[go: up one dir, main page]

RS66700B1 - Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu - Google Patents

Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu

Info

Publication number
RS66700B1
RS66700B1 RS20250364A RSP20250364A RS66700B1 RS 66700 B1 RS66700 B1 RS 66700B1 RS 20250364 A RS20250364 A RS 20250364A RS P20250364 A RSP20250364 A RS P20250364A RS 66700 B1 RS66700 B1 RS 66700B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
aspects
immunoglobulin
human animal
junctions
Prior art date
Application number
RS20250364A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Andrew J Murphy
Chunguang Guo
Natasha Levenkova
Naxin Tu
John Mcwhirter
Vera Voronina
Faith Harris
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS66700B1 publication Critical patent/RS66700B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1264—DNA nucleotidylexotransferase (2.7.7.31), i.e. terminal nucleotidyl transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07031—DNA nucleotidylexotransferase (2.7.7.31), i.e. terminal deoxynucleotidyl transferase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
SRODNA PRIJAVA
[0001] Ova prijava zahteva benefit prioriteta za U.S. privremenu prijavu patenta serijskog broja 62/345,524, koja je podneta 3 juna, 2016.
STANJE TEHNIKE
[0002] Ne-humane životinje, posebno miševi i pacovi, dokazano su vredan izvor terapijskih antitela i potencijalno bi mogli služiti kao izvor drugih molekula koji vezuju antigen. Visok nivo raznolikosti antigenskih receptora kod takvih ne-humanih životinja povećava verovatnoću da će neki molekul koji vezuje antigen i koji ima željena terapijska svojstva biti generisan nakon imunizacije. U skladu sa tim, postoji potreba za genetički promenjenim ne-humanim životinjama koje imaju povećanu raznolikost antigenskih receptora kako bi se poboljšala proizvodnja terapijskih molekula koji vezuju antigen.
SUŠTINA
[0003] Pronalazak obezbeđuje postupak dobijanja antitela specifičnog za antigen pri čemu postupak sadrži izlaganje genetički modifikovanog glodara antigenu, pri čemu genetički modifikovani glodar sadrži u svom genomu: sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu (TdT) u operativnoj vezi sa transkripcionim kontrolnim elementom koji vodi ekspresiju sekvence nukleinske kiseline koja kodira humanu TdT u pre-B ćelijama; i humani varijabilni region imunoglobulina specifičan za antigen koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona imunoglobulina, pri čemu je humani varijabilni region imunoglobulina u operativnoj vezi sa konstantnim regionom imunoglobulina.
Pronalazak takođe obezbeđuje postupak dobijanja nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina koji je specifičan za antigen i/ili humani varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina koji je specifičan za antigen, pri čemu postupak obuhvata: (a) izlaganje genetički modifikovanog glodara antigenu, gde genetički modifikovani glodar u svom genomu sadrži: sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu Terminalnu Deoksinukleotidiltransferazu (TdT) u operativnoj vezi sa transkripcionim kontrolnim elementom koji pokreće ekspresiju sekvence nukleinske kiseline koja kodira humanu TdT u pre-B ćelijama; i humani varijabilni region imunoglobulina koji je specifičan za antigen koji sadrži nerearanžirane humane genske segmente varijabilnog regiona imunoglobulina, gde je humani varijabilni region imunoglobulina operativno vezan na konstantni region; i (b) dobijanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina specifičan za antigen i/ili humani varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina specifičan za antigen iz glodara. U izvesnim aspektima, ovde su opisani genetički modifikovani glodari čiji genom sadrži egzogenu humanu nukleinsku kiselinu koja kodira terminalnu deoksinukleotidiltransferazu (TdT).TdT.. U nekim aspektima, ovde opisani glodari eksprimiraju humanu TdT kodiranu egzogenom nukleinskom kiselinom tokom razvoja B ćelija, na primer, u pro-B ćelijama i/ili u pre-B ćelijama. U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja sadrži više kopija egzogenih nukleinskih kiselina koje kodiraju TdT (npr. najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 kopija).
[0004] U nekim aspektima, genetički modifikovan glodar u svom genomu sadrži humani varijabilni region imunoglobulina specifičan za antigen koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona imunoglobulina (npr. genske segmente teškog lanca, genske segmente κ lanca, genske segmente λ lanca) u operativnoj vezi sa jednim genom konstantnog regiona imunoglobulina (npr., genom konstantnog regiona teškog lanca, genom konstantnog regiona κ lanca, genom konstantnog regiona λ lanca). U nekim aspektima, gen konstantnog regiona je gen humanog konstantnog regiona, gen mišjeg konstantnog regiona ili gen konstantnog regiona pacova. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, gen varijabilnog regiona i gen konstantnog regiona locirani su u endogenom lokusu imunoglobulina (npr., lokusu teškog lanca, κ lokusu, λ lokusu). U nekim aspektima, genetički modifikovan glodar eksprimira antitela koja obuhvataju humani varijabilni domen imunoglobulina izveden iz varijabilnog regiona imunoglobulina i konstantnog domena imunoglobulina kodiranog genom konstantnog regiona imunoglobulina. U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za upotrebu takvog genetički modifikovanog glodara kako bi se dobilo antitelo, B ćelija, hibridom ili nukleinska kiselina koja kodira humani varijabilni region imunoglobulina.
[0005] U izvesnim aspektima, genetički modifikovan glodar u svom genomu sadrži varijabilni region receptora T ćelija (T cell receptor – TCR) koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCR (npr., genske segmente TCRα, genske segmente TCR β, genske segmente TCRγ, genske segmente TCRδ) u operativnoj vezi sa genom konstantnog regiona TCR (npr., genom konstantnog regiona TCRα, genom konstantnog regiona TCR β, genom konstantnog regiona TCRγ, genom konstantnog regiona TCRδ). U nekim aspektima, gen konstantnog regiona je gen humanog konstantnog regiona, gen mišjeg konstantnog regiona ili gen konstantnog regiona pacova. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, gen varijabilnog regiona i gen konstantnog regiona locirani su u endogenom lokusu TCR (npr., lokusu TCRα, lokusu TCR β, lokusu TCRγ, lokusu TCRδ). U nekim aspektima, genetički modifikovan glodar eksprimira TCR koji obuhvata humani varijabilni domen TCR izveden iz varijabilnog regiona TCR i konstantnog domena TCR kodiranih genom konstantnog regiona TCR. U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za upotrebu takve genetički modifikovani glodar za dobijanje TCR, T ćelije, hibridoma T ćelije ili nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen humanog TCR.
[0006] U nekim aspektima, genetički modifikovan glodar u svom genomu sadrži varijabilni region imunoglobulina koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona imunoglobulina (npr., genske segmente teškog lanca, genske segmente κ lanca, genske segmente λ lanca) u operativnoj vezi sa genom konstantnog regiona TCR (npr., genom konstantnog regiona TCRα, genom konstantnog regiona TCR β, genom konstantnog regiona TCRγ, genom konstantnog regiona TCRδ). U nekim aspektima, gen konstantnog regiona je gen humanog konstantnog regiona, gen mišjeg konstantnog regiona ili gen konstantnog regiona pacova. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, gen varijabilnog regiona i gen konstantnog regiona locirani su u endogenom lokusu TCR (npr., lokusu TCRα, lokusu TCRβ, lokusu TCRγ, lokusu TCRδ). U nekim aspektima, genetički modifikovan glodar eksprimira himerni antigenski receptor (CAR) koji obuhvata humani varijabilni domen imunoglobulina izveden iz varijabilnog domena imunoglobulina i konstantnog domena TCR kodiranih genom konstantnog regiona TCR. U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za upotrebu takvog genetički modifikovanog glodara za dobijanje CAR receptora, T ćelija, hibridoma T ćelije ili nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen imunoglobulina.
[0007] U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za pravljenje ovde prikazanog glodara, koji obuhvataju menjanje ne-humane životinje tako da u svojoj germinativnoj liniji sadrži ovde opisane genske modifikacije. U nekim aspektima, ovde su obezbeđene ne-humane ES ćelije koje sadrže ovde opisane genske modifikacije.
SAŽET OPIS SLIKA NACRTA
[0008]
Slika 1 prikazuje dijagram primera vektora za ciljanje (nije u razmeri) u kome je deo mišjeg Rag2 gena zamenjen sekvencom DNK koja kodira kratki izooblik humane TdT (hTdTs). U aspektima primera, vektor je nasumično integrisan u genom. Osim ako označavanje na dijagramu ne sugeriše drugačije (npr., kao za selekcione kasete, mesta loxP, itd.), ispunjeni oblici i pojedinačne linije predstavljaju mišje sekvence, a prazni oblici i dvostruke linije predstavljaju humane sekvence. E1, E2, itd. predstavljaju egzone posebnih ilustrovanih gena, GFP je zeleni fluorescentni protein, CM je gen otporan na hloramfenikol, neo je gen otporan na neomicin. Spojevi 1-4 odgovaraju spojevima naznačenim u Tabeli 1.
Slika 2 prikazuje dijagram primera vektora za ciljanje (nije u razmeri) u kome je deo mišjeg Rag2 gena zamenjen sekvencom DNK koja kodira kratki izooblik humane TdT (hTdTs). U prikazanom aspektu, vektor je upotrebljen za insertovanje hTdT, vođene promoterom mišjeg RAG2, u kapa lokus Ig. Osim ako označavanje na dijagramu ne sugeriše drugačije (npr., kao za selekcione kasete, mesta loxP, itd.), ispunjeni oblici i pojedinačne linije predstavljaju mišje sekvence, a prazni oblici i dvostruke linije predstavljaju humane sekvence. E1, E2, itd. predstavljaju egzone posebnih ilustrovanih gena, GFP je zeleni fluorescentni protein, CM je gen otporan na hloramfenikol, hyg je gen rezistentan na higromicin. Spojevi 1-7 odgovaraju spojevima u Tabeli 2.
Slika 3 prikazuje dijagram primera vektora za ciljanje (nije u razmeri) upotrebljenog za insertovanje sekvence DNK koja kodira humanu TdT (hTdTs), vođene promoterom VH1-72 i pojačivačem Eμ, u κ lokus imunoglobulina. Osim ako označavanje na dijagramu ne sugeriše drugačije (npr. kao za selekcione kasete, mesta loxP, itd.), ispunjeni oblici i pojedinačne linije predstavljaju mišje sekvence, a prazni oblici i dvostruke linije predstavljaju humane sekvence. E1, E2, itd. predstavljaju egzone posebnih ilustrovanih gena, GFP je zeleni fluorescentni protein, CM je gen otporan na hloramfenikol, hyg je gen rezistentan na higromicin. Spojevi 1-4 odgovaraju spojevima u Tabeli 3.
Slika 4 prikazuje ekspresiju hTdT mRNK u limfocitima VELOCIMMUNE miševa sa TdT u poređenju sa ® ®
kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. VELOCIMMUNE miševi su ovde miševi koji sadrže raznovrstan repertoar nerearanžiranih varijabilnih genskih segmenata (V(D)J) humanog teškog lanca i kapa lakog lanca. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša.
Slika 5 prikazuje grafik koji pokazuje raznolikost hIgκ sekvenci (# jedinstvenih CDR3 sekvenci lakog ®
lanca na 10.000 očitavanja sekvenciranja hIgx ) kod VELOCIMMUNE miševa koji eksprimiraju hTdT u
®
poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša.
®
Slika 6 prikazuje grafik koji pokazuje raspodelu nematričnih adicija hIgκ kod VELOCIMMUNE miševa ®
koji eksprimiraju hTdT u poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša. „NT“ predstavlja nukleotide.
Slika 7 ima dve celine. Celina (A) prikazuje grafik koji pokazuje distribuciju dužina CDR3 hIgx kod
® ®
VELOCIMMUNE miševa koji eksprimiraju hTdT u poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. „AA“ predstavlja aminokiselinu. Celina (B) prikazuje grafik koji pokazuje učestalost dužina delecija ®
egzonukleaze na regionu 5’ segmenata JK kod VELOCIMMUNE miševa koji eksprimiraju hTdT u
®
poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša.
® Slika 8 ima dve celine. Celina (A) prikazuje grafik koji pokazuje upotrebu Vκ kod VELOCIMMUNE ®
miševa koji eksprimiraju hTdT u poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Celina (B) ®
prikazuje grafik koji pokazuje upotrebu Jκ kod VELOCIMMUNE miševa koji eksprimiraju hTdT u
®
poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša.
Slika 9 prikazuje grafik koji pokazuje raznolikost mIgλ sekvenci (# jedinstvenih CDR3 sekvenci lakog ®
lanca na 10.000 očitavanja sekvenciranja hIgx) kod VELOCIMMUNE miševa koji eksprimiraju hTdT u
®
poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša.
®
Slika 10 prikazuje grafik koji pokazuje distribuciju nematričnih adicija mIgλ kod VELOCIMMUNE miševa ®
koji eksprimiraju hTdT u poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša. „NT“ predstavlja nikleotide.
®
Slika 11 prikazuje grafik koji pokazuje distribuciju dužina CDR3 mIgλ kod VELOCIMMUNE miševa koji ®
eksprimiraju hTdT u poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša. „AA“ predstavlja aminokiselinu.
®
Slika 12 prikazuje grafik koji pokazuje upotrebu Vλ kod VELOCIMMUNE miševa koji eksprimiraju hTdT
®
u poređenju sa kontrolnim VELOCIMMUNE miševima. Het označava heterozigotnog miša, HO označava homozigotnog miša.
Slika 13 prikazuje grafik koji pokazuje raznolikost hIgκ sekvenci (# jedinstvenih CDR3 sekvenci lakog lanca na 10.000 očitavanja sekvenciranja hIgx) kod miševa sa dvostrukim lakim lancem (dual light chain – DLC; miševi koji sadrže dva nerearanžirana humana Vk genska segmenta i pet nerearanžiranih humanih Jk genskih segmenata, kao i raznovrstan repertoar nerearanžiranih V, D i J genskih segmenata humanog teškog lanca) koji ekprimiraju hTdT (desna celina; geni hTdT prisutni kao što je naznačeno) u ®
poređenju sa VELOCIMMUNE miševima koji eksprimiraju hTdT (leva celina; geni hTdT prisutni kao što
®
je naznačeno) i DLC miševima i kontrolnim VELOCIMMUNE miševima koji ne eksprimiraju hTdT. Het označava heterozigotnog miša za hTdT, HO označava homozigotnog miša za hTdT.
Slika 14 prikazuje grafik koji pokazuje distribuciju nematričnih adicija hIgx kod miševa koji eksprimiraju hTdT u poređenju sa kontrolnim DLC miševima koji ne eksprimiraju hTdT (DLC). Het označava heterozigotnog miša za hTdT, HO označava homozigotnog miša za hTdT. „NT“ predstavlja nukleotide.
Slika 15 prikazuje grafik koji pokazuje distribuciju dužina CDR3 hIgx kod DLC miševa koji eksprimiraju hTdT u poređenju sa kontrolnim DLC miševima koji ne eksprimiraju hTdT. Het označava heterozigotnog miša za hTdT, HO označava homozigotnog miša za hTdT.
Slika 16 prikazuje grafik koji pokazuje upotrebu Vκ i upotrebu Jκ kod DLC miševa koji eksprimiraju hTdT u poređenju sa kontrolnim DLC miševima koji ne eksprimiraju hTdT. Het označava heterozigotnog miša za hTdT, HO označava homozigotnog miša za hTdT. Upotrebljena su samo dva različita Rag TdT tg (HO) DLC miša, koji su opisani odvojeno.
DETALJAN OPIS
Opšti opis
[0009] Ovde su opisani postupci i kompozicije koji se odnose na glodare (npr. miša ili pacova) čiji genom sadrži egzogenu nukleinsku kiselinu koja kodira humanu TdT. U izvesnim aspektima, genom glodara sadrži dalje modifikacije tako da eksprimira molekule koji vezuju antigen koji imaju humane varijabilne domene (npr., anitetela, TCR receptore i/ili CAR receptore).
[0010] TdT je DNK polimeraza koja katalizuje adicije nukleotida koje ne zavise od matrice (N-adicije) tokom obrazovanja spojeva u rekombinaciji V(D)J, što dovodi do povećanja raznolikosti antigenskih receptora kod limfocita B i T. U nekim aspektima, ovde obezbeđene ne-humane životinje eksprimiraju povišene nivoe TdT tokom razvoja B ćelija i/ili razvoja T ćelija u poređenju sa odgovarajućim ne-humanim životinjama (tj., ne-humanim životinjama iz iste vrste i soja) čiji genom ne uključuje egzogene nukleinske kiseline koje kodiraju TdT. U nekim aspektima, ovde obezbeđene ne-humane životinje mogu da eksprimiraju TdT tokom faza razvoja B ćelija i/ili razvoja T ćelija tokom kojih odgovarajuće ne-humane životinje, čiji genom ne uključuje egzogene nukleinske kiseline koje kodiraju TdT, ne eksprimiraju TdT (npr., tokom faze pre-B ćelija). U nekim aspektima, ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje mogu da imaju povećanu raznolikost antigenskih receptora (npr., raznolikost antitela, raznolikost TCR receptora i/ili raznolikost CAR receptora) u poređenju sa odgovarajućim ne-humanim životinjama čiji genom ne uključuje egzogene nukleinske kiseline koje kodiraju TdT.
Definicije
[0011] Neodređeni oblik reči ovde se upotrebljava tako da se odnosi na jedan ili više od jedan (tj. na najmanje jedan). Kao primer, „(jedan/neki) element“ znači jedan element ili više od jednog elementa.
[0012] Termin „aminokiselina“ predviđen je da obuhvata sve molekule, bilo prirodne ili sintetičke, koji uključuju i funkcionalne amino grupe i funkcionalne kiselinske grupe i koji se mogu uključiti u polimer aminokiselina koje se javljaju u prirodi. Primeri aminokiselina uključuju aminokiseline koje se javljaju u prirodi; analoge, njihove derivate i kongenere; analoge aminokiselina koji imaju promenjive bočne lanace; i sve stereoizomere bilo kojih od prethodno navedenih.
[0013] Kako se upotrebljava ovde, termin „antitelo“ može se odnositi i na intaktno antitelo i na njegov fragment koji vezuje antigen. Intaktna antitela su glikoproteini koji uključuju najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac uključuje varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantni region teškog lanca. Svaki laki lanac uključuje varijabilni region lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantni region lakog lanca. Regioni VH i VL mogu se dalje podeliti na regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni za određivanje komplementarnosti (complementarity determining regions – CDR), isprekidane regionima koji su konzerviraniji, koji se nazivaju okvirni regioni (framework regions – FR). Svaki VH i VL sastavljen je od tri CDR regiona i četiri FR regiona, koji su raspoređeni od amino-terminusa do karboksi-terminusa po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže domene za vezivanje koji stupaju u interakciju sa antigenom. Termin „antitelo“ takođe uključuje antitela sa jednim domenom, antitela sa samo teškim lancem, antitela sa varijabilnim genskim segmentima lakog lanca na teškom lancu, itd.
[0014] Termini „fragment koji vezuje antigen“ i „deo koji vezuje antigen“ molekula koji vezuje antigen (npr., antitelo, receptor T ćelija (TCR), himerni antigenski receptor (CAR)), kako se upotrebljavaju ovde, odnosi se na jedan ili više fragmenata molekula koji vezuje antigen koji zadržava sposobnost vezivanja za antigen. Fragment koji vezuje antigen može uključivati bilo koje antitelo, fragment TCR receptora ili CAR receptora koji zadržava najmanje jedan deo varijabilnog regiona intaktnog molekula koji vezuje antigen i ima sposobnost vezivanja za antigen. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćeni terminom „fragmenti koji vezuju antigen“ uključuju, ali nisu ograničeni na njih, Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv, disulfidom povezane Fv, Fd, antitela sa jednim lancem, rastvorljivi TCR, TCR sa jednim lancem, rastvorljivi CAR, CAR sa jednim lancem, izolovani CDRH3 (antitelo ili TCR), i druge fragmente koji vezuju antigen koji zadržavaju najmanje jedan deo varijabilnog regiona intaktnog molekula koji vezuje antigen. Ti fragmenti koji vezuju antigen mogu se dobiti konvencionalnim rekombinantnim i/ili enzimskim postupcima i mogu se testirati na vezivanje antigena na isti način kao intaktna antitela.
[0015] Termin „odgovarajući“, koji se odnosi na ne-humane životinje, upotrebljava se za opisivanje karakteristika kontrolne ne-humane životinje koja pripada istoj vrsti i sadrži iste genske modifikacije kao ne-humani subjekat, osim što ne-humani životinjski subjekat eksprimira egzogenu TdT, dok odgovarajuća ne-humana životinja to ne čini.
[0016] Kako se ovde upotrebljava, „himerni antigenski receptor“ ili „CAR“ odnosi se na protein koji vezuje antigen, što uključuje imunoglobulinski domen koji vezuje antigen (npr., varijabilni imunoglobulinski domen) i konstantni domen receptora T ćelija (TCR) ili jedan njihov deo. Kako se ovde upotrebljava, „konstantni domen“ TCR polipeptida uključuje konstantni domen TCR receptora koji je proksimalan u odnosu na membranu, i takođe može uključivati transmembranski domen TCR receptora i/ili citoplazmatski rep TCR receptora. Na primer, kao što je ovde opisano, CAR može biti dimer koji uključuje prvi polipeptid koji obuhvata jedan varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina povezan sa konstantnim domenom TCRβ i drugi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (npr., varijabilni domen κ ili λ) povezan sa konstantnim domenom TCRα. U nekim aspektima, CAR može biti dimer koji uključuje prvi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina povezan sa konstantnim domenom TCRα i drugi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (npr., varijabilni domen κ ili λ) povezan sa konstantnim domenom TCRβ.
[0017] Izraz „izveden iz“ kada se upotrebljava tako da se odnosi na rearanžirani gen varijabilnog regiona ili varijabilni domen „izveden iz“ nerearanžiranog varijabilnog regiona i/ili nerearanžiranih genskih segmenata varijabilnog regiona odnosi se na sposobnost praćenja sekvence rearanžiranog gena varijabilnog regiona ili varijabilnog domena do seta nerearanžiranih genskih segmenata varijabilnog regiona koji su rearanžirani tako da obrazuju rearanžirani gen varijabilnog regiona koji eksprimira varijabilni domen (uzimajući u obzir, gde je primenljivo, razlike u spajanju (splice) i somatske mutacije). Na primer, rearanžirani gen varijabilnog regiona koji je pretrpeo somatsku mutaciju ne menja činjenicu da je izveden iz nerearanžiranih genskih segmenata varijabilnog regiona.
[0018] Kako se ovde upotrebljava, termin „lokus“ odnosi se na region na hromozomu koji sadrži set povezanih genskih elemenata (npr., gena, genskih segmenata, regulatornih elemenata). Na primer, nerearanžirani lokus imunoglobulina može uključivati genske segmente varijabilnog regiona imunoglobulina, jedan ili više gena konstantnog regiona imunoglobulina i povezane regulatorne elemente (npr., promotere, pojačivače, elemente za prebacivanje, itd.) koji usmeravaju rekombinaciju V(D)J i ekspresiju imunoglobulina, dok nerearanžirani lokus TCR receptora može uključivati genske segmente varijabilnog regiona TCR receptora, gen konstantnog regiona TCR receptora i povezane regulatorne elemente (npr., promotere, pojačivače, itd.) koji usmeravaju rekombinaciju V(D)J i ekspresiju TCR. Slično tome, nerearanžirani lokus CAR receptora može uključivati genske segmente varijabilnog regiona imunoglobulina, gen konstantnog regiona TCR receptora i povezane regulatorne elemente (npr., promotere, pojačivače, itd.) koji usmeravaju rekombinaciju V(D)J i ekspresiju CAR receptora. Lokus može biti endogeni ili neendogeni. Termin „endogeni lokus“ odnosi se na lokaciju na hromozomu na kojoj se prirodno nalazi određeni genski element.
[0019] Nerearanžirani genski segmenti varijabilnog regiona su „u operativnoj vezi“ sa susednim genom konstantog regiona ako su nerearanžirani genski segmenti varijabilnog regiona sposobni za rearanžiranje tako da obrazuju rearanžirani gen varijabilnog regiona koji se eksprimira u konjunkciji sa genom konstantnog regiona kao polipeptidni lanac proteina koji vezuje antigen.
[0020] Termin „polinukleotid“ i „nukleinska kiselina“ upotrebljavaju se kao sinonimi. Odnose se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo dezoksiribonukleotida ili ribonukleotida, ili njihovih analoga. Polinukleotidi mogu imati bilo koju trodimenzionalnu strukturu, i mogu izvoditi bilo koju funkciju. Slede neograničavajući primeri polinukleotida: kodirajući ili nekodirajući regioni gena ili genskog fragmenta, lokusi definisani na osnovu analize povezivanja, egzoni, introni, informaciona RNK (mRNK), transportna RNK, ribozomalna RNK, ribozimi, cDNK, rekombinantni polinukleotidi, razgranati polinukleotidi, plazmidi, vektori, izolovana DNK bilo koje sekvence, izolovana RNK bilo koje sekvence, sonde nukleinske kiseline i prajmeri. Polinukleotid može obuhvatati modifikovane nukleotide, kao što su metilisani nukleotidi i analozi nukleotida. Ako su prisutne, modifikacije se u strukturu nukleotida mogu uneti pre ili nakon sastavljanja polimera. Polinukleotid se može dalje modifikovati, kao na primer konjugacijom sa komponentama za označavanje. U svim ovde obezbeđenim sekvencama nukleinske kiseline, U nukleotidi mogu se smenjivati sa T nukleotidima.
[0021] Kako se upotrebljaju ovde, „specifično vezivanje“ i „antigenska specifičnost“ odnose se na sposobnost molekula koji vezuje antigen (npr., antitelo, TCR, CAR) da vezuje predodređenu metu, kao što je prethodno određen antigen. Tipično, molekul koji vezuje antigen specifično se vezuje za svoju
-7
predodređenu metu sa afinitetom koji odgovara KD od oko 10 M ili manje, i vezuje se za predodređenu metu sa afinitetom koji odgovara KDkoja je najmanje 10 puta manja, najmanje 100 puta manja ili najmanje 1000 puta manja od njene KD za nespecifičnu i nesrodnu metu (npr., BSA, kazein). U nekim izvođenjima, molekul koji vezuje antigen specifično se vezuje za svoju predodređenu metu sa afinitetom koji odgovara -8 -9 -10
KDod oko 10 M ili manje, 10 M ili manje, ili 10 M ili manje.
[0022] Kako se upotrebljava ovde, „receptor T ćelija“ ili „TCR“ odnosi se na protein koji vezuje antigen, što uključuje i domen koji vezuje antigen TCR receptora (npr., varijabilni domen TCR) i najmanje jedan deo konstantnog domena TCR. Kako se upotrebljava ovde, „konstantni domen“ polipeptida TCR uključuje konstantni domen TCR proksimalan u odnosu na membranu, i takođe može uključivati transmembranski domen TCR i/ili citoplazmatski rep TCR. Kako je ovde opisano, TCR može biti rastvorljiv TCR i ne uključuje transmembranski domen TCR ili citoplazmatski rep TCR. Na primer, u nekim aspektima, TCR može biti dimer koji uključuje prvi polipeptid koji obuhvata varijabilni domen TCRβ povezan sa konstantnim domenom TCRβ (ili njegovim fragmentom) i drugi polipeptid koji obuhvata TCRα povezan sa konstantnim domenom TCRα (ili njegovim fragmentom).
[0023] Termin „nerearanžiran“ uključuje stanje imunoglobulina, lokus varijabilnog regiona TCR receptora ili CAR receptora, ili genske segmente varijabilnog regiona, pri čemu se V genski segmenti i J genski segmenti (za varijabilne regione teškog ili TCRβ, kao i D genske segmente) održavaju odvojeno, ali su u stanju da se spoje kako bi obrazovali rearanžirani V(D)J gen („gen varijabilnog regiona“) koji obuhvata pojedinačne V, (D), J iz repertoara V(D)J.
Genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije
[0024] U izvesnim aspektima, ovde su opisane ne-humane životinje i ES ćelije koje mogu sadržati u njihovom genomu egzogenu nukleinsku kiselinu koja kodir TdT (npr., humanu, mišju, ili pacovsku TdT). U izvesnim aspektima, genom glodara i ES ćelije mogu da sadrže dalje modifikacije uključujući, na primer, modifikacije koje kao rezultat imaju ekspresiju molekula koji vezuju antigen koji imaju humane varijabilne domene (npr., antitela, TCR receptore i/ili CAR receptore).
[0025] Ovde opisani genetički modifikovani glodari i ES ćelije mogu se dobiti bilo kojim prikladnim postupkom poznatim u oblasti tehnike. Na primer, ES ćelije glodara koje sadrže ciljane genske modifikacije
®
mogu se dobiti tehnologijom VELOCIGENE , koja je opisana u U.S. Patent Nos. 6,586,251, 6,596,541, 7,105,348, i Valenzuela et al. (2003) "High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis" Nat. Biotech. 21(6): 652-659, i U.S Pat. Pub. No. US 2014/0310828. Ciljane modifikacije mogu se takođe napraviti sistemom CRISPR/Cas, kako je opisano, na primer, u U.S. Pat. No.9,228,208, i U.S. Pub. Nos. US 2015-0159174 A1, US 2016-0060657 A1, US 2015-0376650 A1, US 2015-0376651 A1, US 2016-0046960 A1, US 2015-0376628 A1, i US 2016-0115486 A1. Ciljane modifikacije mogu se takođe napraviti upotrebljavajući meganukleazu, kako je opisano, na primer, u U.S. Pat. No.
8,703,485, 8,530,214 i 8,624,000. Ne-ciljane genske modifikacije mogu se napraviti standardnim postupcima u oblasti tehnike, uključujući, na primer, kako je opisano u U.S. Pat. No.6,150,584, 6,114,598, 5,633,425, 7,501,552, 6,235,883, 6,998,514 i 5,776,773.
[0026] Ovde opisane ES ćelije mogu se tada upotrebljavati za dobijanje glodara postupcima poznatim u oblasti tehnike. Na primer, ovde opisane ES ćelije miša mogu se upotrebljavati za dobijanje genetički
®
modifikovanih miševa postupkom VELOCIMOUSE , kako je opisano u U.S. Pat. No.7,294,754 i Poueymirou et al., Nature Biotech 25:91-99 (2007). ES ćelije pacova mogu se upotrebljavati za dobijanje modifikovanih pacova postupkom opisanim, npr., u U.S. Pat. Pub. No. US 2014/0310828. Dobijeni miševi ili pacovi mogu se uzgajati do homozigotnosti. U jednom genetički modifikovanom organizmu može se kombinovati više različitih modifikacija, bilo uzgajanjem posebno modifikovanih životinja ili uvođenjem dodatnih modifikacija u već modifikovane ES ćelije (npr., ovde opisanim postupcima).
[0027] Za glodare kod kojih pogodne ES ćelije koje se mogu genetički modifikovati nisu lako dostupne, mogu se primeniti drugi postupci kako bi se napravio glodar koji sadrži genske modifikacije opisane ovde. Takvi postupci uključuju, na primer, modifikovanje genoma ne-Es ćelija (npr., fibroplasta ili indukovane pluripotentne ćelije) i primenjivanje prenosa jezgra kako bi se modifikovani genom preneo u pogodnu ćeliju, kao što je oocit, i uvođenje modifikovane ćelije u gestaciju (npr., modifikovanog oocita) u glodaru pod pogodnim uslovima kako bi se formirao embrion.
[0028] U izvesnim aspektima, glodar je miš, pacov ili hrčak. U nekim aspektima, glodar se bira iz natporodice Muroidea. U nekim aspektima, glodar je iz porodice koja se bira od Calomyscidae (npr., mišoliki hrčci), Cricetidae (npr., hrčci, pacovi i miševi Novog sveta, voluharice), Muridae (npr., obični miševi i pacovi, skočimiši, bodljikavi miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (npr., miševi penjači, kameni miševi, belorepi pacovi, malgaški pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr., bodljikavi puhovi), i Spalacidae (npr., slepi kučići, bambusovi pacovi, i zokori). U nekim aspektima, glodar se bira od običnog miša ili pacova (porodica Muridae), skočimiša, bodljikavog miša i grivastog pacova. U nekim aspektima, miš je pripadnik porodice Muridae. U nekim aspektima, glodar se bira od miša i pacova. U nekim aspektima, glodar je miš.
[0029] U nekim aspektima, glodar je miš iz soja C57BL. U nekim aspektima, soj C57BL se bira od C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U nekim aspektima, glodar je miš iz soja 129. U nekim aspektima, soj 129 se bira iz grupe koja se sastoji od soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2. U nekim aspektima, genetički modifikovan miš je mešavina soja 129 i soja C57BL. U nekim aspektima, miš je mešavina sojeva 129 i/ili mešavina sojeva C57BL/6. U nekim aspektima, soj 129 mešavine je soj 129S6 (129/SvEvTac). U nekim aspektima, miš je iz soja BALB (npr., BALB/c). U nekim aspektima, miš je mešavina soja BALB i drugog soja (npr., soja C57BL i/ili soja 129). U nekim aspektima, ovde opisani glodari mogu biti miš izveden iz bilo koje kombinacije prethodno navedenih sojeva.
[0030] U nekim aspektima, ovde opisan glodar je pacov. U nekim aspektima, pacov se bira od pacova iz soja Wistar, soja LEA, soja Sprague Dawley, soja Fischer, F344, F6 i Dark Agouti. U nekim aspektima, soj pacova je mešavina dva ili više sojeva izabranih iz grupe koja se sastoji od sojeva Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.
Glodari koji eksprimiraju egzogenu TdT
[0031] U izvesnim aspektima, ovde su opisane genetički modifikovane ES ćelije glodara koje u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu (TdT). Dezoksinukleotidil transferaza (TdT) je DNK polimeraza koja katalizuje adicije nukleotida nezavisne od matrice (NP adicije) tokom obrazovanja spojeva u rekombinaciji V(D)J, što vodi do povećanja raznolikosti receptora antigena kod limfocita B i T. Sve adicije nezavisne od matrice, nematrične adicije i negerminativne adicije odnose se na adicije nukleotida katalizovane pomoću TdT, i ti termini se ovde upotrebljavaju kao sinonimi.
[0032] Sekvenca egzogene TdT u genomu glodara jeste humana. U nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline je genomska sekvenca TdT (tj., koja uključuje egzone i introne). U nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline kodira mRNK/cDNK TdT (tj., egzone jednog ili više izooblika TdT).
[0033] Humana TdT (hTdT) kodirana je genom DNTT, koji je lociran na humanom hromozomu 10. Primer sekvenci genomske DNK humane TdT (hTdT) može se naći na položaju 96304328 do 96338564 pristupnog broja NCBI NC_000010.11. Primer sekvence mRNK izooblikā hTdT obezbeđen je pristupnim brojevima NCBI NM_001017520.1 i NM_004088.3. Sekvence proteina kodirane tim izooblicima obezbeđene su pristupnim brojevima NCBI NP_001017520.1 i NP_004079.3, tim redom. Među izooblicima TdT su kratki izooblik (hTdTS) i dva duga izooblika (hTdTL1 i hTdTL2). Obezbeđena su tri izooblika sekvenci, na primer, u Thai and Kearney, Adv. Immunol.86:113-36 (2005). U izvesnim aspektima, sekvenca egzogene nukleinske kiseline kodira hTdTS. U nekim aspektima, sekvenca egzogene nukleinske kiseline kodira hTdTL1. U nekim aspektima, sekvenca egzogene nukleinske kiseline kodira hTdTL2. U izvesnim aspektima, glodar koji sadrži sekvencu egzogene nukleinske kiseline kodira više izooblika (npr., i hTdTS i hTdTL2). U izvesnim aspektima, glodar sadrži sekvence egzogene nukleinske kiseline koje kodiraju sva tri humana izooblika (npr., i hTdTS i hTdTL2).
[0034] Mišja TdT (mTdT) kodirana je genom Dntt, koji je lociran na mišjem hromozomu 19. Primer genomske sekvence DNK mišje TdT (mTdT) može se naći na položaju 41029275 do 41059525 pristupnog broja NCBI NC_000085.6. Primer sekvence mRNK izooblika mTdT obezbeđen je pristupnim brojevima NCBI NM_001043228.1 i NM_009345.2. Sekvence proteina kodirane tim izooblicima obezbeđene su pristupnim brojevima NCBI NP_001036693.1 i NP_033371.2, tim redom.
[0035] TdT pacova (rTdT) kodirana je genom Dntt, koji je lociran na hromozomu 1 pacova. Primer genomske sekvence DNK TdT pacova (rTdT) može se naći na položaju 260289626 do 260321174 pristupnog broja NCBI NC_005100.4. Primer mRNK sekvence rTdT obezbeđen je pristupnim brojevima NCBI NM_001012461.1. Sekvenca proteina kodirana tom mRNK obezbeđena je pristupnim brojem NCBI NP_001012479.1.
[0036] U nekim aspektima, genom genetički modifikovane ne-humane životinje sadrži više kopija sekvence nukleinske kiseline koja kodra egzogenu TdT. U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja sadrži 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 kopija sekvence nukleinske kiseline koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 kopija sekvence nukleinske kiseline koja kodira egzogenu TdT.
[0037] U nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humanu TdT operativno se povezuje sa jednim ili više transkripcionih kontrolnih elemenata (npr., promoterom i/ili pojačivačem). U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je konstitutivni (tj., sveprisutni) promoter. Primeri konstitutivnih promotera uključuju, ali nisu ograničeni na njih, SV40, promoter CMV, adenovirusni promoter, promoter EF1, β-aktinski promoter, promoter EGR1, promoter eIF4A1, promoter FerH, promoter FerL, promoter GAPDH, promoter GRP78, promoter GRP94, promoter HSP70, promoter β-kina, promoter PGK-1, promoter ROSA i promoter B ubikvitina. U nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline nije u operativnoj vezi sa konstitutivnim promoterom.
[0038] U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element indukuje ekspresiju kodirane TdT tokom razvoja B ćelija. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element indukuje ekspresiju TdT u pro-B ćelijama i/ili pre-B ćelijama. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je transkripcioni kontrolni element (npr., promoter i/ili pojačivač) gena eksprimiranog tokom razvoja B ćelija, u pro-B ćelijama i/ili u pre-B ćelijama. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je transkripcioni kontrolni element RAG1, transkripcioni kontrolni element RAG2, transkripcioni kontrolni element teškog lanca imunoglobulina, transkripcioni kontrolni element κ lakog lanca imunoglobulina i/ili transkripcioni kontrolni element λ lakog lanca imunoglobulina. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je mišji transkripcioni kontrolni element, transkripcioni kontrolni element pacova ili humani transkripcioni kontrolni element. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je endogeni transkripcioni kontrolni element (npr., sekvenca nukleotida koja kodira egzogenu TdT umeće se u genom ne-humane životinje na takav položaj da endogeni transkripcioni kontrolni element barem delimično kontroliše ekspresiju egzogene TdT). U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni elementi mogu uključivati one koji regulišu transkripciju: RAG1, RAG2, λ5, VpreB, CD34, CD45, AA4.1, CD45R, IL-7R, MHC klase II, CD10, CD19, CD38, CD20, CD40, promotera i pojačivača različitih V genskih segmenata lakog i teškog lanca imunoglobulina (videti, npr., spisak različitih V genskih segmenata navedenih na internet stranici Međunarodnog imunogenetičkog ®
informacionog sistema (International Immunogenetics Information System ) – IMGT, imgt.org, npr., mišji promoter VH1-72 i drugi, itd.). Transkripcioni kontrolni elementi mogu uključivati one koji potiču od čoveka, miša, pacova, ili drugih vrsta.
[0039] U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element indukuje ekspresiju kodirane TdT tokom razvoja T ćelija. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element indukuje ekspresiju TdT u duplo negativnim (DN) timocitima CD4/CD8 i/ili duplo pozitivnim (DP) timocitima CD4/CD8. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je transkripcioni kontrolni element (npr., promoter i/ili pojačivač) gena eksprimiranog tokom razvoja T ćelija, u DN timocitima i/ili u DP timocitima. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je transkripcioni kontrolni element RAG1, transkripcioni kontrolni element RAG2, transkripcioni kontrolni element TCRα, transkripcioni kontrolni element TCRβ, transkripcioni kontrolni element TCRγ i/ili transkripcioni kontrolni element TCRδ. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element potiče od endogenih vrsta. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je mišji transkripcioni kontrolni element, transkripcioni kontrolni element pacova ili humani transkripcioni kontrolni element. U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni element je endogeni transkripcioni kontrolni element (npr., sekvenca nukleotida koja kodira egzogenu TdT umeće se u genom ne-humane životinje na takav položaj da endogeni transkripcioni kontrolni element barem delimično kontroliše ekspresiju egzogene TdT). U nekim aspektima, transkripcioni kontrolni elementi mogu uključivati one koji regulišu transkripciju: RAG1, RAG2, Lck, ZAP-70, CD34, CD2, HSA, CD44, CD25, PTα, CD4, CD8, CD69, promotera i pojačivača različitih V genskih segmenata TCRα, TCRβ, TCRδ i TCRγ (videti. npr., spisak različitih V genskih segmenata nevedenih na internet stranici Međunarodnog imunogenetičkog ®
informacionog sistema (International Immunogenetics Information System ) – IMGT, imgt.org, itd.) Transkripcioni kontrolni elementi mogu uključivati one koji potiču od ljudskog bića, miša, pacova ili drugih vrsta.
[0040] U nekim aspektima, nukleinska kiselina koja kodira TdT locirana je u genomu glodara na ili proksimalno (npr. unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 kb) u genomskom lokusu gena koji se eksprimira tokom razvoja B ćelija, u pro-B ćelijama i/ili u pre-B ćelijama. U nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira TdT locirana je u ili proksimalno lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, lokusu λ lakog lanca imunoglobulina, lokusu teškog lanca imunoglobulina, lokusu RAG1 ili lokusu RAG2.
[0041] U nekim aspektima, nukleinska kiselina koja kodira TdT locirana je u genomu glodara u ili proksimalno (npr. unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 kb) genomskom lokusu gena koji se eksprimira tokom razvoja T ćelija, u DN timocitima i/ili u DP timocitima. U nekim aspektima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira TdT locirana je u ili proksimalno lokusu lanca TCRα, lokusu lanca TCRβ, lokusu lanca TCRγ, lokusu lanca TCRδ, lokusu RAG1 ili lokusu RAG2.
[0042] U nekim aspektima, ovde opisan glodar eksprimira povišene nivoe ekspresije TdT tokom jedne ili više faza razvoja T ćelija i/ili B ćelija (npr., u pro-B ćelijama, u pre-B ćelijama, u DN timocitima i/ili u DP timocitima) u poređenju sa odgovarajućom ne-humanom životinjom čiji genom nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, ovde opisani genetički modifikovani glodari eksprimiraju najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450% ili 500% više TdT u jednoj ili više faza razvoja T ćelija i/ili B ćelija nego odgovarajući glodar.
[0043] U svim sledećim apektima, ne-humana životinja je glodar. U nekim aspektima, ovde opisana nehumana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselina koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima niži procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja manji je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 4 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci κ lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima najmanje 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 ili 1700 jedinstvenih CDR3 sekvenci κ lanca imunoglobulina na 10.000 CDR3 sekvenci κ lanca imunoglobulina.
[0044] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajućih nehumanih životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima najmanje 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 ili 300 jedinstvenih CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina na 10.000 CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina.
[0045] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana nehumana životinja ima veći procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci teškog lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0046] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih životinja manji je od procenta D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana nehumana životinja ima veći procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 3 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže najmanje 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod životinje obuhvata nematrične adicije.
[0047] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-J spojeva lanaca TCRα kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže najmanje 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže najmanje 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže najmanje 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže najmanje 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže najmanje 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže najmanje 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže najmanje 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRα koji sadrže najmanje 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva lanaca TCRα kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, nehumana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci TCRα nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0048] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-D spojeva lanca TCRβ kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže najmanje 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže najmanje 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže najmanje 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže najmanje 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže najmanje 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže najmanje 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže najmanje 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanca TCRβ koji sadrže najmanje 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-D spojeva lanca TCRβ kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, nehumana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci TCRβ nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0049] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih životinja manji je od procenta D-J spojeva lanaca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže najmanje 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže najmanje 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-modifikovanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže najmanje 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže najmanje 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže najmanje 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže najmanje 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRβ kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže najmanje 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRβ koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% D-J spojeva lanaca TCRβ kod životinje obuhvata nematrične adicije.
[0050] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRγ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-J spojeva lanaca TCRγ kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRγ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRγ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRγ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva lanaca TCRγ koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva lanaca TCRγ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva lanaca TCRγ kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci TCRγ nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0051] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humaih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-D spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana nehumana životinja ima veći procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-D spojeva lanaca TCRδ kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci TCRδ nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0052] U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima niži procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta D-J spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 2 Nadicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat D-J spojeva lanaca TCRδ koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta D-J spojeva lanaca TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% D-J spojeva lanaca TCRδ kod životinje obuhvata nematrične adicije.
[0053] U nekim aspektima, endogeni lokusi TdT kod ne-humanih organizama su intaktni. U nekim aspektima endogeni lokusi TdT su inaktivirani. Na primer, u nekim aspektima, endogeni lokusi TdT deletirani su u celosti ili delimično tako da ne-humani organizam ne eksprimira endogenu TdT.
Glodari koji eksprimiraju antitela humanog varijabilnog domena i egzogenu TdT
[0054] U izvesnim aspektima, genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije ne-humanih životinja koje sadrže egzogenu TdT, kako je ovde opisano, takođe u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrže imunoglobulinski lokus (egzogeni ili endogeni) koji obuhvata varijabilni region imunoglobulina koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona imunoglobulina i konstantni region imunoglobulina koji obuhvata gen konstantnog regiona imunoglobulina i u kome su nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina u operativnoj vezi sa genom konstantnog regiona imunoglobulina. U nekim aspektima, ne-humane životinje i ne-humane ES ćelije u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrže više takvih imunoglobulinskih lokusa. Na primer, u nekim aspektima, genetički modifikovane he-humane životinje i ne-humane ES ćelije u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrže najmanje jedan imunoglobulinski lokus koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona lakog lanca i najmanje jedan imunoglobulinski lokus koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona lakog lanca (npr., genske segmente κ lanca i/ili genske segmente λ lanca). U nekim aspektima, genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije ne-humanih životinja u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrže najmanje jedan imunoglobulinski lokus koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona teškog lanca, najmanje jedan imunoglobulinski lokus koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona κ lanca i najmanje jedan imunoglobulinski lokus koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona λ lanca. U nekim aspektima, genetički modifikovane ne-humane životinje, npr., genetički modifikovani miševi ili pacovi, u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrže genetički modifikovane imunoglobulinske lokuse (genetički modifikovane rearanžirane ili nerearanžirane imunoglobulinske lokuse) tako da miševi prave humana, humanizovana, delimično humana, reverzna himerna(humani varijabilni i ne-humani konstantni regioni) antitela.
[0055] Imunoglobulinski lokusi koji obuhvataju genske segmente humanih varijabilnih regiona poznati su u oblasti tehnike i mogu se naći, na primer, u U.S. Pat. Nos.5,633,425, 5,770,429, 5,814,318, 6,075,181, 6,114,598, 6,150,584, 6,998,514, 7,795,494, 7,910,798, 8,232,449, 8,502,018, 8,697,940, 8,703,485, 8,754,287, 8,791,323, 8,907,157, 9,035,128, 9,145,588, i 9,206,263, kao i u U.S. Pat. Pub. Nos.
2008/0098490, 2010/0146647, 2011/0195454, 2012/0167237, 2013/0145484, 2013/0167256, 2013/0219535, 2013/0326647, 2013/0096287, 2014/013275, 2014/093908, i 2015/0113668, i u PCT Pub. Nos. WO2007117410, WO2008151081, WO2009157771, WO2010039900, WO2011004192, WO2011123708 and WO2014093908.
[0056] U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina su genski segmenti teškog lanca i gen konstantnog regiona imunoglobulina je gen konstantnog regiona teškog lanca. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina su laki lanac, npr., κ lanac, genski segmenti, i gen konstantnog regiona imunoglobulina je gen konstantnog regiona teškog lanca.
[0057] U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina su genski segmenti teškog lanca i gen konstantnog regiona imunoglobulina je gen konstantnog regiona κ lanca. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina su genski segmenti κ lanca i gen konstantnog regiona imunoglobulina je gen konstantnog regiona κ lanca. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina su genski segmenti λ lanca i gen konstantnog regiona imunoglobulina je gen konstantnog regiona κ lanca. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina su genski segmenti λ lanca i gen konstantnog regiona imunoglobulina je gen konstantnog regiona λ lanca.
[0058] U izvesnim aspektima, varijabilni region imunoglobulina sadrži nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona teškog lanca Ig. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona Ig obuhvataju više humanih VHsegmenata, jedan ili više humanih DHsegmenata i jedan ili više humanih JHsegmenata. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona Ig obuhvataju najmanje 3 VHgenska segmenta, najmanje 18 VHgenskih segmenata, najmanje 20 VHgenskih segmenata, najmanje 30 VHgenskih segmenata, najmanje 40 VHgenskih segmenata, najmanje 50 VHgenskih segmenata, najmanje 60 VHgenskih segmenata, najmanje 70 VHgenskih segmenata, ili najmanje 80 VHgenskih segmenata. U nekim aspektima, nerearanžirani humani genski segmenti Ig uključuju sve segmente humanog DHgena. U nekim aspektima, nerearanžirani humani genski segmenti Ig uključuju sve segmente humanog JHgena. Primeri varijabilnih regiona koji obuhvataju genske segmente teškog lanca Ig obezbeđeni su, na primer, u Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 i dopunskim informacijama. U nekim aspektima, ovde opisane ne-humane životinje imaju ograničeni lokus teškog lanca imunoglobulina koji karakteriše jedan polimorfni humani VHgenski segment, više DHgenskih segmenata i više JHgenskih segmenata (npr., kao što je opisano u U.S. Pat. Pub. No.
2013/0096287). U nekim aspektima, VHgenski segment je VH1-2 ili VH1-69.
[0059] U različitim aspektima, ovde opisane modifikacije imunoglobulinskog lokusa ne utiču na fertilitet ne-humane životinje. U nekim aspektima, lokus teškog lanca obuhvata endogeni Adam6a gen, Adam6b gen, ili oba, i genska modifikacije ne utiče na ekspresiju i/ili funkciju endogenog Adam6a gena, Adam6b gena, ili oba. U nekim aspektima, genom genetički modifikovane ne-humane životinje sadrži ektopično lociran Adam6a gen, Adam6b gen, ili oba. Primeri ne-humanih životinja koje eksprimiraju endogeni Adam6a i/ili Adam6b opisani su u U.S. Pat. Nos.8,642,835 and 8,697,940.
[0060] U nekim aspektima, genski segmenti humanog varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina rearanžiraju se tokom razvoja B ćelija tako da generišu rearanžirane gene humanog varijabilnog regiona teškog lanca u B ćelijama ne-humanog organizma. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvene CDR3 sekvence teškog lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0061] U izvesnim aspektima, varijabilni region imunoglobulina sadrži nerearanžirane genske segmente κ humanog varijabilnog regiona Ig. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju više humanih Vκ segmenata i jedan ili više humanih Jκ segmenata. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju sve humane Jκ segmente. U nekim aspektima, genski segmenti varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju četiri funkcionalna Vκsegmenta i sve humane Jκsegmente. U nekim aspektima, genski segmenti varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju 16 funckionalnih Vκsegmenata i sve humane Jκsegmente (npr., sve funkcionalne humane Vκ segmente i Jκ segmente). U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju sve humane Vκ segmente i sve humane Jκsegmente. Primeri varijabilnih regiona koji obuhvataju κ genske segmente Ig obezbeđeni su, na primer, u Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 i dopunskim informacijama. U nekim aspektima, ovde obezbeđene ne-humane životinje imaju ograničen lokus lakog lanca imunoglobulina koji karakterišu ne više od dva humana VLgenska segmenta i više JLgenskih segmenata (npr., miševi sa dvostrukim lakim lancem (dual light chain), ili DLC, kao što je opisano u U.S. Pat. Pub. No.2013/0198880). U nekim aspektima, VLgenski segmenti su Vκgenski segmenti. U nekim aspektima VLgenski segmenti su Vλgenski segmenti. U nekim aspektima Vκgenski segmenti su IGKV3-20 i IGKV1-39.
[0062] U nekim aspektima, genski segmenti humanog κ varijabilnog regiona imunoglobulina rearanžiraju se tokom ravoja B ćelija tako da generišu rearanžirane gene humanog κ varijabilnog regiona u B ćelijama ne-humanih organizama. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-J spojeva κ lanca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana nehumana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva κ lanca imunoglobulina kod životinje obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvene CDR3 sekvence κ lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima najmanje 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 ili 1700 jedinstvenih CDR3 sekvenci κ lanca imunoglobulina na 10.000 CDR3 sekvenci κ lanca imunoglobulina.
[0063] U izvesnim aspektima, varijabilni region imunoglobulina sadrži nerearanžirane genske segmente humanog λ varijabilnog regiona Ig. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju više humanih Vλsegmenata i jedan ili više humanih Jλsegmenata. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju sve humane Vλsegmente. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju sve humane Jλ segmente. Primeri varijabilnih regiona koji obuhvataju λ genske segmente Ig obezbeđeni su, na primer, U.S. Pat. Pub. Nos.2012/0073004 i 2002/0088016.
[0064] U nekim aspektima, genski segmenti humanog λ varijabilnog regiona imunoglobulina rearanžiraju se tokom razvoja B ćelija tako da generišu rearanžirane gene humanog λ varijabilnog regiona u B ćelijama ne-humanih organizama. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja manji je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim izvođenjima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod životinje može da obuhvata nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima najmanje 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 ili 300 jedinstvenih CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina na 10.000 CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina.
[0065] U nekim aspektima, varijabilni region imunoglobulina koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona imunoglobulina takođe uključuju intergenske sekvence humanog varijabilnog regiona imunoglobulina. U nekim aspektima, varijabilni region imunoglobulina uključuje intergenske sekvence varijabilnog regiona ne-humanog (npr., glodara, pacova, miša) Ig. U nekim aspektima, intergenska sekvenca potiče od endogene vrste.
[0066] U nekim aspektima, ne-humani organizam u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrži imunoglobulinski lokus koji obuhvata rearanžirani varijabilni region teškog lanca (varijabilni region univerzalnog teškog lanca). U nekim aspektima, rearanžirani gen varijabilnog regiona teškog lanca Ig je rearanžirani gen humanog varijabilnog regiona teškog lanca Ig. Primeri rearanžiranih varijabilnih regiona teškog lanca Ig obezbeđeni su u U.S. Patent Pub. No. 2014/0245468. U nekim aspektima, ne-humani organizam koji sadrži varijabilni region univerzalnog teškog lanca upotrebljava se za proizvođenje bispecifičnih antitela.
[0067] U nekim aspektima, ne-humani organizam u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrži imunoglobulinski lokus koji obuhvata rearanžirani laki varijabilni region (varijabilni region univerzalnog lakog lanca). U nekim aspektima, rearanžirani gen varijabilnog regiona lakog lanca Ig je rearanžirani gen humanog varijabilnog regiona lakog lanca Ig. Primeri rearanžiranih varijabilnih regiona lakog lanca Ig obezbeđeni su u, npr., U.S. Patent Pub. Nos. 2011/0195454, 2012/0021409, 2012/0192300, 2013/0045492, 2013/0185821, 2013/0302836, 2015/0313193, 2015/0059009, i 2013/0198879. U nekim aspektima, ne-humani organizam (organizam sa „univerzalnim lakim lancem“) koji sadrži varijabilni region univerzalnog lakog lanca upotrebljava se za proizvođenje bispecifičnih antitela.
[0068] U nekim aspektima, ne-humani organizam u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrži imunoglobulinski lokus lakog lanca koji obuhvata limitiran repertoar varijabilnih genskih segmenata lakog lanca (npr., varijabilni region dvostrukog lakog lanca koji obuhvata dva varijabilna genska segmenta lakog lanca). U nekim aspektima, varijabilni genski segmenti lakog lanca u limitiranom repertoaru genskih segmenata lakog lanca jesu genski segmenti humanog lakog lanca. Primeri varijabilnih regiona dvostrukog lakog lanca obezbeđeni su u U.S. Patent Pub. No. 2013/0198880. U nekim aspektima, ne-humani organizam koji sadrži varijabilni region dvostrukog lakog lanca upotrebljava se za proizvođenje bispecifičnih antitela.
[0069] U još nekim aspektima, ne-humani organizam može u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadržati lokus lakog lanca i/ili teškog lanca imunoglobulina koji uključuje inserte i/ili zamene histidinskih kodona osmišljenih da unesu pH-zavisna svojstva vezivanja u antitela stvorena u takvom ne-humanom organizmu. U nekom od takvih aspekata, histidinski kodoni se umeću i/ili zamenjuju u sekvenci nukleinske kiseline koja kodira CDR3. Različiti takvi laki i/ili teški imunoglobulinski lokusi obezbeđeni su u U.S. Patent Nos.
9,301,510, 9,334,334, U.S. Patent Application Publication Nos.2013/0247236, 20140013456.
[0070] U nekim aspektima, konstantni region imunoglobulina obuhvata gen konstantnog regiona teškog lanca. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona teškog lanca je gen konstantnog regiona humanog teškog lanca. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona teškog lanca potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona teškog lanca je gen mišjeg konstantnog regiona ili gen konstantnog regiona pacova. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona je mešavina humane i nehumane sekvence. Na primer, u nekim aspektima, gen konstantnog regiona kodira humani region CH1 i ne-humani (npr., koji potiče od endogene vrste, od miša, od pacova) region CH2 i/ili CH3. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona teškog lanca je gen konstantnog regiona Cm, Cδ, Cy (Cγ1, Cy2, Cy3, Cy4), Cα ili Cε. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona je endogeni gen konstantnog regiona. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona kodira mutirani region CH1 tako da ne-humana životinja eksprimira antitela samo teškog lanca (videti., npr., Patent No. 8,754,287, U.S. Patent Application Publication No.
2015/0289489). U nekim aspektima, npr., gde je cilj dobijanje teških lanaca kako bi se napravila bispecifična antitela (npr., kod organizama sa univerzalnim ili dvostrukim lakim lancem), Fc domeni teških lanaca obuhvataju modifikacije kako bi se olakšalo formiranje heterodimera teškog lanca i/ili inhibiralo formiranje homodimera teškog lanca. Takve modifikacije obezbeđene su, na primer, u U.S. Pat. Nos.
5,731,168, 5,807,706, 5,821,333, 7,642,228 i 8,679,785 i u U.S. Pat. Pub. No.2013/0195849.
[0071] U nekim aspektima, konstantni region imunoglobulina obuhvata gen konstantnog regiona lakog lanca. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona lakog lanca je gen κ konstantnog regiona. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona lakog lanca je gen λ konstantnog regiona. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona lakog lanca potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona lakog lanca je gen mišjeg konstantnog regiona ili gen konstantnog regiona pacova. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona lakog lanca mešavina je humane i ne-humane sekvence.
[0072] U nekim aspektima, varijabilni region imunoglobulina koji obuhvata genske segmente humanog varijabilnog regiona i gen konstantnog regiona imunoglobulina sa kojim su genski segmenti varijabilnog regiona u operativnoj vezi locirani su u endogenom lokusu imunoglobulina. U nekim aspektima, endogeni lokus imunoglobulina je endogeni lokus teškog lanca. U nekim aspektima, endogeni lokus imunoglobulina je endogeni κ lokus. U nekim aspektima, endogeni lokus imunoglobulina je endogeni λ lokus. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona sa kojim su genski segmenti humanog varijabilnog regiona u operativnoj vezi jeste endogeni gen konstantnog regiona.
[0073] U nekim aspektima, jedan ili više endogenih lokusa imunoglobulina ili delova jednog ili više endogenih lokusa (npr., varijabilni region i/ili konstantni region) u genomu ovde obezbeđene ne-humane životinje se inaktiviraju. Endogeni genski lokusi varijabilnog regiona imunoglobulina i njihovi delovi mogu se inaktivirati bilo kojim postupkom poznatim u oblasti tehnike, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, deleciju lokusa ili njegovog dela iz genoma organizma, zamenu lokusa ili njegovog dela različitom sekvencom nukleinske kiseline, inverziju dela lokusa i/ili premeštanje dela lokusa na drugi položaj u genomu ne-humanog organizma. U nekim aspektima, inaktivacija lokusa samo je delimična inaktivacija. U nekim aspektima je varijabilni region lokusa inaktiviran, ali konstantni region ostaje funkcionalan (npr., zato što je u operativnoj vezi sa neendogenim genskim segmentima varijabilnog regiona).
[0074] U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja uključuje inaktivirani endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina. U nekim aspektima, endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina ili njegov deo inaktiviraju se delecijom, zamenom, premeštanjem i/ili inverzijom najmanje dela endogenog varijabilnog regiona endogenog lokusa teškog lanca. U nekim aspektima, najmanje deo varijabilnog regiona endogenog lokusa teškog lanca koji se deletira, zamenjuje, premešta i/ili invertuje obuhvata J segmente varijabilnog regiona. U nekim aspektima, endogeni lokus teškog lanca imunoglobulina ili njegov deo inaktiviraju se delecijom, zamenom, premeštanjem i/ili inverzijom najmanje dela endogenog konstantnog regiona endogenog lokusa teškog lanca. U nekim aspektima, najmanje deo konstantnog regiona endogenog lokusa teškog lanca koji se deletira, zamenjuje, premešta i/ili invertuje može da obuhvata Cµ gen endogenog konstantnog regiona.
[0075] U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja uključuje inaktiviran endogeni lokus κ lanca imunoglobulina. U nekim aspektima, endgoeni lokus κ lanca imunoglobulina ili njegov deo inaktiviraju se delecijom, zamenom, premeštanjem i/ili inverzijom najmanje dela endogenog varijabilnog regiona endogenog lokusa κ lanca. U nekim aspektima, najmanje deo varijabilnog regiona endogenog lokusa κ lanca koji se deletira, zamenjuje, premešta i/ili invertuje obuhvata J segmente varijabilnog regiona. U nekim aspektima, endogeni lokus κ lanca imunoglobulina ili njegov deo inaktiviraju se delecijom, zamenom, premeštanjem i/ili inverzijom najmanje dela endogenog konstantnog regiona endogenog lokusa κ lanca. U nekim aspektima, najmanje deo konstantnog regiona endogenog lokusa κ lanca koji se deletira, zamenjuje, premešta i/ili invertuje obuhvata Cκ gen endogenog konstantnog regiona.
[0076] U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja uključuje inaktivirani endogeni lokus λ lanca imunoglobulina. U nekim aspektima, endogeni lokus λ lanca imunoglobulina ili njegov deo inaktiviraju se delecijom, zamenom, premeštanjem i/ili inverzijom najmanje dela endogenog varijabilnog regiona endogenog lokusa λ lanca. U nekim aspektima, najmanje deo najmanje jednog klastera gena V-J-C u endogenom lokusa λ lanca deletira se, zamenjuje, premešta i/ili invertuje. U nekim aspektima, endogeni imunoglobulinski lokus λ lanca ili njegov deo inaktivira se delecijom, zamenom, premeštanjem i/ili inverzijom najmanje dela endogenog konstantnog regiona endogenog lokusa λ lanca. U nekim aspektima, najmanje deo konstantnog regiona endogenog lokusa λ lanca koji se deletira, zamenjuje, premešta i/ili invertuje obuhvata gen Cλ endogenog konstantnog regiona.
[0077] U nekim aspektima, ovde obezbeđena genetički modifikovana ne-humana životinja eksprimira antitela koja imaju humane varijabilne domene (npr., humani varijabilni domen izveden iz ovde opisanih nerearanžiranih genskih segmenata humanog varijabilnog regiona). U nekim aspektima, humani varijabilni domen je humani varijabilni domen teškog lanca. U nekim aspektima, antitela su antitela samo teškog lanca. U nekim aspektima, humani varijabilni domen je humani varijabilni domen lakog lanca. U nekim aspektima, antitela proizvedena od strane ne-humanih životinja imaju i humane varijabilne domene teškog lanca i humane varijabilne domene lakog lanca. U nekim aspektima, antitela imaju humane konstantne domene teškog lanca. U nekim aspektima, antitela imaju humane konstantne domene lakog lanca. U nekim aspektima, konstantni domen teškog i/ili lakog lanca je ne-humanog porekla. Na primer, u nekim aspektima, konstantni domen teškog lanca potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, konstantni domen teškog lanca potiče od miša ili pacova. U nekim aspektima, konstantni domen lakog lanca potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, konstantni domen lakog lanca potiče od pacova ili miša.
Glodari koji eksprimiraju receptore T ćelija sa humanim varijabilnim domenom i egzogenu TdT
[0078] U izvesnim aspektima, genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije ne-humanih životinja koje sadrže egzogenu TdT kao što je opisano ovde takođe u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu obuhvataju lokus (egzogeni ili endogeni) TCR receptora koji sadrži varijabilni region TCR koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCR i konstantni region TCR koji obuhvata gen konstantnog regiona TCR i u kojem su nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona TCR u operativnoj vezi sa genom konstantnog regiona TCR. U nekim aspektima, različite genetički modifikovane ne-humane životinje, npr., genetički modifikovani miševi, u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrže modifikovane lokuse receptora T ćelija (genetički modifikovane lokuse TCRα, β, γ i/ili δ) tako da miševi eksprimiraju humane, humanizovane, delimično humane, reverzne himerne (sa humanim varijabilnim i ne-humanim konstantnim regionima) receptore T ćelija. U jednom aspektu, primeri nehumanih životinja obezbeđeni su u U.S. Patent No.9,113,616 i International Pub. No. WO 2016/164492.
[0079] U nekim aspektima, gen konstantnog regiona TCR je gen ne-humanog konstantnog regiona TCR. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona TCR je gen konstantnog regiona glodara, kao što je gen konstantnog regiona pacova ili gen konstantnog regiona miša. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona potiče od endogene vrste. U nekim aspektima gen konstantnog regiona TCR je gen humanog konstantnog regiona.
[0080] U nekim aspektima, ne-humane životinje i ne-humane ES ćelije u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu sadrže više takvih lokusa TCR receptora. Na primer, u nekim aspektima, genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije ne-humanih životinja u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu mogu da sadrže najmanje jedan lokus TCR receptora koji obuhvata nerearanžirane genske segmente varijabilnog regiona TCRα i najmanje jedan lokus TCR receptora koji obuhvata nerearanžirane genske segmente varijabilnog regiona TCRβ. U nekim aspektima, genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije nehumanih životinja u svojoj germinativnoj liniji i/ili genomu mogu da sadrže najmanje jedan lokus TCR receptora koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCRγ i najmanje jedan lokus TCR receptora koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCRδ.
[0081] U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona TCR su genski segmenti TCRα i gen konstantnog regiona TCR je gen konstantnog regiona TCRα. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona TCR su genski segmenti lanca TCRβ i gen konstantnog regiona TCR je gen konstantnog regiona TCRβ. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona TCR su genski segmenti lanca TCRγ i gen konstantnog regiona TCR je gen konstantnog regiona TCRγ. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona TCR su genski segmenti lanca TCRδ i gen konstantnog regiona TCR je gen konstantnog regiona TCRδ. Primer varijabilnih regiona koji obuhvataju humane genske segmente TCR obezbeđeni su, na primer, u U.S. Patent No.9,113,616 i Li et al., Nature Medicine 16:1029-1035 (2010).
[0082] U nekim aspektima, varijabilni region TCR sadrži nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCRβ. U nekim aspektima, genski segmenti humanog varijabilnog regiona TCRβ rearanžiraju se tokom razvoja T ćelija tako da generišu rearanžirane gene humanog varijabilnog regiona TCRβ u T ćelijama ne-humanog organizma. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D spojeva TCRβ koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde obezbeđenih genetički modifikovanih životinja manji je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat VD i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRβ koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRβ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-D i/ili D-J spojeva TCRβ kod životinje sadrži nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci TCRβ nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0083] U nekim aspektima, varijabilni region TCR sadrži nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCRα. U nekim aspektima, humani genski segmenti varijabilnog regiona TCRα rearanžiraju se tokom razvoja T ćelija tako da generišu rearanžirane gene humanog varijabilnog regiona TCRα u T ćelijama ne-humanog organizma. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D spojeva TCRα koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva TCRα koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-J spojeva TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva TCRα koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva TCRα kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva TCRα kod životinje sadrži nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci TCRα nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0084] U nekim aspektima, varijabilni region TCR može da sadrži nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCRδ. U nekim aspektima, genski segmenti humanog varijabilnog domena TCRδ rearanžiraju se tokom razvoja T ćelija tako da generišu rearanžirane gene humanog varijabilnog regiona TCRδ u T ćelijama ne-humanog organizma. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRδ kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D spojeva TCRδ koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana nehumana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRδ kod odgovarajuće nehumane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva TCRδ koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva TCRδ kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-D i/ili D-J spojeva TCRδ kod životinje sadrži nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci TCRδ nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0085] U nekim aspektima, varijabilni region TCR obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCRγ. U nekim aspektima, genski segmenti humanog varijabilnog regiona TCRγ se rearanžiraju tokom razvoja T ćelija da se dobiju rearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona TCRγ u T ćelijama ne-humanog organizma. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja je veći od procenta V-J TCRγ spojeva u odgovarajućoj ne-humanoj životinji za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D TCRγ spojeva koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja nema nukleinsku kiselinu koja u svom genomu kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J TCRγ spojeva koji ne sadrže nematrične adicije u ovde opisanim genetički modifikovanim ne-humanim životinjama je manji od procenta V-J TCRγ spojeva u odgovarajućoj ne-humanoj životinji za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim izvođenjima, ovde opisana nehumana životinja ima veći procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže najmanje 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja nema u svom genomu nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže najmanje 1 N-adiciju u ovde opisanim genetički modifikovanim ne-humanim životinjama je veći od procenta V-J TCRγ spojeva u odgovarajućoj ne-humanoj životinji za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže najmanje 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu ne sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže najmanje 2 N-adicije u ovde opisanim genetički modifikovanim ne-humanim životinjama je veći od procenta V-J TCRγ spojeva u odgovarajućoj ne-humanoj životinji za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže najmanje 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu ne sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže najmanje 3 N-adicije u ovde opisanim genetički modifikovanim ne-humanim životinjama je veći od procenta V-J TCRγ spojeva u odgovarajućoj ne-humanoj životinji za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže najmanje 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja nema nukleinsku kiselinu koja u svom genomu kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J TCRγ spojeva koji sadrže najmanje 4 N-adicije u ovde opisanim genetički modifikovanim ne-humanim životinjama je veći od procenta V-J TCRγ spojeva u odgovarajućoj ne-humanoj životinji za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% od V-J TCRγ spojeva u životinji sadrži nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih TCRγ CDR3 sekvenci nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0086] U nekim aspektima, varijabilni region TCR koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona TCR takođe uključuje intergenske sekvence humanog varijabilnog regiona TCR. U nekim aspektima, varijabilni region TCR uključuje intergenske sekvence varijabilnog regiona ne-humanog (npr., glodara, pacova, miša) TCR. U nekim aspektima, intergenske sekvence potiču od endogene vrste.
[0087] U nekim aspektima, varijabilni region TCR koji obuhvata genske segmente humanog varijabilnog regiona i gen konstantnog regiona TCR sa kojim su genski segmenti varijabilnog regiona u operativnoj vezi locirani su u endogenom lokusu TCR. U nekim aspektima, endogeni lokus TCR je endogeni lokus TCRα. U nekim aspektima, endogeni lokus TCR je endogeni lokus TCRβ. U nekim aspektima, endogeni lokus TCR je endogeni lokus TCRy. U nekim aspektima, endogeni lokus TCR je endogeni lokus TCRδ. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona sa kojim su genski segmenti humanog varijabilnog regiona u operativnoj vezi jeste gen endogenog konstantnog regiona, npr., odgovarajućeg endogenog konstantnog regiona.
[0088] U nekim aspektima, jedan ili više endogenih lokusa TCR ili deo jednog ili više endogenih lokusa (npr., varijabilni region i/ili konstantni region) u genomu ovde opisane ne-humane životinje se inaktivira. Endogeni genski lokusi varijabilnog regiona TCR i njihovi delovi mogu se inaktivirati bilo kojim postupkom poznatim u oblasti tehnike, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, deleciju lokusa ili njegovog dela iz genoma organizma, zamenu lokusa ili njegovog dela različitom sekvencom nukleinske kiseline, inverziju dela lokusa i/ili premeštanje dela lokusa na drugi položaj u genomu ne-humanog organizma. U nekim aspektima, inaktivacija lokusa samo je delimična inaktivacija. U nekim aspektima, varijabilni region lokusa se inaktivira, ali konstantni region ostaje funkcionalan (npr., zato što je u operativnoj vezi sa genskim segmentima ne-endogenog varijabilnog regiona). Primeri inaktiviranih lokusa TCR opisani su, na primer, u Mombaerts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3084-3087 (1991) i Mombaerts et al., Nature 390:225-231 (1992).
[0089] U nekim aspektima, ovde opisana genetički modifikovana ne-humana životinja eksprimira TCR koji ima varijabilne domene (npr., humani varijabilni domen izveden iz ovde opisanih nerearanžiranih genskih segmenata humanog varijabilnog domena). U nekim aspektima, humani varijabilni domen je humani varijabilni domen TCRα. U nekim aspektima, humani varijabilni domen može biti humani varijabilni domen TCRβ. U nekim aspektima, humani varijabilni domen je humani varijabilni domen TCRγ. U nekim aspektima, humani varijabilni domen je humani varijabilni domen TCRδ. U nekim aspektima, TCR proizveden od strane ne-humane životinje ima i humane varijabilne domene TCRα i humane varijabilne domene TCRβ. U nekim aspektima, TCR proizveden od strane ne-humane životinje može da ima i humane varijabilne domene TCRγ i humane varijabilne domene TCRδ. U nekim aspektima, TCR proizveden od strane ne-humane životinje ima i humane varijabilne domene TCRα i humane varijabilne domene TCRβ, i humane varijabilne domene TCRγ i humane varijabilne domene TCRδ. U nekim aspektima, TCR ima humane konstantne domene. U nekim aspektima, konstantni domeni su ne-humanog porekla. Na primer, u nekim aspektima, konstantni domeni potiču od endogene vrste. U nekim aspektima, konstantni domeni potiču od miša ili pacova.
Glodari koji eksprimiraju himerne antigenske receptore (CAR receptore) i egzogenu TdT
[0090] U izvesnim aspektima, ovde su opisane genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije nehumanih životinja koje sadrže egzogenu TdT, kao što je ovde opisano, koje takođe sadrže lokuse himernog antigenskog receptora (CAR). Takvi lokusi CAR generalno obuhvataju varijabilni region i konstantni region. Varijabilni region uključuje nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona Ig, dok lokus konstantnog regiona uključuje gen konstantnog regiona TCR, pri čemu su genski segmenti varijabilnog regiona Ig u operativnoj vezi sa genom konstantnog regiona. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona TCR je gen ne-humanog konstantnog regiona TCR. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona TCR je gen konstantnog regiona glodara, kao što je gen konstantnog regiona pacova ili gen konstantnog regiona miša. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, gen konstantnog regiona TCR je gen humanog konstantnog regiona.
[0091] U nekim aspektima, ovde opisani lokusi CAR receptora locirani su u endogenim lokusima TCR. Na primer, u nekim aspektima, lokus CAR receptora koji obuhvata gen konstantnog regiona TCRα lociran je u lokusu endogenog konstantnog regiona TCRα. U nekim aspektima, takav lokus se kreira zamenjivanjem dela ili celog nerearanžiranog varijabilnog regiona TCRα nerearanžiranim varijabilnim regionom Ig. U nekim aspektima, lokus CAR receptora koji obuhvata gen konstantnog regiona TCRβ lociran je u lokusu endogenog konstantnog regiona TCRβ. U nekim aspektima, takav lokus se kreira zamenjivanjem dela ili celog nerearanžiranog varijabilnog regiona TCRβ nerearanžiranim varijabilnim regionom Ig.
[0092] U izvesnim aspektima, lokus varijabilnog regiona CAR sadržaće nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona Ig. Primeri lokusa varijabilnog regiona koji sadrže genske segmente humanog varijabilnog regiona opisani su u tehnici. Na primer, takvi lokusi opisani su U.S. Pat. Nos.
5,633,425, 5,770,429, 5,814,318, 6,075,181, 6,114,598, 6,150,584, 6,998,514, 7,795,494, 7,910,798, 8,232,449, 8,502,018, 8,697,940, 8,703,485, 8,754,287, 8,791,323, 8,907,157, 9,035,128, 9,145,588, i 9,206,263, kao i u U.S. Pat. Pub. Nos. 2008/0098490, 2010/0146647, 2011/0195454, 2012/0167237, 2013/0145484, 2013/0167256, 2013/0219535, 2013/0326647, 2014/013275, 2014/093908, 2015/0113668 i 2016/0081314, i u PCT Pub. Nos. WO2007117410, WO2008151081, WO2009157771, WO2010039900, WO2011004192, WO2011123708, WO2014093908 i WO2016/044745.
[0093] U izvesnim aspektima, lokus varijabilnog regiona CAR sadrži nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona teškog lanca Ig. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona Ig obuhvataju više humanih VHsegmenata, jedan ili više humanih DHsegmenata i jedan ili više humanih JHsegmenata. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona Ig obuhvataju najmanje 3 VHgenska segmenta, najmanje 18 VHgenskih segmenata, najmanje 20 VHgenskih segmenata, najmanje 30 VHgenskih segmenata, najmanje 40 VHgenskih segmenata, najmanje 50 VHgenskih segmenata, najmanje 60 VHgenskih segmenata, najmanje 70 VHgenskih segmenata, ili najmanje 80 VHgenskih segmenata. U nekim aspektima, nerearanžirani humani genski segmenti Ig uključuju sve humane DHgenske segmente. U nekim aspektima, varijabilni region CAR dalje obuhvata genske segmente varijabilnog regiona TCRβ (npr., V, D i/ili J genske segmente). U jednom aspektu, varijabilni region CAR dalje obuhvata distalne Vβ genske segmente TCR, npr., Vβ31 genski segment. U drugom aspektu, distalni Vβ genski segmenti TCR, npr., Vβ31 genski segment TCR, funkcionalno su inaktivirani ili deletirani. U nekim aspektima, nerearanžirani humani genski segmenti Ig uključuju sve humane JHgenske segmente. Primeri varijabilnih regiona koji sadrže genske segmente teškog lanca Ig obezbeđeni su, na primer, u Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111:5147-52 i dopunskim informacijama.
[0094] U nekim aspektima, genski segmenti humanog varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina rearanžiraju se tokom razvoja T ćelija tako da se generišu rearanžirani geni humanog varijabilnog regiona teškog lanca u T ćelijama ne-humanog organizma. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-D spojeva teških lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja manji je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde obezbeđena ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim izvođenjima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-D i/ili D-J spojeva teških lanaca imunoglobulina kod životinje mogu da sadrže nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci teškog lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%.
[0095] U nekim aspektima, varijabilni genski lokus CAR receptora koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona teškog lanca Ig takođe može da uključi intergenske sekvence humanog varijabilnog regiona teškog lanca Ig. U nekim aspektima, varijabilni genski lokus CAR receptora uključuje intergenske sekvence ne-humanog (npr., glodara, pacova, miša) varijabilnog regiona teškog lanca Ig. U nekim aspektima, varijabilni genski lokus CAR receptora uključuje intergenske sekvence humanog ili ne-humanog (npr., glodara, pacova, miša) varijabilnog regiona TCRβ. Na primer, u nekim aspektima, nerearanžirani varijabilni region lokusa CAR receptora obuhvata jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20) gena tripsinogena (TRY) (npr., geni i/ili pseudogeni TRY normalno prisutni u lokusu varijabilnog regiona TCRβ). U nekim aspektima, geni TRY su ne-humani, npr., geni TRY miša. U nekim aspektima, geni TRY miša biraju se iz grupe koja se sastoji od Try1, Try2, Try3, Try4, Try5, Try6, Try7, Try8, Try9, Try 10, Try11, Try12, Try 13, Try 14, Try15, Try16, Try17, Try18, Try19 i Try20. U nekim aspektima, jedan ili više gena TRY locirani su ushodno od VHsegmenata nerearanžiranog varijabilnog regiona. U nekim aspektima, jedan ili više gena TRY locirani su nishodno od VHsegmenata i ushodno od DH segmenata nerearanžiranog varijabilnog regiona. U nekim aspektima, Try 1-7 locirani su ushodno od VHsegmenata nerearanžiranog varijabilnog regiona i Try 8-20 locirani su nishodno od VHsegmenata i ushodno od DHsegmenata nerearanžiranog varijabilnog regiona. Dodatne informacije koje se tiču gena TRY lociranih u humanom i/ili mišjem lokusu TCRβ obezbeđene su u Glusman et al., Immunity 15:337-349 (2001) i Skok et al., Nature Immunology 8:378-387 (2007). U nekim aspektima, genski lokus CAR receptora obuhvata nehumane regulatorne elemente (npr., ne-humane promotere i/ili pojačivače). U nekim aspektima, nehumani regulatorni elementi su regulatorni elementi glodara (npr., promoteri ili pojačivači pacova ili miša). U nekim aspektima, lokus CAR receptora obuhvata pojačivač IgM (E μ). U nekim aspektima, pojačivač IgM je ne-humani Eμ (npr., Eμ glodara, kao što je Eμ miša ili pacova).
[0096] U izvesnim aspektima, lokus varijabilnog regiona CAR receptora sadrži nerearanžirane genske segmente humanog κ varijabilnog regiona Ig. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju više humanih Yκsegmenata i jedan ili više humanih Jκsegmenata. U nekim aspektima, genski segmenti varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju četiri funkcionalna Vκsegmenta i sve humane Jκsegmente. U nekim aspektima, genski segmenti varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju 16 funkcionalnih Vκsegmenata i sve humane Jκsegmente. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju sve humane Vκsegmente i sve humane Jκsegmente (npr., sve funkcionalne humane Vκsegmente i Jκsegmente). Primeri varijabilnih regiona koji obuhvataju κ genske segmente Ig obezbeđeni su, na primer, u Macdonald et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 111: 5147-52 i dopunskim informacijama. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju sve humane Jκ segmente. U nekim aspektima, varijabilni region CAR receptora dalje obuhvata genske segmente varijabilnog regiona TCRα (npr., V i/ili J genske segmente).
[0097] U nekim aspektima, genski segmenti humanog κ varijabilnog regiona imunoglobulina rearanžiraju se tokom razvoja T ćelija tako da generišu rearanžirane gene humanog κ varijabilnog regiona u T ćelijama ne-humanog organizma. U nekim aspektima, ovde obezbeđena ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde obezbeđenih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde obezbeđena ne-humana životinja ima manji procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde obezbeđenih genetički modifikovanih životinja manji je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde obezbeđena ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde obezbeđenih genetički modifikovanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde obezbeđena ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije kod ovde obezbeđenih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde obezbeđena ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije kod ovde obezbeđenih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde obezbeđena ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije kod ovde obezbeđenih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva κ lanaca imunoglobulina kod životinje sadrži nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci κ lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U nekim aspektima, ovde obezbeđena ne-humana životinja ima najmanje 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 ili 1700 jedinstvenih CDR3 sekvenci κ lanca imunoglobulina na 10.000 CDR3 sekvenci κ lanca imunoglobulina.
[0098] U izvesnim aspektima, lokus varijabilnog regiona CAR receptora sadrži nerearanžirane genske segmente humanog λ varijabilnog regiona Ig. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju više humanih Vλsegmenata i jedan ili više humanih Jλsegmenata. U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju sve humane Vλsegmente (npr., sve funkcionalne humane Vλsegmente). U nekim aspektima, nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina obuhvataju sve humane Jλsegmente. U nekim aspektima, varijabilni region CAR dalje obuhvata genske segmente varijabilnog regiona TCRα (npr., V, i/ili J genske segmente). Primeri varijabilnih regiona koji obuhvataju λ genske segmente Ig obezbeđeni su, na primer, u U.S. Pat. Pub. Nos. 2012/0073004 i 2002/0088016.
[0099] U nekim aspektima, genski segmenti λ humanog varijabilnog regiona imunoglobulina rearanžiraju se tokom razvoja T ćelija tako da generišu rearanžirane gene humanog λ varijabilnog regiona u T ćelijama ne-humanog organizma. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima manji procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji ne sadrže nematrične adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja manji je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 1 N-adiciju kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije nego odgovarajuća nehumana životinja čiji genom nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 2 N-adicije kod ovde obezbeđenih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisane nehumane životinje ima ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 3 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih ne-humanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima veći procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije nego odgovarajuća ne-humana životinja koja u svom genomu nema nukleinsku kiselinu koja kodira egzogenu TdT. U nekim aspektima, procenat V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina koji sadrže 4 N-adicije kod ovde opisanih genetički modifikovanih nehumanih životinja veći je od procenta V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod odgovarajuće ne-humane životinje za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 30% ili 40%. U nekim aspektima, najmanje 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% ili 40% V-J spojeva λ lanaca imunoglobulina kod životinje sadrži nematrične adicije. U nekim aspektima, ne-humana životinja ima veću učestalost jedinstvenih CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina nego odgovarajuća ne-humana životinja za najmanje 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U nekim aspektima, ovde opisana ne-humana životinja ima najmanje 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 ili 300 jedinstvenih CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina na 10.000 CDR3 sekvenci λ lanca imunoglobulina.
[0100] U nekim aspektima, varijabilni genski lokus CAR receptora koji sadrži nerearanžirane genske segmente varijabilnog regiona lakog lanca humanog Ig takođe uključuje intergenske sekvence varijabilnog regiona lakog lanca humanog Ig (npr., intergenske sekvence κ varijabilnog regiona i/ili intergenske sekvence λ varijabilnog regiona). U nekim aspektima, varijabilni genski lokus CAR receptora uključuje intergenske sekvence ne-humanog (npr., glodara, pacova, miša) varijabilnog regiona lakog lanca Ig (npr., intergenske sekvence κ varijabilnog regiona i/ili intergenske sekvence λ varijabilnog regiona). U nekim aspektima, varijabilni genski lokus CAR receptora uključuje intergenske sekvence humanog ili ne-humanog (npr., glodara, pacova, miša) varijabilnog regiona TCRα. U nekim aspektima, genski lokus CAR receptora obuhvata ne-humane regulatorne elemente (npr., ne-humane promotere i/ili pojačivače). U nekim aspektima, ne-humani regulatorni elementi su regulatorni elementi glodara (npr., promoteri ili pojačivači pacova ili miša).
[0101] U nekim aspektima, lokus varijabilnog regiona CAR receptora je rearanžirani lokus varijabilnog regiona koji obuhvata gen varijabilnog regiona teškog lanca Ig (varijabilni region univerzalnog teškog lanca). U nekim aspektima, rearanžirani gen varijabilnog regiona teškog lanca Ig je rearanžirani gen humanog varijabilnog regiona teškog lanca Ig. Upotreba varijabilnih regiona univerzalnog teškog lanca olakšava stvaranje bispecifičnih antitela u kojima najmanje jedan domen za vezivanje antigena ima specifičnost za kompleks peptid/MHC. Primeri rearanžiranih varijabilnih regiona teškog lanca Ig obezbeđeni su u U.S. Patent Pub. No.2014/0245468.
[0102] U nekim aspektima, lokus varijabilnog regiona CAR je lokus rearanžiranog varijabilnog regiona koji obuhvata gen varijabilnog regiona lakog lanca Ig (varijabilni region univerzalnog lakog lanca). U nekim aspektima, rearanžirani gen varijabilnog regiona lakog lanca Ig je rearanžirani gen humanog varijabilnog regiona lakog lanca Ig. Upotreba varijabilnih regiona univerzalnog lakog lanca olakšava stvaranje bispecifičnih antitela u kojima najmanje jedan domen za vezivanje antigena ima specifičnost vezivanja za kompleks peptid/MHC. Primeri rearanžiranih varijabilnih regiona teškog lanca Ig obezbeđeni su u U.S. Patent Pub. No.2013/0185821.
Druge genetičke modifikacije
[0103] U nekim aspektima, ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije koji eksprimiraju egzogenu TdT, humanizovane TCR receptore ili CAR receptore takođe eksprimiraju i/ili sadrže u svom genomu lokuse koji kodiraju humanizovane polipeptide lanca α MHC klase I (npr., humanizovane HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-g, HLA-K i/ili HLA-L). U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca α MHC klase I u potpunosti je humani. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca α MHC klase I obuhvata humani vanćelijski domen (npr., humane domene α1, α2 i α3) i citoplazmatski domen koji potiče od endogene vrste. Humanizovani polipeptid lanca α MHC klase I, lokusi koji kodiraju humanizovane polipeptide lanca α MHC klase I i ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovane polipeptide lanca α MHC klase I opisani su u U.S. Pat. Pub. Nos.2013/0111617, 2013/0185819 i 2014/0245467.
[0104] U nekim aspektima, ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije koji eksprimiraju egzogenu TdT, humanizovane TCR receptore i CAR receptore takođe eksprimiraju i/ili sadrže u svom genomu lokus koji kodira humanizovani polipeptid β-2-mikroglobulina. Humanizovani polipeptidi β-2-mikroglobulina, lokusi koji kodiraju humanizovane polipeptide β-2-mikroglobulina i ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovane polipeptide β-2-mikroglobulina opisani su u U.S. Pat. Pub. Nos.
2013/0111617 i 2013/0185819.
[0105] U nekim aspektima, ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije koji eksprimiraju egzogenu TdT, humanizovane TCR receptore i CAR receptore takođe mogu da eksprimiraju i/ili sadrže u svom genomu lokuse koji kodiraju humanizovane polipeptide lanca α MHC klase II (npr., humanizovane HLA-DMA, HLA-DOA, HLA-DPA, HLA-DQA i/ili HLA-DRA). U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca α MHC klase II u potpunosti je humani. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca α MHC klase II obuhvata humani vanćelijski domen i citoplazmatski domen koji potiče od endogene vrste. Humanizovani polipeptidi lanca α MHC klase II, lokusi koji kodiraju humanizovane polipeptide lanca α MHC klase II i ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovane polipeptide lanca α MHC klase II opisani su u U.S. Patent Nos.8,847,005 i 9,043,996 i U.S. Pat. Pub. No.2014/0245467.
[0106] U nekim aspektima, ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije koji eksprimiraju egzogenu TdT, humanizovane TCR receptore i CAR receptore takođe eksprimiraju i/ili sadrže u svom genomu lokuse koji kodiraju humanizovane polipeptide lanca β MHC klase II (nprl, humanizovane HLA-DMB, HLA-DOB, HLA-DPB, HLA-DQB i/ili HLA-DRB). U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca β MHC klase II u potpunosti je humani. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca β MHC klase II obuhvata humani vanćelijski domen i citoplazmatski domen koji potiče od endogene vrste. Humanizovani polipeptidi lanca β MHC klase II, lokusi koji kodiraju humanizovane polipeptide lanca β MHC klase II i nehumane životinje koje eksprimiraju humanizovane polipeptide lanca β MHC klase II opisani su u U.S. Patent Nos.8,847,005 i 9,043,996 i U.S. Pat. Pub. No.2014/0245467.
[0107] Genetički modifikovane ne-humane životinje koje sadrže egzogenu TdT, humanizovane lokuse TCR i humanizovane lokuse MHC I i/ili MHC II (MHC IIα/IIβ) mogu se dobijati uzgajanjem po konvencionalnim postupcima; alternativno, oni se mogu dobijati homolognom rekombinacijom u ES ćelijama koje već sadrže jedan ili više genetički izmenjenih lokusa (npr., humanizovane lokuse TCR), i dobijati ne-humanu životinju iz navedenih ES ćelija.
[0108] Genetički modifikovane ne-humane životinje koje sadrž egzogenu TdT, humanizovane lokuse TCR i humanizovane lokuse MHC I i/ili MHC II (MHC IIα/IIβ) mogu se dobijati uzgajanjem po konvencionalnim postupcima; alternativno, oni se mogu dobijati homolognom rekombinacijom u ES ćelijama koje već sadrže jedan ili više genetički izmenjenih lokusa (npr., humanizovane lokuse CAR), i dobijati glodara iz navedenih ES ćelija.
[0109] U nekim aspektima, ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije koji eksprimiraju egzogenu TdT, humanizovane TCR receptore i CAR receptore takođe eksprimiraju i/ili mogu da sadrže u svom genomu lokus koji kodira humanizovani polipeptid lanca α CD8. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca α CD8 je u potpunosti humani. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca α CD8 obuhvata humani vanćelijski imunoglobulinski domen i citoplazmatski domen koji potiče od endogene vrste. Humanizovani polipeptidi lanca α CD8, lokusi koji kodiraju humanizovane polipeptide lanca α CD8 i ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovane polipeptide lanca α CD8 opisani su u U.S. Pat. Pub. Nos.2014/0245466.
[0110] U nekim aspektima, ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije koji eksprimiraju egzogenu TdT, humanizovane TCR receptore i CAR receptore takođe eksprimiraju i/ili mogu da sadrže u svom genomu lokus koji kodira humanizovani polipeptid lanca β CD8. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca β CD8 u potpunosti je humani. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid lanca β CD8 obuhvata humani vanćelijski imunoglobulinski domen i citoplazmatski domen koji potiče od endogene vrste. Humanizovani polipeptidi lanca β CD8, lokusi koji kodiraju humanizovane polipeptide lanca β CD8 i ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovane polipeptide lanca β CD8 opisani su u U.S. Pat. Pub. Nos.2014/0245466.
[0111] U nekim aspektima, ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje i ES ćelije koji eksprimiraju egzogenu TdT, humanizovane TCR receptore i CAR receptore takođe eksprimiraju i/ili sadrže u svom genomu lokus koji kodira humanizovani polipeptid CD4. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid CD4 u potpunosti je humani. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid CD4 obuhvata najmanje jedan humani vanćelijski imunoglobulinski domen i citoplazmatski domen koji potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid CD4 obuhvata najmanje jedan humani imunoglobulinski domen D1, humani imunoglobulinski domen D2 i humani imunoglobulinski domen D3, i citoplazmatski domen koji potiče od endogene vrste. U nekim aspektima, humanizovani polipeptid CD4 obuhvata humani imunoglobulinski domen D1, humani imunoglobulinski domen D2, humani imunoglobulinski domen D3, imunoglobulinski domen D4 koji potiču od endogene vrste i citoplazmatski domen koji potiče od endogene vrste. Humanizovani polipeptidi CD4, lokusi koji kodiraju humanizovane polipeptide CD4 i ne-humane životinje koje eksprimiraju humanizovane polipeptide CD4 opisani su u U.S. Pat. Pub. Nos.2014/0245466.
[0112] Genetički modifikovane ne-humane životinje koji sadrže egzogenu TdT, humanizovane lokuse TCR i humanizovane lokuse CD4 i/ili CD8 (CD8α/CD8β) mogu se dobijati uzgajanjem po konvencionalnim postupcima; alternativno, oni se mogu dobijati homolognom rekombinacijom u ES ćelijama koje već sadrže jedan ili više genetički izmenjenih lokusa (npr., humanizovane lokuse TCR), i dobijati ne-humanu životinju iz navedenih ES ćelija.
[0113] Genetički modifikovane ne-humane životinje koji sadrže egzogenu TdT, humanizovane lokuse TCR i humanizovane lokuse CD4 i/ili CD8 (CD8α/CD8β) mogu se dobijati uzgajanjem po konvencionalnim postupcima; alternativno, oni se mogu dobijati homolognom rekombinacijom u ES ćelijama koje već sadrže jedan ili više genetički izmenjenih lokusa (npr., humanizovane lokuse CAR), i dobijati ne-humanu životinju iz navedenih ES ćelija.
Postupci za upotrebu genetički modifikovanih glodara
[0114] U izvesnim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za upotrebu ovde opisanih genetički modifikovanih glodara kako bi se dobili proteini koji vezuju antigen (npr., antitela, CAR receptori, TCR receptori), ćelije koje eksprimiraju takve proteine koji vezuju antigen (npr., B ćelije, T ćelije, hibridomi B ćelija, hibridomi T ćelija) i nukleinske kiseline koje kodiraju takve proteine koji vezuju antigen ili njihove delove (npr., varijabilne domene). U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za pravljenje raznovrsnijih proteina koji vezuju antigen (npr., antitela, CAR receptora, TCR receptora). U nekim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci za pravljenje nerearanžiranih varijabilnih regiona proteina koji vezuju antigen (npr., antitela, CAR receptora, TCR receptora) koji imaju povećan broj adicija nukleotida.
[0115] U izvesnim aspektima, postupak obuhvata izlaganje antigenu ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji imaju humane varijabilne domene tako da genetički modifikovana ne-humana životinja proizvodi antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata humani varijabilni domen specifičan za antigen.
[0116] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje antigenu ovde opisanog genetički modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovan tako da eksprimira egzogenu TdT i antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji imaju humani varijabilni domen; i dobijanje B ćelije iz ne-humane životinje koja eksprimira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata humani varijabilni domen specifičan za antigen.
[0117] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje antigenu ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji imaju humane varijabilne domene; dobijanje B ćelije iz glodara koja eksprimira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata humani varijabilni domen specifičan za antigen; i pravljenje hibridoma iz B ćelije.
[0118] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje antigenu ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji imaju humane varijabilne domene; i dobijanje iz glodara nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen imunoglobulina specifičan za antigen.
[0119] U izvesnom aspektu, postupak obuhvata izglaganje antigenu ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji imaju humane varijabilne domene; dobijanje iz ne-humane životinje B ćelije koja eksprimira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata humani varijabilni domen specifičan za antigen; opciono pravljenje hibridoma iz B ćelije; i dobijanje iz B ćelije ili hibridoma nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen imunoglobulina specifičan za antigen.
[0120] U nekim aspektima, postupak obuhvata izglaganje antigenu ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i antitela ili njihove fragmente koji vezuju antigen koji imaju humane varijabilne domene; dobijanje iz ne-humane životinje B ćelije koja eksprimira antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji obuhvata humani varijabilni domen specifičan za antigen; opciono pravljenje hibridoma iz B ćelije; dobijanje iz B ćelije ili hibridoma nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen imunoglobulina specifičan za antigen; operativno povezivanje nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen imunoglobulina sa nukleinskom kiselinom koja kodira humani konstantni region imunoglobulina u ćeliji domaćinu; i uzgajanje ćelije domaćina pod takvim uslovima da ćelija domaćin eksprimira humano antitelo koje obuhvata varijabilni domen imunoglobulina i konstantni domen imunoglobulina.
[0121] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje ovde opisane genetičke modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i TCR koji imaju humane varijabilne domene antigenu koji obuhvata peptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen koji obuhvata peptid tako da se peptid prezentuje na MHC kod ne-humane životinje; i dobijanje iz genetički modifikovane ne-humane životinje T ćelije koja eksprimira TCR specifičan za peptid koji se prezentuje na MHC.
[0122] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje ovde opisanog genetički modifikovane nehumane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i TCR koji imaju humane varijabilne domene antigenu koji obuhvata peptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen koji obuhvata peptid tako da se peptid prezentuje na MHC kod ne-humane životinje; dobijanje iz genetički modifikovanog glodara T ćelije koja eksprimira TCR specifičan za peptid koji se prezentuje na MHC; i pravljanje hibridoma T ćelije iz T ćelije.
[0123] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje ovde opisane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i TCR koji imaju humane varijabilne domene antigenu koji obuhvata peptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen koji obuhvata peptid tako da se peptid prezentuje na MHC u ne-humanoj životinji; dobijanje iz genetički modifikovane ne-humane životinje T ćelije koja eksprimira TCR specifičan za peptid koji se prezentuje na MHC; i izolovanje nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen TCR receptora iz T ćelije.
[0124] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje ovde opisane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i TCR koji imaju humane varijabilne domene antigenu koji obuhvata peptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen koji obuhvata peptid tako da se peptid prezentuje na MHC u ne-humanoj životinji; dobijanje T ćelije koja eksprimira TCR specifičan za peptid koji se prezentuje na MHC iz genetički modifikovane ne-humane životinje; izlovanje nukleinske kiseline koja kodira TCR varijabilni domen TCR receptora iz T ćelije; operativno povezivanje nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen TCR sa konstantnim domenom TCR u ćeliji tako da ćelija eksprimira TCR koji obuhvata varijabilni domen TCR i konstanti domen TCR.
[0125] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i TCR koji imaju humane varijabilne domene antigenu koji obuhvata peptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen koji obuhvata peptid tako da se peptid prezentuje na MHC u ne-humanoj životinji; i dobijanje T ćelije koja eksprimira CAR specifičan za peptid koji se prezentuje na MHC iz genetički modifikovane ne-humane životinje.
[0126] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje ovde opisane genetički modifikovane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i TCR koji imaju humane varijabilne domene antigenu koji obuhvata peptid ili nukleinsku kiselinu koja kodra antigen koji obuhvata peptid tako da se peptid prezentuje na MHC u ne-humanoj životinji; dobijanje T ćelije koja eksprimira CAR specifičan za peptid koji se prezentuje na MHC iz genetički modifikovane ne-humane životinje; i pravljenje hibridoma T ćelije iz T ćelije.
[0127] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje ovde opisane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i TCR koji imaju humane varijabilne domene antigenu koji obuhvata peptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen koji obuhvata peptid tako da se peptid prezentuje na MHC u ne-humanoj životinji; dobijanje T ćelije koja eksprimira himerni antigenski receptor (CAR) specifičan za peptid koji se prezentuje u MHC iz genetički modifikovane ne-humane životinje; i izolovanje nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen CAR receptora iz T ćelije.
[0128] U nekim aspektima, postupak obuhvata izlaganje ovde opisane ne-humane životinje koja je modifikovana tako da eksprimira egzogenu TdT i TCR koji imaju humane varijabilne domene antigenu koji obuhvata peptid ili nukleinsku kiselinu koja kodira antigen koji obuhvata peptid tako da se peptid prezentuje na MHC u ne-humanoj životinji; dobijanje T ćelije koja eksprimira himerni antigenski receptor (CAR) specifičan za peptid koji se prezentuje na MHC iz genetički modifikovane ne-humane životinje; izolovanje nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen imunoglobulina CAR receptora iz T ćelije; operativno povezivanje nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen imunoglobulina sa humanim konstantnim domenom imunoglobulina u ćeliji tako da ćelija eksprimira antitelo koje obuhvata humani varijabilni domen imunoglobulina i humani konstantni domen imunoglobulina.
[0129] U izvesnim aspektima, ovde opisani postupci uključuju korak u kome se ovde opisana ne-humana životinja izlaže antigenu (imunizuje) kako bi se indukovao imunski odgovor (npr., imunski odgovor B ćelija i/ili imunski odgovor T ćelija). U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja imunizuje se antigenom sa celim proteinom ili sa njegovim fragmentom. Glodari se mogu imunizovati bilo kojim postupkom poznatim u tehnici (videti, na primer, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory; Malik and Lillehoj (1994) Antibody Techniques, Academic Press, CA).
[0130] U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja izlaže se antigenu tako što se nehumanoj životinji daje virus (npr., retrovirus, adenovirus, vakcinija virus ili lentivirus) koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antigen. Postupci za viralnu vakcinaciju obezbeđeni su, na primer, u U.S. Pat. Nos.6,001,349, 8,663,622, 8,691,502, 8,377,688, kao i u Precopio et al., JEM204:1405-1416 (2007. U nekim aspektima, ne-humanoj životinji se virus daje direktno. U nekim aspektima, ćelija (npr., ćelija koja prezentuje antigen, kao što je dendritska ćelija) inficira se virusom in vitro ili ex vivo koji se potom daje nehumanoj životinji. U nekim aspektima, virus kodira peptid/MHC kompleks (npr., jednolančani peptid/MHC kompleks). Primeri vakcina zasnovanih na jednolančanom peptidu/MHC obezbeđeni su u Truscott et al., J. Immunol. 178:6280-6289 (2007), EP1773383, Kim et al., Vaccine 30:2178-2186 (2012), Kim et al., J. Immunol.184:4423-4430 (2010).
[0131] U nekim aspektima, genetički modifikovana ne-humana životinja izlaže se antigenu davanjem životinji nukleinske kiseline koja kodira antigen. U nekim aspektima, ne-humanoj životinji se daje nukleinska kiselina koja kodira jednolančani peptid/MHC kompleks. Primeri vakcina zasnovanih na jednolančanom peptidu/MHC obezbeđeni su u Truscott et al., J. Immunol. 178:6280-6289 (2007), EP1773383, Kim et al., Vaccine 30:2178-2186 (2012), Kim et al., J. Immunol. 184:4423-4430 (2010). U izvesnim aspektima, nukleinska kiselina je DNK vektor. Isporuka nukleinskih kiselina može se obaviti bilo kojom tehnikom poznatom u tehnici uključujući virusno posredovanog genskog transfera i lipozomom posredovanog genskog transfera. Polinukleotid od interesa povezuje se sa lipozomom tako da obrazuje sredstvo za prenos gena kao što je opisano u, na primer, U.S. Pat. Nos.6,770,291, 7,001,614, 6,749,863, 5,512,295 i 7,112,338, od kojih je svaki ovde uključen kao referenca. U nekim aspektima, nukleinska kiselina je mRNK vektor. Primeri postupaka za dobijanje i davanje mRNK vektora opisani su u, na primer, U.S. Pat. No.8,278,036 and U.S. Pat. Pub. Nos.2013/151736 i 2012/135805.
[0132] U nekim aspektima, antigen je antigen povezan sa kancerom. Primeri antigena povezanih sa kancerom uključuju, ali nisu ograničeni na njih, adipofilin, AIM-2, ALDH1A1, alfa-aktinin-4, alfa-fetoprotein („AFP“), ALK, ANKRD30A, ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL fuzioni protein b3a2, beta-katenin, BING-4, BIRC7, CA-125, CA9, CALCA, karcinoembrionalni antigen CALR, CASP-5, CASP-8, CCR5, CD19, CD20, CD22, CD27, CD274, CD30, CD33, CD38, CD40, CD44, CD45, CD52, CD56, CD79, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLEC12A, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciklin D1, ciklin-A1, dek-can fuzioni protein, DKK1, EFTUD2, EGFR, EGFR varijata III, elongacioni faktor 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA2, EphA3, antigen epitelnog tumora („ETA“), ERBB3, ERBB4, fuzioni protein ETV6-AML1, EZH2, FCRL3, FGF5, FLT3-ITD, FN1, FOLR1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE3,4,5,6,7, GAS7, glipikan-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, GM3, GPR112, IL3RA, HAUS3, hepsin, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, intestinalnu karboksil esterazu, KRAS/Kras, kalikrein 4, KIF20A, KIT, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 takođe poznat kao CCDC110, KRAS, LAGE-1, fuzioni protein LDLRfukoziltransferazuAS, lengsin, LGR5, LMP2, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, jabučni enzim, mamaglobin-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, melan-A/MART-1, Meloe, midkin, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC5AC, MUC16, mucin, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miozin, miozin klase I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, OX40, P polipeptid, p53, PAP, PAX3, PAX5, PBF, PLAC1, PMEL, fuzioni protein pml-RARalfa, polimorfni epitelni mucin („PEM“), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PRLR, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RET, RGS5, RhoC, RNF43, ROR1, RU2AS, SAGE, SART1, SART3, secernin 1, SIRT2, SLAMF7, SLC39A6, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, STEAP2, survivin, fuzioni protein SYT-SSX1 ili -SSX2, TAG-1, TAG-2, telomeraza, TERT, TGF-betaRII, Thompson-nouvelle antigen, TMPRSS2, TNFRSF17, TPBG, TRAG-3, triosefosfat izomerazu, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirozinazu, tirozinazu („TYR“), UPK3A, VEGF, VTCN1, WT1, XAGE-1b/GAGED2a. U nekim aspektima, antigen je neoantigen.
[0133] U nekim aspektima, antigen je antigen eksprimiran od strane infektivnog patogena. U nekim aspektima, patogen je virus, bakterija, gljivica, helmint ili protozoa. Neograničavajući primeri virusa uključuju HIV, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, virus herpesa (npr., HSV-1, HSV-2, CMV, HAV-6, VZV, Epštajn-Barov virus), adenovirus, virus gripa, flavivirus, ehovirus, rinovirus, koksaki virus, koronavirus, respiratorni sincicijalni virus, virus zauški, rotavirus, virus malih boginja, virus rubeole, parvovirus, vakcinija virus, HTLV, virus denge, papiloma virus, virus moluski, poliovirus, virus besnila, JC virus, ebola virus, i antigen virusa arbovirusnog encefalitisa. U nekim aspektima, the parazit je malarija. U nekim aspektima, patogen je Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dirofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Klebsiella, Legionella, Leishmania, Meningococci, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Toxoplasma i Vibriocholerae. Primeri vrsta uključuju Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Candida tropicalis, Trichomonas vaginalis, Haemophilus vaginalis, Group B Streptococcus sp., Microplasma hominis, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus. Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Trichomonas foetus, Toxoplasma gondii, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobaccilus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Aspergillus fumigatus, Absidia ramosa, Trypanosoma equiperdum, Babesia caballi, Clostridium tetani, Clostridium botulinum; ili, gljivica, kao što je, npr., Paracoccidioides brasiliensis; ili drugi patogen, npr., Plasmodium falciparum.
[0134] U nekim aspektima ovde opisanih postupaka, postupak uključuje korak dobijanja T ćelije i/ili B ćelije iz genetički modifikovane ne-humane životinje. U izvesnim aspektima, bilo koji postupak poznat u tehnici može se upotrebiti za dobijanje takvih ćelija. Na primer, takve T ćelije i/ili B ćelije mogu se dobiti iz jetre, limfnih čvorova i/ili periferne krvi životinje. Takve T ćelije i/ili B ćelije mogu se testirati na specifičnost vezivanja postupcima dostupnim u tehnici.
[0135] U nekim aspektima, ovde opisani postupci uključuju korak pravljenja hibridoma B ćelije iz B ćelije. Postupci korisni za pravljenje hibridoma B ćelije poznati su u tehnici i opisani, na primer, u Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory; Malik and Lillehoj (1994) Antibody Techniques, Academic Press, CA.
[0136] U nekim aspektima, ovde opisani postupci uključuju korak pravljenja hibridoma T ćelije iz T ćelije. Potupci korisni za pravljenje hibridoma T ćelije poznati su u tehnici i opisani, na priemer, u Hedrick et al., Cell 30: 141-152 (1982) i Kruisbeek Curr. Protoc. Immunol. Chapter 3 (2001) i White et al., Methods in Molecular Biology 134:185-193 (2000).
[0137] U nekim aspektima, ovde obezbeđeni postupci uključuju korak izolovanja nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region Ig ili TCR. U nekim aspektima ovde opisanih postupaka, bilo koji postupak može se upotrebiti za izolovanje nukleinske kiseline koja kodira varijabilni region Ig ili TCR.
[0138] U nekim aspektima, korak izolovanja nukleinske kiseline obuhvata pravljenje hibridoma B ćelije ili T ćelije iz B ćelije ili T ćelije tim redom i izolovanje nukleinske kiseline iz hibridoma. U nekim aspektima, nukleinska kiselina se izoluje procesom amplifikacije nukleinske kiseline. Na primer, u nekim aspektima, proces amplifikacije nukleinske kiseline je lančana reakcija polimeraze (PCR), lančana reakcija ligaze (LCR), amplifikacija zamenom lanca (strand displacement amplification – SDA), amplifikacija posredovana transkripcijom (TMA), samoodrživa replikacija sekvence (3SR), Qβ amplifikacija na bazi replikaze, amplifikacija na bazi sekvence nukleinske kiseline (NASBA), reparaciona lančana reakcija(RCR), bumerang amplifikacija DNK (BDA) ili amplifikacije „kotrljajućeg obruča“ (rolling-circle amplification – RCA).
[0139] U nekim aspektima, nukleinska kiselina se izoluje sekvenciranjem rearanžiranog gena varijabilnog regiona Ig ili TCR u B ćeliji, T ćeliji, hibridomu B ćelije ili hibridomu T ćelije i sintetisanjem sekvence nukleinske kiseline koja obuhvata rearanžirani gen varijabilnog regiona Ig ili TCR. Primeri procesa sekvenciranja nukleinske kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na njih, sekvenciranje završetka lanca, sekvenciranje ligacijom, sekvenciranje sintezom, pirosekvenciranje, sekvenciranje jonskih poluprovodnika, sekvenciranje pojedinačnih molekula u realnom vremenu, 454 sekvenciranje, i/ili sekvenciranje Dilute-’N’-Go.
[0140] Kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju varijabilne regione teškog i/ili lakog lanca Ig, tim fragmentima DNK može se dalje manipulisati standardnim tehnike rekombinantne DNK, na primer za konvertovanje gena varijabilnog regiona u gene lanaca antitela pune dužine, u gene Fab fragmenta ili u gen scFv. U tim manipulacijama, fragment DNK koji kodira varijabilni region operativno se povezuje sa drugim fragmentom DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Termin „operativno povezan“, kako se upotrebljava u ovom kontekstu, predviđeno je da znači da su dva fragmenta DNK spojena tako da sekvence aminokiseline kodirane od strane dva fragmenta DNK ostaju u okviru.
[0141] Izolovana DNK koja kodira varijabilni region teškog lanca može se konvertovati u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem DNK koja kodira varijabilni region sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni domen teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena humanog konstantnog regiona teškog lanca poznate su u tehnici (videti npr., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, ili Lefranc, The Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001) i fragmenti DNK koji obuhvataju te regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni domen teškog lanca može biti, na primer, konstantni domen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VHmože se operativno povezati sa drugim molekulom DNK koji kodira samo konstantni region CH1 teškog lanca.
[0142] Prema tome, u nekim aspektima, ovde opisani postupci uključuju korak operativnog povezivanja sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen teškog lanca Ig sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira konstantni domen teškog lanca Ig u ćeliji domaćinu tako da ćelija domaćin eksprimira polipeptid teškog lanca Ig koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca Ig i konstantni domen teškog lanca Ig. U nekim aspektima, postupak uključuje korak operativnog povezivanja sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen lakog lanca Ig sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira konstantni domen lakog lanca Ig u ćeliji domaćinu tako da ćelija domaćin eksprimira polipeptid lakog lanca Ig koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca Ig i konstanti domen teškog lanca Ig. U nekim aspektima, postupak uključuje korak operativnog povezivanja sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijabilni domen teškog lanca Ig sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira konstantni domen teškog lanca Ig u ćeliji domaćinu i operativnog povezivanja sekvence nukleinske kiseline koja kodira varijbailni domen lakog lanca Ig sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira konstantni domen lakog lanca Ig u ćeliji domaćinu tako da ćelija domaćin eksprimira antitelo koje ima teški lanac koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca Ig i konstanti domen teškog lanca Ig i laki lanac koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca Ig i konstanti domen lakog lanca Ig. Varijabilni regioni Ig mogu se povezati sa konstantim regionima Ig standardnim tehnikama molekularne biologije dobro poznatim u oblasti tehnike. U nekim aspektima, može se upotrebiti bilo koja ćelija domaćin sposobna za eksprimiranje polipeptida imunoglobulina. U nekim aspektima, ćelija je ćelija CHO, ćelija HEK-293, ćelija BHK, ćelija NS0, ćelija SP2/0 ili Vero ćelija ili retinalna ćelija koja eksprimira
™
sekvencu virusne nukleinske kiseline (npr., ćelija PERC.6 ).
[0143] U nekim aspektima, nukleinska kiselina koja kodira konstantni domen teškog lanca kodira konstantni domen koji obuhvata modifikovani domen Fc (npr., mutaciju koja menja interakciju između Fc i receptora Fc). Na primer, u nekim aspektima, konstantni domen obuhvata modifikaciju svog domena Fc na položaju 235, 236, 237, 239, 265, 267, 268, 269, 270, 298, 326, 327, 330, 332, 350, 351, 366, 392, 394, 405 i/ili 407 (upotrebljavajući sistem numeracije EU). U nekim aspektima, modifikacija se bira iz grupe koja se sastoji od L235A, G236E, G237F, S239E, S239D, D265E, D265S, S267E, S267D, S267G, H268E, H268D, E269L, D270N, D270E, S298A, K326A, K326D, A327H, A327V, A327L, A330I, A330S, I332E, T350V, L351Y, T366L, K392M, K392L, T394W, F405A i/ili Y407V (upotrebljavajući sistem numeracije EU). U nekim aspektima, konstantni domen obuhvata višestruke modifikacije svog domena Fc. U nekim aspektima, višestruke modifikacije se biraju iz grupe koja se sastoji od D270N/K326D, S239E/S298A/K326A/A327H, L235A/S239E/D265E/A327H, G236E/G237F/S239E, G237F/S239E/D265E, G327F/S239E/H268D, G236E/D270N/A327V/I332E, G237F/S239E/A327H, G237F/A327L/A330I, S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/D265S/H268D/I332E, S239E/D265S/I332E, S239E/S267E/H268D, S239E/A327L/A330I, D265E/S267D/A330S, S267G/H268E/D270E, H268D/E269L/S298A/K326A/A327H, H268D//K326A/A327H. Dodatne modifikacije Fc i kombinacije modifikacija Fc obezbeđene su u U.S. Patent Nos. 5,624,821, 5,648,260, 6,528,624, 6,737,056, 7,122,637, 7,183,387, 7,297,775, 7,317,091, 7,332,581, 7,632,497, 7,662,925, 7,695,936, 8,093,359, 8,216,805, 8,218,805, 8,388,955 and 8,937,158, i U.S. Patent Publication Nos. 2005/0054832, 2006/0222653, 2006/0275282, 2006/0275283, 2007/0190063, 2008/0154025, 2009/0042291, 2013/0108623 i 2013/0089541.
Proteini koji vezuju antigen
[0144] U izvesnim aspektima, ovde su obezbeđeni proteini koji vezuju antigen (npr., antitela, TCR receptori, CAR receptori i njihovi fragmenti koji vezuju antigen) koji se mogu dobiti i/ili su dobijeni prema ovde opisanom postupku (npr., upotrebljavajući ovde opisanu ne-humanu životinju).
[0145] U izvesnim aspektima, ovde obezbeđeni molekuli koji vezuju antigen sposobni su da specifično -6 -7 -8 -9
vezuju ciljani antigen sa konstantom disocijacije koja nije veća od 10 , 10 , 10 ili 10 M. U nekim aspektima, afinitet proteina koji vezuje antigen za vezivanje sa antigenom (kao što je onaj izražen pomoću KD) najmanje je 10-struko manji, najmanje 100-struko manji ili najmanje 1000-struko manji od afiniteta proteina koji vezuje antigen za nesrodni antigen. U nekim aspektima, protein koji vezuje antigen vezuje se -6 -7 -8 -9
za peptid/kompleks MHC sa konstantom disocijacije koja nije veća od 10 , 10 , 10 ili 10 M. U nekim aspektima, afinitet za vezivanje proteina koji vezuje antigen sa peptidom/kompleksom MHC (kao što je onaj izražen pomoću KD) najmanje je 10-struko manji, najmanje 100-struko manji ili najmanje 1000-struko manji od afiniteta proteina koji vezuje antigen za peptid za isti protein MHC koji predstavlja nesrodni peptid. Standardni testovi za evaluiranje sposobnosti vezivanja proteina koji vezuju antigen poznata su u tehnici, uključujući, na primer, ELISA testove, Western blot testove i RIA testove. Kinetika vezivanja (npr., afinitet za vezivanje) proteina koji vezuje antigen takođe se može ispitati standardnim ispitivanjima poznatim u tehnici, kao što je analiza Biacore.
[0146] U nekim aspektima, antigen obuhvata epitop i/ili jeste antigen povezan s kancerom. Primeri antigena povezanih s kancerom uključuju, ali nisu ograničeni na njih, adipofilin, AIM-2, ALDH1A1, alfaaktinin-4, alfa-fetoprotein („AFP“), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL fuzioni protein b3a2, betakatenin, BING-4, CA-125, CALCA, karcinoembrionski antigen CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciklin D1, Ciklin-A1, dek-can fuzioni protein, DKK1, EFTUD2, faktor elongacije 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antigen epitelnog tumora („ETA“), fuzioni protein ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipikan-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsin, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, intestinalnu karboksil esterazu, K-RAS/K-ras, kalikrein 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 takođe poznat kao CCDC110, LAGE-1, fuzioni protein LDLR-fukoziltransferazaAS, lengsin, M-CSF, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, jabučni enzim, mamaglobin-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, Melan-A/MART-1, Meloe, Midkine, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUCSAC, mucin, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miozin, miozin klase I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P polipeptid, p53, PAP, PAX5, PBF, fuzioni protein pml-RARalfa, polimorfni epitelni mucin („PEM“), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernin 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivin, fuzioni protein SYT-SSX1 ili -SSX2, TAG-1, TAG-2, telomeraza, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, triozafosfat izomeraza, TRP1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirozinaza, tirozinaza („TYR“), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED2a. U nekim aspektima, antigen je neoantigen.
[0147] U nekim aspektima, antigen obuhvata epitop i/ili je antigen eksprimiran od strane infektivnog patogena. U nekim aspektima, patogen je virus, bakterija, gljivica, helmint, ili protozoa. Neki neograničavajući primeri virusa uključuju HPV, HBV, hepatitis C Virus (HCV), retroviruse kao što je virus humane imunodeficijencije (HIV-1 and HIV-2), herpes viruse kao što je Epštajn-Barov virus (EBV), citomegalovirus (CMV), HSV-1 i HSV-2, i virus gripa. U nekim aspektima, parazit je malarija. U nekim aspektima, patogen je Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dirofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Toxoplasma i Vibriocholerae. Primeri vrsta uključuju Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Candida tropicalis, Trichomonas vaginalis, Haemophilus vaginalis, Streptococcus sp. grupe B, Microplasma hominis, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Trichomonas foetus, Toxoplasma gondii, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobaccilus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Aspergillus fumigatus, Absidia ramosa, Trypanosoma equiperdum, Babesia caballi, Clostridium tetani, Clostridium botulinum; ili, gljivica, kao što je, npr., Paracoccidioides brasiliensis; ili drugi patogen, npr., Plasmodium falciparum.
[0148] U nekim aspektima, antigen obuhvata epitop i/ili jeste protein koji je meta autoreaktivne T ćelije u inflamatornoj bolesti, odbacivanju transplantacije kože ili organa, bolesti graft protiv domaćina (GVHD), ili autoimunoj bolesti. Primeri autoimunih bolesti uključuju, na primer, glomerularni nefritis, artritis, bolest sličnu dilatiranoj kardiomiopatiji, ulcerozni kolitis, Sjogrenov (Sjogren) sindrom, Kronovu (Crohn) bolest, sistemske eritematoze, hronični reumatoidni artritis, multiplu sklerozu, psorijazu, alergijski kontaktni dermatitis, polimiozitis, zadebljanje kože (pachyderma), periarteritis nodoza, reumatsku groznicu, vitiligo vulgaris, insulin zavisni dijabetes melitus, Behčetovu (Behcet) bolest, Hašimotovu (Hashimoto) bolest, Adisonovu (Addison) bolest, dermatomiozitis, mijasteniju gravis, Rajterov (Reiter) sindrom, Grejvsovu (Graves) bolest, perniciozna anemija, Gudpasturov (Goodpasture) sindrom, bolest steriliteta, hronični aktivni hepatitis, pemfigus, autoimunu trombopenijsku purpuru, i autoimunu hemolitičku anemiju, aktivni hronični hepatitis, Adisonovu (Addison) bolest, antifosfolipidni sindrom, atopijsku alergiju, autoimuni atrofični gastritis, autoimunu ahlorhidriju, celijačnu bolest, Kušingov (Cushing) sindrom, dermatomiozitis, diskoidni lupus, eritematozus, Gudpasturov (Goodpasture) sindrom, Hašimotov (Hashimoto) tiroiditis, idiopatsku atrofiju nadbubrežne žlezde, idiopatsku trombocitopeniju, insulin zavisni dijabetes, Lambert-Itonov (Lambert-Eaton) sindrom, lupoidni hepatitis, neke slučajeve limfopenije, mešovitu bolest vezivnog tkiva, pemfigoid, pemfigus vulgaris, perniciozna anemija, fakogeni uveitis, poliarteritis nodoza, poliglandularne autosindrome, primarnu bilijarnu cirozu, primarni sklerozirajući holangitis, Rejnoov (Raynaud) sindrom, relapsni polihondritis, Šmitov (Schmidt) sindrom, ograničenu sklerodermu (ili CREST sindrom), simpatičku oftalmiju, sistemski lupus eritematozus, Takajasuov (Takayasu) arteritis, temporalni arteritis, tirotoksikozu, insulinsku rezistenciju tipa b, ulcerativni kolitis i Vegenerovu (Wegener) granulomatozu. Primeri proteina uključuju ciljane autoreaktivnim T-ćelijama uključuju, na primer, p205, insulin, tiroidni stimulišući hormon, tirozinaza, TRP1, i mijelin.
[0149] U nekim aspektima, protein koji vezuje antigen je antitelo. U nekim aspektima, ovde obezbeđena antitela obuhvataju humane varijabilne domene teškog lanca. U nekim aspektima, antitela obuhvataju humane konstantne domene teškog lanca. U nekim aspektima, ovde obezbeđena antitela obuhvataju konstantni domen IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. Sekvence konstantnih domena teškog lanca poznate su u tehnici (videti npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242, or Lefranc, The Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001). U nekim aspektima, ovde obezbeđenim antitelima nedostaje konstantni domen teškog lanca ili njegov deo.
[0150] U nekim aspektima, ovde obezbeđena antitela obuhvataju modifikovani domen Fc (npr., mutaciju koja menja interakciju između FC i receptora Fc). Na primer, u nekim aspektima, ovde obezbeđena antitela obuhvataju modifikaciju svog domena Fc na položaju 235, 236, 237, 239, 265, 267, 268, 269, 270, 298, 326, 327, 330, 332, 350, 351, 366, 392, 394, 405 i/ili 407 (upotrebljavajući sistem numeracije EU). U nekim aspektima, modifikacija se bira iz grupe koja se sastoji od L235A, G236E, G237F, S239E, S239D, D265E, D265S, S267E, S267D, S267G, H268E, H268D, E269L, D270N, D270E, S298A, K326A, K326D, A327H, A327V, A327L, A330I, A330S, I332E, T350V, L351Y, T366L, K392M, K392L, T394W, F405A i/ili Y407V (upotrebljavajući sistem numeracije EU). U nekim aspektima, antitela obuhvataju višestruke modifikacije svog domena Fc. U nekim aspektima, višestruke modifikacije biraju se iz grupe koja se sastoji od D270N/K326D, S239E/S298A/K326A/A327H, L235A/S239E/D265E/A327H, G236E/G237F/S239E, G237F/S239E/D265E, G327F/S239E/H268D, G236E/D270N/A327V/I332E, G237F/S239E/A327H, G237F/A327L/A330I, S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/D265S/H268D/I332E, S239E/D265S/I332E, S239E/S267E/H268D, S239E/A327L/A330I, D265E/S267D/A330S, S267G/H268E/D270E, H268D/E269L/S298A/K326A/A327H, H268D//K326A/A327H. Dodatne modifikacije Fc i kombinacije modifikacija Fc obezbeđene su u U.S. Patent Nos.5,624,821, 5,648,260, 6,528,624, 6,737,056, 7,122,637, 7,183,387, 7,297,775, 7,317,091, 7,332,581, 7,632,497, 7,662,925, 7,695,936, 8,093,359, 8,216,805, 8,218,805, 8,388,955 i 8,937,158, i U.S. Patent Publication Nos. 2005/0054832, 2006/0222653, 2006/0275282, 2006/0275283, 2007/0190063, 2008/0154025, 2009/0042291, 2013/0108623 i 2013/0089541.
[0151] U nekim aspektima, antitelo je bispecifično antitelo. U nekim aspektima, dva domena koja vezuju antigen bispecifičnog antitela imaju različite varijabilne domene teškog lanca ali imaju identične varijabilne domene lakog lanca. U nekim aspektima, domeni Fc teškog lanac obuhvataju modifikacije za olakšavanje formiranja heterodimera teškog lanca i/ili za inhibiranje formiranja homodimera teškog lanca. Takve modifikacije obezbeđene su, na primer, u U.S. Pat. Nos. 5,731,168, 5,807,706, 5,821,333, 7,642,228 i 8,679,785 i u U.S. Pat. Pub. No.2013/0195849.
[0152] U nekim aspektima, ovde obezbeđena antitela imaju humane varijabilne domene lakog lanca. U nekim izvođenjima, varijabilni domeni lakog lanca su varijabilni domeni λ lakog lanca. U nekim izvođenjima, varijabilni domeni lakog lanca su varijabilni domeni κ lakog lanca. U nekim izvođenjima, antitela imaju humane konstantne domene lakog lanca. U nekim izvođenjima, konstantni domeni lakog lanca su konstantni domeni λ lakog lanca. U nekim izvođenjima, konstantni domeni lakog lanca su konstantni domeni κ lakog lanca. Sekvence humanog konstantnog domena lakog lanca poznati su u tehnici (videti npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242, ili Lefranc, The Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001).
[0153] U nekim izvođenjima, ovde opisana antitela su intaktna antitela. U nekim izvođenjima, ovde opisana antitela su fragmenti antitela koji zadržavaju vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, fragment antigena je Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, scFv, disulfidnom vezom povezan Fv, Fd, jednolančana antitela, izolovani CDRH3 ili drugi fragment antitela koji zadržava najmanje deo varijabilnog domena intaktnog antitela.
[0154] U izvesnim aspektima, protein koji vezuje antigen je CAR. U nekim aspektima, CAR je vezan za membranu. U nekim aspektima, CAR je rastvorljiv CAR (npr., kome nedostaje transmembrana ili citoplazmatski domen). U nekim aspektima, takvi CAR receptori obuhvataju prvi polipeptid CAR koji obuhvata varijabilni domen teškog lanca Ig i konstantni domen TCRβ i drugi polipeptid CAR koji obuhvata varijabilni domen lakog lanca Ig (npr., κ varijabilni domen Ig ili λ varijabilni domen Ig) i konstantni domen TCRα. U nekim aspektima, varijabilni domen teškog lanca Ig i/ili varijabilni domen lakog lanca Ig su humani varijabilni domeni Ig. U nekim aspektima, konstantni domen TCRβ i/ili konstantni domen TCRα su nehumani konstantni domeni (npr., konstantni domeni pacova ili miša). U nekim aspektima, konstantni domen TCRβ i/ili konstantni domen TCRα su humani konstantni domeni.
[0155] U izvesnim aspektima, protein koji vezuje antigen je TCR. U nekim aspektima, TCR je vezan za membranu. U nekim aspektima, TCR je rastvorljiv TCR (npr., kome nedostaje transmembrana ili citoplazmatski domen). U nekim aspektima, takvi TCR receptori obuhvataju prvi polipeptid TCR koji obuhvata varijabilni domen TCRβ i konstantni domen TCRβ i drugi polipeptid TCR koji obuhvata varijabilni domen TCRα i konstantni domen TCRα. U nekim aspektima, varijabilni domen TCRα i/ili varijabilni domen TCRβ su humani varijabilni domeni TCR. U nekim aspektima, konstantni domen TCRβ i/ili konstantni domen TCRα su ne-humani konstantni domeni (npr., konstantni domeni pacova ili miša). U nekim aspektima, konstantni domen TCRβ i/ili konstantni domen TCRα su humani konstantni domeni.
Farmaceutske kompozicije
[0156] U izvesnim aspektima, ovde je obezbeđena kompozicija, npr., farmaceutska kompozicija, koja sadrži jedno ovde opisano sredstvo (npr., ovde opisan molekul koji vezuje antigen, kao što su ovde opisani antitelo, CAR ili TCR, dobijeni iz ovde opisane ne-humane životinje) formulisano zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0157] Ovde obezbeđene farmaceutske kompozicije mogu se specijalno formulisati za davanje u čvrstom ili tečnom obliku, uključujući one prilagođene za sledeće: (1) oralno davanje, na primer, drenčevi (vodeni ili ne-vodeni rastvori ili suspenzije), tablete, npr., one namenjene za bukalnu, sublingvalnu, i sistemsku apsorpciju, bolusi, prahovi, granule, paste za davanje na jezik; ili (2) parenteralno davanje, na primer, supkutanim, intramuskularnim, intravenskim ili epiduralnim ubrizgavanjem kao, na primer, sterilnog rastvora ili suspenzije, ili formulacije sa odloženim oslobađanjem.
[0158] Ovde obezbeđene farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralno davanje obuhvataju jedno ili više ovde opisanih sredstava u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih sterilnih izotoničnih vodenih ili ne-vodenih rastvora, disperzija, suspenzija ili emulzija, ili sterilnih prahova koji se neposredno pre upotrebe mogu rekonstituisati u sterilni rastvor ili disperziju koji se mogu ubrizgavati, koji mogu sadržati šećere, alkohole, antioksidanse, pufere, bakteriostate, rastvorljive supstance koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju predviđenog primaoca ili sredstva za suspendovanje ili zgušnjavanje.
[0159] Primeri pogodnih vodenih ili ne-vodenih nosača koji se mogu koristi u ovde obezbeđenim farmaceutskim kompozicijama uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i organske estre koji se mogu ubrizgavati, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može se održavati, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem tražene veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.
[0160] U izvesnim aspektima, kompozcije obuhvataju antitelo, ovde opisane TCR i/ili CAR u koncentraciji koja dovodi do mas/v odgovarajuće za željenu dozu. Antitelo, TCR i/ili CAR mogu biti prisutni u kompoziciji u koncentraciji od najmanje 1 mg/mL, najmanje 5 mg/mL, najmanje 10 mg/mL, najmanje 15 mg/mL, najmanje 20 mg/mL, najmanje 25 mg/mL, najmanje 30 mg/mL, najmanje 35 mg/mL, najmanje 40 mg/mL, najmanje 45 mg/mL, najmanje 50 mg/mL, najmanje 55 mg/mL, najmanje 60 mg/mL, najmanje 65 mg/mL, najmanje 70 mg/mL, najmanje 75 mg/mL, najmanje 80 mg/mL, najmanje 85 mg/mL, najmanje 90 mg/mL, najmanje 95 mg/mL, najmanje 100 mg/mL, najmanje 105 mg/mL, najmanje 110 mg/mL, najmanje 115 mg/mL, najmanje 120 mg/mL, najmanje 125 mg/mL, najmanje 130 mg/mL, najmanje 135 mg/mL, najmanje 140 mg/mL, najmanje 150 mg/mL, najmanje 200 mg/mL, najmanje 250 mg/mL, ili najmanje 300 mg/mL.
[0161] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata jedan ili više aktivnih sastojaka kako je potrebno za određenu indikaciju koja se leči, tipično one sa komplementarnim delovanjima koje međusobno ne daju neželjena dejstva. Takvi dodatni aktivni sastojci pogodno su prisutni u kombinaciji u količinama koje su delotvorne za predviđenu svrhu.
[0162] U nekim aspektima, kompozicije se pripremaju mešanjem ovde opisanog antitela, TCR receptora i/ili CAR receptora sa opcionim fiziološki prihvatljivim nosačima, pomoćnim sredstvima ili stabilizatorima, uključujući, ali bez ograničavanja na njih, puferska sredstva, saharide, soli, surfaktante, solubilizatore, poliole, razblaživače, vezivna sredstva, stabilizatore, soli, lipofilne rastvarače, aminokiseline, helatore, konzervanse, ili slično (Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 12th edition, L. Brunton, et al. and Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1999)), u obliku liofilizovanih kompozicija ili vodenih rastvora u željenim finalnim koncentracijama. Prihvatljivi nosači, pomoćna sredstva ili stabilizatori su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što je histidin, fosfat, citrat, glicin, acetat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-kresol); polipeptid niske molekuske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate uključujući trehalozu, glukozu, manozu, ili dekstrine; helatna sredstva kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehalozu ili sorbitol; suprotne jone koji obrazuju so kao što je natrijum; metalne komplekse (npr.,
® Zn-proteinske komplekse); i/ili ne-jonske surfaktante kao što su TWEEN, polisorbat 80, PLURONICS ili polietilen glikol (PEG).
[0163] U nekim aspektima, pufersko sredstvo je histidin, citrat, fosfat, glicin ili acetat. Saharidno pomoćno sredstvo može bti trehaloza, saharoza, manitol, maltoza ili rafinoza. Surfaktant može biti polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 80, ili Pluronic F68. So može biti NaCl, KCl, MgCl2, ili CaCl2.
[0164] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata pufersko sredstvo ili sredstvo za podešave pH kako bi se obezbedila poboljšana kontrola pH. Takva kompozicija može imati pH između oko 3,0 i oko 9,0, između oko 4,0 i oko 8,0, između oko 5,0 i oko 8,0, između oko 5,0 i oko 7,0, između oko 5,0 i oko 6,5, između oko 5,5 i oko 8,0, između oko 5,5 i oko 7,0, ili između oko 5,5 i oko 6,5. U daljem aspektu, takva kompozicija ima pH od oko 3,0, oko 3,5, oko 4,0, oko 4,5, oko 5,0, oko 5,1, oko 5,2, oko 5,3, oko 5,4, oko 5,5, oko 5,6, oko 5,7, oko 5,8, oko 5,9, oko 6,0, oko 6,1, oko 6,2, oko 6,3, oko 6,4, oko 6,5, oko 6,6, oko 6,7, oko 6,8, oko 6,9, oko 7,0, oko 7,5, oko 8,0, oko 8,5, ili oko 9,0. U specifičnom aspektu, kompozicija ima pH od oko 6,0. Stručnjak u oblasti tehnike razume da pH kompozicije generalno ne bi trebalo da bude jednaka izoelekričnoj tački određenog antitela, TCR receptora ili CAR receptora koje treba upotrebiti u kompoziciji. Tipično, pufersko sredstvo je so pripremljena od organske ili neorganske kiseline ili baze. Predstavnici puferskog sredstva uključuju, ali nisu ograničeni na njih, soli organskih kiselina kao što su soli limunske kiseline, askorbinske kiseline, glukonske kiseline, ugljene kiseline, vinske kiseline, ćilibarne kiseline, sirćetene kiseline, ili ftalne kiseline; Tris, trometamin hidrohlorid, ili fosfatne pufere. Uz to, komponente aminokiselina mogu takođe funkcionisati u svojstvu pufera. Predstavnici komponenata aminokiselina koje se mogu upotrebljavati u kompoziciji kao puferska sredstva uključuju, ali nisu ograničeni na njih, glicin i histidin. U izvesnim aspektima, pufersko sredstvo se bira od histidina, citrata, fosfata, glicina i acetata. U specifičnom aspektu, pufersko sredstvo je histidin. U drugom specifičnom aspektu, pufersko sredstvo je citrat. U još jednom specifičnom aspektu, pufersko sredstvo je glicin. Čistoća puferskog sredstva trebalo bi da je najmanje 98%, ili najmanje 99%, ili najmanje 99,5%. Kako se upotrebljava ovde, termin „čistoća“ u kontekstu histidina i glicina odnosi se na hemijsku čistoću histidina ili glicina onako kako se to razume u tehnici, npr., kao što je opisano u The Merck Index, 13th ed., O’Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001).
[0165] U izvesnim aspektima, kompozicija obuhvata histidin kao pufersko sredstvo. U izvesnim aspektima, histidin je prisutan u kompoziciji u koncentraciji od najmanje oko 1 mM, najmanje oko 5 mM, najmanje oko 10 mM, najmanje oko 20 mM, najmanje oko 30 mM, najmanje oko 40 mM, najmanje oko 50 mM, najmanje oko 75 mM, najmanje oko 100 mM, najmanje oko 150 mM, ili najmanje oko 200 mM histidina. U drugom aspektu, kompozicija obuhvata između oko 1 mM i oko 200 mM, između oko 1 mM i oko 150 mM, između oko 1 mM i oko 100 mM, između oko 1 mM i oko 75 mM, između oko 10 mM i oko 200 mM, između oko 10 mM i oko 150 mM, između oko 10 mM i oko 100 mM, između oko 10 mM i oko 75 mM, između oko 10 mM i oko 50 mM, između oko 10 mM i oko 40 mM, između oko 10 mM i oko 30 mM, između oko 20 mM i oko 75 mM, između oko 20 mM i oko 50 mM, između oko 20 mM i oko 40 mM, ili između oko 20 mM i oko 30 mM histidina. U daljem aspektu, kompozicija obuhvata oko 1 mM, oko 5 mM, oko 10 mM, oko 20 mM, oko 25 mM, oko 30 mM, oko 35 mM, oko 40 mM, oko 45 mM, oko 50 mM, oko 60 mM, oko 70 mM, oko 80 mM, oko 90 mM, oko 100 mM, oko 150 mM, ili oko 200 mM histidina. U specifičnom aspektu, kompozicija može obuhvatati oko 10 mM, oko 25 mM, ili ne sadržati histidin.
[0166] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata ugljenohidratno pomoćno sredstvo. Ugljenohidratna pomoćna sredstva mogu delovati, npr., kao sredstva za poboljšavanje viskoznosti, stabilizatori, sredstva za punjenje, sredstva za rastvaranje, i/ili slično. Ugljenohidratna pomoćna sredstva su generalno prisutna u između oko 1% do oko 99% po masi ili zapremini, npr., između oko 0,1% do oko 20%, između oko 0,1% do oko 15%, između oko 0,1% do oko 5%, između oko 1% do oko 20%, između oko 5% do oko 15%, između oko 8% do oko 10%, između oko 10% i oko 15%, između oko 15% i oko 20%, između 0,1% do 20%, između 5% do 15%, između 8% do 10%, između 10% i 15%, između 15% i 20%, između oko 0,1% do oko 5%, između oko 5% do oko 10%, ili između oko 15% do oko 20%. U još nekim drugim specifičnim aspektima, ugljenohidratno pomoćno sredstvo je prisutno u 1%, ili u 1,5%, ili u 2%, ili u 2,5%, ili u 3%, ili u 4%, ili u 5%, ili u 10%, ili u 15%, ili u 20%.
[0167] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata ugljenohidratno pomoćno sredstvo. Ugljenohidratna pomoćna sredstva pogodna za upotrebu u kompozicijama uključujući, ali bez ograničavanja na njih, monosaharide kao što su fruktoza, maltoza, galaktoza, glukoza, D-manoza, sorboza, i slično; disaharide, kao što su laktoza, saharoza, trehaloza, celobioza, i slično; polisaharide, kao što su rafinoza, melazitoza, maltodekstrini, dekstrani, skrobovi, i slično; i alditole, kao što su manitol, ksilitol, maltitol, laktitol, ksilitol sorbitol (glucitol) i slično. U izvesnim aspektima, ugljenohidratna pomoćna sredstva za upotrebu u ovde obezbeđenim kompozicijama biraju se od saharoze, trehaloze, laktoze, manitola i rafinoze. U specifičnom aspektu, ugljenohidratno pomoćno sredstvo je trehaloza. U drugom specifičnom aspektu, ugljenohidratno pomoćno sredstvo je manitol. U još jednom specifičnom aspektu, ugljenohidratno pomoćno sredstvo je saharoza. U još jednom specifičnom aspektu, ugljenohidratno pomoćno sredstvo je rafinoza. Čistoća ugljenohidratnog pomoćnog sredstva trebalo bi da je najmanje 98%, ili najmanje 99%, ili najmanje 99,5%.
[0168] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata trehalozu. U izvesnim aspektima, kompozicija obuhvata najmanje oko 1%, najmanje oko 2%, najmanje oko 4%, najmanje oko 8%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, ili najmanje oko 40% trehaloze. U drugom aspektu, kompozicija obuhvata između oko 1% i oko 40%, između oko 1% i oko 30%, između oko 1% i oko 20%, između oko 2% i oko 40%, između oko 2% i oko 30%, između oko 2% i oko 20%, između oko 4% i oko 40%, između oko 4% i oko 30%, ili između oko 4% i oko 20% trehaloze. U daljem aspektu, kompozicija obuhvata oko 1%, oko 2%, oko 4%, oko 6%, oko 8%, oko 15%, oko 20%, oko 30%, ili oko 40% trehaloze. U specifičnom aspektu, kompozicija obuhvata oko 4%, oko 6% ili oko 15% trehaloze.
[0169] U izvesnim aspektima, kompozicija obuhvata pomoćno sredstvo. U specifičnom aspektu, kompozicija obuhvata najmanje jedno pomoćno sredstvo koje se bira od: šećera, soli, surfaktanta, aminokiseline, poliola, helatnog sredstva, emulgatora i konzervansa. U izvesnim aspektima, kompozicija obuhvata so, npr., so koja se bira od: NaCl, KCl, CaCl2 i MgCl2. U specifičnom izvođenju, kompozicija obuhvata NaCl.
[0170] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata aminokiselinu, npr., lizin, arginin, glicin, histidin ili so aminokiseline. Kompozicija može obuhvatati njmanje oko 1 mM, najmanje oko 10 mM, najmanje oko 25 mM, najmanje oko 50 mM, najmanje oko 100 mM, najmanje oko 150 mM, najmanje oko 200 mM, najmanje oko 250 mM, najmanje oko 300 mM, najmanje oko 350 mM, ili najmanje oko 400 mM aminokiseline. U drugom aspektu, kompozicija može obuhvatati između oko 1 mM i oko 100 mM, između oko 10 mM i oko 150 mM, između oko 25 mM i oko 250 mM, između oko 25 mM i oko 300 mM, između oko 25 mM i oko 350 mM, između oko 25 mM i oko 400 mM, između oko 50 mM i oko 250 mM, između oko 50 mM i oko 300 mM, između oko 50 mM i oko 350 mM, između oko 50 mM i oko 400 mM, između oko 100 mM i oko 250 mM, između oko 100 mM i oko 300 mM, između oko 100 mM i oko 400 mM, između oko 150 mM i oko 250 mM, između oko 150 mM i oko 300 mM, ili između oko 150 mM i oko 400 mM of aminokiseline. U daljem aspektu, kompozicija obuhvata oko 1 mM, 1,6 mM, 25 mM, oko 50 mM, oko 100 mM, oko 150 mM, oko 200 mM, oko 250 mM, oko 300 mM, oko 350 mM, ili oko 400 mM aminokiseline.
[0171] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata surfaktant. Termin „surfaktant“ kako se upotrebljava ovde odnosi se na organske supstance koje imaju amfipatske strukture; naime, sastoje se od grupa suprotnih tendencija rastvaranja, tipično ugljovodonični lanac rastvorljiv u ulju i jonska grupa rastvorljiva u vodi. Surfaktanti se mogu klasifikovati, zavisno od naelektrisanja površinski aktivnog dela, na anjonske, katjonske i nejonske surfaktante. Surfaktanti se često upotrebljavaju kao sredstva za ovlaživanje, emulgovanje, rastvaranje i dispergovanje za različite farmaceutske kompozicije i preparature bioloških materijala. Farmaceutski prihvatljivi surfaktanti kao što su polisorbati (npr., polisorbati 20 ili 80); polioksameri (npr., poloksamer 188); Triton; natrijum oktill glikozid; lauril-, miristil-, linoleil-, ili stearilsulfobetain; lauril-, miristil-, linoleil-ilir stearil-sarkozin; linoleil-, miristil-, ili cetil-betain; lauroamidopropil-, kokamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, paImidopropil-, ili izostearamidopropil-betain (npr., lauroamidopropil); miristamidopropil-, paImidopropil-, ili izostearamidopropil-dimetilamin; natrijum
®
metill kockil-, ili dinatrijum metil oleil-taurat; i MONAQUA serija (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.),
®
polietil glikol, polipropil glikol, i kopolimeri etilen i propilen glikola (npr., PLURONICS PF68, itd.), mogu se opciono dodavati kompoziciji kako bi se umanjila agregacija. U izvesnim aspektima, kompozicija obuhvata polisorbat 20, polisorbat 40, polisorbat 60, ili polisorbat 80. Surfaktanti u posebno korisni ako se za davanje kompozicije upotrebljavaju pumpica ili plastična posuda. Prisustvo farmaceutski prihvatljivog surfaktanta ublažava sklonost proteina ka agregaciji. Kompozicija može obuhvatati polisorbat koji je u koncentraciji u opsegu između oko 0,001% do oko 1%, ili oko 0,001% do oko 0,1%, ili oko 0,01% do oko 0,1%. U drugim specifičnim aspektima, kompozicije obuhvataju polisorbat koji je u koncentraciji od 0,001%, ili 0,002%, ili 0,003%, ili 0,004%, ili 0,005%, ili 0,006%, ili 0,007%, ili 0,008%, ili 0,009%, ili 0,01%, ili 0,015%, ili 0,02%.
[0172] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata druga pomoćna sredstva i/ili aditive uključujući, ali bez ograničavanja na njih, razblaživače, vezivna sredstva, stabilizatore, lipofilne rastvarače, konzervanse, adjuvante, ili slično. Farmaceutski prihvatljiva pomoćna sredstva i/ili aditivi mogu se upotrebljavati u ovde obezbeđenim kompozicijama. Uobičajeno upotrebljavana pomoćna sredstva/aditivi, kao što su farmaceutski prihvatljivi helatori (na primer, ali bez ograničavanja na njih, EDTA, DTPA ili EGTA) mogu se opciono dodavati kompozicijama kako bi se redukovala agregacija. Ti aditivi su posebno korisni ako se za davanje kompozicije upotrebljava pumpica ili plastična posuda.
[0173] U nekim aspektima, kompozicija obuhvata konzervans. Konzervansi, kao što su fenol, m-krezol, pkrezol, o-krezol, hlorokrezol, benzil alkohol, fenilmerkuri nitrit, fenoksietanol, formaldehid, hlorobutanol, magnezijum hlorid (na primer, ali ne ograničavajući se na njega, heksahidrat), alkilparaben (metil, etil, propil, butil i slično), benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, natrijum dehidroacetat i timerosal, ili njihove smeše mogu se opciono dodavati kompozicijama u bilo kojoj pogodnoj koncentraciji kao što je između oko 0,001% do oko 5%, ili bilo koji opseg vrednosti u tom opsegu. Koncentracija konzervansa koji se upotrebljava u kompozicijama jeste u koncentraciji dovoljnoj da proizvede mikrobni efekat. Takve koncentracije zavise od izabranog konzervansa i stručnjak u oblasti tehnike lako ih određuje.
[0174] U nekim aspektima, kompozicija je izotonična sa humanom krvi, pri čemu kompozicije imaju suštinski isti osmotski pritisak kao humana krv. Takve izotonične kompozicije generalno će imati osmotski pritisak od oko 250 mOSm do oko 350 mOSm. Izotoničnost se može meriti, na primer, osmometrom za pritisak pare ili zamrzavanje leda. Toničnost kompozicije podešava se upotrebom modifikatora toničnosti. „Modifikatori toničnosti“ su one farmaceutski prihvatljive inertne supstance koje se mogu dodati kompoziciji kako bi se obezbedila izotoničnost kompozicije. Modifikatori toničnosti pogodni za ovde obezbeđenu kompoziciju uključuju, ali nisu ograničeni na njih, saharide, soli i aminokiseline.
[0175] U izvesnim aspektima, kompozicija je kompozicija bez pirogena koja je suštinski bez endotoksina i/ili povezanih pirogenih supstanci. Endotoksini uključuju toksine koji su zatvoreni unutar mikroorganizma i oslobađaju se samo kada se mikroorganizam razbije ili umre. Pirogene supstance takođe uključuju termostabilne supstance koje izazivaju groznicu iz spoljašnje membrane bakterije i drugih mikroorganizama. Obe te supstance mogu izazvati groznicu, hipotenziju i šok ako se daju ljudima. Usled potencijalno štetnih dejstava, čak i male količine endotoksina moraju se ukloniti iz farmaceutskog rastvora leka koji se daje intravenski. Uprava za hranu i lekove (The Food & Drug Administration – „FDA“) postavila je gornju granicu od 5 jedinica endotoksina (EU) po dozi po kilogramu telesne mase u jednom jednočasovnom periodu za intravensku primenu leka (The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000)). Kada se terapijski proteini daju u količinama od nekoliko stotina ili hiljada miligrama po kilogramu telesne mase, kao što može biti slučaj sa proteinima od interesa (npr., antitelima), čak i količine u tragovima štetnog i opasnog endotoksina moraju se ukloniti. U nekim aspektima, nivoi endotoksina i pirogena u kompoziciji manji su od 10 EU/mg, ili manji od 5 EU/mg, ili manji od 1 EU/mg, ili manji od 0,1 EU/mg, ili manji od 0,01 EU/mg, ili manji od 0,001 EU/mg.
[0176] Kada se upotrebljava za davanje in vivo, ovde opisana kompozicija treba da je sterilna. Kompozicija se može sterilisati različitim postupcima sterilizacije, uključujući sterilnu filtraciju, zračenje itd. U izvesnim aspektima, kompozicija se steriliše filtriranjem sa prethodno sterilisanim filterom od 0,22 mikrona. Sterilne kompozicije za ubrizgavanje mogu se formulisati prema konvencionalnoj farmaceutskoj praksi kao što je opisano u „Remington: The Science & Practice of Pharmacy“, 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, (2005). Kompozicije koje obuhvataju proteine od interesa (npr., antitela ili TCR receptore ili CAR receptore) kao što su oni opisani ovde, obično će se skladištiti u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Razmatra se da se sterilne kompozicije koje obuhvataju proteine od interesa (npr., antitelo, TCR ili CAR) stave u posudu koja ima sterilni pristupni otvor, na primer, vrećicu sa intravenskim rastvorom ili bočicu koja ima adapter koji omogućava preuzimanje kompozicije, kao što je čep koji se može probiti iglom za hipodermalno ubrizgavanje. U izvesnim aspektima, kompozicija se obezbeđuje kao unapred napunjen špric.
[0177] U izvesnim aspektima, kompozicija je liofilizovana formulacija. Termin „liofilizovan“ ili „osušen smrzavanjem“ uključuje stanje supstance koja je podvrgnuta proceduri sušenja kao što je liofilizacija, gde je uklonjeno najmanje 50% vlažnosti.
[0178] Bez obzira na odabrani put davanja, ovde obezbeđena sredstva, koja se mogu upotrebljavati u pogodnom hidratihovanom obliku, i/ili farmaceutske kompozicije od onih koje su obezbeđene ovde, fomulišu se u farmaceutski prihvatljive oblike doze konvencionalnim postupcima poznate stručnjacima u oblasti tehnike.
Terapijski postupci
[0179] U izvesnim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja bolesti ili poremećaja koji obuhvataju davanje subjektu proteina koji vezuje antigen (npr., ovde opisanog antitela, TCR receptora i/ili CAR receptora, kao što je potpuno humano antitelo, TCR ili CAR). U nekim aspektima, antitelo, TCR i/ili CAR je antitelo, TCR i/ili CAR dobijeni ili koji se mogu dobiti ovde opisanim postupcima (npr., upotrebljavajući ovde opisane ne-humane životinje).
[0180] U izvesnim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja kancera kod subjekata koji obuhvataju davanje subjektima ovde opisane farmaceutske kompozicije (npr., farmaceutska kompozicija koja obuhvata ovde opisano antitelo, kao što je ovde opisano potpuno humano antitelo, TCR ili CAR, dobijeni iz ne-humane životinje kao što je ovde opisano). U nekim aspektima, ovde opisani postupci mogu se upotrebiti za lečenje bilo kojeg kanceroznog ili pre-kanceorznog tumora. Kanceri koji se mogu lečiti ovde opisanim postupcima i kompozicijama uključuju, ali nisu ograničeni na njih, ćelije kancera iz bešike, krvi, kosti, koštane srži, mozga, dojke, kolona, jednjaka, creva, desni, glave, bubrega, jetre, pluća, nazofarinksa, vrata, jajnika, prostate, kože, želuca, testisa, jezika ili materice. Neograničavajući primeri različitih histoloških tipova kancera uključuju: neoplazmu, malignu; karcinom; karcinom, nediferencirani; karcinom džinovskih i vretenastih ćelija; karcinom malih ćelija; papilarni karcinom; karcinom skvamoznih ćelija; limfoepitelni karcinom; karcinom bazalnih ćelija; pilomatriks karcinom; karcinom prelaznih ćelija; papilarni karcinom prelaznih ćelija; adenokarcinom; gastrinom, maligni; holangiokarcinom; hepatocelularni karcinom; kombinovani hepatocelularni karcinom i holangiokarcinom; trabekularni adenokarcinom; adenoidni cistični karcinom; adenokarcinom u adenomatoznom polipu; adenokarcinom, porodičnu polipozu koli; solidni karcinom; karcinoidni tumor, maligni; bronhioalveolarni adenokarcinom; papilarni adenokarcinom; hromofobni karcinom; acidofilni karcinom; oksofilni adenokarcinom; bazofilni karcinom; adenokarcinom bistrih ćelija; karcinom granularnih ćelija; folikularni adenokarcinom; papilarni i folikularni adenokarcinom; nekapsulirajući sklerozirajući karcinom; karcinom kore nadbubrežne žlezde; endometrijski karcinom; karcinom dodatka kože; apokrini adenokarcinom; lojni adenokarcinom; ceruminozni adenokarcinom; mukoepidermoidni karcinom; cistadenokarcinom; papilarni cistadenokarcinom; papilarni serozni cistadenokarcinom; mucinozni cistadenokarcinom; mucinozni adenokarcinom; signet ring cell karcinom; infiltrirajući duktalni karcinom; medularni karcinom; lobularni karcinom; inflamatorni karcinom; Pagetovu (Paget) bolest, dojke, karcinom acinarnih ćelija; adenoskvamozni karcinom; adenokarcinom sa skvamoznom metaplazijom; timom, maligni; stromalni tumor jajnika, maligni; tekom, maligni; granulozu – ćelijski tumor, maligni; androblastom, maligni; karcinom Sertolijevih (Sertoli) ćelija; tumor Lejdigovih (Leydig) ćelija, maligni; tumor lipidnih ćelija, maligni; paragangliom, maligni; ekstramamarni paragangliom, maligni; feohromocitom; glomangiosarkom; maligni melanom; amelanotični melanom; površno šireći melanom; maligni melanom u džinovskom pigmentiranom nevusu; melanom epiteloidnih ćelija; plavi nevus, maligni; sarkom; fibrosarkom; fibrozni histocitom, maligni; miksosarkom; liposarkom; leiomiosarkom; rabdomiosarkom; embrionalni rabdomiosarkom; alveolarni rabdomiosarkom; stromalni sarkom; mešoviti tumor, maligni; Milerov (Mullerian) mešoviti tumor; nefroblastom; hepatoblastom; karcinosarkom; mezenhimom, maligni; Brenerov (Brenner) tumor, maligni; filoidni (phyllodes) tumor, maligni; sinovijalni sarkom; mezoteliom, maligni; disgerminom; embrionalni karcinom; teratom, maligni; ovarijalna struma, maligna; horiokarcinom; mezonefrom, maligni; hemangiosarkom; hemangioendoteliom, maligni; Kapošijev (Kaposi) sarkom; hemangiopericitom, maligni; limfangiosarkom; osteosarkom; jukstakortikalni osteosarkom; hondrosarkom; hondroblastom, maligni; mezenhimalni hondrosarkom; tumor džinovskih ćelija kostiju; Juingov (Ewing) sarkom; odontogeni tumor, maligni; ameloblastični odontosarkom; ameloblastom, maligni; ameloblastični fibrosarkom; pinealom, maligni; hordom; gliom, maligni; ependimom; astrocitom; protoplazmatski astrocitom; fibrilarni astrocitom; astroblastom; glioblastom; oligodendrogliom; oligodendroblastom; primitivni neuroektodermalni; cerebelarni sarkom; ganglioneuroblastom; neuroblastom; retinoblastom; olfaktorni neurogeni tumor; meningiom, maligni; neurofibrosarkom; neurilemom, maligni; tumor granularnih ćelija, maligni; maligni limfom; Hodžkinovu (Hodgkin) bolest; Hodžkinov (Hodgkin) limfom; paragranulom; maligni limfom, malih limfocita; maligni limfom, velikih ćelija, difuzni; maligni limfom, folikularni; fungoidnu mikozu (mycosis fungoides); druge spefikovane ne-Hodžkinove (non-Hodgin) limfome; malignu histiocitozu; multipli mijelom; sarkom mastocita; imunoproliferativnu bolest tankog creva; leukemiju; limfoidnu leukemiju; leukemiju plazma ćelija; eritroleukemiju; limfosarkom ćelijska leukemija; mijeloidnu leukemiju; bazofilnu leukemiju; eozinofilnu leukemiju; monocitnu leukemiju; leukemiju mastocita; megakarioblastnu leukemiju; mijeloidni sarkom; i leukemiju vlasastih ćelija.
[0181] U izvesnim aspektima, antitelo, TCR ili CAR u farmaceutskoj kompoziciji koja se daje subjektu ima specifičnost vezivanja za epitop antigena povezan sa kancerom (npr., epitop eksprimiran od strane kancera na koji se deluje). Primeri antigena povezanih sa kancerom uključuju, ali nisu ograničeni na njih, adipofilin, AIM-2, ALDH1A1, alfa-aktinin-4, alfa-fetoprotein („AFP“), ARTC1, B-RAF, BAGE-1, BCLX (L), BCR-ABL fuzioni protein b3a2, beta-katenin, BING-4, CA-125, CALCA, karcinoembrionski antigen CASP-5, CASP-8, CD274, CD45, Cdc27, CDK12, CDK4, CDKN2A, CEA, CLPP, COA-1, CPSF, CSNK1A1, CTAG1, CTAG2, ciklin D1, ciklin-A1, dek-can fuzioni protein, DKK1, EFTUD2, elongacioni faktor 2, ENAH (hMena), Ep-CAM, EpCAM, EphA3, antigen epitelnog tumora („ETA“), fuzioni protein ETV6-AML1, EZH2, FGF5, FLT3-ITD, FN1, G250/MN/CAIX, GAGE-1,2,8, GAGE-3,4,5,6,7, GAS7, glipikan-3, GnTV, gp100/Pmel17, GPNMB, HAUS3, Hepsin, HER-2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A11, HLA-A2, HLA-DOB, hsp70-2, IDO1, IGF2B3, IL13Ralfa2, intestinalnu karboksil esterazu, K-RAS/K-ras, Kalikrein 4, KIF20A, KK-LC-1, KKLC1, KM-HN-1, KMHN1 takođe poznat kao CCDC110, LAGE-1, fuzioni protein LDLR-fukoziltransferazuAS, Lengsin, M-CSF, MAGE-A1, MAGEA10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-C1, MAGE-C2, jabučni enzim, mamaglobin-A, MART2, MATN, MC1R, MCSP, mdm-2, ME1, melan-A/MART-1, Meloe, Midkine, MMP-2, MMP-7, MUC1, MUC5AC, mucin, MUM-1, MUM-2, MUM-3, miozin, miozin klase I, N-raw, NA88-A, neo-PAP, NFYC, NY-BR-1, NY-ESO-1/LAGE-2, OA1, OGT, OS-9, P polipeptid, p53, PAP, PAX5, PBF, fuzioni protein pml-RARalfa, polimorfni epitelni mucin („PEM“), PPP1R3B, PRAME, PRDX5, PSA, PSMA, PTPRK, RAB38/NY-MEL-1, RAGE-1, RBAF600, RGS5, RhoC, RNF43, RU2AS, SAGE, secernin 1, SIRT2, SNRPD1, SOX10, Sp17, SPA17, SSX-2, SSX-4, STEAP1, survivin, fuzioni protein SYT-SSX1 ili -SSX2, TAG-1, TAG-2, telomerazu, TGF-betaRII, TPBG, TRAG-3, triosefosfat izomerazu, TRP-1/gp75, TRP-2, TRP2-INT2, tirozinazu, tirozinazu („TYR“), VEGF, WT1, XAGE-1b/GAGED2a. U nekim aspektima, antigen je neoantigen.
[0182] U izvesnim aspektima, ovde su obezbeđeni postupci lečenja subjekta koji pati od infekcije, uključujući virusnu infekciju, gljivičnu infekciju, bakterijsku infekciju, infekciju helmintima, ili infekciju protozoama, koji obuhvataju davanje subjektu ovde opisane farmaceutske kompozicije (npr., farmaceutske kompozicije koja obuhvata ovde opisane antitelo, TCR ili CAR dobijene iz ovde opisanih nehumanih životinja). Neograničavajući primeri virusnih infektivnih bolesti uključuju HPV, HBV, virus hepatitisa C (HCV), retroviruse kao što je virus humane imunodeficijencije (HIV-1 i HIV-2), herpes virusi kao što je Epštajn-Barov (Epstein Barr) virus (EBV), citomegalovirus (CMV), HSV-1 i HSV-2, i virus gripa. Neograničavajući primer parazitske infekcije je malarija. Neograničavajući primeri bakterijskih, gljivičnih i drugih patogenih bolesti uključuju Aspergillus, Brugia, Candida, Chlamydia, Coccidia, Cryptococcus, Dirofilaria, Gonococcus, Histoplasma, Leishmania, Mycobacterium, Mycoplasma, Paramecium, Pertussis, Plasmodium, Pneumococcus, Pneumocystis, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Toxoplasma i Vibriocholerae. Primeri vrsta uključuju Neisseria gonorrhea, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans, Candida tropicalis, Trichomonas vaginalis, Haemophilus vaginalis, Group B Streptococcus sp., Microplasma hominis, Hemophilus ducreyi, Granuloma inguinale, Lymphopathia venereum, Treponema pallidum, Brucella abortus. Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella canis, Campylobacter fetus, Campylobacter fetus intestinalis, Leptospira pomona, Listeria monocytogenes, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Trichomonas foetus, Toxoplasma gondii, Escherichia coli, Actinobacillus equuli, Salmonella abortus ovis, Salmonella abortus equi, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium equi, Corynebacterium pyogenes, Actinobaccilus seminis, Mycoplasma bovigenitalium, Aspergillus fumigatus, Absidia ramosa, Trypanosoma equiperdum, Babesia caballi, Clostridium tetani, Clostridium botulinum; ili, gljivicu, kao što je, npr., Paracoccidioides brasiliensis; ili drugi patogen, npr., Plasmodium falciparum.
[0183] U izvesnim aspektima, antitelo, TCR ili CAR u farmaceutskoj kompoziciji koja se daje subjektu imaju specifičnost vezivanja za epitop antigena koji se eksprimira od strane infektivnog patogena (npr., epitop eksprimiran od strane infektivnog patogena na koji se deluje).
[0184] U nekim aspektima, ovde je obezbeđen postupak lečenja zapaljenske bolesti, odbacivanja transplantacije kože ili organa, bolesti graft-protiv domaćina (graft-versus-host disease – GVHD), ili autoimune bolesti, koji obuhvata davanje subjektu ovde opisane farmaceutske kompozicije (npr., farmaceutske kompozicije koja obuhvata ovde opisane antitelo, TCR ili CAR dobijene iz ovde opisanih nehumanih životinja). Primeri autoimunih bolesti uključuju, na primer, glomerularni nefritis, artritis, bolest slična dilatiranoj kardiomiopatiji, ulcerozni kolitis, Sjogrenov (Sjogren) sindrom, Kronovu (Crohn) bolest, sistemske eritematoze, hronični reumatoidni artritis, multiplu sklerozu, psorijazu, alergijski kontaktni dermatitis, polimiozitis, zadebljanje kože (pachyderma), periarteritis nodoza, reumatsku groznicu, vitiligo vulgaris, insulin zavisni dijabetes melitus, Behčetovu (Behcet) bolest, Hašimotovu (Hashimoto) bolest, Adisonovu (Addison) bolest, dermatomiozitis, mijasteniju gravis, Rajterov (Reiter) sindrom, Grejvsovu (Graves) bolest, perniciozna anemija, Gudpasturov (Goodpasture) sindrom, bolest steriliteta, hronični aktivni hepatitis, pemfigus, autoimunu trombopenijsku purpuru, i autoimunu hemolitičku anemiju, aktivni hronični hepatitis, Adisonovu (Addison) bolest, antifosfolipidni sindrom, atopijsku alergiju, autoimuni atrofični gastritis, autoimunu ahlorhidriju, celijačnu bolest, Kušingov (Cushing) sindrom, dermatomiozitis, diskoidni lupus, eritematozus, Gudpasturov (Goodpasture) sindrom, Hašimotov (Hashimoto) tiroiditis, idiopatsku atrofiju nadbubrežne žlezde, idiopatsku trombocitopeniju, insulin zavisni dijabetes, Lambert-Itonov (Lambert-Eaton) sindrom, lupoidni hepatitis, neke slučajeve limfopenije, mešovitu bolest vezivnog tkiva, pemfigoid, pemfigus vulgaris, perniciozna anemija, fakogeni uveitis, poliarteritis nodoza, poliglandularne autosindrome, primarnu bilijarnu cirozu, primarni sklerozirajući holangitis, Rejnoov (Raynaud) sindrom, relapsni polihondritis, Šmitov (Schmidt) sindrom, ograničenu sklerodermu (ili CREST sindrom), simpatičku oftalmiju, sistemski lupus eritematozus, Takajasuov (Takayasu) arteritis, temporalni arteritis, tirotoksikozu, insulinsku rezistenciju tipa b, ulcerativni kolitis i Vegenerovu (Wegener) granulomatozu.
[0185] U izvesnim aspektima, antitelo, TCR ili CAR u farmaceutskoj kompoziciji koja se daje subjektu imaju specifičnost vezivanja za metu autoreaktivne T ćelije u bolesti koja se leči (npr., epitop na koji ciljaju autoreaktivne T ćelije u autoimunoj bolesti). Primeri proteina uključujući one na koje ciljaju T ćelije uključuju, na primer, p205, insulin, tiroidni stimulišući hormon, tirozinazu, TRP1, i mijelin.
[0186] Ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu se isporučivati bilo koji pogodnim putem davanja, uključujući oralno, nazalno, kao, na primer, sprejom, rektalno, intravaginalno, parenteralno, intracisternalno i topikalno, kao prahovima, mastima ili kapima, uključujući bukalno i sublingvalno. U izvesnim aspektima, farmaceutske kompozicije se isporučuju generalno (npr., putem oralnog ili parenteralnog davanja).
[0187] Stvarni nivoi doze aktivnih sastojaka u ovde opisanim farmaceutskim kompozicijama mogu se razlikovati tako da se dobije količina aktivnog sastojka koja je delotvorna za postizanje željenog terapijskog odgovora za posebnog pacijenta, kompoziciju i način davanja, a da pri tom nije toksična za pacijenta.
[0188] Izabran nivo doze zavisiće od različitih faktora uključujući aktivnost posebnog primenjenog sredstva, puta davanja, vremena davanja, brzine izlučivanja ili metabolizma posebnog sastojka koji se primenjuje, trajanja lečenja, drugih lekova, sastojaka i/ili materijala koji se upotrebljavaju u kombinaciji sa posebnim sastojkom koji se primenjuje, starosti, pola, mase, stanja, generalnog zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u oblastima medicinske struke.
[0189] U nekim aspektima, ovde opisani CAR i/ili TCR upotrebljavaju se za terapiju na bazi T ćelija. Na primer, u izvesnim aspektima, T ćelije koje eksprimiraju ovde opisane CAR i/ili TCR daju se subjektu kako bi se kod subjekta indukovao imunski odgovor na bazi T ćelija. Postupci korisni u terapiji na bazi T ćelija opisani su, na primer, u Schumacher Nat. Rev. Immunol. 2:512-519 (2002) i Bitton et al., Frontiers in Bioscience 4:d386-393
[0190] (1999).
[0191] U nekim aspektima, ovde je obezbeđen postupak indukovanja imunskog odgovra (npr., imunskog odgovora na bazi T ćelija) kod subjekta. U nekim aspektima, postupak uključuje davanje subjektu ćelije (npr., humane T ćelije, kao što je CD4 T ćelija ili CD8 T ćelija) koja eksprimira ovde opisane CAR ili TCR.
[0192] U nekim aspektima, subjekat je subjekat kome je to potrebno. U nekima aspektima, subjekat je subjekat sa kancerom ili subjekat zaražen patogenom. U nekim aspektima, peptid u peptid/MHC kompleksu koji prepoznaju CAR ili TCR jeste peptid antigena kancera ili peptid iz antigena eksprimiranog od strane infektivnog patogena.
[0193] U nekim aspektima, ovde je obezbeđen postupak inhibiranja imunskog odgovra kod subjekta. U nekim aspektima, postupak uključuje davanje subjektu regulatorne T ćelije (npr., CD4 , CD-25 i Foxp3 regulatorne T ćelije ili Treg17 T ćelije) koja eksprimira opisani CAR ili TCR.
[0194] U nekim aspektima, subjekt je subjekt kome je to potrebno, npr., subjekt sa autoimunom bolešću. U takvim aspektima, T ćelija je regulatorna T ćelija (tj., supresorska T ćelija) i peptid u peptid/MHC kompleksu koji prepoznaju TCR ili CAR jeste auto-antigen protiv koga u subjektu dolazi do autoimunskog odgovora.
Molekuli nukleinske kiseline
[0195] Ovde su obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju ovde opisana antitela, TCR receptora ili CAR receptore i/ili delove ovde opisanih antitela, TCR receptora i CAR receptora. U nekim izvođenjima, nukleinska kiselina kodira varijabilni domen ovde opisanog antitela, TCR ili CAR. Molekuli nukleinske kiseline mogu biti prisutni, na primer, u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišećenom ili suštinski čistom obliku.
[0196] U izvesnim aspektima, ovde su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisan polipeptid antitela, TCR i/ili CAR receptora ili njihov deo. Nukleinske kiseline mogu biti prisutne, na primer, u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Ovde opisane nukleinske kiseline mogu se dobiti standardnim tehnikama molekularne biologije. Na primer, ovde opisani molekuli nukleinske kiseline mogu se klonirati standardnim PCR tehnikama ili se sintetisati hemijski. Za nukleinske kiseline koje kodiraju CAR receptore, TCR receptore ili antitela eksprimirana od strane hibridoma, cDNK kiseline koje kodiraju svaki lanac antitela, TCR ili CAR receptora napravljene od strane hibridoma mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom ili tehnikama kloniranja cDNK.
[0197] U izvesnim aspektima, ovde su obezbeđeni vektori koji sadrže ovde opisane molekule nukleinske kiseline. Kako se upotrebljava ovde, termin „vektor“ se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. Jedan tip vektora je „plazmid“, koji se odnosi na cirkularna dvolančana DNK petilja u koju se dodatno segmenti DNK mogu vezati. Drugi tip vektora je virusni vektor, pri čemu se dodatni segmenti DNK mogu vezati u virusni genom. Izvesni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju se uvode (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni vektori sisara). Drugi vektori (npr. ne-epizomalni vektori sisara) mogu se integrisati u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina, i time se replicirati zajedno sa genomom domaćina. Povrh toga, izvesni vektori su sposobni za usmeravanje ekspresije gena. Na takve vektore se ovde poziva kao na „rekombinantne ekspresione vektore“ (ili prosto, „eskpresione vektore“).
[0198] U izvesnim aspektima, ovde su obezbeđene ćelije koje sadrže ovde opisanu nukleinsku kiselinu (npr., nukleinsku kiselinu koja kodira ovde opisane antitelo, TCR ili CAR ili njihov deo). Ćelija može biti, na primer, prokariotska, eukariotska, sisara, ptica, miševa i/ili humana. U izvesnim aspektima, ovde opisana nukleinska kiselina u operativnoj je vezi sa transkripcionim kontrolnim elementom kao što je promoter. U nekim aspektima, ćelija tranksribuje ovde opisanu nukleinsku kiselinu i time eksprimira ovde opisane antitelo, njegov fragment koji vezuje antigen ili polipeptid. Molekus nukleinske kiseline može biti integrisan u genom ćelije ili može biti ekstrahromozomski.
[0199] Ovde obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline mogu se dobiti standardnim tehnikama molekularne biologije. Na primer, ovde opisani molekuli nukelinske kiseline mogu se klonirati standardnim PCR tehnikama ili se sintetisati hemijski.
[0200] Za ovde opisane antitela i CAR nukleinske kiseline, pošto se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VHi VL segmente, tim fragmentima DNK može se dalje manipulisati standardnim rekombinantnim DNK tehnikama, na primer, za konvertovanje gena verijabilnog regiona u gene lanca antitela pune dužeine, u gene Fab fragmenata ili u gen scFv. U tim manipulacijama, fragment za kodiranje VLili VHu operativnoj je vezi sa drugim fragmentom DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibilni linker. Termin „u operativnoj vezi“, kako se upotrebljava u ovom kontekstu, predviđeno je da znači da se dva fragmenta DNK spajaju tako da sekvence aminokiselina kodirane od strane dva fragmenta DNK ostaju u okviru.
[0201] Izolovana DNK koja kodira varijabilni region teškog lanca može se konvertovati u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem DNK varijabilnog regiona teškog lanca sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (npr., CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena konstantnog regiona teškog lanca poznate su u oblasti tehnike (videti npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.
91-3242, ili Lefranc, The Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001) i fragmenti DNK koji obuhvataju te regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VHmože se operativno povezati sa drugim molekulom DNK koji kodira samo konstantni region CH1 teškog lanca.
[0202] Izolovana DNK koja kodria varijabilni region lakog lanca može se konvertovati u gen lakog lanca pune dužine (kao i u gen Fab lakog lanca) operativnim povezivanjem DNK koja kodira varijabilni region lakog lanca sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantni region lakog lanca. Sekvence gena konstantnog regiona humanog lakog lanca poznate su u oblasti tehnike (videti npr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, ili Lefranc, The Immunoglobulin Handbook, London: Academic Press 2001) i fragmenti DNK koji obuhvataju te regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti konstantni region kapa ili lambda.
PRIMERI
[0203] Pronalazak će dalje biti ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima. Primeri ne uključuju detaljne opise konvencionalnih postupaka koji bi bili dobro poznati osobi uobičajene stručnosti u oblasti tehnike (tehnike molekularnog kloniranja, itd.). Osim ako nije naznačeno drugačije, delovi su delovi mase, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je označena u Celzijusima, i pritisak je na nivou atmosferskog ili blizu njega.
Primer 1: Dobijanje miševa koji eksprimiraju humanu TdT
[0204] Miševi koji sadrže gen humane TdT, bilo kao nasumični transgen ili ciljan na kapa lokus
®
imunoglobulina, napravljeni su VELOCIGENE tehnologijom genetičkog inženjeringa (videti, npr., US Pat. No.6,586,251 i Valenzuela, D.M., et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659), pri čemu se humane sekvence izvedene iz BAC biblioteka bakterijskom homolognom rekombinacijom upotrebljavaju za pravljenje vektora sa velikim spektrom meta (large targeting vectors – LTVEC vektori) koji obuhvataju genomske fragmente lokusa humane TdT i, u slučaju TdT koja cilja u lokus IgK, uz koji se bočno sa obe strane nalaze ciljajući kraci za ciljanje LTVEC vektora u lokus IgK u ES ćelijama miša. LTVEC vektori su linearizovani i ® elektroporisani u liniju ES ćelija miša prema Valenzuela et al. ES ćelije su testirane pomoću testa TAQMAN da bi se odredio broj kopija svakog gena (za nasumično integrisane transgene) ili pravilno ciljanje u lokus IgK.
[0205] Alternativno, cDNK kratkog izooblika humane TdT (TdTS) sintetisana je de novo (Blue Heron Bio) i inkorporisana u ciljanje radi uvođenja u ES ćelije kao što je opisano iznad.
[0206] Ciljani klonovi ES ćelija uvedeni su u embrione miša na stupnju 8 ćelija (ili ranije) postupkom ®
VELOCIMOUSE (Poueymirou, W.T. et al. (2007). Miševi generacije F0 potpuno su izvedeni iz genski ciljanih embrionskih matičnih ćelija što omogućava neposredne fenotipske analize. Nat. Biotech. 25: 91-99).
®
VELOCIMICE (miševi F0 potpuno izvedeni iz donorske ES ćelije) koji nose humani lokus TdT identifikovani ®
su praćenjem pomoću testa TAQMAN u testu za dobijanje humanih alela (Valenzuela et al.). Mladunci F0 su genotipizirani i uzgojeni do homozigotnosti. Napravljeni su i fenotipizirani miševi homozigotni za humani lokus TdT. Kao što je posebno opisano u Primeru 1 dole, miševi koji sadrže humanu TdTS i nerearanžirane lokuse humanog varijabilnog lakog i teškog lanca stvoreni su uvođenjem nasumičnog ®
transgena humane TdTS ili ciljanjem humane TdTS u lokus IgK u VELOCIMMUNE miševima koji sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen. Međutim, barem za nasumično uveden transgen humane TdTS, takve životinje se takođe mogu dobiti prvo dobijanjem ES ćelija koje sadrže humanu TdTS kao što je opisano dole, dobijanjem miševa iz njih, i uzgajanjem miševa koji sadrže nasumično integrisan humani ®
lokus TdTS sa VELOCIMMUNE miševima koji sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen.
Primer 1.1. Dobijanje transgena koji eksprimira kratak izooblik humane TdT (TdTS) pod kontrolom regulatornih elemenata mišjeg Rag (Rag-TdT tg)
[0207] Ukratko, vektor sa širokim spektrom meta (LTVEC), prikazan detaljno na SL. 1, konstruisan je od mišjih i humanih BAC klonova u kojima mišji Rag2 gen (od ATG start kodona u egzonu 3 do TGA stop kodona u egzonu 3 zamenjen je genom humane terminalne dezoksinukleotidil transferaze (TdT ili DNTT) koji kodira samo kratak izooblik, TdTS (od ATG start kodona u egzonu 1 do ~0,5 kb 3’ polyA signala u egzonu 13). Mesta spajanja RNK TdT egzona 7 i 12 mutirana su da bi se sprečila ekspresija dugih izooblika (TdTL1 i L2). U istom LTVEC vektoru, mišji Rag1 gen od ATG start kodona u egzonu 2 do TAA stop kodona u egzonu 2 zamenjen je kodirajućom sekvencom pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP) i LacZ 3’UTR-polyA signal. LTVEC sadrži 130 kb ushodno regulatornih sekvenci 5’ mišjeg Rag2 gena i 8,8 kb ushodno regulatornih sekvenci 3’ mišjeg Rag1 gena, kao i 5,6 kb Rag2-Rag1 intergenskog regiona.
[0208] LTVEC je konstruisan od mišjeg BAC klona RP23-374f10 (Invitrogen/Life Technologies) koji sadrži gene Rag2 i Rag1, i humanog BAC klona RP11-1070o2 (Invitrogen/Life Technologies) koji sadrži gen TdT pomoću standardnih tehnika molekularne biologije i rekombinovanja kao što su PCR, restrikciona digestija/ligacija, Gibsonov izotermalni sklop (Gibson Isothermal Assembly), CRISPR/Cas9, bakterijska homologna rekombinacija, itd. Finalni LTVEC sadrži, od 5’ do 3’: (1) Loxp-pgkp-em7-neo-loxp selekcionu kasetu u ES ćelijama ili bakterijama, (2) 134.069 bp sekvence mišjeg genoma koja počinje 129.440 bp ushodno od egzona 1 Rag2 gena i završava se 25 bp od početka egzona 3 Rag2 gena (koordinate mišjeg genoma 2:101,495,278-101,629,347 na bazi GRCm38 sklopa), (3) 34.573 bp genomske sekvence humane TdT koja počinje u ATG start kodonu u egzonu 1 i završava se 514 bp 3’ polyA signala (koordinate humanog genoma 10:96,304,498-96,339,063 na bazi GRCh38 sklopa); u okviru gena humane TdT, donorsko mesto spajanja egzona 7 deletiran je i zamenjen NotI mestom kako bi se sprečilo eksprimiranje izooblika TdTL2, i akceptorsko mesto spajanja egzona 12 deletiran je kako bi se sprečilo eksprimiranje izooblika TdTL1 (detaljan opis dole), (4) AsiSI mesto; (5) 10.742 bp sekvence mišjeg genoma (GRCm38 genomske koordinate 2:101,630,931-101,641,672) koja sadrži 3’UTR egzona 3 Rag2 gena (1599 bp), intergenski region od 5753 bp Rag2/Rag1, i 3’UTR egzona 2 Rag1 gena (3390 bp), (6) FseI mesto, (7) minus lanac od 1.068 bp koji sadrži 249 bp polyA signala LacZ i 793 bp CDS EGFR, (8) 13.459 bp sekvence mišjeg genoma (GRCm38 koordinate 2:101,644,793-101,658,251) sa Rag1 na minus lancu, koja počinje u ATG start kodonu u egzonu 2 Rag1 gena i završava se 8.750 bp 3’ mesta početka transkripcije Rag1 gena, i (9) Em7-CM kasetu za selekciju u bakterijama (videti SL.1).
[0209] Detaljno, koraci kloniranja radi stvaranja dve modifikacije gena TdT kako bi se sprečilo alternativno spajanje upotrebljavajući TdT egzone 7 i 12 (koji se upotrebljavaju za pravljenje dugih izooblika TdTL2 i TdTL1, tim redom) dok i dalje omogućavaju spajanje transkripta koji kodira kratak izooblik TdTS konstruisani su od BAC klona RP11-1070o2 pomoću BHR i ligacije:
(1) 13 bp uključujući donorsko mesto spajanja egzona 7 (GTCGGGTCGTGGT (SEQ ID NO:1), donor spajanja istaknut) deletirani su i zamenjeni NotI mestom (GCGGCCGC (SEQ ID NO:2)). To je stvorilo SacII mesto preklapanja (CCGCGG (SEQ ID NO:3)), i
(2) akceptorsko mesto od 2 bp spajanja egzona 12 je deletirano.
[0210] Finalni LTVEC prikazan je na SL.1, sa približnim položajima različitih spojeva sekvenci označenim na slici. Spojevi su takođe sažeto prikazane u Tabeli 1 dole.
Tabela 1: Spojevi sekvenci LTVEC vektora Rag-TdT Tg
®
[0211] Finalni LTVEC je linearizovan i eletroporisan u VELOCIMMUNE ES ćelije koje sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen (videti, npr., U.S. Patent No.8,642,835). Nakon selektovanja sa Neo, ES ćelije ®
su testirane pomoću testa TAQMAN kako bi se odredio broj kopija transgena. Dobijene su ES ćelije koje sadrže jednu kopiju, dve kopije ili više kopija humanog Rag transgena TdT.
[0212] Mesto integrisanja transgena Rag-TdT određuje se postupcima poznatim u oblasti tehnike. Na primer, mesto integrisanja određuje se sekvenciranjem uparenih krajeva niske pokrivenosti celog genoma miša (Biblioteka sekvenciranja – Nextera DNA Library Preparation, Illumina; Sequence – Miseq, Illumina). Na primer, u jednom slučaju određeno je da Rag transgen TdT integrisan kao dve tandemske glava-rep kopije između koordinata 41130492 i 41130502 na hromozomu 1 (koordinate u GRCm38/mm10 sklopu), bez remećenja bilo kog kodirajućeg regiona.
Primer 1.2. Dobijanje ciljanog inserta kapa lokusa imunoglobulina kratkog izooblika humane TdT (TdTS) pod kontrolom regulatornih elemenata mišjeg Rag (Rag-TdT IgK)
[0213] Kako bi se dobio miš koji sadrži humanu TdT pod kontrolom Rag regulatornih elemenata u mišjem kapa lokusu imunoglobulina, mišji homologni krakovi IgK za rekombinovanje u ES ćelijama dodati su krajevima 5’ i 3’ konstrukta koji se generiše kao što je opisano u Primeru 1.1 i na SL. 1. Generalno, mišji krakovi IgK dodaju se: (1) modifikovanjem mišjeg IgK BAC bakterijskom homolognom rekombinacijom da bi se insertovala selekciona kaseta (npr., Hyg, Neo, itd.) uz koju se bočno sa obe strane nalaze I-CeuI i PI-SceI mesta restrikcionih enzima, i (2) insertovanjem konstrukta TdT u mišji IgK BAC pomoću I-CeuI i PI-SceI ligacije. Finalni LTVEC prikazan na SL.2.
[0214] Taj finalni LTVEC sadrži, od 5’ do 3’: (1) Spec kasetu za selekciju u bakterijama, (2) 5’ mišji homologni krak od 28591 bp (GRCm38 genomske koordinate 6:70,725,823-70,754,415) koji sadrži gen IgKc, IgK 3’ pojačivač, i 3’ rekombinujuću sekvencu (RS) IgK; krajeve mišjeg kraka ~2,6 kb 3’ RS, (3) PI-SceI mesto, (4) loxp-UbCpem7-hyg-loxp kasetu za selekciju u ES ćelijama ili bakterijama, (5) konstrukt opisan iznad u Primeru 1.1 i na SL.1 koji sadrži gene promoter Rag2 – humana TdTS i Rag1-EGFP, (6) I-CeuI mesto, (7) 3’ mišji homologni krak od 44.900 bp IgK (GRCm38 genomske koordinate 6:70,754,508-70,799,678), i (8) CM kasetu za selekciju u bakterijama.
[0215] Finalni LTVEC prikazan je na SL.2, sa približnim položajima spojeva različitih sekvenci označenim na slici. Spojevi su takođe sažeto prikazani u Tabeli 2 dole.
Tabela 2: Spojevi sekvenci LTVEC vektora Rag-TdT IgK
(nastavak)
®
[0216] Dobijeni LTVEC linearizovan je i elektroporisan u VELOCIMMUNE ES ćelije koje sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen (vidti, npr., U.S. Patent No. 8,642,835). Nakon selektovanja za otpornost na
®
Hyg, ES ćelije su testirane pomoću TAQMAN testa modifikacije alela (Valenzuela et al, supra) kako bi se identifikovali pravilno ciljani klonovi.
Primer 1.3. Dobijanje nasumičnog transgenog i ciljanog inserta kapa lokusa imunoglobulina kratkog izooblika humane TdT (TdTS), pri čemu su oba pod kotrolom mišjeg intronskog pojačivača teškog lanca imunoglobulina (Eμ) i mišjeg IgVH1-72 promotera (mIgH-Eμ-VH1-72-TdT tg i mIgH-Eμ-IH1-72-TdT IgK, tim redom)
[0217] Isti gen humane TdTS kakav je upotrebljen za pravljenje Rag-TdT u Primerima 1.1 i 1.2 (tj., od ATG start kodona do oko 514 bp 3’ polyA signala), stavljen je pod kontrolu mišjeg Eμ pojačivača od 689 bp i mišjeg IgVH1-72 promotera od 303 bp. Taj konstrukt bio je nasumično integrisan u mišji genom ili ciljan u lokus imunoglobulina K (IgK). Za ciljanu integraciju, gen je insertovan između istih 5’ i 3’ mišjih homolognih krakova IgK kao što je upotrebljeno za pravljenje LTVEC vektora u Primeru 1.2.
[0218] Određenije, finalni LTVEC sadrži, od 5’ do 3’ (SL.3): (1) Spec kasetu za selekciju u bakterijama, (2) 5’ mišji homologni krak od 28591 bp (GRCm38 genomske koordinate 6:70,725,823-70,754,415) koji sadrži gen konstantnog dela IgK (IgKC), 3’ pojačivač IgK, i 3’ rekombinujuću sekvencu (RS) IgK; krajeve mišjeg kraka ~2,6 kb 3’ RS, (3) I-CeuI mesto, (4) loxp-UbCp-em7-hyg-loxp kasetu u reverznoj orijentaciji za selekciju u ES ćelijama ili bakterijama, (5) isti gen od 34.573 bp humane TdTS upotrebljen u Primerima iznad u reverznoj orijentaciji, (6) mišji IgHV1-72 promoter od 303 bp u reverznoj orijentaciji (GRCm38 genomske koordinate 12:115,758,417-115,758,719), (7) mišji Eμ pojačivač od 689 bp (EcoRI-XbaI fragment, GRCm38 genomske koordinate 12:113,427,284-113,427,972) u reverznoj orijentaciji, (8) PI-SceI mesto, (9) 3’ mišji homologni krak od 44.900 bp IgK (GRCm38 genomske koordinate 6:70,754,508-70,799,678), i (10) CM kasetu za selekciju u bakterijama.
[0219] Približni položaji specifičnih spojeva sekvenci u finalnom vektoru prikazani su na SL. 3, a njihove sekvence označene u Tabeli 3 dole.
Tabela 3: Spojevi sekvenci LTVEC vektora mIgH-Eμ-VH1-72-TdT IgK
(nastavak)
®
[0220] Dobijeni LTVEC linearizovan je i elektroporisan u VELOCIMMUNE ES ćelije koje sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen (videti, npr., U.S. Patent No. 8,642,835). Nakon selektovanja za Hyg-®
rezistenciju, klonovi ES ćelija su testirani pomoću testa TAQMAN na pravilno ciljanje u mišji lokus IgK (za mIgH-Eμ-VH1-72-TdT IgK) ili na broj kopija transgena (za mIgH-Eμ-VH1-72-TdT tg).
Primer 1.4. Dobijanje ciljanog inserta kapa lokusa imunoglobulina kao i transgene humane TdTS iz cDNK TdTS
[0221] Alternativno, cDNK TdTS sintetiše se de novo (Blue Heron Bio) kao fragment od 3682 bp DNK i inkorporiše u ciljajući vektor za uvođenje u ES ćelije. Ciljajući vektor sadrži, od 5’ do 3’, PI-SceI mesto, mišji intronski pojačivač IgH (EcoRI-XbaI fragment) od 689 bp, mišji VH1-72 promoter od 303 bp, CDS humane TdTS (NCBI RefSeq NM_004088) od 1530 bp sa intronom 2 od 735 bp zadržan između egzona 2 i 3 za pojačavanje ekspresije posredovane intronom, humani TdT 3’ UTR/polyA signal od 340 bp, NotI i SalI mesta restrikcionog enzima za ligaciju u loxp-neo-loxp kaseti, i I-CeuI mesto. Vektor je insertovan između istih 5’ i 3’ mišjih homolognih krakova IgK kao što je upotrebljeno za pravljenje LTVEC vektora u Primeru 1.2 i svaki je ciljan u lokus IgK ili nasumično integrisan u genom miša.
®
[0222] Dobijeni LTVEC linearizovan je i elektroporisan u VELOCIMMUNE ES ćelije koje sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen (videti, npr., U.S. Patent No.8,642,835). Nakon selektovanja za Hyg-rezistenciju
®
klonovi ES ćelija su testirani pomoću testa TAQMAN na pravilno ciljanje na mišji lokus IgK (za ciljanu verziju IgK) ili na broj kopija transgena (za verziju transgena).
Primer 1.5. Miševi koji eksprimiraju humanu TdTS
[0223] Kao što je opisano iznad, nakon što su pravilno ciljane ES ćelije proizvedene, one se postupkom ®
VELOCIMOUSE uvode u u embrione miša na stupnju 8 ćelija (ili ranije), pri čemu su ti embrioni testirani u testu sticanja alela, i nakon toga uzgojeni do homozigotnosti. Heterozigotne ili homozigotne životinje eksprimiraju humanu TdTS kao i antitela koja obuhvataju humane varijabilne domene lakog i teškog lanca i mišje konstantne regione (budući da ti miševi sadrže humane varijabilne lake i teške genske segmente ®
imunoglobulina na endogenim lokusima IgK i IgH, tim redom: VELOCIMMUNE miševi).
[0224] Dobijeno je i testirano nekoliko verzija miševa sa humanom TdTS, i oni su uključivali nasumičnu transgenu TdTS i IgK ciljanu TdTS, pri čemu su i jedna i druga pod kontrolom Rag promotera i Eμ-VH1-72 regulatornih elemenata. Takođe su uključene verzije sa jednom, dve ili nekoliko kopija transgena TdTS; kao i verzije dobijene iz sekvenci genomske TdT i cDNK TdT. Ostali primeri prikazuju podatke dobijene sa miševima koji sadrže transgen Rag genomske TdTS (tandemska insercija dve kopije na hromozom 1, kao što je opisano u Primeru 1.1 iznad) i Eμ-VH1-72 genomsku TdTS ciljanu u lokus IgK (Primer 1.3).
[0225] Prvo, miševi se testiraju na ekspresiju TdT. PT-PCR je upotrebljen za amplifikovanje transkripta TdT
® ®
iz koštane srži miševa bilo VELOCIMMUNE kontrolne grupe, VELOCIMMUNE transgen Rag-genomske ®
TdTS, ili VELOCIMMUNE Eμ-VH1-72 genomska TdTS ciljana u lokus IgK. Ukupna RNK upotrebljena je za ®
reverznu transkripciju pomoću SUPESCRIPT III reverzne transkriptaze (Life Technologies) upotrebljavajući ™ ®
Oligo-dT prajmer. PCR je sprovedena pomoću SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, sa prajmerima za bilo beta aktin (kontrola), prajmerima osmišljenim da amplifikuju egzone 1-2, prajmerima osmišljenim da amplifikuju egzone 4-6, prajmerima osmišljenim da amplifikuju egzone 7-9, i prajmerima osmišljenim da amplifikuju egzone 9-11. Kao što je prikazano na SL. 4, prisustvo egzona humane TdT ® detektovano je u obe verzije miševa, dok je bila odsutna kod kontrolnih VELOCIMMUNE miševa.
Primer 2. Spojna raznolikost humanog imunoglobulina kapa kod miševa koji sadrže humanu TdTS
[0226] Da bi se procenila raznolikost sekvenci repertoara imunoglobulina u različitim modelima ®
VELOCIMMUNE miševa sa humanom TdTS opisanih iznad u Primeru 1, sekvence IgK amplifikovane su pomoću 5’ RACE iz slezina različitih miševa sa prajmerom konstantnog dela mIgK i sekvencirane pomoću Illumina MiSeq.
[0227] Određeno, B ćelije slezine su pozitivno obogaćene iz ukupnih splenocita magnetnim sortiranjem ®
ćelija pomoću antiCD19 (mišjih) magnetnih kuglica i kolona MACS (Miltenyi Biotech). Ukupna RNK izolovana je od prečišćenih B ćelija slezine upotrebljavajući RNeasy Plus kit za izolovanje RNK (Qiagen) prema uputstvima proizvođača. Reverzna transkripcija izvedena je da bi se dobila cDNK koja sadrži
™
sekvencu Igκ konstantnog regiona, upotrebljavajući SMARTer RACE kit za amplikaciju cDNK (Clontech) i prajmer specifičan za Igκ (Tabela 4). Tokom tog procesa, sekvenca DNK, koja je reverzno komplementarna 3’ sa prajmerom PE2-PIIA, pripojena je za 3’ kraj novosintetisanih cDNK. Prečišćene cDNK specifične za Igκ zatim su amplifikovane pomoću 1. kruga PCR upotrebljavajući prajmer PE2-PIIA i prajmer specifičan za konstantni Igκ koji su navedeni u Tabeli 4. Proizvodi PCR između 450–700 bp izolovani su pomoću Pippin Prep (SAGE Science). Ti proizvodi su dalje amplifikovani pomoću 2. kruga PCR upotrebljavajući prajmere navedene u Tabeli 4 („XXXXXX“ predstavlja indeks sekvence od 6 bp za omogućavanje multipleksiranja uzoraka za sekvenciranje). Proizvodi PCR između 400 bp – 700 bp izolovani su, prečišćeni i kvantifikovani pomoću qPCR upotrebljavajući kit za kvantifikaciju KAPA biblioteke (KAPA Biosystems) pre nanošenja na Miseq sekvencer (Illumina) za sekvenciranje pomoću Miseq kitova sa reagensima v3 (600 ciklusa).
Tabela 4: Prajmeri upotrebljeni u dobijanju biblioteke za sekvenciranje repertoara Igk
[0228] Za bioinformatičke analize, neobrađene Illumina sekvence su de-multiplesksirane i filtrirane na osnovu kvaliteta, dužine i savršenog podudaranja sa prajmerom kapa konstantnog regiona. Preklapajuća očitavanja uparenih krajeva spojena su i analizirana pomoću prilagođenog internog cevovoda. Cevovod je upotrebljavao lokalnu instalaciju IgBLAST (NCBI, v2.2.25+) za poravnavanje rearanžiranih sekvenci lakog lanca sa bazom podataka humanih germinativnih V i J gena. Smatrano je da su rearanžiranja produktivna ako nisu detektovani stop kodoni i ako je VJ spoj bio u okviru sa J segmentom. U suprotnom, rearanžiranja su smatrana neproduktivnim i isključena su iz analize.
[0229] CDR3 sekvence ekstrahovane su upotrebljavajući granice Međunarodnog imunogenetičkog informacionog sistema (IMGT). Spojni region između obeleženih V i J segmenata klasifikovan je kao P i N nukleotidi. Region sa N/P adicijama ekstrahovan je iz svake sekvence i izračunata je njegova dužina. Raznolikost repertoara antitela izračunata je analiziranjem jedinstvenih klonotipova. Raznolikost sekvenci definisana je kao broj jedinstvenih CDR3 sekvenci u nasumično izabranih 10.000 očitavanja.
[0230] SL.5 prikazuje da je u modelima miševa sa humanom TdTS detektovano do dvostruko povećanje u ®
broju jedinstvenih aminokiselinskih CDR3 sekvenci u poređenju sa VELOCIMMUNE miševima koji nisu sadržali humanu TdTS. Povećana raznolikost CDR3 uočena je i na nivou nukleotida (podaci nisu prikazani).
SL.5 pokazuje samo podatke dobijene sa miševima koji sadrže dve kopije Rag transgena genomske TdTS (Rag TdT Tg) i Eμ-VH1-72 genomsku TdTS ciljanu u lokus IgK (mIgH-Eμ-VH1-72 TdT IgK) (i homozigotne i heterozigotne verzije), dok su slični podaci dobijeni iz drugih verzija miševa (nije prikazano).
Primer 3. Povećanje broja negerminativnih adicija kod miševa koji sadrže humanu TdTS
[0231] Procenat negerminativnih nukleoditskih adicija u CDR3 (koji se sastoji od delova i Vκ i Jκ genskih segmenata) takođe je određen iz Sekvenciranja sledeće generacije (Next Generation Sequencing) opisanog u Primeru 2 iznad.
[0232] Kao što je prikazano na Sl.6, oko 45% humanihovanog kapa lakog lanca u B ćelijama pokazalo se da ima negerminativne adicije u obe verzije miševa sa humanizovanom TdTS u poređenju sa oko 10% kod ®
VELOCIMMUNE miševa koji sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen. Analiza sekvenci lakih lanaca imunoglobulina iz slezine pokazala je 0 do 8 nematričnih adicija u lakim lancima miševa sa humanom TdTS (8 na slici uključuje sekvence sa 8 ili više nematričnih adicija).
Primer 4. Dužine CDR3 humanog lakog lanca u imunoglobulinima dobijenim iz miševa sa humanom TdTS
[0233] CDR3 sekvence ekstrahovane su upotrebljavajući granice Međunarodnog imunogenetičkog informacionog sistema (IMGT). Nematrični nukleotidi određeni su na bazi poznatih V i J sekvenci lakog lanca.
[0234] Kao što je prikazano na SL.7A, povećanje u broju nematričnih adicija uočeno u dve verzije miševa sa humanom TdTS koja se opisuje u Primerima 2 i 3 iznad dovelo je do povećanja u dužinama CDR3 kapa ®
lakog lanca u poređenju sa kontrolnom grupom (VELOCIMMUNE miševima koji sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen). Kao što je prikazano na SL. 7B, analize sekvenci otkrile su da nema velike aktivnosti egzonukleaze koja utiče na brzine skraćivanja 5’ J kod Rag-TdTS miševa (ovde su prikazani samo ®
podaci za heterozigotne miševe) u poređenju sa kontrolnom grupom (VELOCIMMUNE miševima koji sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen).
Primer 5. Upotreba humanih Vκ i Jκ genskih segmenata lakog lanca kod miševa sa humanom TdTS
[0235] Kao što je prikazano na SL 8A i 8B, uvođenje humane TdTS u dve verzije miševa opisanih u Primerima 2 i 3 iznad nije značajno promenilo upotrebu bilo Vκ genskih segmenata ili Jκ genskih segmenata ®
u poređenju sa VELOCIMMUNE miševima koji sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen.
Primer 6. Spojna raznolikost u lokusu lambda lakog lanca imunoglobulina i drugim rearanžirajućim lokusima kod miševa koji sadrže humanu TdTS
[0236] Uz humani kapa lokus imunoglobulina, može se ispitivati raznolikost receeptora antigena na drugim lokusima iz limfocita B (λ lakog lanca, teškog lanca) i T (α/β).
®
[0237] Na primer, kada je C λ1-koji sadrži spojnu raznolikost lambda lakih lanaca kod VELOCIMMUNE ® miševa koji sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen upoređen sa istim VELOCIMMUNE miševima koji takođe sadrže transgene humane TdT opisane u Primeru 1 iznad upotrebljavajući isti postupak sekvenciranja kao što je opisano u Primeru 2 i prajmere navedene u Tabeli 5, uočena je povećana raznolikost sekvenci (oko dvostruka) u mišjem lmbda lokusu transgenih miševa (SL. 9). Uz to, uočili smo povećanu brzinu lambda nematričnih adicija mišjeg imunoglobulina (SL.10). Dužine CDR3 lambda lanaca kod TdT transgenih miševa prikazane su na SL.11. Najzad, nije uočena nikakva razlika u upotrebi mišjeg V lambda između različitih testiranih životinja (SL.12).
Tabela 5: Prajmeri upotrebljeni u dobijanju biblioteke za sekvenciranje repertorara IgL-C1
®
[0238] Dodatno, uz VELOCIMMUNE miševe koji sadrže nerearanžirane genske segmente humanog teškog i lakog lanca, uključujući one koji sadrže funkcionalan ektopičan mišji Adam6 gen kao što je opisano iznad (npr., U.S. Patent Nos. 8,878,001; 9,078,418; 9,125,386), ili miševe koji sadrže samo nerearanžirane varijabilne genske segmente humanog teškog lanca ili nerearanžirane varijabilne genske segmente humanog lakog lanca, mogu se dobijati druge životinje koje sadrže humanu TdTS. Neke takve životinje uključuju one koje sadrže humani lambda varijabilni region bilo u endogenom mišjem lambda ili kapa lokusu (US Patent Nos. 9,035,128; 9,066,502; 9,163,092; 9,120,662; 9,029,628; 9,006,511; 9,012,717), humani kapa varijabilni region u endogenom lokusu teškog lanca (npr., U.S. Patent Application Publication No. 2012/0096572), humanizovane TCR alfa i beta lokuse (npr., U.S. Patent No. 9,113,616) i njihove različite permutacije, miševe sa dvostrukim lakim lancem i njihove permutacije (US Patent Application Publication No. 2013/0198880), miševe sa univerzalnim lakim lancem i njihove permutacije (npr., US Patent Application Publication Nos.2011/0195454; 2013/018582), miševe sa univerzalnim teškim lancem i njihove permutacije (npr., US Patent No.9,204,624), miševe koji sadrže histidinske supstitucije u svom germinativnom genomu (npr., U.S. Patent Nos.9,334,334 and 9,301,510, US Patent Application Publication Nos. 2013/0247236, 2014/0013456), miševe sa himernim antigenskim receptorom (npr., US Patent Application Publication No. 2016/0081314), miševe kojima nedostaje CH1 domen (npr., US Patent No.
8,754,287 and US Patent Application Publication No.2015/0289489). Bilo koje takve životinje kod kojih se želi povećati spojna raznolikost bilo na lakom i/ili teškom lancu (npr., humanom lakom i/ili teškom lancu) mogu se dobijati uvođenjem u ES ćelije koje sadrže takve modifikacije bilo transgena ili ciljanog inserta humane TdTS opisanih ovde. U slučaju miševa dobijenih iz ES ćelija koje sadrže nasumično integrisane TdTS transgene (i u slučjevima kada lokus IgK nije bio modifikovan, npr., kod miševa sa humanizovanim TCR lokusima), mogu se takođe dobijati uzgajanjem sa miševima koji sadrže različite gore navedene modifikacije. Uspešno inkorporisanje TdTS alela u takve životinje određuje se onako kako je opisano ovde iznad, i efekat ekspresije humane TdTS na dobijanje spojne raznolikosti u različitim lokusima određuje se onako kako je opisano ovde iznad. Takođe se proučava delovanje na nemodifikovane rearanžirajuće lokuse, npr., endogene lokuse mišjeg imunoglobulina i lokuse T ćelija.
[0239] Jedan takav primer, u kome je proučavano delovanje uvođenja TdTs na spojnu raznolikost miševa sa dvostrukom lakim lancem, predstavljen je u Primerima 7–10 dole.
Primer 7. Spojna raznolikost humanog imunoglobulina kapa kod miševa sa dvostrukim lakim lancem (DLC) koji sadrže humanu TdTS
[0240] Miševi koji sadrže lokus dvostrukog lakog lanca i humanu TdTS dobijeni su uzgajanjem ®
VELOCIMMUNE miševa koji sadrže funkcionalan mišji Adam6 gen (videti U.S. Patent Nos. 8,642,835 i 8,697,940) i egzogenu humanu TdTS sa miševima koji sadrže lokus dvostrukog lakog lanca (videti U.S. Patent Application Publication Number US 2013/0198880).
[0241] Za procenu raznolikosti sekvenci repertoara imunoglobulina kod DLC miševa sa humanom TdTS koji imaju ograničene Igκ lokuse koji sadrže samo dva nerearanžirana Vκgenska segmenta: IGVK3-20 i IGVK1-39, i pet nerearanžiranih IGJK genskih segmenata (videti U.S. Patent Application Publication Number US2013/0198880), sekvence Igκ amplifikovane su pomoću 5’ RACE iz slezine različitih miševa sa prajmerom konstantnog dela mIgK i sekvencirane pomoću Illumina MiSeq. U većini eksperimenata, upotrebljeno je nekoliko miševa heterozigotnih za Rag TdT Tg i homozigotnih za DLC lokus (Rag TdT tg (HET) DLC) i dva miša homozigotna za Rag TdT Tg i homozigotna za DLC lokus (Rag TdT tg (HO) DLC); podatak za Rag TdT tg (HET) DLC prikazan je kao prosek svih testiranih miševa, dok su dva TdT tg (HO) DLC miša prikazana pojedinačno.
[0242] Određeno, B ćelije slezine pozitivno su obogaćene iz ukupnih splenocita magnetnim sortiranjem ®
ćelija pomoću antiCD19 (mišjih) magnetnih kuglica i kolona MACS (Miltenyi Biotech). Ukupna RNK izolovana je iz prečišćenih B ćelija slezine pomoću RNeasy Plus kita za izolovanje RNK (Qiagen) prema uputstvima proizvođača. Za dobijanje cDNK koja sadrži sekvencu Igκ konstantnog regiona izvedena je
™
reverzna transkripcija, upotrebljavajući SMARTer RACE kit za amplifikaciju cDNK (Clontech) i prajmer specifičan za Igκ (Tabela 4). Tokom tih procesa, sekvenca DNK, koja je reverzno komplementarna sa 3’ prajmerom PE2-PIIA, pripojena je za 3’ kraj novosintetisanih cDNK. Prečišćene cDNK specifične za Igκ zatim su amplifikovane pomoću 1. kruga PCR upotrebljavajući prajmer PE2-PIIA i prajmer specifičan za konstantni Igκ navedene u Tabeli 4. Proizvodi PCR između 450–700 bp izolovani su pomoću Pippin Prep (SAGE Science). Ti proizvodi su dalje amplifikovani pomoću 2. kruga PCR upotrebljavajući prajmere navedene u Tabeli 4 („XXXXXX“ predstavlja indeks sekvence od 6 bp za omogućavanje multipleksiranja uzoraka za sekvenciranje). Proizvodi PCR između 400 bp – 700 bp izolovani su, prečišćeni i kvantifikovani pomoću qPCR upotrebljavajući Kit za kvantifikaciju KAPA biblioteke (KAPA Biosystems) pre nanošenja na Miseq sekvencer (Illumina) za sekvenciranje upotrebljavajući Miseq kitove sa reagensima v3 (600 ciklusa).
[0243] Za bioinformatičke analize, neobrađene Illumina sekvence demultipleksirane su i filtrirane na osnovu kvaliteta, dužine i savršenog podudaranja sa prajmerom kapa konstantnog regiona. Preklapajuća očitavanja uparenih krajeva spojena su i analizirana pomoću prilagođenog internog cevovoda. Cevovod je upotrebljavao lokalnu instalaciju IgBLAST (NCBI, v2.2.25+) za poravnavanje rearanžiranih sekvenci lakog lanca sa bazom podataka humanih germinativnih V i J gena. Smatrano je da su rearanžiranja produktivna ako nisu detektovani nikakvi stop kodoni i ako je VJ spoj bio u okviru sa J segmentom. U suprotnom, rearanžiranja su smatrana neproduktivnim i isključena su iz analize.
[0244] CDR3 sekvence ekstrahovane su upotrebljavajući granice Međunarodnog imunogenetičkog informacionog sistema (IMGT). Spojni region između obeleženih V i J segmenata klasifikovan je kao nukleotidi P i N (nematrične adicije). Region sa adicijama N/P ekstrahovan je iz svake sekvence i izračunata je njegova dužina. Raznolikost repertoara antitela izračunata je analiziranjem jedinstvenih klonotipova. Raznolikost sekvenci definisana je kao broj jedinstvenih CDR3 sekvenci u nasumično izabranih 10.000 očitavanja.
[0245] SL. 13 prikazuje da je više nego dvostruko povećanje broja jedinstvenih aminokiselinskih CDR3 sekvenci detektovano u modelima DLC miševa sa humanom TdTS u poređenju sa DLC miševima koji nisu sadržali uvedenu humanu TdTS.
Primer 8. Povećanje broja negerminativnih adicija kod DLC miševa koji sadrže humanu TdTS
[0246] Procenat negerminativnih adicija nukleotida u CDR3 (koji se sastoji od delova i Vκ i Jκ genskih segmenata) u imunoglobulinskim sekvencama DLC miševa sa TdT takođe je određen iz Sekvenciranja sledeće generacije opisanog u Primeru 7 iznad.
[0247] Kao što je prikazano na SL.14, pokazalo se da oko pola humanizovanih kapa lakih lanaca u B ćelijama imaju negerminativne adicije kod DLC miševa sa humanizovanom TdTS (i HET i HO za TdT) u poređenju sa oko 10% kod kontrolnih DLC miševa (DLC miševa u koje nije uvedena humana TdT).
Primer 9. Dužine CDR3 humanog lakog lanca u imunoglobulinima dobijenim iz DLC miševa koji sadrže humanu TdTS
[0248] CDR3 sekvence ekstrahovane su upotrebljavajući granice Međunarodnog imunogenetičkog informacionog sistema (IMGT). Nematrični nukleotidi određeni su iz poznatih sekvenci lakog lanca V i J.
[0249] Kao što je prikazano na SL. 15, povećanje u broju nematričnih adicija uočeno kod opisanih DLC miševa sa humanizovanom TdTS (i HET i HO) dovelo je do povećanja u dužini CDR3 kapa lakog lanca u poređenju sa kontrolnom grupom (DLC miševima u koje nije uvedena humana TdT).
Primer 10. Vκ humanog lakog lanca i upotreba genska segmenta Jκ kod DLC miševa koji sadrže humanu TdTS
[0250] Kao što je prikazano na SL. 16, uvođenje humane TdTS u DLC miševe nije znatno promenilo upotrebu bilo genskih Vκ segmenata ili Jκ genskih segmenata u poređenju sa kontrolnim DLC miševima (DLC miševima u koje nije uvedena humana TdT).
Sequence Listing Information:
DTD Version: V1_3
File Name: Sequence Listing N415221EP-A.xml
Software Name: WIPO Sequence
Software Version: 2.2.0
Production Date: 2023-01-11
General Information:
Current application / IP Office: EP
Current application / Application number: EP23151094.2
Current application / Filing date: 2017-06-02
Current application / Applicant file reference: N415221EP-A
Earliest priority application / IP Office: US
Earliest priority application / Application number: 62/345,524
Earliest priority application / Filing date: 2016-06-03
Applicant name: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
Applicant name / Language: en
Invention title: NON-HUMAN ANIMALS EXPRESSING EXOGENOUS TERMINAL DEOXYNUCLEOTIDYLTRANSFERASE ( en )
Sequence Total Quantity: 25
Sequences:
Sequence Number (ID): 1
Length: 13
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..13
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
gtcgggtcgt ggt 13
Sequence Number (ID): 2
Residues:
000
Sequence Number (ID): 3
Residues:
000
Sequence Number (ID): 4
Length: 99
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..99
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
tattgcgttt ttttaatcct ttcagataaa agacctattc acaatcaaaa atggatccac 60 cacgagcgtc ccacttgagc cctcggaaga agagacccc 99
Sequence Number (ID): 5
Length: 108
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, ..
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
gccctggctg agggaaattt tggaactccc aggctccaga cccattcttt gcgatcgctt 60 tagcaaaagc ccctcagact caggtatatt gctctctgaa tctacttt 108 Sequence Number (ID): 6
Length: 107
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..107
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
ccaaaggaaa acacattggc aaataccaac ttctatgtgg agatcctatg gccggccggg 60 gatccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaac 107 Sequence Number (ID): 7
Length: 100
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..100
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
tcgaccagga tgggcaccac cccggtgaac agctcctcgc ccttgctcac catgttggct 60 aagctacctg ggaacaatgg gggggggggg gggagtcaag 100 Sequence Number (ID): 8
Length: 139
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..139
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
catccttaca tctttgtcat cccctgtatc aacatggaaa ggcattaatg atctatgtcg 60 ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggcaa ccggtataac ttcgtataat gtatgctata 120 cgaagttata tgcatggcc 139
Sequence Number (ID): 9
Length: 100
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..100
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg tcgacctcga gggggggccc acctccagct 60 gccttacaga aaagcaaatg cttgcttgca acaatcacct 100 Sequence Number (ID): 10
Length: 99
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..99
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
tattgcgttt ttttaatcct ttcagataaa agacctattc acaatcaaaa atggatccac 60 cacgagcgtc ccacttgagc cctcggaaga agagacccc 99
Sequence Number (ID): 11
Length: 108
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..108
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
gccctggctg agggaaattt tggaactccc aggctccaga cccattcttt gcgatcgctt 60 tagcaaaagc ccctcagact caggtatatt gctctctgaa tctacttt 108
Sequence Number (ID): 12
Length: 108
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..108
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
cccaaaggaa aacacattgg caaataccaa cttctatgtg gagatcctat ggccggccgg 60 ggatccagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaac 108
Sequence Number (ID): 13
Length: 100
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..100
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
tcgaccagga tgggcaccac cccggtgaac agctcctcgc ccttgctcac catgttggct 60 aagctacctg ggaacaatgg gggggggggg gggagtcaag 100
Sequence Number (ID): 14
Length: 151
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..151
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
acctctgctg tgtctgcaag tttggcttgt tcctgcttct gatttttggg tctagacccc 60 cgggctcgat aactataacg gtcctaaggt agcgactcga gcataaccac tttcctgcta 120 tggatctgtt aaatatccgc caaaggccaa g 151
Sequence Number (ID): 15
Length: 126
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..126
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
catccttaca tctttgtcat cccctgtatc aacatggaaa ggcattaatg tcgctacctt 60 aggaccgtta tagttaggcc ccccctcgag gtcgacataa cttcgtatag catacattat 120 acgaag 126
Sequence Number (ID): 16
Length: 100
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..100
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
ggccatgcat ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataccggt aaagaatggg 60 tctggagcct gggagttcca aaatttccct cagccagggc 100
Sequence Number (ID): 17
Length: 100
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..100
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
cggggtctct tcttccgagg gctcaagtgg gacgctcgtg gtggatccat ggtgaggtcc 60 tgtgtgctca gtaactgtaa agagaacagt gatctcatgt 100
Sequence Number (ID): 18
Length: 146
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..146
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
tagtttcccc aaacttaagt ttatcgactt ctaaaatgta tttagaattc tgccatttca 60 ttacctcttt ctccgcaccc gacatagata aagcttcata accactttcc tgctatggat 120 ctgttaaata tccgccaaag gccaag 146
Sequence Number (ID): 19
Length: 22
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..22
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
aagaagcaca cgactgaggc ac 22
Sequence Number (ID): 20
Length: 55
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..55
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggaagat ggatacagtt ggtgc 55 Sequence Number (ID): 21
Length: 57
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..57
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctaagcag tggtatcaac gcagagt 57 Sequence Number (ID): 22
Length: 68
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..68
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnacact ctttccctac acgacgctct 60 tccgatct 68
Sequence Number (ID): 23
Length: 64
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..64
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60 atct 64
Sequence Number (ID): 24
Length: 24
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..24
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
caccagtgtg gccttgttag tctc 24
Sequence Number (ID): 25
Length: 57
Molecule Type: DNA
Features Location/Qualifiers:
- source, 1..57
> mol_type, other DNA
> organism, synthetic construct
Residues:
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctaaggtgg aaacagggtg actgatg 57 END

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Postupak za dobijanje antitela koje je specifično za antigen, pri čemu postupak sadrži izlaganje antigenu genetički modifikovanog glodara, pri čemu genetički modifikovani glodar u svom genomu sadrži:
sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu terminalnu dezoksinuleotidil transferazu (TdT) u operativnoj vezi sa transkripcionim kontrolnim elementom koji vodi ekspresiju sekvence nukleinske kiseline koja kodira humanu TdT u pre-B ćelijama; i
humani varijabilni region imunoglobulina koji obuhvata nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona imunoglobulina, pri čemu je humani varijabilni region imunoglobulina u operativnoj vezi sa konstantnim regionom imunoglobulina.
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, pri čemu postupak dalje sadrži:
(a) dobijanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen imunoglobulina antitela iz glodara
(b) operativno vezivanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen imunoglobulina antitela za sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humani konstantni domen imunoglobulina u ćeliji domaćinu; i
(c) kultivisanje ćelije domaćina pod uslovima tako da ćelija domaćin eksprimira humano antitelo koje sadrži varijabilni domen imunoglobulina i konstantni domen imunoglobulina.
3. Postupak prema patentnom zahtevu 2, gde:
(a) varijabilni domen imunoglobulina je varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina i konstantni domen imunoglobulina je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina; i/ili (b) varijabilni domen imunoglobulina je varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina i konstantni domen imunoglobulina je konstantni domen lakog lanca imunoglobulina.
4. Postupak za dobijanje nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina specifičan za antigen i/ili humani varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina koji je specifičan za antigen, gde postupak sadrži:
(a) izlaganje genetički modifikovanog glodara antigenu, gde genetički genetički modifikovani glodar u svom genomu sadrži:
sekvencu nukleinske kiseline koja kodira humanu Terminalnu Deoksinukleotidiltransferazu (TdT) u operativnoj vezi sa elementom za kontrolu transkripcije koji pokreće ekspresiju sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju humanu TdT u pre-B ćelijama; i
humani varijabilni region imunoglobulina koji sadrži nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona imunoglobulina, gde humani varijabilni region imunoglobulina je u operativnoj vezi sa konstantnim regionom imunoglobulina; i
(b) dobijanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina specifičan za antigen i/ili humani varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina specifičan za antigen iz glodara.
5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, pri čemu element za kontrolu transkripcije:
(i) pokreće ekspresiju sekvence nukleinske kiseline koja kodira humanu TdT u pro-B ćelijama i pre-B ćelijama; i/ili
(ii) je odabran iz grupe koja se sastoji iz RAG1 transkripcionog kontrolnog elementa, RAG2 transkripcionog kontrolnog elementa, kontrolnog elementa transkripcije teškog lanca imunoglobulina, kontrolnog elementa transkripcije κ lakog lanca imunoglobulina i/ili kontrolnog elementa transkripcije λ lakog lanca imunoglobulina.
6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, gde humana TdT nije konstitutivno eksprimirana.
7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humanu TdT je locirana u lokusu κ lakog lanca imunoglobulina, lokusu λ lakog lanca imunoglobulina, lokusu teškog lanca imunoglobulina, RAG1 lokusu, ili RAG2 lokusu.
8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, gde humani varijabilni region imunoglobulina je humani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži nerearanžirane humane V, D, i J genske segmente teškog lanca imunoglobulina i gen konstantnog regiona imunoglobulina je konstantni region teškog lanca imunoglobulina.
9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, gde:
(i) gen konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je poreklom iz endogene vrste; i/ili (ii) humani varijabilni region teškog lanca imunoglobulina i gen konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina se nalaze na lokusu teškog lanca endogenog imunoglobulina.
10. Postupak prema patentnom zahtevu 8 ili 9, koji dalje sadrži u svom genomu humani varijabilni region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži nerearanžirane genske segmente humanog varijabilnog regiona lakog lanca u operativnoj vezi sa konstantnim regionom lakog lanca imunoglobulina, opciono gde varijabilni region lakog lanca imunoglobulina u operativnoj vezi sa konstantnim regionom imunoglobulina se nalazi na lokusu lakog lanca endogenog imunoglobulina.
11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, gde
(i) humani varijabilni region lakog lanca imunoglobulina sadrži genske segmente humanog varijabilnog regiona κ lanca;
(ii) konstantni region lakog lanca imunoglobulina je κ konstantni region imunoglobulina;
(iii) konstantni region lakog lanca imunoglobulina je κ konstantni region imunoglobulina poreklom iz endogene vrste; i/ili
(iv) humani varijabilni region lakog lanca imunoglobulina i konstantni region lakog lanca imunoglobulina se nalaze na κ lokusu lakog lanca endogenog imunoglobulina.
12. Postupak prema patentnom zahtevu 10, gde:
(i) humani varijabilni region lakog lanca imunoglobulina sadrži genske segmente humanog varijabilnog regiona λ lanca;
(ii) konstantni region lakog lanca imunoglobulina je λ konstantni region imunoglobulina;
(iii) konstantni region lakog lanca imunoglobulina je λ konstantni region imunoglobulina poreklom iz endogene vrste; i/ili
(iv) humani varijabilni region lakog lanca imunoglobulina i konstantni region lakog lanca imunoglobulina se nalaze na λ lokusu lakog lanca endogenog imunoglobulina.
13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 12, gde nerearanžirani genski segmenti humanog varijabilnog regiona imunoglobulina prolaze kroz rearanžman u toku razvoja B ćelija da se dobiju rearanžirani humani varijabilni regioni imunoglobulina u B ćelijama ne-humane životinje, opciono gde: (i) bar 10% rearanžiranih gena varijabilnog regiona čine nematrične adicije; i/ili (ii) bar 10% spojeva V-J lakog lanca imunoglobulina u životinji čine nematrične adicije.
14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 13, pri čemu je glodar pacov ili miš, opciono gde je glodar miš.
15. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu je humana TdT kratak izooblik TdT (TdTS).
RS20250364A 2016-06-03 2017-06-02 Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu RS66700B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662345524P 2016-06-03 2016-06-03
EP23151094.2A EP4218408B1 (en) 2016-06-03 2017-06-02 Rodents expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66700B1 true RS66700B1 (sr) 2025-05-30

Family

ID=59215996

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250364A RS66700B1 (sr) 2016-06-03 2017-06-02 Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu
RS20230395A RS64216B1 (sr) 2016-06-03 2017-06-02 Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230395A RS64216B1 (sr) 2016-06-03 2017-06-02 Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu

Country Status (26)

Country Link
US (3) US10980221B2 (sr)
EP (3) EP4567104A3 (sr)
JP (4) JP7053499B2 (sr)
KR (3) KR102598120B1 (sr)
CN (3) CN109640644B (sr)
AU (2) AU2017272337C1 (sr)
BR (1) BR112018074794A2 (sr)
CA (1) CA3026088A1 (sr)
CY (1) CY1126063T1 (sr)
DK (2) DK3462853T3 (sr)
ES (2) ES2941810T3 (sr)
FI (2) FI4218408T3 (sr)
HR (2) HRP20230497T1 (sr)
HU (2) HUE061619T2 (sr)
IL (2) IL263160B2 (sr)
LT (2) LT4218408T (sr)
MX (3) MX385681B (sr)
NZ (1) NZ788750A (sr)
PL (2) PL4218408T3 (sr)
PT (2) PT4218408T (sr)
RS (2) RS66700B1 (sr)
RU (1) RU2753585C2 (sr)
SG (2) SG11201810757YA (sr)
SI (2) SI3462853T1 (sr)
SM (2) SMT202500152T1 (sr)
WO (1) WO2017210586A1 (sr)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2958937T3 (en) 2013-02-22 2018-11-26 Regeneron Pharma Mice expressing humanized major histocompatibility complex
RS66700B1 (sr) 2016-06-03 2025-05-30 Regeneron Pharma Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu
ES2928995T3 (es) 2017-12-05 2022-11-24 Regeneron Pharma Ratones que tienen una cadena ligera lambda de inmunoglobulina genomanipulada y usos de los mismos
SMT202500038T1 (it) * 2018-03-24 2025-03-12 Regeneron Pharma Topi o ratti geneticamente modificati per la generazione di anticorpi terapeutici contro complessi peptide-mhc, metodi di produzione e loro utilizzo
US20210238312A1 (en) * 2018-06-13 2021-08-05 The Children's Medical Center Corporation Methods and compositions relating to high-throughput models for antibody discovery and/or optimization
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
AU2020226865A1 (en) * 2019-02-22 2021-07-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
CA3136478A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a limited lambda light chain repertoire expressed from the kappa locus and uses thereof
CA3161087A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Dna Script Chimeric terminal deoxynucleotidyl transferases for template-free enzymatic synthesis of polynucleotides
CN111057754B (zh) * 2019-12-27 2021-01-12 四川省医学科学院.四川省人民医院实验动物研究所 鉴定适用于hbv研究的动物模型的方法和应用
CA3169272A1 (en) 2020-01-28 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
CA3167557A1 (en) * 2020-04-21 2021-10-28 Davor Frleta Non-human animals having a humanized cxcl13 gene
AU2021342159A1 (en) 2020-09-11 2023-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
CN116848254A (zh) 2020-12-16 2023-10-03 瑞泽恩制药公司 表达人源化Fcα受体的小鼠
MX2023007401A (es) 2020-12-23 2023-07-06 Regeneron Pharma Acidos nucleicos que codifican anticuerpos modificados por anclaje y usos de los mismos.
CN118511853A (zh) 2021-03-31 2024-08-20 瑞泽恩制药公司 包含具有改善的tcrb组库多样性的人源化细胞免疫系统组分的基因修饰的小鼠
CA3265746A1 (en) * 2022-09-22 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. GENETICALLY MODIFIED MICE EXPRESSING COMPONENTS OF A HUMAN CELLULAR IMMUNE SYSTEM
WO2025185669A1 (en) * 2024-03-05 2025-09-12 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric trbc
NL2037811B1 (en) 2024-05-29 2025-12-12 Univ Oslo Treatment for Cancer
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof

Family Cites Families (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
DK0463151T3 (da) 1990-01-12 1996-07-01 Cell Genesys Inc Frembringelse af xenogene antistoffer
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
GB9119338D0 (en) 1991-09-10 1991-10-23 Inst Of Animal Physiology And Control of gene expression
US5523226A (en) * 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
US6001349A (en) 1995-02-22 1999-12-14 Therion Biologics Corporation Generation of human cytotoxic T-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US7001614B2 (en) 1996-08-19 2006-02-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
US6770291B2 (en) 1996-08-30 2004-08-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
US7112338B2 (en) 1997-03-12 2006-09-26 The Regents Of The University Of California Cationic liposome delivery of taxanes to angiogenic blood vessels
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US6749863B1 (en) 1997-11-19 2004-06-15 Georgetown University Targeted liposome gene delivery
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
WO2002076196A1 (en) 2001-03-22 2002-10-03 Abbott Gmbh & Co. Kg Transgenic animals expressing antibodies specific for genes of interest and uses thereof
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20090042291A1 (en) 2002-03-01 2009-02-12 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
JP2006514549A (ja) 2002-12-16 2006-05-11 アメリカ合衆国 Ｉｌ−１５を発現する組換えワクチンウイルスおよびその使用方法
EP1590453B1 (en) 2003-01-28 2013-11-27 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
US8218805B2 (en) 2003-10-11 2012-07-10 Charles Hornback Wireless speaker system for use with ceiling fans
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
WO2005116072A2 (en) 2004-05-27 2005-12-08 Weidanz Jon A Antibodies as t cell receptor mimics, methods of production and uses thereof
PT1802193E (pt) 2004-10-19 2014-06-23 Regeneron Pharma Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética
EP1810035A4 (en) 2004-11-10 2010-03-17 Macrogenics Inc GENERATION OF FC ANTIBODY REGIONS FOR EFFECTOR FUNCTION
US20060222653A1 (en) 2004-11-12 2006-10-05 Xencor, Inc. Antibodies operably linked to selected chemoattractants
WO2006076594A2 (en) 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc. Antibodies and fc fusion proteins with altered immunogenicity
CN102443058A (zh) * 2005-08-03 2012-05-09 人类多克隆治疗股份有限公司 表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制
WO2007022520A2 (en) 2005-08-19 2007-02-22 Cerus Corporation Antibody-mediated enhancement of immune response
EP4332227B1 (en) 2005-08-23 2026-02-11 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
US7910798B2 (en) 2006-03-31 2011-03-22 Medarex, Inc. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
SG10201509853UA (en) 2007-06-01 2015-12-30 Omt Inc Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies
KR20160065985A (ko) 2007-10-18 2016-06-09 버베리안 노딕 에이/에스 전립선 암 치료를 위한 ｍｖａ의 용도
US8225343B2 (en) 2008-01-11 2012-07-17 Sony Computer Entertainment America Llc Gesture cataloging and recognition
SG10201914027VA (en) * 2008-06-27 2020-03-30 Merus Nv Antibody producing non-human mammals
KR101826224B1 (ko) 2008-09-30 2018-02-06 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
US8691502B2 (en) 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
NZ597481A (en) 2009-07-08 2013-10-25 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
SG181477A1 (en) * 2009-12-10 2012-07-30 Regeneron Pharma Mice that make heavy chain antibodies
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
NZ631363A (en) 2010-02-08 2016-05-27 Regeneron Pharma Common light chain mouse
US20130185821A1 (en) 2010-02-08 2013-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20120021409A1 (en) 2010-02-08 2012-01-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Common Light Chain Mouse
CN102971340A (zh) 2010-03-29 2013-03-13 酵活有限公司 具有增强的或抑制的效应子功能的抗体
NZ601171A (en) 2010-03-31 2014-11-28 Ablexis Llc Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies
PL2480676T3 (pl) 2010-06-22 2016-10-31 Mysz wykazująca ekspresję hybrydowego łańcucha lekkiego immunoglobuliny
US10881084B2 (en) 2010-07-26 2021-01-05 Trianni, Inc Transgenic animals and methods of use
NZ707327A (en) 2010-08-02 2017-01-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
JP2014507137A (ja) 2011-02-25 2014-03-27 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ａｄａｍ６マウス
JP5893258B2 (ja) 2011-03-31 2016-03-23 フェリカネットワークス株式会社 情報処理装置および方法、並びにプログラム
US20130018582A1 (en) 2011-07-13 2013-01-17 Miller Paul A Inertial Navigation Common Azimuth Reference Determination System and Method
LT3572517T (lt) 2011-08-05 2021-04-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizuotos universalios lengvosios grandinės pelės
EP3839049A3 (en) * 2011-09-19 2021-10-20 Kymab Limited Antibodies, variable domains & chains tailored for human use
CA2791109C (en) 2011-09-26 2021-02-16 Merus B.V. Generation of binding molecules
SI3216871T1 (sl) 2011-10-17 2022-04-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miš z omejeno težko verigo imunoglobulina
KR102295746B1 (ko) 2011-10-28 2021-09-01 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 유전자 변형된 주요 조직적합성 복합체 마우스
HUE033400T2 (en) 2011-10-28 2017-12-28 Regeneron Pharma Humanized IL-6 and IL-6 receptor
LT3590332T (lt) 2011-10-28 2022-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetiškai modifikuotos pelės, ekspresuojančios chimerines pagrindinio audinių dermės komplekso (mhc) ii molekules
US9591835B2 (en) 2011-10-28 2017-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
US9043996B2 (en) 2011-10-28 2015-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
US9113616B2 (en) 2011-10-28 2015-08-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice having humanized TCR variable genes
HUE056462T2 (hu) 2011-11-04 2022-02-28 Zymeworks Inc Stabil heterodimer antestest tervezés mutációkkal az FC domainben
US9120662B2 (en) 2011-11-14 2015-09-01 Susan A. Thomson Gathering and dispensing scoop with gate valve
US9547499B2 (en) 2011-12-09 2017-01-17 Microsoft Technology Licensing, Llc Device configuration with cached pre-assembled driver state
DK2825037T3 (da) 2012-03-16 2019-07-29 Regeneron Pharma Gnavere, der udtrykker pH-sensitive immunoglobulinsekvenser
HK1200271A1 (en) * 2012-03-16 2015-08-07 瑞泽恩制药公司 Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
SMT201800229T1 (it) 2012-03-16 2018-07-17 Regeneron Pharma Anticorpi a catena leggera ingegnerizzati con istidina e roditori modificati geneticamente per la generazione degli stessi
JP5920830B2 (ja) 2012-09-28 2016-05-18 シスメックス株式会社 試料調製装置および細胞分析装置
EP2931030B2 (en) 2012-12-14 2024-01-17 OmniAb, Inc. Polynucleotides encoding rodent antibodies with human idiotypes and animals comprising same
US20140245468A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
JP6444895B2 (ja) 2013-02-20 2018-12-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ヒト化ｔ細胞補助受容体を発現するマウス
DK2958937T3 (en) 2013-02-22 2018-11-26 Regeneron Pharma Mice expressing humanized major histocompatibility complex
SI2986729T1 (sl) 2013-04-16 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ciljana sprememba genoma podgane
US9783618B2 (en) * 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
CN110951779B (zh) 2013-12-11 2024-04-16 瑞泽恩制药公司 用于靶向修饰基因组的方法和组合物
EP3895528A1 (en) 2014-03-21 2021-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
KR20160131118A (ko) 2014-03-21 2016-11-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상이한 결합 특징을 전시하는 vl 항원 결합 단백질
DK3152312T3 (da) 2014-06-06 2020-04-06 Regeneron Pharma Fremgangsmåder og sammensætninger til modifikation af et mållocus
BR112016029650A2 (pt) * 2014-06-19 2017-10-24 Regeneron Pharma roedor, polipeptídeo pd-1, célula isolada ou tecido de roedor, célula-tronco embrionária de roedor, métodos de produzir um roedor, de reduzir o crescimento de tumor em um roedor, de matar células tumorais em um roedor e de avaliar as propriedades farmacocinéticas de uma droga que direciona pd-1 humano, e, modelo de tumor de roedor?
ES2666179T3 (es) 2014-06-23 2018-05-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Montaje de ADN mediado por nucleasas
JP6752158B2 (ja) 2014-06-26 2020-09-09 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物、並びに使用方法
CA2959428A1 (en) 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
PT3280257T (pt) 2015-04-06 2023-09-12 Regeneron Pharma Respostas imunes mediadas por células t humanizadas em animais não humanos
RS66700B1 (sr) 2016-06-03 2025-05-30 Regeneron Pharma Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu

Also Published As

Publication number Publication date
FI4218408T3 (fi) 2025-04-25
RU2753585C2 (ru) 2021-08-18
CN113907043B (zh) 2023-08-01
NZ749707A (en) 2024-04-26
RU2018144954A3 (sr) 2020-10-02
US10980221B2 (en) 2021-04-20
SMT202500152T1 (it) 2025-05-12
US20250386808A1 (en) 2025-12-25
JP7805430B2 (ja) 2026-01-23
US20170347633A1 (en) 2017-12-07
EP4218408B1 (en) 2025-03-19
IL263160B1 (en) 2023-09-01
WO2017210586A8 (en) 2018-05-03
KR20230156162A (ko) 2023-11-13
NZ788750A (en) 2025-12-19
JP2022088597A (ja) 2022-06-14
MX2018014982A (es) 2019-09-18
MX2021010352A (es) 2021-10-22
LT3462853T (lt) 2023-03-27
AU2017272337B9 (en) 2023-12-14
RU2018144954A (ru) 2020-07-14
FI3462853T3 (fi) 2023-04-05
PL4218408T3 (pl) 2025-06-09
JP2025020339A (ja) 2025-02-12
RS64216B1 (sr) 2023-06-30
PT3462853T (pt) 2023-04-21
MX385681B (es) 2025-03-18
BR112018074794A2 (pt) 2019-03-12
US12295354B2 (en) 2025-05-13
CN116458475A (zh) 2023-07-21
IL304839A (en) 2023-09-01
HUE071052T2 (hu) 2025-07-28
JP7586960B2 (ja) 2024-11-19
PT4218408T (pt) 2025-03-26
PL3462853T3 (pl) 2023-06-26
AU2017272337B2 (en) 2023-11-09
SI3462853T1 (sl) 2023-05-31
IL263160B2 (en) 2024-01-01
WO2017210586A1 (en) 2017-12-07
SI4218408T1 (sl) 2025-06-30
KR102483193B1 (ko) 2023-01-04
JP7053499B2 (ja) 2022-04-12
CN109640644A (zh) 2019-04-16
EP4567104A3 (en) 2025-09-24
CN113907043A (zh) 2022-01-11
AU2017272337A1 (en) 2019-01-24
EP3462853A1 (en) 2019-04-10
MX2021010351A (es) 2021-10-13
US20210195877A1 (en) 2021-07-01
DK3462853T3 (da) 2023-04-03
CN109640644B (zh) 2021-10-26
HRP20250471T1 (hr) 2025-06-06
SG10201914014XA (en) 2020-03-30
JP2019521668A (ja) 2019-08-08
AU2017272337A8 (en) 2019-03-14
JP2023093729A (ja) 2023-07-04
SMT202300132T1 (it) 2023-05-12
KR102784608B1 (ko) 2025-03-27
SG11201810757YA (en) 2018-12-28
HUE061619T2 (hu) 2023-07-28
IL263160A (en) 2018-12-31
CY1126063T1 (el) 2023-11-15
KR20190031447A (ko) 2019-03-26
EP3462853B1 (en) 2023-03-01
EP4218408A1 (en) 2023-08-02
LT4218408T (lt) 2025-05-12
DK4218408T3 (da) 2025-04-14
EP4567104A2 (en) 2025-06-11
KR102598120B1 (ko) 2023-11-07
AU2017272337C1 (en) 2024-02-29
JP7274018B2 (ja) 2023-05-15
HRP20230497T1 (hr) 2023-07-21
AU2024200577A1 (en) 2024-02-22
CA3026088A1 (en) 2017-12-07
ES3018427T3 (es) 2025-05-16
ES2941810T3 (es) 2023-05-25
KR20230006053A (ko) 2023-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7586960B2 (ja) 外因性ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを発現する非ヒト動物
US20160081314A1 (en) Chimeric Antigen Receptors
HK40097136B (en) Rodents expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
HK40097136A (en) Rodents expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
HK40126474A (en) Rodents expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
RU2848049C1 (ru) Животные, не являющиеся человеком, экспрессирующие экзогенную терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу
HK1262655A1 (en) Rodents expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
HK1262655B (en) Rodents expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
NZ788749A (en) Non-human animals expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase