[go: up one dir, main page]

RS58709B1 - Miševi koji čine antitela teškog lanca - Google Patents

Miševi koji čine antitela teškog lanca

Info

Publication number
RS58709B1
RS58709B1 RS20190538A RSP20190538A RS58709B1 RS 58709 B1 RS58709 B1 RS 58709B1 RS 20190538 A RS20190538 A RS 20190538A RS P20190538 A RSP20190538 A RS P20190538A RS 58709 B1 RS58709 B1 RS 58709B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
gene
human
light chain
locus
Prior art date
Application number
RS20190538A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS58709B1 publication Critical patent/RS58709B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST
[0001] Genetski modifikovani miševi koji obuhvataju nepreraspoređeni segment gena ljudskog λ lakog lanca imunoglobulina (hVλ) i ljudski λ spojni segment gena (hJλ) koji su funkcionalno povezani sa konstantnim regionom mišjeg kappa (κ) lakog lanca. Genetski modifikovani miševi koji ispoljavaju antitela koja obuhvataju laki lanac imunoglobulina koji obuhvata preraspoređenu ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu.
PRETHODNO STANJE TEHNIKE
[0002] Miševi koji ispoljavaju antitela koja su potpuno ljudska, ili delimično ljudska i delimično mišja, su poznati u ovoj oblasti. Na primer, transgenski miševi koji ispoljavaju potpuno ljudska antitela iz transgena koji sadrže ljudske gene promenljivog regiona imunoglobulina lakog i teškog lanca. Genetski modifikovani miševi koji sadrže zamenu endogenih mišjih segmenata gena promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) i promenljivog regiona kapa (κ) lakog lanca (LCVR) segmente gena sa ljudskim HCVR i LCVR segmente gena i koji prave himerna antitela s himenim ljudskim/mišjim kapa lancem, takođe su poznati.
[0003] Laki lanci antitela se enkodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (κ) i lambda (λ). Laki lanci mišjeg antitela su primarno κ tipa. Odnos κ prema λ upotrebi lakog lanca kod ljud je oko 60:40, dok je kod miševa oko 95:5. Preferirana upotreba κ lakih lanaca kod miševa je prema izveštajima zadržana kod genetski modifikovanih miševa sposobnih da ispolje potpuno ili delimično ljudska antitela. Dakle, izgleda da su miševi koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela ograničeni u pogledu upotrebe promenljivog lambda lanca.
[0004] Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da se generišu promenljivi regioni lambda lanca, bilo mišjeg ili ljudskog, za upotrebu za pravljenje proteina za vezivanje epitopa. Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike za miševima koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu promenljivu upotrebu lambda (Vλ) lanca.
[0005] Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da miševi koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu λ promenljivu (Vλ) upotrebu WO 00/26373 se odnosi na mišje ispoljavanje ljudskog Ig λ lokusa.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0006] Ovaj pronalazak u svom najširem smislu jeste kako je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima. Opisuju se genetski modifikovani miševi, embrioni, ćelije, tkiva, kao i konstrukti nukleinske kiseline za modifikovanje miševa, i postupci i jedinjenja za pravljenje i korišćenje istih. Miševi i ćelije koje generišu ljudske lambda (λ) promenljive regione u kontekstu mišjeg kapa (κ) lakog lanca su obezbeđeni kako se navodi u patentnim zahtevima. Miševi i ćelije koje generišu ljudske λ promenljive regione u ovom kontekstu κ ili λ lakog lanca, npr. iz endogenog mišjeg lokusa lakog lanca se, takođe, opisuju. Takođe, opisani su postupci za pravljenje antitela koja obuhvataju lambda promenljive regione. Postupci za odabri teških lanaca koji se ispoljavaju sa poznatim lambda promenljivim regionima se, takođe, opisuju.
[0007] Opisuju se himerni i ljudski proteini za vezivanje antigena (npr., antitela), i nukleinksa kiselina koja ih kodra, tako da obuhvataju soamtski mutirane promenljive regione, uključujući antitela koja imaju lake lance koji obuhvataju promenljiv domen izveden iz ljudskog Vλ i ljudskog Jλ segmenta gena spojenog na mišji konstantni domen kapa lakog lanca.
[0008] Ovaj pronalazak obezbeđuje miša koji obuhvata nepreraspoređeni ljudski λ segment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (hVλ) i ljudski λ spojni segment gena (hJλ) koji su funkcionalno povezani na mišji konstantni segment gena kapa lakog lanca imunoglobulina (Cκ) na endogenom mišjem κ lokusom lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se na pomenutom lokusu κ element intronskog pojačavača uzvodno od Cκ gena (naznačeni Eκi) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (naznačeni Eκ3’) zadržavaju, pri čemu miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu.
[0009] Ovaj pronalazak još obezbeđuje:
izolovanu ćeliju koja ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji sadrži preraspoređenu ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu, pri čemu je ćelija iz, ili ju je moguće dobiti iz, miša prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, i pri čemu ćelija obuhvata hVλ i hJλ koji su funkcionalno povezani na mišji Cκ segment gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se zadržava na pomenutom lokusu κ intronskog element pojačavača uzvodno od Cκ gena (označen sa Eκi) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (označen sa Eκ3’) su zadržani;
izolovana mišja embrionska matična (ES) ćelija obuhvata nepreraspoređeni ljudski λ segment gena lakog lanca imunoglobulina (hVλ) i ljudski λ spojni segment gena (hJλ) koji su funkcionalno povezani na mišji Cκ segment gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se održava na pomenutom lokusu κ intronski element pojačavača uzvodno od Cκ gena (označen sa Eκi) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (označen sa Eκ3’);
mišji embrion obuhvata, napravljen iz, ili koji se može dobiti iz, pomenute mišje ES ćelije, pri čemu izolovani mišja embrionska matična ćelija obuhvata nepreraspoređen ljudski λ segment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (hVλ) i ljudski λ spojni segment gena (hJλ) koji su funkcionalno povezani na mišji Cκ segment gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se na pomenutom lokusu održava κ intronski element pojačavača uzvodno od Cκ gena (onačen sa Eκi) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (označen sa Eκ3’);
hibridom koji obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz miša prema ovom pronalasku, preraspoređena sekvenca obuhvata hVλ segment gena, hJλ segment gena funkcionalno povezan na mišji Cκ segment gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se na pomenutom lokusu održava κ element intronskog pojačava uzvodno od Cκ gena (označen sa Eκi) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (označen sa Eκ3’), i gde hibridom ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu; i
upotrebu B ćelije prema ovom pronalasku da se napravi hibridom koji obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz miša prema patentnom zahtvu 1, preraspoređena sekvenca obuhvata hVλ segment gena, hJλ segment gena funkcionalno povezan na mišji Cκ segment gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca imunoglobulina pri čemu se na pomenutom lokusu održava κ intronski element pojačavača uzvodno od Cκ gena (označenog sa Eκi) 3’κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (označen sa Eκ3’), i pri čemu hibridom ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu.
[0010] Ovaj pronalazak još obezbeđuje miša koji obuhvata:
(a) 12 do 40 nepreraspoređenih λ segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina (hVλ) i barem jedan ljudski Jλ (hJλ) segment gena koji se funkcionalno povezuje na mišji Cκ gen na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca imunoglobulina; pri čemu se na pomenutom lokusu održavaκ element intronskog pojačavača uzvodno od Cκ gena (označen sa Eκi) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (označen sa Eκ3’); i
(b) ljudska Vκ-Jκ sekvenca intergenske nukleinske kiseline koja je smeštena između 12 do 40 ljudskih segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina i najmanje jedna ljudska Jλ sekvenca nukleinske kiseline;
pri čemu miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu.
[0011] Ovaj pronalazak još obuhvata postupak za pravljenje antitela u mišu, postupak obuhvata:(a) izlaganje miša prema ovom pronalasku antigenu; (b) omogućavanje mišu da razvije imuni odgovor na antigen; i (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje ovaj antigen, pri čemu antielo obuhvata laki lanac izveden iz ljudskog Vλ segmenta gena, ljudskog Jλ segmenta gena i mišjeg Cκ gena.
[0012] Opisana su antitela koja obuhvataju (a) promenljivi domen ljudskog teškog lanca (hVH) spojen na mišji konstantni region teškog lanca, i (b) ljudski Vλ spojen na mišji CLdomen; uključujući gde su jedan ili više promenljivih domena somatski mutirani, npr. tokom antitela ili odabira imune ćelije kod miša prema ovom pronalasku. Ovi nepreraspoređeni hVλ i nepreraspoređeni hJλ su funkcionalno povezani sa ljudskim ili mišjim κ konstantnim regionom (Cκ).
[0013] Takođe je opisan i miš koji sadrži svoju klicinu liniju, na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca, pri čemu se ljudska lambda sekvenca promenljivog regiona ispoljava u lakom lancu koji obuhvata mišju sekvencu gena konstantnog regiona imunoglobulina.
[0014] Endogeni mišji lokus lakog nca je κ lokus.
[0015] U jednom varijantnom rešenju, mišu nedostaje endogena sekvenca promenljivog lakog lanca na endogenom mišjem lokusu lakog lanca.
[0016] U jednom varijantnom rešenju, svi ili pretežno svi endogeni mišji segmenti gena promenljivog regiona lakog lanca se zamene jednim ili više ljudskih λ segmenata gena promenljivog regiona.
[0017] U jednom aspektu, sekvenca varijabilnog regiona humanog lakog lanca sadrži genomski fragment klastera A i genomski fragment klastera B. U jednom aspektu, sekvenca varijabilne regije lakog lanca čoveka sadrži najmanje jedan genski segment klastera A i najmanje jedan segment gena klastera B.
[0018] Upotrebljeni genetski modifikovani miš je onaj gde genetska modifikacija sadrži modifikaciju nukleotidne sekvence koja kodira konstantni region IgG, pri čemu modifikacija rezultira gubitkom funkcije CH1 domena IgG konstantnog regiona. U jednoj realizaciji, modifikacija gubitka funkcije je brisanje nukleotidne sekvence koja kodira CH1 domen, ili delecija unutar nukleotidne sekvence koja kodira CH1 domen
[0019] Takođe je opisan, miš koji eksprimira lak lanac imunoglobulina koji sadrži reorganizovanu ljudsku sekvencu V-J i mišju C sekvencu, gde miš pokazuje odnos od upotrebe do upotrebe od oko 1: 1 .
[0020] U jednom varijantnom rešenju, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata genomski fragment skupine A i genomski fragment skupine B. U jednom varijantnom rešenju, ljudska λ sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata najmanje jedan segment gena skupine A i najmanje jedan segment gena skupine B.
[0021] U jednom varijantnom rešenju, više od 10% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje dva hVλ segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom varijantnom rešenju, više od 20% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje tri hVλ segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom varijantnom rešenju, više od 30% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje četiri hVλ segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49.
[0022] Takođe je opisan, miš koji ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata preraspoređenu ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu, pri čemu miš ispoljava κ upotrebu prema λ odnosu upotrebe od oko 1:1.
[0023] U jednom primeru, laki lanac imunoglobulina se ispoljava iz endogenom mišjeg lokusa lakog lanca.
[0024] Takođe je opisan miš koji obuhvata λ sekvencu promenljivog regiona lakog lanca (Vλ) i barem jednu J sekvencu (J), dodirnu sa mišjom κ sekvencom konstantnog regiona lakog lanca.
[0025] U jednom varijantnom rešenju, mišu nedostaje funkcionalni mišji Vκ i/ili mišji Jκ segment gena.
[0026] U jednom varijantnom rešenju, Vλ je ljudki Vλ (hVλ), i J je ljudski Jλ (hJλ) U jednom varijantnom rešenju, hVλ i hJλ su neprereaspoređeni segmenti gena.
[0027] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata više nepreraspoređenih hVλ segmenata gena i barem jedan hJλ segment gena. U jednom specifičnom varijantnom rešenju, više nepreraspoređenih hVλ segmenata gena su barem 12 segmenata gena, barem 28 segmenata gena, ili barem 40 segmenata gena.
[0028] U jednom izvođenju, miš sadrži segment neogranizovanog humanog varijabilnog regiona imunoglobulina (hVR) na endogenom lokusu varijabilnog regiona teškog lanca miša. sekvenca regiona na lokusu endogenog varijabilnog regiona teškog lanca miša U jednom izvođenju, segmenti hVR gena su iz familije humanog VH gena izabranog od VH1, VH3, VH4, i njihove kombinacije. segmenti su odabrani od 1-2, 1-8, 1-18, 1-46, 1-69, 3-21, 3-72 i 4-59. U specifičnoj realizaciji, jedan ili više segmenata hVR gena su odabrano od 1-8, 1-18 i 1-69.
[0029]U jednom izvođenju, svi ili suštinski svi segmenti V gena teškog lanca miša su zamenjeni sa jednim ili više humanih V gena segmenta teškog lanca. Segmenti gena V i D. U jednoj realizaciji, svi segmenti V, D i J gena mišjeg teškog lanca su zamenjeni jednim ili više humanih teških lanaca V, jednim ili više humanih teških lanaca D, i jedan ili više humanih teških lanaca U ovim realizacijama, segmenti V i / ili D i / ili J gena teškog lanca su na lokusu mišjeg endogenog teškog lanca i operativno su vezani za modifikovani gen (i) mišjeg konstantnog regiona.
[0030] U jednom aspektu, miš dalje sadrži humani V-J intergenski region iz ljudskog lokusa lakog lanca, gde je humani V-J intergenski region susedan sa V sekvencom i J sekvencom. humani V-J intergenski region se nalazi između V sekvence i J sekvence .
[0031] U jednom varijantnom rešenju, oko 10% do oko 45% B ćelija miša ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji sadrži ljudski λ promenljivi domen lakog lanca (Vλ) i mišji κ konstantni domen lakog lanca (Cκ).
[0032] U jednom varijantnom rešenju, ljudski λ promenljivi domen se izvodi iz preraspoređene hVλ/hJλ sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-1013, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 i 1-51/1.
[0033] U jednom varijantnom rešenju, miš još obuhvata ljudski Vκ-Jκ intergenski region iz ljudskog κ lokusa lakog lanca, pri čemu ljudski Vκ-Jκ intergenski region je dodiran sa Vλ sekvencom i J sekvencom. U specifičnom izvođenju, ljudski Vκ-Jκ intergenski region se postavlja između Vλ sekvence i J sekvence.
[0034] Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata λ promenljivu sekvencu i κ konstantnu sekvencu.
[0035] Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin Vλ i Jλ segment gena funkcionalno povezan na mišji lokus lakog lanca koji obuhvata mišji CLgen.
[0036] U jednom varijantnom rešenju, populacija nezrelih B ćelija dobijenih iz koštane srži miša ispoljava κ upotrebu prema λ odnosu upotrebe od oko 1:1.
[0037] Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulin Vλ i Jλ segment gena funkcionalno povezan na mišji lokus lakog lanca koji obuhvata mišji CLgen.
[0038] Vλ i Jλ segmente gena su segmenti ljudskog gena.
[0039] U jednoj realizaciji, miš sadrži zamenu endogenog segmenta mVR gena sa segmentom hVR gena. U specifičnoj realizaciji zamena segmenta mVR gena sa segmentom hVR gena je na istom alelu kao i modifikovani konstantni region teškog lanca. U drugoj specifičnoj realizaciji, zamena segmenta mVR gena sa segmentom hVR gena je na različitom alelu od modifikovanog konstantnog regiona teškog lanca.
[0040] Miš dalje sadrži zamenu jednog ili više segmenata V, D i / ili J teškog lanca sa jednim ili više humanih segmenata V, D i / ili J na endogenom lokusu imunoglobulina teškog lanca miša.
[0041] U jednom varijantnom rešenju, miš još obuhvata zamenu jednog ili više teškog lanca V, D, i/ili J segmenata gena sa jednim ili više ljudskih V, D, i/ili J segmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca.
[0042] Miš obuhvata nepreraspoređenom ljudskom imunolobulinom Vλ i Jλ segment gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cκ gen.
[0043] U jednom aspektu, upotrebljeni genetski modifikovani miš je onaj gde miš eksprimira IgM koji sadrži CH1 domen, a miš eksprimira IgG koji nema funkcionalni CH1 domen ili koji eksprimira IgG koji nema i funkcionalni CH1 domen i koji nema funkcionalnu regiju.
[0044] U jednom varijantnom rešenju, κ lokus obuhvata najviše četiri hJλ segmenata gena. U jednom varijantnom rešenju, κ lokus obuhvata najmanje jedan hVλ i najmanje jedan hJλ i nedostaje ili pretežno nedostaje funkcionalni Vκ segment gena regiona i nedostaje ili pretežno nedostaje funkcionalni Jκ segment gena regiona. U jednom varijantnom rešenju, miš ne obuhvata funkcionalni Vκ segment gena regiona. U jednom varijantnom rešenju, miš ne sadrži funkcionalni Jκ segment gena regiona.
[0045] U jednom varijantnom rešenju, Vκ lokus obuhvata više hVλ. U jednom varijantnom rešenju, više hVλ se bira tako da kao rezultat da ispoljavanje λ repertoara promenljivog regiona lakog lanca koji odražava oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, ili oko 90% ili više, Vλ upotrebu primećenu kod čoveka. U jednom varijantnom rešenju, Vκ lokus obuhvata segmente gena hVλ 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, i njihovu kombinaciju.
[0046] U jednom varijantnom rešenju, hVλ obuhvata 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12. U specifičnom varijantnom rešenju, Vκ lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog λ lakog lanca koja se prostire od Vλ3-12 do Vλ3-1. U jednom varijantnom rešenju, VLlokus obuhvata barem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 hλks. U jednom varijantnom rešenju, hVλ obuhvata 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12. U specifičnom varijantnom rešenju, Vκ lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog λ lokusa koji se prostire od Vλ3-12 do Vλ3-1. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni λ lokusi lakog lanca se brišu delimično ili potpuno.
[0047] U jednom varijantnom rešenju, Vκ lokus obuhvata 13 do 28 ili više hVλ. U specifičnom varijantnom rešenju, hVλobuhvata 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, i 3-27. U specifičnom varijantnom rešenju, κ lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog λ lokusa koji se prostire od Vλ3-27 do Vλ3-1. Vκ lokus je na endogenom κ lokusu. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni λ lokusi lakog lanca se brišu delimično ili potpuno.
[0048] U jednom varijantnom rešenju, Vκ lokus obuhvata 29 do 40 hVλ. U specifičnom varijantnom rešenju, κ lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog λ lokusa koji se prostire od Vλ3-29 do Vλ3-1, i dodirnu sekvencu ljudskog λ lokusa koji se prostire od Vλ5-52 do Vλ1-40. U specifičnom varijantnom rešenju, sve ili pretežno sve sekvence između hVλ1-40 i hVλ3-29 u genetski modifikovanom mišu obuhvataju u suštini ljudsku λ sekvencu od približno 959 bp pronađenu u prirodi (npr., u ljudskoj populaciji) nizvodno od hVλ1-40 segmenta gena (nizvodno od 3’ neprevedenog dela), mesto reakcije enzima (npr., PI-SceI), posle čega sledi ljudska λ sekvenca od približno 3.431 bp uzvodno od hVλ3-29 segmenta gena pronađenog u prirodi. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni mišji λ lokusi lakog lanca se brišu delimično ili potpuno.
[0049] U jednom izvođenju, gde varijabilni domen teškog lanca sisara je humani ili mišji promenljivi domen teškog lanca
[0050] Vκ lokus obuhvata najmanje jedan hVλ, najmanje jedan hJλ, i mišji Cκ gen.
[0051] U jednom varijantnom re[enju, miš obuhvata zamenu na endogenom mišjem κ lokusu endogenih mišjih Vκ segmenata gena s jednim ili više hVλ segmenata gena, pri čemu su hVλ segmenti gena funkcionalno povezani na endogeni mišji gen Cκ regiona, tako da miš preraspoređuje ljudske Vλ segmente gena i ispoljava reverzni himerni laki lanac imunoglobulina koji obuhvata ljudski Vλ domen i mišji Cκ. U jednom varijantnom rešenju, 90 -100% nepreraspoređenih mišjih Vκ segmenata gena se zameni najmanje jednim nepreraspoređenim hV λ segmentom gena. U specifičnom varijantnom rešenju, Vκ segmenti gena se zamene najmanje jednim nepreraspoređenim hVλ segmentom gena. U jednom varijantnom rešenju, zamena je sa najmanje 12, najmanje 28, ili najmanje 40 nepreraspoređenih hVλ segmenata gena. U jednom varijantnom rešenju, zamena je sa najmanje 7 funkcionalnih nepreraspoređenih hVλ segmenata gena, najmanje 16 funkcionalnih nepreraspoređenih hVλ segmenata gena, ili najmanje 27 funkcionalnih nepreraspoređenih hVλ segmenata gena. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata zamenu svih mišjih Jκ segmenata gena sa najmanje jednim nepreraspoređenim hJλ segmentom gena. U jednom varijantnom rešenju, najmanje jedan neprerasporešeni hJλ segment gena se bira iz Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ4, Jλ5, Jλ6, Jλ7, i njihove kombinacije. U specifičnom varijantnom rešenju hVλ segment gena se bira iz 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 hVλ segment gena, i njihova kombinacija. U specifičnom varijantnom rešenju, najmanje jedan nepreraspoređeni hJλ segment gena se bira iz Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ7, i njihove kombinacije.
[0052] Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji obuhvata ljudsku Vκ-Jκ sekvencu intergenskog regiona koja se nalazi na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca.
[0053] U jednom varijantnom rešenju, ljudska Vκ-Jκ sekvenca intergenskog regiona je na endogenom κ lokusu lakog miša koji sadrži hVλ i hJλ segment gena, i ljudska Vκ-Jκ sekvenca intergenskog regiona se raspoređuje između hVλ i hJλ segmenata gena. U specifičnom varijantnom rešenju, hVλ i hJλ segmenti gena su sposobni da rekombinuju oblik funkcionalnog ljudskog λ promenljivog domena lakog lanca kod miša.
[0054] U jednom slučaju, varijabilni domen koji nije camelid je somatski mutirani humani ili mišji teški lanac varijabilnog domena koji je dobiven iz IgM- ili IgG-kodirajuće nukleotidne sekvence B ćelije od miša ili genetski modifikovanog miša koji sadrži ljudski teški segmentu gena varijabilne regije lanca.U specifičnoj realizaciji, miš sadrži humanizovani segment gena varijabilnog regiona teškog lanca.U drugom izvođenju, miš sadrži zamenu lokusa segmenta gena segmenta endogenog mišjeg teškog lanca mišjeg lanca sa najmanje jednim humanim varijabilnim regionom U drugom izvođenju, miš sadrži zamenu endogenog lokusa teškog lanca miša sa najmanje jednim segmentom humanog varijabilnog gena, najmanje jednim segmentom humanog D gena, i najmanje jednim segmentom humanog J gena. lokus endogene varijabilne regije imunoglobulina miša je sve ili suštinski sve zamenjeno lokusom varijabilne regije humanog imunoglobulina koji sadrži množinu humanih segmenata V, D i J gena.
[0055] U jednom aspektu, varijabilni domen koji nije camelid je humani varijabilni domen. U drugoj realizaciji, varijabilni domen koji nije camelid je humani varijabilni domen koji sadrži jednu ili više modifikacija kamilisa. L11S, V37F, G44E, L45C, L45R i V47G (Kabatova numeracija) .U specifičnoj realizaciji, modifikacija kamelizacije je izabrana od V37F, G44E i L45C. U specifičnoj realizaciji, varijabilni domen teškog lanca sadrži region za određivanje komplementarnosti 3 (CDR3) koji sadrži dva cisteina.
[0056] Takođe je opisana ćelija miša (npr.; mišja embrionska matična ćelija), mišji embrion, i mišje tkivo koji obuhvataju formulisanu ljudsku sekvencu Vκ-Jκ intergenskog regiona, pri čemu je intergenski region sekvence sekvenca intergenskog regiona ektopičan. U specifičnom varijantnom rešenju, ektopična sekvenca se postavlja na humanizovano mesto endogenog mišjeg imunoglobulina.
[0057] U jednom izvođenju, genetski modifikovani miš koji stvara antitela teškog lanca je miš, kao što je ovde opisano. U jednom izvođenju, miš sadrži najmanje jedan segment mVR gena koji je operativno povezan sa konstantnim lokusom teškog lanca koji sadrži intaktni IgM gen i koji sadrži IgG gen koji nema CH1 domen ili kome nedostaje CH1 domen i kojem nedostaje šarki domen. U jednom izvođenju, IgG gen je IgGl gen. U jednom izvođenju, IgG gen je izabran od IgGl, IgG2A, IgG2B, IgG3, i njihove kombinacije.
[0058] U jednom slučaju, ćelija je izabrana iz mišje ES ćelije, pluripotentne ćelije i totipotentne ćelije.
[0059] U jednom varijantnom rešenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je κ lokus. U specifičnom varijanom izvođenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je λ lokus.
[0060] U jednom varijantnom rešenju, ne više od dva alela lakog lanca se bira iz κ alela i λ alela, dva κ alela, i dva λ alela. U jednom specifičnom varijantnom rešenju, jedan od dva alela lakog lanca je λ alel koji obuhvata Cλ2 gen.
[0061] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata jedan funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina i jedan nefunkcionalni lokus lakog lanca, pri čemu funkcionalni lokus lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski imunoglobulin Vλ i Jλ segmenta gena na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cκ gen.
[0062] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata jedan funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina i jedan nefunkcionalni lokus lakog lanca, pri čemu funkcionalni lokus lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski imunoglobulin Vλ i Jλ segmenta gena na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Cλ gen. U jednom varijantnom rešenju, Cλ gen je Cλ2. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji Cλ gen je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjem Cλ2.
[0063] U jednom varijantnom rešenju, miš još obuhvata barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina. U jednom varijantnom rešenju, barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina obuhvata ljudski VHsegment gena, ljudski DHsegment gena i ljudski JHsegmenta na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata ljudski gen teškog lanca koji ispoljava ljudski/mišji teški lanac. U specifičnom varijantnom rešenju, miš obuhvata dva alela teškog lanca imunoglobulina, i miš ispoljava ljudski/mišji teški lanac.
[0064] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata prvi alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVκ i nepreraspoređeni hJκ, na endogenom mišjem κ lokusu koji obuhvata endogeni Cκ gen; i drugi alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVλ i nepreraspoređeni hJλ, na endgoenom mišjem κ lokusu koji obuhvata endogeni Cκ gen. U specifičnom varijantnom rešenju, prvi i drugi alel lakog lanca su jedini funkcionalni aleli lakog lanca genetski modifikovanog miša. U specifičnom izvođenju, miš obuhvata nefunkcionalni λ lokus. U jedno varijantno rešenje, genetski modifikovan miš koji ne ispoljava laki lanac koji obuhvata λ konstantni region.
[0065] Miš dalje sadrži najmanje jedan alel imunoglobulinskog teškog lanca. U jednom aspektu, najmanje jedan alel imunoglobulinskog teškog lanca sadrži humani segment VH gena, segment humanog DH gena i humani segment JH gena kod endogenog lokus teškog lanca miša koji sadrži gen za humani teški lanac koji eksprimira teški lanac čovek / miš, u specifičnom aspektu, miš sadrži dva alela imunoglobulinskog teškog lanca, a miš eksprimira teški lanac čovek / miša .
[0066] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za humanizovanje antitela mišjeg teškog lanca, koji obuhvata imunizaciju genetički modifikovanog miša koji pravi antitela teškog lanca sa antigenom od interesa, dozvoljavajući mišu da montira imuni odgovor, identifikujući mišji VH region miša koji je kodiran u B ćeliji miša, pri čemu B ćelija specifično vezuje antigen od interesa i humanizuje VH region.
[0067] U jednom izvođenju, genetički modifikovani miš koji proizvodi antitela teškog lanca je miš, kao što je ovde opisano. U jednom izvođenju, miš sadrži najmanje jedan segment mVR gena koji je operativno povezan sa konstantnim lokusom teškog lanca koji sadrži intaktni IgM gen i koji sadrži IgG gen koji nema CH1 domen ili kome nedostaje CH1 domen i kojem nedostaje šarki domen. U jednom izvođenju, IgG gen je IgGl gen. U jednom slučaju, IgG gen je izabran od IgGl, IgG2A, IgG2B, IgG3, i njihove kombinacije.
[0068] U jednom izvođenju, postupak dalje obuhvata kloniranje nukleotidne sekvence koja kodira humanizovani VH region na nukleotidnu sekvencu humanog konstantnog regiona imunoglobulina.
[0069] U jednom izvođenju, mišji mVR genski segment je iz porodice miša VH gena izabranog od VH1 i VH14, a humanizacija obuhvata zamenu mišjeg okvira VH1 ili VH14 sa okvirom iz humanog VH1 gena. U jednom izvođenju, humani VH1 gen je izabran od 1-2, 1-3, 1-8, 1-17, 1-18, 1-24, 1-45, 1-46, 1-58 i 1-69. U specifičnim izvođenjima, mVR gen je 1-58 gen i humani gen je 1-18 gen; mVR gen je 1-26 gen i humani gen je 1-2 gen; gen mVR je 1-50 gen i humani gen je 1-46 gen; gen mVR je gen 1-17 i humani gen je 1-2 gen; mVR gen je 1-42 gen i humani gen je 1-2 gen; mVR je 14-1 gen i humani gen je 1-2 gen; ili mVR je 14-2 gen i humani gen je 1-2 gen.
[0070] U jednom izvođenju, segment mVR gena je iz mišjeg VH gena izabranog od VH4, VH5, VH6, VH7, VH10, VH11 i VH13 gena, a humanizacija obuhvata zamenu okvira miša sa okvirom od humanog VH3 gen. U jednom izvođenju, primer, humani VH3 gen je izabran od 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3- 30, 3-33, 3-35, 3-38, 3-43, 3-48, 3-49, 3-53, 3-64, 3-66, 3-72, 3-73 i 3-74 . U specifičnoj realizaciji, mVR gen je 7-1 gen i humani gen je 3-72 gen; mVR gen je 3-6 gen i humani gen je 4-59 gen; mVR gen je 5-6 gen i humani gen je 3-21 gen.
[0071] U jednom izvođenju, segment mVR gena je iz porodice miša VH gena izabranog od VH3 i VH12, a humanizacija obuhvata zamenu okvira miša sa okvirom iz humanog VH4 gena. U jednoj realizaciji, humani VH4 gen je odabran od 4-4, 4-28, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59 i 4-61.
[0072 U jednom izvođenju, segment mVR gena je iz porodice miša VH4 gena, a humanizacija obuhvata zamenu VH4 okvira miša sa okvirom od humanog VH6 gena. U jednom izvođenju, humani VH6 gen je 6-1.
[0073] U jednom izvođenju, segment mVR gena je iz porodice miša VH9 gena, a humanizacija obuhvata zamenu VH9 okvira miša sa okvirom od humanog VH gena humane VH7 porodice. U jednoj realizaciji, humani VH gen je izabran od 7-4-1 i 7-81.
[0074] U jednom izvođenju, humanizacija dalje obuhvata pravljenje jedne ili više konzervativnih ili nekonzervativnih supstitucija, jednu ili više delecija, i / ili jednu ili više insercija u mišjem CDR tako da mišji CDR odgovara bliže humanom CDR.
[0075] U jednom izvođenju, humanizacija dalje obuhvata pravljenje jedne ili više konzervativnih ili nekonzervativnih supstitucija, jednu ili više delecija, i / ili jednu ili više insercija u ljudskom okviru tako da ljudski okvir bolje odgovara okvirima miša.
[0076] U jednom aspektu, upotrebljeni genetski modifikovani miš sadrži funkcionalni gen lakog lanca imunoglobulina, pri čemu miš eksprimira antitelo teškog lanca kojem nedostaje lak lanac i kojem nedostaje CH1 region ili kome nedostaje CH1 region i region zgloba.
[0077] Miš sadrži gen za imunoglobulin koji nema sekvencu koja kodira CH1 region, ili mu nedostaje sekvenca koja kodira zglob i CH1 region. Imunoglobulinski gen koji nema sekvencu je jedan ili više konstantnih gena teškog lanca. imunoglobulinski gen koji nema sekvencu je izabran iz IgGl, IgG2a, IgG2b i IgG3 gena. Miš sadrži gen konstantnog IgM regiona koji sadrži funkcionalni CH1 domen.
[0078] U jednom varijantnom rešenju, oko 52-70% koštane srži miša su B ćelije (t.j., CD19 pozitivno), od toga oko 31-47% nezrelih B ćelija (t.j., CD19 pozitivno/B220 intermedijar pozitivan/IgM pozitivan) ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVλ domen spojen na mišji Cκ domen.
[0079] U jednom varijantnom rešenju, oko 60% koštane srži miša su B ćelije (t.j., CD19 pozitivno), od toga oko 38,3% nezrelih B ćelija (t.j., CD19 pozitivno/B220 intermedijar pozitivan/IgM pozitivan) ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVλ domen spojen na mišji Cκ domen.
[0080] Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku Vλ-Jλ sekvencu i mišju Cκ sekvencu. Mišji gen konstantnog regiona je Cκ gen. U specifičnom varijantnom rešenju, antitelo još obuhvata teški lanac koji obuhvata promenljivi domen izveden iz ljudskog V, ljudskog D i ljudskog J segmenta gena, i konstantnog domena teškog lanca izvedenog iz mišjeg gena konstantnog domena teškog lanca. U jednom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata spoj-CH2-CH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH1-spoj-CH2-CH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH1-CH2-CH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH2-CH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca.
[0081] U jednom aspektu, genetski modifikovani miš koji se koristi eksprimira vezujući protein koji se u suštini sastoji od dva teška lanca IgG1, od kojih svaki nema CH1 domen, pri čemu miš eksprimira IgM koji sadrži CH1 region, i gde je miš nesposoban za ekspresiju iz njegov genom mRNA koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira CH1 domen IgGl.
[0082] U jednom varijantnom rešenju, miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređeni λ promenljivi region lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata ljudsku Vλ/Jλ sekvencu izabranu iz 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1, 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 i 1-51/1. U jednom specifičnom varijantnom rešenju, B ćelija ispoljava antitelo koje obuhvata promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina čoveka spojen na mišji konstantni domen teškog lanca, i ljudski λ promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina spojen sa mišjim κ konstantim domenom lakog lanca.
[0083] U jednom aspektu, upotrebljeni miš eksprimira antitelo teškog lanca kojem nedostaje lak lanac i kojem nedostaje CH1 region u celini ili delimično, pri čemu miš eksprimira receptor B ćelija na B ćeliji, pri čemu receptor B ćelija na njegovoj površina prikazuje vezujući molekul koji sadrži varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina, fuzionisan direktno za područje imunoglobulinskog zgloba ili fuzionisan direktno za CH2 region, gde vezujući molekul nema CH1 region.U jednoj realizaciji, vezujući molekul sadrži IgGl CH2 i CH3 region.
[0084] U jednom aspektu, obezbeđen je postupak za pravljenje antitela teškog lanca, koji obuhvata imunizaciju miša sa antigenom od interesa, gde miš sadrži IgG gen koji nema sekvencu koja kodira CH1 region, pri čemu miš sadrži intaktni IgM konstantni region gena, koji dozvoljava mišu da montira imuni odgovor protiv antigena od interesa, i izoluje iz miša ćeliju ili protein koji specifično prepoznaje antigen od interesa, pri čemu ćelija ili protein sadrži antitelo teškog lanca kojem nedostaje CH1 domen i nedostaje srodan laki lanac i koji specifično vezuje antigen od interesa.
[0085] U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata (i) lokus teškog lanca koji obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih V, D i J segmenata gena sa svim ili pretežon svim funkcionalnim ljudskim V, D, i J segmentima gena, mišji CHgen, (ii) prvi λ lokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih Vλ i Jλ segmenata gena sa svim, pretežnom svim, ili više, funkcionalniih hVλ i hJλ segmenata gena, i mišjim Cλ genom, (iii) drugi λ lokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih Vλ i Jλ segmenata gena sa svim, pretežno svim, ili više, funkcionalnih hVλ i hJλ segmenata gena, i mišji Cλ gen. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji Cλ gen je Cλ2. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji Cλ gen se izvodi iz Cλ gena koji je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjem Cλ2.
[0086] Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo, pri čemu više od 10%, više od 15%, više od 20%, više od 25%, više od 30%, više od 35%, više od 40%, više od 60%, više od 70%, više od 80%, ili više od 90% ukupnog IgG antitela proizvedenog od strane miša obuhvata λ-izvedeni promenljivi domen, i pri čemu miš ispoljava antitela koja obuhvataju κ-izveden promenljivi domen spojen sa mišjim Cκ regionom. U specifičnim varijantnim rešenjima, oko 15-40%, 20-40%, 25-40%, 30-40%, ili 35-40% ukupnog antitela proizvedenog pomoću miša obuhvata λ-izvedeni promenljivi domen.
[0087] U jednom varijantnom rešenju, λ-izvedeni promenljivi domen se izvodi iz hVλ i hJλ. U jednom varijantnom rešenju, λ izvedeni promenljivi domen je laki lanac koji obuhvata mišji Cκ region. U specifičnom varijantnom rešenju, λ-izvedeni promenljivi region je u lakom lancu koji obuhvata mišji Cλ region. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, Cλ region je Cλ2 region. U jednom varijantnom rešenju, κ-izvedeni održivi domen se izvodi iz hVκ i hJκ, i u specifičnom varijantnom rešenju je u lakom lancu koji obuhvata mišji Cκ region.
[0088] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt koji obuhvata uzvodni homologni krak i nizvodni homologni krak, pri čemu uzvodni i nizvodni homologni kraci ciljaju konstrukt na mišjem κ lokusu, i konstrukt obuhvata funkcionalni nepreraspoređeni hVλ segment i funkcionalni nepreraspoređeni hJλ segment, i sekvencu odabira ili marker sekvencu.
[0089] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence uzvodno od mišje Vλ2, kasete odabira prirubnih 5’ i 3’ sa mestom prepoznavanja rekombinaze, i ciljajućim krakom za ciljanje mišje λ sekvence 3’ mišjeg Jλ2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed Hyg-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, 3’ ciljajući krak obuhvata mišji Cλ2,Jλ4, Cλ4 i mišji pojačavač 2.4.
[0090] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u vezi sa Vλ1, kaseta odabiraprirubnice 5’ i 3’ sa mestom prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišje λ sekvence 3’ sa mišjim Jλ1. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je kaseta neomicina u tečnom kiseoniku. U jednom varijantnom rešenju, 3’ ciljajući krak obuhvata mišji λ 3' pojačavač i mišji λ 3' pojačavač 3.1.
[0091] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u vezi sa Vλ2, kasetu odabira prirubnu 5’ i 3’ sa mestom prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence 3’ u vezi sa mišjim Jλ2 i 5' u vezi sa mišjim Cλ2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, 3’ ciljajući krak obuhvata mišje Cλ2-Jλ4-Cλ4 segmente gena i mišji λ pojačavač 2.4.
[0092] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokus 5’ u vezi sa Vλ2, kasetom odabira prirubnu 5’ i 3’ mestu prepoznavanja rekombinaze, ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-12 nizvodno do kraja hJλ1, i 3’ ciljajući krak za ciljanje mišje λ sekvence 3’ u vezi sa mišjim Jλ2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed kaseta neomicina. U jednom varijantnom rešenju, 3’ ciljajući krak obuhvata mišje Cλ2-Jλ4-Cλ4 segmente gena i mišji λ pojačavač 2.4.
[0093] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-12 nizvodno do kraja hJλ1.
[0094] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokus 5’ u vezi sa Vλ2, kasetom odabira prirubnu 5’ i 3’ sa mesta prepoznavanja rekombinaze i ljudskog genomskog fragmenta koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-27 nizvodno do kraja hJλ2-8. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed higromicin kaseta. U jednom varijantnom rešenju, ljudski genomski fragment obuhvata 3’ ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 53 kb ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-12 nizvodno do kraja hJλ2-8.
[0095] Jednom kada ćelija koja nosi pre-BCR prođe ovaj korak selekcije, sledeći korak odabira zahteva da teški lanac bude uparen sa srodnim lakim lancem (npr., Ili kapa ili lambda kod miševa i ljudi). Spojena struktura teškog lanca / kognata lakog lanca je ponovo prikazana na površini ćelije, sada naivna pre-B ćelija, u kontekstu izotipa IgM preko IgM-ovog CH1 domena. Ovaj kompleks na površini dovodi do funkcionalnog, B-ćelijskog receptora vezanog za membranu (BCR). Veruje se da ovaj BCR signalizira ćeliji da je teški lanac pogodan za dalju selekciju, i da ćelija sada može da se obaveže da eksprimira ovaj određeni laki lanac i da nastavi dalje korake sazrevanja B ćelija, uključujući sazrevanje afiniteta i promenu klase. Ako teški lanac sadrži defekt koji je štetan za formiranje BCR kada je predstavljen u kontekstu IgM i njegovog srodnog lakog lanca, ćelija će biti podvrgnuta apoptozi. Ako se ćelija podvrgne apoptozi, korisnost ili doprinos raznolikosti varijabilnog regiona teškog lanca teškog lanca će biti izgubljena. Stoga, veoma rani korak u selekciji antitela zahteva predstavljanje teškog lanca zajedno sa surogatnim lakim lancem u kontekstu IgM izotipa. Ponovo, neuspeh ili poremećaj u strukturi antitela (npr., Nefunkcionalni CH1 domen) u ovom ranom trenutku može dovesti do klonalne selekcije i propadanja pre-B ćelije koja eksprimira teški lanac.
[0096] Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg λ lokusa 5’ u vezi sa Vλ2, kasetu odabira prirubnu 5’ i 3’ sa mestima prepoznavanja rekombinaze, prvi ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ5-52 nizvodno do kraja hVλ1-40, mesto restrikcionog enzima, i drugi ljudski geomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-29 nizvodno do kraja hJλ82K. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt’ed kasete neomicina. U jednom varijantnom rešenju, mesto restrikcionog enzima je mesto za homing endonukleaze. U specičnom varijantnom rešenju, homing endonukleaza je PI-Scel. U jednom varijantnom rešenju, drugi ljudski genomski fragment je 3’ ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 27 kb ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ3-29 nizvodno do kraja hVλ82K.
[0097] Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog λ lokusa lakog lanca od hVλ5-52 nizvodno do kraja hJλ1-40.
[0098] Jedinjenja i postupci se odnose na izradu miša koji čini antitelo koje nema imunoglobulinski CH1 domen (i opciono šarki region), uključujući antitela teškog lanca, i uključujući antitela koja sadrže VH domene (npr. Mišji ili humani VH domeni) Metode obuhvataju selektivno prikazivanje endogenog ne-IgM CH1 regiona da bude nefunkcionalno (npr., Delecijom sekvence CH1 domena), i upotrebom segmenata genskog segmenta ili nerereorganizovanog humanog varijabilnog regiona (ili mera). hVR) segmenti gena na lokusu endogene varijabilne regije miša da bi se napravilo himerno humano / mišje antitelo u mišu.Delecija CH1 domena je napravljena u jednom ili više IgG gena, ali ne u IgM genu. ili više IgG CH1 domena nefunkcionalnih uz zadržavanje funkcionalnog IgM.Uz deleciju jednog ili više IgG CH1 domena, dalja realizacija obezbeđuje brisanje ili prikazivanje nefunkcionalnosti al. šarke regiona IgG (s) u kojima je CH1 domen izbrisan ili učinjen nefunkcionalnim.
[0099] Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg κ lokusa 5’ u vezi sa mišjim Jκ segmentima gena, kaseta odabira, mesto prepoznavanja rekombinaze 3’ prema kaseti odabira, i 3’ciljajući krak za ciljanje mišje κ sekvence 3’ u vezi sa mišjim Jκ segmentima gena i 5’ prema mišjem κ intronskom pojačavaču. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je u istom smeru prema transkripciji kao ova kaseta odabira. U specifičnom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je loxP mesto.
[0100] Takođe, opisan je izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5’ do 3’ u vezi sa smerom transkripcije, prvi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 5’ endogenih mišjih Vκ segmenata gena, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze, drugo mesto prepoznavanja rekombinaze, i drugi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 3’ endogenih mišjih Jκ segmenata gena i 5’ mišjeg κ intronskog pojačavača.
[0101] Тако, у различитим реализацијама, генетички модификовани миш који се користи у проналаску треба да одржава функционалну експресију ИгМ, која треба да пружи могућност за природнији клонални процес селекције. На пример, са функционалним ИгМ (нпр., ИгМ који не недостаје) ЦХ1 домен), и сурогатни лаки ланац и сродни лаки ланац ће бити у могућности да се повежу преко ИгМ домена ЦХ1 и учествују у селекционим процесима у раном развоју Б ћелија. прелазак на класу ИгГ изотипа је први корак селекције где се сусреће било који избор варијабилних домена тешког ланца који се може изразити у контексту константног домена који нема функционалну ЦХ1 домену или који нема функционални ЦХ1 домен и функционални зглоб.
[0102] Takođe je opisana, upotreba izolovanog DNK konstrukta da se napravi miš kako je ovde opisano.
Takođe je opisana, upotreba opisanog DNK konstrukta kako je ovde opisan u postupku za pravljenje proteina koji vezuje antigen.
[0103] Takođe je opisana matična nehumana ćelija koja obuhvata ciljajući vektor koji obuhvata DNK konstrukt kako je opisano gore i ovde. Takođe je opisana matična nehumana ćelija, pri čemu je nehumana matična ćelija izvedena iz ovde opisanog miša.
[0104] U jednom varijantnom rešenju, matična ćelija koja nije čovekova je embrionska matična (ES) ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je mišja ES ćelija.
[0105] Takođe je opisana upotreba matične ćelije koja nije ljudska kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano. Takođe je opisana upotreba matične ćelije koja nije ljudska kako je opisano ovde da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0106] Preživljavajući selekciju do sada, pre-B ćelija koja predstavlja teški lanac uparena sa svojim srodnim lakim lancem u IgM kontekstu, prolazi kroz proces sazrevanja koji na kraju rezultira u promeni klase i daljnjim mehanizmima selekcije u kojima teški lanac i srodna svetlost lanac su predstavljeni na površini B ćelija u kontekstu IgG izotipa. To bi bilo u ovom koraku bilo koja selekcija IgG teških lanaca kojima nedostaje CH1 domen ili koji nemaju CH1 domen i zglobnu regiju. u pronalasku, veruje se da bi normalan repertoar varijabilnih regiona teškog lanca bio dostupan za selekciju na osnovu toga da li bi varijabilni domen preživeo da bude eksprimiran u IgG teškom lancu koji nema CH1 domen ili kome nedostaje CH1 domen i Nasuprot tome, miševi koji imaju poremećene IgM verovatno ne bi predstavljali puni repertoar varijabilnih regiona teškog lanca, pošto samo one varijabilne regione mogu preživeti selekciju u kontekstu oslabljenog IgM bi bio dostupan za prebacivanje klasa.
[0107] Takođe je opisana upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisan da se napravi mišji kako ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisana je upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0108] Pogodan broj preuređenih varijabilnih regiona teškog lanca koji mogu efikasno da prežive selekciju kada su predstavljeni tokom razvoja B ćelija u kontekstu IgM je poželjno da se održava kako bi se generisala dovoljna raznolikost za pravljenje antitela imunizacijom miša sa imunogenom od interesa Prema tome, genetički modifikovani miš koji sadrži nefunkcionalni CH1 domen ili nefunkcionalni CH1 domen i nefunkcionalni zglobni region u teškom lancu imunoglobulina ne bi trebalo da sadrže CH1 deleciju u oba IgM alela.
[0109] Takođe je opisana, nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je B ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koja je somatski mutirana.
[0110] Prema tome, upotrebljava se genetički modifikovan miš, na koje se takođe pozivaju postupci i kompozicije za pravljenje miša, pri čemu genetska modifikacija dovodi do nedostatka funkcionalnog CH1 domena (u daljem ostvarenju nedostatka funkcionalnog zglobnog regiona) u Ig domenu. U različitim realizacijama, sekvenca koja kodira CH1 ili CH1 i zglobni region (ili njegov suštinski funkcionalni deo) su izbrisani u genomu genetski modifikovanog miša. lanac antitela (tj. antitela koja nemaju laki lanac), uključujući potpuno humana antitela (u mišjem genetski modifikovanom da uključe humane imunoglobulinske gene) i himerna ljudska / mišja antitela (npr., u mišjem genetski modifikovanom da uključe genske segmente humane varijabilne regije) , D regije i J regije).
[00111] Takođe je otkrivena ne-ljudska ćelija, gde ne-ljudska ćelija sadrži reorganizovanu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetički modifikovanog miša, kao što je ovde opisano. U jednom aspektu, ćelija je hibridom.U jednom aspektu, ćelija kodira varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina i / ili varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina koji je somatski mutiran ".
[0112] Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovanog miša prema antigenu, pri čemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVλ i barem jedan hJλ na endogenom lokusu lakog lanca, pr čemu endogeni lokus lakog lanca obuhvata mišji CLgen; (b) što omogućava genetski modifikovanom mišu da prema antigenu razvije odgovor imunog sistema; i, (c) izolovanje iz miša prema (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVλ, hJλ i mišji CLgen. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CL gen je mišji Cκ gen.
[0113] Genetski modifikovani miševi koji se koriste u ovom pronalasku mogu se koristiti za pravljenje širokog spektra antitela teškog lanca. Ovde opisane genetske modifikacije mogu biti napravljene, npr., U bilo kom pogodnom mišjem soju. stvaranje antitijela teškog lanca po izboru. Neke genetičke pozadine koje obuhvataju određene realizacije su date u daljem tekstu.
[00114] Takođe je otkrivena mišja B ćelija koja eksprimira lak lanac imunoglobulina, koji sadrži (a) varijabilni region izveden iz segmenta hV gena i segmenta hJ gena, i (b) mišji CL gen. mišji CL gen je odabran od C i C gena.U specifičnom aspektu, C gen je C2. U specifičnom aspektu, mišji C gen je izveden iz C gena koji je najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identično sa mišjim C2. U jednom aspektu, mišja B ćelija dalje eksprimira srodni teški lanac koji sadrži (c) varijablu regiona izvedenog od hVH, hDH, i (d) hJH segmenta.U jednom aspektu, B ćelija ne sadrži preuređeni gen.U drugom aspektu, B ćelija ne sadrži preuređeni gen ".
[0115] U jednom varijantnom rešenju, λ konstantni gen lakog lanca se bira iz ljudskog Cλ gena i mišjeg Cλ gena. U jednom varijantnom rešenju, λ konstantni gen lakog lanca je ljudski Cλ gen. U specifičnom varijantnom rešenju, ljudski Cλ gen je izabran iz Cλ1, Cλ2, Cλ3 i Cλ7. U jednom varijantnom rešenju, λ konstantni gen lakog lanca je mišji Cλ gen. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji Cλ gen je izabran iz Cλ1, Cλ2 i Cλ3. U još specifičnijem varijantnom rešenju, mišji Cλ gen je Cλ2. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mišji Cλ gen je izveden iz Cλ gena koji je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjem Cλ2.
[0116] Takođe je opisan, postupak za pravljenje gena preraspoređenog antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVλ i hJλ na endogenom lokusu lakog lanca, pri čemu endogeni lokus lakog lanca obuhvata mišji CLgen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata λ segment gena promenljivog regiona lakog lanca i CLgen ili njegovi funkcionalni fragment.
[0117] U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca od antitela koje obuhvata ljudski Vλ i mišji CL.
[0118] U jednom varijantnom rešenju, mišji CLgen ili njegov funkcionalni fragment se bira iz ljudskog CLgena I mišjeg CLgena, ili njegovog funkcionalnog fragmenta.
[0119] U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje preraspoređenog gena antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVλ i hJλ na κ lokusu lakog lanca, pri čemu κ lokus lakog lanca obuhvata mišji Cκ gen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata λ segment gena promenljivog regiona lakog lanca i Cκ gena ili njegov funkcionalni fragment.
[0120] Takođe je otkriveno, postupak za pravljenje preuređenog gena antitela u genetički modifikovanom mišu, koji sadrži: (a) izlaganje genetički modifikovanog miša antigenu, gde genetska modifikacija sadrži hV i hJ na endogenom lokus lakog lanca, pri čemu lokus endogenog lakog lanca sadrži mišji CL gen ili njegov funkcionalni fragment, i (b) identifikaciju reorganizovanog imunoglobulinskog gena u navedenom mišu, pri čemu preuređeni gen imunoglobulina obuhvata segment segmenta lakog lanca varijabilnog regiona i CL njen gen ili funkcionalni fragment.
[0121] U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca od antitela koji obuhvata ljudski Vλ i mišji Cκ.
[0122] U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje preraspoređenog gena antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVλ i hJλ na mišjem λ lokusu lakog lanca, pri čemu λ lokus lakog lanca obuhvata mišji Cλ gen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata λ segment gena promenljivog regiona lakog lanca i Cλ gen ili njegov funkcionalni fragment.
[0123] U jednom varijantnom rešenju, λ konstantni gen lakog lanca ili njegov funkcionalni fragment se bira iz ljudskog Cλ gena i mišjeg Cλ gena, ili njegovog funkcionalnog fragmenta. U specifičnom varijantnom rešenju, λ konstantni gen lakog lanca je mišji Cλ gen, za njegov funkcionalni fragment.
[0124] U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca od antitela koje obuhvata ljudski Vλ i mišji Cλ.
[0125] Takođe je opisan, postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koje specifično vezuje taj antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koja kodira teški lanac i preraspoređenu sekvencu nukleinske kisleine kod miša koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca nekog antitela, pri čemu to antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline promenljivih domena teškog i lakog lanca spojenih na konstantne domene čoveka da se napravi željeno antitelo, pri čemu željeno antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata Vλ domen spojen na CLdomen. U jednom varijantnom rešenju, Vλ domen je ljudski i CLdomen je ljudski ili mišji Cλ domen. U jednom varijantnom rešenju, Vλ domen je mišji i CLdomen je ljudski ili mišji Cκ domen.
[0126] U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje antitela koji obuhvata izlaganje kako je ovde opisano miša 16 antigenu,, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koje se specifično vezuje na antigen, utvrđivanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koja enkodira teški lanac i preraspoređenu sekvencu nukleinske kiselien kod miša koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca antitela, pri čemu to antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline promenljivih domena teškog i lakog lanca spojenih na sekvence nukleinske kiseline konstantnih domena čoveka da se napravi željeno antitelo, pri čemu željeno antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata Vλ domen spojen na Cκ domen.
[0127] U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano prema antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koji specifično vezuje antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koji kodira promenljivi domen teškog lanca i preraspoređenu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznatu sekvencu poznatog domena lakog lanca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline spojene na sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski konstantni domen teškog lanca i ljudski konstantni domen lakog lanca da se napravi antitelo izvedeno iz ljudske sekvence, pri čemu to antitelo koje se specifično vezuje na antigen obuhvata laki lanac koji obuhvata ljudski Vλ domen spojen na mišji Cλ region.
[0128] U specifičnom varijantnom rešenju, mišji Cλ region se bira iz Cλ1, Cλ2 i Cλ3. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji Cλ region je Cλ2.
[0129] Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata izlaganje miša kao što je ovde opisano antigenu, koji omogućava mišu da montira imuni odgovor koji obuhvata pravljenje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikujući reorganizovanu nukleinsku kiselinu sekvenca u mišu koja kodira teški lanac i reorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline u mišu koja kodira srodnu sekvencu varijabilnog domena lakog lanca antitela, gde antitelo specifično vezuje antigen, i koristi sekvence nukleinske kiseline teškog i lakog lanca varijabilni domeni fuzionisani sa humanim konstantnim domenima da bi se napravilo željeno antitelo, pri čemu željeno antitelo sadrži laki lanac koji sadrži V domen fuzionisan za CL domenu.U jednom aspektu, V domena je humana i CL domena je humani ili mišji U jednom aspektu, V domen je miš, a CL domen je humani ili mišji C domen .
[0130] U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je opisano u ovom opisu antigenu; (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; (c) identifikovanje ćelije kod miša koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira preraspoređeni ljudsku V sekvencu domena dodirne na istom molekulu nukleinske kiseline sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira mišji
, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski VHdomen i mišji CH
domen, i pri čemu ćelija koja ispoljava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski V i sekvence nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VHdomen; i, korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski i klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VH domen da se napravi potpuno ljudsko antitelo.
[00131] U jednom aspektu, otkriven je postupak za pravljenje antitela koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, dozvoljavajući mišu da montira imuni odgovor koji obuhvata pravljenje antitela koje specifično vezuje antigen, identifikujući preuređenu sekvencu nukleinske kiseline u mišu koja kodira varijabilni domen teškog lanca i reorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira srodnu sekvencu varijabilnog domena lakog lanca antitela, pri čemu se antitelo specifično vezuje za antigen, i koristi sekvence nukleinskih kiselina koje su spojene na nukleinske kiselinske sekvence koje kodiraju konstantni domen teškog lanca ljudskog lanca i konstantni domen humanog lakog lanca da bi se dobilo antitelo izvedeno iz humanih sekvenci, pri čemu antitelo koje specifično vezuje antigen sadrži lak lanac koji sadrži humani V domen fuzionisan sa C područjem miša .
[0132] Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava ljudski -izvedeni laki lanac spojen na endogeni konstantni region lakog lanca (CL), pri čemu miš, posle imunizacije sa antigenom, stvara antitelo koje obuhvata ljudski spojen na mišji CLdomen. U jednom varijantnom rešenju, mišji CLdomen je izabran iz i U jednom varijantnom rešenju, mišji CLdomen je CKdomen. U jednom varijantnom rešenju, mišji CLdomen je U specifičnom varijantnom rešenju,
je U specifičnom varijantnom rešenju, mišji C se izvodi iz C koji je
barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan m
[0133] Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji obuhvata modifikovani endogeni kus lakog lanca kako je ovde opisano, koji ispoljava više lanaca imunoglobulina povezanih sa više teških lanaca imunoglobulina. U jednom varijantnom rešenju, teški lanac obuhvata ljudsku sekvencu. U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom varijantnom rešenju, više anaca imunoglobulina sadrži sekvencu čoveka. U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, konstantne sekvence, i njihove kombinacije. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata onemogućeni endogeni lokus imunoglobulina i ispoljava teški lanac i/ili anac iz transgena ili ekstrahromozomnog epizoma. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata zamenu na endogenom mišjem lokusu nekih ili svih endogenih mišjih segmenata gena teškog lanca (t.j., V, D, J), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence konstantnog teškog lanca (npr., CH1, zglob, CH2, CH3, ili njihovu kombinaciju), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence lakog lanca (npr., V, J, konstantne, ili njihove kombinacije), sa jednom ili više sekvenci imunoglobulina čoveka.
[0134] Takođe je opisan miš pogodan za pravljenje antitela koja imaju ljudski laki lanac pri čemu su sva ili pretežno sva antitela napravljena kod miša ispoljena sa ljudskim lakim lancem. U jednom varijantnom rešenju, ljudski aki lanac se ispoljava iz endogenog lokusa lakog lanca. U jednom varijantnom rešenju, endogeni lokus lakog lanca je κ lokus lakog lanca. U specifičnom varijanom izvođenju, κ lokus lakog lanca je mišji κ lokus lakog lanca.
[0135] Takođe je opisan postupak za pravljenje λ-izvedenog lakog lanca za ljudsko antitelo, koje obuhvata dobijanje iz miša kako je ovde opisano sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca, i korišćenje sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca za pravljenje ljudskog antitela.
[0136] Takođe je opisan, postupak za pravljenje proteina koji vezuje antigen, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, omogućavanje mošu da izgradi odgovor imunog sistema, i dobijanje od miša proteina koji vezuje antigen koji vezuje taj antigen, ili dobijanje od miša sekvence koju treba koristiti za pravljenje proteina koji vezuje antigen da veže ovaj antigen.
[0137] Takođe je otkriven genetički modifikovan miš koji sadrži modifikovani lokus endogenog ili lakog lanca, kao što je ovde opisano, koji eksprimira mnoštvo lakih lanaca imunoglobulina povezanih sa mnoštvom teških lanaca imunoglobulina. U različitim aspektima, ljudska sekvenca je izabrana iz varijabilne sekvence, CH1, zglob, CH2, CH3, i njihova kombinacija. U jednom aspektu, mnoštvo lakih lanaca imunoglobulina sadrži humanu sekvencu. Različiti aspekti, ljudska sekvenca je izabrana iz varijabilne sekvence, konstantne sekvence i njihove kombinacije. U jednom aspektu, miš sadrži onesposobljeni endogeni lokus imunoglobulina i eksprimira teški lanac i / ili laki lanac iz transgena ili ekstrakromosomskog U jednom aspektu, miš sadrži zamenu na endogenom lokusu miša nekih ili svih endogenih segmenata gena teškog lanca miša (tj., V, D, J), i / ili neke ili sve konstantne sekvence endogenih mišjih teških lanaca (npr. CH1, zglob, CH2, CH3 ili njihova kombinacija), i / ili neke ili sve sekvence endogenih mišjih lakih lanaca (npr., V, J, konstantom, ili njihovom kombinacijom), sa jednom ili više humanih imunoglobulinskih sekvenci .
[0138] Takođe je opisana ćelija koja obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ova ćelija je mišja ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija se bira iz hibridoma i kvadroma. U jednom varijantnom rešenju, ćelija ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata ljudsku λ promenljivu skevencu spojenu sa mišjom konstantnom sekvencom. U specifičnom varijantnom rešenju, mišja konstantna sekvenca je mišja κ konstantna sekvenca.
[0139] Takođe je opisano tkivo izvedeno iz miša kako je ovde opisano.
[0140]Takođe je opisan postupak za pravljenje proteina koji se vezuje za antigen, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, dozvoljavajući mišu da uspostavi imuni odgovor, i da dobije od miša antigen-vezujući protein koji se vezuje antigena, ili dobijanjem od miša sekvence koja će se koristiti za pravljenje antigen-vezujućeg proteina koji vezuje antigen .
[0141] Takođe se odnosi na protein koji vezuje antigen napravljen pomoću miša, ćelije, tkiva, ili postupka kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, protein koji vezuje antigen je ljudski protein. U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo.
KRATAK OPIS SLIKA
[0142] Takođe je otkrivena ćelija koja sadrži genetsku modifikaciju kao što je ovde opisana.U jednom aspektu, ćelija je mišja ćelija.U jednom aspektu, ćelija je izabrana od h bridoma i kvadroma. ćelija eksprimira lak lanac imunoglobulina koji sadrži humanu varijabilnu sekvencu fuzionisanu sa konstantnom sekvencom miša.
SL. 1 pokazuje detaljnu ilustraciju, ne u razmeri, ljudskog λ lokusa lakog lanca uključujući skupine Vλ segmenata gena (A, B i C) i parove Jλ i Cλ regiona (J-C parove)
SL. 2 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenog miša λ lokus lakog lanca.
SL. 3 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenog miša κ lokus lakog lanca.
SL. 2 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogeni mišji λ lokus lakog lanca sa ljudskim λ sekvencama lakog lanca uključujući 12
hVλ segmente gena i hJλ1 segmente gena (12/1-λ ciljajući vektor).
SL. 4B pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri četiri prvobitna ciljna vektora za ciljanje endogenog mišjeg κ lokusa lakog lanca sa ljudskim λ sekvencama lakog lanca uključujući 12 hVλ segmente gena i hJλ1 segmente gena (12/1-κ ciljajući vektor), 12 hVλ segmente gena i hJλ1, 2, 3 i 7 segmente gena (12/4-κ ciljajući vektor), 12 hVλ segmente gena, ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu i hJλ1 segment gena (12(κ)1-κ ciljajući vektor) i 12 hVλ segmente gena, ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu i hJλ1, 2, 3 i 7 segmente gena (12(κ)4-κ ciljajući vektor).
SL. 5A pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljne strategije za progresivno umetanje 40 hVλ segmenata gena i jedan hJλ segment gena u mišji λ lokus lakog lanca.
SL. 5B pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljne strategije za progresivno umetanje 40 hVλ segmenata gena i jedan hJλ segment gena u mišji κ lokus.
SL. 6 pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljnih koraka i koraka molekularnog inženjeringa korišćenih da se napravi jedinstveni ljudski λ-κ hibridni ciljajući vektori za konstrukciju hibridnog lokusa lakog lanca koji sadrži ljudsku κ intergensku sekvencu, višestruke hJλ segmente gena ili oba.
SL. 7A pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strukture lokusa za modifikovani mišji λ lokus lakog lanca koji sadrži 40 hVλ segmente gena i jedan hJλ segment gena funkcionalno povezan na endogeni Cλ2 gen.
SL. 7B pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strukture lokusa za četiri nezavisna, mofifikovana mišja κ lokusa lakog lanca koji sadrže 40 hVλ segmenata gena i bilo jedan ili četiri hJλ segmenta gena sa ili bez dodirne ljudske Vκ-Jκ genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni Cκ gen.
SL. 8A pokazuje skice konture Igλ<+>i Igκ<+>splenocita usmerenih na CD19<+>od miša divljeg tipa (WT), miša homozigotnih za 12 hVλ i četiri hJλ segmenta gena koji obuhvataju ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (12hVλ-VκJκ- 4hJλ) i mišji homozigotni za 40 hVλ i jedan hJλ segment gena (40hVλ-1hJλ).
SL. 8B pokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz divljeg tipa (WT), mišji homozigotni za 12 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sequencu (12hVλ-VκJκ-4hJλ) i miševe homozigotne za 40 hVλ i jedan hJλ segment gena (40hVλ-1hJλ). SL. 9A, na gornjem panelu, pokazane su skice konture splenocita usmerenih na singlete i postavljenih za B i T ćelije (CD19<+>i CD3<+>, respektivno) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Donji panel pokazuje iscrtane konture splenocita usmerenih na CD19<+>postavljene za Igλ<+>i Igλ<+>ispoljavanje iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 9B pokazuje ukupan broj CD19<+>, CD19<+>Igκ<+>i CD19<+>Igλ<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 9C pokazuje iscrtanu konturu splenocita usmerenih na CD19<+>i postavljenih za imunoglobulin D (IgD) i imunoglobulin M (IgM) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Zrele (72 za WT, 51 za 40hVλ-VκJκ-4hJλ) i tranzicione (13 za WT, 22 za 40hVλ-VκJκ-4hJλ) B ćelije su navedene na svakoj od iscrtanih kontura.
SL. 9D pokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija, tranzicionih B ćelija (CD19<+>IgM<hi>IgD<lo>) i zrelih B ćelija (CD19<+>IgM<lo>IgD<hi>) u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudske Vκ-Jκ genomske sekvence (40hVλ-VκJκ-4hJλ). SL.10A, na gornjem panelu, pokazuje iscrtanu konturu koštane srži postavljene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3+, respektivno) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Donji panel pokazuje skice konture koštane srži usmerene na CD19<+>i postavljene za ckit<+>i CD43<+>iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Pro i Pre B ćelije se označavaju na iscrtanoj konturi na donjoj ploči.
SL. 10B pokazuje broj Pro (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i Pre (CD19<+>CD43<->ckit-) B ćelije u koštanoj srži prikupljenoj iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 10C pokazuje iscrtanu konturu koštane srži na singletima postavljenim za imunoglobulin M (IgM) i B220 od miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ- Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ). Nezrele, zrele i pro/pre B ćelije su označene na svakoj od iscrtanih kontura.
SL. 10D pokazuje ukupan broj nezrelih (B220<int>IgM<+>) i zrelih (B220<hi>IgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanih iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (WT) i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 10E pokazuje iscrtane konture koštane srži usmerene na nezrele (B220<int>IgM<+>) i zrele (B220<hi>IgM<+>) B ćelije postavljene za Igλ i Igκ ispoljavanje izolovane iz butnih kostiju miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVλ i četiri Jλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (40hVλ-VκJκ-4hJλ).
SL. 11 pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Vλ-Jλ-Cκ spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske λ sekvence gena lakog lanca na endogenim mišjim κ lokusu lakog lanca. A6 = ID BR SEK:57; B6 = ID BR SEK:58; F6 = ID BR SEK:59; B7 = ID BR SEK:60; E7 = SEQ ID NO:61; F7 = ID BR SEK:62, C8 = ID BR SEK:63; E12 = ID BR SEK:64; 1-4 = ID BR SEK:65; 1-20 = ID BR SEK:66; 3B43 = ID BR SEK:67; 5-8 = ID BR SEK:68; 5-19 = ID BR SEK:69; 1010 = ID BR SEK:70; 11A1 = ID BR SEK:71; 7A8 = ID BR SEK:72; 3A3 = ID BR SEK:73; 2-7 = ID BR SEK:74. Baze napisane malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodiran pomoću sekvence nukleotida hJλ1 i miša Cκ su označene sa donje strane poravnanja sekvence.
SL. 12 pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Vλ-Jλ-Cκ spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske λ sekvence gena lakog lanca uključujući dodirnu ljudsku Cκ-Jκgenomsku sekvencu na endogenom mišjem κlokusu lakog lanca. 5-2 = ID BR SEK:87; 2-5 = ID BR SEK:88; 1-3 = ID BR SEK:89; 4B-1 = ID BR SEK:90; 3B-5 = ID BR SEK:91; 7A-1 = ID BR SEK:92; 5-1 = ID BR SEK:93; 4A-1 = ID BR SEK:94; 11A-1 = ID BR SEK:95; 5-7 = ID BR SEK:96; 5-4 = ID BR SEK:97; 2-3 = ID BR SEK:98.
Baze napisane malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida svakog ljudskog Jλ i mišjeg Cκ su označene sa donje strane poravnanja sekvence.
SL. 13 pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Vλ-Jλ-Cλ spoja tri nezavisna RT-PCR klona pojačana iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske λ sekvence gena lakog lanca na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca.2D1 = ID BR SEK:101; 2D9 = ID BR SEK:102; 3E15 = ID BR SEK:103. Baze sa malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FWR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida hJλ1 i miša Cλ2 su označene sa donje strane poravnanja sekvence.
DETALJAN OPIS
[0143] Takođe je pomenuto, tkivo izvedeno od miša kao što je ovde opisano .
[0144]Takođe je otkriveno, korišćenje miša ili ćelije kao što je ovde opisano da bi se napravio antigenvezujući protein.U jednom aspektu, antigen-vezujući protein je ljudski protein. U jednom aspektu, ljudski protein je ljudsko antitelo ".
[0145] Fraza "izvedeno iz" kada se koristi u vezi sa održivim regionom "izveden iz" navedeni gen ili segment gena obuhvata sposobnost da se prati sekvenca nazad do određenog nepreraspoređenog segmenta gena ili segmenata gena koji su preraspoređeni da formiraju gen koji ispoljava promenljivi domen (uzimajući u obzir, gde je primenljivo, razlike u spoju i somatske mutacije).
[0146] Fraza "funkcionalno" kada se koristi u vezi sa segmentom gena promenljivog regiona ili spojnim segmentom gena odnosi se na upotrebu u ispoljenom repertoaru antitela; npr., kod ljudi Vλ segmenti gena 3-1, 4-3, 2-8, itd. su funkcionalni, a Vλ segmenti gena 3-2, 3-4, 2-5, itd. su nefunkcionalni.
[0147] "Lokus teškog lanca" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr., mišjem hromozomu, pri čemu su pronađeni promenljivi teški lanac miša divljeg tipa (VH), raznovrsnost teškog lanca (DH), spoj teškog lanca (JH), i konstantni region teškog lanca (CH) sekvenci DNK.
[0148] "κ Lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr., mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipa κ promenljiv (Vκ), κ spojni (Jκ), i κ konstantni (Cκ) region sekvenci DNK.
[0149] "λ Lokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr<.>, mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipa λ promenljiv (Vλ), λ spojni (Jλ), i λ konstantni (Cλ) region sekvenci DNK.
[0150] Pojam "nepreraspoređeni" obuhvata stanje lokusa imunoglobulina pri čemu se V segmenti gena i J segmenti gena (za teške lance, D segmenti gena takođe) održavaju odvojeno ali mogu da se spoje da formiraju preraspoređeni V(D)J gen koji obuhvata jedan V,(D),J od ovog V(D)J repertoara.
Miševi koji ispoljavaju ljudskeλ promenljive domene
[0151] Miševi koji ispoljavaju antitela koja su potpuno ljudska, ili delimično ljudska i delimično mišja, su prethodno već prikazani. VELOCIMMUNE® genetski projektovani miševi obuhvataju zamenu nepreraspoređenih V(D)J segmenata gena na endogenim mišjim lokusima sa ljudskim V(D)J segmentima gena. VELOCIMMUNE® miševi ispoljavaju himerna antitela koja imaju ljudske promenljive domene i mišje konstantne domene (videti, npr., US Pat. br.7,605,237). Većina drugih izveštaja se odnosi na miševe koji ispoljavaju potpuno ljudska antitela iz potpuno ljudskih transgena kod miševa koji imaju onemogućene endogene lokuse imunoglobulina.
[0152] Laki lanci antitela se enkodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (κ) i lambda (λ). Laki lanci mišjeg antitela su primarno κ tipa. Miševi koji prave mišja antitela, i modifikovani miševi koji prave potpuno ljudska ili himerna ljudsko-mišja antitela, prikazuju neuravnoteženost u pogledu upotrebe lakog lanca. Ljudi takođe ispoljavaju neuravnoteženost lakog lanca, ali ne tako izraženu kao kod miševa, odnos κ lakih lanaca prema λ lakim lancima kod miševa je oko 95,5, pri čemu kod ljudi je oko 60:40. Izraženija neuravnoteženost kod miševa se ne smatra da ozbiljno utiče na raznovrsnost antitela, jer kod miševaλ promenljivi lokus nije tako raznovrstan u prvoj instanci. Ovo nije tako i kod ljudi. Ljudski λ lokus lakog lanca obiluje raznovrsnošću.
[0153] Ljudski λ lokus lakog lanca se proteže preko 1.000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju promenljive (V) ili spojne (J) segmente (SL.1). Unutar ljudskog λ lokusa lakog lanca, preko polovine svih primećenih Vλ domena se kodira pomoću segmenata gena 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, i 3-21. Sve u svemu, oko 30 ili tako nešto ljudskih Vλ segmenata gena se smatra funkcionalnim. Ima sedam Jλ segmenata gena, samo četiri se smatra generalno funkcionalnim Jλ segmentima gena-Jλ1, Jλ2, Jλ3, i Jλ7.
[0154] Lokus λ lakog lanca kod ljudi je slične strukture κ lokusu kod miševa i ljudi po tome što ljudski λ lokus lakog lanca ima nekoliko segmenata gena promenljivog regiona koji su sposobni da se rekombinuju da se formira funkcionalni protein lakog lanca. Ljudski λ lokus lakog lanca sadrži približno 70 V segmenata gena i 7 parova Jλ-Cλ segmenta gena. Samo četiri od ovih Jλ-Cλ parova segmenta gena se čine funkcionalnim. Kod nekih alela, peti Jλ-Cλ par segmenta gena je prema izveštajima naveden kao pseudo gen (Cλ6). 70 Vλ segmenata gena izgleda da sadrže 38 funkcionalnih segmenata gena. 70 Vλ sekvenci se raspoređuje u tri skupine, a sve sadrže različite članove distinktivnih grupa familije V gena (skupine A, B i C; SL. 1). Postoji potencijalno bogat izvor relativno neiskorišćene raznovrsnosti za generisanje antitela sa ljudskim V regionima kod nehumanaih životinja.
[0155] Kao sušti kontrast, mišji λ lokus lakog lanca sadrži samo dva ili tri (zavisno od soja) mišja Vλ segmenta gena regiona (SL.2). Barem iz ovog razloga, ozbiljna κ neuravnoteženost kod miševa se ne smatra posebno pogubnom za ukupnu raznovrsnost antitela.
[0156] Prema objavljenim mapama mišji λ lokus lakog lanca, lokus se sastoji u suštini od dve skupine segmenata gena unuar ospega od približno 200 kb (SL.2). Ove dve skupne sadrže dva kompleta V, J, i C gena koji su sposobni za nezavisnu preraspoređivanje: Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 i Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1. Iako je za Vλ2 utvrđeno da se rekombinuje sa svim Jλ segmentima gena, Vλ1 se izgleda ekskluzivno rekombinuje sa Cλ1. Veruje se da je Cλ4 pseudo gen sa neispravnim mestima spajanja.
[0157] Mišji κ lokus lakog lanca je izrazito drugačiji. Struktura i broj segmenata gena koji učestvuju u događajima rekombinacije koji vode funkcionalom proteinu lakog lanca iz mišjeg κ lokusa je mnogo složeniji (SL.3). Dakle, mišji λ laki lanci ne doprinose u velikoj meri raznovrsnosti populacije antitela kod tipičnog miša.
[0158] Iskorišćavanje obilate raznovrsnosti ljudskih λ lokusa lakog lanca kod miševa bi verovatno kao rezultat dalo, između ostalog, izvor za kompletniji ljudski repertoar V domena lakog lanca. Prethodni pokušaji da se dodirne ova raznovrsnost koristila je ljudske transgene koji sadrže blokove ljudskog lokusa λ lakog lanca nasumično inkorporirane u mišji genom (videti, npr., US 6,998,514 i US 7,435,871). Miševi koji sadrže ove nasumično integrisane transgene su prema izveštajima mogli da ispolje potpuno ljudske λ lake lance, međutim, u nekim slučajevima, jedan ili oba endogena lokusa lakog lanca ostaje nedirnut. Ova situacija nije poželjna jer se ljudske λ sekvence lakog lanca nadmeću sa mišjim lakim lancem (κ ili λ) u ispoljenom repertoaru antitela miša.
[0159] Nasuprot tome, pronalazači opisuju genetski modifikovane miševe koji su sposobni za ispoljavanje jedne ili više λ sekvenci nukleinske kiseline lakog lanca direktno iz endogenog kapa mišjeg lokusa lakog lanca. Genetski modifikovani miševi su sposobni za ispoljavanje ljudskih λ sekvenci lakog lanca iz endogenog κ lokusa mogu još da budu kultivisani na mišjim koji obuhvataju ljudski lokus teškog lanca i tako mogu da se koriste da ispolje antitela koja obuhvataju V regione (teške i κ lake) koji su potpuno ljudski. V regioni se ispoljavaju sa mišjim konstantnim regionima. Kod različitih varijantnih rešenja, nema endogenih mišjih segmenata gena imunoglobulina prisutnih i V regioni se ispoljavaju sa ljudskim konstantnim regionima. Ova antitela će se pokazati korisna u brojnim primenama, i dijagnostičkim i terapijskim.
[0160] Brojne prednosti mogu da se realizuju za različita varijantna rešenja ispoljavanja proteina za vezivanje izvedenih iz ljudskih Vλ i Jλ segmenata gena kod miševa. Prednosti je moguće realizovati postavljanjem ljudskih λ sekvenci na endogenom lokusu lakog lanca, na primer, mišjem κ ili λ lokusu. Antitela napravljena od takvih miševa mogu da imaju lake lance, koji obuhvataju ljudske Vλ domene spojene na mišji Cκ region. Miševi će takođe ispoljiti ljudske Vλ domene koji su pogodni za identifikaciju i kloniranje za upotrebu sa ljudskim CLregionima, specifično Cκ i/ili Cλ regioni. Zato što razvoj B ćelije kod takvih miševa jeste inače normalan, moguće je generisati kompatibilne Vλ domene (uključujući somatski mutirane Vλ domene) u kontekstu bilo Cλ ili Cκ regiona.
[0161] Genetski modifikovani miševi su opisani da obuhvataju nepreraspoređeni ljudski Vλ segment gena i nepreraspoređeni ljudski Jλ na endogenom κ lokusu lakog lanca imunoglobulina. Opisuju se miševi koji ispoljavaju antitela koja obuhvataju laki lanac koji ima ljudski Vλ domen spojen na Cκ region.
Sterilni transkripti κ lokusa lakog lanca imunoglobulina
[0162] Varijacije na temu ispoljavanja ljudskih λ sekvenci imunoglobulina kod miševa se ogledaju u različitim varijantnim rešenjima genetski modifikovanih miševa koji su sposobni za takvo ispoljavanje. Dakle, kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovani miševi obuhvataju izvesnu nekodirajuću sekvencu(e) iz ljudskog lokusa. U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš obuhvata ljudske Vλ i Jλ segmente gena na endogenomκ lokusu lakog lanca, i još obuhvata ljudski κ genomski fragment lakog lanca. U specifičnom varijantnom rešenju, ljudski κ genomski fragment lakog lanca je nekodirajuća sekvenca prirodno otkrivena između ljudskog Vκ segmenta gena i ljudskog Jκ segmenta gena.
[0163] Ljudski i mišji κ lokusi lakog lanca sadrže sekvence koje kodiraju sterilne transkripte kojima nedostaje bilo početni kodon ili otvoreni okvir za učitavanje, i koji se smatraju kao elementima koji regulišu transkripciju κ lokusa lakog lanca. Ovi sterilni transkripti nastaju iz integrisane sekvence smeštene nizvodno ili 3’ od najbližeg Vκ segmenta gena i uzvodno ili 5’ od κ intronskog pojačavača lakog lanca (Eκi) koji je uzvodno od κ konstantnog regiona lakog lanca gena (Cκ).
Sterilni transkripti nastaju iz preraspoređenja intergenske sekvence da se formira VκJκ1 segment spojen na Cκ.
[0164] Zamena κ lokusa lakog lanca uzvodno od Cκ gena bi uklonila intergenski region koji kodira sterilne transkripte. Zbog toga, u različitim varijantnim rešenjima, zamena mišje κ sekvence lakog lanca uzvodno od mišjeg Cκ gena sa ljudskim λ segmentima gena lakog lanca bi kao rezultat dala humanizovani mišji κ lokus lakog lanca koji sadrži ljudske Vλ i Jλ segmente gena ali ne κ intergenski region lakog lanca koji kodira sterilne transkripte.
[0165] Kako je ovde opisano, humanizacija endogenog mišjeg κ lokusa lakog lanca sa ljudskim λ segmentima gena lakog lanca, pri čemu humanizacija uklanja intergenski region, daje kao rezultat značajan pad u upotrebi κ lokusa lakog lanca, spojeno sa zapaženim povećanjem λ upotrebe lakog lanca. Zbog toga, iako humanizovani miš kome nedostaje intergenski region jeste koristan u pogledu toga da može da napravi antitela sa ljudskim promenljivim domenima lakog lanca (npr., ljudski λ ili κ domeni), upotreba iz lokusa se smanjuje.
[0166] Takođe je opisana humanizacija endogenog mišjeg κ lokusa lakog lanca sa ljudskim Vλ i Jλ segmentima gena spojenim sa umetanjem ljudskog κ intergenskog regiona da se stvori Vλ lokus koji sadrži, u vezi sa transkripcijom, između finalnog ljudskog Vλ segmenta gena i prvog ljudskog Jλ segmenta gena, κ intergenski region; koji ispoljava populaciju B ćelije sa višim ispoljavanjem nego neki lokus kome nedostaje κ intergenski region. Ovo zapažanje je dosledno sa hipotezom da intergenski region direktno kroz sterilni transkript, ili indirektno potiskuje upotrebu iz endogenog λ lokusa lakog lanca. Pod takvog hipotezom, uključivanje intergenskog regiona bi kao rezultat dalo smanjenje upotrebe endogenog λ lokusa lakog lanca, što ostavlja mišu ograničen izbor nego da se koristi modifikovan (λ u κ) lokus da se generišu antitela kao što je formulisano u patentnim zahtevima.
[0167] Kod različitih varijantnih rešenja, zamena mišje κ sekvence lakog lanca uzvodno od mišjeg Cκ gena sa ljudskom λ sekvencom lakog lanca još obuhvata ljudski κ intergenski region lakog lanca raspoređen s obzirom na transkripciju, između 3’ neprevedenog regiona 3’ većine Vλ segmenta gena i 5’na prvi ljudski Jλ segment gena. Alternativno, takvi intergenski region može da bude izostavljen iz zamenjenog endogenog κ lokusa lakog lanca (uzvodno od mišjeg Cκ gena) brisanjem na endogenom λ lokusu lakog lanca. Slično tome, u okviru ovog varijantnog rešenja, miš generiše antitela iz endogenog κ lokusa lakog lanca koji sadrži ljudske λ sekvence lakog lanca kako je opisano u ovim patentnim zahtevima.
Pristupi inženjeringu miševa za ispoljavanje ljudskih Vλ domena
[0168] Opisuju se različiti pristupi za pravljenje genetski modifikovanih miševa koji prave antitela koja sadrže laki lanac koji ima ljudski Vλ domen spojen na endogeni Cκ region. Opisuju se genetske modifikacije koje, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvataju brisanje jednog ili oba endogena lokusa lakog lanca. Na primer, da se eliminišu mišji λ laki lanci iz repertoara endogenog antitela brisanje prve Vλ-Jλ-Cλ skupine gena i moguće je izvesti zamenu, u celini ili delimično, Vλ-Jλ segmenata gena druge skupine gena sa ljudskim Vλ-Jλ segmentima gena. Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljni konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija.
[0169] Brisanje jedne endogene Vλ-Jλ-Cλ skupine gena i zamena Vλ-Jλ segmenata gena druge endogene Vλ-Jλ-Cλ skupine gena koristi relativno minimalni prekid u prirodnom udruživanju konstantnog regiona antitela i funkcije kod životinje, kod različitih varijantnih rešenja, zbog toga što se endogeni Cλ geni ostavljaju nedirnuti i samim tim zadržavaju normalnu funkcionalnost i sposobnost da se povezuju sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca. Dakle, kod takvih varijantnih rešenjenja modifikacija ne utiče na druge konstantne regione teškog lanca zavisne od funkcionalnih konstantnih regiona lakog lanca za sklop funkcionalnog molekula antitela koji sadrži dva teška lanca i dva laka lanca. Pored toga, kod različitih varijantnih rešenja ova modifikacija ne utiče na sklop funkciolnalnog molekula antitela vezanog membranom koji obuhvata endogeni teški lanac i laki lanac, npr., hVλ domen povezan na miši Cλ region. Zbog toga što se najmanje jedan funkcionalan Cλ zadržava na endogenom lokusu, životinje koje sadrže zamenu Vλ-Jλ segmenti gena endogene Vλ-Jλ-Cλ skupine gena sa ljudskim Vλ-Jλ segmentima gena teba da mogu da naprave normalne λ lake lance koji su sposobni za vezivanje antigena tokom odgovora imunog sistema kroz ljudske Vλ-Jλ segmente gena prisutne u repertoaru ispoljenog antitela životinje.
[0170] Slika 13 prikazuje poravnanje nukleotidne sekvence V-J-spoja tri nezavisna RT-PCR klonova amplifikovana iz splenocitne RNK miševa koji nose genske sekvence humanog lakog lanca na endogenom lokusu lakog lanca miša. ID NO: 101; 2D9 = SEK ID N0: 102; 3E15 = SEK ID N0: 103. Donje baze ukazuju na baze koje nisu prolazne, koje su rezultat bilo mutacije i / ili dodatka N tokom rekombinacije. FVR4) kodiran nukleotidnom sekvencom hJ 1 i miša C2 su zabeleženi na dnu poravnanja sekvence ".
[0171] Genetsko modifikovanje miša da se dobiju endogeni λ nefunkcionalni segmenti gena, u različitim varijantnim rešenjima, daje kao rezultat kod miša koji ispoljava isključivo κ lake lance u svom repertoaru antitela, što utiče na veću korisnost miša za procenu uloge λ lakih lanaca u odgovoru imunog sistema, i korisnim za pravljenje repertoara antitela koji obuhvata Vκ domene ali ne Vλ domene.
[0172] Termin "susedni" uključuje referencu na pojavu na istom molekulu nukleinske kiseline, npr., Dve sekvence nukleinske kiseline su "susjedne" ako se pojavljuju na istoj nukleinskoj molekuli, ali su prekinute drugom sekvencom nukleinske kiseline. reorganizovana sekvenca V (D) J je "susedna" sa genskom sekvencom konstantnog regiona, mada konačni kodon V (D) J sekvence nije praćen odmah od prvog kodona sekvence konstantnog regiona. Sekvence segmenta V gena su "susedne" ako se pojavljuju na istom genomskom fragmentu, mada se mogu razdvojiti sekvencom koja ne kodira kodon V regiona, npr., Oni mogu biti odvojeni regulatornom sekvencom, npr. Kontinuirana sekvenca uključuje genomski fragment koji sadrži genomske sekvence raspoređene kako su pronađene u genomu divljeg tipa ".
[0173] Dakle, ovaj prvi pristup pozicionira jedan ili više hVλ segmenata gena na endogeni λ lokus lakog lanca dodiran sa jednim hJλ segmentom gena (SL.4A).
[0174] Dodatne modifikacije na modifikovani endogeni λ lokus lakog lanca mogu da budu ostvarene korišćenjem sličnih tehnika da se ubaci više hVλ segmenata gena. Na primer, šematske ilustracije dva dodatna ciljna konstrukta λ i 12-λ ciljajući vektori) korišćeni za progresivno umetanje dodavanja ljudskih hVλ segmenata gena su dati na SL. 5A. Kako je ilustrovano, dodatni genomski fragmenti koji sadrže specifične ljudske hVλ segmente gena se umeću u modifikovani endogeni λ lokus lakog lanca u uzastopnim koracima korišćenjem homologije obezbeđene prethodnim umetanjem ljudskih λ sekvenci lakog lanca. Posle rekombinacije sa svakim ciljnim ilustrovanim konstruktom, na uzastopan način, 28 dodatnih hVλ gene segmenata gena se umeće u modifikovani endogeni λ lokus lakog lanca. Ovo stvara himerni lokus koji proizvodi λ protein lakog lanca koji obuhvata ljudske VλJλ segmente gena povezane na mišji Cλ gen.
[0175] Gornji pristupi za ubacivanje ljudskih λ segmenata gena lakog lanca na mišjem λ lokusu, zadržava pojačavače pozicionirane nizvodno od Cλ2-Jλ4-Cλ4 segmenta gena (naznačen Enh 2.4, Enh i Enh 3.1 SL. 4A i SL. 5A). Ovaj pristup daje kao rezultat jedan modifikovan alel na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca (SL.7A).
[0176] Takođe su opisana jedinjenja i postupci za pravljenje miša koji ispoljava laki lanac koji obuhvata hVλ i Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišji Cλ segment gena, uključujući jedinjenja i postupak za pravljenje miša koji ispoljava takve gene iz endogenog mišjeg λ lokusa lakog lanca. Ovi postupci obuhvataju selektivno činjenje jedne endogene mišje Vλ-Jλ-Cλ skupine gena nefunkcionalnom (npr., ciljano brisanje), i korišćenje hVλ i Jλ segmenata gena na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca da se ispolji hVλ domen kod miša.
[0177] Alternativno, kod drugog pristupa, ljudski λ segmenti gena lakog lanca mogu da budu pozicionirani na endogenom κ lokusu lakog lanca. Genetska modifikacija, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvata brisanje endogenog κ lokusa lakog lanca. Na primer, da bi se eliminisali mišji κ laki lanci iz repertoara endogenog antitela moguće je izvesti brisanje mišjih Vκ i Jκ segmenata gena. Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljni konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija.
[0178] Iz gore navedneih razloga, brisanje mišjih Vκ i Jκ segmenata gena koristi relativno minimalni prekid. Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisanih mišjih Vκ i Jκ segmenata gena je data na SL.3. Ovi endogeni mišji Vκ i Jκ segmenti gena se brišu preko rekombinazom posredovanog brisanja mišjih sekvenci pozicioniranih između dva precizno pozicionirana ciljajuća vektora svaki koristi mesta za rekombinaciju specifiičnu za mesto. Prvi ciljajući vektor (Jκ ciljajući vektor) se koristi u prvom ciljnom događaju za brisanje mišjih Jκ segmenata gena. Drugi ciljajući vektor (Vκ ciljajući vektor) se koristi u drugom, uzastopnom procesu ciljanja da briše sekvencu smeštenu 5’ od najudaljenijeg mišjeg Vκ segmenta gena. Oba ciljajuća vektora sadrže mesta za rekombinaciju specifičnu za mesto čime se omogućava selektivna brisanje obe kasete odabira i sve interventne mišje κ sekvence lakog lanca pošto je uspešno izvedeno ciljanje. Brisani lokus koji se dobije kao rezultat je funkcionalno neaktivan tako da nijedan endogeni κ laki lanac ne može da bude proizveden. Ovaj modifikovani lokus može da se koristi za umetanje hVλ i Jλ segmenata gena da se stvori endogeni mišji κ lokus koji obuhvata hVλ i Jλ segmente gena, pri čemu, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu životinja proizvodi λ lake lance koji obuhvataju preraspoređene hVλ i Jλ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cκ segment gena. Različiti ciljajući vektori obuhvataju ljudske λ sekvence lakog lanca mogu da se koriste u vezi sa ovim obrisanim mišjim κ lokusom da se stvori hibridni lokus lakog lanca koji sadrži ljudske λ segmente gena funkcionalno povezane sa mišjim Cκ regionom.
[0179] Dakle, drugi pristup pozicionira jedan ili više ljudskih Vλ segmenata gena pozicionirane na mišjem κ lokusu lakog lanca dodirnom sa jednim ljudskim Jλ segmentom gena (12/1-κ ciljajući vektor, SL.
4B).
[0180] Modifikacije ovog pristupa mogu da budu izvedene da se dodaju segmenti gena i/ili regulatorne sekvence da se optimizuje upotreba ljudskih λ sekvenci lakog lanca iz mišjeg κ lokusa unutar repertoara mišjeg antitela.
[0181] Lokus humanog λ lakog lanca se proteže preko 1.000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju varijabilne (V) ili spajajuće (J) segmente (Slika 1) .U okviru lokusa humanog λ lakog lanca, preko polovine svih posmatranih Vλ domena su kodirani od strane genskih segmenata 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, i 3-21.Osim toga, veruje se da je oko 30 segmenata humanog V λ gena funkcionalno. segmenti, od kojih se samo četiri smatraju opšte funkcionalnim Jλ g-segmentima Jλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 ".
[0182] U trećem pristupu, jedan ili više hVλ segmenata gena se pozicionira na mišjem κ lokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskom κ intergenskom sekvencom i jednom hJλ sekvencom gena (12(κ)1-κ ciljajući vektor, SL.4B).
[0183] U četvrtom pristupu, jedan ili više hV λ segmenata gena se pozicionira na mišjemκ lokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskom κ intergenskom sekvencom četiri hJλ sekvenci gena (12(κ)4-κ ciljajući vektor SL.4B).
[0184] Svi gore navedeni pristupi za ubacivanje ljudskih λ segmenata gena lakog lanca na mišji κ lokusu, zadržavaju κ element intronskog pojačavača uzvodno od Cκ gena (naznačen Eκi, SL. 4B i SL. 5B) i 3’ κ pojačavač nizvodno od Cκ gena (naznačen Eκ3’, SL.4B i SL.5B). Ovaj pristup daje kao rezultat četiri modifikovana alela na endogenom mišjem κ lokusu lakog lanca (SL.7B).
[0185] U različitim varijantnim rešenjima, genetski modifikovan miš obuhvata mutirani endogeni mišji λ lokus lakog lanca. U jednom varijantnom rešenju, λ lokus lakog lanca je mutiran pomoću strategije koja briše region koji se prostire od Vλ2 do Jλ2, i region koji se prostire Vλ1 do Cλ1 (SL.2). Bilo kakva strategija koja smanjuje ili eliminiše sposobnost endogenog λ lokusa lakog lanca da ispolji endogene λ domene je pogodan za upotrebu sa ovim opisom.
Antitela lambda domena iz genetski modifikovanih miševa
[0186] Miševi obuhvataju ljudske λ sekvence na bilo mišjem κ ili λ lokusu lakog lanca će ispoljiti laki lanac koji sadrži hVλ region spojen na mišji CL(Cκ ili Cλ) region. Ovo su pogodno kultivisani miševi koji (a) obuhvata funkcionalno neaktivan lokus lakog lanca (npr., mutirani oblik endogenog mišejg κ ili λ lokusa lakog lanca); (b) obuhvata endogeni mišji λ lokus lakog lanca koji sadrži hV i hJ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cλ gen; (c) obuhvati endogeni mišji κ lokus lakog lanca koji sadrži hVκ i hJκ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cκ gen; i, (d) miš kod kog jedan κ alel sadrži hVκ-e i hJκ-e; drugi κ alel sadrži hVλ i hJλ; jedan λ alel sadrži hVλ i hJλ i jedan λ alel neaktivan ili mutiran, ili oba λ alela sadrže hVλ i hJλ; i, dva alela teškog lanca od kojih svaki obuhvata hVH, hDH, i hJH.
[0187] Antitela koja obuhvataju hVλ domene ispoljene u kontekstu bilo kog od Cκ se koriste da naprave potpuno ljudska antitela kloniranjem nukleinskih kiselina koje kodiraju hVλ domene u ispoljavanje konstrukata koji nose gene koji kodiraju ljudski Cλ. Dobijeni konstrukti ispoljavaju se presecaju poprečno u ćelije domaćina pogodne za ispoljavanje antitela koja prikazuju potpuno hVλ domen spojen na hCλ.
PRIMERI
[0188] Dati su sledeći primeri tako da se opiše kako da se napravi upotreba postupaka i jedinjenja prema ovom pronalasku, i nisu predviđeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju da je njihov pronalazak. Osim ako nije drugačije navedeno, temperatura je navedena u Celzijusima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer I
Brisanje mišjih lokusa lakog lanaca imunoglobulina
[0189] Različiti ciljni konstrukti su napravljeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US Pat. br.6,586,251 i Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) za modifikovanje biblioteka mišjih genomskih bakterijskih veštačkih hromozoma (BAC) da se inaktiviraju mišji κ i λ lokusi lakog lanca.
[0190] Brisanje mišjeg λ lokusa lakog lanca. DNA iz mišjeg BAC klona RP23-135k15 (Invitrogen) je modifikovana homolognom rekombinacijom da se inaktivira endogeni mišji λ lokus lakog lanca kroz ciljana brisanja Vλ-Jλ-Cλ skupina gena (SL.2).
[0191] Ukratko, cela proksimalna skupina obuhvata Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1 segmente gena je brisana u jednom ciljnom događaju korišćenjem ciljnog vektora koji obuhvata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću loxP mesta sa 5’ mišjim homolognim krakom koji sadrži sekvencu 5’ Vλ1 segmenta gena i 3’ mišjeg homolognog kraka koji sadrži sekvencu 3’ Cλ1 segmenta gena (SL.2, ciljajući vektor 1).
[0192] Drugi ciljni konstrukt je pripremljen da precizno obriše distalnu endogenu mišju λ skupinu gena koja sadrži Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4 izuzev one koju je sadržao ciljajući konstrukt 5’ mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5’ Vλ2 segmenta gena i 3’ mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5’ na endogenom Cλ2 segmentu gena (SL. 2, ciljajući vektor 2). Dakle, drugi ciljani konstrukt je precizno izbrisan Vλ2-Jλ2, pritom ostavio je Cλ2-Jλ4-Cλ4 nedirnut na endogenom mišjem λ lokusu. embrionske matične (ES) ćelije koje su sadržale neaktivirani endogeni λ lokus (kako je gore opisano) su potvrđene putem postupaka karotipovanja i snimanja (npr., TAQMAN®) poznatim u tehnici. DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretiranju sa CRE rekombinazom čime je posredovanog brisanja proksimalne ciljne kasete koja je sadržala gen marker neomicina, ostavljajući samo jedno loxP mesto u tački brisanja (SL.2, dno).
[0193] Brisanje mišjeg κ lokusa lakog lanca. Korišćenjem postupaka sličnih gore opisanim postupcima, napravljeno je nekoliko ciljnih konstrukata da se modifikuje DNK iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04 (Invitrogen) homolognom rekombinacijom da se inaktivira mišji κ lokus lakog lanca u dvostepenom procesu (SL.3).
[0194] Takođe je opisana humanizacija lokusa endogenog mišjeg lakog lanca sa humanim segmentima V i J gena zajedno sa insercijom humanog intergenskog regiona da se stvori V lokus koji sadrži, u odnosu na transkripciju, između konačnog humanog V gena segmentu i prvom segmentu humanog J gena, intergenskom regionu, koji pokazuje populaciju B ćelija sa višom ekspresijom nego lokusu kojem nedostaje intergenska regija.Ovo zapažanje je konzistentno sa hipotezom da je intergenska regija -direktno kroz sterilni transkript, ili indirektno - potiskuje upotrebu iz endogenog lokusa lakog lanca Pod takvom hipotezom, uključujući i intergensku regiju, rezultirat će smanjenjem upotrebe endogenog lokusa lakog lanca, ostavljajući mišu ograničen izbor, ali da koristi modifikovani (u) lokus za generisanje antitela kao što je navedeno u patentnim zahtevima .
[0195] Dakle, dva modifikovana endogena lokusa lakog lanca (κ i λ) koja sadrže nedirnuti pojačavač i konstantne regione su stvorena za progresivno umetanje nepreraspoređenih ljudskih λ segmenata gena klicine linije na precizan način korišćenjem ciljnih vektora opisanih dole u tekstu.
Primer II
Zamena mišjih lokusa lakog lanca sa ljudskim λ mini-lokusom lakog lanca
[0196] Višestruki ciljajući vektori su projektovani za progresivno umetanje ljudskih λ segmenata gena u endogene mišje κ i λ lokuse lakog lanca korišćenjem sličnih postupaka kao što je gore opisano. Višestruke nezavisne početne modifikacije su napravljene na endogenim lokusima lakog lanca proizvodeći himerni lokus lakog lanca koji sadrži hVλ i Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišje konstantne gene lakog lanca i pojačavače.
[0197] Ljudski λ mini-lokus koji sadrži 12 ljudski Vλ i jedan ljudski Jλ segment gena. Niz inicijalnih ciljajućih vektora je projektovan da sadrži prvih 12 uzastopnih ljudskih Vλ segmenata gena iz skupine A I hJλ1 segmenta gena ili četiri hJλ segmenata gena korišćenjem ljudskog BAC klona pod nazivom RP11-729g4 (Invitrogen). SL.4A i 4B pokazuju ciljajuće vektore koji su konstruisani za pravljenje početnog umetanja ljudskih λ segmenata gena lakog lanca na mišjim λ i κ lokusima lakog lanca, respektivno.
[0198] Za prvi komplet početnih ciljajućih vektora, 124,125 bp DNK fragment iz 729g4 BAC klona koji je sadržao 12 hVλ segmenata gena i hJλ1 segment gena je projektovan da sadrži PI-Scel mesto 996 bp nizvodno (3’) od hJλ1 segmenta gena za vezivanje 3’ mišja homologna kraka. Korišćena su dva različita kompleta homolognih krakova za ligaciju na ovom ljudskom fragmentu; jedan komplet homolognih krakova je sadržao endogene mišje λ sekvence iz 135k15 BAC klona (SL.4A) i još jedan komplet je sadržao endogenu κ sekvencu 5’ i 3’ mišjih Vκ i Jκ segmenata gena iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04, respektivno (SL.4B).
[0199] Za 12/1-λ ciljajući vektor (SL. 4A), PI-Scel mesto je projektovano na 5’ kraju 27.847 bp DNK fragmenta koji sadrži mišji Cλ2-Jλ4-Cλ4 i pojačavač 2.4 modifikovanog mišjeg λ lokusa opisanog u Primeru 1. Korišćen je ∼28 kb mišji fragment kao 3’ homologni krak ligacijom na ∼124 kb ljudski λ fragment, koji je stvorio 3’ ukrštanje koje je sadržalo, od 5’ do 3’, hJλ1 segmenta gena, 996 bp ljudske λ sekvence 3’ hJλ1 segmenta gena, 1.229 bp mišje λ sekvence 5’ na mišji Cλ2 gen, mišji Cλ2 gen i preostali deo ∼28 kb mišjeg fragmenta. Uzvodno (5’) od ljudskog Vλ3-12 segmenta je bio dodatni 1.456 bp ljudske λ sekvence pre početka 5’ mišjeg homolognog kraka, koji je sadržao 23.792 bp mišje genomske DNK koja odgovara sekvenci 5’ endogenog mišjeg λ lokusa. Između 5’ homolognog kraka i početka ljudske λ sekvence je bila kaseta neomicina prirubno postavljena pomoću Frt mesta.
[0200] Dakle, 12/1-λ ciljajući vektor je uključio, od 5’ do 3’, 5’ homologni krak sadrži -24 kb mišje λ genomske sekvence 5’ endogenog λ lokusa, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto, ∼123 kb ljudske genomske λ sekvence sadrži prvih 12 uzastopnih hVλ segmenata gena i hJλ1 segmenata gena, PI-Scel mesto, i 3’ homologni krak koji sadrži ∼28 kb mišju genomsku sekvencu koja obuhvata endogene Cλ2-Jλ4-Cλ4 segmente gena, mišji pojačavač 2.4 sekvence i dodanu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3’) od pojačavača 2.4 (SL.4A).
[0201] Na sličan način, 12/1-κ ciljajući vektor (SL.4B) je koristio isti ∼124 ljudski λ fragment sa izuzetkom da su mišji homologni kraci koji sadrže mišju κ sekvencu korišćteni tako da ciljanje na endogeni κ lokus može da se ostvari pomoću homologne rekombinacije. Dakle, 12/1-κ ciljajući vektor je uključio, od 5’ do 3’, 5’ homologni krak koji obuhvata ∼23 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog κ lokusa, I-Ceul mesto, 5’ Frt mesto, kaseta neomicina, 3’ Frt mesto, ∼124 kb ljudske genomske λ sekvence koja sadrži prvih 12 uzastopnih hVλ segmenata gena i hJλ1 segmenata gena, PI-Scel mesto, i 3’ homologni krak koji sadrži ∼28 kb mišje genomske sekvence obuhvata endogeni mišji Cκ gen, Eκi i Eκ3’ i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3’) od Eκ3’ (SL.4B, 12/1-κ ciljajući vektor).
[0202] Daljnje modifikacije lokaliziranog modifikovanog endogenog λ lakog lanca mogu se postići upotrebom sličnih tehnika za ubacivanje više segmenata gena hVλ .Na primer, šematski prikazi dva dodatna ciljna konstrukta (+ 16-λ 12- λ ciljnih vektora) koji se koriste za progresivno umetanje segmenata dodatnog humanog hV gena je prikazano na Slici 5. Kao što je ilustrovano, dodatni genomski fragmenti koji sadrže specifične segmente humanog hVλ gena su ubačeni u modifikovani λ lokus endogenog lakog lanca u uzastopnim koracima koristeći homologiju obezbeđenu prethodnim umetanjem humanog lakog lanca Po rekombinaciji sa svakom ciljanom konstrukcijom ilustrovano, sekvencijalno, 28 dodatnih segmenata gena hVλ je umetnuto u modifikovani λ lokus endogenog lakog lanca, što stvara himerni lokus koji proizvodi protein lakog lanca koji sadrži humane Vλ-Jλ segmente gena povezane sa mišji Cλ gen .
[0203] Ljudski λ mini-lokus sa 12 ljudski Vλ i četiri ljudska Jλ segmenta gena. U drugom pristupu da se doda raznovrsnost himernom λ lakog lanca, treći inicijalni ciljajući vektor je projektovan da se umetne prvih 12 uzastopnih ljudskih Vλ segmenata gena iz skupine A i hJλ1, 2, 3 i 7 segmenata gena u mišji κ lokus lakog lanca (SL.4B, 12/4-κ ciljajući vektor). DNK segment koji sadrži hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 segmenata gena je napravljena de novo DNK sintezom (Integrated DNA Technologies) uključujući svaki Jλ segment gena i ljudsku genomsku sekvencu ∼100 bp od i neposrednih 5’ i 3’ regiona svakog Jλsegmenta gena. PI-Scel mesto je projektovano u 3’ kraj ovog ∼1 kb DNK fragment i povezan na kasetu hloroamfenikol. Homologni kraci su PCR pojačani iz ljudske λ sekvence na 5’ i 3’ pozicijama u odnosu prema hJλ1 segment gena ljudskog BAC klona 729g4. Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom intermedijara je izvedena na modifikovanom 729g4 BAC klonu koji je prethodno ciljan uzvodno (5’) od ljudskog Vλ3-12 segmenta gena sa kasetom neomicina prirubno postavljenom pomoću Frt mesta, koja su takođe sadržala I-Ceul mesto 5’ do 5’ Frt mesta. Dvostruko-ciljani 729g4 BAC klon je obuhvatio od 5’ do 3’ I-Ceul mesto, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mestom, ∼123 kb fragment koji sadrži prvih 12 hVλ segmenata gena, ∼1 kb fragment koji sadrži ljudske Jλ1, 2, 3 i 7 segmente gena, PI-Scel mesto, i kasetu hloroamfenikola.
Ovaj ciljajući vektor intermedijara je rastvoren zajedno sa I-Ceul i PI-Scel i naknadno povezan u modifikovan mišji BAC klon (opisan gore) da se stvori treći ciljajući vektor.
[0204] Ova ligacija je dala kao rezultat treći ciljajući vektor za ubacivanje ljudskih λ sekvenci u endogeni κ lokus lakog lanca, koji je obuhvatio, od 5’ do 3’, 5’ mišji homologni krak koji je sadržao ∼23 kb genomske sekvence 5’ endogenog mišjeg κ lokusa, I-Ceul mesto, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto, ∼123 kb fragment koji obuhvata prvih 12 hVλ segmenata gena, ∼1 kb fragment koji obuhvata hJλ1, 2, 3 i 7 segmente gena, PI-Scel mesto i 3’ homologni krak koji obuhvata ∼28 kb mišje genomske sekvence uključujući endogeni mišji Cκ gen, Eκi i Eκ3’ i dodatnu mišju genomsku sekvencu u donjem toku (3’) Eκ3’ (SL. 4B, 12/4-κ ciljajući vektor). Homologna rekombinacija sa ovim trećim ciljajućim vektorom je stvorila modifikovani mišji κ lokus lakog lanca koji obuhvata 12 hVλ segmente gena i četiri hJλ segmenta gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cκ gen koji, posle rekombinacije, vodi formiraju himernog ljudskog λ/ mišjeg κ lakog lanca.
[0205] Ljudski λ mini-lokus sa integrisanom ljudskom κ sekvencom lakog lanca.
Na sličan način, dva dodatna ciljajuća vektora slična onima koji su projektovani da se napravi početno umetanje ljudskih λ segmenata gena u endogeni κ lokus lakog lanca (SL. 4B, 12/1-κ I 1214-κ ciljajući vektori) su projektovani da progresivno ubacuju ljudske λ segmente gena lakog lanca koristeći jedinstveno konstruisane ciljajuće vektore koji sadrže dodirne ljudske λ i κ genomske sekvence. Ovi ciljajući vektori su konstruisani da obuhvate ~ 23 kb ljudsku κ genomsku sekvencu prirodno postavljenu između ljudskih Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena. Ova ljudska κ genomska sekvenca se specifično pozicionirana u ova dva dodatna ciljajuća vektora između ljudskih Vλ i ljudskih Jλ segmenata gena (SL.
4B, 12(κ)1-κ i 12(κ)4-κ ciljajuće vektore).
[0206] Oba ciljajuća vektora koja sadrže ljudsku κ genomsku sekvencu su napravljena korišćenjem modifikovanog RP11-729g4 BAC klona opisanog gore (SL. 6). Ovaj modifikovani BAC klon je ciljan sa kasetom odabira spektinomicina prirubno postavljenom pomoću Notl i AsiSI mesta ograničenja (SL. 6, gore levo). Homologna rekombinacija sa kasetom spektinomicina dala je kao rezutlat dvostruko ciljani 729g4 BAC klon koji je obuhvatio, od 5’ do 3’, I-CeuI mesto, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto, ~123 kb fragmenta sa prvih 12 hVλ segmenata gena, Notl mesto oko 200 bp donjeg toka (3’) do sekvence nonamera hVλ3-1 segmenta gena, kasete i AsiSI mesto. Odvojeni ljudski BAC klon sa ljudskom κ sekvencom (CTD-2366j12) je ciljan dva nezavisna puta da se projektuju mesta ograničenja na lokacijama između hVκ4-1 i hJκ1 segmenata gena da se omogući naknadno kloniranje ~23 kb fragmenta za ligaciju sa hVλ segmentima gena sadržanim u dvostruko ciljanom modifikovanom 729g4 BAC klonu (SL.6, gore desno).
[0207] Tako, drugi pristup pozicionira jedan ili više segmenata humanog Vλ gena na lokusu mišjeg chain ličnog lanca koji se graniči sa jednim humanim segmentom Jλ gena (12/1-κ vektor ciljanja, slika 4B) .
[0208] Dvostruko-ciljani 729g4 i 2366j12 klonovi su rastvoreni sa NotI i AsiSI dajući kao prinos jednog fragmenta koji obuhvata kasetu neomicina i hVλ segmenata gena i još jedan fragment koji obuhvata ~23 kb genomskog fragmenta ljudskog κ lokusa sa intergenskim regionom između Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena, bilo hJλ1 segment gena ili genosmki fragment koji obuhvata hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 segmenata gena, PI-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola, respektivno. Ligacija ovih fragmenata je generisalo dva jedinstvena BAC klona koji obuhvataju od 5’ do 3’ hVλ segmenata gena, ljudsku κ genomsku sekvencu između Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena, bilo hJλ1 segment gena ili genomski fragment koji obuhvata hJλ1, Jλ2, Jλ3 and Jλ7 segmenata gena, PI-SceI mesto i kasetu hloroamfenikola (SL. 6, dno). Ovi novi BAC klonovi su zatim rastvoreni sa I-Ceul i PI-SceI da ispuste jedinstvene fragmente koji sadrže kasetu neomicina uzvodno i dodirne ljudske λ i κ sekvence i povežu se u modifikovani mišji BAC klon 302g12 koji je sadržao od 5’ do 3’ mišje genomske sekvence 5’ endogenog κ lokusa, I-CeuI mesto, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto, hVλ segmente gena (3-12 to 3-1), NotI mesto -200 bp nizvodno Vλ3-1, ~23 kb ljudske κ sekvence koja se može prirodno naći između ljudskih Vκ4-1 i Jκ1 segmenata gena, bilo hJλ1 segment gena ili genomski fragment sa hJλ1, Jλ2, Jλ3 i Jλ7 segmentima gena, mišji Eκi, mišji Cκ gen i Eκ3’ (SL. 4, 12hVλ-VκJκ-hJλ1 i 12hVλ-VκJκ-4hJλ. ciljajući vektor). Homologna rekombinacija sa oba ova ciljajuća vektora je stvorila dva odvojena mišja κ lokusa lakog lanca sa 12 hVλ segmenata gena, ljudsku κ genomsku sekvencu, i jedan ili četiri hJλ segmenta gena funkcionalno povezana na endogeni mišji Cκ gen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog ljudskog λ/ mišjeg κ lakog lanca.
Primer III
Projektovanje dodatnih ljudskih Vλ segmenata gena u ljudski λ mini-lokus lakog lanca
[0209] Dodatni hVλ segmenti gena su dodati nezavisno na svaku od početnih modifikacija opisanih u Primeru 2 korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i postupaka (SL.5A, 16-λ ciljajući vektor i SL.5B, 16-κ ciljajući vektor).
[0210] Uvođenje 16 dodatnih ljudskih Vλ segmenata gena. Uzvodno (5') homologni kraci korišćeni za sklapanje ciljajućih vektora za dodavanje 16 dodatnih hVλ segmenata gena na modifikovane lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 su sadržali mišju genomsku sekvencu 5’ bilo endogenih κ ili λ lokusa lakog lanca.3’ homologni kraci su bili isti za sve ciljajuće vektore i sadržali su ljudske genomske sekvence koje se preklapaju sa 5’ krajem ljudske λ sekvence modifikacija kako je opisano u Primeru 2.
[0211] U četvrtom pristupu, jedan ili više segmenata hVλ gena su pozicionirani na κ lokusu mišjeg lakog lanca koji se graniče sa κ humanom intergenskom sekvencom i četiri hJλ gen sekvence (12 (κ) 4 - κ Vektor za ciljanje Slika 4B).
[0212] Svi gornji pristupi za ubacivanje humanih λ segmenata gena lakog lanca na κ lokusu miša, održavaju κ intronicni element pojačivača uzvodno od Cκ gena (označen Eκi, Slika 4B i Slika 5B) i 3 ' κ pojačivač nizvodno Cκ gena (označenog Eκ3 ', Slika 4B i Slika 5B) Ovi pristupi rezultiraju sa četiri odvojena modifikovana alela na lokusu endogenog mišjeg κ lakog lanca (Slika 7B) ".
[0213] U različitim aspektima, genetički modifikovani miš sadrži nokaut lokalnog lokusa lakog lanca endogenih λ miševa. U jednom aspektu, λ lokus lakog lanca je izbačen strategijom koja briše region koji obuhvata Vλ2 do Jλ2, i region obuhvatanja Vλ1 u Cλ1 (FIG.2). Svaka strategija koja smanjuje ili eliminiše sposobnost lokalizacije endogenog λ lakog lanca da eksprimira endogene λ domene je pogodna za upotrebu u okviru ovog otkrića .
[0214] Ukratko, ciljajući vektor je projektovan za uvođenje 12 dodatnih hVλ segmenata gena na modifikovani mišji κ i λ lokuse lakog lanca opisane gore u tekstu (SL. 5A i 5B, 12-λ ili 12-κ ciljajućih vektora). DNK fragment 93.674 bp iz ljudskog BAC klona RP11-22I18 (Invitrogen) sa 12 uzastopnih hVλ segmenata gena iz skupine B je projektovan sa 5’ homolognim krakom koji sadrži mišju genomsku sekvencu 5’ na bilo endogeni mišji κ ili λ lokus lakog lance i 3’ homologni krak koji obuhvata ljudsku genomsku λ sekvencu.5’ homologni kraci korišćeni u ovom ciljajućem konstruktu su bili isti 5’ homologni kraci korišćeni za dodavanje 16 hVλ segmenata gena opisanih gore u tekstu (SL.5A i 5B).3’ homologni krak je napravljen projektovanjem PI-SceI mesta ~3431 bp 5’ na ljudski VX3-29P segment gena sadržan u 27.468 bp genomskom fragmentu ljudske λ sekvence iz BAC klona RP11-761I13. Ovo PI-SceI mesto je služilo kao tačka ligacije da se pridruži ~94 kb fragment dodatne ljudske λ sekvence na ~27 kb fragment ljudske λ sekvence koja se preklapa sa 5’ krajem ljudske λ sekvence u prethodnoj modifikaciji korišćenjem 16-λ ili 16-κ ciljajućih vektora (SL. 5A i 5B). Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5’ do 3’, 5’ homologni krak koji sadrži bilo ~23 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog κ lokusa lakog lanca Dr ~24 kb mišje genomske sekvence 5’ endogenog λ lokusa lakog lanca, 5’ Frt mesto, kasetu neomicina, 3’ Frt mesto i 121.188 bp ljudske genomske λ sekvence sa 16 hVλ segmenata gena i PI-SceI mesto; čijih se ~27 kb preklapa sa 5’ krajem ljudske λ sekvence od umetanja 16 dodatnih hVλ segmenata gena i služi kao 3’ homologni krak za ovaj ciljajući konstrukt (SL.5A i 5B, 12-λ ili 12-κ ciljajućih vektora). Homologna rekombinacija ovih ciljajućih vektora je nezavisno stvorila modifikovane mišje κ i λ lokuse lakog lanca sa 40 hVλ segmenata gena ljudski Jλ1 funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Cκ ili Cλ2) koje, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog lakog lanca (dno SL.5A i 5B).
[0215] Na sličan način, 12-κ ciljajući vektor je takođe korišćen da uvede 12 dodatnih hVλ segmenata gena na druge početne modifikacije koje su obuhvatile više hJλ segmenata gena sa i bez integrisane ljudske κ sekvence (SL. 4B). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjem κ lokusu je sadržala druge modifikacije koje su stvorile mišji κ lokus lakog lanca sa 40 kVλ segmenata gena i hJλ1, 2, 3 i 7 segmenata gena sa i bez ljudske Vκ-Jκ genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Cκ gen koji, posle rekombinovanja, vodi formiranju himernog λκ lakog lanca.
Primer IV
Identifikacija ciljanih embrionskih matičnih (ES) ćelija koje nose ljudske λ segmente gena lakog lanca
[0216] Sledeći primeri su dati tako da opisuju kako se prave i koriste postupci prema pronalasku, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. i pritisak jeste ili je blizu atmosferskog .
[0217] Embrionske matične (ES) ćelije koje nose ljudske λ segmente gena lakog lanca su opciono transfektovane sa konstruktom koji ispoljava FLP kako bi se uklonila Frt’ed kaseta neomicina uvedena umetanjem ciljajućeg konstrukta koji obuhvata ljudske Vλ5-52-Vλ1-40 segmente gena (SL. 5A i 5B). Kaseta neomicina može opciono da bude uklonjena oplemenjivanjem na miševima koji ispoljavaju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, kaseta neomicina je zadržana kod miševa.
Tabela 1
Tabela 2
Primer V
Generisanje miševa koji ispoljavaju ljudske λ lake lance iz endogenog lokusa lakog lanca
[0218] Ciljane embrionske matične (ES) ćelije opisane gore u tekstu su korišćene kao donor embrionske matične celije i uvedene u embrion miša u stadiujumu od 8-ćelija mišjeg embriona postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr., US Pat. br.7,294,754 i Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99). VELOCIMICE® (F0 miševi su u potpunosti razvijeni iz matične ćelije (ES) ćelije donatora) koji nezavisno nosi ljudske λ segmente gena su identifikovani genotipovanjem korišćenjem modifikacije ogleda alela (Valenzuela et al., supra) koji su detektovali prisustvo jedinstvenih ljudskih λ segmenata gena (supra).
[0219] κ:λ upotreba lakog lanca miševa koji nose ljudske λ segmente gena lakog lanca.
Homozigotni miševi za svaka tri uzastopna umetanja hVλ segmenata gena se jednim hJλ segmentom gena (SL. 5B) i miševi homozigotni za prvo umetanje hVλ segmenata gena sa bilo jednim hJλ segmentom gena ili četiri ljudska Jλ segmenta gena uključujući
ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu (SL.4B) su analizirani za κ i λ ispoljavanje lakog lanca u splenocitima korišćenjem protočne citometrije.
[0220] Ukratko, slezine su prikupljene iz grupa miševa (koje se kreću od tri do sedam životinja po grupi) i samlevene korišćenjem staklenih klizišta. Posle liziranja crvenih ćelija krvi (RBCs) sa ACK puferskim sredstvom za liziranje (Lonza Walkersville), splenociti su postavljeni sa fluorescentnom bojom konjugovanim antitelima specifičnim za mišji CD19 (Clone 1 D3; BD Biosciences), mišji CD3 (17A2; Biolegend), mišji Igκ (187.1; BD Biosciences) i mišji Igλ (RML-42; Biolegend). Podaci su prikupljeni korišćenjem BD™ LSR II protočne citometrije (BD Biosciences) i analizirani korišćenjem FLOWJO™ softvera (Tree Star, Inc.). Tabela 3 iznosi prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), κ lakog lanca (CD19<+>Igκ<+>Igλ-) i λ ispoljavanje lakog lanca (CD19<+>Igκ<->Ig<+>) primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose svaku genetsku modifikaciju.
[0221] U sličnom eksperimentu, analizirani su sadržaji B ćelija pregrade slezine iz miševa homozigotnih za prvo umetanje 12 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Cκ gen (dno SL. 4B) i mišji homozigot za 40 hVλ i jedan hJλ segment gena (dno SL. 5B ili vrh SL. 7B) za Igx i Igκ ispoljavanje korišćenjem protočne citometrije (kako je gore opisano). SL.8A pokazuje ispoljavanje Igλ i Igx u CD19<+>B ćelijama za miša koji je predstavnik za svaku grupu. Broj CD19<+>B ćelija po slezini je takođe zabeležen za svaki mišji (SL.8B).
[0222] U drugom eksperimentu, analizirani su sadržaj B ćelija pregrada za slezinu i koštanu srž iz mišjih homozigotnih za 40 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Cκ gen (dno SL. 7B) za napredovanje kroz razvoj B ćelije korišćenjem protočne citometrije različitih markera površine ćelije.
[0223] Ukratko, dve grupe (N=3 svaka, 9-12 nedelja stari, muški i ženski) divljeg tipa i miševi homozigotni za 40 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Cκ gen su žrtvovani i pokupljene su slezine i koštana srž. Koštana srž je prikupljena iz butnih kostiju ispiranjem sa potpunom podlogom RPMImedijum (RPMImedium dopunjen serumom telećeg fetusa, natrijum piruvatom, Herpes, 2-merkaptoetanolom, neesencijalnim amino kiselinama, i gentamicinom). RBC preprarati iz slezine i koštane srži su lizovani sa ACK puferskim sredstvom za lizu (Lonza Walkersville), posle čega je usledilo pranje sa potpunom RPMI podlogom. 1x10<6>ćelije su inkubirane sa antitelima koja jako reaguju sa antigenima miša CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, posle čega je usledio označavanje sa odabranim panelom antitela tokom 30 min. na ledu.
[0224] Panel koštane srži: anti-mišji FITC-CD43 (1 B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD) i Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend).
[0225] Panel koštane srži i slezine: anti-mišji FITC-Igκ (187.1, BD), PE-Igλ (RML-42, BioLegend), PeCy7-IgM (II/41, ebioscience), PerCP-Cy5.5-IgD (11-26c.2a, BioLegend), Pacific Blue-CD3 (17A2, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD).
[0226] Posle bojenja, ćelije su oprane i fiksirane u 2% formaldehidu. Prikupljanje podataka je izvedeno na FACSCANTOII™ protočnoj citometriji (BD Biosciences) i analizirani sa FLOWJO™ softverom (Tree Star, Inc.). SL. 9A. - 9D pokazuju rezultate za slezinsku pregradu jednog miša predstavnika iz svake grupe. SL. 10A - 10E pokazuju rezultate za pregradu koštane srži jednog miša predstavnika za svaku grupu. Tabela 4 iznosi prosečne procenutalne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), ispoljavanje κ lakog lanca (CD19<+>IgK<+>Ig-) i λ laki lanac (CD19<+>Igκ-Igλ<+>) primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose različite genetske modifikacije. Tabela 5 iznosi prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), zrele B ćelije (B220<hi>IgM<+>), nezrele B ćelije (B220<int>IgM<+>), nezrele B ćelije koje ispoljavaju κ laki lanac (B220<int>IgM<+>Igκ<+>) i nezrele B ćelije koje ispoljavaju λ laki lanac (B220<int>IgM<+>Igλ<+>) primećen u koštanoj srži divljeg tipa i miševa homozigotnih za 40 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Cκ gen. Ovaj eksperiment je ponovljen sa dodatnim grupama miševa opisanih iznad i pokazani su slični rezultati (podaci nisu prikazani).
Tabela 3
Tabela 4
Tabela 5
[0227] Za 12/1 λ vektor ciljanja (slika 4A), PI-SceI mesto je konstruisano na 5 'kraju 27,847 bp fragmenta DNA koji sadrži miša Cλ2-Jλ4-Cλ4 i pojačivač 2,4. modifikovanog lokusa miša opisanog u Primeru 1. Fragment miša od ~ 28 kb je korišćen kao 3 'ruka homologije ligacijom na ~ 124 kb humani λ fragment, koji je stvorio 3' spoj koji sadrži, od 5 'do 3', hJλ 1 segment gena, 996 bp ljudske λ sekvence 3 'od hJλ1 genskog segmenta, 1229 bp mišje λ sekvence 5' do mišjeg Cλ2 gena, mišji Cλ2 gen i preostali deo od ~ 28 kb misjeg fragmenta. Uzvodno (5 ') iz humanog segmenta Vλ 3-12 gena je bilo dodatnih 1456 bp ljudske λ sekvence pre početka ruke 5' mišjeg homologa, koja je sadržala 23,792 bp mišje genomske DNK koja odgovara sekvenci 5 'endogenog mišjeg λ locusa. Između 5 'ruke za homologiju i početka ljudske λ sekvence bila je neomicinska kaseta koja je bila okružena Frt lokacijama.
[0228] Ukratko, slezine su prikupljene i prelivene sa 10 mL RPMI-1640 (Sigma) sa 5% HI-FBS u sterilnim vrećama za jednokratnu upotrebu. Svaka vreća koja je sadržala jednu slezinu je zatim postavljena u STOMACHER™ (Seward) i homogenizovana na srednjoj postavci tokom 30 sekundi. Homogenizovane slezine su filtrirane korišćenjem 0,7µm cediljke za ćelije i zatim su peletirane centrifugom (1000 ob./min tokom 10 minuta) i RBCs su lizovane u BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) tokom tri minuta. Splenociti su rastvoreni sa RPMI-1640 i ponovo centrifugirani, posle čega je sledilo vraćanje u suspenziju u 1 mL PBS (Irvine Scientific). RNK je izolovana iz peletiranih splenocita korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici.
[0229] RT-PCR je izveden na RNK splenocitu korišćenjem prajmera specifičnih za ljudske hVλ segmente gena I mišji Cκ gen (Tabela 6). PCR proivodi su bili prečišćeni gelom i klonirani u pCR2.1-TOPO TA vektor (Invitrogen) i sekvencionirani prajmeri M13 Forward (GTAAAACGAC GGCCAG; ID BR SEK: 55) i M13 Reverse (CAGGAAACAG CTATGAC; ID BR SEK:56) su smešteni unutar vektora na lokacijama koje su prirubno postavljene na mesto kloniranja. Ukupno osamdeset četiri klona je izvedeno iz prvog i trećeg umetanja ljudske λ sekvence su sekvencionirane da se odredi hVλ upotreba gena (Tabela 7). Ovi sekvenca nukleotida hVλ-hJλ1-mCκ ukrštanje za izabrane RT-PCR klonove je prikazano na SL.11.
[0230] Na sličan način, homozigotni miševi za treće umetanje ljudskih λ sekvenci gena lakog lanca (t.j.
40 hVλ segmenata gena i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu, dno SL.7B) funkcionalno povezano na endogeni mišji Cκ gen su analizirani za upotrebu ljudskog λ gena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore u tekstu). Upotreba ljudskog λ segmenta gena lakog lanca za 26 odabranih RT-PCR klonova je prikazana u Tabeli 8. Sekvenca nukleotida hVλ-hJλ-mCκ ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL.12.
[0231] Na sličan način, homozigotni miševi za prvo umetanje ljudskih λ segmenata gena lakog lanca (12 hVλ segmenata gena i hJλ1, SL. 4A i SL. 5A) funkcionalno povezani na endogeni mišji Cλ2 gen su analizirani za upotrebu ljudskog λ gena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore). Prajmeri specifični za hVλ segmente gena (Tabela 6) su spareni sa jednim od dva prajmera specifična za mišji Cλ2 gen; Cλ2-1 (ID BR SEK:104) ili Cλ2-2 (ID BR SEK:105).
[0232] Više hVλ segmenata gena preraspoređenih u hλ1 je primećeno iz RT-PCR klonova iz miševa koji nose ljudske λ segmente gena lakog lanca na endogenom mišjem λ lokusu lakog lanca. Sekvenca nukleotida hVλ- hJλ-mCλ2 ukrštanja za izabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL.13.
Tabela 6
Tabela 7
Tabela 8
(nastavak)
[0233] SL.11 pokazuje sekvencu hVλ-hJλ1-mCκ ukrštanja za RT-PCR klonove iz miševa koji nose prvo i treće umetanje hVλ segmenata gena sa jednim hJλ segmentom gena. Sekvence prikazane na SL. 11 ilustruje jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVλ segmente gena sa hJλ1 rekombinovanom na mišjem Cκ genu. Heterozigotni miševi koji nose samo jedan modif kovani endogeni κ lokus sa 12 hVλ segmenata gena i hJλ1 i homozigotni miševe koji nose dva modfikovana endogena κ lokusa koji sadrže 40 hVλ segmenata gena i hJλ1 su kod oba bili sposobni da proizvedu ljudske λ segmente gena funkcionalno povezane na mišji Cκ gen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudske λ lake lance. Ova preraspoređivanja pokazuju da su himerni lokusi mogli da nezavisno prerasporede ljudske λ segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, ove modifikacije na endogenom κ lokusu lakog lanca nisu dale nijedan od hVλ segmenata gena inoperativan ili sprečile da himerni lokus rekombinuje više hVλ i hJλ (Jλ1) segmenata gena tokom razvoja B ćelije kako su potvrdili dokazi pomoću16 različitih hVλ segmenata gena koji su primećeni da se preraspoređuju sa hJλ1 (Tabela 7). Dalje, ovi miševi su napravili funkcionalna antitela koja su sadržala preraspoređene ljudske Vλ-Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišje Cκ gene kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0234] SL. 12 pokazuje sekvencu hVλ-hJλ-mCλ ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove iz mišjih homozigotnih za 40 hVλ i četiri hJλ segmenta gena uključujući ljudsku Vκ-Jκ genomsku sekvencu. Sekvence prikazane na SL. 12 ilustruju dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju više različitih hVλ segmenata gena, koji se prostiru kroz ceo raspon himernog lokusa, sa više različitih hJλ segmenata gena raspoređenih i funkcionalno povezanih na mišji Cκ gen. Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene κ lokuse koji sadrže 40 hVλ i četir hJλ segmenata gena su mogli da proizvedu ljudske λ segmente gena funkcionalno povezane na mišji Cκ gen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudske λ lake lance. Ova preraspoređivanja još pokazuju da su sve faze himernih lokusa mogle da nezavisno prerasporede ljudske λ segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, ove dodatne modifikacije na endogenom κ lokusu lakog lanca pokazuju da nije svako umetanje ljudskih λ segmenata gena dalo bilo kakve hVλ i/ili Jλ segmente gena inoperativne ili sprečavaju himerne lokuse da rekombinuju hVλ i Jλ segmente gena tokom razvoja B ćelije kako su potvrdili dokazi pomoću 12 različitih hVλ segmenata gena za koje je primećeno da se preraspoređenuju sa sva četiri hJλ segmenta gena (Tabela 8) od 26 odabrana RT-PCR klona. Dalje, ovi miševi su napravili i funkcionalna antitela koja su sadržala ljudske Vλ-Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišje Cκ regione kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0235] SL. 13 pokazuje sekvencu hVλ-hJλ-mCλ2 spoja za tri pojedinačna RT-PCR klona iz mišjih homozigotnih 12 hVλ segmenata gena i hJλ1. Sekvence prikazane na SL. 13 ilustruju dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVλ segmente gena, u rasponu dužine od prvog umetanja, sa hJλ1 preraspoređen i funkcionalno povezan na mišji Cλ2 gen (2D1 = Vλ2-8Jλ1; 2D9 = Vλ3-10Jλ1; 3E15 = Vλ3-1Jλ1). Jedan klon je pokazao neproduktivno preraspoređivanje usled N dodavanja na hVλ-hJλ ukrštanja (2D1, SL.13). Ovo nije neubičajeno za V(D)J rekombinaciju, jer spajanje segmenata gena tokom rekombinacije se pokazalo kao neprecizno. Iako ovaj klon predstavlja neproduktivni rekombinant prisutan u repertoaru lakog lanca ovih miševa, ovo pokazuje da genetski mehanizam koji doprinosi raznovrsnosti pri ukrštanju među genima antitela radi normalno kod ovih miševa i vodi do repertoara antitela koji sadrži lake lance sa većom raznovrsnošću.
[0236] Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene λ lokuse sa 12 hVλ segmente gena i hJλ1 su takođe mogli da proizvedu ljudske λ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cλ gen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile reverzne himerne λ lake lance sa hVλ regionima povezanim na mišje Cλ regione. Ova preraspoređivanja još pokazuju da su ljudski λ segmenti gena lakog lanca postavljeni na drugom lokusu lakog lanca (t.j., λ lokus) mogli da se nezavisno prerasporede ljudske λ segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, modifikacije na endogenom λ lokusu lakog lanca pokazuju da umetanje ljudskih λ segmenata gena ne daje nijedan od hVλ i/ili hJλ1 segmenata gena inoperativnim ili spreče himerni lokus od rekombinovanja hVλ i hJλ1 segmenata gena tokom razvoja B ćelije. Dalje, ovi miševi su napravili i funkcionalna antitela koja su sadržala ljudske Vλ-Jλ segmente gena funkcionalno povezane na mišji Cλ region kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0237] Kao što je prikazano na ovom Primeru, miševi koji nose ljudske λ segmente gena lakog lanca na endogenim κ i λ lokusima lakog lanca lokusima lakog lanca su sposobni da prerasporede ljudske λ segmente gena lakog lanca i ispoljavaju ih u kontekstu mišjeg Cκ i/ili Cλ regiona kao deo normalnog repertoara antitela miša zato što je funkcionalni laki lanac potreban na različitim kontrolnim tačkama u razvoju B ćelije i u slezini i koštanoj srži. Dalje, rani podskupovi B ćelija (npr., pre-, pro- i tranzicione B ćelije) pokazuju normalan fenotip kod ovih miševa u poređenju sa divljim tipom štenaca iz legla (SL.9D, 10A i 10B). Primećen je mali nedostatak u koštanoj srži i perifernih populacija B ćelija, kojima se mogu pripisati brisanje podskupa auto-reaktivnih nezrelih B ćelija i/ili podoptimalnog udruživanja ljudskog λ lakog lanca sa mišjim teškim lancem. Međutim, Igλ/Igλ upotreba primećena kod ovih miševa prikazuje situaciju koja je više nalik na ispoljavanje ljudskog lakog lanca nego na ono što je primećeno kod miševa.
Primer VI
Odgajanje mišjeg ispoljavanja ljudskih λ lakih lanaca iz endogenih lokusa lakog lanca
[0238] Da se optimizuje upotreba ljudskih λ segmenata gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, miševi koji nose nepreraspoređene ljudske λ segmente gena su odgajani na drugom mišu koji sadrži brisanje u suprotnom endogenom lokusu lakog lanca (bilo κ ili λ). Na primer, ljudski λ segmenti gena pozicionirani na endogenom κ lokusu bi bili jedini funkcionalni segmenti gena lakog lanca prisutni kod miša koji takođe nose brisanje na endogenom λ lokusu lakog lanca. Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi ispoljilo samo ljudske λ lake lance kako je opisano u prethodnim primerima. Odgajanje je izvedeno standardnim tehnikama priznatim u tehnici i, alternativno, pomoću komercijalnih kompanija (npr., The Jackson Laboratory). Mišji sojevi koji nose ljudske λ segmente gena lakog lanca na endogenom κ lokusu i brisanje endogenog λ lokusa lakog lanca se skeniraju na prisustvo jedinstvenih reverzno-himernih (ljudsko-mišjih) λ lakih lanaca i odsustvo endogenih mišjih λ lakih lanaca.
[0239] Miševi koji nose nepreraspoređeni ljudski λ lokus lakog lanca se takođe odgajaju sa miševima koji sadrže zamenu endogeniog mišjeg lokusa promenljivg gena teškog lanca sa ljudskim lokusom promenljivog gena teškog lanca (videti US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, the VELOCIMMUNE® genetski projektovani miš). VELOCIMMUNE® miš obuhvata, delimično, koji ima genom koji obuhvata ljudske promenljive regione ljudskog teškog lanca koji su funkcionalno povezani na endogene mišje lokuse konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitela koja obuhvataju ljudski promenljivi region teškog lanca i mišji konstantni region teškog lanca kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira promenljive regione teških lanaca antitela može da bude izolovana i funkcionalno povezana na DNK koja kodira konstantne regione teškog lanca čoveka. DNK može zatim da se ispolji u ćeliji koja je sposobna da ispolji potpuno ljudski teški lanac antitela. Prema odgovarajućem rasporedu odgoja, dobijaju se miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg lokusa lakog lanca sa ljudskim lokusom teškog lanca i nepreraspoređenim ljudskim λ lokusom lakog lanca na endogenom κ lokusu lakog lanca. Antitela koja sadrže somatski mutirane ljudske regione teškog lanca i ljudske λ promenljive regione lakog lanca mogu da se izoluju posle imunizacije sa antigenom od interesa.
Primer VII
Generisanje antitela iz miševa koji ispoljavaju ljudske teške lance i ljudske λ lake lance
[0240] Posle odgajanja miševa koji sadrže nepreraspoređeni ljudski λ lokus lakog lanca na različitim željenim sojevima koji sadrže modifikacije i brisanje drugih endogenih lg mesta (kako je opisano gore), odabrani miševi su imunizirani sa antigenom od interesa.
[0241] Generalno, VELOCIMMUNE® miš koji sadrži jedan od pojedinačnih preraspoređenih ljudskih regiona lakog lanca klicine linije se izaziva sa antigenom, i limfnim ćelijama (kao što su B ćelije) se oporavljaju iz seruma životinja. Limfne ćelije mogu da se spoje sa linijom ćelije mijeloma da se pripreme besmrtne linije ćelija hibridoma, i takve linije ćelija hibridoma linije ćelija su skenirane i odabrane da se odrede linije ćelija hibridoma koje proizvode antitela koja sadrže ljudski teški lanac i ljudski λ laki lanac koji su specifični za antigen korišćen za imunizaciju. DNK kodiranje promenljivih regiona teških lanaca i λ lakih lanaca može da bude izolovano i povezano na željene izotipne konstantne regione teškog lanca i

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Postupak za pravljenje antitela ili izolovanje ćelije koja proizvodi isto, metoda sadrži:
a. imunizacijom miša sa antigenom od interesa, pri čemu miš sadrži endogeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži gen za konstantni region IgG koji nema sekvencu koja kodira CH1 region zbog genetske modifikacije embrionske linije koja sadrži deleciju nukleotidne sekvence koja kodira CH1 domen, i
gen endogenog IgM konstantnog regiona koji kodira funkcionalni CH1 domen, gde miš eksprimira IgM koji sadrži funkcionalni CH1 domen i IgG koji nema CH1 domen u celini;
b. dozvoljavajući mišu da imuni odgovor na antigen od interesa; i
c. izolovanje iz miša ćelije koja proizvodi antitelo koje specifično vezuje antigen od interesa.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što miš dalje sadrži zamenu svih segmenata V, D i J imunoglobulina teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više VH teškog lanca humanog imunoglobulina, DH humanog imunoglobulinskog teškog lanca, i JH geni segmenata JH humanog imunoglobulina teškog lanca, pri čemu su jedan ili više VH, DH i JH genskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina operativno vezani za endogeni lokus miša za endogeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina.
3. Miš prema patentnom zahtevu 2, prema kom se antitelo sastoji od ljudskog imoglobinskog teškog lanca varijabilne regije.
4. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time što je gen endogenog IgG konstantnog regiona izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1 gena konstantnog regiona, gena konstantnog regiona konstantnog regiona IgG2b, gena konstantnog regiona konstantnog regiona IgG2a, i kombinacija pri čemu je poželjno da je gen konstantne regije IgG gen za konstantni region IgG1.
5. Postupak prema zahtevu 4, naznačen time što je endogeni gen konstantnog regiona IgG gen za konstantni region IgG1 i miš dalje eksprimira (a) divlji tip IgG3 proteina; (b) divlji tip IgG2a proteina; i (c) divlji tip IgG2b proteina, poželjno gde miš dalje eksprimira (d) divlji tip IgM proteina; (e) divlji tip IgD proteina, (f) divlji tip IgA proteina; i (h) divlji tip IgE proteina.
6. Postupak prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što:
(a) endogeno antitelo teškog lanca IgG sadrži zglob IgGl, domen CH2 i domen CH3; (b) miš sadrži funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina, poželjno gde je lokus lakog lanca imunoglobulina k lokus gena lakog lanca ili lokus gena lakog lanca; i / ili
(c) miš je sorte izabrane iz grupe koja se sastoji od 129 sorti , sorte C57BL / 6 i mešanih sorti 129k C57BL / 6, poželjno gde je miš 50% 129 i 50% C57BL / 6.
7. Postupak za izolaciju nukleinske kiseline koja kodira antitelo teškog lanca, a postupak sadrži:
a. imunizacijom miša sa antigenom od interesa, pri čemu miš sadrži endogeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži gen za konstantni region IgG koji nema sekvencu koja kodira CH1 region zbog genetske modifikacije embrionske linije koja sadrži deleciju nukleotidne sekvence koja kodira CH1 domen i endogeni gen konstantnog regiona IgM koji kodira funkcionalni CH1 domen, gde miš eksprimira IgM koji sadrži funkcionalni CH1 domen i IgG koji nema CH1 domen u celini; b. dozvoljavajući mišu da imuni odgovor na antigen od interesa; i
c. izolovanje iz miša ćelije koja proizvodi antitelo koje specifično vezuje antigen od interesa, i d. izolovanje nukleinskih kiselina imunoglobulinskog teškog lanca varijabilnog regiona iz ćelije izolovane u (c).
8. Postupak prema zahtevu 7, naznačen time, što miš dalje sadrži zamenu svih segmenata V, D i J imunoglobulina teškog lanca imunoglobulina sa jednim ili više VH teškog lanca humanog imunoglobulina, DH teškog lanca humanog imunoglobulina, i JH geni segmenata JH humanog imunoglobulina teškog lanca, pri čemu su jedan ili više VH, DH i JH genskih segmenata teškog lanca humanog imunoglobulina operativno povezani na endogenom lokusu miša na endogeni konstantni region teškog lanca imunoglobulina.
9.Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što antitelo sadrži varijabilnu regiju teškog lanca humanog imunoglobulina
10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 7-9, naznačen time što je gen za endogeni IgG konstantni region izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1 konstantnog regiona gena, gena konstantnog regiona konstantnog regiona IgG2b, gena konstantnog regiona konstantnog regiona IgG2a, i njihove kombinacije, poželjno gde je gen konstantne regije IgG gen IgG1 konstantnog regiona.
11. Postupak prema zahtevu 10, naznačen time što je endogeni gen konstantnog regiona IgG gen za konstantni region IgG1 i miš dalje eksprimira (a) divlji tip IgG3 proteina; (b) divlji tip IgG2a proteina; i (c) divlji tip IgG2b proteina, poželjno gde miš dalje eksprimira (d) divlji tip IgM proteina; (e) divlji tip IgD proteina, (f) divlji tip IgA proteina; i (h) divlji tip IgE proteina.
12. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 7-11, naznačen time što:
(a) endogeno antitelo teškog lanca IgG sadrži zglob IgGl, domen CH2 i domen CH3;
(b) miš sadrži funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina, poželjno gde je lokus lakog lanca imunoglobulina k lokus gena lakog lanca ili lokus gena lakog lanca; i / ili
(c) miš je sorte izabrane iz grupe koja se sastoji od sorti 129, soja C57BL / 6 i mešanih sorti 129k C57BL / 6, poželjno gde je miš 50% 129 i 50% C57BL / 6.
13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačen time što dalje obuhvata korake d. proizvodnje hibridoma iz ćelije izolovane u (c) gde ćelija proizvodi antitelo specifično za antigen.
14. Postupak prema zahtevu 13, naznačen time, što dalje sadrži kao korak
f. izolovanje nukleinskih kiselina teškog lanca varijabilnog regiona iz hibridoma proizvedenog u (d)
15. Hibridoma formirana prema postupku iz patentnog zahteva 13, pri čemu hibridom sadrži endogeni konstantni region teškog lanca imu-noglobulina koji sadrži gen za konstantnu regiju IgG koji nema sekvencu koja kodira CH1 region zbog genetske modifikacije klica koja sadrži deleciju nukleotidne sekvence koja kodira CH1 domen.
16. Hibridom prema patentnom zahtevu 15, naznačen time što u endogenom konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina dalje sadrži prekidač -region - miša.
RS20190538A 2009-12-10 2010-12-10 Miševi koji čine antitela teškog lanca RS58709B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28525009P 2009-12-10 2009-12-10
EP15177538.4A EP2954779B1 (en) 2009-12-10 2010-12-10 Mice that make heavy chain antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58709B1 true RS58709B1 (sr) 2019-06-28

Family

ID=43534479

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190538A RS58709B1 (sr) 2009-12-10 2010-12-10 Miševi koji čine antitela teškog lanca

Country Status (24)

Country Link
US (9) US8754287B2 (sr)
EP (3) EP3504964A1 (sr)
JP (5) JP5909449B2 (sr)
KR (2) KR101430514B1 (sr)
CN (3) CN102711449B (sr)
AU (1) AU2010328046C1 (sr)
CA (1) CA2782936C (sr)
CY (2) CY1118163T1 (sr)
DK (2) DK2954779T3 (sr)
ES (2) ES2595376T3 (sr)
HR (1) HRP20190820T1 (sr)
HU (2) HUE043556T2 (sr)
IL (4) IL220150A0 (sr)
LT (2) LT2954779T (sr)
MY (2) MY172472A (sr)
PL (2) PL2509409T3 (sr)
PT (2) PT2509409T (sr)
RS (1) RS58709B1 (sr)
RU (1) RU2603102C2 (sr)
SG (2) SG181477A1 (sr)
SI (2) SI2954779T1 (sr)
SM (1) SMT201900251T1 (sr)
TR (1) TR201906488T4 (sr)
WO (1) WO2011072204A1 (sr)

Families Citing this family (156)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2398882C2 (ru) 2004-07-22 2010-09-10 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
KR101826224B1 (ko) * 2008-09-30 2018-02-06 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
NZ597481A (en) 2009-07-08 2013-10-25 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
SG181477A1 (en) * 2009-12-10 2012-07-30 Regeneron Pharma Mice that make heavy chain antibodies
NZ631363A (en) 2010-02-08 2016-05-27 Regeneron Pharma Common light chain mouse
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
NZ601171A (en) 2010-03-31 2014-11-28 Ablexis Llc Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10881084B2 (en) 2010-07-26 2021-01-05 Trianni, Inc Transgenic animals and methods of use
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
NZ707327A (en) 2010-08-02 2017-01-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
JP2014507137A (ja) 2011-02-25 2014-03-27 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ａｄａｍ６マウス
WO2012122528A1 (en) * 2011-03-10 2012-09-13 Hco Antibody, Inc. Bispecific three-chain antibody-like molecules
LT3572517T (lt) 2011-08-05 2021-04-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizuotos universalios lengvosios grandinės pelės
EP3839049A3 (en) * 2011-09-19 2021-10-20 Kymab Limited Antibodies, variable domains & chains tailored for human use
GB2501753A (en) * 2012-05-04 2013-11-06 Kymab Ltd Human antibodies
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
SI3216871T1 (sl) 2011-10-17 2022-04-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miš z omejeno težko verigo imunoglobulina
US9702869B2 (en) * 2011-11-30 2017-07-11 Defined Diagnostics, Llc Assays, antibodies, immunogens and compositions related to 5-FU
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP3527070B1 (en) 2011-12-20 2025-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized light chain mice
SMT201800229T1 (it) 2012-03-16 2018-07-17 Regeneron Pharma Anticorpi a catena leggera ingegnerizzati con istidina e roditori modificati geneticamente per la generazione degli stessi
HK1200271A1 (en) 2012-03-16 2015-08-07 瑞泽恩制药公司 Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
DK2825037T3 (da) 2012-03-16 2019-07-29 Regeneron Pharma Gnavere, der udtrykker pH-sensitive immunoglobulinsekvenser
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) * 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
JP2015512635A (ja) 2012-03-28 2015-04-30 カイマブ・リミテッド クラススイッチした完全ヒト抗体の発現のためのトランスジェニック非−ヒト脊椎動物
MX379274B (es) 2012-06-12 2025-03-10 Regeneron Pharma Animales no humanos humanizados con loci de cadena pesada de inmunoglobulina restringidos.
US20140245468A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
DK2958937T3 (en) * 2013-02-22 2018-11-26 Regeneron Pharma Mice expressing humanized major histocompatibility complex
WO2014141192A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Erasmus University Medical Center Generation of heavy chain-only antibodies
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
DE112014004537T5 (de) 2013-10-01 2016-07-21 Kymab Limited Tiermodelle und therapeutische Moleküle
EP3068798B1 (en) * 2013-11-12 2020-10-07 OGD2 Pharma Human igg1 derived antibody with pro-apoptotic activity
KR20160131118A (ko) 2014-03-21 2016-11-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상이한 결합 특징을 전시하는 vl 항원 결합 단백질
EP3895528A1 (en) * 2014-03-21 2021-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
SG11201604886WA (en) * 2014-04-08 2016-07-28 Regeneron Pharma Non-human animals having humanized fc-gamma receptors
PT3151921T (pt) 2014-06-06 2019-11-21 Bristol Myers Squibb Co Anticorpos contra recetor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticoide e utilizações dos mesmos
CN104177496B (zh) * 2014-09-02 2015-03-11 安源生物科技(上海)有限公司 人IgG2抗体铰链区修饰体
CA2963470A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof
KR20170073647A (ko) * 2014-10-22 2017-06-28 크레센도 바이오로직스 리미티드 형질전환 마우스
UY36404A (es) 2014-11-21 2016-06-01 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware ANTICUERPOS MONOCLONALES (Ab) COMO DETECTORES DE CD73 E INHIBIDORES DE SU ACTIVIDAD ENZIMÁTICA, Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN
DK3233912T3 (da) 2014-12-19 2021-08-02 Regenesance B V Antistoffer, der binder human c6, og anvendelser deraf
US10189902B2 (en) 2014-12-23 2019-01-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to TIGIT
EP3271403A1 (en) 2015-03-19 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
WO2016196228A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against ox40 and uses thereof
UY36757A (es) 2015-06-29 2016-12-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Anticuerpos monoclonales murinos contra cd40 con actividad agonista mejorada
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
US20170058052A1 (en) * 2015-08-24 2017-03-02 Trianni, Inc. Enhanced production of immunoglobulins
CN105441455B (zh) * 2015-10-21 2020-08-28 重庆金迈博生物科技有限公司 一种嵌合核酸分子及其在人源化抗体制备中的应用
AU2016356780A1 (en) 2015-11-19 2018-06-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) and uses thereof
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
IL260743B2 (en) 2016-02-04 2024-03-01 Trianni Inc Advanced production of antibodies
CA3016187A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy with anti-cd73 antibodies
WO2017151176A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 The Rockefeller University Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
AU2017254674A1 (en) * 2016-04-21 2018-11-01 Abbvie Stemcentrx Llc Novel anti-BMPR1B antibodies and methods of use
MX392069B (es) 2016-05-09 2025-03-21 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos del ligando similar al factor de necrosis tumoral 1a (tl1a) y usos de los mismos.
RU2745563C2 (ru) 2016-05-20 2021-03-29 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы преодоления иммунологической толерантности с использованием множества направляющих рнк
RS66700B1 (sr) * 2016-06-03 2025-05-30 Regeneron Pharma Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu
BR112019000431A2 (pt) 2016-07-14 2019-07-09 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos contra tim3 e usos dos mesmos
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
US10981976B2 (en) 2016-08-31 2021-04-20 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus K envelope (HERV-K) and use thereof
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
EP3525815A2 (en) 2016-10-13 2019-08-21 Massachusetts Institute of Technology Antibodies that bind zika virus envelope protein and uses thereof
WO2018144097A1 (en) 2016-11-04 2018-08-09 Akeagen Llc Genetically modified non-human animals and methods for producing heavy chain-only antibodies
EA201991720A1 (ru) 2017-02-17 2020-01-20 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела к альфа-синуклеину и их применения
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
WO2019000223A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2019006043A1 (en) 2017-06-27 2019-01-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. RECOMBINANT VIRAL VECTORS WITH MODIFIED TROPISM AND USES THEREOF FOR TARGETED INTRODUCTION OF GENETIC MATERIAL INTO HUMAN CELLS
CN110997699A (zh) 2017-06-27 2020-04-10 瑞泽恩制药公司 向性修饰的重组病毒粒子和其用于将遗传物质靶向引入至人类细胞中的用途
JP6677277B2 (ja) 2017-07-19 2020-04-08 株式会社デンソー 車両用制御装置及び電源供給回路
IL271818B2 (en) 2017-07-21 2024-10-01 Trianni Inc Single chain vh and heavy chain antibodies
CN111542543B (zh) 2017-12-28 2023-12-22 南京传奇生物科技有限公司 针对pd-l1的抗体及其变体
SG11202004158QA (en) 2017-12-28 2020-06-29 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
CN111886255B (zh) 2018-01-12 2025-04-04 百时美施贵宝公司 抗tim3抗体及其用途
CA3084518A1 (en) 2018-01-15 2019-07-18 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against pd-1
CA3093407A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against mica and/or micb and uses thereof
SMT202500038T1 (it) 2018-03-24 2025-03-12 Regeneron Pharma Topi o ratti geneticamente modificati per la generazione di anticorpi terapeutici contro complessi peptide-mhc, metodi di produzione e loro utilizzo
WO2019190990A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents for testing therapeutic agents
KR102876940B1 (ko) 2018-03-30 2025-10-24 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Lag-3에 대한 단일-도메인 항체 및 이의 용도
WO2019227490A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and methods for imaging
US11987629B2 (en) 2018-06-01 2024-05-21 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Compositions and uses thereof for treating disease or condition
US12428471B2 (en) * 2018-06-13 2025-09-30 Crystal Bioscience Inc. Transgenic chicken that makes antibodies with long CDR-H3S stabilized by multiple disulfide bridges and diversified by gene conversion
EP3806630A4 (en) * 2018-06-13 2022-02-23 Crystal Bioscience Inc. PRODUCTION OF ANTIBODIES BY MODIFICATION OF AUTONOMOUS HEAVY CHAIN VARIABLE DOMAINS THROUGH GENE CONVERSION
WO2019240999A1 (en) * 2018-06-13 2019-12-19 Crystal Bioscience Inc. Camelization of a human variable domain by gene conversion
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
GB2576914A (en) 2018-09-06 2020-03-11 Kymab Ltd Antigen-binding molecules comprising unpaired variable domains produced in mammals
WO2020052542A1 (en) 2018-09-10 2020-03-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies against cll1 and constructs thereof
AU2019380307B2 (en) 2018-11-16 2026-01-29 Bristol-Myers Squibb Company Anti-NKG2A antibodies and uses thereof
CN118894938A (zh) 2019-01-22 2024-11-05 百时美施贵宝公司 抗IL-7Rα亚基的抗体及其用途
US12263234B2 (en) 2019-01-23 2025-04-01 Tayu Huaxia Biotech Medical Group Co., Ltd. Anti-PD-L1 diabodies and the use thereof
TW202110869A (zh) 2019-05-24 2021-03-16 美商再生元醫藥公司 修飾之病毒顆粒及其用途
EP4069722A1 (en) 2019-12-02 2022-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-mhc ii protein constructs and uses thereof
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
EP4097144A4 (en) * 2020-01-28 2024-02-28 University of Southern California Genome engineering the human immunoglobulin locus to express recombinant binding domain molecules
WO2021170071A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-cd137 constructs, multispecific antibody and uses thereof
BR112022016491A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Shanghai Henlius Biotech Inc Construto anti-cd137 e usos do mesmo
CN111333719B (zh) * 2020-03-16 2021-10-01 西南大学 抗hpv16e7蛋白单抗69a6、杂交瘤细胞及其制备方法和应用
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
US20230235075A1 (en) 2020-06-02 2023-07-27 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-cd93 constructs and uses thereof
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
EP4168433A4 (en) 2020-06-17 2024-07-17 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for the manufacture of pluripotent stem cells
CN116249717A (zh) 2020-06-24 2023-06-09 普罗塞纳生物科学有限公司 识别分拣蛋白的抗体
US20230270086A1 (en) * 2020-07-13 2023-08-31 Kisoji Biotechnology Inc. Transgenic animals expressing heavy chain antibodies
EP4188550A1 (en) 2020-07-29 2023-06-07 Dynamicure Biotechnology LLC Anti-cd93 constructs and uses thereof
KR20230062833A (ko) 2020-08-10 2023-05-09 얀센 바이오테크 인코포레이티드 생물공학적 바이러스 특이적 림프구 생산을 위한 재료 및 방법
CN114134144A (zh) * 2020-09-04 2022-03-04 北京仁源欣生生物科技有限公司 一种非人哺乳动物或其子代的制备方法及其应用
AU2021342159A1 (en) 2020-09-11 2023-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
EP4217389A4 (en) 2020-09-28 2025-03-19 Angitia Incorporated Limited ANTI-SCLEROSTIN CONSTRUCTS AND USES THEREOF
AU2021391054A1 (en) 2020-12-02 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. ANTI-GARP/TGFβ ANTIBODIES AND METHODS OF USE
US20240023526A1 (en) * 2020-12-09 2024-01-25 Trianni, Inc. Heavy chain-only antibodies
CN116848254A (zh) 2020-12-16 2023-10-03 瑞泽恩制药公司 表达人源化Fcα受体的小鼠
MX2023007401A (es) 2020-12-23 2023-07-06 Regeneron Pharma Acidos nucleicos que codifican anticuerpos modificados por anclaje y usos de los mismos.
AU2022224335B2 (en) 2021-02-19 2025-12-18 Shaperon Inc. Bispecific single domain antibody to pd-l1 and cd47 and use thereof
AU2022222423B2 (en) 2021-02-19 2025-12-18 Shaperon Inc. Single domain antibody against pd-l1 and use thereof
EP4296282A4 (en) 2021-02-19 2025-02-26 SHAPERON Inc. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AGAINST CD47 AND USE THEREOF
WO2022187863A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
CN117616041A (zh) 2021-03-25 2024-02-27 当康生物技术有限责任公司 抗-igfbp7构建体及其用途
JP7555296B2 (ja) * 2021-03-31 2024-09-24 太平洋セメント株式会社 二酸化炭素の固定化方法
JP7799706B2 (ja) * 2021-05-05 2026-01-15 レヴェラージェン，インコーポレーテッド 抗体を産生するための組換え非ヒト動物
CN117651486A (zh) * 2021-05-05 2024-03-05 利威瑞健股份有限公司 用于生产抗体的工程改造的非人动物
WO2022266660A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
EP4342908A4 (en) * 2021-06-17 2024-10-23 Fapon Biotech Inc. CHIMERIC IMMUNGLOBULIN
WO2022269473A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Janssen Biotech, Inc. Materials and methods for hinge regions in functional exogenous receptors
CN118201643A (zh) 2021-11-04 2024-06-14 瑞泽恩制药公司 重新靶向到骨骼肌的病毒颗粒
EP4448578A4 (en) 2021-12-17 2026-02-18 Shanghai Henlius Biotech Inc ANTI-OX40 ANTIBODIES, MULTI-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2023109901A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use
KR20250070618A (ko) * 2022-02-24 2025-05-20 에이 앤드 지 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 인간 프로그래뉼린에 대한 완전 인간 모노클로날 항체
JP2025514610A (ja) 2022-03-25 2025-05-09 シャンハイ・ヘンリウス・バイオテック・インコーポレイテッド 抗ｍｓｌｎ抗体及び使用方法
US20250302998A1 (en) 2022-05-09 2025-10-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vectors and methods for in vivo antibody production
EP4558151A1 (en) 2022-07-22 2025-05-28 Janssen Biotech, Inc. Enhanced transfer of genetic instructions to effector immune cells
KR20250058783A (ko) 2022-07-29 2025-04-30 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스페린 수용체 1로 재표적화된 바이러스 입자
CN120077071A (zh) 2022-09-07 2025-05-30 当康生物技术有限责任公司 抗vista构建体及其用途
KR20250075573A (ko) * 2022-09-16 2025-05-28 바이오사이토젠 파마슈티컬스 (베이징) 컴퍼니 리미티드 유전자 변형 비인간 동물 및 중쇄 항체 생산 방법
WO2024102454A1 (en) * 2022-11-09 2024-05-16 Leveragen, Inc. Engineered non-human animals
EP4658687A1 (en) 2023-01-31 2025-12-10 University of Rochester Immune checkpoint blockade therapy for treating staphylococcus aureus infections
KR20260007578A (ko) 2023-05-02 2026-01-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 항-인간 m-카드헤린(cdh15) 항체, 접합체, 및 유전자 페이로드를 근육 세포에 전달하기 위한 이들의 용도
WO2025034806A1 (en) 2023-08-08 2025-02-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Single-domain antibodies and variants thereof against fibroblast activation protein
EP4512243A1 (en) 2023-08-21 2025-02-26 Kymab Limited Binding molecules
WO2025045250A1 (en) 2023-09-03 2025-03-06 Kira Pharmaceuticals (Us) Llc Anti-human factor d antibody constructs and uses thereof
WO2025064738A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dntt 250-258 off-target peptides and uses thereof
WO2025064761A1 (en) 2023-09-22 2025-03-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Kras10-18 g12d off-target peptides and uses thereof
WO2025151796A1 (en) 2024-01-11 2025-07-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Viral particles retargeted to nervous system tissues
WO2025178959A1 (en) 2024-02-20 2025-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Single-domain antibodies and variants thereof against tab1
WO2025184208A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
WO2026006734A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Off-target peptide-mhc complex conformation modeling systems and methods for antigen-recognition molecule development
WO2026006724A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prame off-target peptides and uses thereof
WO2026025058A1 (en) 2024-07-25 2026-01-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aav viral particles retargeted to egfr-expressing cancer cells
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof

Family Cites Families (60)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989007142A1 (en) 1988-02-05 1989-08-10 Morrison Sherie L Domain-modified constant region antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US7041871B1 (en) * 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
GB9020282D0 (en) 1990-09-17 1990-10-31 Gorman Scott D Altered antibodies and their preparation
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DE69233254T2 (de) 1991-06-14 2004-09-16 Genentech, Inc., South San Francisco Humanisierter Heregulin Antikörper
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
AU781922B2 (en) * 1991-12-17 2005-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
US6765087B1 (en) 1992-08-21 2004-07-20 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
DK1621554T4 (da) 1992-08-21 2012-12-17 Univ Bruxelles Immunoglobuliner blottet for lette kæder
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
AU6796094A (en) 1993-04-29 1994-11-21 Raymond Hamers Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of (camelidae)
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
US6080910A (en) 1997-02-20 2000-06-27 Case Western Reserve University Transgenic knockout animals lacking IgG3
US7083950B2 (en) 1998-09-25 2006-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity fusion proteins and therapeutic and diagnostic methods for use
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
RU2262511C2 (ru) * 2000-05-18 2005-10-20 Джапан Тобакко, Инк. Человеческое моноклональное антитело против ailim, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
IL154751A0 (en) 2000-08-03 2003-10-31 Humanized antibodies, recombination vectors, transgenic vectors and methods for the preparation of humanized antibodies from transgenic animals
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7235643B2 (en) 2000-11-07 2007-06-26 Morphotek, Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with high affinity
CN101016543A (zh) * 2000-11-17 2007-08-15 罗切斯特大学 筛选编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的多核苷酸的方法
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
GB0110029D0 (en) 2001-04-24 2001-06-13 Grosveld Frank Transgenic animal
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
ATE477280T1 (de) 2001-06-28 2010-08-15 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US7393648B2 (en) 2001-12-03 2008-07-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Hybrid antibodies
BR0312276A (pt) 2002-06-28 2005-04-26 Centocor Inc Mimeticorpos ch1-removidos miméticos de epo de mamìfero, composições, métodos e usos
AU2003244817B2 (en) 2002-06-28 2010-08-26 Domantis Limited Antigen-binding immunoglobulin single variable domains and dual-specific constructs
GB0228210D0 (en) 2002-12-03 2003-01-08 Babraham Inst Single chain antibodies
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
FR2861255B1 (fr) * 2003-10-24 2006-02-17 Centre Nat Rech Scient Mammifere non-humain transgenique pour la region constante de la chaine lourde des immunoglobulines humaines de classe a et ses applications.
CA2550551C (en) 2004-01-16 2013-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion polypeptides capable of activating receptors
WO2005087177A2 (en) * 2004-03-05 2005-09-22 Ludwig Institute For Cancer Research Chimeric anti-vegf-d antibodies and humanized anti-vegf-d antibodies and methods of using same
RU2398882C2 (ru) 2004-07-22 2010-09-10 Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА Vh ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
PT1802193E (pt) 2004-10-19 2014-06-23 Regeneron Pharma Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética
US7462697B2 (en) 2004-11-08 2008-12-09 Epitomics, Inc. Methods for antibody engineering
JP2008538912A (ja) 2005-04-29 2008-11-13 イナート・ファルマ 遺伝子導入動物および組換え抗体の製造方法
KR20080090406A (ko) * 2005-11-28 2008-10-08 젠맵 에이/에스 재조합 １가 항체 및 그의 제조 방법
SG169348A1 (en) 2006-01-25 2011-03-30 Univ Erasmus Medical Ct Generation of heavy-chain only antibodies in transgenic animals
GB0618345D0 (en) 2006-09-18 2006-10-25 Univ Erasmus Binding molecules
WO2007109370A2 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Viral Logic Systems Technology Corp. Methods for identifying polypeptide targets and uses thereof for treating immunological diseases
SI2041177T1 (sl) 2006-06-02 2012-03-30 Regeneron Pharma Visoko afinitetna protitelesa za humani IL receptor
GB0706628D0 (en) 2007-04-04 2007-05-16 Univ Erasmus Germ-line manipulation 1
SG10201509853UA (en) 2007-06-01 2015-12-30 Omt Inc Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies
WO2008151319A2 (en) 2007-06-08 2008-12-11 Dow Global Technologies Inc. Expression of soluble antibody fragment by truncation of ch1 domain
WO2009013620A2 (en) 2007-06-11 2009-01-29 Erasmus University Medical Center Rotterdam Homologous recombination
BRPI0817079A2 (pt) 2007-09-07 2016-10-11 Symphogen As processos para fabricação recombinante de anticorpos anti-rsv
WO2009114400A1 (en) 2008-03-07 2009-09-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Es cell-derived mice from diploid host embryo injection
US20100122358A1 (en) 2008-06-06 2010-05-13 Crescendo Biologics Limited H-Chain-only antibodies
GB0905023D0 (en) 2009-03-24 2009-05-06 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules
SG181477A1 (en) * 2009-12-10 2012-07-30 Regeneron Pharma Mice that make heavy chain antibodies
JP6023667B2 (ja) * 2013-06-26 2016-11-09 矢崎総業株式会社 コネクタ
JP5602929B1 (ja) * 2013-11-08 2014-10-08 株式会社小松製作所 モータグレーダのリッパー装置およびこれを備えたモータグレーダ

Also Published As

Publication number Publication date
HK1220865A1 (en) 2017-05-19
PT2954779T (pt) 2019-05-29
EP2509409A1 (en) 2012-10-17
CN102711449B (zh) 2015-01-07
PL2954779T3 (pl) 2019-07-31
KR101553244B1 (ko) 2015-09-15
IL257822A (en) 2018-04-30
KR101430514B1 (ko) 2014-08-19
JP6293702B2 (ja) 2018-03-14
IL220150A0 (en) 2012-07-31
KR20140024970A (ko) 2014-03-03
IL237819A (en) 2017-03-30
IL237818A (en) 2016-08-31
WO2011072204A1 (en) 2011-06-16
SI2954779T1 (sl) 2019-06-28
HK1177100A1 (en) 2013-08-16
EP3504964A1 (en) 2019-07-03
CN102711449A (zh) 2012-10-03
JP2015077147A (ja) 2015-04-23
JP2015133991A (ja) 2015-07-27
JP5909449B2 (ja) 2016-04-26
CY1121608T1 (el) 2020-05-29
RU2603102C2 (ru) 2016-11-20
US9888675B2 (en) 2018-02-13
US11234419B2 (en) 2022-02-01
HUE043556T2 (hu) 2019-09-30
HRP20190820T1 (hr) 2019-09-20
KR20130055556A (ko) 2013-05-28
TR201906488T4 (tr) 2019-05-21
RU2012128856A (ru) 2014-01-20
US20110145937A1 (en) 2011-06-16
CA2782936A1 (en) 2011-06-16
HUE030208T2 (en) 2017-04-28
JP2017140058A (ja) 2017-08-17
PT2509409T (pt) 2016-09-29
US20220201993A1 (en) 2022-06-30
CN104131035A (zh) 2014-11-05
US20150196015A1 (en) 2015-07-16
US20140289876A1 (en) 2014-09-25
SI2509409T1 (sl) 2016-12-30
JP2019141095A (ja) 2019-08-29
US20150197557A1 (en) 2015-07-16
IL257822B (en) 2020-01-30
US8754287B2 (en) 2014-06-17
US20150197554A1 (en) 2015-07-16
AU2010328046B2 (en) 2014-07-31
MY173363A (en) 2020-01-21
JP6271450B2 (ja) 2018-01-31
EP2954779B1 (en) 2019-02-06
ES2724975T3 (es) 2019-09-18
JP6615830B2 (ja) 2019-12-04
DK2954779T3 (da) 2019-05-13
AU2010328046C1 (en) 2018-01-18
LT2954779T (lt) 2019-05-27
SMT201900251T1 (it) 2019-07-11
EP2954779A1 (en) 2015-12-16
US12543713B2 (en) 2026-02-10
CA2782936C (en) 2019-06-18
SG181477A1 (en) 2012-07-30
US20150197553A1 (en) 2015-07-16
MY172472A (en) 2019-11-26
US20150197555A1 (en) 2015-07-16
PL2509409T3 (pl) 2017-02-28
SG10201408181PA (en) 2015-01-29
DK2509409T3 (en) 2016-11-14
ES2595376T3 (es) 2016-12-29
LT2509409T (lt) 2016-12-12
CN110079550A (zh) 2019-08-02
US20150197556A1 (en) 2015-07-16
CY1118163T1 (el) 2017-06-28
AU2010328046A1 (en) 2012-07-12
JP2013513388A (ja) 2013-04-22
EP2509409B1 (en) 2016-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7236409B2 (ja) ヒトλ可変領域およびマウス定常領域を含む軽鎖を発現するマウス
RS58709B1 (sr) Miševi koji čine antitela teškog lanca
HK1242732A1 (en) Mice with humanised lambda variable gene segments