[go: up one dir, main page]

RS55037B1 - Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi - Google Patents

Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi

Info

Publication number
RS55037B1
RS55037B1 RS20160496A RSP20160496A RS55037B1 RS 55037 B1 RS55037 B1 RS 55037B1 RS 20160496 A RS20160496 A RS 20160496A RS P20160496 A RSP20160496 A RS P20160496A RS 55037 B1 RS55037 B1 RS 55037B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mouse
human
light chain
gene
locus
Prior art date
Application number
RS20160496A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Sean Stevens
Cagan Gurer
Andrew J Murphy
Karolina A Hosiawa
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS55037B1 publication Critical patent/RS55037B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Position Input By Displaying (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

OBLAST
[0001]Genetski modifikovani miševi koji obuhvataju nepreraspoređeni segment gena ljudskogXlakog lanca imunoglobulina (h\A) i ljudskiXspojni segment gena (hJ/.) koji su funkcionalno povezani sa konstantnim regionom mišjeg kappa (k) lakog lanca Genetski modifikovani miševi koji ispoljavaju antitela koja obuhvataju laki lanac imunoglobulina koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VX-Ja sekvencu i mišju Cksekvencu.
PRETHODNO STANJE TEHNIKE
[0002]Miševi koji ispoljavaju antitela koja su potpuno ljudska, ili delimićno ljudska i delimično mišja, su poznati u ovoj oblasti. Na primer, transgenski miševi koji ispoljavaju potpuno ljudska antitela iz transgena koji sadrže ljudske gene promenljivog regiona imunoglobulina lakog i teškog lanca. Genetski modifikovani miševi koji sadrže zamenu endogenih mišjih segmenata gena promenljivog regiona teškog lanca (HCVR) i promenljivog regiona kapa (k) lakog lanca (LCVR) segmente gena sa ljudskim HCVR i LCVR segmente gena i koji prave himerna antitela s himenim ljudskim/mišjim kapa lancem, takođe su poznati.
[0003]Laki lanci antitela se enkodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (k) i lambda ( X). Laki lanci mišjeg antitela su primarnoktipa. OdnoskpremaXupotrebi lakog lanca kod Ijud je oko 60:40, dok je kod miševa oko 95:5. Preferirana upotrebaklakih lanaca kod miševa je prema izveštajima zadržana kod genetski modifikovanih miševa sposobnih da ispolje potpuno ili delimično ljudska antitela. Dakle, izgleda da su miševi koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela ograničeni u pogledu upotrebe promenljivog lambda lanca,
[0004]Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da se generišu promenljivi regloni lambda lanca, bilo mišjeg ili ljudskog, za upotrebu za pravljenje proteina za vezivanje epitopa. Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike za miševima koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu promenljivu upotrebu lambda (VX) lanca.
[0005]Postoji potreba u ovoj oblasti tehnike da miševi koji ispoljavaju potpuno ili delimično ljudska antitela, pri čemu miševi prikazuju povećanu/.promenljivu(VX) upotrebu WO 00/26373 se odnosi na mišje ispoljavanje ljudskog IgX lokusa.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0006]Ovaj pronalazak u svom najširem smislu jeste kako je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima. Opisuju se genetski modifikovani miševi, embrioni, ćelije, tkiva, kao i konstrukti nukleinske kiseline za modifikovanje miševa, i postupci i jedinjenja za pravljenje i konšćenje istih Miševi i ćelije koje generišu ljudske lambda( X)promenljive regione u kontekstu mišjeg kapa <k) lakog lanca su obezbeđeni kako se navodi u patentnim zahtevima. Miševi i ćelije koje generišu ljudskeX promenljiveregione u ovom kontekstu k iliX lakoglanca, npr. iz endogenog mišjeg lokusa lakog lanca se, takođe, opisuju. Takode, opisani su postupci za pravljenje antitela koja obuhvataju lambda promenljive regione. Postupci za odabri teških lanaca koji se ispoljavaju sa poznatim lambda promenljivim regionima se. takođe, opisuju.
[0007]Opisuju se himerni i ljudski proteini za vezivanje antigena (npr, antitela), i nukleinksa kiselina koja ih kodra, tako da obuhvataju soamtski mutirane promenljive regione, uključujući antitela koja imaju lake lance koji obuhvataju promenljiv domen izveden iz ljudskogVX iljudskog Ja segmenta gena spojenog na mišji konstantni domen kapa lakog lanca.
[0008]Ovaj pronalazak obezbeđuje miša koji obuhvata nepreraspoređeni ljudskiXsegment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (hV/„) i ljudskiXspojni segment gena (hJA) koji su funkcionalno povezani na mišji konstantni segment gena kapa lakog lanca imunoglobulina (Ck) na endogenom mišjemklokusom lakog lanca imunoglobulina pri čemu se na pomenutom lokusukelement intronskog pojačavača uzvodno od Ckgena (naznačeni Eki) i 3'kpojaćavač nizvodno od Ckgena (naznačeni Ek3') zadržavaju, pri čemu miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA,-JA. sekvencu i mišju Cksekvencu
[0009]Ovaj pronalazak još obezbeđuje: izolovanu ćeliju koja ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji sadrži preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu, pri čemu je ćelija iz. ili ju je moguće dobiti iz, miša prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, i pri čemu ćelija obuhvata hVA i hJ/. koji su funkcionalno povezani na mišji Cksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina. pri čemu se zadržava na pomenutom lokusukintronskog element pojačavača uzvodno od Ckgena (označen sa EKi) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3') su zadržani;
izolovana mišja embrionska matična (ES) ćelija obuhvata nepreraspoređeni ljudskiXsegment gena lakog lanca imunoglobulina (hVA) i ljudskiAspojni segment gena (hJA) koji su funkcionalno povezani na mišji Cksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se održava na pomenutom lokusukintronski element pojačavača uzvodno od Ck- gena (označen sa Eid} i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3');
mišji embrion obuhvata, napravljen iz, ili koji se može dobiti iz, pomenute mišje ES ćelije, pri čemu izolovani mišja embrionska matična ćelija obuhvata nepreraspoređen ljudskiXsegment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (hVA) i ljudski A spojni segment gena (hJA) koji su funkcionalno povezani na mišji Cksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se na pomenutom lokusu održavakintronski element pojačavača uzvodno od Ckgena (onačen sa Eki) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3');
hibridom koji obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz miša prema ovom pronalasku, preraspoređena sekvenca obuhvata hVA segment gena, hJA segment gena funkcionalno povezan na mišji Cksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se na pomenutom lokusu održavakelement intronskog pojačava uzvodno od Ckgena (označen sa EKi) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3'), i gde hibridom ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu; i
upotrebu B ćelije prema ovom pronalasku da se napravi hibridom koji obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz miša prema patentnom zahtvu 1, preraspoređena sekvenca obuhvata hVA segment gena, hJA segment gena funkcionalno povezan na mišji Cksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina pri čemu se na pomenutom lokusu održavakintronski element pojačavača uzvodno od Ckgena (označenog sa Eki) 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3 ), i pri čemu hibridom ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu
[0010]Ovaj pronalazak još obezbeđuje miša koji obuhvata; (a) 12 do 40 nepreraspoređenih/.segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina (hVA) i barem jedan ljudski Ja (hJA) segment gena koji se funkcionalno povezuje na mišji Ckgen na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina; pri čemu se na pomenutom lokusu održavaKelement intronskog pojačavača uzvodno od Ckgena (označen sa EkI) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3); i (b) ljudska Vk-Jksekvenca intergenske nukleinske kiseline koja je smeštena između 12 do 40 ljudskih segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina i najmanje jedna ljudska JA sekvenca nukleinske kiseline,
pri čemu miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu.
[0011]Ovaj pronalazak još obuhvata postupak za pravljenje antitela u mišu, postupak obuhvata:(a) izlaganje miša prema ovom pronalasku antigenu; (b) omogućavanje mišu da razvije imuni odgovor na antigen; i (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje ovaj antigen, pri čemu antielo obuhvata laki lanac izveden iz ljudskog VA segmenta gena. ljudskog JA segmenta gena i mišjeg Ckgena.
[0012]Opisana su antitela koja obuhvataju (a) promenljivi domen ljudskog teškog lanca (hVn) spojen na mišji konstantni region teškog lanca, i (b) ljudski VA spojen na mišji C|_ domen; uključujući gde su jedan ili više promenljivih domena somatski mutirani, npr tokom antitela ili odabira imune ćelije kod miša prema ovom pronalasku. Ovi nepreraspoređeni hVA i nepreraspoređeni hJA su funkcionalno povezani sa ljudskim ili mišjimkkonstantnim regionom (Ck).
[0013]Takođe je opisan i miš koji sadrži svoju klicinu liniju, na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca, pri čemu se ljudska lambda sekvenca promenljivog regiona ispoljava u lakom lancu koji obuhvata mišju sekvencu gena konstantnog regiona imunoglobulina.
[0014]Endogeni mišji lokus lakog nca jeklokus
[0015]U jednom varijantnom rešenju, mišu nedostaje endogena sekvenca promenljivog lakog lanca na endogenom mišjem lokusu lakog lanca.
[0016]U jednom varijantnom rešenju, svi ili pretežno svi endogeni mišji segmenti gena promenljivog regiona lakog lanca se zamene jednim ili više ljudskihAsegmenata gena promenljivog regiona.
[0017]U jednom varijantnom rešenju, ljudskaAsekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata ljudsku JA sekvencu, U jednom varijantnom rešenju, ljudska JA sekvenca se bira iz grupe koja se sastoji od JA1, JA2, JA3,JA7,i njihove kombinacije,
[0018]U jednom varijantnom rešenju, ljudska A sekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata fragment skupine A ljudskog lokusu lakog lanca U specifičnom varijantom rešenju, fragment skupne A ljudskog A lokusa lakog lanca se proteže od hVA3-27 kroz hVA3-1.
[0019]U jednom varijantnom rešenju, ljudskaA sekvencapromenljivog regiona lakog lanca obuhvata fragment skupine B ljudskog llokusa lakog lanca, U specifičnom varijantom rešenju, fragment skupne B ljudskog A lokusa lakog lanca se proteže od hVA5-52 kroz hVA1-40.
[0020]U jednom varijantnom rešenju, ljudskaAsekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata genomski fragment skupine A i genomski fragment skupine B U jednom varijantnom rešenju, ljudskaAsekvenca promenljivog regiona lakog lanca obuhvata najmanje jedan segment gena skupine A i najmanje jedan segment gena skupine B
[0021]U jednom varijantnom rešenju, više od 10% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje dva hVA segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49, U jednom varijantnom rešenju, više od 20% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje tri hVA segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49. U jednom varijantnom rešenju, više od 30% naivnog repertoara lakog lanca ovog miša se izvodi iz najmanje četiri hVA segmenta gena odabranih iz 2-8, 2-23, 1-40, 5-45, i 9-49
[0022]Takođe je opisan, miš koji ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu, pri čemu miš ispoljavakupotrebu prema A odnosu upotrebe od oko 1:1
[0023]U jednom primeru, laki lanac imunoglobulina se ispoljava iz endogenom mišjeg lokusa lakog lanca.
[0024]Takođe je opisan miš koji obuhvataAsekvencu promenljivog regiona lakog lanca (VA) i barem
jednu J sekvencu (J), dodirnu sa mišjomksekvencom konstantnog regiona lakog lanca.
[0025]U jednom varijantnom rešenju, mišu nedostaje funkcionalni mišji Vic i/ili mišji Jksegment gena.
[0026]U jednom varijantnom rešenju, VA je Ijudki VA (hVA), i J je ljudski JA (hJA.) U jednom varijantnom rešenju, hVA. i hJA su neprereaspoređeni segmenti gena.
[0027]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata više nepreraspoređenih hVA segmenata gena i barem jedan hJA segment gena. U jednom specifičnom varijantnom rešenju, više nepreraspoređenih hVA segmenata gena su barem 12 segmenata gena, barem 28 segmenata gena, ili barem 40 segmenata gena
[0028]U jednom varijantnom rešenju, barem jedan hJA segment gena se bira iz grupe koja se sastoji od JA1, JA2. JA3, JA.7. i njihove kombinacije
[0029]U jednom varijantnom rešenju. endogeni mišji A lokus lakog lanca se briše u celini ili delimično
[0030]U jednom primeru, mišjaksekvenca konstantnog regiona lakog lanca je na endogenom mišjem k lokusu lakog lanca
[0031]U jednom varijantnom rešenju. oko 10% do oko 45% B ćelija miša ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji sadrži ljudski A promenljivi domen lakog lanca (VA) i mišjikkonstantni domen lakog lanca (Ck).
[0032]U jednom varijantnom rešenju, ljudski A promenljivi domen se izvodi iz preraspoređene hVA/hJA sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od 3-1/1. 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1 3-1013, 3-10/7, 2-14/1, 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2, 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3, 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1, 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2,7-46/79-49/1, 9-49/2, 9-49/7 i 1-51/1.
[0033]U jednom varijantnom rešenju, miš još obuhvata ljudski Vk-Jkintergenski region iz ljudskogklokusa lakog lanca, pri čemu ljudski Vk-Jkintergenski region je dodiran sa VAsekvencom i J sekvencom. U specifičnom izvođenju, ljudski Vk-Jk: intergenski region se postavlja između VA sekvence i J sekvence
[0034]Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata A promenljivu sekvencu ikkonstantnu sekvencu.
[0035]U jednom varijantnom rešenju, miš ispoljavakupotrebu premaAodnosu upotrebe od oko 1:1
[0036]U jednom varijantnom rešenju, populacija nezrelih B ćelija dobijenih iz koštane srži miša ispoljavakupotrebu prema A odnosu upotrebe od oko 1:1.
[0037]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata nepreraspoređeni imunoglobulm VA i JA segment gena funkcionalno povezan na mišji lokus lakog lanca koji obuhvata mišji Cl gen.
[0038]VA i JA. segmente gena su segmenti ljudskog gena
[0039]U jednom varijantnom rešenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je k lokus lakog lanca.
[0040]Nepreraspoređeni VA i JA segmenti gena su na endogenom mišjem lokusu kapa lakog lanca
[0041]U jednom varijantnom rešenju. miš još obuhvata zamenu jednog ili više teškog lanca V, D, i/ili J segmenata gena sa jednim ili više ljudskih V, D, i/ili J segmenata gena na endogenom mišjem lokusu imunoglobulina teškog lanca.
[0042]Miš obuhvata nepreraspoređenom ljudskom imunolobulinom VA i JA segment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen,
[0043]Lokus promenljivog gena lakog lanca ( "Vklokus") obuhvata najmanje jedan ljudski VA (hVA) segment gena i barem jedan ljudski JA (hJA) segment gena. U još jednom varijantnom rešenju, Vklokus obuhvata najviše četiri hJA segmenta gena, U jednom varijantnom rešenju, V[_ lokus obuhvata dodirnu sekvencu koja obuhvata ljudsku A genomsku sekvencu, kako je formulisano u patentnim zahtevima.
[0044]U jednom varijantnom rešenju,klokus obuhvata najviše četiri hJA segmenata gena. U jednom varijantnom rešenju,klokus obuhvata najmanje jedan hVA i najmanje jedan hJA i nedostaje ili pretežno nedostaje funkcionalni Vksegment gena regiona i nedostaje ili pretežno nedostaje funkcionalni Jk segment gena regiona. U jednom varijantnom rešenju, miš ne obuhvata funkcionalni Vksegment gena regiona, U jednom varijantnom rešenju. miš ne sadrži funkcionalni Jksegment gena regiona
[0045]U jednom varijantnom rešenju, Vklokus obuhvata više hVA. U jednom varijantnom rešenju, više hVA se bira tako da kao rezultat da ispoljavanje X repertoara promenljivog regiona lakog lanca koji odražava oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, ili oko 90% ili više, VA upotrebu primećenu kod čoveka, U jednom varijantnom rešenju, Vklokus obuhvata segmente gena hV?v1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 3-21, i njihovu kombinaciju,
[0046]U jednom varijantnom rešenju, hVA obuhvata 3-1. 4-3. 2-8, 3-9, 3-10 2-11, i 3-12 U specifičnom varijantnom rešenju, Vk lokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog A lakog lanca koja se prostire od VA3-12 do VA3-1. U jednom varijantnom rešenju, Vllokus obuhvata barem 2, 3. 4. 5, 6. 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 hAks. U jednom varijantnom rešenju, hVA obuhvata 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, i 3-12 U specifičnom varijantnom rešenju, Vklokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog A lokusa koji se prostire od VA3-12 do VA3-1 U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni A lokusi lakog lanca se brišu delimično ili potpuno.
[0047]U jednom varijantnom rešenju, Vk lokus obuhvata 13 do 28 ili više hVA U specifičnom varijantnom rešenju, hVAobuhvata 2-14, 3-16, 2-18, 3-19. 3-21. 3-22, 2-23, 3-25. i 3-27 U specifičnom varijantnom rešenju,klokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskogAlokusa koji se prostire od VA3-27 do VA3-1. Vk lokus je na endogenom k lokusu. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni A lokusi lakog lanca se brišu delimično ili potpuno.
[0048]U jednom varijantnom rešenju, Vklokus obuhvata 29 do 40 hVA. U specifičnom varijantnom rešenju,klokus obuhvata dodirnu sekvencu ljudskog A lokusa koji se prostire od VA3-29 do VA.3-1, i dodirnu sekvencu ljudskog A lokusa koji se prostire od VA5-52 do VA1-40 U specifičnom varijantnom rešenju, sve ili pretežno sve sekvence između hVA1-40 i hVA3-29 u genetski modifikovanom mišu obuhvataju u suštini ljudskuAsekvencu od približno 959 bp pronađenu u prirodi (npr,. u ljudskoj populaciji) nizvodno od hVA1-40 segmenta gena (nizvodno od 3' neprevedenog dela), mesto reakcije enzima (npr.. Pl-Scel), posle čega sledi ljudska A sekvenca od približno 3,431 bp uzvodno od hVA3-29 segmenta gena pronađenog u prirodi. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni mišjiAlokusi lakog lanca se brišu delimično ili potpuno
[0049]Vklokus obuhvata najmanje jedan hJA. U jednom varijantnom rešenju, Vklokus obuhvata više hJA U jednom varijantnom rešenju, Vklokus obuhvata najmanje 2. 3, 4, 5. 6, ili 7 hJA. U specifičnom varijantnom rešenju, Vklokus obuhvata četiri hJA. U specifičnom varijantnom rešenju, četiri hJA su hJA1, hJA2, hJA.3, i hJA7. U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni A lokusi lakog lanca se brišu delimično ili potpuno. U jednom varijantnom rešenju, Vk lokus obuhvata jedan hJA. U specifičnom varijantnom rešenju, hJAje hJAl U specifičnom varijantnom rešenju, endrogeni A lokusi lakog lanca se brišu delimično ili potpuno
[0050]Vklokus obuhvata najmanje jedan hVA, najmanje jedan hJA, i mišji Ckgen,
[0051]U jednom varijantnom re[enju, miš obuhvata zamenu na endogenom mišjemklokusu endogenih mišjih Vksegmenata gena s jednim ili više hVA segmenata gena, pri čemu su hVA segmenti gena funkcionalno povezani na endogeni mišji gen Ckregiona, tako da miš preraspoređuje ljudske VA segmente gena i ispoljava reverzni himerni laki lanac imunoglobulina koji obuhvata ljudski VA domen i mišji Ck. U jednom varijantnom rešenju, 90 -100% nepreraspoređenih mišjih Vksegmenata gena se zameni najmanje jednim nepreraspoređenim hVAsegmentom gena. U specifičnom varijantnom rešenju, Vksegmenti gena se zamene najmanje jednim nepreraspoređenim hVA segmentom gena. U jednom varijantnom rešenju, zamena je sa najmanje 12, najmanje 28, ili najmanje 40 nepreraspoređenih hVA segmenata gena. U jednom varijantnom rešenju, zamena je sa najmanje 7 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena. najmanje 16 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena, ili najmanje 27 funkcionalnih nepreraspoređenih hVA segmenata gena, U jednom varijantnom rešenju. miš obuhvata zamenu svih mišjih Jksegmenata gena sa najmanje jednim nepreraspoređenim hJA segmentom gena. U jednom varijantnom rešenju, najmanje jedan neprerasporešeni hJA segment gena se bira iz JA1. JA2, JA3, JA4, JA5, JA6, JA7, i njihove kombinacije U specifičnom varijantnom rešenju hVA segment gena se bira iz 3-1, 4-3, 2-8, 3-9. 3-10, 2-11, 3-12, 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 3-27, 1-40, 7-43, 1-44. 5-45, 7-46, 1-47, 5-48, 9-49, 1-50, 1-51, 5-52 hVA segment gena, i njihova kombinacija U specifičnom varijantnom rešenju, najmanje jedan nepreraspoređeni hJA segment gena se bira iz JA1, JA2, JA3, JA7, i njihove kombinacije.
[0052]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji obuhvata ljudsku Vk-Jk- sekvencu intergenskog regiona koja se nalazi na endogenom mišjemklokusu lakog lanca.
[0053]U jednom varijantnom rešenju, ljudska Vk-Jksekvenca intergenskog regiona je na endogenomklokusu lakog miša koji sadrži hVA i hJA segment gena, i ljudska Vk-Jksekvenca intergenskog regiona se raspoređuje između hVA i hJA segmenata gena. U specifičnom varijantnom rešenju, hVA i hJA segmenti gena su sposobni da rekombinuju oblik funkcionalnog ljudskogXpromenljivog domena lakog lanca kod miša.
[0054]Takođe je opisan miš koji obuhvata više hVA's i jedan ili više hJX's, i ljudska Vk-Jksekvenca intergenskog regiona se raspoređuje, u vezi sa transkripcijom, nizvodno od proksimalnog ili 3' većine hVA sekvence i uzvodno ili 5' od prve hJA sekvence.
[0055]U jednom varijantnom rešenju, ljudski Vk-Jkintergenski region je region koji se nalazi oko 130 bp nizvodno ili 3' ljudskog Vk4-1 segmenta gena, oko 130 bp nizvodno od 3' neprevedenog regiona ljudskog Vk4-1 segmenta gena, i prostire se do oko 600 bp uzvodno ili 5' ljudskog Jk1 segmenta gena U specifičnom varijantnom rešenju, ljudski Vk-Jkintergenski region ima veličinu oko 22,8 kb. U jednom varijantnom rešenju, Vk-Jkintergenski region je oko 90% ili više, 91 % ili više, 92% ili više, 93% ili više, 94% ili više, ili oko 95% ili više identičan ljudskom Vk-Jkintergenskom regionu koji se prostire od kraja 3' neprevedenog regiona ljudskog Vk4-1 segmenta gena do oko 600 bp uzvodno od ljudskog Jk1 segmenta gena. U jednom varijantnom rešenju, Vk-Jkintergenski region obuhvata ID BR SEK 100 U jednom varijantnom rešenju, Vk-Jkintergenski region obuhvata funkcionalni fragment ID BR SEK: 100. U specifičnom varijantnom rešenju, Vk-Jkintergenski region je ID BR SEK; 100.
[0056]Takođe je opisana ćelija miša (npr., mišja embrionska matična ćelija), mišji embrion, i mišje tkivo koji obuhvataju formulisanu ljudsku sekvencu Vk-Jkintergenskog regiona. pri čemu je intergenski region sekvence sekvenca intergenskog regiona ektopičan U specifičnom varijantnom rešenju, ektopična sekvenca se postavlja na humanizovano mesto endogenog mišjeg imunoglobulina
[0057]Takođe je opisan konstrukt izolovane nukleinske kiseline koji obuhvata prikazanu ljudsku Vk-Jksekvencu intergenskog regiona sekvencu intergenskog regiona. U jednom varijantnom rešenju, konstrukt nukleinske kiseline obuhvata ciljajuće krake koji ciljaju ljudsku Vk-Jksekvencu intergenskog regiona, U specifičnom varijanom izvođenju, mišji lokus lakog lanca jeklokus. U specifičnom varijanom izvođenju, ciljajući kraci ciljaju ljudski Vk-Jkintergenski region na modifikovani endogeni mišjiklokus, pri čemu ciljanje treba da izvrši pozicioniranje između hVA sekvence i hJA sekvence
[0058]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu miš obuhvata ne više od dva alela lakog lanca, pri čemu aleli lakog lanca obuhvataju (a) nepreraspoređeni ljudski imunogiobulin VA i JA. segment gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Clgen; i, (b) nepreraspoređeni Vli JLsegment gena imunoglobulina na endogenom mišjem lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Clgen
[0059]U jednom varijantnom rešenju, endogeni mišji lokus lakog lanca je k lokus U specifičnom varijanom izvođenju, endogeni mišji lokus lakog lanca jeAlokus
[0060]U jednom varijantnom rešenju, ne više od dva alela lakog lanca se bira izkalela i A alela, dva
kalela, i dva A alela. U jednom specifičnom varijantnom rešenju, jedan od dva alela lakog lanca je A alel koji obuhvata CA2 gen.
[0061]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata jedan funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina i jedan nefunkcionalni lokus lakog lanca, pri čemu funkcionalni lokus lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski imunogiobulin VA i JA. segmenta gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen.
[0062]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata jedan funkcionalni lokus lakog lanca imunoglobulina i jedan nefunkcionalni lokus lakog lanca, pri čemu funkcionalni lokus lakog lanca obuhvata nepreraspoređeni ljudski imunogiobulin VA i JA segmenta gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CAgen U jednom varijantnom rešenju,CAgen je CA2. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CA gen je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%. barem 95%, ili barem 98% identičan mišjemCA2
[0063]U jednom varijantnom rešenju, miš još obuhvata barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina. U jednom varijantnom rešenju, barem jedan alel teškog lanca imunoglobulina obuhvata ljudski VHsegment gena, ljudski DHsegment gena i ljudski Jhsegmenta na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata ljudski gen teškog lanca koji ispoljava ljudski/mišji teški lanac. U specifičnom varijantnom rešenju, miš obuhvata dva alela teškog lanca imunoglobulina, i miš ispoljava ljudski/mišji teški lanac.
[0064]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata prvi alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVKi nepreraspoređeni hjK, na endogenom mišjemklokusu koji obuhvata endogeni Ckgen; i drugi alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVA i nepreraspoređeni hJA, na endgoenom mišjemklokusu koji obuhvata endogeni Ckgen U specifičnom varijantnom rešenju, prvi i drugi alel lakog lanca su jedini funkcionalni aleli lakog lanca genetski modifikovanog miša. U specifičnom izvođenju, miš obuhvata nefunkcionalniAlokus. U jedno varijantno rešenje, genetski modifikovan miš koji ne ispoljava laki lanac koji obuhvata A konstantni region.
[0065]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata prvi alel lakog lanca koji obuhvata nepreraspoređeni hVKi nepreraspoređeni hJK, na endogenom mišjemklokusu koji obuhvata endogeni CKgen; i na drugom alelu lakog lanca koji koji obuhvata nepreraspoređeni hVAi nepreraspoređeni hJA. na endogenom mišjemXlokusu koji obuhvata endogeniCXgen U specifičnom varijantnom rešenju, prvi i drugi alel lakog lanca su jedini funkcionalni aleli lakog lanca genetski modifikovanog miša. U jednom varijantnom rešenju, endogeni CA gen jeCX2.U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CAgen je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjem Cv2
[0066]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata šest alela imunoglobulina, pri čemu prvi alel obuhvata nepreraspoređeni imunogiobulin V?. i Ja segment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, drugi obuhvata nepreraspoređeni imunogiobulin Vki Jksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, treći obuhvata nepreraspoređeni imunogiobulinVXi Ja segment gena na endogenom mišjemXlokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CAgen, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni Vhi Dhi Jhsegment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata mišji gen teškog lanca, i šesti obuhvata bilo (a) nepreraspoređeni imunogiobulin VA i JA segment gena na endogenom mišjemXlokusu lakog lanca koji obuhvata mišjiCX gen,(b) a lokus koji je nefunkcionalni, ili (c) brisanje u celini ili delimično
X lokusa.
[0067]U jednom varijantnom rešenju, prvi alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA. U jednom varijantnom rešenju, drugi alel obuhvata nepreraspoređeni hVKi hJK. U jednom varijantnom rešenju, treći alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA. U jednom varijantnom rešenju. četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni hVn i hDn i hJ|-j U jednom varijantnom rešenju, šesti alel obuhvata endogeni mišjiXlokus koji se briše u celini I delimično
[0068]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata šest alela imunoglobulina, pri čemu prvi alel obuhvata nepreraspoređeni imunogiobulin Va i JA segment gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CA gen, drugi obuhvata nepreraspoređeni imunogiobulin VAi JA segment gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca koji obuhvata mišji CAgen, treći obuhvata nepreraspoređeni imunogiobulin Vx i Jksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni Vhi Ohi Jhsegment gena na endogenom mišjem lokusu teškog lanca koji obuhvata mišji gen teškog lanca i šesti obuhvata bilo (a) nepreraspoređeni imunogiobulin Vki Jksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca koji obuhvata mišji Ckgen, (b)klokus koji je nefunkcionalni, ili (c) brisanje jednog ili više elemenataklokusa.
[0069]U jednom varijantnom rešenju, prvi alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA segment gena. U jednom varijantnom rešenju, drugi alel obuhvata nepreraspoređeni hVA i hJA segment gena U jednom varijantnom rešenju, treći alel obuhvata nepreraspoređeni hVKi hJKsegment gena U jednom varijantnom rešenju, četvrti i peti svaki nezavisno obuhvata nepreraspoređeni hVn i hDHj hJn segment gena. U jednom varijantnom rešenju, šesti alel obuhvata endogeni mišjiklokus koji je funkcionalno neaktivan.
[0070]U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš obuhvata B ćeliju koja obuhvata preraspoređeni gen antitela koji obuhvata preraspoređeni hVAdomen funkcionalno povezan na mišji
Ckdomen.
[0071]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu
[0072]U jednom varijantnom rešenju. oko 10-50% splenocita miša su B ćelije( t. j..CDl9-pozitivan), ili koji oko 9-28% ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mišji Ckdomen
[0073]U specifičnom varijantnom rešenju. oko 23-34% splenocita miša su B ćelije (t.j., CD19-pozitivan), ili koji oko 9-11% ispoljavaju laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mišji Ckdomen.
[0074]U specifičnom varijantnom rešenju. oko 19-31 % splenocita miša su B ćelije (t.j., CD19-pozitivan), ili koje oko 9-17% ispoljavaju laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mišji Ckdomen.
[0075]U specifičnom varijantnom rešenju, oko 21-38% splenocita miša su B ćelije (t j , CD19 pozitivno), ili koje oko 24-27% ispoljavaju laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mišji Ckdomen
[0076]U specifičnom varijantnom rešenju, oko 10-14% splenocita miša su B ćelije( t. j.,CD19 pozitivan), ili koje oko 9-13% ispoljavaju laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mšij Ckdomen.
[0077]U specifičnom varijantnom rešenju, oko 31-48% splenocita miša su B ćelije (t.j., CD19 pozitivno), ili koje oko 15-21% ispoljavaju laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mišji Ckdomen. U specifičnom varijantnom rešenju, oko 30-38% splenocita miša su B ćelije (t.j., CD19 pozitivno), od toga oko 33-48% ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mišji Ckdomen.
[0078]U jednom varijantnom rešenju, oko 52-70% koštane srži miša su B ćelije (tj , CD19 pozitivno), od toga oko 31-47% nezrelih B ćelija (t.j., CD 19 pozitivno/B220 intermedijar pozitivan/lgM pozitivan) ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mišji Ckdomen.
[0079]U jednom varijantnom rešenju, oko 60% koštane srži miša su B ćelije (t.j., CD19 pozitivno), od toga oko 38,3% nezrelih B ćelija (t.j., CD19 pozitivno/B220 intermedijar pozittvan/lgM pozitivan) ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata hVA domen spojen na mišji Ckdomen
[0080]Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu. Mišji gen konstantnog regiona je Ckgen. U specifičnom varijantnom rešenju, antitelo još obuhvata teški lanac koji obuhvata promenljivi domen izveden iz ljudskog V, ljudskog D i ljudskog J segmenta gena, i konstantnog domena teškog lanca izvedenog iz mišjeg gena konstantnog domena teškog lanca. U jednom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvataSPOJ-CH2-CH3sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH^spoj-CHj-CHs sekvencu konstantnog domena teškog lanca U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CH1-CH2-CH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca. U jednom drugom varijantnom rešenju, mišji gen konstantnog regiona teškog lanca obuhvata CHrCH3-CH4sekvencu konstantnog domena teškog lanca.
[0081]Miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Ck sekvencu. U jednom varijantnom rešenju, ljudska VA-JA sekvenca se izvodi iz preraspoređenih hVA segmenata gena izabranih iz 3-1, 4-3, 2-8; 3-9, 3-10, 2-14, 3-19, 2-23, 3-25, 1-40, 7-43, 1-44, 5-45, 7-46, 1-47, 9-49, i 1-51 segmenta gena U jednom varijantnom rešenju, preraspoređena ljudska VA-JA sekvenca se izvodi iz preraspoređenih hJA segmenata gena izabranih iz JA1, JA2, JA3, i JA7 segmenta gena.
[0082]U jednom varijantnom rešenju, miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređeni A promenljivi region lakog lanca imunoglobulina koji obuhvata ljudsku VA/JA sekvencu izabranu iz 3-1/1, 3-1/7, 4-3/1, 4-3/7, 2-8/1, 3-9/1, 3-10/1. 3-10/3, 3-10/7, 2-14/1. 3-19/1, 2-23/1, 3-25/1, 1-40/1, 1-40/2. 1-40/3, 1-40/7, 7-43/1, 7-43/3 1-44/1, 1-44/7, 5-45/1. 5-45/2, 5-45/7, 7-46/1, 7-46/2, 7-46/7, 9-49/1, 9-49/2, 9-49/7 i 1-51/1. U jednom specifičnom varijantnom rešenju, B ćelija ispoljava antitelo koje obuhvata promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina čoveka spojen na mišji konstantni domen teškog lanca, i ljudski/.promenljividomen lakog lanca imunoglobulina spojen sa mišjimkkonstantim domenom lakog lanca.
[0083]Takođe je opisan miš koji ispoljava antitelo koje obuhvata (a) teški lanac koji obuhvata promenljivi domen teškog lanca izveden iz nepreraspoređenog segmenta gena promenljivog regiona teškog lanca, pri čemu se promenljivi domen teškog lanca spaja na mišji konstantni region teškog lanca (Ch); i, (b) laki lanac obuhvata promenljivi domen lakog lanca izveden iz nepreraspoređenog hVA i hJX, pri čemu se promenljivi domen lakog lanca spoji na mišji Ckregion.
[0084]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata (i) lokus teškog lanca koji obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih V, D i J segmenata gena sa svim pretežno ljudskim V, D, i J segmentima gena, mišji Chgen, (ii) prviklokus lakog lanca koji obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih Vki Jksegmenata gena sa svim, pretežno svim. ili većinom, funkcionalnih hVAi hJA segmenata gena, i mišjim Ck genom, (iii) drugi k lokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih Vki Jksegmenata gena sa svim, pretežno svim, ili većinom, funkcionalnih hVK i hJKsegmenata gena, i mišji Ckgen U jednom varijantnom rešenju, miš ne ispoljava antitelo koje obuhvata CA region. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata brisanje CA gena i/ili V/. i/ili JA segmenta gena. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata nefunkcionalniXlokus lakog lanca. U specifičnom varijantnom rešenju,Xlokus lakog lanca se briše u celini ili delimično.
[0085]U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata (i) lokus teškog lanca koji obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih V, D i J segmenata gena sa svim ili pretežon svim funkcionalnim ljudskim V, D, i J segmentima gena, mišji Chgen. (ii)prvi Xlokus lakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih V/. iJX segmenatagena sa svim. pretežnom svim, ili više, funkcionalniih hVA i hJA segmenata gena, i mišjimCXgenom, (iii) drugiX lokuslakog lanca obuhvata zamenu svih ili pretežno svih funkcionalnih endogenih mišjih Va. i JA segmenata gena sa svim, pretežno svim, ili više, funkcionalnih hVA i hJA segmenata gena, i mišji CAgen U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CAgen je CA2 U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CAgen se izvodi iz CA gena koji je barem 60%. barem 70%. barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjem CA.2.
[0086]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava antitelo, pri čemu više od 10%, više od 15%, više od 20%, više od 25%, više od 30%, više od 35%, više od 40%, više od 60%, više od 70%, više od 80%, ili više od 90% ukupnog IgG antitela proizvedenog od strane miša obuhvata A-izvedeni promenljivi domen, i pri čemu miš ispoljava antitela koja obuhvatajuK-izveden promenljivi domen spojen sa mišjim Ckregionom. U specifičnim varijantnim rešenjima, oko 15-40%, 20-40%. 25-40%, 30-40%, ili 35-40% ukupnog antitela proizvedenog pomoću miša obuhvata A-izvedeni promenljivi domen
[0087]U jednom varijantnom rešenju, A-izvedeni promenljivi domen se izvodi iz hVA i hJA U jednom varijantnom rešenju, A izvedeni promenljivi domen je laki lanac koji obuhvata mišji Ckregion. U specifičnom varijantnom rešenju, A-izvedeni promenljivi region je u lakom lancu koji obuhvata mišji CA region. U drugom specifičnom varijantnom rešenju. CA region je CA2 region. U jednom varijantnom rešenju,K-izvedeni održivi domen se izvodi iz hVKi hJK, i u specifičnom varijantnom rešenju je u lakom lancu koji obuhvata mišji Ckregion
[0088]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt koji obuhvata uzvodni homologni krak i nizvodni homologni krak, pri čemu uzvodni i nizvodni homologni kraci ciljaju konstrukt na mišjemklokusu, i konstrukt obuhvata funkcionalni nepreraspoređeni hVA segment i funkcionalni nepreraspoređeni hJA segment, i sekvencu odabira ili marker sekvencu
[0089]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeAsekvence uzvodno od mišje VA2, kasete odabira prirubnih 5' i 3' sa mestom prepoznavanja rekombinaze, i ciijajućim krakom za ciljanje mišjeAsekvence 3' mišjeg JA2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed Hyg-TK kaseta U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata mišjiCA2.JA4,CA.4 i mišji pojačavač 2.4.
[0090]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg A lokusa 5' u vezi sa VA1, kaseta odabiraprirubnice 5' i 3' sa mestom prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajućim krakom za ciljanje mišje X sekvence 3' sa mišjim JX1 . U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je kaseta neomicina u tečnom kiseoniku U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata mišjiX3' pojačavač i mišjiX3' pojačavač 3,1
[0091]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5 do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg X lokusa 5' u vezi sa VX2, kasetu odabira prirubnu 5' i 3' sa mestom prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišje X sekvence 3' u vezi sa mišjim JX2 i 5' u vezi sa mišjim CX2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata mišje CX2-JX4-CX4 segmente gena i mišji X pojačavač 2 4.
[0092]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegXlokus 5' u vezi sa V/.2. kasetom odabira prirubnu 5' i 3' mestu prepoznavanja rekombinaze, ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX3-12 nizvodno do kraja hJX1, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišjeXsekvence 3' u vezi sa mišjim JX2. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed kaseta neomicina. U jednom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata mišjeCX2-JX4-CX4segmente gena i mišji X pojačavač 2.4.
[0093]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX3-12 nizvodno do kraja hJX1.
[0094]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5 do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegXlokus 5' u vezi sa VX2, kasetom odabira prirubnu 5' i 3' sa mesta prepoznavanja rekombinaze i ljudskog genomskog fragmenta koji obuhvata dodirni region ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX3-27 nizvodno do kraja hJX2-8 U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je Frt'ed higromicin kaseta U jednom varijantnom rešenju, ljudski genomski fragment obuhvata 3' ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju 3' ciljajući krak obuhvata oko 53 kb ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX3-12 nizvodno do kraja hJX2-8.
[0095]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX3-27 nizvodno do kraja hVX3-12
[0096]Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5<!>do 3<!>u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjeg X lokusa 5' u vezi sa VX2, kasetu odabira prirubnu 5' i 3' sa mestima prepoznavanja rekombinaze, prvi ljudski genomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX5-52 nizvodno do kraja hVX1-40, mesto restrikcionog enzima, i drugi ljudski geomski fragment koji obuhvata dodirni region ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX3-29 nizvodno do kraja hJX82K. U jednom varijantnom rešenju. kaseta odabira je Frt'ed kasete neomicina. U jednom varijantnom rešenju, mesto restrikcionog enzima je mesto za homing endonukleaze. U specičnom varijantnom rešenju, homing endonukleaza je Pl-Scel U jednom varijantnom rešenju, drugi ljudski genomski fragment je 3' ciljajući krak. U specifičnom varijantnom rešenju, 3' ciljajući krak obuhvata oko 27 kb ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX3-29 nizvodno do kraja hVX82K
[0097]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata dodirni region ljudskog X lokusa lakog lanca od hVX5-52 nizvodno do kraja hJXl-40.
[0098]Takođe je opisan izolovan DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa endogenim Vksegmentima gena, dva podređena mesta prepoznavanja rekombinaze, kasetu odabira 3' prema podređenim mestima prepoznavanja rekombinaze, i 3' ciljajući krak za ciljanje mišje k sekvence 5' u vezi saksegmentima gena promenljivog lakog lanca U jednom varijantnom rešenju, podređena mesta prepoznavanja rekombinaze su suprotno usmerena jedan prema drugom. U specifičnom varijantnom rešenju, mesta prepoznavanja rekombinaze su različita. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mesta prepoznavanja rekombinaze su /oxP mesto i /ox511 mesto U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je kaseta neomicina.
[0099]Takođe je opisan izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, ciljajući krak za ciljanje mišjegklokusa 5' u vezi sa mišjim Jk- segmentima gena, kaseta odabira, mesto prepoznavanja rekombinaze 3' prema kaseti odabira, i 3'ciljajući krak za ciljanje mišjeksekvence 3' u vezi sa mišjim Jksegmentima gena i 5' prema mišjemkintronskom pojačavaču. U jednom varijantnom rešenju, kaseta odabira je higromicin-TK kaseta. U jednom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze je u istom smeru prema transkripciji kao ova kaseta odabira. U specifičnom varijantnom rešenju, mesto prepoznavanja rekombinaze jeloxPmesto.
[0100]Takođe, opisan je izolovani DNK konstrukt, koji obuhvata, od 5' do 3' u vezi sa smerom transkripcije, prvi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 5' endogenih mišjih Vksegmenata gena, prvo mesto prepoznavanja rekombinaze, drugo mesto prepoznavanja rekombinaze, i drugi mišji genomski fragment koji obuhvata sekvencu 3' endogenih mišjih Jk segmenata gena i 5' mišjegkintronskog pojačavača.
[0101]Takođe je opisan, genetski modifikovan miš, pri čemu genetska modifikacija obuhvata modifikaciju sa jednim ili više DNK konstrukata opisanih iznad ili ovde
[0102]Takođe je opisana, upotreba izolovanog DNK konstrukta da se napravi miš kako je ovde opisano. Takođe je opisana, upotreba opisanog DNK konstrukta kako je ovde opisan u postupku za pravljenje proteina koji vezuje antigen
[0103]Takođe je opisana matična nehumana ćelija koja obuhvata ciljajući vektor koji obuhvata DNK konstrukt kako je opisano gore i ovde. Takođe je opisana matična nehumana ćelija, pri čemu je nehumana matična ćelija izvedena iz ovde opisanog miša.
[0104]U jednom varijantnom rešenju, matična ćelija koja nije čovekova je embrionska matična (ES) ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je mišja ES ćelija.
[0105]Takođe je opisana upotreba matične ćelije koja nije ljudska kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano. Takođe je opisana upotreba matične ćelije koja nije ljudska kako je opisano ovde da se napravi protein koji vezuje antigen
[0106]Takođe je opisan mišji embrion, pri čemu mišji embrion obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisan je domaćin mišjeg embriona koji obuhvata embrionsku matičnu (ES) ćeliju donatora, pri čemu ES ćelija donator obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju mišji embrion je embrion u fazi pre-morule 't.j, preblastulacije (korak koji pre formiranja embriona). U specifičnom varijantnom rešenju, embrion u fazi pre-morule je embrion u fazi od 4-ćelije ili embrion u fazi od 8 ćelija. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mišji embrion je blastocist.
[0107]Takođe je opisana upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisan da se napravi mišji kako ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisana je upotreba mišjeg embriona kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0108]Takođe je opisana, nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je B ćelija. U jednom varijantnom rešenju, ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koja je somatski mutirana.
[0109]Takođe je opisana, nehumana ćelija, pri čemu nehumana ćelija obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz genetski modifikovanog miša kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju. ćelija je B ćelija. U jednom varijantnom rešenju. ćelija je hibridom. U jednom varijantnom rešenju, ćelija kodira promenljivi domen lakog lanca imunoglobulina i/ili promenljivi domen teškog lanca imunoglobulina koja je somatski mutirana
[0110]Takođe je opisana upotreba nehumane ćelije kako je opisano ovde da se napravi mišja kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, opisuje se upotreba nehumane ćelije kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen.
[0111]Takođe je opisana mišja B ćelija koja ispoljava laki lanac imunoglobulina koja obuhvata (a) promenljivi region izveden iz hV/„ segmenta gena i hJ/>, segmenta gena, i, (b) mišji C|_ gen. U jednom varijantnom rešenju, mišji CLgen se bira iz Cki C>. gena. U specifičnom varijantnom rešenju, Ck gen jeCX2.U specifičnom varijantnom rešenju, mišji C/. gen se izvodi iz C/.gena koji je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjemC>2,U jednom varijantnom rešenju, mišja B ćelija još ispoljava poznati teški lanac koji obuhvata (c) promenljivi region izveden iz h\/H, hDn, i (d) hJn segmenta. U jednom varijantnom rešenju, B ćelija ne obuhvata preraspoređeni/.gen. U drugom varijantnom rešenju, B ćelija ne obuhvata preraspoređeni k gen
[0112]Takođe je opisan postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovanog miša prema antigenu, pri čemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVA i barem jedan hJA na endogenom lokusu lakog lanca, pr čemu endogeni lokus lakog lanca obuhvata mišji Clgen; (b) što omogućava genetski modifikovanom mišu da prema antigenu razvije odgovor imunog sistema; i, (c) izolovanje iz miša prema (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišji Cl gen. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CL gen je mišji Ckgen
[0113]U jednom varijantnom rešenju, postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVA na endogenomklokusu i barem jedan hJ/. naklokusu, pri čemuklokus obuhvata Ckgen; (b) čime se omogućava da genetski modifikovan miš razvije odgovor imunog sistema prema antigenu; i, (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo prepoznaje laki lanac izveden iz hVA, hJAi mišji Ckgen
[0114]U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) ispoljavanje genetski modifikovanog miša prema antigenu, pri čemu miš ima genom koji obuhvata barem jedan hVA na A lokusu lakog lanca i barem jedanjknaklokusu lakog lanca, pr čemuklokus lakog lanca obuhvata mišji CA gen; (b) što omogućava genetski modifikovanom mišu da prema antigenu razvije odgovor imunog sistema; i, (c) izolovanje iz miša (b) antitela koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz miša prema (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje ovaj antigen, ili identifikovanje mišje B sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca koji vezuje antigen, pri čemu ovo antitelo obuhvata laki lanac izveden iz hVA, hJA i mišjiCAgen.
[0115]U jednom varijantnom rešenju, A konstantni gen lakog lanca se bira iz ljudskog CAgena i mišjeg CAgena U jednom varijantnom rešenju,Akonstantni gen lakog lanca je ljudskiCAgenU specifičnom varijantnom rešenju, ljudski CAgen je izabran iz CA1,CA2,CA3 iCA7U jednom varijantnom rešenju,Akonstantni gen lakog lanca je mišji CA gen. U specifičnom varijantnom rešenju mišjiCAgen je izabran iz CA1, CA2 i CA3. U još specifičnijem varijantnom rešenju mišjiCAgen je CA2. U drugom specifičnom varijantnom rešenju, mišjiCAgenje izveden iz CAgena koji je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjem CA2.
[0116]Takođe je opisan, postupak za pravljenje gena preraspoređenog antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVA i hJA na endogenom lokusu lakog lanca, pri čemu endogeni lokus lakog lanca obuhvata mišji Clgen ili njegov funkcionalni fragment: i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata A segment gena promenljivog regiona lakog lanca i Clgen ili njegovi funkcionalni fragment.
[0117]U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca od antitela koje obuhvata ljudski VA i mišji Cl
[0118]U jednom varijantnom rešenju, mišji Clgen ili njegov funkcionalni fragment se bira iz ljudskog Clgena I mišjeg Clgena, ili njegovog funkcionalnog fragmenta
[0119]U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje preraspoređenog gena antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata: (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pri čemu genetska modifikacija obuhvata hVA i hJA naklokusu lakog lanca, pri čemuklokus lakog lanca obuhvata mišji Ckgen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvataAsegment gena promenljivog regiona lakog lanca i Ckgena ili njegov funkcionalni fragment.
[0120]U jednom varijantnom rešenju,kkonstantni gen lakog lanca ih njegov funkcionalni fragment se bira iz ljudskog Ckgena i mišjeg Ckgena, ih njegovog funkcionalnog fragmenta
[0121]U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca od antitela koji obuhvata ljudski VA i mišji Ck.
[0122]U jednom varijantnom rešenju. opisuje se postupak za pravljenje preraspoređenog gena antitela kod genetski modifikovanog miša, koji obuhvata, (a) izlaganje genetski modifikovanog miša antigenu, pn čemu genetska modifikacija obuhvata hVA i hJA na mišjemAlokusu lakog lanca pri čemu A lokus lakog lanca obuhvata mišjiCAgen ili njegov funkcionalni fragment; i, (b) identifikovanje preraspoređenog gena imunoglobulina kod pomenutog miša, pri čemu preraspoređeni gen imunoglobulina obuhvata A segment gena promenljivog regiona lakog lanca i CA gen ili njegov funkcionalni fragment.
[0123]U jednom varijantnom rešenju,Akonstantni gen lakog lanca ili njegov funkcionalni fragment se bira iz ljudskog CAgena i mišjeg CAgena ili njegovog funkcionalnog fragmenta. U specifičnom varijantnom rešenju, A konstantni gen lakog lanca je mišji CA gen. za njegov funkcionalni fragment.
[0124]U jednom varijantnom rešenju, postupak još obuhvata kloniranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira promenljivi region teškog i/ili lakog lanca iz miša, pri čemu je promenljivi region teškog i/ili lakog lanca od antitela koje obuhvata ljudski VA i mišji CA
[0125]Takođe je opisan, postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koje specifično vezuje taj antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koja kodira teški lanac i preraspoređenu sekvencu nukleinske kisleine kod miša koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca nekog antitela, pri čemu to antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline promenljivih domena teškog i lakog lanca spojenih na konstantne domene čoveka da se napravi željeno antitelo. pri čemu željeno antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata VA domen spojen na Cldomen U jednom varijantnom rešenju, VA domen je ljudski i Cldomen je ljudski ili mišji CAdomen U jednom varijantnom rešenju, VA domen je mišji i Cldomen je ljudski ili mišji Ckdomen
[0126]U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje antitela koji obuhvata izlaganje kako je ovde opisano miša 16 antigenu,, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koje se specifično vezuje na antigen, utvrđivanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koja enkodira teški lanac i preraspoređenu sekvencu nukleinske kiselien kod miša koja kodira poznatu sekvencu promenljivog domena lakog lanca antitela, pri čemu to antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline promenljivih domena teškog i lakog lanca spojenih na sekvence nukleinske kiseline konstantnih domena čoveka da se napravi željeno antitelo, pri čemu željeno antitelo obuhvata laki lanac koji obuhvata VA domen spojen na Ckdomen.
[0127]U jednom varijantnom rešenju, opisuje se postupak za pravljenje antitela, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano prema antigenu, omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema koji obuhvata pravljenje antitela koji specifično vezuje antigen, identifikovanje preraspoređene sekvence nukleinske kiseline kod miša koji kodira promenljivi domen teškog lanca i preraspoređenu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznatu sekvencu poznatog domena lakog ianca antitela, pri čemu antitelo specifično vezuje taj antigen, i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline spojene na sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski konstantni domen teškog lanca i ljudski konstantni domen lakog lanca da se napravi antitelo izvedeno iz ljudske sekvence, pri čemu to antitelo koje se specifično vezuje na antigen obuhvata laki lanac koji obuhvata ljudski VA domen spojen na mišjiCAregion
[0128]U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CA region se bira iz CA1, CA2 i CA3. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CA region je CA2
[0129]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela, obuhvata (a) izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu; (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; (c) određivanje ćelije kod miša koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira preraspoređenu ljudsku sekvencu VA domena spojenu sa mišjim Cldomenom, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski Vhdomen i mišji Chdomen, i pri čemu ćelija ispoljava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ove ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski V/. domen i sekvence nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski Vhdomen, i, (e) korišćenje sekvence klonirane nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA. domen i klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VH domen da se napravi potpuno ljudsko antitelo.
[0130]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je opisano u ovom opisu antigenu; (b) omogućavanje mišu da izgradi odgovor imunog sistema; (c) identifikovanje ćelije kod miša koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira preraspoređeni ljudsku VAsekvencu domena dodirne na istom molekulu nukleinske kiseline sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira mišji Ckdomen, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski Vhdomen i mišji Chdomen, i pri čemu ćelija koja ispoljava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA domen i sekvence nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski Vhdomen; i, korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA domen i klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VH domen da se napravi potpuno ljudsko antitelo.
[0131]U jednom varijantnom rešenju, opisan je postupak za pravljenje preraspoređene sekvence gena promenljivog regiona lakog lanca antitela koji obuhvata (a) izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu; (b) koje omogućava mišu da izgradi odgovor imunog sistema na antigen; (c) određivanje ćelije kod miša koja obuhvata DNK koja kodira preraspoređenu ljudsku sekvencu VAdomena spojenu sa mišjimCAdomenom, pri čemu ćelija takođe kodira poznati teški lanac koji obuhvata ljudski Vhdomen i mišji Chdomen, i pri čemu ćelija ispoljava antitelo koje vezuje antigen; (d) kloniranje iz ćelije sekvence nukleinske kiseline koja kodira preraspoređeni ljudski VA domen i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski Vhdomen; i, (e) korišćenje klonirane sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski VA domen I kloniranu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira poznati ljudski VHdomen da se napravi potpuno ljudsko antitelo U jednom varijantnom rešenju, mišji CA domen je mišji CA2. U specifičnom varijantnom rešenju, mišji CA domen se izvodi iz CAgena koji je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjem CA2,
[0132]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji ispoljava ljudski A-izvedeni laki lanac spojen na endogeni konstantni region lakog lanca (Cl), pri čemu miš, posle imunizacije sa antigenom, stvara antitelo koje obuhvata ljudski VA domen spojen na mišji Cldomen U jednom varijantnom rešenju, mišji CLdomen je izabran iz Ckdomena i CA domena U jednom varijantnom rešenju. mišji CLdomen je CKdomen. U jednom varijantnom rešenju, mišji CL domen je CA domen. U specifičnom varijantnom rešenju, CA. domen je CA2. U specifičnom varijantnom rešenju. mišji CA domen se izvodi iz CA gena koji je barem 60%, barem 70%, barem 80%, barem 90%, barem 95%, ili barem 98% identičan mišjem CA2,
[0133]Takođe je opisan genetski modifikovan miš koji obuhvata modifikovani endogeniKili A lokus lakog lanca kako je ovde opisano, koji ispoljava višeAlakih lanaca imunoglobulina povezanih sa više teških lanaca imunoglobulina U jednom varijantnom rešenju, teški lanac obuhvata ljudsku sekvencu, U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom varijantnom rešenju, više A lakih lanaca imunoglobulina sadrži sekvencu čoveka. U različitim varijantnim rešenjima, ljudska sekvenca se bira iz promenljive sekvence, konstantne sekvence, i njihove kombinacije U jednom varijantnom rešenju. miš obuhvata onemogućeni endogeni lokus imunoglobulina i ispoljava teški lanac i/ili A laki lanac iz transgena ili ekstrahromozomnog epizoma. U jednom varijantnom rešenju, miš obuhvata zamenu na endogenom mišjem lokusu nekih ili svih endogenih mišjih segmenata gena teškog lanca (t.j., V, D. J), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence konstantnog teškog lanca (npr., CH1, zglob, Ch2, Ch3, ili njihovu kombinaciju), i/ili neke ili sve endogene mišje sekvence lakog lanca (npr, V, J, konstantne, ili njihove kombinacije), sa jednom ili više sekvenci imunoglobulina čoveka.
[0134]Takođe je opisan miš pogodan za pravljenje antitela koja imaju ljudski A-izveden laki lanac pri čemu su sva ili pretežno sva antitela napravljena kod miša ispoljena sa ljudskim A-izvedenim lakim lancem. U jednom varijantnom rešenju. ljudski/.-izveden laki lanac se ispoljava iz endogenog lokusa lakog lanca. U jednom varijantnom rešenju, endogeni lokus lakog lanca jeklokus lakog lanca. U specifičnom varijanom izvođenju,k- lokus lakog lanca je mišjiklokus lakog lanca
[0135]Takođe je opisan postupak za pravljenje/.-izvedenog lakog lanca za ljudsko antitelo, koje obuhvata dobijanje iz miša kako je ovde opisano sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca, i korišćenje sekvence lakog lanca i sekvence teškog lanca za pravljenje ljudskog antitela
[0136]Takođe je opisan, postupak za pravljenje proteina koji vezuje antigen, koji obuhvata izlaganje miša kako je ovde opisano antigenu, omogućavanje mošu da izgradi odgovor imunog sistema, i dobijanje od miša proteina koji vezuje antigen koji vezuje taj antigen, ili dobijanje od miša sekvence koju treba koristiti za pravljenje proteina koji vezuje antigen da veže ovaj antigen.
[0137]Takođe je opisana ćelija izvedena iz miša kako je ovde opisano U jednom varijantnom rešenju, ta ćelija se bira iz embrionske matične ćelije, višestruko jake ćelije, indukovane višestruko jake ćelije, B ćelije, i hibridoma.
[0138]Takođe je opisana ćelija koja obuhvata genetsku modifikaciju kako je ovde opisano U jednom varijantnom rešenju, ova ćelija je mišja ćelija. U jednom varijantnom rešenju ćelija se bira iz hibridoma i kvadroma. U jednom varijantnom rešenju, ćelija ispoljava laki lanac imunoglobulina koji obuhvata ljudsku Apromenljivu skevencu spojenu sa mišjom konstantnom sekvencom. U specifičnom varijantnom rešenju, mišja konstantna sekvenca je mišjakkonstantna sekvenca.
[0139]Takođe je opisano tkivo izvedeno iz miša kako je ovde opisano
[0140]Takođe je opisana upotreba miša ili ćelije kako je ovde opisano da se napravi protein koji vezuje antigen. U jednom varijantnom rešenju. protein koji vezuje antigen je ljudski protein U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo.
[0141]Takođe se odnosi na protein koji vezuje antigen napravljen pomoću miša, ćelije, tkiva, ili postupka kako je ovde opisano. U jednom varijantnom rešenju, protein koji vezuje antigen je ljudski protein. U jednom varijantnom rešenju, ljudski protein je ljudsko antitelo.
KRATAK OPIS SLIKA
[0142]
SL. 1pokazuje detaljnu ilustraciju, ne u razmeri, ljudskogAlokusa lakog lanca uključujući skupine VA segmenata gena (A, B i C) i parove Ja i CA regiona (J-C parove)
SL.2 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenog miša A lokus lakog lanca.
SL.3 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogenog mišaklokus lakog lanca.
SL.2 pokazuje opštu ilustraciju, ne prema razmeri, strategiju ciljanja korišćenu da inaktivira endogeni mišji A lokus lakog lanca sa ljudskim Asekvencama lakog lanca uključujući 12
hVA segmente gena i hJA1 segmente gena (12/1-A ciljajući vektor).
SL.4Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri četiri prvobitna ciljna vektora za ciljanje endogenog mišjeg k lokusa lakog lanca sa ljudskim Asekvencama lakog lanca uključujući 12 hVA segmente gena i hJA1 segmente gena (12/1-k ciljajući vektor). 12 hVA segmente gena i hJA1, 2, 3 i 7 segmente gena (12/4-k ciljajući vektor), 12 hVA segmente gena, ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu i hJA1 segment gena (12(k)1-kciljajući vektor) i 12 hVA segmente gena, ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu i hJA1, 2, 3 i 7 segmente gena (12(k)4-kciljajući vektor).
SL. 5Apokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljne strategije za progresivno umetanje 40 hVA segmenata gena ijedan hJA segment gena u mišji A lokus lakog lanca.
SL. 5Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljne strategije za progresivno umetanje 40 hVA segmenata gena ijedan hJA segment gena u mišjiklokus
SL. 6 pokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, ciljnih koraka i koraka molekularnog inženjeringa korišćenih da se napravi jedinstveni ljudskiA-khibridni ciljajući vektori za konstrukciju hibridnog lokusa lakog lanca koji sadrži ljudsku k intergensku sekvencu, višestruke hJA segmente gena ili obaSL. 7Apokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri, strukture lokusa za modifikovani mišji A lokus lakog lanca koji sadrži 40 hVA segmente gena i jedan hJA segment gena funkcionalno povezan na endogeni CA2 gen
SL. 7Bpokazuje opštu ilustraciju, ne u razmeri. strukture lokusa za četiri nezavisna, mofifikovana mišjaklokusa lakog lanca koji sadrže 40 hV7. segmenata gena i bilo jedan ili četiri hJA segmenta gena sa ili bez dodirne ljudske Vk-Jkgenomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni Ck gen.
SL. 8Apokazuje skice konture lgA<+>i lgK<+>splenocita usmerenih na CD19<+>od miša divljeg tipa (WT), miša homozigotnih za 12 hVA i četiri hJA segmenta gena koji obuhvataju ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (12hVA-VKjK- 4hJA) i mišji homozigotni za 40 hVA i jedan hJA segment gena (40hVA-1hJA).
SL. 8Bpokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz divljeg tipa (WT), mišji homozigotni za 12 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sequencu (12hVA-VKjK-4hJA) i miševe homozigotne za 40 hVA i jedan hJA segment gena (40hVA-1hJA).
SL. 9A,na gornjem panelu, pokazane su skice konture splenocita usmerenih na singlete i postavljenih za B i T ćelije (CD19<+>i CD3<+>, respektivno) iz miša divljeg tipa (WT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVA-VKjK-4hJA). Donji panel pokazuje iscrtane konture splenocita usmerenih na CD19<+>postavljene za lgA<+>i lgA<+>ispoljavanje iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hV/,-VKJK-4hJA)
SL. 9Bpokazuje ukupan broj CD19<+>, CD19<+>lgK<+>i CD19<+>lgA<+>B ćelija u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVA-VK-JK-4hJA).
SL. 9Cpokazuje iscrtanu konturu splenocita usmerenih na CD19<+>i postavljenih za imunogiobulin D (IgD) i imunogiobulin M (IgM) iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKJK-4hJX) Zrele (72 za VVT, 51 za 40hVA-VK-JK-4hJX) i tranzicione (13 za WT, 22 za 40hVA-Vk-JK-4hJA) B ćelije su navedene na svakoj od iscrtanih kontura.
SL. 9Dpokazuje ukupan broj CD19<+>B ćelija, tranzicionih B ćelija (CD19+lgMnilgDlci) i zrelih B ćelija (CD19+lgMlolgDrii) u prikupljenim slezinama iz miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudske Vk-Jkgenomske sekvence (40hVA-VKjK-4hJA)SL. 10A,na gornjem panelu, pokazuje iscrtanu konturu koštane srži postavljene za B i T ćelije (CD19<+>i CD3+, respektivno) iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVA-VK-Jk--4hJA) Donji panel pokazuje skice konture koštane srži usmerene na CD19<+>i postavljene za ckit<+>i CD43<+>iz miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VK-jK-4hJA) Pro i Pre B ćelije se označavaju na iscrtanoj konturi na donjoj ploči
SL. 10Bpokazuje broj Pro (CD19<+>CD43<+>ckit<+>) i Pre (CD19<+>CD43- ckit") B ćelije u koštanoj srži prikupljenoj iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu (40hVA-VK-jK-4hJA).
SL. 10Cpokazuje iscrtanu konturu koštane srži na singletima postavljenim za imunogiobulin M (IgM) i B220 od miša divljeg tipa (VVT) i miša homozigotnog za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk- Jk genomsku sekvencu (40hVA-Vk-jK-4hJA). Nezrele, zrele i pro/pre B ćelije su označene na svakoj od iscrtanih kontura.
SL. 10Dpokazuje ukupan broj nezrelih (B220<int>lgM<+>) i zrelih (B220<hi>lgM<+>) B ćelija u koštanoj srži izolovanih iz butnih kostiju miševa divljeg tipa (VVT) i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri JA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKjK-4hJA).
SL. 10Epokazuje iscrtane konture koštane srži usmerene na nezrele (B220'<nt>lgM<+>) i zrele (B220nilgM'f) B ćelije postavljene za igA i IgKispoljavanje izolovane iz butnih kostiju miša divljeg tipa
(VVT) i miša homozigotnog za 40 hV/, i četiri Ja. segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (40hVA-VKJk--4hJ/,)
SL. 11pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Va-Ja-Ck spoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske a sekvence gena lakog lanca na endogenim mišjimklokusu lakog lanca A6 - ID BR SEK:57; B6 - ID BR SEK:58; F6 = ID BR SEK:59; B7 = ID BR SEK:60; E7 = SEQ ID NO:61; F7 = ID BR SEK:62, C8 - ID BR SEK:63; E12 = ID BR SEK:64; 1-4 = ID BR SEK 65; 1-20 = ID BR SEK66, 3B43 = ID BR SEK 67; 5-8 - ID BR SEK:68; 5-19 = ID BR SEK:69; 1010 = ID BR SEK 70; 11A1 = ID BR SEK 71; 7A8 = ID BR SEK:72;
3A3 = ID BR SEK:73; 2-7 - ID BR SEK 74 Baze napisane malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FVVR4) kodiran pomoću sekvence nukleotida hJ?,1 i miša Cksu označene sa donje strane poravnanja sekvence.
SL. 12pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Va.-Ja.-Ckspoja osamnaest nezavisnih RT-PCR klonova pojačanih iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske a sekvence gena lakog lanca uključujući dodirnu ljudsku CK-JK- genomsku sekvencu na endogenom mišjemKlokusu lakog lanca. 5-2 = ID BR SEK:87; 2-5 = ID BR SEK;88; 1-3 = ID BR SEK 89; 4B-1 = ID BR SEK:90; 3B-5 = ID BR SEK:91;7A-1 = ID BR SEK:92; 5-1 = ID BR SEK:93; 4A-1 = ID BR SEK:94; 11A-1 = ID BR SEK:95;
5-7 = ID BR SEK 96; 5-4 = ID BR SEK:97; 2-3 = ID BR SEK 98
Baze napisane malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FVVR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida svakog ljudskog Ja. i mišjeg Ck su označene sa donje strane poravnanja sekvence.
SL. 13pokazuje poravnanje sekvence nukleotida Va-Ja.-Ca spoja tri nezavisna RT-PCR klona pojačana iz splenocita RNK miševa koji nose ljudske X sekvence gena lakog lanca na endogenom mišjem X lokusu lakog lanca. 2D1 - ID BR SEK:101; 2D9 = ID BR SEK:102; 3E15 - ID BR SEK:103. Baze sa malim slovima označavaju baze koje nisu baze klicine linije koje nastaju iz bilo mutacije i/ili N dodavanja tokom rekombinacije. Konsenzus amino kiseline unutar okvirnog regiona 4 (FVVR4) kodirane pomoću sekvence nukleotida hJ/1 i miša C/.2 su označene sa donje strane poravnanja sekvence.
DETALJAN OPIS
[0143]Ovaj pronalazak u svom najširem smislu je kako je definisan u nezavisnim patentnim zahtevima
[0144]Pojam "dodirno" obuhvata referencu na pojavu istog molekula nukleinske kisleine npr., dve sekvence nukleinske kiseline su "dodirne" ako se javljaju na istom nukleinskom molekulu ali su prekiute drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, preraspoređena V(D)J sekvenca je "dodirna" sa sekvencom gena konstantnog regiona, iako finalni kodon V(D)J sekvence nije neposredno praćen prvim kodonom sekvence konstantnog regiona. U drugom primeru, dve sekvence V segmenta gena su "dodirne" ako se jave na istom genomskom fragmentu, iako one mogu da budu odvojene sekvencom koja ne kodira kodon V regiona, npr , one mogu da budu odvojene regulatornom sekvencom, npr., promoterom ili drugom nekodirajućom sekvencom U jednom izvođenju, dodirna sekvenca obuhvata genomski fragment koji obuhvata genomske sekvence raspoređene kako se nalaze u genomu divljeg tipa.
[0145]Fraza "izvedeno iz" kada se koristi u vezi sa održivim regionom "izveden iz" navedeni gen ili segment gena obuhvata sposobnost da se prati sekvenca nazad do određenog nepreraspoređenog segmenta gena ili segmenata gena koji su preraspoređeni da formiraju gen koji ispoljava promenljivi domen (uzimajući u obzir, gde je primenljivo, razlike u spoju i somatske mutacije)
[0146]Fraza "funkcionalno" kada se koristi u vezi sa segmentom gena promenljivog regiona ili spojnim segmentom gena odnosi se na upotrebu u ispoljenom repertoaru antitela; npr, kod ljudi Va. segmenti gena 3-1, 4-3, 2-8, itd. su funkcionalni, a Va segmenti gena 3-2, 3-4, 2-5, itd su nefunkcionalni.
[0147]"Lokus teškog lanca" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr., mišjem hromozomu, pri čemu su pronađeni promenljivi teški lanac miša divljeg tipa (Vh). raznovrsnost teškog lanca (Dh), spoj teškog lanca (Jh), i konstantni region teškog lanca (Ch) sekvenci DNK.
[0148]"kLokus" obuhvata lokaciju na hromozomu, npr., mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljeg tipakpromenljiv (Vk),kspojni (Jk). ikkonstantni (Ck) region sekvenci DNK
[0149]"A Lokus"obuhvata lokaciju na hromozomu, npr, mišji hromozom, pri čemu su pronađeni kod miša divljegtipa Xpromenljiv (VA),Xspojni (Ja), iXkonstantni (CA) region sekvenci DNK.
[0150]Pojam "nepreraspoređeni" obuhvata stanje lokusa imunoglobulina pri čemu se V segmenti gena
i J segmenti gena (za teške lance, D segmenti gena takođe) održavaju odvojeno ali mogu da se spoje da formiraju preraspoređeni V(D)J gen koji obuhvata jedan V,(D),J od ovog V(D)J repertoara
Miševi koji ispoljavaju IjudskeA promenljive domene
[0151]Miševi koji ispoljavaju antitela koja su potpuno ljudska, ili delimično ljudska i delimično mišja, su prethodno već prikazani. VELOCIMMUNE® genetski projektovani miševi obuhvataju zamenu nepreraspoređenih V(D)J segmenata gena na endogenim mišjim lokusima sa ljudskim V(D)J segmentima gena. VELOCIMMUNE® miševi ispoljavaju himerna antitela koja imaju ljudske promenljive domene i mišje konstantne domene (videti, npr, US Pat. br 7,605,237} Većina drugih izveštaja se odnosi na miševe koji ispoljavaju potpuno ljudska antitela iz potpuno ljudskih transgena kod miševa koji imaju onemogućene endogene lokuse imunoglobulina.
[0152]Laki lanci antitela se enkodiraju jednim ili sa dva odvojena lokusa: kapa (k) i lambda (A). Laki lanci mišjeg antitela su primarnoktipa. Miševi koji prave mišja antitela, i modifikovani miševi koji prave potpuno ljudska ili himerna Ijudsko-mišja antitela, prikazuju neuravnoteženost u pogledu upotrebe lakog lanca. Ljudi takođe ispoljavaju neuravnoteženost lakog lanca, ali ne tako izraženu kao kod miševa, odnosklakih lanaca prema A lakim lancima kod miševa je oko 95,5, pri čemu kod ljudi je oko 60:40 Izraženija neuravnoteženost kod miševa se ne smatra da ozbiljno utiče na raznovrsnost antitela, jer kod miševaA promenljivi lokus nije tako raznovrstan u prvoj instanci. Ovo nije tako i kod ljudi. Ljudski A lokus lakog lanca obiluje raznovrsnošću.
[0153]Ljudski A lokus lakog lanca se proteže preko 1 000 kb i sadrži preko 80 gena koji kodiraju promenljive (V) ili spojne (J) segmente (SL. 1). Unutar ljudskog A lokusa lakog lanca, preko polovine svih primećenih VA domena se kodira pomoću segmenata gena 1-40. 1-44. 2-8, 2-14, i 3-21 Sve u svemu, oko 30 ili tako nešto ljudskih VA segmenata gena se smatra funkcionalnim Ima sedam JA segmenata gena, samo četiri se smatra generalno funkcionalnim JA segmentima gena-JA1. JA2. JA3, i JA7
[0154]LokusAlakog lanca kod ljudi je slične struktureklokusu kod miševa i ljudi po tome što ljudski A lokus lakog lanca ima nekoliko segmenata gena promenljivog regiona koji su sposobni da se rekombinuju da se formira funkcionalni protein lakog lanca LjudskiAlokus lakog lanca sadrži približno 70 V segmenata gena i 7 parova JA-CA segmenta gena. Samo četiri od ovih JA-CA parova segmenta gena se čine funkcionalnim. Kod nekih alela, petiJA-CA parsegmenta gena je prema izveštajima naveden kao pseudo gen (CA6) 70 VA segmenata gena izgleda da sadrže 38 funkcionalnih segmenata gena. 70 VA sekvenci se raspoređuje u tri skupine, a sve sadrže različite članove distinktivnih grupa familije V gena (skupine A, B i C; SL. 1). Postoji potencijalno bogat izvor relativno neiskorišćene raznovrsnosti za generisanje antitela sa ljudskim V regionima kod nehumanaih životinja.
[0155]Kao šušti kontrast, mišji A lokus lakog lanca sadrži samo dva ili tri (zavisno od soja) mišja VA segmenta gena regiona (SL. 2) Barem iz ovog razloga, ozbiljnakneuravnoteženost kod miševa se ne smatra posebno pogubnom za ukupnu raznovrsnost antitela
[0156]Prema objavljenim mapama mišji A lokus lakog lanca, lokus se sastoji u suštini od dve skupine segmenata gena unuar ospega od približno 200 kb (SL.2). Ove dve skupne sadrže dva kompleta V, J, i C gena koji su sposobni za nezavisnu preraspoređivanje: VA2-JA2-CA2-JA4-CA4 i VA1-JA3-CA3-JA1-CA1. lako je za VA2 utvrđeno da se rekombinuje sa svim JA segmentima gena VA1 se izgleda ekskluzivno rekombinuje sa CA1. Veruje se da je CA4 pseudo gen sa neispravnim mestima spajanja
[0157]Mišjiklokus lakog lanca je izrazito drugačiji. Struktura i broj segmenata gena koji učestvuju u događajima rekombinacije koji vode funkcionalom proteinu lakog lanca iz mišjegklokusa je mnogo složeniji (SL. 3). Dakle, mišji A laki lanci ne doprinose u velikoj men raznovrsnosti populacije antitela kod tipičnog miša
[0158]Iskorišćavanje obilate raznovrsnosti ljudskih/.lokusa lakog lanca kod miševa bi verovatno kao rezultat dalo, između ostalog, izvor za kompletniji ljudski repertoar V domena lakog lanca. Prethodni pokušaji da se dodirne ova raznovrsnost koristila je ljudske transgene koji sadrže blokove ljudskog lokusaXlakog lanca nasumično inkorporirane u mišji genom (videti, npr., US 6,998,514 i US 7,435,871). Miševi koji sadrže ove nasumično integrisane transgene su prema izveštajima mogli da ispolje potpuno ljudskeX lakelance, međutim, u nekim slučajevima, jedan ili oba endogena lokusa lakog lanca ostaje nedirnut. Ova situacija nije poželjna jer se ljudskeXsekvence lakog lanca nadmeću sa mišjim lakim lancem (teili X)u ispoljenom repertoaru antitela miša.
[0159]Nasuprot tome, pronalazači opisuju genetski modifikovane miševe koji su sposobni za ispoljavanje jedne ili više /.sekvenci nukleinske kiseline lakog lanca direktno iz endogenog kapa mišjeg lokusa lakog lanca. Genetski modifikovani miševi su sposobni za ispoljavanje ljudskihAsekvenci lakog lanca iz endogenogklokusa mogu još da budu kultivisani na mišjim koji obuhvataju ljudski lokus teškog lanca i tako mogu da se koriste da ispolje antitela koja obuhvataju V regione (teške iklake) koji su potpuno ljudski. V regioni se ispoljavaju sa mišjim konstantnim regionima. Kod različitih varijantnih rešenja, nema endogenih mišjih segmenata gena imunoglobulina prisutnih i V regioni se ispoljavaju sa ljudskim konstantnim regionima. Ova antitela će se pokazati korisna u brojnim primenama, i dijagnostičkim i terapijskim.
[0160]Brojne prednosti mogu da se realizuju za različita varijantna rešenja ispoljavanja proteina za vezivanje izvedenih iz ljudskih VA i JA segmenata gena kod miševa Prednosti je moguće realizovati postavljanjem ljudskih A sekvenci na endogenom lokusu lakog lanca, na primer, mišjem k ili A lokusu. Antitela napravljena od takvih miševa mogu da imaju lake lance, koji obuhvataju ljudske VA domene spojene na mišji Ckregion. Miševi će takođe ispoljiti ljudske VA domene koji su pogodni za identifikaciju i kloniranje za upotrebu sa ljudskim Clregionima, specifično Cki/iliCAregioni Zato što razvoj B ćelije kod takvih miševa jeste mače normalan, moguće je generisati kompatibilne VA domene (uključujući somatski mutirane VA domene) u kontekstu biloCAili Ckregiona
[0161]Genetski modifikovani miševi su opisani da obuhvataju nepreraspoređeni ljudski VA segment gena i nepreraspoređeni ljudski JA na endogenomklokusu lakog lanca imunoglobulina. Opisuju se miševi koji ispoljavaju antitela koja obuhvataju laki lanac koji ima ljudski VA domen spojen na Ckregion.
Sterilni transkriptiklokusa lakog lanca imunoglobulina
[0162]Varijacije na temu ispoljavanja ljudskih A sekvenci imunoglobulina kod miševa se ogledaju u različitim varijantnim rešenjima genetski modifikovanih miševa koji su sposobni za takvo ispoljavanje. Dakle, kod nekih varijantnih rešenja, genetski modifikovani miševi obuhvataju izvesnu nekodirajuću sekvencu(e) iz ljudskog lokusa. U jednom varijantnom rešenju, genetski modifikovan miš obuhvata ljudske VA i JA segmente gena na endogenome lokusu lakog lanca, i još obuhvata ljudskikgenomski fragment lakog lanca. U specifičnom varijantnom rešenju, ljudski k genomski fragment lakog lanca je nekodirajuća sekvenca prirodno otkrivena između ljudskog Vk segmenta gena i ljudskog Jk segmenta gena.
[0163]Ljudski i mišji k lokusi lakog lanca sadrže sekvence koje kodiraju sterilne transkripte kojima nedostaje bilo početni kodon ili otvoreni okvir za učitavanje, i koji se smatraju kao elementima koji regulišu transkripcijuklokusa lakog lanca Ovi sterilni transkripti nastaju iz integrisane sekvence smeštene nizvodno ili 3' od najbližeg Vksegmenta gena i uzvodno ili 5' odkintronskog pojačavača lakog lanca (EKi) koji je uzvodno odkkonstantnog regiona lakog lanca gena (Ck). Sterilni transkripti nastaju iz preraspoređenja intergenske sekvence da se formira VkJkI segment spojen na Ck.
[0164]Zamena k lokusa lakog lanca uzvodno od CKgena bi uklonila intergenski region koji kodira sterilne transkripte. Zbog toga, u različitim varijantnim rešenjima, zamena mišjeksekvence lakog lanca uzvodno od mišjeg Ckgena sa ljudskimAsegmentima gena lakog lanca bi kao rezultat dala humanizovani mišjiklokus lakog lanca koji sadrži ljudske VA i JA segmente gena ali nekintergenski region lakog lanca koji kodira sterilne transkripte
[0165]Kako je ovde opisano, humanizacija endogenog mišjegklokusa lakog lanca sa ljudskim A segmentima gena lakog lanca, pri čemu humanizacija uklanja intergenski region, daje kao rezultat značajan pad u upotrebiklokusa lakog lanca, spojeno sa zapaženim povećanjem A upotrebe lakog lanca. Zbog toga, iako humanizovani miš kome nedostaje intergenski region jeste koristan u pogledu toga da može da napravi antitela sa ljudskim promenljivim domenima lakog lanca (npr,. ljudski A ilikdomeni), upotreba iz lokusa se smanjuje.
[0166]Takođe je opisana humanizacija endogenog mišjegklokusa lakog lanca sa ljudskim VA i JA segmentima gena spojenim sa umetanjem ljudskogkintergenskog regiona da se stvori VA lokus koji sadrži, u vezi sa transkripcijom, između finalnog ljudskog VA segmenta gena i prvog ljudskog JA segmenta gena,kintergenski region; koji ispoljava populaciju B ćelije sa višim ispoljavanjem nego neki lokus kome nedostajekintergenski region. Ovo zapažanje je dosledno sa hipotezom da intergenski region direktno kroz sterilni transkript, ili indirektno potiskuje upotrebu iz endogenog A lokusa lakog lanca. Pod takvog hipotezom, uključivanje intergenskog regiona bi kao rezultat dalo smanjenje upotrebe endogenog A lokusa lakog lanca, što ostavlja mišu ograničen izbor nego da se koristi modifikovan (A uk) lokus da se generišu antitela kao što je formulisano u patentnim zahtevima
[0167]Kod različitih varijantnih rešenja, zamena mišjeksekvence lakog lanca uzvodno od mišjeg Ck gena sa ljudskom A^ sekvencom lakog lanca još obuhvata ljudski k intergenski region lakog lanca raspoređen s obzirom na transkripciju, između 3' neprevedenog regiona 3' većine VA segmenta gena i 5'na prvi ljudski JA segment gena. Alternativno, takvi intergenski region može da bude izostavljen iz zamenjenog endogenogklokusa lakog lanca (uzvodno od mišjeg Ckgena) brisanjem na endogenom A lokusu lakog lanca. Slično tome, u okviru ovog varijantnog rešenja, miš generiše antitela iz endogenogklokusa lakog lanca koji sadrži ljudske A sekvence lakog lanca kako je opisano u ovim patentnim zahtevima.
Pristupi inženjeringu miševa za ispoljavanje ljudskihVAdomena
[0168]Opisuju se različiti pristupi za pravljenje genetski modifikovanih miševa koji prave antitela koja sadrže laki lanac koji ima ljudski VA domen spojen na endogeni Ck region. Opisuju se genetske modifikacije koje, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvataju brisanje jednog ili oba endogena lokusa lakog lanca. Na primer, da se eliminišu mišji A laki lanci iz repertoara endogenog antitela brisanje prve VA-JA-CA skupine gena i moguće je izvesti zamenu, u celini ili delimično, VA-JA segmenata gena druge skupine gena sa ljudskim VA-JA segmentima gena. Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije, i ciljni konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija.
[0169]Brisanje jedne endogene VA-JA-CA skupine gena i zamenaVA-JA segmenatagena druge endogene VA.-JA-CA skupine gena koristi relativno minimalni prekid u prirodnom udruživanju konstantnog regiona antitela i funkcije kod životinje, kod različitih varijantnih rešenja, zbog toga što se endogeni CAgeni ostavljaju nedirnuti i samim tim zadržavaju normalnu funkcionalnost i sposobnost da se povezuju sa konstantnim regionom endogenog teškog lanca. Dakle, kod takvih varijantnih rešenjenja modifikacija ne utiče na druge konstantne regione teškog lanca zavisne od funkcionalnih konstantnih regiona lakog lanca za sklop funkcionalnog molekula antitela koji sadrži dva teška lanca i dva laka lanca Pored toga, kod različitih varijantnih rešenja ova modifikacija ne utiče na sklop funkciolnalnog molekula antitela vezanog membranom koji obuhvata endogeni teški lanac i laki lanac, npr., hVA domen povezan na miši CA region. Zbog toga što se najmanje jedan funkcionalanCAzadržava na endogenom lokusu, životinje koje sadrže zamenu VA.-JA segmenti gena endogene VA-JA-CA skupine gena sa ljudskim VA-JA segmentima gena teba da mogu da naprave normalne A lake lance koji su sposobni za vezivanje antigena tokom odgovora imunog sistema kroz ljudske VA-JA segmente gena prisutne u repertoaru ispoljenog antitela životinje.
[0170]Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisane endogene mišje VA-JA-CA skupine gena je data na SL. 2. Kako je ilustrovano. mišji A lokus lakog lanca se organizuje u dve skupine gena, obe sadrže funkcionalne segmente gena sposobne za rekombinovanje da formiraju funkciju mišjeg/.lakog lanca. Endogena mišja VA1-JA3-CA3- JA1-CA1 skupina gena se birše ciljnim konstruktom (ciljajući vektor 1) sa kasetom neomicina prirubno postavljenom pomoću mesta rekombinacije. Druga endogena skupina gena (VA2-VA3-JA2-CA.2-JA4-CA4) se birše ciljnim konstruktom (ciljajući vektor 2) sa kasetom higromicin-timidin kinaze prirubno postavljenom pomoću mesta rekombinacije. U ovom drugom slučaju ciljni događaj,CA2-JA4-CA4endogenih segmenata gena se zadržava. Drugi ciljni konstrukt (ciljajući vektor 2) se konstruiše korišćenjem mesta rekombinacije koja su drugačija u odnosu na mesta kod prvog ciljnog konstrukta (ciljajući vektor 1) čime se omogućava selektivno brisanje kasete odabira pošto je ostvareno uspešno ciljanje. Dvostrukociljani lokus koji je nastao kao rezultat je funkcionalno neaktivan u tome da nijedan endogeni A laki lanac ne može da bude proizveden. Ovaj modifikovan lokus može da se koristi za umetanje ljudskih VA i Ja segmenata gena da se stvori endogeni mišji A lokus koji obuhvata ljudske VA i JA., segmente gena, pomoću kojih, posle rekombnacije na modifikovanom lokusu, životinja proizvodi A lake lance koji obuhvataju preraspoređene ljudske VA i JA segmente gena povezane na endogeni mišji CA segment gena.
[0171]Genetsko modifikovanje miša da se dobiju endogeniAnefunkcionalni segmenti gena, u različitim varijantnim rešenjima, daje kao rezultat kod miša koji ispoljava isključivoklake lance u svom repertoaru antitela, što utiče na veću korisnost miša za procenu ulogeAlakih lanaca u odgovoru imunog sistema, i korisnim za pravljenje repertoara antitela koji obuhvata Vk domene ali ne VA domene
[0172]Genetski modifikovan miš koji ispoljava hVA povezan na mišji CAgen koji je rekombinovan na endogeni mišjiAlokus lakog lanca može da se pravi bilo kojim postupkom poznatim u ovoj oblasti. Sematska ilustracija (ne u razmeri) zamene endogenih mišjih VA2-VA3-JA2 segmenata gena sa ljudskim VA i JA segmentima gena je data na SL. 4A. Kako je ilustrovano. endogeni mišjiAlokus lakog lanca koji je učinjen nefunkcionalnim se zameni ciljnim konstruktom(12/1-A ciljajućivektor) koji obuhvata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću mesta rekombinacije. VA2-VA3-JA2 segmenti gena se zamenjuju sa genomskim fragmentom koji sadrži ljudsku A sekvencu koja obuhvata 12 hVA segmente gena i jedan hJA segment gena
[0173]Dakle, ovaj prvi pristup pozicionira jedan ili više hVA segmenata gena na endogeni A lokus lakog lanca dodiran sa jednim hJA segmentom gena (SL. 4A).
[0174]Dodatne modifikacije na modifikovani endogeni A lokus lakog lanca mogu da budu ostvarene korišćenjem sličnih tehnika da se ubaci više hVA segmenata gena. Na primer, šematske ilustracije dva dodatna ciljna konstruktaAi +12-A ciljajući vektori) korišćeni za progresivno umetanje dodavanja ljudskih hVA segmenata gena su dati na SL 5A Kako je ilustrovano, dodatni genomski fragmenti koji sadrže specifične ljudske hVAsegmente gena se umeću u modifikovani endogeniAlokus lakog lanca u uzastopnim koracima korišćenjem homologije obezbeđene prethodnim umetanjem ljudskih A sekvenci lakog lanca. Posle rekombinacije sa svakim ciljnim ilustrovanim konstruktom, na uzastopan način, 28 dodatnih hVA gene segmenata gena se umeće u modifikovani endogeni A lokus lakog lanca. Ovo stvara himerni lokus koji proizvodi A protein lakog lanca koji obuhvata ljudske VAJA segmente gena povezane na mišji CA gen.
[0175]Gornji pristupi za ubacivanje ljudskih A segmenata gena lakog lanca na mišjem A lokusu, zadržava pojačavače pozicionirane nizvodno od CA2-JA4-CA4 segmenta gena (naznačen Enh 2.4, Enh i Enh 3.1 SL. 4A i SL. 5A). Ovaj pristup daje kao rezultat jedan modifikovan alel na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca (SL. 7A).
[0176]Takođe su opisana jedinjenja i postupci za pravljenje miša koji ispoljava laki lanac koji obuhvata hVA i JA segmente gena funkcionalno povezane na mišjiCAsegment gena, uključujući jedinjenja i postupak za pravljenje miša koji ispoljava takve gene iz endogenog mišjeg A lokusa lakog lanca. Ovi postupci obuhvataju selektivno činjenje jedne endogene mišjeVA-JA-CAskupine gena nefunkcionalnom (npr., ciljano brisanje), i korišćenje hVA i JA segmenata gena na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca da se ispolji hVA domen kod miša.
[0177] Alternativno,kod drugog pristupa, ljudskiAsegmenti gena lakog lanca mogu da budu pozicionirani na endogenomklokusu lakog lanca. Genetska modifikacija, u različitim varijantnim rešenjima, obuhvata brisanje endogenogklokusa lakog lanca. Na primer, da bi se eliminisali mišjiklaki lanci iz repertoara endogenog antitela moguće je izvesti brisanje mišjih Vki Jksegmenata gena Takođe se opisuju genetski modifikovani mišji embrioni, ćelije i ciljni konstrukti za pravljenje miševa, mišjih embriona, i ćelija.
[0178]Iz gore navedneih razloga, brisanje mišjih Vk i Jk segmenata gena koristi relativno minimalni prekid. Šematska ilustracija (nije u razmeri) obrisanih mišjih Vki Jksegmenata gena je data na SL. 3. Ovi endogeni mišji Vki Jksegmenti gena se brišu preko rekombinazom posredovanog brisanja mišjih sekvenci pozicioniranih između dva precizno pozicionirana ciljajuća vektora svaki koristi mesta za rekombinaciju specifiičnu za mesto. Prvi ciljajući vektor (Jkciljajući vektor) se koristi u prvom ciljnom događaju za brisanje mišjih Jksegmenata gena. Drugi ciljajući vektor (Vkciljajući vektor) se koristi u drugom, uzastopnom procesu ciljanja da briše sekvencu smeštenu 5 od najudaljenijeg mišjeg Vksegmenta gena Oba ciljajuća vektora sadrže mesta za rekombinaciju specifičnu za mesto čime se omogućava selektivna brisanje obe kasete odabira i sve interventne mišjeksekvence lakog lanca pošto je uspešno izvedeno ciljanje. Brisani lokus koji se dobije kao rezultat je funkcionalno neaktivan tako da nijedan endogeniklaki lanac ne može da bude proizveden Ovaj modifikovani lokus može da se koristi za umetanje hVA i JA. segmenata gena da se stvori endogeni mišjiklokus koji obuhvata hVA i JA segmente gena, pri čemu, posle rekombinacije na modifikovanom lokusu životinja proizvodi A lake lance koji obuhvataju preraspoređene hVA i JA segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Cksegment gena. Različiti ciljajući vektori obuhvataju ljudskeAsekvence lakog lanca mogu da se koriste u vezi sa ovim obrisanim mišjimklokusom da se stvori hibridni lokus lakog lanca koji sadrži ljudske A segmente gena funkcionalno povezane sa mišjim Ckregionom
[0179]Dakle, drugi pristup pozicionira jedan ili više ljudskih VA segmenata gena pozicionirane na mišjem k lokusu lakog lanca dodirnom sa jednim ljudskimJA segmentomgena (12/1 -k ciljajući vektor, SL. 4B)
[0180]Modifikacije ovog pristupa mogu da budu izvedene da se dodaju segmenti gena i/ili regulatorne sekvence da se optimizuje upotreba ljudskihAsekvenci lakog lanca iz mišjegklokusa unutar repertoara mišjeg antitela.
[0181]U trećem pristupu, jedan ili više hVA segmenata gena se pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa četiri hJA sekvence gena (12/4-kciljajući vektor SL. 4B).
[0182]U trećem pristupu, jedan ili više hVA segmenata gena se pozicionira na mišjemklokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskom k intergenskom sekvencom i jednom hJA sekvencom gena (12(k)1-kciljajući vektor, SL. 4B).
[0183]U četvrtom pristupu, jedan ili više hVAsegmenata gena se pozicionira na mišjemKlokusu lakog lanca dodirnom sa ljudskomkintergenskom sekvencom četiri hJA sekvenci gena (12(k)4-kciljajući vektor SL. 4B).
[0184]Svi gore navedeni pristupi za ubacivanje ljudskihAsegmenata gena lakog lanca na mišjiklokusu, zadržavajukelement intronskog pojačavača uzvodno od Ckgena (naznačen EKi, SL. 4B i SL. 5B) i 3' k pojačavač nizvodno od CK-gena (naznačen Ek3', SL. 4B i SL. 5B). Ovaj pristup daje kao rezultat četiri modifikovana alela na endogenom mišjemklokusu lakog lanca (SL 7B).
[0185]U različitim varijantnim rešenjima, genetski modifikovan miš obuhvata mutirani endogeni mišji A lokus lakog lanca U jednom varijantnom rešenju, A lokus lakog lanca je mutiran pomoću strategije koja briše region koji se prostire od VA.2 do JA2, i region koji se prostire VA1 do CA1 (SL. 2). Bilo kakva strategija koja smanjuje ili eliminiše sposobnost endogenogAlokusa lakog lanca da ispolji endogene A domene je pogodan za upotrebu sa ovim opisom
Antitela lambda domena iz genetski modifikovanih miševa
[0186]Miševi obuhvataju ljudske A sekvence na bilo mišjemkili A lokusu lakog lanca će ispoljiti laki lanac koji sadrži hVA region spojen na mišji C(_ (CkiliCA)region. Ovo su pogodno kultivisani miševi koji (a) obuhvata funkcionalno neaktivan lokus lakog lanca (npr., mutirani oblik endogenog mišejgkili A lokusa lakog lanca); (b) obuhvata endogeni mišji A lokus lakog lanca koji sadrži hV i hJ segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji CAgen; (c) obuhvati endogeni mišjiklokus lakog lanca koji sadrži hVic i hJKsegmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Ckgen; i. (d) miš kod kog jedankalel sadrži hWe i hJK-e; drugikalel sadrži hVX i hJX. jedanXalel sadrži hVXi hJXi jedanXalel neaktivan ili mutiran, ili oba X alela sadrže hVX i hJX; i dva alela teškog lanca od kojih svaki obuhvata hVH, hDH, i hJH.
[0187]Antitela koja obuhvataju hVA domene ispoljene u kontekstu bilo kog od Ckse koriste da naprave potpuno ljudska antitela kloniranjem nukleinskih kiselina koje kodiraju hV/..domene u ispoljavanje konstrukata koji nose gene koji kodiraju ljudskiCX.Dobijem konstrukti ispoljavaju se presecaju poprečno u ćelije domaćina pogodne za ispoljavanje antitela koja prikazuju potpuno hVX domen spojen na hCX
PRIMERI
[0188]Dati su sledeći primeri tako da se opiše kako da se napravi upotreba postupaka i jedinjenja prema ovom pronalasku, i nisu predviđeni da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju da je njihov pronalazak. Osim ako nije drugačije navedeno, temperatura je navedena u Celzijusima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer I
Brisanje mišjih lokusa lakog lanaca imunoglobulina
[0189]Različiti ciljni konstrukti su napravljeni korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti, npr., US Pat. br. 6,586,251 i Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analvsis. Nature Biotech. 21(6) 652-659) za modifikovanje biblioteka mišjih genomskih bakterijskih veštačkih hromozoma (BAC) da se inaktiviraju mišjiki X. lokusi lakog lanca.
[0190] Brisanje mišjegXlokusa lakog lanca.DNA iz mišjeg BAC klona RP23-135k15 (Invitrogen) je modifikovana homoiognom rekombinacijom da se inaktivira endogeni mišjiXlokus lakog lanca kroz ciljana brisanjavX-JX-CXskupina gena (SL 2)
[0191]Ukratko, cela proksimalna skupina obuhvata VX1-JX3-CX3-JX1-CX1 segmente gena je brisana u jednom ciljnom događaju korišćenjem ciljnog vektora koji obuhvata kasetu neomicina prirubno postavljenu pomoću loxP mesta sa 5' mišjim homolognim krakom koji sadrži sekvencu 5' VX1 segmenta gena i 3' mišjeg homolognog kraka koji sadrži sekvencu 3' CX1 segmenta gena (SL 2, ciljajući vektor 1).
[0192]Drugi ciljni konstrukt je pripremljen da precizno obriše distalnu endogenu mišjuXskupinu gena koja sadrži VX2-JX2-CX2-JX4-CX4 izuzev one koju je sadržao ciljajući konstrukt 5' mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5' VX2 segmenta gena i 3' mišji homologni krak koji je sadržao sekvencu 5' na endogenom CX2 segmentu gena (SL. 2, ciljajući vektor 2). Dakle, drugi ciljani konstrukt je precizno izbrisan VX2-JX2, pritom ostavio je CX2-JX4-CX4 nedirnut na endogenom mišjem X lokusu. embrionske matične (ES) ćelije koje su sadržale neaktivirani endogeni X lokus (kako je gore opisano) su potvrđene putem postupaka karotipovanja i snimanja (npr., TAOMAN®) poznatim u tehnici. DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretiranju sa CRE rekombinazom čime je posredovanog brisanja proksimalne ciljne kasete koja je sadržala gen marker neomicina. ostavljajući samo jedno loxP mesto u tački brisanja (SL. 2, dno)
[0193] Brisanje mišjegklokusa lakog lanca.Korišćenjem postupaka sličnih gore opisanim postupcima, napravljeno je nekoliko ciljnih konstrukata da se modifikuje DNK iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04 (Invitrogen) homoiognom rekombinacijom da se inaktivira mišji k lokus lakog lanca u dvostepenom procesu (SL 3).
[0194]Ukratko, Jksegmenti gena (1-5) endogenog mišjegklokusa lakog lanca su izbrisani u samo jednom procesu ciljanja korišćenjem ciljnog vektora koji obuhvata kasetu higromicin-timidin kinaze (hyg-TK) koja sadrži jednoloxPmesto 3' na hyg-TK kasetu (SL. 3, Jkciljajući vektor). Homologni kraci korišćeni da se napravi ovaj ciljajući vektor su sadržali mišju genomsku sekvencu 5' i 3' endogenih mišjih Jksegmenata gena. U drugom procesu ciljanja, drugi ciljajući vektor je pripremljen da obriše deo mišje genomske sekvence uzvodno (5') na najudaljenijem endogenom mišjem Vksegmentu gena (SL 3, Vkciljajući vektor). Ovaj ciljajući vektor je sadržao invertovano lox511 mesto,loxPmesto i kasetu neomicina. Homologni kraci korišćeni da se napravi ovaj ciljajući vektor su sadržali mišju genomsku sekvencu uzvodno od najudaljenijeg mišjeg Vksegmenta gena Ciljajući vektori su korišćeni uzastopno (t./, Jkzatim Vk) da ciljaju DNK u embrionskim matičnim (ES) ćelijama. Embrionskim matične ćelije koje nose dvostruko ciljani hromozom (t.j., jedan endogeni mišji k lokus ciljan sa oba ciljajuća vektora) su potvrđeni postupcima karotipovanja i snimanja (npr., Taqman™) poznat u ovoj oblasti. DNK je zatim izolovana iz modifikovanih ES ćelija i podvrgnuta tretmanu sa Cre rekombinazom čije je posredovano brisanje endogenih mišjih Vksegmenata gena i obe kasete odabira, pritom ostavljajući dva podređena lox mesta suprotno orijentisano jedan u odnosu na drugi (SL. 3 dno; ID BR SEK1).
[0195]Dakle, dva modifikovana endogena lokusa lakog lanca (ki A) koja sadrže nedirnuti pojačavač i konstantne regione su stvorena za progresivno umetanje nepreraspoređenih ljudskihAsegmenata gena klicine linije na precizan način korišćenjem ciljnih vektora opisanih dole u tekstu
Primer II
Zamena mišjih lokusa lakog lanca sa ljudskimXmini-lokusom lakog lanca
[0196]Višestruki ciljajući vektori su projektovani za progresivno umetanje ljudskihXsegmenata gena u endogene mišje k i X lokuse lakog lanca korišćenjem sličnih postupaka kao što je gore opisano. Višestruke nezavisne početne modifikacije su napravljene na endogenim lokusima lakog lanca proizvodeći himerni lokus lakog lanca koji sadrži hVX i JX segmente gena funkcionalno povezane na mišje konstantne gene lakog lanca i pojačavače.
[0197] LjudskiXmini-lokus koji sadrži 12 ljudskiVA ijedan ljudskiJAsegment gena.Niz inicijalnih ciljajućih vektora je projektovan da sadrži prvih 12 uzastopnih ljudskih VA segmenata gena iz skupine A I hJX1 segmenta gena ili četiri hJX segmenata gena korišćenjem ljudskog BAC klona pod nazivom RP11-729g4 (Invitrogen). SL. 4A i 4B pokazuju ciljajuće vektore koji su konstruisani za pravljenje početnog umetanja ljudskihXsegmenata gena lakog lanca na mišjimX iklokusima lakog lanca, respektivno.
[0198]Za prvi komplet početnih ciljajućih vektora, 124,125 bp DNK fragment iz 729g4 BAC klona koji je sadržao 12 hVX segmenata gena i hJX1 segment gena je projektovan da sadrži Pl-Scel mesto 996 bp nizvodno (3') od hJX1 segmenta gena za vezivanje 3' mišja homologna kraka. Korišćena su dva različita kompleta homologmh krakova za ligaciju na ovom ljudskom fragmentu; jedan komplet homolognih krakova je sadržao endogene mišjeXsekvence iz 135k15 BAC klona (SL.4A) i još jedan komplet je sadržao endogenuksekvencu 5' i 3' mišjih Vk i Jksegmenata gena iz mišjih BAC klonova RP23-302g12 i RP23-254m04, respektivno (SL 4B).
[0199]Za 12/1-X ciljajući vektor (SL. 4A). Pl-Scel mesto je projektovano na 5' kraju 27.847 bp DNK fragmenta koji sadrži mišji CX2-JX4-CX4 i pojačavač 2 4 modifikovanog mišjeg X lokusa opisanog u Primeru 1. Korišćen je -28 kb mišji fragment kao 3' homologni krak ligacijom na -124 kb ljudski A fragment, koji je stvorio 3' ukrštanje koje je sadržalo, od 5<*>do 3', hJX1 segmenta gena, 996 bp ljudske A sekvence 3' hJA1 segmenta gena, 1 229 bp mišjeAsekvence5'na mišji CA2 gen, mišji C/^2 gen i preostali deo -28 kb mišjeg fragmenta. Uzvodno (5') od ljudskog VA3-12 segmenta je bio dodatni 1.456 bp ljudskeXsekvence pre početka 5' mišjeg homolognog kraka, koji je sadržao 23.792 bp mišje genomske DNK koja odgovara sekvenci 5' endogenog mišjegAlokusa Između 5' homolognog kraka i početka ljudske X sekvence je bila kaseta neomicina prirubno postavljena pomoću Frt mesta ;[0200]Dakle, 12/1-A ciljajući vektor je uključio, od 5' do 3'. 5' homologni krak sadrži -24 kb mišje A genomske sekvence 5' endogenog A lokusa, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto. -123 kb ljudske genomskeA sekvencesadrži prvih 12 uzastopnih hVA segmenata gena i hJA1 segmenata gena, Pl-Scel mesto, i 3' homologni krak koji sadrži -28 kb mišju genomsku sekvencu koja obuhvata endogene CA2-JA4-CA.4 segmente gena, mišji pojačavač 2.4 sekvence i dodanu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3') od pojačavača 2.4 (SL 4A). ;[0201]Na sličan način, 12/1-k ciljajući vektor (SL 4B) je koristio isti -124 ljudski A fragment sa izuzetkom da su mišji homologni kraci koji sadrže mišjuksekvencu korišćteni tako da ciljanje na endogeniklokus može da se ostvari pomoću homologne rekombinacije Dakle, 12/1-kciljajući vektor je uključio, od 5' do 3', 5' homologni krak koji obuhvata -23 kb mišje genomske sekvence 5' endogenog k (okusa, l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kaseta neomicina, 3" Frt mesto, -124 kb ljudske genomskeX sekvencekoja sadrži prvih 12 uzastopnih hV/. segmenata gena i hJ?,1 segmenata gena, Pl-Scel mesto, i 3' homologni krak koji sadrži -28 kb mišje genomske sekvence obuhvata endogeni mišji Ck gen. Em i Ek3' i dodatnu mišju genomsku sekvencu nizvodno (3 ) od Ek3' (SL 4B, 12/1-k ciljajući vektor), ;[0202]Homologna rekombinacija sa bilo kojim od ova dva inicijalna ciljajuća vektora je kreirala modifikovan mišji lokus lakog lanca (ic ili X) koji sadrži 12 hVX segmenata gena i hJ/.1 segment gena funkcionalno povezan na endogeni mišji konstantni gen lakog lanca i pojačavače (Ckili Ca.2 i Eki/Ek3' ili Enh 2.4/Enh 3.1) gen koji. posle rekombinacije, vodi formiranju himernogXlakog lanca. ;[0203] Ljudski X mini-lokus sa 12 ljudskiVa ičetiri ljudskaJk segmentagena.U drugom pristupu da se doda raznovrsnost himernom /, lakog lanca, treći inicijalni ciljajući vektor je projektovan da se umetne prvih 12 uzastopnih ljudskih Va segmenata gena iz skupineAi hJ/.l,2,3i7segmenata gena u mišjiklokus lakog lanca (SL. 4B, 12/4-k ciljajući vektor). DNK segment koji sadrži hJ>,l, Ja2, Ja.3 i1X7segmenata gena je napravljenade novoDNK sintezom (Integrated DNA Technologies) uključujući svakiiX segmentgena i ljudsku genomsku sekvencu -100 bp od i neposrednih 5' i 3' regiona svakog JAsegmenta gena. Pl-Scel mesto je projektovano u 3' kraj ovog -l kb DNK fragment i povezan na kasetu hloroamfenikol Homologni kraci su PCR pojačani iz ljudskeXsekvence na 5' i 3' pozicijama u odnosu prema hJ/.lsegment gena ljudskog BAC klona 729g4. Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom intermedijara je izvedena na modifikovanom 729g4 BAC klonu koji je prethodno ciljan uzvodno (5') od ljudskogVA3-12 segmenta gena sa kasetom neomicina prirubno postavljenom pomoću Frt mesta, koja su takođe sadržala l-Ceul mesto 5' do 5' Frt mesta. Dvostruko-ciljani 729g4 BAC klon je obuhvatio od 5' do 3' l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mestom, -123 kb fragment koji sadrži prvih 12 hV/. segmenata gena, -i kb fragment koji sadrži ljudske J/.1, 2, 3 i 7 segmente gena, Pl-Scel mesto, i kasetu hloroamfenikola ;Ovaj ciljajući vektor intermedijara je rastvoren zajedno sa l-Ceul i Pl-Scel i naknadno povezan u modifikovan mišji BAC klon (opisan gore) da se stvori treći ciljajući vektor ;[0204]Ova ligacija je dala kao rezultat treći ciljajući vektor za ubacivanje ljudskihXsekvenci u endogeni k lokus lakog lanca, koji je obuhvatio, od 5' do 3', 5' mišji homologni krak koji je sadržao -23 kb genomske sekvence 5' endogenog mišjegklokusa, l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto, -123 kb fragment koji obuhvata prvih 12 hV/. segmenata gena, -1 kb fragment koji obuhvata hJA.1, 2, 3 i 7 segmente gena, Pl-Scel mesto i 3' homologni krak koji obuhvata -28 kb mišje genomske sekvence uključujući endogeni mišji Ckgen, Eki i Ek3<!>i dodatnu mišju genomsku sekvencu u donjem toku (3') Ek3' (SL. 4B, 12/4-k ciljajući vektor). Homologna rekombinacija sa ovim trećim ciljajućim vektorom je stvorila modifikovani mišjiklokus lakog lanca koji obuhvata 12 hV/. segmente gena i četiri hJA segmenta gena funkcionalno povezane na endogeni mišji Ck gen koji, posle rekombinacije, vodi formiraju himernog ljudskogXImišjeg k lakog lanca. ;[0205] LjudskiXmini-lokus sa integrisanom ljudskomksekvencom lakog lanca.;Na sličan način, dva dodatna ciljajuća vektora slična onima koji su projektovani da se napravi početno umetanje ljudskihX segmenatagena u endogeni k lokus lakog lanca (SL. 4B, 12/1-k I 12 14-k ciljajući vektori) su projektovani da progresivno ubacuju ljudskeXsegmente gena lakog lanca koristeći jedinstveno konstruisane ciljajuće vektore koji sadrže dodirne ljudskeXikgenomske sekvence. Ovi ciljajući vektori su konstruisani da obuhvate - 23 kb ljudsku k genomsku sekvencu prirodno postavljenu između ljudskih Vk4-1 i Jk1 segmenata gena Ova ljudskaKgenomska sekvenca se specifično pozicionirana u ova dva dodatna ciljajuća vektora između ljudskih Va i ljudskih J?. segmenata gena (SL. 4B, 12(k)1-ki 12(k)4-kciljajuće vektore). ;[0206]Oba ciljajuća vektora koja sadrže ljudskukgenomsku sekvencu su napravljena korišćenjem modifikovanog RP11-729g4 BAC klona opisanog gore (SL. 6). Ovaj modifikovani BAC klon je ciljan sa kasetom odabira spektinomicina prirubno postavljenom pomoću Noti i AsiSI mesta ograničenja (SL. 6, gore levo). Homologna rekombinacija sa kasetom spektinomicina dala je kao rezutlat dvostruko ciljani 729g4 BAC klon koji je obuhvatio, od 5' do 3', l-Ceul mesto. 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto, -123 kb fragmenta sa prvih 12 hV7. segmenata gena, Noti mesto oko 200 bp donjeg toka (3') do sekvence nonamera hVA.3-1 segmenta gena, kasete i AsiSI mesto. Odvojeni ljudski BAC klon sa ljudskomksekvencom (CTD-2366j12) je ciljan dva nezavisna puta da se projektuju mesta ograničenja na lokacijama između hVK-4-1 i hJid segmenata gena da se omogući naknadno kloniranje -23 kb fragmenta za ligaciju sa hVA segmentima gena sadržanim u dvostruko ciljanom modifikovanom 729g4 BAC klonu (SL. 6. gore desno) ;[0207]Ukratko, 2366j12 BAC klon je oko 132 kb veličine i sadrži hVk- segmente gena 1-6, 1-5, 2-4, 7-3, 5-2, 4-1, ljudsku k genomsku sekvencu nizvodno od Vk segmenata gena, hJK segmenata gena 1-5, hCK i oko 20 kb dodatne genomske sekvence ljudskogklokusa. Ovaj klon je prvo ciljan sa ciljajućim vektorom sa kasetom higromicina postavljenom prirubno pomoću Frt mesta i Noti mesto nizvodno (3') od 3' Frt mesta. Homologni kraci za ovaj ciljajući vektor sadržali su ljudsku genomsku sekvencu 5' i 3' Vksegmente gena sa BAC klonom tako da su posle homologne rekombinacije sa ovim ciljajućim vektorom, Vksegmenti gena brisani i Noti mesto je projektovano~133 bp nizvodno od hVk-4-1 segmenta gena (SL. 6, gore desno). Ovaj modifikovan 2366j12 BAC klon je ciljan nezavisno sa dva ciljajuća vektora na 3' kraju da se brišu hJKsegmenti gena sa kasetom hloroamfenikola kasetom hloroamfenikola koji su takođe sadržali bio hJA1 segment gena. Pl-Scel mesto i AsiSI mesto ili ljudski A genomski fragment koji je sadržao četiri hJA segmenta gena( supra),P!-Scel mesto i AsiSI mesto (SL 6, gore desno). Homologni kraci za ova dva slična ciljajuća vektora su sadržali sekvencu 5' i 3' hJK segmenata gena. Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima i modifikovan 2366j12 BAC klon je dao prinos dvostruko-ciljanog 2366J12 klona koji je obuhvatio, od 5' do 3', 5' Frt mesto, kasetu higromicina, 3' Frt meto, Noti mesto, 22.800 bp genomski fragment ljudskiklokus koji obuhvata intergenski region između Vk4-1 i Jk1 segmentima gena. bilo hJA1 segment gena ili ljudski A genomski fragment koji obuhvata hJA1, JA2, JA3 i JA7, Pl-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola (SL. 6, gore desno). Dva finalna ciljajuća vektora da se naprave dve dodatne modifikacije su izvedene dva koraka ligacije korišćenjem dvostruko-ciljanih 729g4 i 2366j12 klonova. ;[0208]Dvostruko-ciljani 729g4 i 2366j12 klonovi su rastvoreni sa Noti i AsiSI dajući kao prinos jednog fragmenta koji obuhvata kasetu neomicina i hVA segmenata gena i još jedan fragment koji obuhvata -23 kb genomskog fragmenta ljudskog k lokusa sa intergenskim regionom između Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJA1 segment gena ili genosmki fragment koji obuhvata hJA1, J/*2, JA3 i JA7 segmenata gena, Pl-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola, respektivno. Ligacija ovih fragmenata je generisalo dva jedinstvena BAC klona koji obuhvataju od 5' do 3<!>hVA segmenata gena, ljudskukgenomsku sekvencu između Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJA1 segment gena ili genomski fragment koji obuhvata hJA1, JA2, JA3 and JA7 segmenata gena, Pl-Scel mesto i kasetu hloroamfenikola (SL. 6, dno). Ovi novi BAC klonovi su zatim rastvoreni sa l-Ceul i Pl-Scel da ispuste jedinstvene fragmente koji sadrže kasetu neomicina uzvodno i dodirne ljudske A iksekvence i povežu se u modifikovani mišji BAC klon 302g12 koji je sadržao od 5' do 3' mišje genomske sekvence 5' endogenogklokusa. l-Ceul mesto, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3' Frt mesto, hVA segmente gena (3-12 to 3-1), Noti mesto -200 bp nizvodno VA3-1, -23 kb ljudskeksekvence koja se može prirodno naći između ljudskih Vk4-1 i Jk1 segmenata gena, bilo hJA1 segment gena ili genomski fragment sa hJA1. JA2, JA3 i JA7 segmentima gena, mišji Ek\, mišji CK-gen i Ek3' (SL. 4, 12hVA-VKJK-hJA1 i 12hVA-VK\JK-4hJA ciljajući vektor). Homologna rekombinacija sa oba ova ciljajuća vektora je stvorila dva odvojena mišjaklokusa lakog lanca sa 12 hVA segmenata gena, ljudsku k genomsku sekvencu, i jedan ili četiri hJA segmenta gena funkcionalno povezana na endogeni mišji Ckgen koji, posle rekombinacije, vodi formiranju himernog ljudskog A/ mišjegklakog lanca.
Primer III
Projektovanje dodatnih ljudskihVA segmenatagena u ljudski A mini-lokus lakog lanca
[0209]Dodatni hVA segmenti gena su dodati nezavisno na svaku od početnih modifikacija opisanih u Primeru 2 korišćenjem sličnih ciljajućih vektora i postupaka (SL. 5A, +16-/. ciljajući vektor i SL. 5B +16-Kciljajući vektor).
[0210] Uvođenje 16 dodatnih ljudskih VA segmenata gena.Uzvodno (5 ) homologni kraci korišćeni za sklapanje ciljajućih vektora za dodavanje 16 dodatnih hVA segmenata gena na modifikovane lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 su sadržali mišju genomsku sekvencu 5' bilo endogenihkili A lokusa lakog lanca 3' homologni kraci su bili isti za sve ciljajuće vektore i sadržali su ljudske genomske sekvence koje se preklapaju sa 5' krajem ljudske A sekvence modifikacija kako je opisano u Primeru 2.
[0211]Ukratko, dva ciljajuća vektora su projektovana za uvođenje 16 dodatnih hVA segmenata gena na modifikovane mišje lokuse lakog lanca opisane u Primeru 2 (SL 5A i 5B, +16-Aili +16-K ciljajući vektor). DNK fragment od -172 kb iz ljudskog BAC klona RP11-761113 (Invitrogen) sa 21 uzastopnih hVA segmenata gena iz skupine A je projektovan sa 5' homolognim krakom koji obuhvata mišju genomsku sekvencu 5' na bilo endogeni lokus k iliAlokus lakog lanca i 3' homologni krak koji obuhvata ljudsku genomsku A sekvencu. 5' mišjikiliAhomologni kraci korišćeni u ovim ciljajućim konstruktima su bili isti 5' homologni kraci opisani u Primeru 2 (SL. 5A i 5B) 3' homologni krak je obuhvatio 53.057 bp preklapanja ljudske genomske A sekvence koja odgovara ekvivalentnom 5' kraju -123 kb fragmenta ljudske genomske A sekvence opisane u Primeru 2 Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5' do 3', 5' mišji homologni krak koji je sadržao bilo -23 kb genomske sekvence 5' endogenog mišjegklokusa lakog lanca ili -24 kb mišje genomske sekvence 5' endogenogAlokusa lakog lanca, 5' Frt mesto, kasetu higromicina, 3' Frt mesto i 171.457 bp ljudske genomske A sekvence sa 21 uzastopnih hVA segmenata gena, -53 kb od tih se preklapa sa 5' krajem ljudskeAsekvence opisane u Primeru 3 i služi kao 3' homologni krak za ovaj ciljajući konstrukt (SL 5A i 5B, +16-Aili +16-K vektora ciljanja). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorima je stvorila nezavisno modifikovan mišji lokuskiAlokus lakog lanca svaki sa 28 hVA segmentima gena segmentima gena i hJA1 segment gena funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Ck ili CA2) koji, posle rekombinacije, vode formiranju himernog lakog lanca.
[0212]Na sličan način, +16-Kciljajući vektor je takođe korišćen da uvede 16 dodatnih hVA segmenata gena na druge početne modifikacije opisane u Primeru 2 koje su obuhvatile više hJA segmenata gena sa i bez integrisane ljudskeksekvence (SL. 4B) Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjemklokusu sa drugim početnim modifikacijama je stvorila mišjeklokuse lakog lanca sa 28 hVA segmenata gena i hJA1, 2. 3 i 7 segmente gena sa i bez ljudske Vk-Jk genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Ck gen koji, posle rekombinacije. vodi formiranju himernog A-klakog lanca,
[0213] Uvođenje 12 dodatnih ljudskih VA segmenata gena.Dodatni heks segmenti gena su dodati nezavisno na svaku od modifikacija opisanih gore u tekstu korišćenjem sličnih ciljajućih vektora t postupaka. Finalna konstrukcija lokusa koja je nastala iz homologne rekombinacije sa ciljajućim vektorima je sadržala dodatne hVA segmente gena su prikazane na SL. 7A i 7B.
[0214]Ukratko, ciljajući vektor je projektovan za uvođenje 12 dodatnih hVA segmenata gena na modifikovani mišjik iA lokuse lakog lanca opisane gore u tekstu (SL 5A i 5B. +12-Aili 12-k ciljajućih vektora). DNK fragment 93.674 bp iz ljudskog BAC klona RP11-22118 (Invitrogen) sa 12 uzastopnih hVA segmenata gena iz skupine B je projektovan sa 5' homolognim krakom koji sadrži mišju genomsku sekvencu 5' na bilo endogeni mišjikili A lokus lakog lance i 3' homologni krak koji obuhvata ljudsku genomsku A sekvencu. 5' homologni kraci korišćeni u ovom ciljajućem konstruktu su bili isti 5' homologni kraci korišćeni za dodavanje 16 hVA segmenata gena opisanih gore u tekstu (SL 5A i 5B) 3' homologni krak je napravljen projektovanjem Pl-Scel mesta -3431 bp 5' na ljudski VX3-29P segment gena sadržan u 27.468 bp genomskom fragmentu ljudske A sekvence iz BAC klona RP11-761113. Ovo Pl-Scel mesto je služilo kao tačka ligacije da se pridruži -94 kb fragment dodatne ljudske A sekvence na -27 kb fragment ljudske A sekvence koja se preklapa sa 5' krajem ljudskeAsekvence u prethodnoj modifikaciji korišćenjem +16-A ili +16-Kciljajućih vektora (SL. 5A i 5B). Ova dva ciljajuća vektora su obuhvatila, od 5' do 3', 5' homologni krak koji sadrži bilo -23 kb mišje genomske sekvence 5' endogenogklokusa lakog lanca Dr -24 kb mišje genomske sekvence 5' endogenog A lokusa lakog lanca, 5' Frt mesto, kasetu neomicina, 3 Frt mesto i 121 188 bp ljudske genomske /.sekvence sa 16 hVA segmenata gena i Pl-Scel mesto; čijih se -27 kb preklapa sa 5' krajem ljudske/.sekvence od umetanja 16 dodatnih hVA segmenata gena i služi kao 3' homologni krak za ovaj ciljajući konstrukt (SL. 5A i 5B, +12-/, ili 12-kciljajućih vektora). Homologna rekombinacija ovih ciljajućih vektora je nezavisno stvorila modifikovane mišje k i A lokuse lakog lanca sa 40 hVA segmenata gena ljudski JA1 funkcionalno povezan na endogene mišje konstantne gene (Ckili CA2) koje. posle rekombinacije, vodi formiranju himernog lakog lanca (dno SL 5A i 5B).
[0215]Na sličan način, +12-K ciljajući vektor je takođe korišćen da uvede 12 dodatnih hVAsegmenata gena na druge početne modifikacije koje su obuhvatile više hJA segmenata gena sa i bez integrisane ljudskeksekvence (SL. 4B). Homologna rekombinacija sa ovim ciljajućim vektorom na endogenom mišjemklokusu je sadržala druge modifikacije koje su stvorile mišjiklokus lakog lanca sa 40 kVA segmenata gena i hJA1, 2, 3 i 7 segmenata gena sa i bez ljudske Vk-Jk genomske sekvence funkcionalno povezane na endogeni mišji Ckgen koji, posle rekombinovanja, vodi formiranju himernog A-klakog lanca.
Primer IV
Identifikacija ciljanih embrionskih matičnih (ES) ćelija koje nose ljudske A segmente gena
lakog lanca
[0216]Ciljana BAC DNK napravljena prema prethodnim primerima je konšćena na elektroporizovanim mišjim embrionskim matičnim (ES) ćelijama da se stvore modifikovane embrionske matične (ES) ćelije za generisanje himernih miševa koji ispoljavaju ljudske A segmente gena lakog lanca Embrionske matične (ES) ćelije koje obuhvataju umetanje nepreraspoređenih ljudskih A segmenata gena lakog lanca su identifikovani pomoću kvantitativnog TAQMAN® ogleda. Kompleti i probe specifičnih prajmera su projektovani za umetanje ljudskihAsekvenci i udruženih kaseta odabira (prirast alela, GOA), gubitak endogenih mišjih sekvenci i bilo koje kasete odabira (gubitak alela, LOA) i zadržavanje prirubnih mišjih sekvenci (zadržavanje alela, AR) Za svako dodatno umetanje ljudskihAsekvenci. Kompleti i probe dodatnih prajmera su korišćeni da se potvrdi prisustvo dodatnih ljudskihAsekvenci kao i kompleti i probe prethodnih prajmera korišćenih da se potvrdi zadržavanje prethodno ciljanih ljudskih sekvenci. Tabela 1 prikazuje prajmere i sa njima povezane probe korišćene za oglede kvantitativne PCR analize. Tabela 2 iznosi kombinacije korišćene za potvrdu umetanja svakog odeljka ljudskih A segmenata gena lakog lanca u klonove embrionskih matičnih (ES) ćelija
[0217]Embrionske matične (ES) ćelije koje nose ljudskeAsegmente gena lakog lanca su opciono transfektovane sa konstruktom koji ispoljava FLP kako bi se uklonila Frt'ed kaseta neomicina uvedena umetanjem ciljajućeg konstrukta koji obuhvata ljudske VA5-52-VA1-40 segmente gena (SL. 5A i 5B) Kaseta neomicina može opciono da bude uklonjena oplemenjivanjem na miševima koji ispoljavaju FLP rekombinazu (npr., US 6,774,279). Opciono, kaseta neomicina je zadržana kod miševa.
Primer V
Generisanje miševa koji ispoljavaju ljudskeXlake lanceizendogenog lokusa lakog lanca
[0218]Ciljane embrionske matične (ES) ćelije opisane gore u tekstu su korišćene kao donor embrionske matične ćelije i uvedene u embrion miša u stadiujumu od 8-ćelija mišjeg embriona postupkom VELOCIMOUSE® (videti, npr , US Pat br 7,294,754 i Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentiallv fully derived from the donor gene-targeted ES cells allovving immediate phenotypic analyses Nature Biotech, 25{1):91-99), VELOCtMICE® (F0 miševi su u potpunosti razvijeni iz matične ćelije (ES) ćelije donatora) koji nezavisno nosi ljudskeXsegmente gena su identifikovani genotipovanjem korišćenjem modifikacije ogleda alela (Valenzuelaef a/., supra)koji su detektovali prisustvo jedinstvenih ljudskih/.segmenata gena( supra).
[0219]k:X upotreba lakog lanca miševa kojinoseljudske / segmente gena lakog lanca.Homozigotni miševi za svaka tri uzastopna umetanja hV/. segmenata gena se jednim hJA segmentom gena (SL, 5B) i miševi homozigotni za prvo umetanje hV/. segmenata gena sa bilo jednim hJA segmentom gena ili četiri ljudskaJ/.segmenta gena uključujući
ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu (SL. 4B) su analizirani za k i/. ispoljavanje iakog lanca u splenocitima korišćenjem protočne citometrije
[0220]Ukratko, slezine su prikupljene iz grupa miševa (koje se kreću od tri do sedam životinja po grupi) i samlevene korišćenjem staklenih klizišta. Posle liziranja crvenih ćelija krvi (RBCs) sa ACK puferskim sredstvom za liziranje (Lonza VValkersville) splenociti su postavljeni sa fluorescentnom bojom konjugovanim antitelima specifičnim za mišji CD 19 (Clone 1 D3, BD Biosciences), mišji CD3 (17A2, Biolegend), mišji kjK(187.1; BD Biosciences) i mišji\<gx>(RML-42.Biolegend). Podaci su prikupljeni korišćenjem BD™ LSR II protočne citometrije (BD Biosciences) i analizirani korišćenjem FLOVVJO™ softvera (Tree Star, Inc.). Tabela 3 iznosi prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>),klakog lanca (CD19<+>lgK<+>lgX~) i/.ispoljavanje lakog lanca (CD19<+>lgK~lg<+>) primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose svaku genetsku modifikaciju
[0221]U sličnom eksperimentu, analizirani su sadržaji B ćelija pregrade slezine iz miševa homozigotnih za prvo umetanje 12 hV/. i četiri hJ). segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ckgen (dno SL 4B) i mišji homozigot za 40 hV/. i jedan hJX. segment gena (dno SL 5B ili vrh SL. 7B) za lgx i IgKispoljavanje korišćenjem protočne citometrije (kako je gore opisano). SL. 8A pokazuje ispoljavanje lg/, i lgx u CD19<+>B ćelijama za miša koji je predstavnik za svaku grupu. Broj CD19<+>B ćelija po slezini je takođe zabeležen za svaki mišji (SL. 8B)
[0222]U drugom eksperimentu, analizirani su sadržaj B ćelija pregrada za slezinu i koštanu srž iz mišjih homozigotnih za 40 hV). i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ckgen (dno SL 7B) za napredovanje kroz razvoj B ćelije korišćenjem protočne citometrije različitih markera površine ćelije
[0223]Ukratko, dve grupe (N-3 svaka, 9-12 nedelja stari, muški i ženski) divljeg tipa i miševi homozigotni za 40 hVA i četiri hJ/. segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jk genomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ckgen su žrtvovani i pokupljene su slezine i koštana srž. Koštana srž je prikupljena iz butnih kostiju ispiranjem sa potpunom podlogom R PM I medij um (RPMImedium dopunjen serumom telećeg fetusa, natrijum piruvatom, Herpes, 2-merkaptoetanolom, neesencijalnim amino kiselinama, i gentamicinom). RBC preprarati iz slezine i koštane srži su lizovani sa ACK puferskim sredstvom za lizu (Lonza VValkersville). posle čega je usledilo pranje sa potpunom RPMI podlogom. 1x10^ ćelije su inkubirane sa antitelima koja jako reaguju sa antigenima miša CD16/CD32 (2.4G2, BD Biosciences) na ledu tokom 10 minuta, posle čega je usledio označavanje sa odabranim panelom antitela tokom 30 min. na ledu.
[0224]Panel koštane srži: anti-mišji FITC-CD43 (1 B11, BioLegend), PE-ckit (2B8, BioLegend), PeCy7-lgM (11/41, eBioscience), PerCP-Cy5.5-lgD (11-26c.2a. BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD) i Pacific Blue-CD3 (17A2. BioLegend).
[0225]Panel koštane srži i slezine: anti-mišji FITC-lgK (187 1, BD). PE-lg/. (RML-42, BioLegend),
PeCy7-lgM (11/41, ebioscience), PerCP-Cy5 5-lgD (11-26c.2a, BioLegend), Pacific Biue-CD3 (17A2, BioLegend), APC- B220 (RA3-6B2, eBioscience), APC-H7-CD19 (ID3, BD)
[0226]Posle bojenja, ćelije su oprane i fiksirane u 2% formaldehidu Prikupljanje podataka je izvedeno na FACSCANTOII™ protočnoj citometriji (BD Biosciences) i analizirani sa FLOVVJO™ softverom (Tree Star, Inc.). SL. 9A. - 9D pokazuju rezultate za slezinsku pregradu jednog miša predstavnika iz svake grupe. SL. 10A - 10E pokazuju rezultate za pregradu koštane srži jednog miša predstavnika za svaku grupu. Tabela 4 iznosi prosečne procenutalne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), ispoljavanjeklakog lanca (CD19<+>lgK<+>lg~) i A laki lanac (CD19<+>lgK-lgA<+>) primećeno u splenocitima iz grupa životinja koje nose različite genetske modifikacije. Tabela 5 iznosi prosečne procentualne vrednosti za B ćelije (CD19<+>), zrele B ćelije (B220<ni>|gM<+>), nezrele B ćelije (B220<int>lgM<+>), nezrele B ćelije koje ispoljavajuklaki lanac (B220intlgM+lgK+) i nezrele B ćelije koje ispoljavaju A laki lanac (B220intlgM+lgA+) primećen u koštanoj srži divljeg tipa i miševa homozigotnih za 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu funkcionalno povezanu na mišji Ckgen. Ovaj eksperiment je ponovljen sa dodatnim grupama miševa opisanih iznad i pokazani su slični rezultati (podaci nisu prikazani).
[0227] Upotreba ljudskogVAgena kod miševa koji nose ljudskeAsegmente gena lakog
lanca.Heterozigotni miševi za prvo umetanje ljudskihAsekvenci (hVA3-12-hVA3-1 i hJA1, SL. 5B) i homozigotni za treće umetanje ljudskihAsekvenci (hVA5-52 - hVA3-1 i hJA1, SL 5B) su analizirani za ljudski A. gen lakog lanca korišćenjem reverzne lančane reakcije transkriptaze polimeraze (RT-PCR)
koršćenjem RNK izolovanih iz splenocita.
[0228]Ukratko, slezine su prikupljene i prelivene sa 10 mL RPMI-1640 (Sigma) sa 5% HI-FBS u sterilnim vrećama za jednokratnu upotrebu. Svaka vreća koja je sadržala jednu siezinu je zatim postavljena u STOMACHER™ (Sevvard) i homogenizovana na srednjoj postavci tokom 30 sekundi. Homogenizovane slezine su filtrirane korišćenjem 0,7um cediljke za ćelije i zatim su peletirane centrifugom (1000 ob./min tokom 10 minuta) i RBCs su lizovane u BD PHARM LYSE™ (BD Biosciences) tokom tri minuta. Splenociti su rastvoreni sa RPMI-1640 i ponovo centrifugirani, posle čega je sledilo vraćanje u suspenziju u 1 mL PBS (Irvine Scientific). RNK je izolovana iz peletiranih splenocita korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici.
[0229]RT-PCR je izveden na RNK splenocitu korišćenjem prajmera specifičnih za ljudske hVA segmente gena I mišji Ckgen (Tabela 6). PCR proivodi su bili prečišćeni gelom i klonirani u pCR2.1-TOPO TA vektor (Invitrogen) i sekvencionirani prajmeri M13 Forward (GTAAAACGAC GGCCAG; ID BR SEK: 55) i M13 Reverse (CAGGAAACAG CTATGAC; ID BR SEK 56) su smešteni unutar vektora na lokacijama koje su prirubno postavljene na mesto kloniranja. Ukupno osamdeset četiri klona je izvedeno iz prvog i trećeg umetanja ljudske X sekvence su sekvencionirane da se odredi hVA upotreba gena (Tabela 7). Ovi sekvenca nukleotida hVA-hJA1-mCic ukrštanje za izabrane RT-PCR klonove je prikazano na SL 11.
[0230]Na sličan način, homozigotni miševi za treće umetanje ljudskih/sekvenci gena lakog lanca(t./40 hVA segmenata gena i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu, dno SL. 7B) funkcionalno povezano na endogeni mišji Ckgen su analizirani za upotrebu ljudskogXgena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore u tekstu). Upotreba ljudskogXsegmenta gena lakog lanca za 26 odabranih RT-PCR klonova je prikazana u Tabeli 8. Sekvenca nukleotida hVA.-hJA-mCKukrštanja za odabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL. 12.
[0231]Na sličan način, homozigotni miševi za prvo umetanje ljudskihXsegmenata gena lakog lanca (12 hVA segmenata gena i hJA1, SL 4A i SL 5A) funkcionalno povezani na endogeni mišji CA2 gen su analizirani za upotrebu ljudskog A gena lakog lanca pomoću RT-PCR korišćenjem RNK izolovane iz splenocita (kako je opisano gore) Prajmeri specifični za hVA segmente gena (Tabela 6) su spareni sa jednim od dva prajmera specifična za mišji CA2 gen; CA2-1 (ID BR SEK:104) ili CA2-2 (ID BR SEK105).
[0232]Više hVA segmenata gena preraspoređenih u hA1 je primećeno iz RT-PCR klonova iz miševa koji nose ljudske A segmente gena lakog lanca na endogenom mišjem A lokusu lakog lanca Sekvenca nukleotida hVA- hJA-mCA2 ukrštanja za izabrane RT-PCR klonove je prikazana na SL 13
[0233]SL. 11 pokazuje sekvencu hVA-hJX1-mCK ukrštanja za RT-PCR klonove iz miševa koji nose prvo i treće umetanje hVA segmenata gena sa jednim hJA segmentom gena. Sekvence prikazane na SL. 11 ilustruje jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVA segmente gena sa hJA1 rekombinovanom na mišjem Ckgenu. Heterozigotni miševi koji nose samo jedan modifikovani endogeniklokus sa 12 hVA segmenata gena i hJA.1 i homozigotni miševe koji nose dva modfikovana endogena k lokusa koji sadrže 40 hVA segmenata gena i hJA1 su kod oba bili sposobni da proizvedu ljudskeAsegmente gena funkcionalno povezane na mišji Ckgen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudske A lake lance Ova preraspoređivanja pokazuju da su himerni lokusi mogli da nezavisno prerasporede ljudske A segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, ove modifikacije na endogenomklokusu lakog lanca nisu dale nijedan od hVA segmenata gena inoperativan ili sprečile da himerni lokus rekombinuje više hVA i hJA (JA1) segmenata gena tokom razvoja B ćelije kako su potvrdili dokazi pomoću16 različitih hVA segmenata gena koji su primećeni da se preraspoređuju sa hJA1 (Tabela 7). Dalje, ovi miševi su napravili funkcionalna antitela koja su sadržala preraspoređene ljudske VA-JA segmente gena funkcionalno povezane na mišje Ckgene kao deo endogenog repertoara lakog tanca imunoglobulina,
[0234]SL, 12 pokazuje sekvencu hVA-hJA-mCA ukrštanja za odabrane RT-PCR klonove iz mišjih homozigotnih za 40 hVA i četiri hJA segmenta gena uključujući ljudsku Vk-Jkgenomsku sekvencu. Sekvence prikazane na SL. 12 ilustruju dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju više različitih hVA segmenata gena, koji se prostiru kroz ceo raspon himernog lokusa, sa više različitih hJA segmenata gena raspoređenih i funkcionalno povezanih na mišji Ck gen. Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogeneklokuse koji sadrže 40 hVA i ćetir hJA segmenata gena su mogli da proizvedu ljudskeAsegmente gena funkcionalno povezane na mišji Ckgen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile ljudskeAlake lance. Ova preraspoređivanja još pokazuju da su sve faze himernih lokusa mogle da nezavisno prerasporede ljudske A segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, ove dodatne modifikacije na endogenomklokusu lakog lanca pokazuju da nije svako umetanje ljudskih A segmenata gena dalo bilo kakve hVA i/ili JA segmente gena inoperativne ili sprečavaju himerne lokuse da rekombinuju hVA i JA segmente gena tokom razvoja B ćelije kako su potvrdili dokazi pomoću 12 različitih hVA segmenata gena za koje je primećeno da se preraspoređenuju sa sva četiri hJA segmenta gena (Tabela 8) od 26 odabrana RT-PCR klona Dalje ovi miševi su napravili i funkcionalna antitela koja su sadržala ljudske VA-JA segmente gena funkcionalno povezane na mišje Ckregione kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0235]SL. 13 pokazuje sekvencu hVA-hJA-mCA2 spoja za tri pojedinačna RT-PCR klona iz mišjih homozigotnih 12 hVA segmenata gena i hJA1. Sekvence prikazane na SL 13 ilustruju dodatna jedinstvena preraspoređivanja koja obuhvataju različite hVA segmente gena, u rasponu dužine od prvog umetanja, sa hJA1 preraspoređen i funkcionalno povezan na mišji CA2 gen (2D1 - VA2-8JA1; 2D9 = VA3-10JA1; 3E15 = VA3-1JA1). Jedan klon je pokazao neproduktivno preraspoređivanje usled N dodavanja na hVA-hJA ukrštanja (2D1, SL.13) Ovo nije neubićajeno za V(D)J rekombinaciju, jer spajanje segmenata gena tokom rekombinacije se pokazalo kao neprecizno lako ovaj klon predstavlja neproduktivni rekombinant prisutan u repertoaru lakog lanca ovih miševa, ovo pokazuje da genetski mehanizam koji doprinosi raznovrsnosti pri ukrštanju među genima antitela radi normalno kod ovih miševa i vodi do repertoara antitela koji sadrži lake lance sa većom raznovrsnošću,
[0236]Homozigotni miševi koji nose modifikovane endogene A lokuse sa 12 hVA segmente gena i hJA1 su takođe mogli da proizvedu ljudske/.segmente gena funkcionalno povezane na endogeni mišji CA gen i proizvedu B ćelije koje su ispoljile reverzne himerne A lake lance sa hVA regionima povezanim na mišje CA regione. Ova preraspoređivanja još pokazuju da su ljudskiXsegmenti gena lakog lanca postavljeni na drugom lokusu lakog lanca (t.j., A lokus) mogli da se nezavisno prerasporede ljudske A segmente gena u više, nezavisnih B ćelija kod ovih miševa. Dalje, modifikacije na endogenom A lokusu lakog lanca pokazuju da umetanje ljudskih X segmenata gena ne daje nijedan od hVA i/ili hJA1 segmenata gena inoperativnim ili spreče himerni lokus od rekombinovanja hVA i hJA1 segmenata gena tokom razvoja B ćelije. Dalje, ovi miševi su napravili i funkcionalna antitela koja su sadržala ljudske VA-JA segmente gena funkcionalno povezane na mišji CA region kao deo endogenog repertoara lakog lanca imunoglobulina.
[0237]Kao što je prikazano na ovom Primeru, miševi koji nose ljudske/.segmente gena lakog lanca na endogenimki A lokusima lakog lanca lokusima lakog lanca su sposobni da prerasporede ljudske A segmente gena lakog lanca i ispoljavaju ih u kontekstu mišjeg Cki/ili CA regiona kao deo normalnog repertoara antitela miša zato što je funkcionalni laki lanac potreban na različitim kontrolnim tačkama u razvoju B ćelije i u slezini i koštanoj srži. Dalje, rani podskupovi B ćelija (npr., pre-, pro- i tranzicione B ćelije) pokazuju normalan fenotip kod ovih miševa u poređenju sa divljim tipom štenaca iz legla (SL. 9D, 10A i 10B). Primećen je mali nedostatak u koštanoj srži i perifernih populacija B ćelija, kojima se mogu pripisati brisanje podskupa auto-reaktivnih nezrelih B ćelija i/ili podoptimalnog udruživanja ljudskog A lakog lanca sa mišjim teškim lancem. Međutim. IgA/lgA upotreba primećena kod ovih miševa prikazuje situaciju koja je više nalik na ispoljavanje ljudskog lakog lanca nego na ono što je primećeno kod miševa.
Primer V!
Odgajanje mišjeg ispoljavanja ljudskihAlakih lanaca iz endogenih lokusa lakog lanca
[0238]Da se optimizuje upotreba ljudskih A segmenata gena na endogenom mišjem lokusu lakog lanca, miševi koji nose nepreraspoređene ljudske A segmente gena su odgajani na drugom mišu koji sadrži brisanje u suprotnom endogenom lokusu lakog lanca (bilokili A). Na primer, ljudski A segmenti gena pozicionirani na endogenomklokusu bi bili jedini funkcionalni segmenti gena lakog lanca prisutni kod miša koji takođe nose brisanje na endogenom A lokusu lakog lanca. Na ovaj način, dobijeno potomstvo bi ispoljilo samo ljudske A lake lance kako je opisano u prethodnim primerima. Odgajanje je izvedeno standardnim tehnikama priznatim u tehnici i, alternativno, pomoću komercijalnih kompanija (npr., The Jackson Laboratorv). Mišji sojevi koji nose ljudskeAsegmente gena lakog lanca na endogenomklokusu i brisanje endogenog A lokusa lakog lanca se skeniraju na prisustvo jedinstvenih reverzno-himernih (Ijudsko-mišjih) A. lakih lanaca i odsustvo endogenih mišjihAlakih lanaca.
[0239]Miševi koji nose nepreraspoređeni ljudski A lokus lakog lanca se takođe odgajaju sa miševima koji sadrže zamenu endogeniog mišjeg lokusa promenljivg gena teškog lanca sa ljudskim iokusom promenljivog gena teškog lanca (videti US 6.596,541, Regeneron Pharmaceuticals, the VELOCIMMUNE® genetski projektovani miš). VELOCIMMUNE® miš obuhvata, delimično. koji ima genom koji obuhvata ljudske promenljive regione ljudskog teškog lanca koji su funkcionalno povezani na endogene mišje lokuse konstantnog regiona tako da miš proizvodi antitela koja obuhvataju ljudski promenljivi region teškog lanca i mišji konstantni region teškog lanca kao odgovor na antigensku stimulaciju. DNK koja kodira promenljive regione teških lanaca antitela može da bude izolovana i funkcionalno povezana na DNK koja kodira konstantne regione teškog lanca čoveka. DNK može zatim da se ispolji u ćeliji koja je sposobna da ispolji potpuno ljudski teški lanac antitela. Prema odgovarajućem rasporedu odgoja, dobijaju se miševi koji nose zamenu endogenog mišjeg lokusa lakog lanca sa ljudskim lokusom teškog lanca i nepreraspoređenim ljudskim X lokusom lakog lanca na endogenomklokusu lakog lanca. Antitela koja sadrže somatski mutirane ljudske regione teškog lanca i ljudskeXpromenljive regione lakog lanca mogu da se izoluju posle imunizacije sa antigenom od interesa.
Primer VII
Generisanje antitela iz miševa koji ispoljavaju ljudske teške lanceiljudskeXlake lance
[0240]Posle odgajanja miševa koji sadrže nepreraspoređeni ljudskiXlokus lakog lanca na različitim željenim sojevima koji sadrže modifikacije i brisanje drugih endogenih Ig mesta (kako je opisano gore), odabrani miševi su imunizirani sa antigenom od interesa.
[0241]Generalno, VELOCIMMUNE® miš koji sadrži jedan od pojedinačnih preraspoređenih ljudskih regiona lakog lanca klicine linije se izaziva sa antigenom, i limfnim ćelijama (kao što su B ćelije) se oporavljaju iz seruma životinja. Limfne ćelije mogu da se spoje sa linijom ćelije mijeloma da se pripreme besmrtne linije ćelija hibridoma, i takve linije ćelija hibridoma linije ćelija su skenirane i odabrane da se odrede linije ćelija hibridoma koje proizvode antitela koja sadrže ljudski teški lanac i ljudskiXlaki lanac koji su specifični za antigen korišćen za imunizaciju. DNK kodiranje promenljivih regiona teških lanaca i X. lakih lanaca može da bude izolovano i povezano na željene izotipne konstantne regione teškog lanca i lakog lanca. Zbog prisustva dodatnih hVX segmenata gena u poređenju sa endogenim mišjim X lokusom, raznovsnost repertoara lakog lanca je dramatično povećana i posle imunizacije daje veću raznovrsnost na antigen-specifičnom repertoaru. Dobijene sekvence kloniranog antitela mogu da budu naknadno proizvedene u ćeliji, kao što je CHO ćelija Alternativno, DNK koja kodira himerna antitela specifična za antigen ili promenljive domene lakog lanca i teškog lanca mogu da budu izolovane direktno iz limfocita specifičnih za antigen (npr., B ćelije)
[0242]U početku, visokoafinitetna himerna antitela su izolovana tako da imaju promenljivi region čoveka i konstantni region miša. Kao što je gore opisano, antitela se karakterišu i odabiraju za poželjne karakteristike, uključujući afinitet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni se zamenjuju sa željenim ljudskim konstantnim regionom da se generiše potpouno ljudsko antitelo koje sadrži somatski mutirani ljudski teški lanac i ljudski X laki lanac izveden iz nepreraspoređenog ljudskog X lokusa lakog lanca ovog pronalaska. Pogodni ljudski konstantni regioni obuhvataju, na primer divlji tip ili modifikovan lgG1, lgG2, lgG3, ili lgG4.
LISTA SEKVENCI
[0243]

Claims (19)

  1. nepreraspoređeni ljudski A segment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (hVA) i ljudski X spojni segment gena kod čoveka (hJA) koji su funkcionalno povezani na kapa konstantni segment gena lakog lanca imunoglobulina (Ck) na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se održavaju na pomenutom lokusukintronski element pojačavača uzvodno od Ckgena (označen sa EKi) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3'), pri čemu miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu.
  2. 2 Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu miš ima nedostatak ili u ima značajan nedostatak funkcionalnog Vkmiša i nedostaje mu ili mu pretežno nedostaje funkcionalni mišji Jksegment gena.
  3. 3. Miš prema patentnom zahtevu 1, koji obuhvata više nepreraspoređenih hVA segmenata gena
  4. 4. Miš prema patentnom zahtevu 3, koji obuhvata više nepreraspoređenih hVA segmenata gena obuhvata: a) najmanje 12 hVA segmenata gena; ili b) 13 do 28 ili više hVA segmenata gena.
  5. 5. Miš prema patentnom zahtevu 4, pri čemu hVA segmenti gena obuhvataju 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11 i 3-12.
  6. 6 Miš prema patentnom zahtevu 4, pri čemu hVA segmenti gena obuhvataju 2-14, 3-16. 2-18, 3-19. 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, i 3-27
  7. 7. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu ljudski JA segment gena jeste ljudski JA1 segment gena.
  8. 8. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu miš obuhvata četiri ljudska JA segmenta gena. preporučljivo pri čemu četiri ljudska JA segmenta gena jesu JA1, JA2, JA3. i JA7.
  9. 9. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se mišjiAlokus lakog lanca briše u celini ili delimično.
  10. 10. Miš prema patentnom zahtevu 1, pri čemu mišjiklokus lakog lanca obuhvata ajdodirunu sekvencu ljudskog A lokusa lakog lanca čoveka koja se proteže od hVA.3-12 do hVA3-1: b)dodirunu sekvencu ljudskog A lokusa lakog lanca koja se proteže od hVA 3-27 do hVA3-1; ili cjdodirnu sekvencu ljudskog A lokusa lakog lanca koja se proteže od hVA5-52 do hVA1-40 i dodirnu sekvencu ljudskog A, lokusa lakog lanca koja se proteže od hVA3-29 do hVA3-1
  11. 11. Izolovana ćelija koja ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Ck sekvencu, pri čemu je ćelija iz, ili se može dobiti iz, miša iz bilo kog od prethodnih patentnih zahteva, i pri čemu ćelija obuhvata hVA i hJA koji su funkcionalno povezani na mišji Cksegment gena na endogeni mišjiklokus lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se održe na pomenutom lokusukintronski element pojačavača uzvodno od Ckgena (označen sa Eki) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3 )
  12. 12 Izolvana ćelija prema patentnom zahtevu 11. pri čemu je ćelija ćelija B.
  13. 13. Izolovana mišja embrionska matična ćelija (ES) koja obuhvata nepreraspoređeni ljudski A segment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (hVA) i ljudskiXspojni segment gena (hJA) koji su funkcionalno povezani na Cksegment gena miša na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se održe na pomenutom lokusukintronski element pojačavača uzvodno od Ckgena (označen sa EKi) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3').
  14. 14. Mišji embrion koi obuhvata, napravljen od, ili koji se može dobiti iz, mišje embrionske matične (ES) ćelije prema patentnom zahtevu 13, pri čemu mišji embrion obuhvata nepreraspoređeni ljudskiXsegment gena promenljivog lakog lanca imunoglobulina (hVA) i ljudskiXspojni segment gena (hJA) koji su funkcionalno povezani na mišji Cksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se održi na pomenutom lokusu tajkintronski element pojačavača uzvodno od Ckgena (označen sa EKi) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označeno sa Ek3 )
  15. 15. Hibridom koji obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz miša prema patentnom zahtevu 1, preraspoređena sekvenca obuhvata hVA segment gena, hJA segment gena funkcionalno povezan na mišji Cksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se održi na pomenutom lokusukintronski element pojačavača uzvodno od Ckgena (označen sa EKi) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3 ), i pri čemu ovaj hibridom ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i Cksekvencu miša.
  16. 16. Upotreba B ćelije prama patentnom zahtevu 12 da se napravi hibridom koji obuhvata preraspoređenu sekvencu gena lakog lanca imunoglobulina izvedenu iz miša prema patentnom zahtevu 1, preraspoređena sekvenca obuhvata hVA segment gena, hJA segment gena funkcionalno povezan na mišji Cksegment gena na endogenom mišjemklokusu lakog ianca imunoglobulina, pri čemu se održe na pomenutom lokusukintronski element pojačavača uzvodno Ckgena (označen sa EK-i) i 3'kpojačavač nizvodno od Ck gena (označen sa Ek3 ), i pri čemu hibridom ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA-JA sekvencu i mišju Cksekvencu.
  17. 17. Miš, koji obuhvata: a) 12 do 40 nepreraspoređenih ljudskih?, segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina (hVA) i barem jedan ljudski JA (hJA) segment gena koji su funkcionalno povezani na Ckgen miša na endogeni mišjiklokus lakog lanca imunoglobulina, pri čemu se održe na pomenutom lokusukintronski element pojačavača uzvodno od Ckgena (označen sa EkI) i 3'kpojačavač nizvodno od Ckgena (označen sa Ek3 ): i b) ljudsku Vk-Jkintergensku sekvencu nukleinske kiseline koja je smeštena između 12, do 40 ljudskih segmenata gena promenljivog regiona lakog lanca imunoglobulina i barem jednu ljudsku JA sekvencu nukleinske kiseline čoveka;
    pri čemu miš ispoljava antitelo koje obuhvata laki lanac koji obuhvata preraspoređenu ljudsku VA.-JA sekvencu i mišju Cksekvencu.
  18. 18 Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1. pri čemu miš obuhvata a) 12 ljudskih Va. segmenata gena; ili b) 28 ili više ljudskih V?, segmenata gena.
  19. 19 Postupak za pravljenje antitela kod miša. taj postupak obuhvata a) izlaganje miša prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 ili 17 antigenu b) omogućavanje mišu da razvije odgovor imunog sistema na antigen, i c) izolovanje miša pod (b) antitelu koje specifično prepoznaje ovaj antigen, ili izolovanje iz tog miša (b) ćelije koja obuhvata domen imunoglobulina koji specifično prepoznaje antigen, pri čemu antitelo obuhvata laki lanac izveden iz V/. segmenta gena čoveka ljudski J>. segment gena čoveka i mišji Ckgene.
RS20160496A 2010-06-22 2011-06-22 Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi RS55037B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35731710P 2010-06-22 2010-06-22
US35731410P 2010-06-22 2010-06-22
EP11728509.8A EP2480676B1 (en) 2010-06-22 2011-06-22 Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain
PCT/US2011/041370 WO2011163314A1 (en) 2010-06-22 2011-06-22 Hybrid light chain mice

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55037B1 true RS55037B1 (sr) 2016-12-30

Family

ID=44509861

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160496A RS55037B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Hibridni laki lanac imunoglobulina koji ispoljavaju miševi
RS20160548A RS55042B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka
RS20190533A RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
RS20171091A RS56589B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina
RS20160483A RS54891B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20160548A RS55042B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac hibridnog imunoglobulina sa promenljivim regionom čoveka
RS20190533A RS58736B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju imunoglobinski hibrid lakog lanca sa ljudskom varijabilnom regijom
RS20171091A RS56589B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Transgeni miševi sa modifikovanim lokusom endogenog lambda imunoglobulina
RS20160483A RS54891B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-22 Miševi koji ispoljavaju laki lanac sa ljudskim lambda promenljivim regionom i mišjim konstantnim regionom

Country Status (30)

Country Link
US (22) US9035128B2 (sr)
EP (7) EP3034608B1 (sr)
JP (16) JP6009441B2 (sr)
KR (16) KR20220150430A (sr)
CN (4) CN104342455B (sr)
AU (1) AU2011271046B2 (sr)
BR (3) BR112012033248A2 (sr)
CA (2) CA2803864C (sr)
CY (5) CY1117537T1 (sr)
DK (5) DK3034608T3 (sr)
ES (5) ES2721749T3 (sr)
HR (5) HRP20160794T1 (sr)
HU (5) HUE030285T2 (sr)
IL (12) IL313063A (sr)
LT (4) LT3034608T (sr)
ME (5) ME02442B (sr)
MX (6) MX336344B (sr)
MY (6) MY157477A (sr)
NO (1) NO2905338T3 (sr)
NZ (6) NZ605758A (sr)
PL (5) PL2480676T3 (sr)
PT (5) PT2480675T (sr)
RS (5) RS55037B1 (sr)
RU (3) RU2724736C2 (sr)
SG (4) SG10201504324UA (sr)
SI (5) SI2480675T1 (sr)
SM (5) SMT201900241T1 (sr)
TR (1) TR201905992T4 (sr)
WO (2) WO2011163314A1 (sr)
ZA (5) ZA201300063B (sr)

Families Citing this family (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
KR101826224B1 (ko) * 2008-09-30 2018-02-06 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
ES2613730T3 (es) 2008-12-18 2017-05-25 Erasmus University Medical Center Rotterdam Animales transgénicos no humanos que expresan anticuerpos humanizados y su uso
US9445581B2 (en) * 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
NZ597481A (en) 2009-07-08 2013-10-25 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
NZ631363A (en) 2010-02-08 2016-05-27 Regeneron Pharma Common light chain mouse
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
NZ601171A (en) 2010-03-31 2014-11-28 Ablexis Llc Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies
PL2480676T3 (pl) * 2010-06-22 2016-10-31 Mysz wykazująca ekspresję hybrydowego łańcucha lekkiego immunoglobuliny
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10881084B2 (en) 2010-07-26 2021-01-05 Trianni, Inc Transgenic animals and methods of use
NZ707327A (en) * 2010-08-02 2017-01-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
LT3572517T (lt) 2011-08-05 2021-04-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanizuotos universalios lengvosios grandinės pelės
EP3839049A3 (en) 2011-09-19 2021-10-20 Kymab Limited Antibodies, variable domains & chains tailored for human use
JP2014531452A (ja) * 2011-09-19 2014-11-27 カイマブ・リミテッド 動物、レパートリーおよび方法
EP2761008A1 (en) 2011-09-26 2014-08-06 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US9253965B2 (en) * 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
EP3527070B1 (en) * 2011-12-20 2025-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized light chain mice
DK2825037T3 (da) 2012-03-16 2019-07-29 Regeneron Pharma Gnavere, der udtrykker pH-sensitive immunoglobulinsekvenser
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
SMT201800229T1 (it) 2012-03-16 2018-07-17 Regeneron Pharma Anticorpi a catena leggera ingegnerizzati con istidina e roditori modificati geneticamente per la generazione degli stessi
HK1200271A1 (en) 2012-03-16 2015-08-07 瑞泽恩制药公司 Mice that produce antigen-binding proteins with ph-dependent binding characteristics
JP2015512635A (ja) 2012-03-28 2015-04-30 カイマブ・リミテッド クラススイッチした完全ヒト抗体の発現のためのトランスジェニック非−ヒト脊椎動物
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
US20140245468A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals with modified immunoglobulin heavy chain sequences
ES2712207T3 (es) * 2013-03-13 2019-05-09 Regeneron Pharma Ratones que expresan un repertorio limitado de cadenas ligeras de inmunoglobulina
US9980470B2 (en) 2013-03-14 2018-05-29 Erasmus University Medical Center Antibody production
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US11707056B2 (en) * 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
ES2738679T3 (es) * 2013-09-18 2020-01-24 Regeneron Pharma Anticuerpos de cadena ligera diseñados genéticamente con histidina y animales no humanos modificados genéticamente para generar los mismos
DE112014004537T5 (de) 2013-10-01 2016-07-21 Kymab Limited Tiermodelle und therapeutische Moleküle
TW201532513A (zh) * 2014-01-10 2015-09-01 Alfur Fu-Hsin Hung 能產生比小鼠ＩgＥ量高出許多的人源化ＩgＥ之基因轉殖動物
EP3895528A1 (en) 2014-03-21 2021-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that make single domain binding proteins
KR20160131118A (ko) 2014-03-21 2016-11-15 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 상이한 결합 특징을 전시하는 vl 항원 결합 단백질
PT3151921T (pt) 2014-06-06 2019-11-21 Bristol Myers Squibb Co Anticorpos contra recetor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticoide e utilizações dos mesmos
CA2959428A1 (en) 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
CA2963470A1 (en) 2014-10-03 2016-04-07 Massachusetts Institute Of Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof
UY36404A (es) 2014-11-21 2016-06-01 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware ANTICUERPOS MONOCLONALES (Ab) COMO DETECTORES DE CD73 E INHIBIDORES DE SU ACTIVIDAD ENZIMÁTICA, Y COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN
DK3233912T3 (da) 2014-12-19 2021-08-02 Regenesance B V Antistoffer, der binder human c6, og anvendelser deraf
US10189902B2 (en) 2014-12-23 2019-01-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to TIGIT
MA40708B1 (fr) 2015-02-05 2020-12-31 Basf Se Centrale solaire comprenant un premier circuit de caloporteur et un deuxième circuit de caloporteur
EP3271403A1 (en) * 2015-03-19 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals that select for light chain variable regions that bind antigen
WO2016196228A1 (en) 2015-05-29 2016-12-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against ox40 and uses thereof
UY36757A (es) 2015-06-29 2016-12-30 Bristol Myers Squibb Company Una Corporación Del Estado De Delaware Anticuerpos monoclonales murinos contra cd40 con actividad agonista mejorada
CN105274116B (zh) * 2015-10-21 2020-09-29 重庆金迈博生物科技有限公司 一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用
AU2016356780A1 (en) 2015-11-19 2018-06-28 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (GITR) and uses thereof
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
IL260743B2 (en) 2016-02-04 2024-03-01 Trianni Inc Advanced production of antibodies
CA3016187A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy with anti-cd73 antibodies
WO2017151176A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 The Rockefeller University Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
MX392069B (es) 2016-05-09 2025-03-21 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos del ligando similar al factor de necrosis tumoral 1a (tl1a) y usos de los mismos.
RU2745563C2 (ru) 2016-05-20 2021-03-29 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы преодоления иммунологической толерантности с использованием множества направляющих рнк
RS66700B1 (sr) 2016-06-03 2025-05-30 Regeneron Pharma Glodari koji eksprimiraju egzogenu terminalnu dezoksinukleotidil transferazu
WO2017214089A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing antibodies with human lambda light chains
US20170372142A1 (en) * 2016-06-27 2017-12-28 Facebook, Inc. Systems and methods for identifying matching content
BR112019000431A2 (pt) 2016-07-14 2019-07-09 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos contra tim3 e usos dos mesmos
US10981976B2 (en) 2016-08-31 2021-04-20 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus K envelope (HERV-K) and use thereof
EP3525815A2 (en) 2016-10-13 2019-08-21 Massachusetts Institute of Technology Antibodies that bind zika virus envelope protein and uses thereof
AU2017348743C1 (en) 2016-10-31 2022-03-03 National University Corporation Tottori University Human antibody–producing non-human animal and method for preparing human antibodies using same
SI3766343T1 (sl) * 2016-11-04 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nehumane živali z modificiranim lokusom lahke verige lambda imunoglobulina
EA201991720A1 (ru) 2017-02-17 2020-01-20 Бристол-Маерс Сквибб Компани Антитела к альфа-синуклеину и их применения
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
ES2928995T3 (es) 2017-12-05 2022-11-24 Regeneron Pharma Ratones que tienen una cadena ligera lambda de inmunoglobulina genomanipulada y usos de los mismos
CN111886255B (zh) 2018-01-12 2025-04-04 百时美施贵宝公司 抗tim3抗体及其用途
CA3093407A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against mica and/or micb and uses thereof
SMT202500038T1 (it) 2018-03-24 2025-03-12 Regeneron Pharma Topi o ratti geneticamente modificati per la generazione di anticorpi terapeutici contro complessi peptide-mhc, metodi di produzione e loro utilizzo
WO2019190990A1 (en) 2018-03-26 2019-10-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized rodents for testing therapeutic agents
EP3813521B1 (en) * 2018-06-08 2025-03-05 Crystal Bioscience Inc. Transgenic chicken for producing diversified antibodies that have the same light chain ii
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
EP3872506A4 (en) 2018-10-26 2023-01-11 Vehicle Energy Japan Inc. Battery control device
AU2019380307B2 (en) 2018-11-16 2026-01-29 Bristol-Myers Squibb Company Anti-NKG2A antibodies and uses thereof
CN118894938A (zh) 2019-01-22 2024-11-05 百时美施贵宝公司 抗IL-7Rα亚基的抗体及其用途
AU2020226865A1 (en) 2019-02-22 2021-07-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
CA3136478A1 (en) * 2019-06-05 2020-12-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a limited lambda light chain repertoire expressed from the kappa locus and uses thereof
WO2021003152A1 (en) * 2019-07-01 2021-01-07 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
EP4069722A1 (en) 2019-12-02 2022-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Peptide-mhc ii protein constructs and uses thereof
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
KR20230024822A (ko) * 2020-06-25 2023-02-21 주식회사 휴맵 이형접합성 형질전환 동물
AU2021342159A1 (en) 2020-09-11 2023-03-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Identification and production of antigen-specific antibodies
CN116848254A (zh) 2020-12-16 2023-10-03 瑞泽恩制药公司 表达人源化Fcα受体的小鼠
US12371487B2 (en) 2020-12-23 2025-07-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for obtaining antibodies that bind transmembrane proteins and cells that produce the same
MX2023007401A (es) 2020-12-23 2023-07-06 Regeneron Pharma Acidos nucleicos que codifican anticuerpos modificados por anclaje y usos de los mismos.
WO2023199655A1 (ja) 2022-04-13 2023-10-19 日本精工株式会社 軸受装置の状態の検出方法、検出装置、およびプログラム
USD999969S1 (en) * 2022-04-29 2023-09-26 Shenzhen Intellirocks Tech. Co., Ltd. Lamp
EP4658687A1 (en) 2023-01-31 2025-12-10 University of Rochester Immune checkpoint blockade therapy for treating staphylococcus aureus infections
WO2024229461A2 (en) 2023-05-04 2024-11-07 Novasenta, Inc. Anti-cd161 antibodies and methods of use thereof
WO2025184208A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
WO2026030428A2 (en) 2024-08-01 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Prostate-specific antigen peptides and uses thereof

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) * 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7041871B1 (en) 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CA2078539C (en) * 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
JP4215172B2 (ja) * 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
GB9823930D0 (en) 1998-11-03 1998-12-30 Babraham Inst Murine expression of human ig\ locus
RU2262511C2 (ru) * 2000-05-18 2005-10-20 Джапан Тобакко, Инк. Человеческое моноклональное антитело против ailim, костимулирующей молекулы передачи сигнала, и его фармацевтическое применение
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
IL155977A0 (en) * 2000-11-30 2003-12-23 Medarex Inc Transgenic transchromosomal rodents for making human antibodies
GB0031284D0 (en) * 2000-12-21 2001-01-31 Ks Biomedix Ltd High affinity antibodies
DE60227067D1 (de) * 2001-05-11 2008-07-24 Kirin Pharma Kk Künstliches menschliches chromosom mit dem gen für die lambda-leichte kette menschlicher antikörper
GB0115256D0 (en) 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
DK2319301T3 (en) 2001-11-30 2017-12-04 Amgen Fremont Inc Transgenic animals with human Ig lambda light chain genes
US20030217171A1 (en) 2002-05-17 2003-11-20 Von Stuermer Wolfgang R. Self-replicating and self-installing software apparatus
MXPA06000562A (es) * 2003-07-15 2006-03-30 Therapeutic Human Polyclonals Loci de inmunoglobulina humanizada.
CN1605628A (zh) * 2003-09-03 2005-04-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Cho细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体
US7476724B2 (en) * 2004-08-05 2009-01-13 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antibodies
PT1802193E (pt) 2004-10-19 2014-06-23 Regeneron Pharma Método para gerar um murganho homozigótico para uma modificação genética
DE602005026571D1 (de) * 2004-12-29 2011-04-07 Yuhan Corp Tumornekrosefaktor-alpha spezifische humanisierte antikörper
US7910798B2 (en) 2006-03-31 2011-03-22 Medarex, Inc. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
CN101501073A (zh) * 2006-08-22 2009-08-05 G2英弗勒美欣私人有限公司 抗体制备方法
RS53340B (sr) 2006-10-02 2014-10-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humana antitela visokog afiniteta za humani il-4 receptor
US7864492B2 (en) 2006-10-31 2011-01-04 Siemens Industry, Inc. Systems and methods for arc fault detection
DE102007045897A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe
WO2009129247A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
EP2288623B1 (en) 2008-05-23 2013-07-10 Ablexis, LLC Method of generating single vl domain antibodies in transgenic animals
KR101826224B1 (ko) 2008-09-30 2018-02-06 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 인간 이외의 포유동물
ES2613730T3 (es) * 2008-12-18 2017-05-25 Erasmus University Medical Center Rotterdam Animales transgénicos no humanos que expresan anticuerpos humanizados y su uso
NZ597481A (en) 2009-07-08 2013-10-25 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
NZ631363A (en) * 2010-02-08 2016-05-27 Regeneron Pharma Common light chain mouse
SG186238A1 (en) 2010-06-17 2013-01-30 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
PL2480676T3 (pl) * 2010-06-22 2016-10-31 Mysz wykazująca ekspresję hybrydowego łańcucha lekkiego immunoglobuliny

Also Published As

Publication number Publication date
US9850462B2 (en) 2017-12-26
CA2804311A1 (en) 2011-12-29
NZ605751A (en) 2014-10-31
NO2905338T3 (sr) 2017-12-30
RU2724736C2 (ru) 2020-06-25
JP2021061863A (ja) 2021-04-22
KR20200143511A (ko) 2020-12-23
PT2480676E (pt) 2016-06-09
CN103068994B (zh) 2016-01-20
JP6963542B2 (ja) 2021-11-10
KR20200064166A (ko) 2020-06-05
US20190153384A1 (en) 2019-05-23
AU2011271043B2 (en) 2015-10-01
DK2480676T3 (en) 2016-06-20
CY1122877T1 (el) 2021-05-05
DK2568049T3 (en) 2016-08-01
KR102462042B1 (ko) 2022-11-03
IL255179B (en) 2018-06-28
TR201905992T4 (tr) 2019-05-21
US9334333B2 (en) 2016-05-10
ZA201404600B (en) 2015-09-30
IL300712B1 (en) 2024-07-01
ZA201506598B (en) 2017-03-29
EP2480675B1 (en) 2016-04-06
US9012717B2 (en) 2015-04-21
CA2803864C (en) 2017-05-16
US9206261B2 (en) 2015-12-08
PT2480675T (pt) 2016-07-11
KR20220150430A (ko) 2022-11-10
IL223719A (en) 2016-10-31
KR20130027555A (ko) 2013-03-15
KR101934852B1 (ko) 2019-01-04
HRP20160497T1 (hr) 2016-07-15
SI2480676T1 (sl) 2016-10-28
KR102211911B1 (ko) 2021-02-05
SI2905338T1 (sl) 2017-12-29
SG186391A1 (en) 2013-01-30
RU2016119423A3 (sr) 2019-11-19
US9066502B2 (en) 2015-06-30
CN103068993A (zh) 2013-04-24
SMT201600212B (it) 2016-08-31
US9006511B2 (en) 2015-04-14
KR20180135997A (ko) 2018-12-21
HUE030285T2 (en) 2017-05-29
CN104342455B (zh) 2017-05-31
EP2905338B8 (en) 2018-01-24
JP5988969B2 (ja) 2016-09-07
JP2017006152A (ja) 2017-01-12
HRP20160794T1 (hr) 2016-08-12
JP6073441B2 (ja) 2017-02-01
IL291301A (en) 2022-05-01
CA2803864A1 (en) 2011-12-29
DK3034608T3 (da) 2019-05-06
KR20130121814A (ko) 2013-11-06
LT2568049T (lt) 2016-10-10
ME02902B (me) 2018-04-20
JP2018201528A (ja) 2018-12-27
HUE029691T2 (en) 2017-03-28
EP2480675A1 (en) 2012-08-01
SG10201504324UA (en) 2015-07-30
AU2011271046A1 (en) 2013-01-31
US9029628B2 (en) 2015-05-12
PL2905338T3 (pl) 2018-01-31
US9399683B2 (en) 2016-07-26
EP2480676B1 (en) 2016-04-06
CN103068993B (zh) 2016-01-06
NZ605758A (en) 2014-08-29
IL313063A (en) 2024-07-01
IL269078B (en) 2021-05-31
IL282872B (en) 2022-04-01
JP2017012204A (ja) 2017-01-19
DK2905338T3 (da) 2017-11-06
US9163092B2 (en) 2015-10-20
MY194456A (en) 2022-11-30
CY1118126T1 (el) 2017-06-28
ES2721749T3 (es) 2019-08-05
HK1168384A1 (zh) 2012-12-28
AU2011271043A8 (en) 2016-01-21
NZ626979A (en) 2015-05-29
ZA201404601B (en) 2016-02-24
US20240327785A1 (en) 2024-10-03
EP2905338B1 (en) 2017-08-02
PL3034608T3 (pl) 2019-08-30
RS54891B1 (sr) 2016-10-31
JP2013532974A (ja) 2013-08-22
JP2022066449A (ja) 2022-04-28
KR102193823B1 (ko) 2020-12-22
ES2570131T3 (es) 2016-05-17
ME02444B (me) 2016-09-20
SMT201600213B (it) 2016-08-31
PL2568049T3 (pl) 2017-03-31
PL2480675T3 (pl) 2017-03-31
PT2568049T (pt) 2016-07-11
US20160060359A1 (en) 2016-03-03
RS55042B1 (sr) 2016-12-30
RS58736B1 (sr) 2019-06-28
MX2012015298A (es) 2013-05-01
US9206263B2 (en) 2015-12-08
LT2480675T (lt) 2016-10-10
RU2601297C2 (ru) 2016-10-27
CY1119478T1 (el) 2018-03-07
KR102266097B1 (ko) 2021-06-18
PT2905338T (pt) 2017-11-10
HRP20190807T1 (hr) 2019-08-23
US9150662B2 (en) 2015-10-06
RU2013102596A (ru) 2014-07-27
SG186390A1 (en) 2013-01-30
LT2905338T (lt) 2017-12-27
MY165287A (en) 2018-03-21
IL282872A (en) 2021-06-30
US20130323790A1 (en) 2013-12-05
ES2575223T3 (es) 2016-06-27
IL264634B (en) 2019-09-26
JP6243384B2 (ja) 2017-12-06
MY157477A (en) 2016-06-15
MX2022002117A (es) 2022-03-17
EP3034608A1 (en) 2016-06-22
JP2018023403A (ja) 2018-02-15
US20170107484A1 (en) 2017-04-20
CN104404050B (zh) 2018-06-08
KR101975884B1 (ko) 2019-05-10
LT3034608T (lt) 2019-05-27
IL244450A (en) 2017-11-30
KR102320944B1 (ko) 2021-11-04
SI3034608T1 (sl) 2019-06-28
SMT201900241T1 (it) 2019-05-10
BR112012033248A2 (pt) 2017-11-28
AU2011271046B2 (en) 2015-10-01
KR102001430B1 (ko) 2019-07-18
EP3456832A1 (en) 2019-03-20
NZ627119A (en) 2015-05-29
MX348942B (es) 2017-07-04
JP6341972B2 (ja) 2018-06-13
ME02440B (me) 2016-09-20
PT3034608T (pt) 2019-05-28
SMT201600229B (sr) 2016-08-31
KR20190014576A (ko) 2019-02-12
RU2016119423A (ru) 2018-11-07
MX2012015300A (es) 2013-05-01
HK1226766A1 (en) 2017-10-06
KR20190014578A (ko) 2019-02-12
BR112012032991A2 (pt) 2015-10-06
US20150173332A1 (en) 2015-06-25
NZ707200A (en) 2016-04-29
IL244450A0 (en) 2016-04-21
IL259965A (en) 2018-07-31
MX347318B (es) 2017-04-21
EP3205726A1 (en) 2017-08-16
JP2013531501A (ja) 2013-08-08
KR20190073584A (ko) 2019-06-26
US9540452B2 (en) 2017-01-10
EP3034608B1 (en) 2019-01-30
KR101945352B1 (ko) 2019-02-07
EP2568049B1 (en) 2016-04-13
MY195212A (en) 2023-01-11
US20150246976A1 (en) 2015-09-03
MY195214A (en) 2023-01-11
WO2011163314A1 (en) 2011-12-29
US20150176002A1 (en) 2015-06-25
RU2013102595A (ru) 2014-07-27
IL223720A (en) 2017-05-29
EP2568049A1 (en) 2013-03-13
MY195217A (en) 2023-01-11
US20140137275A1 (en) 2014-05-15
ME03386B (me) 2020-01-20
EP2905338A1 (en) 2015-08-12
US9035128B2 (en) 2015-05-19
US9226484B2 (en) 2016-01-05
US9844212B2 (en) 2017-12-19
JP2025027148A (ja) 2025-02-26
IL255179A0 (en) 2017-12-31
SI2568049T1 (sl) 2016-10-28
KR102506001B1 (ko) 2023-03-07
KR101970944B1 (ko) 2019-04-23
HK1170766A1 (zh) 2013-03-08
US20150246977A1 (en) 2015-09-03
JP6009441B2 (ja) 2016-10-19
IL291301B2 (en) 2023-07-01
JP2016010417A (ja) 2016-01-21
HRP20171666T1 (hr) 2017-12-15
BR112012032991B1 (pt) 2021-08-10
JP2019033765A (ja) 2019-03-07
ES2646052T3 (es) 2017-12-11
MX336344B (es) 2016-01-15
HUE044001T2 (hu) 2019-09-30
CY1117537T1 (el) 2017-04-26
CA2804311C (en) 2017-09-12
RS56589B1 (sr) 2018-02-28
BR122020013427B1 (pt) 2021-08-03
JP2020128440A (ja) 2020-08-27
MX347322B (es) 2017-04-21
KR101991234B1 (ko) 2019-06-20
CN104342455A (zh) 2015-02-11
KR20230036157A (ko) 2023-03-14
KR20180135996A (ko) 2018-12-21
AU2011271043A9 (en) 2015-10-01
KR20210073609A (ko) 2021-06-18
CN104404050A (zh) 2015-03-11
US20150173331A1 (en) 2015-06-25
DK2480675T3 (en) 2016-08-01
KR102118565B1 (ko) 2020-06-03
RU2590594C2 (ru) 2016-07-10
CY1117692T1 (el) 2017-05-17
KR20210134424A (ko) 2021-11-09
ZA201300063B (en) 2014-09-25
US20170258059A1 (en) 2017-09-14
US20200239837A1 (en) 2020-07-30
US20150351371A1 (en) 2015-12-10
US9206262B2 (en) 2015-12-08
JP7236409B2 (ja) 2023-03-09
US10266803B2 (en) 2019-04-23
US20180064078A1 (en) 2018-03-08
ES2576928T3 (es) 2016-07-12
SG10201504568YA (en) 2015-07-30
US20150320023A1 (en) 2015-11-12
HK1183321A1 (en) 2013-12-20
KR20190049932A (ko) 2019-05-09
PL2480676T3 (pl) 2016-10-31
JP6545773B2 (ja) 2019-07-17
US20120073004A1 (en) 2012-03-22
WO2011163311A1 (en) 2011-12-29
JP2023133554A (ja) 2023-09-22
US20190203171A1 (en) 2019-07-04
HUE029692T2 (en) 2017-03-28
KR20210013376A (ko) 2021-02-03
SI2480675T1 (sl) 2016-08-31
KR20190142436A (ko) 2019-12-26
IL300712B2 (en) 2024-11-01
IL291301B1 (en) 2023-03-01
ME02442B (me) 2016-09-20
IL247386A (en) 2017-07-31
NZ707198A (en) 2016-04-29
EP2480676A1 (en) 2012-08-01
CN103068994A (zh) 2013-04-24
ZA201300062B (en) 2014-09-25
AU2011271043A1 (en) 2013-01-31
KR102059909B1 (ko) 2019-12-27
HUE036597T2 (hu) 2018-07-30
US20160057979A1 (en) 2016-03-03
HRP20160865T1 (hr) 2016-10-07
IL259965B (en) 2019-02-28
JP2018201527A (ja) 2018-12-27
BR112012032991A8 (pt) 2020-09-29
US20130326647A1 (en) 2013-12-05
US20120070861A1 (en) 2012-03-22
IL300712A (en) 2023-04-01
JP2016010415A (ja) 2016-01-21
SMT201700506T1 (it) 2018-01-11
US20150089680A1 (en) 2015-03-26
US9394373B2 (en) 2016-07-19
JP2020062061A (ja) 2020-04-23
IL269078A (en) 2019-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6963542B2 (ja) ハイブリッド軽鎖マウス
RS58709B1 (sr) Miševi koji čine antitela teškog lanca
AU2015275243B2 (en) Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions
HK40010621A (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain
HK1242732A1 (en) Mice with humanised lambda variable gene segments
HK1226766B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain with a human variable region
AU2015275242A1 (en) Hybrid light chain mice
HK1168384B (en) Mice expressing an immunoglobulin hybrid light chain
HK1170766B (en) Mice expressing a light chain with human lambda variable and mouse constant regions