TW202400652A

TW202400652A - 抗ｂｄｃａ２抗體及其用途

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Publication number: TW202400652A
Application number: TW112119159A
Authority: TW
Inventors: 李曦; 花海清; 朱忠遠
Original assignee: 大陸商映恩生物製藥（蘇州）有限公司
Priority date: 2022-05-25
Filing date: 2023-05-23
Publication date: 2024-01-01
Also published as: CA3256637A1; IL317248A; MX2024014591A; WO2023227033A1; US20250346673A1; JP2025518061A; CN119365488A; EP4534557A1; KR20250017233A; AU2023274754A1

Abstract

本發明提供了與BDCA2特異性結合的抗體或其抗原結合片段和包含其的組成物。還提供了編碼本發明抗體或其抗原結合片段的核酸分子，用於表達本發明抗體或其抗原結合片段的載體和宿主細胞，以及本發明抗體或其抗原結合片段的治療和診斷方法和用途。

Description

抗BDCA2抗體及其用途

本發明關於單株抗體和/或工程化抗體領域，具體地，本發明提供了與BDCA2特異性結合的抗體或其抗原結合片段和包含其的組成物。還提供了編碼本發明抗體或其抗原結合片段的核酸分子，用於表達本發明抗體或其抗原結合片段的載體和宿主細胞，以及本發明抗體或其抗原結合片段的治療和診斷/檢測方法和用途。

隨著醫學研究的深入，已經發現多種疾病與免疫系統的功能失調相關，對於免疫系統的研究有助於進一步瞭解其發病機制並尋求效果更優的治療方案。

免疫系統是由許多細胞類型組成的高度複雜的系統，包括但不限於T細胞、B細胞、自然殺傷細胞、抗原呈遞細胞、樹突狀細胞、單核細胞和巨噬細胞。這些細胞擁有複雜而微妙的系統來控制其相互作用和響應。細胞利用激活和抑制機制以及反饋回路來保持反應的控制，並且盡可能防止不受控制的免疫反應(例如，自身免疫疾病)帶來的負面後果。在與免疫相關的多條信號通路之中，有大量信號分子及其相互作用的參與。

血液樹突細胞抗原2(Blood DC Antigen 2，BDCA2)是一種在人漿細胞樣樹突細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)上表達的C型凝集素(Dzioneketal.,J.Immunol.,165：6037-6046(2000))。BDCA2由在其C端的單個胞外碳水化合物識別域(CRD)(其屬於II類C型凝集素組)、從第45位天冬醯胺殘基至第213位異亮胺酸殘基的跨膜區和在其N端的短胞質尾區(其不含信號基序)組成。BDCA2藉由相關的跨膜銜接子FcεRIγ傳播胞內信號，並誘導B細胞受體(BCR)樣信號傳導級聯。

本發明提供了抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其具有針對人和食蟹猴BDCA2的高親和力和高特異性等優勢。本發明提供的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段可作為獨立的療法或與其它療法/或其他藥劑聯合，用於諸如炎症性病症/疾病的治療。

本文所述的抗BDCA2抗體抑制人漿細胞樣樹突細胞(pDC)產生和/或分泌炎性細胞因子和趨化因子。此外，本文所述的抗BDCA2抗體可以下調pDC的表面上CD32a和/或CD62L的水平。另外，本揭露的抗BDCA2抗體可介導BDCA2從pDC的表面的內吞。此外，本文描述的抗BDCA2抗體可用於藉由ADCC或CDC消耗pDC並且可用於治療或預防免疫病症，例如炎性病症和自身免疫性病症。

在一個方面，本發明提供了一種抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗BDCA2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區：

該重鏈可變區包含：

(I)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(Ⅱ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(Ⅲ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(Ⅳ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(V)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(Ⅵ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、 HCDR2和HCDR3；或

(Ⅶ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：47所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：47所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(Ⅷ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：53所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(Ⅸ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：37所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或

該輕鏈可變區包含：

(I)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅱ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅲ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅳ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(V)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：42所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅵ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅶ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：49所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：49所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅷ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55 和SEQ ID NO：42所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅸ)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方式中，本發明所述抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：

(I)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅱ)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅲ)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2，如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：37所示的HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅳ)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(V)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(Ⅵ)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31所示的HCDR1、SEQ ID NO：46或50所示的HCDR2和SEQ ID NO：47所示的HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34所示的LCDR1、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51所示的LCDR2和SEQ ID NO：49所示的LCDR3；或

(Ⅶ)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：86所示的LCDR1、SEQ ID NO：15所示的LCDR2和SEQ ID NO：16所示的LCDR3。

在一些實施方式中，本發明所述抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區：

(I)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅱ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅲ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅳ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(V)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅵ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅶ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅷ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅸ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

(I)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：87-110中任一項所示的胺基酸序列，或包含與87-110中任一項所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：135-158中任一項所示的胺基酸序列，或包含與135-158中任一項所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅱ)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：111-134中任一項所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：111-134中任一項所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：159-182中任一項所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：159-182中任一項所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(Ⅲ)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：137所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：137所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

(Ⅳ)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：154所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：154所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

(V)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、 97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。

在一些實施方式中，本發明該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：

(I)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：87-110中任一項所示的胺基酸序列，和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：135-158中任一項所示的胺基酸序列；或

(Ⅱ)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：111-134中任一項所示的胺基酸序列，和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：159-182中任一項所示的胺基酸序列；或

(Ⅲ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：137所示的胺基酸序列；

(Ⅳ)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：154所示的胺基酸序列；

(V)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列，和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列。

在一些實施方式中，本發明所述抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。在一些實施方式中，本發明該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體。

在一些實施方式中，本發明所述抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv和sdAb。

在一些實施方式中，本發明所述抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段是任何IgG亞型，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳為 IgG1亞型。

在一些實施方式中，本發明所述抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含以下序列或由其組成：

(I)胺基酸序列如SEQ ID NO：183所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：186所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈；或

(Ⅱ)胺基酸序列如SEQ ID NO：184所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：187所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈；或

(III)胺基酸序列如SEQ ID NO：185所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：188所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈。

(I)胺基酸序列如SEQ ID NO：183所示的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：186所示的輕鏈；或

(Ⅱ)胺基酸序列如SEQ ID NO：184所示的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：187所示的輕鏈；或

(III)胺基酸序列如SEQ ID NO：185所示的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：188所示的輕鏈。

(I)與SEQ ID NO：183所示的胺基酸序列具有1、2或3個胺基酸差異的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：186所示的輕鏈；或

(Ⅱ)與SEQ ID NO：184所示的胺基酸序列具有1、2或3個胺基酸差異的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：187所示的輕鏈；或

(III)與SEQ ID NO：185所示的胺基酸序列具有1、2或3個胺基酸差異的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：188所示的輕鏈。

在一些實施方式中，本發明該抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含以下序列或由其組成：

(I)胺基酸序列如SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：193所示的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：186所示的輕鏈；或

(Ⅱ)胺基酸序列如SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195或SEQ ID NO：196所示的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：187所示的輕鏈。

在一些實施方式中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其為鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、或全人抗體，或其抗原結合片段。

在一些實施方式中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或sdAb。

在一些實施方式中，本發明所述的抗體或其抗原結合片段，其中抗體或其抗原結合片段是任何IgG亞型，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳為IgG1亞型或IgG4亞型。

在另一個方面，本發明提供了一種分離的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其具有以下特性中的一種或多種：

(1)與本發明的任何一種抗BDCA2抗體或其抗原結合片段結合相同或者完全或部分重疊的人BDCA2蛋白的表位；

(2)與本發明的任何一種抗BDCA2抗體或其抗原結合片段競爭結合人BDCA2蛋白的表位。

在一些實施方式中，本發明的抗體或其抗原結合片段，其具有以下特性中的一種或多種：

(1)以高親和力與人/食蟹猴BDCA2蛋白結合，例如，表現出1.0×10^-6M或更低的K_D值、5.0×10^-7M或更低的K_D值、2.5×10^-7M或更低的K_D值、1.0×10^-7M或更低的K_D值、5.0×10^-8M或更低的K_D值、2.5×10^-8M或更低的K_D值、1.0×10^-8M或更低的K_D值、5.0×10^-9M或更低的K_D值、2.5×10^-9M或更低的K_D值、1.0×10^-9M或更低的K_D值、5.0×10^-10M或更低的K_D值、2.5×10^-10M或更低的K_D值、1.0×10^-10M或更低的K_D值、5.0×10^-11M或更低的K_D值或2.5×10^-11M或更低的K_D值；

(2)抑制CpG-A刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα，例如，使得靶細胞的IFNα的產生減少了至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%；

(3)在與BDCA2結合後促進BDCA2從細胞表面的內吞，例如，使得細胞表面至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的BDCA2分子發生內吞。

在一些實施方式中，本發明所述的抗體是單株抗體。

本發明還提供了一種多特異性抗體，包含本文所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和重鏈可變區。

本發明還提供了一種單鏈抗體，包含本文所述抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和重鏈可變區。

本發明還提供了一種免疫綴合物，其包含與治療劑或診斷劑綴合的本文所述抗體或其抗原結合片段，較佳地，治療劑或診斷劑是抗炎藥或免疫抑制劑。

在又一個方面，本發明提供了多核苷酸分子，其編碼本文所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段。

在又一個方面，本發明提供了表達載體，其包含本文所述的多核苷酸分子，較佳地，該載體為真核表達載體。

在又一個方面，本發明提供了宿主細胞，其包含本文所述的多核苷酸分子或本文所述的表達載體，較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳哺乳動物細胞。

在又一個方面，本發明提供了製備本文所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括在適合於該抗體或其抗原結合片段表達的條件下在本文所述的宿主細胞中表達該抗體或其抗原結合片段，並從該宿主細胞回收所表達的抗體或其抗原結合片段。

在又一個方面，本發明提供了醫藥組成物，其包含本文所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，和藥學上可接受的載體或賦形劑。

在又一個方面，本發明提供了藥物組合，其包含如本文所述的抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物，以及一種或多種另外的治療劑。

在又一個方面，本發明提供了一種抑制受試者免疫細胞釋放細胞因子IFNα的方法，該方法包括將本文所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段或醫藥組成物接觸受試者免疫細胞，較佳地，該免疫細胞為CpG-A刺激的PBMC 細胞。

在又一個方面，本發明提供了本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的醫藥組成物或本文所述的藥物組合在製備用於治療和/或預防BDCA2介導的疾病的藥物中的用途，較佳該疾病為炎症性疾病；更佳地，該炎症性疾病選自全身性紅斑狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡性腎炎、表皮性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、炎性腸疾病、全身性硬化症(硬皮病)、銀屑病、I型糖尿病、皮肌炎和多肌炎。

在又一個方面，本發明提供了本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的醫藥組成物或本文所述的藥物組合，其用於治療和/或預防BDCA2介導的疾病，較佳該疾病為炎症性疾病；更佳地，該炎症性疾病選自全身性紅斑狼瘡、盤狀狼瘡、表皮性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、類風濕性關節炎、炎性腸疾病、全身性硬化症(硬皮病)、銀屑病、I型糖尿病、皮肌炎和多肌炎。

在又一個方面，本發明提供了一種治療和/或預防BDCA2介導的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受試者施用治療或預防有效量的本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的醫藥組成物或本文所述的藥物組合，較佳該疾病為炎症性疾病；更佳地，該炎症性疾病選自全身性紅斑狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡性腎炎、表皮性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、炎性腸疾病、全身性硬化症(硬皮病)、銀屑病、I型糖尿病、皮肌炎和多肌炎。

在又一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其包括本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的醫藥組成物或本文所述的藥物組合，較佳其進一步包括給藥裝置。

在又一個方面，本發明提供了一種使用本文所述的抗體或其抗原結合片段或含有該抗體或其抗原結合片段的檢測組成物檢測BDCA2在樣品中的存在的方法。

圖1所示為FACS法檢測融合瘤抗體與表達人BDCA2分子的人CHOK1-hBDCA2穩定轉染細胞結合測定的結果。小圖a至e分別涉及來自不同融合瘤的抗體，如圖例所標註。

圖2所示為FACS法檢測融合瘤抗體與表達食蟹猴BDCA2分子的293F-cynoBDCA2穩定轉染細胞結合。測定的結果。小圖a至e分別涉及來自不同融合瘤的抗體，如圖例所標註。

圖3所示為FACS法檢測抗BDCA2嵌合抗體與人CHOK1-hBDCA2細胞結合測定的結果。小圖a-c分別涉及來自不同的嵌合抗體，如圖例所標註。

圖4所示為人源化抗體內吞能力檢測。小圖a為hu005組人源化抗體以100nM濃度進行測定的結果。小圖b為hu005組人源化抗體以10nM濃度進行測定的結果。小圖c為hu033組人源化抗體以100nM濃度進行測定的結果。小圖d為hu033組人源化抗體以10nM濃度進行測定的結果。

圖5所示為FACS法檢測Fc改造後抗體與細胞結合能力。小圖a為與CHOK1-Human hBDCA2細胞結合測定的結果。小圖b為與293-Cyno BDCA2細胞結合測定的結果。

圖6所示為FACS檢測Fc改造後人源化抗體內吞能力。小圖a為人源化抗體以100nM濃度進行測定的MFI結果。小圖b為人源化抗體以10nM 濃度進行測定的MFI結果。小圖c為人源化抗體以1nM濃度進行測定的MFI結果。小圖d為人源化抗體以100nM濃度進行測定的表面信號百分比。小圖e為人源化抗體以10nM濃度進行測定的表面信號百分比。小圖f為人源化抗體以1nM濃度進行測定的表面信號百分比。

圖7所示為Fc改造後人源化抗體對SLE-IC引起的PBMC分泌IFNa抑制作用。

定義

除非另有說明，本發明的實施將採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的常規技術，這些都在本領域的技術範圍內。

為了可以更容易地理解本發明，某些科技術語具體定義如下。除非本文其它部分另有明確定義，否則本文所用的科技術語或表述都具有本發明所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。關於本領域的定義及術語，專業人員至少部分地可以具體參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。胺基酸殘基的縮寫遵循本領域中所用的指代20個常用L-胺基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。本文(包括申請專利範圍)所用單數形式包括其相應的複數形式，除非文中另有明確規定。

術語“約”在與數字數值聯合使用時意為涵蓋具有比指定數字數值小5%的下限和比指定數字數值大5%的上限的範圍內的數字數值，包括但不限於±5%、±2%、±1%和±0.1%，因為這些變化適於進行所揭露的方法。

術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項中的任意兩項或更多項的組合。

如本文所用，術語“或”應被理解為與如上定義的“和/或”具有相同的含義。例如，當分離列表中的項目時，“或”或“和/或”應被解釋為包容性的，即，包括數量或元素列表中的至少一個，但也包括多於一個，以及視需要地，額外的未列出的項目。只有明確指出相反的術語下，例如“只有一個”或“的確一個”或者在申請專利範圍中使用“由．．．組成”時，將指的是僅列出的一個數字或列表的一個元素。

除非上下文明確指出相反的情況，否則如本文所用，詞“一”和“一個”應理解為“至少一個”。

本文中的術語“BDCA2”是在pDC上特異性表達的II型C-型凝集素BDCA2，由C-端的單個胞外糖類識別域(CRD)、從第45位天冬醯胺殘基至第213位異亮胺酸殘基的跨膜區和N-端短的胞質尾區(不具有信號基序)組成。BDCA2藉由相關的跨膜銜接子FcεRIγ發送胞內信號。抗體介導的BDCA2的結合導致脾酪胺酸激酶(SYK)募集到FcεRIγ的基於磷酸化免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAM)。Syk的活化導致B細胞連接體(BLNK)，Bruton酪胺酸激酶(BTK)和磷脂酶Cγ2(PLCγ2)的激活，從而導致Ca²⁺的流動。

術語“BDCA2”包括人BDCA2的變體、亞型、物種同源物或其他物種的BDCA2和具有BDCA2的至少一個共同表位的類似物，除非另有說明。該術語包括未處理的全長BDCA2以及由於在細胞中處理而產生的任何形式的BDCA2。該術語涵蓋“全長”未加工的BDCA2以及由細胞內加工產生的任何形式的BDCA2或其任何片段，例如剪接變體或等位基因變體。在一個實施方式中， BDCA2是指來自人或食蟹猴BDCA2全長或其片段(諸如其缺乏信號肽的成熟片段)。

術語“免疫應答”是指由例如淋巴細胞、抗原呈遞細胞、吞噬細胞、粒細胞和由上述細胞或肝產生可溶性大分子(包括抗體、細胞因子和補體)的作用，該作用導致從人體選擇性損害、破壞或清除侵入的病原體、感染病原體的細胞或組織、癌細胞或者在自體免疫或病理性炎症的情況下的正常人細胞或組織。

術語“人漿細胞樣樹突細胞(pDC)”是一種響應toll樣受體(TLR)配體而分泌I型干擾素(IFN)的骨髓衍生細胞的特化群體。pDC是細胞免疫的關鍵環節，涉及免疫應答和抗原耐受的誘導和啟動。pDC與普通DC不同，例如它們藉由受體介導的內吞作用獲取抗原等等。藉由模式識別受體激活的pDC產生的I型干擾素，還可以呈遞抗原，從而將固有免疫應答和獲得性免疫應答相關聯。與此同時，pDC的過度激活也可能對兌免疫應答過程產生負面影響，例如可能導致自身免疫病。

術語“信號轉導途徑”或“信號轉導活性”是指通常由蛋白質間相互作用諸如生長因子對受體的結合啟動的生化因果關係，該關係導致信號從細胞的一部分傳遞至細胞的另一部分。一般地，傳遞包括引起信號轉導的系列反應中的一種或多種蛋白質上的一個或多個酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸殘基的特定磷酸化。倒數第二過程通常包括細胞核事件，從而導致基因表達的變化。

術語“活性”或“生物活性”，或術語“生物性質”或“生物特徵”此處可互換使用，包括但不限於表位/抗原親和力和特異性、在體內或體外中和或拮抗BDCA2活性的能力、IC₅₀、抗體的體內穩定性和抗體的免疫原性質。本領域公知的抗體的其它可鑑定的生物學性質或特徵包括，例如，交叉反應性(即通常與靶定肽的非人同源物，或與其它蛋白質或組織的交叉反應性)，和保持哺乳動物細胞中蛋白質高表達水平的能力。使用本領域公知的技術觀察、測定或評估前面提及的性質或特徵，該技術包括但不局限於ELISA、FACS或BIACORE等離子體共振分析、不受限制的體外或體內中和測定、受體結合、細胞因子或生長因子的產生和/或分泌、信號轉導和不同來源(包括人類、靈長類或任何其它來源)的組織切片的免疫組織化學。

術語“抗體”是指具有所需生物活性的任何形式的抗體。因此，其以最廣義使用，具體包括但不限於單株抗體(包括全長單株抗體)、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、人源化抗體、全人抗體、嵌合抗體和駱駝源化單結構域抗體。

術語“分離的抗體”是指結合化合物的純化狀態，且在這種情況下意指該分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白質、脂質、糖或其它物質例如細胞碎片和生長培養基。術語“分離(的)”並非意指完全不存在這類物質或不存在水、緩衝液或鹽，除非它們以明顯干擾本文所述結合化合物的實驗或治療應用的量存在。

術語“單株抗體”是指獲自基本均質抗體群的抗體，即組成該群的各個抗體除可少量存在的可能天然存在的突變之外是相同的。單株抗體是高度特異性的，針對單一抗原表位。相比之下，常規(多株)抗體製備物通常包括大量針對不同表位(或對不同表位有特異性)的抗體。修飾語“單株”表明獲自基本均質抗體群的抗體的特徵，且不得解釋為需要藉由任何特定方法產生抗體。

術語“全長抗體”，是指在天然存在時包含至少四條肽鏈的免疫球蛋白分子：兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈藉由二硫鍵互相連接。每一條重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區(在本文中縮寫為CH)組成。重鏈恆定區由3個結構域CH1、CH2和CH3組成。每一條輕鏈由輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區組成。輕鏈恆定區由一個結構域CL組成。VH和VL區可被進一步細分為具有高可變性的互補決定區(CDR)和其間隔以更保守的稱為框架區(FR)的區域。每一個VH或VL區由按下列順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從胺基末端至羧基末端排列的3個CDR和4個FR組成。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恆定區可介導免疫球蛋白對宿主組織或因子(包括免疫系統的各種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq))的結合。

術語抗體(“親代抗體”)的“抗原結合片段”包括抗體的片段或衍生物，通常包括親代抗體的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)的至少一個片段，其保持親代抗體的至少一些結合特異性。抗體的結合片段的實例包括但不限於本領域所熟知的Fab，Fab'，F(ab)₂和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；由抗體片段形成的奈米抗體(nanobody)和多特異性抗體。在本發明的一些較佳實施方案中，本發明的抗原結合片段選自Fab，Fab'，F(ab')₂和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；由抗體片段形成的奈米抗體(nanobody)和多特異性抗體。當抗原的結合活性在莫耳濃度基礎上表示時，結合片段或衍生物通常保持其抗原結合活性的至少10%。較佳結合片段或衍生物保持親代抗體的抗原結合親和力的至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更高。還預期抗體的抗原結合片段可包括不明顯改變其生物活性的保守或非保守胺基酸取代(稱為抗體的“保守變體”或“功能保守變體”)。術語“結合化合物”是指抗體及其結合片段兩者。

術語“單鏈Fv”或“scFv”抗體是指包含抗體的VH和VL結構域的抗體片段，其中這些結構域存在於單條多肽鏈中。Fv多肽一般還包含VH和VL結構域之間的多肽接頭，其使scFv能夠形成用於抗原結合的所需結構。

術語“結構域抗體”是只含有重鏈可變區或輕鏈可變區的免疫功能性免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或更多個VH區與肽接頭共價連接形成二價結構域抗體。二價結構域抗體的2個VH區可靶向相同或不同的抗原。

術語“二價抗體”包含2個抗原結合部位。在某些情況下，2個結合部位具有相同的抗原特異性。然而，二價抗體可以是雙特異性的。

術語“雙抗體”是指具有兩個抗原結合部位的小抗體片段，該片段包含在同一多肽鏈(VH-VL或VL-VH)中與輕鏈可變結構域(VL)連接的重鏈可變結構域(VH)。藉由使用短得不允許在同一鏈的兩個結構域之間配對的接頭，迫使該結構域與另一鏈的互補結構域配對並產生兩個抗原結合部位。

術語“鼠源抗體”或“融合瘤抗體”在本揭露中為根據本領域知識和技能製備的抗BDCA2的單株抗體。製備時用BDCA2抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。融合瘤技術是藉由融合兩種細胞，並且同時還保持兩者的主要特徵。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細胞(B淋巴細胞)的主要特徵是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續培養，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即具有所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才能具有持續培養的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特徵的細胞株。在一些實施方案中，本發明藉由使用BDCA2蛋白免疫小鼠，再獲取小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞融合，獲得能夠表達陽性抗體的融合瘤細胞。

術語“嵌合抗體”是具有第一抗體的可變結構域和第二抗體的恆定結構域的抗體，其中第一抗體和第二抗體來自不同物種。通常，可變結構域獲自齧齒動物等的抗體(“親代抗體”)，而恆定結構域序列獲自人抗體，使得與親代齧齒動物抗體相比，所得嵌合抗體在人受試者中誘導不良免疫應答的可能性較低。在本發明的一些實施方案中，該齧齒動物是小鼠或大鼠。在本發明的一些較佳的實施方案中，嵌合抗體對抗原的親和力不低於或幾乎不低於親本鼠抗體。

術語“人源化抗體”是指含有來自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗體的序列的抗體形式。一般而言，人源化抗體包含基本所有的至少一個、通常兩個可變結構域，其中所有或基本所有的超變環相當於非人免疫球蛋白的超變環，而所有或基本所有的構架(FR)區是人免疫球蛋白序列的構架區。人源化抗體視需要可包含至少一部分的人免疫球蛋白恆定區(Fc)。

術語“全人抗體”是指只包含人免疫球蛋白蛋白質序列的抗體。如在小鼠中、在小鼠細胞中或在來源於小鼠細胞的融合瘤中產生，則全人抗體可含有鼠糖鏈。同樣，“小鼠抗體”是指僅包含小鼠免疫球蛋白序列的抗體。或者，如果在大鼠中、在大鼠細胞中或在來源於大鼠細胞的融合瘤中產生，則全人抗體可含有大鼠糖鏈。同樣，“大鼠抗體”是指僅包含大鼠免疫球蛋白序列的抗體。

“同種型”抗體是指由重鏈恆定區基因提供的抗體種類(例如，IgM、IgE、IgG諸如IgG1、IgG2或IgG4)。同種型還包括這些種類之一的修飾形式，其中修飾已被產生來改變Fc功能，例如以增強或減弱效應子功能或對Fc受體的結合。

本文術語“Fc區”用於定義包含至少一部分恆定區的免疫球蛋白重鏈的C端區域。該術語包括天然序列Fc區和變異Fc區。在一些實施方案中，人IgG重鏈Fc區從Cys226或Pro230延伸至重鏈的羧基末端。但是，Fc區的C端賴胺酸(Lys447)可能存在或不存在(此段中的編號是根據EU編號系統，也稱為EU索引，如Rabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991)。

術語“表位”指能夠與抗體特異性結合的蛋白質決定簇。表位通常由各種化學活性表面分子諸如胺基酸或糖側鏈組成，並且通常具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。構象性表位和非構象性表位的區別在於在變性溶劑存在下，與前者而非與後者的結合喪失。

本文中所描述的術語“交叉反應”指的是對人類、猴、和/或鼠源(小鼠或大鼠)相同靶分子的抗原片段的結合。因此，“交叉反應”應被理解為抗原結合分子(例如，抗體)與在不同物種中表達的同類分子(例如，BDCA2)的種屬間反應。識別人BDCA2、猴、和/或鼠BDCA2(小鼠或大鼠)的單株抗體的交叉反應特異性可藉由FACS分析確定。

“親和力”或“結合親和力”指反映結合對子的成員之間相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶物Y的親和力可以通常由平衡解離常數(K_D)代表，平衡解離常數是解離速率常數和結合速率常數(分別是k_dis和k_on)的比值。親和力可以由本領域已知的常見方法測量。在本發明的一些實施方案中，利用表面電漿共振(SPR)技術測量親和力，例如本發明的抗體與抗原之間的親和力。在本發明的一些較佳的實施方案中，用於測量親和力的一個具體方法是本文中的BIAcore法。

術語“不結合”蛋白或細胞是指，不與蛋白或細胞結合，或者不以高親和力與其結合，即結合蛋白或細胞的K_D為1.0×10^-6M或更高，更佳1.0×10^-5M或更高，更佳1.0×10^-4M或更高、1.0×10^-3M或更高，更佳1.0×10^-2M或更高。

術語“高親和性”對於IgG抗體而言，是指對於抗原的K_D為1.0×10^-6M或更低，較佳5.0×10^-8M或更低，更佳1.0×10^-8M或更低、5.0×10^-9M或更低，更佳1.0×10^-9M或更低。對於其他抗體亞型，“高親和性”結合可能會變化。例如，IgM亞型的“高親和性”結合是指K_D為10^-6M或更低，較佳10^-7M或更低，更佳10^-8M或更低。

術語“抗體依賴的細胞毒性”、“抗體依賴的細胞介導的細胞毒性”或“ADCC”是指細胞介導的免疫防禦，其中免疫系統效應細胞主動地將細胞膜表面抗原與抗體結合的靶細胞裂解。

術語“補體依賴的細胞毒性”或“CDC”是指IgG和IgM抗體的效應功能，當與表面抗原結合時引發典型的補體途徑，包括形成膜攻擊複合體以及靶細胞裂解。。

術語“核酸”、“多核苷酸”、“核酸分子”以及“多核苷酸分子”在本文中可互換地使用(除非上下文另有指明)，並且是指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈單鏈或雙鏈形式的聚合物。除非明確地限制，否則術語包括具有與參照核酸相似的結合性質並且以與天然存在的核苷酸相似的方式被代謝的含有已知的天然核苷酸的類似物的核酸(參見，屬於Kariko等人的美國專利No.8,278,036，其揭露了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成該mRNA分子的方法以及用於在體內遞送治療性蛋白的方法)。除非另有所指，否則特定核酸序列還隱含地包括其保守修飾的變體(例如，簡併密碼子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互補序列以及明確指出的序列。具體地，簡併密碼子取代可藉由生成其中一個或多個選擇的(或全部)密碼子的第三位被混合鹼基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

“構建體”是指任何重組多核苷酸分子(諸如質粒、黏粒、病毒、自主複製多核苷酸分子、噬菌體或線性或環狀單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子)，其可衍生自任何來源，能夠與基因組整合或自主複製，其中包含已經以功能操作的方式連接(即，可操作地連接)的一或多個多核苷酸分子。在本發明的一些較佳的實施方案中，重組構建體包含可操作地連接至轉錄起始調節序列的本發明的多核苷酸，這些序列會驅動和/或導引本發明的多核苷酸在宿主細胞中的轉錄。可使用異源及非異源(即，內源)啟動子兩者驅動和/或導引本發明的多核苷酸的表達。

“載體”是指任何重組多核苷酸構建體，該構建體可用於轉化的目的(即將異源DNA引入到宿主細胞中)。一種類型的載體為“質粒”，是指環狀雙鏈DNA環，可將額外DNA區段連接至該環中。另一類型的載體為病毒載體，其中可將額外DNA區段連接至病毒基因組中。某些載體能夠在被引入到的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體及游離型哺乳動物載體)。在引入到宿主細胞中後，其他載體(例如，非游離型哺乳動物載體)整合至宿主細胞的基因組中，且因此與宿主基因組一起複製。此外，某些載體能夠導引被操作性連接的基因的表達。本文將此類載體稱為“表達載體”。

本文所用術語“表達載體”是指能夠在轉化、轉染或轉導至宿主細胞中時複製及表達目的基因的核酸分子。表達載體包含一或多個表型選擇標記及複製起點，以確保維護載體及以在需要的情況下於宿主內提供擴增。在本發明的一些較佳的實施方案中，本發明的表達載體包含本發明的構建體和/或本發明的多核苷酸。

用於細胞或受體的操作“活化”、“刺激”和“處理”可具有相同含義，例如細胞或受體用配體活化、刺激或處理，除非上下文另外或明確規定。“配體”包括天然和合成配體，例如細胞因子、細胞因子變體、類似物、突變蛋白和來源於抗體的結合化合物。“配體”還包括小分子，例如細胞因子的肽模擬物和抗體的肽模擬物。“活化”可指藉由內部機制以及外部或環境因素調節的細胞活化。“應答/反應”，例如細胞、組織、器官或生物體的應答，包括生化或生理行為(例如生物區室內的濃度、密度、黏附或遷移、基因表達速率或分化狀態)的改變，其中改變與活化、刺激或處理有關，或者與例如遺傳編程等內部機制有關。

如本文中所用，術語“BDCA2介導的疾病”是指在起病、進展或遷延等過程中有BDCA2的參與的疾病，例如涉及BDCA2的激活(例如，異常激活或過度激活)，並且BDCA2的參與直接或間接產生了如下影響中的至少一種：疾病起始/發生；疾病的病理改變增加/加深；疾病影響的部位/範圍擴大；疾病帶來的機體損傷加重；疾病產生的痛苦增加；疾病對治療措施不敏感/抵抗；疾病的自愈傾向下降和疾病的預後變差。在本發明的一些實施方案中，BDCA2介導的疾病是炎症性疾病；在本發明的一些具體的實施方案中，該BDCA2介導的疾病是全身性紅斑狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡性腎炎、表皮性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、炎性腸疾病、全身性硬化症(硬皮病)、銀屑病、I型糖尿病、皮肌炎和/或多肌炎。

如本文中所用，術語任何疾病或病症的“治療”或“醫治”在一個實施方式中是指改善疾病或病症(即，減緩或阻止或減少疾病的進展或其臨床症狀的至少一個)。在另一個實施方式中，“治療”或“醫治”是指緩解或改善至少一個身體參數，包括可能不能被患者辨別出的那些物理參數。在另一個實施方式中，“治療”或“醫治”是指在身體上(例如，可辨別的症狀的穩定)、生理上(例如，身體參數的穩定)或在這兩方面調節疾病或病症。除非在本文中明確描述，否則用於評估疾病的治療和/或預防的方法在本領域中通常是已知的。

“受試者”包括任何人或非人動物。術語“非人動物”包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人靈長類動物、綿羊、狗、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。如本文中所用，術語“cyno”或“食蟹猴”是指食蟹猴或源自食蟹猴的。

“聯合”一種或多種其它治療劑的施用包括同時(共同)施用和任意次序的連續施用。

“治療有效量”、“治療有效劑量”和“有效量”是指本發明的BDCA2抗體或其抗原結合片段當單獨或與其它治療藥物組合給予細胞、組織或受試者時，有效預防或改善一種或多種疾病或病況的症狀或該疾病或病況的發展的量。治療有效劑量還指足以導致症狀改善的抗體或其抗原結合片段的量，例如治療、治癒、預防或改善相關醫學病況或者提高這類病況的治療、治癒、預防或改善的速度的量。當對個體施用單獨給予的活性成分時，治療有效劑量僅是指該成分。當組合施用時，治療有效劑量是指引起治療效果的活性成分的綜合量，不論是組合、依次給予還是同時給予。治療劑的有效量將導致診斷標準或參數提高至少10%，通常至少20%，較佳至少約30%，更佳至少40%，最佳至少50%。

“藥學上可接受的載體”是指藥物製劑或組成物中除活性成分以外的對受試者無毒的成分。藥學上可接受的載體包括但不限於緩衝劑，賦形劑，穩定劑或防腐劑。

抗BDCA2抗體

在一個方面，本發明提供了特異性結合BDCA2的抗體或其抗原結合片段。術語“抗BDCA2抗體”、“抗BDCA2”、“BDCA2抗體”或“結合BDCA2的抗體”是指能夠以足夠的親合力結合BDCA2蛋白或其片段以致該抗體可以用作靶向BDCA2的診斷劑和/或治療劑。

在一些實施方案中，本發明抗體結合人或食蟹猴BDCA2蛋白。在一些實施方案中，本發明抗體結合CHOK1-humanBDCA2細胞或293F-cynoBDCA2細胞。在一些實施方案中，本發明抗體抑制CpG-A刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα。在一些實施方案中，本發明抗體具有較強的內吞能力。

可採用用於產生抗體的任何合適方法來產生本發明的抗體。任何合適形式的BDCA2都可用作產生抗體的免疫原(抗原)。藉由舉例而非限制，任何BDCA2變體或其片段都可用作免疫原。在一些實施方式中，產生鼠源的單株抗BDCA2抗體的融合瘤細胞可藉由本領域公知的方法產生。

來源於齧齒動物(如小鼠)的抗體在體內用作治療藥物時可能引起不需要的抗體免疫原性，重複使用導致人體產生針對治療性抗體的免疫應答，這類免疫應答至少導致喪失治療功效，而嚴重的則導致潛在致死過敏反應。降低齧齒動物抗體的免疫原性的一種方法包括嵌合抗體的產生，其中將小鼠可變區與人恆定區融合(Liu等(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3439-43)。然而，嵌合抗體中的完整齧齒動物可變區的保留仍可能在患者中引起有害的免疫原性。將齧齒動物可變結構域的互補決定區(CDR)環移植到人構架上(即人源化)已被用於進一步將齧齒動物序列減至最低(Jones等(1986)Nature 321：522；Verhoeyen等(1988)Science 239：1534)。在一些實施方案中，本發明的抗體是嵌合抗體。在一些較佳的實施方案中，本發明的抗體是人源化抗體。在本發明的一些較佳的實施方案中，本發明的鼠源抗體、嵌合抗體和/或人源抗體與抗原人BDCA2或食蟹猴BDCA2的親和力體現為1.0×10^-6M或更低的K_D值、5.0×10^-7M或更低的K_D值、2.5×10^-7M或更低的K_D值、1.0×10^-7M或更低的K_D值、5.0×10^-8M或更低的K_D值、2.5×10^-8M或更低的K_D值、1.0×10^-8M或更低的K_D值、5.0×10^-9M或更低的K_D值、2.5×10^-9M或更低的K_D值、1.0×10^-9M或更低的K_D值、5.0×10^-10M或更低的K_D值、2.5×10^-10M或更低的K_D值、1.0×10^-10M或更低的K_D值。

本發明抗BDCA2鼠源抗體的輕鏈和重鏈可變區及CDR的胺基酸序列如表2所示。

在一些實施方式中，本發明的嵌合或人源化抗體可基於該製備的鼠單株融合瘤抗體的序列來製備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可以從目標鼠融合瘤中獲得，並且使用標準分子生物學技術進行工程改造以包含非鼠(例如人)免疫球蛋白序列。

在一些實施方式中，本發明所述的嵌合BDCA2抗體，可使用本領域已知的方法將融合瘤來源的免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區與人IgG恆定區有效連接(參見例如屬Cabilly等人的美國專利No.4,816,567)，獲得嵌合型重鏈和嵌合型輕鏈來製備。在一些實施方式中，本發明的嵌合抗體包含的恆定區可選自任何人IgG亞型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，較佳IgG1。

在一些實施方式中，本發明的嵌合BDCA2抗體可由嵌合型輕鏈與嵌合型重鏈表達質粒“混合和匹配”轉染表達細胞獲得，此類“混合和匹配”的抗體的BDCA2結合可使用上述結合測定和其它常規結合測定(例如，ELISA)來進行測試。

本發明所述抗體的可變區CDR的精確胺基酸序列邊界可使用許多公知的方案的任何方案來確定，包括基於抗體的三維結構和CDR環的拓撲學的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342：877-883；Al-Lazikani等人，“Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997))、基於抗體序列可變性的Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第4版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987))，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，國際ImMunoGeneTics database(IMGT)(1999 Nucleic Acids Research,27,209-212)，以及基於利用大量晶體結構的近鄰傳播聚類(affinity propagation clustering)的North CDR定義。

除非另有說明，否則本發明抗體的CDR可以由所屬技術領域具有通常知識者根據本領域的任何方案(例如不同的指派系統或組合)確定邊界。

應該注意，基於不同的指派系統獲得的同一抗體的可變區的CDR的邊界可能有所差異。即不同指派系統下定義的同一抗體可變區的CDR序列有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，該抗體的範圍還涵蓋了這樣的抗體，其可變區序列包含所述的具體CDR序列，但是由於應用了不同的方案(例如不同的指派系統或組合)而導致其所聲稱的CDR邊界與本發明所定義的具體CDR邊界不同。

具有不同特異性(即，針對不同抗原的不同結合位點)的抗體具有不同的CDR。然而，儘管CDR在抗體與抗體之間是不同的，但是CDR內只有有限數量的胺基酸位置直接參與抗原結合。使用Kabat、Chothia、AbM、Contact和North方法中的至少兩種，可以確定最小重疊區域，從而提供用於抗原結合的“最小結合單位”。最小結合單位可以是CDR的一個子部分。正如所屬技術領域具有通常知識者明瞭，藉由抗體的結構和蛋白折疊，可以確定CDR序列其餘部分的殘基。因此，本發明也考慮本文所給出的任何CDR的變體。例如，在一個CDR的變體中，最小結合單位的胺基酸殘基可以保持不變，而根據Kabat或Chothia定義的其餘CDR殘基可以被保守胺基酸殘基替代。

本發明將各種嵌合型重鏈和輕鏈表達質粒混合配對轉染表達細胞，其抗BDCA2嵌合抗體。

本發明所述的人源化抗體，可以使用本領域已知的方法將鼠源CDR區插入人種系框架區。參見Winter等人的美國專利No.5,225,539及Queen等人的美國專利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370。

本發明抗BDCA2人源化抗體Hu033-03、Hu033-20和Hu005-04的輕鏈和重鏈胺基酸序列如下所示。其餘人源化抗體LC和HC的可變區外的序列與Hu033-03、Hu033-20和Hu005-04的相應序列相同。

Hu033-03-HC-IgG1：SEQ ID NO：183(HCDR1-HCDR3分別為SEQ ID NO：52、39和53)

Hu033-03-LC：SEQ ID NO：186(LCDR1-LCDR3分別為SEQ ID NO：54、55和42)

Hu033-20-HC-IgG1：SEQ ID NO：184(HCDR1-HCDR3分別為SEQ ID NO：52、39和53)

Hu033-20-LC：SEQ ID NO：187(LCDR1-LCDR3分別為SEQ ID NO：54、55和42)

Hu005-04-HC-IgG1：SEQ ID NO：185(HCDR1-HCDR3分別為SEQ ID NO：11、12和13)

Hu005-04-LC：SEQ ID NO：188(LCDR1-LCDR3分別為SEQ ID NO：86、15和16)

在一些實施方式中，胺基酸變化包括胺基酸缺失、插入或置換。在一些實施方式中，本發明的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段包括具有已藉由胺基酸缺失、插入或置換突變的，但仍與上述抗體(特別地在上述序列中描繪的CDR區中)有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的胺基酸序列的那些抗體。在一些實施方式中，本發明的抗體與具體序列中描繪的CDR區相比較時，在CDR區中已藉由胺基酸缺失、插入或置換的胺基酸突變不超過1、2、3、4或5個。在一些實施方式中，本發明的抗體與具體序列中框架區相比較時，在框架區中已藉由胺基酸缺失、插入或置換的胺基酸突變不超過1、2、3、4或5個。

在一些實施方式中，本發明人源化抗體Hu033-03和Hu033-20的Fc區進行突變，包括S239D/I332E、G236A/S239D/I332E和G236A/I332E，產生以下抗體：Hu033-03-T1、Hu033-03-T2、Hu033-03-T3、Hu033-20-T1、Hu033-20-T2、Hu033-20-T3，其輕鏈和重鏈胺基酸序列如下所示：

Hu033-03-T1-HC：SEQ ID NO：191

Hu033-03-T2-HC：SEQ ID NO：192

Hu033-03-T3-HC：SEQ ID NO：193

Hu033-03-T1/T2/T3-LC：SEQ ID NO：186

Hu033-20-T1-HC：SEQ ID NO：194

Hu033-20-T2-HC：SEQ ID NO：195

Hu033-20-T3-HC：SEQ ID NO：196

Hu033-20-T1/T2/T3-LC：SEQ ID NO：187

術語“百分比(%)胺基酸序列同一性”或簡稱“同一性”定義為在將胺基酸序列進行比對(並在必要時導入空位)以獲取最大百分比序列同一性，且不將任何保守取代視為序列同一性的部分之後，候選胺基酸序列中的胺基酸殘基與參比胺基酸序列中的相同胺基酸殘基的百分比。可使用本領域各種方法進行序列比對以便測定百分比胺基酸序列同一性，例如，使用公眾可得到的計算機軟件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)軟件。所屬技術領域具有通常知識者可以決定測量比對的適宜參數，包括對所比較的序列全長獲得最大比對所需的任何算法。

因此，在一些實施方案中，本發明的抗體包含如下表A任一組合所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。

表A

在一些實施方案中，本發明的抗體包含如下表B任一組合所示的VH和VL。

表B

在一些實施方案中，本發明的抗體包含如下表C任一組合所示的VH和VL。

表C

在一些實施方案中，BDCA2抗體是IgG抗體，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體或其修飾形式，如以下部分所述。

在一些實施方式中，可在本文中所提供抗體的Fc區中引入一個或多個胺基酸修飾，以此產生Fc區變體。Fc區變體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如置換)的人Fc區序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc區)。

在一些實施方式中，可能需要產生經半胱胺酸工程改造的抗體，例如“硫代MAb”，其中抗體的一或多個殘基經半胱胺酸殘基置換。

在一些實施方式中，本文中所提供的抗體可進一步經修飾為含有本領域中已知且輕易獲得的其他非蛋白質部分。適合抗體衍生作用的部分包括，但不限於，水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性實例包括，但不限於，聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二烷、聚-1,3,6-三烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、及其混合物。

抗體表達

在又一個方面，本發明提供了一種多核苷酸分子，其編碼本文所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段。該多核苷酸分子可以包含編碼抗體的輕鏈可變區和/或重鏈可變區的胺基酸序列的多核苷酸分子，或包含編碼抗體的輕鏈和/或重鏈的胺基酸序列的多核苷酸分子。

在一些實施方式中，編碼本發明抗體的多核苷酸分子包括已藉由核苷酸缺失、插入或置換突變的，但仍然與上文中所述的序列中描繪的CDR對應編碼區具有至少約60、70、80、90、95或100%同一性的多核苷酸分子。

在又一個方面，本發明提供了一種表達載體，其包含如本文所述的多核苷酸分子，較佳地，該載體為真核表達載體。在一些實施方式中，如本文所述的多核苷酸分子包含在一個或多個表達載體中。

在又一個方面，本發明提供了一種宿主細胞，其包含如本文所述的多核苷酸分子或如本文所述的表達載體，較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳哺乳動物細胞。

在又一個方面，本發明提供了一種用於製備如本文所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括在適合於該抗體或其抗原結合片段表達的條件下在本文所述的宿主細胞中表達該抗體或其抗原結合片段，並從該宿主細胞回收所表達的抗體或其抗原結合片段。

本發明提供用於表達本發明的重組抗體的哺乳動物宿主細胞，包括可獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC)的許多永生化細胞系。這些尤其包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0、SP2/0細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人肝細胞癌細胞、A549細胞、293T細胞和許多其它細胞系。哺乳動物宿主細胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、豬、山羊、牛、馬和倉鼠細胞。藉由測定哪種細胞系具有高表達水平來選擇特別較佳的細胞系。

在一個實施方式中，本發明提供製備抗BDCA2抗體的方法，其中該方法包括，將表達載體導入哺乳動物宿主細胞中時，藉由將宿主細胞培養足夠的一段時間，以允許抗體在宿主細胞中表達，或者更佳抗體分泌到宿主細胞生長的培養基中，來產生抗體。

可採用標準蛋白質純化方法從培養基中回收抗體。如本文所述製備的抗體分子可以藉由已知的現有技術如高效液相色譜、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、大小排阻層析等純化。用來純化特定蛋白質的實際條件還取決於淨電荷、疏水性、親水性等因素，並且這些對所屬技術領域具有通常知識者是顯而易見的。可以藉由多種熟知分析方法中的任一種方法確定本發明的抗體分子的純度，該熟知分析方法包括尺寸排阻層析、凝膠電泳、高效液相色譜等。

很可能由不同細胞系表達或在轉基因動物中表達的抗體彼此具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸分子編碼的或包含本文提供的胺基酸序列的所有抗體是本發明的組成部分，而不論抗體的糖基化如何。同樣，在某些實施方式中，非岩藻糖基化抗體是有利的，因為它們通常在體外和體內具有比其岩藻糖基化對應物更強力的功效，並且不可能是免疫原性的，因為它們的糖結構是天然人血清IgG的正常組分。

醫藥組成物和藥物製劑

在又一個方面，本發明提供了一種醫藥組成物，其包含如本文所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表達載體或本文所述的宿主細胞，和藥學上可接受的載體或賦形劑。應理解，本發明提供的抗BDCA2抗體或其醫藥組成物可以整合製劑中合適的運載體、賦形劑和其他試劑以聯合給藥，從而提供改善的轉移、遞送、耐受等。

術語“醫藥組成物”指這樣的製劑，其允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不包含對施用該製劑的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。

可以藉由將具有所需純度的本發明的抗BDCA2抗體與一種或多種視需要的藥用輔料(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))混合來製備包含本文所述的抗BDCA2抗體的藥物製劑，較佳地以水溶液或凍乾製劑的形式。

本發明的醫藥組成物或製劑還可以包含一種或多種其它活性成分，該活性成分是被治療的特定適應症所需的，較佳具有不會不利地影響彼此的互補活性的那些活性成分。在一些實施方式中，其它的活性成分為免疫檢查點抑制劑、生長抑制劑，該活性成分以對於目的用途有效的量合適地組合存在。在一些實施方式中，本發明的醫藥組成物還包含編碼抗BDCA2抗體的多核苷酸分子的組成物。

在又一個方面，本發明提供了一種藥物組合，其包含本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表達載體、本文所述的宿主細胞、或本文所述的醫藥組成物，以及一種或多種另外的治療劑。

在又一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其包括本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的多核苷酸分子、本文所述的表達載體、本文所述的宿主細胞、或本文所述的醫藥組成物。

醫藥用途及治療方法

本文提供的任何抗BDCA2抗體或相應的免疫綴合物均可用於治療方法。還應當理解，在討論“抗體”時，也包括包含抗體的組成物。本發明的抗BDCA2抗體可以治療有效量或預防有效量用於本發明任一實施方案所述的治療或預防方法中。

在又一個方面，本發明提供了本文所述的抗體或其抗原結合片段、本文所述的醫藥組成物或本文所述的藥物組合，其用於治療和/或預防BDCA2介導的疾病，較佳該疾病為炎症性疾病；更佳地，該炎症性疾病選自全身性紅斑狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡性腎炎、類風濕性關節炎、炎性腸疾病、全身性硬化症(硬皮病)、銀屑病、I型糖尿病、皮肌炎和多肌炎。

在一些實施方式中，本發明給藥方式包括但不限於口服、靜脈內、皮下、肌內、動脈內、關節內(例如在關節炎關節中)、藉由吸入、氣霧劑遞送或病灶局部給予等。

術語“治療”指意欲改變正在接受治療的個體中疾病之天然過程的臨床介入。想要的治療效果包括但不限於防止疾病出現或復發、減輕症狀、減小疾病的任何不良感受或直接或間接病理學後果、降低病情進展速率、改善或緩和疾病狀態，以及緩解或改善預後。對於本發明的抗體而言，能夠從一個或多個方面降低病情的嚴重程度，即發揮治療作用。在某些實施方案中，表現為以下情形中的一項或多項：患者的平均壽命(存活期)延長；疾病進展延遲；對醫療照護的需求下降。

本發明還提供了向受試者聯合施用治療有效量的一種或多種療法(例如治療方式和/或其它治療劑)。可以單獨或與療法中的其它治療劑組合使用本發明的抗體。在一些實施方式中，本發明抗體與至少一種另外的治療劑共施用。

用於診斷和檢測的方法

在又一個方面，本發明提供了一種使用本文所述的抗體或其抗原結合片段檢測BDCA2在樣品中的存在的方法。術語“檢測”用於本文中時，包括定量或定性檢測。在一些實施方式中，該樣品是生物樣品。在某些實施方式中，生物樣品是血、血清或生物來源的其他液體樣品。在某些實施方式中，生物樣品包含細胞或組織。在某些實施方案中，BDCA2是人BDCA2或食蟹猴BDCA2。該方法包括使本文所述的抗體或其抗原結合片段或含有該抗體或其抗原結合片段的檢測組成物與樣品接觸的步驟，以及檢測是否存在該抗體或其抗原結合片段與BDCA2結合產生的結合物或結合信號的步驟。用於檢測用途時，本文所述的抗體或其抗原結合片段可被標記，以指示是否形成了該結合物。在某些實施方案中，方法可以是體外或體內方法。

在一些實施方案中，在治療之前，例如，在起始治療之前或在治療間隔後的某次治療之前檢測BDCA2。在一個實施方案中，提供用於診斷或檢測方法的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段。

本發明的積極進步效果在於：

本發明的靶向BDCA2的抗體具有以下一種或多種優勢：

1.相比現有技術中的抗BDCA2抗體BIIB059，本發明抗體與CHOK1-humanBDCA2細胞和/或293F-cynoBDCA2細胞的活性結合更強；

2.相比現有技術中的抗BDCA2抗體BIIB059，本發明抗體對CpG-A刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα具有更好的抑制作用；

3.本發明抗體在表達BDCA2的細胞上具有更高的內化效率；

4.相比現有技術中的抗BDCA2抗體BIIB059，本發明人源化抗體對人BDCA2抗原具有更高的親和力。

5. BDCA2基因不在小鼠，大鼠和兔等非靈長類動物中表達，而BDCA2抗體治療的主要疾病(如表皮性紅斑狼瘡和全身性紅斑狼瘡)在靈長類動物中無成功建立的藥效檢測模型。根據抗體BIIB059的體外和臨床的研究，其在體外實驗中表現出誘導BDCA2內化和對PBMC分泌I型干擾素功能的抑制效果，同時在針對表皮性紅斑狼瘡和全身性紅斑狼瘡的臨床實驗研究中表現出緩解症狀的療效(Werth VP et al.N Engl J Med 2022；387：321-31.Furie RA et al.N Engl J Med 2022；387：894-904.)，推測本發明抗BDCA2抗體在臨床上對於上述疾病或病症有更好的治療效果。

本發明包括該特定實施方式的所有組合。本發明的進一步實施方式及可應用性的完整範疇將自下文所提供的詳細描述變得顯而易見。然而，應理解，儘管詳細描述及特定實施例指示本發明的較佳實施方式，但僅以說明的方式提供這些描述及實施例，因為本發明的精神及範疇內的各種改變及修改將自此詳細描述對熟悉此項技術者變得顯而易見。出於所有目的，包括引文在內的本文所引用的所有公開物、專利及專利申請將以引用的方式全部併入本文。本發明的化合物可以藉由所屬技術領域具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，較佳的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明至少採用了下述縮略詞：

his-tag代表組胺酸標簽；

Fc tag代表可結晶片段標簽；

ECD代表胞外結構域；

PEI代表聚乙烯亞胺；

BSA代表牛血清白蛋白；

PBS代表磷酸緩衝鹽溶液；

FBS代表胎牛血清；

CFSE代表羧基螢光素二醋酸鹽琥珀醯亞胺酯；

APC代表異位藻藍蛋白；

NA-PE代表藻紅蛋白標記的中性親和素；

PE代表藻紅蛋白；

TMB代表3,3',5,5'-四甲基聯苯胺；

HEPES：羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩衝液；

DTT：二硫蘇糖醇。

實施例

藉由以下實施例對本發明進行說明，但並不旨在對本發明作出任何限制。本文已經詳細描述了本發明，其中也揭露了其具體實施方式。對所屬技術領域具有通常知識者而言，在不脫離本發明精神和範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。

實施例1、用於抗BDCA2抗體活性檢測的重組蛋白的製備

編碼人源BDCA2(hBDCA2或human BDCA2)胞外結構域(Asn45-Ile213)的cDNA序列按照Genbank參考序列由Genscript公司合成。利用常規的選殖技術，將擴增片段選殖到自主構建的包含人源Fc(hIgG1)片段真核表達質粒系統(pCP-EF1a-CMV-FcεRIγ)中，從而產生重組融合蛋白表達質粒Human BDCA2 Fc(pCP-EF1a-BDCA2-CMV-FcεRIγ)。利用表達細胞293E表達並利用尺寸排阻色譜管柱純化獲取Human BDCA2 Fc重組蛋白(Fc區位於BDCA2胞外結構域的N端方向，藉由linker融合)，藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定。

編碼食蟹猴BDCA2(Cyno BDCA2)胞外結構域(Asn45-Ile212)的cDNA序列按照Genbank參考序列由Genscript公司合成，且在cDNA的N端添加6個His表達序列。利用常規的選殖技術，將片段選殖到自主構建的真核表達質粒系統(pCP-EF1a-CMV-FcεRIγ)，從而產生重組融合蛋白表達質粒Cyno BDCA2 His(pCP-EF1a-Cyno BDCA2-CMV-FcεRIγ)。利用表達細胞293E表達並利用尺寸排阻色譜管柱純化獲取Cyno BDCA2 His重組蛋白，藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定。

經鑑定，所獲得兩種蛋白濃度、總量和內毒素含量均適於後續應用。

Human BDCA2 Fc胺基酸序列見SEQ ID NO：189，Human BDCA2蛋白序列所用NCBI登錄號Q8WTT0，Cyno BDCA2 His胺基酸序列見SEQ ID NO：190，Cyno BDCA2蛋白序列所用NCBI登錄號A0A2K5UWP4-1，用於本發明抗體的活性檢測。

BDCA2特異結合的參照抗體BIIB059序列來源於專利US9902775B2，其中重鏈序列對應專利序列No.4，輕鏈序列對應專利序列No.3.，使用常規重組抗體生產工藝生產得到。

實施例2、用於抗BDCA2抗體活性檢測的BDCA2表達細胞株構建

編碼人源BDCA2的cDNA序列按照Genbank參考序列由Genscript公司合成。利用常規的選殖技術，將擴增片段選殖到自主構建的慢病毒包裝質粒系統 (PLvx-EF1a-CMV-hFcεRIγ-IRES-puro)中，從而產生慢病毒包裝質粒Human BDCA2(PLvx-EF1a-hBDCA2-CMV-hFcεRIγ-IRES-puro)。

編碼食蟹猴Cyno BDCA2的cDNA序列按照Genbank參考序列由Genscript公司合成。利用常規的選殖技術，將擴增片段選殖到自主構建的慢病毒包裝質粒質粒系統(PLvx-EF1a-CMV-hFcεRIγ-IRES-puro)中，從而產生慢病毒包裝質粒Cyno BDCA2(PLvx-EF1a-cynoBDCA2-CMV-cynoFcεRIγ-IRES-puro)

以293T為宿主細胞，用瞬轉方法將PLvx-EF1a-hBDCA2-CMV-hFcεRIγ-IRES-puro質粒或PLvx-EF1a-cynoBDCA2-CMV-cynoFcεRIγ-IRES-puro轉到293T細胞。收集轉染後48小時和72小時含有human BDCA2或Cyno BDCA2表達病毒的細胞培養上清，將濃縮至1E8 EU/mL。

將提前培養至對數生長期的CHOK1細胞消化處理好，以1E5/孔鋪至6孔細胞培養板，過夜培養待細胞貼壁。隨後，將濃縮得到的human BDCA2病毒以逐次遞增的感染用量(100μl,200μl)加入提前貼壁的6孔板細胞內，感染後的細胞經用含有嘌呤黴素(puromycin)的培養基進行篩選後進行抗原表達量流式細胞術檢測，並對細胞做亞選殖處理。流式細胞術使用參照抗體BIIB059檢測，結果表明，相對於對照hIgG，檢測到BDCA2的顯著結合。挑選抗原表達量高的單株，擴大培養作為後期實驗細胞株。

將提前培養至對數生長期的293F細胞消化處理好，以1E5/孔鋪至6孔細胞培養板，過夜培養待細胞貼壁。隨後，將濃縮得到的Cyno BDCA2病毒以逐次遞增的感染用量(100μl,200μl)加入提前貼壁的6孔板細胞內，感染後的細胞經用含有嘌呤黴素(puromycin)的培養基進行篩選後進行抗原表達量流式細胞術檢測，並對細胞做亞選殖處理。流式細胞術使用參照抗體BIIB059檢測，結果表明，相對於對照hIgG，檢測到BDCA2的顯著結合。挑選抗原表達量高的單株，擴大培養作為後期實驗細胞株。

實施例3、小鼠融合瘤細胞的製備

3.1.小鼠免疫與血清效價檢測

3.1.1.小鼠免疫方案

採用2種免疫途徑，一共免疫3組小鼠(每組5隻)，每次免疫時間間隔14天。第1組5隻Balb/c小鼠(購自SLAC，雌性BALB/c，8週)，第2組5隻SJL小鼠(購自SLAC，雌性BALB/c，8週)，採用基因槍(pCP-EF1a-BDCA2-CMV-FcεRIγ)加蛋白(humanBDCA2 Fc)混合方案共5次：前4次基因槍免疫，劑量4μg/次；第5次蛋白免疫，劑量25μg/隻。第3組5隻SJL小鼠(購自SLAC，雌性8週)採用純蛋白(humanBDCA2 Fc)免疫，總共免疫3次，首次免疫劑量50μg/隻，後兩次25μg/隻。參見表1。

表1小鼠免疫方案

3.1.2.小鼠免疫效價檢測

設定多個時間點收集到免疫小鼠的血清樣本，分別進行ELISA和FACS檢測。根據數次檢測的結果(以最後一次小鼠血清檢測(TB)結果為主要參考因素，詳細結果未展示)，共挑選4隻小鼠，做了2個融合：融合#F0223挑選的是G1組螢光強度最高的Balb/c#9735和G2組螢光強度最高的SJL#9740兩隻小鼠；融合#F0511挑選的是G3組螢光強度最高的SJL#9947和SJL#9948兩隻小鼠。

3.2.細胞融合

在最後一針加強免疫後第四天，處死小鼠後收集脾細胞，在生理鹽水中碾磨後取富含淋巴細胞的懸浮液，按常規電轉方法將其與小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0混合，採用高效電融合進行細胞融合。

將融合後細胞稀釋到含有HT(次黃嘌呤、胸腺嘧啶核苷)的DMEM培養基中，按比例鋪到96孔板，放入5% CO₂、37℃培養箱中過夜培養，24小時後加入含有2*HAT含有次黃嘌呤、胺甲蝶呤和胸腺嘧啶核苷)的DMEM培養基。以篩選成功融合的細胞(融合瘤細胞)。

DMEM完全培養基配比是：15%FBS(胎牛血清)+1：50L-穀胺醯胺+100U/mL青鏈黴素+1：100 OPI(草醯乙酸、丙酮酸和胰島素)，培養箱條件是8% CO₂，37℃。

實施例4、小鼠融合瘤細胞的篩選和抗BDCA2鼠源抗體純化

融合細胞培養篩選10天左右後用Acumen激光細胞檢測儀檢測上清中BDCA2抗體的表達，用於檢測的陽性細胞是CHOK1-humanBDCA2，陰性細胞是CHOK1-blank，陽性對照抗體為參照抗體BIIB059。根據Acumen結果，挑選出陽性的株轉至24孔板擴大培養，培養3天後取24孔板中擴大培養的上清用以下方法檢測：1)FACS檢測與CHOK1-humanBDCA2細胞和293F-cynoBDCA2 細胞的結合活性；2)ELISA檢測與humanBDCA2 Fc蛋白和cynoBDCA2 His蛋白的結合活性；3)檢測在CpG-A刺激PBMC產生細胞因子IFNα的實驗中的抑制能力(抑制IFNα產生)。

在F0223融合得到的多株融合瘤細胞中，藉由結合Acumen，篩選出189株融合瘤細胞，其分泌的抗體可與hBDCA2特異地結合。在這189株結合陽性的融合瘤細胞中，進一步擴大至24孔板複篩，有28株融合瘤細胞表達的抗體可以在ELISA檢測中結合hBDCA2和cyno BDCA2，可在FACS中結合表達在細胞表面的hBDCA2和cyno BDCA2，在IFNα阻斷實驗中，上述的28個多株細胞株可以抑制CpG對PBMC細胞IFNα分泌的誘導。將此28株融合瘤細胞進行了亞選殖。藉由亞選殖篩選得到18株阻斷型單株細胞株，編號為mAb001-mAb018。

在F0511融合得到的多株融合瘤細胞中，藉由結合Acumen，篩選出168株融合瘤細胞，其分泌的抗體可與hBDCA2特異地結合。在這168株結合陽性的融合瘤細胞中，進一步擴大至24孔板複篩，有35株融合瘤細胞表達的抗體可以在ELISA檢測中結合hBDCA2和cyno BDCA2，可在FACS中結合表達在細胞表面的hBDCA2和cyno BDCA2，在IFNα阻斷實驗中，上述的35個多株細胞株可以抑制CpG對PBMC細胞IFNα分泌的誘導。將此35株融合瘤細胞進行了亞選殖。藉由亞選殖篩選得到16株阻斷型單株細胞株，編號為mAb019-mAb034。

藉由2個融合及篩選，最終共得到34個陽性單株。將其分泌的抗體進行了純化和分析，其濃度、質量、純度和內毒素含量均符合後續實驗要求。

實施例5、抗BDCA2鼠源抗體性能測定

所得鼠源抗體都能夠與humanBDCA2 Fc蛋白有很好的結合活性，藉由ELISA檢測結合力為EC₅₀<0.3nM。鼠源抗體與cynoBDCA2 His蛋白有較好結合能力，大部分抗體經ELISA檢測結合力EC₅₀<0.5nM。

所有鼠源抗體與CHOK1-humanBDCA2細胞均有結合(結果參見圖1a至圖1e)，其EC₅₀優於對照抗體BIIB059或與其相當。大部分鼠源抗體與293F-cynoBDCA2細胞都有結合(結果參見圖2a至圖2e)，其EC₅₀優於對照抗體BIIB059或與其相當。

對與CHOK1-humanBDCA2和293F-cynoBDCA2細胞都有結合的32個抗體，檢測其在CpG-A刺激PBMC實驗中抑制細胞因子IFNα釋放的能力。抗體都有一定的抑制活性。其中mAb005、mAb019、mAb020、mAb021、mAb022、mAb024、mAb027、mAb030、mAb033抑制細胞因子釋放的IC₅₀分別為0.08667nM、0.003323nM、0.006146nM、0.004047nM、0.006232nM、0.002744nM、0.07004nM、0.004762nM和0.004083nM。

上述實驗方法如下所示。其中，mAb001-mAb034為本發明的鼠源抗體，BIIB059為如前所描述的參照抗體，hIgG1為人IgG1陰性對照，mIgG1為鼠IgG1陰性對照。

5.1. ELISA檢測鼠源抗體與蛋白的結合活性

用PBS稀釋HumanBDCA2 Fc蛋白或cynoBDCA2 His蛋白至1μg/mL，以100μL/孔加入ELISA微孔板，4℃過夜孵育。用ELISA封閉液(含1%BSA，pH7.4的PBS磷酸緩衝液，該百分比為質量百分比)於37℃封閉兩小時。加入依次10倍梯度稀釋的抗體，共8個濃度點(0.0001nM-100nM，包括0點對照)。100μL/孔，37℃溫育1小時。洗板3次，加入anti-mouse IgG(Fab specific)-HRP(Sigma, A3682；1：5000稀釋)二抗，100μL/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，加入100μL/孔TMB顯色液(湖州英創生物科技，EL0009)，37℃孵育10分鐘後，加入50μL 1N鹽酸終止顯色反應。用ELISA讀板機讀取OD450nm值，並用GraphPad Prism6擬合曲線，計算EC₅₀值。

5.2. FACS檢測鼠源抗體與細胞的結合活性

用TrypLE胰酶消化培養至對數生長期的CHOK1-humanBDCA2和293F-cynoBDCA2細胞。收集細胞後，將細胞用FACS buffer(PBS+2%FBS)重新懸浮至2x10^6/mL。將細胞以100μL每孔加入3799細胞板(Corning)，300g離心後棄上清。抗體用FACS buffer梯度稀釋(同上)，將稀釋後的抗體加入離心後的細胞中，將細胞重新懸浮。4℃孵育一個小時。孵育後的細胞300g離心5min，並用FACS buffer洗兩遍。加入100μL Donkey anti-Mouse IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody-Alexa Fluor 488(Invitrogen,A21202；1：1000)二抗，4℃孵育一個小時後FACS buffer洗兩遍，用PBS重新懸浮後用FACS(BD FACS CantoTM II)儀器分析，並用GraphPad Prism6擬合曲線，計算EC₅₀值。

5.3.鼠源抗體抑制CpG-A刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα的能力

1)復蘇凍存的人PBMC細胞，用完全培養基(1640+10%FBS+1×NEAA+1×L-Glutamine)過夜培養18小時。第二天，收集PBMC細胞，用600g離心8分鐘，棄上清。細胞用培養基(1640+10%FBS)重新懸浮至8x10^6/mL，100μL每孔加入3799細胞培養板。待測抗體用培養基(1640+10%FBS)10級梯度稀釋(終濃度，0.0001nM-10nM)，將稀釋後的抗體按50μL/孔加入PBMC中。將細胞重新懸浮後放在37℃孵育6小時。每孔加入50μL培養基(1640+10%FBS)稀釋的2μM CpG- A(Invitrogen，tlr1-2216-5)，混勻後繼續在37℃孵育20小時。第三天，將細胞培養板以400g離心5分鐘，收集細胞培養上清並檢測上清當中細胞因子IFNα。

2)ELISA方法檢測細胞因子IFNα

用PBS稀釋抗體MT1/3/5(Mabtech，3425-1H-20)至4μg/mL，以100μL每孔加入CORNING ELISA板，4℃過夜孵育包板。之後，棄掉包板抗體，以300μL每孔向板中加入封閉液(PBS+1% BSA)，4℃過夜孵育。待測上清用封閉液稀釋至合適濃度(根據情況在1：3-1：7中選擇)，按100μL每孔加入包好的ELISA板。IFNα檢測標準品用封閉液以2倍梯度稀釋(最高濃度1000pg/mL，8個濃度點，最後1個點為0)，100μL每孔加入包好的ELISA板。放置ELISA板37℃培養箱孵育1小時。洗板3次，以100μL每孔加入檢測抗體MT2/4/6(1：1000)，37℃培養箱孵育1小時。洗板3次，以100μL每孔加入第二抗體SA-HRP(1：1000)後37℃培養箱孵育0.5小時。洗板3次，以100μL每孔加入TMB顯色液，顯色至合適時間以50μL每孔加入1M HCl終止反應。用ELISA讀板機讀取OD450nm讀數，計算抑制率並用GraphPad Prism6作擬合曲線，計算IC₅₀值。

實施例6、抗BDCA2鼠源融合瘤(單株抗體)的可變區序列的測定(根據Kabat表示)

根據鼠源抗體在蛋白水平和細胞水平與抗原的結合能力和在PBMC體系中抗體對於CpG-A刺激引起的細胞因子IFNα釋放的抑制能力結果選擇16個融合瘤單株進行VH/VL序列測定。

用基於簡併引子PCR的方法，測定抗BDCA2鼠源抗體的可變區對應的DNA編碼序列。培養候選融合瘤細胞，1000rpm離心收集細胞，並以Trizol提取總RNA。以此為模板合成第一鏈cDNA，之後以第一鏈cDNA作為後續模板，PCR擴增對應的可變區DNA編碼序列。擴增反應中所使用的引子序列與抗體的可變區第一框架區和恆定區互補(Larrick，J.W.等，1990,Scand.J.Immunol.,32,121-128和Coloma,J.J.等，(1991)BioTechniques,11,152-156)。在50μl反應體系中，分別加入cDNA 1μl，10×PCR緩衝液5μl，上游及下游引子各1μl(25pmol)，dNTP 1μl，25mmol PL MgCl₂ 1μl，H₂O 39μl，95℃預變性10min，加Taq酶1μl，進入溫度循環，進行PCR擴增。反應條件為94℃變性1min，58℃退火1min，72℃延伸15s，共32個循環，然後72℃保溫10min。回收並純化PCR產物。對擴增產物測序，得到抗BDCA2鼠源抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區胺基酸序列。

用NCBI Ig-Blast(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/)在種系和重排Ig可變區序列數據庫中搜索共有序列。基於Kabat(Wu,T.T及Kabat,E.A.1970 J.Exp.Med.,132：211-250)及IMGT系統(Lefranc M.-P.等人，1999 Nucleic Acids Research,27,209-212)，藉由序列批註及藉由基於因特網的序列分析(http：//www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest與http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)鑑定互補決定區(CDR)胺基酸序列。

經選擇的抗BDCA2鼠源抗體的輕鏈和重鏈可變區及CDR的胺基酸序列如表2所示。並且進行了多序列比對及進化樹分類，根據結果將16個單株抗體序列重鏈可變區VH主要分為5大類：1)mAb020、022、026；2)mAb021、027、028、030、032、034；3)mAb019、024、033；4)mAb001、002；5)mAb005、016，其中mAb028和mAb030重鏈可變區只有2個胺基酸不同，mAb028和mAb032只有1個胺基酸不同。輕鏈可變區VL可分為3大類：1)mAb019；2)mAb021、027、028、030、032、034；3)其他抗體。其中mAb028、030、032輕鏈可變區序列相同。

表2抗BDCA2鼠源抗體的CDR和可變區胺基酸序列(KABAT方案)

實施例7、抗BDCA2嵌合抗體的構建

根據序列檢測結果，兩個融合共挑選12條單株抗體序列，進行人鼠嵌合抗體構建，質粒構建過程中選擇hIgG1 Fc段序列作為人恆定區序列。前述抗BDCA2鼠源抗體的重鏈和輕鏈可變區編碼序列由Genscript公司合成。選用expi 293F為宿主細胞進行抗體表達。所得嵌合抗體分別為：mab001c、mab002c、mab005c、mab016c、mab019c、mab020c、mab021c、mab022c、mab024c、mab027c、mab030c和mab033c。

並對表達後的嵌合抗體進行各項表徵。

實施例8、嵌合抗體的篩選

8.1. ELISA方法檢測抗BDCA2嵌合抗體與蛋白的結合活性

用PBS稀釋HumanBDCA2 Fc蛋白或cynoBDCA2 His蛋白至1μg/mL，以100μL/孔加入ELISA微孔板，4℃過夜孵育。包被完成後，用ELISA封閉液(含1%BSA，pH7.4的PBS磷酸緩衝液，該百分比為質量百分比)37℃封閉兩小時。加入10倍梯度稀釋的抗體，共8個濃度點(0.0001nM-100nM，包括0點對照)。100μL/孔，37℃溫育1小時。洗板3次，加入Anti-Human IgG(Fab specific)-Peroxidase antibody(Sigma,A0293；1：5000稀釋度)二抗，100μL/孔，37℃孵育1小時。洗板3次，加入100μL/孔TMB顯色液(湖州英創生物科技，EL0009)，37℃孵育10分鐘後，加入50μL 1N鹽酸終止顯色反應。用ELISA讀板機讀取OD450nm值，並用GraphPad Prism6擬合曲線，計算EC₅₀值。

結果如下：所測嵌合抗體與humanBDCA2 Fc蛋白和cynoBDCA2 His蛋白都有結合，與humanBDCA2-Fc蛋白結合的EC₅₀為0.1~0.2nM；大部分嵌合抗體以小於0.6nM的EC₅₀值與cynoBDCA2 His蛋白都有結合。

8.2. FACS方法檢測嵌合抗體與細胞的結合活性

用TrypLE胰酶消化培養至對數生長期的CHOK1-humanBDCA2和293F-cynoBDCA2細胞。收集細胞後，將細胞用FACS buffer(PBS+2%FBS)重新懸浮至2x10^6/mL。將細胞以100μL每孔加入3799細胞板，300g離心後棄上清。抗體用FACS buffer梯度稀釋，將稀釋後的抗體加入離心後的細胞中，將細胞重新懸浮。4度孵育一個小時。孵育後的細胞300g離心5min，並用FACS buffer洗兩遍。加入100μL Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor 488(Sigma,A11013；1：1000)二抗，4抗孵育一個小時後FACS buffer洗兩遍，用PBS重新懸浮後用FACS(BD FACS CantoTM II)儀器分析，並用GraphPad Prism6擬合曲線，計算EC₅₀值。

如圖3(3a-至3c)所示，所檢測嵌合抗體都與CHOK1-humanBDCA2細胞有結合，其EC₅₀優於對照抗體BIIB059或與其相當。同時，所檢測嵌合抗體都和293F-cynoBDCA2細胞結合，其EC₅₀約為0.3-2nM，優於對照抗體BIIB059或與其相當。

8.3.檢測嵌合抗體抑制CpG-A刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα的能力

復蘇凍存的人PBMC細胞，用完全培養基(1640+10%FBS+1×NEAA+1×L-Glutamine)過夜培養18小時。第二天，收集PBMC細胞，用600g離心8分鐘，棄上清。細胞用培養基(1640+10%FBS)重新懸浮至8x10^6/mL，100μL每孔加入3799細胞培養板。待測抗體用培養基(1640+10%FBS)以10倍梯度稀釋(終濃度0.0001nM-10nM)，將稀釋後的抗體按50μL/孔加入PBMC中。將細胞重新懸浮後放在37℃孵育6小時。每孔加入50μL培養基(1640+10%FBS)稀釋的2μM CpG-A(Invivogen，tlr1-2216-5)，混勻後繼續在37℃孵育20小時。第三天，將細胞培養板以400g離心5分鐘，收集細胞培養上清並檢測上清當中細胞因子IFNα。

用PBS稀釋抗體MT1/3/5(Mabtech，3425-1H-20)至4μg/mL，以100μL每孔加入CORNING ELISA板，4℃過夜孵育。棄掉包板抗體，以300μL每孔向板中加入封閉液(PBS+1% BSA)，4℃過夜孵育。待測上清用封閉液稀釋至合適濃度(一般在1：3-1：7)，100μL每孔加入包好的ELISA板。IFNα檢測標準品用封閉液以2倍梯度稀釋(最高濃度1000pg/mL，8個濃度點，最後1個點為0)，100μL每孔加入包好的ELISA板。ELISA板放置37℃培養箱孵育1小時。洗板 3次，以100μL每孔加入檢測抗體MT2/4/6(1：1000)，37℃培養箱孵育1小時。洗板3次，以100μL每孔加入第二抗體SA-HRP(1：1000)。37℃培養箱孵育0.5小時。洗板3次，以100μL每孔加入TMB顯色液，顯色至合適時間以50μL每孔加入1M HCl。用ELISA讀板機讀取OD450nm讀數，計算抑制率並用GraphPad Prism6作擬合曲線，計算IC₅₀。

在CpG-A刺激PBMC釋放細胞因子實驗中，所檢測12個嵌合抗體都能抑制細胞因子IFNα分泌，其中，mab005c、mab019c、mab020c、mab021c、mab022c、mab024c、mab027c、mab030c和mab033c的IC₅₀分別為：0.008359nM、0.01493nM、0.01853nM、0.01268nM、0.03239nM、0.01677nM、0.008976、nM、0.01645nM和0.008331nM。

8.4.嵌合抗體內吞能力檢測

用TrypLE胰酶消化培養至對數生長期的CHOK1-humanBDCA2細胞。收集細胞後，將細胞用FACS buffer(PBS+2%FBS)重新懸浮至2x10^6/mL。將細胞以100μL每孔加入3799細胞板，300g離心後棄上清，細胞放置冰盒降溫。用FACS buffer梯度稀釋抗體(設置3個濃度：100nM，10nM，1nM；以及各3組：0小時對照；4℃ 1小時；37℃ 1小時)，稀釋後放置冰盒降溫15分鐘，15分鐘後將抗體加入離心後的細胞中，將細胞重新懸浮。4℃孵育40分鐘。孵育後的細胞300g離心5分鐘，並用FACS buffer洗兩遍。0h組細胞用多聚甲醛室溫固定10分鐘，FACS buffer洗兩遍；另外兩組細胞用100μL FACS buffer重新懸浮後分別放置4℃和37℃孵育1h。將4℃ 1小時和37℃ 1小時兩組細胞用多聚甲醛室溫固定10分鐘，FACS buffer洗兩遍。3組條件下的細胞同時加入100μL二抗Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody-Alexa Fluor 488(Sigma, A11013；1：1000)，4℃孵育一個小時。FACS buffer洗兩遍，用PBS重新懸浮後用FACS儀器分析，並計算表面信號百分率。

嵌合抗體在100nM、10nM、和1nM濃度下都出現內吞情況，12個嵌合抗體介導內吞能力相差不大，且略優於陽性對照抗體BIIB059。抗體濃度100nM時，經37℃內吞1小時，細胞表面信號值在50%~60%。

實施例9、抗體可變區的人源化改造

對於抗體可變區的人源化改造，首先在NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)網站中的人類免疫球蛋白基因數據庫搜尋與鼠抗體的cDNA序列同源的人類種系IgG基因，再藉由Kabat編號系統或IMGT編號系統定義可變區CDR的胺基酸序列及其精確邊界。原則上將與鼠源抗體具有高同源性的人類IGHV選為人源化模板，藉由CDR嫁接實施抗體可變區的人源化。

從上述獲得的鼠源抗體的序列中選擇mAb005和mAb033進行人源化改造。人源化改造過程步驟如下：A、把鼠源抗體的基因序列與人胚系抗體基因序列進行比對，找出同源性高的序列；B、分析考察HLA-DR親和性，選出親和力低的人胚系框架序列；C、利用計算機模擬技術，應用分子對接分析可變區及其周邊的框架胺基酸序列，考察其空間立體結合方式。藉由計算靜電力、范德華力、親疏水性和熵值，分析得到鼠源抗體基因序列中可與人BDCA2作用以及維護空間構架的關鍵胺基酸個體，將其嫁接回已經選擇的人胚系基因框架，並在此基礎上標配出必須保留的框架區胺基酸位點，合成人源化抗體。在此基礎上得到了多種人源化抗體可變區序列，將設計的人源化抗BDCA2抗體可變區進行各種組合，獲得人源化抗BDCA2抗體，其可變區胺基酸序列具體見表3。

Hu005系列人源化抗體可變區的CDR(KABAT方案)如下所示：

HCDR1：NYGVH(SEQ ID NO：11)

HCDR2：VIWSGESTDYDAAFIS(SEQ ID NO：12)

HCDR3：RRSHYYGYVMDY(SEQ ID NO：13)

LCDR1：KASQSIDYDAIGYLN(SEQ ID NO：86)

LCDR2：AASNLES(SEQ ID NO：15)

LCDR3：QQSNEDPPT(SEQ ID NO：16)

Hu033系列人源化抗體可變區的CDR(KABAT方案)如下所示：

HCDR1：SYGMS(SEQ ID NO：52)

HCDR2：TISSGDSYTYYPDSVKG(SEQ ID NO：39)

HCDR3：QIYYDYAYYFDF(SEQ ID NO：53)

LCDR1：RASESVSFRTSHLMH(SEQ ID NO：54)

LCDR2：GASNLES(SEQ ID NO：55)

LCDR3：QQSIEDPPT(SEQ ID NO：42)

表3抗BDCA2人源化抗體的可變區胺基酸序列

實施例10、人源化抗BDCA2抗體的篩選

10.1.人源化抗體與BDCA2的結合活性

用TrypLE胰酶消化培養至對數生長期的CHOK1-humanBDCA2和293F-cynoBDCA2細胞。收集細胞後，將細胞用FACS buffer(PBS+2%FBS)重新懸浮至2x10^6/mL。重新懸浮後的細胞以100μL每孔加入3799細胞板，300g離心後棄上清。將待測抗體用FACS buffer 5倍梯度稀釋(終濃度0.012nM-200nM)，將稀釋後的抗體加入離心後的細胞中，將細胞重新懸浮。4℃孵育一個小時。孵育後的細胞300g離心5min，並用FACS buffer洗兩遍。加入100μL Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor 488(Sigma,A11013；1：1000)二抗，4℃孵育一個小時後FACS buffer洗兩遍。PBS重新懸浮細胞後用FACS(BD FACS CantoTM II)儀器分析結合細胞表面抗體螢光信號，並用GraphPad Prism6擬合曲線，計算抗體結合BDCA2抗原的EC₅₀值。其中，選擇BIIB059抗體為陽性對照，hIgG1為陰性對照。

由mAb033序列人源化改造後得到的候選抗體，其對於CHOK1-humanBDCA2和293F-cynoBDCA2細胞結合的活性優於陽性對照BIIB059抗體，結果見表4。使用SPR測定抗體與human BDCA2親和力，所選擇抗體與human BDCA2親和力強於陽性對照BIIB059抗體。

表4 mAb033系列人源化抗體與BDCA2的結合活性

由mAb005序列人源化改造後得到的候選抗體，其對於CHOK1-humanBDCA2細胞結合的EC₅₀值優於陽性對照BIIB059抗體，結果見表5。同時，由mAb005序列人源化改造後得到的候選抗體對於293F-cynoBDCA2細胞也有較好的結合活性。

表5 mAb005系列人源化抗體與BDCA2的結合活性

10.2.人源化抗體抑制CpG-A刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα的能力

挑選一系列人源化後的候選抗體分子進行抑制CpG-A刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα的功能檢測。復蘇凍存的人PBMC細胞，用完全培養基(1640+10%FBS+1×NEAA+1×L-Glutamine)過夜培養18小時。第二天，收集PBMC細胞，用600g離心8分鐘，棄上清。細胞用培養基(1640+10%FBS)重新懸浮至8x10^6/mL，100μL每孔加入3799細胞培養板。待測抗體用培養基(1640+10%FBS)10倍梯度稀釋(0.0001nM-10nM，以及0點對照)，將稀釋後的抗體按50μL/孔加入PBMC中。將細胞重新懸浮後放在37℃孵育6小時。每孔加入50μL培養基(1640+10%FBS)稀釋的2μM CpG-A(Invitrogen，tlr1-2216-5)，混勻後繼續在37℃孵育20小時。第三天，將細胞培養板以400g離心5分鐘，收集細胞培養上清並檢測上清當中細胞因子IFNα。選擇BIIB059抗體為陽性對照，hIgG1為陰性對照。

用PBS稀釋抗體MT1/3/5(Mabtech，3425-1H-20)至4μg/mL，以100μL每孔加入CORNING ELISA板，4℃過夜孵育包板。之後棄掉包板抗體，以300μL每孔向板中加入封閉液(PBS+1% BSA)，4℃過夜孵育。封閉完成後，待測上清用封閉液稀釋至合適濃度(一般在1：3-1：7)，100μL每孔加入包好的ELISA板。IFNα檢測標準品用封閉液以2倍梯度稀釋(最高濃度1000pg/mL，8個濃度點，最後1個點為0)，100μL每孔加入包好的ELISA板。ELISA板放置37℃培養箱孵育1小時。洗板3次，以100μL每孔加入檢測抗體MT2/4/6(1：1000)，37℃培養箱孵育1小時。洗板3次，以100μL每孔加入第二抗體SA-HRP(1：1000)。37℃培養箱孵育0.5小時。洗板3次，以100μL每孔加入TMB顯色液，顯色至合適時間以50μL每孔加入1M HCl。用ELISA讀板機讀取OD450nm讀數，並用GraphPad Prism6作擬合曲線。選擇10nM抗體濃度對應OD值，按照抑制率=(OD(IgG1)-OD(Ab))/OD(IgG1)計算最大抑制率。

在CpG-A刺激PBMC釋放細胞因子實驗中，所檢測人源化抗體都能抑制細胞因子IFNα分泌，EC₅₀值小於陽性對照抗體BIIB059，結果進一步參見表6。

表6人源化抗體抑制CpG-A刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα

10.3.人源化抗體內吞能力檢測

用TrypLE胰酶消化培養至對數生長期的CHOK1-humanBDCA2細胞。收集細胞後，將細胞用FACS buffer(PBS+2%FBS)重新懸浮至2x10^6/mL。將細胞以100μL每孔加入3799細胞板，300g離心後棄上清，細胞放置冰盒降溫。用FACS buffer梯度稀釋抗體(設置2個濃度：100nM，10nM；以及各3組：0小時；4℃ 1小時；37℃ 1小時)，稀釋後放置冰盒降溫15分鐘，15分鐘後將抗體加入離心後的細胞中，將細胞重新懸浮。4℃孵育40分鐘。孵育後的細胞300g離心5分鐘，並用FACS buffer洗兩遍。0h組細胞用多聚甲醛室溫固定10分鐘，FACS buffer洗兩遍；另外兩組細胞用100μL FACS buffer重新懸浮後分別放置4℃和37℃孵育1h。將4℃ 1小時和37℃ 1小時兩組細胞用多聚甲醛室溫固定10分鐘，FACS buffer洗兩遍。3組條件下的細胞同時加入100μL二抗Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody-Alexa Fluor 488(Sigma,A11013；1：1000)，4℃下孵育一個小時。FACS buffer洗兩遍，用PBS重新懸浮後用FACS儀器分析，並計算表面信號百分率。

結果如圖4所示，Hu005和Hu033兩組人源化抗體在100nM和10nM濃度下都出現內吞情況，人源化抗體介導內吞的能力與陽性對照抗體BIIB059相當。

10.4.人源化抗體親和力檢測

本發明的人源化抗體藉由BIAcore實驗測定親和力：用1：1混合的50mM NHS和200mM EDC(NHS和EDC來自胺基偶聯試劑盒)活化CM5芯片通道表面，注射Anti-human IgG(Fc)抗體(稀釋在pH5.0的醋酸鈉溶液中，濃度25μg/mL)420秒。然後以10μL/min流速注射1M乙醇胺，時間420秒，封閉芯片上多餘的有活性羧基。使用運行緩衝液將人源化抗體稀釋至1ug/mL後，向檢測通道流動池注射，流速10μL/min，進樣60s，進行捕獲。用1×HBS-EP+(pH 7.4)將重組Human BDCA2稀釋至50或100nM，並1：2梯度稀釋至0.39nM。以30μL/min流速分別向檢測通道注射各個濃度梯度的待測樣品hBDCA2，2個0濃度樣品用於去除背景信號。抗原抗體的結合和解離時間分別為180和400秒。利用Biacore Insight Evaluation Software(Version 2.0.15.12933)進行數據分析。扣除參比通道(流動池1)以及0濃度的信號後，選擇用1：1結合模型進行曲線擬合併計算動力學參數。測定所得結果如下表7所示。

表7人源化抗體親和力

實施例11人源化抗BDCA2抗體的Fc突變和抗體篩選

對實施例10中得到的人源化抗體Hu033-03和Hu033-20，選擇Fc位點進行突變，增加其Fc與FcγRIIA親和力。總共設計得到人源化抗體Hu033-03-T1、Hu033-03-T2、Hu033-03-T3、Hu033-20-T1、Hu033-20-T2和Hu033-20-T3，得到的重鏈和輕鏈編碼序列由Genscript公司合成。重鏈和輕鏈胺基酸序列見表8。選用293F為宿主細胞進行抗體表達，並對表達純化後的抗體體進行各項表徵測試。

表8：突變的抗BDCA2人源化抗體的可變區、全長胺基酸序列

11.1. Fc突變增加抗體對FcγRIIA親和力

使用BIAcore 8K以及新鮮固定了biotinylated human FcγRIIA(R167)/FcγRIIA(H167)的SA芯片來測定抗體動力學或親和力參數，實驗運行在25℃，運行緩衝液為1×HBS-EP++(10mM HEPES pH 7.4,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% Surfactant P20)。將抗體用運行緩衝液以1：2的比例稀釋成5000nM、2500nM、1250nM、625nM、321.5nM、156.25nM、78.13nM、39.06nM、19.53nM 或9.77nM濃度，以30μL/min流速分別向流動池1和流動池2注射各濃度梯度的待測抗體，抗體的結合和解離時間分別為60和90秒。2個0濃度樣品用於去除背景信號。樣品以多循環方式進樣，每個循環結束分析物都能充分從芯片表面解離下來，因此没有應用再生步驟。利用Biacore Insight Evaluation Software(Version 2.0.15.12933)進行數據分析。扣除參比通道(流動池1)以及兩個0濃度的信號後，親和力分析選擇用1：1結合模型或穩態模型分析進行曲線擬合並計算動力學參數。

與野生型Fc相比，突變後的抗體對人FcγRIIA(R167)或FcγRIIA(H167)亞型的親和力都顯著提高。結果見表9-1和表9-2。

表9-1抗BDCA2人源化抗體對人FcγRIIA(H167)的親和力(1：1 binding)

表9-2抗BDCA2人源化抗體對人FcγRIIA(R167)的親和力(1：1 binding)

11.2. Fc突變後的抗體對BDCA2結合力不變

對於Fc突變後的抗體藉由FACA檢測其與human BDCA2和Cyno BDCA2表達細胞的結合能力。

實驗方法如下。

用TrypLE消化CHOK1-humanBDCA2和293F-cynoBDCA2細胞。收集細胞後，將細胞用FACS buffer(PBS+2%FBS)重新懸浮至2x10^6/mL。將細胞以100uL每孔加入3799細胞板，300g離心後棄上清。抗體用FACS buffer按照200nM起始濃度，按照1：5梯度稀釋，將稀釋後的抗體加入離心後的細胞中，將細胞重新懸浮。4℃孵育一個小時。孵育後的細胞300g離心5min，並用FACS buffer洗兩遍。加入100uL Donkey anti-Mouse IgG(H+L)Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody-Alexa Fluor 488(Invitrogen,A21202；1：1000)二抗，4℃孵育一個小時後FACS buffer洗兩遍，用PBS重新懸浮後用FACS(BD FACS CantoTM II)儀器分析，並用GraphPad Prism6擬合曲線，計算EC50值。

Fc突變後的抗體與human BDCA2的結合能力略優於野生型Fc，且顯著優於參照抗體BIIB059。Fc突變後的抗體與Cyno BDCA2的結合能力優於野生型Fc和BIIB059。結果見圖5a、圖5b、表10。

表10抗BDCA2人源化抗體對人BDCA2的結合能力

11.3. Fc突變後抗體內吞能力不變

使用FACS檢測各抗體的內吞能力。

用TrypLE消化CHOK1-humanBDCA2細胞。收集細胞後，將細胞用FACS buffer(PBS+2%FBS)重新懸浮至2x10^6/mL。將細胞以100uL每孔加入3799細胞板，300g離心後棄上清，細胞放置冰盒降溫。用FACS buffer梯度稀釋抗體至1nM，10nM或100nM(每個抗體濃度設置5組檢測條件：0小時；4℃，1小時；37℃，1小時；4℃，4小時；37℃，4小時)，稀釋後放置冰盒降溫15分鐘，15分鐘後將抗體加入離心後的細胞中，將細胞重新懸浮。4℃孵育40分鐘。孵育後的細胞300g離心5分鐘，並用FACS buffer洗兩遍。0h組細胞用多聚甲醛室溫固定10分鐘，FACS buffer洗兩遍；另外四組細胞用100uL FACS buffer重新懸浮後分別放置4℃和37℃孵育1h或4h。在設定時間將對應4℃和37℃兩組細胞用多聚甲醛室溫固定10分鐘，FACS buffer洗兩遍。5組條件下的細胞同時加入100uL二抗Goat anti-Human IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody-Alexa Fluor 488(Sigma,A11013；1：1000)，4℃孵育一個小時。FACS buffer洗兩遍，用PBS重新懸浮後用FACS儀器分析，並計算表面信號百分率。

測定Fc突變抗體在100nM、10nM、和1nM濃度下都有內吞。3種Fc改造後對抗體內吞沒有影響。具體見圖6a至圖6f。

11.4. Fc突變抗體更強抑制抗體複合物SLE-IC刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα

對Fc改造後的抗體進行抑制抗體複合物刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα的功能檢測。復蘇凍存的人PBMC細胞，用完全培養基(1640+10%FBS+1×NEAA+1×L-Glutamine)過夜培養18小時。第二天，收集PBMC細胞，用600g離心8分鐘，棄上清。細胞用培養基(1640+10%FBS)重新懸浮至8x10^6/mL，100μL每孔加入3799細胞培養板。待測抗體用培養基(1640+10%FBS)5倍梯度稀釋(0.0032nM-10nM，以及0點對照)，將稀釋後的抗體按50μL/孔加入PBMC中。將細胞重新懸浮後放在37℃孵育6小時。每孔加入50μL培養基(1640+10%FBS) 稀釋的SLE-IC(2.5μl Sm/RNP-antigen(AROTEC,ART01-10)混合10μl anti-RNP antibody(RayBiotech,MD-14-0513))，混勻後繼續在37℃孵育20小時。第三天，將細胞培養板以400g離心5分鐘，收集細胞培養上清並檢測上清當中細胞因子IFNα。選擇BIIB059抗體為陽性對照，hIgG1為陰性對照。

檢測上清中細胞因子IFNα，用PBS稀釋抗體MT1/3/5(Mabtech，3425-1H-20)至4ug/mL，以100uL每孔加入CORNING ELISA板，4℃过夜孵育。棄掉包板抗體，以300uL每孔向板中加入封閉液(PBS+1% BSA)，4℃過夜孵育。待測上清用封閉液稀釋至合適濃度(一般在1：3-1：7)，100uL每孔加入包好的ELISA板。IFNα檢測標準品用封閉液以2倍梯度稀釋(最高濃度1000pg/mL，8個濃度點，最後1個點為0)，100uL每孔加入包好的ELISA板。ELISA板放置37℃培養箱孵育1小時。洗板3次，以100uL每孔加入檢測抗體MT2/4/6(1：1000)，37℃培養箱孵育1小時。洗板3次，以100uL每孔加入第二抗體SA-HRP(1：1000)。37℃培養箱孵育0.5小時。洗板3次，以100uL每孔加入TMB顯色液，顯色至合適時間以50uL每孔加入1×HCl。用ELISA讀板機讀取OD₄₅₀nm讀數，並用GraphPad Prism6作擬合曲線計算上清中IFNα濃度。

相比較於野生型Fc抗體和BIIB059抗體，Fc改造後的抗體在SLE-IC刺激條件下具有更強的IFNα抑制效果，在0.016nM實現了完全的IFNα分泌抑制。具體見圖7和表11。

表11 突變的人源化抗體抑制SLE-IC刺激人PBMC細胞釋放細胞因子IFNα

本發明所述方法和系統的多種修改和變化對於所屬技術領域具有通常知識者將顯而易見，而不脫離本發明的範圍和精神。雖然已經聯繫具體的較佳實施方案描述本發明，應當理解如要求的本發明不應不當地受限於此類具體的實施方案。實際上，用於實施本發明的所述模式的多種修改，對於分子生物學、免疫學或相關領域的通常知識者顯而易見，意在屬於所附申請專利範圍的範圍內。

序列列表(均為胺基酸序列，序列的定義/說明參見本文前述部分)：

TW202400652A_112119159_SEQL.xml

Claims

一種抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗BDCA2抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和/或輕鏈可變區：

該重鏈可變區包含：

(I)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(II)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(III)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(IV)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(V)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(VI)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(VII)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：47所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：50和SEQ ID NO：47所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(VIII)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：53所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(IX)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或與SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：37所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

和/或

該輕鏈可變區包含：

(I)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(II)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(III)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(IV)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(V)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：42所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(VI)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(VII)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：49所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：49所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(VIII)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：42所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(IX)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或與SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示胺基酸序列分別具有1、2或3個胺基酸差異的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
如請求項1所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：

(I)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：53所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(II)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(III)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26所示的HCDR1、HCDR2，如SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：37所示的HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(IV)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(V)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：42所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(VI)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31所示的HCDR1、SEQ ID NO：46或50所示的HCDR2和SEQ ID NO：47所示的HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34所示的LCDR1、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：51所示的LCDR2和SEQ ID NO：49所示的LCDR3；或

(VII)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：86所示的LCDR1、SEQ ID NO：15所示的LCDR2和SEQ ID NO：16所示的LCDR3。
如請求項1或2所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區：

(I)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：61所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(II)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：65所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：66所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(III)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：67所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(IV)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：69所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：70所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(V)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：71所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：68所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(VI)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：72所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：73所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(VII)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：76所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：77所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(VIII)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：80所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：79所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(IX)該重鏈可變區包含如SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：82所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和該輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：83所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99% 序列同一性的胺基酸序列。
如請求項1或2所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含：

(I)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：87-110中任一項所示的胺基酸序列，或包含與87-110中任一項所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：135-158中任一項所示的胺基酸序列，或包含與135-158中任一項所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(II)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：111-134中任一項所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：111-134中任一項所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：159-182中任一項所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：159-182中任一項所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(III)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：89所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：137所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：137所示的胺基酸序列具有至少95%，96%，97%，98%或99%序列同一性的胺基酸序列；

(IV)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：106所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：154所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：154所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；

(V)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：114所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列，或包含與SEQ ID NO：162所示的胺基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列；或

(VI)重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區和輕鏈可變區包含如表C中任一組合所示的胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體選自鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人抗體。
如請求項1至4中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv和sdAb。
如請求項1至4中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段是任何IgG亞型，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，較佳為IgG1亞型。
如請求項4所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含以下序列或由其組成：

(I)胺基酸序列如SEQ ID NO：183所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：186所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈；或

(II)胺基酸序列如SEQ ID NO：184所示或與其具有至少95%、96%、97%、 98%或99%序列同一性的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：187所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈；或

(III)胺基酸序列如SEQ ID NO：185所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：188所示或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的輕鏈。
如請求項8所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含以下序列或由其組成：

(I)與SEQ ID NO：183所示的胺基酸序列具有1、2或3個胺基酸差異的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：186所示的輕鏈；或

(II)與SEQ ID NO：184所示的胺基酸序列具有1、2或3個胺基酸差異的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：187所示的輕鏈；或

(III)與SEQ ID NO：185所示的胺基酸序列具有1、2或3個胺基酸差異的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：188所示的輕鏈。
如請求項8所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含以下序列或由其組成：

(I)胺基酸序列如SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192或SEQ ID NO：193所示的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：186所示的輕鏈；或

(II)胺基酸序列如SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195或SEQ ID NO：196所示的重鏈，和胺基酸序列如SEQ ID NO：187所示的輕鏈。
一種多核苷酸分子，其編碼如請求項1至10中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段。
一種表達載體，其包含如請求項11所述的多核苷酸分子，較佳地，該表達載體為真核表達載體。
一種宿主細胞，其包含如請求項11所述的多核苷酸分子或如請求項12所述的表達載體，較佳地，該宿主細胞是真核細胞，更佳哺乳動物細胞。
一種製備如請求項1至10中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括在適合於該抗體或其抗原結合片段表達的條件下在請求項13所述的宿主細胞中表達該抗體或其抗原結合片段，並從該宿主細胞回收所表達的抗體或其抗原結合片段。
一種免疫綴合物，其包含如請求項1至10中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段與至少一種治療劑或診斷劑綴合，較佳地，抗炎藥或免疫抑制劑。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至10中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段、如請求項11所述的多核苷酸分子、如請求項12所述的表達載體、如請求項13所述的宿主細胞、如請求項15所述的免疫綴合物，和藥學上可接受的載體或賦形劑。
一種抑制受試者免疫細胞釋放細胞因子超出的方法，該方法包括將如請求項1至10中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段、如請求項15所述的免疫綴合物或如請求項16所述的醫藥組成物接觸受試者免疫細胞，較佳地，該免疫細胞為CpG-A刺激的PBMC細胞。
一種如請求項1至10中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段、如請求項15所述的免疫綴合物或如請求項16所述的醫藥組成物在製備用於治療和/或預防BDCA2介導的疾病的藥物中的用途，較佳該疾病為炎症性疾病；更佳地，該炎症性疾病選自全身性紅斑狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡性腎炎、表皮性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、炎性腸疾病、全身性硬化症(硬皮病)、銀屑病、I型糖尿病、皮肌炎和多肌炎。
一種試劑盒，其包括如請求項1至10中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段、如請求項15所述的免疫綴合物或如請求項16所述的醫藥組成物。
一種使用如請求項1至10中任一項所述的抗BDCA2抗體或其抗原結合片段或含有該抗體或其抗原結合片段的檢測組成物檢測BDCA2在樣品中的存在的方法，包括使該抗體或其抗原結合片段或含有該抗體或其抗原結合片段的檢測組成物與該樣品接觸的步驟。