmψGGmψCmψGCAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAGAAAGAGGAmψGGCAAGGmψmψmψmψCmψGGCAGAACCmψGGCCGGCmψACAAGAGACAAGAAGCCCmψGAGGCCmψmψACCmψGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGmψmψCGCCAGAmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGCAAAGmψGmψACGAmψGAGGCCmψGGGAGAGAAmψCGACAAGAAGGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψmψAAGCmψGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAAmψCmψAAAGCCGCmψCmψGACCGAmψmψGGCmψGAGAGCCAAGGCCAGCmψmψmψGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGCGAmψCmψGAGAGGCAAGCCCmψmψCGCCAmψmψGAGGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGCGCCmψmψCAmψmψmψGGCAGAAAGACGGCGmψCAAGAAACmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAAmψmψACmψmψCAAAGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCCGAGGCCmψmψCGAGGCmψAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGmψCCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAAGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψmψAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGmψmψCAmψCmψGGAACGAmψCmψGCmψGAGCCmψGGAAACCGGCmψCmψCmψGAAGCmψGGCCAAmψGGCAGAGmψGAmψCGAGAAAACCCmψGmψACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCmψGCmψCmψGmψmψmψGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGAGAAGAGAGGmψGCmψGGACAGCAGCAACAmψCAAGCCCAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCCCGGGGCGAGAAmψAmψCCCmψGCmψGmψGAmψCGCCCmψGACAGACCCmψGAAGGAmψGCCCACmψGAGCAGAmψmψCAAGGACmψCCCmψGGGCAACCCmψACACACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψACAAAGAGAAGCAGAGGACAAmψCCAGGCCAAGAAAGAGGmψGGAACAGAGAAGAGCCGGCGGAmψACmψCmψAGGAAGmψACGCCAGCAAGGCCAAGAAmψCmψGGCCGACGACAmψGGmψCCGAAACACCGCCAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACACAGGACGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCGAAmψCmψGAGCAGAGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGAGAACCmψmψmψAmψGGCCGAGAGGCAGmψACACCAGAAmψGGAAGAmψmψGGCmψCACAGCmψAAACmψGGCCmψACGAGGGACmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAAACACmψGGCCCAGmψAmψACCmψCCAAGACCmψGCAGCAAmψmψGCGGCmψmψCACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGAGmψGCmψGGAAAAGCmψCAAGAAAACCGCCACCGGCmψGGAmψGACCACCAmψCAACGGCAAAGAGCmψGAAGGmψmψGAGGGCCAGAmψCACCmψACmψACAACAGGmψACAAGAGGCAGAACGmψCGmψGAAGGAmψCmψGAGCGmψGGAACmψGGACAGACmψGAGCGAAGAGAGCGmψGAACAACGACAmψCAGCAGCmψGGACAAAGGGCAGAmψCAGGCGAGGCmψCmψGAGCCmψGCmψGAAGAAGAGGmψmψmψAGCCACAGACCmψGmψGCAAGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCCGCmψGAACAGGCmψGCCCmψGAACAmψmψGCCAGAAGCmψGGCmψGmψmψCCmψGAGAAGCCAAGAGmψACAAGAAGmψACCAGACCAACAAGACCACCGGCAACACCGACAAGAGGGCCmψmψmψGmψGGAAACCmψGGCAGAGCmψmψCmψACAGAAAAAAGCmψGAAAGAAGmψCmψGGAAGCCCGCCGmψGCGAmψCGGGCGGmψmψCCGGCGGAGGmψmψCCACmψAGmψAmψGAACAAmψmψCCCAGGGAAGAGmψGACCmψmψCGAGGAmψGmψCACmψGmψGAACmψmψCACCCAGGGGGAGmψGGCAGCGGCmψGAAmψCCCGAACAGAGAAACmψmψGmψACAGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAGAAmψmψACAGCAACCmψmψGmψCmψCmψGmψGGGACAAGGGGAAACCACCAAACCCGAmψGmψGAmψCmψmψGAGGmψmψGGAACAAGGAAAGGAGCCAmψGGmψmψGGAGGAAGAGGAAGmψGCmψGGGAAGmψGGCCGmψGCAGAAAAAAAmψGGGGACAmψmψGGAGGGCAGAmψmψmψGGAAGCCAAAGGAmψGmψGAAAGAGAGmψCmψCACmψAGmψCCAAAAAAGAAGAGAAAGGmψAGAmψmψACAAAGAmψGACGAmψGACAAAGACmψACAAGGAmψGAmψGAmψGAmψAAGGGAmψCCGGCmψGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3099
LTRP5 - ZIM3-KRAB	GACCGGCCGCCACCAmψGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGmψCmψCmψAGAAmψGAACCAmψGACCAGGAAmψmψmψGACCCCCCAAAGGmψmψmψACCCACCmψGmψGCCAGCmψGAGAAGAGGAAGCCCAmψCCGCGmψGCmψGmψCmψCmψCmψmψmψGAmψGGGAmψmψGCmψACAGGGCmψCCmψGGmψGCmψGAAGGACCmψGGGCAmψCCAAGmψGGACCGCmψACAmψCGCCmψCCGAGGmψGmψGmψGAGGACmψCCAmψCACGGmψGGGCAmψGGmψGCGGCACCAGGGAAAGAmψCAmψGmψACGmψCGGGGACGmψCCGCAGCGmψCACACAGAAGCAmψAmψCCAGGAGmψGGGGCCCAmψmψCGACCmψGGmψGAmψmψGGAGGCAGmψCCCmψGCAACGACCmψCmψCCAmψmψGmψCAACCCmψGCCCGCAAGGGACmψmψmψAmψGAGGGmψACmψGGCCGCCmψCmψmψCmψmψmψGAGmψmψCmψACCGCCmψCCmψGCAmψGAmψGCGCGGCCCAAGGAGGGAGAmψGAmψCGCCCCmψmψCmψmψCmψGGCmψCmψmψmψGAGAAmψGmψGGmψGGCCAmψGGGCGmψmψAGmψGACAAGAGGGACAmψCmψCGCGAmψmψmψCmψmψGAGmψCmψAACCCCGmψGAmψGAmψmψGACGCCAAAGAAGmψGmψCmψGCmψGCACACAGGGCCCGmψmψACmψmψCmψGGGGmψAACCmψmψCCmψGGCAmψGAACAGGCCmψmψmψGGCAmψCCACmψGmψGAAmψGAmψAAGCmψGGAGCmψGCAAGAGmψGmψCmψGGAGCACGGCAGAAmψAGCCAAGmψmψCAGCAAAGmψGAGGACCAmψmψACCACCAGGmψCAAACmψCmψAmψAAAGCAGGGCAAAGACCAGCAmψmψmψCCCCGmψCmψmψCAmψGAACGAGAAGGAGGACAmψCCmψGmψGGmψGCACmψGAAAmψGGAAAGGGmψGmψmψmψGGCmψmψCCCCGmψCCACmψACACAGACGmψGmψCCAACAmψGAGCCGCmψmψGGCGAGGCAGAGACmψGCmψGGGCCGGmψCGmψGGAGCGmψGCCGGmψCAmψCCGCCACCmψCmψmψCGCmψCCGCmψGAAGGAAmψAmψmψmψmψGCmψmψGmψGmψGmψCmψAGCGGCAAmψAGmψAACGCmψAACAGCCGCGGGCCGAGCmψmψCAGCAGCGGCCmψGGmψGCCGmψmψAAGCmψmψGCGCGGCAGCCAmψAmψGGGCCCmψAmψGGAGAmψAmψACAAGACAGmψGmψCmψGCAmψGGAAGAGACAGCCAGmψGCGGGmψACmψGAGCCmψCmψmψCAGAAACAmψCGACAAGGmψACmψAAAGAGmψmψmψGGGCmψmψCmψmψGGAAAGCGGmψmψCmψGGmψmψCmψGGGGGAGGAACGCmψGAAGmψACGmψGGAAGAmψGmψCACAAAmψGmψCGmψGAGGAGGGACGmψGGAGAAAmψGGGGCCCCmψmψmψGACCmψGGmψGmψACGGCmψCGACGCAGCCCCmψAGGCAGCmψCmψmψGmψGAmψCGCmψGmψCCCGGCmψGGmψACAmψGmψmψCCAGmψmψCCACCGGAmψCCmψGCAGmψAmψGCGCmψGCCmψCGCCAGGAGAGmψCAGCGGCCCmψmψCmψmψCmψGGAmψAmψmψCAmψGGACAAmψCmψGCmψGCmψGACmψGAGGAmψGACCAAGAGACAACmψACCCGCmψmψCCmψmψCAGACAGAGGCmψGmψGACCCmψCCAGGAmψGmψCCGmψGGCAGAGACmψACCAGAAmψGCmψAmψGCGGGmψGmψGGAGCAACAmψmψCCAGGGCmψGAAGAGCAAGCAmψGCGCCCCmψGACCCCAAAGGAAGAAGAGmψAmψCmψGCAAGCCCAAGmψCAGAAGCAGGAGCAAGCmψGGACGCCCCGAAAGmψmψGACCmψCCmψGGmψGAAGAACmψGCCmψmψCmψCCCGCmψGAGAGAGmψACmψmψCAAGmψAmψmψmψmψmψCmψCAAAACmψCACmψmψCCmψCmψmψGGCGGmψmψCCGGCGGAGGAAmψGAACAAmψmψCCCAGGGAAGAGmψGACCmψmψCGAGGAmψGmψCACmψGmψGAACmψmψCACCCAGGGGGAGmψGGCAGCGGCmψGAAmψCCCGAACAGAGAAACmψmψGmψACAGGGAmψGmψGAmψGCmψGGAGAAmψmψACAGCAACCmψmψGmψCmψCmψGmψGGGACAAGGGGAAACCACCAAACCCGAmψGmψGAmψCmψmψGAGGmψmψGGAACAAGGAAAGGAGCCAmψGGmψmψGGAGGAAGAGGAAGmψGCmψGGGAAGmψGGCCGmψGCAGAAAAAAAmψGGGGACAmψmψGGAGGGCAGAmψmψmψGGAAGCCAAAGGAmψGmψGAAAGAGAGmψCmψCGGAGGGCCGAGCmψCmψGGCGCACCCCCACCAAGmψGGAGGGmψCmψCCmψGCCGGGmψCCCCAACAmψCmψACmψGAAGAAGGCACCAGCGAAmψCCGCAACGCCCGAGmψCAGGCCCmψGGmψACCmψCCACAGAACCAmψCmψGAAGGmψAGmψGCGCCmψGGmψmψCCCCAGCmψGGAAGCCCmψACmψmψCCACCGAAGAAGGCACGmψCAACCGAACCAAGmψGAAGGAmψCmψGCCCCmψGGGACCAGCACmψGAACCAmψCmψGAGCAAGAGAmψCAAGAGAAmψCAACAAGAmψCAGAAGGAGACmψGGmψCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCAmψGAAAACCCmψGCmψCGmψCAGAGmψGAmψGACCCCmψGACCmψGAGAGAGCGGCmψGGAAAACCmψGAGAAAGAAGCCCGAGAACAmψCCCmψCAGCCmψAmψCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCmψGAACAAGCmψGCmψGACCGACmψACACCGAGAmψGAAGAAAGCCAmψCCmψGCACGmψGmψACmψGGGAAGAGmψmψCCAGAAAGACCCCGmψGGGCCmψGAmψGAGCAGAGmψmψGCmψCAGCCmψGCCAGCAAGAAGAmψCGACCAGAACAAGCmψGAAGCCCGAGAmψGGACGAGAAGGGCAAmψCmψGACCACAGCCGGCmψmψmψGCCmψGCmψCmψCAGmψGmψGGCCAGCCmψCmψGmψmψCGmψGmψACAAGCmψGGAACAGGmψGmψCCGAGAAAGGCAAGGCCmψACACCAACmψACmψmψCGGCAGAmψGmψAACGmψGGCCGAGCACGAGAAGCmψGAmψmψCmψGCmψGGCCCAGCmψGAAACCmψGAGAAGGACmψCmψGAmψGAGGCCGmψGACCmψACAGCCmψGGGCAAGmψmψmψGGACAGAGAGCCCmψGGACmψmψCmψACAGCAmψCCACGmψGACCAAAGAAAGCACACACCCCGmψGAAGCCCCmψGGCmψCAGAmψCGCCGGCAAmψAGAmψACGCCmψCmψGGACCmψGmψGGGCAAAGCCCmψGmψCCGAmψGCCmψGCAmψGGGAACAAmψCGCCAGCmψmψCCmψGAGCAAGmψACCAGGACAmψCAmψCAmψCGAGCACCAGAAGGmψGGmψCAAGGGCAACCAGAAGAGACmψGGAAAGCCmψGAGGGAGCmψGGCCGGCAAAGAGAACCmψGGAAmψACCCCAGCGmψGACCCmψGCCmψCCmψCAGCCmψCACACAAAAGAAGGCGmψGGACGCCmψACAACGAAGmψGAmψCGCCAGAGmψGAGAAmψGmψGGGmψCAACCmψGAACCmψGmψGGCAGAAGCmψGAAACmψGmψCCAGGGACGACGCCAAGCCmψCmψGCmψGAGACmψGAAGGGCmψmψCCCmψAGCmψmψCCCmψCmψGGmψGGAAAGACAGGCCAAmψGAAGmψGGAmψmψGGmψGGGACAmψGGmψCmψGCAACGmψGAAGAAGCmψGAmψCAACGAGAAGAAAGAGGAmψGGCAAGGmψmψmψmψCmψGGCAGAACCmψGGCCGGCmψACAAGAGACAAGAAGCCCmψGAGGCCmψmψACCmψGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGmψmψCGCCAGAmψACCAGCmψGGGCGACCmψGCmψGCmψGCACCmψGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACmψGGGGCAAAGmψGmψACGAmψGAGGCCmψGGGAGAGAAmψCGACAAGAAGGmψGGAAGGCCmψGAGCAAGCACAmψmψAAGCmψGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAAmψCmψAAAGCCGCmψCmψGACCGAmψmψGGCmψGAGAGCCAAGGCCAGCmψmψmψGmψGAmψCGAGGGCCmψGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGmψmψCmψGCAGAmψGCGAGCmψGAAGCmψGCAGAAGmψGGmψACGGCGAmψCmψGAGAGGCAAGCCCmψmψCGCCAmψmψGAGGCCGAGAACAGCAmψCCmψGGACAmψCAGCGGCmψmψCAGCAAGCAGmψACAACmψGCGCCmψmψCAmψmψmψGGCAGAAAGACGGCGmψCAAGAAACmψGAACCmψGmψACCmψGAmψCAmψCAAmψmψACmψmψCAAAGGCGGCAAGCmψGCGGmψmψCAAGAAGAmψCAAACCCGAGGCCmψmψCGAGGCmψAACAGAmψmψCmψACACCGmψGAmψCAACAAAAAGmψCCGGCGAGAmψCGmψGCCCAmψGGAAGmψGAACmψmψCAACmψmψCGACGACCCCAACCmψGAmψmψAmψCCmψGCCmψCmψGGCCmψmψCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGmψmψCAmψCmψGGAACGAmψCmψGCmψGAGCCmψGGAAACCGGCmψCmψCmψGAAGCmψGGCCAAmψGGCAGAGmψGAmψCGAGAAAACCCmψGmψACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCmψGCmψCmψGmψmψmψGmψGGCCCmψGACCmψmψCGAGAGAAGAGAGGmψGCmψGGACAGCAGCAACAmψCAAGCCCAmψGAACCmψGAmψCGGCGmψGGCCCGGGGCGAGAAmψAmψCCCmψGCmψGmψGAmψCGCCCmψGACAGACCCmψGAAGGAmψGCCCACmψGAGCAGAmψmψCAAGGACmψCCCmψGGGCAACCCmψACACACAmψCCmψGAGAAmψCGGCGAGAGCmψACAAAGAGAAGCAGAGGACAAmψCCAGGCCAAGAAAGAGGmψGGAACAGAGAAGAGCCGGCGGAmψACmψCmψAGGAAGmψACGCCAGCAAGGCCAAGAAmψCmψGGCCGACGACAmψGGmψCCGAAACACCGCCAGAGAmψCmψGCmψGmψACmψACGCCGmψGACACAGGACGCCAmψGCmψGAmψCmψmψCGCGAAmψCmψGAGCAGAGGCmψmψCGGCCGGCAGGGCAAGAGAACCmψmψmψAmψGGCCGAGAGGCAGmψACACCAGAAmψGGAAGAmψmψGGCmψCACAGCmψAAACmψGGCCmψACGAGGGACmψGAGCAAGACCmψACCmψGmψCCAAAACACmψGGCCCAGmψAmψACCmψCCAAGACCmψGCAGCAAmψmψGCGGCmψmψCACCAmψCACCAGCGCCGACmψACGACAGAGmψGCmψGGAAAAGCmψCAAGAAAACCGCCACCGGCmψGGAmψGACCACCAmψCAACGGCAAAGAGCmψGAAGGmψmψGAGGGCCAGAmψCACCmψACmψACAACAGGmψACAAGAGGCAGAACGmψCGmψGAAGGAmψCmψGAGCGmψGGAACmψGGACAGACmψGAGCGAAGAGAGCGmψGAACAACGACAmψCAGCAGCmψGGACAAAGGGCAGAmψCAGGCGAGGCmψCmψGAGCCmψGCmψGAAGAAGAGGmψmψmψAGCCACAGACCmψGmψGCAAGAGAAGmψmψCGmψGmψGCCmψGAACmψGCGGCmψmψCGAGACACACGCCGCmψGAACAGGCmψGCCCmψGAACAmψmψGCCAGAAGCmψGGCmψGmψmψCCmψGAGAAGCCAAGAGmψACAAGAAGmψACCAGACCAACAAGACCACCGGCAACACCGACAAGAGGGCCmψmψmψGmψGGAAACCmψGGCAGAGCmψmψCmψACAGAAAAAAGCmψGAAAGAAGmψCmψGGAAGCCCGCCGmψGCGAmψCGGGCGGmψmψCCGGCGGAGGmψmψCCACmψAGmψCCAAAAAAGAAGAGAAAGGmψAGAmψmψACAAAGAmψGACGAmψGACAAAGACmψACAAGGAmψGAmψGAmψGAmψAAGGGAmψCCGGCmψGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA	3100

實例 6 ： 對編碼引導 RNA 支架之 DNA 進行 CpG- 耗竭會改良活體外 CasX 介導之編輯

病原體相關分子模式(PAMP)，諸如未甲基化CpG模體，為微生物類別內保守的小分子模體。其藉由真核細胞中之鐸樣受體(toll-like receptor，TLR)及其他模式識別受體進行識別且通常誘導非特異性免疫活化。在基因療法之情形下，含有PAMP之治療劑通常不具有良好耐受性且在所觸發之強力免疫反應的情況下自患者快速清除，此最終導致治療功效降低。CpG模體為含有二核苷酸CG之短單股DNA序列。當此等CpG模體未甲基化時，其充當PAMP且因此刺激免疫反應。在此實例中，進行實驗以在編碼CasX變異體491、引導支架變異體235及靶向內源性B2M (β-2-微球蛋白)基因座之間隔子7.37的AAV構築體的情形下耗竭引導支架編碼序列中之CpG模體，且測試活體外引導支架中之CpG耗竭對B2M基因座之編輯的影響。 材料及方法： CpG耗竭之引導支架之設計：

核苷酸取代係經合理設計以置換基礎gRNA支架變異體(gRNA支架235)內之天然CpG模體，意欲保持編輯活性同時降低支架免疫原性。咸信，應自支架編碼序列移除儘可能多的CpG-模體以便充分降低免疫原性。支架235含有總共八個CpG元件；預測其中六個進行鹼基配對且形成雙股二級結構之互補股(參見圖22)。因此，對形成三個對之六個鹼基配對CpG進行協同突變以維持重要二級結構。此將獨立的含CpG區域之數目減少至五個(三個對及兩個單一CpG)以獨立地考慮用於CpG移除。具體而言，在(1)假結莖、(2)支架莖、(3)延伸莖泡、(4)延伸步驟及(5)延伸莖環中設計突變，如圖23中所圖解說明且在下文詳細描述。

在假結莖(區域1)中，CpG對翻轉為GpC以使基礎組合物及序列之改變降至最低。基於先前涉及置換個別鹼基對之實驗，預期此突變不可能損害引導RNA支架之結構及功能。

類似地，在支架莖(區域2)中，CpG對翻轉為GpC以使基礎組合物及序列之變化減至最少。預期此突變可能損害引導RNA支架之結構及功能，因為在使個別鹼基或鹼基對突變之先前實驗中在此區域中發現強序列保守。此強序列保守可能係由於支架莖環在與CasX蛋白相互作用以及與假結區域形成三螺旋體結構元件方面起著重要作用。

在延伸莖泡(區域3)中，單一CpG係藉由三種策略之一移除。首先，藉由CG-＞C突變使泡缺失。其次，藉由CG-＞CT突變使泡消退以恢復理想的鹼基配對。再者，整個延伸莖環經置換為支架174之延伸莖環。應注意，延伸莖環經置換為支架174的延伸莖環本身就再現了支架316 (先前已被證明其能進行高效編輯)。支架174之延伸莖環中不存在CpG模體。因此，延伸莖環置換為支架174的延伸莖環亦移除延伸莖中之CpG模體(區域4)。基於先前實驗表明延伸莖對微小變化具有相對的穩固性，因此預期延伸莖泡突變可能會損害引導RNA支架之結構及功能。

在延伸莖(區域4)中，在不產生額外CpG模體下CpG對不能翻轉成GpC。因此，CpG變成GG及互補CC模體。類似於區域3，基於延伸莖對微小變化具有相對的穩固性，因此預期此突變不可能損害引導RNA支架之結構及功能。

最後，延伸莖環(區域5)以基於檢查莖環穩定性之先前實驗設計的三種方式之一進行突變。詳言之，先前已展示莖環之若干變化形式具有類似的穩定性水平，且莖環之此等變化形式中的一些不含有CpG。基於此等發現，首先，該環經置換為具有CUUG序列之新環。其次，該環經置換為具有GAAA序列之新環。由於GAAA環置換將產生鄰近於環之新穎CpG，因此將其與互補股上的C-＞G鹼基對交換以及相應的G🡪C鹼基對交換相結合，最終形成CUUCGG-＞GGAAAC交換。再者，藉由插入A以中斷CpG模體，使環發生突變且從而將環之尺寸自4個鹼基增加至5個鹼基。預期延伸莖環發生隨機突變將可能對二級結構穩定性產生不利影響，且因此對編輯造成不利影響。然而，依賴於先前確認之序列被認為與置換相關之風險較低。

為產生由DNA編碼之具有降低CpG水平的引導RNA支架，以各種組態組合上文所描述之突變。下表33概述所用突變之組合。在表33中，0指示無突變引入至指定區域，1、2或3指示該區域中引入突變，如圖23中所圖解說明，而n/a指示不適用。具體而言，對於區域1假結莖，1指示引入CG-＞GC突變。對於區域2支架莖，1指示引入CG-＞GC突變。對於區域3延伸莖泡，1指示藉由缺失形成泡之鹼基G及A來移除泡，2指示藉由CG-＞CU突變以允許鹼基A與U之間進行鹼基配對，使泡消退，且3指示延伸莖環經置換為來自引導支架174之延伸步驟環。對於區域4延伸莖，1指示引入CG-＞GC突變。對於區域5延伸莖環，1指示環係由UUCG-＞CUUG置換，2指示環與鄰近於環之鹼基對一起自CUUCGG-＞GGAAAC置換，且3指示在C與G之間插入A。 表 33 ： 引導支架 235 中之 CpG 減少及耗竭的突變概述

支架ID	區域1 ( 假結莖)	區域2 ( 支架莖)	區域3 ( 延伸莖泡)	區域 4 ( 延伸莖 )	區域5 ( 延伸莖環)
320	1	0	0	1	0
321	1	0	1	1	0
322	1	0	2	1	0
323	1	0	3	n/a	0
324	1	0	1	1	1
325	1	0	2	1	1
326	1	0	3	n/a	1
327	1	0	1	1	2
328	1	0	2	1	2
329	1	0	3	n/a	2
330	1	0	1	1	3
331	1	0	2	1	3
332	1	0	3	n/a	3
334	1	1	2	1	1
335	1	1	3	n/a	1
336	1	1	1	1	2
337	1	1	2	1	2
338	1	1	3	n/a	2
339	1	1	1	1	3
340	1	1	2	1	3
341	1	1	3	n/a	3
235	0	0	0	0	0

下表34列出經設計之CpG減少或耗竭之引導支架的DNA序列。 表 34 ： 編碼 CpG 減少或耗竭之引導 RNA 支架的 DNA 序列

支架ID	DNA 序列	SEQ ID NO
320	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCGCTTAGGGACTTCGGTCCCTAAGAGGCATCAGAG	3210
321	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCCTTAGGGACTTCGGTCCCTAAGGGCATCAGAG	3211
322	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCTCTTAGGGACTTCGGTCCCTAAGAGGCATCAGAG	3212
323	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCTCCCTCTTCGGAGGGAGCATCAGAG	3213
324	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCCTTAGGGACCTTGGTCCCTAAGGGCATCAGAG	3214
325	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCTCTTAGGGACCTTGGTCCCTAAGAGGCATCAGAG	3215
326	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCTCCCTCCTTGGAGGGAGCATCAGAG	3216
327	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCCTTAGGGAGGAAACTCCCTAAGGGCATCAGAG	3217
328	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCTCTTAGGGAGGAAACTCCCTAAGAGGCATCAGAG	3218
329	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCTCCCTGGAAACAGGGAGCATCAGAG	3219
330	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCCTTAGGGACTTCAGGTCCCTAAGGGCATCAGAG	3220
331	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCCTCTTAGGGACTTCAGGTCCCTAAGAGGCATCAGAG	3221
332	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGCGACTATGTCGTAGTGGGTAAAGCTCCCTCTTCAGGAGGGAGCATCAGAG	3222
333	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCCCTTAGGGACCTTGGTCCCTAAGGGCATCAGAG	3223
334	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCCTCTTAGGGACCTTGGTCCCTAAGAGGCATCAGAG	3224
335	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCTCCCTCCTTGGAGGGAGCATCAGAG	3225
336	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCCCTTAGGGAGGAAACTCCCTAAGGGCATCAGAG	3226
337	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCCTCTTAGGGAGGAAACTCCCTAAGAGGCATCAGAG	3227
338	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCTCCCTGGAAACAGGGAGCATCAGAG	3228
339	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCCCTTAGGGACTTCAGGTCCCTAAGGGCATCAGAG	3229
340	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCCTCTTAGGGACTTCAGGTCCCTAAGAGGCATCAGAG	3230
341	ACTGGGCCTTCTATCTGATTACTCTGAGGCCCATCACCAGGCACTATGTGCTAGTGGGTAAAGCTCCCTCTTCAGGAGGGAGCATCAGAG	3231

CpG耗竭之AAV質體的產生：

除AAV2 ITR之外，在另外CpG耗竭之AAV載體之情形下測試CpG減少或耗竭之gRNA支架。具體而言，基於以下元件來自相關物種之同源核苷酸序列，經由電腦設計用於置換AAV組分中之原生CpG模體的核苷酸取代：小鼠U1a snRNA (小核RNA)基因啟動子、bGHpA (牛生長激素聚腺苷酸化)序列及人類U6啟動子。CasX 491之編碼序列針對CpG耗竭經密碼子最佳化。所有得到之序列(表34及表35)係以為具有適用於選殖及等溫組裝之突出端的基因片段排序，以單獨地置換現有基礎AAV質體(構築體ID 183)之對應元件。將靶向內源性B2M基因的間隔子7.37 (GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG；SEQ ID NO: 3137)用於此實例中論述之實驗。首次進行實驗(「N=1」)時，亦包括具有非靶向間隔子0.0之樣本作為對照(CGAGACGUAAUUACGUCUCG, SEQ ID NO: 3232；參見圖24)。

使用標準分子選殖技術產生所得AAV構築體。中間預處理經選殖及序列驗證之質體構築體，用於後續的核轉染及AAV載體產生。除編碼gRNA之序列(表33)以外，AAV構築體之額外組分之序列列於表35中。 表 35 ： AAV 元件之序列 (AAV 構築體中之 5'-3')

元件	DNA 序列	SEQ ID NO:
AAV2 5' ITR	CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT	3233
CpG耗竭之U1a啟動子	AATGGAGGTGGTACTATGTAGATGAGAATTCAGGAGCAAACTGGGAAAAGCAACTGCTTCCAAATATTTGTGATTTTTACAGTGTAGTTTTGGAAAAACTCTTAGCCTACCAATTCTTCTAAGTGTTTTAAAATGTGGGAGCCAGTACACATGAAGTTATAGAGTGTTTTAATGAGGCTTAAATATTTACTGTAACTATGAAATGCTACACATATCATGCTGTTCAGGCTCTGTGGCCATGCAACTCATACT	3234
CpG耗竭之cMycNLS-CasX491-cMycNLS	ATGGCTCCAGCTGCCAAGAGAGTGAAGCTGGACTCTAGACAAGAGATCAAGAGGATCAACAAGATTAGAAGAAGGCTGGTCAAGGACAGCAACACCAAGAAGGCAGGCAAGACAGGCCCCATGAAGACCCTGCTTGTCAGAGTGATGACCCCTGACCTGAGAGAGAGACTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCTGAGAACATCCCTCAGCCTATCTCCAACACCAGCAGAGCCAACCTGAACAAGCTGCTGACAGACTACACAGAGATGAAGAAAGCCATCCTGCATGTGTACTGGGAAGAGTTCCAGAAAGACCCTGTGGGCCTGATGAGCAGAGTGGCCCAGCCTGCCAGCAAGAAGATTGACCAGAACAAACTGAAGCCAGAGATGGATGAGAAGGGCAACCTGACCACAGCTGGCTTTGCCTGCTCTCAGTGTGGCCAGCCTCTGTTTGTGTACAAGCTGGAACAAGTGTCTGAGAAAGGCAAGGCCTACACCAACTACTTTGGCAGATGCAATGTGGCTGAGCATGAGAAGCTGATCCTGCTGGCCCAGCTGAAGCCTGAAAAGGACTCTGATGAGGCTGTGACCTACAGCCTGGGCAAGTTTGGACAGAGAGCCCTGGACTTCTACAGCATCCATGTGACCAAAGAAAGCACACACCCTGTGAAGCCCCTGGCTCAGATTGCTGGCAACAGATATGCCTCTGGACCTGTGGGCAAAGCCCTGTCTGATGCCTGCATGGGAACCATTGCCAGCTTTCTGAGCAAGTACCAGGACATCATCATTGAGCACCAGAAAGTGGTCAAGGGGAACCAGAAGAGGCTGGAATCTCTGAGAGAGCTGGCTGGCAAAGAGAACCTGGAATACCCCTCTGTGACCCTGCCTCCTCAGCCTCACACCAAAGAGGGTGTTGATGCCTACAATGAAGTGATTGCCAGAGTCAGGATGTGGGTCAACCTGAATCTGTGGCAGAAGCTGAAGCTGAGCAGGGATGATGCCAAGCCTCTGCTGAGACTGAAGGGCTTCCCTAGCTTCCCACTGGTGGAAAGGCAGGCTAATGAAGTGGATTGGTGGGACATGGTCTGCAATGTGAAGAAACTGATCAATGAGAAGAAAGAGGATGGCAAGGTTTTCTGGCAGAACCTGGCTGGCTACAAGAGGCAAGAAGCCCTGAGGCCTTACCTGTCCTCTGAGGAAGATAGGAAGAAGGGGAAGAAGTTTGCCAGATACCAGCTGGGAGATCTGCTGCTGCACCTGGAAAAGAAACATGGGGAAGATTGGGGCAAAGTGTATGATGAGGCCTGGGAGAGAATTGACAAGAAGGTGGAAGGCCTGAGCAAGCACATTAAGCTGGAAGAGGAAAGAAGATCTGAGGATGCCCAGAGCAAGGCTGCCCTGACTGATTGGCTGAGAGCCAAGGCCAGCTTTGTGATTGAGGGCCTGAAAGAGGCTGACAAGGATGAGTTCTGTAGATGTGAACTGAAGCTGCAAAAGTGGTATGGGGACCTGAGGGGCAAGCCCTTTGCCATTGAGGCAGAGAACAGCATCCTGGACATCAGTGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGTGCCTTCATTTGGCAGAAGGATGGGGTTAAGAAGCTCAACCTGTACCTGATCATCAACTACTTCAAAGGTGGCAAGCTGAGGTTCAAGAAGATCAAGCCAGAGGCCTTTGAGGCCAACAGGTTCTACACAGTGATCAACAAAAAGTCTGGGGAGATTGTGCCCATGGAAGTGAACTTCAACTTTGATGATCCCAACCTCATCATCCTGCCACTGGCCTTTGGCAAGAGACAGGGCAGAGAATTCATCTGGAATGACCTGCTGAGCCTGGAAACAGGCAGCCTGAAACTGGCCAATGGCAGAGTGATTGAGAAAACCCTGTACAACAGAAGGACCAGACAGGATGAGCCTGCACTGTTTGTGGCCCTGACCTTTGAGAGAAGGGAAGTGCTGGATAGCAGCAACATCAAGCCCATGAACCTGATTGGAGTGGACAGAGGGGAGAATATCCCTGCTGTCATTGCCCTGACAGACCCTGAGGGCTGTCCCCTGAGCAGATTCAAGGACTCCCTGGGCAACCCCACACACATTCTGAGAATTGGGGAGAGCTACAAAGAGAAGCAGAGAACCATCCAGGCCAAGAAAGAAGTGGAACAGAGGAGAGCTGGAGGCTACTCTAGGAAGTATGCCAGCAAAGCCAAGAATCTGGCTGATGACATGGTCAGAAACACAGCCAGGGACCTGCTGTACTATGCTGTGACCCAGGATGCCATGCTGATCTTTGAGAATCTGAGCAGAGGATTTGGGAGACAAGGCAAGAGGACCTTCATGGCTGAAAGACAGTACACCAGGATGGAAGATTGGCTGACTGCCAAACTGGCCTATGAGGGACTGAGCAAGACCTACCTGTCCAAGACACTGGCCCAGTATACCTCCAAGACCTGCAGCAATTGTGGCTTCACCATCACCTCTGCAGACTATGACAGAGTGCTGGAAAAGCTCAAGAAAACAGCCACAGGCTGGATGACCACCATCAATGGGAAAGAGCTGAAGGTTGAGGGCCAGATCACCTACTACAACAGATACAAAAGGCAGAATGTGGTTAAGGACCTGTCTGTGGAACTGGACAGACTGTCTGAGGAATCTGTGAACAATGACATCAGCAGCTGGACCAAGGGCAGATCTGGGGAAGCTCTGAGCCTGCTGAAGAAGAGATTCAGCCACAGACCTGTGCAAGAGAAGTTTGTGTGTCTGAACTGTGGCTTTGAGACACATGCTGATGAACAGGCTGCTCTGAACATTGCCAGAAGCTGGCTGTTCCTGAGAAGCCAAGAGTACAAGAAGTACCAGACCAACAAGACCACAGGCAACACTGACAAGAGGGCCTTTGTGGAAACCTGGCAGAGCTTCTACAGAAAGAAACTCAAAGAAGTCTGGAAGCCTGCTGTGGGCAGCCCTGCAGCTAAAAGGGTCAAGCTGGACTGA	3235
CpG耗竭之bGH-聚腺苷酸序列	CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCAGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCACATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGAGAATAGCAGGCATGCTGGGGA	3236
CpG耗竭之U6啟動子	GAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACAATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATATTTGATGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCATAACTTGAAAGTATTTCTATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGAC	3237
參見上文表34 中之sgRNA 序列。
AAV2 3' ITR	AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG	3238

AAV產生：

在轉染當天將保持在FreeStyle 293培養基中的懸浮液調適之HEK293T細胞以1.5E6個細胞/毫升接種於20-30 mL培養基中。在無血清Opti-MEM培養基中，使用PEI-Max (Polysciences)將具有由ITR重複序列側接之轉殖基因的無內毒素pAAV質體與提供用於複製的腺病毒輔助基因以及AAV rep/cap基因體的質體共轉染。三天後，將培養物離心以將上清液與細胞集結粒分離，且按照標準程序收集AAV粒子，濃縮且過濾。

為了確定病毒基因體(vg)力價，用DNA酶及ProtK消化1 µL粗溶胞物病毒，接著進行定量PCR。5 µL經消化病毒用於25 µL qPCR反應，該反應由IDT primetime主混合物、一組引子及6'FAM/Zen/IBFQ探針(IDT)構成，經設計以擴增位於AAV2-ITR中的62 bp-片段。AAV ITR質體用作參考標準以計算病毒樣本之力價(vg/mL)。 所誘導之神經元的活體外AAV轉導：

在轉導之前24小時，將誘導神經元以每孔50,000個接種於塗佈有基質膠的96孔盤上。隨後在神經元塗鋪培養基中稀釋表現具有各種型式之引導支架之CasX:gRNA系統的AAV且添加至細胞中。首次進行實驗(「N=1」)時，細胞係以4e3個病毒基因體(vg)/細胞之感染倍率(MOI)進行轉導(參見圖24)。塗鋪後七天，將誘導神經元用在新鮮進料培養基中稀釋之病毒進行轉導。轉導後八天，使用溶解緩衝液提取細胞，根據實驗條件合併4孔重複，且收集基因體DNA (gDNA)且準備用於使用次世代定序(NGS)分析B2M基因座處之編輯。第二次進行實驗(「N=2」)時，細胞係以3e3個vg/細胞、1e3個vg/細胞或3e2個vg/細胞之MOI進行轉導(參見圖25、圖26及圖27)。塗鋪後七天，將誘導神經元用在新鮮進料培養基中稀釋之病毒進行轉導。轉導後七天，使用溶解緩衝液提取細胞，根據實驗條件合併2孔重複，且收集gDNA且準備用於使用NGS分析B2M基因座處之編輯。包括未經AAV轉導之樣本作為對照。 NGS處理及分析：

按照製造商說明書使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus套組提取來自所收集細胞之基因體DNA (gDNA)。目標擴增子係藉由用一組對人類B2M基因座具有特異性之引子擴增來自200 ng所提取gDNA之所關注區域而形成。此等基因特異性引子在5'末端含有額外序列以引入Illumina銜接子及16核苷酸之獨特分子識別符。用Ampure XP DNA淨化套組來純化經擴增DNA產物。使用Fragment Analyzer DNA分析套組(Agilent，dsDNA 35-1500 bp)評定擴增子之品質及定量。根據製造商說明書在Illumina Miseq上定序擴增子。使用cutadapt v2.1、flash2 v2.2.00及CRISPResso2 v2.0.29對定序之原始fastq檔案進行品質控制及處理。在間隔子3'末端周圍的窗口(以間隔子3'末端-3 bp為中心的30 bp窗口)內，針對相對於參考序列含有插入或缺失(插入/缺失)，對各序列進行定量。對於各樣本，CasX活性定量為此窗口內任何地方含有插入、取代及/或缺失之讀段的總百分比。 結果：

將突變引入引導支架235中，以減少編碼引導支架之DNA序列的CpG含量。出人意料地，與支架235相比，CpG減少及CpG耗竭之支架變異體均產生經誘導神經元中之較高編輯水平。此為兩個獨立實驗重複(其中第一次實驗重複的結果顯示於圖24中，且第二次實驗重複的結果顯示於圖25至圖27中)以及多個MOI (參見圖26至圖27)的情況。增強的編輯水平係出人意料的，因為降低CpG含量之目的僅為在降低免疫原性的同時保持編輯活性。實際上，突變增強編輯活性，而非僅保持該編輯活性。

值得注意的是，與支架235相比，支架320顯示效力顯著提高。支架320僅包括對支架之兩個區域的突變：假結莖及延伸莖(區域1及區域4)。此外，一些突變組合產生的編輯比支架320更差。不過，即使比支架320表現更差的CpG減少之支架，諸如支架331及334，其表現亦與支架235相似或更好。

基於此等結果，不希望受理論束縛，咸信在許多CpG減少及CpG耗竭之支架中所見之效力增強可能由存在於所有CpG減少之支架(亦即區域1及/或4)中的一種突變引起。由於延伸莖環置換(亦即對區域3的第三種突變)之支架中不存在對區域4之突變，且此等支架顯示出與320類似的超過235的效力改良，因此認為有益的作用可能由區域1 (假結莖)的突變引起，該突變存在於所有測試的支架中。將進行其他實驗以分別測試假結莖(區域1)及延伸莖(區域4)中之個別突變的作用。

另外，如圖24中所呈現之N=1資料表明，區域2 (支架莖)中攜帶突變之所有新支架的編輯水平均略低於其沒有該突變的各別對應物。此表明使支架莖中之此位置突變可能對編輯效力具有較小不利影響。此將在額外實驗中檢驗。

本文所描述之結果證明，引入降低編碼引導RNA支架之DNA的CpG含量的突變會相對於引導支架235改良基因編輯。 實例 7 ： 證實包括來自 DNMT3A 之 ADD 域增強了 LTRP 分子之活性及特異性

除其C端甲基轉移酶域以外，DNMT3A亦含有調控其功能及對染色質之募集的兩個N端域：ADD域及PWWP域。據報導，PWWP域與甲基化組蛋白尾(包括H3K36me3)相互作用。已知ADD域具有兩個關鍵功能：1)其藉由充當甲基轉移酶自抑制域異位調控DNMT3A之催化活性，且2)其識別未甲基化H3K4 (H3K4me0)。ADD域與H3K4me0標記物之相互作用顯露DNMT3A之催化位點，從而向染色質募集活性DNMT3A以重新實施此等位點處之甲基化。

鑒於ADD域之此等功能，進行實驗以評定將ADD域併入LTRP5構築體中(先前描述於實例1中)是否將使目標基因座之長期抑制改良及脫靶甲基化降低。亦評定併入PWWP域與ADD域對LTRP活性及特異性之影響。 材料及方法： LTRP構築體之產生及質體選殖：

使用標準分子選殖技術構建質體構築體，其編碼具有ZIM3-KRAB域之LTRP5構築體之變異體(LTRP5.A；LTRP5組態參見圖28)。所得構築體包含編碼LTRP5-ZIM3之以下四個替代變異形式中之一者的序列，其中併入額外DNMT3A域：1) LTRP5-ZIM3 + ADD；2) LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP；3) LTRP5-ZIM3 + ADD，無DNMT3A催化域；及4) LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP，無DNMT3A催化域。LTRP5-ZIM3分子及其變異體內關鍵元件之序列列於表36中，其中各LTRP5-ZIM3及其變異體之全長蛋白質序列列於表37中。圖29為繪示在此實例中分析之各種LTRP5架構的示意圖。編碼LTRP分子之序列亦含有2×FLAG標誌。質體亦具有編碼具有靶向內源性 B2M基因座之間隔子或非靶向對照(表38中所列之間隔子序列)之gRNA支架變異體174的構築體。 表 36 ： 用以產生圖 29 中所繪示之 LTRP5 變異體的 LTRP 組分 ( 例如與 dCasX 融合之額外域 ) 的序列

組分	蛋白質序列	SEQ ID NO
ZIM3 KRAB域	MNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESL	3240
DNMT3A催化域(CD)	NHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV	126
DNMT3L相互作用域	MGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL	127
dCasX491	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV	4
連接子1	GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE	123
連接子2	SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH	122
連接子3A'	GGSGGG	124
連接子3B	GGSGGGS	120
連接子4	GSGSGGG	121
NLS A	PKKKRKV	30
NLS B
DNMT3A ADD域	ERLVYEVRQKCRNIEDICISCGSLNVTLEHPLFIGGMCQNCKNCFLECAYQYDDDGYQSYCTICCGGREVLMCGNNNCCRCFCVECVDLLVGPGAAQAAIKEDPWNCYMCGHKGTYGLLRRREDWPSRLQMFFAN	125
DNMT3A PWWP域	TKAADDEPEYEDGRGFGIGELVWGKLRGFSWWPGRIVSWWMTGRSRAAEGTRWVMWFGDGKFSVVCVEKLMPLSSFCSAFHQATYNKQPMYRKAIYEVLQVASSRAGKLFPACHDSDESDSGKAVEVQNKQMIEWALGGFQPSGPKGLEPPEEEKNPYKEV	3252
DNMT3A PWWP與ADD域之間的內源序列(endo)	YTDMWVEPEAAAYAPPPPAKKPRKSTTEKPKVKEIIDERTR	3253

表 37 ： 在此實例中分析之 LTRP5 變異體之蛋白質序列

LTRP ID	蛋白質序列	SEQ ID NO
LTRP5-ZIM3	MAPKKKRKVSRMNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGSGGGMNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSPKKKRKV	3131
LTRP5-ZIM3 + ADD	MAPKKKRKVSRMERLVYEVRQKCRNIEDICISCGSLNVTLEHPLFIGGMCQNCKNCFLECAYQYDDDGYQSYCTICCGGREVLMCGNNNCCRCFCVECVDLLVGPGAAQAAIKEDPWNCYMCGHKGTYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGSGGGMNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSPKKKRKV	3132
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表 38 ： 構築體中所用之間隔子之序列

間隔子ID	目標基因	序列	SEQ ID NO
0.0	非靶向	CGAGACGUAAUUACGUCUCG	3232
7.37	B2M	GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG	3137
7.160	B2M	UAAACAUCACGAGACUCUAA	3113
7.165	B2M	UCCCUAUGUCCUUGCUGUUU	3114

HEK293T細胞之轉染：

用100 ng LTRP5變異體質體暫態轉染所接種HEK293T細胞，該等質體各自含有編碼LTRP5-ZIM3之LTRP:gRNA構築體或其替代變異形式中之一者(圖29；序列見表37)，其中gRNA具有非靶向間隔子0.0或靶向 B2M之間隔子(間隔子序列見表38)。間隔子7.160及7.165已展示當與LTRP一起使用而非與由融合至ZIM3 KRAB域之dCasX製成之dXR一起使用時可抑制 B2M基因座(資料未示出)。重複三次測試各構築體。轉染後24小時，用1 μg/mL嘌呤黴素選擇細胞三天。在轉染後第5天、第12天、第21天及第51天收集細胞用於抑制分析。簡言之，如實例4中所描述，藉由經由HLA免疫染色，隨後進行流動式細胞測量術，來分析B2M蛋白表現來進行抑制分析。另外，在轉染後七天收集經LTRP5變異體質體及 B2M靶向gRNA或非靶向gRNA暫態轉染之HEK293T細胞，用於gDNA提取以進行亞硫酸氫鹽定序，以評定 VEGFA基因座處之脫靶甲基化，其係如實例5中所描述進行。 結果：

評定將ADD域伴隨或不伴隨PWWP域併入至LTRP5分子中對目標 B2M基因座之長期抑制增加及脫靶甲基化減少的影響。用 B2M靶向gRNA (具有間隔子7.37以及LTRP特異性間隔子7.160及7.165)或非靶向gRNA評估LTRP5-ZIM3分子之變異形式，且結果描繪於圖30至圖33中之圖表中。圖30顯示，當與LTRP5-ZIM3、LTRP5-ZIM3 + ADD及LTRP5-ZIM3 + ADD + PWWP配對時，使用間隔子7.37產生飽和水平之抑制活性，使得評定LTRP5變異體之間的活性差異更具有挑戰性。然而，當使用間隔子7.160及7.165時，LTRP5變異體之間的抑制活性差異更明顯(圖31及圖32)。資料表明，與用其他LTRP5-ZIM3分子達成之抑制水平相比，當與兩個LTRP特異性間隔子配對時，併入ADD域引起長期抑制之顯著增加。同時，併入ADD域及PWWP域兩者並不引起 B2M基因座之抑制改良，尤其與基線LTRP5-ZIM3分子相比。如所預期，無DNMT3A催化域之兩個LTRP5變異體展現不良長期抑制。此外，圖33中描繪之結果指示，相對於基線LTRP5-ZIM3分子，鑒於觀測到較低百分比之HLA陰性細胞，添加ADD域似乎會使特異性提高。

使用亞硫酸氫鹽定序評定可能由LTRP5變異體介導的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化。圖34描繪亞硫酸氫鹽定序之結果，其具體顯示 VEGFA基因座周圍之CpG甲基化之百分比。結果證實，對於所有 B2M靶向gRNA以及非靶向gRNA，將ADD域併入LTRP5-ZIM3分子中皆顯著降低 VEGFA基因座處之脫靶甲基化水平(圖34)。圖35為散佈圖，其繪製在此實例中研究之LTRP5-ZIM3變異體的活性-特異性概況，其中活性係以與間隔子7.160配對時在第21天之HLA陰性細胞之平均百分比形式量測，且特異性係由與間隔子7.160配對時在第7天定量的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化百分比表示。散佈圖清楚顯示，添加ADD域使LTRP5分子之活性相對於無ADD域之基線ELX5分子顯著提高(圖35)。

實驗證實，包括DNMT3A ADD域但不包括ADD域及PWWP域會改良LTRP分子之抑制活性及特異性。在多種gRNA之情況下觀測到活性及特異性之增強，證實將ADD域併入LTRP中的重要性。 實例 8 ： 證實將來自 DNMT3A 之 ADD 域包括於 LTRP 中會 增強中靶活性且減少脫靶甲基化

進行實驗以評定將ADD域併入具有組態1、4及5之LTRP分子(圖1)中對目標基因座之長期抑制及脫靶甲基化的影響。 材料及方法： LTRP構築體之產生及質體選殖：

使用標準分子選殖技術構建編碼具有組態1、4及5、具有ZNF10-KRAB或ZIM3-KRAB域及DNMT3A ADD域的LTRP分子之質體構築體。所得LTRP分子之序列列於表39中，該表亦顯示特定LTRP分子之縮寫構築體名稱(例如LTRP1.A, 1.B)。圖36為繪示LTRP組態1、4及5的併入有ADD域之LTRP分子之通用架構的示意圖。編碼LTRP分子之序列亦含有2×FLAG標誌。質體亦具有編碼具有靶向內源性 B2M基因座之間隔子或非靶向對照(表38中所列之間隔子序列)之gRNA支架174的序列。 表 39 ： 在此實例中分析之各種 LTRP1 、 4 及 5 變異體的蛋白質序列

LTRP #	域	蛋白質序列	SEQ ID NO
LTRP1	ZNF10-KRAB、 DNMT3A ADD、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP1.D)	MAPKKKRKVSRMERLVYEVRQKCRNIEDICISCGSLNVTLEHPLFIGGMCQNCKNCFLECAYQYDDDGYQSYCTICCGGREVLMCGNNNCCRCFCVECVDLLVGPGAAQAAIKEDPWNCYMCGHKGTYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGGSGGGSAQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPTSPKKKRKV	3257
ZIM3-KRAB、 DNMT3A ADD、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用(LTRP1.C)	MAPKKKRKVSRMERLVYEVRQKCRNIEDICISCGSLNVTLEHPLFIGGMCQNCKNCFLECAYQYDDDGYQSYCTICCGGREVLMCGNNNCCRCFCVECVDLLVGPGAAQAAIKEDPWNCYMCGHKGTYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGGSGGGSAQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSMNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLTSPKKKRKV	3258
ZNF10-KRAB、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP1.B)	MAPKKKRKVSRVNGSGSGGGMNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGGSGGGSAQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPTSPKKKRKV	3259
ZIM3-KRAB、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP1.A)	參見表 14 中之序列	3066
LTRP4	ZNF10-KRAB、 DNMT3A ADD、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP4.D)	MAPKKKRKVSRMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPGGSGGGSAMERLVYEVRQKCRNIEDICISCGSLNVTLEHPLFIGGMCQNCKNCFLECAYQYDDDGYQSYCTICCGGREVLMCGNNNCCRCFCVECVDLLVGPGAAQAAIKEDPWNCYMCGHKGTYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSPKKKRKV	3260
ZIM3-KRAB、 DNMT3A ADD、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP4.C)	MAPKKKRKVSRMNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLGGSGGGSAMERLVYEVRQKCRNIEDICISCGSLNVTLEHPLFIGGMCQNCKNCFLECAYQYDDDGYQSYCTICCGGREVLMCGNNNCCRCFCVECVDLLVGPGAAQAAIKEDPWNCYMCGHKGTYGLLRRREDWPSRLQMFFANNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSPKKKRKV	3261
ZNF10-KRAB、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP4.B)	MAPKKKRKVSRMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPGGSGGGSAMNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSPKKKRKV	3262
ZIM3-KRAB、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP4.A)	MAPKKKRKVSRVNGSGSGGGMNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGSGGGMDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEPGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSPKKKRKV	3263
LTRP5	ZNF10-KRAB、 DNMT3A ADD、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用(LTRP5.D)	MAPKKKRKVSRMNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESLGGSGGGSAMNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSPKKKRKV	3264
ZIM3-KRAB、 DNMT3A ADD、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP5.C)	參見表 37 中之序列	3132
	ZNF10-KRAB、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP5.B)	MAPKKKRKVSRVNGSGSGGGMNHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACVSSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSHMGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPLGGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSEGGSGGGSAQEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAVRSGGSGGGSTSSQGSVTFRDVAIDFSQEEWKWLQPAQRDLYRRVMLENYGHLVSLGLSISKPDVVSLLEQGKEPWLGKRNVKRDLFSASESSTSPKKKRKV	3265
ZIM3-KRAB、 DNMT3A CD、 DNMT3L相互作用 (LTRP5.A)	參見表 37 中之序列	3131

HEK293T細胞之轉染：

用100 ng LTRP變異體質體暫態轉染所接種HEK293T細胞，該等質體各自含有編碼LTRP分子(表39；圖36)之LTRP:gRNA構築體，其中gRNA具有非靶向間隔子0.0或靶向 B2M之間隔子(表38)。重複三次測試各構築體。轉染後24小時，用1 μg/mL嘌呤黴素選擇細胞3天。收集細胞以在轉染後第8天、第13天、第20天及第27天用於抑制分析。簡言之，如實例4中所描述，藉由經由HLA免疫染色，隨後進行流動式細胞測量術，來分析B2M蛋白表現來進行抑制分析。另外，亦在轉染後第5天收集細胞，用於gDNA提取以進行供亞硫酸氫鹽定序，以評定非目標 VEGFA基因座處之脫靶甲基化，其係使用與如實例5中所描述類似之方法進行。 結果：

評估將ADD域併入至具有組態1、4或5、具有ZNF10或ZIM-KRAB的LTRP分子中對 B2M基因座之長期抑制及脫靶甲基化的影響。用 B2M靶向gRNA或非靶向gRNA測試LTRP分子，且結果描繪於圖37至圖47中之圖表中。資料證實，當使用間隔子7.160時，將ADD域併入LTRP分子中明顯使得含有ZIM3-KRAB之所有LTRP組態在所有時間點之B2M抑制顯著增加(圖37)，且在使用間隔子7.165及7.37時觀測到類似發現(資料未顯示)。圖38顯示當與具有間隔子7.160之gRNA配對時，使用含有ZNF10或ZIM3-KRAB之LTRP5後所得的B2M抑制；資料證實，包括ADD域總體上增加持久B2M抑制，其中LTRP5-ZIM3 + ADD具有比LTRP5-ZNF10 + ADD高之活性。針對LTRP1及LTRP4以及其他兩個間隔子，觀測到類似時程發現(資料未示出)。圖39顯示當與三種 B2M靶向gRNA中之任一者配對時，在使用含有ZIM3-KRAB之LTRP5後所得的B2M抑制，且資料證實，包括ADD域總體上引起較高之B2M抑制。針對LTRP1及LTRP4，亦觀測到類似時程發現(資料未示出)。

圖40至圖42顯示所有LTRP組態及所測試gRNA在第27天時間點的所得B2M抑制。結果顯示與使用間隔子7.37相比，使用次佳間隔子7.160及7.165之B2M抑制的增加更加顯著。此外，使用在分子之N端含有DNMT3A及DNMT3L域的LTRP1及LTRP5使得B2M抑制在添加DNMT3A ADD域後增加最多(圖40至圖42)。使用在KRAB域之3'及dCasX之5'具有DNMT3A/3L域的LTRP4引起較少活性提高，其可歸因於ADD域與染色質適當相互作用之能力下降。

藉由使用亞硫酸氫鹽定序剖析 VEGFA基因(脫靶基因座)處之CpG甲基化水平來測定LTRP分子之特異性，且資料繪示於圖43至圖51中。資料證實，包括DNMT3A ADD域引起所有所測試條件的 VEGFA基因座之脫靶甲基化顯著減少(圖43至圖45)。值得注意的是，由包括ADD域介導的特異性提高對於LTRP1及LTRP5組態最為顯著，該等兩個組態在分子之N端末端具有DNMT3A/3L域。有趣的是，含有ZIM3-KRAB域之LTRP分子引起VEGFA基因座之更強脫靶甲基化。此外，即使在不存在ADD域之情況下，使用LTRP4及5組態產生之特異性比使用LTRP1組態高。與LTRP1-ZIM3及LTRP4-ZIM3組態相比，將ADD域包括於LTRP5-ZIM3中引起最低之脫靶甲基化。

圖46至圖51為一系列散佈圖，其繪製各種LTRP分子之活性-特異性概況，其中活性係以第27天的HLA陰性細胞之平均百分比形式量測，且特異性係由第5天 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化百分比測定。資料證實，在所測試之所有三個靶向 B2M之間隔子中，包括ADD域使得中靶B2M抑制增加且VEGFA基因座處之脫靶甲基化減少。具有組態1及5組態之LTRP分子在所測試之各間隔子處展現活性及特異性之最大增加。

在此實例中論述之實驗結果支持實例7中之發現，亦即資料證實，包括DNMT3A ADD域會增強早期時間點之抑制強度及緘默化跨細胞分裂之可遺傳性，且減少由LTRP分子中之DNMT3A催化域引發的脫靶甲基化。資料亦確證，不同LTRP組態之特異性具有固有差異，其可因使用更強效抑制子域而加劇。此特異性降低可藉由包括DNMT3A ADD域而減輕，其亦可總體上引起更多中靶抑制。認為抑制活性之提高係由DNMT3A ADD域識別H3K4me0的功能及至染色質之後續募集介導。認為特異性提高係經由DNMT3A ADD域在不存在H3K4me0結合之情況下誘導DNMT3A之催化域之異位抑制的功能介導。結果亦突顯，將ADD域定位於不同所測試組態中對於實現LTRP分子之特異性及活性的最強提高十分重要。 實例 9 ： 證實使用 DNMT1 抑制劑使由 LTRP 分子介導之目標基因座之緘默化可逆

進行實驗以證實由LTRP分子介導的目標基因座之持久抑制可逆，使得用DNMT1抑制劑處理將移除甲基標記物以再活化目標基因之表現。 材料及方法： LTRP構築體之產生及慢病毒質體選殖：

使用標準分子選殖技術建構編碼LTRP分子之慢病毒質體構築體。此等構築體包括編碼催化失效CasX蛋白491 (dCasX491)之序列、來自ZNF10或ZIM3之KRAB域以及分別來自DNMT3A (D3A)及DNMT3L (D3L)之催化域及相互作用域。簡言之，構築體呈寡核苷酸排序，且藉由重疊延伸PCR，然後等溫組裝進行組裝。所得質體含有以不同組態安置以產生LTRP分子之構築體。編碼LTRP分子之序列亦含有2×FLAG標誌。質體亦具有編碼具有靶向內源性B2M基因座之間隔子或非靶向對照之gRNA支架變異體174的序列。此等構築體均選殖於慢病毒質體上之P2A嘌呤黴素元件上游。中間預處理經選殖及序列驗證之構築體且進行品質評定，之後在HEK293T細胞中轉染。

在此實驗中使用含有ZIM3-KRAB域及CasX變異體491之LTRP5。此實驗中使用具有含有間隔子7.37 (SEQ ID NO: 3137)之支架174的 B2M靶向gRNA或含有間隔子0.0 (SEQ ID NO: 3232)的非靶向gRNA。 HEK293T細胞之轉染：

用100 ng質體轉染HEK293T細胞且培養58天，該質體含有編碼CasX 491或含有ZIM3-KRAB域之LTRP5的具有 B2M靶向gRNA或非靶向gRNA的構築體。隨後，將此等經轉染之HEK293T細胞以約30,000個細胞再接種於96孔盤各孔中，且用濃度範圍在0 µM至20 µM內的DNMT1抑制劑5-氮雜-2'-去氧胞苷(5-azadC)處理。在用5-azadC處理後六天，收集細胞以在轉染後第5天、第12天及第21天用於B2M緘默化分析。簡言之，如實例4中所描述，藉由經由HLA免疫染色，隨後進行流動式細胞測量術，來分析B2M蛋白表現來進行抑制分析。重複三次進行各實驗條件的各劑量之5-azadC的處理。 結果：

圖52中之圖表顯示用指定濃度之表現B2M蛋白之5-azadC處理的經轉染HEK293T細胞之百分比。資料表明，經編碼LTRP5-ZIM3與 B2M靶向gRNA的質體轉染的細胞的5-azadC處理引起 B2M基因之再活化(圖52)。具體而言，與25%細胞在0 µM濃度下具有B2M表現相比，約75%經20 µM 5-azadC處理之細胞展現B2M表現(圖52)。此外，經編碼CasX 491與 B2M靶向gRNA的質體轉染的細胞之5-azadC處理並未展現 B2M基因之再活化。圖53為並列示出5-azadC處理後的B2M抑制活性與基因再活化的圖表。資料顯示，用CasX 491或LTRP5-ZIM3與 B2M靶向gRNA轉染後出現B2M抑制，在第58天引起約75%之B2M表現抑制；然而，B2M表現在5-azadC處理後增加(圖53)。如所預期，經CasX 491或LTRP5-ZIM3與非靶向gRNA轉染之細胞的5-azadC處理未展現抑制或再活化(圖52至圖53)。

實驗證實LTRP介導的目標基因座抑制之可逆性。藉由使用DNMT1抑制劑移除LTRP分子形成之甲基標記物，再活化緘默化之目標基因以誘導目標蛋白之表現。 實例 10 ： LTRP 融合蛋白之例示性序列   

表40提供呈組態1、4或5、具有ADD域(圖1)，具有人類ZIM3或ZNF10 KRAB域或以下前九個最有效抑制子域之一的例示性全長LTRP融合蛋白中所用的組分序列：域_7694、域_10123、域_15507、域_17905、域_20505、域_26749、域_27604、域_29304及域_30173。在表40中，針對各別LTRP組態，組分係按N端至C端次序列出。 表 40 ： LTRP 融合蛋白之例示性蛋白質序列

LTRP #	組分	域	AA 序列	SEQ ID NO
具有ADD域之LTRP1	起始密碼子+ NLS + 緩衝序列		MAPKKKRKVSR	3269
起始密碼子+ DNMT3A ADD域		MERLVYEVRQKCRNIEDICISCGSLNVTLEHPLFIGGMCQNCKNCFLECAYQYDDDGYQSYCTICCGGREVLMCGNNNCCRCFCVECVDLLVGPGAAQAAIKEDPWNCYMCGHKGTYGLLRRREDWPSRLQMFFAN	3270
DNMT3A催化域		NHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV	126
連接子(L2)		SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH	122
DNMT3L相互作用域		MGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL	127
連接子(L1)		GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE	123
連接子(L3A) + 緩衝液		GGSGGGSA	3271
dCasX491		QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV	4
緩衝液 + 連接子(L3B)		RSGGSGGGSTS	3272
抑制子域1	人類ZIM3	MNNSQGRVTFEDVTVNFTQGEWQRLNPEQRNLYRDVMLENYSNLVSVGQGETTKPDVILRLEQGKEPWLEEEEVLGSGRAEKNGDIGGQIWKPKDVKESL	3240
人類ZNF10	MDAKSLTAWSRTLVTFKDVFVDFTREEWKLLDTAQQIVYRNVMLENYKNLVSLGYQLTKPDVILRLEKGEEP	3239
原鴿( Columba livia)抑制子域(域_7694)	QDVVTFKDVAIYFSPEEWVRLSAGQRELYQEVMLDNYELVTSLDRESKLLYKMDPEEESCEGVPYSSADSGAPDSSSTSAC	130
褐家鼠( Rattus norvegicus)抑制子域 ( 域_10123)	ALVTFEDVAVRFTQEEWALLDPSQKILYRDVMRETYRNLTSVGINWECWDLEACFRSLGRNLRVQVVKRKCELTNSGPCAE	131
巴拿馬卷尾猴( Cebus imitator)抑制子域 ( 域_15507)	SKAPITFGDLAIYFSQEEWEWLSPIQKDLYEDVMLENYRNLVSLGLSFRRPNVITLLEKGKAPWMVEPARRRRGPDSGSKV	132
黑猩猩(Chimpanzee)抑制子域(域_17905)	EMGLLTFRDIAIEFSLEEWQCLDCAQRNLYRDVMLENYRNLVSLGIAVSKPDLITCLEQNKESQNIKRNKMVAKHPVMHSH	133
綠猴( Chlorocebus sabaeus) 抑制子域 ( 域_20505)	SQESVAFEDVAVYFTTKEWAIMVPAERALYRDVMLENYEAVAFVAVPPTSKPALVSHLEQGKESCFIRPPGVLSRSDWRAG	134
眼鏡王蛇( Ophiophagus hannah)抑制子域 ( 域_26749)	STPVTFEDVVVYFTAAEWVHLTNWQRDFYQAVMMETYELVASVAGDGVPMAEDEEGGVERPVWQYIPRGKRRRKTPQPRAD	135
大熊貓( Ailuropoda melanoleuca)抑制子域 ( 域_27604)	LLTFEDVAVSFSEEEWELLDPPQKTLYNDVMQENYETVISLGLKLKNDTGNDQPISISALEMQASGSKVLRKARMKVAQKT	136
貝氏東部鹿鼠( Peromyscus maniculatus bairdii)抑制子域 ( 域_29304)	VTYNDVHVDITQEEWALMDPSQRNLYKDVMVETYMNLTAIGYNWENLEVEEPCQNPLKHGRHERPHTGEKPYEYNQCGKAFAQP	137
矛吻蝠( Phyllostomus discolor)抑制子域 ( 域_30173)	VAFRDVIVDFTQEEWQQLKPAQKDLYRDVMMEIYWNLVSLDLETEGDMNEPDPEKDSWEDRTSIVVVEGLMRNGAQGYACEKAGIQGCRV	138
緩衝液 + NLS		TSPKKKRKV	3273
具有ADD域之LTRP4	起始密碼子+ NLS + 緩衝序列		參見以上序列	3269
抑制子域1	人類ZIM3	參見以上序列	3240
人類ZNF10	參見以上序列	3239
原鴿抑制子域(域_7694)	參見以上序列	130
褐家鼠抑制子域 ( 域_10123)	參見以上序列	131
巴拿馬卷尾猴抑制子域 ( 域_15507)	參見以上序列	132
黑猩猩抑制子域(域_17905)	參見以上序列	133
綠猴抑制子域 ( 域_20505)	參見以上序列	134
眼鏡王蛇抑制子域 ( 域_26749)	參見以上序列	135
大熊貓抑制子域 ( 域_27604)	參見以上序列	136
貝氏東部鹿鼠抑制子域 ( 域_29304)	參見以上序列	137
矛吻蝠抑制子域 ( 域_30173)	參見以上序列	138
連接子(L3A) + 緩衝液		參見以上序列	3271
起始密碼子+ DNMT3A ADD域		參見以上序列	3270
DNMT3A催化域		參見以上序列	126
連接子(L2)		參見以上序列	122
DNMT3L相互作用域		參見以上序列	127
連接子(L1)		參見以上序列	123
dCasX491		參見以上序列	4
緩衝液 + 連接子(L3B)		參見以上序列	3272
NLS		參見以上序列	30
具有ADD域之LTRP5	起始密碼子+ NLS + 緩衝序列		參見以上序列	3269
起始密碼子+ DNMT3A ADD域		參見以上序列	3270
DNMT3A催化域		參見以上序列	126
連接子(L2)		參見以上序列	122
DNMT3L相互作用域		參見以上序列	127
連接子(L3A)		參見以上序列	124
抑制子域1	人類ZIM3	參見以上序列	3240
人類ZNF10	參見以上序列	3239
原鴿抑制子域(域_7694)	參見以上序列	130
褐家鼠抑制子域 ( 域_10123)	參見以上序列	131
巴拿馬卷尾猴抑制子域 ( 域_15507)	參見以上序列	132
黑猩猩抑制子域(域_17905)	參見以上序列	133
綠猴抑制子域 ( 域_20505)	參見以上序列	134
眼鏡王蛇抑制子域 ( 域_26749)	參見以上序列	135
大熊貓抑制子域 ( 域_27604)	參見以上序列	136
貝氏東部鹿鼠抑制子域 ( 域_29304)	參見以上序列	137
矛吻蝠抑制子域 ( 域_30173)	參見以上序列	138
連接子(L1)		參見以上序列	123
dCasX491		參見以上序列	4
緩衝液 + 連接子(L3B)		參見以上序列	3272
NLS		參見以上序列	30

表41提供LTRP構築體各組分之例示性胺基酸序列。在表41中，示出無起始甲硫胺酸之蛋白質域。 表 41 ： LTRP 構築體各組分之例示性蛋白質序列

組分	蛋白質序列SEQ ID NO
DNMT3A催化域(CD)	126
DNMT3L相互作用域	127
dCasX491	4
連接子1 (L1)	123
連接子2 (L2)	122
連接子3A (L3A)	124
連接子3B (L3B)	120
NLS	30
DNMT3A ADD域	125

實例 11 ： 證實包括第二抑制子域會增強 LTRP-ADD 分子之活性同時維持其特異性

進行實驗以確定併入第二抑制子域是否會增強含有ADD域之LTRP分子的活性及特異性。此第二抑制子域定位於先前描述於實例7中之LTRP5-ADD分子之C端上，使得產生具有新組態之LTRP分子(下文描述為LTRP6分子)。圖54中之示意圖顯示具有組態6a或6b之LTRP6分子。具有組態#6a之分子相對於dCasX在N端及C端位置利用相同的抑制子域，而具有組態6b之分子在該兩個位置處使用兩個不同的抑制子域。

在此實例中，進行實驗以評定在LTRP5-ADD-ZIM3分子之C末上併入第二抑制子域產生具有組態6b組態之LTRP6分子是否會誘導目標基因座之長期抑制。 材料及方法： LTRP6構築體之產生及質體選殖：

使用所描述之標準分子選殖技術構建編碼使用ZIM3-KRAB域作為第一抑制子域之LTRP6分子的質體構築體。簡言之，將前95個抑制子域之代表性成員(表42)作為第二抑制子域選殖於如實例7中所述產生之LTRP5-ADD-ZIM3構築體之C端上(其中DNA及蛋白質序列提供於表37中)。LTRP5-ADD-ZIM3分子充當實驗對照。質體亦具有編碼gRNA支架變異體174之構築體，該gRNA支架變異體具有靶向內源性 B2M基因座之間隔子(間隔子7.165；UCCCUAUGUCCUUGCUGUUU；SEQ ID NO: 3114)或非靶向對照。此等構築體均選殖於慢病毒質體上之P2A嘌呤黴素元件上游。 HEK293T細胞之轉染：

用100 ng LTRP質體暫態轉染所接種之HEK293T細胞，該等質體各自含有LTRP:gRNA構築體，該構築體編碼含有ZIM3-KRAB域作為第一抑制子域且增強之抑制子域作為第二抑制子域的LTRP6變異體，及具有非靶向間隔子或靶向 B2M之間隔子的gRNA。轉染後24小時，用1 μg/mL嘌呤黴素選擇細胞三天。在轉染後第4天、第8天及第13天收集細胞以用於抑制分析。簡言之，如實例4中所描述，藉由經由HLA免疫染色，隨後進行流動式細胞測量術，來分析B2M蛋白表現來進行抑制分析。 結果：

評定將第二抑制子域併入LTRP5-ADD-ZIM3分子中由此產生LTRP6構築體對增加對目標 B2M基因座之長期抑制的影響。此時程實驗的結果描繪於表43至表45中，其顯示在轉染後4天、8天及13天在各條件下表徵為HLA陰性(指示B2M抑制)之細胞的平均百分比。對應於下表中之域ID的SEQ ID NO提供於表42中。 表 42 ： 前 9 個 及前 95 個最有效抑制子域的清單

域ID	描述	SEQ ID NO
前9 個抑制子域
域_7694	原鴿抑制子域	130
域_10123	褐家鼠抑制子域	131
域_15507	巴拿馬卷尾猴抑制子域	132
域_17905	黑猩猩抑制子域	133
域_20505	綠猴抑制子域	134
域_26749	眼鏡王蛇抑制子域	135
域_27604	大熊貓抑制子域	136
域_29304	貝氏東部鹿鼠抑制子域	137
域_30173	矛吻蝠抑制子域	138
前95 個抑制子域中的剩餘抑制子域
域_737	倭黑猩猩(Bonobo)抑制子域	139
域_10331	安哥拉黑白疣猴(Colobus angolensis palliatus)抑制子域	140
域_10948	安哥拉黑白疣猴抑制子域	141
域_11029	黑面山魈(Mandrillus leucophaeus)抑制子域	142
域_17358	印度牛x 歐洲牛(Bos indicus x Bos Taurus)抑制子域	143
域_17759	家貓(Felis catus)抑制子域	144
域_18258	抹香鯨(Physeter microcephalus)抑制子域	145
域_19804	北方海狗(Callorhinus ursinus)抑制子域	146
域_221	倭黑猩猩抑制子域	147
域_881	倭黑猩猩抑制子域	148
域_2380	紅毛猩猩(Orangutan)抑制子域	149
域_2942	長臂猿(Gibbon)抑制子域	150
域_4687	狨(Marmoset)抑制子域	151
域_4806	狨抑制子域	152
域_4968	狨抑制子域	153
域_5066	狨抑制子域	154
域_5290	梟猴(Owl Monkey)抑制子域	155
域_5463	梟猴抑制子域	156
域_6248	玻利維亞松鼠猴(Saimiri boliviensis boliviensis)抑制子域	157
域_6445	中華短吻鱷(Alligator sinensis)抑制子域	158
域_6802	粟米蛇(Pantherophis guttatus)抑制子域	159
域_6807	非洲爪蟾(Xenopus laevis)抑制子域	160
域_7255	單色蚯蚓(Microcaecilia unicolor)抑制子域	161
域_8503	田鼷鼠(Mus caroli)抑制子域	162
域_8790	美洲旱獺(Marmota monax)抑制子域	163
域_8853	敍利亞倉鼠(Mesocricetus auratus)抑制子域	164
域_9114	貝氏東部鹿鼠抑制子域	165
域_9331	貝氏東部鹿鼠抑制子域	166
域_9538	小家鼠(Mus musculus)抑制子域	167
域_9960	八齒鼠(Octodon degus)抑制子域	168
域_10277	奧氏更格盧鼠(Dipodomys ordii)抑制子域	169
域_10577	安哥拉黑白疣猴抑制子域	170
域_11348	綠猴抑制子域	171
域_11386	家山羊(Capra hircus)抑制子域	172
域_11486	野犛牛(Bos mutus)抑制子域	173
域_11683	白頰長臂猿(Nomascus leucogenys)抑制子域	174
域_12292	野豬(Sus scrofa)抑制子域	175
域_12452	長江江豚(Neophocaena asiaeorientalis asiaeorientalis)抑制子域	176
域_12631	食蟹獼猴(Macaca fascicularis)抑制子域	177
域_13331	食蟹獼猴抑制子域	178
域_13468	無尾熊(Phascolarctos cinereus)抑制子域	179
域_13539	大猩猩(Gorilla)抑制子域	180
域_14659	獵豹(Acinonyx jubatus)抑制子域	181
域_14755	巴拿馬卷尾猴抑制子域	182
域_15126	普通狨(Callithrix jacchus)抑制子域	183
域_16444	獵豹抑制子域	184
域_16688	白鱀豚(Lipotes vexillifer)抑制子域	185
域_16806	卷尾猴(Sapajus apaella)抑制子域	186
域_17317	小耳大嬰猴(Otolemur garnettii)抑制子域	187
域_17432	小耳大嬰猴抑制子域	188
域_18137	灰色短尾負鼠(Monodelphis domestica)抑制子域	189
域_18216	抹香鯨抑制子域	190
域_18563	梟猴抑制子域	191
域_19229	阿拉斯加海獺(Enhydra lutris kenyoni)抑制子域	192
域_19460	灰色短尾負鼠抑制子域	193
域_19476	梟猴抑制子域	194
域_19821	川金絲猴(Rhinopithecus roxellana)抑制子域	195
域_19892	北極熊(Ursus maritimus)抑制子域	196
域_19896	綿羊(Ovis aries)抑制子域	197
域_19949	北方海狗抑制子域	198
域_21247	美洲水鼬(Neovison vison)抑制子域	199
域_21317	大狐蝠(Pteropus vampyrus)抑制子域	200
域_21336	家馬(Equus caballus)抑制子域	201
域_21603	白鱀豚抑制子域	202
域_21755	家馬抑制子域	203
域_22153	加州海獅(Zalophus californianus)抑制子域	204
域_22270	倭黑猩猩抑制子域	205
域_23394	小羊駝(Vicugna pacos)抑制子域	206
域_23723	眼鏡猴(Carlito syrichta)抑制子域	207
域_24125	玻利維亞松鼠猴抑制子域	208
域_24458	伊比利亞猞猁(Lynx pardinus)抑制子域	209
域_24663	伯氏鼠耳蝠(Myotis brandtii)抑制子域	210
域_25289	北極熊抑制子域	211
域_25379	卷尾猴抑制子域	212
域_25405	吸血蝠(Desmodus rotundus)抑制子域	213
域_26070	蚓螈(Geotrypetes seraphini)抑制子域	214
域_26322	蚓螈抑制子域	215
域_26732	野生火雞(Meleagris gallopavo)抑制子域	216
域_27060	沙漠地鼠龜(Gopherus agassizii)抑制子域	217
域_27385	八齒鼠抑制子域	218
域_27506	野犛牛抑制子域	219
域_27811	普通狨抑制子域	220
域_28640	山齒鶉(Colinus virginianus)抑制子域	221
域_28803	灰色短尾負鼠抑制子域	222
域_30661	抹香鯨抑制子域	223
域_31643	南美珊瑚蛇(Micrurus lemniscatus lemniscatus)抑制子域	224

表 43 ： 在轉染後 4 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 指示所使用及評定之第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均 HLA 陰性細胞 %	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	6.827	0.359	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	53.833	1.159	3
LTRP6_域_20505	7.165	69.333	0.493	3
LTRP6_域_30173	7.165	70.267	1.115	3
LTRP6_域_15507	7.165	71.800	0.436	3
LTRP6_域_18137	7.165	71.900	0.600	3
LTRP6_域_24458	7.165	73.333	0.961	3
LTRP6_域_6445	7.165	73.567	0.666	3
LTRP6_域_17432	7.165	74.667	0.603	3
LTRP6_域_9960	7.165	76.000	0.100	3
LTRP6_域_13468	7.165	76.167	0.493	3
LTRP6_域_8853	7.165	77.400	0.173	3
LTRP6_域_6802	7.165	77.700	0.361	3
LTRP6_域_7694	7.165	78.300	0.361	3
LTRP6_域_29304	7.165	78.933	0.814	3
LTRP6_域_25379	7.165	80.033	0.569	3
LTRP6_域_22153	7.165	80.200	1.493	3
LTRP6_域_7255	7.165	80.567	0.551	3
LTRP6_域_26749	7.165	81.467	0.503	3
LTRP6_域_10123	7.165	81.833	0.289	3

表 44 ： 在轉染後 8 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 指示所使用及評定之第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	2.100	0.311	2
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	55.000	0.300	3
LTRP6_域_20505	7.165	72.367	1.686	3
LTRP6_域_30173	7.165	72.733	1.069	3
LTRP6_域_15507	7.165	74.033	0.351	3
LTRP6_域_18137	7.165	75.100	1.253	3
LTRP6_域_24458	7.165	76.167	0.737	3
LTRP6_域_6445	7.165	77.600	1.249	3
LTRP6_域_17432	7.165	78.233	0.153	3
LTRP6_域_9960	7.165	77.600	0.346	3
LTRP6_域_13468	7.165	79.067	0.651	3
LTRP6_域_8853	7.165	79.333	1.150	3
LTRP6_域_6802	7.165	78.400	0.265	3
LTRP6_域_7694	7.165	81.433	0.416	3
LTRP6_域_29304	7.165	80.433	0.569	3
LTRP6_域_25379	7.165	82.167	0.351	3
LTRP6_域_22153	7.165	81.333	1.210	3
LTRP6_域_7255	7.165	80.933	0.404	3
LTRP6_域_26749	7.165	85.767	0.777	3
LTRP6_域_10123	7.165	83.000	0.625	3

表 45 ： 在轉染後 13 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 指示所使用及評定之第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	1.587	0.670	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	50.267	0.987	3
LTRP6_域_20505	7.165	70.133	0.945	3
LTRP6_域_30173	7.165	70.233	0.666	3
LTRP6_域_15507	7.165	72.067	0.252	3
LTRP6_域_18137	7.165	72.767	1.514	3
LTRP6_域_24458	7.165	73.967	0.404	3
LTRP6_域_6445	7.165	75.967	0.723	3
LTRP6_域_17432	7.165	75.667	0.351	3
LTRP6_域_9960	7.165	74.233	0.814	3
LTRP6_域_13468	7.165	76.767	0.764	3
LTRP6_域_8853	7.165	75.133	1.457	3
LTRP6_域_6802	7.165	74.700	1.136	3
LTRP6_域_7694	7.165	78.967	0.321	3
LTRP6_域_29304	7.165	78.233	1.332	3
LTRP6_域_25379	7.165	78.600	0.985	3
LTRP6_域_22153	7.165	77.533	0.839	3
LTRP6_域_7255	7.165	77.700	0.265	3
LTRP6_域_26749	7.165	83.800	1.127	3
LTRP6_域_10123	7.165	79.367	0.702	3

表43至表45中之資料顯示，到轉染後至少13天，具有 B2M靶向gRNA的所有LTRP6構築體均能夠誘導更高的B2M抑制水平，且取決於用作第二抑制子域之抑制子域，抑制效力存在微小變化。值得注意的是，使用域_26749 (來自眼鏡王蛇)作為第二抑制子域引起約83.8%之B2M抑制，此為所評定之其他抑制子域中抑制水平最高的。相比之下，LTRP5-ADD-ZIM3構築體僅實現約50.3%之抑制水平，該抑制水平比由具有ZIM3及域_26749抑制子域之LTRP6構築體所實現之抑制水平低約40% (表43至表45)。自此等實驗觀測到的抑制改良可藉由使用更強效之抑制子域、ADD域之存在及LTRP6構築體組態中第二抑制子域之併入的協同效應解釋。以下實例12進一步研究使用兩個增強型抑制子域對LTRP6構築體之活性及特異性的影響。

此等實驗結果表明，併入第二抑制子域可增強含有ADD域之LTRP分子的活性。本文所描述之結果顯示，在LTRP5-ADD-ZIM3分子之C端上併入增強型抑制子域，產生LTRP6構築體，將改良在人類細胞中內源性基因座處之抑制活性。 實例 12 ： 評定使用兩個抑制子域及其在 LTRP6 分子內之相對位置對活性及特異性之影響

進行實驗以確定先前描述於實例11中之LTRP組態6 (LTRP6)分子之變化形式是否會引起目標基因座之長期抑制的改良及脫靶甲基化之減少。此處，對使用增強型抑制子域在LTRP6分子內作為第一抑制子域及第二抑制子域以及此等抑制子域之相對位置的影響進行評估。如圖61中所示，在此實例中測試LTRP6組態之兩種變化形式。具有組態6a之分子相對於dCasX在N端及C端位置利用相同的抑制子域，而具有組態6b之分子在該兩個位置處使用兩個不同的抑制子域。 材料及方法： LTRP6構築體之產生及質體選殖：

使用標準分子選殖技術構建質體構築體，其編碼具有圖61之示意圖中所示之組態6a或6b的LTRP6分子之變異體。在此實例中，使用以下四個抑制子域產生LTRP6分子之變異體：域_22153、域_7255、域_26749及域_10123。選擇此四個域係因為當其併入作為LTRP6組態中之第二抑制子域時，在轉染後4天誘導最高水平的B2M抑制，如實例11中所示(表43至表45)。相對於dCasX在N端及/或C端位置處以組合方式測試該四個抑制子域中之各者，產生總計16個評定組合。該16種LTRP6變異體之編碼序列示於表46中，其對應蛋白質序列示於表47中。質體亦具有編碼gRNA支架變異體174之構築體，該gRNA支架變異體具有靶向內源性 B2M基因座之間隔子(間隔子7.165；UCCCUAUGUCCUUGCUGUUU；SEQ ID NO: 3114)或非靶向對照。此等構築體均選殖於慢病毒質體上之P2A嘌呤黴素元件上游。 表 46 ： 此 實例中 評定之 16 種 LTRP6 變異體的編碼序列 *

組分	域組合#	域	DNA 序列
起始密碼子+ NLS + 緩衝序列			ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCTCTAGA
起始密碼子+ DNMT3A ADD域			ATGGAGCGGCTGGTGTATGAGGTGCGCCAGAAGTGCAGAAACATCGAGGACATTTGTATCTCATGTGGGAGCCTCAATGTCACCCTGGAGCACCCACTCTTCATTGGAGGCATGTGCCAGAACTGTAAGAACTGCTTCTTGGAGTGTGCTTACCAGTATGACGACGATGGGTACCAGTCCTATTGCACCATCTGCTGTGGGGGGCGTGAAGTGCTCATGTGTGGGAACAACAACTGCTGCAGGTGCTTTTGTGTCGAGTGTGTGGATCTCTTGGTGGGGCCAGGAGCTGCTCAGGCAGCCATTAAGGAAGACCCCTGGAACTGCTACATGTGCGGGCATAAGGGCACCTATGGGCTGCTGCGAAGACGGGAAGACTGGCCTTCTCGACTCCAGATGTTCTTTGCCAAT
DNMT3A催化域			AACCATGACCAGGAATTTGACCCCCCAAAGGTTTACCCACCTGTGCCAGCTGAGAAGAGGAAGCCCATCCGCGTGCTGTCTCTCTTTGATGGGATTGCTACAGGGCTCCTGGTGCTGAAGGACCTGGGCATCCAAGTGGACCGCTACATCGCCTCCGAGGTGTGTGAGGACTCCATCACGGTGGGCATGGTGCGGCACCAGGGAAAGATCATGTACGTCGGGGACGTCCGCAGCGTCACACAGAAGCATATCCAGGAGTGGGGCCCATTCGACCTGGTGATTGGAGGCAGTCCCTGCAACGACCTCTCCATTGTCAACCCTGCCCGCAAGGGACTTTATGAGGGTACTGGCCGCCTCTTCTTTGAGTTCTACCGCCTCCTGCATGATGCGCGGCCCAAGGAGGGAGATGATCGCCCCTTCTTCTGGCTCTTTGAGAATGTGGTGGCCATGGGCGTTAGTGACAAGAGGGACATCTCGCGATTTCTTGAGTCTAACCCCGTGATGATTGACGCCAAAGAAGTGTCTGCTGCACACAGGGCCCGTTACTTCTGGGGTAACCTTCCTGGCATGAACAGGCCTTTGGCATCCACTGTGAATGATAAGCTGGAGCTGCAAGAGTGTCTGGAGCACGGCAGAATAGCCAAGTTCAGCAAAGTGAGGACCATTACCACCAGGTCAAACTCTATAAAGCAGGGCAAAGACCAGCATTTCCCCGTCTTCATGAACGAGAAGGAGGACATCCTGTGGTGCACTGAAATGGAAAGGGTGTTTGGCTTCCCCGTCCACTACACAGACGTGTCCAACATGAGCCGCTTGGCGAGGCAGAGACTGCTGGGCCGGTCGTGGAGCGTGCCGGTCATCCGCCACCTCTTCGCTCCGCTGAAGGAATATTTTGCTTGTGTG
連接子2 (L2)			TCTAGCGGCAATAGTAACGCTAACAGCCGCGGGCCGAGCTTCAGCAGCGGCCTGGTGCCGTTAAGCTTGCGCGGCAGCCAT
DNMT3L相互作用域			ATGGGCCCTATGGAGATATACAAGACAGTGTCTGCATGGAAGAGACAGCCAGTGCGGGTACTGAGCCTCTTCAGAAACATCGACAAGGTACTAAAGAGTTTGGGCTTCTTGGAAAGCGGTTCTGGTTCTGGGGGAGGAACGCTGAAGTACGTGGAAGATGTCACAAATGTCGTGAGGAGGGACGTGGAGAAATGGGGCCCCTTTGACCTGGTGTACGGCTCGACGCAGCCCCTAGGCAGCTCTTGTGATCGCTGTCCCGGCTGGTACATGTTCCAGTTCCACCGGATTCTGCAGTATGCGCTGCCTCGCCAGGAGAGTCAGCGGCCCTTCTTCTGGATATTCATGGACAATCTGCTGCTGACTGAGGATGACCAAGAGACAACTACCCGCTTCCTTCAGACAGAGGCTGTGACCCTCCAGGATGTCCGTGGCAGAGACTACCAGAATGCTATGCGGGTGTGGAGCAACATTCCAGGGCTGAAGAGCAAGCATGCGCCCCTGACCCCAAAGGAAGAAGAGTATCTGCAAGCCCAAGTCAGAAGCAGGAGCAAGCTGGACGCCCCGAAAGTTGACCTCCTGGTGAAGAACTGCCTTCTCCCGCTGAGAGAGTACTTCAAGTATTTTTCTCAAAACTCACTTCCTCTT
連接子3A (L3A)			GGCGGTTCCGGCGGAGGA
N端抑制子域	組合1、5、9及13	域_22153	GTTCGTATGCCTGTTACTTTTGAAGATGTTGCTGTTACTTTTACTCAAGAAGAATGGGGGCAATTAGATCCTGCTCAACGTACTTTATATCAAGAAGTTATGTTAGAGACTTGTGGTTTATTAGTTTCTTTAGGTTGTCCTTTACCTAAACCTGAATTATTTTATCCTTTAGATCATTCTCCTGAATTACAAACTTTAAAACGTGGTTTATCTCCTAATTCTTGTCCTGGTGATTCTACTAAA
	組合2、6、10及14	域_7255	ACTCAAGTTCCTGTTACCTTTGAAGATGTTGCTGTTTATTTTTGTGAAGGTGAATGGGAAACTTTAGCTGAATGGCAAAAAGAATTATATCGTGAAACTATGAAAGAGAATTATGAAACTTTAACTTCTTTAGGTTTTTCTTCTAAAAAACCTTCTTTAATTTCTAAAATAGAACGTGAAGAAGATCCTTGTGTGCGTGATAAACAAGATTCTCGTGATCGTCGTCGTTTACGTTCTTGTTGG
	組合3、7、11及15	域_26749	TCTACTCCTGTTACTTTTGAAGATGTTGTTGTTTATTTTACTGCTGCTGAATGGGTTCATTTAACTAATTGGCAACGTGATTTTTATCAAGCTGTTATGATGGAAACTTATGAATTAGTTGCTTCTGTTGCTGGTGATGGTGTTCCTATGGCTGAAGATGAAGAAGGTGGTGTTGAACGTCCTGTTTGGCAATATATTCCTCGTGGTAAACGTCGTCGTAAAACTCCTCAACCTCGTGCTGAT
	組合4、8、12及16	域_10123	GCTTTAGTTACTTTTGAAGATGTTGCTGTTCGTTTTACTCAAGAAGAATGGGCTTTATTAGATCCTTCTCAAAAAATTTTATATCGTGATGTTATGCGTGAGACTTATCGTAATTTAACTTCTGTTGGTATTAATTGGGAATGTTGGGATTTAGAAGCTTGTTTTCGTTCTTTAGGTCGTAATTTACGTGTTCAAGTCGTTAAACGTAAATGTGAATTAACTAATTCTGGTCCTTGTGCTGAA
連接子1 (L1)			GGAGGGCCGAGCTCTGGCGCACCCCCACCAAGTGGAGGGTCTCCTGCCGGGTCCCCAACATCTACTGAAGAAGGCACCAGCGAATCCGCAACGCCCGAGTCAGGCCCTGGTACCTCCACAGAACCATCTGAAGGTAGTGCGCCTGGTTCCCCAGCTGGAAGCCCTACTTCCACCGAAGAAGGCACGTCAACCGAACCAAGTGAAGGATCTGCCCCTGGGACCAGCACTGAACCATCTGAG
dCasX		dCasX491	CAAGAGATCAAGAGAATCAACAAGATCAGAAGGAGACTGGTCAAGGACAGCAACACAAAGAAGGCCGGCAAGACAGGCCCCATGAAAACCCTGCTCGTCAGAGTGATGACCCCTGACCTGAGAGAGCGGCTGGAAAACCTGAGAAAGAAGCCCGAGAACATCCCTCAGCCTATCAGCAACACCAGCAGGGCCAACCTGAACAAGCTGCTGACCGACTACACCGAGATGAAGAAAGCCATCCTGCACGTGTACTGGGAAGAGTTCCAGAAAGACCCCGTGGGCCTGATGAGCAGAGTTGCTCAGCCTGCCAGCAAGAAGATCGACCAGAACAAGCTGAAGCCCGAGATGGACGAGAAGGGCAATCTGACCACAGCCGGCTTTGCCTGCTCTCAGTGTGGCCAGCCTCTGTTCGTGTACAAGCTGGAACAGGTGTCCGAGAAAGGCAAGGCCTACACCAACTACTTCGGCAGATGTAACGTGGCCGAGCACGAGAAGCTGATTCTGCTGGCCCAGCTGAAACCTGAGAAGGACTCTGATGAGGCCGTGACCTACAGCCTGGGCAAGTTTGGACAGAGAGCCCTGGACTTCTACAGCATCCACGTGACCAAAGAAAGCACACACCCCGTGAAGCCCCTGGCTCAGATCGCCGGCAATAGATACGCCTCTGGACCTGTGGGCAAAGCCCTGTCCGATGCCTGCATGGGAACAATCGCCAGCTTCCTGAGCAAGTACCAGGACATCATCATCGAGCACCAGAAGGTGGTCAAGGGCAACCAGAAGAGACTGGAAAGCCTGAGGGAGCTGGCCGGCAAAGAGAACCTGGAATACCCCAGCGTGACCCTGCCTCCTCAGCCTCACACAAAAGAAGGCGTGGACGCCTACAACGAAGTGATCGCCAGAGTGAGAATGTGGGTCAACCTGAACCTGTGGCAGAAGCTGAAACTGTCCAGGGACGACGCCAAGCCTCTGCTGAGACTGAAGGGCTTCCCTAGCTTCCCTCTGGTGGAAAGACAGGCCAATGAAGTGGATTGGTGGGACATGGTCTGCAACGTGAAGAAGCTGATCAACGAGAAGAAAGAGGATGGCAAGGTTTTCTGGCAGAACCTGGCCGGCTACAAGAGACAAGAAGCCCTGAGGCCTTACCTGAGCAGCGAAGAGGACCGGAAGAAGGGCAAGAAGTTCGCCAGATACCAGCTGGGCGACCTGCTGCTGCACCTGGAAAAGAAGCACGGCGAGGACTGGGGCAAAGTGTACGATGAGGCCTGGGAGAGAATCGACAAGAAGGTGGAAGGCCTGAGCAAGCACATTAAGCTGGAAGAGGAAAGAAGGAGCGAGGACGCCCAATCTAAAGCCGCTCTGACCGATTGGCTGAGAGCCAAGGCCAGCTTTGTGATCGAGGGCCTGAAAGAGGCCGACAAGGACGAGTTCTGCAGATGCGAGCTGAAGCTGCAGAAGTGGTACGGCGATCTGAGAGGCAAGCCCTTCGCCATTGAGGCCGAGAACAGCATCCTGGACATCAGCGGCTTCAGCAAGCAGTACAACTGCGCCTTCATTTGGCAGAAAGACGGCGTCAAGAAACTGAACCTGTACCTGATCATCAATTACTTCAAAGGCGGCAAGCTGCGGTTCAAGAAGATCAAACCCGAGGCCTTCGAGGCTAACAGATTCTACACCGTGATCAACAAAAAGTCCGGCGAGATCGTGCCCATGGAAGTGAACTTCAACTTCGACGACCCCAACCTGATTATCCTGCCTCTGGCCTTCGGCAAGAGACAGGGCAGAGAGTTCATCTGGAACGATCTGCTGAGCCTGGAAACCGGCTCTCTGAAGCTGGCCAATGGCAGAGTGATCGAGAAAACCCTGTACAACAGGAGAACCAGACAGGACGAGCCTGCTCTGTTTGTGGCCCTGACCTTCGAGAGAAGAGAGGTGCTGGACAGCAGCAACATCAAGCCCATGAACCTGATCGGCGTGGCCCGGGGCGAGAATATCCCTGCTGTGATCGCCCTGACAGACCCTGAAGGATGCCCACTGAGCAGATTCAAGGACTCCCTGGGCAACCCTACACACATCCTGAGAATCGGCGAGAGCTACAAAGAGAAGCAGAGGACAATCCAGGCCAAGAAAGAGGTGGAACAGAGAAGAGCCGGCGGATACTCTAGGAAGTACGCCAGCAAGGCCAAGAATCTGGCCGACGACATGGTCCGAAACACCGCCAGAGATCTGCTGTACTACGCCGTGACACAGGACGCCATGCTGATCTTCGCGAATCTGAGCAGAGGCTTCGGCCGGCAGGGCAAGAGAACCTTTATGGCCGAGAGGCAGTACACCAGAATGGAAGATTGGCTCACAGCTAAACTGGCCTACGAGGGACTGAGCAAGACCTACCTGTCCAAAACACTGGCCCAGTATACCTCCAAGACCTGCAGCAATTGCGGCTTCACCATCACCAGCGCCGACTACGACAGAGTGCTGGAAAAGCTCAAGAAAACCGCCACCGGCTGGATGACCACCATCAACGGCAAAGAGCTGAAGGTTGAGGGCCAGATCACCTACTACAACAGGTACAAGAGGCAGAACGTCGTGAAGGATCTGAGCGTGGAACTGGACAGACTGAGCGAAGAGAGCGTGAACAACGACATCAGCAGCTGGACAAAGGGCAGATCAGGCGAGGCTCTGAGCCTGCTGAAGAAGAGGTTTAGCCACAGACCTGTGCAAGAGAAGTTCGTGTGCCTGAACTGCGGCTTCGAGACACACGCCGCTGAACAGGCTGCCCTGAACATTGCCAGAAGCTGGCTGTTCCTGAGAAGCCAAGAGTACAAGAAGTACCAGACCAACAAGACCACCGGCAACACCGACAAGAGGGCCTTTGTGGAAACCTGGCAGAGCTTCTACAGAAAAAAGCTGAAAGAAGTCTGGAAGCCCGCCGTG
緩衝序列 + 連接子3B (L3B) + 緩衝序列			CGATCGGGCGGTTCCGGCGGAGGTTCCACTAGT
C端抑制子域	組合1至4	域_7255	ACTCAAGTTCCTGTTACCTTTGAAGATGTTGCTGTTTATTTTTGTGAAGGTGAATGGGAAACTTTAGCTGAATGGCAAAAAGAATTATATCGTGAAACTATGAAAGAGAATTATGAAACTTTAACTTCTTTAGGTTTTTCTTCTAAAAAACCTTCTTTAATTTCTAAAATAGAACGTGAAGAAGATCCTTGTGTGCGTGATAAACAAGATTCTCGTGATCGTCGTCGTTTACGTTCTTGTTGG
	組合5至8	域_22153	GTTCGTATGCCTGTTACTTTTGAAGATGTTGCTGTTACTTTTACTCAAGAAGAATGGGGGCAATTAGATCCTGCTCAACGTACTTTATATCAAGAAGTTATGTTAGAGACTTGTGGTTTATTAGTTTCTTTAGGTTGTCCTTTACCTAAACCTGAATTATTTTATCCTTTAGATCATTCTCCTGAATTACAAACTTTAAAACGTGGTTTATCTCCTAATTCTTGTCCTGGTGATTCTACTAAA
	組合9至12	域_10123	GCTTTAGTTACTTTTGAAGATGTTGCTGTTCGTTTTACTCAAGAAGAATGGGCTTTATTAGATCCTTCTCAAAAAATTTTATATCGTGATGTTATGCGTGAGACTTATCGTAATTTAACTTCTGTTGGTATTAATTGGGAATGTTGGGATTTAGAAGCTTGTTTTCGTTCTTTAGGTCGTAATTTACGTGTTCAAGTCGTTAAACGTAAATGTGAATTAACTAATTCTGGTCCTTGTGCTGAA
	組合13至16	域_26749	TCTACTCCTGTTACTTTTGAAGATGTTGTTGTTTATTTTACTGCTGCTGAATGGGTTCATTTAACTAATTGGCAACGTGATTTTTATCAAGCTGTTATGATGGAAACTTATGAATTAGTTGCTTCTGTTGCTGGTGATGGTGTTCCTATGGCTGAAGATGAAGAAGGTGGTGTTGAACGTCCTGTTTGGCAATATATTCCTCGTGGTAAACGTCGTCGTAAAACTCCTCAACCTCGTGCTGAT
連接子4v1 (L4v1)			GGAAGTGGGAGC
NLS			CCCAAGAAAAAGAGAAAAGTG

*各組分以在構築體內之5'至3'次序列出 表47 ： 此實例中評定之 16 種 LTRP6 變異體的全長蛋白質序列

組分	域組合#	域	AA 序列
起始密碼子+ NLS + 緩衝序列			MAPKKKRKVSR
起始密碼子+ DNMT3A ADD域			MERLVYEVRQKCRNIEDICISCGSLNVTLEHPLFIGGMCQNCKNCFLECAYQYDDDGYQSYCTICCGGREVLMCGNNNCCRCFCVECVDLLVGPGAAQAAIKEDPWNCYMCGHKGTYGLLRRREDWPSRLQMFFAN
DNMT3A催化域			NHDQEFDPPKVYPPVPAEKRKPIRVLSLFDGIATGLLVLKDLGIQVDRYIASEVCEDSITVGMVRHQGKIMYVGDVRSVTQKHIQEWGPFDLVIGGSPCNDLSIVNPARKGLYEGTGRLFFEFYRLLHDARPKEGDDRPFFWLFENVVAMGVSDKRDISRFLESNPVMIDAKEVSAAHRARYFWGNLPGMNRPLASTVNDKLELQECLEHGRIAKFSKVRTITTRSNSIKQGKDQHFPVFMNEKEDILWCTEMERVFGFPVHYTDVSNMSRLARQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYFACV
連接子2 (L2)			SSGNSNANSRGPSFSSGLVPLSLRGSH
DNMT3L相互作用域			MGPMEIYKTVSAWKRQPVRVLSLFRNIDKVLKSLGFLESGSGSGGGTLKYVEDVTNVVRRDVEKWGPFDLVYGSTQPLGSSCDRCPGWYMFQFHRILQYALPRQESQRPFFWIFMDNLLLTEDDQETTTRFLQTEAVTLQDVRGRDYQNAMRVWSNIPGLKSKHAPLTPKEEEYLQAQVRSRSKLDAPKVDLLVKNCLLPLREYFKYFSQNSLPL
連接子3A (L3A)			GGSGGG
N端抑制子域	組合1、5、9及13	域_22153	VRMPVTFEDVAVTFTQEEWGQLDPAQRTLYQEVMLETCGLLVSLGCPLPKPELFYPLDHSPELQTLKRGLSPNSCPGDSTK
	組合2、6、10及14	域_7255	TQVPVTFEDVAVYFCEGEWETLAEWQKELYRETMKENYETLTSLGFSSKKPSLISKIEREEDPCVRDKQDSRDRRRLRSCW
	組合3、7、11及15	域_26749	STPVTFEDVVVYFTAAEWVHLTNWQRDFYQAVMMETYELVASVAGDGVPMAEDEEGGVERPVWQYIPRGKRRRKTPQPRAD
	組合4、8、12及16	域_10123	ALVTFEDVAVRFTQEEWALLDPSQKILYRDVMRETYRNLTSVGINWECWDLEACFRSLGRNLRVQVVKRKCELTNSGPCAE
連接子1 (L1)			GGPSSGAPPPSGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTEEGTSTEPSEGSAPGTSTEPSE
dCasX		dCasX491	QEIKRINKIRRRLVKDSNTKKAGKTGPMKTLLVRVMTPDLRERLENLRKKPENIPQPISNTSRANLNKLLTDYTEMKKAILHVYWEEFQKDPVGLMSRVAQPASKKIDQNKLKPEMDEKGNLTTAGFACSQCGQPLFVYKLEQVSEKGKAYTNYFGRCNVAEHEKLILLAQLKPEKDSDEAVTYSLGKFGQRALDFYSIHVTKESTHPVKPLAQIAGNRYASGPVGKALSDACMGTIASFLSKYQDIIIEHQKVVKGNQKRLESLRELAGKENLEYPSVTLPPQPHTKEGVDAYNEVIARVRMWVNLNLWQKLKLSRDDAKPLLRLKGFPSFPLVERQANEVDWWDMVCNVKKLINEKKEDGKVFWQNLAGYKRQEALRPYLSSEEDRKKGKKFARYQLGDLLLHLEKKHGEDWGKVYDEAWERIDKKVEGLSKHIKLEEERRSEDAQSKAALTDWLRAKASFVIEGLKEADKDEFCRCELKLQKWYGDLRGKPFAIEAENSILDISGFSKQYNCAFIWQKDGVKKLNLYLIINYFKGGKLRFKKIKPEAFEANRFYTVINKKSGEIVPMEVNFNFDDPNLIILPLAFGKRQGREFIWNDLLSLETGSLKLANGRVIEKTLYNRRTRQDEPALFVALTFERREVLDSSNIKPMNLIGVARGENIPAVIALTDPEGCPLSRFKDSLGNPTHILRIGESYKEKQRTIQAKKEVEQRRAGGYSRKYASKAKNLADDMVRNTARDLLYYAVTQDAMLIFANLSRGFGRQGKRTFMAERQYTRMEDWLTAKLAYEGLSKTYLSKTLAQYTSKTCSNCGFTITSADYDRVLEKLKKTATGWMTTINGKELKVEGQITYYNRYKRQNVVKDLSVELDRLSEESVNNDISSWTKGRSGEALSLLKKRFSHRPVQEKFVCLNCGFETHAAEQAALNIARSWLFLRSQEYKKYQTNKTTGNTDKRAFVETWQSFYRKKLKEVWKPAV
緩衝序列 + 連接子3B (L3B) + 緩衝序列			RSGGSGGGSTS
C端抑制子域	組合1至4	域_7255	TQVPVTFEDVAVYFCEGEWETLAEWQKELYRETMKENYETLTSLGFSSKKPSLISKIEREEDPCVRDKQDSRDRRRLRSCW
	組合5至8	域_22153	VRMPVTFEDVAVTFTQEEWGQLDPAQRTLYQEVMLETCGLLVSLGCPLPKPELFYPLDHSPELQTLKRGLSPNSCPGDSTK
	組合9至12	域_10123	ALVTFEDVAVRFTQEEWALLDPSQKILYRDVMRETYRNLTSVGINWECWDLEACFRSLGRNLRVQVVKRKCELTNSGPCAE
	組合13至16	域_26749	STPVTFEDVVVYFTAAEWVHLTNWQRDFYQAVMMETYELVASVAGDGVPMAEDEEGGVERPVWQYIPRGKRRRKTPQPRAD
連接子4v1 (L4v1)			GSGS
NLS			PKKKRKV

按照與實例11中所描述類似之方法進行HEK293T細胞之轉染。簡言之，用編碼LTRP6變異體(列於表46中)及具有靶向 B2M之間隔子之gRNA的質體暫態轉染HEK293T細胞。轉染後24小時，用嘌呤黴素選擇細胞五天。在轉染後8、12、20、27、44、59、74及104天，收集細胞以測定B2M抑制水平。LTRP5-ZIM3分子及LTRP5-ADD-ZIM3分子充當實驗對照。另外，比較，此實驗中亦包括使用ZIM3域作為第一及第二抑制子域之LTRP6變異體(亦稱為具有雙重ZIM3之LTRP6)以進行比較。

亦進行亞硫酸氫鹽定序以評定在 VEGFA基因座處之脫靶甲基化，此係如實例5中所描述進行。簡言之，在轉染後五天，收集用具有 B2M靶向gRNA或非靶向gRNA的LTRP6變異體質體暫態轉染HEK293T細胞以提取gDNA用於亞硫酸氫鹽定序。亦包括以下對照：1)與B2M間隔子7.37 (GGCCGAGAUGUCUCGCUCCG; SEQ ID NO: 3137)配對之CasX 491；2)具有其對應的 B2M間隔子之dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L；3)具有非靶向或 B2M間隔子7.165之LTRP1 (描述於圖28)；4)具有 B2M間隔子7.165之LTRP5-ZIM5；及5)具有非靶向或 B2M間隔子7.165之LTRP5-ADD-ZIM3。 結果：

評定使用增強型抑制子域作為第一抑制子域及第二抑制子域以及其在LTRP6分子內之相對定位的影響。評估對目標 B2M基因座之長期抑制之影響的時程實驗的結果描繪於表48至表55中。總體而言，資料表明，將第二抑制子域併入LTRP5-ADD分子之C端(產生LTRP6組態)實質上改良持久B2M抑制，再現實例11中觀測到的發現。至少到轉染後59天，當與由LTRP5-ADD-ZIM3構築體實現之B2M抑制水平相比較時，將ZIM3域添加至LTRP5-ADD-ZIM3之C端產生LTRP6-雙重-ZIM3，使長期抑制增強，但此長期抑制之改良未持續到第104天(表48至表55)。藉由使用第二ZIM3域觀測到的增強之抑制進一步支持，所觀測到的LTRP6組態之活性改良係由於C端連接至dCasX之第二抑制子域的存在所致。與LTRP6-雙重-ZIM3相比較，大多數帶有兩個增強型抑制子域的其他LTRP6構築體進一步改良抑制活性，甚至持續至轉染後104天。值得注意的是，含有域_26749 (在N端及/或C端處)之LTRP6分子在誘導持久B2M抑制(＞90%)直至第104天方面表現最佳的分子，其中LTRP6-雙重-26749 (組態6a)展示最高的抑制水平且LTRP6-10123-26749 (組態6b)展現第二高的抑制活性(表48至表55)。值得關注的是，在一些情況下，與定位於C端上相比較，抑制子域定位於dCasX之N端上亦影響分子之活性。舉例而言，域_7255定位於dCasX之N端上與域_22153定位於C端上的組合引起約58%抑制；然而，當域_22153位於N端上且域_7255位於C端上時，抑制水平增加至91% (表48至表55)。 表 48 ： 在轉染後 8 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	8.437	2.483	3
LTRP5-ZIM3	7.165	61.133	2.003	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	74.967	1.443	3
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	89.833	0.416	3
LTRP6-22153-7255	7.165	92.200	0.361	3
LTRP6-雙重-7255	7.165	91.267	0.321	3
LTRP6-26749-7255	7.165	92.567	0.208	3
LTRP6-10123-7255	7.165	92.100	0.529	3
LTRP6-雙重-22153	7.165	88.700	0.600	3
LTRP6-7255-22153	7.165	91.500	0.100	3
LTRP6-26749-22153	7.165	93.033	0.737	3
LTRP6-10123-22153	7.165	91.967	0.702	3
LTRP6-22153-10123	7.165	91.767	1.405	3
LTRP6-7255-10123	7.165	90.800	2.128	3
LTRP6-26749-10123	7.165	94.000	1.082	3
LTRP6-雙重-10123	7.165	93.100	1.136	3
LTRP6-22153-26749	7.165	92.167	1.474	3
LTRP6-7255-26749	7.165	91.567	1.365	3
LTRP6-雙重-26749	7.165	92.100	1.044	3
LTRP6-10123-26749	7.165	92.367	0.802	3

表 49 ： 在轉染後 12 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	1.970	0.442	3
LTRP5-ZIM3	7.165	50.433	1.250	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	75.300	1.997	3
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	90.067	0.404	3
LTRP6-22153-7255	7.165	93.567	0.493	3
LTRP6-雙重-7255	7.165	90.400	0.173	3
LTRP6-26749-7255	7.165	94.367	0.306	3
LTRP6-10123-7255	7.165	93.300	0.608	3
LTRP6-雙重-22153	7.165	89.067	0.924	3
LTRP6-7255-22153	7.165	90.733	0.058	3
LTRP6-26749-22153	7.165	95.267	0.709	3
LTRP6-10123-22153	7.165	94.500	0.608	3
LTRP6-22153-10123	7.165	93.400	0.100	3
LTRP6-7255-10123	7.165	89.667	1.210	3
LTRP6-26749-10123	7.165	95.700	0.200	3
LTRP6-雙重-10123	7.165	94.033	0.289	3
LTRP6-22153-26749	7.165	95.067	0.651	3
LTRP6-7255-26749	7.165	95.300	0.866	3
LTRP6-雙重-26749	7.165	95.567	0.404	3
LTRP6-10123-26749	7.165	95.400	0.608	3

表 50 ： 在轉染後 20 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	6.060	3.841	3
LTRP5-ZIM3	7.165	45.233	3.958	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	71.700	2.107	3
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	89.767	1.124	3
LTRP6-22153-7255	7.165	92.433	0.987	3
LTRP6-雙重-7255	7.165	89.233	1.528	3
LTRP6-26749-7255	7.165	93.200	0.400	3
LTRP6-10123-7255	7.165	92.133	0.929	3
LTRP6-雙重-22153	7.165	87.700	0.872	3
LTRP6-7255-22153	7.165	88.633	0.814	3
LTRP6-26749-22153	7.165	94.767	0.850	3
LTRP6-10123-22153	7.165	93.400	0.794	3
LTRP6-22153-10123	7.165	91.967	1.274	3
LTRP6-7255-10123	7.165	87.233	1.960	3
LTRP6-26749-10123	7.165	94.767	0.208	3
LTRP6-雙重-10123	7.165	92.367	0.404	3
LTRP6-22153-26749	7.165	94.400	1.015	3
LTRP6-7255-26749	7.165	93.667	1.069	3
LTRP6-雙重-26749	7.165	95.367	0.681	3
LTRP6-10123-26749	7.165	94.867	0.907	3

表 51 ： 在轉染後 27 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	2.600	1.006	3
LTRP5-ZIM3	7.165	36.733	2.608	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	69.100	1.900	3
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	87.200	1.300	3
LTRP6-22153-7255	7.165	91.300	1.179	3
LTRP6-雙重-7255	7.165	87.233	1.250	3
LTRP6-26749-7255	7.165	92.367	0.551	3
LTRP6-10123-7255	7.165	90.733	1.518	3
LTRP6-雙重-22153	7.165	85.567	1.007	3
LTRP6-7255-22153	7.165	86.433	1.290	3
LTRP6-26749-22153	7.165	94.067	0.681	3
LTRP6-10123-22153	7.165	92.467	1.002	3
LTRP6-22153-10123	7.165	90.900	1.646	3
LTRP6-7255-10123	7.165	85.200	1.411	3
LTRP6-26749-10123	7.165	93.567	0.643	3
LTRP6-雙重-10123	7.165	91.033	0.058	3
LTRP6-22153-26749	7.165	93.900	0.693	3
LTRP6-7255-26749	7.165	92.933	1.474	3
LTRP6-雙重-26749	7.165	95.300	0.557	3
LTRP6-10123-26749	7.165	94.133	1.528	3

表 52 ： 在轉染後 44 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	1.307	0.070	3
LTRP5-ZIM3	7.165	26.533	3.232	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	63.700	1.345	3
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	82.600	1.929	3
LTRP6-22153-7255	7.165	88.933	4.110	3
LTRP6-雙重-7255	7.165	83.233	2.610	3
LTRP6-26749-7255	7.165	88.833	1.604	3
LTRP6-10123-7255	7.165	86.567	1.909	3
LTRP6-雙重-22153	7.165	79.867	0.153	3
LTRP6-7255-22153	7.165	80.033	3.807	3
LTRP6-26749-22153	7.165	91.933	2.159	3
LTRP6-10123-22153	7.165	89.567	0.929	3
LTRP6-22153-10123	7.165	86.900	3.119	3
LTRP6-7255-10123	7.165	77.433	2.031	3
LTRP6-26749-10123	7.165	91.133	0.611	3
LTRP6-雙重-10123	7.165	87.033	0.231	3
LTRP6-22153-26749	7.165	93.000	2.100	3
LTRP6-7255-26749	7.165	89.367	3.758	3
LTRP6-雙重-26749	7.165	96.167	0.737	3
LTRP6-10123-26749	7.165	94.050	0.919	2

表 53 ： 在轉染後 59 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	0.947	0.012	3
LTRP5-ZIM3	7.165	19.667	2.627	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	60.533	1.801	3
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	76.567	4.274	3
LTRP6-22153-7255	7.165	87.933	6.385	3
LTRP6-雙重-7255	7.165	84.100	2.211	3
LTRP6-26749-7255	7.165	85.733	1.704	3
LTRP6-10123-7255	7.165	83.267	3.868	3
LTRP6-雙重-22153	7.165	74.500	0.608	3
LTRP6-7255-22153	7.165	74.133	5.463	3
LTRP6-26749-22153	7.165	89.833	3.691	3
LTRP6-10123-22153	7.165	89.200	1.825	3
LTRP6-22153-10123	7.165	84.733	3.581	3
LTRP6-7255-10123	7.165	71.667	5.980	3
LTRP6-26749-10123	7.165	90.567	0.808	3
LTRP6-雙重-10123	7.165	83.167	1.026	3
LTRP6-22153-26749	7.165	93.467	2.301	3
LTRP6-7255-26749	7.165	86.900	6.077	3
LTRP6-雙重-26749	7.165	96.833	0.874	3
LTRP6-10123-26749	7.165	93.450	1.202	2

表 54 ： 在轉染後 74 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	2.407	1.086	3
LTRP5-ZIM3	7.165	21.033	9.890	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	61.167	5.807	3
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	68.133	7.305	3
LTRP6-22153-7255	7.165	90.033	6.144	3
LTRP6-雙重-7255	7.165	87.833	2.219	3
LTRP6-26749-7255	7.165	84.700	1.539	3
LTRP6-10123-7255	7.165	83.833	3.859	3
LTRP6-雙重-22153	7.165	73.000	0.721	3
LTRP6-7255-22153	7.165	71.267	7.343	3
LTRP6-26749-22153	7.165	92.533	3.062	3
LTRP6-10123-22153	7.165	92.133	2.542	3
LTRP6-22153-10123	7.165	87.533	1.069	3
LTRP6-7255-10123	7.165	69.533	5.265	3
LTRP6-26749-10123	7.165	92.667	0.833	3
LTRP6-雙重-10123	7.165	80.133	2.458	3
LTRP6-22153-26749	7.165	92.433	2.804	3
LTRP6-7255-26749	7.165	87.800	8.143	3
LTRP6-雙重-26749	7.165	97.133	0.643	3
LTRP6-10123-26749	7.165	94.067	1.686	3

表 55 ： 在轉染後 104 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導之 B2M 抑制的水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域

抑制子構築體	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	0.610	0.314	3
LTRP5-ZIM3	7.165	14.270	12.499	3
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	57.533	7.419	3
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	43.467	9.843	3
LTRP6-22153-7255	7.165	90.900	1.929	3
LTRP6-雙重-7255	7.165	93.367	0.603	3
LTRP6-26749-7255	7.165	84.000	1.044	3
LTRP6-10123-7255	7.165	77.700	16.664	3
LTRP6-雙重-22153	7.165	69.567	6.336	3
LTRP6-7255-22153	7.165	57.567	12.667	3
LTRP6-26749-22153	7.165	87.867	4.277	3
LTRP6-10123-22153	7.165	88.600	7.134	3
LTRP6-22153-10123	7.165	84.600	0.624	3
LTRP6-7255-10123	7.165	78.033	4.922	3
LTRP6-26749-10123	7.165	94.400	1.375	3
LTRP6-雙重-10123	7.165	79.100	5.216	3
LTRP6-22153-26749	7.165	92.067	5.595	3
LTRP6-7255-26749	7.165	90.067	6.274	3
LTRP6-雙重-26749	7.165	98.267	0.929	3
LTRP6-10123-26749	7.165	94.633	1.779	3

在轉染後5天，進行亞硫酸氫鹽定序以評估由16個LTRP6分子介導的 VEGFA基因座處脫靶CpG甲基化之程度，且結果顯示於表56中。資料表明，大多數LTRP6構築體展示相對較低的脫靶甲基化水平，尤其當與利用編碼dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L、LTRP1及LTRP5-ZIM3對照之構築體實現的水平相比較時。實際上，在任一個或兩個位置處含有域_26749(組態6a或6b)之LTRP6構築體展現出與LTRP5-ADD-ZIM3及LTRP6-雙-ZIM3分子類似的脫靶甲基化(表56)。LTRP6-雙26749及LTRP6-10123-26749分別展現最高及第二高的抑制活性(表48至表55)，其分別誘導約5.15%及約3.84%之脫靶甲基化水平。 表 56 ： 在轉染後第 5 天定量的由具有各種抑制子域之 LTRP6 構築體介導的 VEGFA 基因座處脫靶 CpG 甲基化之水平。所顯示的各 LTRP6 構築體之域 ID 的次序指定 分別在 N 端 及 C 端 位置處之第一抑制子域及第二抑制子域。亦包括編碼 CasX 、 dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L 、 LTRP1 、 LTRP5-ZIM3 及 LTRP5-ADD-ZIM3 之 構築體作為對照

抑制子構築體	間隔子	平均CpG 甲基化%	標準誤差
CasX 491	7.37	0.851	0.160
dCas9-ZNF10-DNMT3A/3L	7.148	34.220	2.356
LTRP1	NT	16.900	1.346
LTRP1	7.165	30.880	1.829
LTRP5-ADD-ZIM3	NT	6.887	0.403
LTRP5-ZIM5	7.165	14.690	1.338
LTRP5-ADD-ZIM3	7.165	4.841	0.508
LTRP6-雙重-ZIM3	7.165	5.782	0.565
LTRP6-7255-22153	7.165	3.988	0.479
LTRP6-雙重-7255	7.165	11.330	0.993
LTRP6-7255-26749	7.165	5.719	0.737
LTRP6-7255-10123	7.165	5.796	0.635
LTRP6-22153-26749	7.165	4.789	0.492
LTRP6-22153-10123	7.165	1.244	0.422
LTRP6-10123-22153	7.165	6.607	0.757
LTRP6-10123-7255	7.165	16.530	1.417
LTRP6-10123-26749	7.165	4.810	0.523
LTRP6-雙重-10123	7.165	5.729	0.699
LTRP6-26749-22153	7.165	5.401	0.565
LTRP6-26749-7255	7.165	4.608	0.582
LTRP6-雙重-22153	7.165	3.522	0.537
LTRP6-22153-7255	7.165	4.388	0.669
LTRP6-雙重-26749	7.165	5.153	0.457
LTRP6-26749-10123	7.165	3.836	0.482

實驗結果表明，將第二抑制子域併入LTRP分子中產生LTRP6組態將改良持久抑制，且藉由相對於dCasX在N端及C端位置處使用增強型抑制子域進一步增強此改良。另外，資料表明，使用一些但非所有新抑制子域可誘導目標基因座的非常持久之抑制，且其在LTRP分子內之相對定位亦可影響活性。此等實驗之發現亦顯示，將第二抑制子域併入LTRP-ADD分子中將維持分子特異性，同時改良活性。 實例 13 ： 最佳化連接子序列以增加總體 LTRP 活性

進行實驗以展示藉由使以下兩個位置處之連接子序列最佳化可增加LTRP5構築體之抑制活性：1) DNMT3L相互作用域與抑制子域之間；及2)抑制子域與催化失效CasX之間。此等連接子位置分別對應於圖55關於LTRP5組態之示意圖中的「L3A」及「L1」。此處，進行實驗以篩選及鑑別會改良LTRP活性的新連接子組合。 材料及方法：

產生在DNMT3L相互作用域與抑制子域之間及抑制子域與呈LTRP5組態定向的催化失效CasX之間帶有限制酶位點的入門載體(entry vector) (圖55)。此外，52個連接子之清單係藉由編譯來自多個研究之連接子序列產生。合成連接子庫作為寡核苷酸池，隨後擴增且經由Golden Gate組裝方案將其隨機地選殖至入門載體中，產生涵蓋約2700個可能連接子集合的LTRP5變異體質體庫。隨機選擇含有該等連接子集合之約90個LTRP5變異體質體並進行陣列式篩選，由此將各LTRP5變異體質體與編碼gRNA之質體共轉染至96孔盤中所接種之HEK293T細胞中，該gRNA使用支架316及靶向間隔子(有關間隔子序列，參見表58)。轉染之後，用嘌呤黴素及潮黴素選擇細胞三天，且接著收集細胞，經由目標細胞表面標記物之免疫染色，隨後使用Attune ^TMNxT流式細胞儀進行流動式細胞測量術來評估目標基因座處之抑制。對於含有連接子集合1至28之變異體質體(有關連接子組合之序列，參見表57)，評估三個不同目標基因座( B2M、目標1及目標2)之LTRP抑制活性。對於連接子集合1至11，在轉染後8天、15天及45天量測抑制。對於連接子集合12至28，在轉染後7天及17天量測抑制。對於含有連接子集合31至89以及連接子集合1、10及25 (表57)之質體，在轉染後6天、13天及24天評估 B2M基因座之LTRP抑制活性。使用編碼LTRP5分子(不含ADD域)及原始連接子集合(對於L1為SEQ ID NO:123；對於L3A為SEQ ID NO:124)之質體作為實驗對照。亦包括非靶向間隔子作為陰性對照。 表 57 ： 在此實例中評估之約 90 種連接子集合之 AA 序列

連接子集合ID	集合內第一連接子之AA 序列( 位置L3A)	集合內第二連接子之AA 序列( 位置L1)	SEQ ID NO. ( 位置L3A)	SEQ ID NO. ( 位置L1)
集合1	ASAAAPAAASAAASAPSAAAA	ASAAAPAAA	3281	3286
集合36	PPTPSPSPVPSTPPTNSSSTPPTPS	GSGNSSGSGGS	3280	3285
集合43	GSGGSGGSGGSPVPSTPPTPSPSTPPTP	AFPAAPAPA	3279	3284
集合66	AASPAAPSAPPAAASP	PPTP	3282	3287
集合85	ASPAAPAPASPAAPAPSAPAA	IRAHGD	3278	3283
集合2	LQPVPPQALKREQVSQQ	HIGGINS	22745	22748
集合3	GGGSGGGS	GGGSGGGS	22746	22746
集合4	AASPAAPSAPPAAASP	SPAGSPTSTEEGTSESAT	3282	22773
集合5	PGTSTEPSEGSAPGSP	PPTP	22747	3287
集合6	HIGGINS	GGGS	22748	22763
集合7	AASPAAPSAPPAAASP	PPTPSPSPVP	3282	22768
集合8	ASPAAPSP	ILGELT	22749	22774
集合9	GSGNSSGSGG	HIGGINS	22750	22748
集合10	PPTPSPSPVPSTPPTNSSSTPPTPS	SGSETPGTSESATPES	3280	22754
集合11	HIGGINS	PPTPSPSPVP	22748	22768
集合12	EAAKEAAK	PPTP	22751	3287
集合13	PPTP	SWRVRYMVA	3287	22775
集合14	LRTRYEADLA	GSGNSSGSGGS	22752	3285
集合15	EAAKEAAKEAAKEAAK	PPTP	22753	3287
集合17	SGSETPGTSESATPES	GGGSGGGS	22754	22746
集合19	GSGNSSGSGGS	STEEGTSTEPSEGSAP	3285	22756
集合20	PPTPSPSPVSSTPPTPPTPS	EAAKEAAK	22755	22751
集合21	STEEGTSTEPSEGSAP	PPTPSPSPVP	22756	22768
集合23	GGGSGGGS	YGAHLM	22746	22776
集合24	STEEGTSTEPSEGSAP	GSGNSSGSGGSGGSGNSSGSGGS	22756	22777
集合25	PPTPSPSPVPSTPPTPPTPS	GGGSGGGSGGGS	22757	22762
集合26	GGGSGGGSGGGSEAAKEAAKEAAK	VQQKYKVSDTAATVTG	22758	22765
集合27	ASAAAPAAA	GSGNSSGSGGSGGSGNSSGSGGS	3286	22777
集合28	PPTP	GGGSGGGS	3287	22746
集合31	SGSETPGTSESATPES	STEEGTSTEPSEGSAP	22754	22756
集合32	GSGGSGGSGGSPVPSTPPTPSPSTPPTP	SPAGSPTSTEEGTSESAT	3279	22773
集合33	PPTP	GGGS	3287	22763
集合34	ASPAAPAPA	GGGS	22759	22763
集合37	GGGSGGGS	GGGS	22746	22763
集合38	GGGSGGGS	SGSETPGTSESATPES	22746	22754
集合39	GGGSGGGSEAAKEAAK	STEEGTSTEPSEGSAP	22760	22756
集合40	PPTPSPSPVPSTPPTPPTPS	GGGSGGGSGGGS	22757	22762
集合41	GGGSGGGSGGGSGGGS	SPAGSPTSTEEGTSESAT	22761	22773
集合42	GSGNSSGSGGS	AYVVSADEREGG	3285	22778
集合44	SGSETPGTSESATPES	GSGNSSGSGGS	22754	3285
集合45	GGGSGGGSGGGS	PGTSTEPSEGSAPGSP	22762	22747
集合46	GGGSGGGSGGGSGGGS	EAAKEAAK	22761	22751
集合47	GSGNSSGSGGS	PPTPSPSPVPSTPPTPPTPS	3285	22757
集合48	GGGSGGGSEAAKEAAK	EAAKEAAKGGGSGGGS	22760	22771
集合49	GGGS	GGGSGGGS	22763	22746
集合50	EAAK	GSGGSGGSGGSPVPSTPPTPSPSTPPTP	22764	3279
集合51	EAAKEAAK	EAAKEAAK	22751	22751
集合52	SGSETPGTSESATPES	PPTP	22754	3287
集合53	GGGSGGGS	PPTP	22746	3287
集合55	GGGSGGGSGGGS	MIGP	22762	22779
集合56	VQQKYKVSDTAATVTG	SGSETPGTSESATPES	22765	22754
集合57	GGGSGGGSGGVS	GSGGSGGSGGSPVPSTPPTPSPSTPPTP	22766	3279
集合58	EAAKEAAKEAAKEAAK	STEEGTSTEPSEGSAP	22753	22756
集合59	GGGSGGGS	EAAKEAVKGGGSGGGS	22746	22780
集合60	GGGSGGGSGGGSGGGS	PPTP	22761	3287
集合61	EAAK	EAAKEAAKGGGSGGGS	22764	22771
集合62	GGGS	PPTPSPSPVP	22763	22768
集合63	EAAKEAVKEAAKEAAK	HIGGINS	22767	22748
集合64	PPTPSPSPVPSTPPTPPTPS	GGGSGGGS	22757	22746
集合65	PPTPSPSPVP	PPTP	22768	3287
集合67	STEEGTSTEPSEGSAP	PPTP	22756	3287
集合68	GGGSGGGSGGGS	PPTPSPSPVPSTPPTNSSSTPPTPS	22762	3280
集合69	PPTPSPSPVP	PGTSTEPSEGSAPGSP	22768	22747
集合70	ASPAAPAPA	LMPYEL	22759	22781
集合71	PPTPSPSPVP	PPTP	22768	3287
集合72	GGGSGGGSGGGS	ASAAAPAAA	22762	3286
集合73	GGGSGGGS	STEEGTSTEPSEGSAP	22746	22756
集合74	PPTPSPSPVP	HIGGINS	22768	22748
集合75	EAAKEAAK	HIGGINS	22751	22748
集合76	PPTPSPSPVPSTPPTPPTPS	SPTP	22757	22782
集合77	EAAKEAAKEAAKEAAK	GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS	22753	22742
集合78	EAAKEAAK	PPTPSPSPVPSTPPTPPTPS	22751	22757
集合79	PPTPSPSPVP	GGGSGGGSGGGSGGGS	22768	22761
集合80	ITHKASSRMTFA	GGGSGGGSGGGS	22769	22762
集合81	STEEGTSTEPSEGSAP	GCGS	22756	22783
集合82	ASSAAPAPA	GGGS	22770	22763
集合83	STEEGTSTEPSEGSAP	GGGSGGGS	22756	22746
集合84	SGSETPGTSESATPES	GGGSGGGSGGGSGGGSGGGS	22754	22742
集合86	EAAKEAAKGGGSGGGS	EAAKEAAKGGGSGGGS	22771	22771
集合87	EAAKEAAKEAAKEAAK	NKQNIWQA	22753	22784
集合88	GGGSGGGSGGGS	ASAAAPAAA	22762	3286
集合89	AASPAAPSAPPASASP	PPMPSPSPVP	22772	22785

表 58 ： 靶向 B2M 基因座之間隔子的序列

間隔子ID	目標	靶向間隔子序列(RNA)	SEQ ID NO
7.165	B2M	UCCCUAUGUCCUUGCUGUUU	3114

結果：

進行陣列式篩選以評估用具有不同連接子組合之LTRP5變異體質體轉染之HEK293T細胞中內源性目標基因座處之抑制活性水平。在轉染後8天、15天及45天量測含有連接子集合1至11之LTRP5質體在 B2M、目標1及目標2基因座處之抑制，且結果繪示於圖56至圖58中。資料表明，表現最佳之連接子組合因特定目標而變化。在此實驗中所分析之11種連接子組合中，使用連接子集合1及10始終整體誘導 B2M及目標2基因座兩者處之最高抑制水準，其中連接子集合10展現目標1基因座處所測試之第二高連接子集合。隨後，在分析連接子集合12至28及連接子集合31至89的後續兩個實驗中使用連接子1作為基準。

在轉染後7天及17天量測含有連接子集合12至28之LTRP5質體在 B2M、目標1及目標2基因座處之抑制，其中來自前一實驗之連接子集合1作為基準，且結果描繪於圖59至圖60中。資料顯示，與在前一實驗中觀測到的類似，表現最佳的連接子集合因目標而變化。在此第二實驗中分析之17種連接子組合中，使用連接子集合1及25在三個目標基因座中之兩個(對於集合1為 B2M及目標1；對於集合25為 B2M及目標2)中引起最高水平之抑制。

在轉染後6天、13天及24天量測含有連接子集合31至89之LTRP5質體在 B2M基因座處之抑制，其中來自前兩個實驗之連接子集合1、10及25作為基準，且結果描繪於表59至表61中。資料顯示，在轉染後24天，當與 B2M間隔子配對時，使用連接子集合85、43、36、10、64、1、40、25、66、76及52引起抑制活性相對於LTRP5對照之活性水平增加至少50% (表59至表61)。接著，基於具有不同於其他最佳候選組合及連接子之原始連接子集合的序列(對於L1為SEQ ID NO:123；對於L3A為SEQ ID NO:124)，選擇此等11個表現最佳之連接子集合中之五個用於將來的驗證。 表 59 ： 在轉染後 6 天 定量的由具有連接子集合 1 、 10 、 25 及 31-39 之 LTRP5 構築體介導的 B2M 抑制水平

構築體	連接子集合	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5	原始/基線	NT	4.607	0.289	3
LTRP5	集合54	7.165	31.000	2.955	3
LTRP5	集合69	7.165	33.400	1.015	3
LTRP5	集合42	7.165	35.167	1.258	3
LTRP5	集合89	7.165	34.733	0.603	3
LTRP5	原始/基線	7.165	38.667	0.379	3
LTRP5	集合61	7.165	48.300	1.931	3
LTRP5	集合59	7.165	49.467	0.709	3
LTRP5	集合80	7.165	48.633	0.643	3
LTRP5	集合33	7.165	53.800	1.200	3
LTRP5	集合37	7.165	55.167	0.416	3
LTRP5	集合51	7.165	51.900	0.819	3
LTRP5	集合49	7.165	52.267	0.723	3
LTRP5	集合48	7.165	50.500	1.082	3
LTRP5	集合62	7.165	53.367	0.493	3
LTRP5	集合41	7.165	53.067	0.473	3
LTRP5	集合50	7.165	53.400	0.458	3
LTRP5	集合38	7.165	53.833	0.231	3
LTRP5	集合78	7.165	52.633	0.379	3
LTRP5	集合86	7.165	53.833	1.484	3
LTRP5	集合53	7.165	55.167	0.764	3
LTRP5	集合87	7.165	55.533	0.833	3
LTRP5	集合46	7.165	53.033	0.153	3
LTRP5	集合55	7.165	50.633	1.650	3
LTRP5	集合34	7.165	57.800	0.794	3
LTRP5	集合75	7.165	53.400	0.794	3
LTRP5	集合39	7.165	55.467	1.002	3
LTRP5	集合56	7.165	54.000	1.114	3
LTRP5	集合60	7.165	57.933	1.328	3
LTRP5	集合82	7.165	57.500	0.889	3
LTRP5	集合73	7.165	53.433	0.907	3
LTRP5	集合83	7.165	59.333	1.069	3
LTRP5	集合63	7.165	55.400	0.872	3
LTRP5	集合88	7.165	58.567	1.436	3
LTRP5	集合68	7.165	55.633	0.231	3
LTRP5	集合58	7.165	54.433	0.723	3
LTRP5	集合79	7.165	56.700	0.520	3
LTRP5	集合70	7.165	55.467	1.350	3
LTRP5	集合32	7.165	58.467	0.723	3
LTRP5	集合77	7.165	56.133	0.651	3
LTRP5	集合81	7.165	60.400	0.500	3
LTRP5	集合57	7.165	57.800	1.153	3
LTRP5	集合44	7.165	57.933	1.617	3
LTRP5	集合47	7.165	55.400	0.173	3
LTRP5	集合31	7.165	59.767	0.751	3
LTRP5	集合74	7.165	58.067	0.569	3
LTRP5	集合65	7.165	60.300	0.954	3
LTRP5	集合84	7.165	59.333	0.902	3
LTRP5	集合67	7.165	60.767	1.779	3
LTRP5	集合72	7.165	57.433	0.723	3
LTRP5	集合71	7.165	59.467	0.379	3
LTRP5	集合52	7.165	61.533	0.153	3
LTRP5	集合76	7.165	62.900	0.400	3
LTRP5	集合66	7.165	61.933	0.379	3
LTRP5	集合25	7.165	61.033	0.416	3
LTRP5	集合40	7.165	62.800	0.889	3
LTRP5	集合1	7.165	58.133	0.058	3
LTRP5	集合64	7.165	57.400	1.229	3
LTRP5	集合10	7.165	59.967	1.222	3
LTRP5	集合36	7.165	65.333	0.902	3
LTRP5	集合43	7.165	64.800	1.253	3
LTRP5	集合85	7.165	64.333	1.274	3

表 60 ： 在轉染後 13 天 定量的由具有連接子集合 1 、 10 、 25 及 31 至 39 之 LTRP5 構築體介導的 B2M 抑制水平

構築體	連接子集合	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5	原始/基線	NT	1.877	0.315	3
LTRP5	集合54	7.165	2.670	0.866	3
LTRP5	集合69	7.165	1.200	0.190	3
LTRP5	集合42	7.165	24.000	0.794	3
LTRP5	集合89	7.165	25.500	0.755	3
LTRP5	原始/基線	7.165	30.800	0.917	3
LTRP5	集合61	7.165	31.600	0.700	3
LTRP5	集合59	7.165	32.267	0.473	3
LTRP5	集合80	7.165	32.767	0.231	3
LTRP5	集合33	7.165	36.833	1.137	3
LTRP5	集合37	7.165	35.900	1.179	3
LTRP5	集合51	7.165	34.767	0.723	3
LTRP5	集合49	7.165	36.167	0.929	3
LTRP5	集合48	7.165	36.267	1.274	3
LTRP5	集合62	7.165	34.433	0.551	3
LTRP5	集合41	7.165	35.067	1.484	3
LTRP5	集合50	7.165	38.067	0.874	3
LTRP5	集合38	7.165	36.567	0.351	3
LTRP5	集合78	7.165	35.000	0.700	3
LTRP5	集合86	7.165	34.933	1.747	3
LTRP5	集合53	7.165	35.833	1.234	3
LTRP5	集合87	7.165	35.800	1.015	3
LTRP5	集合46	7.165	36.200	0.361	3
LTRP5	集合55	7.165	36.033	1.950	3
LTRP5	集合34	7.165	40.733	1.168	3
LTRP5	集合75	7.165	36.033	1.604	3
LTRP5	集合39	7.165	38.867	1.266	3
LTRP5	集合56	7.165	37.467	0.764	3
LTRP5	集合60	7.165	40.467	1.750	3
LTRP5	集合82	7.165	38.567	1.069	3
LTRP5	集合73	7.165	35.433	1.845	3
LTRP5	集合83	7.165	39.100	0.889	3
LTRP5	集合63	7.165	37.433	1.002	3
LTRP5	集合88	7.165	39.033	1.930	3
LTRP5	集合68	7.165	37.833	0.493	3
LTRP5	集合58	7.165	38.700	0.866	3
LTRP5	集合79	7.165	39.367	0.153	3
LTRP5	集合70	7.165	37.467	1.701	3
LTRP5	集合32	7.165	42.833	0.289	3
LTRP5	集合77	7.165	38.767	0.907	3
LTRP5	集合81	7.165	39.300	1.039	3
LTRP5	集合57	7.165	41.233	1.779	3
LTRP5	集合44	7.165	40.667	0.814	3
LTRP5	集合47	7.165	39.667	0.850	3
LTRP5	集合31	7.165	43.433	1.650	3
LTRP5	集合74	7.165	40.467	0.802	3
LTRP5	集合65	7.165	42.000	0.608	3
LTRP5	集合84	7.165	41.700	0.200	3
LTRP5	集合67	7.165	41.600	1.277	3
LTRP5	集合72	7.165	39.400	0.781	3
LTRP5	集合71	7.165	42.533	0.153	3
LTRP5	集合52	7.165	44.333	0.635	3
LTRP5	集合76	7.165	45.033	1.721	3
LTRP5	集合66	7.165	43.233	0.833	3
LTRP5	集合25	7.165	49.233	0.231	3
LTRP5	集合40	7.165	47.767	1.002	3
LTRP5	集合1	7.165	48.100	0.917	3
LTRP5	集合64	7.165	44.133	1.097	3
LTRP5	集合10	7.165	48.733	1.069	3
LTRP5	集合36	7.165	48.833	1.358	3
LTRP5	集合43	7.165	49.267	1.222	3
LTRP5	集合85	7.165	46.933	2.312	3

表 61 ： 在轉染後 24 天 定量的由具有連接子集合 1 、 10 、 25 及 31 至 39 之 LTRP5 構築體介導的 B2M 抑制水平

構築體	連接子集合	間隔子	平均HLA 陰性細胞%	標準偏差	樣本大小
LTRP5	原始/基線	NT	1.290	0.098	3
LTRP5	集合54	7.165	3.670	1.105	3
LTRP5	集合69	7.165	4.270	0.282	3
LTRP5	集合42	7.165	22.600	1.153	3
LTRP5	集合89	7.165	24.500	0.781	3
LTRP5	原始/基線	7.165	25.067	0.907	3
LTRP5	集合61	7.165	27.100	0.781	3
LTRP5	集合59	7.165	27.167	0.351	3
LTRP5	集合80	7.165	28.367	1.185	3
LTRP5	集合33	7.165	28.367	0.208	3
LTRP5	集合37	7.165	28.833	0.751	3
LTRP5	集合51	7.165	28.933	0.551	3
LTRP5	集合49	7.165	28.967	1.950	3
LTRP5	集合48	7.165	29.467	0.757	3
LTRP5	集合62	7.165	29.633	0.551	3
LTRP5	集合41	7.165	29.767	1.457	3
LTRP5	集合50	7.165	30.000	0.436	3
LTRP5	集合38	7.165	30.167	1.050	3
LTRP5	集合78	7.165	30.200	1.480	3
LTRP5	集合86	7.165	30.367	1.041	3
LTRP5	集合53	7.165	30.567	2.055	3
LTRP5	集合87	7.165	30.733	1.258	3
LTRP5	集合46	7.165	31.033	0.723	3
LTRP5	集合55	7.165	31.167	2.413	3
LTRP5	集合34	7.165	31.833	0.802	3
LTRP5	集合75	7.165	31.867	2.892	3
LTRP5	集合39	7.165	31.867	0.874	3
LTRP5	集合56	7.165	32.267	0.681	3
LTRP5	集合60	7.165	32.733	1.206	3
LTRP5	集合82	7.165	32.967	1.274	3
LTRP5	集合73	7.165	33.133	0.351	3
LTRP5	集合83	7.165	33.333	0.569	3
LTRP5	集合63	7.165	33.400	2.551	3
LTRP5	集合88	7.165	33.500	1.803	3
LTRP5	集合68	7.165	33.533	0.666	3
LTRP5	集合58	7.165	33.633	1.266	3
LTRP5	集合79	7.165	34.000	0.100	3
LTRP5	集合70	7.165	34.167	2.836	3
LTRP5	集合32	7.165	34.167	1.193	3
LTRP5	集合77	7.165	34.467	0.814	3
LTRP5	集合81	7.165	34.733	0.404	3
LTRP5	集合57	7.165	34.833	2.250	3
LTRP5	集合44	7.165	34.933	1.012	3
LTRP5	集合47	7.165	35.167	0.802	3
LTRP5	集合31	7.165	35.433	2.060	3
LTRP5	集合74	7.165	35.833	0.651	3
LTRP5	集合65	7.165	36.467	0.681	3
LTRP5	集合84	7.165	37.167	1.069	3
LTRP5	集合67	7.165	37.300	1.311	3
LTRP5	集合72	7.165	37.667	0.850	3
LTRP5	集合71	7.165	37.733	0.681	3
LTRP5	集合52	7.165	38.767	0.929	3
LTRP5	集合76	7.165	39.167	1.858	3
LTRP5	集合66	7.165	39.367	0.503	3
LTRP5	集合25	7.165	40.400	1.808	3
LTRP5	集合40	7.165	40.633	1.629	3
LTRP5	集合1	7.165	41.000	1.127	3
LTRP5	集合64	7.165	41.367	1.877	3
LTRP5	集合10	7.165	42.167	2.113	3
LTRP5	集合36	7.165	42.333	1.250	3
LTRP5	集合43	7.165	42.433	0.666	3
LTRP5	集合85	7.165	42.500	2.272	3

實驗顯示，藉由改變定位於LTRP分子之關鍵域之間的連接子序列可進一步增強LTRP分子之抑制活性。此處，將兩個位置處，亦即DNMT3L相互作用域與抑制子域之間及抑制子域與催化失效CasX之間的連接子序列最佳化會引起LTRP分子之抑制活性的實質性改良。 實例 14 ：在小鼠模型中評估 LTRP 中 ADD 域的使用

進行實驗以評定當在小鼠模型中活體內遞送時用CasX:gRNA系統處理後甲基化之持久性。評估在ADD域存在及不存在下LTRP1取向分子之甲基化持久性、mPCSK9轉錄物減弱及mPCSK9蛋白產生。 材料及方法： LNP製備：

使用基於ALC-0315之脂質混合物，使用定製的T型混合器微型混合裝置，以20 mL/min之流動速率及3:1的水相與有機相混合比，將LTRP mRNA及gRNA囊封至LNP中。組成如下：50:10:38.5:1.5 mol%的可離子化脂質:DSPC:膽固醇:DMG-PEG2000。簡言之，為調配LNP，將相等質量比之LTRP mRNA及gRNA稀釋於25 mM乙酸鈉(pH 4.0)中。在無水乙醇中製備10 mM濃度之脂質混合物。使用預定N/P比產生mRNA/gRNA共同調配物。使用注射泵輸注器，使RNA及脂質以預定流動速率比穿過定製的T型混合器裝置。調配後，將LNP滲析至PBS (pH 7.4)中，以降低乙醇濃度且提高pH，由此提高粒子之穩定性。藉由在4℃下使用10k Slide-A-Lyzer™滲析卡匣(Thermo Scientific™)或12-14 kDa滲析管(Repligen)隔夜滲析至PBS (pH 7.4)中來達成mRNA/gRNA-LNP之緩衝液交換。滲析之後，將mRNA/gRNA-LNP使用30-100 kDa Amicon®-Ultra離心過濾器(Millipore)濃縮至＞0.2 mg/mL，隨後使用Acrodisc PES膜過濾器進行滅菌過濾。於Malvern Zetasizer上分析所調配LNP以測定其直徑及多分散性指數(PDI)。藉由RiboGreen™分析，使用Invitrogen之Quant-iT™ RiboGreen™ RNA分析套組測定囊封效率及RNA濃度。在各個實驗中使用上述LNP以遞送LTRP mRNA及gRNA，從而在活體內遞送至目標組織。 活體內遞送囊封CasX mRNA及靶向gRNA之LNP：

為了評定在活體內使用LTRP1A及LTRP1B之作用，使用1:1的mRNA:gRNA質量比，將LTRP mRNA (參見表62)及使用支架316 v1與間隔子27.94的靶向 mPCSK9之gRNA (SEQ ID: 3330，表63)囊封於同一LNP內。將所調配LNP經緩衝液交換為PBS以用於活體內注射。簡言之，透過尾靜脈將3.0 mg/kg之LNP靜脈內投與4週齡之C57BL/6小鼠。在注射之後觀測小鼠五分鐘以確保其自麻醉恢復，隨後置放於飼養籠中。注射媒劑(PBS)之動物充當陰性實驗對照且注射編碼LTRP1及以上靶向mPCSK9之引導物的mRNA:gRNA之小鼠充當陽性對照。經由空腹抽血獲取基線。再每三週一次抽取血液。投與後七天、十四天及四十二天，對各條件下之3隻小鼠實施安樂死，收集血液及肝組織。收集血清進行mPCSK9 ELISA，將肝臟組織均質化，以按照製造商說明書，使用Zymo Research Quick DNA/RNA Miniprep套組進行mRNA提取及gDNA提取。 酶法甲基化定序(EM-seq)：

為了測定 PCSK9基因座處之中靶甲基化水平，按照製造商說明書，使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus套組自所收集之組織提取gDNA。接著，按照製造商之方案，使用酶法甲基序列轉化模組(NEB)將任何未甲基化之胞嘧啶轉化成尿嘧啶，對所提取之gDNA進行酶法甲基化轉化。隨後，使用次世代定序(NGS)對所得到的經處理DNA進行定序，以測定中靶甲基化之水平。

NGS處理及分析：

利用一組對EM轉化之所關注目標位置(小鼠 PCSK9基因座)具有特異性之引子，經由PCR自50 ng經EM處理之DNA擴增目標擴增子。此等基因特異性引子在5′末端含有額外序列以引入Illumina ^TM銜接子。利用Cytiva Sera-Mag Select DNA淨化套組來純化經擴增DNA產物。使用Fragment Analyzer DNA分析套組(Agilent，dsDNA 35至1500 bp)評定擴增子之品質及定量。根據製造商說明書，在Illumina ^TMMiseq ^TM上對擴增子進行定序。使用Bismark亞硫酸氫鹽讀段定位程式及甲基化調用程式處理定序之原始fastq檔案。對經EM處理之DNA進行PCR擴增會將所有尿嘧啶核苷酸轉化成胸腺嘧啶，且對PCR產物定序將決定胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶之速率，其係呈各LTRP分子介導的PCSK9基因座處中靶甲基化之水平的讀數形式。 關於mPCSK9 mRNA減弱之qPCR分析：

在屍體剖檢之後，將肝塊快速冷凍。接著，將此等肝塊浸入過量體積的zymo DNA/RNA Shield試劑中且使用研磨珠套管(bullet blender儀器，其中在管中具有陶瓷珠或鋼珠)進行均質化。均質化之後，用蛋白酶k處理溶胞物。根據製造商說明書，使用zymo quick RNA miniprep 套組(目錄號r1055)提取經蛋白酶k處理之肝溶胞物中的mRNA，且按照製造商說明書，使用taqman基因表現分析，利用mPCSK9及真核18s探針進行分析。 ELISA方法：

按照製造商說明書，使用legend max小鼠PCSK9 ELISA套組(biolegend目錄號443207)分析來自動物樣本之血清。 結果：

為了評定當在小鼠模型中活體內遞送時用CasX:gRNA系統處理後甲基化之持久性，將編碼LTRP1 (SEQ ID NO. 3333)、LTRP1A (SEQ ID NO: 6528)或LTRP1B (SEQ ID NO: 9741)之mRNA及gRNA 316v1.27.94 (SEQ ID NO: 3330)囊封於LNP中且注射至C57BL/6小鼠中。所得PCSK9 mRNA減弱之定量示於表64中。資料表明，在7天及14天時，全部三個LTRP1取向分子具有類似的減弱水平，其中LTRP1及LTRP1A在第42天顯示較高的抑制水平。來自EM-seq的甲基化資料(圖62)顯示測試的全部三個LTRP1取向分子之高甲基化水平支持此結果，其中用LTRP1及LTRP1B處理之小鼠的總甲基化百分比在第14天及第42天略有降低。

PCSK9分泌定量顯示測試的全部LTRP分子在第7天(第1週，表65)具有類似的PCSK9抑制水平。與LTRP1相比較，LTRP1A在測試第6週顯示抑制持久性增加，而LTRP1B在第8週顯示抑制持久性增加。

此等實驗證實，在ADD域存在及不存在下LTRP1取向分子以mRNA形式經由LNP遞送且能夠在活體內誘導有效緘默化。 表 62 ： 此實例中測試之 LTRP 構築體的 mRNA 序列

LTRP	SEQ ID NO.	組分
LTRP1	3333	LTRP1 ZIM3、80 聚腺苷酸、SV40、C端2xFLAG
LTRP1A	6528	LTRP1 ZIM3、分裂聚腺苷酸、SV40
LTRP1B	9741	LTRP1 ZIM3、ADD、分裂聚腺苷酸、SV40

表 63 ： 此實例中所用之 gRNA 及靶向序列

gRNA ID	SEQ ID NO.
27.94	3071
316v1.27.94	3330

表 64 ： 肝溶胞物 mRNA qPCR

	給藥後天數
LTRP	7 天	14 天	42 天
平均值	std	平均值	std	平均值	std
媒劑(N=3)	7.14	49.81	5.24	42.63	1.00	17.10
LTRP1 (N=3)	-96.55	1.77	-96.96	1.21	-93.65	2.60
LTRP1A (N=3)	-99.04	0.66	-99.76	0.09	-93.19	4.73
LTRP1B (N=3)	-96.13	1.47	-92.39	5.65	-80.55	5.79

表 65 ： 藉由 ELISA 測定的 分泌 PCSK9 之 變化

相對於基線 標準化的藉由血清ELISA 測定之PCSK9 分泌百分比
研究 週	媒劑	LTRP1	LTRP1A	LTRP1B
平均值	SEM	平均值	SEM	平均值	SEM	平均值	SEM
1	23.80	45.23	-94.45	0.45	-93.50	0.91	-94.30	0.60
2	-15.06	14.48	-92.20	1.96	-85.10	7.07	-93.69	0.44
5	4.98	10.38	-90.18	2.78	-95.80	0.78	-93.37	0.42
6	-11.92	27.13	-92.65	1.72	-95.81	0.79	-90.36	2.14
8	17.84	9.53	-80.96	6.72	NA	NA	-90.58	1.20

將分析的低於LOQ之值設定為LOQ (6.25 ng/mL)，不收集LTRP1A第8週資料。 實例 15 ： 具有 RD1 域之 LTRP 的 功效及持久性

進行實驗以評定在活體內用含有RD1域之LTRP1取向分子處理後小鼠模型中甲基化之持久性。 材料及方法：

LNP係如實例14中所述製備。

活體內實驗檢查含有眼鏡王蛇(King Cobra) RD1域(SEQ ID NO. 3339)之LTRP1取向分子的功效。藉由用LTRP1A及LTRP 1B中之ZIM3域取代RD1域來構建LTRP1A-眼鏡蛇及LTRP1B-眼鏡蛇(SEQ ID NO. 6530、SEQ ID NO. 9743)。將經調配的含有LTRP mRNA (表66)及靶向mPCSK9之gRNA (SEQ ID: 3330，表66)的LNP經緩衝液交換為PBS以進行活體內注射。簡言之，透過尾靜脈將LNP經靜脈內投與4週齡之C57BL/6小鼠。在注射之後觀測小鼠五分鐘以確保其自麻醉恢復，隨後置放於飼養籠中。注射媒劑(PBS)之動物充當陰性實驗對照且注射mRNA:gRNA之小鼠充當陽性對照，該mRNA:gRNA編碼LTRP1A (SEQ ID: 6528)以及使用支架316及間隔子27.94 (SEQ ID: 3330)的靶向 mPCSK9之gRNA。經由空腹抽血獲取基線。再每三週一次抽取血液。投與後七天及四十二天，對小鼠實施安樂死，收集血液及肝臟組織。收集血清進行mPCSK9 ELISA，將肝臟組織均質化，以按照製造商說明書，使用Zymo Research Quick DNA/RNA Miniprep套組進行mRNA提取及gDNA提取。 酶法甲基化定序(EM-seq)：

為了測定 PCSK9基因座處之中靶甲基化水平，按照製造商說明書，使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus套組自所收集之組織提取gDNA。接著，按照製造商之方案，使用酶法甲基序列轉化模組(NEB)將任何未甲基化之胞嘧啶轉化成尿嘧啶，對所提取之gDNA進行酶法甲基化轉化。隨後，使用次世代定序(NGS)對所得到的經處理DNA進行定序，以測定中靶甲基化之水平。 NGS處理及分析：

利用一組對EM轉化之所關注目標位置(小鼠 PCSK9基因座)具有特異性之引子，經由PCR自50 ng經EM處理之DNA擴增目標擴增子。此等基因特異性引子在5′末端含有額外序列以引入Illumina ^TM銜接子。利用Cytiva Sera-Mag Select DNA淨化套組來純化經擴增DNA產物。使用Fragment Analyzer DNA分析套組(Agilent，dsDNA 35至1500 bp)評定擴增子之品質及定量。根據製造商說明書，在Illumina ^TMMiseq ^TM上對擴增子進行定序。使用Bismark亞硫酸氫鹽讀段定位程式及甲基化調用程式處理定序之原始fastq檔案。對經EM處理之DNA進行PCR擴增會將所有尿嘧啶核苷酸轉化成胸腺嘧啶，且對PCR產物定序將決定胞嘧啶轉化為胸腺嘧啶之速率，其係呈各LTRP分子介導的PCSK9基因座處中靶甲基化之水平的讀數形式。 關於mPCSK9 mRNA減弱之qPCR分析：

在屍體剖檢之後，將肝塊快速冷凍。接著，將此等肝塊浸入過量體積的Zymo DNA/RNA Shield試劑中且使用研磨珠套管(Bullet Blender儀器，其中在管中具有陶瓷珠或鋼珠)進行均質化。均質化之後，用蛋白酶K處理溶胞物。根據製造商說明書，使用Zymo Quick RNA Miniprep套組(目錄號R1055)提取經蛋白酶K處理之肝溶胞物中的mRNA，且按照製造商說明書，使用TaqMan基因表現分析，利用mPCSK9及真核18S探針進行分析。 ELISA方法：

按照製造商說明書，使用LEGEND MAX小鼠PCSK9 ELISA套組(BioLegend目錄號443207)分析來自動物樣本之血清。 結果：

藉由擴增子酶法甲基化定序(EM-seq)自處理後第7天處死的N=3隻小鼠的均質化之肝提取之gDNA量測的轉錄起始位點(TSS)近端DNA甲基化水平展現所有構築體均具有類似的甲基化水平，其中在較高劑量下往往具有較高中值甲基化(圖63)。

表67定量血清PCSK9 ELISA結果，其表明所有LTRP1構築體均顯示類似的初始作用，且給予0.75 mpk或1.5 mpk之群組在給藥後42天血清PCSK9減弱約90%。

表68定量mPCSK9 mRNA qPCR分析結果，其表明全部3種LTRP1構築體在兩種劑量下維持超過80%減弱之穩健轉錄物減少。LTRP1A、LTRP1A-眼鏡蛇及LTRP1B-眼鏡蛇在mRNA轉錄物水平上呈現強效及持久作用，直至給藥後42天。在42天時，LTRP1A及LTRP1A-眼鏡蛇在較低劑量(0.75 mg/kg)下顯示mPCSK9表現略有上升，但尚不清楚此是否代表一個傾向。

此等實驗展示LTRP1取向分子可產生持久甲基化，導致小鼠模型中具有RD1域之PCSK9表現減少。 表 66 ： 所評定之 mRNA 及 gRNA 之序列

mRNA	SEQ ID NO.	gRNA	劑量 mg/kg
LTRP1A	6528	316v1 27.94 (SEQ ID NO. 3330)	1.5
0.75
LTRP1A-眼鏡蛇	6530	1.5
0.75
LTRP1B-眼鏡蛇	9743	1.5
0.75
PBS (陰性對照)	NA	NA	NA

表 67 ： 在第 7 天、第 14 天 、第 35 天 及第 42 天進行的 血清 PCSK9 ELISA*

血清PCSK9 相對於 基線之變化%
	媒劑(PBS)	媒劑(PBS)
天	平均值	SEM	n	平均值	SEM	n
0	0	0	9	N/A	N/A	N/A
7	50.87	79.48	3	N/A	N/A	N/A
14	89.78	86.04	6	N/A	N/A	N/A
35	-19.45	80.54	6	N/A	N/A	N/A
42	111.26	6.19	2	N/A	N/A	N/A
	LTRP1A- 眼鏡蛇(0.75 mpk)	LTRP1A- 眼鏡蛇(1.5 mpk)
天	平均值	SEM	n	平均值	SEM	n
0	0	0	9	0	0	9
7	-90.42	3.47	3	-87.40	2.37	3
14	-87.51	9.17	6	-87.03	5.74	6
35	-83.73	12.37	6	-87.03	5.74	6
42	-91.31	2.87	2	-93.43	1.15	2
	LTRP1B- 眼鏡蛇(0.75 mpk)	LTRP1B- 眼鏡蛇(1.5 mpk)
天	平均值	SEM	n	平均值	SEM	n
0	0	0	9	0	0	9
7	-90.22	4.27	3	-87.99	4.45	3
14	-88.43	6.86	6	-91.63	2.61	6
35	-89.11	3.79	6	-91.63	2.61	6
42	-88.33	1.86	2	-90.18	2.72	2
	LTRP1A (0.75 mpk)	LTRP1A (1.5 mpk)
天	平均值	SEM	n	平均值	SEM	n
0	0	0	9	0	0	9
7	-91.57	1.12	3	-87.94	2.11	3
14	-88.21	4.21	6	-90.87	2.15	6
35	-86.95	4.41	6	-90.87	2.15	6
42	-70.89	21.14	2	-89.01	1.36	2

* 第7天的資料僅來自在該時間點取樣之動物。第7天及第35天的資料來自一直存活到第42天的不同個體。第42天的資料僅來自在該時間點取樣之動物。 表 68 ： 經由 qPCR 測定的 在第 7 天及第 42 天的 mPCSK9 mRNA 抑制百分比

mPCSK9 轉錄物/18S 抑制百分比
	媒劑	媒劑
天	平均值	SEM	n	平均值	SEM	n
0	0	0	3	N/A	N/A	N/A
7	19.65	49.23	3	N/A	N/A	N/A
42	9.38	44.25	2	N/A	N/A	N/A
	LTRP1A- 眼鏡蛇(0.75 mpk)	LTRP1A- 眼鏡蛇(1.5 mpk)
天	平均值	SEM	n	平均值	SEM	n
0	0	0	3	0	0	3
7	-92.90	1.48	3	-96.68	2.01	3
42	-79.37	0.57	2	-87.63	6.35	2
	LTRP1B- 眼鏡蛇(0.75 mpk)	LTRP1B- 眼鏡蛇(1.5 mpk)
天	平均值	SEM	n	平均值	SEM	n
0	0	0	3	0	0	3
7	-91.54	4.95	3	-98.15	0.55	3
42	-90.86	0.57	2	-96.02	1.31	2
	LTRP1A (0.75 mpk)	LTRP1A (1.5 mpk)
天	平均值	SEM	n	平均值	SEM	n
0	0	0	3	0	0	3
7	-92.79	1.21	3	-95.36	1.81	3
42	-84.55	5.15	2	-91.95	4.47	2

實例 16 ： 靶向人類 PCSK9 基因座之 CasX:gRNA 系統之功能評定

進行實驗以證實遞送囊封LTRP6 mRNA及 PCSK9靶向gRNA的LNP誘導初代人類肝細胞(PHH)中內源性人類PCSK9基因座處之抑制且因此誘導分泌之PCSK9及PCSK9 mRNA減少。選擇四個LTRP分子(表69)及引導支架316v1 (EQ ID NO: 2968)於此實例中之評定。 材料及方法：

初代人類肝細胞中的PCSK9減弱為前四個編輯靶向序列(表69)脂質體轉染至PHH細胞中以評定PCSK9分泌及mRNA減少提供實驗基礎。由兩批PHH細胞產生劑量反應曲線，其中每種條件以一式三份孔執行三輪。使用2400奈克/孔最高測試劑量的總囊封RNA，以經由RNA-seq量測經處理細胞與初始細胞之間的mRNA表現變化。 gRNA之合成：

靶向人類 PCSK9基因座之gRNA係以化學方式合成為經化學修飾之v1型式以便遞送。靶向 PCSK9之序列列於表69中。

藉由IVT產生LTRP mRNA。簡言之，將編碼5'UTR區、密碼子最佳化之LTRP及3'UTR區之構築體選殖至含有T7啟動子及聚腺苷酸尾之質體中。將所得質體線性化，隨後用於IVT反應，該等反應係使用CleanCap® AG及N1-甲基-假尿苷進行。 脂質奈米粒子(LNP)之調配：

使用內部訂製的T型混合器，以N/P 6將LTRP mRNA及靶向gRNA囊封於由可離子化脂質混合物製成之LNP中，該可離子化脂質混合物含有ALC0315可離子化脂質:18:0 PC DSPC):膽固醇:DMG-PEG2000。簡言之，為了調配LNP，在25 mM pH 4.0之乙酸鈉緩衝液中，對於共調配將分裂調配物(含有mRNA或僅含sgRNA)以固定比率稀釋，或對於分裂調配物分別稀釋。ALC315可離子化脂質使用無水乙醇以50:10:38.5:1.5%的莫耳比混合上述脂質。使RNA及脂質相以3:1之流動速率比及20 ml/min之流動速率穿過訂製的T型混合器。調配之後，將LNP轉移且使用10 KDa膜滲析盒(Thermo Scientific ^TM)進行滲析，並經緩衝液交換至1×PBS中以降低乙醇濃度且將pH增加至7.4，從而形成成熟且穩定的粒子。滲析後，將RNA-LNP經緩衝液交換至含300 mM蔗糖之PBS (pH 7.4)儲存緩衝液中並使用100 kDa Amicon®-Ultra離心過濾器(Millipore)濃縮至適當濃度，且無菌過濾。接著，使調配的LNP在-80℃下經歷一次冷凍-解凍循環，且在Stunner (Unchained Labs)上進行分析以測定其平均粒徑(d. nm.)及多分散性指數(PDI)。藉由RiboGreen™分析，使用Invitrogen之Quant-iT™ RiboGreen™ RNA分析套組測定囊封效率及RNA濃度。在本文所描述之各個實驗中，藉由混合1:1質量比之含有mRNA之LNP及含有gRNA之LNP，使用LNP將mRNA及gRNA遞送至目標細胞及組織。 將囊封CasX mRNA及靶向gRNA之LNP遞送至初代人類肝細胞中：

將兩批(批號271及批號31)初代人類肝細胞(Lonza Biologics)以65K個細胞/孔之密度鋪塗。二十四小時後，對於各條件，在一式三份孔中在指定劑量下，用指定總經囊封RNA劑量之單一調配物ALC-0315 LNP (1:1比率，與人類血清一起預培育隔夜)壓印各盤。各mRNA:gRNA對之測試劑量(表70)為每孔2400、800、270、90、30、10、0.1及0.01 ng總經囊封RNA。

將細胞維持在Geltrex-夾心培養物中，且藉由HTRF ELISA，利用CISBio 人類PCSK9 HTRF ELISA套組(Revvity)分析在處理後第5天收集之培養基上清液中的PCSK9分泌。重複細胞培養實驗3輪。

對於第1輪及第2輪，將細胞立即在100 μL DNA RNA shield ^TM中溶解且在第5天收集培養基之後儲存於-80℃。

各盤上包括初始的具有靶向序列6.1的CasX 515及具有靶向序列27.94的LTRP5作為對照處理，以評定整個實驗中量測的穩定性。 關 於 PCSK9mRNA減弱之qPCR分析：

對提取之mRNA進行處理並藉由RT-qPCR分析。使用單步RT-qPCR方法量測PCSK9 mRNA表現。使用50 μL溶胞物，以使用Zymo 96 RNA提取套組提取總RNA。接著，使總RNA反轉錄成cDNA，且使用TaqMan探針，藉由定量PCR相對於GAPDH內源性對照定量PCSK9轉錄物。藉由與非靶向序列處理之樣本相比較來計算mRNA之百分比變化。 ELISA：

按照製造商說明書，使用BioLegend® ELISA MAX ^TM套組分析培養基上清液中分泌的PCSK9水平。 RNA seq：

按照製造商說明書，使用Illumina之NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep套組(NEB #E7760)分析mRNA水平。使用雙端短讀RNA定序分析所有盤孔中用指定mRNA-gRNA對處理之最高劑量樣本(N=2至6個孔/條件)及初始孔(N=4)中的RNA。使用DEseq2，由讀段計數計算基因表現相對於初始細胞之變化。所用截止值係|log2(倍數變化)|＞1且本傑明及霍赫貝格調整之p值(Benjamini and Hochberg-adjusted p value；padj)＜0.05。 結果：

評定包含支架316及靶向 PCSK9之序列之mRNA:gRNA對減少PCSK9分泌及減少PCSK9 mRNA的能力。下表71至表74提供利用每一個別mRNA：sgRNA對在初代人類肝細胞中之半數最大抑制濃度(IC ₅₀)、90%最大抑制(IC ₉₀)及最大反應(Emax)，四捨五入至最接近的百分之一。表71及表72分別以ng經囊封RNA/孔及pM經囊封RNA為單位提供血清ELISA劑量反應測試中PCSK9分泌減少的結果。表73及表74分別以ng經囊封RNA/孔及pM經囊封RNA為單位提供qPCR劑量反應測試中PCSK9 mRNA減少的結果。

LTRP5及LTRP6-大鼠-眼鏡蛇係在減少分泌蛋白方面最強效的分子，其分泌之PCSK9蛋白減少類似於陽性對照編輯物CasX 515及SpyCas9，6.154為最強效的LTRP間隔子(表71及表72)。

LTRP5及LTRP6-大鼠-眼鏡蛇係在減小PCSK9 mRNA水平方面最強效的分子，其減小類似於陽性對照編輯劑CasX 515及SpyCas9，6.154為最強效的LTRP間隔子(表73及表74)。

藉由mRNA表現變化所量測，LTRP構築體LTRP6-大鼠-眼鏡蛇、LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3及LTRP6-2×眼鏡蛇與gRNA 316.6.154 (V1)配對顯示出最高特異性(表75)。經padj截止值＜0.05量測，LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3及LTRP6-2×眼鏡蛇無顯著脫靶效應。

此等實驗結果表明，遞送囊封LTRP mRNA及 PCSK9靶向gRNA的LNP將誘導初代人類肝細胞中內源性人類 PCSK9基因座處之抑制，由此引起分泌之PCSK9及mRNA水平實質上降低。 表 69 ： mRNA 及 gRNA 之 序列

mRNA	SEQ ID NO.	gRNA	目標	SEQ ID NO.
LTRP5	22829	316.6.1 (V1)	PCSK9	22789
LTRP6-2x眼鏡蛇	22830	316.6.154 (V1)	PCSK9	22790
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	22831	316.6.157 (V1)	PCSK9	22788
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	22832	316.6.141 (V1)	PCSK9	22835
CasX 515	22833	316.27.94 (V1)	NT	3330
SpyCas9	22834	Spy.50.1 (vInt)	PCSK9	22791

表 70 ： 測試之 mRNA:gRNA 對

構築體	gRNA
CasX 515	316.6.1 (V1)
LTRP5	316.6.141 (V1)
LTRP5	316.6.154 (V1)
LTRP5	316.6.157 (V1)
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)
LTRP5	316.27.94 (V1)
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.141 (V1)
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.157 (V1)
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.141 (V1)
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.157 (V1)
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.141 (V1)
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.157 (V1)
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)

表 71 ： 藉由總運載物質量測定的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導的 PCSK9 分泌蛋白抑制水平

	PHH 批次271
IC50 (ng/ 孔)	IC90* (ng/ 孔)	Emax* (Δ%)
mRNA	gRNA	平均值	SEM	平均值	SEM	平均值	SEM
CasX 515	316.6.1 (V1)	27.7	5	190.1	84.2	-94.6	4
LTRP5	316.6.154 (V1)	40	4	119.9	27.1	-98.8	3.1
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	39.5	3.8	226.6	50.9	-99.1	2.8
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	42.6	4.6	114.5	26.5	-97.8	3.6
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	57.4	5.4	217.5	43.6	-98.9	2.7
LTRP5	316.6.141 (V1)	79.9	6.3	289.7	52.8	-97.2	2.5
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	81.8	9.2	286.6	74.6	-96.3	3.8
LTRP5	316.6.157 (V1)	96	10	491.6	122.3	-100.8	4
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	115.8	21.4	494.7	215.8	-99.5	7
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	131.5	14.8	552.5	146.2	-100.8	4.4
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	133.3	22.8	624	252.8	-98.3	5.9
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	177.6	38	1216.6	635	-99	8.6
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	173.3	37.7	1054.8	558.8	-91.5	8.5
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.141 (V1)	247	56.6	933.6	530.2	-92.7	9.4
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.157 (V1)	253.4	66.9	1195.8	780.8	-69.2	8.4
mRNA	gRNA	PHH 批次31
CasX 515	316.6.1 (V1)	23.2	5.4	180	107.8	-93.2	5.2
LTRP5	316.6.154 (V1)	13.7	1.9	73.4	25.5	-97.4	3.4
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	24.8	5.1	244.2	134.2	-100.1	5.7
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	29.1	2.3	80.1	15.6	-97.2	2.7
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	24.4	4.1	153.9	63.4	-100.7	4.6
LTRP5	316.6.141 (V1)	49.6	7.2	364.6	126.9	-100.6	4.1
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	72	16.6	327.5	171.8	-100.5	8
LTRP5	316.6.157 (V1)	58	8.1	222.9	66.9	-96.2	4.9
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	98.6	12.7	310	98	-98.8	5.8
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	89.4	9.3	284.2	71.6	-98.5	4.2
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	88.8	18.6	406.6	199.3	-96.2	7.1
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	101.3	18.1	634	271.4	-98.5	7
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	181.6	36.2	718.8	335.1	-92.5	9.4
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.141 (V1)	158.9	29.9	527	218	-89.1	7.8
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.157 (V1)	261.2	77.3	997.8	738.1	-72.3	12.7

表 72 ： 藉由 mRNA 莫耳濃度測定的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導的 PCSK9 分泌蛋白抑制水平

	PHH 批次271
IC50 (pM)	IC90* (pM)	Emax (Δ%)
mRNA	gRNA	平均值	SEM	平均值	SEM	平均值	SEM
LTRP5	316.6.154 (V1)	110.4	11.2	330.7	74.9	-98.8	3.1
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	117.6	12.6	315.8	73	-97.8	3.6
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	128.1	12.5	734.7	165.1	-99.1	2.8
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	153.8	14.4	582.4	116.8	-98.9	2.7
CasX 515	316.6.1 (V1)	138.1	25.1	947	419.5	-94.6	4
LTRP5	316.6.141 (V1)	220.4	17.5	798.8	145.5	-97.2	2.5
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	219	24.6	767.7	199.8	-96.3	3.8
LTRP5	316.6.157 (V1)	264.6	27.6	1355.5	337.3	-100.8	4
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	310	57.3	1325.1	578	-99.5	7
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	352.1	39.7	1479.3	391.5	-100.8	4.4
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	365.9	62.5	1713.1	694	-98.3	5.9
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	475.6	101.7	3257.6	1700.3	-99	8.6
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	464.2	101	2825	1496.7	-91.5	8.5
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.141 (V1)	678.1	155.5	2563	1455.4	-92.7	9.4
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.157 (V1)	695.8	183.7	3282.8	2143.6	-69.2	8.4
mRNA	gRNA	PHH 批次31
LTRP5	316.6.154 (V1)	37.9	5.2	202.4	70.3	-97.4	3.4
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	80.2	6.4	221	42.9	-97.2	2.7
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	80.5	16.6	791.8	435.2	-100.1	5.7
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	65.2	11.1	412.2	169.7	-100.7	4.6
CasX 515	316.6.1 (V1)	115.5	27.1	896.6	537	-93.2	5.2
LTRP5	316.6.141 (V1)	136.8	19.9	1005.3	350	-100.6	4.1
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	192.7	44.4	877.1	460.3	-100.5	8
LTRP5	316.6.157 (V1)	160.1	22.3	614.7	184.5	-96.2	4.9
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	264	34	830.3	262.5	-98.8	5.8
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	239.3	24.9	761	191.6	-98.5	4.2
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	243.9	51.1	1116.2	547.1	-96.2	7.1
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	271.3	48.5	1697.7	726.8	-98.5	7
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	486.2	97	1925.3	897.6	-92.5	9.4
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.141 (V1)	436.2	82.1	1446.8	598.5	-89.1	7.8
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.157 (V1)	717.1	212.2	2739.2	2026.2	-72.3	12.7

表 73 ： 藉由總運載物質量測定的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導的 PCSK9 mRNA 抑制水平

	PHH 批次271
IC50 (ng/ 孔)	IC90* (ng/ 孔)	Emax* (Δ%)
mRNA	gRNA	平均值	SEM	平均值	SEM	平均值	SEM
CasX 515	316.6.1 (V1)	29.6	5.7	103.3	45.2	-60.1	2.7
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	50.3	8.2	161.2	53.9	-59.8	2.6
LTRP5	316.6.154 (V1)	38.2	7.8	211.2	101	-96.7	5.5
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	45.7	4.5	143.1	30.4	-95.1	2.9
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	92.9	13.7	357.9	124.5	-94.9	4.3
LTRP5	316.6.157 (V1)	101.3	14.5	504.4	173.5	-94.7	5
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	123.7	19.8	528.3	199.1	-91.9	5
LTRP5	316.6.141 (V1)	112.8	13.8	354.6	104.1	-88.9	3.7
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	153.1	22.4	755	264.3	-92.9	4.5
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	168.6	36	793.8	405.5	-83.3	6.4
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	159.7	47.4	695.8	486.5	-92.7	8.7
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	182.7	35.7	957	453.1	-80.3	5.8
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	189.8	42.8	817.3	439.1	-70.7	6.2
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.157 (V1)	135.1	37.9	470.1	300.4	-41.1	4.3
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.141 (V1)	233.2	67.6	1054.7	750.9	-73.1	8.1
	PHH 批次31
mRNA	gRNA	平均值	SEM	平均值	SEM	平均值	SEM
CasX 515	316.6.1 (V1)	42.7	10.6	149.3	80.3	-54.4	3.3
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	37.5	28.2	293.3	539.3	-44.4	9.4
LTRP5	316.6.154 (V1)	53.8	10.9	202.5	87.7	-97	4.6
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	59.7	9.2	194.2	61.6	-96.5	3.9
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	39.9	5.7	387	139.8	-96.1	3.6
LTRP5	316.6.157 (V1)	115.9	10.6	438.4	93.9	-93.4	2.5
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	106.8	16.8	327.2	125.7	-89.6	5.2
LTRP5	316.6.141 (V1)	122	30.2	701.4	417.1	-92.1	7.3
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	115	13.2	407.9	110.7	-88.6	3.6
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	129.6	22.2	461.3	182.3	-83.1	5.2
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.141 (V1)	148.6	18.7	377.4	93.9	-89.7	4.1
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	172.1	42.4	1053.3	631.5	-87.3	8
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.157 (V1)	196.7	35.5	659.9	271.6	-77.4	6
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.157 (V1)	254.2	69.8	728.3	523.5	-55.4	7.6
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.141 (V1)	228	37	536.7	210	-73.7	5.4

表 74 ： 藉由 mRNA 莫耳濃度測定的由具有各種抑制子域之 LTRP 構築體介導的 PCSK9 mRNA 抑制水平

	PHH 批次271
IC50 (pM)	IC90* (pM)	Emax* (Δ%)
mRNA	gRNA	平均值	SEM	平均值	SEM	平均值	SEM
LTRP5	316.6.154 (V1)	105.3	21.4	582.3	278.4	-96.7	5.5
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	163.2	26.6	522.5	174.8	-59.8	2.6
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	126	12.5	394.7	83.8	-95.1	2.9
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	248.7	36.7	958.4	333.5	-94.9	4.3
CasX 515	316.6.1 (V1)	147.5	28.6	514.9	225	-60.1	2.7
LTRP5	316.6.154 (V1)	279.3	40	1390.8	478.5	-94.7	5
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	331.4	53	1415.1	533.1	-91.9	5
LTRP5	316.6.154 (V1)	311	38.1	977.8	286.9	-88.9	3.7
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	409.9	60	2021.7	707.6	-92.9	4.5
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	462.8	99	2179.2	1113.3	-83.3	6.4
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	427.7	126.9	1863.5	1303	-92.7	8.7
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	489.3	95.5	2562.4	1213.2	-80.3	5.8
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	508.4	114.6	2188.9	1175.9	-70.7	6.2
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	370.8	103.9	1290.5	824.5	-41.1	4.3
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	640.1	185.5	2895.5	2061.3	-73.1	8.1
	PHH 批次31
mRNA	gRNA	平均值	SEM	平均值	SEM	平均值	SEM
LTRP5	316.6.154 (V1)	148.3	30.1	558.3	241.9	-97	4.6
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	121.5	91.3	950.9	1748.5	-44.4	9.4
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	164.6	25.3	535.5	169.9	-96.5	3.9
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	106.8	15.2	1036.2	374.3	-96.1	3.6
CasX 515	316.6.1 (V1)	212.8	52.8	743.7	399.9	-54.4	3.3
LTRP5	316.6.154 (V1)	319.5	29.1	1208.7	259	-93.4	2.5
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	286.1	44.9	876.3	336.5	-89.6	5.2
LTRP5	316.6.154 (V1)	336.3	83.3	1934.1	1150.2	-92.1	7.3
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	307.8	35.5	1092.1	296.5	-88.6	3.6
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	355.7	61	1266.3	500.4	-83.1	5.2
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	398	50	1010.9	251.4	-89.7	4.1
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	460.9	113.4	2820.4	1690.8	-87.3	8
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	526.9	95.2	1767.5	727.6	-77.4	6
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	697.9	191.7	1999.3	1437.2	-55.4	7.6
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	625.9	101.5	1473.4	576.4	-73.7	5.4

表 75 ： 藉由 RNA-seq 測定之 基因表現變化

mRNA	gRNA	劑量(ng*)	基因	log2( 倍數變化)	P 值
CasX 515	316.6.1 (V1)	2400	TUBB3	-1.05	5.90E-08
MARCO	-2.67	8.61E-07
ESAM	-1.04	1.07E-06
SUSD2	-1.14	3.07E-06
C1QB	-1.67	2.87E-05
KIF23	-1.19	5.82E-05
SpyCas9	Spy.50.1 (vInt)	2400	PLD4	-1.36	4.14E-07
SLC7A7	-1.03	8.09E-07
TSPAN15	-1.28	1.54E-06
ANXA8	-1.28	3.39E-06
RAC2	-1.08	4.94E-06
CYP7A1	1.45	1.09E-05
LTRP5	316.6.154 (V1), 316.6.157 (V1)	2400	PLD4	-1.36	4.14E-07
SLC7A7	-1.03	8.09E-07
TSPAN15	-1.28	1.54E-06
ANXA8	-1.28	3.39E-06
RAC2	-1.08	4.94E-06
CYP7A1	1.45	1.09E-05
LTRP5	316.6.154 (V1)	2400	PCSK9	-3.87	1.93E-64
C1QB	-2.92	1.78E-08
GPNMB	-1.96	3.06E-08
CD163	-1.49	3.89E-07
ITGAX	-2.02	5.74E-07
LAPTM5	-1.60	1.33E-06
RNASE1	-2.12	2.05E-06
MSR1	-2.30	2.10E-06
RGCC	-2.20	2.88E-06
PLEK	-2.46	1.88E-05
MIR6501	1.04	0.00011389
HCK	-2.84	0.00013665
LTRP5	316.6.157 (V1)	2400	PCSK9	-2.97	9.32E-41
TM4SF19	-2.59	1.26E-06
UCP2	-2.07	3.00E-05
MIR6501	1.09	8.01E-05
LTRP5	316.27.94 (V1)	2400	NA	NA	NA
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	2400	PCSK9	-3.34	5.86E-47
DNMT3A	1.83	1.55E-08
G6PD	1.01	4.75E-05
SDS	1.47	0.00012577
LTRP6-大鼠-眼鏡蛇-連接子集合3	316.6.154 (V1)	2400	PCSK9	-1.45	3.00E-12
LTRP6-2x眼鏡蛇	316.6.154 (V1)	2400	PCSK9	-2.34	2.85E-27

*劑量係以ng經囊封RNA/孔報導

將參看以下諸圖促進對本揭示之特徵及優點的理解：

圖1示出併入有DNMT3A ADD域之抑制子融合蛋白之各種組態的示意圖。「D3A ADD」、「D3A CD」及「D3L ID」分別表示DNMT3A之ADD域、DNMT3A之催化域及DNMT3L之相互作用域。L1至L3為連接子。NLS為核定位信號。

圖2為條形圖，其顯示經mRNA脂質體轉染之Huh7細胞中轉染後6天、18天及36天時的分泌PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對之CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例1中所描述。將分泌之PCSK9水平以總細胞計數標準化。初始(naïve)、未經處理之細胞用作實驗對照。

圖3為條形圖，其顯示在經mRNA脂質體轉染之HepG2細胞中轉染後第4天時的標準化分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例2中所描述。將分泌之PCSK9水平以總細胞計數標準化。初始的未經處理之細胞用作實驗對照。

圖4為條形圖，其顯示在經mRNA脂質體轉染之Huh7細胞中轉染後4天時的標準化分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例2中所描述。將分泌之PCSK9水平以總細胞計數標準化。初始的未經處理之細胞用作實驗對照。

圖5為條形圖，其顯示在經mRNA脂質體轉染之Hep3B細胞中轉染後4天時的標準化分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例2中所描述。將分泌之PCSK9水平以總細胞計數標準化。初始的未經處理之細胞用作實驗對照。

圖6為條形圖，其顯示在經mRNA脂質體轉染之Huh7細胞中轉染後4天、14天及27天時的分泌之PCSK9水平的定量，該mRNA編碼與指定靶向gRNA配對的CasX 676、dXR1或LTRP5-ADD-ZIM3，如實例2中所描述。分泌之PCSK9水平之定量係相對於在第4天時間點時在初始的未經處理之細胞中所偵測到的分泌水平顯示。

圖7係如實例3中所描述之gRNA支架變異體174 (SEQ ID NO: 1744)之示意圖。結構模體經突出顯示。

圖8為如實例3中所描述之gRNA支架變異體235 (SEQ ID NO: 1745)之示意圖。突出顯示的結構模體與圖7中相同。變異體174與變異體235之間的差異在於延伸莖模體及若干單核苷酸變化(用星號指示)。變異體316維持來自變異體174之較短延伸莖，但具有在支架235中發現的四個取代。

圖9為如實例3中所描述之gRNA支架變異體316 (SEQ ID NO: 1746)之示意圖。突出顯示的結構模體與圖7中相同。變異體316維持來自變異體174之較短延伸莖(圖7)，但具有在支架235中發現的四個取代(圖8)。

圖10係示出如實例3中所描述對gRNA支架變異體235進行的化學修飾之型式1至3的示意圖。結構模體經突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。對於v2概況，在相關圓圈中用「U」標註三個3'尿嘧啶(3'UUU)的添加。

圖11係示出如實例3中所描述對gRNA支架變異體235進行的化學修飾之型式4至6的示意圖。結構模體經突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。

圖12係示出如實例3中所描述對gRNA支架變異體316進行的化學修飾之型式7至9的示意圖。結構模體經突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。

圖13係示出如實例3中所描述對gRNA支架變異體316進行的化學修飾之型式1至3的示意圖。結構模體經突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。

圖14係示出如實例3中所描述對gRNA支架變異體316進行的化學修飾之型式4至6的示意圖。結構模體經突出顯示。標準核糖核苷酸描繪為空心圓，且2'OMe-修飾之核糖核苷酸描繪為黑色圓。硫代磷酸酯鍵在鍵下方或鍵旁邊用*指示。

圖15為顯示在HepG2細胞中藉由次世代定序(NGS)所量測之 PCSK9基因座之插入/缺失率(描繪為編輯部分) (x軸)與藉由酶聯免疫吸附分析(ELISA)偵測之分泌的PCSK9水平(ng/mL) (y軸)之間的相關性的圖，該等HepG2細胞經CasX 491 mRNA及含有指定支架變異體及間隔子組合的 PCSK9靶向gRNA進行脂質體轉染，如實例3中所描述。

圖16係示出HepG2細胞中 B2M基因剔除百分比之定量的圖，該等HepG2細胞係經100 ng CasX 491 mRNA及指示劑量之具有間隔子7.37的末端經修飾(v1)或未經修飾(v0)的 B2M靶向gRNA共轉染，如實例3中所描述。關於因在 B2M基因座處成功編輯而損失HLA複合物之表面呈現的細胞群體，藉由流動式細胞測量術測定編輯水平。

圖17係描繪編輯分析之結果的圖，該等編輯分析結果經量測為在經指定劑量之LNP處理之HepG2細胞中人類 B2M基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率，該等LNP係用CasX 491 mRNA及指定的 B2M靶向gRNA調配，如實例3中所描述。

圖18係示出用指定劑量之LNP處理之HepG2細胞中B2M基因剔除百分比之定量的圖，該等LNP係用CasX 491 mRNA及指定的 B2M靶向gRNA調配，如實例3中所描述。關於因在 B2M基因座處成功編輯而不具有HLA複合物之表面呈現的細胞群體，藉由流動式細胞測量術編輯水平。

圖19係描繪編輯分析之結果的圖，該等編輯分析結果經量測為在經指定劑量之LNP處理之Hepa1-6細胞中在小鼠 ROSA26基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率，該等LNP係用CasX 676 mRNA #2及具有v1或v5修飾概況之指定的 ROSA26靶向gRNA調配，如實例3中所描述。

圖20係示出經量測為在用LNP處理之小鼠中在 ROSA26基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率的編輯百分比之定量的圖，該等LNP係用CasX 676 mRNA #2及指定的經化學修飾之 ROSA26靶向gRNA調配，如實例3中所描述。

圖21係顯示編輯分析之結果的條形圖，該等編輯分析結果經量測為在經LNP處理之小鼠中在小鼠 PCSK9基因座處藉由NGS偵測之插入/缺失率，該等LNP係用CasX 676 mRNA #1及所指示的經化學修飾之 PCSK9靶向gRNA調配，如實例3中所描述。未經處理之小鼠用作實驗對照。

圖22係引導RNA支架235 (SEQ ID NO: 1745)之二級結構之圖，其指出具有CpG模體之區域，如實例6中所描述。(1)假結莖、(2)支架莖、(3)延伸莖泡、(4)延伸步驟及(5)延伸莖環中之CpG模體係在結構上標記。

圖23為引入至引導RNA支架之編碼序列中的五個區域中之各者中的CpG減少突變之圖，如實例6中所描述。

圖24提供編輯實驗之結果，其中具有各種CpG減少或CpG耗竭之引導RNA支架之AAV載體用於編輯誘導神經元中之 B2M基因座，如實例6中所描述。AAV載體係以4e3之感染倍率(multiplicity of infection；MOI)投與。條形柱顯示每個樣本兩個複本之平均值±SD。「No Tx」指示未經轉導之對照，且「NT」指示具有非靶向間隔子之對照。

圖25提供編輯實驗之結果，其中具有各種CpG減少或CpG耗竭之引導RNA支架之AAV載體用於編輯誘導神經元中之 B2M基因座，如實例6中所描述。AAV載體係以3e3之MOI投與。條形柱顯示每個樣本兩個複本之平均值±SD。「未處理」指示未轉導之對照。

圖26提供編輯實驗之結果，其中具有各種CpG減少或CpG耗竭之引導RNA支架之AAV載體用於編輯誘導神經元中之 B2M基因座，如實例6中所描述。AAV載體係以1e3之MOI投與。條形柱顯示每個樣本兩個複本之平均值±SD。「未處理」指示未轉導之對照。

圖27提供編輯實驗之結果，其中具有各種CpG減少或CpG耗竭之引導RNA支架之AAV載體用於編輯誘導神經元中之 B2M基因座，如實例6中所描述。AAV載體係以MOI=3e2之MOI投與。條形柱顯示每個樣本兩個複本之平均值±SD。「未處理」指示未轉導之對照。

圖28示出長期抑制子蛋白(LTRP，在本文中亦稱為「抑制子融合蛋白」)融合蛋白之五種組態之示意圖，其中抑制子分子連接至催化失效之CasX。D3A及D3L分別表示DNA甲基轉移酶3α (DNMT3A)及DNMT3A樣蛋白(DNMT3L)。L1至L4為連接子。NLS為核定位信號。

圖29示出各種LTRP #5架構之示意圖，其中併入額外DNMT3A域，如實例7中所描述。額外DNMT3A域為DNMT3A之ADD域(「D3A ADD」)及DNMT3A之PWWP域(Pro-Trp-Trp-Pro模體)(「D3A PWWP」)。「D3A endo」編碼DNMT3A PWWP與ADD域之間出現之內源序列。「D3A CD」及「D3L ID」分別表示DNMT3A之催化域及DNMT3L之相互作用域。「L1至L3」為連接子。「NLS」為核定位信號。LTRP序列參見表13。

圖30呈現時程實驗之結果，該時程實驗對指定LTRP-ZIM3及其具有使用間隔子7.37之 B2M靶向gRNA的變異體的B2M抑制活性(表示為HLA陰性細胞之百分比)進行比較，如實例7中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。CD=DNMT3A之催化域。

圖31呈現圖30中所示之相同時程實驗之結果，但顯示具有使用間隔子7.160之 B2M靶向gRNA的指定LTRP-ZIM3變異體的B2M抑制活性，如實例7中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。

圖32呈現圖30中所示之相同時程實驗之結果，但顯示具有使用間隔子7.165之 B2M靶向gRNA的指定LTRP-ZIM3變異體的B2M抑制活性，如實例7中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。

圖33呈現圖30中所示之相同時程實驗之結果，但顯示具有非靶向gRNA之指定LTRP-ZIM3變異體的B2M抑制活性，如實例7中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。

圖34為針對三個 B2M靶向gRNA及非靶向gRNA，各指定LTRP-ZIM3變異體之 VEGFA基因座之轉錄起始位點下游的CpG位點之CpG甲基化百分比的小提琴圖，如實例7中所描述。

圖35係散佈圖，其顯示指定LTRP5-ZIM3變異體的相對活性(對於間隔子7.160，第21天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(對於間隔子7.160，第7天定量的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化百分比)，如實例7中所描述。

圖36示出實例8中所測試之LTRP組態#1、#4及#5的具有ADD域之LTRP分子之一般架構的示意圖。「D3A ADD」、「D3A CD」及「D3L ID」分別表示DNMT3A之ADD域、DNMT3A之催化域及DNMT3L之相互作用域，如實例8中所描述。「L1至L4」為連接子。「NLS」為核定位信號。LTRP序列參見表11。

圖37呈現時程實驗之結果，該時程實驗對與具有間隔子7.160之 B2M靶向gRNA配對、具有ZIM3-KRAB域、具有組態#1、#4或#5、具有或沒有DNMT3A ADD域的LTRP之B2M抑制活性(表示為HLA陰性細胞之百分比)進行比較，如實例8中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖38係圖表，其顯示圖37中所示之相同時程實驗之結果，但示出具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有或沒有DNMT3A ADD域、與具有間隔子7.160之 B2M靶向gRNA配對的LTRP #5的B2M抑制活性，如實例8中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖39係圖表，其顯示圖37中所示之相同時程實驗之結果，但示出具有或沒有DNMT3A ADD域、與具有指定間隔子之 B2M靶向gRNA配對的LTRP5-ZIM3之B2M抑制活性，如實例8中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖40係圖表，其示出針對指定gRNA的LTRP在轉染後第27天的B2M抑制活性結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#1、具有或沒有DNMT3A ADD域，如實例8中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖41係圖表，其示出針對指定gRNA，LTRP在轉染後第27天的B2M抑制活性結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#4、具有或沒有DNMT3A ADD域，如實例8中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖42係圖表，其示出針對指定gRNA， LTRP在轉染後第27天的B2M抑制活性結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#5、具有或沒有DNMT3A ADD域，如實例8中所描述。資料呈現為具有標準偏差之平均值，N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖43係圖表，其示出針對指定gRNA，LTRP在轉染後第5天用於確定 VEGFA基因座處之脫靶甲基化的亞硫酸氫鹽定序之結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#1、具有或沒有DNMT3A ADD域，如實例8中所描述。資料呈現為 VEGFA基因座附近之CpG部位之CpG甲基化的平均百分比；亦呈現平均值標準誤差；N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖44係圖表，其示出針對指定gRNA，LTRP在轉染後第5天用於確定 VEGFA基因座處之脫靶甲基化的亞硫酸氫鹽定序之結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#4、具有或沒有DNMT3A ADD域，如實例8中所描述。資料呈現為 VEGFA基因座附近之CpG部位之CpG甲基化的平均百分比；亦呈現平均值標準誤差；N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖45係圖表，其示出針對指定gRNA，LTRP在轉染後第5天用於確定 VEGFA基因座處之脫靶甲基化的亞硫酸氫鹽定序之結果，該等LTRP具有ZNF10或ZIM3-KRAB域、具有組態#5、具有或沒有DNMT3A ADD域，如實例8中所描述。資料呈現為 VEGFA基因座附近之CpG部位之CpG甲基化的平均百分比；亦呈現平均值標準誤差；N=3。「NT」為具有非靶向間隔子之gRNA。

圖46為點圖，其顯示針對具有間隔子7.160之 B2M靶向gRNA，具有ZIM3-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天定量的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例8中所描述。

圖47為點圖，其顯示針對具有間隔子7.160之 B2M靶向gRNA，具有ZNF10-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天定量的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例8中所描述。

圖48為點圖，其顯示針對具有間隔子7.37之 B2M靶向gRNA，具有ZIM3-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天定量的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例8中所描述。

圖49為點圖，其顯示針對具有間隔子7.37之 B2M靶向gRNA，具有ZNF10-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天定量的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例8中所描述。

圖50為點圖，其顯示針對具有間隔子7.165之 B2M靶向gRNA，具有ZIM3-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天定量的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例8中所描述。

圖51為點圖，其顯示針對具有間隔子7.165之 B2M靶向gRNA，具有ZNF10-KRAB域、具有組態#1、#4及#5之LTRP分子的相對活性(第27天之HLA陰性細胞之平均百分比)與特異性(第5天定量的 VEGFA基因座處之脫靶CpG甲基化之百分比)，如實例8中所描述。

圖52係圖表，其示出經編碼指定CasX或LTRP:gRNA構築體之質體轉染、在用不同濃度之DNMT1抑制劑5-azadC處理後六天表現B2M的HEK293T細胞之百分比，如實例9中所描述。

圖53係圖表，其並列示出經編碼指定CasX或LTRP:gRNA構築體之質體轉染且培養58天的HEK293T細胞之B2M抑制的定量，以及在用5-azadC處理經轉染細胞之後的B2M再活化之定量，如實例9中所描述。

圖54示出如實例11中所描述的不含DNMT3A之ADD域之LTRP5分子的示意圖。「D3A CD」及「D3L ID」分別表示DNMT3A之催化域及DNMT3L之相互作用域。「L1」、「L2」、「L3A」及「L3B」係連接子。「NLS」為核定位信號。「RD1」表示抑制子域。

圖55係示出時程實驗之結果之條形圖，該時程實驗對經含有連接子集1-11之LTRP5變異體質體轉染的HEK293T細胞中B2M抑制水平(表示為HLA陰性細胞之平均百分比)進行比較，如實例13中所描述。將各時間點(第8天、第15天及第45天)之資料疊加且以平均值加標準偏差呈現，N=3。包括非靶向間隔子(NT)作為實驗對照。

圖56係示出時程實驗之結果之條形圖，該時程實驗對在HEK293T中量測的含有連接子集合1-11之LTRP5變異體的目標1抑制之水平(表示為含目標1減弱之總細胞的百分比)進行比較，如實例13中所描述。將各時間點(第8天、第15天及第45天)之資料疊加且以平均值加標準偏差呈現，N=3。

圖57係示出時程實驗之結果之條形圖，該時程實驗對HEK293T中量測的含有連接子集合1-11之LTRP5變異體的目標2抑制之水平(表示為含目標2減弱之總細胞的百分比)進行比較，如實例13中所描述。將各時間點(第8天、第15天及第45天)之資料疊加且以平均值加標準偏差呈現，N=3。包括非靶向間隔子(NT)作為實驗對照。

圖58係示出時程實驗之結果之條形圖，該時程實驗對經含有連接子集12-28之LTRP5變異體質體轉染的HEK293T細胞中B2M抑制水平(表示為HLA陰性細胞之平均百分比)進行比較，如實例13中所描述。將各時間點(第7天及第17天)之資料疊加且以平均值加標準偏差呈現，N=3。包括非靶向間隔子(NT)作為實驗對照。包括非靶向間隔子(NT)作為實驗對照。

圖59係示出時程實驗之結果之條形圖，該時程實驗對HEK293T中量測的含有連接子集12-28之LTRP5變異體的目標1抑制之水平(表示為含目標1減弱之總細胞的百分比)進行比較，如實例13中所描述。將各時間點(第7天及第17天)之資料疊加且以平均值加標準偏差呈現，N=3。包括非靶向間隔子(NT)作為實驗對照。

圖60係示出時程實驗之結果之條形圖，該時程實驗對HEK293T中量測的含有連接子集12-28之LTRP5變異體的目標2抑制之水平(表示為含目標2減弱之總細胞的百分比)進行比較，如實例13中所描述。將各時間點(第7天及第17天)之資料疊加且以平均值加標準偏差呈現，N=3。包括非靶向間隔子(NT)作為實驗對照。

圖61示出具有DNMT3A ADD域之LTRP分子之各種組態的示意圖。「D3A ADD」、「D3A CD」及「D3L ID」分別表示DNMT3A之ADD域、DNMT3A之催化域及DNMT3L之相互作用域。「L1」、「L2」、「L3A」、「L3B」及「L4」係連接子。」 「NLS」為核定位信號。「RD1」表示抑制子域，且「RD1a」及「RD1b」表示抑制子域變異體。

圖62係小提琴圖，其中每個點表示在個別CpG處之平均甲基化%。中值甲基化係由虛線指示，其中上四分位數及下四分位數以點線指示。轉錄起始位點(TSS)附近之DNA甲基化係自處理後第7天、第14天及第42天處死之N=3隻小鼠的肝提取之經均質化gDNA，藉由擴增子酶法甲基化定序(EM-seq)量測，如實例14中所描述。

圖63係小提琴圖，其中每個點表示在個別CpG處之平均甲基化%。中值甲基化係由虛線指示，其中上四分位數及下四分位數以點線指示。轉錄起始位點(TSS)附近之DNA甲基化係自處理後第7天處死之N=3隻小鼠的肝提取之經均質化gDNA，藉由擴增子酶法甲基化定序(EM-seq)量測，如實例14中所描述。

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Claims (164)

1. 一種用於轉錄抑制前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/kexin 9型(proprotein convertase subtilisin/kexin Type 9； PCSK9)基因之系統，該系統包含： (a)引導核糖核酸(gRNA)，其包含與 PCSK9基因目標核酸序列互補之靶向序列，及 (b)編碼長期抑制子融合蛋白(LTRP)之mRNA，其中該LTRP包含： a.   催化失效(catalytically-dead) CasX (dCasX)； b.  DNA甲基轉移酶(DNMT) 3A催化域(DNMT3A)； c.   DNMT3樣相互作用域(DNMT3L)；及 d.  第一抑制子域(RD1)， 其中該LTRP能夠與該gRNA形成核糖核蛋白(RNP)。
2. 如請求項1之系統，其中該LTRP自N端至C端包含： a.   該DNMT3A； b.  該DNMT3L； c.   該dCasX；及 d.  該RD1。
3. 如請求項1之系統，其中該LTRP自N端至C端包含： a.   該DNMT3A； b. 該DNMT3L； c.   該RD1；及 d.  該dCasX。
4. 如請求項3之系統，其中該LTRP進一步包含另一RD1位於該dCasX之C端。
5. 如請求項4之系統，其中該等RD1序列係相同的。
6. 如請求項4之系統，其中該等RD1序列係不同的。
7. 如請求項1至6中任一項之系統，其中該LTRP包含連接至該DNMT3A之N端的DNA DNMT3A ATRX-DNMT3-DNMT3L域(ADD)。
8. 如請求項1至7中任一項之系統，其中該LTRP包含一或多個連接子肽。
9. 如請求項8之系統，其中該一或多個連接子肽中之至少一者包含獨立地選自由SEQ ID NO: 98至124及3278至3289組成之群的序列。
10. 如請求項1至9中任一項之系統，其中該LTRP包含一或多個核定位信號(NLS)。
11. 如請求項10之系統，其中該一或多個NLS中之至少一者包含選自由SEQ ID NO: 30至97組成之群的序列。
12. 如請求項10或請求項11之系統，其中該一或多個NLS中之至少一者為猿猴病毒40 (SV40) NLS。
13. 如請求項12之系統，其中該SV40 NLS包含SEQ ID NO: 30之序列。
14. 如請求項10或請求項11之系統，其中該一或多個NLS中之至少一者為c-MYC NLS。
15. 如請求項14之系統，其中該c-MYC NLS包含SEQ ID NO: 32之序列。
16. 如請求項1至2或8至15中任一項之系統，其中該LTRP自N端至C端包含： a.   第一NLS； b.  該DNMT3A； c.   第一連接子肽； d.  該DNMT3L； e.   第二連接子肽； f.   第三連接子肽； g.  該dCasX； h.  第四連接子肽； i.   該RD1，及 j.   第二NLS。
17. 如請求項16之系統，其中該LTRP包含選自由SEQ ID NO: 22836及SEQ ID NO: 22838至22846組成之群的序列。
18. 如請求項7至15中任一項之系統，其中該LTRP自N端至C端包含： a.   第一NLS； b.  該ADD； c.   該DNMT3A； d.  第一連接子肽； e.   該DNMT3L； f.   第二連接子肽； g.  第三連接子肽； h.  該dCasX； i.   第四連接子肽； j.   該RD1，及 k.  第二NLS。
19. 如請求項18之系統，其中該LTRP包含選自由SEQ ID NO: 22837及SEQ ID NO: 22847至22855組成之群的序列。
20. 如請求項1、3或8至15中任一項之系統，其中該LTRP自N端至C端包含： a.   第一NLS； b.  該DNMT3A； c.   第一連接子肽； d.  該DNMT3L； e.   第三連接子肽； f.   該RD1； g.  第二連接子肽； h.  該dCasX； i.   第四連接子肽，及 j.   第二NLS。
21. 如請求項7至15中任一項之系統，其中該LTRP自N端至C端包含： a.   第一NLS； b.  該ADD； c.   該DNMT3A； d.  第一連接子肽； e.   該DNMT3L； f.   第二連接子肽； g.  該RD1 h.  第三連接子肽； i.   該dCasX； j.   第四連接子肽，及 k.  第二NLS。
22. 如請求項7至15中任一項之系統，其中該LTRP自N端至C端包含： a.   第一NLS； b.  該ADD； c.   該DNMT3A； d.  第一連接子肽； e.   該DNMT3L； f.   第二連接子肽； g.  該RD1 h.  第三連接子肽； i.   該dCasX； j.   第四連接子肽； k.  另一RD1； l.   第五連接子，及 m.  第二NLS。
23. 如請求項22之系統，其中該RD1序列及該另一RD1序列係相同的。
24. 如請求項22之系統，其中該RD1序列及該另一RD1序列係不同的。
25. 如請求項1至24中任一項之系統，其中該dCasX包含選自由SEQ ID NO: 4至29組成之群的序列，或與其具有至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
26. 如請求項25之系統，其中該dCasX包含SEQ ID NO: 4之序列，或與其具有至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
27. 如請求項26之系統，其中該dCasX由SEQ ID NO: 4之序列組成。
28. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含選自由SEQ ID NO: 128至1726組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
29. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含選自由SEQ ID NO: 130至138組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
30. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 130之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
31. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 131之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
32. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 132之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
33. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 133之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
34. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 134之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
35. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 135之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
36. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 136之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
37. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 137之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
38. 如請求項1至27中任一項之系統，其中該RD1包含SEQ ID NO: 138之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
39. 如請求項7至15、18或19至38中任一項之系統，其中該ADD包含SEQ ID NO: 125之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
40. 如請求項1至39中任一項之系統，其中該DNMT3A包含SEQ ID NO: 126之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
41. 如請求項1至40中任一項之系統，其中該DNMT3L包含SEQ ID NO: 127之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
42. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該dCasX之序列包含選自由SEQ ID NO: 3122及22727組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
43. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3334至6527組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
44. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3334至3342及4931至4939組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
45. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3335及SEQ ID NO: 4932組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
46. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3339及SEQ ID NO: 4936組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
47. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3334及SEQ ID NO: 4931組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
48. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3336及SEQ ID NO: 4933組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
49. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3337及SEQ ID NO: 4934組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
50. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3338及SEQ ID NO: 4935組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
51. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3340及SEQ ID NO: 4937組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
52. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3341及SEQ ID NO: 4938組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
53. 如請求項1至41中任一項之系統，其中編碼該RD1之序列包含選自由SEQ ID NO: 3342及SEQ ID NO: 4939組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
54. 如請求項1至53中任一項之系統，其中編碼該DNMT3A之序列包含選自由SEQ ID NO: 3128及SEQ ID NO: 3331組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
55. 如請求項1至54中任一項之系統，其中編碼該DNMT3L之序列包含選自由SEQ ID NO: 3119及SEQ ID NO: 3332組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
56. 如請求項7至15、18、19或21至55中任一項之系統，其中編碼該ADD之序列包含選自由SEQ ID NO: 3127、3296及22726組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
57. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529至8134及14628至16233組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
58. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529至6537及14628至14636組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
59. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6529及SEQ ID NO: 14628組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
60. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6530及SEQ ID NO: 14629組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
61. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6531及SEQ ID NO: 14630組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
62. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6532及SEQ ID NO: 14631組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
63. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6533及SEQ ID NO: 14632組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
64. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6535及SEQ ID NO: 14632組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
65. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6534及SEQ ID NO: 14633組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
66. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6536及SEQ ID NO: 14635組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
67. 如請求項1、2、8至17或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 6537及SEQ ID NO: 4636組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
68. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9742至11347及17840至19446組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
69. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9742至9750及17841至17849組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
70. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9742及SEQ ID NO: 17841組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
71. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9743及SEQ ID NO: 17842組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
72. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9744及SEQ ID NO: 17843組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
73. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9745及SEQ ID NO: 17844組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
74. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9746及SEQ ID NO: 17845組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
75. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9747及SEQ ID NO: 17846組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
76. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9748及SEQ ID NO: 17847組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
77. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9749及SEQ ID NO: 17848組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
78. 如請求項1、2、7至15、18、19或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 9750及SEQ ID NO: 17849組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
79. 如請求項1、3、8至15、20或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 8135至9740及16234至17839組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
80. 如請求項1、3、8至15、20或25至55中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 8135至8143及16234至16242組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
81. 如請求項1、3、7至15、21或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 11348至12953及19447至21052組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
82. 如請求項1、3、7至15、21或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 11348至11356及19447至19455組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
83. 如請求項1、3至5、7至15、22、23或25至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 12954至14553及21053至22652組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
84. 如請求項1、3至4、6至15、22或24至56中任一項之系統，其中編碼該LTRP之mRNA包含選自由SEQ ID NO: 14554至14626及22653至22725組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
85. 如請求項1至84中任一項之系統，其中該mRNA經密碼子最佳化。
86. 如請求項85之系統，其中該mRNA經密碼子最佳化以表現於人類細胞中。
87. 如請求項1至86中任一項之系統，其中該mRNA經化學修飾，視情況其中該mRNA之一或多個或所有尿苷殘基經1-甲基-假尿苷置換。
88. 如請求項1至87中任一項之系統，其中該mRNA包含5'非轉譯區(UTR)、3' UTR、聚腺苷酸(poly(A))序列，及/或5'帽。
89. 如請求項88之系統，其中該5' UTR包含SEQ ID NO: 3300之序列。
90. 如請求項88或請求項89之系統，其中該3' UTR包含SEQ ID NO: 3310之序列。
91. 如請求項88至90中任一項之系統，其中該聚腺苷酸包含SEQ ID NO: 3057之序列。
92. 如請求項88至91中任一項之系統，其中該5'帽連接至該mRNA之5'。
93. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含選自由SEQ ID NO: 14628至16233、16234至17839、17841至19446、19447至21052、21053至22652及22653至22725組成之群的序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
94. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14628至14635或14636之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
95. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14628之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
96. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14629之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
97. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14630之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
98. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14631之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
99. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含序列SEQ ID NO: 14632，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
100. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14633之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
101. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14634之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
102. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14635之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
103. 如請求項87至92中任一項之系統，其中該mRNA包含SEQ ID NO: 14636之序列，或與其具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之序列。
104. 如請求項1至103中任一項之系統，其中該 PCSK9基因目標核酸序列係於該基因之轉錄起始位點(TSS)的1.5 kb以內。
105. 如請求項1至103中任一項之系統，其中該 PCSK9基因目標核酸序列係於該基因之TSS上游500 bp至下游500 bp以內。
106. 如請求項1至103中任一項之系統，其中該 PCSK9基因目標核酸序列係於該基因之TSS上游300 bp至下游300 bp以內，或係於該基因之TSS上游100 bp至下游100 bp以內。
107. 如請求項1至103中任一項之系統，其中該 PCSK9基因目標核酸序列係於該基因之TSS上游100 bp至下游100 bp以內。
108. 如請求項1至107中任一項之系統，其中該 PCSK9基因目標核酸序列係於該基因之強化子的1 kb以內。
109. 如請求項1至107中任一項之系統，其中該 PCSK9基因目標核酸序列係於該 PCSK9基因之3'非轉譯區內。
110. 如請求項1至109中任一項之系統，其中該gRNA之靶向序列包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 1824至1881、1883至1897、1899至1934、1937至1991、1993至1999、2001至2026、2029至2057、2059至2106、2108至2114、2116至2122、2124至2139、2141至2209、2211至2212、2214至2233、2235至2252、2254至2269、2271至2281、2283至2284、2286至2320、2322至2334、2236至2346、2348至2362、2364至2375、2377至2395、2397至2428、2430至2438、2440至2463、2465至2509、2511至2544、 2672、2675、2694及2714。
111. 如請求項1至109中任一項之系統，其中該gRNA之靶向序列包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 1824至1880、1883、1884、1888、1889、2672、2675、2694及2714。
112. 如請求項1至109中任一項之系統，其中該gRNA之靶向序列包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO: 1834、1849、1853、1855至1858、1860、1862、1863、1867、1869、1870、1872、1874及1875。
113. 如請求項1至109中任一項之系統，其中該gRNA之靶向序列包含選自由SEQ ID NO: 1855、1867及1869組成之群的序列。
114. 如請求項110至113中任一項之系統，其中該gRNA之靶向序列包含其中1、2、3、4或5個核苷酸自序列之3'端移除之序列。
115. 如請求項1至114中任一項之系統，其中該gRNA為單分子gRNA (sgRNA)。
116. 如請求項1至115中任一項之系統，其中該gRNA包含支架莖環，該支架莖環包含CCAGCGACUAUGUCGUAGUGG (SEQ ID NO: 1822)之序列或其具有1、2、3、4或5個錯配之序列。
117. 如請求項1至116中任一項之系統，其中該gRNA包含支架，該支架包含選自由SEQ ID NO: 1744至1746組成之群的序列，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列。
118. 如請求項1至116中任一項之系統，其中該gRNA包含支架，該支架包含SEQ ID NO: 1746之序列，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列。
119. 如請求項1至118中任一項之系統，其中該gRNA包含選自由SEQ ID NO: 3074至3081、3145至3147、3150至3153及3158至3176組成之群的序列，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列。
120. 如請求項1至119中任一項之系統，其中該gRNA經化學修飾。
121. 如請求項120之系統，其中對該gRNA之化學修飾包含向該gRNA之一或多個核苷酸添加2'O-甲基。
122. 如請求項121之系統，其中位於該gRNA之5'末端、3'末端或兩個末端之1、2、3或4個核苷酸的一或多個核苷酸係藉由添加2'O-甲基修飾。
123. 如請求項120至122中任一項之系統，其中對該gRNA之化學修飾包含該gRNA之兩個或更多個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵的取代。
124. 如請求項123之系統，其中該化學修飾包含位於該gRNA之5'末端、3'末端或兩個末端之1、2、3或4個核苷酸的兩個或更多個核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵的取代。
125. 如請求項104至124中任一項之系統，其中該gRNA包含選自由SEQ ID NO: 3074至3081、3147、3151、3153、3159至3164、3166至3171、3173至3176及22788至22803組成之群的序列，或與其具有至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性之序列。
126. 如請求項104至124中任一項之系統，其中該gRNA包含選自由SEQ ID NO: 22788至22803組成之群的序列。
127. 如請求項104至124中任一項之系統，其中該gRNA包含選自由SEQ ID NO: 22788至22790組成之群的序列。
128. 一種脂質奈米粒子，其包含如請求項1至127中任一項之系統。
129. 一種脂質奈米粒子(LNP)，其包含如請求項87至103中任一項之mRNA及如請求項120至127中任一項之gRNA。
130. 如請求項128或129之LNP，其中該LNP包含一或多種選自由以下組成之群的組分：可離子化脂質、一或多種輔助磷脂、一或多種經聚乙二醇(PEG)修飾之脂質，及膽固醇或其衍生物。
131. 如請求項128至130中任一項之LNP，其中該LNP包含可離子化脂質、輔助磷脂、經聚乙二醇(PEG)修飾之脂質，及膽固醇或其衍生物。
132. 如請求項128至131中任一項之LNP，其包含含有5至8之pKa的陽離子型脂質。
133. 一種醫藥組合物，其包含： a.   如請求項1至127中任一項之系統；或 b. 如請求項128至132中任一項之LNP， 及一或多種醫藥學上適合之賦形劑。
134. 一種醫藥組合物，其包含複數個如請求項128至132中任一項之脂質奈米粒子，及醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。
135. 如請求項134之醫藥組合物，其中該複數個脂質奈米粒子之平均直徑在約20 nm與約200 nm之間。
136. 如請求項134或請求項135之醫藥組合物，其中該醫藥組合物經調配用於選自由以下組成之群的投與途徑：靜脈內、動脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌肉內、腦室內、腦池內、鞘內、顱內、腰椎內(intralumbar)、眼內、皮下及經口途徑。
137. 一種抑制細胞群體中 PCSK9基因之轉錄的方法，該方法包含向該群體之細胞中引入： a.   如請求項1至127中任一項之系統； b.  如請求項128至132中任一項之LNP； c.   如請求項133至136中任一項之醫藥組合物；或 d.  (a)至(c)中之兩者或更多者之組合， 由此抑制該細胞群體中該 PCSK9基因之轉錄。
138. 如請求項137之方法，其中該 PCSK9基因之轉錄抑制在該群體之至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4%、至少約5%、至少約6%、至少約7%、至少約8%、至少約9%、或至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或更多的細胞中。
139. 如請求項137或請求項138之方法，其中與未經處理之細胞相比，該群體之細胞中該 PCSK9基因之轉錄減少至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%。
140. 如請求項137至139中任一項之方法，其中該群體之細胞為真核細胞。
141. 如請求項140之方法，其中該等真核細胞選自由以下組成之群：嚙齒動物細胞、小鼠細胞、大鼠細胞，及非人類靈長類動物細胞。
142. 如請求項140之方法，其中該等真核細胞為人類細胞。
143. 如請求項140至142中任一項之方法，其中該等真核細胞選自由以下組成之群：肝細胞、腸細胞、腎細胞、中樞神經系統細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞，及動脈壁細胞。
144. 如請求項137至143中任一項之方法，其中該細胞群體之 PCSK9基因之抑制係在活體外或離體發生。
145. 如請求項137至143中任一項之方法，其中該細胞群體之 PCSK9基因之抑制係在個體活體內發生。
146. 如請求項145之方法，其中該個體選自由以下組成之群：嚙齒動物、小鼠、大鼠，及非人類靈長類動物。
147. 如請求項145之方法，其中該個體為人類。
148. 如請求項137至147中任一項之方法，其中該轉錄抑制經由一或多次細胞分裂而穩定。
149. 如請求項137至148中任一項之方法，其中該轉錄抑制係可遺傳的。
150. 如請求項137至149中任一項之方法，其中該抑制係可逆的。
151. 如請求項150之方法，其中該抑制可藉由使用DNMT抑制劑而逆轉。
152. 如請求項151之方法，其中該DNMT之抑制劑為胞苷類似物。
153. 如請求項151或請求項152之方法，其中該DNMT之抑制劑選自由以下組成之群：阿紮胞苷(azacytidine)、地西他濱(decitabine)、氯法拉濱(clofarabine)，及澤布拉林(zebularine)。
154. 一種治療有需要個體之 PCSK9相關疾病的方法，其包含投與治療有效劑量之： a.   如請求項1至127中任一項之系統； b.  如請求項128至132中任一項之LNP；或 c.   如請求項133至136中任一項之醫藥組合物， 由此治療該PCSK9相關疾病。
155. 如請求項154之方法，其中該個體係用治療有效劑量之該LNP治療。
156. 如請求項154或請求項155之方法，其中投與該LNP係藉由選自由以下組成之群的投與途徑：靜脈內、動脈內、門靜脈內注射、腹膜內、肌肉內、腦室內、腦池內、鞘內、顱內、腰椎內、眼內、皮下及經口途徑。
157. 如請求項154至156中任一項之方法，其中該 PCSK9相關疾病選自由以下組成之群：體染色體顯性高膽固醇血症(autosomal dominant hypercholesterolemia；ADH)、高膽固醇血症(hypercholesterolemia)、總膽固醇水平升高、高血脂症(hyperlipidemia)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein；LDL)水平升高、LDL-膽固醇水平升高、高密度脂蛋白水平降低、肝臟脂肪變性、冠心病、缺血、中風、周邊血管疾病、血栓形成、2型糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化、肥胖症、主動脈狹窄、PCSK9水平升高，或其組合。
158. 如請求項154至157中任一項之方法，其中該方法使得至少一個選自由以下組成之群的臨床相關終點改善：LDL-膽固醇相對於基線之變化、斑塊動脈粥瘤體積減小、冠狀動脈斑塊減少、動脈粥樣硬化性心血管疾病(atherosclerotic cardiovascular disease；ASCVD)減少、心臟血管死亡、非致命心肌梗塞、缺血性中風、非致命中風、冠狀動脈血管再形成、不穩定型心絞痛，及視力。
159. 如請求項154至158中任一項之方法，其中該方法使得至少兩個選自由以下組成之群的臨床相關終點改善：LDL-膽固醇相對於基線之變化、斑塊動脈粥瘤體積減小、冠狀動脈斑塊減少、動脈粥樣硬化性心血管疾病(ASCVD)減少、心臟血管死亡、非致命性心肌梗塞、缺血性中風、非致命性中風、冠狀動脈血管再形成、不穩定型心絞痛，及視力。
160. 一種套組，其包含如請求項1至127中任一項之系統、如請求項128至132中任一項之LNP、如請求項133至136中任一項之醫藥組合物，或其組合，及合適的容器。
161. 如請求項160之套組，其包含緩衝劑、賦形劑、核酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、脂質體、治療劑、標記、標記顯現試劑、使用說明書，或前述之任何組合。
162. 一種組合物，其包含： a.   如請求項1至127中任一項之系統； b.  如請求項128至132中任一項之LNP；或 c.   如請求項133至136中任一項之醫藥組合物。
163. 如請求項162之組合物，其係用於製造治療有需要個體之 PCSK9相關疾病的藥劑。
164. 如請求項162之組合物，其係用於治療有需要個體之 PCSK9相關疾病。