PT98931B

PT98931B - Processo para a ligacao de nucleosidos com uma ponte siloxano

Info

Publication number: PT98931B
Application number: PT98931A
Authority: PT
Inventors: Alexander Ludvik Weis; Frederick Herman Hausheer; Ashis Kumar Saha
Original assignee: Sanofi Sa
Priority date: 1990-09-12
Filing date: 1991-09-11
Publication date: 1999-01-29
Also published as: HUT64555A; IE913213A1; FI931068A0; MY108078A; ATE116328T1; DE69106376D1; US5214134A; CA2091559A1; IL99451A; DE69106376T2; AU651289B2; NO930896D0; AU8533991A; FI931068A7; IE74706B1; KR0173997B1; MX9101039A; BR9106838A; IL99451A0; ES2067246T3

Description

A prsssnts invsnyáo ;··· Y a um

U é t Cd O d S 1 i q a y U C d S Π UZ 1 S ό 3 X d 03 C CC UOS p ΟΠ t S 3 X I OH SC O constituido peia reaccio de um nucle isi do 3 ·'' --..:0.'.:....adx: u nucleósido nao protegido, A prsssnts invenglo rs-í^:sre--se ainda a métodos para a síntese ds análogos de oligonucleótido oossuinao peio menos uma ponte internucleósido siloxano»

Os ácidos nuclsicos, ARN s ADN representam oligonucleótidos que ocorrem natural mente. Como aqui utiiiccdx o termo oligonucleótidos” signitica sequências ds homopolimeros ou hetsropolimeros de nucl eósi -::::os em que me nucleósidos são ligados com uma ponte de -fosíc~<i-éster„

Dev i d o aos avan ç os d a t seηo1 ogi a c ί .λ i m i c a -, o 3 o 1 i g o n u e 1 e ô t i d o s i n c 1 s i n d o -/1 c e n t s n a s d e

nucleósidos ou bases podem agora produzir-se sintéticamente.

01igonuc1eotids Synthesiss_A Pratica1 Aprroach, ed. by M»J»

Gait, IRL Press, Washington, D.C» (1984). Os oligonucleótidos sintéticos possuem importante utilidade científica e terapêutica» Os oligodesoxinucleótidos sintéticos, por exemplo, são muito utilizados no âmbito do ADN recombinante» . Gait, supra at 1» Nos' últimos anos, tem sido demonstrada que os ol i gonuc 1 e61 i d os s i n t é t i c os p ossu^m ef e i t os t er apêut i c ospotenciais como agentes anti-sentido,para inibir a expressão do gene. Uhlman, E» and Peyman, A», Chemical Revi ews, 90 (45 s 544-583 (1990).

agente anti-sentido-é um composto que se liga ou hibridiza uma sequência de nucleótido num ácido nucleíco alvo, ARN ou ADN, para inibir a função do referido ácido nucleíco alvo» Devido á sua capacidade para se hibridizar com o ARN e ADN, os agentes anti-sentido podem interferir com a expressão ds gene ao nível da transcrição, processamento ou translação de ARN»

Presentemente, contudo, o desenvolvimento de aplicações científicas e terapêuticas das tecnologias anti-sentido é dificultado por vários problemas técnicos. Ver por exemplo; Klausner, A., S1 ot echη o1 og y, 8:303™ -394 (1.990); Armstrong, L.» , Business week, 5 de Março, 1990. Tais problemas incluem (í) degradação por nucleases endógenas, (2) o custo elevado de produção, (3) a falta de sequência específica de hibridização par-a os ácidos nuclsícos alvo, (4) não uniformidade devida à presença de centros quirais de fósforo e (5) libertação inadequada para os alvos desejados, por· exemplo, devido a coeficientes não apropriados de solubilidade, transporte de membrana e rastreio celular.

Uma tentativa para preparar agentes anti-sentido que sejam estáveis, resistentes à nuclease, de produção não dispendiosa e que possam ser libertados e hibridizarem-se com os ácidos nucleícos alvos no copo é fazer a síntese de análogos de oligonucleótidos possuindo modificações nas pontes ou ligações internucleósido» Como aqui utilizada, a frase análogo de oligonuclsótido refere—ss a sequências de hamopal ímeras ou heterapal ímeros de nucleósidos ou seus análogos com ligações internucleósida não fosfα-di-éstar.

Em geral, t@m sido referidos dois tipos de análogos ds oligonucleótidos, 0 primeiro tipo inclui os que possuem ligações fosfato modificados» 0 segundo tipo inclui os análogos que possuem ligações internucleósido não fosfato, Uhlmann, E«, supra.

As 1i ga ç ões inter n uc1eΰ s i do n ão fosfato representativas incluem siloxano, carbamato, ésteres de carboxi-metilo, acetamidato, carbonato e tio-éteres» Uhlmann, supra.,

De importância particular para a presente invenção é a ligação ou ponte si3.oxa.no» Os dlmeros e hexameros nucleósidos possuindo ligações internucleósido siloxano e o método de síntese de tais polímeros foram referidos por Ogilvie e Cormier» Ver por exemplo,·Ogilvie, K.K» and Cormier, J»F» Tetrahedron Letters, 26(35)s4159-4162 (1985)5 Cormier J.F. and Ogi1 vie, K„K», Nuc1 ei c Acids Research, 16(10) s 4583-4594 (1988),,

De acordo com este método publicado, faz-se reagir um 5'-nucleósido protegido com um reagente sililante para formar um nucleósido 3'-sililsdo, nucleósido si li lado que depois se faz reagir com um nucleósido protegido para produzir um dinucleósido ligado com 3',5'-~silila completamente protegido, 0 dinucleósido ligado com sililo completamente protegido é depois desprotegido no seu terminal para efectuar a extensão da cadeia por intermédio de outro acoplamento com nucleósidos desprotegidos»

Determinados problemas estão associados com este método» Suando se utilisa este método para sintetizar polímeros nucleósido, o produto final desejado é produzido com rendimentos muito baixos que variam aproximadamente entre 35% e 46%. 0 baixo rendimento é atribuído à produção de produtos secundários não desejados, em particular, o 3',3^!-dímero simétrico, Uhlman, E» supra na pág» 553, resultante da auto conjugação de blocos de formação de nucleósido e a perda significativa de produto útil resultante •i

da desprotecção do polímero.

A presente invenção proporciona um método de ligação de nucleósidos com uma ponte siloxano ao mesmo tempo que elimina a formação do 3'«3'-dímero« Este método consiste na reacção de um nucleósido si li lado com um nucleósido não protegido na presença de um catalisador base obstruído. A utilização de' nucleósidos não protegidos quando comparada com o procedimento de Ogilvie and Cormier, possui a vantagem de aumentar o rendimento dos produtos finais desejados e a eficiência da síntese (reduzindo assim o custo)„

A forma de realização preferida da presente invenção, um catalisador base vantagem adi c i onal simétricos indesejã em que a reacção se efectua na presença de espacialmente obstruída, proporciona a de minimizar a formação de 3' ,3'--dímeros ei s.

De acordo com a presente invenção proporciona-se um método de ligação de nucleósidos com uma ponte siloxano que consiste na reacção de um 3'-si 1ilado™5 -nucleósido protegido com um nucleósido não protegido na presença de um catalisador base obstruído.

A ponte siloxano possui a fórmulas

}

- 0 - Si 0 - s

R em que cada um dos radicais R. representa independentemente alqui lo (Ct-Ce>>. Numa forma de realização preferida R representa meti1 o ou i sopropi1 o.

n uc1e ó s i d o s i1i1ad o e o nuc1eósido não protegido podem ser nucleósidos monométricos ou os nucleósidos terminais em 3'' e 5', respectivamente, de um oligonucleótido ou análogo de oligonucleótido. Os nucleósidos monométricos preferidos são timidina, N^-benzoi1desoxiadenosina, N^-benzoi1desoxi ci ti di na e N^s-isobuti1desoxi guanosina.

Ã r eac ção do 3' -s:i. 1 i 1 ado-5' 4 '3

-nucleósido protegido com um nucleósido não protegido efectua-se de preferência numa solução neutra ou alcalina aprótica. Numa forma de realização preferida a solução alcalina aprótica é oonsti tuida por 2,6-di-terc-buti1-4-meti1 pi ri di na numa mistura de acetonitrilo e dimeti If ormantida»

Num outro aspecto a presente invenção refere-se a um método de síntese de um análogo de oligonucleótido possuindo ligações internucleósido siloxano constituído pelos passos des

a) sililação de um 5'-nucleósido protegido com um reagente si 1 i 1 ante bifunci anal para formar um 3 ' -si 1 i 1 ado-5'nucleósi do protegi do;

b> reacção de um nucleósido si li lado com um nucleósido não protegido; e

c) repetição dos passos a) e b) para formar o referido análogo oligonucleótido.

Os reagentes de si lilação bifuncionais utilizados na presente invenção possuem a fórmula I

R

I

Si - R¹ s em que R representa, independentemente, alquiloe R^x representa um grupo removível. Numa forma de realização preferida, o agente de si lilação é simétrico e R representa isopropilo ou metilo e R'^J· representa um grupo removível tal como Cl ou SOaCFs.

5'nucleósido protegido e o nucleósido não protegido são independentemente ti midina, -benzoi 1 desox i adenosi na, N^-benzoi 1 desoxici ti di na e N'^a-i < t i1desox iguanosina.

De preferência os passos a1 o a1i na apró 11ca e efectuam-se numa

De solução iObU-

pref eri ve1men te, numa	so1uç ão c onst ituí d a	por 2,6-di	—terc—
-but i 1 -4“·-met i 1 p i r i d i na	numa mistura de	acetonitri	1 o
d i met i1f or mam i d a, ma i s	pref erivelmente numa	mistura Is 1	Cv	Zv)

d os r ef er- i d os sol ven t es

A presente invenção proporeiona ainda um método de -fase sólida de síntese de análogos de oligonucleótidos possuindo ligações internuoleósido siloxano constituído pelos passos des

a) ligação de um 5'-nucleósido protegido a um suporte sóiido;

b) despr-otecção do nucleósido ligado?

o) reacção do nucleósido desprotegido com um 3'---sililada~ -5'-nucleósido protegido na presença de um catalisadoralcali no e um solvente neutro ou alcalino aprótico?

d) terminação dos nucleósidos não reagidos?

e) repetição dos passos b) , c5 e d) até se -Formar um análogo de oligonucleótido de comprimento desejado? e

f) remoção do análogo de ol igonucleótido -formado do suporte sói ido»

As ligações internuoleósido siloxano do análogo de oligonucleótido possuem a fórmula II

R !

!

C n u c 1 e ó s i d o 3 - S i - L n u c 1 e ô s i d o .1 11 í

R

No método de fase sólida, o catalisador alcalino utilizado de acordo com a presente invenção é de preferencia uma base obstruída e, mais preferivelmente 2,6”di-terc~butil”4--metilpiridina» Em geral, a base, imidazol, está também presente como um estabilizador- -parai o intermédio si li lado» A sua presença auxilia também a melhorar o rendimento» Um solvente aprótico preferido é uma mistura de acetonitri1 o e dimetilformamida, mais preferivelmente, uma m i s t ur a 1 í i (ν / v)

□ .análogo de ol i gonucl eóti do -formado é removi do₅ de preferencia, do suporte sólido por clivagem com amónia aquosa em isopropanol e acetonitrilo»

Os nuc1e ó si d os 1i g ad os c om uma pon t e siloxano são sintetizados por reacção de um 3'-si 1 i 3.ado~5'~ -nucleósido protegido com um nucleósido não protegido» As pontes de siloxano comtempladas pela presente invenção são 1 i gações di -al qui 1 -si 1 i 1 o da f órmul a

OJ.

em que cada um R representa independentemente alquil o „

Numa -forma de realização preferida R representa i soprop i1 o ou meti1 o„

3'-si 1ilado-5'-nucleósido protegido pode produzir-se ds acordo com procedimentos conhecidos e facilmente evidentes para os especialistas» Numa formai de realização preferida faz-se reagir um 3'-hidroxi1-5'-nucleósido protegida com um reagente de si 1 ilação bifuncional numa solução alcalina aprótica» 0 grupo de protecção no grupo 5'-carbono-hidroxilo é seleccionado com base na sua instatai1 idade ácida. Os grupos de protecção adequados são conhecidos e facilmente evidentes para os pecialistas da sintese de oligonucleótidos»

Os grupos de p a r t i c u 1 a r m e n t e, prorecçao preferi dos triti los.

monometoxitritiIo e dimetoxitriti lo» 0 mais preferido é o dimetoxitritilo (DMT)»

Os reagentes bifuncionais comtemplados pela f órmulas

R de si I ilação presente invenção possuem a

Rl

em que cada um dos radicais R representa, independentemente, alquilo(Ci-Cfe) e R¹ representa um grupo removível. Numa -Forma de realização preferida, o agente de si I ilação é simétrico, R representa isopropilo ou metilo e R* representa Cl ou SOsCFs»

A solução aprótica alcalina é constituída, de preferência, por um aceitador de protão, tal como uma base, dissolvido num solvente aprótica» As bases e solventes adequados são conhecidos e facilmente evidentes para os especialistas» Uma base preferida ê uma base obstruída exemplif içada por 2,6-di-terc-buti1-4-meti1piridina» Um solvente preferido é uma mistura de dimeti 1formamida (DMF) e scetonit r i1 o C CH)»

Os nucleósidos utilizados na presente invenção incluem oxi-e desoxi-nucleótidos»

As porções purina e piridina de tais nucleósidos são facultativamente protegidas nos grupos amino exocíclicos» Um grupo de protecção preferido para os grupos am i no exocí c11cos d e ad en i n a e ci tos i na é a ρ orç ão benzoílo» Um grupo de protecção preferido para o grupo de amino exocíclico de guanina é a porção isobutilo» Facultativamente, a guanina ρ ode t amb é m ser ρ r ot eg i d a n a posi ç ão Ο*⁵” „

3' - s i 1 i 1 a d o- n u c 1 e ó s i d o u t i 1 i z a d o no método da presente invenção pode ser um monómero nucleósido ou um nucleósido terminal em 3' de um oligonucleótido ou análogo de ol igonucleótido» 0 3'--5''-nucleósido não protegida utilizado na presente invenção pode ser um monómero nucleósido do nucleósido terminal em 5' de um oligonucleótido ou análogo de oligonucleótido em que os nucleósidos terminais em 3' e 5' são desprotegidos» 0 análogo de oligonucleótido pode possuir qual quer t ipo de 1igação internuc1eósi do =

Alternati vamente, o presente invenção ê utilizado para sintetizar oligonucleótidos possuindo apenas ligações internucleósidos siloxano. A síntese de tais análogos de oligonucleótidos processa-se de acordo com um processo de síntese de fase sólida ou de fase em solução modificada. Sait, supra»

Num método de fase de solução método da análogos de preferido a reacção de um 3'-si 1 i lado”5'~nuc3.eósido protegido monomérico com um primeiro nucleósido desprotegido monomérico é seguida pela reacção do produto (3'’ a 5') di nucleósido ligado por si li lo protegido em 5·' (d í mero de nucleósido) com um reagente de si 1 ilação bifuncional e um segundo nucleósido monomérico não protegido para formar um trímaro ligado por sililo protegido em 5' (trinucleósido). 0 comprimento da cadeia ê prolongado por repetição destes espaços de reacção até se obter um análogo de oligonucleótido (polímero de nucleósido) com o comprimento desejado» ftlternativamente e, de preferência, a extensão ou prolongamento da cadeia processa-se por isolamento dos polímeros ligados por sililo protegidos em 5' quando eles são formados, remoção do grupo de protecção em 5' e utilização de tais polímeros de nucleósido não protegidos em vez dos nucleósidos monoméricos não protegidos» Deste modo, o prolongamento da cadeia processa-se de uma forma mais rápida e estequiometricamente mais eficiente (isto é trimero-i-dímero, tr í mero+trí mero).

Numa forma de realização preferida, os análogos de oligonucleótido possuindo ligações internucleósido siloxano são sintetizados por um processo de síntese de fase sólida modificado que utiliza o método de ligação da presente invenção» passo inicial na síntese de fase sólida é a ligação de um nucleósido protegido em 5' a um suporte sólido, de preferência, um suporte de vidro de poros controlados (CPG) „ 0 nucleósido é, de preferSncia, ligado ao suporte CPG por intermédio de uma ligação succinato na posição 3·'hidroxi lo de nucleósido» Outros meios de ligar os nucleósidos aos suportes sólidos são conhecidos e facilmente evidentes para os especialistas da síntese de oligonucleótidos. Os nucleósidos protegidos em 5' ligados a um suporte de CPG estão também comerci almente di spon ívei s=

A seguir à ligação do primeiro nucleósido ao suporte sólido, ocorre o prolongamento da cadeia por intermédio de passos sequenciais de remoção do grupo de

protecção 5'-hidroxi lo de nucleôsido ligado, adição de um 3'-si 1i1ado-5'-nucleósido protegido em conjunto com um reagente activador e terminação das cadeias que não reagiram» grupo de protecção na posição 5^Z-hidroxi1 o dos nucleósidos ligados ê removido com um ácido, de preferência, com ácido tricloroacético» passo de activação efectua-se na presença de um nucleôsido si li lado adicionado e um reagente de activação de base obstruída» Um agente de activação preferido é uma base obstruída tal como 2,6-di-terc-buti1-4-metiIpiridina» Um solvente preferido é uma mistura de acetonitrilo e DMF» As cadeias que não reagiram são terminadas com reagentes de terminação tais como anidrido acético e N-meti1-imidazol»Depois de se completar o conjunto da cadeia de oliganucleótido desejada, separam-se as cadeias do suporte sólido e removem-se os grupos de protecção por métodos convencionais» Gaits, supra, págs» 67-70,,

As cadeias completas são, de preferência, clivadas a partir do suporte sólido por uma solução de amónia aquosa em isopropanol e acetonitrilo»

Utilizando os procedimentos de síntese de fase sólida anteriormente apresentados podem preparar-se polímeros ds nucleósidos ligados por 3'-5'-si 1i1 o ou análogos de oligonucleótidos possuindo ligações internucleósido siloxano ds qualquer comprimento desejado»

U s e s ρ e c i a 1 x s t a s d e v e m η o t -a r q u e outras meios de síntese de oliganucleótidos podem ser modificadas de uma forma análoga para produzir análogos de oligonucleótidos possuindo ligações internucleósidos siloxano» Da mesma forma, os especialistas podem notar que os métodos da presente invenção se podem utilizar em associação com métodos conhecidos para a preparação de oligonucleótidos ou seus análogos possuindo outros tipos de ligações internucleósidos para preparar análogos de oligonucleótidos possuindo misturas de ligações siloxano e outras» método da presente invenção pode utilizar-se para a síntese de uma variedade de sequências de oligonucleótidos incluindo bases que,, quando substituídas por bases que ocorrem natural mente no ADN e ARN, permitem aos análogos ds oligonucleótidos nos quais estão incorporados hibridizarem-se com segmentas alvas de ADN ou ARN» As bases adequadas incluem adenina CA), citidina CC), guanina CS), Uracil CU), ti mi na CT) e suas modificações, como por exemplo, 5-bromo ou 5-iodo-uraci 1 , 5-meti 1-citosina, isocitosina (2-amino~4—oxo-pirimidina) , isoguanina (2-oxo-6-amino purina) , inosina (6-oxo-purina), 5-vini1-uraci1 e 5~vini1-citosina»

Os exemplos seguintes ilustram ainda esta invenção e não podem ser considerados como limitant.es da descri ção e r ei vi nd i caç ões»

Exemplo 15 Síntese de 5' --O-d jmet οχ 1tri ti 1 -3'-0-· (5·'-dimeti lsi1 i 1 -3' -0-acet i 1t i mi d i 1) t i mi di na

Introduziu-se por intermédia de uma cânula, lehtamente, uma solução de S^O-dimetoxitritil-timidina (7,35 mmoles, 4,0g) em CH_KCl_;a(40ml) e triet.i 1 amida (16,16 minoles, 2,2ml) numa solução de diclorodimetilsilano (7,35 mmoles, 0,94Sg; 0,S9ml) em CHsaCla· ClOOml) a uma temperatura de -40°C (gelo seco-CHasCN) e agitou-se a uma temperatura de -40^eC durante 3 horas, Adic:i.onou--se uma solução de 3'-0-aceti1 ti mi dina (3,5 mmoles, l,0g) e trietilamina ¢16,16 mmoles, 2,2ml) em CH-aCla» C25 ml) e agitou-se a reacção a 0°C durante 3 horas» Terminou-se a reacção por adição de NaHCO-s aquoso a 5% (25ml). Lavou—se a camada orgânica com solução salina C2 x 25ml) e secou-se sobre Na₂S0₄. Purificou-se o produto impuro (5,3g) por cromatografia de coluna (Si0^, gradiente de acetato de etilo/hexanos),.

Rendimento isolados 670mg, 22%» Rf

0»23<7s3 EtOAcs Hexanos) ,, RMN *H (300MHz, CDC1_;:S) ef 9.02 (s, 1 H, NH) , S„95 (s, 1 H, NH) , 7,,64 Cs, 1 H) , 7»50 Cs, 1 Η) , 7»41-7»27 Cm, 9 Η) , 6»64 Cd, J = 7»7 Hz, 4 Η), 6»38 Cm, 2H), 5»19 Cd, d = 5.6 Hz, 1H) , 4,61 Cd, 3 = 2»5 Hz, 1 Η), 4.04 Cs, 2H), 3»S7 Cs,

2H> , 3» 79 Cs, 6H) , 3» 39 (ABq, 3 = 10» 4 Hz, Δν = 67» 3 Hz, 2H) ,

Exemplo 2 ί nt ese d e 5^f -0-d :i. me t ox i t r i t i 1 -3' -0- (5

P^r°P^:i i si 1 * ^s- ti mi di 1) -timidi n;

-O-di-i soMétodo A. (Catalisador· base obstruída),. Adicionou-se uma solução de s'™q.» -dimetoxitriti 1timidina (0,92 mmoles?, 0,5g) e 2,6-di-terc-fauti1-4-metiIpiridina (0,23 mmoles? 47mg) em DMF C4mI5 a uma solução de 2,6-di-terc-buti1-4-metiIpiridina (1,0 mmoles? 0,2g) e bis-tri-flato de di-isopropi1sí1i1o (1,0 mmoles? 0,30ml) em CHsCN (5ml) a uma temperatura de -40°C. Depois de 30 minutos à temperatura de -40°C permitiu-se que a reacção aquecesse até à temperatura ambiente» Adicionou-se imidazol (1,0 mmoles, 70mg) e em seguida adicionou-se timidina não protegida (0,8 mmoles?, 193mg), Agitou-se a reacção durante 1 hora e depois adicionou-se, gota a gota, a uma mistura de gelo e água vigorosamente agitada (500ml). Agitou-se, em seguida, a mistura resultante durante 30 minutos e -filtrou-se» Purificou-se o produto impuro ρor cromatog r a-f i a.

Rendi mento isolado 70%, R-f 0.45 (5% MeOHZEtOAc) „ RMN, ^S-H (300 MHz, CDC1₃) £ 9» 85 (s, 1 Η, NH) , 9» 44 (s, 1 Η, NH) , 7.64 ís, 1 Η) , , 65 (s,

7.41-7.24 (ei, 10 Η) , 6.84 (d, 3

7.8 Hz, 4 Η) , 6.33 Cm,

H)

Hz, 1 H) „ 4.11 Cd, 3 d; L· .£» a rj

I·

3,,93 CABq, 3

Hz» 11.0 Hz

1) ,

Δν

H)„ 3.39 CABq, 3=3.0

10.8 Hz,

Η) , 4.43

4» 00 (d, 3 =

D/! 2. LJ ^v5 iL. r o >-J ç <&> ί ι í tj v = 49.5 Hz,

3.79 (s, 6

214), 2.502.38 (m, 2 Η) , 2.30-2.07 Cm, 2 Η), 1.88 (s.

H)

1.05-0.98 (m, 14 H) . RMN «C CCDC1®) J 164=84, 164.80

159.40, 151.72, 151.25, 144.89. 136.16, 136,01

j. ·..?%.? a LJ tf

128.58, i:

113.80, 112.10, 111.42, 87.48,

87.38, 85.76,

85.48,	73.90,	71„70,	63.82,	63,48,	60,75, 55,57, 41,71,	40,85,
21,24,	4. t uuJ.iL.ij	17.47,	17,39,	14,35,	12,69, 12,18, 12,10,	11,85,
EMBAR	(TS/G)§	(M-i-M)-’	= 399.

Anál ises

C^HgaN^OxaSi; C, 62.79? Η, 6.50? W, C, 61.83? H, 6.53? N, 6.23.

Calculado para ó»23íí PM, 898. Enc ontrado s

Método B» (Catalisador base não obstruída). Adicionou-se por intermédio de um -funil de gota a gota, lentamente, uma solução de 5'-O-dimetoxitriti 11imidina (6,65 mmoles? 3,54g5 e imidasol (13,3 mmoles? 0,88g5 em DMF (ISrnl) a uma solução de di-cloro-di-isopropiisi lano (6,62 «imoles5 l„22g? í,20ml) em DMF (4,5ml5 à temperatura de -40°C (gelo seoo-CHisCN) . Agitou—se a reacção a -40°C durante 1 hora. Adicionou-se uma solução de timidina não protegida (6,65 mmoles? l,61g) e imidazol (1,33 «imoles? 0,9 g) em DMF- (15ml5 por intermédio de um funil de gota a gota. Agitou-se a reacção a -40°C durante 1 hora e depois aqueceu-se è. temperatura ambiente durante a noite. Adicionou-se depois a mistura de reacção, gota a gota, a uma mistura de gelo e agua vigorosamente agitada (115 e agitou—se durante 30 minutos. Filtrou—se a mistura para proporcionar um produto no estado sólido e de cor branca que se secou ao ar e se submeteu a cromatografia de coluna (SiO_ffl, gradiente de 60% a 100% de EtOAc/hexanos). Rendimento isolados l,47g, 25%.

Exemplo 3s Sinteseu^J^^metoxitriUl^ -3' -0- (5^f -d i -i sopr-op i 1 si 3. i 1.1 :i mi d i 1) -adenosina.

i ssol veu“5e N⁶-·{□ gn q £ ]. —2^/ — desox i —

-5'-0-dimetoxitritiladenosina (5 mmoles? 3,28g5 e imidasol (10 «imoles? 0,68g) em DMF- (15ml5 e adicionou-se, lentamente, por i nterm édi o de um funil de gota a gota a uma solução de di— -cloro-di-isopropi1 —si 1 ano (5 mmoles? O,9ml5 em DMF (l,5ml) a -40°C (gelo seco-CH^CN). Agitou-se a reacção a -40^oC durante 1 hora e adicionou-se uma solução de timidina (7,5 mmoles? 1,81 çj) e imidazol (7,5 mmoles? 0,51 g5 em DMF (20ml) por intermédio de um funil de gota a gota. Agitou-se a reacção a -40°C durante . 1 hora e depois aqueceu-se à temperatura ambiente durante a

noite. Adicionou-se depois, gota a gota, a mistura de reacção a uma mistura de gelo e água vigorosamente agitada Cl 1) e agitou—ss durante 30 minutos. Filtrou-se o precipitado e secou-se para proporcionar um sólido branco C5,8 g) gue se purificou por TLC preparativa (1 mm de SiO_s, 3% de MeOH/EtOAc).

Rendimento isolados 50 mg, 38%« Rf

0.32 (2% de MeOH/EtOAc). RMN	±_H	(300	MHz, CDCU) Á	9«99	Cs,		1
H, NH) , 8.76 Cs, 1 Η) , 8« 22 C	S ,	1 Η) ,	8»09 Cd, J =	7» 8,	l	H)	lí
7»55-7«13 Cm, 13 H) , 6.74 Cm,	4	H) , 6	.42 Ct, 3 = 5.	8 Hz,	1	H)	9
6.25 Ct, 3 = 6.0. 1 Η), 4.96	Cd	, 3 =	5.4 Hz, 1 Η),	4.48	Cs,		1
Η), 4.19 (d, 3 - 3.8 Hz, 1 H)	1	3.94 (	s, 1 Η), 3.83		í m,		2
H) 3.72 CS, 6 Η), 3.38 Cd, J	-	3.4 Hz	, 2 Η), 2.83	o.»'*? TL	C m,		1
Η) , 2.60-2.52 Cm, 1 Η), 2.45-	ί··\ •sC. a	38 (m,	1 Η), 2.05-1.	95 C m,	1	H)
1.79 Cs, 3 Η), 0.95 Cm, 14 H)	»	EMBAR	CTS/8)2 CM--M)“	= 1011	»

txemp1 o 4s Síntese de N^-bencoí1

-dssox i-5^z-0-di metoxitri ti1 ·

-3 ' -0- C5' -0-di —i sopr opi1-si 1i1-t i mi di1)-citi di nj

Uti1isou-se o procedimento descrito

anteriormente no exemplo 3 para a síntese do composta em epígrafe» A purificação por TLC preparativa Clmrn de SiO_s? 3% de MeOH/EtOAc) proporcionou o produto puro»

	Rendi mento calculados	70%.	Rf 0.40
C2% de MeOH/EtOAc	) . RMN * H	CCDCl») <f 9.54 Cs,	1 H	, NH)	ra g ra	. 21
Cd, 3 = 7.6 Hz-, 1	Η) , 7.94	Cd, 3 = 8.2 Hz, 2 H)	•l	7 _n 39—7*	»24	C m,
14 Η) , 6.83 Cd, 3	=8.4 Hz	, 4 H) , 6.25 C m, 2 H)	,_} 4	«58 Cs	•l π X	Η) ,
4.46 Cs, 1 Η) , 4»	17 Cs, 1	Η) , 4.07-3.80 Cm, 3	Η) ,	3. í’ f	Cs,	6
Η) , 3.39 CABq, 3	= 3.0 Hz,	10.9 Hz, Δν = 29.1,	*“?	Η) , 2»	84.....2	3 78
Cm, 1 H>, 2.46-2»	41 Cm, 1	Η), 2«14-1.79 Cm, 2	H5 ,	1»84	Cs,	3
Η) , 0.98 Cm, 14 H	). EMBAR	(NBA) s CM~H)“ = 987»

Exempla 5s Síntese de 3'-si 3. i 1 ado-N^-benzoí 1 -2'-desoxi-5' --0-d i met ox i t r i t i 1 c i t i d i n a

Método A» Adicionou-se, por

Í4

V

intermédio da uma seringa, uma solução de N^-benzoíl-2''desoxi-5^/-0”dimetoxitritiIcitidina ¢0,4 mmol as?, 260 mg) s imidazol ¢0,8 mmolesg 52 mg) em CH^CN (1,6 ml) a uma. solução da di-cloro-di-isopropilsilano ¢0,4 mmolesg 72 JJI) era Ci-bCN (0,4 mi) a -40°C Cgelo seco-CH₃CN) » Permitiu-se que a misturai de reacção se agitasse a --40°C durante 30 minutos e depois à temperatura ambiente durante 30 minutas» Filtrou-se a mistura de reacção e isolou—se o produto (3'-0~sí1i1ado-citidina) por cromatografia de coluna (Si0₂, gradiente de 60% de EtOAc/Hex a 100% de EtOAc a 1% de MeOH/EtOAc)=

Rendimentos lOOmg, 28%= R-F 0=71 (0=5% de MeDH/EtOAc)= Isolaram-se também 50 mg de um 3'-3'~

-dímero simétrico C-C=	RMN	^:LH <300 MHz, CDCl:_:s) £ 8=43 (d,	3 -
7=6 Hz, 1 Η), 7=88 (d,	3' =	8=2 Hz, 2 Η) , 7=60-7=26 (m, 13	Η) ,
6=87 (d, 3 = 8=4 Hz, 4	H),	6=25 (t, 3 = 6=5 Hz, 1 Η), 4=71	(m,
1 Η) , 4=10 (m, 1 Η), 3=	80	(s, 6 Η) , 3=48 (ABq, .3 = 3 Hz,	11
Hz , Δ v 30 Hz , 2 Η) , 2 =	67	(ra, 1 Η), 2=35 (m, 1 Η), 0=97 (m,	14

H) = EMBAR (T6/G)s (M*B)*=: 884=6 =

Método B = Parai minimizar a -Formação do 3',3'-dímero simétrico adicionou-ss, gota a gota, uma soluç ão d e N^z|--benzo1l -2'-desoxi-5'-0-d i metox itri ti1ci ti d i n a (3,08 ramolss; 2,0 g) em DMF/CH_SCN (5 mlZ2ml) a -40°C (gelo seco-CHsCN) a uma solução de bis-tri-Flato de di-isopropi Isi 1 i lo (3,38 mmoless 1,0 ml) e 2,6-di-tsrc-buti1-4-meti1-piridina (3,38 raraoles; 700 mg) em CH^CM (Sml). Agitou-se a misturai de reacção a -40° C durante 30 minutos e purificou-se o produto por TLC„

Exemplo 6s i.ti.lc:3.ícO^Í5.i_zQ_ztíj,—i sopropilsilil-ti mi d i1)ti mi d i n a =

Adicionou-se uma solução do composto em epígrafe (22 mmoles? 200 mg) em CH₂C1₂ (4 ml) a ácido tricloroacético a 3% em CH₂C1₂ (6 ml >» Agitou-se a solução cor • de laranja brilhante à temperatura ambiente durante 10 minutos»

H

Verteu-se a mistura de reacção em NaHCOs aquoso a 5% <5 ml) e extraiu—se em 5% de MeOH/EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com uma solução salina ClOml) e secou-se sobre Na_KSO^.„ Puri-ficou-se o produto impuro por cromatografia ds coluna (SiO_a, gradiente de 605 40 de EtOAc/Hex a 10% de MeOH/EtOAc).

Rendimento isolados 90 mg, 70%. R-f 0.4O (10% MeOH/EtOAc). RMN ^a-H (300 MHz, CD^OD) S 7.54 (s, 1 Η) , 7,,28 (s, 1 Η) , 6.03 Cm, 2 Η) , 4.46 (m, 1 Η) , 4.18 Cm, 1 Η) , 3.82-3.69 (m, 3 Η) , 3.50 Cm, 4 Η) , 2.06-1.97 Cm, 4 Η), 1.62 (s, 6 Η), 0.83 Cm, 14 H5 . EMBAR CTS/G)s (M+H)*= 597.3.

Exemplo 75

S í ntese -de 5' -0-d i metox i tr i t i 1 -3 ' -0- C 5^z -0-d i -i sopropi 1 si 1 i 1 ti mi d i 1-5' -0- (5^?-0-di-isopropi1 si 1 i 3. timi-di1)3-timidina» 0 nome do Chem. Abstr, Index é

Tlmidina, 5^f-Q-CbisC1-metileti1)si 1i1enol-5/-0-des-f os-f ini coti midi 1 i '1 - C5^? _____-fwdarw. 5') -S^-Q-Cbis C1-met i 1 et i 1 > si 1 i I eno j -5' -0-des-f os-f i n i c ot i mi d i 1 i 1

- C 5 ·'. -f wdarw. o' 5 4-mstox :i. -f enil) fen :i. 1 met i 1 o 3.

Método A. Adicionou-se, lentamente, por intermédio de um -funil de gota a gota uma solução de 5'-0— -dimetoxitritiltimidina (14,7 mmolesg 8,0g) e imidazol (29,94 mmoles§ 2,0g) em DMF (40ml) ou uma solução de dicloro-di--:i soprop ilsilano (14,7 mmoles§ 2,72g? 2,64ml) em DMF (10ML) a -4Q°c (gelo seco-CH^CN). Agitou-se a reacção a -40°c durante 1 hora. Adicionou-se por intermédio de um -funil de gota a gota uma solução ds timidina (14,7 mmoles§ 3,56g) e imidazol (29,4 mmolesis 2,0g) em DMF (40ml), Agitou-se a reacção a -40- C durante 1 hora e depois introduziu-se a reacção de di-cloro-di-i sopropi 1 si 1 ano (14,7 mmol es5 2,72g , 2,64ml) em DMF- (1 Oml) a -40°C. Agitou-se a mistura da reacção a ·~40°0 durante 1 hora. Ad i c i onou-se uma so 1 ução de t i mi d :i. n-a (14,7 mmo 1 es 5 3,56g) e imidazol (29,4 mmoles§ 2,0g) em DMF C40ml) e agitou-se a reacção a -40°C durante 1 hora. Adicionou-se, gota a gota, a mistura resultante a uma mistura de gelo/âgua vigorosamente agitada (2 1) e agitou-se durante 30 minutos. Filtrou-se o

precipitado e secou-se ao ar·,, Submeteu-se o sólido branco (27g) a cromatogra-f ia de coluna (150g de Si Os, 100% de EtOAc/hexanos) para proporcionar Rend i ment o i so 1 a.d o; 1, Sg , 10%» um produto puro

Rd 3. ci onou-se porCl, 22 mmolessi -meti1ρir i d i n a

Método B.

intermédio de uma seringa uma. solução de 5'-0~dimetoxitriiiI~ -3'-0-<5'-0~di-isopropilsiliItimidil)ti midina (1,11 mmoles; l,0g) e 2,6—di-terc-buti1-4-meti1 piridina (0,28 mmolesj 60g> em DMF (3ml) a. uma solução de bistri-flato de cli-isopropilsílilo 0,504g» 0,360m1) e 2,6~di-terc~bui i1-4(1,22 mmoles; 0,25g) em CH»CN (3ml) a --40°0 (gelo seco-CH-sCN) , Agitou-se a reacção durante 1 hora, a -40°C» Adicionou-se uma solução de imidasol (1,22 mmolesp 0,i6g) em

CHasCN (2,5ml) e aqueceu-se a reacção è temperatura ambiente»

Adicionou-se uma solução de timidina (1,11 mmolesp 0,269g) em a. reacção durante i hora, e depois gota, a. uma. mistura, de gelo/âgua.

(1 1) e agitou-se durante mais 30 o precipitado e secou-se ao ar para.

DMF (2ml) e agitou-se a.d i c i onou-se, gota. a.

vi gorosamente agi tada mi nutos,, Fi 1 trou-se proporcionar um sólido branco (l,5g) que se triturou com hexanos C2.0ml) para, proporcionar o produto puro»

Rendi mento isolados 1»05 g, 76%, Rf 0.33 (5% de MeOH/EtOAc) , RMN. *-H (300 MHz, CDC1») á 7.62 (s, 1

Η) , 7,,36-7,,22 (m, 11 Η) , 6.80 (d, J = 7,7

H), 4.62-4.54 Cm, 2 Η) , 4.45 Cm, 1 H)

3.75 (s, 6 Η) ,

2,,45-2.30 (m, 3

3.36 (ABq, J = 10.0Hz

H)

2.28-2.14 (m,

Η) ,

4»06—3. 8 a (m, Δν ⁼ 47,, 6 Hz , 2.13-2.00 Cm.

1.85 (s, 3 Η), 1.81 (s, 3 Η), 1.48 (s, 3 Η), 0.98 (m,

RMN ¹³C (CDCls) ê 164.54, 164.45, 164.33, 159.00, (m, / H ) , 2 Η) , 2 Η) , 28 H) .

150.99, 144.40

135.51, 135.40, 130.15, 128.16 llí«32g lll«07g 87«50g 87«02_? ‘1.24, 63,28, 63,02, 55.15, 41.43, 40,64, 40.25, i rs: -ί η o

A -u./ A « λ» g

1 O b O í g

73« 35g 17«04g

16«92_? 12«2ά₉ ll„70₅ 11_b59₅ 11,53« 11,,47, EMBfiR CTS/S) ã (M+H)*= 1252.5,

Análi se

C^isjHezi.N&Di-i-SixeS C, 60»385 H, 6» 715 N, calou la. da.

6,715 P.M.

par a

1253.6,

Encontradas C, 60,44; H, 6,84; N,

Exemplo 8 s Des t r i tila ç ão d e 5' -Q-d i met ox i t r i t i 1 -1 r í mer o

Adicionou-se uma solução de 5^z-0-dimetoxitritil-trímero (0,638 mmoles; 0,80 g) em CH^Clsa (12 ml) a ácido tricloroacético/CH^Cl_s a 3% (v/v) (14ml), Agitou-se a solução da cor laranja brilhante à temperatura ambiente durante 1 hora e depois verteu-se em NaHC0.-_s aquoso a 5% (15 ml) e extraíu-se em 5% de MeOH/EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com solução salina (20ml) e secou-se sobre Na^SCU. Puri-Ficou-se o produto por cromatografia de coluna CSiOs, gradiente de EtOAc/MeOH 100% a 95%)„

Rendimento isolados 420mg, 70%, R-f

0.50 (10% de MeOH/EtOAc). RMN ^a-H (300 MHz, CD^OD) J 7,55 (s, 1

Η), 7,27 Cm, 2 Η), 6,05 Cm, 3 Η), 4,47 Cm, 2 Η) , 4,16 (m, 1 Η), 3,87-3,70 (m, 7 Η), 3.50 Cm, 2 Η), 2,14-1,96 Cm, 6 Η) , 1,62 Cs, 9 Η) , 0,92 (m, 28 H) „ EMBAR (TG/Í3) s (M-H)“= 950.

Exemplo 9s Síntese de 5^z-Q-dimetoxitriti 1-3^z-Q-C5/-Q-di-isopropi 1 si 1i1 timidi1-3^z-Q-C5^z-Q-di-isopropi1 si 1i1 ti midi1-3^z -Q- (5^z -Q-di-i. sopropi1si 1i11i mi di1)-3^z -0- (5^z -0-d 1 ~Ί sopr-opi 1 si lj11 i mi di 1 ) 3—himidina < Análogo de

Tetranucleó tido)„

Adiei onou-se, 1entamente, por intermédio de uma seringa uma solução de 5^z-0~dimetoxitriti X-trímero (20 pmoles; 25mg) e 2,6-di-terc-buti 1 -4-meti 1 pi ri di na (40 .umoles; 8,25mg) em DMF (200 pl) a uma solução de bistri -flato de di-isopropi Isíl i lo (20 pmoles, 6 pl) e 2,6-di-terc-buti1-4-metiIpiridina (20 Pmoles, 4,img) em DMF (100 pl) num -frasco de -fundo redondo de 5ml arrefecida a -40°C (gelo seco-CH-aCN) „ Agitou-se a reacção durante 1 hora e adiei onou-se depois uma solução de timidina (20 Pmoles; 4,84mg) e imidazol • C40 Pmoles; 2,7mg) em DMF (200 Pl5, Continuou—se a agitação a

-40 * C durante 30 minutos. Aqueceu-se a reacção à temperatura ambiente. Adicionou-se MaHCO.·® .aquoso (1 ml de uma solução a 5%) e extraíu-se a mistura de reacção em CHCl-s <2 x 5 ml),, lavou-se com solução salina (lml) e secou-se sobre Na^SCU. Purificou-se o produto por HPLC preparativa de fase inversa (ultra-esfera □DS, 20% de acetato de trieti1amóniο Ο,ΟίΜ, pH 7,5; 80% de CHasCIM) .

Rendimento isolados ÍOmg, 31%. Rf 0.16 (5% de MeOH/EtOAc). RMN (300 MHz, CDCU) <f 7.65 Cs, 1 Η), 7.39-7.26 (m, 12 Η) , 6.85 Cd, J = 7.7 Hz, 4 Η) , 6.38-6.27 (m, 4 Η), 4.66-4.45 (m, 4 Η) , 4.10-3.85 Cm, 10 Η) , 3.80 Cs, 6 Η) , 3.39 (ABq, J = li Hz, Av = 45 Hz, 2 Η), 2.45-2.OS Cm, 8 H5, 1.92 Cs, 3 Η), 1.90 Cs, 3 Η) , 1.87 Cs, 3 Η), 1.56 Cs, 3 Η) , 1.03 Cm, 42 H) . EMBAR CTG/8) s CM+H)-··= 1608.3; (M-HMa) *= 1630.0.

Exemplo 10s Síntese____de análogo de nucleótido de pentatimidilo

A d ici ο ηou-se, 1entament e por intermédio de uma seringa, uma solução ds 5' ~dimstoxi tri ti ].—trímero (58,4 Pmoles; 73 mg) e 2,6-di-tsrc-butil-4-metilpiridina (29,2 pmoles; 6 mg) em DMF C600pl) a uma solução ds bistriflato de di-isopropilei 1ilo (58,4 pmoles; 17,5 pl) e 2,6-di-terc-buti1-4-metiipiridina <58,4 pmoles; 12 mg) em DMF (300 pl) num balão de fundo redondo de 5 ml arrefecido a -40°C (gelo seco-CHsCN). Agitou-se a reacção durante 1 hora e adicionou-se uma solução do dímero destritilado ¢55,5 pmoles, 50,6 mg) e imidazol C100 pmoles; 6,75 mg) em DMF (300 Pl). Agitou-se a reacção durante 1 hora a -40°C e depois aqueceu-se è. temperatura ambiente. Adicionou-se NaHCO^ aquoso C2 ml de uma solução a 53%) e extraíu-se a mistura em CHC1₃C2 x lOml), lavou-se com solução salina (2ml) e secou-se sobre NasS0< para proporcionar o produto.

EMBAR (T8/S)s (M+H)~= 19óí„ Iões fragmento a 1900, 1607, 1252, S9S e 544. EMBAR (NBA)s (M-H)“= . 1961.

* L

Exemplo 115 Síntese ds fase s 61 i d -a de dec an uc 1 e 61 i d p d e ti fiiidi na !

A» Síntese da unidade fqonomérica sintética. Adicionou-se, por intermédio de uma serinoa, bistriflato de di-isopropiIsi1ilo (2 mmoles; 0,60 jml) a uma solução de 2,6-di-terc-buti1-4-meti Ipiridina C2 mmolesj? 0=41g) em CK-aCN (5ml) num balão de fundo redondo de 'lOOml sob atmosfera de N_s, Arrefeceu-se a solução límpida a -40>°C (gelo seco-CHsCN) e adicionou-se, gota a gota, por intermédio de uma ser i n g a, uma sol u ç ão de 5' -0-d i metox i t r i t i 11 i m i d i ín a C1,84 mmoles? :L,Og) e 2,6-di-terc-buti1-4-metiIpiridina (0,46 mmoles; 94 mg) em DMF (5 ml) durante 10 minutos» Ag itou-se a 'reacção a -40^eC durante 1 hora» Adicionou-se uma solução de imir!!azol (3,7 mmoles; 250 mg) em DMF (4ml) e, em seguida, diluiu-se.com CH^CN (5ml) até uma concentração final de Ο,ΟΙΜ, B» Síntese do decanucleótido,, Aqueceu-se a mistura à temperatura ambiente e !· utilizou-se numa síntese automatizada de fase dólida do decanucleótido»

RMN ⁴h (300 MHz, CD_::sOH) /7.55-7=47

(m,	10 Η), 6=23-6=33 Cm, 10 Η) , 4=69	(s,	br,	9 Η), 4=40 (s,	ig?
1 H)	, 4»10-3=40 ím, 19 Η), 3=25-3=08	(m,	1 H)	, 2=55-2=,20 Cm,	20
Η) ,	1=87 (s, br, 27 Η), 1=30 (s, br,	3	Η) ,	1=08 Cm, 126	H) =

EMBAR (TG/G)S (M~H)“= 3434,2? (M+H)= 3433=7= EMBAR (NBA) § (MH)~= 3435=2=

F „ M = C _±Cal c 5 Ρ = M = , 3432 = 5 =

Exempla 125 Síntese de 5·'-0-dimetoxitriti 1 -5'-Q-(5'-0-di metox itri ti 1 -3^z -0- (5' -Q-d i -1 soprop :i. Isi 111 fi mi d i 1) ti mi dl na ·' -N, N-d 1 -1 soprop i 1 (2-c i ano-et i 1) -f osf or ami d i t e»

Co-evaporou-se 5‘-Q-dimetox i triti 1-dímero (0,1 mmoles? 90 mg) a partir de tetra-hidra-furano/piridina (6ml) (proporção 2§1) duas vezes, dissolveu-se em THF (500 Ul) e adicionou-se, gota a gota, por intermédio de • uma seringa, a solução agitada de 4-dimetilaminopiridina (4

mg), di-isopropiletilamina (destilada a partir· ds CaH^, 0,4 mmol ss; 37 .UI) e 2---c i ano~et i 1 -IM, N-d i -i soprop i I c 1 orof osf orami d i te (0,15 mmoles; 28,77μΐ) em THF (500 μΐ) sob um caudal de azoto à temperatura ambiente» Agitou-se a reacção durante 2 horas» Para remover as quantidades traço ds 5'·--0di met ox i t ri t i1-3'-0-(5'-0-d i-i soprop i1si11i11 i mi diI)t i mi d i n a, adi ci onou-se mai s 2-ci ano-eti 1 -IM, N-di -i sopropi 1 cl orofosforami -dite (0,02.5 mmoles; 5 pl)= Agitou-se a reacção durante 1 hora e adicionou-se a EtOAc (lOml, pré-lavado com 5ml de solução salina); lavou-se com solução salina (2 x 2 ml) e secou-se sobre Na^SCU»

Pur i f i c ou—se o p r oci u t o p or cromatografia de coluna ÍSiQ», ls i de EtOAc(hexanos)„

Rendimento isolados S2mg, 74»5%. Rf 0.70 (1% de MeOH/EtOAc). RMN ¹H (300 MHz, CDCl») J 8.96 (s, lg, 1 Η, NH), 7.64 (s, 1 H) ,, 7.40-7.22 (m, 10 Η), 6.84 (d, 3 = 8.8,

H)

, w»	40	(t,	J = 6.5	Hz,	1 Η) , ,
(m,	í	Η) ,	4.53 ím,	1 H)	, 4» 10
(m,	1	Η) ,	3.80 (s,	6 H)	, 3» 61
10 H		Δν	= 42 Hz,	2 H)	, 2 »64
í«86	(s	«J ·-«	H), 1.51	(s,	5 Η) , 1
1 »01	(m	, 1	4 H0» RMN	1 3p	(CDCls)
14,	144	» 18	, 135»47,	135»	75, 179
26,	111	. 16	, 111» 02,	110»	O /1 O s\ Ml-ç OÒ

C?O K»7·’ o·;:·

W ,, O I I, w í

RR OR Z!.R RA

6.27 (t, J = 6.5 Hz,

3« 39 CABq,

Η) , ( ííí tj uí’

84.90, 84.74, 84.64, 73.41, 73.22, 63.40, '7ZL -7Zt ΖΙ.Λ QÂ .&’7 *?fs *77· .jU-r b n ,J^T B -}·-!· „ _Μ·;_Μι^. a Z Ο η A.V n a X.V «: ·»’Δ. :

H) 1 H)

2,,5-.3-2»05 (m, 4

-1) , 1.17 (m, 12

158,72

RR RO

62»70,

ZJ.R 17 .-3.1 /(.? RQ AO » ·«? « Λ t a : «í. a i ί tj ·„.* .· n (.,.¹ t t ***? Λ CS» .1 i b VuJ g cn*o

•.Jw a J g “Ό A

Z n *T i íj

11,92,

11.71, 11.57» RMN ^:2S:LF' (CDCL®, referida a H^PUzi.) £ 149.16; IV (KBr) 3192,, 3058,, 2965 •*p O '·? 7¹

2868,

7O-M λ~. tj

1510, 1465, 1398, 1382, 1365, 1322, 1289, 1179, 1158, 1129, 1084, 1064, 1035,, 1003»

2246, 1274,,

1693, 1251,

1608 <970 .“· -j RRR f U-- .U ’™‘ Z t-j

812, 794, 773, 756, 727, 702 cm-\ EMBAR (NBA)s <M+H)*= 1099,

Anãli ses

Css^H-reNôOtsPSi s C, 61.19; H, 6.88; N, 7.64; P.M. , 1100

Encontrado C, 6O.60; H, 6.37; N, 7»60»

Calculadi p 3, Γ* 3

Exemplo 13s Síntese de 5'~Q~dimetoxitriti 1 -3'-0-L5'-u-di-1 soprop i 1 si I i 1 ti mi di 1 -3' -0- (5' -Q-d i -~i soprop i 1 si 1 i 11 i midi1) Iti mi dina-3'-N,N-di-isopropi 1 -(2-ciano-eti 1) -fosforamidite (Trímero).

Lo-evaporou-se 5'-di metox i tri ti1-trímero (0,44 mmoles? 530 mg) a partir de THF (20 ml)/piridina ClOml) duas vezes, dissolvido em CH_aci-_a (2 ml 5 e adicionou-se, gota a gota, por intermédio de uma seringa, a solução agitada d e 4-d i met i1aminopiridina (20 mg) , d i — i sop rop i1et i1amina (destilada a CaH_s»i,6·? mmoles? 370 pl> e 2-ciano-eti 1 -Ν,N-di- i sop r op i I c 1 or of osf or am idite (0,64 mmo 1 es § 120 μ 1) em CH_sq 1 (2,0 ml) sob o fluxo de azoto a 0-'C„ Lavou-se depois a mistura à temperatura ambiente, agitou-se durante 1 hora, verteu-se em EtOAc (pré-lavado com 25 ml de solução salina? 50ml), lavou-se com solução salina (2 x 20ml) e secou-se sobre Na-aSLU» Purificou-se o produto impuro por cromatografia de coluna (10 g de Si0_E, EtOAc).

Rendimento isolados 320mg, 64%. Rf

0.76 (EtOAc). RMN *H (300 MHz, CDCl.^) á 7.63 (s, 1 Η) , 7.417.22 (m, 11 Η) , 6.83 íd, J = 7.8 Hz, 4 Η) , 6.40-6.24 írn, 3 Η),

4.67-4.54 Cm, 3 Η), 4.13-3.85 (m, 7 Η), 3.75 (s, 6 Η), 3,55 (m, 2H), 3.48-3,28 ím, 2 Η), 2,74 (t, J = 6 Hz, 2 Η), 2»45-2»03 ím,

Η) , 1,88 (s, 3 Η) , 1,83 (s, 3 Η) , 1.30 (s, 3 Η), 1.28-1,13

Cm, 14 Η), 1,00 (m, 28 Η), EMBAR (NBA)s (M-H)-= 1453»

Exemplo 14s Sintese de 5'-Q-dimetoxitriti1-3'-D-(3'-Q-di-isoprop i 1 si 1i1-5'-Q-dimetoxi tri ti 1 ti mi di1)-ti midi na (3'-3'-dlmero).

Na preparação ds um dímero 3', 5' timidina-timidina, utilizando o procedimento de sililação descri to no exemplo 13, observou-se um 3',3'-dímero como um produto secundário principal» Isolou-se o composto em epígrafe a partir do produto de reacção impuro (SOOmg) por cromatografia de coluna ÍSiO®, gradiente de 60% a 90% EtOAc/hexanos)»

--7--7Rf 0.41 <60% EtOAc/Hex). RMN ³-H (300

MHz ,	CDCI.-._S) S 9.95 Cs, Ig, 1 H, MH), 8.63 (s,	1 g,	1 H,	NH) ,
7» 51	Cs, 2 Η), 7.35-7.15 Cm» 18 Η), 6.77 Cd, J	= 8.7	Hz,	8 Η) ,
6 »43	Cm, 2 Η) , 4.57 Cd, J =4.3 Hz, 2 H5, 3»91	(s,	2 Η) ,	3.71
(s,	12 Η) , 3»24 CABq, 3 = 2»8 Hz, 10»7 Hz, Δ	v = 54	Hz ,	4 Η) ,
2.46	Cm, 2 Η) , 2,,26 ím, 2 Η) , 1»46 Cs, 6 Η) ,	0.88	(m,	14 H) »

EMBAR (NBA)s (M~H)-= 1200»1

Exempl o 15 s Síntese de N6-benzQ£l-2' -desox i -5' —Q—dimetox i tri ti l~3'~0~<3'~Q~di~isopropi 3. si 1 i 1 -Nò-benz o í1-2'qdesox i -5' -Q-d :i metox i tr i t i 11 adenosi 1) -a de η o si n a»

Na preparação do d £ mero 3' , 5'adenosina-timi d ina, observou-se um 3', 3' -dí mero como um produto secundário principal do passo de sililação. Purificou-se uma porção deste produto impuro (ÍOOmg) por TLC preparativa (Imm de SiO_a, 3% de MeOH/EtOAc) para proporeionar o material puro»

Rf 0.45 (90% de EtOAc/hexanos)» RMN *H (300 MHz, CDCU) J 8» 60 (s, 2 Η) , 2» 14 Cs, 2 Η) , 8,00 (d, J = 8 Hz, 2 Η) , 7»62 Cs, 2 Η), 7.57-7.04 Cm, 22 Η), 6»73 Cd» J = 9, 8 Η), 6.38 <m, 2 Η), 4.79 (m, 2 Η), 4»14 Cm, 2 Η), 3.68 ís, 12 H>, 3.52-3.24 Cm, 4 Η), 2.86 Cm, 2 Η), 2.51 Cm, 2 Η), 0.98

Cm, 14 H) » EMBAR (NBA)s (M+H)--= 1428.3, (M-H)“= 1426.4» txemplo 16

S £ ntese d e N4-benz o £ 1-2'-desox i -5'-Q-dimet ox itrit :i. 1 -3' -0- C 3' -Q-d i ~i soprop i 1 si 1 i 1 -N4-taenz o £ 1 -2' -desox i ---5' -Q-d 1 metox itritilcitidiDcitidina.

Na si 3. ilação de N^-benzoíl-fD-desoxi-5'--0-dimetoxitritileitidina, utilizando o procedimento descrito no exemplo 15, observou-se o 3',3'-dímero como um produto secundário principal» Isolou-se este dímero a partir da mistura de reacção impura por cromatografia de coluna CSiQs-, gradiente de 60% a 1000% de EtOAc/Hex a 1% de EtOAc/MeOH) para proporcionar o composto em epígrafe»

Claims

ta.

Processo para a ligação de nucleósidos com uma ponte siloxano caracterizado por se fazer reagir um 3'-si 1ilado-5'-nucleósido protegido com um nucleósido não protegido em presença de um catalisador alcalino» reivindicação 1 pelo factc f ôrmula ⁵rocesso de acordo com de a ponte siloxano possui em que cada radical R representa independentemente um grupo alquilo»

Processo ds acordo com a ? pelo facto de o radical R representar o grupo i soprop i1o ou meti1o»

Δ3

Processo de acordo rei vindicação 1 caracterizado pelos passos seguintes;

com

a) se fazer a si 1 ilação de um grupo 5'-nucleósido protegido com um reagente de si 1 ilação bifuncional para proporcionar um nucleôsido si li lado?,

b) se fazer reagir o nucleôsido sililado com um nucleôsido não protegido em presença de um catalisador alcalino?

c) se fazer a repetição dos passos a) e b) para proporcionar um análogo oligonucleótido»

Processo de acordo com qualquer das rei vindicações anteriores caracterizado pelo facto de tanto o nucleôsido sililado como o nucleôsido nucleósidos monomêr icos« não protegido serem

Processo rei vindicação 5 caracterizado pelo m ο η o m é r i c o s s e r e m s e 1 e c c i o n a d o s ti mi di na, Ν'⁶*—benzo í 1 -desox i adenosi na e hP-i sobuti1-desoxi guanosina» ds acordo com a facto de os nucleósidos in d sp endentemen ts entre

N^—benz o í1-desoxi c i ti d ina * 4.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado pelo -facto de o nucleósido não protegido ser o nucleósido do terminal 3' de um oligonucleótido ou de um análogo oligonucleótido»

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado pelo facto da o nucleósido não protegido ser um nucleósi· do do terminal 5' de um oligonucleótido ou de um análogo oligonucleótido em que os dois nucleósidos dos terminais 3' e 5' são não protegidos»

... Qâ

Processo de acordo com qual quer das reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de a reacção se desenvolver numa solução aprótica» r e i v i η d i c a ç ão

F f ό u e s o caracterizado oelo acordo tacto de a de com a reacção se desenvolver numa solução neutra, ou alcalina aprótica, de acordo com

Processo reivindicação 9 caracterizado pelo -facto de -a solução aprótica conter 2₉6~-di“terc-butil”4“metil”piridina numa misturai de acetoni tri 1 o e demeti 3. -formamida» f -ir i,

- 12â ~

Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado pelo tacto de o catalisador alcalino ser especialmente obstruído»

13ã

Processo ds acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de o catai i sador al cal :L no ser 2,6~di -terc-buti 1 -4-meti 1 -pi r i di na»

14ã

Processo os acordo com reivindicação 4 caracterizado pelo facto de sililação bifuncional possuir a fórmula» reagente de

P:l.

tíi pi em que cada, radical R representa independentemente um grupo a 1 q u i 1 o (C _t -C&.) ; removível» cada radical R¹ representar um grupo

Kracesso de a t.. LÍ í ’ d t com a r e i v i n d i c a ç So 14 c a r a c t e r i z a d o p e 1 o facto de cada radical R^:1· peppeearvLar* C*^A ou SOeCFís»

* τι e

Processo de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo -facto de cada radical R representar independentemente o grupo isopropilo ou metilo.