[go: up one dir, main page]

CN104404050A - 杂交轻链小鼠 - Google Patents

杂交轻链小鼠 Download PDF

Info

Publication number
CN104404050A
CN104404050A CN201410535091.9A CN201410535091A CN104404050A CN 104404050 A CN104404050 A CN 104404050A CN 201410535091 A CN201410535091 A CN 201410535091A CN 104404050 A CN104404050 A CN 104404050A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mouse
light chain
people
gene
constant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410535091.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104404050B (zh
Inventor
L·麦克唐纳
S·史蒂文斯
C·古雷尔
A·J·莫菲
K·A·霍希亚瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN104404050A publication Critical patent/CN104404050A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104404050B publication Critical patent/CN104404050B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0381—Animal model for diseases of the hematopoietic system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Position Input By Displaying (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了表达人λ可变(hVλ)序列的遗传修饰的小鼠，包括从内源小鼠λ轻链基因座表达hVλ序列的小鼠，从内源小鼠κ轻链基因座表达hVλ序列的小鼠，以及从其中hVλ序列连接至小鼠恒定序列的转基因或附加体表达hVλ序列的小鼠。提供了其为用于产生抗原结合蛋白的体细胞突变的人λ可变序列的来源的小鼠。提供了用于产生包含人λ可变序列的抗原结合蛋白包括人抗体的组合物和方法。

Description

杂交轻链小鼠
本申请是申请号为201180038411.4、申请日为2011年6月22日、发明名称为“杂交轻链小鼠”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2011/041370的国家阶段申请，该国际申请要求申请日分别为2010年6月22日和2010年6月22日，申请号分别为61/357,314和61/357,317的美国申请的优先权。
领域
包含与小鼠或人轻链恒定区(λ或kappa(κ))有效连接的小鼠或人λ可变(Vλ)轻链序列的遗传修饰的小鼠。表达包含含有来源于人λ可变(hVλ)基因区段的可变结构域、人λJ(hJλ)基因区段和小鼠轻链恒定(CL)结构域的免疫球蛋白轻链的表位结合蛋白的遗传修饰的小鼠。遗传修饰的小鼠，其在内源小鼠轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白lambda(λ)轻链可变核酸序列。能够重排并且从内源轻链基因座表达嵌合人λ/小鼠CL轻链的小鼠，所述内源轻链基因座包括，利用一个或多个hVλ基因区段以及一个或多个hJλ基因区段对所有内源小鼠轻链可变区基因区段的替换。包含hVλ结构域和小鼠CL结构域的体细胞突变的抗体。
背景
表达为完全人或者部分人及部分小鼠的抗体的小鼠在本领域是已知的。例如，已报导了，从包含人轻链和重链免疫球蛋白可变区基因的转基因表达完全人抗体的转基因小鼠。包括利用人HCVR和LCVR基因区段对内源小鼠重链可变区(HCVR)基因区段和κ轻链可变区(LCVR)基因区段的替换并且产生具有嵌合人/小鼠κ链的嵌合抗体的遗传修饰的小鼠也是已知的。
抗体轻链由两个分离的基因座:kappa(κ)和lambda(λ)之一编码。小鼠抗体轻链主要为κ型。人中的κ对λ轻链使用的比率为约60:40，然而在小鼠中，该比率为约95:5。小鼠中κ轻链的偏爱性使用据报导在能够表达完全或部分人抗体的遗传修饰的小鼠中被保留。因此，表达完全或部分人抗体的小鼠显示在λ可变使用上受到限制。
本领域需要产生用于制备表位结合蛋白的λ可变区(无论是小鼠的还是人的)。本领域需要表达完全或部分人抗体的小鼠，其中所述小鼠显示增加的λ可变(Vλ)使用。
本领域需要表达完全或部分人抗体的小鼠，其中所述小鼠显示增加的λ可变(Vλ)使用。
概述
提供了遗传修饰的小鼠、胚胎、细胞、组织以及用于修饰小鼠的核酸构建体，和用于产生和使用它们的方法及组合物。提供了在kappa(κ)轻链的背景下产生lambda(λ)可变区(人或非人)的小鼠和细胞。还提供了在κ或λ轻链的背景下，例如从内源小鼠轻链基因座，产生人λ可变区的小鼠和细胞。还提供了，用于产生包含λ可变区的抗体的方法。还提供了，用于选择与关联(cognate)λ可变区一起表达的重链的方法。
提供了包括体细胞突变的可变区的嵌合和人抗原结合蛋白(例如，抗体)以及编码其的核酸，包括具有包含融合至小鼠轻链恒定结构域的、来源于人Vλ和人Jλ基因区段的可变结构域的轻链的抗体。
在一个方面，提供了在包含小鼠恒定区的轻链上表达人λ可变区序列的小鼠。在一个方面，提供了在包含κ恒定区的轻链上表达人λ可变区序列的小鼠。在一个方面，提供了从内源小鼠轻链基因座表达包含人λ可变区序列的轻链的小鼠。在一个方面，提供了包含重排的轻链基因的小鼠，所述轻链基因包含连接至小鼠恒定区序列的人λ可变序列；在一个实施方案中，小鼠恒定区序列为λ恒定序列；在一个实施方案中，小鼠恒定区序列为κ恒定序列。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含未重排的人λ轻链可变基因区段(hVλ)和人λ连接基因区段(hJλ)。在一个实施方案中，未重排的hVλ和hJλ在小鼠轻链基因座上。在一个实施方案中，未重排的hVλ和未重排的hJλ在转基因上并且有效地连接至人或小鼠恒定区序列。在一个实施方案中，未重排的hVλ和未重排的hJλ在附加体(episome)上。在一个实施方案中，小鼠能够产生免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含从未重排的hVλ序列和hJλ序列以及小鼠轻链恒定区(CL)核酸序列衍生的轻链。还提供了用于产生和使用遗传修饰的小鼠的方法和组合物。提供了抗体，所述抗体包含(a)融合至小鼠重链恒定区的人重链可变结构域(hVH)，和(b)融合至小鼠CL结构域的人Vλ；包括其中，例如在本发明的小鼠的抗体或免疫细胞的选择过程中，对一个或多个可变结构域进行体细胞突变。在一个实施方案中，未重排的hVλ和未重排的hJλ与人或小鼠κ恒定区(Cκ)有效地连接。在一个实施方案中，未重排的hVλ和未重排的hJλ与人或小鼠λ恒定区(Cλ)有效地连接。
在一个方面，提供了在其种系中在内源小鼠轻链基因座上包含人λ轻链可变区序列的小鼠，其中人λ可变区序列在包含小鼠免疫球蛋白恒定区基因序列的轻链中表达。
在一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为λ基因座。在一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为κ基因座.
在一个实施方案中，小鼠在内源小鼠轻链基因座上不存在内源轻链可变序列。
在一个实施方案中，所有或基本上所有的内源小鼠轻链可变区基因区段被一个或多个人λ可变区基因区段替换。
在一个实施方案中，人λ轻链可变区序列包含人Jλ序列。在一个实施方案中，人Jλ序列选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。
在一个实施方案中，人λ轻链可变区序列包含人轻链基因座的A簇的片段。在具体的实施方案中，人λ轻链基因座的A簇的片段从hVλ3-27延伸至hVλ3-1。
在一个实施方案中，人λ轻链可变区序列包含人轻链基因座的B簇的片段。在具体的实施方案中，人λ轻链基因座的B簇的片段从hVλ5-52延伸至hVλ1-40。
在一个实施方案中，人λ轻链可变区序列包含A簇的基因组片段和B簇的基因组片段。在一个实施方案中，人λ轻链可变区序列包含A簇的至少一个基因区段和B簇的至少一个基因区段。
在一个实施方案中，超过10％的小鼠轻链天然库(repertoire)来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少两个hVλ基因区段。在一个实施方案中，超过20％的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少三个hVλ基因区段。在一个实施方案中，超过30％的小鼠轻链天然库来源于选自2-8、2-23、1-40、5-45和9-49的至少四个hVλ基因区段。
在一个方面，提供了表达免疫球蛋白轻链的小鼠，所述免疫球蛋白轻链包含与小鼠恒定区融合的人λ可变序列，其中所述小鼠显示约1:1的κ使用对λ使用的比率。
在一个实施方案中，从内源小鼠轻链基因座表达免疫球蛋白轻链。
在一个方面，提供了包含与小鼠κ轻链恒定区序列连续的λ轻链可变区序列(Vλ)和至少一个J序列(J)的小鼠。
在一个实施方案中，小鼠缺乏功能性小鼠Vκ和/或小鼠Jκ基因区段。
在一个实施方案中，Vλ为人Vλ(hVλ)，并且J为人Jλ(hJλ)。在一个实施方案中，hVλ和hJλ为未重排的基因区段。
在一个实施方案中，小鼠包含多个未重排的hVλ基因区段和至少一个hJλ基因区段。在具体的实施方案中，多个未重排的hVλ基因区段为至少12个基因区段、至少28个基因区段或至少40个基因区段。
在一个实施方案中，至少一个hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。
在一个实施方案中，内源小鼠λ轻链基因座被完整或部分缺失。
在一个实施方案中，小鼠κ轻链恒定区序列在内源小鼠κ轻链基因座上。
在一个实施方案中，约10％至约45％的小鼠B细胞表达抗体，所述抗体包括包含人λ轻链可变(Vλ)结构域和小鼠κ轻链恒定(Cκ)结构域的轻链。
在一个实施方案中，人λ可变结构域来源于重排的hVλ/hJλ序列，所述hVλ/hJλ序列选自3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、3-19/1、2-23/1、3-25/1、1-40/1、1-40/2、1-40/3、1-40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、1-44/7、5-45/1、5-45/2、5-45/7、7-46/1、7-46/2、7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7和1-51/1。
在一个实施方案中，小鼠还包括来自人κ轻链基因座的人Vκ-Jκ基因间区域，其中人Vκ-Jκ基因间区域与Vλ序列和J序列连续。在具体的实施方案中，人Vκ-Jκ基因间区域置于Vλ序列与J序列之间。
在一个方面，提供了小鼠，所述小鼠(a)在内源小鼠轻链基因座上包含至少12至至少40个未重排的人λ轻链可变区基因区段和至少一个人Jλ基因区段；(b)包含位于至少12至至少40个轻链可变区基因区段与至少一个人Jλ序列之间的人Vκ-Jκ基因间序列；其中所述小鼠表达包含含有人Vλ结构域和小鼠Cκ结构域的轻链的抗体。
在一个方面，提供了表达包含含有λ可变序列和κ恒定序列的轻链的抗体的小鼠。
在一个实施方案中，小鼠显示了约1:1的κ使用对λ使用的比率。
在一个实施方案中，获自小鼠骨髓的未成熟B细胞群体显示约1:1的κ使用对λ使用的比率。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中所述小鼠包含与包含小鼠CL基因的小鼠轻链基因座有效连接的未重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段。
在一个实施方案中，Vλ和/或Jλ基因区段为人基因区段。在一个实施方案中，Vλ和/或Jλ基因区段为小鼠基因区段，并且CL为小鼠Cκ。
在一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为κ轻链基因座。在一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为λ轻链基因座。
在一个实施方案中，未重排的Vλ和Jλ基因区段在内源小鼠轻链基因座上。
在一个实施方案中，未重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段在转基因上。
在一个实施方案中，小鼠还在内源小鼠重链免疫球蛋白基因座上包括，一个或多个人V、D和/或J基因区段对一个或多个重链V、D和/或J基因区段的替换。
在一个实施方案中，小鼠在包含小鼠Cκ基因的内源小鼠κ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段。
在一个实施方案中，小鼠在包含小鼠Cλ基因的内源小鼠λ轻链基因座上包含未重排的人免疫球蛋白λ轻链可变基因区段(Vλ)和λ连接基因区段(Jλ)。
在一个实施方案中，轻链可变基因基因座(“VL基因座”)包含至少一个人Vλ(hVλ)基因区段。在一个实施方案中，VL基因座包含至少一个人Jλ(hJλ)基因区段。在另一个实施方案中，VL基因座包含多至4个hJλ基因区段。在一个实施方案中，VL基因座包含含有人λ和人κ基因组序列的连续序列。
在一个实施方案中，κ轻链可变基因基因座(“κ基因座”)包含至少一个人Vλ(hVλ)基因区段。在一个实施方案中，κ基因座包含至少一个人Jλ(hJλ)基因区段。在一个实施方案中，κ基因座包含多至4个hJλ基因区段。在一个实施方案中，κ基因座包含至少一个hVλ和至少一个hJλ，并且不存在或基本上不存在功能性Vκ区基因区段以及不存在或基本上不存在功能性Jκ区基因区段。在一个实施方案中，小鼠不包含功能性Vκ区基因区段。在一个实施方案中，小鼠不包含功能性Jκ区基因区段。
在一个实施方案中，λ轻链可变基因基因座(“λ基因座”)包含至少一个hVλ基因区段。在一个实施方案中，λ基因座包含至少一个人Jλ(hJλ)基因区段。在另一个实施方案中，λ基因座包含多至4个hJλ基因区段。
在一个实施方案中，VL基因座包含多个hVλ。在一个实施方案中，选择多个hVλ，以导致反映人中观察到的Vλ使用的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％或约90％或更多的λ轻链可变区库的表达。在一个实施方案中，VL基因座包含基因区段hVλ1-40、1-44、2-8、2-14、3-21及其组合。
在一个实施方案中，hVλ包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在具体的实施方案中，VL基因座包括横跨Vλ3-12至Vλ3-1的人λ轻链基因座的连续序列。在一个实施方案中，VL基因座包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个hVλ。在具体的实施方案中，hVλ包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在具体的实施方案中，VL基因座包含横跨Vλ3-12至Vλ3-1的人λ基因座的连续序列。在一个实施方案中，VL基因座在内源κ基因座上。在具体的实施方案中，VL基因座在内源κ基因座上并且内源λ轻链基因座被部分或完全缺失。在一个实施方案中，VL基因座在内源λ基因座上。在具体的实施方案中，VL基因座在内源λ基因座上并且内源κ基因座被部分或完全缺失。
在一个实施方案中，VL基因座包括13至28个或更多的hVλ。在具体的实施方案中，hVλ包括2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25和3-27。在具体的实施方案中，κ基因座包含横跨Vλ3-27至Vλ3-1的人λ基因座的连续序列。在一个实施方案中，VL基因座在内源κ基因座上。在具体的实施方案中，VL基因座在内源κ基因座上并且内源λ轻链基因座被部分或完全缺失。在另一个实施方案中，VL基因座在内源λ基因座上。在具体的实施方案中，VL基因座在内源λ基因座上并且内源κ基因座被部分或完全缺失。
在一个实施方案中，VL基因座包含29至40个hVλ。在具体的实施方案中，κ基因座包含横跨Vλ3-29至Vλ3-1的人λ基因座的连续序列，横跨Vλ5-52至Vλ1-40的人λ基因座的连续序列。在具体的实施方案中，遗传修饰的小鼠中的hVλ1-40与hVλ3-29之间的所有或基本上所有序列基本上由下述组成：天然发现的(例如，在人群中)在hVλ1-40基因区段下游(3'非翻译部分的下游)的约959 bp的人λ序列、限制性酶位点(例如，PI-SceI)、紧接着天然发现的hVλ3-29基因区段的上游的约3,431 bp的人λ序列。在一个实施方案中，VL基因座在内源小鼠κ基因座上。在具体的实施方案中，VL基因座在内源小鼠κ基因座上并且内源小鼠λ轻链基因座被部分或完全缺失。在另一个实施方案中，VL基因座在内源小鼠λ基因座上。在具体的实施方案中，VL基因座在内源小鼠λ基因座上并且内源小鼠κ基因座被部分或完全缺失。
在一个实施方案中，VL基因座包含至少一个hJλ。在一个实施方案中，VL基因座包含多个hJλ。在一个实施方案中，VL基因座包含至少2、3、4、5、6或7个hJλ。在具体的实施方案中，VL基因座包含4个hJλ。在具体的实施方案中，4个hJλ为hJλ1、hJλ2、hJλ3和hJλ7。在一个实施方案中，VL基因座为κ基因座。在具体的实施方案中，VL基因座在内源κ基因座上并且内源λ轻链基因座被部分或完全缺失。在一个实施方案中，VL基因座包含一个hJλ。在具体的实施方案中，一个hJλ为hJλ1。在一个实施方案中，VL基因座在内源κ基因座上。在具体的实施方案中，VL基因座在内源κ基因座上并且内源λ轻链基因座被部分或完全缺失。在另一个实施方案中，VL基因座在内源λ基因座上。在具体的实施方案中，VL基因座在内源λ基因座上并且内源κ基因座被部分或完全缺失。
在一个实施方案中，VL基因座包含至少一个hVλ、至少一个hJλ和小鼠Cκ基因。在一个实施方案中，VL基因座包含至少一个hVλ、至少一个hJλ和小鼠Cλ基因。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因为Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、96％、97％、98％或至少99％的同一性。
在一个实施方案中，小鼠在内源小鼠κ基因座上包括，利用一个或多个hVλ基因区段对内源小鼠Vκ基因区段的替换，其中hVλ基因区段有效地连接至内源小鼠Cκ区基因，以便小鼠重排人Vλ基因区段并且表达包含人Vλ结构域和小鼠Cκ的反向嵌合免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，90-100％的未重排的小鼠Vκ基因区段被至少一个未重排的hVλ基因区段替换。在具体的实施方案中，所有或基本上所有内源小鼠Vκ基因区段被至少一个未重排的hVλ基因区段替换。在一个实施方案中，利用至少12、至少28或至少40个未重排的hVλ基因区段进行替换。在一个实施方案中，利用至少7个功能性未重排的hVλ基因区段、至少16个功能性未重排的hVλ基因区段或至少27个功能性未重排的hVλ基因区段进行替换。在一个实施方案中，小鼠包括利用至少一个未重排的hJλ基因区段对所有小鼠Jκ基因区段的替换。在一个实施方案中，至少一个未重排的hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ4、Jλ5、Jλ6、Jλ7及其组合。在具体的实施方案中，一个或多个hVλ基因区段选自3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、5-48、9-49、1-50、1-51、5-52 hVλ基因区段及其组合。在具体的实施方案中，至少一个未重排的hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。
在一个实施方案中，小鼠在内源小鼠λ基因座上包括，利用一个或多个人Vλ基因区段对内源小鼠Vλ基因区段的替换，其中hVλ基因区段有效地连接至小鼠Cλ区基因，以便小鼠重排hVλ基因区段并且表达包含hVλ结构域和小鼠Cλ的反向嵌合免疫球蛋白轻链。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因为Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。在一个实施方案中，90-100％的未重排的小鼠Vλ基因区段被至少一个未重排的hVλ基因区段替换。在具体的实施方案中，所有或基本上所有内源小鼠Vλ基因区段被至少一个未重排的hVλ基因区段替换。在一个实施方案中，利用至少12、至少28或至少40个未重排的hVλ基因区段进行替换。在一个实施方案中，利用至少7个功能性未重排的hVλ基因区段、至少16个功能性未重排的hVλ基因区段或至少27个功能性未重排的hVλ基因区段进行替换。在一个实施方案中，小鼠包括利用至少一个未重排的hJλ基因区段对所有小鼠Jλ基因区段的替换。在一个实施方案中，至少一个未重排的hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ4、Jλ5、Jλ6、Jλ7及其组合。在具体的实施方案中，一个或多个hVλ基因区段选自3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11、3-12、2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25、3-27、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、5-48、9-49、1-50、1-51、5-52 hVλ基因区段及其组合。在具体的实施方案中，至少一个未重排的hJλ基因区段选自Jλ1、Jλ2、Jλ3、Jλ7及其组合。
在一个方面，提供了包含位于内源小鼠κ轻链基因座上的人Vκ-Jκ基因间区域序列的遗传修饰的小鼠。
在一个实施方案中，人Vκ-Jκ基因间区域序列在小鼠的内源κ轻链基因座上，所述基因座包含hVλ和hJλ基因区段，并且人Vκ-Jκ基因间区域序列位于hVλ与hJλ基因区段之间。在具体的实施方案中，hVλ和hJλ基因区段能够在小鼠中重组以形成功能性人λ轻链可变结构域。
在一个实施方案中，提供了包含多个hVλ和一个或多个hJλ的小鼠，并且人Vκ-Jκ基因间区域序列在转录方向上被置于邻近的或最3'端的hVλ序列的下游和第一个hJλ序列的上游或5'端。
在一个实施方案中，人Vκ-Jκ基因间区域为这样的区域，其位于人Vκ4-1基因区段的下游或3'端约130 bp，人Vκ4-1基因区段的3'非翻译区下游约130 bp，并且横跨至人Jκ1基因区段的上游或5'端约600 bp。在具体的实施方案中，人Vκ-Jκ基因间区域在大小上为约22.8 kb。在一个实施方案中，Vκ-Jκ基因间区域与从人Vκ4-1基因区段的3'非翻译区的末端延伸至人Jκ1基因区段的上游约600bp的人Vκ-Jκ基因间区域具有约90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多或约95％或更多的同一性。在一个实施方案中，Vκ-Jκ基因间区域包含SEQ ID NO:100。在具体的实施方案中，Vκ-Jκ基因间区域包含SEQ ID NO:100的功能性片段。在具体的实施方案中，Vκ-Jκ基因间区域为SEQ ID NO:100。
在一个方面，提供了包含所述的人Vκ-Jκ基因间区域序列的小鼠、小鼠细胞(例如，小鼠胚胎干细胞)、小鼠胚胎和小鼠组织，其中基因间区域序列是异位的。在具体的实施方案中，异位序列置于人源化内源小鼠免疫球蛋白基因座上。
在一个方面，提供了包含所述的人Vκ-Jκ基因间区域序列的分离的核酸构建体。在一个实施方案中，核酸构建体包含将人Vκ-Jκ基因间区域序列靶向小鼠轻链基因座的靶向臂。在具体的实施方案中，小鼠轻链基因座为κ基因座。在具体的实施方案中，靶向臂将人Vκ-Jκ基因间区域靶向修饰的内源小鼠κ基因座，其中靶向是至hVλ序列与hJλ序列之间的位置。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中小鼠包含不超过2个的轻链等位基因，其中轻链等位基因(a)在包含小鼠CL基因的内源小鼠轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白人Vλ和Jλ基因区段；以及，(b)在包含小鼠CL基因的内源小鼠轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白VL和JL基因区段。
在一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为κ基因座。在另一个实施方案中，内源小鼠轻链基因座为λ基因座。
在一个实施方案中，不超过2个的轻链等位基因选自κ等位基因和λ等位基因、2个κ等位基因和2个λ等位基因。在具体的实施方案中，2个轻链等位基因之一为包含Cλ2基因的λ等位基因。
在一个实施方案中，小鼠包含一个功能性免疫球蛋白轻链基因座和一个非功能性轻链基因座，其中所述功能性轻链基因座在包含小鼠Cκ基因的内源小鼠κ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白人Vλ和Jλ基因区段。
在一个实施方案中，小鼠包含一个功能性免疫球蛋白轻链基因座和一个非功能性轻链基因座，其中所述功能性轻链基因座在包含小鼠Cλ基因的内源小鼠λ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白人Vλ和Jλ基因区段。在一个实施方案中，Cλ基因为Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。
在一个实施方案中，小鼠还包含至少一个免疫球蛋白重链等位基因。在一个实施方案中，至少一个免疫球蛋白重链等位基因在表达人/小鼠重链的包含人重链基因的内源小鼠重链基因座上包含人VH基因区段、人DH基因区段和人JH基因区段。在具体的实施方案中，小鼠包含2个免疫球蛋白重链等位基因，并且小鼠表达人/小鼠重链。
在一个实施方案中，小鼠包含第一轻链等位基因，所述第一轻链等位基因在包含内源Cκ基因的内源小鼠κ基因座上包含未重排的hVκ和未重排的hJκ；和第二轻链等位基因，所述第二轻链等位基因在包含内源Cκ基因的内源小鼠κ基因座上包含未重排的hVλ和未重排的hJλ。在具体的实施方案中，第一和第二轻链等位基因为遗传修饰的小鼠的仅有的功能性轻链等位基因。在具体的实施方案中，小鼠包含非功能性λ基因座。在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠不表达包含λ恒定区的轻链。
在一个实施方案中，小鼠包含第一轻链等位基因，所述第一轻链等位基因在包含内源Cκ基因的内源小鼠κ基因座上包含未重排的hVκ和未重排的hJκ；和第二轻链等位基因，所述第二轻链等位基因在包含内源Cλ基因的内源小鼠λ基因座上包含未重排的hVλ和未重排的hJλ。在具体的实施方案中，第一和第二轻链等位基因是遗传修饰的小鼠的仅有的功能性轻链等位基因。在一个实施方案中，内源Cλ基因为Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性。
在一个实施方案中，小鼠包含6个免疫球蛋白等位基因，其中第一等位基因在包含小鼠Cκ基因的内源小鼠κ轻链基因座包含未重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，第二等位基因在包含小鼠Cκ基因的内源小鼠κ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段，第三等位基因在包含小鼠Cλ基因的内源小鼠λ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，第四和第五等位基因各自独立地在包含小鼠重链基因的内源小鼠重链基因座上包含未重排的VH和DH以及JH基因区段，并且第六等位基因(a)在包含小鼠Cλ基因的内源小鼠λ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，(b)包含无功能的λ基因座，或(c)完全或部分缺失λ基因座。
在一个实施方案中，第一等位基因包含未重排的hVλ和hJλ。在一个实施方案中，第二等位基因包含未重排的hVκ和hJκ。在一个实施方案中，第三等位基因包含未重排的hVλ和hJλ。在一个实施方案中，第四和第五等位基因各自独立地包含未重排的hVH和hDH以及hJH。在一个实施方案中，第六等位基因包含被完全或部分缺失的内源小鼠λ基因座。
在一个实施方案中，小鼠包含6个免疫球蛋白等位基因，其中第一等位基因在包含小鼠Cλ基因的内源小鼠λ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，第二等位基因在包含小鼠Cλ基因的内源小鼠λ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段，第三等位基因在包含小鼠Cκ基因的内源小鼠κ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段，第四和第五等位基因各自独立地在包含小鼠重链基因的内源小鼠重链基因座上包含未重排的VH和DH以及JH基因区段，并且第六等位基因(a)在包含小鼠Cκ基因的内源小鼠κ轻链基因座上包含未重排的免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段,(b)包含无功能的κ基因座，或(c)缺失κ基因座的一个或多个元件。
在一个实施方案中，第一等位基因包含未重排的hVλ和hJλ基因区段。在一个实施方案中，第二等位基因包含未重排的hVλ和hJλ基因区段。在一个实施方案中，第三等位基因包含未重排的hVκ和hJκ基因区段。在一个实施方案中，第四和第五等位基因各自独立地包含未重排的hVH和hDH以及hJH基因区段。在一个实施方案中，第六等位基因包含在功能上被沉默的内源小鼠κ基因座。
在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠包括包含重排的抗体基因的B细胞，所述抗体基因包含有效地连接至小鼠CL结构域的重排的hVλ结构域。在一个实施方案中，小鼠CL结构域选自小鼠Cκ和小鼠Cλ结构域。在具体的实施方案中，小鼠Cλ结构域来源于Cλ2基因。在具体的实施方案中，小鼠Cλ结构域来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的Cλ结构域。
在一个方面，提供了在为Cκ的CL上表达Vλ区的遗传修饰的小鼠。在一个方面，提供了在选自人Cκ、人Cλ或小鼠Cκ的CL上表达hVλ区的遗传修饰的小鼠。在一个方面，提供了在小鼠Cκ上表达hVλ区的遗传修饰的小鼠。
在一个实施方案中，约10-50％的小鼠脾细胞为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约9-28％表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。
在具体的实施方案中，约23-34％的小鼠脾细胞为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约9-11％表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。
在具体的实施方案中，约19-31％的小鼠脾细胞为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约9-17％表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。
在具体的实施方案中，约21-38％的小鼠脾细胞为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约24-27％表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。
在具体的实施方案中，约10-14％的小鼠脾细胞为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约9-13％表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。
在具体的实施方案中，约31-48％的小鼠脾细胞为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约15-21％表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。在具体的实施方案中，约30-38％的小鼠脾细胞为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约33-48％表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，约52-70％的小鼠骨髓为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约31-47％的未成熟B细胞(即，CD19-阳性/B220-中间阳性(intermediate positive)/IgM-阳性)表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，约60％的小鼠骨髓为B细胞(即，CD19-阳性)，或其约38.3％的未成熟B细胞(即，CD19-阳性/B220中间阳性/IgM-阳性)表达包含融合至小鼠Cκ结构域的hVλ结构域的免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，小鼠表达包含轻链的抗体，所述轻链包含来源于人V和人J基因区段的可变结构域，以及来源于小鼠恒定区基因的恒定结构域。在一个实施方案中，小鼠恒定区基因为Cκ基因。在另一个实施方案中，小鼠恒定区基因为Cλ基因。在具体的实施方案中，Cλ区为Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的Cλ基因。在具体的实施方案中，抗体还包括包含来源于人V、人D和人J基因区段的可变结构域以及来源于小鼠重链恒定区基因的重链恒定结构域的重链。在一个实施方案中，小鼠重链恒定区基因包含重链恒定结构域的铰链-CH2-CH3序列。在另一个实施方案中，小鼠重链恒定区基因包含重链恒定结构域的CH1-铰链-CH2-CH3序列。在另一个实施方案中，小鼠重链恒定区基因包含重链恒定结构域的CH1-CH2-CH3-CH4序列。在另一个实施方案中，小鼠重链恒定区基因包含重链恒定结构域的CH2-CH3-CH4序列。
在一个实施方案中，小鼠表达包含含有重排的人Vλ-Jλ序列和小鼠Cκ序列的轻链的抗体。在一个实施方案中，重排的人Vλ-Jλ序列来源于选自3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-14、3-19、2-23、3-25、1-40、7-43、1-44、5-45、7-46、1-47、9-49和1-51基因区段的hVλ基因区段的重排。在一个实施方案中，重排的人Vλ-Jλ序列来源于选自Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的hJλ基因区段的重排。
在一个实施方案中，小鼠表达包含含有重排的免疫球蛋白λ轻链可变区的轻链的抗体，所述重排的免疫球蛋白λ轻链可变区包含选自3-1/1、3-1/7、4-3/1、4-3/7、2-8/1、3-9/1、3-10/1、3-10/3、3-10/7、2-14/1、3-19/1、2-23/1、3-25/1、1-40/1、1-40/2、1-40/3、1-40/7、7-43/1、7-43/3、1-44/1、1-44/7、5-45/1、5-45/2、5-45/7、7-46/1、7-46/2、7-46/7、9-49/1、9-49/2、9-49/7和1-51/1的人Vλ/Jλ序列。在具体的实施方案中，B细胞表达抗体，所述抗体包含与小鼠重链恒定结构域融合的人免疫球蛋白重链可变结构域，以及与小鼠κ轻链恒定结构域融合的人免疫球蛋白λ轻链可变结构域。
在一个方面，提供了表达抗体的小鼠，所述抗体包含，(a)含有来源于未重排的人重链可变区基因区段的重链可变结构域的重链，其中重链可变结构域融合至小鼠重链恒定(CH)区；和(b)含有来源于未重排的hVλ和hJλ的轻链可变结构域的轻链，其中轻链可变结构域融合至小鼠CL区。
在一个实施方案中，小鼠包含，(i)重链基因座，其包括用所有或基本上所有功能性人V、D和J基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠V、D和J基因区段的替换，小鼠CH基因,(ii)第一κ轻链基因座，其包括用所有、基本上所有或多个功能性hVλ和hJλ基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠Vκ和Jκ基因区段的替换，以及小鼠Cκ基因,(iii)第二κ轻链基因座，其包括用所有、基本上所有或多个功能性hVκ和hJκ基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠Vκ和Jκ基因区段的替换，以及小鼠Cκ基因。在一个实施方案中，小鼠不表达包含Cλ区的抗体。在一个实施方案中，小鼠包括Cλ基因和/或Vλ和/或Jλ基因区段的缺失。在一个实施方案中，小鼠包括非功能性λ轻链基因座。在具体的实施方案中，λ轻链基因座被全部或部分缺失。
在一个实施方案中，小鼠包含(i)重链基因座，其包括用所有或基本上所有功能性人V、D和J基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠V、D和J基因区段的替换、小鼠CH基因,(ii)第一λ轻链基因座，其包括用所有、基本上所有或多个功能性hVλ和hJλ基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠Vλ和Jλ基因区段的替换，以及小鼠Cλ基因,(iii)第二λ轻链基因座，其包括用所有、基本上所有或多个功能性hVλ和hJλ基因区段对所有或基本上所有功能性内源小鼠Vλ和Jλ基因区段的替换，以及小鼠Cλ基因。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因为Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的Cλ基因。
在一个实施方案中，小鼠包括Cκ基因和/或Vκ和/或Jκ基因区段的缺失。在一个实施方案中，小鼠包括非功能性κ轻链基因座。
在一个方面，提供了表达抗体的遗传修饰的小鼠，其中超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过35％、超过40％、超过60％、超过70％、超过80％或超过90％的由小鼠产生的总IgG抗体包含λ-来源的可变结构域，并且其中小鼠表达包含与小鼠Cκ区融合的κ来源的可变结构域的抗体。在具体实施方案中，约15-40％、20-40％、25-40％、30-40％或35-40％的由小鼠产生的总抗体包含λ来源的可变结构域。
在一个实施方案中，λ来源的可变结构域来源于hVλ和hJλ。在一个实施方案中，λ来源的可变结构域存在于包含小鼠Cκ区的轻链中。在具体的实施方案中，λ来源的可变区存在于包含小鼠Cλ区的轻链中。在另一个具体的实施方案中，Cλ区为Cλ2区。在一个实施方案中，κ来源的可变结构域来源于hVκ和hJκ，并且在具体的实施方案中存在于包含小鼠Cκ区的轻链中。
在一个方面，提供了包含上游同源臂和下游同源臂的分离的DNA构建体，其中上游和下游同源臂将所述构建体靶向小鼠κ基因座，并且构建体包含功能性未重排的hVλ区段和功能性未重排的hJλ区段，以及选择或标记序列。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含用于靶向小鼠Vλ2上游的小鼠λ序列的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒，以及用于靶向小鼠Jλ2的3'端的小鼠λ序列的靶向臂。在一个实施方案中，选择盒为Frt'ed Hyg-TK盒。在一个实施方案中，3'靶向臂包含小鼠Cλ2、Jλ4、Cλ4和小鼠增强子2.4。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：用于靶向Vλ1的5'端的小鼠λ基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒以及用于靶向小鼠Cλ1的3'端的小鼠λ序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，选择盒为loxed新霉素盒。在一个实施方案中，3'靶向臂包含小鼠λ3'增强子和小鼠λ3'增强子3.1。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含用于靶向Vλ2的5'端的小鼠λ基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒以及用于靶向小鼠Jλ2的3'端与小鼠Cλ2的5'端的小鼠λ序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，选择盒为Frt'ed潮霉素-TK盒。在一个实施方案中，3'靶向臂包含小鼠Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段和小鼠λ增强子2.4。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含用于靶向Vλ2的5'端的小鼠λ基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒、包含从hVλ3-12下游至hJλ1的末端的人λ轻链基因座的连续区域的人基因组片段，以及用于靶向小鼠Jλ2的3'端的小鼠λ序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，选择盒为Frt'ed新霉素盒。在一个实施方案中，3'靶向臂包含小鼠Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段和小鼠λ增强子2.4。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其包含从hVλ3-12下游至hJλ1的末端的人λ轻链基因座的连续区域。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含用于靶向Vλ2的5'端的小鼠λ基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒，以及包含从hVλ3-27下游至hVλ2-8的末端的人λ轻链基因座的连续区域的人基因组片段。在一个实施方案中，选择盒为Frt'ed潮霉素盒。在一个实施方案中，人基因组片段包含3'靶向臂。在具体的实施方案中，3'靶向臂包含约53 kb的从hVλ3-12下游至hVλ2-8的末端的人λ轻链基因座。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其包含从hVλ3-27下游至hVλ3-12的末端的人λ轻链基因座的连续区域。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：用于靶向Vλ2的5'端的小鼠λ基因座的靶向臂、5'和3'侧翼连接有重组酶识别位点的选择盒、包含从hVλ5-52下游至hVλ1-40的末端的人λ轻链基因座的连续区域的第一人基因组片段、限制性酶位点以及包含从hVλ3-29下游至hVλ82K的末端的人λ轻链基因座的连续区域的第二人基因组片段。在一个实施方案中，选择盒为Frt'ed新霉素盒。在一个实施方案中，限制性酶位点为归巢内切核酸酶的位点。在具体的实施方案中，归巢内切核酸酶为PI-SceI。在一个实施方案中，第二人基因组片段为3'靶向臂。在具体的实施方案中，3'靶向臂包含约27 kb的从hVλ3-29下游至hVλ82K的末端的人λ轻链基因座。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其包含从hVλ5-52下游至hVλ1-40的末端的人λ轻链基因座的连续区域。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：用于靶向内源Vκ基因区段的5'端的小鼠κ基因座的靶向臂、两个并置的重组酶识别位点、并置的重组酶识别位点的3'端的选择盒以及用于靶向κ轻链可变基因区段的5'端的小鼠κ序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，并置的重组酶识别位点彼此以相反的方向放置。在具体的实施方案中，重组酶识别位点是不同的。在另一个具体的实施方案中，重组酶识别位点为loxP位点和lox511位点。在一个实施方案中，选择盒为新霉素盒。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：用于靶向小鼠Jκ基因区段的5'端的小鼠κ基因座的靶向臂、选择盒、选择盒3'端的重组酶识别位点以及用于靶向小鼠Jκ基因区段的3'端与小鼠κ内含增强子(intronic enhancer)的5'端的小鼠κ序列的3'靶向臂。在一个实施方案中，选择盒为潮霉素-TK盒。在一个实施方案中，重组酶识别位点在转录上处于与选择盒相同的方向。在具体的实施方案中，重组酶识别位点为loxP位点。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体，其在转录的方向上从5'至3'包含：包含内源小鼠Vκ基因区段的5'端的序列的第一小鼠基因组片段、第一重组酶识别位点、第二重组酶识别位点以及包含内源小鼠Jκ基因区段的3'端与小鼠κ内含增强子的5'端之间的序列的第二小鼠基因组片段。
在一个方面，提供了遗传修饰的小鼠，其中遗传修饰包括使用上述或本文中描述的一个或多个DNA构建体进行的修饰。
在一个方面，提供了分离的DNA构建体用于制备本文中描述的小鼠的用途。在一个方面，提供了本文中描述的分离的DNA构建体用于产生抗原结合蛋白的方法的用途。
在一个方面，提供了非人干细胞，其包括包含上述和本文中描述的DNA构建体的靶向载体。在一个方面，提供了非人干细胞，其中非人干细胞来源于本文中描述的小鼠。
在一个实施方案中，非人干细胞为胚胎干(ES)细胞。在具体的实施方案中，ES细胞为小鼠ES细胞。
在一个方面，提供了本文中描述的非人干细胞用于产生本文中描述的小鼠的用途。在一个方面，提供了本文中描述的非人干细胞用于产生抗原结合蛋白的用途。
在一个方面，提供了小鼠胚胎，其中小鼠胚胎包含本文中提供的遗传修饰。在一个实施方案中，提供了包含供体ES细胞的宿主小鼠胚胎，其中供体ES细胞包含本文中描述的遗传修饰。在一个实施方案中，小鼠胚胎为前桑椹胚期(pre-morula stage)胚胎。在具体的实施方案中，前桑椹胚期胚胎为4细胞期胚胎或8细胞期胚胎。在另一个具体实施方案中，小鼠胚胎为胚泡。
在一个方面，提供了本文中描述的小鼠胚胎用于产生本文中描述的小鼠的用途。在一个方面，提供了本文中描述的小鼠胚胎用于产生抗原结合蛋白的用途。
在一个方面，提供了非人细胞，其中非人细胞包含来源于本文中描述的遗传修饰的小鼠的重排的免疫球蛋白轻链基因序列。在一个实施方案中，细胞为B细胞。在一个实施方案中，细胞为杂交瘤。在一个实施方案中，所述细胞编码体细胞突变的免疫球蛋白轻链可变结构域和/或免疫球蛋白重链可变结构域。
在一个方面，提供了非人细胞，其中非人细胞包含来源于本文中描述的遗传修饰的小鼠的重排的免疫球蛋白轻链基因序列。在一个实施方案中，细胞为B细胞。在一个实施方案中，细胞为杂交瘤。在一个实施方案中，所述细胞编码体细胞突变的免疫球蛋白轻链可变结构域和/或免疫球蛋白重链可变结构域。
在一个方面，提供了本文中描述的非人细胞用于产生本文中描述的小鼠的用途。在一个方面，提供了本文中描述的非人细胞用于产生抗原结合蛋白的用途。
在一个方面，提供了表达免疫球蛋白轻链的小鼠B细胞，所述免疫球蛋白轻链包含(a)来源于hVλ基因区段和hJλ基因区段的可变区；和(b)小鼠CL基因。在一个实施方案中，小鼠CL基因选自Cκ和Cλ基因。在具体的实施方案中，Cλ基因为Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的Cλ基因。在一个实施方案中，小鼠B细胞还表达关联重链，所述重链包含(c)来源于hVH，hDH，和(d)hJH区段的可变区。在一个实施方案中，B细胞不包含重排的λ基因。在另一个实施方案中，B细胞不包含重排的κ基因。
在一个方面，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生抗体的方法，包括：(a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中小鼠具有在内源轻链基因座上包含至少一个hVλ和至少一个hJλ的基因组，其中内源轻链基因座包含小鼠CL基因；(b)允许遗传修饰的小鼠产生对抗原的免疫应答；和(c)从(b)的小鼠分离特异性识别抗原的抗体，或从(b)的小鼠分离包含特异性识别抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，其中抗体包含来源于hVλ、hJλ和小鼠CL基因的轻链。在具体的实施方案中，小鼠CL基因为小鼠Cκ基因。
在一个实施方案中，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生抗体的方法，包括：(a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中小鼠具有在内源κ基因座上包含至少一个hVλ和在κ基因座上包含至少一个hJλ的基因组，其中κ基因座包含小鼠Cκ基因；(b)允许遗传修饰的小鼠产生对抗原的免疫应答；和(c)从(b)的小鼠分离特异性识别抗原的抗体，或从(b)的小鼠分离包含特异性识别抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，其中抗体包含来源于hVλ、hJλ和小鼠Cκ基因的轻链。
在一个实施方案中，κ轻链恒定基因选自人Cκ基因和小鼠Cκ基因。
在一个实施方案中，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生抗体的方法，包括：(a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中小鼠具有在λ轻链基因座上包含至少一个hVλ和在λ轻链基因座上包含至少一个Jλ的基因组,其中λ轻链基因座包含小鼠Cλ基因；(b)允许遗传修饰的小鼠产生对抗原的免疫应答；和(c)从(b)的小鼠分离特异性识别抗原的抗体，或从(b)的小鼠分离包含特异性识别抗原的免疫球蛋白结构域的细胞，或在B的小鼠中鉴定编码结合抗原的重链和/或轻链可变结构域的核酸序列，其中抗体包含来源于hVλ、hJλ和小鼠Cλ基因的轻链。
在一个实施方案中，λ轻链恒定基因选自人Cλ基因和小鼠Cλ基因。在一个实施方案中，λ轻链恒定基因为人Cλ基因。在具体的实施方案中，人Cλ基因选自Cλ1、Cλ2、Cλ3和Cλ7。在一个实施方案中，λ轻链恒定基因为小鼠Cλ基因。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因选自Cλ1、Cλ2和Cλ3。在具体的实施方案中，小鼠Cλ基因为Cλ2。在另一个具体的实施方案中，小鼠Cλ基因来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的Cλ基因。
在一个方面，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生重排的抗体基因的方法，包括：(a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中所述遗传修饰在内源轻链基因座上包含hVλ和hJλ，其中内源轻链基因座包含小鼠CL基因或其功能性片段；和，(b)在所述小鼠中鉴定重排的免疫球蛋白基因，其中所述重排的免疫球蛋白基因包含λ轻链可变区基因区段和CL基因或其功能性片段。
在一个实施方案中，该方法还包括从小鼠克隆编码重链和/或轻链可变区的核酸序列，其中重链和/或轻链可变区来自包含人Vλ和小鼠CL的抗体。
在一个实施方案中，小鼠CL基因或其功能性片段选自人CL基因和小鼠CL基因，或其功能性片段。
在一个实施方案中，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生重排的抗体基因的方法，包括：(a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中所述遗传修饰包括在κ轻链基因座上包含hVλ和hJλ,其中κ轻链基因座包含小鼠Cκ基因或其功能性片段；和(b)在所述小鼠中鉴定重排的免疫球蛋白基因，其中重排的免疫球蛋白基因包含λ轻链可变区基因区段和Cκ基因或其功能性片段。
在一个实施方案中，κ轻链恒定基因或其功能性片段选自人Cκ基因和小鼠Cκ基因或其功能性片段。
在一个实施方案中，该方法还包括从小鼠克隆编码重链和/或轻链可变区的核酸序列，其中重链和/或轻链可变区来自包含人Vλ和小鼠Cκ的抗体。
在一个实施方案中，提供了用于在遗传修饰的小鼠中产生重排的抗体基因的方法，包括：(a)将遗传修饰的小鼠暴露于抗原，其中所述遗传修饰在小鼠λ轻链基因座上包含hVλ和hJλ，其中λ轻链基因座包含小鼠Cλ基因或其功能性片段；和，(b)在所述小鼠中鉴定重排的免疫球蛋白基因，其中重排的免疫球蛋白基因包含λ轻链可变区基因区段和Cλ基因或其功能性片段。
在一个实施方案中，λ轻链恒定基因或其功能性片段选自人Cλ基因和小鼠Cλ基因或其功能性片段。在具体的实施方案中，λ轻链恒定基因为小鼠Cλ基因或其功能性片段。
在一个实施方案中，该方法还包括从小鼠克隆编码重链和/或轻链可变区的核酸序列，其中重链和/或轻链可变区来自包含人Vλ和小鼠Cλ的抗体。
在一个方面，提供了用于产生抗体的方法，包括：将本文中描述的小鼠暴露于抗原，让小鼠产生包括产生特异性结合抗原的抗体的免疫应答，鉴定小鼠中的编码重链的重排的核酸序列和小鼠中的编码抗体的关联轻链可变结构域序列的重排的核酸序列，其中所述抗体特异性结合抗原，和利用融合至人恒定结构域的重链和轻链可变结构域的核酸序列来产生期望的抗体，其中期望的抗体包括包含融合至CL结构域的Vλ结构域的轻链。在一个实施方案中，Vλ结构域为人的并且CL结构域为人或小鼠Cλ结构域。在一个实施方案中，Vλ结构域为小鼠的并且CL结构域为人或小鼠Cκ结构域。
在一个实施方案中，提供了用于产生抗体的方法，包括：将本文中描述的小鼠暴露于抗原，让小鼠产生包括产生特异性结合抗原的抗体的免疫应答，鉴定小鼠中的编码重链的重排的核酸序列和小鼠中的编码抗体的关联轻链可变结构域序列的重排的核酸序列，其中所述抗体特异性结合抗原，和利用融合至人恒定结构域的核酸序列的重链和轻链可变结构域的核酸序列来产生期望的抗体，其中期望的抗体包括包含融合至Cκ结构域的Vλ结构域的轻链。
在一个实施方案中，提供了用于产生抗体的方法，包括：将本文中描述的小鼠暴露于抗原，让小鼠产生包括产生特异性结合抗原的抗体的免疫应答，鉴定小鼠中的编码重链可变结构域的重排的核酸序列和编码抗体的关联轻链可变结构域序列的重排的核酸序列，其中所述抗体特异性结合抗原，和利用融合至编码人重链恒定结构域和人轻链恒定结构域的核酸序列的所述核酸序列来产生来源于人序列的抗体，其中特异性结合抗原的抗体包括包含融合至小鼠Cλ结构域的人Vλ结构域的轻链。
在一个实施方案中，小鼠Cλ区选自Cλ1、Cλ2和Cλ3。在具体的实施方案中，小鼠Cλ区为Cλ2。
在一个方面，提供了用于产生重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，包括(a)将本文中描述的小鼠暴露于抗原；(b)让小鼠产生免疫应答；(c)鉴定小鼠中的包含编码与小鼠CL结构域融合的重排的人Vλ结构域序列的核酸序列的细胞，其中细胞还编码包含人VH结构域和小鼠CH结构域的关联重链，并且其中细胞表达结合抗原的抗体；(d)从细胞克隆编码人Vλ结构域的核酸序列和编码关联人VH结构域的核酸序列；和，(e)使用编码人Vλ结构域的克隆的核酸序列和编码关联人VH结构域的克隆的核酸序列来产生完全人的抗体。
在一个实施方案中，提供了用于产生重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，包括(a)将本文中描述的小鼠暴露于抗原；(b)使小鼠产生免疫应答；(c)鉴定小鼠中的包含核酸序列的细胞，所述核酸序列编码在相同核酸分子上与编码小鼠Cκ结构域的核酸序列连续的重排的人Vλ结构域序列,其中细胞还编码包含人VH结构域和小鼠CH结构域的关联重链，并且其中细胞表达结合抗原的抗体；(d)从细胞克隆隆编码人Vλ结构域的核酸序列和编码关联人VH结构域的核酸序列；和(e)使用编码人Vλ结构域的克隆的核酸序列和编码关联人VH结构域的克隆的核酸序列来产生完全人的抗体。
在一个实施方案中，提供了用于产生重排的抗体轻链可变区基因序列的方法，包括(a)将本文中描述的小鼠暴露于抗原；(b)让小鼠产生针对抗原的免疫应答；(c)鉴定小鼠中的包含编码与小鼠Cλ结构域融合的重排的人Vλ结构域序列的DNA的细胞，其中所述细胞还编码包含人VH结构域和小鼠CH结构域的关联重链，并且其中细胞表达结合抗原的抗体；(d)从细胞克隆编码重排的人Vλ结构域的核酸序列和编码关联人VH结构域的核酸序列；和，(e)使用编码人Vλ结构域的克隆的核酸序列和编码关联人VH结构域的克隆的核酸序列了产生完全人的抗体。在一个实施方案中，小鼠Cλ结构域为小鼠Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ结构域来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的Cλ基因。
在一个方面，提供了表达融合至内源轻链恒定区(CL)的人λ来源的轻链的遗传修饰的小鼠，其中小鼠在用抗原免疫后，产生包含融合至小鼠CL结构域的人Vλ结构域的抗体。在一个实施方案中，小鼠CL结构域选自Cκ结构域和Cλ结构域。在一个实施方案中，小鼠CL结构域为Cκ结构域。在一个实施方案中，小鼠CL结构域为Cλ结构域。在具体的实施方案中，Cλ结构域为Cλ2。在具体的实施方案中，小鼠Cλ结构域来源于与小鼠Cλ2具有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％的同一性的Cλ基因。
在一个方面，提供了包含本文中描述的修饰的内源κ或λ轻链基因座的遗传修饰的小鼠，其表达与多个免疫球蛋白重链相关的多个免疫球蛋白λ轻链。在一个实施方案中，重链包括人序列。在多个实施方案中，人序列选自可变序列、CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方案中，多个免疫球蛋白λ轻链包括人序列。在多个实施方案中，人序列选自可变序列、恒定序列及其组合。在一个实施方案中，小鼠包括失能的内源免疫球蛋白基因座，并且从转基因或染色体外附加体表达重链和/或λ轻链。在一个实施方案中，小鼠在内源小鼠基因座上包括，利用一个或多个人免疫球蛋白序列对一些或所有内源小鼠重链基因区段(即，V、D、J)和/或一些或所有内源小鼠重链恒定序列(例如，CH1、铰链、CH2、CH3或其组合)和/或一些或所有内源小鼠轻链序列(例如，V、J、恒定区或其组合)的替换。
在一个方面，提供了适用于产生具有人λ来源的轻链的抗体的小鼠，其中在小鼠中产生的所有或基本上所有抗体经表达具有人λ来源的轻链。在一个实施方案中，从内源轻链基因座表达人λ来源的轻链。在一个实施方案中，内源轻链基因座为κ轻链基因座。在具体的实施方案中，κ轻链基因座为小鼠κ轻链基因座。
在一个方面，提供了用于产生人抗体的λ来源的轻链的方法，包括从本文中描述的小鼠获得轻链序列和重链序列，以及使用轻链序列和重链序列来产生人抗体。
在一个方面，提供了用于产生抗原结合蛋白的方法，包括将本文中描述的小鼠暴露于抗原；让小鼠产生免疫应答；和从小鼠获得结合抗原的抗原结合蛋白，或从小鼠获得用于产生结合抗原的抗原结合蛋白的序列。
在一个方面，提供了来源于本文中描述的小鼠的细胞。在一个实施方案中，细胞选自胚胎干细胞、多能细胞、诱导的多能细胞、B细胞和杂交瘤。
在一个方面，提供了包含本文中描述的遗传修饰的细胞。在一个实施方案中，细胞为小鼠细胞。在一个实施方案中，细胞选自杂交瘤和四源杂交瘤(quadroma)。在一个实施方案中，细胞表达包含与小鼠恒定序列融合的人λ可变序列的免疫球蛋白轻链。在具体的实施方案中，小鼠恒定序列为小鼠κ恒定序列。
在一个方面，提供了来源于本文中描述的小鼠的组织。
在一个方面，提供了本文中描述的小鼠或细胞的用于产生抗原结合蛋白的用途。在一个实施方案中，抗原结合蛋白为人蛋白质。在一个实施方案中，人蛋白质为人抗体。
在一个方面，提供了由本文中描述的小鼠、细胞、组织或方法产生的抗原结合蛋白。在一个实施方案中，抗原结合蛋白为人蛋白质。在一个实施方案中，人蛋白质为人抗体。
除非另外明确地指出或从上下文中很明显的看出，否则可将本文中描述的任何实施方案和方面彼此结合使用。通过参考随后的描述，其它实施方案对于本领域技术人员将变得很显然。
附图概述
图1显示了包括Vλ基因区段的簇(A、B和C)以及Jλ和Cλ区对(J-C对)的人λ轻链基因座的不按比例的详细说明。
图2显示了用于使内源小鼠λ轻链基因座失活的靶向策略的不按比例的总体说明。
图3显示了用于使内源小鼠κ轻链基因座失活的靶向策略的不按比例的总体说明。
图4A显示用于靶向内源小鼠λ轻链基因座的具有人λ轻链序列(包括12个hVλ基因区段和hJλ1基因区段)的初始靶向载体(12/1-λ靶向载体)的不按比例的总体说明。
图4B显示4个用于靶向内源小鼠κ轻链基因座的具有人λ轻链序列的初始靶向载体的不按比例的总体说明，所述载体分别包括12个hVλ基因区段以及hJλ1基因区段(12/1-κ靶向载体)、12个hVλ基因区段以及hJλ1、2、3和7基因区段(12/4-κ靶向载体)、12个hVλ基因区段、人Vκ-Jκ基因组序列以及hJλ1基因区段(12(κ)1-κ靶向载体)和12个hVλ基因区段、人Vκ-Jκ基因组序列以及hJλ1、2、3和7个基因区段(12(κ)4-κ靶向载体)。
图5A显示了用于将40个hVλ基因区段和单个hJλ基因区段逐步插入小鼠λ轻链基因座内的靶向策略的不按比例的总体说明。
图5B显示了用于将40个hVλ基因区段和单个hJλ基因区段逐步插入小鼠κ基因座内的靶向策略的不按比例的总体说明。
图6显示了用于产生独特人λ-κ杂交靶向载体的靶向和分子工程步骤的不按比例的总体说明，所述杂交靶向载体用于构建包含人κ基因间序列、多个hJλ基因区段或这两者的杂交轻链基因座。
图7A显示包含有效地连接至内源Cλ2基因的40个hVλ基因区段和单个hJλ基因区段的修饰的小鼠λ轻链基因座的基因座结构的不按比例的总体说明。
图7B显示4个独立的修饰的小鼠κ轻链基因座的基因座结构的不按比例的总体说明，所述基因座包含有效地连接至内源Cκ基因的40个hVλ基因区段和1或4个hJλ基因区段，并且具有或不具有连续的人Vκ-Jκ基因组序列。
图8A显示来自野生型小鼠(WT)、对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的12个hVλ和4个hJλ基因区段是纯合的小鼠(12hVλ-VκJκ-4hJλ)以及对于40个hVλ和1个hJλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-1hJλ)的针对CD19+门控的Igλ+和Igκ+脾细胞的等值线图。
图8B显示从野生型(WT)、对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的12个hVλ和4个hJλ基因区段是纯合的小鼠(12hVλ-VκJκ-4hJλ)以及对于40个hVλ和1个hJλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-1hJλ)收获的脾中的CD19+B细胞的总数。
图9A，在上图框中，显示了来自野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的针对单线态(singlet)门控和针对B和T细胞(分别地CD19+和CD3+)染色的脾细胞的等值线图。下图框显示了来自野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的针对CD19+门控和针对Igλ+和Igκ+的表达染色的脾细胞的等值线图。
图9B显示从野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)收获的脾中的CD19+、CD19+Igκ+和CD19+Igλ+B细胞的总数。
图9C显示来自野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的针对CD19+门控和针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的脾细胞的等值线图。在各个等值线图上标明了成熟(对于WT，72；对于40hVλ-VκJκ-4hJλ，51)和过渡(对于WT，13；对于40hVλ-VκJκ-4hJλ，22)B细胞。
图9D显示从野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)收获的脾中的CD19+B细胞、过渡B细胞(CD19+IgMhiIgDlo)和成熟B细胞(CD19+IgMloIgDhi)的总数。
图10A，在上图框中，显示了来自野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的针对B和T细胞(分别地，CD19+和CD3+)染色的骨髓的等值线图。下图框显示了来自野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的针对CD19+门控和针对ckit+和CD43+染色的骨髓的等值线图。祖B细胞(Pro B cell)和前B细胞标示于下图框的等值线图上。
图10B显示从野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的股骨收获的骨髓中的祖B细胞(CD19+CD43+ckit+)和前B细胞(CD19+CD43-ckit-)的数目。
图10C显示来自野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的针对单线态门控的、针对免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的骨髓的等值线图。未成熟的、成熟的和祖/前B细胞标示于各个等值线图上。
图10D显示从野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的股骨分离的骨髓中的未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞的总数。
图10E显示从野生型小鼠(WT)和对于包括人Vκ-Jκ基因组序列的40个hVλ和4个Jλ基因区段是纯合的小鼠(40hVλ-VκJκ-4hJλ)的股骨分离的、针对未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞门控的、针对Igλ和Igκ表达染色的骨髓的等值线图。
图11显示从在内源小鼠κ轻链基因座上具有人λ轻链基因序列的小鼠的脾细胞RNA扩增的18个独立的RT-PCR克隆的Vλ-Jλ-Cκ连接的核苷酸序列比对。A6＝SEQ ID NO:57；B6＝SEQ ID NO:58；F6＝SEQ ID NO:59；B7＝SEQ ID NO:60；E7＝SEQ ID NO:61；F7＝SEQID NO:62；C8＝SEQ ID NO:63；E12＝SEQ ID NO:64；1-4＝SEQ IDNO:65；1-20＝SEQ ID NO:66；3B43＝SEQ ID NO:67；5-8＝SEQ IDNO:68；5-19＝SEQ ID NO:69；1010＝SEQ ID NO:70；11A1＝SEQ IDNO:71；7A8＝SEQ ID NO:72；3A3＝SEQ ID NO:73；2-7＝SEQ ID NO:74。小写碱基表示因重组过程中的突变和/或N添加而产生的非种系碱基。由hJλ1和小鼠Cκ的核苷酸序列编码的构架4区域(FWR4)内的共有氨基酸示于序列比对的底部。
图12显示从在内源小鼠κ轻链基因座上具有包括连续的人Vκ-Jκ基因组序列的人λ轻链基因序列的小鼠的脾细胞RNA扩增的12个独立的RT-PCR克隆的Vλ-Jλ-Cκ连接的核苷酸序列比对。5-2＝SEQ IDNO:87；2-5＝SEQ ID NO:88；1-3＝SEQ ID NO:89；4B-1＝SEQ IDNO:90；3B-5＝SEQ ID NO:91；7A-1＝SEQ ID NO:92；5-1＝SEQ IDNO:93；4A-1＝SEQ ID NO:94；11A-1＝SEQ ID NO:95；5-7＝SEQ IDNO:96；5-4＝SEQ ID NO:97；2-3＝SEQ ID NO:98。小写碱基表示因重组过程中的突变和/或N添加而产生的非种系碱基。由各个人Jλ和小鼠Cκ的核苷酸序列编码的构架4区域(FWR4)内的共有氨基酸示于序列比对的底部。
图13显示从在内源小鼠λ轻链基因座上具有人λ轻链基因序列的小鼠的脾细胞RNA扩增的3个独立RT-PCR克隆的Vλ-Jλ-Cλ连接的核苷酸序列比对。2D1＝SEQ ID NO:101；2D9＝SEQ ID NO:102；3E15＝SEQ ID NO:103。小写碱基表示因重组过程中的突变和/或N添加而产生的非种系碱基。由hJλ1和小鼠Cλ2的核苷酸序列编码的构架4区域(FWR4)内的共有氨基酸示于序列比对的底部。
发明详述
虽然详细地论述了不同实施方案的具体特征，但具体方面、实施方案和实施例的描述不限制权利要求的主题；权利要求描述了本发明的范围。本文中使用的所有术语和短语包括本领域中通常赋予它们的含义。
术语“连续的”是指，在相同核酸分子上的存在，例如，如果两个核酸序列存在于相同核酸分子上但被另一个核酸序列中断，则它们是“连续的”。例如，重排的V(D)J序列与恒定区基因序列是“连续的”，虽然V(D)J序列的最后一个密码子之后并未紧接恒定区序列的第一个密码子。在另一个实例中，如果两个V基因区段序列存在于相同的基因组片段上，则它们是“连续的”，尽管它们可被不编码V区域的密码子的序列隔开，例如它们可被调控序列例如启动子或其它非编码序列隔开。在一个实施方案中，连续序列包括包含如在野生型基因组中发现的排列的基因组序列的基因组片段。
短语“来源于”，当在“来源于”引述的基因或基因区段的可变区方面使用时，包括使序列追溯至特定未重排的基因区段的能力，所述未重排的基因区段经重排以形成表达可变结构域的基因(在适用的情况下，解释剪接差异和体细胞突变)。
短语“功能性”，当在可变区基因区段或连接基因区段方面使用时，是指在表达的抗体库中的使用；例如，在人Vλ基因区段中3-1、4-3、2-8等是功能性的，而Vλ基因区段3-2、3-4、2-5等是非功能性的。
“重链基因座”包括染色体例如小鼠染色体上的位置，其中在野生型小鼠中发现重链可变区(VH)、重链多样性区(DH)、重链连接区(JH)和重链恒定区(CH)DNA序列。
“κ基因座”包括染色体例如小鼠染色体上的位置，其中在野生型小鼠中发现κ可变区(Vκ)、κ连接区(Jκ)和κ恒定区(Cκ)DNA序列。
“λ基因座”包括染色体例如小鼠染色体上的位置，其中在野生型小鼠中发现λ可变区(Vλ)、λ连接区(Jλ)和λ恒定区(Cλ)DNA序列。
术语“未重排的”包括免疫球蛋白基因座的这样的状态，其中V基因区段和J基因区段(对于重链，还有D基因区段)分开地存在，但能够被连接以形成包含V(D)J库的单个V、(D)、J的重排的V(D)J基因。
表达人λ可变结构域的小鼠
先前已报导了表达完全人或部分人且部分小鼠的抗体的小鼠。基因工程小鼠包括，利用人V(D)J基因区段对内源小鼠基因座上的未重排的V(D)J基因区段的替换。小鼠表达具有人可变结构域和小鼠恒定结构域的嵌合抗体(参见，例如，美国专利7,605,237)。大部分其它报导涉及，在具有失能的内源免疫球蛋白基因座的小鼠中从完全人转基因表达完全人抗体的小鼠。
抗体轻链由两个分开的基因座:kappa(κ)和lambda(λ)之一编码。小鼠抗体轻链主要为κ型。产生小鼠抗体的小鼠和产生完全人或嵌合人-小鼠抗体的修饰的小鼠在轻链使用上显示偏爱性。人也显示轻链偏爱性，但不像小鼠这样明显；小鼠的κ轻链对λ轻链的比率为约95:5，然而在人中，该比率为约60:40。小鼠中的更明显的偏爱性据认为不会严重地影响抗体多样性，因为在小鼠中，λ可变基因座并不是如此多样的。在人中情况则不同。人λ轻链基因座是丰富多样的。
人λ轻链基因座延伸超过1,000 kb并且包含超过80个编码可变(V)或连接(J)区段的基因(图1)。在人λ轻链基因座内，超过一半的所有观察到的Vλ结构域由基因区段1-40、1-44、2-8、2-14和3-21编码。总体上，约30个左右的人Vλ基因区段据认为是功能性的。存在7个Jλ基因区段，其中仅4个被认为是通常具有功能的Jλ基因区段--Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。
人中的λ轻链基因座在结构上与小鼠和人中的κ基因座相似，因为人λ轻链基因座具有几个能够重组以形成功能性轻链蛋白质的可变区基因区段。人λ轻链基因座包含约70个V基因区段和7个Jλ-Cλ基因区段对。此类Jλ-Cλ基因区段对中仅有4个显示是功能性的。在一些等位基因中，第五Jλ-Cλ基因区段对据报导为假基因(Cλ6)。70 Vλ基因区段显示包含38个功能性基因区段。70个Vλ序列排列在3个簇中，其全都包含不同V基因家族组的不同成员(A、B和C簇；图1)。这是用于在非人动物中产生具有人V区域的抗体的相对未利用的多样性的潜在丰富资源。
形成鲜明对比地，小鼠λ轻链基因座仅包含2个或3个(取决于品系)小鼠Vλ区基因区段(图2)。至少因为该原因，小鼠中的严重的κ偏爱性据认为对总的抗体多样性不是特别有害。
根据小鼠λ轻链基因座的已公布的图谱，该基因座基本上由在约200 kb的跨度内的两个基因区段簇组成(图2)。这两个簇包含两组能够独立地重排的V、J和C基因：Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4和Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1。虽然已发现Vλ2与所有Jλ基因区段重组，但Vλ1显示只与Cλ1重组。Cλ4据认为是具有缺陷性剪接位点的假基因。
小鼠κ轻链基因座明显不同。来自小鼠κ基因座的参与导致功能性轻链蛋白的重组事件的基因区段的结构和数目要复杂得多(图3)。因此，小鼠λ轻链未对一般小鼠中的抗体群体的多样性作出巨大贡献。
在小鼠中利用人λ轻链基因座的丰富多样性，特别地，将很可能产生用于轻链V结构域的更完全的人库的来源。先前利用该多样性的尝试使用包含大量随机整合入小鼠基因组的人λ轻链基因座的人转基因(参见，例如，US 6,998,514和US 7,435,871)。包含此类随机整合的转基因的小鼠据报导表达完全人λ轻链，然而，在一些情况下，一个或两个内源轻链基因座保持完整。该情形是不想要的，因为人λ轻链序列与小鼠轻链(κ或λ)在小鼠的表达的抗体库中相对抗。
相比之下，本发明人描述了遗传修饰的小鼠，其能够从小鼠轻链基因座直接表达一个或多个λ轻链核酸序列，包括通过内源小鼠轻链基因座上的替换。能够从内源基因座表达人λ轻链序列的遗传修饰的小鼠可被进一步培育成包含人重链基因座，从而可用于表达包含完全人的V区(重链和轻链)的抗体的小鼠。在多种实施方案中，V区与小鼠恒定区一起表达。在多种实施方案中，内源小鼠免疫球蛋白基因区段不存在并且V区与人恒定区一起表达。此类抗体被证明在许多应用(诊断以及治疗)中是有用的。
对于在小鼠中表达来源于人Vλ和Jλ基因区段的结合蛋白的各种实施方案，可实现许多有利方面。可通过将人λ序列置于内源轻链基因座例如小鼠κ或λ基因座上来实现有利方面。从此类小鼠产生的抗体可具有包含融合至小鼠CL区(特别地小鼠Cκ或Cλ区)的人Vλ结构域的轻链。小鼠还将表达人Vλ结构域，所述人Vλ结构域适于与人CL区(特别地Cκ和/或Cλ区)一起用于鉴定和克隆。因为此类小鼠中的B细胞发育在其它方面是正常的，所以能够在Cλ或Cκ区的背景中产生相容的Vλ结构域(包括体细胞突变的Vλ结构域)。
描述了在免疫球蛋白κ或λ轻链基因座上包含未重排的Vλ基因区段的遗传修饰的小鼠。描述了表达包含具有融合至Cκ和/或Cλ区的人Vλ结构域的轻链的抗体的小鼠。
免疫球蛋白κ轻链基因座的不表达转录物(Sterile Transcript)
在小鼠中表达人免疫球蛋白λ序列的主题的变化反映在能够进行此类表达的遗传修饰的小鼠的不同实施方案上。因此，在一些实施方案中，遗传修饰的小鼠包含来自人基因座的某些非编码序列。在一个实施方案中，遗传修饰的小鼠在内源κ轻链基因座上包含人Vλ和Jλ基因区段，并且还包含人κ轻链基因组片段。在具体的实施方案中，人κ轻链基因组片段为在人Vκ基因区段与人Jκ基因区段之间天然发现的非编码序列。
人和小鼠κ轻链基因座包含编码不表达转录物的序列，所述转录物不存在起始密码子或开放阅读框架，并且被当作是调控κ轻链基因座的转录的元件。此类不表达转录物产生自位于最接近的Vκ基因区段的下游或3'端与处于κ轻链恒定区基因(Cκ)的上游的κ轻链内含增强子(Eκi)的上游或5'端之间的基因间序列。不表达转录物产生自基因间序列的重排(以形成融合至Cκ的VκJκ1区段)。
处于Cκ基因的上游的κ轻链基因座的替换可除去编码不表达转录物的基因间区域。因此，在多种实施方案中，利用人λ轻链基因区段对小鼠Cκ基因上游的小鼠κ轻链序列的替换将导致人源化小鼠κ轻链基因座，所述基因座包含人Vλ和Jλ基因区段但不包含编码不表达转录物的κ轻链基因间区域。
如本文中所描述的，利用人λ轻链基因区段对内源小鼠κ轻链基因座的人源化(其中人源化除去基因间区域)导致，与λ轻链使用的显著增加偶联的κ轻链基因座的使用的显著下降。因此，虽然不存在基因间区域的人源化小鼠是有用的(因为其可产生具有人轻链可变结构域(例如，人λ或κ结构域)的抗体)，但是来自基因座的使用减少。
还描述了，利用人Vλ和Jλ基因区段对内源小鼠κ轻链基因座的人源化，该人源化偶联人κ基因间区域的插入以产生Vλ基因座，所述基因座在转录上在最后一个人Vλ基因区段与第一个人Jλ基因区段之间包含κ基因间区域；所述基因座与不存在κ基因间区域的基因座相比，在B细胞群体中显示了更高的表达。该观察结果与这样的假说相符：基因间区域--通过不表达转录物直接地，或间接地--抑制内源λ轻链基因座的使用。在这样的假说下，包括所述基因间区域将导致内源λ轻链基因座的使用减少，从而使得小鼠限制性选择，但利用修饰的(λ至κ)基因座来产生抗体。
在不同的实施方案中，利用人λ轻链序列对小鼠Cκ基因上游的小鼠κ轻链序列的替换还在转录方向上包括，置于最3'端的Vλ基因区段的3'非翻译区与第一个人Jλ基因区段的5'端之间的人κ轻链基因间区域。或者，这样的基因间区域可通过在内源λ轻链基因座中产生缺失而从替换的内源κ轻链基因座(在小鼠Cκ基因的上游)省略。同样地，在该实施方案下，小鼠从包含人λ轻链序列的内源κ轻链基因座产生抗体。
工程化小鼠以表达人Vλ结构域的方法
描述了产生遗传修饰的小鼠的各种方法，所述遗传修饰的小鼠产生包含具有融合至内源CL(例如Cκ或Cλ)区的人Vλ结构域的轻链的抗体。描述了遗传修饰，在不同的实施方案中，所述遗传修饰包括一个或两个内源轻链基因座的缺失。例如，为了从内源抗体库消除小鼠λ轻链，可进行第一Vλ-Jλ-Cλ基因簇的缺失和利用人Vλ-Jλ基因区段完全或部分地替换第二基因簇的Vλ-Jλ基因区段。还提供了遗传修饰的小鼠的胚胎、细胞，以及用于产生所述小鼠、小鼠胚胎和细胞的靶向构建体。
一个内源Vλ-Jλ-Cλ基因簇的缺失和另一个内源Vλ-Jλ-Cλ基因簇的Vλ-Jλ基因区段的替换，在不同的实施方案中，对动物的天然抗体恒定区的缔合和功能具有相对最小的破坏，因为内源Cλ基因保持完整并从而保持正常的功能性和与内源重链恒定区缔合的能力。因此，在此类实施方案中，取决于用于装配包含2条重链和2条轻链的功能性抗体分子的功能性轻链恒定区，修饰不影响其它内源重链恒定区。此外，在不同实施方案中，修饰不影响包括内源重链和轻链(例如连接至小鼠Cλ区的hVλ结构域)的功能性膜结合的抗体分子的装配。因为至少一个功能性Cλ基因保留在内源基因座上，所以包括利用人Vλ-Jλ基因区段对内源Vλ-Jλ-Cλ基因簇的Vλ-Jλ基因区段的替换的动物应当能够产生正常λ轻链，所述轻链能够在免疫应答中通过存在于动物的表达的抗体库中的人Vλ-Jλ基因区段结合抗原。
在图2中提供了缺失的内源小鼠Vλ-Jλ-Cλ基因簇的示意性说明(未按比例)。如所说明的，小鼠λ轻链基因座被组织成2个基因簇，所述两个基因簇都包含能够重组以形成功能性小鼠λ轻链的功能性基因区段。内源小鼠Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1基因簇被具有侧翼连接重组位点的新霉素盒的靶向构建体(靶向载体1)缺失。另一个内源基因簇(Vλ2-Vλ3-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4)被具有侧翼连接有重组位点的潮霉素-胸苷激酶盒的靶向构建体(靶向载体2)部分缺失。在该第二靶向事件中，Cλ2-Jλ4-Cλ4内源基因区段得到保留。使用与第一靶向构建体(靶向载体1)不同的重组位点构建第二靶向构建体(靶向载体2)，从而允许在已实现成功靶向后选择性缺失选择盒。所得的双靶向基因座在功能上被沉默，因为不能产生内源λ轻链。该修饰的基因座可用于插入人Vλ和Jλ基因区段以产生包含人Vλ和Jλ基因区段的内源小鼠λ基因座，由此在修饰的基因座上重组后，动物产生包含连接至内源小鼠Cλ基因区段的重排的人Vλ和Jλ基因区段的λ轻链。
在不同的实施方案中，遗传修饰小鼠以使得内源λ基因区段不具有功能，这导致在其抗体库中只显示κ轻链的小鼠，从而产生可用于评估λ轻链在免疫应答中的作用以及可用于产生包含Vκ结构域但不包含Vλ结构域的抗体库的小鼠。
表达已在内源小鼠λ轻链基因座上重组的连接至小鼠Cλ基因的hVλ的遗传修饰的小鼠可由本领域已知的任何方法产生。图4A中提供了，利用人Vλ和Jλ基因区段对内源小鼠Vλ2-Vλ3-Jλ2基因区段的替换的示意性说明(未按比例)。如所说明的，内源小鼠λ轻链基因座(已使其无功能)被包括侧翼连接有重组位点的新霉素盒的靶向构建体(12/1-λ靶向载体)替换。Vλ2-Vλ3-Jλ2基因区段被包含含有12个hVλ基因区段和单个hJλ基因区段的人λ序列的基因组片段置换。
因此，该第一方法在内源λ轻链基因座上放置了与单个hJλ基因区段连续的一个或多个hVλ基因区段(图4A)。
可通过使用类似的技术来实现对修饰的内源λ轻链基因座的进一步修饰(以插入更多的hVλ基因区段)。例如，在图5A中提供了，用于逐步插入额外的人hVλ基因区段的两个另外的靶向构建体(+16-λ和+12-λ靶向载体)的示意性说明。如所说明的，使用由先前插入的人λ轻链序列提供的同源性，在连续的步骤中将包含特定人hVλ基因区段的另外的基因组片段插入修饰的内源λ轻链基因座。通过依次与每一个说明的靶向构建体重组，将28个另外的hVλ基因区段插入修饰的内源λ轻链基因座。这产生了嵌合基因座，所述基因座产生包含连接至小鼠Cλ基因的人Vλ-Jλ基因区段的λ轻链蛋白质。
在小鼠λ基因座上插入人λ轻链基因区段的上述方法保持位于Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段下游的增强子(命名为Enh 2.4、Enh和Enh3.1，图4A和图5A)。该方法在内源小鼠λ轻链基因座上导致单个修饰的等位基因(图7A)。
提供了用于产生表达包含有效地连接至小鼠Cλ基因区段的hVλ和Jλ基因区段的轻链的小鼠的组合物和方法，包括用于产生从内源小鼠λ轻链基因座表达此类基因的小鼠的组合物和方法。所述方法包括，选择性地使一个内源小鼠Vλ-Jλ-Cλ基因簇丧失功能(例如，通过靶向缺失)，并在内源小鼠λ轻链基因座上使用hVλ和Jλ基因区段，以在小鼠中表达hVλ结构域。
或者，在第二方法中，可将人λ轻链基因区段置于内源κ轻链基因座上。在不同的实施方案中，遗传修饰包括内源κ轻链基因座的缺失。例如，为了从内源抗体库消除小鼠κ轻链，可进行小鼠Vκ和Jκ基因区段的缺失。还提供了遗传修饰的小鼠胚胎、细胞，以及用于产生所述小鼠、小鼠胚胎和细胞的靶向构建体。
由于上述原因，小鼠Vκ和Jκ基因区段的缺失使用相对最小的破坏。在图3中提供了，缺失的小鼠Vκ和Jκ基因区段的示意性说明(未按比例)。通过位于两个精确定位的靶向载体(各自使用位点特异性重组位点)之间的小鼠序列的重组酶介导的缺失，来缺失内源小鼠Vκ和Jκ基因区段。将第一靶向载体(Jκ靶向载体)用于第一靶向事件以缺失小鼠Jκ基因区段。将第二靶向载体(Vκ靶向载体)用于第二随后的靶向事件，以缺失位于最远端的小鼠Vκ基因区段的5'端的序列。两个靶向载体都包含位点特异性重组位点，从而允许在实现成功靶向后选择性缺失两个选择盒和所有其间的小鼠κ轻链序列。所得的经缺失的基因座在功能上被沉默，因为不能产生内源κ轻链。该修饰的基因座可用于插入hVλ和Jλ基因区段以产生包含hVλ和Jλ基因区段的内源小鼠κ基因座，从而在修饰的基因座上重组后，动物产生包含有效地连接至内源小鼠Cκ基因区段的重排的hVλ和Jλ基因区段的λ轻链。可将不同的包含人λ轻链序列的靶向载体与该缺失的小鼠κ基因座结合使用，以产生包含与小鼠Cκ区有效连接的人λ基因区段的杂交轻链基因座。
因此，第二方法将一个或多个人Vλ基因区段置于小鼠κ轻链基因座上，与单个人Jλ基因区段连续(12/1-κ靶向载体,图4B)。
在不同的实施方案中，可改进该方法以添加基因区段和/或调控序列，从而优化小鼠抗体库内来自小鼠κ基因座的人λ轻链序列的使用。
在第三方法中，将一个或多个hVλ基因区段置于小鼠κ轻链基因座上，与4个hJλ基因序列连续(12/4-κ靶向载体，图4B)。
在第三方法中，将一个或多个hVλ基因区段置于小鼠κ轻链基因座上，与人κ基因间序列和单个hJλ基因序列连续(12(κ)1-κ靶向载体,图4B)。
在第四方法中，将一个或多个hVλ基因区段置于小鼠κ轻链基因座上，与人κ基因间序列和4个hJλ基因序列连续(12(κ)4-κ靶向载体，图4B)。
在小鼠κ基因座上插入人λ轻链基因区段的所有上述方法维持在Cκ基因上游的κ内含增强子元件(命名为Eκi,图4B和图5B)和在Cκ基因下游的3'κ增强子(命名为Eκ3',图4B和图5B)。所述方法在内源小鼠κ轻链基因座上导致4个分开的修饰的等位基因(图7B)。
在不同的实施方案中，遗传修饰的小鼠包括内源小鼠λ轻链基因座的敲除。在一个实施方案中，通过缺失横跨Vλ2至Jλ2的区域和横跨Vλ1至Cλ1的区域的策略来敲除λ轻链基因座(图2)。减小或消除内源λ轻链基因座表达内源λ结构域的能力的任何策略适合于与本公开内容中的实施方案一起使用。
来自遗传修饰的小鼠的λ结构域抗体
在小鼠κ或λ轻链基因座上包含人λ序列的小鼠将表达包含融合至小鼠CL(Cκ或Cλ)区的hVλ区的轻链。将此类小鼠有利地培育成这样的小鼠，所述小鼠(a)包含在功能上被沉默的轻链基因座(例如，内源小鼠κ或λ轻链基因座的敲除)；(b)包含含有有效地连接至内源小鼠Cλ基因的hV和hJ基因区段的内源小鼠λ轻链基因座；(c)包含含有有效地连接至内源小鼠Cκ基因的hVκ和hJκ基因区段的内源小鼠κ轻链基因座；和，(d)这样的小鼠，其中一个κ等位基因包含hVκ和hJκ；另一个κ等位基因包含hVλ和hJλ；一个λ等位基因包含hVλ和hJλ并且一个λ等位基因被沉默或敲除，或两个λ等位基因都包含hVλ和hJλ；和，两个重链等位基因各自包含hVH、hDH和hJH。
通过将编码hVλ结构域的核酸克隆入具有编码人Cλ的基因的表达构建体，来将包含在Cκ或Cλ的背景中表达的hVλ结构域的抗体用于产生完全人抗体。将所得的表达构建体转染入适当的宿主细胞，以表达显示融合至hCλ的完全hVλ结构域的抗体。
实施例
下列实施例被提供用以描述如何产生和使用本发明的方法和组合物，并且无意限制本发明人所认定的本发明的范围。除非另外指出，否则温度以摄氏度表示，并且压力为大气压或接近大气压。
实施例I
小鼠免疫球蛋白轻链基因座的缺失
使用技术(参见，例如，美国专利6,586,251和Valenzuela等人(2003)High-throughput engineering of the mousegenome coupled with high-resolution expression analysis,Nature Biotech.21(6):652-659)产生各种靶向构建体来修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)文库，以使小鼠κ和λ轻链基因座失活。
小鼠λ轻链基因座的缺失。通过同源重组修饰来自小鼠BAC克隆RP23-135k15(Invitrogen)的DNA，以通过Vλ-Jλ-Cλ基因簇的靶向缺失来使内源小鼠λ轻链基因座失活(图2)。
简而言之，使用靶向载体在单个靶向事件中缺失包含Vλ1-Jλ3-Cλ3-Jλ1-Cλ1基因区段的整个近端簇，所述靶向载体包含侧翼连接有loxP位点的新霉素盒，具有包含Vλ1基因区段5'端的序列的5'小鼠同源臂和包含Cλ1基因区段3'端的序列的3'小鼠同源臂(图2，靶向载体1)。
制备第二靶向构建体以精确地缺失包含Vλ2-Jλ2-Cλ2-Jλ4-Cλ4的远端内源小鼠λ基因簇，除了靶向构建体包含含有Vλ2基因区段5'端的序列的5'小鼠同源臂和含有内源Cλ2基因区段5'端的序列的3'小鼠同源臂外(图2，靶向载体2)。因此，第二靶向构建体精确地缺失Vλ2-Jλ2，同时在内源小鼠λ基因座上留下完整的Cλ2-Jλ4-Cλ4。通过本领域已知的核型分析和筛选方法(例如，)确认包含灭活的内源λ基因座(如上文中描述的)的ES细胞。随后从修饰的ES细胞分离DNA，将其经历利用CRE重组酶的处理，从而介导包含新霉素标记基因的近端靶向盒的缺失，仅在缺失点留下单个loxP位点(图2，下图)。
小鼠κ轻链基因座的缺失。使用类似的上述方法产生几个靶向构建体，以通过同源重组修饰来自小鼠BAC克隆RP23-302g12和RP23-254m04(Invitrogen)的DNA，从而在两步法中使小鼠κ轻链基因座失活(图3)。
简而言之，使用靶向载体在单个靶向事件中缺失内源小鼠κ轻链基因座的Jκ基因区段(1-5)，所述靶向载体包含潮霉素-胸苷激酶(hyg-TK)盒，且在hyg-TK盒的3'端含有单个loxP位点(图3,Jκ靶向载体)。用于产生该靶向载体的同源臂包含在内源小鼠Jκ基因区段的5'和3'端的小鼠基因组序列。在第二靶向事件中，制备第二靶向载体以缺失最远端的内源小鼠Vκ基因区段的上游(5')的小鼠基因组序列的部分(图3,Vκ靶向载体)。该靶向载体包含反向lox511位点、loxP位点和新霉素盒。用于产生该靶向载体的同源臂包含在最远端的小鼠Vκ基因区段上游的小鼠基因组序列。依次(即，Jκ然后Vκ)将靶向载体用于靶向ES细胞中的DNA。通过本领域已知的核型分析和筛选方法(例如，TaqmanTM)确认具有双靶向的染色体(即，被两个靶向载体靶向的单个内源小鼠κ基因座)的ES。随后从修饰的ES细胞分离DNA，将其经历利用Cre重组酶的处理，从而介导内源小鼠Vκ基因区段和两个选择盒的缺失，同时以彼此相反的方向留下两个并置的lox位点(图3，下图；SEQ ID NO:1)。
因此，产生了两个包含完整增强子和恒定区的修饰的内源轻链基因座(κ和λ)，用于以精确地方式使用下述靶向载体逐步插入未重排的人λ种系基因区段。
实施例II
用人λ轻链微小-基因座(Mini-Locus)对小鼠轻链基因座的替换
工程化多个靶向载体以将人λ基因区段逐步插入内源小鼠κ和λ轻链基因座(使用类似的上述方法)。对内源轻链基因座进行多个独立的初始修饰，每一个修饰产生包含有效地连接至小鼠轻链恒定基因和增强子的hVλ和Jλ基因区段的嵌合轻链基因座。
包含12个人Vλ和1个人Jλ基因区段的人λ微小-基因座。使用称为RP11-729g4的BAC克隆(Invitrogen)，对一系列初始靶向载体进行工程化以包含来自A簇的前12个连续的人Vλ基因区段和hJλ1基因区段或4个hJλ基因区段。图4A和4B分别显示了被构建用于产生人λ轻链基因区段在小鼠λ和κ轻链基因座上的初始插入的靶向载体。
对于第一组初始靶向载体，工程化来自729g4 BAC克隆的包含12个hVλ基因区段和hJλ1基因区段的124,125 bp DNA片段，以在hJλ1基因区段的996 bp下游(3')包含PI-SceI位点，用于连接3'小鼠同源臂。不同的两组同源臂用于连接至该人片段；一组同源臂包含来自135k15 BAC克隆的内源小鼠λ序列(图4A)，另一组包含分别来自小鼠BAC克隆RP23-302g12和RP23-254m04的小鼠Vκ和Jκ基因区段的5'和3'端的内源κ序列(图4B)。
对于12/1-λ靶向载体(图4A)，在实施例1中描述的修饰的小鼠λ基因座的包含小鼠Cλ2-Jλ4-Cλ4和增强子2.4的27,847 bp DNA片段的5'末端上进行PI-SceI位点的工程化。通过将约28 kb小鼠片段连接至约124 kb人λ片段而将其用作3'同源臂，这产生了从5'至3'包含hJλ1基因区段、在hJλ1基因区段3'端的996 bp的人λ序列、在小鼠Cλ2基因5'端的1229 bp的小鼠λ序列、小鼠Cλ2基因和约28 kb小鼠片段的剩余部分的3'连接。人Vλ3-12基因区段的上游(5')是在5'小鼠同源臂的起点之前的另外1456 bp的人λ序列，所述5'小鼠同源臂包含相应于内源小鼠λ基因座5'端的序列的23,792bp的小鼠基因组DNA。在5'同源臂与人λ序列的起点之间的是侧翼连接有Frt位点的新霉素盒。
因此，12/1-λ靶向载体从5'至3'包括，5'同源臂(包含内源λ基因座5'端的约24 kb的小鼠λ基因组序列)、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约123 kb的人基因组λ序列(包含前12个连续的hVλ基因区段和hJλ1基因区段)、PI-SceI位点和3'同源臂(包含约28 kb的小鼠基因组序列，包括内源Cλ2-Jλ4-Cλ4基因区段、小鼠增强子2.4序列和增强子2.4下游(3')的另外的小鼠基因组序列)(图4A)。
以类似的方式，12/1-κ靶向载体(图4B)使用相同的约124人λ片段，除了使用包含小鼠κ序列的小鼠同源臂，以便可通过同源重组实现对内源κ基因座的靶向外。因此，12/1-κ靶向载体从5'至3'包括，5'同源臂(包含内源κ基因座5'端的约23 kb的小鼠基因组序列)、I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约124 kb的人基因组λ序列(包含前12个连续的hVλ基因区段和hJλ1基因区段)、PI-SceI位点和3'同源臂(包含约28 kb的小鼠基因组序列，包括内源小鼠Cκ基因、Eκi和Eκ3'以及Eκ3'下游(3')的另外的小鼠基因组序列)(图4B,12/1-κ靶向载体)。
与这两个初始靶向载体之一的同源重组产生了修饰的小鼠轻链基因座(κ或λ)，其包含有效地连接至内源小鼠轻链恒定基因和增强子(Cκ或Cλ2以及Eκi/Eκ3'或Enh 2.4/Enh 3.1)基因的12个hVλ基因区段和hJλ1基因区段，所述基因座在重组后导致嵌合λ轻链的形成。
具有12个人Vλ和4个人Jλ基因区段的人λ微小基因座。在将多样性添加至嵌合λ轻链基因座的另一个方法中，将第三初始靶向载体工程化，以将来自A簇的前12个连续的人Vλ基因区段和hJλ1、2、3和7基因区段插入小鼠κ轻链基因座(图4B,12/4-κ靶向载体)。通过从头DNA合成(Integrated DNA Technologies)产生包含hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的DNA区段，其包含每一个Jλ基因区段和来自每一个Jλ基因区段的紧邻5'和3'区域的约100 bp的人基因组序列。将PI-SceI位点工程化至该约1 kb DNA片段的3'末端，并且连接至氯霉素盒。从相对于人BAC克隆729g4的hJλ1基因区段在5'和3'位置上的人λ序列PCR扩增同源臂。在修饰的729g4 BAC克隆上进行利用该中间靶向载体的同源重组，所述修饰的729g4 BAC克隆先前已利用侧翼连接有Frt位点的新霉素盒靶向人Vλ3-12基因区段的上游(5')，其还在5'Frt位点的5'端包含I-CeuI位点。双靶向的729g4 BAC克隆从5'至3'包含I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约123 kb的片段(包含前12个hVλ基因区段)、约1 kb的片段(包含人Jλ1、2、3和7基因区段)、PI-SceI位点和氯霉素盒。用I-CeuI和PI-SceI一起降解该中间靶向载体，随后将其连接入修饰的小鼠BAC克隆(上文中描述的)以产生第三靶向载体。
该连接导致用于将人λ序列插入内源κ轻链基因座的第三靶向载体，所述第三靶向载体从5'至3'包括，5'小鼠同源臂(包含内源小鼠κ基因座5'端的约23 kb的基因组序列)、I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约123 kb片段(包含前12个hVλ基因区段)、约1 kb的片段(包含hJλ1、2、3和7基因区段)、PI-SceI位点和3'同源臂(包含约28 kb的小鼠基因组序列，包括内源小鼠Cκ基因、Eκi和Eκ3'以及Eκ3'下游(3')的另外的小鼠基因组序列(图4B,12/4-κ靶向载体)。利用该第三靶向载体的同源重组产生包含有效地连接至内源小鼠Cκ基因的12个hVλ基因区段和4个hJλ基因区段的修饰的小鼠κ轻链基因座，所述基因座在重组后导致嵌合人λ/小鼠κ轻链的形成。
具有整合的人κ轻链序列的人λ微小基因座。以类似的方式将两个另外的靶向载体(与经工程化用于产生人λ基因区段至内源κ轻链基因座中的初始插入的那些靶向载体(图4B,12/1-κ和12/4-κ靶向载体)相似)工程化，以通过使用独特地构建的靶向载体(包含连续的人λ和κ基因组序列)逐步地插入人λ轻链基因区段。此类靶向载体被构建来包括天然地位于人Vκ4-1与Jκ1基因区段之间的约23 kb人κ基因组序列。将该人κ基因组序列特别地置于这两个另外的靶向载体中的人Vλ与人Jλ基因区段之间(图4B,12(κ)1-κ和12(κ)4-κ靶向载体)。
使用上述修饰的RP11-729g4 BAC克隆产生包含人κ基因组序列的两个靶向载体(图6)。利用侧翼连接有NotI和AsiSI限制位点的壮观霉素选择盒靶向该修饰的BAC克隆(图6,左上)。利用壮观霉素盒的同源重组导致双靶向的729g4 BAC克隆，所述克隆从5'至3'包括，I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、约123 kb片段(包含前12个hVλ基因区段)、位于hVλ3-1基因区段的九聚物序列下游(3')约200 bp的NotI位点、壮观霉素盒和AsiSI位点。将包含人κ序列的单独的人BAC克隆(CTD-2366j12)以独立的两次靶向在hVκ4-1与hJκ1基因区段之间的位置上的工程化限制位点，以允许随后克隆约23 kb的片段，用于与双靶向的修饰的729g4 BAC克隆中包含的hVλ基因区段连接(图6,上右)。
简而言之，2366j12 BAC克隆在大小上为约132 kb并且包含hVκ基因区段1-6、1-5、2-4、7-3、5-2、4-1、在Vκ基因区段下游的人κ基因组序列、hJκ基因区段1-5、hCκ和约20 kb的人κ基因座的另外的基因组序列。首先用靶向载体靶向该克隆，所述靶向载体包含侧翼连接有Frt位点的潮霉素盒和在3'Frt位点下游(3')的NotI位点。用于该靶向载体的同源臂包含BAC克隆内的Vκ基因区段的5'和3'端的人基因组序列，从而在用该靶向载体进行同源重组后，Vκ基因区段被缺失并且NotI位点被工程化在hVκ4-1基因区段下游约133 bp(图6,上右)。利用两个靶向载体在3'末端独立地靶向该修饰的2366j12 BAC克隆以用氯霉素盒使hJκ基因区段缺失，所述靶向载体还包含hJλ1基因区段、PI-SceI位点和AsiSI位点或包含4个hJλ基因区段的人λ基因组片段(同上)、PI-SceI位点和AsiSI位点(图6,右上)。这两个相似的靶向载体的同源臂包含hJκ基因区段的5'和3'端的序列。利用此类第二靶向载体和修饰的2366j12 BAC克隆的同源重组产生双靶向的2366j12克隆，其从5'至3'包括5'Frt位点、潮霉素盒、3'Frt位点、NotI位点、人κ基因座的22,800 bp基因组片段(包含Vκ4-1与Jκ1基因区段之间的基因间区域)、hJλ1基因区段或含有hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7的人λ基因组片段、PI-SceI位点和氯霉素盒(图6,右上)。使用双靶向的729g4和2366j12克隆通过两个连接步骤获得用于产生两个另外的修饰的两个最终的靶向载体。
利用NotI和AsiSI降解双靶向的729g4和2366j12克隆，从而分别产生包含新霉素盒和hVλ基因区段的一个片段，和包含人κ基因座的约23 kb基因组片段(包含在Vκ4-1与Jκ1基因区段之间的基因间区域)、hJλ1基因区段或包含hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的基因组片段、PI-SceI位点和氯霉素盒的另一个片段。这些片段的连接产生两个独特的BAC克隆，其从5'至3'分别包含hVλ基因区段、Vκ4-1与Jκ1基因区段之间的人κ基因组序列、hJλ1基因区段或包含hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的基因组片段、PI-SceI位和氯霉素盒(图6,下方)。随后用I-CeuI和PI-SceI降解这些新的BAC克隆以释放独特的片段(包含上游新霉素盒和连续的人λ及κ序列)，将其连接入修饰的小鼠BAC克隆302g12，所述克隆从5'至3'包含内源κ基因座5'端的小鼠基因组序列、I-CeuI位点、5'Frt位点、新霉素盒、3'Frt位点、hVλ基因区段(3-12至3-1)、Vλ3-1下游约200 bp的NotI位点、在人Vκ4-1与Jκ1基因区段之间天然发现的约23 kb的人κ序列、hJλ1基因区段或包含hJλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7基因区段的基因组片段、小鼠Eκi、小鼠Cκ基因和Eκ3'(图4,12hVλ-VκJκ-hJλ1和12hVλ-VκJκ-4hJλ靶向载体)。利用这两个靶向载体的同源重组产生了两个单独的修饰的小鼠κ轻链基因座，所述基因座包含与内源小鼠Cκ基因有效连接的12个hVλ基因区段、人κ基因组序列以及1个或4个hJλ基因区段，所述基因座在重组后导致嵌合人λ/小鼠κ轻链的形成。
实施例III
将另外的人Vλ基因区段工程化至人λ轻链微小基因座中
使用类似的靶向载体和方法将另外的hVλ基因区段独立地添加至实施例2中描述的每一个初始修饰中(图5A,+16-λ靶向载体和图5B,+16-κ靶向载体)。
16个额外的人Vλ基因区段的引入。用于构建靶向载体(用于将16个另外的hVλ基因区段添加至实施例2中描述的修饰的轻链基因座)的上游(5')同源臂包含内源κ或λ轻链基因座的5'端的小鼠基因组序列。3'同源臂与所有靶向载体一样，包含与实施例2中描述的修饰的人λ序列的5'末端重叠的人基因组序列。
简而言之，工程化两个靶向载体(图5A和5B,+16-λ或+16-κ靶向载体)以用于将16个额外的hVλ基因区段引入实施例2中描述的修饰的小鼠轻链基因座。工程化包含来自A簇的21个连续hVλ基因区段的来自人BAC克隆RP11-761l13(Invitrogen)的约172 kb DNA片段，以具有包含内源κ或λ轻链基因座的5'端的小鼠基因组序列的5'同源臂和包含人基因组λ序列的3'同源臂。此类靶向构建体中使用的5'小鼠κ或λ同源臂与实施例2中描述的5'同源臂相同(图5A和5B)。3'同源臂包括相应于实施例2中描述的人基因组λ序列的约123 kb片段的5'末端的等同物的人基因组λ序列的53,057 bp重叠。这两个靶向载体从5'至3'包括，5'小鼠同源臂(包含内源小鼠κ轻链基因座的5'端的约23 kb的基因组序列或内源λ轻链基因座的5'端的约24kb的小鼠基因组序列)、5'Frt位点、潮霉素盒、3'Frt位点和包含21个连续hVλ基因区段的171,457 bp的人基因组λ序列，该人基因组λ序列的约53 kb与实施例3中描述的人λ序列的5'末端重叠，且用作该靶向构建体的3'同源臂(图5A和5B,+16-λ或+16-κ靶向载体)。利用此类靶向载体的同源重组独立地产生修饰的小鼠κ和λ轻链基因座，其各自包含有效地连接至内源小鼠恒定基因(Cκ或Cλ2)的28个hVλ基因区段和hJλ1基因区段，所述基因座在重组后导致嵌合轻链的形成。
还以类似的方式将+16-κ靶向载体用于将16个另外的hVλ基因区段引入实施例2中描述的其它初始修饰，所述修饰整合了多个hJλ基因区段，且具有和不具有整合的人κ序列(图4B)。利用该靶向载体在包含其它初始修饰的内源小鼠κ基因座上进行的同源重组产生包含与内源小鼠Cκ基因有效连接的28个hVλ基因区段和hJλ1、2、3和7基因区段(具有和不具有人Vκ-Jκ基因组序列)的小鼠κ轻链基因座，所述基因座在重组后导致嵌合λ-κ轻链的形成。
12个另外的人Vλ基因区段的引入。使用相似的靶向载体和方法将另外的hVλ基因区段独立地添加至上文描述的每一个修饰中。与包含另外的hVλ基因区段的靶向载体的同源重组所产生的最终的基因座结构示于图7A和7B中。
简而言之，工程化靶向载体(图5A和5B,+12-λ或12-κ靶向载体)以将12个另外的hVλ基因区段引入上述修饰的小鼠κ和λ轻链基因座。工程化来自人BAC克隆RP11-22I18(Invitrogen)的包含12个连续的来自B簇的hVλ基因区段的93,674 bp DNA片段，以具有5'同源臂(包含内源小鼠κ或λ轻链基因座的5'端的小鼠基因组序列)和3'同源臂(包含人基因组λ序列)。用于该靶向构建体的5'同源臂与上述用于添加16个hVλ基因区段的5'同源臂相同(图5A和5B)。通过将PI-SceI位点工程化至来自BAC克隆RP11-761I13的人λ序列的27,468 bp基因组片段中包含的人Vλ3-29P基因区段的5'端约3431bp来产生3'同源臂。该PI-SceI位点用作连接点，以使用+16-λ或+16-κ靶向载体(图5A和5B)将另外的约94 kb人λ序列的片段连接至约27 kb人λ序列片段(其与先前的修饰中的人λ序列的5'末端重叠)。这两个靶向载体从5'至3'包括，5'同源臂(包含内源κ轻链基因座的5'端的约23 kb的小鼠基因组序列或内源λ轻链基因座的5'端的约24kb的小鼠基因组序列)、5'Frt位点,新霉素盒、3'Frt位点和121,188bp的包含16个hVλ基因区段和PI-SceI位点的人基因组λ序列，所述人基因组λ序列的约27 kb与获自16个另外的hVλ基因区段的插入的人λ序列的5'末端重叠，且用作该靶向构建体的3'同源臂(图5A和5B,+12-λ或12-κ靶向载体)。利用此类靶向载体的同源重组独立地产生修饰的小鼠κ和λ轻链基因座(其包含有效地连接至内源小鼠恒定基因(Cκ或Cλ2)的40个hVλ基因区段和人Jλ1)，所述基因座在重组后导致嵌合轻链的形成(图5A和5B的下方)。
还以类似的方式将+12-κ靶向载体用于将12个另外的hVλ基因区段引入其它初始修饰，所述初始修饰整合了多个hJλ基因区段，且具有和不具有整合的人κ序列(图4B)。利用该靶向载体在包含其它修饰的内源小鼠κ基因座上的进行同源重组产生小鼠κ轻链基因座，所述基因座包含有效地连接至内源小鼠Cκ基因的40个hVλ基因区段和hJλ1、2、3和7基因区段(具有和不具有人Vκ-Jκ基因组序列)，所述基因座在重组后，导致嵌合λ-κ轻链的形成。
实施例IV
具有人λ轻链基因区段的靶向的ES细胞的鉴定
按照上述实施例制备的靶向的BAC DNA被用于对小鼠ES细胞进行电穿孔，以产生修饰的ES细胞，所述细胞用于产生表达人λ轻链基因区段的嵌合小鼠。通过定量测定来鉴定包含未重排的人λ轻链基因区段的插入的ES细胞。针对人λ序列和相关选择盒的插入(等位基因的获得，GOA)、内源小鼠序列和任何选择盒的丢失(等位基因的丢失，LOA)以及侧翼小鼠序列的保留(等位基因保留，AR)，设计特异性引物组和探针。对于人λ序列的每一次额外插入，使用另外的引物组和探针来确认另外的人λ序列的存在，且使用先前的引物组和探针来确认先前靶向的人序列的保留。表1显示了用于定量PCR测定的引物和相关探针。表2显示了用于确认人λ轻链基因区段的每一个部分在ES细胞克隆中的插入的组合。
任选地用表达FLP的构建体转染具有人λ轻链基因区段的ES细胞，以除去通过插入包含人Vλ5-52-Vλ1-40基因区段的靶向构建体而引入的Frt'ed新霉素盒(图5A和5B)。新霉素盒可任选地通过与表达FLP重组酶的小鼠交配来除去(例如，US 6,774,279)。任选地，新霉素盒被保留在小鼠中。
表1
表2
实施例V
从内源轻链基因座表达人λ轻链的小鼠的产生
将上述靶向的ES细胞用作供体ES细胞并且通过法(参见，例如，美国专利7,294,754和Poueymirou等人(2007)FOgeneration mice that are essentially fully derived from thedonor gene-targeted ES cell allowing immediate phenotypicanalyses Nature Biotech.25(1):91-99)将其引入8细胞期小鼠胚胎。独立地具有人λ基因区段的(FO小鼠完全来源于供体ES细胞)通过使用检测独特的人λ基因区段(同上)的存在的等位基因测定的改进法(Valenzuela等人，同上)进行基因分型来鉴定。
具有人λ轻链基因区段的小鼠的κ:λ轻链使用。使用流式细胞术分析对于与单个hJλ基因区段一起的hVλ基因区段的3次连续插入的每一次插入(图5B)是纯合的小鼠和对于与单个hJλ基因区段或4个人Jλ基因区段(包括人Vκ-Jκ基因组序列)一起的hVλ基因区段的第一次插入(图4B)是纯合的小鼠的κ和λ轻链在脾细胞中的表达。
简而言之，从成组的小鼠(每组3至7只动物)收获脾，使用载玻片将其磨碎。在用ACK裂解缓冲液(Lonza Walkersville)裂解红细胞(RBC)后，用特异于小鼠CD19(克隆1D3；BD Biosciences)、小鼠CD3(17A2；Biolegend)、小鼠Igκ(187.1；BD Biosciences)和小鼠Igλ(RML-42；Biolegend)的缀合有荧光染料的抗体对脾细胞进行染色。使用BDTM LSR II流式细胞仪(BD Biosciences)获得数据，使用FLOWJOTM软件(Tree Star,Inc)分析数据。表3显示了在来自具有各个遗传修饰的成组动物的脾细胞中观察到的B细胞(CD19+)、κ轻链(CD19+Igκ+Igλ-)和λ轻链(CD19+Igκ-Igλ+)表达的平均百分数值。
在类似的实验中，使用流式细胞术(如上所述)分析脾室(spleniccompartment)的B细胞内容物的Igκ和Igλ表达，所述脾室来自对于有效地连接至小鼠Cκ基因的12个hVλ和4个hJλ基因区段(包括人Vκ-Jκ基因组序列)的第一次插入(图4B的下方)是纯合的小鼠和对于40个hVλ和1个hJλ基因区段(图5B的下方或图7B的上方)是纯合的小鼠。图8A显示来自各组的代表性小鼠的CD19+B细胞的Igλ和Igκ表达。还记录了每一只小鼠的CD19+B细胞数目/脾(图8B)。
在另一个实验中，使用不同细胞表面标记的流式细胞术，就通过B细胞发育的进展分析对于有效地连接至小鼠Cκ基因的40个hVλ和4个hJλ基因区段(包括人Vκ-Jκ基因组序列)(图7B的下方)是纯合的小鼠的脾室和骨髓室(bone marrow compartment)的B细胞内容物。
简而言之，将两组小鼠(每一组N＝3，9-12周龄，雄性和雌性)：野生型小鼠和对于有效地连接至小鼠Cκ基因的40个hVλ和4个hJλ基因区段(包括人Vκ-Jκ基因组序列)是纯合的小鼠处死，随后收获脾和骨髓。通过用完全RPMI培养基(补充有胎牛血清、丙酮酸钠、Hepes、2-巯基乙醇、非必需氨基酸和庆大霉素的RPMI培养基)冲洗从股骨收集骨髓。用ACK裂解缓冲液(Lonza Walkersville)裂解脾和骨髓制备物的RBC，随后用完全RPMI培养基进行洗涤。将1x106个细胞与抗-小鼠CD16/CD32(2.4G2,BD Biosciences)一起在冰上温育10分钟，然后用选择的抗体组进行标记，在冰上进行30分钟。
骨髓组：抗-小鼠FITC-CD43(1B11,BioLegend)、PE-ckit(2B8,BioLegend)、PeCy7-IgM(II/41,eBioscience)、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,BioLegend)、APC-B220(RA3-6B2,eBioscience)、APC-H7-CD19(ID3,BD)和Pacific Blue-CD3(17A2,BioLegend)。
骨髓和脾组：抗-小鼠FITC-Igκ(187.1,BD)、PE-Igλ(RML-42,BioLegend)、PeCy7-IgM(II/41,ebioscience)、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,BioLegend)、Pacific Blue-CD3(17A2,BioLegend)、APC-B220(RA3-6B2,eBioscience)、APC-H7-CD19(ID3,BD)。
染色后，洗涤细胞，将其在2％甲醛中进行固定。在FACSCANTOIITM流式细胞仪(BD Biosciences)上获取数据，用FLOWJOTM软件(Tree Star,Inc.)分析数据。图9A-9D显示来自各组的一只代表性小鼠的脾室的结果。图10A-10E显示来自各组的一只代表性小鼠的骨髓室的结果。表4显示了在来自具有不同遗传修饰的动物组的脾细胞中观察到的B细胞(CD19+)、κ轻链(CD19+Igκ+Igλ-)和λ轻链(CD19+Igκ-Igλ+)表达的平均百分数值。表5显示了在野生型小鼠和对于有效地连接至小鼠Cκ基因的40个hVλ和4个hJλ基因区段(包括人Vκ-Jκ基因组序列)是纯合的小鼠的骨髓中观察到的B细胞(CD19+)、成熟B细胞(B220hiIgM+)、未成熟B细胞(B220intIgM+)、表达κ轻链的未成熟B细胞(B220intIgM+Igκ+)和表达λ轻链的未成熟B细胞(B220intIgM+Igλ+)的平均百分数值。用其它组的上述小鼠重复本实验，显示了相似的结果(数据未显示)。
表3
表4
表5
具有人λ轻链基因区段的小鼠的人Vλ基因使用。使用从脾细胞分离的RNA，通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，就人λ轻链基因使用，分析对于人λ序列的第一次插入(hVλ3-12-hVλ3-1和hJλ1,图5B)是纯合的以及对于人λ序列的第三次插入(hVλ5-52-hVλ3-1和hJλ1,图5B)是纯合的小鼠。
简而言之，收获脾，并在无菌一次性袋中用10 mL具有5％HI-FBS的RPMI-1640(Sigma)灌注脾。随后将每一个包含单个脾的袋子置于STOMACHERTM(Seward)中，并在培养基中匀浆30秒。使用0.7μm细胞滤过器过滤匀浆的脾，随后通过离心(1000 rpm，10分钟)进行沉淀，并且在BD PHARM LYSETM(BD Biosciences)中裂解RBC 3分钟。脾细胞用RPMI-1640稀释，再次离心，随后于1 mL PBS(Irvine Scientific)中重悬浮。使用本领域已知的标准技术从沉淀的脾细胞分离RNA。
使用特异于人hVλ基因区段和小鼠Cκ基因的引物(表6)对脾细胞RNA进行RT-PCR。将PCR产物凝胶纯化，并克隆入pCR2.1-TOPO TA载体(Invitrogen)，然后用位于载体内的在侧翼连接克隆位点的位置上的引物M13正向(GTAAAACGAC GGCCAG；SEQ ID NO:55)和M13反向(CAGGAAACAG CTATGAC；SEQ ID NO:56)进行测序。对来源于人λ序列的第一次和第三次插入的84个克隆进行测序，以测定hVλ基因的使用(表7)。所选择的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ1-mCκ连接的核苷酸序列示于图11中。
以类似的方式，使用从脾细胞分离的RNA，通过RT-PCR就人λ轻链基因使用，分析对于有效地连接至内源小鼠Cκ基因的人λ轻链基因序列的第三次插入(即40个hVλ基因区段和4个hJλ基因区段，包括人Vκ-Jκ基因组序列，图7B的下方)是纯合的小鼠(如上文所述)。26个选择的RT-PCR克隆的人λ轻链基因区段的使用示于表8中。选择的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ-mCκ连接的核苷酸序列示于图12中。
以类似的方式，使用从脾细胞分离的RNA，通过RT-PCR就人λ轻链基因使用，分析对于有效地连接至内源小鼠Cλ2基因的人λ轻链基因区段的第一次插入(12个hVλ基因区段和hJλ1,图4A及图5A)是纯合的小鼠(如上文所述)。将特异于hVλ基因区段的引物(表6)与特异于小鼠Cλ2基因的两个引物之一(Cλ2-1(SEQ ID NO:104)或Cλ2-2(SEQ ID NO:105))配对。
从在内源小鼠λ轻链基因座上具有人λ轻链基因区段的小鼠的RT-PCR克隆观察到，多个hVλ基因区段重排至hλ1。选择的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ-mCλ2连接的核苷酸序列示于图13中。
表6
              表7                                          表8
图11显示了，来自具有与单个hJλ基因区段一起的hVλ基因区段的第一次和第三次插入的小鼠的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ1-mCκ连接的序列。图11中显示的序列说明，牵涉不同的hVλ基因区段的独特重排，且hJλ1重组至小鼠Cκ基因。具有单个包含12个hVλ基因区段和hJλ1的修饰的内源κ基因座的杂合小鼠和具有两个包含40个hVλ基因区段和hJλ1的修饰的内源κ基因座的纯合小鼠都能产生有效地连接至小鼠Cκ基因的人λ基因区段和产生表达人λ轻链的B细胞。这些重排显示，嵌合基因座能够在此类小鼠的多个独立的B细胞中独立地重排人λ基因区段。此外，对内源κ轻链基因座的此类修饰并未使任何hVλ基因区段不能操作或阻止嵌合基因座在B细胞发育过程中重组多个hVλ和hJλ(Jλ1)基因区段，如通过观察到16个不同hVλ基因区段与hJλ1重排(表7)所证明的。此外，此类小鼠产生功能性抗体，所述抗体包含有效地连接至小鼠Cκ基因的重排的人Vλ-Jλ基因区段(作为内源免疫球蛋白轻链库的部分)。
图12显示，从对于40个hVλ和4个hJλ基因区段(包括人Vκ-Jκ基因组序列)是纯合的小鼠选择的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ-mCκ连接的序列。图12中显示的序列说明另外的独特重排，所述重排牵涉多个不同的hVλ基因区段(横跨整个嵌合基因座)，且多个不同的hJλ基因区段重排并且有效地连接至小鼠Cκ基因。具有包含40个hVλ和4个hJλ基因区段的修饰的内源κ基因座的纯合小鼠也能够产生有效地连接至小鼠Cκ基因的人λ基因区段和产生表达人λ轻链的B细胞。此类重排还显示，所有时期的嵌合基因座都能够在小鼠的多个独立的B细胞中独立地重排人λ基因区段。此外，对内源κ轻链基因座的此类其它修饰显示，人λ基因区段的每一次插入并未使任何hVλ和/或Jλ基因区段不能操作或阻止嵌合基因座在B细胞发育过程中重组hVλ和Jλ基因区段，如通过在26个选择的RT-PCR克隆中观察到12个不同hVλ基因区段与所有4个hJλ基因区段重排(表8)所证明的。此外，此类小鼠同样也产生功能性抗体，所述抗体包含有效地连接至小鼠Cκ区的人Vλ-Jλ基因区段(作为内源免疫球蛋白轻链库的部分)。
图13显示了来自对于12个hVλ基因区段和hJλ1是纯合的小鼠的3个单独的RT-PCR克隆的hVλ-hJλ-mCλ2连接的序列。图13中显示的序列说明另外的独特重排，所述重排牵涉不同的hVλ基因区段(横跨第一插入的长度)，且hJλ1重排并且有效地连接至小鼠Cλ2基因(2D1＝Vλ2-8Jλ1；2D9＝Vλ3-10Jλ1；3E15＝Vλ3-1Jλ1)。一个克隆显示，因hVλ-hJλ连接上的N添加而导致的非生产性重排(2D1,图13)。这在V(D)J组合中并不少见，因为已显示，重组过程中基因区段的连接是不精确的。虽然该克隆代表存在于此类小鼠的轻链库中的非生产性重组体，但这显示了，促成抗体基因之间的连接多样性的遗传机制在此类小鼠中正常地运作并且导致具有更大多样性的包含轻链的抗体库。
具有包含12个hVλ基因区段和hJλ1的修饰的内源λ基因座的纯合小鼠也能够产生有效地连接至内源小鼠Cλ基因的人λ基因区段和产生表达包含连接至小鼠Cλ区的hVλ区的反向嵌合λ轻链的B细胞。此类重排还显示，置于其它轻链基因座(即，λ基因座)上的人λ轻链基因区段能够在此类小鼠的多个独立的B细胞中独立地重排人λ基因区段。此外，对内源λ轻链基因座的修饰显示，人λ基因区段的插入并未使任何hVλ和/或hJλ1基因区段不可操作或阻止嵌合基因座在B细胞发育过程中重组hVλ和hJλ1基因区段。此外，此类小鼠也产生功能性抗体，所述抗体包含有效地连接至小鼠Cλ区的人Vλ-Jλ基因区段(作为内源免疫球蛋白轻链库的部分)。
如本实施例中所示，在内源κ和λ轻链基因座上具有人λ轻链基因区段的小鼠能够重排人λ轻链基因区段和在小鼠Cκ和/或Cλ区的背景中表达它们(作为小鼠的正常抗体库的部分)，因为在脾和骨髓中在B细胞发育的不同检查点上都需要功能性轻链。此外，与野生型同窝出生仔相比较，此类小鼠中的B细胞的早期亚组(例如，前B细胞、祖B细胞和过渡B细胞)显示正常的表型(图9D、10A和10B)。观察到骨髓和外周B细胞群体中的小缺陷，这可归因于自体反应性未成熟B细胞的亚组的缺失和/或人λ轻链与小鼠重链的亚最佳缔合。然而，此类小鼠中观察到的Igκ/Igλ使用显示了这样的情形：其与小鼠中观察到的相比，更接近人轻链表达。
实施例VI
从内源轻链基因座表达人λ轻链的小鼠的培育
为了优化内源小鼠轻链基因座上的人λ基因区段的使用，将具有未重排的人λ基因区段的小鼠与在相对的内源轻链基因座(κ或λ)中包含缺失的另一种小鼠交配。例如，位于内源κ基因座上的人λ基因区段可以是存在于还在内源λ轻链基因座中具有缺失的小鼠中的唯一功能性轻链基因区段。这样，所获得的后代仅表达人λ轻链，如在上述实施例中描述的。通过本领域公认的标准技术或通过商业公司例如The Jackson Laboratory来进行育种。就独特的反向-嵌合(人-小鼠)λ轻链的存在和内源小鼠λ轻链的不存在，筛选在内源κ基因座上具有人λ轻链基因区段并且具有内源λ轻链基因座的缺失的小鼠品系。
还将具有未重排的人λ轻链基因座的小鼠与包含利用人重链可变基因基因座对内源小鼠重链可变基因基因座的替换的小鼠(参见US6,596,541,Regeneron Pharmaceuticals,基因工程小鼠)交配。小鼠包括，部分地，具有包含有效地连接至内源小鼠恒定区基因座的人重链可变区的基因组，以便所述小鼠响应抗原刺激产生包含人重链可变区和小鼠重链恒定区的抗体。可分离编码抗体重链可变区的DNA，将其有效地连接至编码人重链恒定区的DNA。随后可将DNA在能够表达完全人抗体重链的细胞中进行表达。在进行适当的育种方案后，获得这样的小鼠，其具有利用人重链基因座对内源小鼠重链基因座的替换和在内源κ轻链基因座上具有未重排的人λ轻链基因座。可在用目标抗原免疫后分离包含体细胞突变的人重链可变区和人λ轻链可变区的抗体。
实施例VII
从表达人重链和人λ轻链的小鼠产生抗体
在将包含未重排的人λ轻链基因座的小鼠与包含其它内源Ig基因座的修饰和缺失的各种期望的品系(如上文中所描述的)交配后，用目标抗原免疫所选择的小鼠。
一般而言，用抗原攻击包含单个重排的人种系轻链区之一的小鼠，从动物的血清回收淋巴细胞(例如B细胞)。可将淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生化杂交瘤细胞系，随后筛选和选择此类杂交瘤细胞系以鉴定产生特异于用于免疫的抗原的包含人重链和人λ轻链的抗体的杂交瘤细胞系。可分离编码重链和λ轻链的可变区的DNA，将其连接至期望的重链和轻链的同种型恒定区。由于存在额外的hVλ基因区段，因此与内源小鼠λ基因座相比较，轻链库的多样性急剧增加，并且在免疫后赋予抗原特异性库更高的多样性。随后可在细胞例如CHO细胞中产生所得的克隆的抗体序列。可者，可从抗原特异性淋巴细胞(例如，B细胞)直接分离编码抗原特异性嵌合抗体或轻链和重链的可变结构域的DNA。
最初，分离了具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。如上所述，就期望的特征包括亲和力、选择性、表位等表征和选择抗体。用期望的人恒定区替换小鼠恒定区以产生包含体细胞突变的人重链和来源于本发明的未重排的人λ轻链基因座的人λ轻链的完全人抗体。适当的人恒定区包括例如，野生型或经修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

Claims (25)

1.一种轻链等位基因，所述轻链等位基因包含与小鼠Cκ基因区段可操作地连接的、未重排的人λ免疫球蛋白轻链可变基因区段(hVλ)和人λ连接基因区段(hJλ)。
2.如权利要求1所述的轻链等位基因，其中，所述等位基因包含多个未重排的hVλ基因区段。
3.如权利要求2所述的轻链等位基因，其中，所述轻链等位基因包含：
(a)至少12个hVλ基因区段；或
(b)13至28个hVλ基因区段；
(c)28个或更多个hVλ基因区段。
4.如权利要求3所述的轻链等位基因，其中，所述hVλ基因区段包含：hVλ3-1、hVλ4-3、hVλ2-8、hVλ3-9、hVλ3-10、hVλ2-11和hVλ3-12。
5.如权利要求3所述的轻链等位基因，其中，所述hVλ基因区段包含：hVλ2-14、hVλ3-16、hVλ2-18、hVλ3-19、hVλ3-21、hVλ3-22、hVλ2-23、hVλ3-25和hVλ3-27。
6.如权利要求1所述的轻链等位基因，其中，所述人Jλ基因区段是hJλ1。
7.如权利要求1所述的轻链等位基因，其中，所述轻链等位基因包含四个未重排的hJλ基因区段。
8.如权利要求7所述的轻链等位基因，其中，所述四个未重排的hJλ基因区段是Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。
9.如权利要求1所述的轻链等位基因，其中，所述轻链等位基因包含：
(a)横跨hVλ3-12至hVλ3-1的人λ轻链基因座的连续序列；
(b)横跨hVλ3-27至hVλ3-1的人λ轻链基因座的连续序列；或
(c)横跨hVλ3-29至hVλ3-1的人λ轻链基因座的连续序列，以及横跨hVλ5-52至hVλ1-40的人λ轻链基因座的连续序列。
10.一种用于产生小鼠的方法，所述方法包括遗传修饰所述小鼠以使所述小鼠在其种系中包含如权利要求1-9中任一项所述的轻链等位基因。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述轻链等位基因位于所述小鼠种系的内源κ基因座上。
12.一种抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白是在如权利要求10或11所述方法产生的经遗传修饰的小鼠中生成的。
13.一种细胞，所述细胞包含如权利要求1-9中任一项所述的小鼠轻链等位基因。
14.一种生成分离的小鼠胚胎干细胞(ES)的方法，所述方法包含遗传修饰所述ES细胞以使其包含如权利要求1-9中任一项所述的轻链等位基因。
15.一种体细胞突变的抗体，所述抗体是在如权利要求10或11所述方法产生的经遗传修饰的小鼠中生成的。
16.一种编码重排的人λ轻链可变区的核酸，所述核酸是从如权利要求10或11所述方法产生的经遗传修饰的小鼠中分离。
17.一种分离的细胞，所述细胞来自如权利要求10或11所述方法产生的经遗传修饰的小鼠或者可从所述小鼠中获得。
18.如权利要求17所述的细胞，其中，所述细胞是B细胞。
19.一种编码重排的人λ轻链可变区的核酸，所述核酸是从权利要求18所述的细胞中分离。
20.一种杂交瘤，所述杂交瘤来自如权利要求10或11所述方法产生的经遗传修饰的小鼠或者可从所述小鼠中获得。
21.一种编码重排的人λ轻链可变区的核酸，所述核酸是从权利要求20所述的杂交瘤中分离。
22.使用如权利要求12所述的抗原结合蛋白在生产用作治疗剂的药物中的用途。
23.一种产生体细胞突变的抗体的方法，所述抗体与目标抗原结合，所述方法包括：
(a)将如权利要求10或11所述方法产生的经遗传修饰的小鼠暴露于目标抗原；
(b)从(a)的小鼠中获得一种或多种B淋巴细胞，其中，所述一种或多种B淋巴细胞产生与目标抗原结合的抗体；和
(c)鉴定编码(b)的抗体的免疫球蛋白轻链的核酸序列，其中，所述免疫球蛋白轻链包含人免疫球蛋白λ轻链可变结构域和小鼠免疫球蛋白恒定结构域；和
(d)使用具有人免疫球蛋白恒定区核酸序列的(c)的核酸序列来产生与目标抗原结合的人抗体。
24.一种如权利要求23所述的方法产生的体细胞突变的抗体。
25.使用如权利要求24所述的体细胞突变的抗体在生产用作治疗剂的药物中的用途。
CN201410535091.9A 2010-06-22 2011-06-22 杂交轻链小鼠 Active CN104404050B (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35731710P 2010-06-22 2010-06-22
US35731410P 2010-06-22 2010-06-22
US61/357,317 2010-06-22
US61/357,314 2010-06-22
CN201180038411.4A CN103068993B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 杂交轻链小鼠

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180038411.4A Division CN103068993B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 杂交轻链小鼠

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104404050A true CN104404050A (zh) 2015-03-11
CN104404050B CN104404050B (zh) 2018-06-08

Family

ID=44509861

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410535091.9A Active CN104404050B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 杂交轻链小鼠
CN201180038415.2A Active CN103068994B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 表达具有人λ可变区和小鼠恒定区的轻链的小鼠
CN201410538631.9A Active CN104342455B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 表达具有人λ可变区和小鼠恒定区的轻链的小鼠
CN201180038411.4A Active CN103068993B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 杂交轻链小鼠

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180038415.2A Active CN103068994B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 表达具有人λ可变区和小鼠恒定区的轻链的小鼠
CN201410538631.9A Active CN104342455B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 表达具有人λ可变区和小鼠恒定区的轻链的小鼠
CN201180038411.4A Active CN103068993B (zh) 2010-06-22 2011-06-22 杂交轻链小鼠

Country Status (30)

Country Link
US (22) US9012717B2 (zh)
EP (7) EP3205726A1 (zh)
JP (16) JP6009441B2 (zh)
KR (16) KR102001430B1 (zh)
CN (4) CN104404050B (zh)
AU (1) AU2011271046B2 (zh)
BR (3) BR112012032991B1 (zh)
CA (2) CA2804311C (zh)
CY (5) CY1117537T1 (zh)
DK (5) DK2480675T3 (zh)
ES (5) ES2646052T3 (zh)
HR (5) HRP20160794T1 (zh)
HU (5) HUE036597T2 (zh)
IL (12) IL313063A (zh)
LT (4) LT2568049T (zh)
ME (5) ME03386B (zh)
MX (6) MX347318B (zh)
MY (6) MY195217A (zh)
NO (1) NO2905338T3 (zh)
NZ (6) NZ605758A (zh)
PL (5) PL3034608T3 (zh)
PT (5) PT2905338T (zh)
RS (5) RS55042B1 (zh)
RU (3) RU2590594C2 (zh)
SG (4) SG186391A1 (zh)
SI (5) SI2568049T1 (zh)
SM (5) SMT201900241T1 (zh)
TR (1) TR201905992T4 (zh)
WO (2) WO2011163314A1 (zh)
ZA (5) ZA201300063B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107438622A (zh) * 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物

Families Citing this family (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PL2346994T3 (pl) 2008-09-30 2022-04-19 Ablexis, Llc Myszy knock-in do wytwarzania chimerycznych przeciwciał
US20110314563A1 (en) 2008-12-18 2011-12-22 Kingdon Craig R Antibody production
US9445581B2 (en) 2012-03-28 2016-09-20 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
DK2564695T3 (en) 2009-07-08 2015-05-26 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
PL2505654T5 (pl) 2010-02-08 2020-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mysz ze wspólnym łańcuchem lekkim
US20130045492A1 (en) 2010-02-08 2013-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain
US9796788B2 (en) 2010-02-08 2017-10-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire
PL2553100T3 (pl) 2010-03-31 2018-03-30 Ablexis, Llc Inżynieria genetyczna zwierząt nie będących ludźmi w celu wytworzenia przeciwciał chimerycznych
WO2011163314A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hybrid light chain mice
US10662256B2 (en) 2010-07-26 2020-05-26 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10793829B2 (en) 2010-07-26 2020-10-06 Trianni, Inc. Transgenic mammals and methods of use thereof
US10881084B2 (en) 2010-07-26 2021-01-05 Trianni, Inc Transgenic animals and methods of use
NZ707327A (en) 2010-08-02 2017-01-27 Regeneron Pharma Mice that make binding proteins comprising vl domains
WO2013022782A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized universal light chain mice
EP2758534B1 (en) 2011-09-19 2020-04-29 Kymab Limited Animals, repertoires & methods for the production of human antibodies
AU2012311286B2 (en) 2011-09-19 2018-07-26 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
WO2013045916A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Kymab Limited Chimaeric surrogate light chains (slc) comprising human vpreb
US9253965B2 (en) 2012-03-28 2016-02-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
KR102038974B1 (ko) * 2011-12-20 2019-10-31 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 경쇄 마우스
MX355944B (es) 2012-03-16 2018-05-07 Regeneron Pharma Animales no humanos que expresan secuencias de inmunoglobulina sensibles al ph.
US20140013456A1 (en) 2012-03-16 2014-01-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Histidine Engineered Light Chain Antibodies and Genetically Modified Non-Human Animals for Generating the Same
DK2883449T3 (en) 2012-03-16 2018-04-23 Regeneron Pharma Histidine engineered light chain antibodies and genetically modified rodents to generate them
MY173376A (en) 2012-03-16 2020-01-21 Regeneron Pharma Mice that produce antigen?binding proteins with ph?dependent binding characteristics
EP2831245A1 (en) 2012-03-28 2015-02-04 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class - switched, fully human, antibodies
GB2502127A (en) 2012-05-17 2013-11-20 Kymab Ltd Multivalent antibodies and in vivo methods for their production
US10251377B2 (en) 2012-03-28 2019-04-09 Kymab Limited Transgenic non-human vertebrate for the expression of class-switched, fully human, antibodies
DK2840892T3 (en) 2013-02-20 2018-07-23 Regeneron Pharma Non-human animals with modified heavy chain immunoglobulin sequences
HRP20230490T1 (hr) * 2013-03-13 2023-08-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miševi koji izražavaju ograničeni repertoar lakog lanca imunoglobulina
PL2967012T3 (pl) 2013-03-14 2021-04-19 Erasmus University Medical Center Rotterdam Transgeniczne ssaki inne niż człowiek do wytwarzania przeciwciał
US9788534B2 (en) 2013-03-18 2017-10-17 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US9783618B2 (en) 2013-05-01 2017-10-10 Kymab Limited Manipulation of immunoglobulin gene diversity and multi-antibody therapeutics
US9783593B2 (en) 2013-05-02 2017-10-10 Kymab Limited Antibodies, variable domains and chains tailored for human use
US11707056B2 (en) * 2013-05-02 2023-07-25 Kymab Limited Animals, repertoires and methods
HUE044747T2 (hu) * 2013-09-18 2019-11-28 Regeneron Pharma Hisztidinmódosított könnyûláncú antitestek és genetikailag módosított nem humán állati élõlények ugyanennek az elõállítására
CA2925723A1 (en) 2013-10-01 2015-04-09 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
US20170101460A1 (en) * 2014-01-10 2017-04-13 Allermabs Co. Ltd. Transgenic animals capable of producing humanized ige at much higher levels than mouse ige
KR102846903B1 (ko) 2014-03-21 2025-08-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
US20150266976A1 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics
PT3151921T (pt) 2014-06-06 2019-11-21 Bristol Myers Squibb Co Anticorpos contra recetor do fator de necrose tumoral induzido por glicocorticoide e utilizações dos mesmos
KR20170083534A (ko) 2014-09-19 2017-07-18 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 키메라 항원 수용체
SG11201702606TA (en) 2014-10-03 2017-04-27 Massachusetts Inst Technology Antibodies that bind ebola glycoprotein and uses thereof
DK3221363T3 (da) 2014-11-21 2020-08-10 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer mod cd73 og anvendelser deraf
EP3945096A1 (en) 2014-12-19 2022-02-02 Regenesance B.V. Antibodies that bind human c6 and uses thereof
MA40662B1 (fr) 2014-12-23 2020-12-31 Bristol Myers Squibb Co Anticorps contre tigit
ES2721775T3 (es) 2015-02-05 2019-08-05 Basf Se Central solar con un primer circuito de portador de calor y un segundo circuito de portador de calor
DK3303396T5 (da) 2015-05-29 2024-10-07 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer mod ox40 og anvendelser deraf
KR20180021833A (ko) 2015-06-29 2018-03-05 더 락커펠러 유니버시티 증진된 효능제 활성을 갖는 cd40에 대한 항체
CN105274116B (zh) * 2015-10-21 2020-09-29 重庆金迈博生物科技有限公司 一种制备人源化抗体的核酸分子及其应用
CN108738324B (zh) 2015-11-19 2022-06-21 百时美施贵宝公司 抗糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(gitr)抗体及其用途
US10813346B2 (en) 2015-12-03 2020-10-27 Trianni, Inc. Enhanced immunoglobulin diversity
IL260743B2 (en) 2016-02-04 2024-03-01 Trianni Inc Advanced production of antibodies
IL295230A (en) 2016-03-04 2022-10-01 Bristol Myers Squibb Co Combination therapy with anti-cd73 antibodies
US10894835B2 (en) 2016-03-04 2021-01-19 The Rockefeller University Antibodies to CD40 with enhanced agonist activity
BR112018072211A2 (pt) 2016-05-09 2019-02-12 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos anti tl1a e utilizações dos mesmos
CN113831407B (zh) 2016-05-20 2024-06-11 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
AU2017272337C1 (en) 2016-06-03 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing exogenous terminal deoxynucleotidyltransferase
WO2017214089A1 (en) * 2016-06-06 2017-12-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals expressing antibodies with human lambda light chains
US20170371963A1 (en) * 2016-06-27 2017-12-28 Facebook, Inc. Systems and methods for identifying matching content
BR112019000431A2 (pt) 2016-07-14 2019-07-09 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos contra tim3 e usos dos mesmos
WO2018044970A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 University Of Rochester Human monoclonal antibodies to human endogenous retrovirus k envelope (herv-k) and uses thereof
CU20210030A7 (es) 2016-10-13 2021-11-04 Massachusetts Inst Technology Anticuerpos que se unen a la proteína de envoltura del virus zika
US12063913B2 (en) 2016-10-31 2024-08-20 National University Corporation Tottori University Human antibody-producing non-human animal and method for preparing human antibodies using same
RS66884B1 (sr) * 2016-11-04 2025-07-31 Regeneron Pharma Ne-humane životinje koje imaju konstruisani lokus imunoglobulinskog lambda lakog lanca
WO2018151821A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to alpha-synuclein and uses thereof
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
PT3720279T (pt) 2017-12-05 2022-10-06 Regeneron Pharma Ratinhos tendo uma cadeia leve lambda de imunoglobulina manipulada e seus usos
US12129297B2 (en) 2018-01-12 2024-10-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against TIM3 and uses thereof
US11242393B2 (en) 2018-03-23 2022-02-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against MICA and/or MICB and uses thereof
DK3772927T3 (da) 2018-03-24 2025-02-17 Regeneron Pharma Genetisk modificerede mus eller rotter til generering af terapeutiske antistoffer mod peptid¿MHC-komplekser, fremgangsmåde til fremstilling og anvendelser deraf
KR20250121150A (ko) 2018-03-26 2025-08-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제를 시험하기 위한 인간화된 설치류
AU2019282671B2 (en) 2018-06-08 2021-05-06 Crystal Bioscience Inc. Transgenic animal for producing diversified antibodies that have the same light chain i
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses
CN112969929B (zh) 2018-10-26 2024-06-21 日本汽车能源株式会社 电池控制装置
JP7520003B2 (ja) 2018-11-16 2024-07-22 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー 抗ｎｋｇ２ａ抗体およびその使用
AU2020210635B2 (en) 2019-01-22 2024-12-12 Bristol Myers Squibb Company Antibodies against IL-7R alpha subunit and uses thereof
SG11202107589PA (en) 2019-02-22 2021-08-30 Regeneron Pharma Rodents having genetically modified sodium channels and methods of use thereof
AU2020289554A1 (en) 2019-06-05 2021-11-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a limited lambda light chain repertoire expressed from the kappa locus and uses thereof
DK3993623T3 (da) * 2019-07-01 2025-05-26 Zoetis Services Llc Transgene gnavere og fremgangsmåder til anvendelse deraf
IL293330A (en) 2019-12-02 2022-07-01 Regeneron Pharma mhc ii peptide protein structures and uses thereof
WO2021231732A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp
WO2021261620A1 (ko) * 2020-06-25 2021-12-30 주식회사 휴맵 이형접합성 형질전환 동물
IL301137A (en) 2020-09-11 2023-05-01 Regeneron Pharma Identification and production of antigen-specific antibodies
KR20230147048A (ko) 2020-12-16 2023-10-20 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 Fc 알파 수용체를 발현하는 마우스
CA3197426A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for obtaining antibodies that bind transmembrane proteins and cells that produce the same
US20240317849A1 (en) 2020-12-23 2024-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding anchor modified antibodies and uses thereof
WO2023199655A1 (ja) 2022-04-13 2023-10-19 日本精工株式会社 軸受装置の状態の検出方法、検出装置、およびプログラム
USD999969S1 (en) * 2022-04-29 2023-09-26 Shenzhen Intellirocks Tech. Co., Ltd. Lamp
EP4658687A1 (en) 2023-01-31 2025-12-10 University of Rochester Immune checkpoint blockade therapy for treating staphylococcus aureus infections
KR20260007566A (ko) 2023-05-04 2026-01-14 노바센타, 인크. 항-cd161 항체 및 이의 사용 방법
WO2025184208A1 (en) 2024-02-27 2025-09-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026373A1 (en) * 1998-11-03 2000-05-11 Babraham Institute MURINE EXPRESSION OF HUMAN Igμ LOCUS
WO2008054606A2 (en) * 2006-10-02 2008-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human il-4 receptor
WO2009143472A2 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Method of generating single vl domain antibodies in transgenic animals

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US7041871B1 (en) * 1995-10-10 2006-05-09 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) * 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE269401T1 (de) 1991-04-10 2004-07-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
CA2078539C (en) * 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
US6632976B1 (en) 1995-08-29 2003-10-14 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric mice that are produced by microcell mediated chromosome transfer and that retain a human antibody gene
CA2273194C (en) * 1996-12-03 2011-02-01 Abgenix, Inc. Transgenic mammals having human ig loci including plural vh and vk regions and antibodies produced therefrom
US6774279B2 (en) 1997-05-30 2004-08-10 Carnegie Institution Of Washington Use of FLP recombinase in mice
CN101498731A (zh) * 2000-05-18 2009-08-05 日本烟草产业株式会社 抗协同刺激信号转导分子ailim的人单克隆抗体及其药物用途
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1916303B1 (en) * 2000-11-30 2013-02-27 Medarex, Inc. Nucleic acids encoding rearranged human immunoglobulin sequences from transgenic transchromosomal mice
GB0031284D0 (en) * 2000-12-21 2001-01-31 Ks Biomedix Ltd High affinity antibodies
EP1970448A1 (en) * 2001-05-11 2008-09-17 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Human artificial chromosome containting human antibody lambda light chain and non-human animal containting the human artificial chromosome capable of genetic transmission
GB0115256D0 (en) * 2001-06-21 2001-08-15 Babraham Inst Mouse light chain locus
DK1461442T3 (en) * 2001-11-30 2017-12-04 Amgen Fremont Inc Transgenic animals with human Ig lambda light chain genes
US20030217171A1 (en) 2002-05-17 2003-11-20 Von Stuermer Wolfgang R. Self-replicating and self-installing software apparatus
MXPA06000562A (es) * 2003-07-15 2006-03-30 Therapeutic Human Polyclonals Loci de inmunoglobulina humanizada.
CN1605628A (zh) * 2003-09-03 2005-04-13 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 Cho细胞生产的人源抗甲肝病毒基因工程抗体
ES2344793T3 (es) * 2004-08-05 2010-09-07 Genentech, Inc. Antagonistas anti-cmet humanizados.
DK1802193T3 (da) 2004-10-19 2014-06-10 Regeneron Pharma Fremgangsmåde til frembringelse af en homozygot mus til genetisk modifikation
ATE499385T1 (de) * 2004-12-29 2011-03-15 Yuhan Corp Tumornekrosefaktor-alpha spezifische humanisierte antikörper
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
JP2010501165A (ja) * 2006-08-22 2010-01-21 ジーツー インフラメイション プロプライエタリー リミテッド 抗体の作製方法
US7864492B2 (en) 2006-10-31 2011-01-04 Siemens Industry, Inc. Systems and methods for arc fault detection
DE102007045897A1 (de) 2007-09-26 2009-04-09 Carl Zeiss Microimaging Gmbh Verfahren zur mikroskopischen dreidimensionalen Abbildung einer Probe
WO2009129247A2 (en) * 2008-04-14 2009-10-22 Innovative Targeting Solutions Inc. Sequence diversity generation in immunoglobulins
PL2346994T3 (pl) * 2008-09-30 2022-04-19 Ablexis, Llc Myszy knock-in do wytwarzania chimerycznych przeciwciał
US20110314563A1 (en) * 2008-12-18 2011-12-22 Kingdon Craig R Antibody production
DK2564695T3 (en) * 2009-07-08 2015-05-26 Kymab Ltd Animal models and therapeutic molecules
PL2505654T5 (pl) * 2010-02-08 2020-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mysz ze wspólnym łańcuchem lekkim
EP3366125A1 (en) 2010-06-17 2018-08-29 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
WO2011163314A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Hybrid light chain mice

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000026373A1 (en) * 1998-11-03 2000-05-11 Babraham Institute MURINE EXPRESSION OF HUMAN Igμ LOCUS
WO2008054606A2 (en) * 2006-10-02 2008-05-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High affinity human antibodies to human il-4 receptor
WO2009143472A2 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Method of generating single vl domain antibodies in transgenic animals

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREI V.POPOV,ET AL: "A human Immunoglobulin λ Locus Is Similarly Well Expressed in Mice and Humans", 《JOURNAL OF EXPERIMENTAL MEDICINE》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107438622A (zh) * 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物

Also Published As

Publication number Publication date
JP6341972B2 (ja) 2018-06-13
PT3034608T (pt) 2019-05-28
SMT201600229B (zh) 2016-08-31
CA2803864C (en) 2017-05-16
US9206262B2 (en) 2015-12-08
KR20190014578A (ko) 2019-02-12
JP2023133554A (ja) 2023-09-22
EP2905338B8 (en) 2018-01-24
ES2721749T3 (es) 2019-08-05
HK1168384A1 (zh) 2012-12-28
PL2480675T3 (pl) 2017-03-31
PT2568049T (pt) 2016-07-11
MY195214A (en) 2023-01-11
KR20200143511A (ko) 2020-12-23
MX336344B (es) 2016-01-15
RU2016119423A3 (zh) 2019-11-19
ES2570131T3 (es) 2016-05-17
ES2575223T3 (es) 2016-06-27
IL264634B (en) 2019-09-26
JP6243384B2 (ja) 2017-12-06
DK2568049T3 (en) 2016-08-01
ES2646052T3 (es) 2017-12-11
KR20190073584A (ko) 2019-06-26
IL223720A (en) 2017-05-29
EP3034608B1 (en) 2019-01-30
CN103068993A (zh) 2013-04-24
ES2576928T3 (es) 2016-07-12
IL313063A (en) 2024-07-01
US9150662B2 (en) 2015-10-06
HRP20160497T1 (hr) 2016-07-15
US9163092B2 (en) 2015-10-20
JP2013532974A (ja) 2013-08-22
JP2022066449A (ja) 2022-04-28
AU2011271043A9 (en) 2015-10-01
CN103068994B (zh) 2016-01-20
US20150246976A1 (en) 2015-09-03
MX2022002117A (es) 2022-03-17
SI2480675T1 (sl) 2016-08-31
RU2590594C2 (ru) 2016-07-10
MX348942B (es) 2017-07-04
SG186390A1 (en) 2013-01-30
US20140137275A1 (en) 2014-05-15
EP2568049B1 (en) 2016-04-13
CN103068994A (zh) 2013-04-24
JP2013531501A (ja) 2013-08-08
US20170258059A1 (en) 2017-09-14
US20150173331A1 (en) 2015-06-25
IL291301A (en) 2022-05-01
MX347322B (es) 2017-04-21
US9226484B2 (en) 2016-01-05
IL247386A (en) 2017-07-31
JP6009441B2 (ja) 2016-10-19
HRP20160794T1 (hr) 2016-08-12
HRP20160865T1 (hr) 2016-10-07
SI2905338T1 (sl) 2017-12-29
NZ605758A (en) 2014-08-29
KR102266097B1 (ko) 2021-06-18
PT2905338T (pt) 2017-11-10
HRP20171666T1 (hr) 2017-12-15
KR20190049932A (ko) 2019-05-09
WO2011163314A1 (en) 2011-12-29
DK2480675T3 (en) 2016-08-01
US9035128B2 (en) 2015-05-19
KR20210134424A (ko) 2021-11-09
ZA201300063B (en) 2014-09-25
IL255179B (en) 2018-06-28
EP2480676B1 (en) 2016-04-06
RS56589B1 (sr) 2018-02-28
IL244450A0 (en) 2016-04-21
MY194456A (en) 2022-11-30
SG10201504568YA (en) 2015-07-30
MY195217A (en) 2023-01-11
ME02444B (me) 2016-09-20
KR102118565B1 (ko) 2020-06-03
PT2480675T (pt) 2016-07-11
SI2568049T1 (sl) 2016-10-28
KR101970944B1 (ko) 2019-04-23
RU2601297C2 (ru) 2016-10-27
SMT201600213B (it) 2016-08-31
SI2480676T1 (sl) 2016-10-28
KR102001430B1 (ko) 2019-07-18
ME03386B (me) 2020-01-20
NZ627119A (en) 2015-05-29
DK3034608T3 (da) 2019-05-06
LT2905338T (lt) 2017-12-27
US20190153384A1 (en) 2019-05-23
KR102506001B1 (ko) 2023-03-07
JP2020128440A (ja) 2020-08-27
KR101945352B1 (ko) 2019-02-07
ZA201404600B (en) 2015-09-30
IL291301B2 (en) 2023-07-01
ME02442B (me) 2016-09-20
HUE036597T2 (hu) 2018-07-30
ZA201300062B (en) 2014-09-25
US20160057979A1 (en) 2016-03-03
LT2568049T (lt) 2016-10-10
NZ605751A (en) 2014-10-31
US9066502B2 (en) 2015-06-30
IL300712A (en) 2023-04-01
MX347318B (es) 2017-04-21
KR20130121814A (ko) 2013-11-06
BR112012033248A2 (pt) 2017-11-28
US9844212B2 (en) 2017-12-19
US20130326647A1 (en) 2013-12-05
KR101934852B1 (ko) 2019-01-04
EP2480675B1 (en) 2016-04-06
MX2012015300A (es) 2013-05-01
KR20200064166A (ko) 2020-06-05
CA2804311A1 (en) 2011-12-29
KR20220150430A (ko) 2022-11-10
AU2011271046A1 (en) 2013-01-31
US20240327785A1 (en) 2024-10-03
JP2016010415A (ja) 2016-01-21
RU2013102595A (ru) 2014-07-27
US9850462B2 (en) 2017-12-26
KR20210013376A (ko) 2021-02-03
MY195212A (en) 2023-01-11
CN104342455B (zh) 2017-05-31
US9334333B2 (en) 2016-05-10
AU2011271046B2 (en) 2015-10-01
EP3205726A1 (en) 2017-08-16
KR102059909B1 (ko) 2019-12-27
HUE029691T2 (en) 2017-03-28
TR201905992T4 (tr) 2019-05-21
NZ707200A (en) 2016-04-29
HUE029692T2 (en) 2017-03-28
JP2017012204A (ja) 2017-01-19
JP7236409B2 (ja) 2023-03-09
US20150173332A1 (en) 2015-06-25
JP2025027148A (ja) 2025-02-26
US20120070861A1 (en) 2012-03-22
ME02902B (me) 2018-04-20
US20200239837A1 (en) 2020-07-30
CY1117692T1 (el) 2017-05-17
IL300712B1 (en) 2024-07-01
SG10201504324UA (en) 2015-07-30
EP3034608A1 (en) 2016-06-22
KR102193823B1 (ko) 2020-12-22
MX2012015298A (es) 2013-05-01
US9206263B2 (en) 2015-12-08
KR102211911B1 (ko) 2021-02-05
BR122020013427B1 (pt) 2021-08-03
EP2905338B1 (en) 2017-08-02
HK1170766A1 (zh) 2013-03-08
IL269078A (en) 2019-11-28
JP2018023403A (ja) 2018-02-15
HUE030285T2 (en) 2017-05-29
IL259965B (en) 2019-02-28
US20150089680A1 (en) 2015-03-26
CY1122877T1 (el) 2021-05-05
RS54891B1 (sr) 2016-10-31
ZA201506598B (en) 2017-03-29
IL223719A (en) 2016-10-31
PL2568049T3 (pl) 2017-03-31
EP2905338A1 (en) 2015-08-12
KR20130027555A (ko) 2013-03-15
IL300712B2 (en) 2024-11-01
KR101991234B1 (ko) 2019-06-20
RU2724736C2 (ru) 2020-06-25
US10266803B2 (en) 2019-04-23
US20180064078A1 (en) 2018-03-08
BR112012032991A8 (pt) 2020-09-29
IL255179A0 (en) 2017-12-31
CN104342455A (zh) 2015-02-11
KR20230036157A (ko) 2023-03-14
US20190203171A1 (en) 2019-07-04
HRP20190807T1 (hr) 2019-08-23
AU2011271043A1 (en) 2013-01-31
JP2018201528A (ja) 2018-12-27
US20150246977A1 (en) 2015-09-03
US9399683B2 (en) 2016-07-26
KR20180135997A (ko) 2018-12-21
ZA201404601B (en) 2016-02-24
US9012717B2 (en) 2015-04-21
US9029628B2 (en) 2015-05-12
US20150176002A1 (en) 2015-06-25
NZ707198A (en) 2016-04-29
IL259965A (en) 2018-07-31
KR20180135996A (ko) 2018-12-21
KR101975884B1 (ko) 2019-05-10
LT3034608T (lt) 2019-05-27
JP2021061863A (ja) 2021-04-22
SMT201600212B (it) 2016-08-31
NO2905338T3 (zh) 2017-12-30
US20150351371A1 (en) 2015-12-10
US20130323790A1 (en) 2013-12-05
JP2017006152A (ja) 2017-01-12
CA2804311C (en) 2017-09-12
PL3034608T3 (pl) 2019-08-30
US9540452B2 (en) 2017-01-10
CY1117537T1 (el) 2017-04-26
JP6963542B2 (ja) 2021-11-10
IL244450A (en) 2017-11-30
US20160060359A1 (en) 2016-03-03
CA2803864A1 (en) 2011-12-29
US9394373B2 (en) 2016-07-19
US20170107484A1 (en) 2017-04-20
DK2480676T3 (en) 2016-06-20
JP6073441B2 (ja) 2017-02-01
IL269078B (en) 2021-05-31
IL282872B (en) 2022-04-01
JP2018201527A (ja) 2018-12-27
BR112012032991A2 (pt) 2015-10-06
EP2480675A1 (en) 2012-08-01
MY165287A (en) 2018-03-21
KR20190014576A (ko) 2019-02-12
RU2016119423A (ru) 2018-11-07
IL291301B1 (en) 2023-03-01
JP2020062061A (ja) 2020-04-23
LT2480675T (lt) 2016-10-10
SG186391A1 (en) 2013-01-30
KR102462042B1 (ko) 2022-11-03
PL2480676T3 (pl) 2016-10-31
JP5988969B2 (ja) 2016-09-07
CN104404050B (zh) 2018-06-08
HK1226766A1 (zh) 2017-10-06
EP2568049A1 (en) 2013-03-13
EP3456832A1 (en) 2019-03-20
RS55042B1 (sr) 2016-12-30
PT2480676E (pt) 2016-06-09
AU2011271043A8 (en) 2016-01-21
HUE044001T2 (hu) 2019-09-30
RS58736B1 (sr) 2019-06-28
DK2905338T3 (da) 2017-11-06
RU2013102596A (ru) 2014-07-27
CN103068993B (zh) 2016-01-06
US9006511B2 (en) 2015-04-14
US20150320023A1 (en) 2015-11-12
RS55037B1 (sr) 2016-12-30
BR112012032991B1 (pt) 2021-08-10
NZ626979A (en) 2015-05-29
KR102320944B1 (ko) 2021-11-04
SI3034608T1 (sl) 2019-06-28
US9206261B2 (en) 2015-12-08
PL2905338T3 (pl) 2018-01-31
HK1183321A1 (zh) 2013-12-20
SMT201700506T1 (it) 2018-01-11
IL282872A (en) 2021-06-30
EP2480676A1 (en) 2012-08-01
SMT201900241T1 (it) 2019-05-10
CY1119478T1 (el) 2018-03-07
ME02440B (me) 2016-09-20
US20120073004A1 (en) 2012-03-22
WO2011163311A1 (en) 2011-12-29
KR20190142436A (ko) 2019-12-26
CY1118126T1 (el) 2017-06-28
JP6545773B2 (ja) 2019-07-17
JP2019033765A (ja) 2019-03-07
JP2016010417A (ja) 2016-01-21
KR20210073609A (ko) 2021-06-18
MY157477A (en) 2016-06-15
AU2011271043B2 (en) 2015-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104342455B (zh) 表达具有人λ可变区和小鼠恒定区的轻链的小鼠
HK40010621A (zh) 表达免疫球蛋白杂交轻链的小鼠
HK1242732A1 (zh) 具有人类化的λ可变基因片段的小鼠

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant