[go: up one dir, main page]

RS58606B1 - Konjugat koji sadrži oksintomodulin i imunoglobulinski fragment, i njegova upotreba - Google Patents

Konjugat koji sadrži oksintomodulin i imunoglobulinski fragment, i njegova upotreba

Info

Publication number
RS58606B1
RS58606B1 RS20190079A RSP20190079A RS58606B1 RS 58606 B1 RS58606 B1 RS 58606B1 RS 20190079 A RS20190079 A RS 20190079A RS P20190079 A RSP20190079 A RS P20190079A RS 58606 B1 RS58606 B1 RS 58606B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oxyntomodulin
immunoglobulin
seq
region
conjugate according
Prior art date
Application number
RS20190079A
Other languages
English (en)
Inventor
Sung Youb Jung
Dae Jin Kim
Sung Hee Park
Young Eun Woo
In Young Choi
Se Chang Kwon
Original Assignee
Hanmi Science Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47357296&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58606(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hanmi Science Co Ltd filed Critical Hanmi Science Co Ltd
Publication of RS58606B1 publication Critical patent/RS58606B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
Oblast tehnike
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na konjugat koji sadrži oksintomodulin i imunoglobulinski fragment i njegovu upotrebu. Određenije, ovaj pronalazak se odnosi na konjugat koji sadrži oksintomodulin, imunoglobulinski Fc region, i ne-peptidil polimer gde se konjugat može dobiti kovalentnim vezivanjem oksintomodulina za Fc region preko ne-peptidnog polimera, i farmaceutske kompozicije za prevenciju ili tretman gojaznosti koji sadrži konjugat.
Stanje tehnike
[0002] Od nedavno, ekonomski rast i promene u načinu života dovode do promena u navikama ishrane. Glavni uzroci porasta stope prekomerne tezine i gojaznosti kod savremenih ljudi su konzumiranje visokokalorične hrane kao što je brza hrana i nedostatak vežbanja. Svetska zdravstvena organizacija (SZO) procenjuje da više od 1 milijarde ljudi širom sveta ima prekomernu težinu i najmanje 300 miliona njih je klinički gojazno. Tačnije, 250.000 ljudi umire svake godine u Evropi i više od 2.5 miliona ljudi širom sveta umire svake godine kao rezultat prekomerne težine (Svetska zdravstvena organizacija, Globalna strategija o ishrani, fizičkoj aktivnosti i zdravlju, 2004).
[0003] Prekomerna težina i gojaznost poveć avaju krvni pritisak i nivo holesterola i tako izazivaju pojavu ili pogoršanje različitih bolesti kao što su kardiovaskularne bolesti, dijabetes i artritis, a takođe su glavni uzroci poveć anja učestalosti arterioskleroze, hipertenzije, hiperlipidemije ili kardiovaskularnih bolesti kod dece ili adolescenata kao i kod odraslih.
[0004] Gojaznost je teško stanje koje uzrokuje razne bolesti širom sveta. Smatra se da se prevazilazi ličnim naporima, a takođe se veruje da gojaznim pacijentima nedostaje samokontrola. Međutim, lečiti gojaznost je teško, jer je gojaznost složen poremeć aj koji uključuje regulaciju apetita i energetski metabolizam. Za lečenje gojaznosti, abnormalne aktivnosti povezane sa regulacijom apetita i energetskim metabolizmom treba lečiti zajedno sa naporima gojaznih pacijenata. Napravljeno je mnogo pokušaja da se razviju lekovi koji su sposobni da leče te abnormalne aktivnosti. Kao rezultat ovih napora, razvijeni su lekovi kao što su Rimonabant (Sanofi-Aventis), Sibutramin (Abbott), Contrave (Takeda) i Orlistat (Roche), ali oni imaju nedostatke ozbiljnih neželjenih efekata ili veoma slabih anti-gojaznost efekata. Na primer, zabeleženo je da Rimonabant (Sanofi-Aventis) pokazuje nuspojavu centralnog nervnog poremeć aja, Sibutramin ( Abbott) i Contrave (Takeda) pokazuju kardiovaskularne nuspojave, a Orlistat (Roche) pokazuje samo 4 kg gubitka težine kada se uzima za jednu godinu. Nažalost, ne postoje terapeutski agensi za gojaznost koji se mogu bezbedno prepisati za gojazne pacijente.
[0005] Mnoge studije su napravljene da bi se razvili terapeutski agensi za gojaznost koji nemaju probleme konvencionalnih lekova protiv gojaznosti. Od nedavno derivati glukagona privlače mnogo pažnje. Glukagon se proizvodi u pankreasu kada nivo glukoze u krvi padne kao rezultat drugih lekova ili bolesti, hormonskih ili enzimskih nedostataka. Glukagon stimuliše razgradnju glikogena u jetri i olakšava oslobađanje glukoze u cilju poveć anja nivoa glukoze u krvi do normalnog opsega. Pored efekta poveć anja nivoa glukoze u krvi, glukagon suzbija apetit i aktivira hormon-osetljivu lipazu (HOL) adipocita da olakša lipolizu, čime se pokazuju efekti protiv gojaznosti. Jedan od derivata glukagona, glukagonu sličan peptid-1 (GLP-1) se razvija kao terapeutski agens za hiperglikemiju kod pacijenata sa dijabetesom, i funkcioniše tako da stimuliše sintezu i sekreciju insulina, inhibira sekreciju glukagona, usporava pražnjenje želuca, poveć ava iskoriš ć avanje glukoze i inhibira unos hrane. Eksendin-4 je izolovan iz otrova guštera koji deli približno 50% aminokiselinske homologije sa GLP-1 i takođe je zabeleženo da aktivira GLP-1 receptor, čime se poboljšava hiperglikemija kod pacijenata sa dijabetesom. Međutim, navodi se da lekovi protiv gojaznosti uključujuć i GLP-1 da pokazuju nuspojave kao što su povra ć anje i mučnina.
[0006] Kao alternativa GLP-1, stoga, velika pažnja je usmerena na oksintomodulin, peptid izveden iz glukagonskog prekursora, pre-glukagon koji se vezuje za receptore dva peptida, GLP-1 i glukagona. Oksintomodulin predstavlja moć nu terapiju protiv gojaznosti, jer inhibira unos hrane kao što je GLP-1, stvara zasić enost i ima lipolitičku aktivnost kao što je glukagon.
[0007] Zasnovano na dvostrukoj funkciji oksintomodulin peptida, aktivno je proučavan kao lek za lečenje gojaznosti. Na primer, korejski patent br. 925017 opisuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje oksintomodulin kao aktivni sastojak za lečenje ljudi sa prekomernom težinom, koji se ordinira oralnim, parenteralnim, mukoznim, rektalnim, subkutanim ili transdermalnim putem. Međutim, objavljeno je da ovaj lek protiv gojaznosti, uključujuć i oksintomodulin, ima kratak in vivo poluživot i slabu terapeutsku efikasnost, iako se primenjuje u visokoj dozi tri puta dnevno. Prema tome, učinjeno je mnogo napora da se poboljša in vivo poluživot ili terapijski efekat oksintomodulina na gojaznost njegovom modifikacijom.
[0008] Na primer, dvostruki agonist oksintomodulin (Merck) se priprema zamenom L-serina sa D-serinom na poziciji 2 oksintomodulina da se poveć a otpornost na dipeptidil peptidazu-IV (DPP-IV) i da se vezivanjem holesterol ostatka na C-terminal pove ć a poluživot krvi u isto vreme. ZP2929 (Zeland) se priprema supstituisanjem L-serina sa D-serinom na poziciji 2 da bi se poveć ala rezistencija na DPP-IV, zamenom arginina alaninom na poziciji 17 da se pove ć a otpornost na proteazu, zamenom metionina sa lizinom na poziciji 27 da se poboljša oksidativna stabilnost i zamenom glutamina asparaginskom kiselinom i alaninom na pozicijama 20 i 24 i asparaginom sa serinom na poziciji 28 da se poboljša stabilnost deamidacije. Međutim, iako je poluživot dualnog agonista oksintomodulina (Merck) poboljšan tako da pokazuje poluživot 8-12 minuta duže nego nativni oksintomodulin, on još uvek ima veoma kratak in vivo poluživot od 1,7 sati i njegova doza koja se daje je takođe visoka nekoliko mg/kg. Drugi postupci za poveć anje poluživota peptidnih lekova, kao što su PEG-konjugati ili PEG-imunoglobulinski Fc konjugati su takođe predloženi (WO 2010/107256 A2). Dalji derivati oksintomodulina za lečenje dijabetesa i gojaznosti su opisani u WO 2007/100535 A2. Nažalost, oksintomodulin ili njegovi derivati imaju nedostatke dnevne primene visoke doze zbog kratkog poluživota i niske efikasnosti.
Otkriće Pronalaska
Tehnički Problem
[0009] U skladu sa tim, ovi pronalazači su uložili mnogo napora da razviju metod za poveć anje poluživota krvi oksintomodulina uz održavanje njegove aktivnosti in vivo. Kao rezultat, otkrili su da konjugat pripremljen povezivanjem nosača sa oksintomodulinom koristeć i ne-peptidilni polimer pokazuje poboljšani poluživot krvi uz održavanje aktivnosti in vivo tako da pokazuje odlične efekte protiv gojaznosti, čime se dovršava ovaj pronalazak.
Rešenje Problema
[0010] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi konjugat koji sadrži derivat oksintomodulina koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR: 24, 25 ili 26, imunoglobulinski Fc region, i ne-peptidil polimer pri čemu ne-peptidilni polimer kovalentno povezuje derivat oksintomodulina i imunoglobulinski Fc region.
[0011] Drugi cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi farmaceutsku kompoziciju za prevenciju ili lečenje gojaznosti, koja sadrži konjugate.
[0012] Još jedan cilj ovog pronalaska je da obezbedi pomenuti konjugat ili pomenutu farmaceutsku kompoziciju za upotrebu u prevenciji ili lečenju gojaznosti.
[0013] Dalji ciljevi ovog pronalaska nalaze se u zavisnim patentnim zahtevima.
Povoljni efekti pronalaska
[0014] Konjugat koji sadrži oksintomodulin i imunoglobulinski Fc iz predmetnog pronalaska smanjuje unos hrane, suzbija pražnjenje želuca i olakšava lipolizu bez sporednih efekata, za razliku od nativnog oksintomodulina, i takođe pokazuje odlične efekte aktiviranja receptora i dugoročnu održivost, u poređenju sa oksintomodulinom. Prema tome, može se na širokom polju koristiti u lečenju gojaznosti uz bezbednost i efikasnost. Za razliku od nativnog oksintomodulina, novi peptid iz ovog pronalaska smanjuje unos hrane, potiskuje želudačno pražnjenje i olakšava lipolizu bez nuspojava, a takođe pokazuje odlične efekte aktiviranja receptora. Prema tome, može se široko koristiti u lečenju gojaznosti uz bezbednost i efikasnost. Konjugati koji sadrže derivate oksintomodulina prema pronalasku su oni koji se odnose na SEK ID BR: 24, 25 i 26. Ostali derivati oksintomodulina ili varijante koje su predstavljene su predstavljene samo referencom.
Kratak Opis Crteža
[0015]
SLIKA 1 je grafikon koji prikazuje promene u unosu hrane prema dozama oksintomodulina ili derivata oksintomodulina SLIKA 2a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog oksintomodulina kroz kolonu za pročiš ć avanje SOURCE S.
SLIKA 2b je grafikon koji prikazuje rezultat mapiranja peptida pročiš ć enog mono-PEGilovanog oksintomodulina.
SLIKA 2c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i oksintomodulin i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q.
SLIKA 3a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 29) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
SLIKA 3b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 29) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q.
SLIKA 4a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 30) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
SLIKA 4b je grafikon koji prikazuje rezultat mapiranja peptida pročišć enog mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR.30).
SLIKA 4c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 30) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q.
SLIKA 5a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 31) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
SLIKA 5b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 31) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q.
SLIKA 6a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 2) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
SLIKA 6b je grafikon koji prikazuje rezultat mapiranja peptida pročišć enog mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR.2).
SLIKA 6c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 2) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q.
SLIKA 6d je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 2) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Source ISO.
SLIKA 7a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 3) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
SLIKA 7b je grafikon koji prikazuje rezultat mapiranja peptida pročišć enog mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR.3).
SLIKA 7c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 3) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Butil FF.
SLIKA 7d je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 3) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Source 15Q.
SLIKA 8a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 23) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S;
SLIKA 8b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 23) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Source 15Q;
SLIKA 8c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 23) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE ISO;
SLIKA 9a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 24) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S;
SLIKA 9b je grafikon koji prikazuje rezultat konjugata za pročišć avanje uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 24) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Source 15Q;
SLIKA 9c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 24) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE ISO;
SLIKA 10a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR.25) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S;
SLIKA 10b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 25) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Source 15Q;
SLIKA 10c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 25) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE ISO;
SLIKA 11a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR.28) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S;
SLIKA 11b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 28) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Source 15Q;
SLIKA 11c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 28) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE ISO;
SLIKA 12 je grafikon koji pokazuje promene telesne težine miševa u skladu sa tipom i datom dozom konjugata derivata oksintomodulina - imunoglobulinskog Fc.
SLIKA 13 je grafikon koji pokazuje promene telesne težine miševa u skladu sa tipom i datom dozom konjugata derivata oksintomodulina - imunoglobulinskog Fc.
Najbolji način za Izvođenje Pronalaska
[0016] U jednom aspektu za postizanje gore navedenih ciljeva, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži oksintomodulin, imunoglobulinski Fc region, i ne-peptidil polimer, gde se konjugat može dobiti kovalentnim vezivanjem oksintomodulina za imunoglobulinski Fc region preko ne-peptidil polimera.
[0017] Kako se ovde koristi, termin "konjugat" označava konjugat koji sadrži oksintomodulin i druge faktore. Drugi faktori mogu biti bilo koja supstanca koja može izazvati poveć anu stabilnost u krvi, suspendovati emisiju kroz bubreg ili druge korisne efekte. U predmetnom pronalasku, faktori mogu biti imunoglobulinski Fc regioni. Poželjno, konjugat se može sastojati od oksintomodulina i imunoglobulinskog Fc regiona, koji su povezani ne-peptidnim polimerom. Ne-peptidilni polimer može povezati oksintomodulin i imunoglobulinski Fc region preko kovalentnih veza. Dva završna kraja ne-peptidilnog polimera mogu biti povezana sa aminskom grupom ili tiolnom grupom imunoglobulinskog Fc regiona i derivata oksintomodulina.
[0018] Konjugat predmetnog pronalaska treba da ima poboljšano in-vivo trajanje efikasnosti, u poređenju sa nativnim oksintomodulinom, i konjugat dugog dejstva može uključiti oksintomodulin pripremljen modifikacijom, supstitucijom, dodavanjem ili delecijom aminokiselinskih sekvenci nativnog oksintomodulina, oksintomodulin konjugovan sa biorazgradivim polimerom kao što je polietilen glikol (PEG), oksintomodulin konjugovan sa proteinom dugog dejstva kao što je albumin ili imunoglobulin, oksintomodulin konjugovan sa masnom kiselinom koja ima sposobnost vezivanja za albumin u telu, ili oksintomodulin inkapsuliran u biorazgradive nanočestice, ali tip konjugata dugog dejstva nije ograničen na njih.
[0019] Izraz "oksintomodulin" označava peptid izveden iz glukagonskog prekursora, pre-glukagona, i uključuje nativni oksintomodulin, prekursore, derivate, njihove fragmente i njihove varijante. Na primer, može imati aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR.1 (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA).
[0020] Izraz "varijanta oksintomodulina" je peptid koji ima jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju od onih iz nativnog oksintomodulina, i označava peptid koji zadržava funkciju aktiviranja GLP-1 i glukagon receptora, i može biti pripremljen bilo kojom supstitucijom, dodavanjem, delecijom i modifikacijom ili njihovom kombinacijom u delu aminokiselinskih sekvenci nativnog oksintomodulina.
[0021] Termin "derivat oksintomodulina" uključuje peptide, derivate peptida ili peptidne mimetike koji su pripremljeni dodavanjem, delecijom ili supstitucijom aminokiselina oksintomodulina tako da aktiviraju i GLP-1 receptor i glukagon receptor na visokom nivou, u poređenju sa nativnim oksintomodulinom.
[0022] Termin "fragment oksintomodulina" označava fragment koji ima jednu ili više aminokiselina koje se dodaju ili brišu na N-kraju ili na C-kraju nativnog oksintomodulina, u kome aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi (na primer, aminokiseline D-tipa) ) mogu da se dodaju, i ima funkciju aktiviranja i GLP-1 receptora i glukagon receptora.
[0023] Svaki od postupaka pripreme varijanti, derivata i fragmenata oksintomodulina se moze koristiti pojedinačno ili u kombinaciji. Na primer, predmetni pronalazak obuhvata peptid koji ima jednu ili više aminokiselina koje se razlikuju od onih iz nativnog peptida i deaminacije ostatka aminokiseline N-terminala, i ima funkciju aktiviranja i GLP-1 receptora i glukagon receptora.
[0024] Ovde pomenute aminokiseline su skrać ene prema pravilu nomenklature IUPAC-IUB kako sledi:
Alanin A Arginin R
Asparagin N Asparaginska kiselina D
Cistein C Glutaminska kiselina E
Glutamin Q Glicin G
Histidin H Izoleucin I
Leucin L Lizin K
Metionin M Fenilalanin F
Prolin P Serin S
Treonin T Triptofan W
Tirozin Y Valin V
[0025] Pokazani su oksitomodulinski peptidi koji su pripremljeni supstitucijama, adicijama, delecijama ili post-translacionim modifikacijama (npr. metilacija, acilacija, ubikvitinacija, intramolekulska kovalentna veza) u aminokiselinskoj sekvenci oksintomodulina (HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA, SEK ID BR. 1) tako da se aktiviraju glukagon i GLP-1 receptori u isto vreme. Nakon supstitucije ili adicije aminokiselina, može se koristiti bilo koja od 20 aminokiselina koje se obično nalaze u humanim proteinima, kao i atipične ili ne-prirodne amino kiseline. Komercijalno dostupni izvori atipičnih amino kiselina uključuju Sigma-Aldrich, ChemPep Inc. i Genzyme Pharmaceuticals. Peptidi koji uključuju ove amino kiseline i atipične peptidne sekvence mogu biti sintetizovani i kupljeni od komercijalnih dobavljača, na primer, American Peptide Company ili Bachem (USA) ili Anygen (Koreja).
[0026] Na primer, derivat oksintomodulina uključuje amino kiseline dole prikazane Formule 1.
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-X23-X24-R2 (Formula 1)
gde je R1 histidin, desamino-histidil, dimetil-histidil (N-dimetil-histidil), beta-hidroksiimidazopropionil, 4-imidazoacetil, beta-karboksi imidazopropionil ili tirozin;
X1 je Aib (aminoso-buterna kiselina), d-alanin, glicin, Sar (N-metilglicin), serin ili d-serin;
X2 je glutaminska kiselina ili glutamin;
X3 je leucin ili tirozin;
X4 je serin ili alanin;
X5 je lizin ili arginin;
X6 je glutamin ili tirozin;
X7 je leucin ili metionin;
X8 je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina;
X9 je glutaminska kiselina, serin, alfa-metil-glutaminska kiselina ili se briše;
X10 je glutamin, glutaminska kiselina, lizin, arginin, serin ili se briše;
X11 je alanin, arginin, valin ili se briše;
X12 je alanin, arginin, serin, valin ili se briše;
X13 je lizin, glutamin, arginin, alfa-metil-glutaminska kiselina ili se briše;
X14 je asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, leucin ili se briše;
X15 je fenilalanin ili se briše;
X16 je izoleucin, valin ili se briše;
X17 je alanin, cistein, glutaminska kiselina, lizin, glutamin, alfa-metil-glutaminska kiselina ili se briše;
X18 je triptofan ili se briše;
X19 je alanin, izoleucin, leucin, serin, valin ili se briše;
X20 je alanin, lizin, metionin, glutamin, arginin ili se briše;
X21 je asparagin ili se briše;
X22 je alanin, glicin, treonin ili se briše;
X23 je cistein, lizin ili se briše;
X24 je peptid koji ima 2 do 10 aminokiselina koje se sastoje od kombinacija alanina, glicina i serina, ili se briše; i R2 je KRNRNNIA (SEK ID BR. 35), GPSSGAPPPS (SEK ID BR. 36), GPSSGAPPPSK (SEK ID BR. 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEK ID BR.
38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEK ID BR. 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEK ID BR. 40) ili se briše (isključuje se ako je aminokiselinska sekvenca Formule 1 identična sa SEK ID BR. 1).
[0027] Da bi se pojačala aktivnost oksintomodulina divljeg tipa za glukagon receptor i GLP-1 receptor, peptid može biti supstituisan sa 4-imidazoacetilom gde je alfa ugljenik histidina na poziciji 1 aminokiselinske sekvence predstavljene kao SEK ID BR. 1 izbrisan, desamino-histidil gde je N-terminalna amino grupa izbrisana, dimetil-histidil (N-dimetil-histidil) gde je N-terminalna amino grupa modifikovana sa dve metil grupe, beta-hidroksi imidazopropionil gde je N-terminalna amino grupa je supstituisana sa hidroksilnom grupom, ili sa beta-karboksi imidazopropionilom gde je N-terminalna amino grupa supstituisana sa karboksilnom grupom. Dodatno, GLP-1 receptor-vezujuć i region može biti supstituisan sa amino kiselinama koje pojačavaju hidrofobne i jonske veze ili njihove kombinacije. Deo sekvence oksintomodulina može biti supstituisan sa aminokiselinskom sekvencom GLP-1 ili Eksendin-4 da bi se pojačala aktivnost na GLP-1 receptoru.
[0028] Dalje, deo oksintomodulinske sekvence može biti supstituisan sa sekvencom koja stabilizuje alfa heliks. Aminokiseline na pozicijama 10, 14, 16, 20, 24 i 28 aminokiselinske sekvence Formule 1 mogu biti supstituisane sa amino kiselinama ili derivatima amino kiselina koji se sastoje od Tyr (4-Me), Phe, Phe (4-Me) Phe (4-Cl), Phe (4-CN), Phe (4-NO2), Phe (4-NH2), Phg, Pal, Nal, Ala (2-tienil) i Ala (benzotienil) koji su poznati za stabilizaciju alfa heliksa, i nema ograničenja za tip i broj aminokiselina ili derivata aminokiselina koje stabilizuju alfa heliks, koje treba ubaciti. Takođe, amino kiseline na pozicijama 10 i 14, 12 i 16, 16 i 20, 20 i 24, i 24 i 28 mogu takođe biti supstituisane sa glutaminskom kiselinom ili lizinom, tako da se formiraju prstenovi, i ne postoji ograničenje na broj prstenova za umetanje. Peptidi su prikazani sa amino kiselinskom sekvencom izabranom iz dole prikazanih Formula 1 do 6.
[0029] Prikazan je i derivat oksintomodulina koji uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazane Formule 2 gde je aminokiselinska sekvenca oksintomodulina supstituisana sekvencom eksendina ili GLP-1.
R1-A-R3 (Formula 2)
[0030] Takođe je opisan peptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu dole prikazane Formule 3, koja je pripremljena povezivanjem dela aminokiselinske sekvence oksintomodulina i dela aminokiselinske sekvence eksendina ili GLP-1 preko odgovaraju ć eg aminokiselinskog veznika.
R1-B-C-R4 (Formula 3)
[0031] Dalji derivat oksintomodulina uključuje aminokiselinsku sekvencu dole prikazane Formule 4, gde je deo sekvence aminokiselina oksintomodulina supstituisana sa aminokiselinom koja može poveć ati afinitet vezivanja za GLP-1 receptor, na primer, Leu na položaju 26, koji se vezuje za GLP-1 receptor hidrofobnom interakcijom je supstituisan sa hidrofobnim ostatkom, Ile ili Val.
R1-SQGTFTSDYSKYLD-D1-D2-D3-D4-D5-LFVQW-D6-D7-N-D8-R3 (Formula 4)
[0032] Takođe je opisan derivat oksintomodulina koji uključuje dole prikazanu Formulu 5, gde je deo aminokiselinske sekvence izbrisan, dodat ili supstituisan sa drugom aminokiselinom da bi se poboljšale aktivnosti nativnog oksintomodulina na GLP-1 receptoru i receptoru glukagona.
R1-E1-QGTFTSDYSKYLD-E2-E3-RA-E4-E5-FV-E6-WLMNT-E7-R5 (Formula 5)
[0033] U Formulama 2 do 5, R1 je isti kao u opisu Formule 1;
A je izabran iz grupe koju cine SQGTFTSDYSKYLDSRRAQD-FVQWLMNT (SEK ID BR. 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEK ID BR. 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEK ID BR.43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEK ID BR. 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG
(SEK ID BR.45), GEGTFTSDL-SRQMEEEAVRLFIEWAA (SEK ID BR.46), i SQGTFTSDYSRQMEEEAV- RLFIEWLMNG (SEK ID BR.47); B je izabran iz grupe koju cine SQGTFTSDYSKYLDSRRAQD-FVQWLMNT (SEK ID BR. 41), SQGTFTSDYSKYLDEEAVRLFIEWLMNT (SEK ID BR. 42), SQGTFTSDYSKYLDERRAQDFVAWLKNT (SEK ID BR.43), GQGTFTSDYSRYLEEEAVRLFIEWLKNG (SEK ID BR. 44), GQGTFTSDYSRQMEEEAVRLFIEWLKNG
(SEK ID BR. 45), GEGTFTSDL-SRQMEEEAVRLFIEWAA (SEK ID BR. 46), SQGTFTSDYSRQMEEEAVRL-FIEWLMNG (SEK ID BR. 47), GEGTFTSDLSRQMEEEAVRLFIEW (SEK ID BR.48), i SQGTFTSDYSRYLD
(SEK ID BR.49);
C je peptid koji ima 2 do 10 aminokiselina koje se sastoje od kombinacija alanina, glicina i serina;
D1 je serin, glutaminska kiselina ili arginin;
D2 je arginin, glutaminska kiselina ili serin;
D3 je arginin, alanin ili valin;
D4 je arginin, valin ili serin;
D5 je glutamin, arginin ili lizin;
D6 je izoleucin, valin ili serin;
D7 je metionin, arginin ili glutamin;
D8 je treonin, glicin ili alanin;
E1 je serin, Aib, Sar, d-alanin ili d-serin;
E2 je serin ili glutaminska kiselina;
E3 je arginin ili lizin;
E4 je glutamin ili lizin;
E5 je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina;
E6 je glutamin, cistein ili lizin;
E7 je cistein, lizin ili se briše;
R3 je KRNRNNIA (SEK ID BR.35), GPSSGAPPPS (SEK ID BR.36) ili GPSSGAPPPSK (SEK ID BR.37);
R4 je HSQGTFTSDYSKYLD (SEK ID BR. 38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEK ID BR. 39) ili HGEGTFTSDLS- KQMEEEAVK (SEK ID BR.
40); i,
R5 je KRNRNNIA (SEK ID BR. 35), GPSSGAPPPS (SEK ID BR. 36), GPSSGAPPPSK (SEK ID BR. 37) ili se briše (izuzima se ako su aminokiselinske sekvence Formula 2 do 5 identične sa sekvencom SEK ID BR.1).
[0034] Drugi opisani derivat oksintomodulina ima dole prikazanu Formulu 6.
R1-X1-X2-GTFTSD-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20-X21-X22-
X23-X24-R2 (Formula 6)
gde je R1 histidin, desamino-histidil, 4-imidazoacetil ili tirozin;
X1 je Aib (aminoso-buterna kiselina), glicin ili serin;
X2 je glutaminska kiselina ili glutamin;
X3 je leucin ili tirozin;
X4 je serin ili alanin;
X5 je lizin ili arginin;
X6 je glutamin ili tirozin;
X7 je leucin ili metionin;
X8 je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina;
X9 je glutaminska kiselina, alfa-metil-glutaminska kiselina ili se briše;
X10 je glutamin, glutaminska kiselina, lizin, arginin ili se briše;
X11 je alanin, arginin ili se briše;
X12 je alanin, valin ili se briše;
X13 je lizin, glutamin, arginin, alfa-metil-glutaminska kiselina ili se briše;
X14 je asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, leucin ili se briše;
X15 je fenilalanin ili se briše;
X16 je izoleucin, valin ili se briše;
X17 je alanin, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, alfa-metil-glutaminska kiselina ili se briše;
X18 je triptofan ili se briše;
X19 je alanin, izoleucin, leucin, valin ili se briše;
X20 je alanin, lizin, metionin, arginin ili se briše;
X21 je asparagin ili se briše;
X22 je treonin ili se briše;
X23 je cistein, lizin ili se briše;
X24 je peptid sa 2 do 10 amino kiselina koje se sastoje od glicina ili se briše; i
R2 je KRNRNNIA (SEK ID BR.35), GPSSGAPPPS (SEK ID BR.36), GPSSGAPPPSK (SEK ID BR. 37), HSQGTFTSDYSKYLD (SEK ID BR.
38), HSQGTFTSDYSRYLDK (SEK ID BR. 39), HGEGTFTSDLSKQMEEEAVK (SEK ID BR. 40) ili se briše (izuzima se ako su aminokiselinske sekvence Formule 6 identične sa sekvencom SEK ID BR.1)
[0035] Ovde opisani derivat oksintomodulina je takođe jedan od peptida SEK ID BR. 2 do 34. Ovo je detaljnije opisano u Tabeli 1 Primera 2-1. Od ovih poslednjih derivata oksintomodulina, oni od SEK ID BR: 24, 25 i 26 su deo pronalaska.
[0036] Oksintomodulin ima aktivnosti dva peptida, GLP-1 i glukagon. GLP-1 smanjuje glukozu u krvi, smanjuje unos hrane i potiskuje pražnjenje želuca, a glukagon poveć ava glukozu u krvi, olakšava lipolizu i smanjuje telesnu težinu pove ć anjem energetskog metabolizma. Različiti biološki efekti ova dva peptida mogu izazvati neželjene efekte kao što je poveć anje glukoze u krvi ako glukagon pokazuje dominantniji efekat od GLP-1, ili mučnina i povrać anje ako GLP-1 pokazuje dominantniji efekat od glukagona. Na primer, konjugat koji je proizveden u Primeru 10 prikazanom dalje u tekstu pokazuje već i afinitet prema GLP-1 receptoru nego onaj koji je proizveden u Primeru 12, ali efikasnost kod prvog je niža nego kod drugog, kao što je pokazano u eksperimentu in vivo u Primeru 18. Ovo može biti zbog poveć ane efikasnosti konjugata u odnosu na glukagon receptor u Primeru 12 uprkos njegovoj niskoj efikasnosti u odnosu na GLP-1 receptor. Prema tome, derivati oksintomodulina i njihovi konjugati iz predmetnog pronalaska nisu ograničeni na one derivate koji pokazuju bezuslovno poveć anje aktivnosti. Na primer, aminokiseline se mogu modifikovati na položajima 1 i 11 oksintomodulina, za koje je poznato da suzbijaju aktivnost glukagona, da bi se kontrolisao odnos aktivnosti glukagona i GLP-1.
[0037] Konjugati iz ovog pronalaska mogu indukovati poveć anu stabilnost u krvi, suspendovati emisiju kroz bubreg i promeniti afinitet prema receptorima povezujuć i nosač sa oksintomodulinom preko kovalentne veze ili formiraju ć i mikrosferu. Nosač koji može da formira konjugat koji sadrži oksintomodulin može biti izabran iz grupe koja se sastoji od albumina, transferina, antitela, delova antitela, elastina, heparina, polisaharida kao što je hitin, fibronektin i najpogodnije imunoglobulinskog Fc regiona, od kojih svi mogu poveć ati poluživot krvi konjugata kada se vezuje za oksintomodulin.
[0038] Termin "Imunoglobulinski Fc region", kako je ovde korišć en, odnosi se na protein koji sadrži konstantni region teškog lanca 2 (CH2) i konstantni region teškog lanca 3 (CH3) imunoglobulina, isključujuć i varijabilne regione teških i lakih lanaca, konstantni region teškog lanca 1 (CH1) i konstantni region lakog lanca 1 (CL1) imunoglobulina. On može dalje da obuhvati region zgloba na konstantnom regionu teškog lanca. Takođe, imunoglobulinski Fc region iz predmetnog pronalaska može sadržati deo ili ceo Fc region uključujuć i konstantni region teškog lanca 1 (CH1) i/ili konstantni region lakog lanca 1 (CL1), izuzev varijabilnih regiona teških i lakih lanaca, sve dok ima fiziološku funkciju koja je suštinski slična ili bolja od prirodnog proteina. Takodje, imunoglobulinski Fc region može biti fragment koji ima deleciju u relativno dugom delu aminokiselinske sekvence CH2 i/ili CH3. To jest, imunoglobulinski Fc region iz ovog pronalaska može da sadrži 1) CH1 domen, CH2 domen, CH3 domen i CH4 domen, 2) CH1 domen i CH2 domen, 3) CH1 domen i CH3 domen 4) CH2 domen i CH3 domen, 5) kombinaciju jednog ili više domena i imunoglobulinskog zglobnog regiona (ili dela zglobnog regiona), i 6) dimer svakog domena konstantnih regiona teškog lanca i konstantni region lakog lanca.
[0039] Imunoglobulinski Fc region iz predmetnog pronalaska obuhvata nativnu aminokiselinsku sekvencu, i njen derivat sekvence (mutant). Derivat aminokiselinske sekvence je sekvenca koja je različita od nativne aminokiselinske sekvence usled delecije, insercije, ne-konzervativne ili konzervativne supstitucije ili njihove kombinacije jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Na primer, u IgG Fc, aminokiselinski ostaci za koje je poznato da su važni u vezivanju, na pozicijama od 214 do 238, 297 do 299, 318 do 322, ili 327 do 331, se mogu koristiti kao pogodna meta za modifikaciju.
[0040] Takođe, moguć i su i drugi različiti derivati, uključuju ć i jedan u kojem je obrisan region koji je sposoban da formira disulfidnu vezu, ili su određeni aminokiselinski ostaci eliminisani na N-terminalnom kraju nativnog Fc oblika ili je u njega dodat metioninski ostatak. Dalje, da bi se uklonile efektorske funkcije, može se pojaviti delecija u mestu za vezivanje komplementa, kao što je mesto vezivanja C1q i mesto ADCC (citotoksičnost izazvana ć elijom zavisnom od antitela). Tehnike dobijanja takvih derivata sekvence imunoglobulinskog Fc regiona opisane su u WO 97/34631 i WO 96/32478.
[0041] Amino kiselinske izmene u proteinima i peptidima, koje generalno ne menjaju aktivnost proteina ili peptida, su poznate u ovoj oblasti (H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Najčešće izmene koje se pojavljuju su Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly, u oba smera. Pored toga, Fc region, po zelji, može biti modifikovan fosforilacijom, sulfacijom, akrilacijom, glikozilacijom, metilacijom, farnezilacijom, acetilacijom, amidacijom i slično.
[0042] Gore pomenuti Fc derivati su derivati koji imaju biološku aktivnost identičnu Fc regionu predmetnog pronalaska ili poboljšanu strukturnu stabilnost, na primer, protiv toplote, pH ili slično.
[0043] Pored toga, ovi Fc regioni se mogu dobiti od nativnih oblika izolovanih od ljudi i drugih životinja, uključujuć i krave, koze, svinje, miševe, zečeve, hrčkove, pacove i zamorce, ili mogu biti rekombinanti ili njihovi derivati, dobijeni iz transformisanih životinjskih ć elija ili mikroorganizama. U ovom tekstu, oni se mogu dobiti iz nativnog imunoglobulina izolovanjem celih imunoglobulina iz humanih ili životinjskih organizama i njihovim tretiranjem sa proteolitičkim enzimom. Papain digestira prirodni imunoglobulin u Fab i Fc regione, a tretman pepsinom dovodi do proizvodnje pF'c i F (ab) 2 fragmenata. Ovi fragmenti mogu biti podvrgnuti, na primer, ekskluzionoj hromatografiji za veličine da bi se izolovao Fc ili pF 'c. Poželjno, Fc-region izveden iz čoveka je rekombinantni imunoglobulinski Fc region koji se dobija iz mikroorganizma.
[0044] Pored toga, imunoglobulinski Fc region iz predmetnog pronalaska može biti u obliku prirodnih šeć ernih lanaca, poveć anih še ć ernih lanaca u poređenju sa prirodnim oblikom ili smanjenim še ć ernim lancima u poređenju sa prirodnim oblikom, ili može biti u deglikozilovanom obliku. Poveć anje, smanjenje ili uklanjanje imunoglobulinskih Fc še ć ernih lanaca se može postić i metodama koje su uobičajene u struci, kao što su hemijski postupak, enzimatski postupak i metod genetskog inženjeringa koji koristi mikroorganizam. Uklanjanje šeć ernih lanaca iz Fc regiona dovodi do naglog smanjenja afiniteta vezivanja za C1q deo prve komplementarne komponente C1 i do smanjenja ili gubitka citotoksičnosti koja je ć elijski posredovana i zavisna od antitela ili citotoksičnosti zavisne od komplementa, čime se ne izazivaju nepotrebni imuni odgovori invivo. U tom smislu, imunoglobulinski Fc region u deglikozilovanom ili aglikozilovanom obliku može biti pogodniji za predmet ovog pronalaska kao nosač leka.
[0045] Kako se ovde koristi, termin "deglikozilacija" se odnosi na enzimatsko uklanjanje šeć ernih ostataka iz Fc regiona, a termin "aglikozilacija" znači da je Fc region proizveden u ne-glikozilovanom obliku pomoć u prokariota, poželjno E. coli.
[0046] U međuvremenu, imunoglobulinski Fc region može biti izveden od ljudi ili drugih životinja, uključujuć i krave, koze, svinje, miševe, zečeve, hrčkove, pacove i zamorce, a poželjno od ljudi.
[0047] Dodatno, imunoglobulinski Fc region može biti Fc region koji je izveden iz IgG, IgA, IgD, IgE i IgM, ili koji je napravljen njihovim kombinacijama ili njihovim hibridima. Poželjno je da je izveden iz IgG ili IgM, koji su među najobilnijim proteinima u ljudskoj krvi, a najpoželjnije od IgG, za koji je poznato da poveć ava poluživote ligand-vezuju ć ih proteina.
[0048] S druge strane, termin "kombinacija", kako se ovde koristi, označava da su polipeptidi koji kodiraju jedno-lančane imunoglobulinske Fc regione istog porekla vezani za jedno-lančani polipeptid različitog porekla da bi formirali dimer ili multimer. To jest, dimer ili multimer mogu biti formirani od dva ili više fragmenata izabranih iz grupe koja se sastoji od IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc i IgE Fc fragmenta.
[0049] Termin "ne-peptidilni polimer", se odnosi na biokompatibilan polimer koji uključuje dve ili više ponavljajuć ih jedinica koje su povezane jedna sa drugom bilo kojom kovalentnom vezom, izuzev peptidne veze. U predmetnom pronalasku, nepeptidilni polimer se može zamenjivo koristiti sa ne-peptidilnim linkerom.
[0050] Nepeptidilni polimer koji je koristan u predmetnom pronalasku može biti izabran iz grupe koja se sastoji od bioloski razgradljivog polimera, lipidnog polimera, hitina, hijaluronske kiseline i njihove kombinacije, a poželjno je da biološki razgradljiv polimer može biti polietilen glikol, polipropilen glikol, etilen glikol-propilen glikol kopolimer, polioksietilovani poliol, polivinil alkohol, polisaharid, dekstran, polivinil etil etar, polilaktična kiselina (PLA) ili polilaktikglikolna kiselina (PLGA), i još poželjnije, je polietilen glikol (PEG). Dodatno, njihovi derivati koji su poznati u struci i derivati koji se lako dobijaju postupkom poznatim u struci mogu biti uključeni u obim predmetnog pronalaska.
[0051] Peptidni linker koji se koristi u fuzionom proteinu dobijenom konvencionalnim infram fuzionim postupkom ima nedostatke u tome što se lako in vivo cepa proteolitičkim enzimom, i na taj način se ne može dobiti dovoljan efekat poveć anja polu-života seruma aktivnog leka od strane nosača kao što je očekivano. Međutim, u ovom pronalasku, polimer koji ima rezistenciju na proteolitički enzim se može koristiti za održavanje polu-života seruma peptida koji je sličan onom od nosača. Prema tome, bilo koji ne-peptidilni polimer se može koristiti bez ograničenja, sve dok je to polimer koji ima gore navedenu funkciju, to jest, polimer koji ima otpornost na in vivo proteolitički enzim. Nepeptidil polimer ima molekulsku masu u opsegu od 1 do 100 kDa, a poželjno od 1 do 20 kDa. Nepeptidilni polimer iz predmetnog pronalaska, povezan sa imunoglobulinskim Fc regionom, može biti jedan polimer ili kombinacija različitih tipova polimera.
[0052] Nepeptidilni polimer koji se koristi u predmetnom pronalasku ima reaktivnu grupu koja je sposobna da se veže za imunoglobulinski Fc region i za lek proteina. Nepeptidilni polimer ima reaktivnu grupu na oba kraja, koja je poželjno izabrana iz grupe koja se sastoji od reaktivnog aldehida, propionaldehida, butiraldehida, maleimida i derivata sukcinimida. Derivat sukcinimida može biti sukcinimidil propionat, hidroksi sukcinimidil, sukcinimidil karboksimetil ili sukcinimidil karbonat. Posebno, kada ne-peptidilni polimer ima reaktivnu aldehidnu grupu na oba njihova kraja, on je efikasan u vezivanju na oba kraja sa fiziološki aktivnim polipeptidom i imunoglobulinom sa minimalnim nespecifičnim reakcijama. Finalni proizvod koji se generiše reduktivnom alkilacijom aldehidnom vezom je mnogo stabilniji od onog koji je povezan amidnom vezom. Aldehidna reaktivna grupa se selektivno vezuje za N-terminus pri niskom pH, i vezuje se za ostatak lizina da bi se formirala kovalentna veza pri visokom pH, kao što je pH 9.0. Reaktivne grupe na oba kraja nepeptidilnog polimera mogu biti iste ili različite. Na primer, ne-peptidilni polimer može posedovati maleimid grupu na jednom kraju, i aldehidnu grupu, propionaldehidnu grupu ili butiraldehidnu grupu na drugom kraju. Kada se polietilen glikol koji ima reaktivnu hidroksi grupu na oba njegova kraja koristi kao ne-peptidilni polimer, hidroksi grupa može biti aktivirana u različitim reaktivnim grupama poznatim hemijskim reakcijama, ili polietilen glikol koji ima komercijalno dostupnu modifikovanu reaktivnu grupu se može koristiti za pripremu konjugata dugog dejstva predmetnog pronalaska.
[0053] Konjugat predmetnog pronalaska, može biti oba kraja nepeptidilnog polimera koji imaju dve reaktivne terminalne grupe koje su vezane za amin grupu ili tiol grupu imunoglobulinskog Fc regiona i derivate oksintomodulina.
[0054] Nepeptidilni polimer ima reaktivnu grupu na oba kraja, koja je poželjno izabrana iz grupe koja se sastoji od reaktivne aldehidne grupe, propionaldehidne grupe, butiraldehidne grupe, maleimidne grupe i sukcinimidnog derivata. Derivat sukcinimida može biti sukcinimidil propionat, hidroksi sukcinimidil, sukcinimidil karboksimetil ili sukcinimidil karbonat.
[0055] Dve reaktivne terminalne grupe ne-peptidil polimera mogu biti iste ili različite jedna od druge. Na primer, nepeptidni polimer može da poseduje maleimidnu grupu na jednom kraju i aldehidnu grupu, propionaldehidnu grupu ili butiraldehidnu grupu na drugom kraju. Na primer, kada ne-peptidilni polimer ima reaktivnu aldehidnu grupu na terminalnoj grupi, i maleimidnu grupu na drugoj terminalnoj grupi, ona je efikasna u vezivanju na oba kraja sa fiziološki aktivnim polipeptidom i imunoglobulinom sa minimalnim ne-specifičnim reakcijama. Prema Primerima predmetnog pronalaska, konjugati su pripremljeni vezivanjem oksintomodulina ili njegovog derivata i imunoglobulinski Fc region preko kovalentne veze koristeć i PEG koji je ne-peptidilni polimer uključuju ć i samu propionaldehidnu grupu ili obe maleimidne grupe i aldehidne grupe.
[0056] Konjugati ovog pronalaska pokazuju odličnu aktivnost na GLP-1 receptor i glukagon receptor, u poređenju sa prirodnim oksintomodulinom, a poluživot u krvi se poveć ava vezivanjem sa Fc regionom tako da se održava aktivnost in vivo tokom dugog vremenskog perioda.
[0057] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za prevenciju ili lečenje gojaznosti koja sadrži peptid.
[0058] Kako se ovde koristi, termin "prevencija" označava sve postupke kojima se pojava bolesti suzbija ili usporava. U predmetnom pronalasku, "prevencija" znači da se pojavljivanje gojaznosti od faktora kao što je poveć anje telesne težine ili telesne masti ograničava ili usporava davanjem konjugata iz predmetnog pronalaska.
[0059] Kako se ovde koristi, termin "tretman" označava sve postupke kojima se ublažavaju, poboljšavaju ili umiruju simptomi bolesti. U ovom pronalasku, "tretman" znači da su simptomi gojaznosti ublaženi, poboljšani ili umireni davanjem konjugata iz predmetnog pronalaska, što rezultira smanjenjem telesne težine ili telesne masti.
[0060] Kako se ovde koristi, izraz "gojaznost" podrazumeva akumulaciju viška količine adipoznog tkiva u telu, i indeks telesne mase (telesna težina (kg) podeljena sa kvadratom visine (m)) iznad 25 treba posmatrati kao gojaznost. Gojaznost je obično prouzrokovana energetskim disbalansom, kada količina unesene hrane prelazi količinu energije koja se troši dugo vremena. Gojaznost je metabolička bolest koja pogađa celo telo i poveć ava rizik od dijabetesa, hiperlipidemije, seksualne disfunkcije, artritisa i kardiovaskularnih bolesti, au nekim slučajevima je povezana sa pojavom raka.
[0061] Konjugati iz predmetnog pronalaska, koji su pripremljeni vezivanjem derivata oksintomodulina SEK ID BR: 24, 25 i 26 sa imunoglobulinskim Fc regionom, pokazuju odličan afinitet vezivanja za glukagon i GLP-1 receptore (Tabela 3) i odličnu otpornost na in-vivo proteolitičke enzime tako da pokazuju in vivo aktivnost tokom dugog vremenskog perioda, tako pokazujuć i odlične efekte protiv gojaznosti kao što je smanjenje telesne težine (Slika 12).
[0062] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska može dalje da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, ekscipijent ili razblaživač. Kako se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljiv" znači da je kompozicija dovoljna da postigne terapeutske efekte bez štetnih sporednih efekata, i može se lako odrediti u zavisnosti od tipa bolesti, starosti pacijenta, telesne težine, zdravstvenog stanja, pola i osetljivost na lek, put primene, način primene, učestalost primene, trajanje tretmana, lekova koji se koriste u kombinaciji ili koincidiraju sa kompozicijom iz predmetnog pronalaska, i drugih faktora poznatih u medicini.
[0063] Farmaceutska kompozicija koja sadrži derivat predmetnog pronalaska može dalje da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. Za oralno davanje, nosač može uključivati, ali nije ograničen na, vezivo, lubrikant, dezintegrant, ekscipijent, solubilizator, disperzivni agens, stabilizator, suspenzioni agens, bojilo i aromu. Za preparate koji se mogu injektirati, nosač može uključivati pufersko sredstvo, konzervans, analgetik, solubilizator, izotonični agens i stabilizator. Za preparate za lokalnu primenu, nosač može da sadrži bazu, ekscipijent, lubrikant i konzervans.
[0064] Kompozicija predmetnog pronalaska može biti formulisana u različite dozne oblike u kombinaciji sa gore pomenutim farmaceutski prihvatljivim nosačima. Na primer, za oralno davanje, farmaceutska kompozicija može biti formulisana u tablete, pastile, kapsule, eliksire, suspenzije, sirupe ili vafere. Za injekcione preparate, farmaceutska kompozicija može biti formulisana u ampule kao jednostruki dozni oblik ili višedozni kontejner. Farmaceutska kompozicija se takođe može formulisati u rastvore, suspenzije, tablete, pilule, kapsule i preparate dugog dejstva.
[0065] S druge strane, primeri nosača, ekscipijenta i razblaživača koji su pogodni za farmaceutske formulacije uključuju laktozu, dekstrozu, saharozu, sorbitol, manitol, ksilitol, eritritol, maltitol, skrob, bagrem gumu, alginat, želatin, kalcijum fosfat, kalcijum silikat, celulozu, metilcelulozu, mikrokristalnu celulozu, polivinilpirolidon, vodu, metilhidroksibenzoat, propilhidroksibenzoat, talk, magnezijum stearat i mineralna ulja. Pored toga, farmaceutske formulacije mogu dalje uključivati punila, agense protiv koagulacije, lubrikante, humektante, arome i antiseptike.
[0066] Dalje, farmaceutska kompozicija iz predmetnog pronalaska može imati bilo koju formulaciju izabranu iz grupe koja se sastoji od tableta, pilula, prašaka, granula, kapsula, suspenzija, tečnosti za unutrašnju upotrebu, emulzija, sirupa, sterilnih vodenih rastvora, ne-vodenih rastvarača, liofilizovane formulacije i supozitorije.
[0067] Dalje, kompozicija može biti formulisana u jedan oblik doze pogodan za telo pacijenta, i poželjno je formulisan u preparat koji je koristan za peptidne lekove u skladu sa tipičnim postupkom u farmaceutskom polju, tako da se administrira oralnim ili parenteralnim putem, kao što je kroz kožu, intravenozno, intramuskularno, intraarterijalno, intramedularno, intraventrikularno, pulmonarno, transdermalno, subkutano, intraperitonealno, intranazalno, intrakolonično, lokalno, sublingvalno, vaginalno ili rektalno, ali nije ograničeno na njih.
[0068] Kompozicija se može koristiti tako sto se meša sa različitim farmaceutski prihvatljivim nosačima kao što su fiziološki rastvor ili organski rastvarači. Da bi se poveć ala stabilnost ili apsorpcija, mogu se koristiti ugljeni hidrati kao što su glukoza, saharoza ili dekstrani, antioksidanti kao što su askorbinska kiselina ili glutation, helatni agensi, proteini niske molekularne težine ili drugi stabilizatori.
[0069] Doza primene i učestalost farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska se određuju prema tipu aktivnog sastojka, zajedno sa različitim faktorima kao što su bolest koju treba lečiti, način primene, starost pacijenta, pol i telesna težina, i težina bolesti.
[0070] Ukupna efektivna doza kompozicije prema predmetnom pronalasku se može dati pacijentu u jednoj dozi, ili se može primenjivati tokom dužeg vremenskog perioda u višestrukim dozama prema frakcionisanom protokolu tretmana. U farmaceutskoj kompoziciji predmetnog pronalaska, sadržaj aktivnog sastojka može varirati u zavisnosti od težine bolesti. Poželjno, ukupna dnevna doza peptida predmetnog pronalaska može biti približno 0,0001 mg do 500 mg na 1 kg telesne težine pacijenta. Međutim, efektivna doza peptida je određena uzimajuć i u obzir različite faktore, uključuju ć i starost pacijenta, telesnu težinu, zdravstveno stanje, pol, težinu bolesti, ishranu i brzinu sekrecije, kao i put primene i učestalost lečenja farmaceutskom kompozicijom. U tom smislu, oni koji su stručni u ovom polju mogu lako da odrede efikasnu dozu koja je pogodna za određenu upotrebu farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska. Farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku nije posebno ograničena na formulaciju i put i način primene, sve dok pokazuje efekte predmetnog pronalaska.
[0071] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska pokazuje odlično in vivo trajanje efikasnosti i titra, čime se značajno smanjuje broj i učestalost njenog davanja.
[0072] Štaviše, farmaceutska kompozicija se može primenjivati sama ili u kombinaciji ili koincidira sa drugim farmaceutskim formulacijama koje pokazuju profilaktičke ili terapeutske efekte na gojaznost. Farmaceutske formulacije koje pokazuju profilaktičke ili terapeutske efekte na gojaznost nisu posebno ograničene, i mogu uključiti agonist receptora GLP-1, agonist leptinskog receptora, inhibitor DPP-IV, antagonist Y5 receptora, antagonist receptora hormona koji koncentruje melanin (MCH), agonist receptora Y2/3, agonist receptora MC3/4, inhibitor želučane/pankreasne lipaze, agonist 5HT2c, agonist β3A receptora, agonist receptora Amilina, antagonist Grelina i/ili antagonist receptora Grelina.
[0073] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za prevenciju ili lečenje gojaznosti, koji sadrži korak davanja subjektu konjugata ili farmaceutske kompozicije uključujuć i isti.
[0074] Kako se ovde koristi, termin "davanje" označava unošenje količine prethodno određene supstance u pacijenta određenim pogodnim postupkom. Kompozicija prema predmetnom pronalasku se može primenjivati bilo kojim od uobičajenih puteva, sve dok je sposobna da dostigne željeno tkivo, na primer, ali nije ograničeno na, intraperitonealno, intravenozno, intramuskularno, subkutano, intradermalno, oralno, lokalno, intranazalno, intrapulmonarno ili intrarektalno davanje. Međutim, pošto se peptidi razgrađuju nakon oralne primene, aktivni sastojci kompozicije za oralnu primenu treba da budu obloženi ili formulisani za zaštitu od degradacije u stomaku.
[0075] U ovom pronalasku, termin "subjekt" su oni za koje se sumnja da imaju gojaznost, što znači sisari, uključujuć i ljude, miševe i stoku sa gojaznošć u ili sa mogu ć noš ć u gojaznosti. Međutim, bilo koji subjekt koji se tretira sa peptidom ili farmaceutskom kompozicijom predmetnog pronalaska je uključen bez ograničenja. Farmaceutska kompozicija koja uključuje peptid iz predmetnog pronalaska se daje subjektu za koji se sumnja da ima gojaznost, čime se efektivno tretira subjekt. Gojaznost je kao što je gore opisano.
[0076] Terapeutski postupak iz predmetnog pronalaska može uključivati korak davanja kompozicije uključujuć i peptid u farmaceutski efikasnoj količini. Ukupna dnevna doza treba da se utvrdi odgovarajuć om medicinskom procenom od strane lekara i da se primeni jednom ili više puta. U odnosu na ciljeve predmetnog pronalaska, specifični terapeutski efektivni nivo doze za svakog pojedinačnog pacijenta mogu varirati u zavisnosti od različitih faktora koji su dobro poznati u medicinskoj struci, uključujuć i vrstu i stepen odgovora koji se treba posti ć i, konkretnu kompoziciju prema tome da li se sa njom koriste drugi agensi ili ne, starost pacijenta, telesna težina, zdravstveno stanje, pol i ishrana, vreme i put primene, brzina sekrecije kompozicije, vremenski period terapije, drugi lekovi koji se koriste u kombinaciji ili koincidenciju sa kompozicijom predmetnog pronalaska i slični faktori koji su dobro poznati u medicini.
[0077] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu konjugata ili farmaceutske kompozicije uključujuć i istih u pripremi lekova za prevenciju ili lečenje gojaznosti.
Primeri izvodjenja Pronalaska
[0078] U daljem tekstu, predmetni pronalazakć e biti detaljnije opisan u odnosu na slede ć e Primere.
[0079] Prema tome, derivati oksintomodulina i konjugati koji sadrže aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 24, 25 i 26 su u skladu sa pronalaskom. Derivati i konjugati koji sadrže aminokiselinske sekvence drugih SEK ID BR su dati za ilustrativnu svrhu.
Primer 1. Proizvodnja in vitro aktiviraneć elijske linije
Primer 1-1: Proizvodnjać elijske linije koja pokazuje cAMP odgovor na GLP-1
[0080] PCR je izveden korišć enjem regiona koji odgovara ORF ( Open Reading Frame) u cDNA (OriGene Technologies, Inc. USA) gena za humani GLP-1 receptor kao šablon, i dole prikazani prednji i reverzni prajmeri, uključujuć i svako od Hindlll i EcoRI restrikcionih mesta tako da se dobije PCR proizvod.
[0081]
Prednji prajmer: 5’-CCCGGCCCCCGCGGCCGCTATTCGAAATAC-3’(SEK ID BR.47)
Reverzni prajmer: 5’-GAACGGTCCGGAGGACGTCGACTCTTAAGATAG-3’(SEK ID BR.48)
[0082] PCR proizvod je kloniran u poznati vektor ekspresije životinjskih ć elija x0GC/dhfr da bi se dobio rekombinantni vektor x0GC/GLP1R.
[0083] CHO DG44 ć elijska linija kultivisana u DMEM/F12 (10% FBS) medijumu je transfektovana sa rekombinantnim vektorom x0GC/GLP1R korišć enjem Lipofectamin-a ( Invitrogen, SAD), i kultivisana u selekcionom medijumu koji sadrži 1 mg/mL G418 i 10 nM metotraksata. Odatle su odabrane pojedinačne klonirane ć elijske linije tehnikom graničnog razblaživanja, a na kraju je konačno odabranać elijska linija koja pokazuje odličan cAMP odgovor na GLP-1 na način zavisan od koncentracije.
Primer 1-2: Proizvodnjać elijske linije koja pokazuje cAMP odgovor na glukagon
[0084] PCR je izveden korišć enjem regiona koji odgovara ORF u cDNA ( OriGene Technologies, Inc. USA) gena humanog receptora glukagona kao šablona, i sledeć ih prednjih i reverznih prajmera koji uključuju svako od EcoRI i XhoI restrikcionih mesta tako da se dobije PCR proizvod.
[0085]
Prednji prajmer: 5’-CAGCGACACCGACCGTCCCCCCGTACTTAAGGCC-3’(SEK ID BR.49)
Reverzni prajmer: 5’-CTAACCGACTCTCGGGGAAGACTGAGCTCGCC-3’(SEK ID BR.50)
[0086] PCR produkt je kloniran u poznati vektor ekspresije životinjskih ć elija x0GC/dhfr da bi se dobio rekombinantni vektor x0GC/GCGR.
[0087] CHO DG44 ć elijska linija kultivisana u DMEM/F12 (10% FBS) medijumu je transfektovana sa rekombinantnim vektorom x0GC/GCGR koristeć i Lipofectamin, i kultivisana u medijumu za selekciju koji sadrži 1mg/mL G418 i 10 nM metotraksata. Odatle su odabrane pojedinačne klonirane ć elijske linije tehnikom graničnog razblaživanja, a na kraju je konačno izabrana ć elijska linija koja pokazuje odličan cAMP odgovor na glukagon na način zavisan od koncentracije.
Primer 2. Test na in vitro aktivnost derivata oksintomodulina
Primer 2-1: Sinteza derivata oksintomodulina
[0088] U cilju merenja in vitro aktivnosti derivata oksintomodulina, sintetisani su derivati oksintomodulina sa sledeć im sekvencama amino kiselina (Tabela 1).
Tabela 1
[0089]
Tabela 1
[0090] U Tabeli 1, podebljane i podvučene aminokiseline predstavljaju formiranje prstena, a amino kiseline predstavljene sa X označavaju ne-nativnu amino kiselinu, alfa-metil-glutaminsku kiselinu. Pored toga, CA predstavlja 4-imidazoacetil, a DA predstavlja desamino-histidil.
Primer 2-2: Test na in vitro aktivnost derivata oksintomodulina
[0091] U cilju merenja efikasnosti anti-gojaznosti derivata oksintomodulina sintetizovanih u Primeru 2-1, ć elijska aktivnost je izmerena in vitro korišć enjem ć elijskih linija dobijenih u Primerima 1-1 i 1-2.
[0092] Ć elijske linije su one koje su pripremljene transfekcijom CHO (jajnik kineskog hrčka) da se eksprimira humani GLP-1 receptorski gen i gen receptora glukagona, respektivno. Prema tome, oni su pogodni za merenje GLP-1 i aktivnosti glukagona. Prema tome, aktivnost svakog derivata oksintomodulina merena je korišć enjem svake transformisane ć elijske linije.
[0093] Specifično, svakać elijska linija je subkultivisana dva ili tri puta nedeljno, i alikvotirana u svakom bunarčiću mikrotitar ploče sa 96 bunarčića pri gustini od 1 X 105, prać ena kultivacijom od 24 sata.
[0094] Kultivisane ć elije su isprane sa KRB puferom i suspendovane u 40 ml KRB pufera koji sadrži 1 mM IBMX, i ostavljene na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Oksintomodulin (SEK ID BR.1) i derivati oksintomodulina (predstavljeni kao SEK ID BR.2-6, 8, 10-13, 17, 18, 23-25, 27, 28 i 32-34) su razblaženi od 1000 nM do 0.02 nM sa 5-strukim serijskim razblaženjem, i po 40 mL tog sastava je dodato u ć elije i kultivisano na 37 °C tokom 1 sata u CO2 inkubatoru. Zatim je dodato 20 mL pufera za liziranje ć elija za lizu ć elija, a ć elijski lizati su primenjeni na cAMP test kit ( Molecular Device, USA) za merenje koncentracija cAMP. Iz toga su izračunate vrednosti EC50 i upoređene jedna sa drugom. EC50 vrednosti su prikazane u sledeć oj Tabeli 2.
Tabela 2
[0095]
Tabela 2
[0096] Kao što je prikazano u Tabeli 2, bilo je derivata oksintomodulina koji pokazuju odlične in vitro aktivnosti i različite odnose aktivnosti na GLP-1 receptor i glukagon receptor, u poređenju sa nativnim oksintomodulinom SEK ID BR.1.
[0097] Poznato je da oksintomodulin aktivira i GLP-1 receptor i glukagon receptor za suzbijanje apetita, olakšavanje lipolize i stvaranje sitosti, čime se pokazuju efekti protiv gojaznosti. Derivati oksintomodulina u skladu sa predmetnim pronalaskom pokazuju višu in vitro aktivnost i na GLP-1 receptor i na glukagon receptor nego na divlji tip oksintomodulina, i stoga se mogu koristiti kao terapeutski agens za gojaznost sa višim efikasnostima od poznatog oksintomodulina.
Primer 3. Testiranje in vivo aktivnosti derivata oksintomodulina
[0098] Da bi se merila in vivo terapijska aktivnost derivata oksintomodulina, promene u unosu hrane primenom derivata oksintomodulina su ispitivane u ob/ob mišu korišć enjem nativnog oksintomodulina kao kontrolu.
[0099] Specifično, gojazni dijabetični ob/ob miševi, koji se obično koriste za testiranje efikasnosti terapeutskih agensa za gojaznost i dijabetes, su postili 16 sati, i primenjivano im je 1 ili 10 mg/kg oksintomodulina, ili 0.02, 0.1, 1 ili 10 mg/kg derivata oksintomodulina SEK ID BR. 2. Zatim je ispitan unos hrane tokom 2 sata (Slika 1). Slika 1 je grafikon koji prikazuje promene u unosu hrane u zavisnosti od primene doza oksintomodulina ili derivata oksintomodulina. Kao što je prikazano na Slici. 1, primena 1 mg/kg derivata oksintomodulina pokazala je bolje inhibitorne efekte na unos hrane od primene 10 mg/kg oksintomodulina.
[0100] Kada se uzmu zajedno, derivati oksintomodulina iz predmetnog pronalaska imaju mnogo već e efekte protiv gojaznosti od oksintomodulina divljeg tipa, čak i ako su primenjeni u nižoj dozi, što ukazuje na poboljšanje problema kod divljeg tipa oksintomodulina koji pokazuje niže efekte protiv gojaznosti i treba da se primenjuje u visokim dozama tri puta dnevno.
Primer 4: Priprema konjugata uključujuć i oksintomodulin i imunoglobulinski Fc
[0101] Prvo, za PEGilaciju lizinskog ostatka na poziciji 30 aminokiselinske sekvence oksintomodulina (SEK ID BR. 1) sa 3.4 K PropionALD (2) PEG (PEG sa dve grupe propilaldehida, NOF, Japan), oksintomodulin i 3.4 K PropionALD (2) PEG reaguju u molarnom odnosu 1 : 12 sa koncentracijom proteina od 5 mg/ml na 4 °C tokom 4.5 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u smeši rastvarača od 100 mM Na-Borat pufera (pH 9.0) i 45% izopropanola, i dodat je 20 mM natrijum cijanoborohidrid (cijanoborohidrid (SCB, NaCNBH3), NaCNBH3) kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na SOURCE S (XK16, Amersham Biosciences) da bi se pročistio oksintomodulin sa mono-pegilovanim lizinom (Kolona: SOURCE S (XK16, Amersham Biosciences), brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent : A 0 → 3% 1 min B → 40% 222 min B (A: 20 mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 2a). Slika 2a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog oksintomodulina kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S. Mono-PEGilacija eluiranih pikova je ispitana pomo ć u SDS-PAGE, a selektivnost lizina je ispitana mapiranjem peptida upotrebom Asp-N proteaze (Slika 2b). Slika 2b je grafikon koji prikazuje rezultat mapiranja peptida prečišć enog mono-PEGilovanog oksintomodulina.
[0102] Sledeć e, prečiš ć eni mono-PEGilovani oksintomodulin i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 10 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q da bi se prečistili konjugati uključuju ć i oksintomodulin i imunoglobulin Fc (Kolona: SOURCE 15Q (XK16, Amersham Biosciences), brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A0 → - 20% 100 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 2c). Slika 2c je grafikon koji prikazuje rezultat konjugata za pročišć avanje uključuju ć i oksintomodulin i imunoglobulinski Fc.
Primer 5: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.29) i imunoglobulinski Fc
[0103] Prvo, za PEGilaciju lizinskog ostatka na položaju 30 aminokiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 29) sa 3.4 K PropionALD (2) PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 29) i 3.4 K PropionALD (2 ) PEG reaguju u molarnom odnosu 1 : 12 sa koncentracijom proteina od 5 mg/ml na 4 °C tokom 4.5 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u smeši rastvarača od 100 mM Na-Borat pufera (pH 9.0) i 45% izopropanola, i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na SOURCE S da pročisti derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim lizinom (Kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0). ml/min, gradijent: A 0 → 3% 1 min B → 40% 222 min B (A: 20 mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 3a). Slika 3a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina ( SEK ID BR.29) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
[0104] Sledeć e, prečiš ć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina ( SEK ID BR. 29) i imunoglobulinski Fc reaguju u molarnom odnosu 1 : 10 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q da bi se pročistili konjugati uključuju ć i derivat oksintomodulina ( SEK ID BR.
29) i imunoglobulinski Fc (Kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0→ 20% 100 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 3b). Slika 3b je a grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.29) i imunoglobulinski Fc.
Primer 6: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.30) i imunoglobulinski Fc
[0105] Prvo, za PEGilaciju lizinskog ostatka na poziciji 30 amino kiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 30) sa 3.4 K PropionALD (2) PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 30) i 3.4 K PropionALD (2 ) PEG reaguju u molarnom odnosu 1 : 15 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na 4 °C tokom 4.5 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u smeši rastvarača od 100 mM HEPES pufera (pH 7,5) i 45% izopropanola, i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Po završetku reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišćavanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa monopegilovanim lizinom (Kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 3% 1 min B → 40% 222 min B (A: 20 mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 4a). Slika 4a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 30) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S. Mono-PEGilacija eluiranih pikova je ispitana pomoć u SDS-PAGE, a selektivnost lizina je ispitana mapiranjem peptida upotrebom Asp-N proteaze (Slika 4b). Slika 4b je grafikon koji prikazuje rezultat mapiranja peptida prečišć enog mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina ( SEK ID BR.
30).
[0106] Zatim, prečišć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 30) i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 10 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Po završetku reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q da bi se prečistili konjugati uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 30) i imunoglobulinski Fc (Kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 20% 100 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 4c). Slika 4c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.30) i imunoglobulinski Fc.
Primer 7: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.31) i imunoglobulinski Fc
[0107] Prvo, za PEGilaciju lizinskog ostatka na položaju 30 aminokiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 31) sa 3.4 K PropionALD (2) PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 31) i 3.4 K PropionALD (2 ) PEG reaguju u molarnom odnosu 1 : 15 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na 4 °C tokom 4.5 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u smeši rastvarača od 100 mM HEPES pufera (pH 7,5) i 45% izopropanola, i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Po završetku reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišćavanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa monopegilovanim lizinom (Kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 3% 1 min B → 40% 222 min B (A: 20 mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 5a). Slika 5a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 31) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
[0108] Zatim, prečišć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 31) i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 10 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Po završetku reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q da bi se prečistili konjugati uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 31) i imunoglobulinski Fc (Kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 20% 100 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 5b). Slika 5b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.31) i imunoglobulinski Fc.
Primer 8: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.2) i imunoglobulinski Fc
[0109] Prvo, za PEGilaciju lizinskog ostatka na položaju 30 aminokiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 2) sa 3.4 K PropionALD (2) PEG, oksintomodulinski derivat (SEK ID BR. 2) i 3.4 K PropionALD (2 ) PEG reaguju u molarnom odnosu 1 : 10 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na 4 °C tokom 4 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u smeši rastvarača od 100 mM HEPES pufera (pH 7,5) i 45% izopropanola, i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za prociscavanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa monopegilovanim lizinom (Kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 3% 1 min → 40% 222 min B (A: 20 mM Nacitrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 6a). Slika 6a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 2) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S. Mono-PEGilacija eluiranih pikova je ispitana pomoć u SDS-PAGE, a selektivnost lizina je ispitana mapiranjem peptida upotrebom Asp-N proteaze (Slika 6b). Slika 6b je grafikon koji prikazuje rezultat mapiranja peptida prečišć enog mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR.
2).
[0110] Zatim, prečišć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR.2) i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 8 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q (Kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 6c) i kolona za pročišć avanje sa ISO-om (kolona: SOURCE ISO (XK16, Amersham Biosciences), brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 100% 100 min B, (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.3M AS)) (Slika 6d) za pročišć avanje konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 2) i imunoglobulinski Fc. Slika 6c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 2) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje ISO izvora, i Slika 6d je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 2) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročiš ć avanje iz Source ISO.
Primer 9: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.3) i imunoglobulinski Fc
[0111] Prvo, za PEGilaciju lizinskog ostatka na položaju 27 aminokiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 3) sa 3.4 K PropionALD (2) PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 3) i 3.4 K PropionALD (2 ) PEG reaguje u molarnom odnosu 1 : 10 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na 4 °C tokom 4 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u smeši rastvarača od 100 mM HEPES pufera (pH 7,5) i 45% izopropanola, i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišćavanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim lizinom (Kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 3% 1 min → 40% 222 min B (A: 20 mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 7a). Slika 7a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 3) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S. Mono-PEGilacija eluiranih pikova je ispitana pomoć u SDS-PAGE, a selektivnost lizina je ispitana mapiranjem peptida upotrebom Asp-N proteaze (Slika 7b). Slika 7b je grafikon koji prikazuje rezultat mapiranja peptida pročišć enog mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR.3).
[0112] Zatim, pročišć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR.3) i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 8 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Po završetku reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročiš ć avanje Butil FF (Kolona: Butil FF (XK16, Amersham Biosciences), brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: B0 → 100% 5 min A (A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.5M NaCl)) (Slika 7c) i SOURCE 15Q kolona za pročišć avanje (Kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0→ 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 7d) za pročišć avanje konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 3) i imunoglobulinski Fc. Slika 7c je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 3) i Fc imunoglobulina preko kolone za pročišć avanje Butil FF, i Fig. 7d je graf koji prikazuje rezultat pročiš ć avanja konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.3) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročiš ć avanje SOURCE 15Q.
Primer 10: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.23) i imunoglobulinski Fc
[0113] Prvo, za PEGilaciju ostatka cisteina na položaju 24 sekvence amino kiselina derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 23) sa MAL-10K-ALD PEG (NOF., Japan), derivat oksintomodulina (SEK ID BR.23) i MAL-10KALD PEG su reagovali u molarnom odnosu 1 : 3 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u 50 mM Tris puferu (pH 8.0) i 45% izopropanolu, i u to je dodat 1M gvanidin. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za prociscavanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim cisteinom (kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 100% 50 min (A: 20 mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 8a). Slika 8a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 23) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
[0114] Zatim, pročišć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 23) i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 5 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q (kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 8b) i kolona za pročišć avanje sa ISO-om (kolona: SOURCE ISO, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: B 0→ 100% 100 min A, (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.1M AS)) (Slika 8c) za pročišć avanje konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 23) i imunoglobulinski Fc. Slika 8b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 23) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q, i Slika 8c je grafikon koji prikazuje rezultat pročiš ć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.23) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Source ISO.
Primer 11: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.24) i imunoglobulinski Fc
[0115] Prvo, za PEGilaciju ostatka cisteina na položaju 30 amino kiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 24) sa MAL-10K-ALD PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 24) i MAL-10K-ALD PEG reaguju u molarnom odnosu 1 : 3 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u 50 mM Tris puferu (pH 8.0) i 45% izopropanolu, i u to je dodat 1M gvanidin. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišćavanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim cisteinom (kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A0 → 100% 50 min B (A: 20 mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 9a). Slika 9a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 24) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
[0116] Zatim, pročišć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 24) i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 5 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q (kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 9b) i kolone za pročišć avanje ISO-a (kolona: SOURCE ISO, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: B→ 100% 100 min A, (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.1M AS)) (Slika 9c) za pročišć avanje konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 24) i imunoglobulinski Fc. Slika 9b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 24) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q, i Slika 9c je grafikon koji prikazuje rezultat pročiš ć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.24) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje Source ISO.
Primer 12: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.25) i imunoglobulinski Fc
[0117] Prvo, za PEGilaciju ostatka cisteina na poziciji 30 aminokiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 25) sa MAL-10K-ALD PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 25) i MAL-10K-ALD PEG reaguje u molarnom odnosu 1 : 3 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u 50 mM Tris puferu (pH 8.0) i dodat je 1M gvanidin. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišćavanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim cisteinom (kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 100% 50 min (A: 20mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 10a). Slika 10a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 25) kroz kolonu za pročiš ć avanje SOURCE S.
[0118] Sledeć e, pročiš ć eni mono-PEGilovani oksintomodulinski derivat (SEK ID BR. 25) i imunoglobulinski Fc reaguju u molarnom odnosu 1 : 5 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q (kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 10b) i kolona za pročišć avanje sa ISO-om (kolona:SOURCE ISO, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: B 0→ 100% 100 min A, (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.1M AS)) (Slika 10c) za pročišć avanje konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR 25) i imunoglobulinski Fc. Slika 10b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 25) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15K, i Slika 10c je grafikon koji prikazuje rezultat pročiš ć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.25) i imunoglobulinski Fc preko kolone za pročišć avanje Source ISO.
Primer 13: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.28) i imunoglobulinski Fc
[0119] Prvo, za PEGilaciju lizinskog ostatka na položaju 20 amino kiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 28) sa 3.4 K PropionALD (2) PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 28) i MAL-10K-ALD PEG reagovali su u molarnom odnosu 1 : 5 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na 4 °C tokom 3 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u 50 mM Na-Boratnom puferu (pH 9.0) i dodato mu je 2M gvanidina. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišćavanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim lizinom (kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A0 → 3% 1 min B → 40% 222 min B (A: 20 mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)) (Slika 11a). Slika 11a je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja mono-PEGilovanog derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 28) kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE S.
[0120] Zatim, pročišć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 28) i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 10 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q (kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1M NaCl)) (Slika 11b) i kolona za pročišć avanje sa ISO-om (kolona: SOURCE ISO, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: B 0 → 100% 100 min A, (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.1M AS)) (Slika 11c) za pročišć avanje konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 28) i imunoglobulinski Fc. Slika 11b je grafikon koji prikazuje rezultat pročišć avanja konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 28) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q, Slika 11c je grafikon koji prikazuje rezultat pročiš ć avanja konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.28) i imunoglobulinski Fc kroz kolonu za pročiš ć avanje Source ISO.
Primer 14: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.32) i imunoglobulinski Fc
[0121] Prvo, za PEGilaciju cisteinskog ostatka na položaju 30 aminokiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR.
32) sa MAL-10K-ALD PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 32) i MAL-10K-ALD PEG su reagovali u molarnom odnosu 1 : 3 sa koncentracijom proteina od 1 mg/ml na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u 50 mM Tris puferu (pH 8.0) i dodato mu je 2M gvanidina. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim cisteinom (kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0→ 100% 50 min (A: 20mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)).
[0122] Sledeć e, pročiš ć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 32) i imunoglobulinski Fc reaguju u molarnom odnosu 1 : 8 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q (kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A 1 M NaCl)) i kolona za pročišć avanje Source ISO (kolona: SOURCE ISO, brzina protoka: 2,0 ml/min, gradijent: B 0 → 100% 100 min A, (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.1M AS)) za pročišć avanje konjugata uključuju ć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.32) i imunoglobulinski Fc.
Primer 15: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.33) i imunoglobulinski Fc
[0123] Prvo, za PEGilaciju ostatka cisteina na poziciji 30 sekvence amino kiselina derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 33) sa MAL-10K-ALD PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 33) i MAL-10K-ALD PEG su reagovali u molarnom odnosu 1 : 1 sa koncentracijom proteina od 1 mg/ml na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u 50 mM Tris puferu (pH 8.0) i dodato mu je 2M gvanidina. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim cisteinom (kolona: SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0→ 100% 50 min (A: 20mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)).
[0124] Zatim, pročišć eni mono-PEGilovani derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 33) i imunoglobulinski Fc su reagovali u molarnom odnosu 1 : 5 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q (kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A 1 M NaCl)) i kolona za pročišć avanje Source ISO (kolona: SOURCE ISO, brzina protoka: 2,0 ml/min, gradijent: B 0 → 100% 100 min A, (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.1 M AS)) za pročišć avanje konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.33) i imunoglobulinski Fc.
Primer 16: Priprema konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.34) i imunoglobulinski Fc
[0125] Prvo, za PEGilaciju ostatka cisteina na položaju 30 amino kiselinske sekvence derivata oksintomodulina (SEK ID BR. 34) sa MAL-10K-ALD PEG, derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 34) i MAL-10K-ALD PEG su reagovali u molarnom odnosu 1 : 1 sa koncentracijom proteina od 3 mg/ml na sobnoj temperaturi tokom 3 sata. Za to vreme, reakcija je izvedena u 50 mM Tris puferu (pH 8.0) i dodat je 1M gvanidin. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE S da bi se pročistio derivat oksintomodulina sa mono-pegilovanim cisteinom (kolona:SOURCE S, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 100% 50 min (A: 20mM Na-citrat, pH 3.0 45% etanol, B: A 1M KCl)).
[0126] Zatim, pročišć eni mono-PEGilovani oksintomodulinski derivat (SEK ID BR. 34) i imunoglobulinski Fc reaguju u molarnom odnosu 1 : 5 sa koncentracijom proteina od 20 mg/ml na 4 °C tokom 16 sati. Za to vreme, reakcija je izvedena u 100 mM kalijum fosfatnog pufera (pH 6.0) i dodato je 20 mM SCB kao redukcioni agens. Nakon završetka reakcije, reakciona smeša je primenjena na kolonu za pročišć avanje SOURCE 15Q (kolona: SOURCE 15Q, brzina protoka: 2.0 ml/min, gradijent: A 0 → 4% 1 min B → 20% 80 min B (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, B: A 1 M NaCl)) i kolona za pročišć avanje Source ISO (kolona: SOURCE ISO, brzina protoka: 2,0 ml/min, gradijent: B 0 → 100% 100 min A, (A: 20 mM Tris-HCl, pH 7.5, B: A 1.1M AS)) za pročišć avanje konjugata uključujuć i derivat oksintomodulina (SEK ID BR.34) i imunoglobulinski Fc.
Primer 17: In vitro aktivnost konjugata derivata oksintomodulina i imunoglobulinskog Fc
[0127] U cilju merenja efikasnosti protiv gojaznosti konjugata uključujuć i oksintomodulin ili derivat oksintomodulina i imunoglobulinski Fc koji su pripremljeni u gore navedenim Primerima, eksperimenti su izvedeni na isti način kao u Primeru 2-2.
[0128] Specifično, svaki od transformanata pripremljenih u Primerima 1-1 i 1-2 je subkultivisan dva ili tri puta nedeljno, i alikvotiran u svaki bunarčić mikrotitar ploče sa 96 bunarčić a pri gustini od 1 X 105, pra ć eno kultivacijom od 24 sata. Svaki od kultivisanih transformanata je ispran sa KRB puferom i suspendovan u 40 ml KRB pufera koji sadrži 1 mM IBMX, i ostavljen na sobnoj temperaturi 5 minuta. GLP-1, glukagon i derivat oksintomodulina (SEK ID BR. 23, 24, 25, 32, 33 ili 34) - konjugati imunoglobulinskog Fc razređeni su od 1000 nM do 0.02 nM sa 5-strukim serijskim razblaženjem, i po 40 ml je dodato svakom transformantu i kultivisano na 37 °C tokom 1 sata u CO2 inkubatoru. Zatim, 20 ml pufera za lizu ć elije je dodato radi lize celije, a ć elijski lizati su primenjeni na cAMP test kit ( Molecular Device, USA) da bi se izmerile koncentracije cAMP koristeć i Victor (Perkin Elmer, USA). Iz toga su izračunate vrednosti EC50 i upoređene jedna sa drugom (Tabela 3).
Tabela 3
Tabela 3
[0130] Kao što je prikazano u Tabeli 3, konjugati derivata oksintomodulina-imunoglobulinskog Fc pokazuju in vitro aktivnost na GLP-1 i glukagon receptore.
Primer 18: In vivo aktivnost konjugata derivata oksintomodulina-imunoglobulina
[0131] Ispitano je da li konjugati derivata oksintomodulina-imunoglobulinskog Fc pokazuju odlične in vivo efekte smanjenja telesne težine.
[0132] Konkretno, normalni C57BL/6 miševi stari 6 nedelja su hranjeni sa visoko masnom ishranom od 60 kcal tokom 24 nedelje da bi poveć ali svoju telesnu težinu u proseku za približno 50 g, i subkutano su im primenjivani derivat oksintomodulina (SEK ID BR.23, 24). ili 25) -imunoglobulinski Fc konjugati u dozi od 0,03 ili 0,06 mg/kg/nedeljno tokom 3 nedelje. Posle toga, izmerene su telesne težine miševa (Slika 12 i Slika 13). Slika 12 i Slika 13 su grafikoni koji pokazuju promene telesne težine miševa u skladu sa tipom i dozom primene konjugata derivata oksintomodulina-imunoglobulinskog Fc. Kao što je prikazano na Slici 12 i Slici 13, pošto je primenjena doza konjugata derivata oksintomodulina-imunoglobulinskog Fc poveć ana, telesna težina je smanjena u direktnoj proporciji, iako su postojale razlike između tipova konjugata oksintomodulinskih derivataimunoglobulinskog Fc, što ukazuje da konjugati derivata oksintomodulina-imunoglobulinskog Fc smanjuju telesnu težinu zavisno od doze.

Claims (25)

Patentni Zahtevi
1. Konjugat koji sadrži derivat oksintomodulina koji sadrži sekvencu aminokiselina SEK ID BR: 24, 25 ili 26, imunoglobulinski Fc region, i ne-peptidilni polimer, pri čemu ne-peptidilni polimer kovalentno povezuje derivat oksintomodulina i imunoglobulinski Fc region.
2. Konjugat prema zahtevu 1, u kojem derivat oksintomodulina sadrži sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 24.
3. Konjugat prema zahtevu 1, u kojem amino kiseline na pozicijama 12 i 16 ili 16 i 20 derivata oksintomodulina formiraju prsten.
4. Konjugat prema zahtevu 3, u kojem derivat oksintomodulina sadrži sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 25.
5. Konjugat prema zahtevu 3, u kojem derivat oksintomodulina sadrži sekvencu aminokiseline SEK ID BR: 26.
6. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 5, u kojem je derivat oksintomodulina sposoban da aktivira GLP-1 receptor i glukagon receptor.
7. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 6, u kojem konjugat ima efekte protiv gojaznosti.
8. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 7, u kojem je ne-peptidilni polimer polietilen glikol, polipropilen glikol, kopolimer etilen glikol propilen glikola, polioksietilovani poliol, polivinil alkohol, polisaharid, polivinil etil etar, polilaktična kiselina (PLA), polilaktična-glikolna kiselina (PLGA), lipidni polimer, hijaluronska kiselina, ili njihova kombinacija.
9. Konjugat prema zahtevu 8, u kojem je ne-peptidilni polimer polietilen glikol.
10. Konjugat prema zahtevu 8, u kojem je polisaharid dekstran, hitin ili njihova kombinacija.
11. Konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 10, u kojem je jedan kraj ne-peptidil polimera vezan za amin grupu ili tiol grupu imunoglobulinskog Fc regiona i drugi kraj ne-peptidil polimera je povezan sa amino grupom ili tiol grupom derivata oksintomodulina.
12. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 11, u kojem ne-peptidilni polimer ima reaktivne grupe sposobne za vezivanje sa imunoglobulinskim Fc regionom i derivatom oksintomodulina na oba kraja.
13. Konjugat prema zahtevu 12, u kojem je reaktivna grupa odabrana iz aldehidne grupe, propionaldehidne grupe, butiraldehidne grupe, maleimidne grupe ili sukcinimidnog derivata.
14. Konjugat prema zahtevu 12, u kojem su reaktivne grupe na oba kraja iste ili različite jedna od druge.
15. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 14, u kojem je imunoglobulinski Fc region ne-glikozilovani Fc region.
16. Konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 15, u kojem je imunoglobulinski Fc region CH1 domen, CH2 domen, CH3 domen i CH4 domen; CH1 domen i CH2 domen; CH1 domen i CH3 domen; CH2 domen i CH3 domen; kombinacija jednog ili više domena i imunoglobulinskog zglobnog regiona ili njegovog dela; ili dimer svakog domena konstantnih regiona teškog lanca i konstantnog regiona lakog lanca.
17. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 16, u kojem je imunoglobulinski Fc region derivat u kome se briše region koji je sposoban da formira disulfidnu vezu, neki ostaci amino kiselina se eliminišu na N-terminalnom kraju nativnog Fc oblika, ostatak metionina se dodaje na N-terminalnom kraju nativnog Fc oblika, briše se mesto za vezivanje komplementa, ili se briše mesto za citotoksičnost koja je posredovanać elijama zavisnim od antitela (ADCC).
18. Konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 17, u kojem imunoglobulinski Fc region jeste Fc region izveden iz IgG, IgA, IgD, IgE ili IgM.
19. Konjugat prema zahtevu 18, u kojem imunoglobulinski Fc region jeste IgG4 Fc region.
20. Konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 19, u kojem je imunoglobulinski Fc region humani IgG4-izvedeni neglikozilovani Fc region.
21. Farmaceutska kompozicija za prevenciju ili lečenje gojaznosti, koja sadrži konjugat prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 20.
22. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 21, koja dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
23. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 21 ili 22, gde se kompozicija primenjuje sama ili u kombinaciji sa drugim farmaceutskim formulacijama koje pokazuju profilaktičke ili terapeutske efekte na gojaznost.
24. Farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od zahteva 21 do 23, gde je farmaceutska formulacija agonist receptora GLP-1, agonist leptin receptora, inhibitor DPP-IV, antagonist Y5 receptora, antagonist receptora koncentracije hormona za melanin (MCH), agonist receptora Y2/3, agonist receptora MC3/4, inhibitor lipaze želuca/pankreasa, agonist 5HT2c, agonist β3A receptora, agonist receptora amilina, antagonist grelina ili antagonist receptora grelina.
25. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 20 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kojem od zahteva 21 do 24, koji su za upotrebu u prevenciji ili lečenju gojaznosti.
RS20190079A 2011-06-17 2012-06-15 Konjugat koji sadrži oksintomodulin i imunoglobulinski fragment, i njegova upotreba RS58606B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20110058852 2011-06-17
EP12801247.3A EP2721062B1 (en) 2011-06-17 2012-06-15 A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
PCT/KR2012/004722 WO2012173422A1 (en) 2011-06-17 2012-06-15 A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58606B1 true RS58606B1 (sr) 2019-05-31

Family

ID=47357296

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190079A RS58606B1 (sr) 2011-06-17 2012-06-15 Konjugat koji sadrži oksintomodulin i imunoglobulinski fragment, i njegova upotreba

Country Status (33)

Country Link
US (3) US9731031B2 (sr)
EP (2) EP3502129B1 (sr)
JP (2) JP6038905B2 (sr)
KR (2) KR101577734B1 (sr)
CN (2) CN109306015B (sr)
AR (2) AR086969A1 (sr)
AU (3) AU2012270366C1 (sr)
BR (1) BR112013032375B1 (sr)
CA (2) CA2838504C (sr)
CL (1) CL2013003619A1 (sr)
CY (1) CY1121255T1 (sr)
DK (2) DK3502129T3 (sr)
ES (2) ES2710356T3 (sr)
HR (1) HRP20190265T1 (sr)
HU (1) HUE042585T2 (sr)
IL (4) IL229759A (sr)
LT (1) LT2721062T (sr)
MX (2) MX381780B (sr)
MY (1) MY164680A (sr)
PE (3) PE20181268A1 (sr)
PH (2) PH12018501119B1 (sr)
PL (1) PL2721062T3 (sr)
PT (1) PT2721062T (sr)
RS (1) RS58606B1 (sr)
RU (2) RU2733544C2 (sr)
SG (2) SG10201605006XA (sr)
SI (1) SI2721062T1 (sr)
SM (1) SMT201900078T1 (sr)
TR (1) TR201901402T4 (sr)
TW (2) TWI601744B (sr)
UA (2) UA125895C2 (sr)
WO (1) WO2012173422A1 (sr)
ZA (1) ZA201309013B (sr)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9249407B2 (en) 2006-02-03 2016-02-02 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US20150038413A1 (en) 2006-02-03 2015-02-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US10221228B2 (en) 2006-02-03 2019-03-05 Opko Biologics Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US8048849B2 (en) 2006-02-03 2011-11-01 Modigene, Inc. Long-acting polypeptides and methods of producing same
US20140113860A1 (en) 2006-02-03 2014-04-24 Prolor Biotech Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
US12203113B2 (en) 2009-07-09 2025-01-21 Opko Biologics Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US9663778B2 (en) 2009-07-09 2017-05-30 OPKO Biologies Ltd. Long-acting coagulation factors and methods of producing same
US10166295B2 (en) 2011-06-02 2019-01-01 Opko Biologics Ltd. Pegylated OXM variants
WO2013183052A1 (en) 2012-06-04 2013-12-12 Prolor Biotech Inc. Pegylated oxm variants
CA2838503C (en) 2011-06-10 2020-02-18 Hanmi Science Co., Ltd. Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
ES2710356T3 (es) 2011-06-17 2019-04-24 Hanmi Science Co Ltd Conjugado que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina, y uso del mismo
KR20130049671A (ko) 2011-11-04 2013-05-14 한미사이언스 주식회사 생리활성 폴리펩타이드 결합체 제조 방법
AR090281A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Hanmi Science Co Ltd Proceso mejorado para la preparacion de un complejo polipeptidico fisiologicamente activo
KR101968344B1 (ko) * 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
WO2014049610A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Cadila Healthcare Limited Peptides as gip, glp-1 and glucagon receptors triple-agonist
UA116217C2 (uk) 2012-10-09 2018-02-26 Санофі Пептидна сполука як подвійний агоніст рецепторів glp1-1 та глюкагону
MY197849A (en) * 2012-11-06 2023-07-20 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
SG11201503526UA (en) 2012-12-21 2015-06-29 Sanofi Sa Dual glp1/gip or trigonal glp1/gip/glucagon agonists
AR096890A1 (es) * 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugando fc de inmunoglobulina, que mantiene la afinidad de unión del fragmento fc de la inmunoglobulina a fcrn
AR096891A1 (es) 2013-07-12 2016-02-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Conjugado de monómero polipéptido biológicamente activo y conjugado de fragmento fc de inmunoglobulina, que muestra aclaramiento mediado por receptor reducido, y el método para la preparación del mismo
US20150158926A1 (en) 2013-10-21 2015-06-11 Opko Biologics, Ltd. Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same
WO2015086730A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Non-acylated exendin-4 peptide analogues
WO2015086733A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/glucagon receptor agonists
WO2015086729A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Sanofi Dual glp-1/gip receptor agonists
EP3080150B1 (en) 2013-12-13 2018-08-01 Sanofi Exendin-4 peptide analogues as dual glp-1/gip receptor agonists
MA43289B1 (fr) 2014-01-20 2019-12-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Insuline à action prolongée et utilisation associée
EA201691795A1 (ru) * 2014-03-31 2017-03-31 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Способ улучшения растворимости белка и пептида за счет использования связывания с фрагментом fc иммуноглобулина
TW201625670A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自ｅｘｅｎｄｉｎ－４之雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑
TW201625668A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 作為胜肽性雙重ｇｌｐ－１／昇糖素受體激動劑之艾塞那肽－４衍生物
TW201625669A (zh) 2014-04-07 2016-07-16 賽諾菲公司 衍生自艾塞那肽－４（Ｅｘｅｎｄｉｎ－４）之肽類雙重ＧＬＰ－１／升糖素受體促效劑
AR100639A1 (es) 2014-05-29 2016-10-19 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Composición para tratar diabetes que comprende conjugados de análogos de insulina de acción prolongada y conjugados de péptidos insulinotrópicos de acción prolongada
TWI684458B (zh) * 2014-05-30 2020-02-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 包含胰島素及ｇｌｐ-１/昇糖素雙重促效劑之治療糖尿病之組成物
KR20150140177A (ko) 2014-06-05 2015-12-15 한미약품 주식회사 단백질 및 펩타이드의 면역원성을 감소시키는 방법
US9932381B2 (en) 2014-06-18 2018-04-03 Sanofi Exendin-4 derivatives as selective glucagon receptor agonists
TWI802396B (zh) 2014-09-16 2023-05-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
PH12021552108A1 (en) 2014-12-10 2022-05-11 Opko Biologics Ltd Methods of producing long acting ctp-modified growth hormone polypeptides
KR102418477B1 (ko) * 2014-12-30 2022-07-08 한미약품 주식회사 글루카곤 유도체
AR103322A1 (es) * 2014-12-30 2017-05-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Derivados de glucagón con estabilidad mejorada
AR105319A1 (es) 2015-06-05 2017-09-27 Sanofi Sa Profármacos que comprenden un conjugado agonista dual de glp-1 / glucagón conector ácido hialurónico
CN113289009B (zh) 2015-06-19 2025-05-02 Opko生物科学有限公司 长效凝固因子及其产生方法
PT3322437T (pt) 2015-06-30 2024-03-20 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Derivado de glucagon e composição que compreende um conjugado de ação prolongada do mesmo
TW201706291A (zh) 2015-07-10 2017-02-16 賽諾菲公司 作為選擇性肽雙重ｇｌｐ－１／升糖素受體促效劑之新毒蜥外泌肽（ｅｘｅｎｄｉｎ－４）衍生物
UY36870A (es) 2015-08-28 2017-03-31 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Análogos de insulina novedosos
JP7222710B2 (ja) * 2015-09-24 2023-02-15 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 免疫グロブリン断片の特定位置を連結部位として用いたタンパク質結合体
EA038544B1 (ru) 2015-12-31 2021-09-13 Ханми Фарм. Ко., Лтд. Тройной агонист рецепторов глюкагона/glp-1/gip
UA126662C2 (uk) 2016-06-29 2023-01-11 Ханмі Фарм. Ко., Лтд. Похідна глюкагону, її кон'югат, композиція, яка її містить, та її терапевтичне застосування
SG10202100189WA (en) 2016-07-11 2021-02-25 Opko Biologics Ltd Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same
BR112019005637A2 (pt) 2016-09-23 2019-07-30 Hanmi Pharm Ind Co Ltd análogos da insulina com afinidade reduzida para o receptor de insulina e seu uso
JOP20190095A1 (ar) 2016-10-27 2019-04-28 Janssen Pharmaceutica Nv مركبات ببتيد تيروسين-تيروسين الحلقية كمعدلات لمستقبلات الببتيد العصبي y
AR110299A1 (es) 2016-12-02 2019-03-13 Sanofi Sa Conjugados que comprenden un agonista dual de glp-1 / glucagón, un conector y ácido hialurónico
CN108299553B (zh) * 2017-01-13 2021-07-16 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 胃泌酸调节素修饰物
JP2020506932A (ja) 2017-02-03 2020-03-05 ハンミ ファーマシューティカル カンパニー リミテッド 持続性が増加した生理活性物質の結合体及びその用途
TWI798209B (zh) 2017-03-23 2023-04-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 對胰島素受體有降低親和性之胰島素類似物之接合物及其用途
WO2019035672A1 (ko) 2017-08-16 2019-02-21 동아에스티 주식회사 아실화 옥신토모듈린 펩타이드 유사체
AU2018318672B2 (en) 2017-08-16 2021-04-15 Dong-A St Co., Ltd. Acylated oxyntomodulin peptide analog
WO2019171352A2 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
TW202015735A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 法商賽諾菲公司 包含ｇｌｐ－１／升糖素／ｇｉｐ三重受體促效劑、連接子及透明質酸之接合物
KR20200135618A (ko) * 2019-05-23 2020-12-03 ㈜ 디앤디파마텍 폴리펩티드를 포함하는 비알코올성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
EP3823659A4 (en) * 2018-07-19 2022-06-22 D&D Pharmatech Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH A POLYPEPTIDE
CN110964116A (zh) * 2018-09-26 2020-04-07 北京辅仁瑞辉生物医药研究院有限公司 GLP1-Fc融合蛋白及其缀合物
US12441776B2 (en) 2018-11-30 2025-10-14 Eirgen Pharma Ltd. Oxyntomodulin peptide analog formulations
WO2020128967A2 (en) * 2018-12-19 2020-06-25 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity
CN114853908B (zh) * 2019-05-16 2024-06-07 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的融合蛋白
AU2021276071A1 (en) * 2020-05-22 2023-02-02 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Liquid formulation
CR20250275A (es) * 2023-01-17 2025-08-18 Lilly Co Eli Enlazadores novedosos para el suministro sostenido de terapéuticos

Family Cites Families (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
CA2249195A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
JP3895109B2 (ja) 1998-03-06 2007-03-22 中外製薬株式会社 蛋白非添加製剤
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6677136B2 (en) 2000-05-03 2004-01-13 Amgen Inc. Glucagon antagonists
GB0121709D0 (en) * 2001-09-07 2001-10-31 Imp College Innovations Ltd Food inhibition agent
US7737260B2 (en) * 2003-11-13 2010-06-15 Hanmi Pharm. Co., Ltd Protein complex using an immunoglobulin fragment and method for the preparation thereof
US7217845B2 (en) * 2002-11-25 2007-05-15 Sun Bio, Inc. Bifunctional polyethylene glycol derivatives
GB0300571D0 (en) 2003-01-10 2003-02-12 Imp College Innovations Ltd Modification of feeding behaviour
EP1594530A4 (en) 2003-01-22 2006-10-11 Human Genome Sciences Inc HYBRID PROTEINS OF ALBUMIN
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
WO2005035761A1 (en) 2003-10-16 2005-04-21 Compugen Ltd. Splice variants of preproglucagon, glucagon-like peptide-1 and oxyntomodulin
US8263084B2 (en) 2003-11-13 2012-09-11 Hanmi Science Co., Ltd Pharmaceutical composition for treating obesity-related disease comprising insulinotropic peptide conjugate
KR101135244B1 (ko) * 2007-11-29 2012-04-24 한미사이언스 주식회사 인슐린 분비 펩타이드 결합체를 포함하는 비만 관련질환 치료용 조성물
US20090238838A1 (en) 2003-11-13 2009-09-24 Hanmi Pharm. Ind. Co. Ltd. Insulinotropic peptide conjugate using an immunoglobulin fc
RU2428431C2 (ru) 2004-12-02 2011-09-10 Домантис Лимитед Слитые конструкции лекарственного средства и конъюгаты
CA2597649A1 (en) 2005-02-11 2006-08-17 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Gip analog and hybrid polypeptides with selectable properties
DK1888094T3 (da) * 2005-03-31 2009-11-09 Amylin Pharmaceuticals Inc Amylin og amylinagonister til behandling af psykiatriske sygdomme og forstyrrelser
KR100754667B1 (ko) 2005-04-08 2007-09-03 한미약품 주식회사 비펩타이드성 중합체로 개질된 면역글로불린 Ｆｃ 단편 및이를 포함하는 약제학적 조성물
GB0511986D0 (en) * 2005-06-13 2005-07-20 Imp College Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
JP2008543816A (ja) 2005-06-13 2008-12-04 インペリアル イノベーションズ リミテッド 新規化合物および該化合物が摂食行動に及ぼす効果
AU2006279680B2 (en) 2005-08-11 2012-12-06 Amylin Pharmaceuticals, Llc Hybrid polypeptides with selectable properties
US20090297496A1 (en) 2005-09-08 2009-12-03 Childrens Hospital Medical Center Lysosomal Acid Lipase Therapy for NAFLD and Related Diseases
EP2471810A1 (en) * 2006-02-22 2012-07-04 Merck Sharp & Dohme Corporation Oxyntomodulin derivatives
WO2007146038A2 (en) 2006-06-07 2007-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
KR100880509B1 (ko) 2006-10-16 2009-01-28 한미약품 주식회사 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 신규한 벡터, 발현세포주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
TWI428346B (zh) 2006-12-13 2014-03-01 Imp Innovations Ltd 新穎化合物及其等對進食行為影響
GB0624868D0 (en) * 2006-12-13 2007-01-24 Imp Innovations Ltd Novel compounds and their effects on feeding behaviour
JP2008169195A (ja) 2007-01-05 2008-07-24 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd キャリア物質を用いたインスリン分泌ペプチド薬物結合体
US20090098130A1 (en) 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
AU2008216265B2 (en) * 2007-02-15 2014-04-03 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/GLP-1 receptor co-agonists
US20100196405A1 (en) 2007-07-10 2010-08-05 Kingman Ng GLP-1 Fc FUSION PROTEIN FORMULATION
CN103416421B (zh) 2007-07-27 2016-07-27 拜尔农作物科学股份公司 三元活性化合物结合物
AU2008306141A1 (en) 2007-09-11 2009-04-09 Mondobiotech Laboratories Ag Thyrotropin releasing hormone for therapeutic applications
EP2214691B1 (en) 2007-10-30 2015-09-30 Indiana University Research and Technology Corporation Compounds exhibiting glucagon antagonist and glp-1 agonist activity
AU2009210570B2 (en) 2008-01-30 2014-11-20 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based insulin prodrugs
MX337038B (es) 2008-06-17 2016-02-10 Univ Indiana Res & Tech Corp Co-antagonistas de receptor de glucagon/glp-1.
CN104447980A (zh) 2008-06-17 2015-03-25 印第安纳大学研究及科技有限公司 在生理pH缓冲液中具有增强的溶解性和稳定性的胰高血糖素类似物
WO2010013012A2 (en) 2008-08-01 2010-02-04 Lund University Bioscience Ab Novel polypeptides and uses thereof
US8680263B2 (en) 2008-09-19 2014-03-25 Nektar Therapeutics Carbohydrate-based drug delivery polymers and conjugates thereof
US20110171312A1 (en) 2008-09-19 2011-07-14 Nektar Therapeutics Modified therapeutic peptides, methods of their preparation and use
MX2011006320A (es) 2008-12-15 2011-09-22 Zealand Pharma As Analogos de glucagon.
SG172291A1 (en) 2008-12-19 2011-07-28 Univ Indiana Res & Tech Corp Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
EA020843B1 (ru) 2009-02-03 2015-02-27 Амуникс Оперейтинг Инк. Удлиненные рекомбинантные полипептиды и содержащие их композиции
WO2010096052A1 (en) * 2009-02-19 2010-08-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Oxyntomodulin analogs
PL2408800T3 (pl) 2009-03-20 2016-11-30 Sposób wytwarzania koniugatu miejscowo-specyficznego, fizjologicznie aktywnego polipeptydu
WO2010108154A2 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Amgen Inc. Selective and potent peptide inhibitors of kv1.3
MX2011013625A (es) 2009-06-16 2012-01-20 Univ Indiana Res & Tech Corp Compuestos glucagon activo de receptor de gip.
AP3329A (en) 2009-07-13 2015-06-30 Zealand Pharma As Acylated glucagon analogues
WO2011056713A2 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Glp-1 receptor agonist compounds for obstructive sleep apnea
WO2011071957A1 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Sea Lane Biotechnologies, Llc Conjugates comprising an antibody surrogate scaffold with improved pharmacokinetic properties
WO2011075393A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Indiana University Research And Technology Corporation Glucagon/glp-1 receptor co-agonists
AR079344A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina, composicion farmaceutica que lo comprende y uso para preparar un medicamento util para tratar diabetes no insulinodependiente y/u obesidad
AR079345A1 (es) 2009-12-22 2012-01-18 Lilly Co Eli Analogo peptidico de oxintomodulina
RU2559320C2 (ru) 2010-03-26 2015-08-10 Ново Нордиск А/С Новые аналоги глюкагона
RU2012153753A (ru) 2010-05-13 2014-06-20 Индиана Юниверсити Рисерч Энд Текнолоджи Корпорейшн Пептиды глюкагонового суперсемейства, обладающие активностью в отношении сопряженных с g-белком рецепторов
CA2796894A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Indiana University Research And Technology Corporation Amide based glucagon superfamily peptide prodrugs
KR101337797B1 (ko) 2010-07-14 2013-12-06 한미사이언스 주식회사 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제
KR101382593B1 (ko) 2010-07-21 2014-04-10 한미사이언스 주식회사 신규한 지속형 글루카곤 결합체 및 이를 포함하는 비만 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN102576513B (zh) 2010-09-06 2014-11-12 松下电器产业株式会社 显示装置及其控制方法
CN101974077A (zh) 2010-09-15 2011-02-16 南京瑞年天平医药科技有限公司 一种新颖的多肽化合物
KR101303388B1 (ko) 2010-10-26 2013-09-03 한미사이언스 주식회사 지속형 인터페론 알파 결합체의 액상 제제
KR101767570B1 (ko) 2010-10-26 2017-08-14 한미사이언스 주식회사 항 비만 펩타이드의 지속형 결합체
CN102010473A (zh) 2010-11-10 2011-04-13 曹鹏 重组胃泌酸调节素融合蛋白及其制备和应用
RU2013133803A (ru) 2010-12-22 2015-01-27 Маркадиа Байотек, Инк. Способы лечения метаболических нарушений и ожирения при помощи пептидов на основе глюкагона, активных по отношению к рецепторам гип и гпп
EP2492749A1 (en) 2011-02-28 2012-08-29 Rohm and Haas Electronic Materials LLC Photoresist compositions and methods of forming photolithographic patterns
KR101161526B1 (ko) 2011-05-16 2012-07-02 숭실대학교산학협력단 연료전지용 촉매전극을 위한 코어/쉘 구조의 나노 지지체 및 그 제조방법
CA2838503C (en) 2011-06-10 2020-02-18 Hanmi Science Co., Ltd. Novel oxyntomodulin derivatives and pharmaceutical composition for treating obesity comprising the same
ES2710356T3 (es) 2011-06-17 2019-04-24 Hanmi Science Co Ltd Conjugado que comprende oxintomodulina y un fragmento de inmunoglobulina, y uso del mismo
MX2013015168A (es) 2011-06-22 2014-03-31 Univ Indiana Res & Tech Corp Co-agonista del receptor de glucagon/glp-1.
KR101665009B1 (ko) 2012-03-09 2016-10-11 한미사이언스 주식회사 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
AU2013250711A1 (en) 2012-04-19 2014-11-27 Opko Biologics Ltd. Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same
CN104583232B (zh) 2012-06-21 2018-04-13 印第安纳大学研究及科技有限公司 展现gip受体活性的胰高血糖素类似物
KR101373563B1 (ko) 2012-07-25 2014-03-12 전북대학교산학협력단 Ｔｏｆ-ｍｒａ를 이용한 혈류특성 및 ｍｒ-신호강도구배(전단율) 유도방법
KR101968344B1 (ko) 2012-07-25 2019-04-12 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 고지혈증 치료용 조성물
WO2014049610A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Cadila Healthcare Limited Peptides as gip, glp-1 and glucagon receptors triple-agonist
KR101993393B1 (ko) 2012-11-06 2019-10-01 한미약품 주식회사 옥신토모듈린 유도체를 포함하는 당뇨병 또는 비만성 당뇨병 치료용 조성물
MY197849A (en) 2012-11-06 2023-07-20 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Liquid formulation of protein conjugate comprising the oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment
JP6137046B2 (ja) 2014-05-09 2017-05-31 信越化学工業株式会社 単量体、高分子化合物、レジスト材料及びパターン形成方法
TWI802396B (zh) 2014-09-16 2023-05-11 南韓商韓美藥品股份有限公司 長效glp-1/高血糖素受體雙促效劑治療非酒精性脂肝疾病之用途
WO2019171352A2 (en) 2018-03-08 2019-09-12 Janssen Pharmaceutica Nv Methods of treating severe non-diabetic obesity

Also Published As

Publication number Publication date
IL257928B (en) 2020-02-27
JP6038905B2 (ja) 2016-12-07
RU2013153198A (ru) 2015-07-27
TW201305195A (zh) 2013-02-01
DK3502129T3 (da) 2021-07-12
CN103732616B (zh) 2018-08-17
PH12013502517A1 (en) 2014-01-20
RU2733544C2 (ru) 2020-10-05
CN103732616A (zh) 2014-04-16
SG10201605006XA (en) 2016-08-30
CN109306015A (zh) 2019-02-05
AU2017202672A1 (en) 2017-05-11
ES2710356T3 (es) 2019-04-24
IL229759A0 (en) 2014-01-30
TWI601744B (zh) 2017-10-11
AU2012270366B2 (en) 2017-02-02
EP2721062B1 (en) 2018-11-14
JP2014518209A (ja) 2014-07-28
CL2013003619A1 (es) 2014-05-30
PE20141178A1 (es) 2014-09-12
IL257928A (en) 2018-06-28
LT2721062T (lt) 2019-02-11
AU2018282298A1 (en) 2019-01-17
MX2013014779A (es) 2014-06-23
SI2721062T1 (sl) 2019-03-29
PE20181268A1 (es) 2018-08-03
SMT201900078T1 (it) 2019-02-28
WO2012173422A9 (en) 2013-03-14
US9731031B2 (en) 2017-08-15
KR101577734B1 (ko) 2015-12-29
PH12018501119B1 (en) 2022-08-03
US20190321485A1 (en) 2019-10-24
CA3080189A1 (en) 2012-12-20
RU2016147505A3 (sr) 2020-04-08
TW201506037A (zh) 2015-02-16
CA2838504C (en) 2020-07-21
RU2016147505A (ru) 2018-10-24
UA114709C2 (uk) 2017-07-25
TR201901402T4 (tr) 2019-02-21
IL229759A (en) 2017-08-31
US10363320B2 (en) 2019-07-30
EP2721062A4 (en) 2014-11-12
ES2882520T3 (es) 2021-12-02
MY164680A (en) 2018-01-30
US20140212440A1 (en) 2014-07-31
US20170340753A1 (en) 2017-11-30
AU2012270366A1 (en) 2014-01-16
CN109306015B (zh) 2022-04-26
AU2012270366C1 (en) 2017-07-13
JP6345216B2 (ja) 2018-06-20
WO2012173422A1 (en) 2012-12-20
PH12018501119A1 (en) 2019-02-04
EP3502129A1 (en) 2019-06-26
US11872283B2 (en) 2024-01-16
KR20120139579A (ko) 2012-12-27
NZ742400A (en) 2021-05-28
IL272345B (en) 2021-01-31
TWI519541B (zh) 2016-02-01
AR086969A1 (es) 2014-02-05
AU2017202672B2 (en) 2019-01-17
PT2721062T (pt) 2019-02-12
KR20140133493A (ko) 2014-11-19
RU2607365C2 (ru) 2017-01-10
UA125895C2 (uk) 2022-07-06
BR112013032375A2 (pt) 2016-11-22
NZ718999A (en) 2017-07-28
CY1121255T1 (el) 2020-05-29
CA2838504A1 (en) 2012-12-20
NZ733478A (en) 2020-06-26
ZA201309013B (en) 2014-11-26
PE20230404A1 (es) 2023-03-07
EP3502129B1 (en) 2021-04-07
EP2721062A1 (en) 2014-04-23
IL245556B (en) 2018-03-29
IL272345A (en) 2020-03-31
AU2018282298B2 (en) 2020-06-18
CA3080189C (en) 2023-01-17
PL2721062T3 (pl) 2019-05-31
MX353402B (es) 2018-01-11
BR112013032375B1 (pt) 2022-09-20
MX381780B (es) 2025-03-13
KR101591411B1 (ko) 2016-02-05
AR125914A2 (es) 2023-08-23
NZ618811A (en) 2016-05-27
SG195275A1 (en) 2013-12-30
IL245556A0 (en) 2016-06-30
HRP20190265T1 (hr) 2019-04-05
JP2017071609A (ja) 2017-04-13
DK2721062T3 (en) 2019-02-25
HUE042585T2 (hu) 2019-07-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2018282298B2 (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
RU2739209C2 (ru) Новые производные оксинтомодулина и содержащая их фармацевтическая композиция для лечения ожирения
KR102291020B1 (ko) 안정성이 증가된 글루카곤 유도체
CN108025041A (zh) 胰高血糖素衍生物和包含其长效缀合物的组合物
HK40009561B (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
HK40003883A (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
HK40003883B (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
HK40009561A (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
NZ742400B2 (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
HK1193828A (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof
NZ718999B2 (en) A conjugate comprising oxyntomodulin and an immunoglobulin fragment, and use thereof