PT2230299E

PT2230299E - Novo ligando de citocina zcytor17

Info

Publication number: PT2230299E
Application number: PT10168189T
Authority: PT
Inventors: Francis J Grant; Cindy A Sprecher; Jane A Gross; Stacey R Dillon; Angela K Hammond; Joseph L Kuijper; Maria M Dasovich; Rolf Kuestner
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2012-03-02
Also published as: US20180155418A1; JP2005526494A; US20090149635A1; US7425325B2; CN1643138A; US20070077627A1; BR0306979A; IL210455A; RU2008118227A; US7459293B2; ES2351678T3; US20110196128A1; NO20043419L; IL163066A; US20070111266A1; JP4795641B2; IL210455A0; EP1961811B1; ATE536406T1; KR101013401B1

Description

1 DESCRIÇÃO "NOVO LIGANDO DE CITOCINA ZCYTOR17'

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A proliferação e a diferenciação de células de organismos multicelulares são controladas por hormonas e factores de crescimento polipeptidicos. Estas moléculas que se podem deslocar por difusão permitem que as células comuniquem umas com as outras e actuem de forma concertada para formar células, tecidos e órgãos, e para reparar tecido danificado. Exemplos de hormonas e factores de crescimento incluem as hormonas esteróides (por exemplo, estrogénio, testosterona), hormona paratiróide, hormona estimulante de foliculo, as interleucinas, factor de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), factor de crescimento epidérmico (EGF), factor estimulante das colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), eritropoietina (EPO) e calcitonina.

As hormonas e os factores de crescimento influenciam o metabolismo celular por meio da ligação a receptores. Os receptores podem ser proteínas de membrana integrais que são ligados a vias de sinalização dentro da célula, tais como sistemas de segundo mensageiro. Outras classes de receptores são moléculas solúveis, tais como os factores de transcrição.

As citocinas geralmente estimulam a proliferação ou a diferenciação de células da linhagem hematopoiética ou participam nos mecanismos de resposta imune e inflamatória do corpo. Exemplos de citocinas que afectam a hematopoiese são eritropoietina (EPO), que estimula o desenvolvimento de células sanguíneas vermelhas; trombopoietina (TPO), que estimula o desenvolvimento de células da linhagem de megacariócito; e factor estimulante das colónia de granulócitos (G-CSF), que estimula o desenvolvimento de 2 neutrófilos. Estas citocinas são úteis em restaurar níveis normais de células sanguíneas em pacientes que sofrem de anemia, trombocitopenia, e neutropenia ou que recebem quimioterapia contra cancro.

As interleucinas são uma família de citocinas que mediam respostas imunológicas, incluindo inflamação. As interleucinas mediam uma variedade de patologias inflamatórias. Centrais a uma resposta imune são as células T, que produzem muitas citocinas e imunidade adaptativa a antigénios. As citocinas produzidas por células T foram classificadas como tipo 1 e tipo 2 (Kelso, A. Immun. Célula Biol. 76:300-317, 1998). As citocinas de tipo 1 incluem IL-2, IFN—γ, LT-oí, e estão envolvidas em respostas inflamatórias, imunidade virai, imunidade contra parasitas intracelulares e rejeição a aloenxertos. As citocinas de tipo 2 incluem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, e estão envolvidas em respostas humorais, imunidade contra helmintos e respostas alérgicas. Citocinas compartidas entre o Tipo 1 e 2 incluem IL-3, GM-CSF e TNF-α. Existe algumas evidências que sugerem que populações de células T que produzem Tipo 1 e Tipo 2 preferencialmente migram para diferentes tipos de tecido inflamado. Células T maturas podem ser activadas, isto é, por um antigénio ou outro estímulo, para produzir, por exemplo, citocinas, as moléculas de sinalização bioquímica, ou receptores que influenciam adicionalmente o destino da população de células T.

As células B podem ser activadas por receptores que existem na sua superfície celular, incluindo o receptor de células B e outras moléculas acessórias para realizar funções celulares acessórias, tais como a produção de citocinas.

Monócitos/macrófagos e células T podem ser activados por receptores que existem na sua superfície celular e desempenham um papel central na resposta imune pela 3 apresentação dos antigénios a linfócitos e também actuam como células acessórias a linfócitos pela segregação de numerosas citocinas .

As células assassinas naturais (NK) têm uma célula progenitora comum com as células T e as células B, e desempenham um papel na vigilância imune. As células NK, que compreendem até 15 % de linfócitos sanguíneos, não expressam receptores de antígeno e, portanto, não usam reconhecimento de MHC como requisito para ligação a uma célula alvo. As células NK estão envolvidas no reconhecimento e morte de certas células de tumor e células infectadas por vírus. In vivo, acredita-se as células NK necessitam de activação, no entanto, in vitro, as células NK têm mostrado que destroem alguns tipos de células de tumor sem activação. Número de acesso da base de dados EMBL. AC048338 (16 de Abril de 2000) proporciona Homo sapiens 12 BAC RP211-512M8. Número de acesso da base de dados EMBL. AK005939 (8 de Fevereiro de 2001) proporciona ADNc de testículo de macho adulto de Mus musculus, biblioteca enriquecida de comprimento completo RIKEN, clone: 1700013B14 produto: proteína hipotética, sequência de inserto completa.

As actividades in vivo demonstradas para a família de citocinas ilustram o enorme potencial clínico e a necessidade de outras citocinas, agonistas de citocinas, e antagonistas de citocinas. Esta memória descritiva descreve uma nova citocina que estimula as células da linhagem de célula hematopoiética, bem como composições e métodos relacionados. A presente invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 2, em que a dita porção consiste em entre 30 e 100 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 2, e em que a dita porção contém aminoácidos seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 54 a 4 59 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácido 129 a 134 da

SEQ ID NO: 2; (c) resíduos de aminoácido 53 a 58 da SEQ ID

NO: 2; (d) resíduos de aminoácido 35 a 40 da SEQ ID NO: 2; (e) resíduos de aminoácido 33 a 38 da SEQ ID NO: 2; (f) resíduos de aminoácido 114 a 119 da SEQ ID NO: 2; (g) resíduos de aminoácido 101 a 105 da SEQ ID NO: 2; (h) resíduos de aminoácido 126 a 131 da SEQ ID NO: 2; (i) resíduos de aminoácido 113 a 118 da SEQ ID NO: 2; e (j) resíduos de aminoácido 158 a 162 da SEQ ID NO: 2 A

presente invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a um polipéptido que consiste em resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 54 a 59 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácido 129 a 134 da SEQ ID NO: 2; (c) resíduos de aminoácido 53 a 58 da SEQ ID NO: 2; (d) resíduos de aminoácido 35 a 40 da SEQ ID NO: 2; (e) resíduos de aminoácido 33 a 38 da SEQ ID NO: 2; (f) resíduos de aminoácido 114 a 119 da SEQ ID NO: 2; (g) resíduos de aminoácido 101 a 105 da SEQ ID NO: 2; (h) resíduos de aminoácido 126 a 131 da SEQ ID NO: 2; (i) resíduos de aminoácido 113 a 118 da SEQ ID NO: 2; e (j) resíduos de aminoácido 158 a 162 da SEQ ID NO: 2. A presente invenção proporciona ainda um anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a um polipéptido que consiste numa porção da SEQ ID NO: 11, em que a dita porção consiste em entre 30 e 100 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 11, e em que a dita porção contém a sequência de aminoácido seleccionada a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 34 a 39 da SEQ ID NO: 11; (b) resíduos de aminoácido 46 a 51 da SEQ ID NO: 11; (c) resíduos de aminoácido 131 a 136 da SEQ ID NO: 11; (d) resíduos de aminoácido 158 a 163 da SEQ ID NO: 11; e (e) resíduos de aminoácido 157 a 162 da SEQ ID NO: 11. A presente invenção ainda proporciona adicionalmente um anticorpo ou fragmento de anticorpo que 5 especificamente se liga a um polipéptido que consiste em resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 34 a 39 da SEQ ID NO: 11; (b) resíduos de aminoácido 46 a 51 da SEQ ID NO: 11; (c) resíduos de aminoácido 131 a 136 da SEQ ID NO: 11; (d) resíduos de aminoácido 158 a 163 da SEQ ID NO: 11; e (e) resíduos de aminoácido 157 a 162 da SEQ ID NO: 11. A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção como foi definido anteriormente para utilização na redução de inflamação induzida por um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 27 a 164 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos de aminoácido 31 a 163 da SEQ ID NO: 11. A presente invenção também proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo da presente invenção como foi definido anteriormente para utilização no tratamento do mamífero afligido com uma doença inflamatória, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo especificamente se liga a um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 27 a 164 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos de aminoácido 31 a 163 da SEQ ID NO: 11. A invenção proporciona ainda um anticorpo da presente invenção como foi definido anteriormente para utilização num método de supressão de uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação, o dito método que compreende: (1) determinar o nível de uma molécula inflamatória; (2) administrar o dito medicamento; (3) determinar um nível após a administração da molécula inflamatória; (4) comparar o nível da molécula inflamatória na etapa (1) ao nível da molécula inflamatória na etapa (3), em que uma ausência de aumento ou uma diminuição no nível de molécula inflamatória é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória. A invenção também proporciona um método in vitro de detecção da presença de um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 27 a 164 da SEQ ID NO: 2 ou um 6 polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 31 a 163 da SEQ ID NO: 11 numa amostra biológica, que compreende as etapas de: (a) colocar em contacto a amostra biológica com um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, da presente invenção como foi definido anteriormente, em que a colocação em contacto é realizada sob condições que permitem a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo à amostra biológica; e (b) detectar qualquer dos anticorpos ligados ou fragmentos de anticorpo ligados. A invenção também proporciona um método in vitro para detectar inflamação num paciente, que compreende: (a) incubar uma amostra de amostra de tecido ou biológica de um paciente com um anticorpo da presente invenção como foi definido anteriormente sob condições em que o anticorpo se liga ao seu polipéptido complementar na amostra de tecido ou biológica; (b) visualizar o anticorpo ligado numa amostra de tecido ou biológica; e (c) comparar níveis de anticorpo ligado na amostra de tecido ou biológica do paciente com uma amostra de tecido ou biológica normal de controlo, em que um aumento no nível de anticorpo ligado à amostra de tecido ou biológica do paciente em relação à amostra de tecido ou biológica normal de controlo é indicativo de inflamação no paciente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma ilustração do alinhamento múltiplo de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 2) (zcytorl71ig), zcytorl71ig de ratinho (SEQ ID NO: 11) (mzcytorl71ig), ratinho IL-3 (mIL-3) (SEQ ID NO: 100), e IL-3 humana (hlL-3) (SEQ ID NO: 102) . A Figura 2 é uma ilustração de um alinhamento múltiplo de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 2) (zcytorl71ig), e zcytorl71ig ratinho (SEQ ID NO: 11) (mzcytorl71ig). A Figura 3 é um gráfico de hidrofilicidade Hopp/Woods de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 2). 7

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Antes de expor a invenção em detalhe, pode ser proveitoso para o entendimento da mesma definir os seguintes termos: 0 termo "etiqueta de afinidade" é utilizado no presente documento para denotar um segmento de polipéptido que pode ser unido a um segundo polipéptido para proporcionar purificação ou detecção do segundo polipéptido ou proporcionar locais para união do segundo polipéptido a um substrato. Em principal, qualquer péptido ou proteína para que um anticorpo ou outro agente de ligação específico está disponível pode ser utilizado como uma etiqueta de afinidade. Etiquetas de afinidade incluem uma cauda de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198 :3, 1991), glutationa S transferase (Smith e Johnson, Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7952-4,1985), substância P, péptido Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de ligação a estreptavidina, ou outro epítopo antigénico ou domínio de ligação. Veja-se, em geral, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Etiquetas de afinidade que codificam ADN estão disponíveis de fornecedores comerciais (por exemplo, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). O termo "variante alélica" é utilizado no presente documento para denotar qualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossómico. A variação alélica surge de forma natural através de mutação, e pode ter como resultado polimorfismo fenotípico dentro de populações. Mutações génicas podem ser silenciosas (sem mudança no polipéptido codificado) ou podem codificar polipéptidos que têm sequência de aminoácido alterada. O termo variante alélica também é utilizado no presente documento para denotar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. 0 termos "amino-terminal" e "carboxil-terminal" são utilizados no presente documento para denotar posições nos polipéptidos. Onde o contexto permite, estes termos são utilizados com referência a uma particular sequência ou porção de um polipéptido para denotar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma certa sequência numa posição carboxil-terminal em relação a uma sequência de referência num polipéptido tem uma localização proximal à terminação carboxilo da sequência de referência, mas não está necessariamente na terminação carboxilo do polipéptido completo. 0 termo "par complemento/anti-complemento" denota fracções não idênticas que formam um par estável associado de forma não covalente sob condições apropriadas. Por exemplo, biotina e avidina (ou estreptavidina) são membros prototípicos de um par complemento/anti-complemento. Outros pares complemento/anti-complemento exemplares incluem pares receptor/ligando, pares anticorpo/antigénio (ou hapteno ou epítopo), pares de polinucleótido sense/antisense, e similares. Onde a dissociação subsequente do par complemento/anti-complemento é desejável, o par complemento/anti-complemento preferentemente tem uma afinidade de ligação de <109 M"1. O termo "complementos de uma molécula de polinucleótido" denota uma molécula de polinucleótido que tem uma sequência de bases complementares e orientação reversa em comparação com uma sequência de referência. Por exemplo, a sequência 5' ATGCACGGG 3' é complementar a 5' CCCGTGCAT 3'. 0 termo "contig" denota um polinucleótido que tem um trecho contíguo de sequência idêntica ou complementar a outro polinucleótido. Diz-se que as sequências contíguas "sobrepõem" um dado trecho de sequência de polinucleótido 9 em sua totalidade ou ao longo de um trecho parcial do polinucleótido. Por exemplo, contigs representativos da sequência de polinucleótido 5'-ATGGCTTAGCTT-3' são 5'-TAGCTTgagtct-3' e 3'-gtcgacTACCGA-5'. 0 termo "sequência de nucleótidos degenerada" denota uma sequência de nucleótidos que inclui um ou mais codões degenerados (em comparação com uma molécula de polinucleótido de referência que codifica um polipéptido). Codões degenerados contêm tripletos diferentes de nucleótidos, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (isto é, tripletos GAU e GAC cada codificam Asp). O termo "vector de expressão" é utilizado para denotar uma molécula de ADN, linear ou circular, que compreende um segmento que codifica um polipéptido de interesse ligado operativamente a segmentos adicionais que possibilitam sua transcrição. Tais segmentos adicionais incluem sequências promotoras e de terminação, e podem também incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores seleccionáveis, um potenciador, um sinal de poliadenilação, etc. Vectores de expressão são geralmente derivados de ADN de plasmídeo ou virai, ou pode conter elementos de ambos. 0 termo "isolado", quando é aplicado a um polinucleótido, denota que o polinucleótido foi retirado de seu ambiente genético natural e é assim livre de outras sequências codificantes estranhas ou não desejadas, e está numa forma adequada para utilização dentro sistemas de produção de proteínas modificadas por engenharia genética. Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas de seu ambiente natural e incluem ADNc e clones genómicos. Moléculas isoladas de ADN da presente invenção são livres de outros genes com que estão ordinariamente associados, mas podem incluir regiões não traduzidas que ocorrem de forma natural 5' e 3' tal como promotores e terminadores. A identificação de regiões associadas será evidente a um 10 perito comum na especialidade (veja-se, por exemplo, Dynan e Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Um polipéptido ou proteína "isolado" é um polipéptido ou proteína que se encontra numa condição diferente de seu ambiente nativo, tal como fora do tecido animal e sangue. Numa forma preferida, o polipéptido isolado é substancialmente livre de outros polipéptidos, particularmente outros polipéptidos de origem animal. É preferido proporcionar os polipéptidos numa forma altamente purificada, isto é, superior a 95 % pura, mais preferentemente superior a 99 % pura. Quando é utilizado neste contexto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipéptido em formas físicas alternativas, tais como dímeros ou alternativamente formas glicosiladas ou derivatizadas. O termo "neoplásico", quando se refere a células, indica célula que está a sofrer proliferação nova e anormal, particularmente num tecido onde na proliferação é descontrolada e progressiva, resultando num neoplasma. As células neoplásicas podem ser malignas, isto é, invasivas e metastáticas, ou benignas. O termo "ligado operativamente", quando se refere a segmentos de ADN, indica que os segmentos são dispostos de modo que funcionam em harmonia para seus propósitos pretendidos, por exemplo, a transcrição inicia no promotor e prossegue através do segmento de codificação até o terminador. O termo "ortólogo" denota um polipéptido ou proteína obtida de uma espécie que é a contraparte funcional de um polipéptido ou proteína de uma espécie diferente. Diferenças de sequência entre ortólogos são o resultado de especiação. "Parálogos" são proteínas distintas, mas estruturalmente relacionadas feitas por um organismo. Acredita-se que os parálogos surjam através da duplicação 11 do gene. Por exemplo, a-globina, β-globina, e mioglobina são parálogos entre si.

Um "polinucleótido" é um polímero de cadeia simples ou dupla de bases de desoxirribonucleótido ou ribonucleótido lidos desde a extremidade 5' até a extremidade 3'. Os polinucleótidos incluem ARN e ADN, e podem ser isolados de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. Os tamanhos de polinucleótidos são expressos como pares de bases (abreviados "pb"), nucleótidos ("nt"), ou quilobases ("kb"). Onde o contexto permita, os dois últimos termos podem descrever polinucleótidos que são de cadeia simples ou de cadeia dupla. Quando o termo é aplicado a moléculas de cadeia dupla é utilizado para denotar o comprimento completo e será entendido que seja equivalente ao termo "pares de bases". Será reconhecido pelos peritos na especialidade que as duas cadeias de um polinucleótido de cadeia dupla podem diferir ligeiramente em comprimento e que as extremidades do mesmo podem ser dispostas alternadamente como um resultado da clivagem enzimática; assim todos os nucleótidos numa molécula de polinucleótido de cadeia dupla podem não estar emparelhados.

Um "polipéptido" é um polímero de resíduos de aminoácido unido por ligações peptídicas, tanto se for produzido de forma natural ou sinteticamente. Polipéptidos de menos de aproximadamente 10 resíduos de aminoácido são comummente denominados como "péptidos". O termo "promotor" é utilizado no presente documento pelo seu significado conhecido na especialidade para denotar uma porção de um gene que contém sequências de ADN que possibilitam a ligação da ARN polimerase e iniciação da transcrição. As sequências promotoras são comummente, mas não sempre, encontradas nas regiões não codificantes 5' dos genes. 12

Uma "proteína" é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias de polipéptidos. Uma proteína pode também compreender componentes não peptídicos, tais como grupos de hidratos de carbono. Hidratos de carbono e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula na qual a proteína é produzida, e variará com o tipo de célula. As proteínas são definidas no presente documento em termos das suas estruturas principais de aminoácido; substituintes tais como grupos de hidratos de carbono não são geralmente especificados, mas podem estar presentes mesmo assim. 0 termo "receptor" denota uma proteína associada à célula que se liga a uma molécula bioactiva (isto é, um ligando) e medeia o efeito do ligando sobre a célula. Receptores ligados à membrana são caracterizados por uma estrutura multi-peptídica que compreende um domínio de ligação a um ligando extracelular e um domínio efector intracelular que está tipicamente envolvido na transdução de sinal. Ligação de ligando a receptor tem como resultado uma mudança conformacional no receptor que produz uma interacção entre o domínio efector e outra(s) molécula(s) na célula. Esta interacção por sua vez leva a uma alteração no metabolismo da célula. Eventos metabólicos que estão associados a interacções receptor-ligando incluem transcrição de genes, fosforilação, desfosforilação, aumentos na produção de AMP cíclico, mobilização de cálcio celular, mobilização de lípidos de membrana, adesão celular, hidrólise de lípidos de inositol e hidrólise de fosfolípidos. Em geral, os receptores podem ser receptor ligado à membrana, citossólico ou nuclear; monomérico (por exemplo, receptor da hormona de estimulação da tireoide, receptor beta-adrenérgico) ou multimérico (por exemplo, receptor do PDGF, receptor da hormona do crescimento, receptor da IL-3, receptor do GM-CSF, receptor do G-CSF, receptor da eritropoietina e receptor da IL-6). 13 0 termo "sequência sinal de secreção" denota uma sequência de ADN que codifica um polipéptido (um "péptido de secreção") que, como um componente de um polipéptido maior, direcciona o polipéptido maior através de uma via de secreção de uma célula na qual é sintetizado. 0 polipéptido maior é comummente clivado para remover o péptido de secreção durante o trânsito através da via de secreção. 0 termo "variante de splicing" é utilizado no presente documento para denotar formas alternativas de ARN transcritas de um gene. Variação resultante de splicing surge de forma natural através da utilização de locais de splicing alternativos dentro de uma molécula de ARN transcrita, ou menos comummente entre moléculas de ARN separadamente transcritas, e pode ter como resultado diversos ARNm transcritos do mesmo gene. Variantes de splicing podem codificar polipéptidos que têm

Pesos moleculares e comprimentos de polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (por exemplo, eletroforese em gel) serão entendidos como sendo valores aproximados. Quando tal valor é expresso como "aproximadamente" X ou "de maneira aproximada" X, o valor indicado de X será entendido que seja exacto a ±10 %. A presente memória descritiva descreve a descoberta de uma nova sequência de ADN que codifica uma proteína que tem a estrutura de uma citocina de quatro feixes helicoidais. Através de processos de clonagem, e ensaios de proliferação descritos em detalhe no presente documento, identificou-se uma sequência de polinucleótido que codifica um novo polipéptido de ligando que é um ligando com alta especificidade para o receptor zcytorl7 (SEQ ID NO: 5) e pelo menos uma subunidade adicional que compreende receptor da Oncostatina M beta (OSMRbeta) (SEQ ID NO: 7) e WSX-1 (SEQ ID NO: 9). Este ligando de polipéptido, designado zcytorl71ig, foi isolado de uma biblioteca de ADNc gerada a partir de células de sangue periférico humano activadas 14 (hPBCs), que foram seleccionadas para CD3. CD3 é um marcador de superfície celular único para células de origem linfóide, particularmente células T.

Nos exemplos que se seguem, uma linha de células que é dependente da via associada ao receptor de zcytorl7 e OSMRbeta ou dependente de OSMRbeta e WSX-1 e a via associada ao zcytorl7 para a sobrevivência e crescimento na ausência de outros factores de crescimento foi utilizada para rastrear uma fonte do ADNc que codifica o zcytorl71ig. A linha de células dependente de factor de crescimento preferida que foi utilizada para a transfecção e expressão de receptor zcytorl7 foi BaF3 (Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). No entanto, outras linhas de células dependentes de factor de crescimento, tais como FDC-Pl (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984), e M07e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993) são adequadas para este propósito. A sequência de aminoácido para os receptores de OSMR, WSX-1 e zcytorl7 indicou que os receptores codificados pertenciam à subfamília de receptor de citocina de Classe 1, que inclui, mas não é limitado a, os receptores para IL- 2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF e G-CSF (para uma revisão veja-se, Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" em Cytokine 5(2): 95-106,1993). O receptor de zcytorl7 está descrito completamente no Pedido de Patente PCT de propriedade comum N° US01/20484 (publicação WIPO N° WO 02/00721), e WSX-1 está descrito completamente na Patente US N° 5.925.735. A análise da distribuição de tecido do ARNm do receptor de zcytorl7 revelou a expressão em subconjuntos de células T CD4+ e CD8+ activadas, monócitos CD14+, e expressão mais fraca em células B CD19+. Além disso, o ARNm estava presente em ambas as linhas de células monocíticas em repouso ou 15 activadas THP-1 (N° de ATCC TIB-202), U937 (N° de ATCC CRL-1593,2) e HL60 (N° de ATCC CCL-240). A expressão de WSX-1 é maís forte no timo, baço, PBL, e gânglio linfático, bem como expressão aumentada observada para células T activadas. A distribuição de tecido para OSMRbeta é descrita como muito ampla. A distribuição de tecido destes três receptores sugere que um alvo para o Zcytorl71ig predito são as células de linhagem hematopoiética, em particular células T, monócitos/macrófagos e células progenitoras linfóides e células linfóides. Outras citocinas de quatro feixes helicoidais conhecidas que actuam sobre as células linfóides incluem IL-2, IL-4, IL-7, e IL-15. Para uma revisão de citocinas de quatro feixes helicoidais, veja-se, Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52:1-65, 1999 e Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76:300-317, 1998.

Meios condicionados (CM) de células de sangue periférico humano seleccionadas por CD3+, estimuladas por Ionomicina/PMA suportaram o crescimento de células BaF3 que expressaram o receptor de zcytorl7, OSMRbeta e receptor de WSX-1 e eram dependentes de outro modo de IL-3. Meios condicionados de células que não eram: 1) estimuladas por PMA/Ionomicina; ou não eram: 2) seleccionadas por CD3 (com ou sem estimulação por PMA/Ionomicina) não suportaram o crescimento de células Baf3 que expressam zcytorl7, OSMRbeta e células que expressam receptor de WSX-1 (BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta). Experiências de controlo demonstraram que esta actividade proliferativa não foi atribuível a outros factores de crescimento conhecidos, e que a habilidade de tais meios condicionados estimulam a proliferação de células que expressam receptor de zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta poderia ser neutralizada por uma forma solúvel do receptor de zcytorl7.

Os meios condicionados de células seleccionadas por CD3+ activadas com PMA/Ionomicina também suportaram o 16 crescimento de células BaF3 que expressaram o receptor de zcytorl7 e receptor de OSMRbeta (zcytor17/OSMRbeta), enquanto células BaF3 que expressam somente receptor de zcytorl7 e receptor de WSX-1 (zcytor17/WSX-l), ou que contêm somente o receptor de OSMRbeta, não foram estimuladas por este meio condicionado. A proliferação de células BaF3 que expressam receptor de zcytorl7fWSX-l/0SMRbeta expostas a CM de células de sangue periférico humano seleccionadas por CD3+, estimuladas por Ionomicina/PMA foi identificada por inspecção visual das culturas e/ou por ensaio de proliferação. Muitos ensaios de proliferação adequados são conhecidos na técnica, e incluem ensaios para a redução de um corante tal como AlamarBlue™ (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (Mosman, J. Immunol. Met. 65: 55-63, 1983); 3,(4,5 dimetil tiazol-2il)-5-3- carboximetoxifenil-2H-tetrazólio; hidróxido de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazólio; e cloreto de cianoditolil-tetrazólio (que estão disponíveis comercialmente de Polisciences, Inc., Warrington, PA) ; ensaios de mitogénese, tais como medição de incorporação de 3H-timidina; ensaios de exclusão de corante utilizando, por exemplo, negro de naftaleno ou azul de tripano; absorção de corante utilizando fluoresceina de diacetilo; e libertação de cromo. Veja-se, em geral, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Básico Technique, 3a ed., Wiley-Liss, 1994, que é incorporado no presente documento por referência.

Uma biblioteca de ADNc foi preparada a partir de células primárias de sangue periférico humano seleccionados por CD3+, estimuladas por Ionomicina e PMA. A biblioteca de ADNc de células de sangue periférico humano seleccionadas por CD3+, estimuladas por Ionomicina e PMA foi dividida em grupos que contêm múltiplas moléculas de ADNc e foi 17 transfectada numa linha de células hospedeiras, por exemplo, células BHK 570 (N° de Acesso do ATCC 10314) . As células hospedeiras transfectadas foram cultivadas num meio que não contém factores de crescimento exógenos (por exemplo, 5 % de FBS) e meio condicionado foi colhido. Os meios condicionados foram ensaiados para a habilidade de estimulação da proliferação de células BaF3 transfectadas com os receptores de zcytorl7, WSX-1, e OSMRbeta. Os grupos de ADNc produtores de meio condicionado que estimulou células de receptor de BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta foram identificados. Este ADNc de plasmídeo agrupado foi electroporado em E. coli. O ADNc foi isolado a partir de colónias únicas e transfectadas individualmente em células BHK570. Clones positivos foram identificados por um resultado positivo no ensaio de proliferação de receptor de BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta, e a actividade foi confirmada pela neutralização de proliferação utilizando o receptor de zcytorl7 solúvel.

Um clone positivo foi isolado, e a análise de sequência revelou que a sequência de polinucleótido contida dentro do ADN de plasmídeo era nova. A sequência sinal de secreção está compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 23 (Ala), e o polipéptido maduro está compreendido de resíduos de aminoácido 24 (Ser) a 164 (Thr) (como é mostrado na SEQ ID NO: 2). A análise de sequenciamento N terminal adicional de zcytorl71ig purificado de células 293T mostrou uma terminação N no resíduo 27 (Leu) como é mostrado na SEQ ID NO: 2, com o polipéptido maduro compreendido de resíduos de aminoácido 27 (Leu) a 164 (Thr) (como é mostrado na SEQ ID NO: 2).

Em geral, prevê-se que as citocinas tenham uma estrutura de quatro hélices alfa, com as hélices A, C e D sendo as mais importantes nas interacções ligando-receptor, e são mais altamente conservadas entre membros da família. Em referência à sequência de aminoácido de zcytorl71ig 18 humano mostrada na SEQ ID NO: 2, alinhamento de zcytorl71ig humano, IL-3 humana, e sequências de aminoácido de citocina humana prevê-se que a hélice A de zcytorl71ig seja definida por resíduos de aminoácido 38-52; a hélice B por resíduos de aminoácido 83-98; a hélice C por resíduos de aminoácido 104-117; e a hélice D por resíduos de aminoácido 137-152; como é mostrado na SEQ ID NO: 2. A análise estrutural sugere que o loop A/B é longo, o loop B/C é curto e o loop C/D é longo. Esta estrutura de loop tem como resultado uma organização helicoidal para cima-para cima-para baixo-para baixo. Com base na estrutura de feixe de 4 hélices, os resíduos de cisteína dentro de zcytorl71ig que são conservados correspondem a resíduos de aminoácido 72, 133, e 147 da SEQ ID NO: 2; e 74, 137, e 151 da SEQ ID NO: 11 descritos no presente documento. A colocação de cisteína consistente é confirmação adicional da estrutura de feixe de quatro hélices. Também altamente conservado no zcytorl71ig é o resíduo Glu como é mostrado na SEQ ID NO: 2 no resíduo 43.

Além disso, a sequência de aminoácido predita de zcytorl71ig murino mostra 31 % de identidade à proteína humana predita sobre o comprimento inteiro das sequências (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 11) . Com base na comparação entre as sequências de zcytorl71ig humano e murino encontraram-se resíduos conservados nas regiões preditas que codificam alfa hélices C e D. Os polinucleótidos correspondentes que codificam as regiões, domínios, motivos, resíduos e sequências de polipéptido de zcytorl71ig humano descritos no presente documento são como é mostrado na SEQ ID NO: 1.

Enquanto a hélice D é conservada relativamente entre zcytorl71ig humano e murino, a hélice C é a mais conservada. Enquanto ambas as espécies têm aminoácidos ácidos predominantes nesta região, as diferenças podem representar especificidade de espécies na interacção entre 19 zcytorl71ig e o seu receptor, zcytorl7 que compreende receptores monomérico, heterodimérico (por exemplo, zcytorl7/0S-MRbeta, WSX-l/IOSMRbeta, zcytor17/WSX-l) ou multimérico (por exemplo, zcytorl7/0SMRbetaIWSX-l). Loop A/B e a hélice B de zcytorl71ig são marginalmente conservados, e a hélice C através de Loop C/D em hélice D é a mais conservada entre as espécies; conservação através desta região sugere que é significativa funcionalmente. As hélices D de zcytorl71ig humano e murino são também conservadas. Os antagonistas de receptor de zcytorl7 podem ser desenhados através de mutações dentro da hélice D de zcytorl71ig. Estes podem incluir truncamento da proteina do residuo Thrl56 (SEQ ID NO: 2), ou conservação de resíduos que conferem a ligação do ligando ao receptor, mas diminuem a actividade de sinalização.

As citocinas de quatro feixes helicoidais são também agrupadas pelo comprimento das suas hélices de componente. As citocinas de forma de "hélice longa" consistem geralmente em hélices de entre 24-30 resíduos, e incluem IL-6, factor neutrotrófico ciliar (CNTF) , factor de inibição da leucemia (LIF) e hormona de crescimento humano (hGH). As citocinas de forma de "hélice curta" consistem geralmente em hélices de entre 18-21 resíduos e incluem IL-2, IL-4 e GM-CSF. Acredita-se que zcytozl71ig seja um novo membro do grupo das citocinas de forma de hélice curta. Estudos utilizando CNTF e IL-6 demonstraram que uma hélice de CNTF podem ser permutadas para a hélice equivalente em IL-6, que conferem propriedades de ligação de CTNF à quimera. Assim, parece que os domínios funcionais de citocinas de quatro hélices são determinados com base na homologia estrutural, independente da identidade de sequência, e pode manter integridade funcional numa quimera (Kallen et ai., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). Portanto, os domínios helicoidais de zcytorl71ig serão úteis para preparar moléculas, fusão quimérica, 20 particularmente com outras citocinas de forma de hélice curta. Para determinar e modular a especificidade de ligação a receptor. De particular interesse são proteínas de fusão modificadas por engenharia com hélice A e/ou hélice D, e proteínas de fusão que combinam domínios helicoidais e loop de outras citocinas de forma curta tais como IL-2, IL-4, IL-15, Lif, 1-12, IL-3 e GM-CSF. A sequência de polinucleótido para IL-2 humana é mostrada na SEQ ID NO: 161 e a sequência de aminoácido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 162. A sequência sinal de secreção está compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 20 (Ser) da SEQ ID NO: 162; nucleótidos 48 a 107 da SEQ ID NO: 161. O polipéptido maduro está compreendido de resíduos de aminoácido 21 (Ala) a 156 (Thr) da SEQ ID NO: 162; nucleótidos 108 a 515 da SEQ ID NO: 161. A hélice A de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 27 (Thr) a 48 (Leu) da SEQ ID NO: 162; nucleótidos 126 a 191 da SEQ ID NO: 161. A hélice B de IL-2 humana compreende Hélice BI e a hélice B2. A hélice BI de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 73 (Ala) a 80 (Gin) da SEQ ID NO: 162; nucleótidos 264 a 287 da SEQ ID NO: 161. A hélice B2 de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 83 (Glu) a 92 (Vai) da SEQ ID NO: 162, nucleótidos 294 a 323 da SEQ ID NO: 161. Assim, a Hélice B (que compreende as Hélices BI e B2) de IL-2 é representada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 168 (sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 167) em que resíduos de aminoácido 9 e 10 podem ser qualquer aminoácido. SEQ ID NO: 168 é idêntica a aminoácidos 73 (Ala) a 92 (Vai) da SEQ ID NO: 162 em que aminoácidos 81 e 82 são qualquer aminoácido. Numa forma preferida, a Hélice B de IL-2 compreende aminoácidos 73 (Ala) a 92 (Vai) da SEQ ID NO: 162; nucleótidos 264 a 323 da SEQ ID NO: 161. A hélice C de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 102 (His) a 116 (Vai) da SEQ ID NO: 162 21 nucleótidos 351 a 395 da SEQ ID NO: 161. A hélice D de IL-2 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 134 (Thr) a 149 (Gin) da SEQ ID NO: 162; nucleótidos 447 a 494 da SEQ ID NO: 161. A sequência de polinucleótido para IL-4 humana é mostrada na SEQ ID NO: 163 e a sequência de aminoácido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 164. A sequência sinal de secreção está compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 24 (Gly) da SEQ ID NO: 164; nucleótidos 64 a 135 da SEQ ID NO: 163. O polipéptido maduro está compreendido de resíduos de aminoácido 25 (His) a 153 (Ser) da SEQ ID NO: 164; nucleótidos 136 a 522 da SEQ ID NO: 163. A hélice A de IL-4 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 30 (Thr) a 42 (Thr) da SEQ ID NO: 164; nucleótidos 151 a 189 da SEQ ID NO: 163. A hélice B de IL-4 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 65 (Glu) a 83 (His) da SEQ ID NO: 164; nucleótidos 256 a 312 da SEQ ID NO: 163. A hélice C de IL-4 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 94 (Ala) a 118 (Ala) da SEQ ID NO: 164; nucleótidos 343 a 417 da SEQ ID NO: 163. A hélice D de IL-4 humana está compreendida de resíduos de aminoácido 133 (Leu) a 151 (Cys) da SEQ ID NO: 164; nucleótidos 460 a 516 da SEQ ID NO: 163. A sequência de polinucleótido para GM-CSF humano é mostrada na SEQ ID NO: 165 e a sequência de aminoácido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 166. A sequência sinal de secreção está compreendida de resíduos de aminoácido 1 (Met) a 17 (Ser) da SEQ ID NO: 166; nucleótidos 9 a 59 da SEQ ID NO: 165. O polipéptido maduro está compreendido de resíduos de aminoácido 18 (Ala) a 144 (Glu) da SEQ ID NO: 166; nucleótidos 60 a 440 da SEQ ID NO: 165. A hélice A de GM-CSF humano está compreendida de resíduos de aminoácido 30 (Trp) a 44 (Asn) da SEQ ID NO: 166; nucleótidos 96 a 140 da SEQ ID NO: 165. A hélice B de GM-CSF humano está compreendida de resíduos de aminoácido 22 72 (Leu) a 81 (Gin) da SEQ ID NO: 166; nucleótidos 222 a 251 da SEQ ID NO: 165. A hélice C de GM-CSF humano está compreendida de resíduos de aminoácido 85 (Gly) a 103 (Gin) da SEQ ID NO: 166; nucleótidos 261 a 317 da SEQ ID NO: 165. A hélice D de GM-CSF humano está compreendida de resíduos de aminoácido 120 (Phe) a 131 (Leu) da SEQ ID NO: 166; nucleótidos 366 a 401 da SEQ ID NO: 165.

Os resíduos de aminoácido que compreendem hélices A C, e D, para zcytorl71ig humano, IL-3, IL-2, IL-4, e GM-CSF são mostrados no Quadro 1.

Quadro 1 Hélice A Hélice B Hélice C Hélice D zcytor171ig 38-52 83-98 104-117 137-152 de SEQ ID NO: 2 IL—3 35-45 73-86 91-103 123-141 de SEQ ID NO: 102 IL —2 27-48 73-92 102-116 134-149 de SEQ ID NO: 162; ou Hélice B como é descrito na SEQ ID NO: 168 IL— 4 GM-CSF 30-42 30-44 65-83 72-81 94-118 133- 51 85-103 120-131 de SEQ ID NO: 164 de SEQ ID NO: 166 A presente memória descritiva descreve moléculas de polinucleótido, incluindo moléculas de ADN e ARN, que codificam os polipéptidos de zcytorl71ig revelados no presente documento. Os peritos na especialidade reconhecerão prontamente que, em vista de degeneração do código genético, uma variação considerável da sequência é possível entre estas moléculas de polinucleótido. SEQ ID NO: 3 é uma sequência de ADN degenerada que abrangia todos os ADN que codificam o polipéptido de zcytorl71ig, e fragmentos do mesmo, da SEQ ID NO: 2. Os peritos na especialidade reconhecerão que a sequência degenerada da SEQ ID NO: 3 também proporciona todas as sequências de ARN que codificam SEQ ID NO: 2 por meio da substituição de U por T. Assim, os polinucleótidos que codificam polipéptido 23 de zcytorl71ig que compreendem nucleótido 1 ou 70 a nucleótido 492 da SEQ ID NO: 3 e os seus equivalentes de ARN estão contemplados pela presente invenção. O Quadro 2 indica os códigos de uma letra utilizados dentro da SEQ ID NO: 3 para denotar posições de nucleótido degeneradas. "Resoluções" são os nucleótidos denotados por uma letra de código. "Complemento" indica o código para o(s) nucleótido(s) complementar(es). Por exemplo, o código Y denota C ou T, e o seu complemento R denota A ou G, com A sendo complementar a T, e G sendo complementar a C.

Quadro 2

Nucleótido Resolução Complemento Resolução A A T T c c G G G G C C T T A A R A G Y C | T Y C T R A | G M A C K G | T K G | T M A | C s C | G s C | G w A | T W A | T H A| C | T D A | G | T B C | G | T V A|C|G V A| C | G B C | G | T D A | G | T H AICIT N A | C | G | T N A | C | G | T Os codões degenerados utilizados na SEQ ID NO: 3, que abrangem todos os codões possíveis para um dado aminoácido, são indicados no Quadro 3. Quadro 3 Aminoácido Código de Aa Letra Codões Codão Degenerado Cys C TGC TGT TGY Ser S AGC AGT TCA TCC WSN

TCG TCT 24

Thr T ACA ACC ACG ACT ACN Pro P CCA CCC CCG CCT CCN Ala A GCA GCC GCG GCT GCN Gly G GGA GGC GGG GGT GGN Asn N AAC AAT AAY Asp D GAC GAT GAY Glu E GAA GAG GAR Gin G CAA CAG CAR His H CAC CAT CAY Arg R AGAAGGCGACGCCGGCGT MGN Lys K AAA AAG AAR Met M ATG ATG Ile I ATA ATC ATT ATH Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Vai V GTA GTC GTG GTT GTN Phe F TTC TTT TTY Tyr Y T ACT AT TAY Trp W TGG TGG Ter TAA TAG TGA TRR Asn|Asp B RAY Glu|Gin Z SAR Qualquer X NNN Um perito na especialidade apreciará que alguma ambiguidade é introduzida na determinação de um codão degenerado, representativo de todos os codões possíveis que codificam cada aminoácido. Por exemplo, o codão degenerado para serina (WSN) pode, em algumas circunstâncias, codificar arginina (AGR), e o codão degenerado para arginina (MGN) pode, em algumas circunstâncias, codificar serina (AGY). Uma relação similar existe entre codões que codificam fenilalanina e leucina. Assim, alguns polinucleótidos abrangidos pela sequência degenerada podem codificar sequências de aminoácido variantes, mas um perito na especialidade pode facilmente identificar tais sequências variantes por referência à sequência de 25 aminoácido da SEQ ID NO: 2. As sequências variantes podem ser prontamente testadas para funcionalidade como é descrito no presente documento.

Um perito na especialidade apreciará também que espécies diferentes podem exibir "utilização de codão preferencial". Em geral, veja-se, Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean e Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Como utilizado no presente documento, o termo "utilização de codão preferencial" ou "codões preferenciais" é um termo da especialidade que se refere a codões de tradução de proteínas que são utilizados com mais frequência em células de uma certa espécie, favorecendo assim um ou alguns representativos dos codões possíveis que codificam cada aminoácido (Veja-se Quadro 3). Por exemplo, o aminoácido Treonina (Thr) pode ser codificado por ACA, ACC, ACG, ou ACT, mas em células de mamíferos ACC é o codão utilizado mais comummente; em outras espécies, por exemplo, células de insectos, levedura, vírus ou bactérias, codões Thr diferentes podem ser preferenciais. Codões preferenciais para uma espécie particular podem ser introduzidos nos polinucleótidos da presente invenção por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Introdução de sequências de codão preferenciais em ADN recombinante pode, por exemplo, aumentar a produção da proteína tornando a tradução da proteína mais eficaz dentro de uma espécie ou tipo de células particular. Portanto, a sequência de codão degenerada revelada na SEQ ID NO: 3 serve como um molde para optimizar a expressão de polinucleótidos em várias espécies ou tipos de células comummente utilizados na especialidade e revelados no presente documento. As sequências que contêm codões preferenciais podem ser testadas e optimizadas para a expressão em várias espécies. 26 e testadas para funcionalidade como é revelado no presente documento.

Como foi notado anteriormente, os polinucleótidos isolados descritos no presente documento incluem ADN e ARN. Os métodos para preparar ADN e ARN são bem conhecidos na técnica. Em geral, ARN é isolado de um tecido ou célula que produz quantidades grandes de ARN de zcytorl71ig. Tais tecidos e células são identificadas por Northern blotting (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 5201, 1980), ou por rastreio do meio condicionado de vários tipos de células para actividade em células ou tecido alvo. Uma vez que o tecido ou célula que produz ARN ou actividade seja identificado, ARN total pode ser preparado utilizando extraeção de isotiocianato de guanidinio seguido por isolamento por centrifugação num gradiente de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). ARN poli (a)+ é preparado a partir de ARN total utilizando o método de Aviv e Leder (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408-12, 1972). ADN complementar (ADNc) é preparado a partir de ARN poli(a)+ utilizando métodos conhecidos. Na alternativa, ADN genómico pode ser isolado. Polinucleótidos que codificam polipéptidos de zcytorl71ig são então identificados e isolado por meio de, por exemplo, hibridação ou PCR.

Um clone de comprimento completo que codifica zcytorl71ig pode ser obtido por procedimentos de clonagem convencionais. Clones ADN complementar (ADNc) são preferidos, embora para algumas aplicações (por exemplo, a expressão em animais transgénicos) pode ser preferível utilizar um clone genómico, ou para modificar um clone de ADNc para incluir pelo menos um intrão genómico. Os métodos para preparar ADNc e clones genómicos são bem conhecidos e dentro do nível de um perito ordinário na especialidade, e incluem a utilização da sequência revelada no presente documento, ou partes da mesma, para sondar ou iniciação de uma biblioteca. Bibliotecas de expressão podem ser sondadas 27 com anticorpos contra fragmentos de zcytorl71ig, receptores solúveis que compreendem zcytorl7, ou outros parceiros de ligação específica.

As sequências de polinucleótido de zcytorl71ig reveladas no presente documento podem também ser utilizadas como sondas ou iniciadores às regiões não codificantes 5' do clone de um gene de zcytorl71ig. Em vista da expressão específica a tecido observada para zcytorl71ig espera-se que esta região de gene trate da expressão hematopoiética e linfóide específica. Elementos de promotor de um gene de zcytorl71ig poderiam ser utilizados assim para direccionar a expressão específica a tecido de genes heterólogos em, por exemplo, animais transgénicos ou pacientes tratados com terapêutica génica. Clonagem de sequências flanqueantes 5' também facilita a produção de proteínas de zcytorl71ig por "activação de gene" como foi revelado na Patente US N° 5.641.670. De maneira breve, a expressão de um gene de zcytorl71ig endógeno numa célula é alterada pela introdução no locus de zcytorl71ig de uma construção de ADN que compreende pelo menos uma sequência de direccionamento, uma sequência reguladora, um exão, e um local dador de splice não emparelhado. A sequência de direccionamento é uma sequência não codificante 5' de zcytorl71ig que permite a recombinação homóloga da construção com o locus de zcytorl71ig endógeno, por meio do qual as sequências dentro da construção se tornam ligadas operativamente com a sequência codificante de zcytorl71ig endógeno. Nesse sentido, um promotor de zcytorl71ig endógeno pode ser substituído ou suplementado com outras sequências reguladoras para proporcionar a expressão aumentada específica a tecido, ou de outro modo regulada. A presente memória descritiva descreve polinucleótidos e polipéptidos equivalentes de outras espécies (ortólogos). Estas espécies incluem, mas não são limitadas a, espécies de mamíferos, aviária, anfíbia, de réptil, de peixe, de 28 insecto e outros vertebrados e invertebrados. De particular interesse são polipéptidos de zcytorl71ig de outras espécies de mamíferos, incluindo, por exemplo, polipéptidos murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos, e outros polipéptidos de primata. Ortólogos de zcytorl71ig humano podem ser clonados utilizando informação e composições proporcionadas pela presente invenção em combinação com técnicas de clonagem convencionais. Por exemplo, um ADNc pode ser clonado utilizando ARNm obtido de um tipo de célula ou tecido que expressa zcytorl71ig como é revelado no presente documento. Fontes adequadas de ARNm podem ser identificadas pela sondagem de Northern blots com sondas desenhadas a partir das sequências reveladas no presente documento. Uma biblioteca é então preparada a partir de ARNm de um tecido ou linha de células positiva. Um ADNc que codifica zcytorl71ig pode então ser isolado por uma variedade de métodos, tais como pela sondagem com um ADNc humano completo ou parcial ou com um ou mais conjuntos de sondas degeneradas com base nas sequências reveladas. Um ADNc pode também ser clonado utilizando a reacção em cadeia da polimerase, ou PCR (Mullis, Patente US N° 4.683.202), utilizando iniciadores desenhados a partir da sequência de zcytorl71ig humano representativa revelada no presente documento. Dentro de um método adicional, a biblioteca de ADNc pode ser utilizada para transformar ou transfectar células hospedeiras, e expressão do ADNc de interesse pode ser detectada com um anticorpo contra o polipéptido de zcytorl71ig, estudos de ligação ou ensaios de actividade. Técnicas similares podem também ser aplicadas ao isolamento de clones genómicos. A sequência de polinucleótido para o ratinho ortólogo de zcytorl71ig foi identificada e é mostrada na SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 90 e a sequência de aminoácido correspondente mostrada na SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 91. A sequência degenerada de polinucleótido que codifica o 29 polipéptido da SEQ ID NO: 11 é mostrada na SEQ ID NO: 12. Para a sequência de aminoácido de citocina de zcytorl71ig de ratinho prevê-se que a hélice A é definida por resíduos de aminoácido 38-52; a hélice B por resíduos de aminoácido 85-98; a hélice C por resíduos de aminoácido 104-118; e a hélice D por resíduos de aminoácido 141-157; como é mostrado na SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 91. Existe 31 % de identidade entre as sequências de ratinho e humanas ao longo de todo o comprimento das sequências de aminoácido (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 11) de zcytorl71ig. A sequência madura para o zcytorl71ig de ratinho começa putativamente em Meti, como é mostrado na SEQ ID NO: 11, que corresponde a Meti, como é mostrado na SEQ ID NO: 2, na sequência humana. A análise de tecido revelou que a expressão de zcytorl71ig de ratinho é encontrada em testículo, cérebro, células CD90+, células de próstata, glândula salivar e pele. A análise de sequenciamento N terminal adicional de zcytorl71ig purificado de células 293T mostrou uma terminação N no resíduo 31 (Ala) como é mostrado na SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 91, com o polipéptido maduro compreendido de resíduos de aminoácido 31 (Ala) a 163 (Cys) (como é mostrado na SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 91).

Os peritos na especialidade reconhecerão que a sequência revelada na SEQ ID NO: 1 representa um único alelo de zcytorl71ig humano e que se espera que ocorram a variação alélica e splicing alternativo. Variantes alélicas desta sequência podem ser clonadas pela sondagem de ADNc ou bibliotecas genómicas de indivíduos diferentes de acordo com procedimentos spadrão. Variantes alélicas da sequência de ADN mostrada na SEQ ID NO: 1, incluindo aquelas que contém mutações silenciosas e aquelas em que mutações resultam nas mudanças de sequências de aminoácido, estão dentro do âmbito da presente invenção, como são as proteínas que são variantes alélicas da SEQ ID NO: 2. ADNc gerados a partir de ARNm de splicing alternativo, que retêm 30 as propriedades do polipéptido de zcytorl71ig, são descritos no presente documento, como são os polipéptidos codificados por tais ADNc e ARNm. Variantes alélicas e variantes de splicing destas sequências podem ser clonadas por rastreio de ADNc ou bibliotecas genómicas de diferentes indivíduos ou tecidos de acordo com procedimentos padrão conhecidos na técnica. A presente memória descritiva descreve reagentes que serão úteis em aplicações de diagnóstico. Por exemplo, o gene de zcytorl71ig, uma sonda que compreende ADN ou ARN de zcytorl71ig ou uma subsequência dos mesmos, pode ser utilizado para determinar se o gene de zcytorl71ig está presente num cromossoma humano, tal como cromossoma 12, ou se uma mutação de gene ocorreu. Zcytorl71ig está localizado na região 12q24.31 do cromossoma 12 (Exemplo 13). Aberrações cromossómicas detectáveis no locus de gene de zcytorl71ig incluem, mas não são limitadas a, aneuploidia, mudanças no número de cópias do gene, perda de heterozigosidade (LOH), translocações, inserções, deleções, mudanças e rearranjos de local de restrição. Tais aberrações podem ser detectadas utilizando polinucleótidos da presente invenção utilizando técnicas de genética molecular, tais como análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP), análise de repetição curta em tandem (STR) utilizando técnicas de PCR, e outras técnicas de análise de ligação genética conhecidas na especialidade (Sambrook et al., ibid.; Ausubel et al., ibid.; Marian, Chest 108:255-65, 1995). O conhecimento exacto de uma posição de gene pode ser útil para um número de propósitos, incluindo: 1) determinar se uma sequência é parte de um contig existente e obter sequências genéticas circunvizinhas adicionais em várias formas, tais como YAC, BAC ou clones de ADNc; 2) proporcionar um possível gene candidato para uma doença transmissível por hereditariedade que mostra ligação à 31 mesma região cromossómica; e 3) organismos modelo de referência cruzada, tais como ratinho, que podem ajudar na determinação de qual função um gene particular poderia ter.

Um perito na especialidade reconheceria que a região 12q24 está envolvida com frequência em rearranjos genómicos grosseiros, incluindo translocações, deleções, inversões, e duplicações, que são associadas a vários cancros. 0 banco de dados de Mitelman de Aberrações Cromossómicas em Cancro, no Câncer Genome Anatomy Project, National Insitutes of Health, Betesda, Md localizado na Internet lista 199 casos de cancros com rearranjos genómicos que envolvem 12q24. Destes, a maioria é parte de cariótipos complexos com outros rearranjos; no entanto, em alguns casos o rearranjo que envolve 12q24 é a única alteração genómica. Dada a expressão do receptor para zcytorl71ig em células de linhas linfóide e mielóide, é particularmente significativo notar existem pelo menos 4 casos de leucemia mielóide relatados na literatura em que translocação (2 casos: Yamagata et al, Câncer Genet Cytogenet 97:90-93, 1997; Dunphy e Batanian, Câncer Genet Cytogenet 114:51-57, 1999) ou duplicação (2 casos: Bonomi et al, Câncer Genet Cytogenet 108:75-78, 1999) são a única alteração genómica. Isto sugere que um gene ou genes que se situam dentro de 12q24 poderiam ser directamente envolvidas na transformação maligna destas células dos pacientes. Sobre-expressão inapropriada de zcytorl71ig poderia contribuir a transformação maligna pela promoção da proliferação aberrante de células que possuem receptor, através de mecanismos autócrinos ou parácrinos. A inibição da actividade de zcytorl71ig poderia inibir assim o crescimento de tais células. Alternativamente, um rearranjo genómico que tem como resultado a inactivação do gene de zcytorl71ig podem promover transformação maligna e/ou a metástase por meio da remoção das funções imunoreguladoras de zcytorl71ig. de facto, um gene supressor da metástase em cancro de próstata foi mapeado a 32 12q24-qter (Ichikawa et al, Asian J Androl 2:167-171, 2000). Se zcytorl71ig for o gene dentro desta região responsável pela supressão da metástase, então zcytorl71ig por si mesmo pode ter valor terapêutico no tratamento de cancro.

Um diagnóstico poderia assistir aos médicos na determinação do tipo de doença e terapêutica associada apropriada, ou assistência no aconselhamento genético. Como tal, os inventivos anticorpos anti-zcytorl71ig, polinucleótidos, e polipéptidos podem ser utilizados para a detecção de polipéptido de zcytorl71ig, ARNm ou anticorpos anti-zcytorl71ig, servindo assim como marcadores e sendo utilizados directamente para detectar ou doenças genéticas ou cancros, como é descrito no presente documento, utilizando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento. Além disso, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig podem ser utilizadas para detectar anormalidades ou genótipos associados ao cromossoma deleções e translocações de 12q24.3 associadas a doenças humanas, ou outras translocações envolvidas com progressão maligna de tumores ou outras mutações de 12q24.3, que são esperadas que estejam envolvidas em rearranjos de cromossoma em malignidade; ou em outros cancros. De maneira similar, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig podem ser utilizadas para detectar anormalidades ou genótipos associados a trissomia do cromossoma 12 e perda de cromossoma associada a doenças humanas ou aborto espontâneo. Assim, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig podem ser utilizadas para detectar anormalidades ou genótipos associados a estes defeitos.

Um perito na especialidade reconheceria que as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig são particularmente úteis para o diagnóstico de anormalidades cromossómicas grosseiras associadas a perda de heterogeneidade (LOH), ganho de cromossoma (por exemplo, trissomia), translocação, 33 amplificação de ADN, e similares. Translocações dentro do locus cromossómico 12q24.3 em que o gene de zcytorl71ig está localizado são conhecidas por estarem associadas a doença humana. Por exemplo, deleções e translocações de 12q24, duplicações e trissomia são associadas a cancros como foi discutido acima. Assim, uma vez que o gene de zcytorl71ig mapeia esta região critica, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig da presente invenção podem ser utilizadas para detectar anormalidades ou genótipos associados a translocação, deleção e trissomia de 12q24, e similares, descritos acima.

Como foi discutido acima, defeitos no gene de zcytorl71ig por si mesmo podem ter como resultado um estado de doença humana transmissível por hereditariedade. As moléculas da presente invenção, tais como os polipéptidos, antagonistas, agonistas, polinucleótidos e anticorpos da presente invenção ajudariam na detecção, diagnóstico, prevenção, e tratamento associados a um defeito de gene de zcytorl71igtic. Além disso, as sondas de polinucleótido de zcytorl71ig podem ser utilizadas para detectar diferenças alélicas entre indivíduos doentes ou não doentes no locus cromossómico de zcytorl71ig. Como tal, as sequências de zcytorl71ig podem ser utilizadas como diagnóstico no perfil de ADN forense.

No geral, os métodos de diagnóstico utilizados na análise de ligação genética, para detectar uma anormalidade genética ou aberração num paciente são conhecidas na técnica. Sondas analíticas serão geralmente pelo menos 20 nt de comprimento, embora sondas um pouco mais curtas possam ser utilizadas (por exemplo, 14-17 nt) . Iniciadores de PCR são pelo menos 5 nt de comprimento, preferentemente 15 ou mais, mais preferentemente 20-30 nt. Para a análise bruta de genes, ou ADN cromossómico, uma sonda de polinucleótido de zcytorl71ig pode compreender um exão inteiro ou mais. Exões são prontamente determinados por um 34 perito na especialidade por meio da comparação de sequências de zcytorl71ig (SEQ ID NO: 1) com o ADN genómico para zcytorl71ig de ratinho (SEQ ID NO: 76). Em geral, os métodos de diagnóstico utilizados na análise de ligação genética para detectar uma anormalidade genética ou aberração num paciente são conhecidas na técnica. A maioria dos métodos de diagnóstico compreende as etapas de (a) obter uma amostra genética de um paciente potencialmente doente, paciente doente ou portador não doente potencial de um alelo de doença recessivo; (b) produzir um primeiro produto de reacção por meio da incubação da amostra genética com uma sonda de polinucleótido de zcytorl71ig em que o polinucleótido hibridará a sequência de polinucleótido complementar, tal como em análise RFLP ou por meio da incubação da amostra genética com iniciadores sense e antisense numa reacção de PCR sob condições de reacção de PCR apropriadas; (iii) visualizar o primeiro produto de reacção por electroforese em gel e/ou outros métodos conhecidos tais como visualizar o primeiro produto de reacção com uma sonda de polinucleótido de zcytorl71ig em que o polinucleótido hibridará à sequência de polinucleótido complementar da primeira reacção; e (iv) comparar o primeiro produto de reacção visualizado a um segundo produto de reacção de controlo de uma amostra genética do paciente do tipo selvagem, ou um indivíduo normal ou de controlo. Uma diferença entre o primeiro produto de reacção e o produto de reacção de controlo é indicativo de uma anormalidade genética no paciente doente ou paciente potencialmente doente, ou a presença de um fenótipo portador heterozigoto recessivo para um paciente não doente, ou a presença de um defeito genético num tumor de um paciente doente, ou a presença de uma anormalidade genética num feto ou embrião de pré-implantação. Por exemplo, uma diferença em padrão de fragmento de restrição, comprimento de produtos de PCR, comprimento de sequências 35 repetitivas no locus de gene de zcytorl71igtic, e similares, são indicativos de uma anormalidade genética, aberração genética, ou diferença alélica em comparação com o controlo do tipo selvagem normal. Os controlos podem ser de membros de família não afectados, ou indivíduos não relacionados, dependendo do teste e disponibilidade de amostras. As amostras genéticas para utilização na presente invenção incluem ADN genómico, ARNm, e ADNc isolado de qualquer tecido ou outra amostra biológica de um paciente, que inclui, mas não é limitada a, sangue, saliva, sémen, células embrionárias, fluido amniótico, e similares. A sonda de polinucleótido ou iniciador pode ser ARN ou ADN, e compreenderá uma porção da SEQ ID NO: 1, o complemento da SEQ ID NO: 1, ou um equivalente de ARN do mesmo. Tais métodos para mostrar a análise de ligação genética a fenótipos de doença humana são bem conhecidos na técnica. Para a referência a métodos à base de PCR em diagnósticos veja-se geralmente, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods e Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.). Molecular Diagnosis of Câncer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek e Walaszek (eds.). Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.). Clinicai Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), e Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998) .

Mutações associadas ao locus de zcytorl71ig podem ser detectados utilizando moléculas de ácido nucleico utilizando métodos padrão para a análise de mutação directa, tais como análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição, análise de repetição curta em tandem utilizando técnicas de PCR, análise de sistema de mutação refractária a amplificação, detecção de polimorfismo de conformação de cadeia simples, métodos de clivagem de ARNase, electroforese em gel em gradiente 36 desnaturante, análise de desemparelhamento assistida por fluorescência, e outras técnicas de análise genética conhecidas na especialidade (veja-se, por exemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman e Tsongalis, Molecular Diagnostics (Humana Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al. (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al. (eds.), Current Protocolos in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), e Richards e Ward, "Molecular Diagnostic Testing", em Principies of Molecular Medicine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998). A análise directa de um gene de zcytorl71ig para uma mutação pode ser realizada utilizando um ADN genómico do indivíduo. Os métodos para amplificar ADN genómico, obtido, por exemplo, de linfócitos de sangue periférico, são bem conhecidos aos peritos na especialidade (veja-se, por exemplo, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, nas páginas 7.1.6 a 7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)).

As posições de intrões no gene de zcytorl71ig de ratinho foram determinadas pela identificação de clones genómicos, seguido por análise das junções de intrão/exão. O ADN genómico de ratinho é mostrado na SEQ ID NO: 76. Com referência à SEQ ID NO: 76, três exões codificantes separados por intrões são evidentes: o primeiro exão codificante está situado entre números de ácido nucleico 1104-1119 da SEQ ID NO: 76, o segundo exão entre números de ácido nucleico 1300-1451 da SEQ ID NO: 76, e o terceiro exão entre números de ácido nucleico 2411-2998 da SEQ ID NO: 76.

Dentro das formas de realização da invenção, as moléculas de ácido nucleico isolado que codificam 37 zcytorl71ig podem hibridar sob condições restringentes a moléculas de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1, a moléculas de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos de nucleótidos 28 a 519 de SEQ ID NO: 1, ou a moléculas de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos complementar a SEQ ID NO: 1. Em geral, condições restringentes são seleccionadas para serem aproximadamente 5°C inferiores ao ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência especifica numa força iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iónica e pH definidos) na qual 50 % da sequência alvo híbrida a uma sonda emparelhada perfeitamente.

Um par de moléculas de ácido nucleico, tais como ADN-ADN, ARN-ARN e ADN-ARN, pode hibridar se as sequências de nucleótido têm algum grau de complementaridade. Os híbridos podem tolerar pares de bases desemparelhadas na hélice dupla, mas a estabilidade do híbrido é influenciada pelo grau de desemparelhamento. A Tm do híbrido desemparelhado diminui em 1°C para cada 1-1,5 % de desemparelhamento de par de bases. A variação da restringência das condições de hibridação permite o controlo sobre o grau de desemparelhamento que estará presente no híbrido. O grau de restringência aumenta à medida que aumenta a temperatura de hibridação e a força iónica do tampão de hibridação diminui.

Está bem dentro das habilidades de um perito na especialidade adaptar estas condições para utilização com um híbrido de polinucleótido particular. A Tm para uma sequência alvo específica é a temperatura (sob condições definidas) na qual 50 % da sequência alvo hibridará a uma sequência de sonda emparelhada perfeitamente. Aquelas condições que influenciam a Tm incluem o tamanho e conteúdo de par de bases da sonda de polinucleótido, a força iónica da solução de hibridação, e a presença de agentes desestabilizantes na solução de hibridação. Numerosas 38 equações para calcular a Tm são conhecidas na técnica, e são específicas para ADN, ARN e híbridos de ADN-ARN e sequências de sonda de polinucleótido de comprimento variado (veja-se, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley e Sons, Inc. 1987); Berger e Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); e Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Software de análise de sequência tal como OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) e Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Paio Alto, CA), bem como sites na Internet estão disponíveis ferramentas para analisar uma dada sequência e calcular Tm com base nos critérios definidos pelo utilizador. Tais programas podem também analisar uma dada sequência sob condições definidas e identificar sequências de sonda adequadas. Tipicamente, a hibridação de sequências de polinucleótido mais longas, >50 pares de bases, é realizada a temperaturas de aproximadamente 20-25°C abaixo da Tm calculada. Para sondas menores, <50 pares de bases, a hibridação é tipicamente levada a cabo na Tm ou 5-10°C abaixo da Tm calculada. Isto considera a taxa máxima de hibridação para híbridos de ADN-ADN e ADN-ARN.

Em seguida à hibridação, as moléculas de ácido nucleico podem ser lavadas para remover moléculas de ácido nucleico não hibridadas sob condições restringentes, ou sob condições altamente restringentes. Condições de lavagem restringentes típicas incluem lavar numa solução de 0,5x -2x SSC com 0,1 % de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 15 -65°C. Isto é, as moléculas de ácido nucleico que codificam um polipéptido de zcytorl71ig variante hibridam com uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1 (ou o seu complemento) sob condições de lavagem restringentes, em que a restringência 39 de lavagem é equivalente a 0,5x - 2x SSC com 0,1 % de SDS a 15 - 65°C, incluindo 0,5x SSC com 0,1 % de SDS a 15°C, ou 2x SSC com 0,1 % de SDS a 15°C. Um perito na especialidade pode prontamente imaginar condições equivalentes, por exemplo, por meio da substituição de SSPE por SSC na solução de lavagem.

Condições de lavagem altamente restringentes típicas incluem lavar numa solução de 0,lx - 0,2x SSC com 0,1 % de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10 - 65°C. Em outras palavras, as moléculas de ácido nucleico que codificam um variante polipéptido de zcytorl71ig hibridam com uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1 (ou o seu complemento) sob condições de lavagem altamente restringentes, em que a restringência de lavagem é equivalente a 0,lx - 0,2x SSC com 0,1 % de SDS a 10 - 65°C, incluindo 0,lx SSC com 0,1 % de SDS a 10°C, ou 0,2x SSC com 0,1 % de SDS a 15°C. A presente memória descritiva descreve polipéptidos de zcytorl71ig isolados que têm uma identidade de sequência substancialmente similar aos polipéptidos da SEQ ID NO: 2, ou aos seus ortólogos. O termo "identidade de sequência substancialmente similar" é utilizado no presente documento para denotar polipéptidos que compreendem pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou superior a 99 % de identidade de sequência às sequências mostradas na SEQ ID NO: 2, ou aos seus ortólogos. A presente invenção também inclui polipéptidos que compreendem uma sequência de aminoácido que tem pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou superior a 99 % de identidade de sequência à sequência de resíduos de aminoácido 1 a 162 ou 33 a 162 da SEQ ID NO: 2. A presente memória descritiva descreve moléculas de ácido nucleico que codificam tais 40 polipéptidos. Os métodos para determinar a percentagem de identidade são descritos a seguir. A presente memória descritiva descreve moléculas de ácido nucleico de zcytorl71ig variantes que podem ser identificadas utilizando dois critérios: uma determinação da similaridade entre o polipéptido codificado com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2, e/ou um ensaio de hibridação, como foi descrito acima. Tais variantes de zcytorl71ig incluem moléculas de ácido nucleico: (1) que hibridam com uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1 (ou o seu complemento) sob condições de lavagem restringentes, em que a restringência de lavagem é equivalente a 0,5x - 2x SSC com 0,1 % de SDS a 15 - 65°C; ou (2) que codificam um polipéptido que tem pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou superior a 99 % de identidade à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Alternativamente, as variantes de zcytorl71ig podem ser caracterizadas como moléculas de ácido nucleico: (1) que hibridam com uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1 (ou o seu complemento) sob condições de lavagem altamente restringentes, em que a restringência de lavagem é equivalente a 0,lx - 0,2x SSC com 0,1 % de SDS a 10 - 65°C; e (2) que codificam um polipéptido que tem pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou superior a 99 % de identidade de sequência à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. A percentagem de identidade de sequência é determinada por métodos convencionais. Veja-se, por exemplo, Altschul et al., Buli. Math. Bio. 48:603 (1986), e Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915 (1992). De maneira breve, duas sequências de aminoácido são alinhadas 41 para optimizar as pontuações de alinhamento utilizando uma penalidade de abertura de espaço de 10, uma penalidade de extensão de espaço de 1, e a matriz de pontuação "BLOSUM62" de Henikoff e Henikoff (íbid.) como é mostrado no Quadro 4 (aminoácidos são indicados pelos códigos de uma letra padrão). x 100 Número total de correspondências idênticas [comprimento da.sequência mais Longa mais o número dos espaços introduzidos na sequência com a finalidade de alinhar as duas .sequências]

Quadro 4 A R N D c Q E G H I L A 4 R - 5 1 N - 0 6 2 D - - 1 6 2 2 C 0 - - 1 6 3 3 Q - 1 0 0 -3 5 1 E - 0 0 2 -4 2 5 1 G 0 - 0 -1 -3 -2 -2 6 2 H - 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 2 I - - - -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 1 3 3 L - - - -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 1 2 3 K - 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 42 A R N D c Q E G Η I L K M F P S T W Y 1 M - - -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2-15 1 1 2 F - - -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0-306 2 3 3 P - - -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 1 2 2 S 1 1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 1 1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -115 w 1 - -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 3 3 4 Y - - -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 2 2 2 V 0 - - -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -21 -1 -2 -2 0 -3 3 3 Os peritos na especialidade apreciam que existem muitos algoritmos estabelecidos disponíveis para alinhar duas sequências de aminoácido. 0 algoritmo de pesquisa de similaridade "FASTA" de Pearson e Lipman é um método de alinhamento de proteínas adequado para examinar o nível de identidade partilhada por uma sequência de aminoácido revelada no presente documento e a sequência de aminoácido de um zcytorl71ig variante putativo. 0 algoritmo FASTA é descrito por Pearson e Lipman, Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988), e por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990) .

De maneira breve, FASTA primeiro caracteriza similaridade de sequências por meio da identificação de regiões partilhadas pela sequência de consulta (por exemplo, SEQ ID NO: 2) e uma sequência de teste que têm a densidade mais alta de identidades (se a variável ktup for 1) ou pares de identidades (se ktup=2), sem considerar 43 substituições, inserções, ou deleções de aminoácido conservadoras. As dez regiões com a densidade mais alta de identidades são então repontuadas por meio da comparação da similaridade de todos os aminoácidos emparelhados utilizando uma matriz de substituição de aminoácido, e as extremidades das regiões são "recortadas" para incluir somente aqueles resíduos que contribuem à pontuação mais alta. Se existirem diversas regiões com pontuações superiores ao valor de "corte" (calculados por uma fórmula predeterminada com base no comprimento da sequência e o valor de ktup), então as regiões iniciais recortadas são examinadas para determinar se as regiões podem ser unidas para formar um alinhamento aproximado com espaços. Finalmente, as regiões de pontuação mais altas das duas sequências de aminoácido são alinhadas utilizando uma modificação do algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que tem em consideração inserções e deleções de aminoácido. Parâmetros preferidos para a análise FASTA são: ktup=l, penalidade de abertura de espaço=10, penalidade de extensão de espaço=l, e matriz de substituição=BLOSUM62. Estes parâmetros podem ser introduzidos num programa FASTA por meio da modificação do arquivo de matriz de pontuação ("SMATRIX"), como foi explicado no Apêndice 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) . FASTA pode também ser utilizado para determinar a identidade de sequência de moléculas de ácido nucleico utilizando uma razão como foi revelado acima. Para comparações de sequência de nucleótidos, o valor de ktup pode variar entre um a seis, preferentemente desde três até seis, mais preferentemente três, com outros parâmetros ajustados como padrão.

Polipéptidos de zcytorl71ig variantes ou polipéptidos com identidade de sequência substancialmente similar são 44 caracterizados como que tem uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácido. Estas mudanças são preferentemente de uma natureza menor, isto é substituições de aminoácido conservadoras (como é mostrado no Quadro 5 a seguir) e outras substituições que não afectam significativamente o enrolamento ou actividade do polipéptido; deleções pequenas, tipicamente de um a aproximadamente 30 aminoácidos; e extensões amino- ou carboxil-terminal, tais como um resíduo de metionina amino-terminal, um péptido linker pequeno de até aproximadamente 20-25 resíduos, ou uma etiqueta de afinidade. A presente memória descritiva descreve polipéptidos de desde aproximadamente 108 até 216 resíduos de aminoácido que compreendem uma sequência que é pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou superior a 99 % idêntica à região correspondente da SEQ ID NO: 2. Polipéptidos que compreendem etiquetas de afinidade podem compreender ainda um local de clivagem proteolítica entre o polipéptido de zcytorl71ig e a etiqueta de afinidade. Tais locais preferidos incluem locais de clivagem de trombinha e locais de clivagem de factor Xa.

Quadro 5

Substituições de aminoácido conservadoras Básico: Ácido:

Polar:

Hidrofóbico:

Aromático: arginma lisina histidina ácido glutâmico ácido aspártico glutamina asparagina leucina isoleucina valina fenilalanina 45 triptofano tirosina

Pequeno: glicina alanina serina treonina metionina j Con formato: Espanol (Espana, i internacional)

Determinação de resíduos de aminoácido que compreendem regiões ou domínios que são críticos à manutenção da integridade estrutural pode ser realizada. Dentro destas regiões alguém pode determinar resíduos específicos que serão mais ou menos tolerantes à mudança e manutenção da estrutura terciária global da molécula. Os métodos para analisar a estrutura de sequência incluem, mas não são limitados a, alinhamento de sequências múltiplas com alta identidade de aminoácido ou nucleótido, propensões da estrutura secundária, padrões binários, empacotamento complementar e interacções polares enterradas (Barton, Current Opin. jStruct. Biol. 5:372-376, 1995 e Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996). Em geral, ao desenhar modificações a moléculas ou identificar fragmentos específicos, a determinação de estrutura será acompanhada pela avaliação da actividade de moléculas modificadas.

As mudanças da sequência de aminoácido são feitas em polipéptidos de zcytorl71ig de modo a minimizar disrupção da estrutura de ordem mais alta essencial à actividade biológica. Por exemplo, onde o polipéptido de zcytorl71ig compreende uma ou mais hélices, mudanças em resíduos de aminoácido serão feitas de modo a não quebrar a geometria da hélice e outros componentes da molécula onde mudanças na conformação abatem alguma função crítica, por exemplo, ligação da molécula aos seus parceiros de ligação, por exemplo, hélices A e D, resíduos 43 (Glu) , 44 (Glu) , e 136 (Phe) da SEQ ID NO: 2. Os efeitos das mudanças de sequência 46 de aminoácido podem ser preditos por meio de, por exemplo, modelagem por computador como foi revelado acima ou determinados por análise da estrutura cristalina (veja-se, por exemplo, Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995) . Outras técnicas que são bem conhecidas na especialidade comparam o enrolamento de uma proteína variante a uma molécula padrão (por exemplo, a proteína nativa). Por exemplo, comparação da cisteína padrão numa variante e moléculas padrão pode ser feita. Espectrometria de massa e modificação química utilizando redução e alquilação proporcionam métodos para determinar resíduos de cisteína que são associados a pontes dissulfureto ou são livres de tais associações (Bean et ai., Anal. Biochem. ; 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sei. 2:1732-1748, 1993; e

Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994).

Acredita-es geralmente que se uma molécula modificada não tem a mesma cisteína padrão que a molécula padrão, o enrolamento seria afectado. Outro método bem conhecido e aceitado para medir o enrolamento é dicroísmo circular (DC) . A medição e comparação dos espectros de DC gerados por uma molécula modificada e molécula padrão é rotina (Johnson, Proteínas 7:205-214, 1990). A cristalografia é outro método bem conhecido para analisar o enrolamento e estrutura. A ressonância magnética nuclear (RMN), mapeamento de péptido e mapeamento de epítopo digestivo são também métodos conhecidos para analisar o enrolamento e similaridades de maneira estrutural entre proteínas e polipéptidos (Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992).

Um perfil de hidrofilicidade de Hopp/Woods da sequência de proteína de zcytorl71ig como é mostrado na SEQ ID NO: 2 pode ser gerado (Hopp et al., Proc. Natl. Acad.

Sei. 78 :3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Met. 88 : 1-18, 1986 .......;j Con formato: Espanoi (Espana, ·'........... - - internacional) e Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). O perfil está baseado numa janela deslizante de seis 47 resíduos. Resíduos G, S, e T enterrados e resíduos Η, Y, e W expostos foram ignorados.

Por exemplo, em zcytorl71ig humano, as regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido 54-59 da SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácido 129-134 da SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácido 53-58 da SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácido 35-40 da SEQ NO:2, e resíduos de aminoácido 33- 38 da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, em zcytorl71ig de ratinho, as regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido 34- 39 da SEQ ID NO: 11, resíduos de aminoácido 46-51 da SEQ ID NO: 11, resíduos de aminoácido 131-136 da SEQ ID NO: 11, resíduos de aminoácido 158-163 da SEQ ID NO: 11, e resíduos de aminoácido 157-162 da SEQ ID NO: 11.

Os peritos na especialidade reconhecerão que hidrofilicidade ou hidrofobicidade serão levados em consideração ao desenhar modificações na sequência de aminoácido de um polipéptido de zcytorl71ig, de modo a não quebrar o perfil biológico e estrutural global. De particular interesse para recolocação são resíduos hidrofóbicos seleccionados a partir do grupo que consiste em Vai, Leu e Ile ou o grupo que consiste em Met, Gly, Ser, Ala, Tyr e Trp. Por exemplo, resíduos tolerantes de substituição poderiam incluir Vai, Leu e Ile ou o grupo que consiste em resíduos Met, Gly, Ser, Ala, Tyr e Trp como é mostrado na SEQ ID NO: 2. Os resíduos de cisteína conservados nas posições dentro da SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 11, serão relativamente intolerantes de substituição.

As identidades de aminoácidos essenciais podem também ser inferidas a partir da análise da similaridade de sequências entre IL-3, Lif, IL12, IL-15, IL-2, IL-4 e GM- CSF com zcytorl71ig. Utilizando métodos tais como análise "FASTA" descritos anteriormente, as regiões de alta similaridade são identificadas dentro de uma família de proteínas e utilizadas para analisar a sequência de aminoácido para regiões conservadas. Uma abordagem 48 alternativa para identificar um polinucleótido de zcytorl71ig variante com base na estrutura é para determinar se uma molécula de ácido nucleico que codifica um gene de zcytorl71ig variante potencial pode hibridar a uma molécula de ácido nucleico que tem a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1, como foi discutido acima.

Outros métodos de identificação de aminoácidos essenciais nos polipéptidos da presente invenção são procedimentos conhecidos na técnica, tal como mutagénese dirigida ou mutagénese de exame de alanina (Cunningham e Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 88:4498 (1991), Coombs e Corey, "Local-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", em Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). Na técnica anterior, mutações de alanina únicas são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para actividade biológico ou bioquímica como é revelado a seguir para identificar resíduos de aminoácido que são críticos à actividade da molécula. Veja-se também, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996). A presente memória descritiva descreve fragmentos funcionais de polipéptidos de zcytorl71ig e moléculas de ácido nucleico que codificam tais fragmentos funcionais. Um zcytorl71ig "funcional" ou fragmento do mesmo como foi definido no presente documento é caracterizado pela sua actividade proliferativa ou de diferenciação, pela sua habilidade de induzir ou inibir funções de célula especializada, ou pela sua habilidade de ligar-se especificamente a um anticorpo anti- zcytorl71ig ou anticorpo de receptor de zcytorl7 ou zcytorl7, WSX-1, ou receptor de OSMRbeta ou heterodímeros (por exemplo, zcytorl7/WSX-l ou zcytor17/OSMRbeta) ou multímeros (por exemplo, zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta) destes receptores (solúveis ou imobilizados). Como foi descrito anteriormente 49 descrito no presente documento, zcytorl71ig é caracterizado por uma estrutura de quatro feixes helicoidais que compreende a hélice A (residuos de aminoácido 38-52), a Hélice B (resíduos de aminoácido 83-98), a Hélice C (resíduos de aminoácido 104-117) e a hélice D (resíduos de aminoácido 137-152), como é mostrado na SEQ ID NO: 2. Assim, a presente memória descritiva descreve proteínas de fusão que abrangem: (a) polipéptido moléculas que compreendem uma ou mais das hélices descritas acima; e (b) fragmentos funcionais que compreendem uma ou mais destas hélices. A outra porção de polipéptido da proteína de fusão podem ser contribuída por outra citocina de quatro feixes helicoidais, tais como IL-15, IL-2, IL-4 e GM-CSF, ou por um péptido sinal de secreção não nativo e/ou um não relacionado que facilita a secreção da proteína de fusão.

Assim, a presente memória descritiva descreve proteínas de fusão que compreendem pelo menos quatro polipéptidos, em que a ordem de polipéptidos desde a terminação N até a terminação C é: um primeiro polipéptido compreende aminoácidos seleccionados a partir de um grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido da hélice A de IL-2 27-48 da SEQ ID NO: 162; (b) resíduos de aminoácido da hélice A de IL-3 35-45 da SEQ ID NO: 102; (c) resíduos de aminoácido da hélice A de IL-4 30-42 da SEQ ID NO: 164; (d) resíduos de aminoácido da hélice A de GM-CSF 30-44 da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 38 a 52 da SEQ ID NO: 2; um primeiro espaçador de 6-27 aminoácidos; e um segundo polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) IL-2 hélice B resíduos de aminoácido da SEQ ID NO: 168; (b) IL-4 hélice B resíduos de aminoácido 65-83 da SEQ ID NO: 164; (c) IL-3 hélice B resíduos de aminoácido 73-86 da SEQ ID NO: 102; (d) GM-CSF hélice B resíduos de aminoácido 72-81 da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 83-98 da SEQ ID NO: 2; um segundo espaçador de 5-11 resíduos de 50 aminoácido; um terceiro polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos da hélice C de IL-2 102-116 da SEQ ID NO: 162; (b) resíduos da hélice C de IL-4 94-118 da SEQ ID NO: 164; (c) resíduos da hélice C de IL-3 91-103 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos da hélice C de GM-CSF 85-103 da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 104-117 da SEQ ID NO: 2; um terceiro espaçador de 3-29 resíduos de aminoácido; e um quarto polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido da hélice D de IL-2 134-149 da SEQ ID NO: 162; (b) resíduos de aminoácido da hélice D de IL-3 123-141 da SEQ ID NO: 102; (c) resíduos de aminoácido da hélice D de IL-4 133-151 da SEQ ID NO: 164; (d) resíduos de aminoácido da hélice D de GM-CSF 120-131 da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 137-152 da SEQ ID NO: 2, em que pelo menos um dos quatro polipéptidos é de zcytorl71ig. Em outras formas de realização, os péptidos de espaçador serão seleccionados a partir de loops A/B, B/C e C/D de zcytorl71ig, e IL-3, como é mostrado no Quadro 1.

Análises de deleção de rotina de moléculas de ácido nucleico podem ser realizadas para obter fragmentos funcionais de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de zcytorl71ig. Como ilustração, as moléculas de ADN que têm a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 1 ou fragmentos da mesma, podem ser digeridas com nuclease Bal31 para obter uma série de deleções aninhadas. Estes fragmentos de ADN são inseridos então nos vectores de expressão na grelha de leitura apropriada, e os polipéptidos expressos são isolados e testados para actividade de zcytorl71ig, ou para a habilidade de ligar-se a anticorpos anti-zcytorl71ig ou receptor de zcytorl7. Uma alternativa para a digestão de exonuclease é utilizar mutagénese direccionada a oligonucleótido para introduzir 51 deleções ou codões de terminação para especificar a produção de um fragmento de zcytorl71ig desejado. Alternativamente, fragmentos particulares de um gene de zcytorl71ig podem ser sintetizados utilizando a reacção em cadeia da polimerase. Métodos padrão para identificar domínios funcionais são bem conhecidos aos peritos na especialidade. Por exemplo, estudos sobre o truncamento num ou ambos os terminais de interferões foram sumarizados por Horisberger e Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Além disso, técnicas padrão para a análise funcional de proteínas são descritas por, por exemplo, Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary delection analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", em Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987) ; Herschman, "the EGF Receptor", em Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995); e Meisel et al., Plant Molec, Biol. 30:1 (1996) .

Substituições de aminoácido múltiplas podem ser feitas e testadas utilizando métodos conhecidos de mutagénese e rastreio, tais como aqueles revelados por Reidhaar-Olson e Sauer Science 241:53 (1988)) ou Bowie e Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 86:2152 (1989)). De maneira breve, estes autores revelam métodos para aleatorizar simultaneamente duas ou mais posições num polipéptido, seleccionar para polipéptido funcional, e então sequenciar os polipéptidos mutagenizados para determinar o espectro de substituições permissíveis em cada posição. Outros métodos que podem ser utilizados incluem apresentação em fago (por exemplo, 52

Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991), Ladner et al., Patente US N° 5.223.409, Huse, Publicação internacional N° WO 92/06204), e mutagénese direccionada a região (Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986), e Ner et al., ADN 7:127, (1988)).

Variantes das sequências de polipéptido e nucleótido de zcytorl71ig reveladas podem também ser geradas através de rearranjo de ADN como foi revelado por Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Natl Acad. Sei. USA 91:10747 (1994), e Publicação internacional N° WO 97/20078. De maneira breve, moléculas de ADN variantes são geradas por recombinação homóloga in vitro por meio de fragmentação aleatória de um ADN parental seguido por remontagem utilizando PCR, tendo como resultado mutações ponto aleatoriamente introduzidas. Esta técnica pode ser modificada utilizando uma família de moléculas de ADN parentais, tais como variantes alélicas ou moléculas de ADN de espécies diferentes, para introduzir variabilidade adicional no processo. Selecção ou rastreio para a actividade desejada, seguido por iterações adicionais de mutagénese e ensaio trata de "evolução" rápida das sequências por meio da selecção de mutações desejáveis ao mesmo tempo que selecciona simultaneamente contra mudanças prejudiciais.

Os métodos de mutagénese como é revelado no presente documento podem ser combinados com métodos de rastreio automatizados e de alto rendimento para detectar a actividade de polipéptidos mutagenizados clonados em células hospedeiras. As moléculas de ADN mutagenizadas que codificam polipéptidos biologicamente activas, ou polipéptidos que se ligam a anticorpos anti-zcytor171ig ou receptor solúvel de zcytorl7, ou WSX-1 solúvel ou OSMR solúvel ou heterodimeros ou multímeros destes receptores solúveis como é descrito no presente documento podem ser recuperados das células hospedeiras e rapidamente 53 sequenciados utilizando equipamento modem. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos de aminoácido individuais num polipéptido de interesse, e podem ser aplicados a polipéptidos de estrutura desconhecida.

Além disso, as proteínas descritas no presente documento (ou fragmentos de polipéptido das mesmas) podem ser unidas a outras moléculas bioactivas, particularmente outras citocinas, para proporcionar moléculas multifuncionais. Por exemplo, uma ou mais hélices de zcytorl71ig podem ser unidas a outras citocinas para aumentar as suas propriedades biológicas ou eficácia de produção. A presente memória descritiva descreve uma série de novas moléculas híbridas em que um segmento que compreende uma ou mais das hélices de zcytorl71ig é fusionado a outro polipéptido. Fusão é preferentemente feita por splicing no nível de ADN para permitir a expressão de moléculas quiméricas em sistemas de produção recombinante. As moléculas resultantes são então ensaiadas para tais propriedades como solubilidade melhorada, estabilidade melhorada, semivida de depuração prolongada, expressão melhorada e níveis de secreção, e farmacodinâmica. Tais moléculas híbridas podem compreender ainda resíduos de aminoácido adicionais (por exemplo, um linker de polipéptido) entre as proteínas ou polipéptidos de componente.

Aminoácidos que não ocorrem de forma natural incluem, sem limitação, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido carboxílico de tiazolidina, desidroprolina, 3-e 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, tert-leucina, norvalina. 54 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azaphe-nilalanina, e 4-fluorofenilalanina. Diversos métodos são conhecidos na técnica para incorporar resíduos de aminoácido que não ocorrem de forma natural em proteínas. Por exemplo, um sistema in vitro pode ser utilizado em que mutações nonsense são suprimidas utilizando ARNt supressores quimicamente aminoacilados. Os métodos para sintetizar aminoácidos e ARNt de aminoacilação são conhecidos na técnica. Transcrição e tradução de plasmideos que contêm mutações nonsense são tipicamente levadas a cabo num sistema livre de célula que compreende um extracto de E. coli S30 e enzimas comercialmente disponíveis e outros reagentes. As proteínas são purificadas por cromatografia. Veja-se, por exemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman et ai.; Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung et al., Science 259:806 (1993), e Chung et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 90:10145 (1993).

Num segundo método, a tradução é levada a cabo em oócitos de Xenopus por microinjecção de ARNm mutado e ARNt supressores quimicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)). Dentro de um terceiro método. As células de E. coli são cultivadas na ausência de um aminoácido natural que está a ser substituído (por exemplo, fenilalanina) e na presença do(s) aminoácido(s) desejado(s) que não ocorre(m) de forma natural (por exemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-aza-fenilalanina, ou 4-fluorofenilalanina) . O aminoácido que não ocorre de forma natural é incorporado na proteína no lugar do seu equivalente natural. Veja-se, Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994). Resíduos de aminoácido que ocorrem de forma natural podem ser convertidos a espécies que não ocorrem de forma natural por modificação química in vitro. A modificação química pode ser combinada com mutagénese dirigida para expandir adicionalmente o intervalo de substituições (Wynn e Richards, Protein Sei. 2:395 (1993). 55

Pode ser vantajoso estabilizar zcytorl71ig para estender a semivida da molécula, particularmente para estender persistência metabólica num estado activo. Para alcançar a semivida estendida, moléculas de zcytorl71ig podem ser quimicamente modificadas utilizando métodos descritos no presente documento. PEGilação é um método comummente utilizado que demonstrou aumentar a semivida em plasma, solubilidade aumentada, e antigenicidade e imunogenicidade diminuídas (Nucci et al., Advanced Drug Delivery Reviews 6:133-155, 1991 e Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138, 1994).

Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, aminoácidos que não ocorrem de forma natural, e aminoácidos não naturais podem ser substituídos para resíduos de aminoácido de zcytorl71ig. A presente memória descritiva descreve fragmentos de polipéptido ou péptidos que compreendem uma porção que possui epítopo de um polipéptido de zcytorl71ig descrito no presente documento. Tais fragmentos ou péptidos podem compreender um "epítopo imunogénico", que é uma parte de uma proteína que provoca uma resposta de anticorpo quando a proteína inteira é utilizada como um imunogénio. Os péptidos que possuem epítopo imunogénico podem ser identificados utilizando métodos padrão (veja-se, por exemplo, Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sei. USA 81:3998 (1983)) .

Em contraste, fragmentos de polipéptido ou péptidos podem compreender um "epítopo antigénico", que é uma região de uma molécula proteína à qual um anticorpo pode se ligar especificamente. Certos epítopos consistem num trecho contíguo ou linear de aminoácidos, e a antigenicidade de tal epítopo não é quebrada por agentes desnaturantes. Conhece-se na técnica que péptidos sintéticos relativamente curtos que podem mimetizar epítopos de uma proteína podem 56 ser utilizados para estimular a produção de anticorpos contra a proteína (veja-se, por exemplo, Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)). Consequentemente, péptidos e polipéptidos que possuem epítopo antigénico descritos no presente documento são úteis para criar anticorpos (por exemplo, anticorpos neutralizantes) que se ligam aos polipéptidos descritos no presente documento. Perfis de hidrofilicidade de Hopp/Woods podem ser utilizados para determinar regiões que têm o maior potencial antigénico (Hopp et al., 1981, ibid. e Hopp, 1986, ibid). Por exemplo, em zcytorl71ig humano, as regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido 54-59 da SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácido 129-134 da SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácido 53-58 da SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácido 35-40 da SEQ ID NO: 2, e resíduos de aminoácido 33-38 da SEQ ID NO: 2. Por exemplo, em zcytorl71ig de ratinho, as regiões hidrofílicas incluem resíduos de aminoácido 34-39 da SEQ ID NO: 11, resíduos de aminoácido 46-51 da SEQ ID NO: 11, resíduos de aminoácido 131-136 da SEQ ID NO: 11, resíduos de aminoácido 158-163 da SEQ ID NO: 11, e resíduos de aminoácido 157-162 da SEQ ID NO: 11.

Os péptidos e polipéptidos que possuem epítopo antigénico preferentemente contêm pelo menos quatro a dez aminoácidos, pelo menos dez a catorze aminoácidos, ou aproximadamente catorze a aproximadamente trinta aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11. Tais péptidos e polipéptidos que possuem epítopo podem ser produzidos por fragmentação de um polipéptido de zcytorl71ig, ou por síntese química de péptido, como é descrito no presente documento. Além disso, os epítopos podem ser seleccionados pela apresentação em fago de bibliotecas de péptido aleatórias (veja-se, por exemplo, Lane e Stefen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993); e Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616 (1996)). Métodos padrão para identificar epítopos e produzir anticorpos a partir de péptidos 57 pequenos que compreendem um epítopo são descritos, por exemplo, por Mole, "Epitope Mapping", em Methods in Molecular Biology, Vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", em Monoclonal Antibodies: Prodution. Engineering, and Clinicai Application, Ritter e Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), e Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, páginas 9,3.1 -9,3.5 e páginas 9.4.1 - 9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).

Independente da sequência de nucleótidos particular de um polinucleótido de zcytorl71ig variante, o polinucleótido codifica um polipéptido que é caracterizado pela sua actividade proliferativa ou de diferenciação, sua habilidade para induzir ou inibir funções de célula especializada, ou pela habilidade de ligar-se especificamente a um anticorpo anti-zcytor171ig ou receptor de zcytorl7. Mais especificamente, polinucleótidos de zcytorl71ig variante codificarão polipéptidos que exibem pelo menos 50 % e preferentemente, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou superior a 99 %, da actividade do polipéptido como é mostrado na SEQ ID NO: 2.

Para qualquer polipéptido de zcytorl71ig, incluindo variantes e proteínas de fusão, um perito na especialidade pode prontamente gerar uma sequência completamente degenerada de polinucleótido que codifica essa variante utilizando a informação indicada nos Quadros 1 e 2 acima. A presente memória descritiva descreve uma variedade de outros fusões de polipéptidos (e proteínas multiméricas relacionadas que compreendem uma ou mais fusões de polipéptidos). Por exemplo, um polipéptido de zcytorl71ig pode ser preparado como uma fusão a uma proteína de dimerização como foi revelado nas Patentes US N° 5.155.027 58 e 5.567.584. As proteínas de dimerização preferidas neste sentido incluem domínios da região constante da imunoglobulina. Fusões de imunoglobulina- polipéptido de zcytorl71ig podem ser expressas em células geneticamente engenheiradas (para produzir uma variedade de análogos de zcytorl71ig multiméricos). Domínios auxiliares podem ser fusionados a polipéptidos de zcytorl71ig para direcciona-los a células, tecidos, ou macromoléculas específicas. Por exemplo, um polipéptido ou proteína de zcytorl71ig poderia ser direccionado a um tipo de célula predeterminado pela fusão de um polipéptido de zcytorl71ig a um ligando que se liga especificamente a um receptor na superfície dessa célula alvo. Nesse sentido, os polipéptidos e proteínas podem ser direccionados para propósitos terapêuticos ou de diagnóstico. Um polipéptido de zcytorl71ig pode ser fusionado a duas ou mais fracções, tais como uma etiqueta de afinidade para purificação e um domínio de direccionamento. Fusões de polipéptidos podem também compreender um ou mais locais de clivagem, particularmente entre domínios. Veja-se, Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996.

Utilizando os métodos discutidos no presente documento, um perito na especialidade pode identificar e/ou preparar uma variedade de polipéptidos que têm identidade de sequência substancialmente similar aos resíduos 1-164 ou 24-164 da SEQ ID NO: 2, ou fragmentos funcionais e fusões dos mesmos, tais como hélices A-D (resíduos 38-152 da SEQ ID NO: 2) em que tais polipéptidos ou fragmentos ou fusões retêm as propriedades da proteína do tipo selvagem tal como a habilidade para estimular a proliferação, diferenciação, induzir a função de célula especializada ou ligar-se ao receptor de zcytorl7 ou anticorpos de zcytorl71ig.

Os polipéptidos de zcytorl71ig descritos no presente documento, incluindo polipéptidos de comprimento completo, fragmentos funcionais, e polipéptidos de fusão, podem ser 59 produzidos em células hospedeiras geneticamente engenheiradas de acordo com técnicas convencionais. As células hospedeiras adequadas são aqueles tipos de células que podem ser transformadas ou transfectadas com ADN exógeno e crescidas em cultura, e incluem bactérias, células fúngicas, e células eucarióticas superiores cultivadas. As células eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares, são preferidas. Técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introduzir ADN exógeno numa variedade de células hospedeiras são reveladas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley e Sons, Inc., NY, 1987.

Em geral, a sequência de ADN que codifica um polipéptido de zcytorl71ig pode ser ligada operativamente a outros elementos genéticos requeridos para a sua expressão, incluindo geralmente um promotor e terminador de transcrição, dentro de um vector de expressão. 0 vector conterá também comummente um ou mais marcadores seleccionáveis e uma ou mais origens de replicação, embora os peritos na especialidade reconhecessem que dentro de certos sistemas, marcadores seleccionáveis podem ser proporcionados em vectores separados, e replicação do ADN exógeno pode ser proporcionada pela integração no genoma da célula hospedeira. A selecção de promotores, terminadores, marcadores seleccionáveis, os vectores e outros elementos é um assunto de desenho de rotina dentro do nível de um perito ordinário na especialidade. Muitos de tais elementos são descritos na literatura e estão disponíveis através de fornecedores comerciais.

Para direccionar um polipéptido de zcytorl71ig na via de secreção de uma célula hospedeira, uma sequência sinal de secreção (também conhecida como um sequência líder. 60 sequência prepro ou sequência pre) é proporcionada no vector de expressão. A sequência sinal de secreção pode ser essa de zcytorl71ig, ou pode ser derivada de outra proteína secretada (por exemplo, t-PA) ou sintetizada de novo. A sequência sinal de secreção é ligada operativamente à sequência de ADN de zcytorl71ig, isto é, as duas sequências são unidas na grelha de leitura correcta e posicionadas para direccionar o polipéptido sintetizado recentemente na via de secreção da célula hospedeira. As sequências sinal de secreção são comummente posicionadas 5' à sequência de ADN que codifica o polipéptido de interesse, embora certas sequências sinal de secreção possam ser posicionadas em qualquer lugar na sequência de ADN de interesse (veja-se, por exemplo, Welch et al., Patente US N° 5.037.743; Holland et al., Patente US N° 5.143.830).

Alternativamente, a sequência sinal de secreção contida nos polipéptidos descritos no presente documento é utilizada para direccionar outros polipéptidos na via de secreção. A presente invenção trata de tais polipéptidos de fusão. Um polipéptido de fusão sinal pode ser feito em que uma sequência sinal de secreção derivada de resíduo de aminoácido 1-23 da SEQ ID NO: 2 ou resíduos 1-23 SEQ ID NO: 11 é ligado operativamente a uma sequência de ADN que codifica outro polipéptido utilizando métodos conhecidos na técnica e revelados no presente documento. A sequência sinal de secreção contida nos polipéptidos de fusão da presente invenção é preferentemente fusionada amino-terminalmente a um péptido adicional para direccionar o péptido adicional na via de secreção. Tais construções têm numerosas aplicações conhecidas na técnica. Por exemplo, estas novas construções de fusão de sequência sinal de secreção podem direccionar a secreção de um componente activo de uma proteína normalmente não segregada. Tais fusões podem ser utilizadas in vivo ou in vitro para direccionar péptidos através da via de secreção. 61 Células de mamíferos cultivadas são hospedeiros adequados. Os métodos para introduzir ADN exógeno em células de mamíferos hospedeiras incluem transfecção mediada por fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham e Van der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporação (Neumann et al., EMBO J. 1:841-5, 1982), transfecção mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.), e transfecção mediada por lipossoma (Haw-ley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993, e vectores virais (Miller e Rosman, Bio-Técnicas 7:980-90, 1989; Wang e Finer, Nature Med. 2:714-6, 1996). A produção de polipéptidos recombinantes em células de mamíferos cultivadas é revelada, por exemplo, por Levinson et al., Patente US N° 4.713.339; Hagen et al., Patente US N° 4.784.950; Palmiter et al., Patente US N° 4.579.821; e Ringold, Patente US N° 4.656.134. As células de mamíferos cultivadas adequadas incluem as linhas de células COS-1 (N° de ATCC CRL 1650), COS-7 (N° de ATCC CRL 1651), BHK (N° de ATCC CRL 1632), BHK 570 (N° de ATCC CRL 10314), 293 (N° de ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) e ovário de hamster chinês (por exemplo, CHO-K1; N° de ATCC CCL 61). As linhas de células adequadas adicionais são conhecidas na técnica e disponíveis de centros depositários públicos tais como a Colecção Americana de Culturas Celulares, Manassas, VA. Em geral, promotores de transcrição fortes são preferidos, tais como promotores de SV-40 ou citomegalovírus. Veja-se, por exemplo, Patente US N° 4.956.288. Outros promotores adequados incluem aqueles de genes de metalotioneina (Patentes US N° 4.579.821 e 4.601.978) e o promotor tardio principal de adenovírus. A selecção de fármaco é utilizada geralmente para seleccionar células de mamíferos cultivadas em que ADN estranho foi inserido. Tais células são comummente denominadas como "transfectantes". As células que foram 62 cultivadas na presença do agente selectivo e são capazes de passar o gene de interesse à sua progénie são denominadas como "transfectantes estáveis". Um marcador seleccionável preferido é um gene que codifica resistência ao antibiótico neomicina. A selecção é levada a cabo na presença de um fármaco do tipo neomicina, tal como G-418 ou similares. Os sistemas de selecção podem também ser utilizados para aumentar o nível de expressão do gene de interesse, um processo denominado como "amplificação". A amplificação é levada a cabo pela cultura de transfectantes na presença de um nível baixo do agente selectivo e aumentando então a quantidade de agente selectivo para seleccionar células que produzem níveis altos dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador seleccionável amplificável preferido é dihidrofolato reductase, que confere resistência a metotrexato. Outros genes de resistência a fármaco (por exemplo, resistência a higromicina, resistência a múltiplos fármacos, puromicina acetiltransferase) podem também ser utilizados. Marcadores alternativos que introduzem um fenótipo alterado, tal como proteína fluorescente verde, ou proteínas de superfície celular tais como CD4, CD8, MHC de Classe I, fosfatase alcalina placentária podem ser utilizada para separar células transfectadas de células não transfectadas por tais meios como tecnologia de separação FACS ou pérola magnética.

Outras células eucarióticas superiores podem também ser utilizadas como hospedeiros, incluindo células vegetais, células de insectos e células de aves. A utilização de Agrobacterium rhizogenes como um vector para expressar genes em células vegetais foi revisto por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. A transformação de células de insectos e produção de polipéptidos estranhos nas mesmas é revelada por Guarino et al., Patente US N° 5.162.222 e publicação WIPO N° WO 94/06463. As células de insectos podem ser infectadas com 63 baculovírus recombinante, comummente derivado de vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (Ac-NPV). Veja-se, King, L.A. e Possee. R.D., The Baculovírus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; OReilly, D.R. et al.; Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nova Iorque, Oxford University Press., 1994; e Richardson, C.D., Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. 0 segundo método de preparação baculovírus recombinante utiliza um sistema à base de transposon descrito por Luckow (Luckow, V.Um, et ai., J Virol 67:4566-79, 1993). Este sistema é vendido no kit Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza um vector de transferência, pFastBacl™ (Life Technologies) que contém um transposon Tn7 para mover o ADN que codifica o polipéptido de zcytorl71ig num genoma de baculovírus mantido em E. coli como um grande plasmídeo chamado um "bacmídeo". 0 vector de transferência pFastBacl™ utiliza o promotor da polihedrina AcNPV para guiar a expressão do gene de interesse, neste caso zcytorl71ig. No entanto, pFastBacl™ pode ser modificado a um grau considerável. 0 promotor da polihedrina pode ser retirado e substituído com o promotor de proteína básica de baculovírus (também conhecido como Pcor, p6.9 ou promotor MP) que é expresso precocemente na infecção por baculovírus, e mostrou ser vantajoso para expressar proteínas secretadas. Veja-se, Hill-Perkins, M.S. e Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; e, Chazenbalk, G.D., e Rapoport, B., J. Biol. Chem, 270:1543-9, 1995. Em tais construções de vector de transferência, uma versão curta ou longa do promotor de proteína básica pode ser utilizada. Além disso, os vectores de transferência podem ser construídos os quais substituem as sequências sinal de secreção de zcytorl71ig nativo com sequências sinal de secreção derivadas de proteínas de 64 insecto. Por exemplo, uma sequência sinal de secreção de Ecdisteróide Glucosiltransferase (EGT), Melitina de mel de abelhas (Invitrogen, Carlsbad, CA), ou baculovírus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) podem ser utilizados em construções para substituir a sequência sinal de secreção de zcytorl71ig nativo. Além disso, os vectores de transferência podem incluir uma fusão dentro da grelha com ADN que codifica uma etiqueta de epitopo na terminação C ou N do polipéptido de zcytorl71ig expresso, por exemplo, uma etiqueta de epitopo Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7952-4, 1985). Utilizando técnicas conhecidas na especialidade, um vector de transferência que contém zcytorl71ig é transformado em E. coli, e rastreado para baemídeos que contêm um gene lacZ interrompido indicativo baculovírus de recombinante. 0 ADN de baemídeo que contém o genoma de baculovírus recombinante é isolado, utilizando técnicas comuns, e utilizado para transfectar células de Spodoptera frugiperda, por exemplo, células Sf9. 0 vírus recombinante que expressa zcytorl71ig é produzido subsequentemente. Reservas virais recombinantes são feitos por métodos comummente utilizados na técnica.*** 0 vírus recombinante é utilizado para infectar células hospedeiras, tipicamente uma linha celular derivada do lagarta-do-cartucho-do-milho, Spodoptera frugiperda. Veja-se, em geral, Glick e Pasternak, Molecular Biotechnology: Principies and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Outra linha celular adequada é a linha celular High FiveO™ (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente US N° 5.300.435).

Também podem ser utilizados células fúngicas, incluindo células de levedura. As espécies de levedura com um interesse particular a este respeito incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Revelam-se métodos para transformar células de S. cerevisiae com ADN exógeno e produzir polipéptidos 65 recombinantes a partir das mesmas, por exemplo por Kawasaki, Patente US N° 4.599.311; Kawasaki et al., Patente US N° 4.931.373; Brake, Patente US N° 4.870.008; Welch et al., Patente US N° 5.037.743; e Murmy et al., Patente US N° 4.845.075. As células transformadas são seleccionadas pelo fenótipo determinado pelo marcador seleccionável, comummente resistência a fármacos ou a capacidade de crescer na ausência de um nutriente particular (por exemplo, leucina). Um sistema de vector preferido para utilização em (por exemplo, leucina). Um sistema de vector preferido para utilização em Saccharomyces cerevisiae é o sistema de vector POT1 revelado por Kawasaki et al. (Patente US N° 4.931.373), que permite seleccionar as células transformadas por crescimento em meio que contém glicose. Os promotores e terminadores adequados para utilização em levedura incluem os de genes de enzimas glicolíticas (veja-se, por exemplo, Kawasaki, Patente US N° 4.599.311; Kingsman et al., Patente US N° 4.615.974; e Bitter, Patente US N° 4.977.092) e genes de álcool desidrogenase. Vejam-se também as Patentes US N° 4.990.446; 5.063.154; 5.139.936 e 4.661.454. Na técnica conhecem-se sistemas de transformação para outras leveduras, incluindo Hansenula polymorpha, Schlzosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydls, Plchla pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltose. Veja-se, por exemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 e Cregg, Patente US N° 4.882.279. Podem utilizar-se células de Aspergillus de acordo com os métodos de McKnight et al., Patente US N° 4.935.349. Revelam-se métodos para transformar Acremonitum chrysogenum por Sumino et al., Patente US N° 5.162.228. Revelam-se métodos para transformar Neurospora por Lambowitz, Patente US N° 4.486.533. 66 A utilização de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é revelada nas Publicações WIPO N° WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 e WO 98/02565. As moléculas de ADN para utilização na transformação de P. methanolica comummente serão preparadas como plasmídeos circulares, de cadeia dupla, que são alinhadas preferentemente antes da transformação. Para a produção de polipéptidos em P. methanolica, prefere-se que o promotor e terminador no plasmídeo sejam esses de um gene de P. methanolica, tal como um gene de utilização de álcool de P. methanolica (AUG1 ou AUG2) . Outros promotores úteis incluem esses da dihidroxiacetona sintase (DHAS), formiato desidrogenase (FMD), e catalase (CAT). Para facilitar a integração do ADN no cromossoma do hospedeiro, prefere-se ter o segmento de expressão inteiro do plasmídeo flanqueado nas duas extremidades por sequências de ADN do hospedeiro. Um marcador de selecção preferido para utilização em Pichia methanolica é um gene ADE2 de P. methanolica, que codifica a fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilase (AIRC; EC 4.1. 1.21), que permite que as células hospedeiras ade2 cresçam na ausência de adenina. Para os processos industriais em larga escala em que é desejável minimizar a utilização de metanol, prefere-se utilizar células hospedeiras de proteínas segregadas, preferem-se células hospedeiras deficientes em genes de proteases vacuolares (PEP4 e PRB1). Utiliza-se electroporação para facilitar a introdução de um plasmídeo que contém ADN que codifica um polipéptido de interesse em células de P. methanolica. Prefere-se transformar as células de P. methanolica por electroporação utilizando um campo eléctrico de pulsos, que se reduz exponencialmente, que tem uma intensidade de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, preferentemente de aproximadamente 3,75 kV/cm e uma constante de tempo (Ω) de 1 a 40 milissegundos, mais preferentemente de aproximadamente 20 milissegundos. 67 São também células hospedeiras úteis, células hospedeiras procariotas, incluindo estirpes da bactéria Escherichia coli, Bacillus e outros géneros. Neste campo são bem conhecidas técnicas para transformar estes hospedeiros e expressar sequências de ADN estranhas clonadas no seu interior (veja-se, por exemplo, Sambrook et al., ibid.). Quando é expresso um polipéptido zcytorl71ig em bactérias tais como E. coli, o polipéptido pode ficar retido no citoplasma, tipicamente como grânulos insolúveis, ou pode dirigir-se ao espaço periplasmático por uma sequência de secreção bacteriana. No primeiro caso, as células são Usadas, e os grânulos são recuperados e desnaturados utilizando, por exemplo, isotiocianato de guanidina ou ureia. O polipéptido desnaturado depois pode ser redobrado e dimerizado por meio da diluição do desnaturante, tal como por diálise contra uma solução de ureia e uma combinação de glutatião reduzido e oxidado, seguido de diálise contra uma solução salina tamponada. No último caso, o polipéptido pode ser recuperado do espaço periplasmático numa forma solúvel e funcional rompendo as células (por exemplo, por sonicação ou choque osmótico) para libertar o conteúdo do espaço periplasmático e recuperar a proteína, evitando desta maneira a necessidade de desnaturação e re-enrolamento.

As células hospedeiras transformadas ou transfectadas são cultivadas de acordo com os métodos convencionais num meio de cultura que contém nutrientes e outros componentes necessários para o crescimento das células hospedeiras escolhidas. Na técnica conhece-se uma variedade de meios adequados, incluindo meios definidos e meios complexos, e geralmente incluem uma fonte de carbono, uma fonte de azoto, aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais. Os meios também podem conter componentes tais como factores de crescimento ou soro, quando for necessário. 0 meio de crescimento geralmente seleccionará as células que contêm o 68 ADN adicionado exogenamente, por exemplo, por selecção com fármacos ou deficiência num nutriente essencial que é complementado pelo marcador de selecção que possui o vector de expressão ou co-transfectado na célula hospedeira. As células de P. methanolica são cultivadas num meio que compreende fontes de carbono adequadas, azoto e nutrientes de oligoelementos a uma temperatura de aproximadamente 25 °C a 35 °C. As culturas liquidas são proporcionadas com suficiente aeração por meios convencionais, tais como agitação de pequenos balões ou pulverização de fermentadores. Um meio de cultura preferido para P. methanolica é YEPD (2 % de D-glicose, 2 % de Bacto™ Peptona (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1 % de extracto de levedura Bacto™ (Difco Laboratories), 0,004 % de adenina e 0, 006 % de L-leucina) .

Prefere-se purificar polipéptidos até uma pureza >80 %, mais preferentemente até uma pureza >90 %, ainda mais preferentemente até uma pureza >95 %, e prefere-se particularmente um estado farmaceuticamente puro, isto é, com uma pureza maior de 99,9 % com respeito às macromoléculas contaminantes, particularmente outras proteínas e ácidos nucleicos, e sem agentes infecciosos e pirogénicos. Preferentemente, um polipéptido purificado carece substancialmente de outros polipéptidos, particularmente outros polipéptidos de origem animal.

Os polipéptidos zcytorl71ig recombinantes expressos (ou polipéptidos zcytorl71ig quiméricos) podem ser purificados utilizando fracionamento e/ou métodos e meios de purificação convencionais. Pode utilizar-se precipitação com sulfato de amónio e extracção com ácido ou caótropo para o fraccionamento das amostras. As etapas de purificação exemplares podem incluir hidroxiapatita, exclusão por tamanho, FPLC e cromatografia líquida de fase inversa de alta resolução. Os meios cromatográficos adequados incluem dextranos derivatizados, agarose, 69 celulose, poliacrilamida, especialmente sílicas e similares. Preferem-se PEI, DEAE, QAE e derivados de Q. Os meios cromatográficos exemplares incluem os meios derivatizados com grupos fenilo, butilo ou octilo, tais como Phenil-Sepharose FF (Pharmacia) , Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA) , Octyl-Sepharose (Pharmacia) e similares; ou resinas poliacrilicas tais como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) e similares. Os suportes sólidos adequados incluem pérolas de vidro, resinas baseadas em sílica, resinas celulósicas, pérolas de agarose, pérolas de agarose reticulada, resinas de poliacrilamida reticulada com pérolas de poliestireno e similares que são insolúveis nas condições nas quais estão a serem utilizadas. Estes suportes podem modificar-se com grupos reactivos que permitem a ligação de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfidrilo, grupos hidroxilo e/ou resíduos de hidrato de carbono. Os exemplos de químicas de acoplamento incluem activação com brometo de cianogénio, activação com N-hidroxisuccinimida, activação com epóxido, activação com sulfidrilo, activação com hidrazina e derivados de carboxilo e amino para químicas de acoplamento de carbodiimida. Estes e outros meios sólidos são bem conhecidos e são utilizados amplamente na técnica, e estão disponíveis de fornecedores comerciais. Os métodos para ligar polipéptidos receptores a meios de suporte são bem conhecidos na técnica. A selecção de um método particular é questão de um desenho de rotina e determina-se em parte pelas propriedades do suporte escolhido. Veja-se, por exemplo, Affinity Chromatography: Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suécia, 1988.

Os polipéptidos descritos no presente documento podem ser isolados por exploração das suas propriedades físicas ou bioquímicas. Por exemplo, pode utilizar-se cromatografia de adsorção por ião metálico imobilizado (IMAC) para purificar proteínas ricas em histidina, incluindo essas que 70 compreendem marcadores de polihistidina. De maneira breve, um gel primeiro é carregado com iões metálicos divalentes para formar um quelato (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985). Nesta matriz serão adsorvidas proteinas ricas em histidina com diferentes afinidades, dependendo do ião metálico utilizado, e serão eluidas por eluição competitiva, reduzindo o pH, ou por meio da utilização de agentes quelantes fortes. Outros métodos de purificação incluem purificação de proteínas glicosiladas por cromatografia de afinidade de lectina e cromatografia de permuta iónica (Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, págs. 529-39) e utilização do receptor de zcytorl7 solúvel. Pode construir-se uma fusão do polipéptido de interesse e um marcador de afinidade (por exemplo, proteína de ligação de maltose, um domínio de imunoglobulina) para facilitar a purificação.

Além disso, utilizando métodos descritos na técnica, fusões de polipéptidos, ou proteínas zcytorl71ig híbridas são construídas utilizando regiões ou domínios do zcytorl71ig da invenção em combinação com aquelas de outras proteínas da família de citocinas humanas (por exemplo interleucinas ou GM-CSF), ou proteínas heterólogas (Sambrook et al., ibid., Altschul et al., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5: 511-5, 1994, e referências citadas neste documento). Estes métodos permitem a determinação da importância biológica de domínios ou regiões de maior tamanho num polipéptido de interesse. Ditos híbridos podem alterar a cinética de reacção, a ligação, reduzir ou expandir a especificidade do substrato, ou alterar a localização tissular e celular de um polipéptido, e pode aplicar-se a polipéptidos de estrutura desconhecida.

As proteínas de fusão podem ser preparadas por métodos conhecidos pelos peritos na especialidade por meio da preparação de cada componente da proteína de fusão e 71 conjugação dos mesmos quimicamente. Como alternativa, pode ser gerado um polinucleótido que codifica os dois componentes da proteína de fusão na grelha de leitura apropriada utilizando técnicas conhecidas e expressado pelos métodos descritos no presente documento. Por exemplo, pode intercambiar-se parte ou todo de uma hélice que confere uma função biológica entre zcytorl71ig da presente invenção com as hélices funcionalmente equivalentes de outro membro da família, tal como IL-15, IL-2, L-4 ou GMS-CSF. Estes componentes incluem, mas sem limitação, a sequência sinal de secreção; hélices A, B, C, D; loops A/B, B/C, C/D; de citocinas de quatro feixes helicoidais. Seria esperado que ditas proteínas de fusão tivessem um perfil funcional biológico igual ou similar ao dos polipéptidos da presente invenção ou outras proteínas da família de citocinas de quatro feixes helicoidais, dependendo da fusão construída. Além disso, ditas proteínas de fusão podem apresentar outras propriedades como é revelado no presente documento.

Podem utilizar-se técnicas de clonagem e de biologia molecular convencionais para intercambiar os domínios equivalentes entre o polipéptido zcytorl71ig e os polipéptidos com os quais se fusionam. Em geral, um segmento de ADN que codifica um domínio de interesse, por exemplo, as hélices à D de zcytorl71ig, ou outro domínio descrito no presente documento, ligam-se operativamente na grelha com pelo menos outro segmento de ADN que codifica um polipéptido adicional, (por exemplo, um domínio ou região de outra citocina, tal como a IL-2 ou similar), e inserem-se no vector de expressão apropriado, como é descrito no presente documento. Em geral, as construções de ADN são preparadas de tal forma que vários segmentos de ADN que codificam as regiões correspondentes de um polipéptido se ligam operativamente na grelha para obter uma única construção que codifica a proteína de fusão inteira, ou uma 72 parte funcional da mesma. Por exemplo, uma construção de ADN codificaria desde a extremidade N à extremidade C uma proteína de fusão que compreende um polipéptido sinal seguido de uma proteína de fusão de citocina de quatro feixes helicoidais madura que contém a hélice A, seguida da hélice B, seguida da hélice C, seguida da hélice D. Ditas proteínas de fusão podem expressar-se, isolar-se e ensaiar-se com respeito à actividade como é descrito no presente documento.

Também podem ser preparados polipéptidos zcytorl71ig ou fragmentos dos mesmos por meio de síntese química, os polipéptidos zyctor!71ig podem ser monómeros ou multímeros; glicosilados ou não glicosilados; pegilados ou não pegilados; e podem incluir ou não um resíduo de aminoácido metionina inicial. Por exemplo, os polipéptidos podem ser preparados por síntese de péptidos em fase sólida, por exemplo como é revelado por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963. A actividade das moléculas descritas no presente documento pode medir-se utilizando uma variedade de ensaios que medem a proliferação e/ou ligação a células que expressam o receptor de zcytorl71ig. São de um interesse particular as mudanças nas células dependentes de zcytorligl7. As linhas celulares adequadas a modificar por engenharia genética para serem dependentes de zcytorl71ig incluem a linha celular BaF3 dependente de IL-3 (Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984) e M07e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993) . Podem estabelecer-se linhas celulares dependentes de factores de crescimento de acordo com os métodos publicados (por exemplo Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., em Baum et ai. Eds., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980). 73

As proteínas descritas no presente documento são úteis para estimular a proliferação, activação, diferenciação e/ou indução ou inibição da função celular especializada de células da homeostase envolvida na hematopoiese e função imune. Em particular, os polipéptidos zcytorl71ig são úteis para estimular a proliferação, activação, diferenciação, indução, ou inibição de funções celulares especializadas de células das linhagens hematopoiéticas, incluindo, mas sem limitação, linfócitos T, linfócitos B, monócitos/macrófagos, células NK, neutrófilos, células endoteliais, fibroblastos, eosinófilos, condrócitos, mastócitos, células de langerhan, monócitos e macrófagos, assim como células epiteliais. As células epiteliais incluem, por exemplo, ameloblastos, células principais, cromatóforos, células enterocromafins, células de tipo enterocromafim, células caliciformes, células da granulosa, queratinócitos, células dendríticas, células labirínticas de suporte, melanócitos, células de Merkel, células de Paneth, células parietais, células de Sertoli e similares. A proliferação e/ou diferenciação de células hematopoiéticas pode medir-se in vitro utilizando células cultivadas ou in vivo por meio da administração de moléculas descritas no presente documento ao modelo animal apropriado. Os ensaios que medem a proliferação ou diferenciação celular são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os ensaios que medem a proliferação incluem ensaios tais como a quimiossensibilidade a um corante vermelho neutro (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8: 347-354, 1990), incorporação de nucleótidos radiomarcados (Cook et al., Analytical Biochem. 179: 1-7, 1989), incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) no ADN de células proliferativas (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985) e a utilização de sais de tetrazólio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65: 55-63, 1983; Alley et al., Câncer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall 74 et al. , Growth Reg. 5: 69-84, 1995; e Scudiero et al., Câncer Res. 48: 4827-4833, 1988). Os ensaios para medir a diferenciação incluem, por exemplo, a medição de marcadores da superfície celular associados à expressão específica de fase de um tecido, actividade enzimática, actividade funcional ou mudanças morfológicas (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989) .

As moléculas descritas no presente documento podem ser ensaiadas in vivo utilizando sistemas de libertação virais. Os vírus exemplares para este propósito incluem adenovírus, herpesvírus, retrovírus, vaccinia vírus e vírus adeno-associados (VAA). O adenovírus, um vírus de ADN de cadeia dupla, actualmente é o vector de transferência génica melhor estudado para a administração de um ácido nucleico heterólogo (como revisão, veja-se T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43: 161-89, 1994; e J.T. Douglas e D.T. Curiel, Science & Medicine 4: 44-53, 1997).

Como ligando, a actividade do polipéptido zcytorl71ig pode medir-se por um microfisiômetro biossensor à base de silício que mede a velocidade de acidificação extracelular ou a excreção de protões associada à ligação ao receptor e as posteriores respostas celulares fisiológicas. Um dispositivo exemplar é o Microfisiômetro Cytosensor™ fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Pode medir-se uma variedade de respostas celulares, tais como a proliferação celular, o transporte iónico, a produção de energia, respostas inflamatórias, actividade reguladora e de receptores e similares por este método. Veja-se, por exemplo, McConnell, H.M. et al., Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998 . 75

Além disso, zcytorl71ig pode ser utilizado para identificar células, tecidos ou linhas celulares que respondem a uma via estimulada por zcytorl71ig. 0 microfisiômetro, descrito anteriormente, pode utilizar-se para identificar rapidamente células que respondam a ligandos, tais como células que respondem a cytorl71ig da presente invenção. As células podem ser cultivadas na presença ou ausência do polipéptido cytorl71ig. As células que induzem uma mudança medivel na acidificação extracelular na presença de zcytorl71ig respondem a zcytorl71ig. Ditas células ou linhas celulares podem utilizar-se para identificar antagonistas e agonistas do polipéptido zcytorl71ig como foi descrito anteriormente.

Em vista da distribuição tissular observada para agonistas do receptor de zcytorl7 (incluindo o zcytorl71ig natural/substrato/cofactor/etc.) e/ou seus antagonistas têm um potencial enorme em aplicações tanto in vitro como in vivo. Os compostos identificados como agonistas de zcytorl71ig são úteis para a expansão, proliferação, activação, diferenciação e/ou indução ou inibição de funções celulares especializadas de células envolvidas na homeostase da hematopoiese e a função imune. Por exemplo, zcytorl71ig e os compostos agonistas são úteis como componentes de meios de cultura celular definidos, e podem utilizar-se em separado ou em combinação com outras citocinas e hormonas para substituir o soro que comummente é utilizado na cultura celular. Desta maneira, os agonistas são úteis para promover especificamente o crescimento e/ou desenvolvimento de linfócitos T, linfócitos B, monócitos/macrófagos, células NK, linfócitos citotóxicos e outras células da linhagem linfóide e mielóide em cultura.

Os antagonistas também são úteis como reagentes de investigação para caracterizar locais de interacção ligando-receptor. Os antagonistas são úteis para inibir a expansão, proliferação, activação e/ou diferenciação de 76 células envolvidas na regulação da hematopoiese. Os inibidores da actividade de zcytorl71ig (antagonistas de zcytorl71ig) incluem anticorpos antizcytorl71ig e receptores de zcytorl71ig solúveis, assim como outros agentes peptídicos e não peptidicos (incluindo ribozimas). 0 zcytorligl7 também pode ser utilizado para identificar inibidores (antagonistas) da sua actividade. Adicionam-se compostos de ensaio aos ensaios revelados no presente documento para identificar compostos que inibem a actividade de zcytorl71ig. Além dos ensaios revelados no presente documento, podem ser ensaiadas amostras com respeito à inibição da actividade de zcytorl71ig dentro de uma variedade de ensaios desenhados para medir a ligação ao receptor, a estimulação/inibição de respostas celulares dependentes de zcytorl71ig ou a proliferação de células que expressam o receptor de zcytorl7.

Um polipéptido zcytorl71ig pode expressar-se como uma fusão com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, tipicamente um fragmento Fc, que contém dois domínios de região constante e carece da região variável. Revelam-se métodos para preparar ditas fusões nas Patentes US N° 5.155.027 e 5.567.584. Ditas fusões são secretadas tipicamente como moléculas multiméricas nas quais as partes Fc estão ligadas por ponte dissulfureto entre si e dois polipéptidos não Ig estão dispostos muito próximos entre si. Podem utilizar-se fusões deste tipo, por exemplo, para dimerização, para aumentar a estabilidade e a semivida in vivo, para purificar um ligando por afinidade, como ferramenta de ensaio ín vítro ou como antagonista. Para utilização em ensaios, as quimeras ligam-se a um suporte através da região Fc e utiliza-se num formato ELISA.

Um polipéptido de ligação a zcytorl71ig também pode ser utilizado para a purificação do ligando. O polipéptido é imobilizado num suporte sólido, tal como pérolas de 77 agarose, agarose reticulada, vidro, resinas celulósicas, resinas baseadas em sílica, poliestireno, poliacrilamida reticulada ou materiais similares que são estáveis nas condições de utilização. Na técnica conhecem-se métodos para ligar polipéptidos a suportes sólidos e incluem química de amina, activação com brometo de cianogénio, activação com N-hidroxisuccinimida, activação com epóxido, activação com sulfidrilo, e activação com hidrazina. 0 meio resultante será configurado geralmente em forma de uma coluna, e os fluidos que contêm ligandos passam através da coluna uma ou mais vezes para permitir que o ligando se ligue ao polipéptido receptor. 0 ligando é eluído depois utilizando mudanças na concentração de sal, agentes caotrópicos (guanidina HC1) ou o pH para alterar a ligação ligando-receptor.

Vantajosamente pode utilizar-se um sistema de ensaio que utiliza um receptor de ligação a ligando (ou um anticorpo, um membro de um par complemento/anticomplemento) ou um fragmento de ligação do mesmo, e um instrumento biossensor disponível comercialmente (BIAcore, Pharmacia Biossensor, Piscataway, NJ). Dito receptor, anticorpo, membro de par complemento/anticomplemento ou fragmento é imobilizado na superfície de uma microplaca receptora. É revelada a utilização deste instrumento por Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 e Cunningham e Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Um receptor, anticorpo, membro ou fragmento liga-se covalentemente, utilizando química de amina ou sulfidrilo, a fibras de dextrano que estão ligadas a um filme de ouro dentro da célula de fluxo. Passa-se uma amostra de ensaio através da célula. Se na amostra está presente um ligando, um epítopo ou membro oposto do par complemento/anticomplemento, será ligado ao receptor, anticorpo ou membro imobilizado, respectivamente, provocando uma mudança no índice de refracção do meio, que se detecta como uma mudança na ressonância de plasmão 78 superficial do filme de ouro. Este sistema permite a determinação de velocidades de associação e dissociação, a partir das quais pode ser calculada a afinidade de ligação, e a avaliação da estequiometria de ligação. Como alternativa, a ligação ligando/receptor pode analizar-se utilizando a tecnologia SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Paio Alto, CA).

Também podem ser utilizados polipéptidos receptores de ligação a ligando dentro de outros sistemas de ensaio bem conhecidos na técnica. Ditos sistemas incluem o análise de Scatchard para a determinação da afinidade de ligação (veja-se Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 51: 660-72, 1949) e ensaios calorimétricos (Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).

Também podem ser utilizados polipéptidos zcytorl71ig para preparar anticorpos que se ligam a epitopos, péptidos ou polipéptidos zcytorl71ig. O polipéptido zcytorl71ig ou fragmento do mesmo serve como antigénio (imunogénio) para inocular num animal e induzir uma resposta imune. Ditos anticorpos podem utilizar-se para bloquear a acção biológica de zcytorl71ig pró-inflamatório e são úteis como agentes terapêuticos anti-inflamatórias numa variedade de doenças como é descrito no presente documento. Um perito na especialidade reconhecerá que os polipéptidos que possuem epitopos antigénicos contêm uma sequência de pelo menos 6, preferentemente pelo menos 9 e mais preferentemente de pelo menos 15 a aproximadamente 30 resíduos de aminoácido contíguos de um polipéptido zcytorl71ig (por exemplo SEQ ID NO: 2). São incluídos polipéptidos que compreendem uma parte maior de um polipéptido zcytorl71ig, isto é, de 30 a 100 resíduos até o comprimento inteiro da sequência de aminoácidos. Os antigénios ou epitopos imunogénicos também podem incluir marcadores ligados, adjuvantes, veículos e excipientes, como é descrito no presente documento. Os antigénios adequados incluem o polipéptido zcytorl71ig 79 codificado pela SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido número 24 ao aminoácido número 164, ou um fragmento de 9 a 141 aminoácidos contíguo do mesmo. Outros antigénios adequados incluem o zcytorl71ig de comprimento completo maduro, as hélices A-D e hélices A, B, C e D múltiplos ou individuais da estrutura de zcytorl71ig de quatro feixes helicoidais, como é descrito no presente documento. Os péptidos preferidos para utilização como antigénios são péptidos hidrófilos tais como os preditos por um perito na especialidade a partir de um gráfico de hidrofobia, como é descrito no presente documento, por exemplo, os resíduos de aminoácido 114-119, 101-105, 126-131, 113-11 e 158-162 da SEQ ID NO: 2; e os resíduos de aminoácido 34-39, 46-51, 131-136, 158-163 e 157-162 da SEQ ID NO: 11. Além disso, os epítopos antigénicos de zcytorl71ig preditos por um gráfico de Jameson-Wolf, por exemplo, utilizando o programa DNASTAR Protean (DNASTAR, Inc., Madison, WI) servem como antigénios preferidos, e são determinados facilmente por um perito na especialidade.

Podem ser isolados anticorpos de uma resposta imune gerada por inoculação de um animal com estes antigénios como é descrito no presente documento. Os métodos para preparar e isolar anticorpos policlonais e monoclonais são bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley e Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor, NY, 1989; e Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.

Como será evidente para um perito na especialidade, podem gerar-se anticorpos policlonais por inoculação de uma variedade de animais de sangue quente tais como cavalos, vacas, cabras, ovelhas, cães, galinhas, coelhos, ratinhos e ratos com um polipéptido zcytorl71ig ou um fragmento do 80 mesmo. A imunogenicidade de um polipéptido zcytorl71ig pode ser aumentada por meio da utilização de um adjuvante, tal como alúmen (hidróxido de alumínio) ou adjuvante completo ou incompleto de Freund. Os polipéptidos úteis para a imunização também incluem polipéptidos de fusão, tais como fusões de zcytorl71ig ou uma parte do mesmo com um polipéptido de imunoglobulina ou com proteína de ligação a maltose. O imunogénio polipeptídico pode ser uma molécula de comprimento completa ou uma parte do mesmo. Se a parte de polipéptido for de "tipo hapteno", dita parte pode ligar-se vantajosamente ou associar-se a um suporte macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou toxóide tetânico) para imunização.

Como é utilizado no presente documento, o termo "anticorpos" inclui anticorpos policlonais, anticorpos policlonais purificados por afinidade, anticorpos monoclonais e fragmentos de ligação a antigénio, tais como fragmentos proteolíticos F(ab')2 e Fab. Também se incluem anticorpos intactos modificados por engenharia genética ou fragmentos, tais como anticorpos quiméricos, fragmentos Fv, anticorpos de cadeia simples e similares, assim como péptidos e polipéptidos de ligação a antigénio sintéticos. Os anticorpos não humanos podem ser humanizados por enxerto de CDR não humanas em regiões framework e constantes humanas, ou por incorporação dos domínios variáveis não humanos inteiros (opcionalmente "cobrindo" os mesmos com uma superfície de tipo humano por substituição de resíduos expostos, sendo o resultado um anticorpo "revestido"). Em alguns casos, os anticorpos humanizados podem conservar resíduos não humanos dentro dos domínios framework da região variável humana para aumentar as características de ligação apropriadas. Por meio da humanização de anticorpos, pode ser aumentada a semivida biológica e reduzido o potencial de reacções imunes adversas após a administração 81 a seres humanos. Além disso, podem ser produzidos anticorpos humanos em animais transgénicos não humanos que foram modificados por engenharia genética para conter genes de imunoglobulina humana como é revelado na publicação WIPO N° WO 98/24893. Prefere-se que os genes de imunoglobulina endógenos nestes animais sejam inactivados ou eliminados, tal como por recombinação homóloga.

Os anticorpos são considerados de ligação específica se: 1) apresentam um nível limite de actividade de ligação e 2) não apresentam reacção cruzada significativa com moléculas polipeptídicas relacionadas. Determina-se um nível limite de ligação se os anticorpos anti-zcytorl71ig do presente documento se ligarem a um polipéptido, péptido ou epítopo de zcytorl71ig com uma afinidade de pelo menos 10 vezes maior que a afinidade de ligação ao polipéptido de controlo (não-zcytorl71ig) . Prefere-se que os anticorpos apresentem uma afinidade de ligação (Ka) de 106 PT1 ou maior, preferentemente ΙΟ7 ΙΧΓ1 ou maior, mais preferentemente 108 M”1 ou maior e ainda mais preferentemente 109 M"1 ou maior. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser determinada facilmente por um perito na especialidade, por exemplo, por análise de Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sei. 51: 660-672, 1949).

Se os anticorpos anti-zcytorl71ig não apresentam reacção cruzada significativa com moléculas polipeptídicas relacionadas é mostrado, por exemplo, pelo anticorpo que detecta o polipéptido zcytorl71ig, mas não polipéptidos relacionados conhecidos utilizando uma análise de transferência de Western (Ausubel et al., ibid.). São exemplos de polipéptidos relacionados conhecidos os revelados na técnica anterior, tais como ortólogos conhecidos, e parálogos, e membros conhecidos similares de uma família de proteínas. O rastreio também pode ser realizado utilizando zcytorl71ig não humano e polipéptidos mutantes zcytorl71ig. Além disso, podem "ser rastreados 82 anticorpos contra" polipéptidos relacionados conhecidos, para isolar uma população que se liga especificamente aos polipéptidos zcytorl71ig. Por exemplo, absorvem-se anticorpos induzidos contra zcytorl71ig em polipéptidos relacionados aderidos a uma matriz insolúvel; os anticorpos específicos para zcytorl71ig fluirão através da matriz nas condições tamponantes apropriadas. 0 rastreio permite o isolamento de anticorpos policlonais e monoclonais que não apresentam reacção cruzada com polipéptidos muito relacionados conhecidos (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley e Sons, Inc., 1995). 0 rastreio e isolamento de anticorpos específicos são bem conhecidos na técnica. Veja-se, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984. Especificamente, pode detectar-se a ligação de anticorpos anti-zyctorl71ig por vários métodos da técnica, e revela-se a seguir.

Pode utilizar-se uma variedade de ensaios conhecidos pelos peritos na especialidade para detectar anticorpos que se ligam a proteínas ou polipéptidos zcytorl71ig. Descrevem-se ensaios exemplares em detalhe em Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow e Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Os exemplos representativos de ditos ensaios incluem: imunoelectroforese concorrente, radioimunoensaio, radioimunoprecipitação, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), ensaio de transferência pontual (dot blot) ou transferência de Western, inibição ou ensaio competitivo e ensaio de tipo sanduíche. Além disso, os anticorpos podem ser rastreados 83 com respeito à ligação à proteína ou polipéptido zcytorl71ig mutante versus o de tipo selvagem.

Os anticorpos contra zcytorl71ig podem utilizar-se para marcar células que expressam zcytorl71ig; para isolar zcytorl71ig por purificação de afinidade; para ensaios de diagnóstico para determinar os níveis circulantes de polipéptidos zcytorl71ig; para detectar ou quantificar zcytorl71ig solúvel como um marcador da patologia ou doença subjacente; em métodos analíticos que utilizam FACS; para rastrear bibliotecas de expressão; para gerar anticorpos anti-idiotípicos; e como anticorpos neutralizadores ou como antagonistas para bloquear a actividade de zcytorl71ig in vitro e in vivo. Os marcadores ou sinais directos adequados incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e similares; os marcadores ou sinais indirectos podem apresentar a utilização de biotina-avidina ou outros pares complemento/anticomplemento como intermediários. Os anticorpos do presente documento também podem ser conjugados directamente ou indirectamente com fármacos, toxinas, radionuclídeos e similares, e estes conjugados podem utilizar-se para aplicações de diagnóstico ou terapêuticas in vivo. Além disso, podem utilizar-se anticorpos contra zcytorl71ig ou fragmentos do mesmo in vitro para detectar zcytorl71ig desnaturado ou fragmentos do mesmo em ensaios, por exemplo, ensaios de Western ou outros ensaios conhecidos na técnica.

As moléculas detectáveis adequadas podem ligar-se directamente ou indirectamente ao polipéptido ou anticorpo, e incluem radionuclídeos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e similares. As moléculas citotóxicas adequadas podem ligar-se directamente ou indirectamente ao polipéptido ou anticorpo, e incluem 84 toxinas bacterianas ou vegetais (por exemplo, toxina diftérica, saporina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina e similares), assim como radionuclideos terapêuticos, tais como iodo-131, rénio-188 ou ítrio-90 (ligados directamente ao polipéptido ou anticorpo, ou ligados indirectamente por meio de um resíduo quelante, por exemplo). Os polipéptidos ou anticorpos também podem ser conjugados com fármacos citotóxicos tais como adriamicina. Para a ligação indirecta de uma molécula detectável ou citotóxica, a molécula detectável ou citotóxica pode ser conjugada com um membro de uma parte complementar/anticomplementar, estando o outro membro ligado à parte de polipéptido ou anticorpo. Para estes propósitos, um par complementar/anticomplementar exemplar é biotina/estreptavidina.

Os polipéptidos de ligação também podem actuar como "antagonistas" de zcytorl71ig para bloquear a ligação de zcytorl71ig e a transdução de sinais ín vitro e in vivo. Estes polipéptidos de ligação anti-zcytorl71ig seriam úteis para inibir a actividade de zcytorl71ig ou a ligação de proteínas.

Podem utilizar-se proteínas de fusão polipéptido-toxina ou proteínas de fusão anticorpo-toxina para uma inibição ou ablação celular ou tissular dirigida (por exemplo, para tratar células ou tecidos cancerosos). Como alternativa, se o polipéptido tem múltiplos domínios funcionais (isto é, um domínio de activação ou um domínio de ligação ao receptor, mais um domínio de direcção), pode ser adequada uma proteína de fusão que inclua somente o domínio de direcção para dirigir uma molécula detectável, uma molécula citotóxica ou uma molécula complementar a um tipo celular ou tissular de interesse. Nos casos em que a proteína de fusão somente com domínio inclui uma molécula complementar, a molécula anticomplementar pode ser conjugada com uma molécula detectável ou citotóxica. Ditas 85 proteínas de fusão de domínio-molécula complementar desta forma representam um portador ou veículo de direcção genérico para libertação específica de célula/tecido de conjugados genéricos de molécula citotóxica/anti-complementar-detectável.

Em outra forma de realização, podem utilizar-se proteínas de fusão de citocina zcytorl71ig ou proteínas de fusão de citocina-anticorpo para a destruição in vivo de tecidos alvo (por exemplo, leucemia, linfoma, cancro de pulmão, cancro de cólon, melanoma, cancro pancreático, cancro de ovário, cancros de pele, sangue e medula óssea, ou outros cancros em que se expressam receptores de zcytorl71ig) (Veja-se, em geral, Hornick et al., Blood 89: 4437-47, 1997). As proteínas de fusão descritas permitem dirigir uma citocina a um local de acção desejado, proporcionando desta maneira uma concentração local elevada de citocina. Os polipéptidos zcytorl71ig adequados ou anticorpos anti-zcytorligl7 dirigem-se a uma célula ou tecido indesejável (isto é, um tumor ou uma leucemia) e a citocina fusionada media a lise da célula alvo melhorada pelas células efectoras. As citocinas adequadas para este propósito incluem, por exemplo, interleucina 2 e factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) .

Em outra forma de realização, se o polipéptido zcytorl71ig ou o anticorpo anti-zcytorl71ig for dirigido a células ou tecidos vasculares, dito polipéptido ou anticorpo pode ser conjugado com um radionuclídeo, e particularmente com um radionuclídeo de emissão beta, para reduzir restenose. Ditas abordagens terapêuticas envolvem menos risco para os médicos que administram a terapêutica radioactiva. Por exemplo, as fitas impregnadas com irídio-192 colocadas em vasos nos quais foram introduzidos endopróteses vasculares de pacientes até que seja administrada a dose de radiação necessária mostraram um 86 menor crescimento de tecido no vaso e um maior diâmetro do lúmen que no grupo de controlo, que recebeu fitas de placebo. Além disso, a revascularização e trombose da endoprótese vascular foram significativamente menores no grupo de tratamento. São preditos resultados similares com o direccionamento de um conjugado bioactivo que contém um radionuclideo, como é descrito no presente documento.

Os conjugados de polipéptido bioactivo ou anticorpo descritos no presente documento podem ser administrados por via intravenosa, intra-arterial ou intraductal, ou podem ser introduzidos localmente no local de acção desejado.

Além disso, a inflamação é uma resposta protectora por um organismo para esquivar um agente invasor. A inflamação é um evento em cascata que implica muitos mediadores celulares e humorais. Por um lado, a supressão das respostas inflamatórias pode deixar a um hospedeiro imunocomprometido; no entanto, se for desejado sem comprovar, a inflamação pode ocasionar complicações graves incluindo doenças inflamatórias crónicas (por exemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, doença inflamatória do intestino e similares), choque séptico e falência multiorgánica. De forma importante, estas diversas patologias partilham mediadores inflamatórios comuns. As doenças colectivas que se caracterizam por inflamação têm um grande impacto sobre a morbidade e mortalidade humana. Portanto, está claro que os polipéptidos de ligação e anticorpos anti-inflamatórios, tais como os polipéptidos de ligação e anticorpos anti-zcytorl71ig descritos no presente documento, poderiam ter um potencial terapêutico crucial para um amplo número de doenças humanas e animais, desde asma e alergia até autoimunidade e choque séptico. Como tal, a utilização de anticorpos anti-zcytorl71ig anti-inf lamatórios e polipéptidos de ligação descritos no presente documento podem ser utilizados terapeuticamente como antagonistas de zcytorl71ig descritos no presente 87 documento, particularmente em doenças tais como artrite, endotoxemia, doença inflamatória do intestino, psoriase, doenças relacionadas e similares. 1. Artrite A artrite, incluindo a osteoartrite, artrite reumatóide, articulações artríticas como resultado de uma lesão e similares, são afecções inflamatórias comuns que se beneficiariam da utilização terapêutica de anticorpos anti-inflamatórios e polipéptidos de ligação, tais como anticorpos anti-zcytorl71ig e polipéptidos de ligação da presente invenção. Por exemplo, a artrite reumatóide (AR) é uma doença sistémica que afecta ao corpo inteiro e é uma das formas mais comuns de artrite. Caracteriza-se pela inflamação da membrana que reviste a articulação, que produz dor, rigidez, calor, vermelhidão e inflamação. As células inflamatórias libertam enzimas que podem digerir o osso e a cartilagem. Como resultado da artrite reumatóide, o revestimento da articulação inflamada, o sinóvio, pode invadir e danificar o osso e a cartilagem ocasionando um deterioramento da articulação e dor severa entre outros efeitos fisiológicos. A articulação envolvida pode perder a sua forma e alinhamento, tendo como resultado dor e perda de movimento. A artrite reumatóide (AR) é uma doença imune particularmente caracterizada por inflamação e posterior lesão tissular que leva a uma incapacitação severa e a um aumento da mortalidade. Nas articulações reumatóides são produzidas localmente uma variedade de citocinas. Numerosos estudos demostraram que a IL-1 e o TNF-alfa, duas citocinas pró-inflamatórias prototípicas, desempenham um papel importante nos mecanismos envolvidos na inflamação sinovial e na destruição progressiva da articulação. De facto, a administração de inibidores de TNF-alfa e IL-1 em pacientes com AR tem levado a uma melhora espectacular dos sinais clínicos e biológicos de inflamação e a uma redução dos 88 sinais radiológicos de erosão de osso e destruição de cartilagem. No entanto, apesar destes resultados alentadores, uma percentagem significativa dos pacientes não respondem a estes agentes, o que sugere que na fisiopatologia da artrite também estão envolvidos outros mediadores (Gabay, Expert. Opin. Biol. Ther. 2(2): 135-149, 2002). Um destes mediadores poderia ser zcytorl71ig, e portanto, uma molécula que se liga ou iniba zcytorl71ig, tal como anticorpos ou parceiros de ligação a zcytorl71ig, poderia servir como um agente terapêutico valioso para reduzir a inflamação na artrite reumatóide e outras doenças artríticas.

Existem vários modelos animais para a artrite reumatóide conhecidos na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por colagénio (AIC), os ratinhos desenvolvem artrite inflamatória crónica que se parece muito à artrite reumatóide humana. Como a AIC partilha características imunológicas e patológicas similares com a AR, isto faz com que seja um modelo ideal para seleccionar compostos potenciais anti-inflamatórios humanos. O modelo de AIC é um modelo bem conhecido em ratinhos que depende tanto da resposta imune como da resposta inflamatória, para ser produzido. A resposta imune compreende a interacção de linfócitos B e linfócitos T CD4+ em resposta ao colagénio, que se proporciona como antigénio, e conduz à produção de anticorpos anti-colagénio. A fase inflamatória é o resultado das respostas tissulares de mediadores da inflamação, como consequência da reacção cruzada de alguns destes anticorpos com o colagénio nativo do ratinho e a activação da cascata do complemento. Uma vantagem da utilização do modelo de AIC é que são conhecidos os mecanismos básicos da patogénese. Identificaram-se os epítopos relevantes dos linfócitos T e os linfócitos B no colagénio de tipo II, e determinaram-se diversos parâmetros imunológicos (por exemplo, hipersensibilidade de tipo 89 retardado e anticorpo anti-colagénio) e inflamatórios, (por exemplo citocinas, quimiocinas e enzimas de degradação da matriz) relacionados com a artrite mediada pelo sistema imune, e portanto podem utilizar-se para avaliar a eficácia do composto de ensaio no modelo de AIC (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sei. 61:1861-78, 1997; e Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995). A administração de polipéptidos que compreendem zcytorl7 solúvel (incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos descritos no presente documento), tais como zcytorl7-Fc4 ou outras proteínas de fusão e solúveis de zcytorl7 a estes ratinhos do modelo AIC foram utilizados para avaliar a utilização de zcytorl7 para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença. Como molécula que modula a resposta imune e inflamatória, zcytorl71ig pode induzir a produção de SAA, que está envolvido na patogénese da artrite reumatóide, os antagonistas de zcytorl71ig podem reduzir a actividade de SAA in vitro e in vivo, a administração sistémica ou local de antagonistas de zcytorl71ig tais como anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação, polipéptidos que compreendem zcytorl7 (incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos descritos no presente documento), tais como zcytorl7-Fc4 ou outras proteínas solúveis e de fusão de zcytorl7 podem suprimir potencialmente a resposta inflamatória da AR. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares. 2. Endotoxemia A endotoxemia é uma afecção grave que é produzida comummente por agentes infecciosos tais como bactérias e outros agentes de doenças infecciosas, septicemia, síndrome de choque tóxico ou em pacientes imunocomprometidos 90 submetidos a infecções oportunistas, e similares. A administração de anticorpos anti-inflamatórios e polipéptidos de ligação terapeuticamente úteis, tais como anticorpos anti-zcytor171ig e polipéptidos de ligação da presente invenção, poderia ajudar a prevenir e tratar a endotoxemia em seres humanos e animais. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou os anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares, poderiam servir como um agente terapêutico valioso para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos da endotoxemia. A endotoxemia induzida por lipopolissacárido (LPS) incorpora muitos dos mediadores pró-inflamatórios que produzem efeitos patológicos nas doenças infecciosas e a endotoxemia induzida por LPS em roedores é um modelo amplamente utilizado e aceitável para estudar os efeitos farmacológicos de possíveis agentes pró-inflamatórios ou imunomoduladores. O LPS produzido em bactérias gram negativas, é um importante agente causante da patogénese do choque séptico (Glausner et al. , Lancet 338:732, 1991). De facto, pode induzir-se experimentalmente um estado similar ao choque por uma única injecção de LPS em animais. As moléculas produzidas por células que respondem a LPS podem dirigir-se a patogénios directamente ou indirectamente. Embora estas respostas biológicas protejam o hospedeiro contra os patogénios invasores, também podem produzir danos. Desta maneira, uma estimulação massiva da imunidade inata, que se produz como resultado de uma infecção bacteriana gram negativa severa, conduz a um excesso de produção de citocinas e outras moléculas, e ao desenvolvimento de um síndrome fatal, síndrome de choque séptico, que se caracteriza por febre, hipotensão, coagulação intravascular disseminada e falência multiorgánica (Durnitru et al. Cell 103: 1071-1083,2000). 91

Estes efeitos tóxicos do LPS estão relacionados principalmente com a activação de macrófagos que leva à libertação de múltiplos mediadores inflamatórios. Entre estes mediadores, o TNF parece desempenhar um papel crucial, como é indicado pela prevenção da toxicidade do LPS por meio da administração de anticorpos neutralizadores anti-TNF (Beutler et ai., Science 229:869, 1985). Está bem estabelecido que a injecção de 1 μg de LPS de E. coli num ratinho C57B1/6 dará como resultado um aumento significativo dos níveis circulantes de IL-6, TNF-alfa, IL-1 e proteínas de fase aguda (por exemplo, SAA) aproximadamente 2 horas depois da injecção. A toxicidade do LPS parece estar mediada por estas citocinas uma vez que a imunização passiva contra estes mediadores pode produzir uma redução da mortalidade (Beutler et ai., Science 229:869, 1985). As estratégias de imunintervenção potenciais para a prevenção e/ou tratamento do choque séptico incluem mAb anti-TNF, antagonista do receptor de IL-1, LIF, IL-10 e G-CSF. Como o LPS induz a produção de factores pró-inflamatórios que possivelmente contribuem à patologia da endotoxemia, a neutralização da actividade de zcytorl71ig, SAA ou outros factores pró-inflamatórios antagonizando o polipéptido zcytorl71ig pode ser utilizado para reduzir os sintomas da endotoxemia, tais como os observados no choque endotóxico. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares.

3. Doença Inflamatória do Intestino. DII

Nos Estados Unidos, aproximadamente 500.000 personas sofrem de Doença Inflamatória do Intestino (DII) que pode afectar ao cólon e ao recto (colite ulcerosa) ou tanto ao intestino delgado como ao intestino grosso (doença de Crohn). A patogénese destas doenças está pouco clara, mas 92 envolvem uma inflamação crónica dos tecidos afectados. Os agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis, ou os anticorpos anti-zcytor171ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares, poderiam servir como agentes terapêuticos valiosos para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos da DII e doenças relacionadas. A colite ulcerosa (CU) é uma doença inflamatória do intestino grosso, denominado comummente cólon, caracterizada por inflamação e ulceração da mucosa ou o revestimento mais interno do cólon. Esta inflamação faz com que o cólon se esvazie com frequência, tendo como resultado diarreia. Os sintomas incluem evacuações soltas e cãibras abdominais associadas, febre e perda de peso. Embora não seja conhecida a causa exacta da CU, as investigações recentes sugerem que as defesas naturais do corpo estão a actuar contra proteínas do corpo que o corpo considera estranhas (uma "reacção autoimune"). Talvez porque se pareçam a proteínas bacterianas do intestino, estas proteínas podem induzir ou estimular o processo inflamatório que começa a destruir o revestimento do cólon. Quando se destrói o revestimento do cólon, as úlceras libertam muco, pus e sangue. A doença normalmente começa na área rectal e finalmente pode estender-se ao longo de todo o intestino grosso. Os episódios repetidos de inflamação levam a um espessamento da parede do intestino e recto com tecido cicatrizado. Pode ser produzida a morte do tecido do cólon ou sepsia com a doença severa. Os sintomas de colite ulcerosa podem variar em gravidade e o seu princípio pode ser gradual ou súbito. Os ataques podem ser provocados por muitos factores, incluindo infecções respiratórias ou estres.

Embora actualmente não haja cura disponível para a CU, os tratamentos centram-se em suprimir o processo 93 inflamatório anormal no revestimento do cólon. Dispõe-se de tratamentos que incluem corticosteróides imunosupressores (por exemplo azatioprina, mercaptopurina e metotrexato) e aminosalicilatos para tratar a doença. No entanto, a utilização a longo prazo de imunosupressores tais como corticosteróides e azatioprina pode produzir efeitos secundários graves incluindo um adelgaçamento dos ossos, cataratas, infecção e efeitos no fígado e a medula óssea. Nos pacientes em que as terapêuticas actuais não são satisfatórias, uma opção é a cirurgia. A cirurgia implica a eliminação do cólon inteiro e do recto.

Existem vários modelos animais que podem imitar parcialmente a colite ulcerosa crónica. 0 modelo utilizado mais amplamente é o modelo de colite induzida por ácido 2,4,β-trinitrobensulfínico/etanol (TNBS), que induz a inflamação crónica e a ulceração no cólon. Quando introduz-se TNBS no cólon de ratinhos susceptiveis por instilação intrarectal, induz uma resposta imune mediada por linfócitos T na mucosa colónica, levando neste caso a uma inflamação massiva da mucosa caracterizada por infiltração densa de linfócitos T e macrófagos através de toda a parede do intestino grosso. Além disso, este quadro histopatológico é acompanhado pelo quadro clínico de perda de peso progressiva (desgaste), diarreia sanguinolenta, prolapso rectal e um espessamento da parede do intestino grosso (Neurath et al. Intern. Rev. Immunol. 19:51-62,2000) .

Outro modelo de colite utiliza dextrano sulfato de sódio (DSS), que induz uma colite aguda manifestada por diarreia sanguinolenta, perda de peso, encurtamento do cólon e ulceração da mucosa com infiltração de neutrófilos. A colite induzida por DSS caracteriza-se histologicamente por infiltração de células inflamatórias na lâmina própria com hiperplasia linfóide, lesões nas criptas focais e ulceração epitelial. Acredita-se que estas mudanças se 94 desenvolvam devido a um efeito tóxico do DSS sobre o epitélio e por fagocitose das células da lâmina própria e a produção de TNF-alfa e IFN-gama. Apesar de utilização comum, continuam sem resolver vários assuntos relacionados com os mecanismos do DSS sobre a relevância nas doenças humanas. 0 DSS é considerado um modelo independente de linfócitos T porque se observa em animais deficientes em linfócitos T tais como ratinhos SCID. A administração de anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação, polipéptidos que compreendem zcytorl7 solúvel (incluindo receptores heterodiméricos e multiméricos) tais como zcytorl7-Fc4 ou outras proteínas de fusão e solúveis de zcytorl7 a estes modelos de TNBS ou DSS pode utilizar-se para avaliar a utilização de antagonistas de zcytorl71ig para melhorar os sintomas e alterar o curso da doença gastrointestinal. 0 zcytorl71ig pode desempenhar um papel na resposta inflamatória em colite, e a neutralização da actividade de zcytorl71ig por meio da administração de antagonistas de zcytorl71ig é uma possível abordagem terapêutica para a DII. Outros agentes terapêuticos potenciais incluem polipéptidos zcytorl7, polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis ou anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares. 4. Psoríase A psoríase é uma afecção cutânea crónica que afecta a mais de sete milhões de americanos. A psoríase ocorre quando novas células cutâneas crescem de forma anormal tendo como resultado emplastros inflamados, inchados e escamosos de pele em que a pele velha não se desprende o suficientemente rápido. A psoríase em placas, a forma mais comum, caracteriza-se por emplastros inflamados de pele ("lesões") cobertos com escamas brancas prateadas. A psoríase pode ser limitada a umas poucas placas ou implicar áreas moderadas a extensas da pele, aparecendo a maioria 95 das vezes sobre o couro cabeludo, joelhos, cotovelos e tronco. Embora seja muito visível, a psoríase não é uma doença contagiosa. A patogénese da doença implica inflamação crónica dos tecidos afectados. Os polipéptidos zcytorl7, os polipéptidos receptores heterodiméricos e multiméricos solúveis ou os anticorpos anti-zcytorl71ig ou parceiros de ligação da presente invenção, e similares, poderiam servir como agentes terapêuticos valiosos para reduzir a inflamação e os efeitos patológicos na psoríase, outras doenças cutâneas inflamatórias, alergias da pele e a mucosa, e doenças relacionadas. A psoríase é um distúrbio inflamatório mediado por linfócitos T da pele que pode produzir desconfortos consideráveis. É uma doença para a qual não existe cura e afecta a personas de todas as idades. A psoríase afecta aproximadamente a dois por cento da população de Europa e Norte América. Embora os indivíduos com psoríase leve com frequência possam controlar sua doença com agentes tópicos, mais de um milhão de pacientes em todo o mundo requerem uma terapêutica imunosupressora ultravioleta ou sistémica. Infelizmente, a inconveniência e riscos da radiação ultravioleta e as toxicidades de muitas terapêuticas limitam a sua utilização a longo prazo. Além disso, os pacientes normalmente têm recorrência de psoríase, e em alguns casos um rebote, pouco depois de interromper a terapêutica imunosupressora. A diferenciação é um processo progressivo e dinâmico, que começa com as células estaminais pluripotentes e termina com as células diferenciadas terminalmente. As células estaminais pluripotentes que podem ser regeneradas sem o comprometimento de uma linhagem expressam uma série de marcadores de diferenciação que se perdem quando é feito o comprometimento de uma linhagem celular. As células progenitoras expressam uma série de marcadores de diferenciação que podem ou não continuar a se expressar de 96 acordo com progresso das células à via da linhagem celular em direcção à maduração. Os marcadores de diferenciação que se expressam exclusivamente pelas células maduras normalmente são propriedades funcionais tais como produtos celulares, enzimas para produzir produtos celulares e receptores. 0 estágio de diferenciação de uma população celular é monitorizado pela identificação de marcadores presentes na população celular.

Existem indícios que sugerem que factores que estimulam tipos celulares específicos de uma via para a diferenciação ou desdiferenciação terminal afetam à população celular inteira que procede de um precursor ou célula estaminal comum. Desta maneira, a presente invenção inclui a estimulação ou inibição da proliferação de células linfóides, células hematopoiéticas e células epiteliais. 0 zcytorl71ig foi isolado a partir de um tecido que se sabe que tem uma função imunológica importante e que contém células que intervém no sistema imune. 0 zcytorl71ig é expresso em células de sangue periférico activadas, seleccionadas por CDS3+ e mostra-se que a expressão de zcytorl71ig aumenta depois da activação de linfócitos T. Além disso, os resultados de experiências descritas na secção de Exemplos do presente documento sugere que os polipéptidos da presente invenção podem ter um efeito sobre o crescimento/expansão de monócitos/macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, células NK e/ou o estado diferenciado de monócitos/macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, células NK ou os progenitores destas células. Geralmente conhecem-se factores que estimulam a proliferação de progenitores hematopoiéticos e activam as células maduras, no entanto, a proliferação e activação também pode requerer factores de crescimento adicionais. Por exemplo, mostra-se que se requeriam IL-7 e o Factor de Steel (ligando de c-kit) para a formação de colónias de progenitores de NK. A IL-15 + IL-2 em combinação com IL-7 e Factor de Steel era mais eficaz 97 (Mr6zek et al., Blood 87:2632-2640, 1996). No entanto, podem ser necessárias citocinas não identificadas para a proliferação de uma subsérie especifica de células NK e/ou progenitores de NK (Robertson et al., Blood 76:2451-2438, 1990). De forma similar, zcytorl71ig pode actuar em separado ou em coordenação ou sinergia com outras citocinas para aumentar o crescimento, proliferação, expansão e modificação da diferenciação de monócitos/macrófagos, linfócitos T, linfócitos B ou células NK.

Os ensaios que medem a diferenciação incluem, por exemplo, a medição de marcadores celulares associados à expressão específica de etapa de um tecido, actividade enzimática, actividade funcional ou mudanças morfológicas (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; todos incorporados no presente documento por referência). Como alternativa, o próprio polipéptido zcytorl71ig pode servir como um marcador secretado ou da superfície celular adicional associado à expressão específica de etapa de um tecido. Como tal, a medição directa do polipéptido zcytorl71ig ou a sua perda de expressão num tecido à medida que se diferencia, pode servir como marcador de diferenciação de tecidos.

De forma similar, a medição directa do polipéptido zcytorl71ig, ou sua perda de expressão num tecido pode ser determinada num tecido ou em células à medida que passam por progressão tumoral. Os aumentos na invasividade e motilidade das células, ou o aumento ou perda de expressão de zcytorl71ig num estado pré-canceroso ou canceroso, em comparação com o tecido normal, podem servir como diagnóstico para a transformação, invasão e metástase na progressão tumoral. Como tal, o conhecimento do estado de progressão ou metástase de um tumor ajudará ao médico a escolher a terapêutica mais apropriada, ou a agressividade do tratamento, para um paciente com um dado cancro 98 individual. Os métodos para medir o aumento e perda de expressão (de um ARNm ou proteína) são bem conhecidos na técnica e descrevem-se no presente documento e podem aplicar-se à expressão de zcytorl71ig. Por exemplo, o aparecimento ou desaparecimento de polipéptidos que regulam a motilidade celular pode ser utilizado para auxiliar o diagnóstico e pronóstico do cancro de próstata (Banyard, J. e Zetter, B.R., Câncer and Metast. Rev. 17:449-458, 1999). Como um efector da motilidade celular, o aumento ou perda de expressão de zcytorl71ig pode servir como diagnóstico para o cancro linfóide, de linfócitos B, epitelial, células hematopoiéticas e outros cancros.

Além disso, a actividade e o efeito de zcytorl71ig sobre a expressão tumoral e a metástase podem ser medidos in vivo. Criaram-se vários modelos de ratinho singénico para estudar a influência de polipéptidos, compostos ou outros tratamentos sobre a progressão tumoral. Nestes modelos, implantam-se células tumorais submetidas a passadas em cultura em ratinhos da mesma estirpe que o dador do tumor. As células desenvolverão tumores com características similares nos ratinhos receptores, e também será produzida a metástase em alguns dos modelos. Os modelos tumorais apropriados para os estudos dos presentes inventores incluem o carcinoma de pulmão de Lewis (ATCC N° CRL-1642) e o Melanoma B16 (ATCC N° CRL-6323), entre outros. Estes são duas linhas tumorais utilizadas comummente, singénicas para o ratinho C57BL6/J, que são cultivadas e manipuladas facilmente in vitro. Os tumores resultantes da implantação de quaisquer destas linhas celulares podem produzir metástase no pulmão em ratinhos C57BL6/J. 0 modelo de carcinoma de pulmão de Lewis foi utilizado recentemente em ratinhos para identificar um inibidor da angiogénese (0'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328, 1994) . Tratam-se ratinhos C57BL6/J com um agente experimental por meio de uma injecção diária de proteína 99 recombinante, agonista ou antagonista ou uma injecção diária de adenovirus recombinante. Três dias depois deste tratamento, implantam-se de 105 a 106 células embaixo da pele dorsal. Como alternativa, as próprias células podem ser infectadas com adenovirus recombinante, tal como um que expresse zcytorl71ig, antes da implantação de forma que a proteína seja sintetizada no local do tumor ou intracelularmente, ao invés de sistemicamente. Os ratinhos normalmente desenvolvem tumores visíveis em 5 dias. Os tumores são deixados a crescer durante um período de até 3 semanas, durante o qual podem alcançar um tamanho de 1500 -1800 m3 no grupo tratado de controlo. O tamanho do tumor e o peso corporal são monitorizados cuidadosamente ao longo de toda a experiência. No momento do sacrifício, retira-se o tumor e pesa-se junto com os pulmões e o fígado. Mostra-se que o peso do pulmão se correlaciona bem com a carga tumoral metastática. Como medida adicional, contam-se as metástases da superfície do pulmão. O tumor ressecado, os pulmões e o fígado são preparados para o exame histopatológico, imunohistoquímica e hibridação in situ, utilizando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento. A influência do polipéptido expresso em questão, por exemplo, zcytorl71ig, sobre a capacidade do tumor de adquirir o sistema vascular e passar por metástase pode ensaiar-se desta maneira. Além disso, aparte de utilizar adenovirus, as células implantadas podem ser transfectadas de forma transitória com zcytorl71ig. A utilização de transfectantes de zcytorl71ig estáveis assim como a utilização de promotores induzíveis para activar a expressão de zcytorl71ig in vivo são conhecidas na técnica e podem utilizar-se neste sistema para avaliar a indução de metástase por zcytorl71ig. Além disso, pode injectar-se directamente zcytorl71ig purificado ou meio acondicionado de zcytorl71ig neste modelo de ratinho, e portanto utilizar-se neste sistema. Como referência geral, veja-se 100 0'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328, 1994; e Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastase 14:349-361,1995. O zcytorl71ig ou os anticorpos contra o mesmo serão úteis para tratar a tumorogénese, e portanto seriam úteis no tratamento de cancros. O zcytorl71ig é expresso em linfócitos T activados, monócitos e macrófagos, e está associado a uma região de cromossoma humano em que são comuns as translocações em leucemias. Além disso, mostra-se que zcytorl71ig actua por meio de um receptor de citocinas, zcytorl7, que também é expresso em linfócitos T activados, monócitos e macrófagos. Durante a estimulação de linfócitos T activados, monócitos e macrófagos por zcytorl71ig se poderia produzir um estado patológico humano tal como, por exemplo, um cancro de células imunes ou outros cancros. Como tal, a identificação da expressão de zcytorl71ig, polipéptidos (por exemplo, por anticorpos anti-zcytorl71ig, receptores solúveis zcytorl7 (por exemplo, receptor de zcytorl7, heterodimeros (por exemplo, zcytorl7/OSMRbeta, zcytorl7/WSX-l), multimeros (por exemplo, zcytorl7/OSMRbeta/WSX-l)), ou outros parceiros de ligação de zcytorl71ig) pode servir como diagnóstico e pode servir como antagonistas da actividade proliferativa de zcytorl71ig. O ligando poderia ser administrados em combinação com outros agentes que já são utilizados, incluindo agentes quimioterapêuticos convencionais assim como moduladores imunes tais como interferão alfa. Mostra-se que os interferões alfa/beta são eficazes para tratar algumas leucemias e modelos de doenças animais, e os efeitos inibidores do crescimento do interferão alfa e zcytorl71ig podem ser aditivos.

Acredita-se que as células NK desempenham um papel importante na eliminação de células tumorais metastáticas e os pacientes com metástase e tumores sólidos tiveram níveis reduzidos de actividade de células NK (Whiteside et al., 101

Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230:221-244, 1998). Um agente que estimula as células NK seria útil na eliminação de tumores. A presente memória descritiva descreve a redução da proliferação de monócitos/macrófagos neoplásicos que compreendem administrar a um mamífero com um neoplasma de monócitos/macrófagos uma quantidade de uma composição de zcytorl71ig ou anti-zcytorl71ig suficiente para reduzir a proliferação dos monócitos/macrófagos neoplásicos. Em outras formas de realização, a composição pode compreender pelo menos outra citocina. Pode seleccionar-se uma segunda citocina do grupo que consiste em IL-2, IL-3, IL-12, IL-21, IL-22, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando de Flt3 ou um factor de célula estaminal. A presente memória descritiva descreve a inibição da activação ou diferenciação de monócitos/macrófagos. Os monócitos são células diferenciadas incompletamente que migram a diversos tecidos em que maduram e se convertem em macrófagos. Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta imune ao apresentar o antigénio aos linfócitos e desempenham um papel de apoio como células auxiliares aos linfócitos ao secretar numerosas citocinas. Os macrófagos podem internalizar moléculas extracelulares e após a activação têm uma maior capacidade de destruir microrganismos intracelulares e células tumorais. Os macrófagos activados também estão envolvidos na estimulação da inflamação aguda ou local.

Em outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a redução da proliferação de linfócitos B ou T neoplásicos que compreende administrar a um mamífero com um neoplasma de linfócitos B ou T uma quantidade de uma composição de antagonista de zcytorl71ig suficiente para reduzir a proliferação dos monócitos/macrófagos neoplásicos. Em outras formas de realização, a composição pode compreender pelo menos outra citocina, podendo 102 seleccionar-se a citocina do grupo que consiste em IL-12, IL-21, IL-22, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando de Flt3 ou factor de célula estaminal. Além disso, o antagonista de zcytorl71ig pode ser uma proteína de fusão de ligando/toxina.

Pode utilizar-se uma toxina de fusão de zcytorl71ig-saporina contra uma série similar de leucemias e linfomas, ampliando a série de leucemias que pode ser tratada com zcytorl71ig. Por exemplo, ditas leucemias podem ser aquelas que sobre-expressam receptores zcytorl7 (por exemplo, receptor de zcytorl7, heterodímeros (por exemplo zcytorl7/OSMRbeta, zcytorl7/WSX-l) , multímeros (por exemplo zcytorl7/OSMPbeta/WSX)). A activação mediada por toxinas de fusão do receptor de zcytorl7, heterodímeros ou multímeros do receptor de zcytorl7 (por exemplo, zcytorl9/OSMRbeta, zcytorl7/WSX-l ou zcytorl9/WSX-l/OSMR) proporciona dois meios independentes para inibir o crescimento das células alvo, sendo o primeiro idêntico aos efeitos observados pelo ligando somente, e sendo o segundo devido à libertação da toxina por meio da internalização do receptor. O padrão de expressão restringido a linfóides e monócitos do receptor de zcytorl7 sugere que o conjugado de ligando-saporina pode ser tolerado pelos pacientes.

Quando o tratamento de malignidades inclui transplante de células estaminais ou medula óssea alogénica, zcytorl71ig pode ser valioso para aumentar o efeito de enxerto contra o tumor. O zcytorl71ig pode estimular a geração de células NK líticas a partir de progenitores de medula e pode estimular a proliferação de monócitos e macrófagos depois da activação dos receptores de antigénio. Portanto, quando os pacientes recebem transplantes de medula alogénicos, zcytorl71ig aumentará a geração de respostas anti-tumorais, com ou sem a infusão de linfócitos do dador. 103 A distribuição tissular de receptores para dada uma citocina oferece uma forte indicação dos locais potenciais de acção dessa citocina. Observou-se a expressão de zcytorl71ig em monócitos e linfócitos B, com um aumento espectacular da expressão após a activação para linfócitos T CD3+, CD4+ e CD8+. Além disso, dois linhas celulares monocíticas, THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Câncer 26:171-176, 1980) e U937 (Sundstrom et al., Int. J. Câncer 17:565-577, 1976) também foram positivas para a expressão de zcytorl7. A análise de Northern do receptor WSX-1 revelou transcritos em todos os tecidos examinados, com maiores níveis de expressão em baço, timo, gânglio linfático, medula óssea e leucócitos de sangue periférico humanos. Além disso, os níveis de expressão de WSX-1 aumentaram após a activação de linfócitos T.

Relatou-se que a expressão de OSMR é muito ampla (Mosley e col, JBC 271:32635-32643, 1996). Esta distribuição de receptores zcytorl7, WSX-1 e OSM confirma um papel para zcytorl71ig em respostas imunes, especialmente a expansão de linfócitos T após a activação ou um papel no braço de monócitos/macrófagos do sistema imune.

Desta maneira, a presente memória descritiva descreve a utilização de zcytorl7/WSX-l/OSMR solúvel, e heterodímeros de zcytorl7/OSMR como antagonistas em doenças ou afecções inflamatórias e imunes tais como pancreatite, diabetes de tipo I (IDDM), cancro pancreático, pancreatite, doença de Graves, doença inflamatória do intestino (IEE), doença de Crohn, cancro de cólon e intestinal, diverticulose, doença autoimune, sepsia, transplante de órgãos ou de medula óssea; inflamação devido a traumatismo, cirurgia ou infecção; amiloidose; esplenomegalia; doença de enxerto contra hospedeiro; e quando a inibição da inflamação, supressão imune, redução da proliferação de 104 células hematopoiéticas, imunes, inflamatórias ou linfóides, macrófagos, linfócitos T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+), supressão de resposta imune a um patogénio ou antigénio. Além disso, a presença de expressão de zcytorl7 em células imunes activadas tais como células CD4+ e CD19+ activadas mostrou que o receptor de zcytorl7 pode estar envolvido em reacções defensivas imunes corporais contra invasores estranhos tais como microrganismos e detritos celulares, e poderia desempenhar um papel em respostas imunes durante a inflamação e a formação de cancros. Como tais, os anticorpos da presente invenção que são agonistas ou antagonistas para a função do receptor de zcytorl7, tais como zcytorl71ig, podem ser de utilidade para modificar respostas imunes e inflamação, como é definido nas reivindicações. A estrutura e a expressão tissular de zcytorl71ig sugerem um papel no desenvolvimento hematopoiético ou de timócitos precoce e na regulação da resposta imune ou inflamação. Estes processos envolvem a estimulação da proliferação celular e a diferenciação em resposta à ligação de uma ou mais citocinas aos seus receptores cognatos. Em vista da distribuição tissular observada para este zcytorl71ig, os agonistas (incluindo o receptor ou receptores naturais) e os antagonistas têm um enorme potencial em aplicações tanto in vitro como in vivo. Os compostos identificados como agonistas de zcytorl71ig são úteis para estimular a proliferação e o desenvolvimento de células alvo in vitro e in vivo. Por exemplo, os compostos agonistas, zcytorl71ig, ou anticorpos anti- zcytorl71ig são úteis como componentes de um meio de cultura celular definido, e podem utilizar-se em separado ou em combinação com outras citocinas e hormonas para substituir o soro que é utilizado comummente nas culturas celulares. Desta maneira, os agonistas são úteis para promover especificamente o crescimento e/ou desenvolvimento ou 105 activação de monócitos, linfócitos T, linfócitos B e outras células dos linhagens linfóide e mielóide, e células hematopoiéticas em cultura. O zcytorl71ig pode ser útil para estimular a imunidade mediada por células e para estimular a proliferação de linfócitos, tal como no tratamento de infecções que envolvem imunossupressão, incluindo certas infecções virais. Outras utilizações incluem a supressão tumoral, em que transformação maligna tem como resultado células tumorais que são antigénicas. O zcytorl71ig poderia utilizar-se para induzir citotoxicidade, que pode estar mediada pela activação de células efectoras tais como linfócitos T, células NK (citoliticas naturais) ou células LAK (destruidoras activadas por linfóide), ou induzir-se directamente por meio de vias apoptóticas. O zcytorl71ig também pode ser útil para tratar leucopenias aumentando os níveis do tipo celular afectado, e para aumentar a regeneração do repertório de linfócitos T depois do transplante de medula óssea; ou para aumentar a proliferação ou activação de monócitos, e para diagnóstico e outras utilizações descritas no presente documento. O zcytorl71ig pude encontrar utilidade na supressão do sistema imune, tal como no tratamento de doenças autoimunes, incluindo artrite reumatóide, esclerose múltipla, diabetes mellitus, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, etc. A supressão imune pode ser utilizada também para reduzir a rejeição de transplante e enxertos de tecidos ou órgãos e para tratar leucemias ou linfomas específicos de linfócitos T, linfócitos B ou monócitos, e outros cancros, por meio da inibição da proliferação do tipo celular afectado. Além disso, o zcytorl71ig pode ser utilizado para detectar monócitos, macrófagos e linfócitos T activados e ajudar no diagnóstico de dita doença autoimune, particularmente em patologias nas quais estão elevados ou activados os monócitos. 106

Os polipéptidos, péptidos, anticorpos de zcytorl71ig e similares podem ser utilizados também dentro de sistemas de diagnóstico para a detecção de niveis circulantes de zcytorl71ig. Dentro de uma forma de realização relacionada, podem utilizar-se anticorpos ou outros agentes que se ligam especificamente a polipéptidos zcytorl71ig para detectar polipéptidos zcytorl71ig circulantes. A elevação ou redução dos niveis de polipéptidos de ligando pode ser indicativa de estados patológicos, incluindo cancro. Os polipéptidos zcytorl71ig podem contribuir a processos patológicos e podem ser um marcador indirecto de uma doença subjacente.

Além disso, o zcytorl71ig pode ser utilizado para detectar ou fixar como alvo o seu receptor ou receptores em certos estados patológicos. Por exemplo, os niveis elevados de receptor de IL-2 solúvel em soro humano foram associados a uma ampla variedade de afecções inflamatórias e neoplásicas, tais como enfarto de miocárdio, asma, miastenia grave, artrite reumatóide, leucemia aguda de linfócitos T, linfomas de linfócitos B, leucemia linfocitica crónica, cancro de cólon, cancro de mama e cancro de ovário (Heaney et al., Blood 87:847-857, 1996). De forma similar, o receptor de zcytorl7 está elevado em monócitos activados e, portanto, o receptor de zcytorl7 e/ou seus receptores solúveis podem estar associados ou servir como um marcador de afecções inflamatórias e neoplásicas associadas ao mesmo. O zcytorl71ig, incluindo os conjugados citotóxicos, portanto pode ser utilizado para detectar ou fixar como alvos ditos tecidos, e estados patológicos.

As moléculas descritas no presente documento têm utilidade particular no braço de monócitos/macrófagos do sistema imune. Conhecem-se métodos que podem avaliar dita actividade. Por exemplo, o interferão gama (IFNy) é um potente activador de fagócitos mononucleares. Por exemplo, um aumento na expressão de zcytorl7 após a activação de 107 células THP-1 (N° do ATCC TIB-202) com interferão gama poderia sugerir que este receptor está envolvido na activação de monócitos. Os monócitos são células incompletamente diferenciadas que migram a diversos tecidos em que maduram e se convertem em macrófagos. Os macrófagos desempenham um papel fundamental na resposta imune ao apresentar o antigénio aos linfócitos e desempenham um papel de apoio como células auxiliares aos linfócitos ao secretar numerosas citocinas. Os macrófagos podem internalizar moléculas extracelulares e após a activação têm uma maior capacidade de destruir microrganismos intracelulares e células tumorais. Os macrófagos activados também estão envolvidos na estimulação da inflamação aguda ou local. Além disso, mostra-se que a função de monócitos-macrófagos é anormal numa variedade de estados patológicos. Por exemplo, veja-se Johnston, RB, New Eng. J. Med. 318:747-752, 1998.

Um perito na especialidade reconhecerá que são úteis os agonistas do receptor de zcytorl7, tais como zcytorl71ig. Por exemplo, relatou-se uma migração reduzida de monócitos em populações com uma predisposição a infecções, tais como bebés recém-nascidos, pacientes que recebem corticosteróides ou outra terapêutica imunosupressora, e pacientes com diabetes mellitus, queimaduras ou SIDA. Os agonistas para zcytorl7, tais como zcytorl71ig, poderiam produzir um aumento na capacidade dos monócitos de migrar e possivelmente prevenir a infecção nestas populações. Também existe um profundo defeito de destruição fagocítica pelos fagócitos mononucleares de pacientes com doença granulomatosa crónica. Isto tem como resultado a formação de abscessos subcutâneos, assim como abscessos no fígado, pulmões, baço e gânglios linfáticos. Um agonista do receptor de zcytorl7 tal como zcytorl71ig poderia corrigir ou melhorar este defeito fagocitico. Além disso, relatou-se uma citotoxicidade defeituosa de 108 monócitos em pacientes com cancro e síndrome de Wiskott-Aldrich (eczema, trombocitopenia e infecções recorrentes). A activação de monócitos por agonistas do receptor de zcytorl7 tais como zcytorl71ig poderia ajudar no tratamento destas afecções. O sistema de monócitos-macrófagos está envolvido de forma proeminente em várias doenças de armazenamento de lípidos (esfingolipidose) tais como a doença de Gaucher. A resistência à infecção pode ser afectada por um defeito na função dos macrófagos, que poderia tratar-se por agonistas do receptor de zcytorl7 tais como zcytorl71ig.

Além disso, um perito na especialidade reconhecerá que são úteis os antagonistas de zcytorl71ig. Por exemplo, em lesões ateroscleróticas, uma das primeiras anormalidades é a localização de monócitos/macrófagos em células endoteliais. Estas lesões poderiam ser prevenidas por meio da utilização de antagonistas de zcytorl71ig. Os anticorpos anti- zcytorl71ig (por exemplo, anticorpos neutralizadores de zcytorl71ig), receptores solúveis zcytorl7, heterodimeros e multimeros, e parceiros de ligação de zcytorl71ig também podem ser utilizados como antagonistas para o zcytorl71ig. Além disso, a leucemia monoblástica está associada a uma variedade de anormalidades clinicas que refletem a libertação dos produtos biológicos dos macrófagos, os exemplos incluem altos níveis de lisozima no soro e urina e febres elevadas. Além disso, ditas leucemias apresentam um aumento anormal de células monocíticas. Estes efeitos possivelmente poderiam ser prevenidos por antagonistas para zcytorl71ig, tais como os descritos no presente documento. Além disso, anti-zcytorl71ig pode ser conjugado com moléculas tais como resíduos tóxicos e citocinas, como é descrito no presente documento, para dirigir a destruição de células monocíticas de leucemia.

Utilizando métodos conhecidos na técnica e revelados no presente documento, um perito poderia avaliar facilmente 109 a actividade de agonistas e antagonistas de zcytorl71ig nos estados patológicos revelados no presente documento, inflamação, estados imunes (por exemplo autoimunes), cancro ou infecção assim como em outros estados patológicos que envolvem células monociticas. Além disso, como zcytorl71ig é expresso de uma maneira especifica de linfócitos T, macrófagos e monócitos, e estas doenças envolvem anormalidades em células monociticas, tais como proliferação, função, localização e activação celular, os polinucleótidos e polipéptidos descritos no presente documento, e os anticorpos da presente invenção, são úteis como diagnósticos para detectar ditas anormalidades de células monociticas, e indicar a presença de doença, como é definido nas reivindicações. Ditos métodos envolvem uma amostra biológica de um paciente, tal como sangue, saliva ou biopsia, e a comparação da mesma com uma amostra de controlo normal. Podem utilizar-se métodos histológicos, citológicos, citometria de fluxo, métodos bioquímicos e outros métodos para determinar os níveis relativos ou a localização de zcytorl71ig, ou células que expressam zcytorl71ig, isto é, monócitos, na amostra do paciente em comparação com o controlo normal. Uma mudança no nível (aumento ou redução) da expressão de zcytorl71ig, ou uma mudança no número de localização de monócitos (por exemplo, aumento ou infiltração de células monociticas em tecidos em que normalmente não estão presentes) em comparação com um controlo indicaria doença. Ditos métodos de diagnóstico também podem incluir a utilização de marcadores radiométricos, fluorescentes e colorimétricos associados aos polinucleótidos ou polipéptidos descritos no presente documento, ou a anticorpos da presente invenção. Ditos métodos são bem conhecidos na técnica e são revelados no presente documento.

Podem utilizar-se sequências de aminoácidos que têm actividade de zcytorl71ig para modular o sistema imune por 110 ligação ao receptor de zcytorl7, e portanto, prevenir a ligação de zcytorl71ig com o receptor de zcytorl71ig endógeno. Também podem ser utilizados antagonistas de zcytorl71ig, tais como anticorpos anti- zcytorl71ig para modular o sistema imune por inibição da ligação de zcytorl71ig com o receptor de zcytorl71ig endógeno. Por conseguinte, a presente memória descritiva descreve a utilização de proteínas, polipéptidos e péptidos que têm actividade de zcytorl71ig (tais como polipéptidos de zcytorl71ig, análogos de zcytorl71ig (por exemplo, anticorpos anti-idiotipo anti-zcytor171ig) e proteínas de fusão de zcytorl71ig) a um indivíduo que carece de uma quantidade adequada deste polipéptido, ou que produz um excesso de um ou mais receptores que compreendem zcytorl7. Também podem ser utilizados antagonistas de zcytorl7 (por exemplo, anticorpos anti-zcytorl7) para tratar a um indivíduo que produz um excesso de zcytorl71ig ou um ou mais receptores que compreende zcytorl7. Os indivíduos adequados incluem mamíferos, tais como seres humanos.

Mostra-se que zcytorl71ig é expresso em células mononucleares activadas, e pode estar envolvido na regulação da inflamação. Como tal, os polipéptidos descritos no presente documento podem ser ensaiados e utilizados por sua capacidade de modificar a inflamação ou podem ser utilizados como um marcador de inflamação. Na técnica conhecem-se métodos para determinar qualidades pró-inflamatórias e anti-inflamatórias de zcytorl71ig e analisam-se no presente documento. Além disso, pode estar envolvido na regulação positiva da produção de reagentes de fase aguda, tais como amilóide A de soro (SAA), al-antiquimotripsina e haptoglobina, e a expressão de ligando do receptor de zcytorl7 pode estar aumentada após a injecção de lipopolissacárido (LPS) in vivo que está envolvido na resposta inflamatória (Dumoutier, L. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei. 97:10144-10149, 2000). A produção 111 de proteínas de fase aguda, tais como SAA, é considerada um mecanismo de sobrevivência a curto prazo em que a inflamação é benéfica; no entanto, a manutenção de proteínas de fase aguda durante períodos mais prolongados contribui à inflamação crónica e pode ser prejudicial para a saúde humana. Como revisão, veja-se Uhlar, CM e Whitehead, AS, Eur. J. Biochem. 265:501-523, 1999, e Baumann H. e Gauldie, J. Immunology Today 15:74-80, 1994. Além disso, a proteína SAA de fase aguda está envolvida na patogénese de várias doenças inflamatórias crónicas, está envolvida na aterosclerose e artrite reumatóide, e é o precursor da proteína A amilóide depositada na amiloidose (Uhlar, CM e Whitehead, supra.). Desta maneira, quando há um ligando tal como zcytorl71ig que actua como molécula pró-inflamatória e induz a produção de SAA, os antagonistas seriam úteis para tratar a doença inflamatória e outras doenças associadas a proteínas de resposta de fase aguda induzidas pelo ligando. Ditos antagonistas são definidos nas reivindicações. Por exemplo, a invenção permite reduzir a inflamação num mamífero com inflamação utilizando uma quantidade de anticorpo anti-zcytorl71ig (por exemplo, anticorpo neutralizador) como é definido nas reivindicações que é suficiente para reduzir a inflamação. Além disso, a memória descritiva descreve a supressão de uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação por meio de: (1) a determinação de um nível de proteína amilóide A em soro; (2) a administração de uma composição que compreende um polipéptido zcytorl71ig ou anticorpo anti-zcytor171ig como é descrito no presente documento num veículo farmaceuticamente aceitável; (3) a determinação do nível posterior à administração de proteína amilóide A em soro; (4) a comparação do nível de proteína A amilóide em soro na etapa (1) com o nível de proteína A amilóide em soro da etapa (3), em que a ausência de um aumento ou uma redução 112 no nível em soro de proteína A amilóide é indicativa de supressão de uma resposta inflamatória.

Os receptores que se ligam a zcytorl71ig incluem pelo menos uma subunidade de receptor de zcytorl7. Um segundo polipéptido receptor incluído no receptor heterodimérico solúvel pertence à subfamília de receptores que inclui as subunidades de receptor de citocinas de classe I, e mais especificamente OSMRbeta e WSX-1. Além de um polipéptido receptor de zcytorl7 monomérico ou homodimérico, um receptor de zcytorl7 heterodimérico solúvel, como é exemplificado por uma forma de realização que compreende um receptor de zcytorl7 solúvel + componente heterodimérico de receptor solúvel de classe I, tal como OSMRbeta ou WSX-1, pode actuar como antagonista do zcytorl71ig. Outras formas de realização incluem receptores multiméricos solúveis que compreendem zcytorl7, tais como receptor de zcytorl7 + componente multimérico de receptor solúvel de classe I, tal como OSMRbeta e WSX-1.

Ao igual que zcytorl71ig, o análise da distribuição tissular do ARNm que corresponde ao ADNc do receptor de zcytorl7 mostrou que o nível de ARNm era máximo em monócitos e células de próstata, e está elevado em monócitos activados, e células CD4+ activadas, CD8+ activadas e CD3+ activadas. Portanto, o receptor de zcytorl7 também está envolvido na indução de respostas inflamatórias e imunes. Desta maneira, certas formas de realização particulares da presente invenção dirigem-se a anticorpos de zcytorl71ig, para utilização como antagonistas em doenças inflamatórias, ou afecções tais como doença inflamatória do intestino (DII), doença de Crohn, sepsia e quando há inibição de inflamação, supressão imune, redução da proliferação de células hematopoiéticas, imunes, inflamatórias ou linfóides, macrófagos, linfócitos T (incluindo células Thl e Th2, células CD4+ e CD8+), supressão da resposta imune a um patogénio ou antigénio. 113

Além disso, a presença de receptor de zcytorl7 e expressão de zcytorl71ig em células imunes activadas tais como células CD3+ activadas, monócitos, células CD4+ e CD19+ mostrou que o receptor de zcytorl7 pode estar envolvido nas reacções defensivas imunes do corpo contra invasores estranhos: tais como microrganismos e detritos celulares, e poderia desempenhar um papel em respostas imunes durante a inflamação e a formação de cancros. Como tais, zcytorl71ig e os anticorpos de zcytorl71ig da presente invenção (como são definidos nas reivindicações) que são agonistas ou antagonistas da função do receptor de zcytorl7 podem utilizar-se para modificar a resposta imune e a inflamação, como é definido nas reivindicações.

Além disso, os polipéptidos zcytorl71ig que se ligam a polipéptidos receptores zcytorl7, e anticorpos contra os mesmos, são úteis para: 1) Antagonizar ou bloquear a sinalização através de receptores que compreendem zcytorl7 no tratamento da inflamação aguda, inflamação como resultado de traumatismo, lesão tissular, cirurgia, sepsia ou infecção, e doenças inflamatórias crónicas tais como asma, doença inflamatória do intestino (DII), colite crónica, esplenomegalia, artrite reumatóide, episódios inflamatórios agudos recorrentes (por exemplo, tuberculose) e tratamento de amiloidose e aterosclerose, doença de Castleman, asma e outras doenças associadas à indução de resposta de fase aguda. 2) Antagonizar ou bloquear a sinalização através de receptores que compreendem o receptor de zcytorl7 no tratamento de doenças autoimunes tais como IDDM, esclerose múltipla (EM), lúpus eritematoso sistémico (LES), miastenia grave, artrite reumatóide e DII para prevenir ou inibir a sinalização em células imunes (por exemplo linfócitos, monócitos, leucócitos) por meio de o receptor de zcytorl7 (Hughes C et ai., J. Immunol 153: 114 3319-3325, 1994). Como alternativa, também podem ser utilizados anticorpos, tais como anticorpos monoclonais (AcM) contra zcytorl71ig, como antagonistas para reduzir células imunes indesejadas para tratar uma doença autoimune. 0 asma, a alergia e outras doenças atópicas podem ser tratados com um AcM contra, por exemplo, anticorpos anti-zcytorl71ig, receptores solúveis zcytorl7 ou heterodimeros zcytor17/CRF2-4, para inibir a resposta imune ou reduzir as células ofensivas. 0 bloqueio ou inibição da sinalização através de zcytorl7 utilizando os polipéptidos e anticorpos da presente invenção também podem ser benéficos para doenças do pâncreas, rim, hipófise e células neuronais. Podem beneficiar-se a IDDM (diabetes mellitus dependente de insulina), NIDDM (diabetes mellitus não dependente de insulina), pancreatite e carcinoma pancreático. 0 zcytorl7 pode servir como alvo para a terapêutica com AcM de cancros em que um AcM antagonista inibe o crescimento do cancro e se dirige a destruição mediada pelo sistema imune. (Holliger P, e Hoogenboom, H: Nature Biotech. 16: 1015-1016, 1998). Os AcM contra monómeros, homodímeros, heterodimeros e multimeros de receptor de zcytorl7 solúvel também podem ser úteis para tratar nefropatias tais como glomeruloesclerose, neuropatia membranosa, amiloidose (que também afecta ao rim entre outros tecidos), arteriosclerose renal, glomerulonefrite de diversas origens, doenças fibroproliferativas do rim, assim como disfunção renal associada a LES, IDDM (diabetes mellitus dependente de insulina), diabetes de tipo II (NIDDM), tumores renais e outras doenças. 3) Agonizar ou iniciar a sinalização através dos receptores zcytorl7 no tratamento de doenças autoimunes tais como IDDM, EM, LES, miastenia grave, artrite reumatóide e DII. O zcytorl71ig pode sinalizar aos linfócitos ou outras células imunes para que se 115 diferenciem, alterem a proliferação ou mudem a produção de citocinas ou proteínas da superfície celular que melhorem a autoimunidade. Especificamente, a modulação de uma resposta de linfócitos T auxiliares a um padrão alternativo de secreção de citocinas pode desviar uma resposta autoimune para melhorar a doença (Smith JA et ai., J. Immunol. 160:4841-4849, 1998). De forma similar, zcytorl71ig pode ser utilizado para sinalizar, reduzir e desviar células imunes envolvidas no asma, alergia e doenças atópicas. A sinalização através do receptor de zcytorl71ig também pode ser benéfico para doenças do pâncreas, rim, pituitária e células neuronais. Podem beneficiar-se a IDDM, NIDDM, pancreatite e carcinoma pancreático. O zcytorl7 pode servir como alvo para a terapêutica com AcM de cancro pancreático quando a sinalização de um AcM inibe o crescimento do cancro e se dirige à destruição mediada pelo sistema imune (Tutt, AO et ai., J Immunol. 161: 3175-3185, 1998). De forma similar, podem ser tratados com anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos neutralizadores) contra receptores solúveis que compreendem zcytorl7 da presente invenção leucemias específicas de linfócitos T, linfomas, discrasia de células plasmáticas (por exemplo mieloma múltiplo) e carcinomas.

Os anticorpos anti-zcytorl71ig, os polipéptidos monoméricos, homodiméricos, heterodiméricos e multiméricos do receptor de zcytorl7 solúvel descritos no presente documento podem ser utilizados para neutralizar/bloquear a actividade do ligando do receptor de zcytorl7 no tratamento de doenças autoimunes, doença atópica, NIDDM, pancreatite e disfunção renal como foi descrito anteriormente. Pode utilizar-se uma forma solúvel do receptor de zcytorl7 para promover uma resposta imune mediada por linfócitos T e/ou promover a produção de IL-4 ou outras citocinas por linfócitos ou outras células imunes: 116

Os anticorpos anti-zcytorl71ig e os receptores que compreendem zcytorl7 solúveis são úteis como antagonistas de zcytorl71ig. Ditos efeitos antagonistas podem ser conseguidos por neutralização directa ou ligação do seu ligando natural. Além das utilizações antagonisticas, os receptores solúveis podem ligar-se a zcytorl71ig e actuar como portador ou proteínas portadoras, para transportar zcytorl71ig a diferentes tecidos, órgãos e células dentro do corpo. Como tais, os receptores solúveis podem fusionar-se ou acoplar-se a moléculas, polipéptidos ou resíduos químicos que dirigem o complexo receptor solúvel-ligando a um local específico, tal como um tecido, célula imune específica, monócitos ou tumor. Por exemplo, na infecção aguda ou alguns cancros, podem ser obtidos benefícios pela indução de inflamação e proteínas de resposta local de fase aguda. Desta maneira, os receptores solúveis descritos no presente documento ou anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para dirigir especificamente a acção de um ligando zcytorl71ig pró-inflamatório. Veja-se Cosman, D. Cytokine 5: 95-106,1993; e Femandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9:497-513, 2000.

Além disso, os receptores solúveis podem ser utilizados para estabilizar o zcytorl71ig, para aumentar a biodisponibilidade, longevidade terapêutica e/ou eficácia do Ligando por meio da estabilização do Ligando contra a degradação ou eliminação, ou por meio do direccionamento do ligando a um local de acção dentro do corpo. Por exemplo, o complexo IL-6/IL6-R solúvel natural estabiliza a IL-6 e pode sinalizar através do receptor gpl30. Veja-se Cosman, D. supra., e Fernandez-Botran, R. supra. Além disso, zcytorl71ig pode ser combinado com um ligando cognato tal como o seu ligando para compreender um complexo ligando/receptor solúvel. Ditos complexos podem ser utilizados para estimular respostas de células que apresentam uma subunidade de receptor de companhia. A 117 especificidade celular dos complexos receptor de zcytorl7/zcytorl71ig pode diferir da observada do ligando administrado somente. Além disso, os complexos podem ter propriedades farmacocinéticas distintas tais como um efeito sobre a semivida, dose/resposta e especificidade de órgão ou tecido, desta maneira, os complexos zcytorl7/ligando podem ter actividade agonista para aumentar uma resposta imune ou estimular às células mesangiais ou estimular às células hepáticas. Como alternativa, somente os tecidos que expressam uma subunidade de sinalização que forma heterodímero com o complexo podem ser afectadsos de forma análoga à resposta aos complexos IL6/IL6R (Hirota H. et al., Proc. Nat'l. Acad. Sei. 92:4862-4866, 1995; Hirano, T. em Thomason, A. (Ed.) "The Cytokine Hanbook", 3a Ed., p. 208-209). Os complexos receptor solúvel/citocina para IL12 e CNTF apresentam actividades similares. O zcytorl71ig também pode ser utilizado dentro de sistemas de diagnóstico para a detecção de níveis circulantes de ligando, e na detecção de uma resposta inflamatória de fase aguda. Dentro de uma forma de realização relacionada, podem utilizar-se anticorpos ou outros agentes que se ligam especificamente a zcytorl71ig para detectar polipéptidos zcytorl71ig circulantes; pelo contrário, o próprio zcytorl71ig pode ser utilizado para detectar polipéptidos do receptor circulante ou de acção local. Os níveis elevados ou reduzidos de polipéptidos de ligando ou receptor podem ser indicativos de estados patológicos, incluindo inflamação ou cancro. Além disso, a detecção de proteínas ou moléculas de fase aguda tais como zcytorl71ig pode ser indicativa de um estado inflamatório crónico em certos estados patológicos (por exemplo artrite reumatóide). A detecção de ditas afecções serve para ajudar ao diagnóstico da doença além de ajudar ao médico a escolher uma terapêutica apropriada. 118

Os polipéptidos e proteínas descritos no presente documento também podem ser utilizados ex vivo, tal como numa cultura de medula autóloga. De maneira breve, retira-se a medula óssea de um paciente antes da quimioterapêutica ou transplante de órgãos e se trata com zcytorl71ig, opcionalmente em combinação com uma ou mais citocinas adicionais. A medula tratada depois é devolvida ao paciente depois da quimioterapêutica para acelerar a recuperação da medula ou depois do transplante para suprimir a doença de enxerto contra hospedeiro. Além disso, as proteínas descritas no presente documento também podem ser utilizadas para a expansão ex vivo de monócitos/macrófagos de medula ou células progenitoras de sangue periférico (PBPC). Antes do tratamento, a medula pode ser estimulada com factor de células estaminais (SCF) para libertar as células progenitoras em seus primeiras fases na circulação periférica. Estes progenitores podem ser recolhidos e concentrados a partir de sangue periférico e depois tratados em cultura com zcytorl71ig, opcionalmente em combinação com uma ou mais citocinas adicionais, incluindo mas sem limitação SCF, IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-3, IL-12, IL-21 ou IL-15, para diferenciar e proliferar culturas linfóides de alta densidade, que depois podem ser devolvidas ao paciente depois da quimioterapêutica ou transplante. A presente memória descritiva descreve a expansão de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas que compreende cultivar medula óssea ou células de sangue periférico com uma composição que compreende uma quantidade de zcytorl71ig suficiente para produzir um aumento no número de células linfóides na medula óssea ou células de sangue periférico em comparação com as células de medula óssea ou de sangue periférico cultivadas na ausência de zcytorl71ig. Em outras formas de realização, as células hematopoiéticas e as células 119 progenitoras hematopoiéticas são células linfóides. Em outra forma de realização, as células linfóides são células NK ou linfócitos T citotóxicos. Além disso, a composição também pode compreender pelo menos outra citocina seleccionada do grupo que consiste em IL-2, IL-15, IL-4, Lif, IL-3, IL-12, IL-21, GM-CSF, ligando de Flt3 e factor de célula estaminal.

Como alternativa, zcytorl71ig pode activar o sistema imune, o qual seria importante para reforçar a imunidade contra doenças infecciosas, tratar a pacientes imunocomprometidos tais como pacientes VIH+, pacientes com cancro ou para melhorar vacinas. Em particular, a estimulação ou expansão com zcytorl71ig de monócitos/macrófagos, linfócitos T, linfócitos B, células NK ou seus progenitores, proporcionaria um valor terapêutico no tratamento de infecções virais, e como um factor antineoplásico. De forma similar, a estimulação com zcytorl71ig da resposta imune contra agentes patogénios virais e não virais (incluindo bactérias, protozoários e fungos) proporcionaria um valor terapêutico no tratamento de ditas infecções por meio da inibição do crescimento de ditos agentes infecciosos. A determinação directamente ou indirectamente dos níveis de um patogénio ou antigénio, tal como uma célula tumoral, presente no corpo pode ser conseguida por vários métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento. A presente memória descritiva descreve a estimulação de uma resposta imune num mamífero exposto a um antigénio ou patogénio que compreende as etapas de: (1) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio presente em dito mamífero; (2) administrar uma composição que compreende polipéptido zcytorl71ig num veículo farmaceuticamente aceitável; (3) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio em dito mamífero; e (4) comparar o nível do 120 antigénio ou patogénio da etapa 1 com o nível de antigénio ou patogénio da etapa 3, em que uma mudança no nível é indicativa da estimulação de uma resposta imune. Em outra forma de realização, a composição de zcytorl71ig é readministrada. Em outras formas de realização, o antigénio é um tumor de linfócitos B; um vírus, um parasita ou uma bactéria.

Em outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a estimulação de uma resposta imune num mamífero exposto a um antigénio ou patogénio que compreende: (1) determinar o nível de um anticorpo específico de antigénio ou patogénio; (2) administrar uma composição que compreende polipéptido zcytorl71ig num veiculo farmacêutico aceitável; (3) determinar um nível posterior à administração de anticorpo específico de antigénio ou patogénio; (4) comparar o nível de anticorpo na etapa (1) com o nível de anticorpo na etapa (3), em que um aumento no nível de anticorpo é indicativo de estimulação de uma resposta imune.

Os polinucleótidos que codificam polipéptidos zcytorl71ig são úteis dentro de aplicações de terapêutica génica nas quais se deseja aumentar ou inibir a actividade de zcytorl71ig. Se um mamífero tiver um gene de zcytorl71ig mutado ou ausente, o gene de zcytorl71ig pode ser introduzido nas células do mamífero. Numa forma de realização, introduz-se um gene que codifica um polipéptido zcytorl71ig in vivo num vector virai. Ditos vectores incluem um vírus de ADN atenuado ou defeituoso tal como, mas sem limitação, o vírus do herpes simples (VHS), papilomavírus, vírus de Epstein Barr (VEB), adenovírus, vírus adeno-associado (VAA) e similares. Preferem-se vírus defeituosos, que carecem totalmente ou quase totalmente de genes virais. Um vírus defeituoso não é infeccioso depois de ser introduzido numa célula. A utilização de vectores virais defeituosos permite a administração às células numa 121 área localizada específica, sem preocupação de que o vector possa infectar outras células. Os exemplos de vectores particulares incluem, mas sem limitação, vector de vírus do herpes simples 1 defeituoso (VHS1) (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991); um vector adenoviral atenuado, tal como o vector descrito por Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626-30, 1992; e um vector de vírus adeno-associado defeituoso (Samulski et al., J. Virol. 61:3096-101,1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-8, 1989).

Um gene de zcytorl71ig pode ser introduzido num vector retroviral, por exemplo, como é descrito em Anderson et al., Patente US N° 5.399.346; Mann et al. Cell 33:153, 1983; Temin et al., Patente US N° 4.650.764; Temin et al., Patente US N° 4.980.289; Markowitz et al., J. Virol. 62 : 1120, 1988; Ternin et al., Patente US N° 5.124.263; Publicação de Patente Internacional N° WO 95/07358, publicada 16 de Março de 1995 por Dougherty et al.; e Kuo et al., Blood 82:845, 1993. Como alternativa, o vector pode ser introduzido por lipofecção in vivo utilizando lipossomas. Podem utilizar-se lípidos catiónicos sintéticos para preparar lipossomas, para a transfecção in vivo de um gene que codifica um marcador (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8027-31, 1988). A utilização de lipofecção para introduzir genes exógenos em órgãos específicos in vivo tem certas vantagens práticas. O direcionamento molecular de lipossomas a células específicas representa uma área de efeitos benéficos. Mais particularmente, o direccionamento da transfecção a células particulares representa uma área de efeitos benéficos. Por exemplo, o direcionamento da transfecção a tipos celulares particulares seria particularmente vantajoso num tecido com heterogeneidade celular, tal como o sistema imune, pâncreas, fígado, rim e cérebro. Os lípidos podem acoplar- 122 se quimicamente a outras moléculas para o direcionamento. Os péptidos dirigidos (por exemplo hormonas ou neurotransmissores), proteínas tais como anticorpos ou moléculas não peptídicas podem ser acopladas a lipossomas quimicamente. É possível retirar as células alvo do corpo para introduzir o vector como um plasmídeo de ADN nu; e depois reimplantar as células transformadas no corpo. Os vectores de ADN nu para terapêutica génica podem ser introduzidos nas células hospedeiras desejadas por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção, electroporação, microinjecção, transdução, fusão celular, DEAE dextrano, precipitação com fosfato cálcico, utilização de uma bombardeamento de partículas ou utilização de um transportador de vectores de ADN. Veja-se, por exemplo, Wu et al.,J. Biol. Chem, 267:963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-4, 1988.

Pode utilizar-se a metodologia antisenso para inibir a transcrição do gene de zcytorl71ig, tal como para inibir a proliferação celular in vivo. Desenham-se polinucleótidos que são complementares a um segmento de um polinucleótido que codifica zcytorl71ig (por exemplo, um polinucleótido como é exposto na SEQ ID NO: 1) para ligar-se ao ARNm que codifica zcytorl71ig e inibir a tradução de dito ARNm. Ditos polinucleótidos antisenso são utilizados para inibir a expressão de genes que codificam o polipéptido zcytorl71ig numa cultura celular ou num indivíduo.

Também podem ser gerados ratinhos modificados por engenharia genética que expressam o gene de zcytorl71ig, denominados "ratinhos transgénicos" e ratinhos que apresentam uma ausência completa de função do gene zcytorl71ig, denominados "ratinhos knock out" (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al. Annu Rev Genet. 20: 465-499, 1986). 123

Por exemplo, podem utilizar-se ratinhos transgénicos que sobre-expressam zcytorl71ig, de forma ubiqua ou sob um promotor especifico de tecido ou restringido a um tecido para perguntar se a sobre-expressão produz um fenótipo. Por exemplo, a sobre-expressão de um polipéptido zcytorl71ig de tipo selvagem, fragmento do polipéptido ou um mutante do mesmo pode alterar processos celulares normais, tendo como resultado um fenótipo que identifica um tecido em que a expressão de zcytorl71ig é funcionalmente relevante e pode indicar um alvo terapêutico para o zcytorl71ig, seus agonistas ou antagonistas. Por exemplo, um ratinho transgénico preferido para modificar-se por engenharia genética é um que sobre-expressa o zcytorl71ig (residuos de aminoácido 23-164 da SEQ ID NO: 2; ou 24-163 da SEQ ID NO: 11). Além disso, dita sobre-expressão pode ter como resultado um fenótipo que amostra similaridade com doenças humanas. De forma similar, podem utilizar-se ratinhos knockout para zcytorl71ig para determinar se zcytorl71ig é absolutamente necessário in vivo. 0 fenótipo de ratinhos knockout é preditivo dos efeitos in vivo que pode ter um antagonista de zcytorl71ig, tais como os descritos no presente documento. 0 ADNc de zcytorl71ig humano ou de ratinho descrito no presente documento pode utilizar-se para gerar ratinhos knockout. Estes ratinhos podem ser utilizados para estudar o gene de zcytorl71ig e a proteina codificada pelo mesmo num sistema in vivo, e pode ser utilizados como modelos in vivo para as doenças humanas correspondentes. Além disso, pode utilizar-se a expressão em ratinhos transgénicos de polinucleótidos antisenso de zcytorl71ig ou ribozimas dirigidas contra zcytorl71ig, descrita no presente documento, de forma análoga aos ratinhos transgénicos descritos anteriormente. Também podem ser realizados estudos por meio da administração de proteina zcytorl71ig purificada. 124

As provas experimentais sugerem um papel de zcytorl71ig na progressão de doenças que envolvem a pele ou epitélio de superfícies internas, tais como, por exemplo, intestino grosso, intestino delgado, pâncreas, pulmão, próstata, útero e similares. Em primeiro lugar, como é revelado no presente documento, os receptores zcytorl7, incluindo tanto o receptor OSM beta como zcytorl7, são expressos em vários tipos celulares localizados em superfícies epiteliais que incluem linhas celulares derivadas de epitélio pulmonar, fibroblastos pulmonares, próstata, cólon, mama, epitélio hepático, osso e epitélio cutâneo, fibroblastos ósseos e similares. Além disso, como é revelado no presente documento, os exemplos de cada um destes tipos celulares respondiam à activação por zcytorl71ig de uma construção indicadora STAX. Além disso, várias linhas celulares respondiam à estimulação por zcytorl71ig por meio da produção de maiores níveis de IL-6, IL-8, MCP-1 (um factor quimiotáctico) como é descrito no presente documento. Em conjunto, estes dados sugerem um papel para zcytorl71ig em doenças que envolvem o epitélio, tais como, por exemplo, dermatite atópica; dermatite; psoríase; artrite psoriásica, eczema, gengivite, doença periodontal; doenças inflamatórias do intestino (DII) (por exemplo, colite ulcerosa, doença de Crohn); distúrbios reprodutivos, tais como, por exemplo, displasia cervical, cancro cervical, outras doenças cutâneas tais como cancros: sarcomas, carcinomas, melanomas, etc., isto é, não somente doenças inflamatórias, uma vez que o sistema imune está envolvido na activação/cura de cancros; doenças que envolvem disfunção de barreiras, tais como, por exemplo, doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD) e síndrome do intestino irritável (DII); e doenças que envolvem o epitélio pulmonar, tais como asma, enfisema e similares. Além disso, a libertação de citocinas IL-6, IL-8 e MPC-1 por células expostas a zcytorl71ig sugere que zcytorl71ig 125 está envolvido na inflamação. Portanto, a regulação de zcytorl71ig pode ser útil no tratamento de doenças autoimunes, inflamatórias ou cancerosas associadas aos tecidos que expressam o receptor. Estas doenças incluem, por exemplo, prostatite, hepatite, osteoartrite e similares. O zcytorl71ig pode regular positivamente ou negativamente, directamente ou indirectamente estas doenças. Portanto, a administração de zcytorl71ig pode ser utilizada para tratar doenças como essas descritas no presente documento directamente ou com moléculas que inibem a actividade de zcytorl71ig que incluem, por exemplo, anticorpos monoclonais contra zcytorl71ig ou anticorpos monoclonais contra zcytorl71ig, ou anticorpos monoclonais que reconhecem o complexo de receptor de zcytorl7 e OSM beta.

Os dados também sugerem que zcytorl71ig pode estar envolvido na regulação de doenças mediadas por linfócitos T TH2. Em primeiro lugar, zcytorl71ig é feito pela subsérie TH2 de linfócitos T activados. As células TH2 expressam mais zcytorl71ig que as células TH1. Além disso, estimularam-se pelo menos duas linhas de células epiteliais pulmonares (SK-LU-1, A549) para aumentar o ARNm do receptor de IL13 alfa-2 em resposta à estimulação por ligando de zcytorl7 como é descrito no presente documento. Existe uma associação da cadeia alfa2 do receptor de IL-13 e a tumorigenicidade de tumores pancreáticos e de mama humanos. Isto sugere que zcytorl71ig pode desempenhar um papel na regulação da tumorigenicidade destes tipos de cancros, assim como de outros cancros. Portanto, a administração de um antagonista de zcytorl71ig ou a utilização directa de zcytorl71ig pode ser útil no tratamento destes tipos de cancros, benignos ou malignos e em diversos graus (graus I-IV) e estágios (por exemplo, métodos de classificação de estágios TNM ou AJC) do desenvolvimento tumoral, em mamíferos, preferentemente seres humanos. 126

Sabe-se bem na técnica que a IL13 está envolvida na geração de células TH2 activadas e em doenças mediadas por TH2, tais como asma, dermatite atópica e similares. O zcytorl71ig ou os antagonistas de zcytorl71ig podem ser úteis no tratamento de doenças nas quais estão envolvidos os linfócitos T TH2. Isto incluiria doenças tais como, por exemplo, dermatite atópica, asma, assim como outras doenças que se exacerbam por células TH2 activadas. A implicação de zcytorl71ig em doenças, tais como, por exemplo, dermatite atópica, também se confirma pelo fenótipo dos ratinhos transgénicos que sobre-expressam zcytorl71ig e desenvolvem sintomas de dermatite atópica como é descrito no presente documento.

Apesar da expressão preferente de zcytorl71ig pelas células TH2, existe ainda alguma expressão de zcytorl71ig nas células TH1 e nos linfócitos T CD8+. Portanto, zcytorl71ig ou seus antagonistas podem ser úteis no tratamento de doenças que envolvem a modulação imune de linfócitos T activos que incluem, por exemplo, infecção virai, cancros, rejeição de enxertos e similares.

Zyctorl71ig também pode estar envolvido no desenvolvimento de cancros. Há a expressão do receptor de zcytorl7 e de receptores OSM beta em osteossarcomas de fibroblastos ósseos humanos, melanoma de fibroblastos cutâneos humanos, carcinoma epitelial de cólon, adenocarcinoma, adenocarcinoma epitelial de mama, adenossarcoma epitelial de próstata e adenocarcinoma e carcinoma epitelial de pulmão. Portanto, pode ser útil tratar tumores de origem epitelial com zcytorl71ig, fragmentos do mesmo ou antagonistas de zcytorl71ig que incluem, mas sem limitação, carcinoma, adenocarcinoma e melanoma. Independentemente, zcytorl71ig ou um antagonista de zcytorl71ig pode ser utilizado para tratar um cancro ou reduzir um ou mais sintomas de um cancro, desde um cancro que inclui, mas sem limitação, carcinoma de células 127 escamosas ou epidermóide, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma papilar, cistadenocarcinoma, carcinoma broncogénico, adenoma bronquial, melanoma, carcinoma de células renais, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células transicionais, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor misto maligno de origem de glândulas salivares, tumor de Wilms, teratoma imaturo, teratocarcinoma e outros tumores que compreendem pelo menos algumas células de origem epitelial.

Geralmente, a dose de polipéptido zcytorl71ig administrado (ou análogo ou proteína de fusão de zcytorl7) variará dependendo de factores tais como a idade do paciente, o peso, a altura, o sexo, o estado médico geral e a história médica anterior. Tipicamente, é desejável proporcionar ao receptor uma dosagem de polipéptido zcytorl71ig que esteja no intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 10 mg/kg (quantidade de agente/peso corporal do paciente), embora também possa ser administrada uma dosagem menor ou maior quando ditem as circunstâncias. Um perito na especialidade pode determinar facilmente ditas dosagens, e os ajustes das mesmas, utilizando métodos conhecidos na técnica. A administração de um polipéptido Zyctorl71ig a um indivíduo pode ser tópica, por meio de um inalador, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intrapleural, intratecal, por perfusão através de um cateter regional ou por injecção intralesional directa. Quando se administram proteínas terapêuticas por injecção, a administração pode ser realizada por infusão contínua ou por meio de um único ou múltiplos bólus. zeína

As vias de administração adicionais incluem a via oral, na membrana mucosa, pulmonar e transcutânea. A administração oral é adequada para microesferas de poliéster, microesferas de zeína, microesferas de 128 proteinóide, microesferas de policianoacrilato, e sistemas à base de lípidos (veja-se, por exemplo, DiBase e Morrei, "Oral Delivery of Microencapsulated Proteins," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 255-288 (Plenum Press 1997)). A viabilidade de uma administração intranasal é exemplificada por um modo parecido de administração de insulina (veja-se, por exemplo, Hinchcliffe e Illum, Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 199 (1999)). Podem ser preparadas partículas secas ou líquidas que compreendem Zcytorl71ig e inaladas com a ajuda de dispensadores de pó seco, geradores de aerossol líquido ou nebulizadores (por exemplo, Pettit e Gombotz, TIBTECH 16: 343 (1998); Patton et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 35: 235 (1999)). Esta abordagem é ilustrada pelo sistema de tratamento de diabetes AERX, que é um inalador electrónico portátil que liberta insulina em aerossol nos pulmões. Certos estudos mostraram que foram administradas proteínas de até 48.000 kDa através da pele a concentrações terapêuticas com ajuda de ultra-som de baixa frequência, o que ilustra a viabilidade da administração transcutânea (Mitragotri et al., Science 269: 850 (1995)). A administração transdérmica utilizando electroporação proporciona outro meio para administrar uma molécula que tem actividade de ligação a Zcytorl71ig (Potts et al., Pharm. Biotechnol. 10: 213 (1997)).

Uma composição farmacêutica que compreende uma proteína, polipéptido ou péptido que tem actividade de ligação a Zcytorl71ig pode ser formulada de acordo com os métodos conhecidos para preparar composições farmaceuticamente úteis, por meio da qual as proteínas terapêuticas são combinadas numa mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. Diz-se que uma composição é um "veículo farmaceuticamente aceitável" se a sua administração pode ser tolerada por um paciente receptor. A solução salina tamponada com fosfato estéril é um exemplo 129 de um veículo farmaceuticamente aceitável. Outros veículos adequados são bem conhecidos pelos peritos na especialidade. Veja-se, por exemplo, Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edição (Mack Publishing Company 1995) .

Para o objectivo da terapêutica, as moléculas que têm actividade de ligação a Zcytorl71ig e um veículo farmaceuticamente aceitável são administradas a um paciente numa quantidade terapeuticamente eficaz. Diz-se que uma combinação de uma proteína, polipéptido ou péptido que tem actividade de ligação a Zcytorl71ig e um veículo farmaceuticamente aceitável é administrada numa "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada for fisiologicamente significativa. Um agente é fisiologicamente significativo se a sua presença produzir uma mudança detectável na fisiologia de um paciente receptor. Por exemplo, um agente utilizado para tratar a inflamação é fisiologicamente significativo se a sua presença aliviar pelo menos uma parte da resposta inflamatória.

Uma composição farmacêutica que compreende Zcytorl71ig (ou um análogo ou proteína de fusão de Zcytorl71ig) pode ser preparada em forma líquida, num aerossol ou em forma sólida. As formas líquidas são ilustradas por soluções injectáveis, aerossóis, pequenas gotas, soluções topológicas e suspensões orais. Os exemplos de formas sólidas incluem cápsulas, comprimidos e formas de libertação controlada. Esta última forma é ilustrada por bombas mini-osmóticas e implantes (Bremer et ai., Pharm. Biotechnol. 10: 239 (1997); Ranade, "Implants in Drug Delivery" em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 95-123 (CRC Press 1995); Bremer et ai., "Protein Delivery with Infusion Pumps," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 239-254 (plenum Press 1997); Yewey et ai., 130 "Delivery of Proteins from a Controlled Release Injectable Implant," em Proteins Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 93-117 (Plenum Press 1997)). Outras formas incluem cremes, pastas, outras aplicações topológicas e similares.

Os lipossomas proporcionam um meio para administrar polipéptidos terapêuticos a um indivíduo por via intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, subcutânea ou por meio de administração oral, inalação ou administração intranasal. Os lipossomas são vesículas microscópicas que consistem numa ou mais bicapas lipídicas que rodeiam compartimentos aquosos (veja-se, em geral, Bakker-Woudenberg et al., Eur. J. Clin. Microbiol. Infect, Dis. 12 (Supli. 1):S61 (1993), Kim, Drugs 46: 618 (1993), e Ranade, "Site-Specific Drug Delivery Using Liposomes as Carriers," em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 3-24 (CRC Press 1995)). Os lipossomas são similares em composição às membranas celulares e como resultado, os lipossomas podem ser administrados de forma segura e são biodegradáveis. Dependendo do método de preparação, os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares, e os lipossomas podem variar em tamanho com diâmetros que variam de 0,02 μιη a mais de 10 |im. Nos lipossomas pode ser encapsulada uma variedade de agentes: agentes hidrofóbicos repartidos nas bicapas e agentes hidrofílicos repartidos dentro do espaço ou espaços aquosos internos. (Veja-se, por exemplo, Machy et al., Liposomes In Cell Biology And Pharmacology (John Libbey 1987), e Ostro et al., American J. Hosp. Pharm 46: 1576 (1989)). Além disso, é possível controlar a disponibilidade terapêutica do agente encapsulado variando o tamanho do lipossoma, o número de bicapas, a composição de lípidos, assim como a carga e as caracteristicas superficiais dos lipossomas.

Os lipossomas podem adsorver praticamente qualquer tipo de célula e depois libertar lentamente o agente 131 encapsulado. Como alternativa, um lipossoma absorvido pode ser introduzido por endocitose em células que são fagociticas. A endocitose é seguida pela degradação intralisossómica dos lipidos lipossomais e a libertação dos agentes encapsulados (Scherphorf et al., Ann. N.E. Acad. Sei. 446: 368 (1985)). Depois da administração intravenosa, os lipossomas pequenos (de 0,1 a 1,0 μιη) são captados tipicamente pelas células do sistema reticulo-endotelial, localizado principalmente no fígado e baço, enquanto que os lipossomas maiores de 3,0 μτη se depositam no pulmão. Esta captação preferente dos lipossomas mais pequenos pelas células do sistema reticular endotelial foi utilizada para administrar agentes quimioterapêuticos a macrófagos e a tumores do fígado. O sistema reticulo-endotelial pode ser evitado por vários métodos que incluem a saturação com grandes doses de partículas de lipossoma, ou inactivação selectiva de macrófagos por meios farmacológicos (Claassen et al., Biochim. Biophys. Acta 802:429 (1984)). Além disso, mostra-se que a incorporação de fosfolípidos derivatizados com glicolípidos ou polietilenoglicol nas membranas do lipossoma tem como resultado uma captação significativamente reduzida pelo sistema reticulo-endotelial (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1068:133 (1991); Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150:9 (1993)) .

Também podem ser preparadas lipossomas para dirigir-se a células ou órgãos particulares por meio da variação da composição de fosfolípidos ou inserção de receptores ou ligandos nos lipossomas. Por exemplo, utilizaram-se lipossomas preparados com um alto conteúdo de tensioactivo não iónico para dirigir ao fígado (Hayakawa et al., Patente japonesa 04-244.018 ; Kato et al., Biol. Pharm. Buli. 16: 960 (1993)). Estas formulações foram preparadas por meio da mistura de fosfatidileolina de soja, α-tocoferol e óleo de 132 rícino hidrogenado etoxilado (HCO-60) em metanol, concentração da mistura a vácuo e depois reconstituição da mistura com água. Também se mostra que uma formulação lipossomal de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) com uma mistura de esteril-glucósido (SG) derivado de soja e colesterol (Ch) se dirige ao fígado (Shimizu et al., Biol. Pharm. Buli. 20: 881 (1997)).

Como alternativa, diversos ligandos de direcção podem ligar-se à superfície do lipossoma, tais como anticorpos, fragmentos de anticorpo, hidrato de carbonos, vitaminas e proteínas de transporte. Por exemplo, os lipossomas podem modificar-se com derivados de galactosil lípidos de tipo ramificado para dirigir-se a receptores de asialoglicoproteína (galactosa), que se expressam exclusivamente na superfície de células hepáticas (Kato e Sugiyama, Crit. Rev. Ther. Drue Carrier Syst. 14: 287 (1997); Murahashi et al., Biol. Pharm. Buli. 20: 259 (1997) ). De forma similar, Wu et al., Hepatology 27: 772 (1998) mostraram que a marcação de lipossomas com asialofetuína levou a uma menor semivida em plasma de lipossoma e a uma captação muito aumentada do lipossoma marcado com asialofetuína pelos hepatócitos. Por outro lado, a acumulação hepática de lipossomas que compreendem derivados de galactosil lípidos de tipo ramificado pode ser inibida por meio de uma pré-injecção de asialofetuína (Murahashi et al., Biol. Pharm. Buli. 20: 259 (1997)). Os lipossomas de albumina de soro humano poliaconitilados proporcionam outra abordagem para dirigir lipossomas às células hepáticas (Kamps et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 94: 11681 (1997)). Além disso, Geho, et al. Patente US N° 4.603.044, descrevem um sistema de libertação de vesículas de lipossomas dirigidas a hepatócitos, que tem especificidade por receptores hepatobiliares associados às células metabólicas especializadas do fígado. 133

Numa abordagem mais geral ao direccionamento de tecidos, as células alvo são pré-marcadas com anticorpos biotinilados específicos por um ligando expresso pela célula alvo (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)). Depois da eliminação em plasma do anticorpo livre, são administrados lipossomas conjugados com estreptavidina. Em outra abordagem, os anticorpos de direccionamento ligam-se directamente aos lipossomas (Harasym et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 32: 99 (1998)).

Os polipéptidos que têm actividade de ligação a Zcytorl71ig podem ser encapsulados dentro de lipossomas utilizando técnicas convencionais de microencapsulação de proteínas (veja-se, por exemplo, Anderson et al., Infect. Immun. 31: 1099 (1981), Anderson et al., Câncer Res. 50: 1853 (1990), e Cohen et al., Biochim. Biophys. Acta 1063: 95 (1991), Alving et al. "Preparation and Use of Liposomes in Immunological Studies," em Liposome Technology, 2a Edição, Vol. III, Gregoriadis (ed.), página 317 (CRC Press 1993), Wassef et al. , Meth. Enzymol. 149: 124 (1987)). Como foi indicado anteriormente, os lipossomas terapeuticamente úteis podem conter uma variedade de componentes. Por exemplo, os lipossomas podem compreender derivados de lípidos de poli(etilenoglicol) (Allen et al., Biochim. Biophys. Acta 1150: 9 (1993)).

Desenharam-se microesferas de polímeros degradáveis para manter altos níveis sistémicos de proteínas terapêuticas. As microesferas são preparadas a partir de polímeros degradáveis tais como poli(lactida-co-glicolida) (PLG), polianidridos, poli (orto ésteres), polímeros de acetato de etilvinilo não biodegradáveis, em que as proteínas ficam presas no polímero (Gombotz e Pettit, Bioconjugate Chem. 6: 332 (1995); Ranade, "Role of Polymers in Drug Delivery," em Drug Delivery Systems, Ranade e Hollinger (eds.), páginas 51-93 (CRC Press 1995); Roskos e Maskiewicz, "Degradable Controlled Release Systems Useful 134 for Protein Delivery," em Protein Delivery: Physical Systems, Sanders e Hendren (eds.), páginas 45-92 (Plenum Press 1997); Bartus et al., Science 281: 1161 (1998); Putney e Burke, Nature Biotechnology 16: 153 (1998); Putney, Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 548 (1998)). As nanoesferas revestidas com polietilenoglicol (PEG) também podem proporcionar veículos para a administração intravenosa de proteínas terapêuticas (veja-se, por exemplo, Gref et al., Pharm. Biotechnol. 10: 167 (1997)). A presente memória descritiva descreve polipéptidos modificados quimicamente que têm actividade de zcytorl71ig, tais como o polipéptido zcytorl71ig, agonistas de zcytorl71ig e antagonistas de Zcytorl71ig, por exemplo, anticorpos anti-zcytorl71ig, em que um polipéptido se liga a um polímero, como foi analisado anteriormente.

Os peritos na especialidade podem idealizar outras formas de dosagem como é mostrado, por exemplo, por Ansel e Popovich, Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 5a Edição (Lea & Febiger 1990), Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Edição (Mack Publishing Company 1995), e por Ranade e Hollinger, Drug Delivery Systems (CRC Press 1996).

Como ilustração, as composições farmacêuticas podem ser fornecidas como um kit que compreende um recipiente que compreende um polipéptido zcytorl71ig ou um antagonista de zcytorl71ig (por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ao polipéptido Zcytorl71ig). Os polipéptidos terapêuticos podem ser proporcionados em forma de uma solução injectável para uma única ou múltiplas doses, ou como um pó estéril que será reconstituída antes da injecção. Como alternativa, dito kit pode incluir um dispensador de pó seco, gerador de aerossol líquido, ou nebulizador para a administração de um polipéptido terapêutico. Dito kit pode compreender além disso informação escrita sobre as indicações e utilização da 135 composição farmacêutica. Além disso, dita informação pode incluir uma informação de que a composição de Zcytorl71ig está contraindicada em pacientes com hipersensibilidade conhecida a Zcytorl71ig.

Dentro de um aspecto, a presente memória descritiva descreve um polipéptido isolado que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntica à sequência de resíduos de aminoácidos seleccionados do grupo que consiste em: (a) o polipéptido mostrado desde o resíduo 38 (Vai) ao 152 (Leu) como é mostrado na SEQ ID NO: 2; (b) o polipéptido mostrado desde o resíduo 27 (Leu) ao 164 (Thr) como é mostrado na SEQ ID NO: 2; (c) o polipéptido mostrado desde o resíduo 24 (Thr) ao 164 (Thr) como é mostrado na SEQ ID NO: 2; e (d) o polipéptido mostrado desde o resíduo 1 (Met) ao 164 (Thr) como é mostrado na SEQ ID NO: 2. Numa forma de realização, o polipéptido isolado é como foi revelado anteriormente, em que os resíduos de aminoácido 73, 133 e 147 são cisteínas. Em outra forma de realização, o polipéptido isolado é, como foi revelado anteriormente, em que o polipéptido se liga ao receptor de zcytorl7 como é mostrado na SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 71. Em outra forma de realização, o polipéptido isolado compreende pelo menos 14 resíduos de aminoácido contíguos da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11. Em outra forma de realização, o polipéptido isolado é como foi revelado anteriormente, em que os resíduos de aminoácido são seleccionados do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 38-52 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácido 83-98 da SEQ ID NO: 2; (c) resíduos de aminoácido 104-117 da SEQ ID NO: 2; e (d) resíduos de aminoácido 137-152 da SEQ ID NO : 2.

Dentro de um segundo aspecto a presente memória descritiva descreve uma proteína de fusão que compreende pelo menos quatro polipéptidos em que a ordem dos polipéptidos desde a extremidade N à extremidade C é: um 136 primeiro polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido de 38-52 da SEQ ID NO: 2; um primeiro espaçador de 6-27 resíduos de aminoácido; um segundo polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada entre o grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido da hélice B de IL-2 da SEQ ID NO: 168; (b) resíduos 65-83 da hélice B de IL-4 da SEQ ID NO: 164; (c) resíduos 73-86 da hélice B de IL-3 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos 72-81 da hélice B de GM-CSF da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 83-98 da SEQ ID NO: 2; um segundo espaçador de 5-11 resíduos de aminoácido; um terceiro polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada entre o grupo que consiste em: (a) resíduos 102-116 da hélice D de IL—2 da SEQ ID NO: 162; (b) resíduos 94-118 da hélice C de IL-4 da SEQ ID NO: 164; (c) resíduos 91-103 da hélice C de IL-3 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos 85-103 da hélice C de GM-CSF da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 104-117 da SEQ ID NO: 2; um terceiro espaçador de 3-29 resíduos de aminoácido; e um quarto polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada entre o grupo que consiste em: (a) resíduos 134-149 da hélice D de IL-2 da SEQ ID NO: 162; (b) resíduos 123-141 da hélice D de IL-3 da SEQ ID NO: 102; (c) resíduos 131-151 da hélice D de IL-4 da SEQ ID NO: 164; (d) resíduos 120-131 da hélice D de GM-CSF da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 137-152 da SEQ ID NO: 2.

Dentro de um terceiro aspecto, a presente memória descritiva descreve uma proteína de fusão que compreende pelo menos quatro polipéptidos, em que a ordem dos polipéptidos desde a extremidade N à extremidade C é: um primeiro polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada entre um grupo que consiste em: (a) resíduos 27-48 da hélice A de IL-2 da SEQ ID NO: 162; (b) resíduos 30-42 da hélice A de IL-4 da SEQ 137 ID NO: 164; (c) resíduos 35-45 da hélice A de IL-3 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos 30-44 da hélice A de GM-CSF da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 38-52 da SEQ ID NO: 2; um primeiro espaçador de 6-27 resíduos de aminoácido; um segundo polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada entre o grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido da hélice B de IL-2 da SEQ ID NO: 168; (b) resíduos 65-83 da hélice B de IL-4 da SEQ ID NO: 164; (c) resíduos 73-86 da hélice B de IL-3 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos 72-81 da hélice B de GM-CSF da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 83-98 da SEQ ID NO: 2; um segundo espaçador de 5-11 resíduos de aminoácido; um terceiro polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos seleccionada entre o grupo que consiste em: (a) resíduos 102-116 da hélice C de IL-2 da SEQ ID NO: 162; (b) resíduos 94-118 da hélice C de IL-4 da SEQ ID NO: 164; (c) resíduos 91-103 da hélice C de IL-3 da SEQ ID NO: 102; (d) resíduos 85-103 da hélice C de GM-CSF da SEQ ID NO: 166; e (e) resíduos de aminoácido 104-117 da SEQ ID NO: 2; um terceiro espaçador de 3-29 resíduos de aminoácido; e um quarto polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido de 137-152 da SEQ ID NO: 2. Em outra forma de realização, a proteína de fusão é como foi revelado anteriormente, em que o quarto polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 137-152 da SEQ ID NO: 2.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve uma molécula de polinucleótido isolada que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido revelado anteriormente. Numa forma de realização, o polinucleótido isolado é como foi revelado anteriormente, em que os nucleótidos são seleccionados entre o grupo que consiste em: (a) um polinucleótido como é mostrado na SEQ ID NO: 1 desde o nucleótido 139 ao nucleótido 483; (b) um polinucleótido como é mostrado na 138 SEQ ID NO: 1 desde o nucleótido 106 ao nucleótido 519; (c) um polinucleótido como é mostrado na SEQ ID NO: 1 desde o nucleótido 97 ao nucleótido 519; e (d) um polinucleótido como é mostrado na SEQ ID NO: 1 desde o nucleótido 28 ao nucleótido 519.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve uma molécula de polinucleótido isolada que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica o polipéptido como é revelado no presente documento.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve um vector de expressão que compreende os seguintes elementos ligados operativamente: (a) um promotor de transcrição; (b) um segmento de ADN que codifica um polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada entre o grupo que consiste em: (i) os resíduos de aminoácido 38-52 da SEQ ID NO: 2; (ii) os resíduos de aminoácido 83-98 da SEQ ID NO: 2; (iii) os resíduos de aminoácido 104-117 da SEQ ID NO: 2; (iv) os resíduos de aminoácido 137-152 da SEQ ID NO: 2; e (v) combinações dos mesmos; e (c) um terminador da transcrição.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve um vector de expressão que compreende os seguintes elementos ligados operativamente: (a) um promotor de transcrição; (b) um segmento de ADN que codifica um polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido que é pelo menos 90 % idêntica aos resíduos 38 (Vai) a 152 (Leu) como é mostrado na SEQ ID NO: 2; e (c) um terminador da transcrição. Numa forma de realização, o vector de expressão é como foi revelado anteriormente, que compreende os seguintes elementos ligados operativamente: (a) um promotor de transcrição; (b) um segmento de ADN que codifica um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 38 (Vai) a 152 (Leu) da SEQ ID NO: 2; e (c) um terminador da transcrição. 139

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva proporciona uma célula cultivada que compreende o vector de expressão como foi revelado anteriormente.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve um método para produzir uma proteína que compreende: cultivar uma célula como foi revelado anteriormente em condições nas quais é expresso o segmento de ADN; e recuperar a proteína codificada pelo segmento de ADN. número 24 polipéptido

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve um método para produzir um anticorpo contra um polipéptido zyctorl71ig que compreende: inocular um animal com um polipéptido seleccionado do grupo que consiste em: (a) um polipéptido que consiste em 9 a 141 aminoácidos, em que polipéptido é idêntico a uma sequência contígua de resíduos de aminoácido na SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido (Ser) ao aminoácido número 164 (Thr); um como foi revelado anteriormente; (c) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 desde a aminoácido número 38-52; (d) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido número 83-98; (e) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido número 104-117; (f) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido número 137-152; (g) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido número 38-152; (h) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da um da um da um da SEQ ID NO: 2 desde o aminoácido número 24-164; (c) polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11 desde o aminoácido número 38-52; (d) polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11 desde o aminoácido número 85-98; (e) polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos 140 SEQ ID NO: 11 desde o aminoácido número 104-118; (f) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 desde o aminoácido número 141-157; (g) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 desde o aminoácido número 38-157; (h) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11 desde o aminoácido número 24-163; (i) um polipéptido que compreende um epitopo antigénico de acordo com o perfil de hidrofilicidade de Hopp/Woods da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11, em que o perfil é baseado numa janela de seis resíduos deslizantes, os resíduos G, S e T ocultos e os resíduos Η, E e W expostos ignorados; e em que o polipéptido induz uma resposta imune no animal para produzir o anticorpo; e isolar o anticorpo a partir do animal.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve um anticorpo (por exemplo, anticorpo neutralizador) produzido pelo método revelado anteriormente, em que o anticorpo se liga a um polipéptido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11. Numa forma de realização, o anticorpo revelado anteriormente liga-se especificamente a um polipéptido mostrado na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 11.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a estimulação de uma resposta imune num mamífero exposto a um antigénio ou patogénio, que compreende as etapas de: (1) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio presente em dito mamífero; (2) administrar uma composição que compreende polipéptido zyctorl71ig num veículo farmaceuticamente aceitável; (3) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio em dito mamífero; e (4) comparar o nível do antigénio ou patogénio da etapa 1 com o nível de antigénio ou patogénio da etapa 3, em que uma mudança no nível é indicativa da estimulação de uma resposta imune. Numa forma de realização, o método para estimular uma 141 resposta imune num mamífero revelado anteriormente compreende além disso: (5) volver a administrar uma composição que compreende polipéptido zyctorl71ig num veículo farmaceuticamente aceitável; (6) determinar directamente ou indirectamente o nível de antigénio ou patogénio em dito mamífero; e; (7) comparar o número de nível de antigénio ou patogénio da etapa 1 com o nível de antigénio da etapa 6, em que uma mudança no nível é indicativa de estimulação de uma resposta imune.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a expansão de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas que compreende cultivar medula óssea ou células de sangue periférico com uma composição que compreende uma quantidade de zyctorl71ig suficiente para produzir um aumento no número de células linfóides na medula óssea ou células de sangue periférico em comparação com a medula óssea ou células de sangue periférico cultivadas na ausência de zyctorl71ig. Numa forma de realização, o método para a expansão de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas é como foi revelado anteriormente, em que as células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas são células linfóides. Em outra forma de realização, o método para a expansão de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas é como foi revelado anteriormente, em que as células linfóides são células monocíticas, macrófagos ou linfócitos T.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a estimulação de uma resposta imune num mamífero exposto a um antigénio ou patogénio, que compreende: (1) determinar o nível de um anticorpo específico de antigénio ou patogénio; (2) administrar uma composição que compreende polipéptido zyctorl71ig num veículo farmaceuticamente aceitável; (3) determinar o nível depois da administração de anticorpo específico de antigénio ou patogénio; (4) 142 comparar o nível de anticorpo na etapa (1) com o nível de anticorpo na etapa (3), em que um aumento no nível de anticorpo é indicativo de estimulação de uma resposta imune.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a detecção da presença de ARN de zyctorl71ig numa amostra biológica, que compreende as etapas de: (a) colocar em contacto uma sonda de ácido nucleico de zyctorl71ig em condições de hibridação com (i) moléculas de ARN de ensaio isoladas a partir da amostra biológica, ou (ii) moléculas de ácido nucleico sintetizadas a partir das moléculas de ARN isoladas, em que a sonda tem uma sequência de nucleótidos que compreende uma parte da sequência de nucleótidos da molécula de ácido nucleico revelada anteriormente, ou seu complemento e (b) detectar a formação de híbridos da sonda de ácido nucleico e as moléculas de ARN de ensaio ou as moléculas de ácido nucleico sintetizadas, em que a presença dos híbridos indica a presença de ARN de zyctorl71ig na amostra biológica.

Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método in vitro para detectar a presença de polipéptido zyctorl71ig que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2 numa amostra biológica, que compreende as etapas de: (a) colocar em contacto a amostra biológica com um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo como é revelado nas reivindicações, em que o contacto se realiza em condições que permitem a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo à amostra biológica e (b) detectar qualquer anticorpo ligado ou fragmento de anticorpo ligado.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a destruição de células cancerosas que compreende obter ex vivo um tecido ou amostra biológica que contém células cancerosas a partir de um paciente, ou identificar as células cancerosas in vivo; produzir um polipéptido pelo método revelado no presente documento; formular o 143 polipéptido num veículo farmaceuticamente aceitável; e administrar ao paciente ou expor as células cancerosas ao polipéptido; em que o polipéptido destrui às células. Numa forma de realização, o método de destruição de células cancerosas é como foi revelado anteriormente, em que polipéptido se conjuga adicionalmente com uma toxina. Numa forma de realização, o anticorpo é como foi revelado anteriormente, em que o anticorpo se selecciona entre o grupo que consiste em: (a) anticorpo policlonal, (b) anticorpo monoclonal murino, (c) anticorpo humanizado derivado de (b), (d) um fragmento de anticorpo e (e) anticorpo monoclonal humano.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a um polipéptido que compreende uma sequência de resíduos de aminoácido seleccionada do grupo que consiste em: (a) o polipéptido mostrado desde o resíduo 38 (Vai) ao 152 (Leu) como é mostrado na SEQ ID NO: 2: (b) o polipéptido mostrado desde o resíduo 27 (Leu) ao 164 (Thr) como é mostrado na SEQ ID NO: 2; (c) o polipéptido mostrado desde o resíduo 2 4 (Thr) ao 164 (Thr) como é mostrado na SEQ ID NO: 2; e (d) o polipéptido mostrado desde o resíduo 1 (Met) ao 164 (Thr) como é mostrado na SEQ ID NO: 2. Em outra forma de realização, o anticorpo é como foi revelado anteriormente, em que o anticorpo compreende além disso um radionuclídeo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, marcador peptídico, partícula magnética, fármaco ou toxina.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a inibição da proliferação ou diferenciação induzida por zyctorl71ig de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas, que compreende cultivar medula óssea ou células de sangue periférico com uma composição que compreende uma quantidade de um anticorpo como foi revelado no presente documento 144 suficiente para reduzir a proliferação ou diferenciação das células hematopoiéticas na medula óssea ou células de sangue periférico em comparação com a medula óssea ou células de sangue periférico cultivadas na ausência de receptores de citocinas solúveis. Numa forma de realização, o método para inibir a proliferação ou diferenciação induzida por zyctorl71ig de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas é como foi revelado anteriormente, em que as células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas são células linfóides. Em outra forma de realização, o método para inibir a proliferação ou diferenciação induzida por zyctorl71ig de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas é como foi revelado anteriormente, em que as células linfóides são macrófagos ou linfócitos T.

Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo para utilização na redução da inflamação induzida por um polipéptido que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2.

Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo como é definido nas reivindicações para utilização num método para suprimir uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação, compreendendo dito método: (1) determinar o nível de uma molécula inflamatória; (2) administrar uma composição que compreende o anticorpo num veículo farmacêutico aceitável; (3) determinar o nível da molécula inflamatória depois da administração; (4) comparar o nível da molécula inflamatória na etapa de (1) com o nível da molécula inflamatória na etapa (3), em que a ausência de um aumento ou uma redução do nível da molécula inflamatória é indicativa de supressão da resposta inflamatória. Numa forma de realização, o anticorpo é como é definido nas reivindicações, nas quais o anticorpo compreende além disso 145 um radionuclídeo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, marcador peptídico, partícula magnética, fármaco ou toxina.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a inibição da proliferação ou diferenciação induzida por zyctorl71ig de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas, que compreende cultivar medula óssea ou células de sangue periférico com uma composição que compreende uma quantidade de um anticorpo como é revelado no presente documento suficiente para reduzir a proliferação ou diferenciação das células hematopoiéticas na medula óssea ou células de sangue periférico em comparação com a medula óssea ou células de sangue periférico cultivadas na ausência do receptor de citocinas solúvel. Numa forma de realização, o método para inibir a proliferação ou diferenciação induzida por zyctorl71ig de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas é como foi revelado anteriormente, em que as células hematopoiéticas e células progenitoras hematopoiéticas são células linfóides. Em outra forma de realização, o método para inibir a proliferação ou diferenciação induzida por zyctorl71ig de células hematopoiéticas e progenitores de células hematopoiéticas é como foi revelado anteriormente, em que as células linfóides são macrófagos ou linfócitos T.

Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo como é definido nas reivindicações para utilização na redução da inflamação induzida por um polipéptido que compreende os resíduos 31-163 da SEQ ID NO: 11.

Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo como é definido nas reivindicações para utilização num método para suprimir uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação, compreendendo dito método: (1) determinar o nível de uma molécula 146 inflamatória; (2) administrar uma composição que compreende o anticorpo num veículo farmacêutico aceitável; (3) determinar o nível da molécula inflamatória depois da administração; (4) comparar o nível da molécula inflamatória na etapa (1) com o nível da molécula inflamatória na etapa (3), em que a ausência de um aumento ou uma redução do nível da molécula inflamatória é indicativa de supressão da resposta inflamatória.

Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo ou fragmento de anticorpo como é definido nas reivindicações para utilização no tratamento de um mamífero que padece uma doença inflamatória em que intervém zyctorl71ig, em que o antagonista é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente a um polipéptido que compreende os resíduos 27-164 da SEQ ID NO: 2 ou os resíduos 31-163 da SEQ ID NO: 11. Numa forma de realização, a doença é uma doença inflamatória crónica, tal como uma doença inflamatória crónica seleccionada do grupo que consiste em: doença inflamatória do intestino; colite ulcerosa; doença de Crohn; dermatite atópica; eczema; e psoríase. Em outra forma de realização, a doença é uma doença inflamatória aguda tal como uma doença inflamatória aguda seleccionada do grupo que consiste em endotoxemia, septicemia, síndrome de choque tóxico e doença infecciosa. Em outra forma de realização, o anticorpo compreende além disso um radionuclídeo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, marcador peptídico, partícula magnética, fármaco ou toxina.

Dentro de outro aspecto, a presente invenção proporciona um método in vitro para detectar a inflamação num paciente, que compreende: incubar um tecido ou amostra biológica de um paciente com um anticorpo como é definido nas reivindicações em condições nas quais o anticorpo se liga ao seu polipéptido complementar num tecido ou amostra biológica; visualizar o anticorpo ligado ao tecido ou 147 amostra biológica; e comparar os níveis de anticorpo ligado ao tecido ou amostra biológica do paciente com uma amostra biológica ou tecido de controlo normal, em que um aumento no nível de anticorpo ligado ao tecido ou amostra biológica do paciente com respeito ao tecido ou amostra biológica normal é indicativo de inflamação no paciente.

Dentro de outro aspecto, a presente memória descritiva descreve a detecção de inflamação num paciente, que compreende: obter um tecido ou amostra biológica de um paciente; marcar um polinucleótido que compreende pelo menos 14 nucleótidos contíguos da SEQ ID NO: 1 ou o complemento da SEQ ID NO: 1; incubar o tecido ou amostra biológica em condições nas quais o polinucleótido hibridará com uma sequência polinucleotídica complementar; visualizar o polinucleótido marcado no tecido ou amostra biológica; e comparar o nível de hibridação do polinucleótido marcado no tecido ou amostra biológica do paciente com um tecido ou amostra biológica de controlo normal, em que um aumento na hibridação do polinucleótido marcado no tecido ou amostra biológica do paciente com respeito ao tecido ou amostra biológica de controlo normal é indicativo de inflamação no paciente. A invenção é ilustrada adicionalmente por meio dos seguintes exemplos não limitantes. EXEMPLOS Exemplo 1

Construção de Quimera de polipéptido de MPL-zcytorl7: MPL

Extracelular e Domínio TM Fusionado ao Domínio de sinalização Intracelular zcytorl7 0 domínio extracelular 5' do receptor de MPL murino foi isolado a partir de um plasmídeo que contém o receptor de MPL murino (plasmídeo PHZ1/MPL) por meio de digestão com EcoRI e BamHI gerando um fragmento de 1164 pb. A digestão foi executada num gel de agarose a 1 % e o fragmento foi isolado utilizando o kit de extracção por gel Qiaquick 148 (Qiagen) segunda as instruções do fabricante. 0 resto do domínio extracelular de MPL e domínio transmembranar foram gerados utilizando PCR com iniciadores ZC6,673 (SEQ ID NO: 13) e ZC29, 082 (SEQ ID NO: 14). As condições de reacção foram como segue: 15 ciclos a 94 °C durante 1 min., 55 °C durante 1 min., 72 °C durante 2 min.; seguido por 72 °C durante 7 min.; depois um imersão a 4 °C. 0 produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1 % e o fragmento de receptor MPL de aproximadamente 400 pb foi isolado utilizando kit de extracção por gel Qiaquick™ (Qiagen) segundo as instruções do fabricante. O domínio intracelular de zcytorl7 humano foi isolado de um plasmídeo que contém ADNc de receptor zcytorl7 (#23/pCAP) utilizando PCR com iniciadores ZC29,083 (SEQ ID NO: 15) e ZC29,145 (SEQ ID NO: 16). A sequência de polinucleótido que corresponde à sequência codificante de receptor zcytorl7 é mostrada em SEQ ID NO: 5. As condições de reacção foram como definidas anteriormente. O produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1 % e o fragmento de zcytorl7 de aproximadamente 320 pb foi isolado utilizando kit de extracção por gel Qiaquick segundo as instruções do fabricante.

Cada um dos fragmentos de PCR isolados descritos anteriormente foi misturado a uma razão volumétrica de 1:1 e utilizado numa reacção de PCR utilizando ZC6673 (SEQ ID NO: 13) e ZC29145 (SEQ ID NO: 16) para criar tudo, menos a porção 5' de MPL da quimera de MPL-zcytor17. As condições de reacção foram como segue: 15 ciclos a 94 °C durante 1 min., 55 °C durante 1 min., 72 °C durante 2 min.; seguido por 72 °C durante 7 min.; depois um imersão a 4 °C. Todo o produto de PCR foi corrido num gel de agarose a 1 % e o fragmento de quimera de MPL-zcytorl7 de aproximadamente 700 pb foi isolado utilizando o kit de extracção por gel Qiaquick (Qiagen) segundo as instruções do fabricante. O Fragmento de quimera MPL-zcytorl7 foi digerido com BamHI 149 (BRL) e Xbal (Boerhinger Mannheim) segundo as instruções do fabricante. Todo o material digerido foi corrido num gel de agarose a 1 % e a quimera MPL-zcytorl7 clivada foi isolada utilizando o kit de extracção por gel Qiaquick™ (Qiagen) segundo as instruções do fabricante. A quimera MPL-zcytorl7 clivada mais fragmento 5' de EcoRI/BamHI de MPL descritos anteriormente foram inseridos num vector de expressão para gerar o receptor quimérico de MPL-zcytorl7 completo como se descreve a seguir. 0 vector de expressão recipiente pZP-7 foi digerido com EcoRI (BRL) e Xbal (BRL) segundo as instruções do fabricante, e purificado por gel como foi descrito anteriormente. Este fragmento de vector foi combinado com a quimera de PCR MPL-zcytorl7 clivado com EcoRI e Xbal isolada anteriormente e o fragmento 5' de MPL de EcoRI e BamHI isolado anteriormente numa reacção de ligação. A ligação foi executada utilizando T4 Ligase (Epicentre Technologies), a temperatura ambiente durante 1 hora segundo as instruções do fabricante. Uma amostra da ligação foi electroporada em células de E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAX™ (25 mF, 200 Ω, 1,8 V). Transf ormantes foram plaqueados em placas de LB + Ampicilina e as colónias isoladas foram rastreadas por meio de miniprep (Qiagen) e digestão com EcoRI para verificar para a presença da quimera MPL-zcytor17. A digestão com EcoRI de clones correctos rendeu aproximadamente um fragmento de 2 kb. A confirmação da sequência de quimera MPL-zcytorl7 foi feita por análises de sequência. O inserto era de aproximadamente 3,1 kb, e era de comprimento completo.

Exemplo 2

Proliferação à base de Quimera MPL-zcytorl7 em ensaio de BAF3 Utilizando Alamar Blue A. Construção de Células BaF3 que expressam quimera MPL-zcytorl7 150

BaF3, uma linha de células pré-linfóide dependente de interleucina-3 derivado de medula óssea murina (Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et ai., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986) foi mantida em meio completo (Meio RPMI, JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado com 10 % de soro fetal de bezerro inactivado por calor, 1-2 ng/ml de IL-3 murina (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), 2 mM de L-glutaMax-1™ (Gibco BRL), 1 mM de Piruvato de sódio (Gibco BRL), e antibiótico PSN (GIBCO BRL) ) . Antes da electroporação, ADN de plasmideo de pZP-7/MPL-zcytorl7 (Exemplo 1) foi preparado e purificado utilizando um kit Qiagen Maxi Prep (Qiagen) segundo as instruções do fabricante. Células BaF3 para electroporação foram lavadas duas vezes em Meio RPMI e depois ressuspensas em Meio RPMI a uma densidade celular de 107 células/ml. Um ml de células BaF3 ressuspensas foi misturado com 30 mg do ADN de plasmideo de pZP-7/MPL-zcytorl7 e transferido a câmaras de electroporação descartáveis separadas (GIBCO BRL) . A temperatura ambiente, foram dados às células 5 x choques de 1 mseg a 800 volts seguido por 5 x choques de 2 ms a 600 volts distribuídos por um aparelho de electroporação (Cyto-Pulse). Alternativamente, células foram electroporadas com dois pulsos em série (800 pFAD/300 V; seguido por 1180 pFAD/300 V) distribuídos por um aparelho de electroporação Cell-Porator (GibcoBRL). As células electroporadas foram transferidas para 50 ml de meio completo e colocadas numa incubadora durante 15-24 horas (37 °C, 5 % de CO2) . Depois, solução de Geneticin™ (Gibco) (1 mg/ml G418) foi adicionada às células num balão T-162 para isolar o agrupamento resistente a G-418. Agrupamentos das células BaF3 transfectadas, a seguir no presente documento denominados células BaF3/MPL-zcytorl7, foram testadas para capacidade de sinalização como é descrito a seguir. 151 B. Teste da capacidade de sinalização das células BaF3/MPL-zcytorl7 utilizando um Ensaio de proliferação Alamar Blue Células BaF3/MPL-zcytor17 foram precipitadas por centrifugação e lavadas nos meios completos, descritos anteriormente, mas sem mIL-3 (a seguir no presente documento denominado como "meios livres de mIL-3"). As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada do mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 ml por poço utilizando os meios livres de mIL-3. A proliferação das células BaF3/MPL-zcytorl7 foi avaliada utilizando trombopoietina murina (mTPO) diluída com meios livres de mIL-3 a concentrações de 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,1 ng/ml, 1,5 ng/ml. Cem microlitros da mTPO diluído foram adicionados às células BaF3/MPL-zcytorl7. O volume de ensaio total foi 200 ml. Controlos negativos foram executados em paralelo utilizando meios livres de mIL-3 somente, sem a adição de mTPO. As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 durante 3 dias em cujo tempo Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) foi adicionado a 20 ml/poço. Alamar Blue dá uma leitura fluorométrica com base na actividade de células de células, e é assim uma medida directa da proliferação celular em comparação com um controlo negativo. Placas foram incubadas de novo a 37 "C, 5 % de CO2 durante 24 horas. Placas foram lidas no leitor de placa Fmax™ (Molecular Devices Sunnyvale, CA) utilizando o programa SoftMax™ Pro, a comprimentos de onda de 544 (Excitação) e 590 (Emissão), ou um leitor de placa Wallac Victor 2 (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA).

Os resultados confirmaram a capacidade de sinalização da porção intracelular do receptor zcytorl7, como a proliferação induzida por trombopoietina a aproximadamente 152 9-13 vezes sobre um fundo a concentrações de mTPO de 50 ng/ml e superior.

Exemplo 3

Construção de Vector de expressão que expressa zcytorl7: pZp7pX/zcytorl7 de comprimento completo A. Clonaqem de ADNc de zcytorl7 de comprimento completo para expressão:

Para obter um ADNc zcytorl7 de comprimento completo, produtos de PCR 5' e 3' foram isolados e unidos utilizando um local PstI interno. Os iniciadores de PCR foram desenhados utilizando a sequência de nucleótidos SEQ ID NO: 4 e incluem locais de restrição BamHI e Xho I para propósitos de clonagem.

Um produto de PCR 5' foi gerado utilizando uma biblioteca de ADNc WI-38 como um molde e oligonucleótidos ZC29,359 (SEQ ID NO: 18) e ZC27, 899 (SEQ ID NO: 19) como

iniciadores. WI-38 é uma biblioteca de ADNc interna gerada a partir de uma linha de células embrionárias de pulmão humanas (ATCC CRL-2221). Esta reacção de PCR 5' foi executada como segue: 30 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 65 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 2 minutos, depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reacção de PCR utilizou aproximadamente 3 mg de plasmideos preparados a partir da biblioteca de ADNc, 20 pmoles de cada oligonucleótido, e cinco unidades de PWO ADN polimerase (Roche) . Aproximadamente 9 0 % do produto de PCR 5' foi precipitado com etanol, digerido com BamHI e PstI e purificado em gel num gel de agarose a 1,0 %. A banda de aproximadamente 600 pb foi cortada e utilizada para ligação ao vector de clonagem pUC18 digerido com BamHI e PstI. Os transformantes resultantes foram sequenciados para confirmar a sequência de ADNc de zcytorl7. Para um destes transformantes, o ADN de plasmídeo foi preparado e digerido com BamHI e PstI. A banda de aproximadamente 600 pb 153 resultante foi purificada por gel e utilizada para uma ligação abaixo para formar um ADNc de comprimento completo.

Um produto de PCR 3' foi gerado usando biblioteca de ADNc interna de testículos humanos como um molde e oligonucleótidos ZC27,895 (SEQ ID NO: 20) e ZC29,122 (SEQ ID NO: 21) como iniciadores. Esta reacção de PCR 3' foi executada como segue: 30 ciclos a 94° C durante 45 segundos, 65 °C durante 45 segundos, 72 "C durante 2 minutos, depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. Toda a reacção de PCR 3' foi purificada por gel num gel de agarose a 1,0 % e a banda principal de 1500 pb foi cortada. Esta banda foi clonada no vector PCRBIuntIITOPO utilizando o kit Zeroblunt TOPO (Invitrogen). Os transformantes resultantes foram sequenciados para confirmar a sequência de ADNc de zcytorl7. Para um destes transformantes, o ADN de plasmídeo foi preparado e digerido com PstI e Xhol. A banda resultante de aproximadamente 1500 pb foi purificada por gel. Uma ligação de três partes foi realizada com o fragmento 5' BamHI a Pst I anterior, o fragmento 3' PstI a Xhol, e o vector de expressão pZp7pX digerido com BamHI e Xhol. Isto gerou um plasmídeo pZp7pX que contém um ADNc de comprimento completo para zcytorl7 (SEQ ID NO: 4), designado pZp7p/zcytorl7. O ADNc de zcytorl7 de comprimento completo em pZp7p/zcytorl7 tem uma mutação silenciosa que muda o T para G na posição 1888 da SEQ ID NO: 4 (que codifica um resíduo Gly no resíduo 464 da SEQ ID NO: 5) . Como esta mutação foi silenciosa, o ADNc de zcytorl7 em pZp7p/zcytor17 codifica o polipéptido como mostrado na SEQ ID NO: 5. Plasmídeo pZp7pX é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor CMV, intrão A. Múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, e um terminador de hormona de crescimento humano. O plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão seleccionável de mamífero que tem um promotor SV40, 154 potenciador e origem de replicação, um gene de resistência a puromicina e o terminador SV40. B. Construção de Vector de expressão que expressa WSX-1 de comprimento completo

Todo o receptor WSX-1 (SEQ ID NO: 9) foi isolado a partir de um plasmideo que contém o ADNc de receptor de WSX-1 (SEQ ID NO: 8) (Patente U.S. n° 5.925.735). hWSX-1/pBluescript SK(+) ADN de plasmideo (Stratagene, La Jolla, CA) foi digerido com EcoRI e Xhol para gerar um fragmento de 1075 pb, e também digerido com Xhol e Xbal para gerar um fragmento de 900 pb. Ambos os materiais digeridos foram corridos num gel de agarose a 1 % e os fragmentos de WSX-1 clivados foram isolados. O vector de expressão recipiente pZp7Z foi digerido com EcoRI e Xbal e purificado por gel como foi descrito anteriormente. Este fragmento de vector foi combinado com os dois fragmentos de zcytorl7 clivados isolados anteriormente numa reacção de ligação utilizando T4 Ligase (BRL). A ligação foi incubada a temperatura ambiente durante a noite. Uma amostra da ligação foi electroporada em células de E. colí electrocompetentes DH10B electroMAX™ (25 mF, 200 Ω, 2,3 V). Cresceram-se seis colónias em cultura e ADN miniprep foi preparado e digerido para confirmar o inserto WSX-1 de comprimento completo correto de 2,0 kb. O plasmideo resultante é pZPZ7Z/WSX-l.

Exemplo 4

Proliferação à base de Zcytorl7 em Ensaio de BAF3 utilizando Alamar Blue

A. Construção de Células BAF3 que expressam receptor de zcytorl7, receptor de WSX-1 e OSMR Células BaF3 que expressam o receptor de zcytorl7 de comprimento completo foram construídas como no Exemplo 2A anterior, utilizando 30 mg do vector de expressão de zcytorl7, descritos no Exemplo 3A. Uma excepção é que em 155 lugar de selecção de Geneticina, 2 mg/ml de Puromicina (ClonTech) foram adicionados às células transfectadas num balão T-162 para isolar o agrupamento resistente a puromicina. As células BaF3 que expressam o ARNm de receptor zcytorl7 foram designadas como BaF3/zcytor17. Para obter clones, as células Baf3/zcytorl7 foram contadas num hemocitómetro e inoculadas em placa a 1 célula/poço, 0,5 célula/poço, 0,1 célula/poço, e 0,01 célula/ poço em placas de 96 poços. Quinze clones foram aumentados em escapa em balões T75, e cinco clones foram ensaiados para expressão de zcytorl7. O ARN Total foi isolado de precipitados de células utilizando um Kit de Isolamento de ARN total S.N.A.P.™ (InVitrogen). ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit RT-PCR de primeira cadeia proSTAR™, e depois PCR com iniciadores específicos de zcytorl7 ZC29, 180 (SEQ ID NO: 22) e ZC29,122 (SEQ ID NO: 23) foi realizado para rastrear os clones para expressão de zcytorl7. Um clone, BaF3/zcytorl7#15 foi escolhido para expandir e transfectar com o vector de expressão WSX-1. Células BaF3 que expressam zcytorl7 e WSX-1 de comprimento completo foram construídas como por Exemplo 2A anterior, utilizando 30 pg do vector de expressão de WSX-1 WSX-l/pZp7Z (Exemplo 3B) para electroporar as células BaF3/zcytorl7#15. Uma excepção é que em lugar de selecção com Geneticina, 200 mg/ml de Zeocina (InVitrogen) foram adicionados às células transfectadas num balão T-162 para isolar o agrupamento resistente a zeocina. As células BaF3 que expressam zcytorl7 e WSX-1 foram designadas BaF3/zcytorl7/hWSX-l. Para obter clones, agrupamentos de células Baf3/zcytorl7/hWSX-l foram inoculadas em placa a diluição limitante em placas de 96 poços. Os clones resultantes foram expandidos e ARN total foi isolado utilizando um Kit de Isolamento de ARN total S.N.A.P.™ (InVitrogen). ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit de RT-PCR de primeira cadeia proSTAR™, e 156 depois PCR com iniciadores específicos de WSX-1 ZC9791 (SEQ ID NO: 24) e ZC9793 (SEQ ID NO: 25) foi utilizado para rastrear os clones para a expressão de WSX-1. Um clone, BaF3/zcytorl7/hWSX-l#5 foi escolhido para expandir ainda e transfectar com o vector de expressão OS-MRbeta. Células BaF3 que expressam zcytorl7, WSX-1 e OSMRbeta de comprimento completo foram construídas como pelo Exemplo 2A anterior, utilizando 30 ug do vector de expressão de OSMRbeta OSMR/pZp7NX como é descrito no Exemplo 29 para electroporar as células BaF3/zcytorl7/hWSX-l#5. As células BaF3 que expressam ARNm de zcytorl7, WSX-1, e OSMRbeta foram designadas BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMR. Para obter clones, agrupamentos de células BaF3/zcytorl7/WSX-1/OSMRbeta foram inoculadas em placa a diluição limitante em placas de 96 poços. Clones individuais foram expandidos e o ARN total foi isolado utilizando um Kit de Isolamento de ARN total S.N.A.P.™ (InVitrogen). ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit de RT-PCR de primeira cadeia proSTAR™, e depois PCR com iniciadores específicos de OSMRbeta ZC40109 (SEQ ID NO: 26) e ZC40112 (SEQ ID NO: 27) foi utilizado para rastrear os clones para a expressão de zcytorl7, WSX-1, e OSMR. Um clone, BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMR#5 foi seleccionado e estas células foram utilizadas para rastrear para zcytorl71ig como é descrito a seguir no Exemplos 5 e 6.

B. Construção de Células BAF3 Que expressam receptor de zcytorl7 e OSMR Células BaF3 que expressam o receptor de zcytorl7 de comprimento completo foram construídas como para o Exemplo 2A anterior, utilizando, 30 pg do vector de expressão zcytorl7, descritos no Exemplo 3A. Uma excepção é que em lugar de celecção com Geneticina, 2 ug/ml de Puromicina (ClonTech) foram adicionados às células transfectadas num balão T-162 para isolar o agrupamento resistente a puromicina. As células BaF3 que expressam o ARNm de 157 receptor de zcytorl7 foram designadas como BaF3/zcytorl7. Para obter clones, agrupamentos de células Baf3/zcytorl7 foram inoculadas em placa a diluição limitante em placas de 96 poços. Estes clones foram expandidos em cultura e o ARN total foi isolado utilizando um Kit de Isolamento de ARN total S.N.A.P.™ (Invitrogen). ADNc de primeira cadeia foi sintetizado utilizando o kit de RT-PCR de primeira cadeia proSTAR™, e depois PCR foi utilizado para rastrear os clones para a expressão de zcytorl7. Um clone, BaF3/zcytorl7 #15 foi escolhido para expandir e transfectar com o vector de expressão OSMRbeta. Células BaF3 que expressam zcytorl7 e OSMRbeta de comprimento completo foram construídas como pelo Exemplo 2A anterior, utilizando 30 ug de the OSMRbeta vector de expressão OSMR/pZp7NX (Exemplo 29) para electroporar the BaF3/zcytorl7#15 células. As células BaF3 que expressam zcytorl7 e ARNm OSMRbeta foram designados BaF3/zcytorl7/OSMR. Estas células foram utilizadas para rastrear para zcytorl71ig Exemplo 5. Exemplo 5 como é descrito a seguir no Rastreio para zcytorl71iq utilizando células BaF3/Zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta utilizando um Ensaio de proliferação Alamar Blue A. Activação de CCRF-CEM e CCRF-HSB2 células para testar para presença de zcytorl71ig Células CCRF-CEM e CCRF- -HSB2 foram obtidas a partir de ATCC e estimuladas em cultura para produzir meios condicionados para testar para a presença de actividade de zcytorl71ig como é descrito a seguir. As células em suspensão foram semeadas a 2 x 105 células/ml ou 5 x 105 células/ml em Meios RPMI-1640 suplementados com 10 % de FBS, 2 mM de L-glutamina (GibcoBRL), IX PSN (GibcoBRL), e activadas com 10 ng/ml de Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (Calbiochern, San Diego, CA) e 0,5 ug/ml de 158

Ionomycin™ (Calbiochem) durante 24 ou 48 h. 0 sobrenadante das células estimuladas foi utilizado para ensaiar proliferação das células BaF3/zcytorl7/WSX-I/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta como é descrito a seguir. B. Rastreio para zcytorl71ig utilizando células BaF3/Zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta utilizando um Ensaio de proliferação Alamar Blue Células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta foram precipitadas por centrifugação e lavadas em meios livres de mIL-3. As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada do mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 ml por poço utilizando os meios livres de mIL-3. A proliferação das células BaF3/zcytorl7/WSX-1/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta foi avaliada utilizando meios condicionados das activadas células CCRFCEM e CCRF-HSB2 (veja-se o Exemplo 5A) . Meios condicionados foram diluídos com meios livres de mIL-3 a concentrações de 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 %, e 0,375 %. Cem microlitros dos meios condicionados diluídos foram adicionados às células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta. O volume de ensaio total foi 200 ml. As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 durante 3-5 dias em cujo tempo Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) foi adicionado a 20 ml/poço. As placas foram incubadas de novo a 37 °C, 5 % de C02 durante 24 horas. As placas foram lidas no leitor de placa Fmax™ (Molecular Devices) como foi descrito anteriormente (Exemplo 2).

Os resultados confirmaram a resposta proliferativa das células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcyorl7/OSMRbeta a um factor presente nos meios 159 condicionados CCRF-CEM e CCRF-HSB2 activados. A resposta, como foi medido, foi aproximadamente 10 vezes sobre um fundo à concentração de 25 %. As células BaF3 não transfectadas não proliferam em resposta a este factor, nem as células BaF3 transfectadas com zcytorl7 e WSX-1 (células BaF3/zcytorl7/WXS-l), mostrando que este factor foi especifico para receptores Zcytorl7/OSMRbeta ou zcytorl7/OSMRbeta/WSX-l. Além disso, receptor de zcytorl7 solúvel diminuiu sua actividade proliferativa de zcytorl71ig nas células BaF3/zcytorl7/WSX-I/OSMRbeta (veja-se o Exemplo 11). Resultados similares são esperados em células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta. C. Fonte primária humana utilizada para isolar zcytorl71iq

Colheitas de sangue de cem mililitros foram tomadas de cada um de seis dadores. O sangue foi colhido utilizando 10 X tubos vacutainer de 10 ml que contém heparina. O sangue foi agrupado de seis dadores (600 ml), diluído 1:1 em PBS, e separado utilizando um Ficoll-Plaque® PLUS (Pharmacia Biotech). O rendimento de células humanas primárias isoladas após a separação no gradiente de ficoll foi de 1,2 X 109 células.

As células foram suspensas em 9,6 ml de tampão MACS (PBS, 0,5 % de EDTA, 2 mM de EDTA). 1,6 ml de suspensão de células foram retirados e 0,4 ml de micropérolas CD3 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) adicionados. A mistura foi incubada durante 15 min. A 4 °C. Estas células marcadas com pérolas CD3 foram lavadas com 30 ml de tampão MACS, e depois ressuspensas em 2 ml de tampão MACS.

Uma coluna VS+ (Miltenyi) foi preparada de acordo com as instruções do fabricante. A coluna VS+ foi depois colocada num campo magnético VarioMACS™ (Miltenyi). A coluna foi equilibrada com 5 ml de tampão MACS. As células humanas primária isoladas foram depois aplicadas à coluna. As células CD3 negativas foram deixadas que passassem através. A coluna foi enxaguada com 9 ml (3X3 ml) de 160 tampão MACS. A coluna foi depois retirada do imã e colocada sobre um tube falcon de 15 ml. As células CD3+ foram eluídas pela adição de 5 ml de tampão MACS à coluna e células ligadas retiradas com jacto utilizando o êmbolo proporcionado pelo fabricante. A incubação das células com a pérolas magnéticas de CD3, lavagens, e etapas em coluna VS+ (incubação através de eluição) anteriores foram repetidas mais cinco vezes. As fracções CD3+ resultantes das seis separações em coluna foram agrupadas. O rendimento de Células humanas seleccionadas CD3+ foram 3 X 108 células totais.

Uma amostra das células humanas seleccionadas CD3+ agrupadas foi retirada para coloração e separação num separação de células e anticorpo por fluorescência (FACS) para avaliar sua pureza. As células CD3+ humanas seleccionadas foram 91 % de células CD3+.

As células CD3+ humanas seleccionadas foram activadas por incubação em RPMI + 5 % de FBS + PMA 10 ng/ml e ionomicina 0,5 mg/ml (Calbiochem) durante 13 horas a 37 °C. O sobrenadante destas células humanas seleccionadas CD3+ activadas foi testado para actividade de zcytorl71ig como é descrito a seguir. Além disso, as células humanas seleccionadas CD3+ activadas foram utilizadas para preparar uma biblioteca de ADNc, como é descrito no Exemplo 6, a seguir. D. Teste do sobrenadante a partir de células humanas seleccionadas CD3+ activadas para zcytorl71ig utilizando células BaF3/Zcytorl7/WSX-l/OS-MRbeta e um ensaio de proliferação Alamar Blue Células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou BaF3/zcytorl7/OSMRbeta foram precipitadas por centrifugação e lavadas em meios livres de mIL-3. As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada da mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num 161 formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 ml por poço utilizando os meios livres de mIL-3. A proliferação das células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta foram avaliadas utilizando meios condicionados a partir de células humanas seleccionadas CD3+ activadas (veja-se Exemplo 5C) diluída com meios livres de mIL-3 a concentrações de 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 %, 0,375 % e 0,187 %. Cem microlitros dos meios condicionados diluídos foram adicionados às células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta. O volume de ensaio total foi 200 ml. As placas de ensaio foram incubadas e ensaiadas como foi descrito no Exemplo 5B.

Os resultados confirmaram a resposta proliferativa das células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células

BaF3/zcytorl7/OSMRbeta a um factor presente nos meios condicionados de células humanas seleccionadas CD3+ activadas. A resposta, como foi medida, foi aproximadamente 15 vezes sobre o fundo à concentração de 25 %. As células BaF3 não transfectadas não proliferam em resposta a este factor, nem a células BaF3 transfectadas com zcytorl7 e WSX-1 (células BaF3/zcytorl7/WXS-l), mostrando que este factor foi específico para receptores Z,cytorl7/OSMRbeta ou zcytorl7/OSMRbe-ta/WSX-1.

Exemplo 6

Clonaqem de zcytorl71iq humano a partir de uma biblioteca de células humanas seleccionadas CD3+ O rastreio de uma biblioteca de ADNc de células humanas seleccionadas CD3+ activadas primárias revelou um ADN isolado é que um novo membro da família de citocina de feixe de quatro hélices. Este ADNc codificou o zcytorl71ig. O ADNc foi identificado pelo rastreio para actividade do zcytorl71ig utilizando os receptores zcytorl7/WSX-l/OSM. A. O vector para construção de biblioteca seleccionada de CD3+ 162 0 vector para construção de biblioteca seleccionada de CD3+ foi pZP7NX. 0 vector pZP7NX foi construído como segue: A região codificante para o marcador selectivo DHFR no vector pZP7 foi retirado por meio de digestão de ADN com enzimas de restrição Ncol e PstI (Boehringer Mannheim). 0 ADN digerido foi corrido em gel de agarose a 1 %, cortado e purificado por gel utilizando o Kit de extracção por gel Qiagen (Qiagen) segundo as instruções do fabricante. Um fragmento de ADN que presenta a região codificante de Marcador selectivo de Zeocina foi amplificado por meio de método de PCR com iniciadores ZC13, 946 (SEQ ID NO: 28) e 013,945 (SEQ ID NO: 29), e pZeoSV2(+) como um molde. Existem locais de restrição PstI e Bell adicionais no iniciador ZC13,946 (SEQ ID NO: 28), e locais em iniciador Ncol e Sful adicionais em ZC13,945 (SEQ ID NO: 29) . 0 fragmento de PCR foi cortado com enzimas de restrição PstI e Ncol e clonado em vector pZP7 preparado por meio de clivagem com as mesmas duas enzimas e subsequente purificação em gel. Este vector foi denominado pZP7Z. Depois a região codificante de Zeocina foi retirada por meio de digestão de ADN de vector pZP7Z com enzimas de restrição Bell e Sful. O ADN digerido foi corrido em gel de agarose a 1 %, cortado e purificado por gel, e depois ligado com um fragmento de ADN de região codificante de neomicina cortado do vector pZem228 (depositado na Colecção Americana de Culturas Celulares (ATCC), Manassas, VA; n° de depósito ATCC 69446) com as mesmas enzimas de restrição (Bell e Sful).

Este novo vector foi denominado pZP7N, em que a região codificante para marcador selectivo DHFR foi recolocada pela região codificante para um marcador selectivo de Neomicina do vector pZem228. Um fragmento de preenchimento que inclui um local Xhol foi adicionado a pZP7N para criar um vector adequado para clonagem direccional de alta eficiência de ADNc; este novo vector foi denominado pZP7NX. 163

Para preparar o vector para ADNc, 20 pg de pZP7NX foi digerido com 20 unidades de EcoRl (Life Technologies Gaithersberg, MD) e 20 unidades de Xhol (Boehringer Mannheim Indianapolis, EM) durante 5 horas a 37 °C, depois 68 °C durante 15 minutos. O material digerido foi depois corrido em gel de agarose a 0,8 % de baixo ponto de fusão IXTAE para separar o preenchimento do vector. A banda de vector foi cortada e digerida com "beta-Agarase" (New England Biolabs, Beverly, MA) seguindo as recomendações do fabricante. Após a precipitação por etanol o vector digerido foi ressuspenso em água a 45 ng/ml em preparação para ligação de biblioteca de ADNc seleccionada CD3+ descrita a seguir. B. Preparação de biblioteca de células humanas seleccionadas CD3+ activadas primárias de ADNc

Aproximadamente 1,5 X 108 células CD3+ humanas seleccionadas primárias estimuladas em ionomicina/PMA foram isoladas por meio de centrifugação após cultivar a 37 °C durante 13 horas (Exemplo 5C) . ARN total foi isolado do sedimento de células utilizando o kit "RNeasy Midi" de Qiagen, Inc. (Valência, CA). O ARNm foi isolado de 225 microgramas de ARN total utilizando o "kit de purificação de ARNm MPG" de CPG Inc. (Lincoln Park, NJ) . 3,4 microgramas de ARNm foram isolados e convertidos a ADNc de cadeia dupla utilizando o seguinte procedimento. ADNc de primeira cadeia de células CD3+ humanas seleccionadas estimuladas foi sintetizado como segue. Nove μΐ de Oligo d (T)-seleccionado poli(A) CD3+ ARN numa concentração de 0,34 pg/μΐ e 1,0 μΐ de 1 pg/μΐ iniciador de primeira cadeia ZC18,698 (SEQ ID NO: 30) que contém um local de restrição Xhol foram misturados e aquecidos a 65 °C durante 4 minutos e arrefecidos por meio de resfriamento sobre gelo. A síntese de ADNc de primeira cadeia foi iniciada pela adição de 9 ml de tampão de primeira cadeia (5 x tampão SUPERSCRIPT®; (Life Technologies), 4 μΐ de 100 164 mM de ditiotreitol e 2 μΐ de uma solução de desoxinucleótido trifosfato que contém 10 mM cada de dATP, dGTP, dTTP e 5-metil-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.) à mistura ARN iniciador. A mistura de reacção foi incubada a 45 °C durante 4 minutos seguido pela adição de 8 μΐ de 200 U/μΙ SuperscriptII®, RNase H- reversa transcriptase (Life technologies). A reacção foi incubada a 45 "C durante 45 minutos seguido por uma incubação aumentando 1 °C a cada 2 minutos até 50 °C onde a reacção foi mantida durante 10 minutos. Para desnaturar qualquer estrutura secundária e permitir a extensão adicional do ADNc a reacção foi depois aquecida até 70° C durante 2 minutos depois a temperatura diminuiu até 55° C durante 4 minutos após o qual 2 μΐ de SuperscriptII®. RT foram adicionados e incubados 15 minutos adicionais seguido por um aumento até 70 °C de 1 minuto/1 °C. Os nucleótidos não incorporados foram retirados do ADNc precipitando duas vezes na presença de 2 mg de portador de glicogénio, 2,0 M acetato de amónio e 2,5 volumes de etanol, seguido por uma lavagem com 100 ml de etanol a 70 %. O ADNc foi ressuspenso em 98 ml de água para utilização em síntese da segunda cadeia.

A síntese da segunda cadeia foi realizada no ADNc de primeira cadeia sob condições que promoveram iniciação de primeira cadeia da síntese da segunda cadeia resultando em formação de grampo de cabelo de ADN. A reacção de segunda cadeia continha 98 μΐ do ADNc de primeira cadeia, 30 μΐ de 5 x tampão de polimerase I (100 mM de Tris: HC1, pH 7,5, 500 mM de KC1, 25 mM de MgCl2, 50 mM de (NH4)2S04), 2 ml de 100 mM ditiotreitol, 6 ml de uma solução que contém 10 mM de cada desoxinucleótido trifosfato, 5 μΐ de 5 mM b-NAD, 1 μΐ de 3 ϋ/μΐ de ADN ligase de E. coli (New England Biolabs Inc.) e 4 μΐ de 10 ϋ/μΐ ADN polimerase 1 de E. coli (New England Biolabs Inc.). A reacção foi montada a temperatura ambiente e foi incubada a temperatura ambiente durante 2 minutos seguidos pela adição de 4 μΐ de 3,8 ϋ/μΐ de RNase H 165 (Life Technologies). A reacção foi incubada a 15° C durante duas horas seguido por um 15 minutos de incubação a temperatura ambiente. Dez microlitros de 1 M de TRIS pH 7,4 foram adicionados à reacção e extraídos duas vezes com fenol/clorofórmio e uma vez com clorofórmio, as fases orgânicas foram depois extraídos de novo com 50 ml de TE (10 mM de TRIS pH 7,4, 1 mM de EDTA), agrupado com a outra aquosa e precipitadas com etanol na presença de 0,3 M acetato de sódio. O sedimento foi lavado com 100 ml de etanol 70 % seco ao ar e ressuspenso em 40 ml de água. 0 ADN de cadeia simples da estrutura de grampo de cabelo foi clivado utilizando nuclease de feijão mungo. A mistura de reacção continha 40 ml de ADNc de segunda cadeia, 5 ml de 10 x tampão de nuclease de feijão mungo (Life technologies) , 5 ml de nuclease de feijão mungo (Pharmacia Biotech Corp.) diluída a 1 ϋ/μΐ em 1 X tampão de nuclease de feijão mungo. A reacção foi incubada a 37 °C durante 45 minutos. A reacção foi terminada pela adição de 10 ml de 1 M de Tris: HC1, pH 7,4 seguido por extracções sequenciais de fenol/clorofórmio e clorofórmio como descritos anteriormente. Em seguida as extracções, o ADNc foi precipitado com etanol na presença de 0,3 M de acetato de sódio. O sedimento foi lavado com 100 ml de etanol a 70 % seco ao ar e ressuspenso em 38 ml de água.

As extremidades do ADNc ressuspenso foram tornadas rombas com T4 ADN polimerase. O ADNc, que foi ressuspenso em 38 μΐ de água, foi misturado com 12 μΐ 5 x tampão de T4 ADN polimerase (250 mM de TrisiHCl, pH 8,0, 250 mM de KC1, 25 mM de MgCl2) , 2 μΐ de 0,1 M ditiotreitol, 6 ml de uma solução que contém 10 mM de cada desoxinucleótido trifosfato e 2 ml de 1 U/μΙ T4 ADN polimerase (Boehringer Mannheim Corp.). Após uma incubação de 45 minutos a 15 °C, a reacção foi terminada pela adição de 30 μΐ de TE seguido por extracções sequenciais de fenol/clorofórmio e clorofórmio e extraídos de novo com 20 μΐ de TE como foi 166 descrito anteriormente. 0 ADN foi precipitado com etanol na presença de 2 μΐ de portador de Pellet Paint™ (Novagen) e 0,3 M de acetato de sódio e foi ressuspenso 11 μΐ de água.

Adaptadores de Eco RI foram ligados sobre as extremidades 5' do ADNc descrito anteriormente para permitir clonagem num vector de expressão. 11 μΐ de ADNc e 4 μΐ de 65 pmole/μΐ de adaptador Eco RI hemifosforilado (Pharmacia Biotech Corp) foram misturados com 5 μΐ 5 x de tampão de ligase (Life Technologies), 2 μΐ de 10 mM de ATP e 3 μΐ de lU/μΙ de T4 DNA ligase (Life Technologies), 1 μΐ 10 x de tampão de ligação (Promega Corp), 9 ml de água. A diluição extra com 1 X tampão foi para evitar que o Pellet Paint de precipitar. A reacção foi incubada 9 horas num banho de água a temperatura crescente desde 10 °C até 22 °C ao longo de 9 horas, seguido por 45 minutos a 25 °C. A reacção foi terminada por meio de incubação a 68 °C durante 15 minutos.

Para facilitar a clonagem direccional do ADNc num vector de expressão, o ADNc foi digerido com XhoI, resultando num ADNc que tem uma extremidade coesiva 5' Eco RI e uma extremidade coesiva 3' XhoI. O local de restrição XhoI na extremidade 3' do ADNc foi introduzido previamente utilizando o iniciador ZC18698 (SEQ ID NO: 30). A digestão com enzima de restrição foi levada a cabo numa mistura de reacção que contém 35 μΐ da mistura de ligação descrita anteriormente, 6 μΐ de 10 x tampão H (Boehringer Mannheim Corp.), 1 μΐ de 2 mg/ml BSA (Biolabs Corp.), 17 μΐ de água e 1,0 μΐ de 40 ϋ/μΐ XhoI (Boehringer Mannheim). Digestão foi levada a cabo a 37 °C durante 1 hora. A reacção foi terminada por meio de incubação a 68 °C durante 15 minutos seguido por precipitação por etanol, lavagem e secagem como foi descrito anteriormente e ressuspensão em 30 μΐ de água. O ADNc ressuspenso foi aquecido até 65° C durante 5 minutos e arrefecido sobre gelo, 4 ml de 5 X corante de carga de gel (Research Genetics Corp.) foram adicionados, o 167 ADNc foi carregado sobre um gel de agarose de baixo ponto de fusão a 0,8 % IX TAE (SEA PLAQUE GTG™ agarose de baixo ponto de fusão; FMC Corp.) e submetido a electroforese. Os adaptadores contaminantes e o ADNc inferior a 0,6 Kb em comprimento foram cortados do gel. Os eléctrodos foram revertidos, agarose fundida foi adicionada para encher os poços, o tampão foi trocado e o ADNc foi submetido a electroforese até que se concentrou próximo a origem da pista. A área do gel que contém o ADN concentrado foi cortada e colocada num tubo microfuge, e a agarose foi fundida por meio de aquecimento até 65 °C durante 15 minutos. Em seguida a equilibração da amostra até 45 °C, foram adicionados 2 μΐ de 1 U/μΙ de Bcta-agarase I (Biolabs, Inc.), e a mistura foi incubada durante 90 min. a 45 °C para digerir a agarose. Após incubação, 1 décimo volume de 3 M de acetato de Na foi adicionado à amostra, e a mistura foi incubada sobre gelo durante 15 minutos. A amostra foi centrifugada a 14.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente para retirar agarose não digerida, o ADNc foi precipitado com etanol, lavado em 70 % de etanol, seco ao ar e ressuspenso em 40 μΐ de água.

Para determinar a razão óptima de ADNc para vector várias ligações foram montadas e electroporadas. De maneira breve, 2 μΐ de 5X tampão de T4 ligase (Life Technologies), 1 μΐ de 10 mM de ATP, 1 μΐ de pZP7NX digerido com EcoRl-Xhol, 1 μΐ de T4 ADN ligase diluída até 0,25 u/ml (Life Technologies) água até 10 μΐ e 0,5, 1, 2 ou 3 μΐ de ADNc foram misturados em 4 ligações separadas, incubados a 22 °C durante 4 horas, 68 °C durante 20 minutos, precipitados com acetato de sódio e etanol, lavados, secos e ressuspensos em 10 ml. Um único microlitro de cada ligação foi electroporado em 40 μΐ de bactérias electrocompetentes DHIOb ElectroMax™ (Life Technologies) utilizando um 0,1 cm cuveta (Biorad) e um Genepulser, pulse controller™ (Biorad) ajustado a 2,5 KV, 251 F, 200 ohms. Estas células foram 168 imediatamente ressuspensas em 1 ml. Caldo SOC (Manniatis et al, supra.) seguido por 500 μΐ de 50 % de glicerol-SOC como um conservante. Estas "reservas de glicerol" foram congelados em várias aliquotas a -70 "C. Uma alíquota de cada um foi descongelada e inoculados em placa em série em placas de LB-agar suplementada com ampicilina a 100 pg/ml. Os números de colónias indicaram que a razão óptima de ADN CD3+ para vector pZP7NX foi de 1 μΐ para 45 ng; tal ligação proporcionou 4,5 milhões de clones primários.

Para o propósito de rastrear a biblioteca utilizando um ensaio de proliferação com base em BaF3 (Exemplo 5) reservas de glicerol de anteriormente foram diluídos em culturas líquidas de 100 ou 250 clones por agrupamento em placas de microtitulação de poço profundo, crescidas 24 horas a 37 °C com agitação e o plasmídeo foi isolado utilizando um kit Qiagen seguindo as instruções do fabricante. Tal ADN foi subsequentemente transfectado em células BHK, meios condicionados durante 72 horas, colhidos e armazenado a -80 °C, e subsequentemente colocada em células 5K BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta ou células BaF3/zcytorl7/OSMRbeta durante 72 horas após o que a proliferação foi avaliada utilizando um ensaio de fluorescência "Alamar blue" (Exemplo 5B e Exemplo 2B). Exemplo 7

Clonaqem de expressão de zcytorl71iq humano

As reservas de glicerol da biblioteca de células humanas seleccionadas CD3+ activadas (Exemplo 6) foram adicionadas a Super Broth II™ (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + 0,1 mg/ml de ampicilina (amp) numa concentração de 250 células por 800 microlitros. As E. coli foram deixadas que equilibrassem durante 24 horas a temperatura ambiente. No momento da inoculação, 400 microlitros foram inoculados em placa em placas com LB + amp para determinar a titulação real da inoculação. Após 24 horas as placas foram contadas e depois a concentração 169 final do SuperBrothlI™ + E. coli foi ajustado de modo que a concentração final era de 250 células por 1,2 ml. Três vezes 2 litros foram inoculados para um total de 6 litros. Os meios foram depois inoculados em placa em blocos de 96 poços profundos (Qiagen). A inoculação em placa foi feita no dispensador de 8 canais Q-FÍ112™ (Genetix, Christclturch, Dorset, UK). As E. coli foram crescidas durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rotações/min. Num agitador um New Brunswick Scientific Innova 4900 multi-tier environment. As E. coli foram separadas por centrifugação de solução a 3000 rpm, utilizando uma centrífuga Beckman GS-6KR. Estes sedimentos de E.coli foram congelados a -20 °C ou utilizados frescos antes de realizar o miniprepp do ADN de plasmnideo. Cada sedimento contém aproximadamente 250 clones de ADNc das biblioteca de células humanas seleccionadas CD3+.

Estes agrupamentos de 250 clones de ADNc foram depois submetidos a miniprep utilizando kit QIAprep™ 96 Turbo Miniprep (Qiagen). O ADN de plasmídeo foi eluído utilizando 125 ml de TE (10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA) . Este ADN de plasmídeo foi depois utilizado para transfectar células BHK.

Transfecção de BHK Células BHK foram inoculadas em placa em placas de cultura de tecido de 96 poços a uma densidade de 12.000 células por poço num volume de 100 ml por poço. Meios de cultura foi DMEM (GibcoBRL) , 5 % de soro bovino fetal inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina (Gibco-BRL), IX de PSN (GibcoBRL). 1 mM de piruvato de sódio (GibcoBRL).

No dia seguinte, as células BHK foram lavadas uma vez com 100 ml SFA. SFA é meio livre de soro que é DMEM/F12 ou DMEM (Gibco/BRL), 2 mM de GlutaMax™ (GibcoIBRL), 1 mM de piruvato de sódio, 10 pg/ml de transferrina, 5 pg/ml de insulina, 10 pg/ml fetuina, 2 mg/ml de selénio, 25 mM de 170 HEPES (Gibco/BRL), 100 mM de aminoácidos não essenciais (Gibco/BRL).

Uma mistura ADN/Lipofectamine™ foi preprarada como segue: 2,2 μΐ de reagente Lipofectamine™ (GibcolBRL) foi combinado com 102,8 μΐ de SFA a temperatura ambiente; aproximadamente 5 μΐ do ADN de plasmideo (200 ng/μΐ) foram depois adicionados ao Lipofectamine™/SFA para formar a mistura de ADN/Lipofectamine™, que foi incubada a temperatura ambiente durante 30 minutos. O SFA foi retirado das Células BHK e as células foram incubadas com 50 μΐ da mistura de ADN/lipofectamine™ durante 5 horas a 37 °C com 5 % de C02. Cinquenta μΐ da mistura de ADN/Lipofectamine™ foram adicionados a cada um de dois poços das Células BHK, de modo que as transfecções foram feitas em duplicata.

Após as células BHK terem sido incubadas com mistura de ADN/lipofectamine™ durante 5 horas, mistura de ADN/lipofectamine™ foi retirada e 100 ml de meios de cultura foram adicionados. As cCélulas foram incubadas durante a noite, os meios forami retirados e recolocados com 100 ml de meios de cultura. Após cultivar células durante 48-72 horas, os meios condicionados foram retirados, congelados a -80 "C durante um minimo de 20 minutos, descongelados, e depois 50 ml foram ensaiados no Ensaio de proliferação de BAF3, descritos no Exemplo 5, para identificar agrupamentos de 250 clones com actividade de ligando.

Vinte placas de 96 poços foram rastreadas num ensaio único. Isto representou aproximadamente 250 ADNc/poço ou 480.000 ADNc total. Destes, meios condicionados de aproximadamente 60 poços (representando 250 ADNc por poço) testados positivos no ensaio de proliferação. Um destes agrupamentos positivos foi escolhido para quebrar e isolar um ADNc individual que poderá codificar o zcytorl71ig. Este foi o agrupamento 62A12. 171

Para o agrupamento 62A12, 1 μΐ de ADN foi utilizado para transformar células ElectroMax™ DH10B (Gibco/BRL) por electroporação. Os transformantes foram inoculados em placa em placas de LB + amp (100 mg/ml) para dar colónias isoladas. Do agrupamento electroporado, 672 colónias individuais foram seleccionadas por palito de dente em sete placas de 96 poços que contêm 1,2 ml de SuperBrothlI™ por poço. Estas placas foram numeradas do n° 62,1 a n° 62,7. Estas foram cultivadas durante a noite e o ADN de plasmídeo foi submetido a miniprep como anteriormente. Para todas as sete placas, o ADN de plasmídeo das placas de quebra foi transfectado em células BHK e ensaiadas por proliferação como anteriormente, excepto que as transfecções não foram feitas em duplicata.

Dois clones positivos 62,6C7 e 62,6E9 foram identificado por actividade de um total de 672 clones. ADN de plasmídeo submetido a miniprep do clone 62,6E9 foi sequenciado e uma tentativa de identificação foi obtida, mas uma sequência mista foi obtida destes clones positivos. Para isolar adicionalmente o ADNc de zcytorl71ig a um clone individual, 1 μΐ de ADN do agrupamento 62,6E9 foi utilizado para electroporar células DH10B e os transformantes inoculados em placa em placas de LB + amp (100 mg/ml) para dar colónias isoladas. ADN de plasmídeo submetido a miniprep de várias colónias foi sequenciado para dar a sequência de ADN exacta. A sequência de polinucleótido de zcytorl71ig era de comprimento completo (SEQ ID NO: 1) e sua sequência de aminoácido correspondente é mostrada (SEQ ID NO: 2).

Exemplo 8

Construção de Vectores de expressão de mamífero Que expressar Receptores solúveis de zcytor 17: zcytorl7CEE, zcytorl7CFLG, zcytorl7CHIS e zcytorl7-Fc4 172 A. Construção de Vector de expressão de mamífero de zcytorl7 que contém zcytorl7CEE,_zcytorl7CFLG e

zcytorl7CHIS

Um vector de expressão foi preparado para a expressão do, domínio extracelular solúvel do polipéptido zcytorl7, pZp9zcytorl7CEE, onde a construção foi desenhada para expressar um polipéptido de zcytorl7 compreendido da metionina de iniciação predita e adjacente truncado ao domínio transmembranar predito, e com uma etiqueta Glu-Glu C-terminal. (SEQ ID N4:32).

Um produto de PCR de aproximadamente 1500 pb foi gerado utilizando ZC29,451 (SEQ ID NO: 33) e ZC29,124 (SEQ ID NO: 34) como iniciadores de PCR para adicionais locais de restrição EcoRI e BamHI. Uma biblioteca interna de ADNc HPVS humano foi utilizada como um molde e amplificação por PCR foi realizada como segue: 30 ciclos a 94 °C durante 1 minuto, 65 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 1,5 minutos; depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reacção de PCR foi precipitada com etanol e digerida com enzimas de restrição EcoRI e BamHI. O produto de PCR digerido foi purificado por gel num gel de agarose a 1,0 % e a banda de aproximadamente 1500 pb foi cortada. Esta banda foi depois re-amplifiçada utilizando iniciadores idênticos com a seguinte ciclagem: 30 ciclos a 944 °C durante 1 minuto, 65 "C durante 1 minuto, 72 °C durante 3 minutos, depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A reacção de PCR foi precipitada com etanol e digerida com enzimas de restrição EcoRI e BamHI. O produto de PCR digerido foi purificado por gel num gel de agarose a 1,0 % e a banda de aproximadamente 1500 pb foi cortada. O ADN cortado foi subclonado em plasmídeo CEEpZp9 que foi cortado com EcoRI e BamHI, para gerar plasmídeo com um receptor solúvel etiquetado no C terminal com GLU-GLU para zcytorl7, zcytorl7CEEpZp9. O domínio extracelular no ADNc de zcytorl7CEE em

zcytor!7CEEpZp9 tem uma mutação silenciosa que muda o T 173 para C na posição 1705 da SEQ ID NO: 4 (que codifica um resíduo Pro no resíduo 403 da SEQ ID NO: 5), Como esta mutação foi silenciosa, o ADNc de zcytorl7 em zcytorl7CEEpZp9 codifica o polipéptido como mostrado na SEQ ID NO: 5. Além disso, devido a construção utilizada, um par de resíduos Gly-Ser foi inserido C-terminal na extremidade do domínio extracelular solúvel de zcytorl7 e antes da Etiqueta C-terminal de Glu-Glu (SEQ ID NO: 32). Como tal, a etiqueta na terminação C do domínio extracelular de zcytorl7, foi uma etiqueta Glu-Glu como mostrado na (SEQ ID NO: 17) . Plasmídeo CEEpZp9 é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem the promotor de metalotioneína-1 de ratinho, múltiplos locais de restrição para inserção de sequências codificantes, e um terminador de hormona de crescimento humano. 0 plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de marcador detectável de mamífero que tem um promotor de SV40, potenciador e origem de replicação, um gene DHFR e o terminador de SV40. Utilizando técnicas de biologia molecular padrão zcytor17CEEpZp9 foi electroporada em células DH10B competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acordo com a orientação do fabricante e inoculada em placa em placas de LB que contém 100 pg/ml de ampicilina, e incubada durante a noite. Colónias foram rastreadas por análise de restrição, ou PCR de ADN preparado a partir de colónias individuais. A sequência de inserto de clones positivos foi verificada por meio de análise de sequência. Uma preparação de plasmídeo em larga escala foi feita utilizando um kit QIAGEN® Maxi prep (Qiagen) de acordo com instruções do fabricante. O mesmo processo foi utilizado para preparar os receptores solúveis zcytorl7 com uma etiqueta de His C-terminal, composta de 6 resíduos de His numa fila; e uma etiqueta C-terminal FLAG® (SEQ ID NO: 36), zcytorl7CFLAG. Para construir estas construções, o vector mencionado 174 anteriormente tem a etiqueta de HIS ou a etiqueta FLAG® em lugar da etiqueta glu-glu (por exemplo, SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 32 ou SEQ ID NO: 35). 8. Construção de expressão de mamífero de Receptor zcytorl7 humano solúvel: zcytor17-Fc4.

Um vector de expressão, pEZE-2 hzcytorl7/Fc4, foi preparado para expressar um Versão solúvel marcada com Fc4 na porção C-terminal de hzcytorl7 (zcytorl7 humano-Fc4) em células PF. CHO. As células PF CHO são uma linha de célula CHO interna adaptadas para crescimento em meio livre de proteína (meio ExCell 325 PF; JRH Biosciences). A linha de célula CHO interna foi originalmente derivada de células CHO DG44 (G. Urlaub, J. Mitchell, E. Kas, L.A. Chasin, V.L. Funanage, T.T. Myoda e J.L. Hamlin, "The Effect of Gamma Rays at the Dihidrofolate Reductase Locus: Deletions e Inversions," Somatic Cell and Molec. Genet., 12: 555-566 (1986) . Um fragmento de ADNc de zcytorl7 que inclui a sequência de polinucleótido do domínio extracelular do receptor zcytorl7 foi fundido in frame à sequência de polinucleótido de Fc4 (SEQ ID NO: 37) para gerar uma fusão de zcytorl7-Fc4 (SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 39) . O vector pEZE-2 é um vector de expressão de mamífero que contém a sequência de polinucleótido Fc4 e um local clonagem que permite a rápida construção de fusões de Fc4 C-terminal utilizando técnicas de biologia molecular padrão.

Um fragmento do par de base 1566 foi gerado por meio de PCR, que contém o domínio extracelular de zcytorl7 humano e os primeiros dois aminoácidos de Fc4 (Glu e Pro) com locais Fsel e BglII codificado nas extremidades 5' e 3', respectivamente. Este fragmento de PCR foi gerado utilizando iniciadores ZC29,157 (SEQ ID NO: 40) e ZC29,150 (SEQ ID NO: 41) por meio de amplificação a partir de um plasmídeo que contém o domínio extracelular de zcytorl7 humano (pZp9zcytorl7CEE) (Exemplo 8A). As condições de reacção de PCR foram como segue: 25 ciclos a 94 °C durante 175 1 minuto, 60 °C durante 1 minuto, e 72 °C durante 2 minutos; 1 ciclo a 72 °C durante 10 minutos; seguido por um imersão a 4 °C. O fragmento foi digerido com endonuleases de restrição Fsel e BglII e subsequentemente purificado por electroforese em gel a 1 % e purificação da banda utilizando kit de extracção por gel QiaQuick (Qiagen). O ADN purificado resultante foi ligado durante 5 horas a temperatura ambiente num vector pEZE-2 previamente digerido com Fsel e BglII que contém Fc4 3' dos locais Fsel e BglII.

Dois μΐ da mistura de ligação foi electroporada em 37 μΐ de E. coli DH10B electrocompetente (Gibco) de acordo com as orientações do fabricante. As células transformadas foram diluídas em 400 ml de meios LB e inoculadas em placa em placas de LB que contém 100 mg/ml de ampicilina. Os clones foram analisados por material digerido de restrição e os clones positivos foram enviados para sequenciamento de ADN para confirmar a sequência da construção de fusão. Um microlitro de um clone positivo foi transformado em 37 μΐ de E. coli DH10B electrocompetente e riscado numa placa de LB/amp. Uma colónia individual foi colhida desta placa riscada para começar uma cultura de 250 ml de LB/amp que foi depois crescida durante a noite a 37 °C com agitação a 250 rpm. Esta cultura foi utilizada para gerar 750 mg de ADN purificado utilizando um kit Qiagen plasmid Maxi (Qiagen).

Exemplo 9

Transfecção E Expressão De Polipéptidos de Receptor de Zcytorl7 Solúvel

As células BHK 570 (ATCC No. CRL-10314), DG-44 CHO, ou outras células de mamífero são inoculados em placa a aproximadamente 1,2 X 106 células/poço (placa de 6 poços) em 800 ml de meios livres de soros apropriados (SF) (por exemplo, DMEM, GibcolBRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) . As células são transfectadas com plasmídeos de expressão que contém zcytorl7CEE, 176 zcytorl7CFLG, zcytorl7CHIS ou zcytorl7-Fc4 (Exemplo 8), utilizando Lipofectin™ (Gibco BRL), em meios livres de soro (SF) de acordo com instrução do fabricante. Clones individuais que expressam os receptores solúveis são isolados, seleccionados e crescidos em meios de cultura de célula, e purificados utilizando técnicas padrão. A. Expressão em mamífero de receptor zcytorl7CEE humano solúvel Células 570 BHK (ATCC N°: CRL-10314) foram inoculadas em placa em balões de cultura de tecido T-75 e deixados que crescessem até aproximadamente 50 a 70 % de confluência a 37 °C. 5 % de C02, em meios DMEMIFBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5 % de soro bovino fetal, 1 mM de L-glutamina (JRH Biosciences, Lenea, KS), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco BRL)). As células foram depois transfectadas com o plasmídeo que contém zcytorl7CEE (Exemplo 8A) utilizando Lipofectamine™ (Gibco BRL), em formulação de meios livres de soro (SF) (DMEM, 10 mg/ml de transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina; 1 % de L-glutamina e 1 % piruvato de sódio). Dez microgramas do ADN de plasmídeo pZp9zcytorl7CEE (Exemplo 8A) foi diluído num tubo 15m) a um volume total final de 500 μΐ com meio SF. Cinquenta microlitros de Lipofectamine foram misturados com 450 μΐ de meio SF. A mistura de Lipof ectamine foi adicionada à mistura de ADN e permitida que incubasse durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Quatro ml de meio SF foram adicionados à mistura de ADN:Lipofectamine. As células foram enxaguadas uma vez com 5 ml de meio SF, aspiradas, e a mistura de ADN:Lipofectamine foi adicionada. As células foram incubadas a 37 °C durante cinco horas, e depois 5 ml de meios DMEM/10 % de FBS foram adicionados. O balão foi incubado a 37 °C durante a noite após cujo tempo as células foram divididas entre os meio de selecção (meios DMEM/FBS de acima com a adição de 1 μΜ de metotr exato ou 10 μΜ 177

Metotrexato (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) em placas de 150 mm a 1:2, 1:10, e 1:50. Aproximadamente 10 dias após a transfecção, uma placa de 150 mm de colónias resistentes a 1 μΜ de metotrexato foi tripsinizada, as células foram agrupadas, e metade das células foram reinoculadas em placa em 10 μΜ de metotrexato; para amplificar adicionalmente a expressão da proteína zcytorl7CEE. Uma amostra meios condicionados deste agrupamento de células amplificadas foi testada para a níveis de expressão utilizando SDS-PAGE e análise de Western. B. Expressão em mamífero de receptor zcytorl7-Fc4 humano solúvel

Cinco replicatas de 200 pg de ADN de plasmídeo pEZE-2hzcytorl7Fc4 (Exemplo 8B) foram linearizados por meio de digestão de restrição com FspI, uma enzima de restrição que corta uma vez dentro do vector e não interrompe os genes necessários para a expressão. 200 pg de ADN genómico de células CHO foi adicionado a cada replicata como ADN portador e depois o ADN foi precipitado pela adição de 0,1 volumes de 3 M de Acetato de sódio pH 5,2 e 2,2 volumes de etanol seguido por um incubação em gelo de 15 minutos e microcentrifugação a 4 °C. O ADN resultante precipitado foi lavado em etanol a 70 % e seco ao ar antes de ser ressuspenso em 100 μΐ de meios de crescimento não selectivo de CHO livre de proteína (PF) (21 g/L de PF CHO Ex Cell 325 /200 mM de L-glutamina (Gibco)/100 mM de piruvato de sódio (Gibco)/lx de suplemento HT (Gibco) . Dez milhões de células de 61 passagens PF CHO foram adicionados ao ADN em 600 μΐ de Meios de crescimento não selectivo PF CHO e depois foram electroporadas num sistema de electroporação Gene Pulser II (BioRad) utilizando 950 pF de capacitância e 300 Kv utilizando uma cuveta de electroporação Gene Pulser de 0,4 cm de lacuna (BioRad) . Todas as 5 replicatas das células electroporadas foram agrupadas e directamente seleccionadas em meios -HT (21 g/L PF CHO Ex Cell 325/ 200 mM de L- 178 glutamina (Gibco)/100 mM de piruvato de sódio (Gibco). As células foram seleccionadas durante 1,5 dias em meios -HT antes de ser passadas a 4 x 105 ml el selecção de 50 nm MTX. Oito dias mais tarde as células foram semeadas a 3,5 X 105 células/ml em selecção de 200 mM MTX. Após um semana, células foram semeadas a 4 X 105 células/ml em 1 pom MTX selecção. Após duas semanas a 1 mM MTX, células foram semeadas a 1 X 106 células/ml em 50 ml para gerar meio condicionado. Os meios condicionados de 72 hora resultantes foram analisados sondando western blots com um anticorpo gerado contra Ig humana. As células produziram proteína hzcytorl7/Fc4 a aproximadamente 1 mg/L. C. Expressão em maior escala em mamífero de receptor zcytorl7-Fc4 humano solúvel

Duzentos pg de ADN de plasmídeo de pEZE-2hzcytor17Fc4 (Exemplo 8B) fora, linearizados por meio de digestão de restrição com FspI, uma enzima de restrição que corta uma vez dentro do vector pEZE-2 e não interrompe os genes necessários para a expressão. Duzentos microgramas de ADN genómico de CHO (preparados no laboratório) foram adicionados como ADN portador e depois o ADN foi precipitado pela adição de 0,1 volumes de 3 M de Acetato de sódio pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol seguido por microcentrifugação a temperatura ambiente. Cinco replicatas de sedimento de ADN foram preparados e transformados. O sedimento de ARN resultante foi lavado em etanol a 70 % e seco ao ar antes de ser ressuspenso em 100 μΐ de meios de crescimento não selectivo PF CHO (21 g/L PF CHO Ex Cell 325 /200 mM de L-glutamina (Gibco)/100 mM de piruvato de sódio (Gibco)/lx de complemento HT (Gibco). Dez milhões de células CHO PF foram adicionadas ao ADN em 600 μΐ de Meios de crescimento não selectivo PF CHO e depois foram electroporadas num sistema de electroporação Gene Pulser II (BioRad) utilizando 950 pF de capacitância e 300 volts utilizando uma cuveta de electroporação Gene Pulser de 0,4 179 cm de lacuna (BioRad). As células electroporadas foram agrupadas e postas directamente em selecção em meios -HT (21 g/L PF CHO Ex Cell 325/ 200 mM de L-glutamina (Gibco)/100 mM de piruvato de sódio (Gibco). As células foram seleccionadas durante 14 dias em meios -HT antes de ser passadas a 4 x 105/ml em selecção de 50 nm MTX. As células foram amplificadas a 200nNM MTN e depois a luM MTX. Os agrupamentos -HT, 50nM, e luM foram semeados a 1 x 106 c/mi durante 48 horas, e os meios condicionados resultantes foram analisados sondando western blots com um anticorpo gerado contra Ig humana.

Exemplo 10

Purificação de receptores zcytor!7 solúveis de células BHK 570 e CHO A. Expressão transitória em mamífero e purificação de receptor zcytorl7-Fc4 humano solúvel ADN de plasmídeos pEZE-2hzcytorl7Fc4 (Exemplo 8B) foi introduzido em 40 maxi placas de células BHK utilizando Lipofectamine (Gibco BRL) como foi descrito no presente documento e nas instruções do fabricante. As células foram permitidas que se recuperassem durante a noite, depois foram enxaguadas e realimentadas com meio livre de soro (SL7V4, preparado no laboratório). Após 72 horas, os meios foram colhidos e filtrados, e as células foram realimentadas com meio livre de soro. Após 72 horas, os meios foram colhidos e filtrados de novo.

Os meios condicionados livres de soro (2 x 1,5 L lotes) de células BHK transfectadas de forma transitória foi bombeado numa coluna Proteína A-agarose de 1,5 ml em 20 mM de Tris, pH 7,5, 0,5 M de NaCl. A coluna foi lavada extensivamente com este tampão e depois a proteína ligada foi eluída com 1 ml de 0,2 M de glicina, pH 2,5, 0,5 M de NaCl. A proteína eluída foi colhida em 0,1 ml de 2 M de Tris, pH 8,5. As alíquotas foram colhidas para electroforese em gel de SDS- poliacrilamida e o zcytorl7-Fc 180 bruto foi submetido a diálise durante a noite contra PBS. O receptor solúvel foi filtrado de forma estéril e colocado em aliquotas a -80 'C. B. Purificação de zcytorl7-Fcd

Zcytorl7 marcado com Fc4 carboxilo terminal recombinante (Exemplo 8 e Exemplo 9) foi produzido a partir de células CHO transfectadas. A transfecção de CHO foi realizada utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Aproximadamente cinco litros de meios condicionados foram colhidos e filtrados de forma estéril utilizando filtros Nalgene de 0,2 mm. A proteína foi purificada a partir dos meios filtrados por uma combinação de cromatografia de afinidade Poros 50 proteína A (PerSeptive Biosystems, 1-5559-01, Framingham, MA) e coluna de cromatografia de exclusão em gel Superdex 200 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). O meio de cultura foi directamente carregado sobre uma coluna de afinidade de 10 x 70 mm (5,5 ml de volume de leito) de proteína A a um fluxo de aproximadamente 3-10 ml/minuto. Em seguida de lavagem da coluna por dez volumes de coluna de PBS, a proteína ligada foi eluída por cinco volumes de coluna de 0,1 M de glicina, pH 3,0 a 10 ml/minuto). Fracções de 2 ml cada uma foram colhidas em tubos que contêm 100 μΐ de 2,0 M de Tris, pH 8,0, com a finalidade de neutralizar as proteínas eluídas. Amostras da coluna de afinidade foram analisadas por meio de SDS-PAGE com coloração com comassie e Western blotting para a presença de zcytorl7-Fc4 utilizando Ig-HRP humana. Fracções que contêm Zcytorl7-Fc4 foram agrupadas e concentradas a 1-2 ml utilizando concentrador Biomax-30 (Millipore), e carregado sobre uma coluna de filtração em gel de 20 x 580 mm de Superdex 200. As fracções que contém zcytorl7-Fc4 purificado foram agrupadas, filtradas através de filtro de 0,2 mm, divididas em aliquotas de 100 μΐ cada uma, e congeladas a -80 °C. A concentração da proteína purificada 181 final foi determinada por meio de ensaio BCA (Pierce, Rockford, IL). C. análise SDS-PAGE e Western blottinq de zcytorl7/Fc4

Zcytorl7-Fc4 recombinante foi analisado por meio de SDS-PAGE (Nupage 4-12 %, Invitrogen, Carlsbad, CA) com método de coloração com comassie e Western blotting utilizando Ig-HRP humana. Os meios condicionados ou a proteína purificada foi submetida a electroforese utilizando uma minicélula nvitrogen Novex's Xcell II, e transferido a nitrocelulose (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente utilizando módulo Novex's Xcell II blot com agitação de acordo com orientações proporcionadas no manual do instrumento. A transferência foi executada a 500 mA durante uma hora num tampão que contém 25 mM de base Tris, 200 mM de glicina, e 20 % de metanol Os filtros foram depois bloqueados com 10 % de leite magro em pó em PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. A nitrocelulose foi rapidamente enxaguada, depois o anticorpo Ig-HRP humano (1:2000) foi adicionado em PBS que contém 2,5 % de leite magro em pó. As manchas de transferência foram incubadas durante duas horas a temperatura ambiente, ou durante a noite a 4 °C, com agitação suave. Em seguida a incubação, as manchas de transferência foram lavadas três vezes durante 10 minutos cada em PBS, depois rapidamente enxaguada em H20. As manchas de transferência foram desenvolvidas utilizando reagentes de substrato quimioluminescente disponíveis comercialmente (Super-Signal® ULTRA reagentes 1 e 2 misturados 1:1; reagentes obtidos de Pierce, Rockford, IL) , e o sinal foi capturado utilizando o software Lumi-Imager's Lumi Analyst 3.0 (Boehringer Mannheim GmbH, Alemanha) para tempos de exposição que variam desde 10 segundos até 5 minutos ou conforme seja necessário. O zcytorl7-Fc4purifiçado apareceu como uma banda individual com a coloração com coomassie ou prata a 182 aproximadamente 220 kDa sob condições não redutoras, e a aproximadamente 120 kDa sob condições redutoras, que sugerem a forma dimérica de zcytorl7-Fc4 sob condições não redutoras como esperado.

Exemplo 11

Ensaio utilizando receptor solúvel zcytorl7, receptor solúvel zcytorl7-Fc4 em ensaio de inibição cmpetitiva Células BaF3/zcytorl7/WSX-l/OSMRbeta e células BaF3/zcyl7/OSMRbeta foram precipitadas por centrifugação e lavadas em meios livres de mIL-3. As células foram centrifugadas e lavadas 3 vezes para garantir a retirada da mIL-3. As células foram depois contadas num hematocitómetro. As células foram inoculadas em placa num formato de 96 poços a 5000 células por poço num volume de 100 μΐ por poço utilizando os meios livres de mIL-3.

Meios condicionados tanto da activação de células CCRF-CEM como CCRF-HSB2 e as células CD3+ humanas seleccionadas, descritos no Exemplo 5, foram adicionados em experiências separadas a concentrações de 25 %, 12,5 %, 6,25 %. 3,125 %, 1,5 %, 0,75 %, 0,375 %, e 0,187 %, com ou sem receptores solúveis zcytorl7 (Zcytorl7-Fc4; Veja-se, Exemplo 9 e Exemplo 10) a 1-10 pg/ml. O volume de ensaio total foi 200 ml.

As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C, 5 % de CO2 durante 3-5 dias em cujo tempo Alamar Blue (Accumed) foi adicionado a 20 μΐ/poço. Placas foram incubadas de novo a 37 "C, 5 % de CO2 durante 16-24 horas. As placas foram lidas no leitor de placa Fmax™ (Molecular. Devices) como foi descrito no Exemplo 2. Resultados demonstraram inibição parcial de crescimento celular com receptor solúvel zcytorl7-Fc4 a 10 pg/ml, confirmando que o factor em cada amostra foi especifico para o receptor zcytorl7.

Curvas de titulação, diluindo o receptor solúvel, ou heterodimeros de receptor solúvel que compreende zcytorl7/OSMR e zcytorl7/WSX-l foram também executadas 183 utilizando o ensaio indicado anteriormente para determinar se receptores zcytorl7 são capazes de inibir completamente o crescimento, por exemplo, a concentrações baixas ou fisiológicas.

Ensaios de inibição competitiva similares foram levados a cabo utilizando zcytorl71ig humano purificado (Exemplo 35) e receptores solúveis em ensaios de luciferase (Exemplo 20). Os resultados mostram que tnto zcytorl7 homodimérico e zcytorl7/OSMR heterodimérico são capazes de inibir a actividade de zcytorl71ig.

Exemplo 12

Ensaio de captura de secreção

Um ensaio de captura de secreção foi usado para testar a ligação do zcytorl71ig a receptores que compreendem receptor zcytorl7, tal como o receptor zcytorl7 ou receptores heterodímero que compreendem zcytorl7/OSMR e zcytoxl7/WSX-l. O ADN de Zcytorl71ig de plasmídeo foi transfectado em células COS, e utilizado para avaliar a ligação do zcytorl71ig a receptores que compreende receptor zcytorl7 por captura de secreção como é descrito a seguir. A, Transfecções de células COS A transfecção de células COS foi realizada como segue: foram misturados 800 ng de ADNc de zcytorl71ig e 4 μΐ de

Lipofectamine™ em 8 0 μΐ de meio DMEM livre de soro (55 mg de piruvato de sódio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 μg de selénio e 5 mg de fetuina em 500 ml de DMEM), e foram incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois foram adicionados 320 μΐ de meio DMEM livre de soro. Esta mistura de 500 μΐ foi adicionada sobre 2xl05 células COS/poço cultivadas numa placa de cultura de tecidos de 12 poços e foram incubadas durante 5 horas a 37 °C. Depois foram adicionados 500 μΐ de meio FBS DMEM a 20 % (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato de sódio e 146 mg de L-glutamina em 500 ml de DMEM) e as células foram incubadas durante a noite. 184 Β. Ensaios de Captura de Secreção A captura de secreção foi realizada como segue: o meio foi enxaguado das células com PBS, depois as células foram fixas durante 15 minutos com formaldeido a 1,8 % em PBS. As células depois foram lavadas com PBS/BSA a 0,1 % e foram permeabilizadas com Triton-X a 0,1 % em PBS durante 15 minutos, e de novo foram lavadas com PBS/BSA a 0,1 %. As células foram bloqueadas durante 1 hora com PBS/BSA a 0,1 %. Dependendo do receptor solúvel que foi utilizado, as células foram incubadas durante 1 hora em TNB com: (A) 1-3 μρ/τηΐ de receptor solúvel zcytorl7, proteína de fusão zcytorl7-Fc4 (Exemplo 10); ou (B) 1-3 μρ/τηΐ de proteína receptora solúvel zcytorl7/OSMRbeta. As células depois foram lavadas com TNT. Dependendo do receptor solúvel que foi utilizado (por exemplo, se estava marcado com um marcador Fc4 (SEQ ID NO: 37), um marcador FLAG C-terminal (SEQ ID NO: 26) ou um marcador CEE (SEQ ID NO: 32; SEQ ID NO: 35)), as células foram incubadas durante outra hora com: (A) Ig de cabra anti-humana-HRP diluída 1:200 (específica de Fc) ; (B) M2-HRP diluída 1:1000; (C) anticorpo anti-GluGlu-HRP diluído 1:1000; ou (D) estreptavidina-HRP diluído 1:300 (kit NEN) em TNB, por exemplo. De novo as células foram lavadas com TNT.

Para detectar a ligação positiva, reagente de fluoresceína tiramida foi diluído 1:50 em tampão de diluição (kit NEN) e foi incubado durante 4-6 minutos e foi lavado com TNT. As células foram conservadas com Meio de Montagem Vectashield (Vector Labs Burlingame, CA) diluído 1:5 em TNT. As células foram visualizadas utilizando um filtro FITC num microscópio fluorescente. Os resultados deste ensaio mostraram que zcytorl71ig humano não se liga a nenhum dos receptores solúveis. Estes dados sugerem que a estrutura de zcytorl71ig era sensível à etapa de fixação neste protocolo, já que era claramente capaz de se ligar a receptores da superfície celular (vejam-se, por exemplo, os 185 dados de citometria de fluxo presentados a seguir no Exemplo 39)

Exemplo 13

Designação Cromossómica e Colocação da Sequência Génica para o zcytorl71ig A sequência génica de zcytorl71ig foi mapeada no cromossoma humano 12 utilizando a versão disponível comercialmente do "Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panei" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AO). 0 "Stanford G3 RH Panei" contém ADN de cada um de 83 clones de híbridos de radiação do genoma humano completo, mais dois ADN de controlo (o dador de RM e o receptor de A3). Um servidor WWW disponível publicamente localizado em Internet em www.stanford.edu permite a localização cromossómica de marcadores e genes.

Para o mapeamento da sequência génica de zcytorl71ig com o "Stanford G3 RH Panei", reacções de 20 μΐ foram preparadas numa placa de microtitulação de 96 poços compatível para PCR (Stratagene, A Jolla, CA) e foram utilizadas num termociclador "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Cada uma das 95 reacções de PCR consistia em 2 μΐ de tampão de reacção de PCR 10X (Qiagen, Inc. Valência, CA), 1,6 μΐ de mistura de dNTP (2,5 mM de cada um, PERKIN-ELMER, Foster City, CA) , 1 μΐ de iniciador sense, ZC41,458 (SEQ ID NO: 42), 1 μΐ de iniciador antisense, ZC41,457 (SEQ ID NO: 43), 2 μΐ de "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AO), 0,1 μΐ de HotStarTaq ADN Polimerase de Qiagen (5 unidades/μΐ), 25 ng de ADN de um clone híbrido individual ou controlo e água destilada para um volume total de 20 μΐ. As reacções foram cobertas com uma quantidade igual de óleo mineral e foram seladas. As condições do ciclador de PCR foram como segue: um ciclo inicial de desnaturação de 15 minutos a 95 °C, 35 ciclos de desnaturação de 45 segundos a 95 °C, 1 minuto de hibridação a 53 °C e 1 minuto e 15 segundos de extensão a 186 72 °C, seguido de um 1 ciclo de extensão final de 7 minutos a 72 °C. As reacções foram separadas por electroforese num gel de agarose a 2 % (EM Science, Gibbstown, NJ) e foram visualizadas por coloração com brometo de etidio.

Os resultados mostraram a ligação da sequência do gene de zcytorl71ig ao marcador do cromossoma 12 SHGC-83339 com uma pontuação LOD >11 e a uma distância de 17 cR_10000 do marcador. Este marcador situa ao gene de zcytorl71ig na região crombassómica 12q2 4,31.

Exemplo 14

Identificação e clonagem de zcytorl71ig murino A. Identificação de zcytorl71ig murino de comprimento completo

Utilizando a sequência do péptido zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 2) para consultar uma base de dados de ADN interna, foi identificado um ADNc murino, N° de Acesso do Genbank AK005939, como sequência parcial potencial para o zcytorl71ig murino. A sequência de ADNc de AK005939 foi utilizada para estudar uma base de dados que continha fragmentos genómicos murinos. Foi montado um contig genómico do zcytorl71ig murino (SEQ ID NO: 76). A predição do potencial codificante neste fragmento genómico com o programa Genscan revelou uma provável sequência de ADNc, com a mesma estrutura génica que o zcytorl71ig humano. Na SEQ ID NO: 10, é representada uma sequência de ADNc murina, e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 11. B. Clonagem de zcytorl71iq de ratinho a partir de uma biblioteca de ADNc de testiculo de ratinho por PCR.

Co base na sequência genómica (SEQ ID NO: 76), foram desenhados dois iniciadores de PCR e foram utilizados para identificar uma fonte de ADNc de zcytorl71ig de ratinho por PCR. Estes iniciadores ZC41498 (SEQ ID NO: 86) e ZC41496 (SEQ ID NO: 87) foram desenhados para as supostas regiões não traduzidas 5' e 3' das sequências de ratinho (SEQ ID 187 NO: 76 e SEQ ID NO: 10). Foram rastreadas várias fontes de ADNc por PCR, incluindo ADNc Marathon-ready (Clontech) e alíquotas de bibliotecas de ADNc fabricadas localmente. Os produtos foram visualizados em géis de agarose a 1 %. Foram observadas bandas do tamanho esperado em reacções que utilizavam um molde de biblioteca de ADNc de testículo de ratinho. Estas reacções de PCR foram realizadas satisfatoriamente em volumes de aproximadamente 50 μΐ com ou sem 10 % de DMSO, utilizando pfu turbo polimerase (Stratagene) de acordo com as recomendações do fabricante; com uma aplicação adicional de iniciador a temperaturas elevadas de cera, utilizando início a temperatura elevada 50 s (molecular Bioproducts, Inc. San Diego, CA). Os ciclos térmicos de PCR foram realizados com somente um ciclo de 94 °C durante 4 minutos; seguido de 40 ciclos de 94 °C: 30 segundos, 48 °C: 30 segundos, 72 °C: 50 segundos; com uma extensão final adicional a 72 °C durante 7 minutos. As duas reacções de PCR foram agrupadas e purificadas utilizando agarose de baixo ponto de fusão e a enzima de digestão de agarose Gelase (Epicenter, Inc. Madison, WI) de acordo com as recomendações do fabricante. A determinação da sequência de ADN destes produtos de PCR revelou uma sequência de ADNc de zcytorl7 murino (SEQ ID NO: 90) que compreendia uma ORF idêntica à SEQ ID NO: 10, confirmando que a SEQ ID NO: 10 codificava o polipéptido zcytorl71ig de ratinho. Depois foram utilizados iniciadores de PCR ZC41583 (SEQ ID NO: 88) e ZC41584 (SEQ ID NO: 89), para adicionar locais de restrição Fsel e Asei e uma sequência Kozak parcial à grelha de leitura aberta de mcytorl71ig e um codão de terminação (SEQ ID NO: 92). Foi utilizado um termociclador Robocycler 40 (Stratagene) para realizar um gradiente de temperaturas de hibridação e ciclos como segue, Pfu turbo polimerase (Stratagene) foi aplicado como foi descrito anteriormente, mas somente em DMSO a 10 %. Os ciclos foram realizados com somente um ciclo de 94 °C durante 4 min; seguido de 20 ciclos de 94 °C: 30 segundos, gradiente de 65 °C a 51 °C: 30 segundos, 72 °C: 1 minuto; e somente uma extensão de 72 °C durante 7 minutos. O molde para esta segunda reacção de termociclagem foi 1 μΐ do produto de PCR mcytorl71ig purificado em gel inicial, indicado anteriormente. O produto de PCR resultante das três reacções à menor temperatura foi agrupado e foi purificado em gel utilizando o método de Gelase (Epicenter) descrito anteriormente. Este mzcytorl71ig purificado foi digerido com Fsel e Asei e foi ligado num vector pZP7X modificado para ter locais Fsel e Asei em seu local de clonagem. O plasmideo pZP7X é um vector de expressão de mamifero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor da metalotioneina-1 de ratinho (MT-1), múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, e um terminador de hormona de crescimento humana. O plasmideo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de marcador de selecção de mamifero que tem um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene de DHFR e o terminador de SV40. A sequência de ADNc murina clonada é representada na SEQ ID NO: 90, e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 91 (que é idêntica à SEQ ID NO: 11).

Exemplo 15

Isolamento do clone de ADNc de zcytorl71iq de ratinho a partir de uma biblioteca de baço de ratinho activada A. Fonte primária murina utilizada para isolar zcytorl71iq de ratinho São colhidos baços de ratinho procedentes de ratinho Balb/C e são triturados entre lâminas de extremidades esmeriladas para criar uma suspensão celular. É de esperar que o rendimento de células de ratinho primárias isoladas seja de aproximadamente 6,4 X 108 células antes da selecção descrita a seguir. 189

As células de baço são suspensas em 9,6 ml de tampão MACS (PBS, EDTA a 0,5 %, EDTA 2 mM) . São retirados 1,6 ml de suspensão celular e são adicionados 0,4 ml de micropérolas CD90 (Thy 1,2) (Miltenyi Biotec). A mistura é incubada durante 15 min. a 4 °C. Estas células marcadas com pérolas CD90 são lavadas com 30 ml de tampão MACS, e depois são ressupensas em 2 ml de tampão MACS. É preparada uma coluna VS+ (Miltenyi) de acordo com as instruções do fabricante. A coluna VS+ depois é colocada num campo magnético VarioMACS™ (Miltenyi). A coluna é equilibrada com 5 ml de tampão MACS. As células de ratinho primárias isoladas depois são aplicadas à coluna. As células negativas para CD90 são permitidas que passem através. A coluna é enxaguada com 9 ml (3X3 ml) de tampão MACS. Depois a coluna é retirada do imã e é colocada sobre um tubo Falcon de 15 ml. As células CD90+ são eluidas adicionando 5 ml de tampão MACS à coluna e as células ligadas são retiradas com jacto utilizando o êmbolo proporcionado pelo fabricante. A incubação das células com as pérolas magnéticas CD90, as lavagens e as etapas da coluna VS+ (incubação por meio de eluição) anteriores são repetidas mais uma vez. As fracções de CD90+ resultantes das 2 separações em coluna são agrupadas. É de esperar que o rendimento de células de baço de ratinho seleccionadas CD90+ seja aproximadamente 1 X 108 células em total. É retirada uma amostra das células de ratinho seleccionadas CD90+ agrupadas para a coloração e classificação num separador de células com anticorpos fluorescentes (FACS) para avaliar sua pureza. E utilizado um anticorpo de hámster anti-CD3E de ratinho conjugado com PE (PharMingen) para a coloração e separação das células seleccionadas CD90+. As células seleccionadas CD90+ de ratinho devem ser aproximadamente 93 % de células CD3+, o que sugere que as células são 93 % células T. 190

As células seleccionadas CD90+ murinas são activadas por incubação de 3 X 106 células/ml em RPMI + FBS a 5 % + 10 ng/ml de PMA e 0,5 μρ/τηΐ de Ionomicina (Calbiochem) durante a noite a 37 °C. O sobrenadante destas células de ratinho seleccionadas CD90+ activadas é ensaiado com respeito à actividade zcytorl71ig como é descrito a seguir. Além disso, as células de ratinho seleccionadas CD90+ activadas são utilizadas para preparar uma biblioteca de ADNc, como é descrito no Exemplo 16, mostrado a seguir. Exemplo 16

Clonaqem de zcytorl71ig de ratinho a partir de uma biblioteca de células seleccionadas CD90+ de ratinho O rastreio de uma biblioteca de ADNc de células seleccionadas CD90+ activadas de ratinho pode revelar ADNc isolado que é um novo membro da família de citocinas de quatro feixes helicoidais que codificariam o ortólogo de ratinho do zcytorl71ig humano. O ADNc é identificado por rastreio de hibridação. A. O vector para a construção da biblioteca seleccionada do CD90 +

Para a construção da biblioteca seleccionada de CD3+ é utilizado o vector pZP7N (veja-se o Exemplo 6A). B. Preparação da biblioteca de ADNc de células seleccionadas CD90+ activadas de ratinho primárias. São isoladas por centrifugação aproximadamente 1,5 X 108 células seleccionadas CD90+ de ratinho primárias estimuladas em ionomicina/PMA (Exemplo 15). É isolado o ARN total a partir do sedimento celular e é convertido em ADNc de cadeia dupla como é descrito no Exemplo 6B. Este ADN depois é introduzido por transfecção em células BHK, como é descrito no Exemplo 6B, e a proliferação é avaliada utilizando um ensaio de fluorescência com "Alamar Blue" (Exemplo 2B).

Com a finalidade de rastrear a biblioteca por meio de clonagem de captura de secreção, é necessária uma forma 191 amplificada, complexa, da biblioteca para transfectar células COS-7. São cultivados 4,8 milhões de clones em 110 placas de LB-agar de 15 cm suplementadas com 100 μρ/ιηΐ de ampicilina, 10 μρ/ιηΐ de meticilina. Depois de cultivar as placas durante a noite a 37 °C as bactérias são colhidas por raspado e são sedimentadas. É extraído ADN de plasmídeo das bactérias sedimentadas utilizando um Nucleobond-giga™ (Clonetech) seguindo as instruções do fabricante. Este plasmídeo depois é utilizado para transfectar células COS-7 em lâminas e é rastreado utilizando a técnica de captura de secreção descrita a seguir (Exemplo 17). C. Rastreio da biblioteca de ADNc de ratinho activada São inoculados em placas aproximadamente 5 X 105 clones em 10 placas LB/Amp Maxi. As colónias são levantadas, desnaturadas, neutralizadas e entrecruzadas utilizando os procedimentos padrão (Sambrook, J. et al. supra.). Cinquenta nanogramas do fragmento de PCR 5'-RACE de 300 pb 5' (Exemplo 14) são marcados com 32P utilizando o kit de marcação de iniciador aleatório Prime-Itr RmT (Stratagene) . Os 10 filtros são hibridados com esta sonda marcada a 65 °C durante a noite utilizando solução de hibridação ExpressHyb™ (Clontech). Os filtros depois são lavados sequencialmente a 60 °C durante 1 hora três vezes com SSC 0,2x (NaCl 30 mM, citrato de sódio 3 mM, pH 7,0), SDS a 0,1 %; e depois a 65 °C durante 1 hora. Os filtros são expostos a - 80 °C durante a noite e o filme de raios X é revelado. São extraídos blocos de agar que contêm as colónias positivas e os clones são cultivados em placas LB/Amp de 10 cm. As colónias depois são levantadas em filtros e são hibridadas de novo seguindo o mesmo procedimento descrito anteriormente. São isolados clones de ADN individuais e são sequenciados utilizando métodos convencionais, para identificar o ADNc de ratinho.

Exemplo 17 192 zcylorl71iq de ratinho não se liga ao receptor solúvel zcytorl7 humano no ensaio de captura de secreção 0 ADN para o clone de ratinho mzcytor 171ig/pZP7 foi introduzido por transfecção em células COS, e a ligação de receptores solúveis que compreendem zcytorl7 (receptor solúvel zcytorl7 humano zcytorl7-Fc4 (Exemplo 10), ou heterodímeros de receptor solúvel (zcytorl7/WSX-l ou BaF3/zcytorl7/OSMRbeta), às células COS transfectadas foi ensaiada por um ensaio de captura de secreção (Exemplo 12). O ensaio confirmou que zcytorl71ig de ratinho não se liga ao receptor solúvel zcytorl7 humano. A transfecção de células COS foi realizada de acordo com o Exemplo 12 utilizando aproximadamente 0,7 μg de ADNc de zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 16) em 3 μΐ. A captura de secreção foi realizada de acordo com o Exemplo 12 utilizando, por exemplo, 1 μg/ml de proteina de fusão de receptor solúvel zcytorl7 Fc4 (Exemplo 10) (ou heterodímeros de receptor solúvel que compreendia zcytorl7 como é descrito no presente documento) em TNB, e Ig-HRP de cabra anti-humana (específica de Fc) diluída 1:200 em TNB para o anticorpo detectável. Não foi detectada ligação positiva do receptor zcytorl7 humano solúvel às células fixas preparadas com o reagente fluoresceína tiramida de acordo com o Exemplo 12. As células foram conservadas e foram visualizadas de acordo com o Exemplo 12.

Os resultados indicaram que zcytorl71ig de ratinho não se liga ao receptor solúvel zcytorl7 humano (ou heterodímeros do receptor solúvel que compreende zcytorl7 como é descrito no presente documento).

Exemplo 18

Expressão de zcyrorl71iq em células de mamífero Expressão em mamífero de zcytorl71iq de ratinho Células BHK 570 (ATCC N° CRL-10314) foram inoculadas em placas em placas de cultura de tecido de 10 cm e foram deixadas que crescessem até uma confluência de 193 aproximadamente 20 % durante a noite a 37 °C, com um 5 % de CO2 em meio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL de Alto conteúdo de glicose; GibcoBRL, Gaithersburg, MD), soro bovino fetal a 5 % (Hyclone, Logan, UT), 1 mM de L-glutamina (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM de piruvato de sódio (Gibco BRL) . As células depois foram transfectadas com o plasmídeo mzcytor171ig/pZP7X (Exemplo 14) utilizando um kit de transfecção de Lipofectamine (GibcoBRL) estável de mamífero de acordo com as instruções do fabricante.

Um dia depois da transfecção, as células foram divididas 1:10 e 1:20 no meio de selecção (meio de DMEM/FBS com a adição de 1 μΜ de metotrexato (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) em placas de 150 mm. O meio das células foi substituído por meio de selecção fresco no dia 5 depois da transfecção. Aproximadamente 10 dias depois da transfecção, as colónias resistentes foram tripsinizadas a metotrexato e as células foram agrupadas e cultivadas em balões de cultura a grande escala. Uma vez que as células tinham crescido até uma confluência de aproximadamente 90 %, foram enxaguadas com PBS três vezes e foram cultivadas com meio ESTEP2 livre de soro (meio condicionado DMEM (Gibco BRL) , 0,11 g/1 de Piruvato de Na, 3,7 g/1 de NaHC03, 2,5 mg/1 de insulina, 5 mg/1 de transf errina, pH 7,0). O meio condicionado foi colhido três dias depois, e foi posto num ensaio de proliferação de BaF3 utilizando Alamar Blue descrito no Exemplo 19 apresentado a seguir.

Exemplo 19 zcytorl71ig de ratinho não activa o receptor zcytorl7 humano em ensaios de BaF3 utilizando Alamar Blue A proliferação de células BaF3/zcytorl7, BaF3/zcytorl7/OSMRbeta e BaF3/zcytorl7/WSX-l (Exemplo 4 e 5B) foi avaliada utilizando meio condicionado livre de soro de células BHK que expressavam zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18). 194 Células BaF3/Zcytorl7, BaF3/zcytorl7/OSMRbeta e BaF3/zcytorl7/WSX-l foram centrifugadas, lavadas e cultivadas em meio sem mIL-3 como é descrito no Exemplo 5B. Foi diluído meio condicionado de células BHK que expressavam zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18) com meio sem mIL-3 até concentrações de 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 % e 0,375 %. O ensaio de proliferação foi realizado de acordo com o Exemplo 5B. Os resultados deste ensaio foram negativos, indicando que zcytorl71ig de ratinho não activa complexos de receptor zcytorl7, zcytorl7/OSMRbeta ou zcytorl7/WSX-l humanos.

Exemplo 20 zcytorl71ig humano activa ao receptor zcytorl7/OSMRbeta humano no ensaio de luciferase A. Construção da linha celular BaF3/KZl34/zcytorl7 O plasmídeo KZ134 foi construído com oligonucleótidos complementares ZC12,749 (SEQ ID NO: 44) e ZC12,748 (SEQ ID NO: 45) que contêm elementos de ligação ao factor de transcripção STAT de 4 genes, que inclui um elemento induzível c-fos Sis modificado (m67SIE ou hSIE) (Sadowski, H. et al. , Science 261: 1739-1744, 1993), o p21 SIE1 do gene p21 WAF1 (Chin, E, et al., Science 272: 719-722, 1996), o elemento de resposta de glândula mamária do gene da β-caseína (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755, 1991), e um elemento induzível STAT do gene Fcg RI, (Seidel, H. et al., Proc. NatL Acad. Sei. 92:3041-3045, 1995). Estes oligonucleótidos contêm extremidades compatíveis com Asp718-XhoI e foram ligados, utilizando métodos convencionais, a um vector indicador de luciferase de pirilampo receptor com um promotor de c-fos (Poulsen, LK. et al., J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998) digerido com as mesmas enzimas e que continha um marcador de selecção de neomicina. O plasmídeo KZ134 foi utilizado para transfectar de forma estável células BaF3, utilizando 195 métodos de transfecção e selecção padrão para obter a linha celular BaF3/KZ134.

Foi construída uma linha celular indicadora de BaF3/KZ134 estável, que expressava o receptor zcytorl7 de comprimento completo ou o receptor zcytorl7/0SMRbeta de acordo com o Exemplo 4. Os clones foram diluídos, cultivados em placas e seleccionados utilizando técnicas convencionais. Os clones foram rastreados pelo ensaio de luciferase (veja-se o Exemplo 20B, indicado a seguir) utilizando o meio condicionado de zcytorl71ig humano ou a proteína zcytorl71ig purificada (veja-se o Exemplo 35, indicado a seguir) como indutor. Foram seleccionados clones com a maior resposta a luciferase (por meio de luciferase STAT) e o menor nível de fundo. Foram seleccionados as linhas celulares transfectantes. As linhas celulares foram denominadas BaF3/KZ134/zcytorl7 ou BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta dependendo dos receptores introduzidos por transfecção na linha celular.

De forma similar, também foram construídas linhas celulares BHK utilizando o método descrito no presente documento, e foram utilizados em ensaios de luciferase descritos no presente documento. As linhas celulares foram denominadas BHK/KZ1344/zcytor17 ou BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta dependendo dos receptores introduzidos por transfecção na linha celular. B. Zcytorl71iq humano activa o receptor zcytorl7 humano no ensaio de luciferase BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta ou BHK/KZ134/zcytorl7/0SMRbeta.

Foram centrifugadas células BaF3/KZ134/zcytorl7 e BaF3/KZ134/zcyorl7/OsMRbeta e foram lavadas em meio sem mIL-3. As células foram centrifugadas e foram lavadas 3 vezes para garantir a eliminação de mIL-3. Depois, as células foram contadas em hemacitómetro. As células foram cultivadas num formato de 96 poços a aproximadamente 30.000 células por poço num volume de 100 μΐ por poço utilizando o 196 meio sem mIL-3. Foi utilizado o mesmo método para as células BaF31KZ134 não transfectadas para uso como um controlo no ensaio posterior. Foram cultivadas células BHK/KZ134/xcytorl7 ou BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta num formato de 96 poços a 15.000 células por poço em 100 μΐ de meio. Como controlo foram utilizadas células BHK/KZ134 parentais. lendo A activação por STAT das células BaF3/KZ134/Zcytor17, BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta, BHK/KZ134/zcytorl7 ou BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta foi avaliado utilizando (1) meio condicionado de células BHK570 transfectadas com o zcytorl71ig humano (Exemplo 7), (2) meio condicionado de células BHK570 transfectadas com zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18), (3) zcytorl71ig humano purificado (Exemplo 35), ou (4) meio sem mIL-3 para medir a resposta de controlo somente com meio. O meio condicionado foi diluído com meio RPMI sem mIL-3 a concentrações de 50 %, 25 %, 12,5 %, 6,25 %, 3,125 %, 1,5 %, 0,75 % e 0,375 %. O zcytorl71ig humano purificado foi diluído a uma concentração de 1200, 600, 300, 150, 75, 37,5, 18,75 ou 9,4 pM. Foram adicionados cem microlitros do meio condicionado diluído ou proteína às células BaF3/KZ134/Zcytorl7, BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta, BHK/KZ134/zcytorl7 ou BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta. O ensaio utilizando o meio condicionado foi realizado em paralelo em células de BaF3/KZ134 não transfectadas ou BHK/KZ134 como controlo. O volume total de ensaio foi de 200 μΐ. As placas de ensaio foram incubadas a 37 °C, com 5 % de CO2 durante 24 horas, depois do que as células de BaF3 foram preipitadas por centrifugação a 2000 rpm durante 10 min., e o meio foi aspirado, e foram adicionados 25 μΐ de tampão de lise (Promega). Para as linhas celulares BHK, a etapa de centrifugação não foi necessária já que as células são aderentes. Depois de 10 minutos a temperatura ambiente, as placas foram medidas com respeito à activação da construção indicadora STAT lendo num luminómetro (Labsystems 197

Luminoskan, modelo RS) que adicionou 40 μΐ de substrato de ensaio de luciferase (Promega) a um integração de cinco segundos.

Os resultados deste ensaio confirmaram que a resposta do indicador STAT das células BaF3/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta e BHK/KZ134/zcytorl7/OSMRbeta ao zcytorl71ig humano em comparação com as células BaF3/KZ134/zcytorl7, as células BHK/KZ134/zcytorl7 ou as BaF3/KZ134 não transfectadas ou células de controlo BHK/KZ134, mostraram que a resposta estava mediada pelos receptores zcytor17/OSMRbeta. Os resultados também mostraram que o zcytorl71ig de ratinho não activa o ensaio indicador STAT por meio do complexo de receptor humano.

Exemplo 21 zcytorl71iq de ratinho é activo em ensaio de medula óssea de ratinho A. Isolamento de células de medula de baixa densidade não aderentes:

Aspirado de fémur de ratinho fresco (medula) foi obtido de ratinhos Balb/C ou c57BL/6 de 6-10 semanas de idade, macho. A medula depois é lavada com RPMI + FBS a 10 % (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) e é suspensa em RPMI + FBS a 10 % como uma suspensão de células de medula inteiras. A suspensão de células de medula inteiras depois é submetida a um gradiente de densidade (Nycoprep, 1.077, Animal: Gibco BRL) para enriquecer com respeito às células de baixa densidade, principalmente mononucleares, como segue: a suspensão de células de medula inteiras (aproximadamente 8 ml) é pipetado cuidadosamente sobre aproximadamente 5 ml de solução em gradiente Nycoprep num tubo cónico de 15 ml, e depois é centrifugado a 600 X g durante 20 minutos. Depois é retirada a camada interfacial, que contém as células mononucleares de baixa densidade, é lavada com excesso de RPMI + FBS a 10 % e é precipitada por centrifugação a 400 X g durante 5-10 minutos. Este 198 sedimento é ressuspenso em RPMI + FBS A 10 % e é cultivado num balão T-75 aproximadamente 106 células/ml, e é incubada a 37 °C, com 5 % de CO2 durante aproximadamente 2 horas. As células resultantes em suspensão são Células de Medula de Baixa Densidade Não Aderentes (NA LD). B. Ensaio de 96 poços São cultivadas Células de Medula de Ratinho NA LD de 25.000 a 45.000 células/poço em placas de cultura de tecido de 96 poços em RPMI + FBS a 10 % + 1 ng/ml de Factor de Células estaminais de ratinho (mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN) , mais 5 % de meio condicionado de um dos seguintes: (1) células BHK 570 que expressam zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18), (2) células BHK 570 que expressam zcytorl71ig humano (Exemplo 7), ou (3) células BHK 570 de controlo que contêm vector e que não expressam nenhum ligando. Estas células depois são submetidas a uma diversidade de tratamentos com citocinas para ensaiar a expansão ou diferenciação de células hematopoiéticas da medula. Para o ensaio, as células de medula de ratinho NA LD cultivadas são submetidas a Interleucina-15 humana (hlL-15) (R&D Systems), ou uma de um painel de outras citocinas (R&D System). É ensaiada a diluição em série de hll-15; ou as outras citocinas, com uma diluição em série duas vezes desde uma concentração de aproximadamente 50 ng/ml a aproximadamente 0,5 ng/ml. Depois de 8 a 12 dias os ensaios de 96 poços são pontuados com respeito à proliferação celular pelo ensaio de Alamar Blue como é descrito no Exemplo 5B. C. Resultados do ensaio de Medula de Ratinho NA LD de 96 poços

O meio condicionado das células BHK que expressam zcytorl71ig de ratinho e humano pode promover a expansão de uma população de células hematopoiéticas individualmente ou em sinergia com outra citocina na medula de ratinho NA LD em comparação com meio condicionado de BHK de controlo. A 199 população de células hematopoiéticas expandidas pelo zcytorl71ig de ratinho com ou sem outras citocinas, e as células hematopoiéticas expandidas pelo zcytorl71ig humano com ou sem outras citocinas, são propagadas adicionalmente em cultura celular. Estas células hematopoiéticas são coradas com um anticorpo anti-Pan célula NK marcado com ficoeritrina (PharMingen) e são submetidas a uma análise de citometria de fluxo, que demonstrou que as células expandidas são coradas positivamente para este marcador de células assassinas naturais (NK) . De forma similar, podem ser utilizados outros marcadores específicos de células hematopoiéticas para determinar a expansão de, por exemplo, células T CD4+ ou CD8+, outras populações de células T, linfócitos B e outros marcadores de células imunes. 0 mesmo ensaio de 96 poços é realizado utilizando células de medula humana fresca procedentes de mPoieticTechnologies, Gaithersburg, MD. De novo, um resultado positivo amostra que zcytorl71ig somente ou em sinergia com outras citocinas, o zcytorl71ig de ratinho e humano pode expandir uma população de células hematopoiéticas que é corada positivamente por marcadores celulares específicos como foi revelado anteriormente. Exemplo 22

Construções para gerar ratinhos transgénicos para zcytor 171ig A. Construção para expresar zcytorl71iq humano a partir do promotor de MT-1

Foram desenhados oligonucleótidos para gerar um fragmento de PCR que continha uma sequência Kozak consenso e a região codificante de zcytorl71ig humana. Estes oligonucleótidos foram desenhados com um local Fsel na extremidade 5' e um local Asei na extremidade 3' para facilitar a clonagem em (a) pMT12-8, um vector transgénico convencional ou (b) pKF051, um vector transgénico específico de linfóide (Exemplo 22B). 200

As reacções de PCR são realizadas com aproximadamente 200 ng de molde de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 1) e oligonucleótidos desenhados para amplificar a comprimento completo ou a parte activa do zcytorl71ig. As condições de reacção de PCR são determinadas utilizando métodos conhecidos no estado da técnica. Os produtos de PCR são separados por electroforese em gel de agarose e são purificados utilizando um kit de extracção de gel QiaQuick™ (Qiagen). O fragmento de ADN do tamanho correcto, isolado, é digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim), é precipitado com etanol e é digerido em pMT12-8 previamente digerido com Fsel e Asei. O plasmídeo pMT12-8, desenhado para a expressão de um gene de interesse em fígado e outros tecidos em ratinhos transgénicos, contém uma cassete de expressão flanqueada por 10 kb de ADN 5'-MT-1 e 7 kb de ADN 3' MT-1 A cassete de expressão compreende o promotor de MT-1, o intrão II de insulina de rato, um polilinker para a inserção do clone desejado e a sequência poli A da hormona de crescimento humana (hGH).

Aproximadamente um microlitro de cada de reacção de ligação é introduzido por electroporação em células DH10B ElectroMax™ competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) de acordo com as instruções do fabricante e é cultivado em placas LB que contêm 100 μg/ml de ampicilina, e são incubadas durante a noite. As colónias são colhidas e cultivadas em meio LB que contém 100 μ9/ιη1 de ampicilina. É preparado ADN Miniprep a partir dos clones seleccionados e é rastreado com respeito ao inserto de zcytorl71ig humano por digestão de restrição com EcoRI sola, ou Fsel e Asei combinadas, e posteriormente electroforese em gel de agarose. São realizadas Maxipreps do pMT-zcytor171ig humano correcto. É preparada um fragmento Sall que contém as sequências flanqueantes 5' e 3', o promotor de MT-1, o intrão II de insulina de rato, ADNc de zcytorl71ig humano e a sequência poli A de hGH para serem utilizados para 201 microinjecção em ovócitos murinos fertilizados. A microinjecção e a produção de ratinhos transgénicos é realizada como é descrito em Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994. B. Construção para a expressão de zcytorl71ig humano a partir do promotor de ΕμίΧΚ específico de linfóide. São desenhados oligonucleótidos para gerar um fragmento de PCR que contém uma sequência Kozak consenso e a região codificante de zcytorl71ig humano. Estes oligonucleótidos são desenhados com um local Fsel na extremidade 5' e um local Asei na extremidade 3' para facilitar a clonagem em pKF051, um vector transgénico específico de linfóide.

As reacções de PCR são realizadas com aproximadamente 200 ng de molde de zcytorl71ig humano (SEQ ID NO: 1) e oligonucleótidos desenhados para amplificar o comprimento completo ou a parte activa de zcytorl71ig. É realizada uma reacção de PCR utilizando métodos conhecidos na técnica. O fragmento de ADN de tamanho correcto isolado é digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim), é precipitado com etanol e se liga a pKF051 previamente digerido com Fsel e Asei. O vector transgénico pKF051 procede de pl026X (Iritani, B.M., et al., EMBO J. 16: 7019-31, 1997) e contém o promotor próximo lck especifico de células T, o potenciador da cadeia pesada μ de imunoglobulina especifica de linfócitos B/T, um polilinker para a inserção do clone desejado e um gene de hGH mutado que codifica uma hormona de crescimento inactiva (que proporciona intrões 3' e um sinal de poliadenilação). Aproximadamente um microlitro de cada reacção de ligação é introduzido por electroporação, é cultivado, os clones são colhidos e são rastreados com respeito ao inserto de zcytorl71ig humano por digestão de restrição como foi descrito anteriormente. Um clone correcto de 202 pKF051 -zcytorl71ig é verificado por sequenciamento, e é realizado um Maxiprep deste clone. É preparado um fragmento Notl que contém o promotor proximal lck e o potenciador μ de imunoglobulina (ΕμίΧΚ), ADNc de zcytorl71ig, e o gene de hGH mutado para ser utilizado para a microinjecção em ovócitos murinos fertilizados. C. Construção para a expressão de zcytorl71iq de ratinho a partir do promotor de EF1 alfa

Foram utilizados iniciadores ZC41,498 (SEQ ID NO: 86) e ZC41,496 (SEQ ID NO: 87) para amplificar por PCR um molde de biblioteca de ADNc de testículo de ratinho. Estas reacções de PCR foram realizadas satisfatoriamente em volumes de aproximadamente 50 μΐ com ou sem 10 % de DMSO, utilizando pfu turbo polimerase (Stratagene) de acordo com as recomendações do fabricante; com uma aplicação adicional de um iniciador a alta temperatura de cera utilizando início a alta temperatura 50s (Molecular Bioproducts, Inc. San Diego, CA). Os ciclos térmicos de PCR foram realizados com somente um ciclo de 94 °C durante 4 min; seguido de 40 ciclos de 94 °C: 30 segundos, 48 °C: 30 segundos, 72 °C: 50 segundos; com uma extensão final adicional de 72 °C durante 7 minutos. As duas reacções de PCR foram agrupadas e foram purificadas utilizando agarose de baixo ponto de fusão e a enzima de digestão de agarose Gelase (Epicenter, Inc. Madison, WI) de acordo com as recomendações do fabricante.

Os produtos de PCR com o ADN sequenciado revelaram uma sequência de ADNc de zcytorl7 murino (SEQ ID NO: 90) que compreendia uma ORF idêntica à SEQ ID NO: 10, confirmando que a SEQ ID NO: 10 codificava o polipéptido zcytorl71ig de ratinho. Depois foram utilizados iniciadores de PCR, ZC41583 (SEQ ID NO: 88) e ZC41584 (SEQ ID NO: 89), para adicionar locais de restrição Fsel e Asei e uma sequência Kozak parcial à grelha de leitura aberta de mcytorl71ig e codão de terminação (SEQ ID NO: 92). Foi utilizado um termociclador Robocycler 40 (Stratagene) para realizar um 203 gradiente de temperaturas de hibridação e ciclos como segue. Foi aplicado Pfu turbo polimerase (Stratagene) como foi descrito anteriormente, mas somente em DMSO a 10 %. Os ciclos foram realizados com somente um ciclo de 94 °C durante 4 min; seguido de 20 ciclos de 94 °C: 30 segundos, gradiente de 65 °C a 51 °C: 30 segundos, 72 °C: 1 minuto; e somente uma extensão a 72 °C durante 7 minutos. O molde para esta segunda reacção de ciclos térmicos foi 1 μΐ do produto de PCR mcytorl71ig purificado em gel inicial, indicado anteriormente. O produto de PCR resultante das três reacções à menor temperatura foi agrupado e foram purificadas em gel utilizando o método de Gelase (Epicenter) descrito anteriormente. Este fragmento purificado depois foi digerido com Fsel e Asei e foi ligado ao vector pZP7X modificado para ter locais Fsel e Asei em seu local de clonagem. Isto foi enviado a sequenciamento para confirmar a sequência correcta. A sequência de ADNc murina clonada é representada na SEQ ID NO: 90, e a sequência de polipéptido correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 91 (que é idêntica à SEQ ID NO: 11) . O fragmento de ADN com o tamanho correcto, isolado, digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim) foi subclonado num plasmideo que continha o promotor de EF1 alfa previamente digerido com Fsel e Asei. Foram realizadas Maxipreps de EFlalfa zcytorl71ig de ratinho correcto. a cassete de expressão contém o promotor EF1 alfa (com um local Fsel deletado), o intrão de EF1 alfa, um local similar a SUR IRES para facilitar a expressão, um polilinker flanqueado com locais de insulina II de rato na extremidade 5' que adiciona locais Fsel, Pmel e Asei para a inserção do clone desejado, e a sequência poli A da hormona de crescimento humana (hGH). Foi preparado um fragmento Notl de 7,5 kb que continha a cassete de expressão de promotor de EFlalfa e zcytorl71ig de ratinho para ser utilizado para microinjecção em ovócitos murinos 204 fertilizados. O plasmídeo EFlalfa foi obtido de Louis-Marie do Laboratoire de Differentiation Cellulaire, como é descrito em Taboit-Dameron et al., 1999, Transgenic

Resejarch 8: 223-235. D. Construção para a expressão de zcytorl71ig de ratinho a partir do promotor de ΕμίΰΚ específico de linfóide

Foram desenhados oligonucleótidos para gerar um fragmento de PCR que continha uma sequência Kozak consenso e a região codificante de zcytorl71ig de ratinho. Estes oligonucleótidos foram desenhados com um local Fsel na extremidade 5' e um local Asei na extremidade 3' para facilitar a clonagem em pKF051 (veja-se Exemplo 22B, anterior). O fragmento de ADN de zcytorl71ig com o tamanho correcto, isolado, utilizado nas construções de EFlalfa, digerido com Fsel e Asei (Boerhinger-Mannheim), foi subclonado num plasmídeo que continha pKF051, um vector transgénico específico de linfóide. O vector transgénico pKF051 procede de pl026X (Iritani, B.M., et al., EMBO J. 16:7019-31, 1997) e contém o promotor proximal lck específico de células T, o potenciador da cadeia pesada μ de imunoglobulina específica de linfócitos B/T, um polilinker para a inserção do clone desejado, e um gene de hGH mutado que codifica uma proteína de hormona de crescimento inactiva (proporcionando intrões 3' e uma sinal de poliadenilação). Foi preparado um fragmento Notl de 6,5 kb, que continha o promotor proximal lck e o potenciador μ de imunoglobulina (ΕμίΧΚ), ADNc de zcytorl71ig de ratinho, e o gene de hGH mutado para ser utilizado para a microinjecção em ovócitos murinos fertilizados (Exemplo 41) .

Exemplo 23

Construção de vectores de expressão de mamífero que expressam zcytor 171ig-CEE A. Construção de zCytor17Lig-CEE/pZMP21 205

Foi construído um plasmídeo de expressão que continha todo ou parte de um polinucleótido que codificava zCytorl71ig humano por meio de recombinação homóloga. O plasmídeo foi denominado zCytorl7Lig-CEE/pZMP21. A construção de zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 foi realizada gerando um fragmento zCytor 17Lig-CEE (SEQ ID NO: 95) (sua sequência de aminoácidos correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 96) utilizando amplificação por PCR. O molde de ADN utilizado para a produção do fragmento zCytorl7Lig-CEE foi zCytorl7Lig/pZP7nx. Os iniciadores utilizados para a produção do fragmento zCytorl7Lig-CEE foram: (1) ZC41607 (SEQ ID NO: 97) (sequência com sentido), que inclui desde a extremidade 5' até a extremidade 3': 28 pb da sequência flanqueante do vector (5' do inserto) e 21 pb que correspondem à sequência 5' de zCytorl7Lig; e (2) ZC41605 (SEQ ID NO: 98) (sequência anti-sentido) , que inclui desde a extremidade 5' até a extremidade 3': 37 pb da sequência flanqueante do vector (3' do inserto), 3 pb do codão de terminação, 21 pb que codificam um marcador EE C-terminal e 21 pb que correspondem à extremidade 3' da sequência de zCytorl7Lig. O fragmento resultante da amplificação por PCR anterior é uma cópia do molde zCytorl7Lig com a adição de um marcador EE C-terminal, produzindo um produto final zCytor17Lig-CEE.

As reacções de PCR foram realizadas como segue: A um volume final de 100 μΐ foram adicionados: 10 μΐ de Tampão de Reacção de Taq Polimerase lOx com MgCl 15 mM (Gibco), 1 μΐ de Taq ADN Polimerase (5 unidades/μΐ, Gibco), 3 μΐ de dNTP 10 mM, 78 μΐ de dH20, 3 μΐ de uma solução de reserva de 20 pmol/μΐ de iniciador ZC41607 (SEQ ID NO: 97) 3 μΐ de uma solução de reserva de 20 pmol/μΐ de iniciador ZC41605 (SEQ ID NO: 98), e 2 μΐ de uma solução de reserva de 0,13 μρ/μΐ de ADN molde de zCytorl71ig. Foi adicionado um volume igual a 50 μΐ de óleo mineral à mistura. A reacção foi aquecida até 94 °C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos 206 a 94 °C durante 1 minuto; 55 °C durante 2 minutos; 72 °C durante 3 minutos; seguido de uma extensão de 10 minutos a 72 °C e mantida a 4 °C até que foi colhido a reacção. O plasmideo pZMP21 foi digerido com enzima de restrição BglII, foi limpo com o Kit de Purificação de PCR QiaQuick (Qiagen) utilizando um protocolo de microcentrífuga, e foi utilizada para a recombinação com o fragmento de PCR. O plasmideo pZMP21 foi construído a partir de pZMP20 que foi construído a partir de pZP9 (depositado na Colecção Americana de Culturas Celulares, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e é designado N° 98668) com os elementos genéticos de levedura tomados de pRS316 (depositado na Colecção Americana de Culturas Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e designado N° 77145), um elemento IRES de poliovírus, e o domínio extracelular de CD8, truncado na extremidade carboxilo terminal do domínio transmembranar. PZMP21 é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor de MPSV, um intrão de péptido sinal de imunoglobulina, múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, um codão de terminação e um terminador de hormona de crescimento humana. O plasmideo também uma origem de replicação de E. coli uma unidade de expressão de um marcador de selecção de mamífero que tem um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene de DHFR, o terminador de SV40, assim como a sequências URA3 e CEN-ARS necessárias para a selecção e replicação em S. cerevisiae.

Foram combinados 50 μΐ de células de levedura competentes (S. cerevisiae) independentemente com 100 ng de plasmideo cortado, 5 μΐ de mistura de PCR descrita previamente, e foram transferidos a uma cuveta de electroporação de 0,2 cm. A mistura de levedura/ADN foi submetido a electropulsos a 0,75 kV (5 kV/cm), infinitos 207 ohms, 25 μΡ. A cada cuveta foram adicionados 600 μΐ de sorbitol 1,2 M e a levedura foi cultivada numa aliquota de 100 μΐ e uma aliquota de 300 μΐ em duas placas URA-D e foi incubada a 30 °C. Depois de aproximadamente 72 horas, os transformantes de levedura Ura+ de somente uma placa foram ressuspensos num 1 ml de H2O e foram centrifugadas brevemente para sedimentar as células de levedura. O sedimento celular foi ressupenso em 500 μΐ de tampão de lise (Triton X-100 a 2 %, SDS a 1 %, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris, pH 8,0, 1 mM de EDTA) . Os 500 μΐ da mistura de lise foram adicionados a um tubo Eppendorf que continha 300 μΐ de pérolas de vidro de 600 μιη lavadas com ácidos e 300 μΐ de fenol clorofórmio, submetidos e vórtex durante intervalos de 1 minutos duas ou três vezes, seguido de uma centrifugação 5 minutos numa centrífuga Eppendorf a velocidade máxima. Trezentos microlitros da fase aquosa foram transferidos a um tubo limpo, e o ADN foi precipitado com 600 μΐ de etanol a 100 % (EtOH), seguido de centrifugação durante 10 minutos a 4 °C. O sedimento de ADN depois foi lavado com 500 μΐ de EtOH ao 70 %, seguido de centrifugação durante 1 minuto a 4 °C. O sedimento de ADN foi ressupenso em 30 μΐ de H20. A transformação de células E. coli electrocompetentes (MC1061) foi realizada com 5 μΐ da preparação de ADN de levedura e 50 μΐ de células MC1061. As células foram submetidas a electropulsos a 2,0 kV, 25 μΡ e 400 ohms (Ω) . Depois da electroporação, foram adicionados 600 μΐ de SOC (Bacto Tryptone a 2 % (Difco, Detroit, MI), extracto de levedura a 0,5 % (Difco), 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgC12, 10 mM de MgSCt, 20 mM de glicose). As células E. coli submetidas a electroporação são cultivadas numa aliquota de 200 μΐ e 50 μΐ em duas placas de LB AMP (caldo LB (Lennox) , Bacto Agar a 1,8 % (Difco), 100 mg/1 de Ampicilina) . As placas foram incubadas em posição vertical durante aproximadamente 24 horas a 37 °C. Foram 208 seleccionadas três colónias resistentes a ampicilina aleatoriamente e foram enviadas para análise de sequência do inserto. O ADN de plasmídeo foi isolado a grande escala a partir de um clone com a sequência confirmada utilizando o kit Qiagen Maxi (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. B. Expressão em mamífero de zcytor 171ig humano

Proteína zCytorl7Lig de comprimento completo foi produzida em células BHK transfectadas com zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 (Exemplo 23A). Células BHK 570 (ATCC CRL-10314) foram inoculadas em balões de cultura de tecido T75 e foram deixadas que crescessem até uma confluência de aproximadamente 50 a 70 % a 37 °C, com 5 % de C02, em meio de crescimento (SL7V4, FBS a 5 %, pen/strep a 1 %) . As células depois foram transfectadas com zCytorl7Lig- CEE/pZMP21 por transfecção mediada por lipossomas (utilizando Lipofectamine™; Life Technologies), em meio livre de soro (SF) (SL7V4). O plasmídeo (16 μρ) foi diluído em tubo de 1,5 ml até um volume final total de 640 μΐ com meio SF. Trinta cinco microlitros da mistura de lípido foram misturados com 605 μΐ de meio SF, e a mistura resultante foi deixada incubar aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. Depois foram adicionados 5 mililitros de meio SF à mistura de ADN: lípido. As células foram enxaguadas uma vez com 10 ml de PBS, o PBS foi decantado, e a mistura de ADN:lípidos foi adicionada. As células são incubadas a 37 °C durante cinco horas, e depois foram adicionados 15 ml de meio (SL7V4, FBS a 5 %, pen/strep a 1 %) a cada placa. As placas foram incubadas a 37 °C durante a noite e a mistura de ADNimeio de lípidos foi substituída por meio de selecção (SL7V4, FBS a 5 %, pen/strep a 1 %, 1 μΜ de metotrexato) no dia seguinte. Aproximadamente 10 dias depois da transfecção, colónias resistentes a metotrexato do balão de transfecção T75 foram tripsinizadas e as 209 células foram agrupadas e foram inoculadas num balão T = 162 e foram transferidas a uma cultura a grande escala. Exemplo 24

Expressão de receptor solúvel zcytorl7 em E. coli A. Construção de vector de expressão pCMHOl que expressa polipéptido de fusão huzcytorl7/MBP-6H

Foi construído um plasmídeo de expressão que continha um polinucleótido que codificava um receptor solúvel zcytorl7 fusionado na extremidade C a proteína de ligação a maltose (MBP) por meio de recombinação homóloga. O polipéptido de fusão contém uma parte de MBP de aproximadamente 388 aminoácidos N-terminal fusionada a qualquer dos receptores solúveis zcytorl7 descritos no presente documento. Foi isolado um fragmento de ADNc de zcytorl7 (SEQ ID NO: 4) utilizando PCR como é descrito no presente documento. Foram utilizados dois iniciadores na produção do fragmento de zcytorl7 numa reacção de PCR convencional: (1) um que contém aproximadamente 40 pb da sequência flanqueante do vector e aproximadamente 25 pb correspondentes à extremidade amino do zcytorl7, e (2) outro que contém aproximadamente 40 pb da extremidade 3' correspondente à sequência flanqueante do vector e aproximadamente 25 pb correspondentes à extremidade carboxilo do zcytorl7. Dois μΐ da reacção de PCR de 100 μΐ foram introduzidos num gel de agarose a 1,0 % com tampão TBE 1 x para a análise, e o fragmento aproximadamente esperado foi observado. A reacção de PCR restante foi combinada com o segundo tubo de PCR e foi precipitada com 400 μΐ de etanol absoluto. O ADN precipitado foi utilizado para a recombinação no vector pTAP170 receptor cortado com Smal para produzir a construção que codificava a fusão MBP-zcytorl7 como é descrito a seguir.

Foi obtido plasmídeo pTAP170 a partir dos plasmídeos pRS316 e pMAL-c2. O plasmídeo pRS316 é um vector transportador de Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. e 210

Sikorski, R., Genetics 122:19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) é um plasmídeo de expressão de E. coli. Porta o promotor tac que dirige MalE (gene que codifica MBP) seguido de um marcador His, um local de clivagem por trombina, um local de clonagem e o terminador rmB. O vector pTAP170 foi construído utilizando recombinação homóloga da levedura. Foram recombinados 100 ng de pMAL-c2 cortado com EcoRl com 1 μg de pRS316 cortado com Pvul, 1 μg de línker e 1 μg de pRS316 cortado com Scal/EcoRI. O linker consistia nos oligos zcl9,372 (SEQ ID NO: 157) (100 pmol): zcl9,351 (SEQ ID NO: 158) (1 pmol): zcl9,352 (SEQ ID NO: 159) (1 pmol), e zcl9,371 (SEQ ID NO:160) (100 pmol) combinados numa reacção de PCR. As condições foram as seguintes: 10 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 50 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos; seguido de imersão a 4 °C. Os produtos de PCR foram concentrados por meio de precipitação com etanol a 100 %.

Cem microlitros de células de levedura competentes (S. cerevisiae) foram combinados com 10 μΐ de uma mistura que continha aproximadamente 1 μg do inserto de zcytorl7 humano, e 100 ng de vector pTAP170 digerido com Smal, e foram transferidos a uma cuveta de electroporação de 0,2 cm. A mistura de levedura/ADN foi submetida a electropulsos a 0,75 kV (5 kV/cm) , infinitos ohms, 25 μΡ. A cada cuveta foram adicionados 600 μΐ de sorbitol 1,2 Μ. A levedura depois foi cultivada em duas alíquotas de 300 μΐ sobre duas placas de -URA D e foram incubados a 30 °C.

Depois de aproximadamente 48 horas, os transformantes de levedura Ura+ de somente uma placa foram seleccionados, foi isolado o ADN e foi utilizado para transformar células E. coli electrocompetentes (por exemplo, MC1061, Casadaban et. al. J. Mol. Biol. 138, 179-207) e são inoculados em placas com MM/CA+KAN a 25 μg/l (Pryor e Leiting, Protein Expression and Purification 10:309-319, 1997) utilizando métodos convencionais. As células são inoculadas em MM/CA 211 com 25 μg/ml de Kanamicina durante duas horas, com agitação a 37 °C. Um ml do cultura foi induzido com IPTG 1 mM. De duas a quatro horas depois, os 250 μΐ de cada cultura foram misturados com 250 μΐ de pérolas de vidro lavadas com ácido e 250 μΐ de tampão Thomer com βΜΕ a 5 % e corante (ureia 8 M, Tris 100 mM pH 7,0, glicerol a 10 %, 2 mM de EDTA, SDS a 5 %) . As amostras foram submetidas a agitação com vórtex durante um minuto e foram aquecidas a 65 °C durante 10 minutos. Foram carregados 20 μΐ por pista num gel PAGE de 4 % a 12 % (NOVEX). Os géis foram processados em tampão MES IX. Os clones positivos foram denominados pCMHOl e foram submetidos a análise de sequência.

Um microlitro de ADN de sequenciamento foi utilizado para transformar a estirpe BL21. As células foram submetidas a electropulsos a 2,0 kv, 25 μΕ e 400 ohm. Depois da electroporação, 0,6 ml de MM/CA com 25 μg/l de Kanomiacina. As células foram crescidas em MM/CA e foram induzidas com ITPG como foi descrito anteriormente. Os clones positivos foram utilizados para crescer com respeito à purificação de proteína da proteína de fusão huzcytor17/MBP-6H utilizando técnicas convencionais. B. Purificação do receptor solúvel huzcytor17/MBP-6H por fermentação de E. coli A menos que se indique outra cosa, todas as operações foram realizadas a 4 °C. O seguinte método foi utilizado para a purificação do polipéptido receptor solúvel huzcytor17/MBP-6H recombinante. Foram construídas células E. coli que continham a construção pCMHOl e que expressavam o polipéptido receptor solúvel buzcytorl7/MBP-6H utilizando métodos de biologia molecular convencionais e são cultivados em SuperBroth II (12 g/1 de Casien, 24 g/1 de Extracto de Levedura, 11,4 g/1 de fosfato de dipotássio, 1,7 g/1 de fosfato de monopotássio; Becton Dickenson, Cockeysville, MD) . As células resultantes foram colhidas e congeladas em glicerol a 0,5 %. Para a purificação de 212 proteínas foram utilizados vinte gramas de células congeladas.

As células descongeladas foram ressuspensas em 500 ml de tampão de Equilíbrio de Amilose (Tris 20 nM, NaCl 100 mM, pH 8,0). Para lisar as células foi utilizado um sistema de ruptura de células de Prensa French (Constant Systems Ltd., Warwick, UK) com um ajuste da temperatura de -7 °C a -10 °C e 206,79 MPa. A ruptura das células resuspendidas foi verificada por leituras de A6oo antes e depois dos ciclos através da Prensa French. A suspensão de células lisadas foi precipitada a 10.000 G durante 30 minutos. Foi colhido o sobrenadante do sedimento de detritos para a purificação de proteínas.

Vinte e cinco ml de resina de Amilose (New England Biolabs, Beverly, MA) foram deitados numa coluna de vidro Bio-Rad, de 2,5 cm de diâmetro por 10 cm de altura. A coluna foi cheia e foi equilibrada por gravidade com 10 volumes de coluna (VC) de tampão de equilíbrio de Amilose. O sobrenadante celular colhido foi carregado por lotes na resina de Amilose, durante a noite com agitação. A resina carregada foi devolvida à coluna de vidro, foi lavada com 10 VC de tampão de Equilibro de Amilose e foi eluída por gravidade com -2 VC de tampão de Eluição de Amilose (tampão de Equilíbrio de Amilose, Maltose 10 mM, Fluka Biochemical, Suiza) . Foram colhidas dez fracções de 5 ml ao longo do perfil de eluição e foram ensaiadas com respeito à absorvância a 280 e 320 nm. A resina de Amilose foi regenerada com 1 VC de H2O destilada, 5 VC de SDS a 0,1 % (p/v) (Sigma), 5 VC de H2O destilada, 5 VC de tampão de Equilíbrio de Amilose, e finalmente 1 VC de tampão de Armazenamento de Amilose (tampão de Equilíbrio de Amilose, Azida Sódica ao 0, 02 % (p/v) ) . A resina regenerada foi armazenada a 4 °C.

Foram agrupadas as fracções do perfil de eluição de interesse e foram submetidas a diálise numa câmara de 213 diálise 10 K (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemical) contra 4 trocas de 4 1 de PBS pH 7,4 (Sigma) durante um período de tempo de 8 horas. Depois da diálise, o material colhido representava o polipéptido huzcytorl7/MBP-6H purificado. O polipéptido huzcytorl7/MBP-6H purificado foi esterilizado por filtração e foi analisado por meio de coloração com Coomasie e SDS-PAGE para um produto com o peso molecular apropriado. A concentração do polipéptido huzcytor17/MBP-6H foi determinada por análise BCA e foi de 0,76 mg/ml. O polipéptido huzcytor17/MBP-bH purificado foi formulado de maneira apropriada para a imunização de coelhos e foi enviado a R & R Resejarch and Development (Stanwood, WA) para a produção de anticorpos policlonais (Exemplo 25, a seguir) .

Exemplo 25

Anticorpo Policlonal de Receptor Solúvel zcytor!7 Humano A. Preparação e Purificação

Foram preparados anticorpos policlonais imunizando 2 coelhos brancos New Zealand fêmea com a proteína recombinante purificada huzcytorl7/MBP-6H (Exemplo 24). Cada coelho recebeu uma injecção intraperitoneal (IP) inicial de 200 μg de proteína purificada em Adjuvante Completo de Freund seguido de injecções IP de reforço de 100 μg de proteína em Adjuvante Incompleto de Freund a cada três semanas. De sete a dez dias depois da administração da segunda injecção de reforço (3 injecções em total), foi extraído sangue dos animais e foi colhido o soro. Os animais depois foram submetidos a reforços e a extracções de sangue a cada três semanas. O soro de coelho específico para huzcytorl7/MBP-6H foi pré-absorvido de anticorpos anti-MBP utilizando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que foi preparada utilizando 10 mg de proteína de fusão-MBP recombinante purificada não específica por grama de CNBr-SEPHAROSE. Os anticorpos policlonais específicos para 214 huzcytorl7/MBP-bH foram purificadas por afinidade a partir do soro de coelho pré-adsorvido utilizando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE- 4B (Pharmacia LKB) que foi preparada utilizando 10 mg da proteína recombinante purificada a partir do antigénio específico huzcytorl7/MBP-6H. Depois da purificação, os anticorpos policlonais foram submetidos a diálise com 4 trocas de 20 vezes o volume de anticorpo de PBS durante um período de tempo de pelo menos 8 horas. Os anticorpos específicos para Huzcytorl7 foram caracterizados por ELISA utilizando 500 ng/ml da proteína recombinante purificada huzcytorl7/MBP-6H como alvo de anticorpo. O limite inferior de detecção (LID) do anticorpo purificado por afinidade anti-huzcytorl7/MBP-6H de coelho foi 500 pg/ml em seu antigénio recombinante purificado específico huzcytorl7/MBP-6H. B. Análise de SDS-PAGE e Western blotting de anticorpo de coelho Anti-ZcytoR17 MBP-6H Humano

Foi ensaiado anticorpo de coelho anti-ZcytoR17 MBP-6H humano por SDS-PAGE (NuPage 4-12 %, Invitrogen, Carlsbad, CA) com o método de coloração com coomassie e Western blotting utilizando IgG de cabra anti-coelho-HRP. A proteína purificada (200-25 ng) ou o meio condicionado que continha zcytorl7 foram submetidos a electroporação utilizando uma mini-cell Xcell II de Novex de Invitrogen e foram transferidos a nitrocelulose (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente utilizando o módulo de blot Xcell de Novex com agitação de acordo com as instruções proporcionadas no manual do instrumento. A transferência foi realizada a 300 mA durante uma hora num tampão que continha base Tris 25 mM, glicina 200 mM, e metanol a 20 %. O filtro depois foi bloqueado com tampão A de Western (local, Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, pH 8,0, Igepal CA-630 a 0,05 %, NaCl 150 mM, e gelatina a 0,25 %) durante a noite com agitação suave a 4 °C. A nitrocelulose foi enxaguada rapidamente e depois foi adicionado o 215 anticorpo de coelho anti-zcytoRl7 MBP-6H humano (1:1000) em tampão A de Western. A mancha de transferência foi incubada durante 1,5 horas a temperatura ambiente com agitação suave. A mancha de transferência foi enxaguado 3 vezes durante 5 minutos cada vez em Western A, e depois foi adicionado anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-HRP (1 : 1000) em tampão A de Western A. A mancha de transferência foi incubada durante 1,25 horas a temperatura ambiente com agitação suave. A mancha de transferência foi enxaguada 3 vezes durante 5 minutos em Western A, e depois foi enxaguada rapidamente em H2O. A mancha de transferência foi revelada utilizando reagentes de substratos quimiluminescentes disponíveis comercialmente, reagentes de detecção de CLWestern blotting 1 e 2 misturados 1:1; reagentes obtidos de Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) e a mancha de transferência foi exposta a um filme de raios X durante até 15 minutos. O anticorpo de coelho anti-zcytoR17 MBP-6H humano foi capaz detectar o zcytorl7 humano presente em meios condicionados assim como a proteina zcytoR17 purificada como uma banda a 120 kDa em condições redutoras.

Exemplo 26

Distribuição De tecido de zcytor!7 de ratinho em Painéis de Tecidos Utilizando PCR

Um painel de ADNc de tecidos murinos foi rastreado com respeito à expressão de zcytorl7 de ratinho utilizando PCR. O painel foi realizado internamente e continha 94 ADNc marathon e amostras de ADNc de diversas linhas celulares e tecidos murinos normais e cancerosos como é mostrado no Quadro 6 proporcionado a seguir. Os ADNc procediam de bibliotecas internas ou ADNc marathon de preps de ARN internas, ARN Clontech ou ARN de Invitrogen. Os ADNc marathon de ratinho foram fabricados utilizando o kit marathon Ready™ (Clontech, Paio Alto, CA) e foram ensaiadas QC com iniciadores de receptor de transferrina de 216 ratinho ZC10,651 (SEQ ID NO: 46) e ZC10,565 (SEQ ID NO: 47) e depois foram diluídos com base na intensidade da banda de transferrina. Para garantir a qualidade das amostras de biblioteca amplificadas no painel, foram realizadas três ensaios de controlo de qualidade (QC) : (1) para avaliar a qualidade do ARN utilizado para as bibliotecas, os ADNc internos foram ensaiados com respeito ao tamanho médio do inserto por PCR com oligos do vector que eram específicos para as sequências de vector para uma biblioteca de ADNc individual; (2) a padronização da concentração do ADNc nas amostras do painel foi conseguida utilizando métodos de PCR convencionais para amplificar a alfa tubulina de comprimento completo ou o ADNc de G3PDH utilizando um oligo de vector 5': ZC14, 063 (SEQ ID NO: 48) e um iniciador de oligo específico de alfa tubulina 3' ZC17, 574 (SEQ ID NO: 49) ou iniciador de oligo específico de G3PDH 3' ZC17,600 (SEQ ID NO: 50); e (3) foi enviado uma amostra a sequenciamento para verificar a possível contaminação do ADN ribossómico ou mitocondrial. O painel foi estabelecido num formato de 96 poços que incluía uma amostra de controlo positiva para ADN genómico de ratinho (Clontech, Paio Alto, CA). Cada poço continha aproximadamente 0,2-100 pg/μΐ de ADNc. A PCR foi preparada utilizando oligos ZC38,065 (SEQ ID NO: 51) e ZC38,068 (SEQ ID NO: 52), TaKaRa Ex Taq™ (TAKARA Shuzo Co LTD, Biomedicals Group, Japão), e corante Rediload (Resejarch Genetics, Inc., Huntsville, AO). A amplificação foi realizada como segue: 1 ciclo a 94 °C durante 5 minutos; 5 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 68 °C durante 30 segundos; 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 56 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos, seguido de 1 ciclo a 72 °C durante 5 minutos. Aproximadamente 10 μΐ do produto de reacção de PCR foi submetido a electroforese em gel de agarose convencional utilizando um gel de agarose a 4 %. O tamanho correcto do fragmento de ADN previsto foi observado em cérebro, células 217 CD90+, dendríticas, embriões, MEWt#2, linha celular de próstata Tuvak, glândula salivar, pele e testículo. O fragmento de ADN para pele e testículo foi cortado e purificado utilizando um Kit de Extracção de Gel (Qiagen, Chatsworth, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos foram confirmados por sequenciamento para demostrar que efectivamente eram zcytorl7 de ratinho.***

Quadro 6

Tecido/Linha N° de Tecido/Linh N° de 229 1 7F2 1 Adipócitos- 1 aTC 1,9 1 Cérebro 4 CCC4 1 CD90+ Amplificado 1 OCIOB 1 Dendrítica 1 Embrião 1 Coração 2 Rim 3 Fícrado 2 Pulmão 2 MEWt#2 1 P388D1 1 Pâncreas I Placenta 2 Linha celular de 1 Linha celular de 1 Linha celular de 1 Linha celular de 1 Linha celular de I Glândula Salivar 2 Músculo Esquelético 1 Pele 2 Intestino Delgado 1 218

Tecido/Linha N° de Tecido/Linh N° de Músculo Liso 2 Baço 2 Estômaqo 1 Testículo 3 Timo 1

Exemplo 27

Expressão de zcytorl7 Humano em Diversos Tecidos Utilizando RT/PCR Quantitativa em Tempo Real A. Iniciadores e Sondas para zcytor!7 humano, OSMRbeta e Zcytorl71iq para RT-PCR Convencional e Quantitativa

Previamente foi descrito a RT-PCR quantitativa em tempo real utilizando o Sistema de Detecção de Sequência ABI PRISM 7900 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) (Veja-se, Heid, C.A. et al., Genome Resejarch 6:986-994, 1996; Gibson, OU.E.M. et al., Genome Resejarch 6:995- 1001, 1996; Sundaresan, S. et al., Endocrinology 139:4756- 4764, 1998). Este método incorpora o uso de uma sonda especifica de gene que contém corantes fluorescentes indicadores e inactivadores. Quando a sonda está intacta, a emissão de corante indicador é anulada devido à proximidade do corante inactivador. Durante a extensão de PCR utilizando iniciadores directos e inversos específicos de genes adicionais, a sonda é cortada pela actividade nuclease 5' da Taq polimerase que liberta o corante indicador da sonda dando como resultado um aumento na emissão de fluorescência.

Os iniciadores e sondas utilizados para as análises de RT-PCR quantitativa em tempo real da expressão de Zcytorl7 humano, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram desenhados utilizando o software de desenho de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram desenhados iniciadores para Zcytorl7 humano que incluíam uma ligação intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC37,877 (SEQ ID NO: 53) e o 219 iniciador reverso, ZC37, 876 (SEQ ID NO: 54) foram utilizados numa reacção de PCR a uma concentração 2 00 nM para sintetizar um produto de 73 pb. A sonda Zcytorl7TaqMan® correspondente, denominada ZC37,776 (SEQ ID NO: 55) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems e foi utilizada em cada reacção de PCR a uma concentração de 200 nM. A sonda ZC37, 776 (SEQ ID NO: 55) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante indicador fluorescente (6-carboxi-tetrametilrodamina) (TAMRA) (Epoch Biosciences, Bothell, WA).

Foram desenhados iniciadores para OSMRbeta humana que incluíam uma ligação intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. 0 iniciador directo, ZC43,891 (SEQ ID NO: 122) e o iniciador reverso ZC43,900 (SEQ ID NO: 123) foram utilizados numa reacção de PCR (indicada a seguir) a uma concentração 200 nM. A sonda TaqMan® de OSMRbeta correspondente, denominada ZC43,896 (SEQ ID NO: 124) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems e foi utilizada em cada reacção de PCR a uma concentração de 200 nM. A sonda ZC43,896 (SEQ ID NO: 124) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).

Os iniciadores para Zcytorl71ig humano foram desenhados de maneira que incluíam uma ligação intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,280 (SEQ ID NO: 125) e o iniciador reverso ZC43,281 (SEQ ID NO: 126) foram utilizados numa reacção de PCR (indicada a seguir) a uma concentração aproximadamente 200 nM. A sonda TaqMan® de Zcytorl71ig correspondente, denominada ZC43,275 (SEQ ID NO: 127) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems e foi 220 utilizada em cada reacção de PCR a uma concentração de 200 nM. A sonda ZC43, 275 (SEQ ID NO: 127) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences).

Como controlo para ensaiar a integridade e qualidade das amostras de ARN ensaiadas, todas as amostras de ARN foram rastreadas com respeito ao ARNr ou GUS utilizando séries de iniciador e sonda pedidas a PE Applied Biosystems (kit de ARNr) ou desenhadas internamente (GUS) . O kit de ARNr continha o iniciador directo (SEQ ID NO: 56), o iniciador reverso de ARNr (SEQ ID NO: 57), e a sonda

TaqMan® de ARNr (SEQ ID NO: 58) . A sonda de ARNr foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador VIC (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com o corante fluorescente inactivador TAMRA (PE Applied Biosystems). Os iniciadores e sonda de GUS foram gerados internamente e foram utilizadas em cada reacção de PCR a 200 nM e 100 nM, respectivamente. O iniciador directo foi ZC40,574 (SEQ ID NO: 128) e o iniciador reverso foi

ZC40,575 (SEQ ID NO: 129). A sonda de GUS ZC43,017 (SEQ ID NO: 130) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (Yakima-Yellow) (Epoch Biosciences) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences) . Os resultados do ARNr e GUS também servem como controlo endógeno e permitem a normalização dos resultados de expressão de ARNm de Zcytorl7 vistos nas amostras de ensaio.

Para a RT-PCR não quantitativa convencional, foram desenhados iniciadores utilizando o software de desenho de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . Os iniciadores de zcytorl7 humano geram um produto de aproximadamente 1000 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC28,917 (SEQ ID NO: 83), e 221 iniciador reverso ZC28,480 (SEQ ID NO: 131). Os iniciadores de OSMRbeta humano geram um produto de 202 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC41,653 (SEQ ID NO: 132) e iniciador reverso ZC41,655 (SEQ ID NO: 133). Os iniciadores de Zcytorl71ig humano geram um produto de 305 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC41,703 (SEQ ID NO: 134) e iniciador reverso ZC41,704 (SEQ ID NO: 135). B. Iniciadores e Sondas para Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig murinos para RT-PCR Convencional e Quantitativa

Os iniciadores e sondas usados para os análise de RT-PCR quantitativa de tempo real da expressão de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram desenhados usando o software de desenho de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . Os iniciadores para Zcytorl7 murino foram desenhados de forma que incluíssem uma união intrão-exão para eliminar a possivel amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,272 SEQ ID NO: 136) e o iniciador reverso, ZC43,273 SEQ ID NO: 137) foram usados nas reacções de PCR (indicadas a seguir) a uma concentração 300 nM. A sonda TaqMan® de Zcytorl7 correspondente, denominada ZC43,478 SEQ ID NO: 138) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems. A sonda ZC43,478 SEQ ID NO: 138) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante fluorescente inactivador (6-carboxi-tetrametilrodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). A sonda ZC43,478 SEQ ID NO: 138) foi usada nas reacções de PCR a uma concentração de 100 nM.

Os iniciadores para Zcytorl71ig murino foram desenhados de maneira que incluíssem uma união intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,278 SEQ ID NO: 139) e o iniciador reverso ZC43,279 SEQ ID NO: 140) foram usados nas reacções 222 de PCR a uma concentração 500 nM. A sonda TaqMan® de Zcytorl71ig correspondente, denominada ZC43,276 SEQ ID NO: 141) foi sintetizada e marcada por PE Applied Biosystems. A sonda ZC43, 478 SEQ ID NO: 138) foi marcada na extremidade 5' com o corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceina) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). A sonda ZC4 3,276 SEQ ID NO: 141) foi usada nas reacções de PCR (indicadas a seguir) a uma concentração de 200 nM.

Os iniciadores para OSMRbeta murino foram desenhados de maneira que incluíssem uma união intrão-exão para eliminar a possível amplificação do ADN genómico. O iniciador directo, ZC43,045 SEQ ID NO: 142) e o iniciador reverso, ZC43,046 SEQ ID NO: 143) foram usados nas reacções de PCR a uma concentração 300 nM. A sonda TaqMan® de OSMRbeta correspondente, denominada ZC43,141 SEQ ID NO: 144) foi sintetizada e marcada por Epoch Biosciences. A sonda ZC43,141 SEQ ID NO: 144) foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador não fluorescente (ECLIPSE) (Epoch Biosciences). A sonda ZC43,141 SEQ ID NO: 144) foi usada nas reacções de PCR (indicadas a seguir) a uma concentração de 100 nM.

Como controlo para ensaiar a integridade e qualidade das amostras de ARN ensaiadas, todas as amostras de ARN foram rastreadas com respeito a GUS murino ou receptor de transferrina usando iniciadores e sondas desenhadas usando o programa de desenho de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems Inc., Foster City, CA). Os iniciadores de GUS murino são os seguintes: iniciador directo, ZC43,004 SEQ ID NO: 145), iniciador reverso: ZC43,005 SEQ ID NO: 146) e sonda TaqMan® ZC43,018 SEQ ID NO: 147). A sonda de GUS murino ZC43,018 SEQ ID NO: 147) foi marcada na 223 extremidade 5' com um corante fluorescente indicador Yakima-Yellow (Epoch Biosciences) e na extremidade 3' com o corante inactivador não fluorescente ECLIPSE (Epoch Biosciences). Os iniciadores de GUS murino foram usados nas reacções de PCR a 300 nM e a sonda ZC43,018 SEQ ID NO: 147) foi usada a uma concentração 100 nM. Em alguns casos, foi usado receptor de transferrina murino em lugar de GUS como controlo endógeno. O iniciador directo do receptor de transferrina, ZC40,269 SEQ ID NO: 148) e o iniciador reverso ZC40,268 SEQ ID NO: 149) foram usados a uma concentração 300 nM. A sonda do receptor de transferrina ZC40,298 SEQ ID NO: 150) foi usado na PCR a uma concentração 100 nM e foi marcada na extremidade 5' com um corante fluorescente indicador VIC (PE Applied Biosystems) e na extremidade 3' com um corante inactivador fluorescente (TAMRA) (PE Applied Biosystems). Os resultados de GUS murino e receptor de transferrina também servem como controlo endógeno e permitem a normalização dos resultados de expressão do ARNm de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig observados nas amostras de ensayo.

Para a RT-PCR semiquantitativa convencional, foram desenhados iniciadores usando o software de desenho de iniciadores Primer Express™ (PE Applied Biosystems). Os iniciadores de Zcytorl7 murino geram um produto de 276 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC43,140 SEQ ID NO: 151), e iniciador reverso ZC43,139 SEQ ID NO: 152) . Os iniciadores de OSMRbeta murino geram um produto de 575 pares de bases e são os seguintes: iniciador directo ZC41,608 SEQ ID NO: 153) e iniciador reverso ZC41,609 SEQ ID NO: 154). Os iniciadores de Zcytorl71ig murino geram um produto de 657 pb e são os seguintes: iniciador directo ZC41,502 SEQ ID NO: 155) e iniciador reverso ZC41,500 SEQ ID NO: 156). C. Protocolos para RT-PCR Quantitativa em Tempo Real e RT-PCR Semiquantitativa Convencional 224

Os níveis relativos de ARNm de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram determinados analisando amostras de ARN total usando o método de RT-PCR de uma etapa (PE Applied Biosystems). Foi isolado ARN total de células BHK (murinas) ou células BAF (humanas) transfectadas com Zcytorl7 e OSMRbeta por métodos convencionais e foram usados para gerar uma curva padrão usada para a quantificação de Zcytorl7 e OSMRbeta. A curva consistia em diluições em série de 10 vezes que variavam de 100 a 0,01 ng/μΐ cada ponto da curva padrão sendo analisado em triplicata. De forma similar, para Zcytorl71ig, foi usado ARN de células T CD4+ activadas (que foi demostrado previamente que fabricam Zcytorl71ig) para gerar uma curva padrão no mesmo intervalo de 100 a 0,01 ng/μΐ. O ARN total das células humanas ou murinas foi analisado em triplicata com respeito aos niveis de transcrito de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig humanos ou murinos e com respeito a um dos seguintes genes de controlo endógenos: ARNr, GUS ou receptor de transferrina. Num volume total de 10 μΐ, cada amostra de ARN foi submetida a uma reacção de RT-PCR de uma etapa que continha: aproximadamente 50-100 ng de ARN total em mistura mestre 2X pré-formulada que continha um corante de controlo interno (ROX) (carboxi-x-rodamina) e ADN Polimerase Thermo-Start® (Abgene, Surrey, RU) ; iniciadores apropriados para o gene de interesse (vejam-se as partes A e B do presente exemplo); a sonda apropriada (vejam-se as partes A e B para a concentração); transcriptase reversa Superscript® (50 OU/μΙ) (PE Applied Biosystems), e um volume apropriado de água sem RNase. As condições dos ciclos térmicos de PCR foram as seguintes: uma etapa inicial de transcrição reversa (RT) de um ciclo a 48 °C durante 30 minutos; seguido de uma etapa de activação enzimática Thermo-Start® de um ciclo a 95 °C durante 10 minutos; seguido de 40 ciclos de amplificação a 95 °C durante 15 segundos e 60 °C durante 1 minuto. Os níveis relativos de ARN de Zcytorl7, 225 OSMRbeta e Zcytorl71ig foram determinados usando o método de curva padrão como é descrito pelo fabricante, PE Biosystems (User Bulletin n° 2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation de Gene Expression, 11 de dezembro de 1997) As medições de ARNr, GUS ou Receptor de Transferrina foram usados para normalizar os níveis do gene de interesse.

As reacções de RT-PCR semiquantitativas usaram o "Superscript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq" (Invitrogen, Carlsbad, CA). Cada reacção de 25 μΐ consistia no seguinte: 12,5 ml de Tampão de Reacção 2X, 0,5 μΐ (20 pmol/μΐ) de iniciador directo, 0,5 μΐ (20 pmol/μΐ) de iniciador reverso, 0,4 μΐ de mistura de RT/Taq Polimerase, 5,0 ml de Tampão de Carga de Gel Rediload (Invitrogen), 5,1 μΐ de água sem RNase e 1,0 μΐ de ARN total (100 ng/μΐ) . A amplificação foi realizada como se indica a seguir: um ciclo a 45 °C durante 30 minutos seguido de 35-38 ciclos de 94 °C, 20 segundos; temperatura de hibridação variável (veja-se o Quadro 7 mostrada a seguir), 20 segundos; 72 °C, 45 segundos; e depois terminando com uma extensão final a 72 °C durante 5 minutos. De oito a dez microlitros do produto de reacção de PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose convencional usando um gel de agarose ao 2 %

Quadro 7

Zcytorl7 murino Temperatura de hibridação 58 °C OSMRbeta murino Temperatura de hibridação 60 °C Zcytor 171ig murino Temperatura de hibridação 52 °C Zcytorl7 humano Temperatura de hibridação 55 °C OSMRbeta humano Temperatura de hibridação 59 °C Zcytorl71ig humano Temperatura de hibridação 59 °C 226 D. Isolamento de ARN a partir de Linhas Celulares e Subséries de PBMC Humanas e Murinas

Foi extraído sangue de vários dadores anónimos e foram isoladas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) usando a metodologia de gradiente de Ficoll. Depois foram isolados os monócitos usando o Kit de Isolamento de Monócitos e o Sistema Magnético de Separação de Células (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) . Os monócitos depois foram inoculados em placas de 24 poços de aderência ultrabaixa em meio sem endotoxina. Foram estimulados ou foram tratados com IFNg humano recombinante (R&D Systems Inc.) a 10 ng/ml. As células foram colhidas a 24 e 48 horas. De uma maneira similar, foram isoladas células T CD4+ e CD8+ a partir de PBMC usando as pérolas magnéticas anti-CD4 ou anti-CD8 de Miltenyi Biotic. As células depois foram activadas durante 4 ou 16 horas em placas de cultura de tecidos revestidas com 0,5 μg/ml de anticorpos anti-CD3 em meio que continha 5 μg/ml de anticorpos anti-CD28. Também foram isoladas células NK a partir de PBMC usando pérolas magnéticas revestidas com anti-CD5 de Miltenyi. Algumas das células NK foram colhidas a tempo zero para o ARN e outras foram inoculadas em meios que continham Forbol Miristato Acetato (PMA) (5 ng/ml) e ionomicina (0,5 μg/ml) durante 24 horas. Além disso, foram colhidas várias linhas celulares parecidas a monócitos humanos, U937, THP-1 e HL-60 em estado de repouso ou activado. As células U937 foram activadas durante a noite com PMA (100 ng/ml). As HL-60 foram activadas durante a noite com PMA (10 ng/ml) ou durante 72 e 96 horas com IFNg (10 ng/ml) para dirigir as mesmas a uma via monocítica. As células THP-1 foram activadas durante a noite com uma combinação de LPS (10 ng/ml) e IFNg (10 ng/ml). Foi preparado ARN a partir de todas as células primárias usando o Kit RNeasy Midiprep™ (Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Foi retirado o ADN restante usando o kit DNA- 227

Free™ (Ambion, Inc., Austin, TX) . A concentração de ARN foi determinada usando espectrofotometria convencional e a qualidade do ARN foi determinada usando o Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Paio Alto, CA).

Foi colhido ARN de células T murinos usando uma diversidade de métodos bem conhecidos na técnica. Foram isoladas células T CD4+ e CD8+ esplénicos primários a partir dos baços de ratinhos C57B1/6 usando pérolas magnéticas revestidas de anticorpo e o Sistema Magnético de Separação de Células de Miltenyi Biotec. As células T CD4+ e CD8+ depois foram activadas cultivando as células em placas de 24 poços revestidas com anticorpos anti-CD3 (500 ng/ml) em meio que continha anticorpos anti-CD28 a 5 μρ/τηΐ. As células foram colhidas para o ARN a 0, 4 e 16 horas. De forma similar, foram isoladas células T CD4+ e depois se desviadas a um fenótipo Thl ou Th2 usando o seguinte protocolo. Como os células T C57B1/6 já estão desviadas na direcção Thl, tudo o que era necessário era activar durante 6 horas com 0,5 μg/ml de PMA e 10 ng/ml de ionomicina. O desvio a "Th2" foi obtido cultivando células T CD4+ naive com 2,5 μg/ml de anti-CD28, 10 ng/ml de mIL-2 (R&D Systems Inc.) e 25 ng/ml de mIL-4 (R&D Systems) em placas revestidas com 0,5 μg/ml de anti-CD3. Depois de dois dias em cultura, as células foram ressuspensas em meio que continha 10 ng/ml de mIL-2 (R&D Systems) e 25 ng/ml de mlL-4. As células foram cultivadas durante mais três dias e depois foram activadas com PMA e ionomicina durante 6 horas.

Foi obtido uma série adicional de células T desviados a Thl e Th2 usando a linha de células T DO11.10 transgénica para o Receptor de Células T. Todas as células foram cultivadas em placas revestidas com anti-CD3 e anti-CD28. As células "Th-1" foram cultivadas em meio que continha mIL-12 (1 ng/ml) e anti-IL-4 (10 μg/ml). As células "Th2" foram cultivadas em meio que continha mIL-4 (10 ng/ml) e 228 anti-IFNg (10 μg/ml). Depois de 24 horas, todas as culturas receberam mIL-2 (10 ng/ml). Depois de mais dois dias, o meio das células foi trocado e foi adicionado novo meio que continha as citocinas mencionadas anteriormente e as células foram cultivadas mais 4 dias antes de ser colhidos.

Todo o ARN de células T murinos foi preparado usando o Kit RNeasy Midiprep™ (Qiagen) e o ADN contaminante foi retirado usando o kit DNA-free™ kit de Ambion. E. Isolamento de ARN a partir de Modelos Murinos de Pancreatite e Doença de Intestino Irritable

Para induzir um estado similar à Doença de Intestino Irritável (Eli) humana, foi usado a estirpe de ratinho híbrida C57B16/129S6F1. Os ratinhos foram divididos em 4 grupos com um tamanho médio de seis ratinhos por grupo. O grupo 1 não recebeu Dextran Sulfato de sódio (DSS) e foi sacrificado no dia 14. O grupo 2 recebeu DSS a 2 % durante dois dias antes do sacrifício. O grupo 3 recebeu DSS a 2 % durante sete dias antes do sacrifício. O grupo 4 recebeu DSS a 2 % durante sete dias, depois foi deixado que os ratinhos se recuperassem durante sete dias e foram sacrificados no dia 14. No dia do sacrifício, foram retiradas secções de cólon distai e foram postas em RNAIater™ (Ambion). As secções de cólon foram homogeneizadas usando técnicas convencionais e o ARN foi isolado usando o Kit RNeasy Midiprep™ (Qiagen). O ADN contaminante foi retirado por tratamento com DNA-free™ (Ambion) de acordo com as instruções do fabricante.

Num estudo diferente, foi induzido pancreatite aguda em ratinhos CD-I macho por injecção de caeruleína. Os ratinhos foram divididos em três grupos (n = 8 ratinhos/grupo). Os animais do grupo 1 receberam sete injecções i.p. (1 injecção por hora) de veículo (solução salina) e depois foram sacrificados 12 e 24 horas depois da primeira injecção. Os grupos 2 e 3 receberam sete injecções i.p. de caeruleína (Sigma) (n° de catálogo C-9026) a uma 229 dose de 50 μg/kg/h durante seis horas (1 injecção por hora) . O grupo 2 foi sacrificado 12 horas depois da primeira injecção e o grupo 3 foi sacrificado 24 horas depois da primeira injecção. Foram retirados os pâncreas no momento do sacrifício e foram congelados imediatamente para o isolamento do ARN. Os tecidos foram homogeneizados e o ARN foi isolado usando o Kit RNeasy Midiprep™ de Qiagen.

Em outro estudo, foram gerados ratinhos transgénicos para Zcytorl71ig murino e foram observadas as mudanças fenotípicas (veja-se o Exemplo 41). Foi observado uma piloerecção e perda de pelo em muitos dos ratinhos transgénicos. Foram sacrificados quatro ratinhos transgénicos e foram retiradas amostras de pele de áreas normais e sem pelo e foram congelados imediatamente para um isolamento posterior do ARN. Também foram colhidas secções de pele de dois ratinhos de controlo não transgénicos. As amostras de pele foram homogeneizadas e depois foram digeridas com Proteinase K (Qiagen) (n° de catálogo 19133) durante 20 minutos a 60 °C. Depois foi isolado o ARN usando o Kit RNeasy Midiprep™ de Qiagen seguindo as instruções do fabricante. O ADN excedente foi retirado usando o kit DNA-free™ de Ambion. F. Resultados de RT-PCR Quantitativa e Semiquantitativa para Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig Humanos A expressão de Zcytorl7 e OSMRbeta foi examinado por RT-PCR quantitativa em quatro séries de monócitos humanos primários que estavam em estado de repouso ou activados com IFNg durante 24 ou 48 horas. A expressão de Zcytorl7 estava abaixo da detecção nas células infraestimuladas, mas aumentava espectacularmente depois da activação de 24 horas com IFNg, e era máxima depois de 48 horas de activação. Em todos os casos, OSMRbeta estava abaixo da detecção. Nestas amostras não foi ensaiado Zcytorl71ig.

Nas células T primárias, Zcytorl7 estava abaixo da detecção nas subséries de CD4+ e CD8+ em repouso. Depois de 230 uma activação de quatro horas, no entanto, a expressão de Zcytorl7 aumentou nas duas subséries e depois foi reduzida a um nível ligeiramente menor no ponto de tempo de 16 horas. OSMRbeta esteve abaixo da detecção nestas amostras. A expressão de Zcytorl71ig foi examinada usando RT-PCR semiquantitativa. Não se detectou expressão nas células T CD4+ e CD8+ não estimuladas. No entanto, depois da activação de quatro horas, foram detectados altos níveis de Zcytorl71ig. Este nível foi reduzido em alguma medida no ponto de tempo de 16 horas. A expressão de Zcytorl7 não foi examinada em células NK. OSMRb estava abaixo da detecção nestas amostras. A expressão de Zcytorl71ig estava abaixo da detecção nas células NK em repouso, no entanto houve um sinal débil gerado pelas células NK activadas que sugeria que estás células podem fabricar Zcytorl71ig em certas condições.

Nas linhas celulares similares a monócitos humanos, U937, THP-1 e HL-60, a expressão de OSMRbeta estava abaixo da detecção em todas as amostras em repouso e activadas com a excepção das amostras de THP-1 activadas nas que se detectem que foi detectado um sinal débil. A expressão de Zcytorl7 foi alta nas linhas celulares em repouso U937 e THP-1 e mostrou uma forte regulação positiva depois da activação. A expressão nas células U937 foi a maior de qualquer tipo celular. Nas células HL-60, Zcytorl7 era expresso em níveis moderados nas células não estimuladas e foi reduzida depois da estimulação com PMA. No entanto, a expressão de Zcytorl7 estava regulada positivamente de forma espectacular nas células HL-60 quando eram estimuladas com IFNg durante 72 e 96 horas. Todos os dados de expressão em humanos são resumidos no Quadro 8 proporcionados a seguir. 231

Quadro 8

Monócitos Humanos Primários Estado de Activação Zcytor 17 OSMRbeta Zcytorl7 lig Monócitos Humanos Não estim. - - Act. 24 h Monócitos Humanos + - IFNg Act. 48 h Monócitos Humanos + + - IFNg CD4+ Humana Não estim. - - - CD4+ Humana Act. 4 h + + - + + CD4+ Humana Act. 16 h + - + CD8+ Humana No estim - - - CD8+ Humana Act. 4 h + + - + + CD8+ Humana Act. 16 h + - + Células NK Humanas Não estim. - - Células NK Humanas Act. 24 h - + U937 Não estim. + + - - U937 Act. 16 h + + + - - THP-1 Não estim. + + - - THP-1 Act. 16 h + + + + - HL-60 Não estim. + + - - HL-60 Act. 16 h PMA + - - Act. 72 h HL-60 + + + - - IFNg HL-60 Act 96 h IFNg + + + - - G. Resultados de RT-PCR Quantitativa e Semiquantitativa para Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71iq Murinos

Os níveis de expressão de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig murinos foram examinados em várias populações de células T murinos e os resultados são resumidos no Quadro 9 proporcionada a seguir. A expressão de Zcytorl7 murino foi ensaiada por RT-PCR semiquantitativa e mostro 232 estar a baixos níveis em células T CD4+ primários activados e em repouso. A expressão de Zcytorl7 foi detectada em células T CD8+ em repouso e depois parecia reduzir após a activação com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 nos pontos de tempo de 4 e 16 horas. A expressão de OSMRbeta foi medida por RT-PCR quantitativa e mostrou que expressa em células T CD4+ e CD8+ activados e em repouso. A expressão de OSMRbeta aumentou depois de uma activação de 4 horas e depois voltou aos níveis não estimulados às 16 horas nos células T CD4+ e CD8+. Foi detectada Zcytorl71ig por RT-PCR quantitativa e mostrou que se expressa a níveis muito baixos em células T CD4+ não estimulados. No entanto, depois de uma activação de 4 horas, a expressão de Zcytorl71ig foi regulada positivamente de forma espectacular e depois foi reduzida ligeiramente no ponto de tempo de 16 horas. Em células T CD8+, não foi detectada Zcytorl71ig nas células não estimuladas. Houve alguma expressão de Zcytorl71ig no ponto de tempo de 4 horas, mas às 16 horas os níveis de expressão tinham reduzido abaixo da detecção.

Nas células T DO11.10, foi detectada a expressão de Zcytorl7 nas células naive e desviadas a Th2, mas não nas células desviadas a Thl. A expressão de OSMRbeta estava a baixos níveis nas células D01 1,10 naive. Houve um aumento espectacular nos níveis de expressão de OSMRbeta nas células desviadas a Thl e um aumento moderado da expressão nas células desviadas a Th2. A expressão de Zcytorl71ig nestas células mostrou ser predominantemente pela subsérie desviada Th2. Foram detectados baixos níveis na subsérie Thl e não foi detectada expressão nas células naive. Estes resultados são resumidos no Quadro 9 proporcionado a seguir.

Nas células T CD4+ primários que foram desviados na direcção Thl ou Th2, não foi examinado Zcytorl7. Foi detectada expressão de OSMRbeta nas três amostras, sendo encontrados os maiores níveis na amostra Th2. De forma 233 similar aos resultados de DO11.10, foi detectada expressão de Zcytorl71ig a altos niveis na subsérie desviada a Th2, sendo detectado uma pequena quantidade na subsérie Thl e os niveis estavam abaixo da detecção nas células não estimuladas. Estes resultados são resumidos no Quadro 9 proporcionada a seguir.

Quadro 9 Células T Murinos Zcytor 17 OSMRbeta Zcytor17 lig Células T CD4+ estimulados Não + + + /- Células T CD4+ 4 Activação h de + + + + + Células T CD4+ 16 Activação h de + + + Células T CD8+ estimulados Não + + - Células T CD8+ 4 Activação h de + /- + + + Células T CD8+ 16 Activação h de - + - D01 1,10 Virgen + + - DOÍ 1,10 - + + + + Thl DOÍ 1,11 + + + + + Th2 Células T CD4+ estimulados Não + + - Células T Desviados Thl CD4+ + + + + Células T Desviados Th2 CD4 + + + + + + 234

Nas amostras de pele transgénica de Zcytorl71ig, os níveis de expressão de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig foram determinados usando RT-PCR quantitativa. Foi mostrado que Zcytorl7 estava presente em todas as amostras a níveis aproximadamente equivalentes. Houve níveis espectacularmente superiores de expressão de OSMRbeta nos animais de controlo não transgénicos em comparação com as amostras transgénicas. A expressão de Zcytorl71ig estava abaixo da detecção nos animais de controlo não transgénicos com níveis de expressão de moderados a elevados nos animais transgénicos. Os resultados são resumidos no Quadro 10 proporcionada a seguir.

Quadro 10

Zcytorl71ig Murino Pele Transgénica Ratinho de Tipo Selvagem Ratinho de Tipo Selvagem Transgénico n° 1 Transgénico n° 1 Transgénico n° 2 Transgénico n° 2 Transgénico n° 3 Transgénico n° 3 Transgénico n° 4 Transgénico n° 4

Fenótipo de pele Normal Normal Normal Perda Pelo Normal Perda Pelo Normal Perda Pelo Normal Perda Pelo

Zcytorl7 OSMRbeta

Zcytor171ig +++ + + de de de + de + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

Numa experiência diferente, foram medidos os níveis de expressão de Zcytorl7, OSMRbeta e Zcytorl71ig por RT-PCR 235 quantitativa no pâncreas de ratinhos submetidos a pancreatite aguda. A expressão de Zcytorl7 estava abaixo da detecção em todas as amostras. Foi observado expressão de OSMRbeta a baixos níveis nas amostras de controlo normais (Grupo 1), mas mostrou uma forte regulação positiva em ponto de tempo de 12 horas (Grupo 2) e níveis ligeiramente menores no ponto de tempo de 24 horas (Grupo 3). A expressão de Zcytorl71ig estava abaixo da detecção nos animais de controlo, mas mostrou altos níveis nos dois grupos injectados com caeruleína. Os dados são resumidos no Quadro 11 proporcionado a seguir.

Quadro 11

Modelo de Pancreatite Descrição Zcytor 17 OSMRbeta Zcytorl7 lig Grupo 1 Controlo Normal - + - Grupo 2 12 h Depois Injecção da - + + + + + Grupo 3 24 h Depois Injecção da - + + + +

Em outra experiência, foram examinados os níveis de expressão de Zcytorl7 e OSMRbeta no cólon distai de ratinhos submetidos a tratamento com DSS. Neste modelo murino de doença inflamatória do intestino, os níveis de expressão dos dois genes foram determinados por RT-PCR quantitativa e são resumidos no Quadro 12 proporcionada a seguir. Os níveis de expressão de Zcytorl7 aumentaram com a gravidade da doença, com baixos níveis de expressão nos animais normais do Grupo 1 e quantidades crescentes nos Grupos 2 e 3. Nos animais do Grupo 4, os níveis de Zcytorl7 tinham voltado a níveis mais normais. Ao contrário da expressão de Zcytorl7, os níveis de OSMRbeta foram os máximos nos animais de controlo e os níveis realmente foram reduzidos nos três grupos tratados com DSS. 236

Quadro 12 MODELO Eli Descrição Dia SAC Zcytor 17 OSMRbeta Grupo 1 Controlo Normal 14 + + + Grupo 2 Tratados DSS 2 dias com 2 + + + Grupo 3 Tratados DSS 7 dias com 7 + + + + Grupo 4 Tratados DSS 7 dias com 14 + +

Exemplo 28

Expressão de Distribuição De tecido de Zcytorl71iq Humano baseada na análise RT-PCR de ADNc de Primeira Cadeia de Múltiplos Tecidos A expressão génica de zcytorl71ig foi examinada usando painéis de ADNc de primeira cadeia de Múltiplos tecidos normalizados disponíveis no mercado (OriGene Technologies, Inc. Rockville, MD; BD Biosciences Clontech, Paio Alto, CA) . Estes incluíam o painel "Human Tissue Rapid-Scan™ Painel" de OriGene (n° de cat CHSCA-101, que contém 22 tecidos diferentes, médula óssea e leucócitos de sangue e plasma) e o painel "Human Blood Fractions MTC™ Panei" de BD Biosciences Clontech (n° de cat. K1428-1, que contém 9 fracções de sangue diferentes).

As reacções de PCR foram estabelecidas usando os iniciadores oligo específicos de zcytorl71ig ZC41,458 SEQ ID NO: 60) e ZC41, 457 SEQ ID NO: 61), que produziram um produto de 139 pb, e ZC41,459 SEQ ID NO: 62) e ZC41,460 SEQ ID NO: 63), que produziram um produto de 92 pb, HotStarTaq ADN Polimerase de Quiagen e tampão (Qiagen, Inc., Valência, CA), dH20, e corante RediLoad™ (Research Genetics, Inc., Huntville, AO) . As condições dos ciclos de PCR foram as seguintes: 1 ciclo inicial de 15 minutos de desnaturação a 237 95 °C, 35 ciclos de desnaturação de 45 segundos a 95 °C, 1 minuto de hibridação a 53 °C ou 56 °C e 1 minuto e 15 segundos de extensão a 72 °C, seguido de um ciclo final de extensão de 7 minutos a 72 °C. As reacções foram separadas por electroforese num gel de agarose a 2 % (EM Science, Gibbstown, NJ) e foram visualizadas por coloração com brometo de etidio.

Foi observado um fragmento de ADN do tamanho correcto nos seguintes tecidos adultos humanos usando o painel "Human Tissue Rapid-Scan™ Painel" de OriGene: testículo, leucócitos de plasma sanguíneo (PBL) e médula óssea.

Foi observado um fragmento de AND do tamanho correcto nas seguintes fracções de sangue humana usando o painel "Human Blood Fractions MTC™+ Panei" de BD Biosciences Clontech: células mononucleares activadas (linfocitos B e T e monócitos), células CD8+ activadas (T-supresor/citotóxico), células CD4+ activadas (T-auxiliar/inductor) e débilmente nas células CD8+ em repouso.

Exemplo 29

Clonagem do receptor da Oncostatina M humano 0 receptor da Oncostatina M beta (OSMRbeta) é um receptor de citocina de tipo I com similaridade estrutural a IL-12R-B2. ZcytoR17 tem similaridade estrutural com IL12R - Bl. Os receptores OSMRbeta e zcytorl7 foram ensaiados para ver se podiam interagir como subunidades num complexo de sinalização de citocinas, e se conjuntamente poderiam actuar como receptor de sinalização, ou antagonista de receptor solúvel, para zcytorl71ig.

Para isolar OSMRbeta, foram desenhados iniciadores de PCR oligonucleotídicos ZC39982 SEQ ID NO: 64) e ZC39983 SEQ ID NO: 65) para amplificar a região codificante de comprimento completo da sequência de ADNc da Oncostatina M beta humana SEQ ID NO: 6) (Genbank, N° de Acesso U60805; 238

Mosley B, JBC Volume 271, Número 50, Edição de 20 de Dezembro de 1996, páginas 32635-32643).

Foram realizadas reacções de PCR numa série de moldes de biblioteca de ADNc usando uma Polimerase sólida, Advantage II (Clontech, PaloAlto, CA), para identificar uma fonte do ADNc. O ADN molde usado procedia de bibliotecas de plasmídeos de ADNc amplificadas que continham, cada uma, 5 milhões de clones de ADNc independentes. As reacções foram realizadas seguindo as instruções de fabricante usando 400 fmol/μΐ de cada oligonucleótido e 2-20 ng/μΐ de ADN de biblioteca de plasmídeo purificado como molde. As bibliotecas de ADNc procediam dos seguintes tecidos e linhas celulares humanas: cérebro fetal, músculo liso de próstata, médula óssea, RPMI1588, tiróide, WI-38, testículo, células mononucleares de sangue periférico estimuladas, células CD3+ estimuladas, THP-1, amígdala activada, HACAT e fígado fetal. As reacções foram realizadas numa máquina de termociclagem usando as seguintes condições: 30 ciclos de 95 °C durante 20 segundos, 68 °C durante 3 minutos. Ao final dos 30 ciclos, foi realizada um ciclo de extensão individual adicional de 8 minutos a 68 °C. Os produtos de PCR foram visualizados por electrof orese em gel de TAE agarose em presença de brometo de etídio seguido de iluminação UV. Foi observado que o produto mais abundante procedia de uma biblioteca de ADNc de músculo liso de próstata. A reacção de PCR usando molde de músculo liso de próstata e oligonucleótidos ZC39982 SEQ ID NO: 64) e ZC39983 SEQ ID NO: 65) foi repetido usando uma ADN Polimerase termoestável menos sólida, mas de maior fidelidade "turboPFu" (Stratagene, La Jolla, CA) . Foram realizados trinta ciclos de amplificação com as seguintes condições: desnaturação a 94 °C, 30 segundos, hibridação a 63 °C 45 segundos, extensão a 72 °C 3,5 minutos. Foi purificada em gel uma só banda de produto num gel de TAE, agarose a 0,8 %. 239

Este ADN depois foi amplificado de novo usando iniciadores ZC39980 SEQ ID NO: 66) e ZC39981 SEQ ID NO: 67) desenhados para incluir sequências de reconhecimento de enzimas de restrição para permitir a clonagem de este ADNc num vector de expressão de mamífero. A reacção de PCR foi realizada usando "TurboPfu" e o produto de PCR purificado durante 15 ciclos de 95 °C 1 minuto, 64 °C 1 minuto 20 segundos, 72 °C 4,5 minutos. A reacção de PCR depois foi digerida com EcoRI e Xhol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e foi purificada em gel como foi descrito anteriormente. Foi preparado um vector de expressão de mamífero, pZ7NX por digestão com EcoRI e Xhol e o produto de PCR foi ligado a este vector e foi introduzido por electroporação em células E. coli DHIOb. Foram isoladas várias colónias bacterianas e foram sequenciadas. Um clone era correcto com a excepção de uma só mutação não conservadora. Para mudar esta base para que correspondesse à sequência esperada, foi usada mutação de substituição de um oligonucleótido e um local de restrição PstI estranho numa reacção de PCR com "TurboPfu" usando o plasmídeo pZP7Nx-h de Oncostatina M R previamente sequenciado como molde. O ADN amplificado por PCR foi digerido com PstI e Xhol e foi clonado de novo no plasmídeo pZP7Nx-h de Oncostatina M R em lugar do fragmento PstI/Xhol que continha a mutação ofensiva. Este novo plasmídeo foi sequenciado na região PstI a Xhol recentemente amplificada para confirmar a correcção e garantir de que não eram criados outros erros no processo de amplificação. Esta análise confirmou a sequência de que correspondia à sequência esperada na região codificante. A sequência é mostrada na SEQ ID NO: 6 e a sequência de aminoácidos correspondente se amostra na SEQ ID NO: 7.

Exemplo 30

Construções para Gerar um Heterodímero de Zcytor17/receptor de Oncostatina M (OSMRbeta) Humano 240

Na técnica é conhecido um sistema para a construção, expressão e purificação dos ditos receptores heterodiméricos solúveis e foi adaptado ao par de receptores receptor de oncostatina M humano (OSMRbeta) e zcytorl7 humano. Para esta construção, o polinucleótido para o receptor solúvel OSMRbeta é mostrado na SEQ ID NO: 68 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO: 69; e o polinucleótido para o receptor solúvel zcytorl7 humano é mostrado na SEQ ID NO: 70 e o polipéptido correspondente é mostrado na SEQ ID NO: 71.

Para construir uma linha celular que expressa um heterodímero hzcytorl7 solúvel/OSMRbeta humano segregado, foi realizada uma construção de forma que o receptor solúvel heterodimérico resultante compreendesse o domínio extracelular de OSMRbeta humano fusionado à cadeia pesada da IgG gamai (Fc4) SEQ ID NO: 37) com um marcador Glu-Glu SEQ ID NO: 35) na extremidade C; enquanto que o domínio extracelular de zcytoR17 foi fusionado a Fc4 SEQ ID NO: 37) com um marcador His SEQ ID NO: 72) na extremidade C. Para os dois braços de hzcytorl7 e OSMRbeta humano do heterodímero, foi obtido por engenharia genética um espaçador Gly-Ser de 12 aminoácidos SEQ ID NO: 73) entre a parte extracelular do receptor e a extremidade N de Fc4. A. Construção de OSMRbeta/Fc4-CEE solúvel humano

Para a construção da parte OSMRbeta/Fc4-CEE solúvel humana do heterodímero, foi isolado a parte extracelular de OSMRbeta humano usando PCR com oligos ZC14063 SEQ ID NO: 48) e ZC41557 SEQ ID NO: 74) nas condições de reacção de PCR seguintes: 30 ciclos de 95 °C durante 60 seg, 57 °C durante 30 seg e 72 °C durante 100 seg; e 72 °C durante 7 min. Os produtos de PCR foram purificados usando o Kit de Purificação de PCR QIAquick (Qiagen), foram digeridos com EcoRI e BglII (Boerhinger-Mannheim) , foram separadas por electroforese em gel e foram purificados usando o kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). 241 A cassete de expressão, o esqueleto do plasmídeo e a parte do marcador Fc4-GluGlu da quimera estavam contidos dentro de um vector de plasmídeo interno fabricado previamente. 0 vector de plasmídeo foi digerida com EcoRI e BamHI (Boerhinger-Mannheim), os fragmentos foram separados por electroforese em gel e foram purificados usando o kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). Os fragmentos digeridos e purificados do plasmídeo que continha OSMRbeta humano e Fc4-cEE foram ligados entre si usando ADN ligase de T4 (Life Technologies. Bethesda, MD) usando métodos de ligação convencionais. Foram rastreadas minipreps do ligação resultante com respeito a uma inserção EcoRI/Smal do tamanho correcto (772 pb) para o OSMRbeta solúvel e as minipreps positivas foram sequenciadas para confirmar com exactidão a reacção de PCR. Esta nova construção de plasmídeo se denomina ZP9-ONCOMR-Fc4CEE. B. Construção de Zcytor17/Fc4-CHIS solúvel humano

Para a construção da parte hzcytorl7/Fc4-CHIS do heterodímero, a parte extracelular de zcytorl7 humano foi isolado por digestão de um plasmídeo que continha previamente o receptor solúvel Zcytorl7-Fc4. O plasmídeo foi digerido em primeiro lugar com Sall (New England Biolabs, Beverly, MA) , depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitado com etanol. 0 ADN digerido depois foi tratado com ADN Polimerase de T4 (Boerhinger-Mannheim), para preencher as protuberâncias 5' criados pela digestão com Sall, deixando rombas as extremidades de ADN, depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitada com etanol. 0 ADN de extremidades rombas depois foi digerido adicionalmente com BglII para cortar na extremidade 3', foi separado por electroforese em gel e foi purificado usando um kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 0 fragmento de ADN resultante que continha a sequência 242 codificante do domínio extracelular de zcytoR17 foi ligado a um vector de expressão de mamífero que continha o marcador Fc4-CHIS, preparado como se indica a seguir. A cassete de expressão, o esqueleto do plasmídeo e a parte do marcador Fc4-CHIS da quimera estavam contidos dentro de um vector de plasmídeo interno fabricado previamente. Este vector de plasmídeo foi digerido com EcoRI (Boerhinger-Mannheim) , depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitado com etanol. O ADN digerido depois foi tratado com ADN Polimerase de T4 (Boerhinger-Mannheim), para preencher as protuberâncias 5' criadas pela digestão com EcoRI, deixando rombas as extremidades do ADN, depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitado com etanol. 0 ADN de extremidades rombas depois foi digerida adicionalmente com BamHI (Boerhinger-Mannheim) para cortar a extremidade 3', foi separado por electroforese em gel e foi purificada usando um kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). Os fragmentos digeridos e purificados do plasmídeo que continha zcytorl7 e Fc4-CHIS foram ligados entre si usando ADN Ligase de T4 (Life Technologies, Bethesda, MD) usando métodos de ligação convencionais.

Foram rastreadas minipreps da ligação resultante por PCR usando o iniciador sense específico de zcytorl7 ZC29180 SEQ ID NO: 22) e o iniciador antisense especifico de Fc4 ZC29232 SEQ ID NO: 75) com as seguintes condições das reacções de PCR: 30 ciclos de 94 °C durante 60 seg, 68 °C durante 150 seg; e 72 °C durante 7 min. Um tamanho esperado do produto de 846 pb confirmou a montagem correcta do plasmídeo denominado pZEM228 hzcytorl7/Fc4HIS.

Foi criada uma segunda construção zcytorl7-Fc4 para utilização na geração da proteína homodimérica em células COS. Em resumo, a região codificante da proteína de fusão completa foi isolada por digestão de um plasmídeo que 243 previamente continha receptor solúvel Zcytorl7-Fc4 com Sall (Boerhinger-Mannheim). A reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitada com etanol. 0 ADN digerido depois foi tratado com ADN Polimerase de T4 (Boerhinger-Mannheim) para preencher as protuberâncias 5' criadas pela digestão com EcoRI, deixando rombas as extremidades do ADN, depois do qual a reacção foi extraída em série com fenol clorofórmio e foi precipitada com etanol. 0 ADN de extremidades rombas depois foi digerido adicionalmente com Notl (Boerhinger-Mannheim) para cortar na extremidade 3', foi separado por electroforese em gel e foi purificado usando um kit de extracção de gel QIAquick (Qiagen). Um vector de expressão de mamífero que continha uma cassete de expressão dirigido por CMV foi digerido para gerar extremidades compatíveis e os dois fragmentos foram ligados entre si. Foram rastreadas minipreps da ligação resultante por PCR usando o iniciador sense específico do vector ZC14063 SEQ ID NO: 48) e o iniciador antisense específico de zcytorl7 ZC27899 SEQ ID NO: 19) com as seguintes condições de reacção de PCR: 30 ciclos de 94 °C durante 30 seg, 64 °C durante 30 seg; 70 °C durante 90 seg; e 72 °C durante 7 min. Um tamanho de produto esperado de aproximadamente 1000 pb confirmou a montagem correcta do plasmídeo denominado pZP7NX-hzcytorl7-Fc4. Este plasmídeo pósteriormente foi introduzido por transfecção em células COS usando Lipofectamine (Gibco/BRL) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram condicionadas durante 60 horas em DMEM + FBS a 5 % (Gibco/BRL), depois do qual a proteína foi purificada sobre uma coluna de cromatografia de proteína G-sepharose 4B e foi posta a disposição dos bioensaios in vitro, por exemplo, tais como os descritos no presente documento. C. Geração do receptor Zcytorl7 Oncostatina M (OsmRbeta) humano 244

Foram introduzidos por co-transfecção aproximadamente 16 μ9 de pZP9- e pZEM228 hzcytorl7/Fc4HIS em células BHK-570 (ATCC N° CRL-10314) usando lipofectamine (GibcoBRL) de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas foram seleccionadas durante 10 dias em DMEM + FBS a 5 % (Gibco/BRL) que continha 0,5 mg/ml de G418 (Gibco/BRL) e metiltrexato (MTX) 250 nM (Sigma, St. Louis, MO) durante 10 dias. O agrupamento resultante de células duplamente seleccionadas foi usado para gerar a proteína heterodimérica. Foram usadas três fábricas celulares (Nunc, Dinamarca) deste agrupamento para gerar 10 1 de meio condicionado sem soro. Este meio condicionado foi passado numa coluna de 1 ml de proteína A e foi eluído em (10) fracções de 750 microlitros. Foi descoberto que quatro destas fracções tinham a maior concentração e foram agrupadas e submetidas a diálise (limite de PM 10 kD) contra PBS. O complexo de proteína heterodimérico zcytorl7/OSMRbeta solúvel foi isolado a partir de outros componentes do meio passando o agrupamento sobre uma coluna de níquel e lavando a coluna com diversas concentrações de imidazol. A proteína zcytorl7/OSMRbeta solúvel foi eluída a concentrações intermediárias de imidazol, enquanto que o homodímero hzcytor17/Fc4HIS eluiu a maiores concentrações de imidazol.

Exemplo 31

Distribuição De tecido de zcytor!7 Humano em Painéis de Tecido Usando Northern blot e PCR A. Distribuição De tecido de zcytorl7 Humano Usando Northern blot

Foram sondadas manchas de Northern blot de Múltiplos tecidos humanos (manchas de transferência I e II de MTN de pista 12 humano e mancha de transferência II de MTN de sistema imune humano; MTN de tecido endócrino humano, transferência II de MTN de tecido fetal humano, matriz de 245 Múltiplos tecidos humanos) (Clontech) assim como manchas de transferência internas que continham diversos tecidos, para determinar a distribuição de tecido da expressão de zcytorl7 humano. As manchas de transferência preparadas internamente incluíam os seguintes ARNm de tecidos e linhas celulares: células SK-Hep-1, células THP1, Glândula suprarrenal (Clontech); Rim (Clontech), Fígado (Clontech e Invitrogen); Médula espinal (Clontech), Testículo (Clontech), Células T CD4+ humanos, Células T CD8+ humanos, células T CD19+ humanos, reacção mista de linfócitos humanos (MLR), linha celular THP1 (ATCC N° TIB-202), linha celular U937, linha celular de linfoblastos de ratinho p388DI (ATCC N° CCL-46) com ou sem estimulação por ionomicina; e linha celular de pulmão embrionário humano WI-38 (ATCC N° CRL-2221) com ou sem estimulação por ionomicina.

Foi amplificado uma sonda obtida por PCR de aproximadamente 500 pb para zcytorl7 SEQ ID NO: 4) usando oligonucleótidos ZC28,575 SEQ ID NO: 77) e ZC27, 899 SEQ ID NO: 19) como iniciadores. A amplificação por PCR foi realizada como se indica a seguir: 30 ciclos de 94 °C durante 1 minuto, 65 °C durante um minuto e 72 °C durante um minuto; seguido de um ciclo a 72 °C durante 7 minutos. O produto de PCR foi visualizado por electroforese em gel de agarose e o produto de PCR de aproximadamente 500 pb foi purificado em gel como é descrito no presente documento. A sonda foi marcada radioactivamente usando o kit de marcação de iniciador aleatório PRIME IT II™ (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi purificada usando uma coluna de pressão NUCTRAP™ (Stratagene). Foi usada solução EXPRESSHYB™ (Clontech) para a pré-hibridação e como solução de hibridação para os Northern blot. A pré-hibridação foi realizada a 68 °C durante 2 horas. A hibridação foi realizada durante a noite a 68 °C com aproximadamente 1,5X106 cpm/ml de sonda marcada. As manchas 246 de transferência foram lavadas três vezes a temperatura ambiente em SSC 2X, SDS a 0,05 % seguido de uma lavagem durante 10 minutos em SSC 2X, SDS a 0,1 % a 50 °C. Foram observadas várias bandas foram depois de uma exposição de vários dias. Foi observado um transcrito de aproximadamente 9 kb em traqueia, músculo esquelético e timo; foi observado um transcrito de aproximadamente 2 kb em células PBL, HPV, U937 e THP-1; e foi observado um transcrito de aproximadamente 1,2 kb em placenta, médula óssea e tiróide, e em células HPV e U937. Em todos os tecidos indicados anteriormente, a intensidade do sinal foi fraco. Parecia ter pouca expressão na maioria dos tecidos normais, o que sugere que a expressão de zcytorl7 pode ser dependente da activação das células ou tecidos em que se expressa. B. Distribuição De tecido em painéis de tecidos usando PCR Um painel de ADNc de tecidos humanos foi rastreado com respeito à expressão de zcytorl7 usando PCR. O painel foi realizado internamente e continha 94 amostras de ADNc marathon e amostras de ADNc de diversas linhas celulares e tecidos humanos normais e cancerosos e é mostrado no Quadro 13 apresentado a seguir. Os ADNc procediam de bibliotecas internas ou de ADNc marathon procedente de preparações de ARN internas, ARN de Clontech ou ARN de Invitrogen. Os ADNc marathon foram fabricados usando o kit marathon-Ready™ (Clontech, Paio Alto, CA), foram submetidos a ensaios de CC com iniciadores de clatrina ZC21195 SEQ ID NO: 78) e ZC21196 SEQ ID NO: 79) e depois foram diluídos com base na intensidade da banda de clatrina. Para garantir a qualidade das amostras do painel, foram realizados três ensaios de controlo de qualidade (CC): (1) para avaliar a qualidade do ARN usado para as bibliotecas, os ADNc internos foram ensaiados com respeito ao tamanho médio do inserto por PCR com oligos do vector que eram específicos para as sequências de vector para uma biblioteca de ADNc individual; (2) a padronização da concentração do ADNc nas 247 amostras do painel foi conseguida usando métodos de PCR convencionais para amplificar a alfa tubulina de comprimento completo ou ADNc de G3PDH usando um oligo de vector 5' ZC14, 063 SEQ ID NO: 48) e um iniciador oligo especifico de alfa tubulina 3' ZC17,574 SEQ ID NO: 49) ou o iniciador oligo específico de G3PDH 3' ZC17,600 SEQ ID NO: 50); e (3) uma amostra foi enviada a sequenciamento para verificar a possível contaminação com ADN ribossómico ou mitocondrial. O painel foi preparado num formato de 96 poços que incluía uma amostra de controlo positivo de ADN genómico humano (Clontech, Paio Alto, CA). Cada poço continha aproximadamente 0,2-100 pg/μΐ de ADNc. As reacções de PCR foram preparadas usando oligos ZC26,358 SEQ ID NO: 80) e ZC26,359 SEQ ID NO: 81), TaKaRa Ex Taq™ (TAKARA Shuzo Co LTD, Biomedicals Group, Japão), e corante Rediload (Research Genetics, Inc., Huntsville, AO). A amplificação foi realizada como se indica a seguir: um ciclo a 94 °C durante 2 minutos, 35 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 66,3 °C durante 30 segundos e 72 °C durante 30 segundos, seguido de um ciclo a 72 °C durante 5 minutos. Aproximadamente 10 μΐ do produto de reacção de PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose convencional usando um gel de agarose ao 4 %. Foi observado o tamanho do fragmento de ADN previsto correcto em gânglio linfático, próstata, tiróide, HPV (epitélio de próstata), HPVS (epitélio de próstata, seleccionado), tumor de pulmão, reacções de tumor de útero, junto com a reacção de ADN genómico.

Os fragmentos de ADN para o tecido de próstata (2 amostras), HPV (epitélio de próstata), HPVS (epitélio de próstata, seleccionado) , e genómico foram cortados e purificados usando um kit de extracção em gel (Qiagen, atsworth, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos foram confirmados por sequenciamento para mostrar que efectivamente era zcytorl7. 248Quadro 13

Tecido/ linha celular N° de amostras Tecido/ linha celular N° de amostras Glândula suprarrenal 1 Médula óssea 3 Bexiga 1 Cérebro fetal 3 Médula óssea 1 Ilhota 2 Cérebro 1 Próstata 3 Colo do útero 1 RPMI N° 1788 (ATCC N° CCL-156) 2 Cólon 1 Testículo 4 Cérebro fetal 1 Tiróide 2 Coração fetal 1 WI38 (ATCC N° CCL-75) 2 Rim fetal 1 AR IP (ATCC N ° CRL-1674 rato) 1 Fígado fetal 1 HaCat - queratinócitos humanos 1 Pulmão fetal 1 HPV (ATCC N° CRL-2221) 1 Músculo fetal 1 Glândula suprarrenal 1 Pele fetal 1 SM de próstata 2 Coração 2 PBMC seleccionadas CD3+ estimuladas com ionomicina + PMA 1 K56 2(ATCC N° CCL-243) 1 HPVS (ATCC N° CRL-2221) seleccionadas 1 Rim 1 Coração 1 Fígado 1 Pituitária 1 Pulmão 1 Placenta 2 Gânglio linfático 1 Glândula salivar 1 Melanoma 1 HL6 0 (ATCC N ° CCL-240) 3 Pâncreas 1 Plaqueta 1 Pituitária 1 HBL-100 1 Placenta 1 Mesangial renal 1 Próstata 1 Linfócito T 1 Recto 1 Neutrófilo 1 Glândula salivar 1 MFC 1 249 Músculo esquelético 1 Hut-102 (ATCC N° TIB-162) 1 Intestino delgado 1 Endotelial 1 Médula espinal 1 HepG2 (ATCC N° HB-8065) 1 Baço 1 Fibroblasto 1 Estômago 1 E. Histo 1 Testículo 2 Timo 1 Tiróide 1 Traqueia 1 Útero 1 Tumor esofágico 1 Tumor gástrico 1 Tumor renal 1 Tumor hepático 1 Tumor de pulmão 1 Tumor de ovário 1 Tumor rectal 1 Tumor de útero 1 C. Análise de expressão de zcytorl7 por PCR e Northern A anotação dos tipos celulares e as condições de crescimento que afectam à expressão do receptor é um meio útil para esclarecer sua função e predizer uma fonte de ligando. Para esta finalidade, foram inspeccionadas uma ampla diversidade de tecidos e tipos celulares por PCR. Foi usada a Polimerase termoestável Advantage II™ (Clontech, A Jolla, CA) com os iniciadores oligonucleotidicos ZC29,180 SEQ ID NO: 22) e ZC29, 179 SEQ ID NO: 82) e 1-10 ng dos diversos moldes de ADNc indicados a seguir para 30 ciclos de amplificação de (94 °C, 30 seg.; 66 °C, 20 seg.; 68 °C, 1 min. 30 seg.). Depois disto, foi realizada um 20 % de cada reacção em géis de agarose a 0,8 %, TAE/ brometo de etidio e foram visualizadas com luz UV. Depois, as amostras 250 foram avaliadas com base na intensidade das bandas. Veja-se o Quadro 14 mostrada a seguir.

Quadro 14 Células e Condições Pontuação 0-5 Hei estimulada com PMA 0 U937 3 MCF-7 0 HuH7 1 Folículo humano 0 HT-29 0 HEPG2 0 HepG2 estimulada com IL6 0 Endotélio dérmico humano 0 Endotélio venoso humano 0 CD4+ humana 0 BEWO 0 CD19+ humana 1 PBMC humana estimulada com PHA, PMA, Ionomicina, IL2, IL4, TNF 24horas 0 PBMC humana estimulada com LPS, PWM. IFNy, TNFa, 24 horas 0 Todas as PBMC humanas das condições anteriores durante 48 horas 4 HUVEC p.2 4 RPN1788 0 TF1 0 Células T de baço de macaco estimulados com PMA, Ionomicina 0 Epitélio de próstata humana transformada com HPV 5 Amígdala humana inflamada 0 HACAT 0 Condrócito humano 1 Sinoviócito humano 1 251 THP1 5 REH 0

Dos fortes sinais de PCR positivas, dois procediam das linhas celulares de monócitos humanos U937 e THP1.

Estas duas linhas celulares juntamente com uma linha de epitélio de próstata foram seleccionadas para análise adicionais por Northern blot. Os intentos anteriores de visualizar um transcrito por análise de Northern usando ARNm de diversos tecidos produziram sinais fracos e difusos no intervalo de tamanho surpreendentemente grande de 7-10 kb, fazendo com que este dado seja difícil de interpretar. Foi preparado um gel desnaturalizante de formaldeído/MOPS/agarose a 0,8 % (RNA Methodologies, Farrell, RE Academic Press) e foram postos 2 μρ de polyA+ ARNm para cada amostra juntamente com uma escala de ARN (Life Technologies, Bethesda, MD). O gel depois foi transferido a nylon Hybond (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido), foi submetido a entrecruzamento UV e foi hibridado em solução ExpressHyb (Clontech, A Jolla, CA) a 68 °C durante a noite usando uma sonda para zcytoR17 humano gerada por PCR com os oligos ZC28,575 SEQ ID NO: 77), e ZC27, 899 SEQ ID NO: 19) e foi marcada com o kit Megaprime 32P (Amersham). A mancha de Northern blot posteriormente foi lavada com SSC 4,2X + SDS a 0,1 % a 65 °C durante 15 minutos e foi exposta à película durante 7 dias com crivos de intensificação. Foi observado uma banda proeminente de 8 kb tanto no epitélio de próstata como nas pistas de U937 enquanto que estava presente uma banda mais débil no pista de THP1.

Para optimizar o ADNc usado como sonda de hibridação, foram amplificadas quatro regiões diferentes da sequência de zcytoR17 humano de comprimento completo por PCR, foram marcadas e hibridadas como foi descrito anteriormente com manchas de Southern blot que continham ADN da biblioteca de 252 ADNc genómica e amplificada. As quatro sondas, denominadas no presente documento sondas A-D, foram amplificadas usando os seguintes pares de iniciadores: (A) ZC28,575 SEQ ID NO: 77), ZC27,899 SEQ ID NO: 19); (B) ZC27,895 SEQ ID NO: 20), ZC28, 917 SEQ ID NO: 83); (C) ZC28,916 SEQ ID NO: 84), ZC28, 918 SEQ ID NO: : 85); e (D) ZC28,916 SEQ ID NO: 84), ZC29,122 SEQ ID NO: 21). O ADN genómico humano juntamente com as bibliotecas de ADNc amplificadas demostraram conter zcytoR17 por PCR e foram digeridos com EcoRl e Xhol para libertar insertos e foram processados em géis de TAE/agarose a 0,8 %, em duplicata, foras desnaturalizados com NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M, foram trasferidos a Hybond, foram submetidos a entrecruzamento UV e cada um hibridou com uma sonda distinta. Foi observado que a sonda B tinha a menor ligação não especifica e o sinal mais forte. Desta maneira, a sonda B foi usada para todas as hibridações posteriores.

Dado que as células THP1 são um excelente modelo de monócitos circulantes e expressavam zcytoR17 a baixos níveis, foram tratadas com uma diversidade de compostos com a intenção de aumentar a expressão de zcytoR.17. As células foram cultivadas a uma densidade de 2X105/ml, foram lavadas e foram ressuspensas em diversos meios de estimulação, foram cultivadas durante quatro ou trinta horas e foram colhidas para as preparações de ARN. Cada meio foi suplementado com um dos seguintes fármacos ou pares de citocinas: LPS 2 ug/ml (Sigma Chemicals, St. Louis, MO), hTNFa2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hGM-CSF 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hlFNy 50 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN) , hMCSF 1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hIL6 1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hILiP 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hlFNy 50 ng/ml + hIL4 0,5 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), hlFNy 50 ng/ml + hILlO 1 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, MN), PMA 10 ng/ml (Calbiochem, SanDiego, CA) e um controlo 253 não tratado. Ao final do período de cultura foi preparado ARN total usando um kit RNAeasy Midi (Qiagen, Valência, CA) . Foi seleccionado o ARN poli A+ a partir do ARN total usando um kit MPG (CPG, Lincoln Park, NJ) . Dois ug de ARN poli A+ de cada condição foram processados em géis de formaldeído/MOPS/agarose, foram transferidos a nylon e foram submetidos a entrecruzamento UV como foi descrito anteriormente. Estas manchas de Northern blot depois foram hibridadas, como foi indicado anteriormente, com a sonda B a 68 °C durante a noite, foram lavados a alta restringência com SSC 0,2X, SDS a 0,1 % a 65 °C, foram expostos a um filme durante a noite e depois foram expostos a crivos de fósforo para a quantificação do sinal. Em todos as pistas foi observado um ARNm de 8 kb dominante assim como uma banda de 2,8 kb relativamente mais débil. Foi observado um aumento de 20 vezes no ARNm de zcytoR17 no ARN das células tratadas com hlFNy durante 30 horas, e este efeito foi mutado ligeiramente com tratamento simultâneo com IL4. Foram observadas aumentos minoritários de 3 vezes no ARNm no ARN procedente de células tratadas com LPS, TNFa e GM-CSF, enquanto que o MCSF, IL6 e ΙΕΐβ não tiveram nenhum efeito sobre os níveis de ARNm de zcytorl7. Estes dados sugerem um papel para o receptor zcytorl7 e seu ligando na biologia dos monócitos e macrófagos e, por extensão, em vários processos de doença nos que participam estas células.

Exemplo 32

Distribuição De tecido de zcytorl71ig humano em Painéis de Tecidos Usando Northern blot e PCR

Foi obtido um fragmento de ADNc de zcytorl71ig humano usando PCR com iniciadores específicos de genes: iniciador sense ZC41438 SEQ ID NO: 93) e iniciador antisense ZC41438 SEQ ID NO: 93) e ADNc de zcytorl71ig humano molde SEQ ID NO: 90). Este fragmento foi purificado usando métodos convencionais e aproximadamente 25 ng foram marcadas com 32 254 P alfa dCTP usando o kit de marcação de iniciadores aleatório Prime-It RmT (Stratagene) e foram feitos hibridar em Ultrahyb, (Ambion) e foram usados para expor o filme Biomax/crivos de intensificação de acordo com as recomendações do fabricante em cada caso. Foram hibridadas manchas de transferência novas, não usadas previamente, incluindo MTN de pista 12 humano de Clontech, MTN II de cérebro humano, e a mancha de transferência IV de MTN de cérebro humano, MTN II de sistema imune humano, e a matriz II de MTE humana, de Clontech, durante a noite a 42 °C de acordo com o método Ambion ultrahyb. Foram eliminadas as quantidades radioactivas não específicas usando SSC 0,1/SDS a 0,5 % a 55 °C. As manchas de transferência positivas incluíam MTN de pista 12 humano (Clontech). Dos 12 tecidos examinados, somente a placenta foi positiva para um transcrito de aproximadamente 1,2 kb.

Exemplo 33

Construção de vectores de expressão de mamífero que expressam zcytorl71iq- CEE humano A. Construção de zCytorl7Liq-CEE/pZMP21

Foi construído um plasmídeo de expressão que continha todo ou parte de um polinucleótido que codificava zcytorl7Lig-CEE SEQ ID NO: 95) por meio de recombinação homóloga. O plasmídeo foi denominado zCytorl7Lig- CEE/pZMP21. A construção de zCytorl7Lig-CEE/pZMp21 foi realizada gerando um fragmento zCytorl7Lig-CEE usando amplificação por PCR. O molde de ADN usado para a produção do fragmento zCytorl7Lig-CEE foi zCytorl7Lig/pZP7nx. Os iniciadores usados para a produção do fragmento zCytorl7Lig-CEE foram: (1) ZC4 1,607 SEQ ID NO: 97) (sequência sense) , que inclui desde a extremidade 5' à extremidade 3': 28 pb da sequência flanqueante do vector (5' do inserto) e 21 pb correspondentes à sequência 5' de zCytorl7Lig; e (2) ZC41,605 SEQ ID NO: 98) (sequência antisense), que inclui 255 desde a extremidade 5' à extremidade 3': 37 pb da sequência flanqueante do vector (3' do inserto) , 3 pb do codão de terminação, 21 pb que codificam um marcador EE C-terminal, e 21 pb que correspondem à extremidade 3' da sequência de zCytorl7Lig. 0 fragmento resultante da amplificação por PCR anterior foi uma cópia do zCytorl7Lig molde com a adição de um marcador EE C-terminal, produzindo um produto final zCytorl7Lig-CEE.

As reacções de PCR foram realizadas como se indica a seguir: A um volume final de 100 μΐ foram adicionados: 10 μΐ de tampão de reacção de Taq Polimerase 10X com MgCl 15 mM (Gibco) , 1 μΐ de Taq ADN Polimerase (5 unidades/μΐ (Gibco), 3 μΐ de dNTP 10 mM, 78 μΐ de dH20, 3 μΐ de uma solução de reserva de 20 pmol/μΐ de iniciador ZC41,607 SEQ ID NO: 97), 3 μΐ de uma solução de reserva de 20 pmol/μΐ de iniciador ZC41,605 SEQ ID NO: 98) e 2 μΐ de uma solução de reserva de 0,13 μg/μl de ADN molde de zCytorl71ig. Foi adicionado um volume igual a 50 μΐ de óleo mineral à mistura. A reacção foi aquecida a 94 °C durante 5 minutos, seguido de 35 ciclos a 94 °C durante um minuto; 55 °C durante 2 minutos; 72 °C durante 3 minutos; seguido de uma extensão de 10 minutos a 72 °C e manutenção a 4 °C até que a reacção foi colhida. O plasmídeo pZMP21 foi submetido a digestão de restrição com enzima BglII, foi limpo com kit de purificação de PCR QiaQuick (Qiagen) usando um protocolo de microcentrifuga e foi usado para recombinação com o fragmento de PCR. O plasmídeo pZMP21 foi construído a partir de pZMP20, que foi construído a partir de pZp9 (depositado na Colecção Americana de Culturas celulares, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e é designado N° 98668) com os elementos genéticos de levadura de pRS316 (depositado na Colecção Americana de Culturas celulares, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, e é designado N° 77145), um elemento IRES de 256 poliovírus e o domínio extracelular de CD8, truncado na extremidade carboxilo terminal do domínio transmembranar. PZMP21 é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor de MPSV, intrão de péptido sinal de imunoglobulina, Múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes, um codão de terminação e um terminador de hormona de crescimento humana. O plasmídeo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidad de expressão de marcador de selecção de mamífero que tem um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene de DHFR, o terminador de SV40, assim como as sequências de URA3 e CEN-ARS necessárias para a selecção e replicação em S. cerevisiae.

Foram combinados independentemente 50 μΐ de células de levedura competentes (S. cerevisiae) com 100 ng de plasmídeo de corte, 5 μΐ de mistura de PCR descrita previamente, e foram transferidos a uma cuveta de electroporação de 0,2 cm. A mistura de levedura/ADN foi submetida a electropulsos a 0,75 kV (5 kV/cm) °o ohms, 25 μΕ. A cada cuveta foram adicionados 600 μΐ de sorbitol 1,2 M e a levedura foi inoculada numa alíquota de 100 μΐ e uma alíquota de 300 μΐ sobre duas placas URA-D e foi incubada a 30 °C. Depois de aproximadamente 72 horas, os transf ormantes de levedura URA+ de uma só placa foram ressuspensos em 1 ml de H2O e foram centrifugados brevemente para sedimentar as células de levedura. O sedimento celular foi ressuspenso em 500 μΐ de tampão de lise (Triton X-100 a 2 %, SDS a 1 %, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Os 500 μΐ da mistura de lise foram adicionados a um tubo Eppendorf que continha 300 μΐ de pérolas de vidro de 600 μκι lavadas com ácido e 300 μΐ de fenol-clorofórmio, foram agitados com vórtice durante intervalos de 1 minuto duas ou três vezes, seguido de uma centrifugação de 5 minutos numa centrífuga de Eppendorf a velocidad emáxima. Trezentos microlitros da fase aquosa 257 foram transferidos a um tubo limpo e o ADN foi precipitado com 600 μΐ de etanol (EtOH) a 100 % seguido de centrifugação durante 10 minutos a 4 °C. O sedimento de ADN depois foi lavado com 500 μΐ de EtOH a 70 %, seguido de centrifugação durante 1 minuto a 4 °C. O sedimento de ADN foi ressuspenso em 30 μΐ de H2O. A transformação de células E. coli electrocompetentes (MC1061) foi realizada com 5 μΐ da preparação de ADN de levedura e 50 μΐ de células MC1061. As células foram submetidas a electropulsos a 2,0 kV, 25 μΡ e 400 ohms (Ω) . Depois da electroporação, foram adicionados 600 μΐ de SOC (Bacto Tryptone a 2 % (Difco, Detroit, MI), extracto de levedura a 0,5 % (Difco), NaCl 10 mM, KC1 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSCg 10 mM, glucose 20 mM) . As células E. coli submetidas a electroporação foram cultivadas numa alíquota de 200 μΐ e 50 μΐ em duas placas de LB AMP (caldo LB (Lennox), Bacto Agar a 1,8 % (Difco), 100 mg/1 de Ampicilina). As placas foram incubadas em posição vertical durante aproximadamente 24 horas a 37 °C. Foram seleccionadas três colónias resistentes a ampicilina aleatoriamente e foram enviadas para análise de sequência do inserto. Foi isolado ADN de plasmídeo a grande escala a partir de um clone com a sequência confirmada usando o kit Qiagen Maxi (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. B. Construção de zCytor17Lig(m)-CEE/pZMP21 de ratinho

Também foi construído um plasmídeo de expressão que continha o polinucleótido inteiro que codificava zCytor17Lig-CEE murino SEQ ID NO: 104 e SEQ ID NO: 105) por meio de recombinação homologa usando o método descrito no Exemplo 33A anterior. Os iniciadores usados foram: (1) ZC41643 SEQ ID NO: 105) (directo, 5' a 3', sense), que tinha um vector de 28 pb sobreposto na posição 5' do ponto de inserção; 21 pb da extremidade 5' de zcytorl71ig(m) e (2) ZC41641 SEQ ID NO: 107) (inverso, 5' a 3', antisense) 258 que tinha um vector de 33 pb sobreposto na posição 3' do ponto de inserção; codão de terminação de 3 pb; 21 pb de marcador EE C-terminal; 24 pb da extremidade 3' de zCytorl7Lig(m)-CEE. O plasmideo foi denominado zcytorl71ig(m)-CEE/pZMP21. A sequência de polinucleótido de zcytorl71ig(m)-CEE é mostrada na SEQ ID NO: 104 e a sequência polipeptidica correspondente é mostrado na SEQ ID NO: 105.

Exemplo 34

Transfecção e Expressão de Polipéptidos zcytorl71ig-CEE A. Expressão de zcytorl71ig-CEE/pZMP21 humano em células 293T

Foi expresso ZCytorl71ig-CEE de forma transitória em células 293T (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, ATCC (SD-3515)) para gerar a proteína purificada inicial. No dia anterior à transfecção, foram semeadas células 293T a 6,5 x 104 células/cm2 em 30 balões de cultura T162 com um volume total de 30 ml de meio de cultura (SL7V4 + FBS a 5 % + Pen/Estrep ao 1 %) por balão. As células foram deixadas incubar durante 24 horas a 37 °C.

Foi preparada uma mistura de ADN/Lipossomas como segue: dois tubos cónicos de 50 ml foram cheios com 25 ml de meio de transfecção (SL7V4 + Pen/Estrep ao 1 %) e foram adicionados 1,13 mg de zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 (Exemplo 33) a cada um. Uma série separada de dois tubos cónicos de 50 ml foram cheios com 22 ml de meio de transfecção (anterior) e foram adicionados a cada um 3 ml de lipossomas (Lipofectamine, (Gibco)) . Para cada série de tubos, foi adicionado um tubo de ADN a um tubo de lipossomas e a mistura de ADN/lipossomas foi incubada durante 30 minutos. Os dois tubos cónicos de 50 ml que continham as misturas de AND/lipossomas foram agrupados (aproximadamente 100 ml) e foram adicionados 300 ml de meio de transfecção.

Os 30 balões das células 293T foram decantados, foram lavados uma vez com aproximadamente 15 ml de PBS e foram 259 adicionados 12,5 ml da mistura de ADN/lipossomas diluída a cada balão. Os balões foram incubados durante 3 horas a 37 °C. Depois do período de incubação, foram adicionados 25 ml de meio de cultura (anterior) a cada balão T162. 0 meio de transfecção foi colhido depois de aproximadamente 96 horas e foi usado para a purificação de proteínas (Exemplo 35).

B. Expressão de zcytorl71ig-CEE/pZMP21 humano em células BHK

Foi produzida proteína zCytorl7Lig de comprimento completo em células BHK transfectadas com zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 (veja-se o Exemplo 33 anterior) . Foram cultivadas células BHK 570 (ATCC CRL-10314) em balões de cultura de tecido T75 e foram deixadas crescer até uma confluência de aproximadamente 50 a 70 % a 37 °C, com 5 % de CO2, em meio de crescimento (SL7V4, FBS a 5 %, pen/estrep a 1 %) . As células depois foram transfectadas com zCytorl7Lig-CEE/pZMP21 por transfecção mediada por lipossomas (usando Lipofectamine™; Life Technologies), em meio sem soro (SF) (SL7V4). O plasmídeo (16 μg) foi diluído em tubos de 1,5 ml até um volume final total de 640 μΐ com meio SF. Trinta e cinco microlitros da mistura de lípido foram misturados com 605 μΐ de meio SF, e a mistura resultante foi deixada incubar aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente. Depois foram adicionados 5 mililitros de meio SF à mistura de ADN: lípido. As células foram enxaguadas uma vez com 10 ml de PBS, o PBS foi decantado, e foi adicionado a mistura de ADN:lípidos. As células foram incubadas a 37 °C durante cinco horas, e depois foram adicionados 15 ml de meio (SL7V4, FBS a 5 %, pen/estrep a 1 %) a cada placa. As placas foram incubadas a 37 °C durante a noite e a mistura de ADN:meio de lípidos foi substituído por meio de selecção (SL7V4, FBS a 5 %, pen/estrep a 1 %, metotrexato 1 μΜ) no dia seguinte. Aproximadamente 10 dias depois da transfecção, foram tripsinizadas colónias resistentes a metotrexato do balão de transfecção T75 e as 260 células foram agrupadas e foram cultivadas um balão T-162 e foram transferidos a uma cultura a grande escala.

C. Expressão de zcytorl71ig-CEE(m)/pZMP21 de ratinho em células 293T

Acytorl71ig(m)-CEE de ratinho foi expresso de forma transitória em células 293T como é descrito no Exemplo 34A e foi usado meio de cultura para a purificação de proteínas (Exemplo 35).

Exemplo 35

Purificação de Zcytorl71ig-CEE a partir de células 293T A menos que se indique outra cosa, todas as operações foram realizadas a 4 °C. Foi usado o seguinte método para purificar Zcytorl71ig humano e de ratinho que continha marcadores Glu-Glu (EE) C-terminais SEQ ID NO: 103). Foi purificado meio condicionado a partir de células 293T que expressavam Zcytorl71ig-CEE (Exemplo 34) . As concentrações totais de proteína alvo do meio condicionado foram determinadas por meio de SDS-PAGE e análise de Western blotting com o anticorpo anti-EE.

Uma coluna de 5,5 ml de anti-EE Poros 50 A (PE Biosystems), (Framingham, MA) (preparada como é descrito a seguir) foi deitada numa coluna de vidro Waters AP-1, 1 cm x 7 cm (Waters, Milford MA) . A coluna foi preenchida e equilibrada num BioCad Sprint (PE BioSystems, Framingham, MA) com solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4. O meio condicionado foi ajustado com NaCl a 0,3 Me o pH foi ajustado a 7,2. O meio condicionado depois foi carregado na coluna durante a noite com uma taxa de fluxo de aproximadamente 3 ml/minuto. A coluna foi lavada com 10 volumes de coluna (VC) de PBS pH 7,4 e de novo foi lavada com 3 VC de Sigma PBS 5X pH 7,4. Foi eluída por etapas com acetato 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 2,5 a 3 ml/minuto. Os tubos das fracções continham 1 ml de base Tris (sem ajuste de pH) para neutralizar a eluição imediatamente. A coluna foi lavada de novo com 2 VC com Sigma PBS 5X, pH 7,4, para 261 neutralizar a coluna e depois foi equilibrada em PBS (pH 7, 4) . Foram colhidas fracções de 2 ml durante a cromatografia de eluição completa e foi verificada a absorvância a 280 e 215 nm; também foram guardadas a reserva de eluições e a reserva de lavagem e foram analisadas. O PBS 5X e as fracções pico de eluição ácida foram analisados com respeito à proteína alvo por coloração com prata de SDS-PAGE e Western blotting com o anticorpo primário anti-EE e o anticorpo secundário anti-ratinho conjugado com HRP. As fracções de eluição ácida de interesse foram agrupadas e foram concentradas de 38 ml a 0,8 ml usando um concentrador de centrifugação de membrana com um limite de peso molecular de 5.000 Dalton (Millipore, Bedford, MA) de acordo com as instruções do fabricante.

Para separar Zcytort71ig-CEE do material agregado e qualquer outra proteína de co-purificação contaminante, as fracções concentradas agrupadas foram submetidas a cromatografia de exclusão molecular numa coluna Superdex 75 (120 ml) (Pharmacia, Piscataway, NJ) de 1,6 x 60 cm equilibrada e carregada em PBS a uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min usando um BioCad Sprint. Foram colhidas fracções de 3 ml ao longo de toda a cromatograf ia e foi verificada a absorvância a 280 e 215 nm. As fracções pico foram caracterizadas por coloração com prata de SDS-PAGE e somente foram agrupadas as fracções mais puras. Este material representava a proteína Zcytort71ig-CEE purificada.

Nos géis de SDS-PAGE submetidos a Western blotting, coloração com azul de Coomassie e coloração com prata, o Zcytort71ig-CEE era uma banda principal. A concentração de proteínas do material purificado foi realizada por análise BCA ( (Pierce, Rockford, IL) e a proteína foi dividida em alíquotas e foi armazenada a -80 °C de acordo com métodos convencionais. 262

Para preparar anti-EE Poros A50, foi lavadoum volume de leito de 65 ml de Poros A50 (PE Biosystems) com 100 ml de água e depois trietanolamina 0,1 M, pH 8,2 (TEA, ICN, Aurora, Ohio) , Na2SC>4 1 M, pH 8,8 que continha azida sódica ao 0,02 % usando uma unidade de filtro de balão a vácuo. A solução de anticorpo monoclonal EE, a uma concentração de 2 mg/ml num volume de 300 ml, foi misturada com a resina lavada num volume de 250 ml. Depois de uma incubação

durante a noite a temperatura ambiente, foi retirado o anticorpo não unido lavando a resina com 5 volumes de TEA 200 mM, Na2SC>4 1M, pH 8,8 que continha azida sódica a 0,02 % como foi descrito anteriormente. A resina foi ressuspenso em 2 volúmenes de TEA, Na2SC>4 1 M, pH 8,8 que contenia azida sódica ao 0,02 % e foi transferido a um recipiente adequado. Foram adicionados 3 ml de Didisuccinimidil suberato a 25 mg/ml (68 mM) (em DMSO fornecido por Pierce, Rockford, IL) e a solução foi incubada durante 3 horas a temperatura ambiente. Depois, os locais não específicos na resina foram bloqueados por incubação durante 10 min a temperatura ambiente com 5 volumes de etanolamina 20 mM (Sigma, St. Louis, MO) em TEA 200 mM , pH 8,8 usando a unidade de filtro de balão a vácuo. A resina foi lavada com PBS, pH 7,4, seguido de glicina 0,1 M, pH 3 e depois foi neutralizada com PBS 10X. Depois de lavar com água destilada, a resina anti-EE Poros-A 50 acoplada a final foi armazenada a 4 °C em Etanol ao 20 %.

Exemplo 36

Sequenciamento N-terminal de Zcytorl71iq humano e de ratinho A. Sequenciamento N-terminal de Zcytorl71iq humano

Foi realizada um sequenciamento automático convencional do polipéptido N-terminal (degradação de Edman) usando reactivos de Applied Biosystems. A análise da sequência N-terminal foi realizada num sistema Sequenciador de Proteínas Modelo 494 (Applied Biosystems, Inc., Foster 263

City, CA). A análise dos dados foi realizada com o Sistema de Análise de Dados Modelo 610A para Sequenciamento de Proteínas, versão 2.1a (Applied Biosystems).

Foi fornecida uma amostra de Zcytort71ig-CEE purificada (Exemplo 35). A amostra foi carregada num filtro de fibra de vidro preparado para a sequenciamento N-terminal. 0 filtro de fibra de vidro foi preparado por pré-ciclagem com Biobrene™. A análise da sequência N-terminal do polipéptido Zcytort71ig humano segregado não verificava o local de clivagem previsto da sequência sinan, mas resultou num inicio maduro no resíduo 27 (Leu) na SEQ ID NO: 2 da sequência precursora de zcytorl71ig humano. B. Sequenciamento N-terminal de Zcytorl71iq de ratinho

Foi realizada o sequenciamento do polipéptido N-terminal automático convencional (degradação de Edman) usando reactivos de Applied Biosystems. A análise da sequência N-terminal foi realizada num Sistema Sequenciador de Proteínas Modelo 494 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). A análise dos dados foi realizada com o Sistema de Análise de Dados Modelo 610A para Sequenciamento de Proteínas, 2.1a (Applied Biosystems).

Foi fornecida uma amostra de zcytor171ig-CEE de ratinho purificada conforme foi capturada em pérolas de Proteína G Sepharose/anti-EE (Exemplo 35). As pérolas foram postas em tampão de amostra de SDS PAGE redutor e num banho de água em ebulição antes de se processado em SDS PAGE, usando um sistema SDS PAGE de Novex (Bis-Tris MES NuPAGE 4-12 %; Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 0 gel foi electrotransferido a uma membrana Novex PVDF (Invitrogen), e foi corado com azul de Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) usando métodos convencionais. Foram realizadas transferências de Western anti-EE correspondentes para identificar a banda de Zcytorl71ig para a sequenciamento da proteína N-Terminal. O anticorpo 264 de ratinho anti-IgG EE conjugado com HRP usado foi produzido internamente. A análise da sequência N-terminal do polipéptido zcytorl71ig de ratinho segregado verificou o local de clivagem previsto da sequência sinal, dando como resultado um inicio maduro a 31 (Ala) em referência a as SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 91 da sequência precursora de zcytorl71ig de ratinho.

Exemplo 37

Ensaio de ligação a células Cos

Foi usado um ensaio de ligação para ensaiar a ligação de zcytorl71ig a receptores que compreendem o receptor zcytorl7, tais como o receptor zcytorl7 ou heterodimeros e trimeros do receptor que compreendem receptor zcytorl7 (por exemplo, zcytorl7/0SMR, zcytorl7/WSX-l, ou zcytorl7/0SMR/fVSX-l, ou outras subunidades receptoras de citocinas de Clase I). Foi introduzido por transfecção ADN de plasmideo do receptor zcytorl7 em células COS e as células COS transfectadas foram usados para avaliar a unión de zcytorl71ig a receptores que compreendem o receptor zcytorl7 como é descrito a seguir.

A. Transfecções de células COS A transfecção de células COS foi realizada como segue: misturar 800 ng de ADN de plasmideo de receptor nas seguintes combinações: pZp7pX/zcytor17 só; pZp7Z/WSX-l só; pZp7NX/OSMR só; pZp7pX/zcytorl7 + pZp7NX/OSMR; pZp7pX/zcytorl7 + pZp7Z/WSX-l; pZp7NX/OSMR + pZp7Z/WSX-l; pZp7pX/zcytorl7 + pZp7NX/OSMR + pZp7Z/WSX-l) e 4 ul de

Lipofectamine™ em 80 ul de meio DMEM sem soro (55 mg de piruvato de sódio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de

Transferrina, 2,5 mg insulina, 1 μρ de selénio e 5 mg de fetuína em 500 ml DMEM), incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos e depois adicionar 320 μΐ de meio DMEM sem soro. Adicionar estes 400 μΐ de mistura sobre 2 x 105 células COS/poço cultivadas em placas de cultura de tecidos 265 de 12 poços (revestidas com fibronectina) e incubar durante 5 horas a 37 °C. Anadir 500 ul de meio FBS DMEM a 20 % (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato de sódio e 146 mg de L-glutamina em 500 ml de DMEM) e incubar durante a noite. B. Ensaio de ligação O ensaio de ligação foi realizado como segue: foi retirado o meio das células com PBS + BSA a 0,1 % e depois as células foram bloqueadas durante 60 minutos com a mesma solução. As células depois foram incubadas durante 1 hora em PBS + BSA a 0,1 % com proteina purificada zcytorl71igCEE a 1,0 μρ/τηΐ. As células depois foram lavadas com PBS + BSA a 0,1 % e foram incubadas durante outra hora com anticorpo de ratinho anti-GluGlu diluído 1:1000. De novo, as células foram lavadas com PBS + BSA a 0,1 %, depois foram incubadas durante 1 hora com anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com HRP diluído 1:200. A ligação positiva foi detectada com reagente de fluoresceína tiramida diluído 1:50 em tampão de diluição (kit NEN) e foi incubada durante 4-6 minutos, e foi lavada com PBS + BSA a 0,1 %. As células foram fixas durante 15 minutos com formaldeído ao 1,8 % em PBS, e depois foram lavadas com PBS + BSA a 0,1 %. As células foram conservadas com meio de montagem Vectashield (Vector Labs Burlingame, CA) diluído 1:5 em PBS. As células foram visualizadas usando um filtro FTTC num microscópio fluorescente.

Foi detectada a ligação positiva para as células transfectadas com zcytorl7 só, zcytorl7 + OSMRbeta, zcytorl7 + WSX-1, e zcytorl7 + OSMRbeta + WSX-1. Não se detectou ligação para as células transfectadas com WSX-1 + OSMRbeta, com OSMRbeta só, ou com WSX-1 só.

Exemplo 38

Zcytorl71iq de ratinho activa a receptor zcytorl7/OSMRbeta de ratinho no ensaio de luciferase A. Clonaqem de zcytor!7 de ratinho de comprimento completo e OSMRbeta de ratinho para a expressão 266

Rastreou-se uma biblioteca de ADNc de testículo de ratinho com respeito a um clone de comprimento completo de zcytoR17 de ratinho. A biblioteca foi inoculada em placa a 65.500 ufc/placa em 24 placas de LB + Amp. Prepararam-se elevações de filtro utilizando Hybond N (Amersham-Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) sobre um total de aproximadamente 1,6 milhões de colónias. Os filtros foram marcados com uma agulha quente para a orientação e depois desnaturalizados durante 6 minutos em NaOH 0,5 M e Tris-HCl 1,5 M, pH 7,2. Os filtros depois foram neutralizados em NaCl 1,5 M e Tris-HCl 0,5 M, pH 7,2 durante 6 minutos. O ADN foi fixo aos filtros utilizando um agente de entrecruzamento UV (Stratalinker®, Stratagene, A Jolla, CA) a 1200 joules. Os filtros depois foram deixados secar durante a noite a temperatura ambiente.

Ao dia seguinte, os filtros foram pré-lavados a 65 °C em tampão de pré-lavagem que consistia em SSC 0,25X, SDS a 0,25 % e EDTA 1 mM. Os detritos celulares foram retirados manualmente utilizando Kimwipes® (Kimberly-Clark) e a solução foi mudada 3 vezes durante um período de 1 hora. Os filtros foram secos ao ar e armazenados a temperatura ambiente até serem necessários. Os filtros depois foram pré-hibridados durante aproximadamente 3 horas a 63 °C em 20 ml de solução de hibridação ExpressHyb™ (Clontech, Paio Alto,CA). A sonda B (Exemplo 31) foi gerada por PCR a partir de molde de zcytoR17 humano utilizando iniciadores oligonucleotídicos ZC27,895 (SEQ ID NO: 20) e ZC28,917 (SEQ ID NO: 83) e marcada radiactivamente com 32P utilizando um kit disponível comercialmente (Megaprime DNA Labeling System; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi purificada utilizando uma coluna de pressão Stratagene™ (coluna NucTrap®; Stratagene, A Jolla, CA) . A sonda foi desnaturada a 100 °C durante 15 min e adicionada a 267

ExpressHyb™. Os filtros foram hibridados em 15 ml de solução de hibridação que continha 1,6 x 106 cpm/ml de sonda a 63 °C durante a noite. Os filtros foram lavados a 55 °C em SSC 2X, SDS a 0,1 % e EDTA 1 mM e expostos a uma película de raios X a -80 °C durante 4 dias e meio. Colheram-se 13 positivos das placas como blocos e colocaram-se em 1 ml de LB + amp em tubos de 1,7 ml. Os tubos foram colocados a 4 °C durante a noite. Estes 13 positivos foram submetidos a duas rondas mais de purificação. As placas terciárias foram cultivadas a 37 °C, depois realizaram-se elevações de filtro e colheram-se colónias individuais e enviaram-se ao sequenciamento. Determinou-se que três destas continham a sequência do ortólogo de ratinho de zcytoR17.

Além disso, gerou-se um produto de PCR utilizando ADNc de CTLL-2 como molde e oligonucleótidos ZC38,239 (SEQ ID NO: 108) e ZC38,245 (SEQ ID NO: 109) como iniciadores. CTLL-2 é uma linha celular de linfócitos T citotóxicos de ratinho (ATCC N° TTB-214). Esta reacção de PCR realizou-se como é indicado a seguir: um ciclo a 95 °C durante 1 minuto, 30 ciclos a 95 °C durante 15 segundos, 68 °C durante 3 minutos, e depois 68 °C durante 10 minutos; imersão a 4 °C. A reacção de PCR utilizou aproximadamente 0,5 ng de ADNc, 20 pmol de cada oligonucleótido e 1 μΐ de mistura de polimerase Advantage II (ClonTech). Aproximadamente 6 % do produto de PCR foram utilizados como molde numa nova reacção de PCR, como foi indicado anteriormente, com a excepção de que se utilizaram os oligonucleótidos ZC38,239 (SEQ ID NO: 108) e ZC38,238 (SEQ ID NO: 110). Esta reacção de PCR realizou-se como é indicado a seguir: 30 ciclos a 94 °C durante 45 segundos, 65 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 1 minuto, e depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 10 °C. A maior parte da reacção de PCR foi carregada num gel de agarose a 1,0 % e excisou-se a banda predominante a aproximadamente 360 pb, 268 eluiu-se o fragmento de ADN e realizou-se o sequenciamento de ADN. A sequência do polinucleótido zcytorl7 de ratinho é mostrada na SEQ ID NO: 111 e a sequência de aminoácidos correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 112. Além disso, é mostrada uma forma solúvel truncada do polinucleótido zcytorl7 de ratinho na SEQ ID NO: 113 e a sequência de aminoácidos correspondente é mostrada na SEQ ID NO: 114.

Para obter um ADNc de OSMRbeta de ratinho de comprimento completo, isolaram-se produtos de PCR 5' e 3' e ligaram-se utilizando um local BamHI interno. Os iniciadores de PCR foram desenhados utilizando a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 119 e incluem locais de restrição EcoRI e Xbal para a clonagem. A sequência de ácido nucleico de OSMRbeta de ratinho genómica é mostrada na SEQ ID NO: 119, na qual a sequência codificante inclui os resíduos 780 a 3692 que codificam um polipéptido de 970 aminoácidos OSMRbeta de ratinho, que é mostrado na SEQ ID NO: 120. Na SEQ ID NO: 121 é mostrada uma sequência de ácido nucleico degenerada que codifica o polipéptido da SEQ ID NO: 120.

Gerou-se um produto de PCR 5' utilizando uma biblioteca de ADNc de 3T3-L1 (adipócito de ratinho diferenciado) interna como molde e os oligonucleótidos ZC41,764 (SEQ ID NO: 115) e ZC41,598 (SEQ ID NO: 116) como iniciadores. Esta reacção de PCR 5' realizou-se como é indicado a seguir: 30 ciclos a 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 1 minuto e 30 segundos, e depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 4 °C. A reacção de PCR utilizou aproximadamente 3 μρ de plasmídeo preparado a partir da biblioteca de ADNc, 20 pmol de cada oligonucleótido e cinco unidades de ADN polimerase de Pwo (Roche). Aproximadamente 90 % do produto de PCR 5' foram dirigidos com EcoRI e BamHI e purificados num gel de 269 agarose a 1,0 %. A banda de aproximadamente 1446 pb foi excisada e utilizada para o ligamento (veja-se a seguir).

Gerou-se um produto de PCR 3' utilizando uma biblioteca de ADNc interna de placenta de ratinho como molde e os oligonucleótidos ZC41, 948 (SEQ ID NO: 117) e ZC41,766 (SEQ ID NO: 118) como iniciadores. Esta reacção de PCR 3' realizou-se como é indicado a seguir: 30 ciclos a 95 °C durante 45 segundos, 55 °C durante 45 segundos, 72 °C durante 1 minuto e 30 segundos, e depois 72 °C durante 7 minutos; imersão a 4 °C. A reacção de PCR utilizou aproximadamente 3 μg de plasmideo preparado a partir da biblioteca de ADNc, 20 pmol de cada oligonucleótido e cinco unidades de ADN polimerase de Pwo (Roche). Aproximadamente 90 % do produto de PCR 3' foram dirigidos com BamHI e Xbal e purificados num gel de agarose a 1,0 %. A banda de aproximadamente 2200 pb foi excisada e utilizada para o ligamento junto com o produto de PCR 5' (descrito anteriormente) ao vector de expressão pZP-5Z digerido com EcoRI e Xbal. O ligamento de três partes realizou-se com o fragmento EcoRI a BamHI 5' anterior, o fragmento BamHI a Xbal 3' e o vector de expressão pZP-5Z digerido com EcoRI e Xbal. Isto gerou um plasmideo pZP-5Z que continha um ADNc de comprimento completo para OSMRbeta de ratinho (nucleótidos 780 a 3692 da SEQ ID NO: 119), denominado pZP-5Z/OSMRbeta. O ADNc de OSMRbeta de ratinho de comprimento completo em pZP5Z/OSMRbeta tem duas inserções de aminoácidos da SEQ ID NO: 120. Há uma duplicação do aminoácido glicina na posição 370 e uma duplicação do aminoácido ácido Glutámico na posição 526. O plasmideo pZP-5Z é um vector de expressão de mamifero que contém uma cassete de expressão que tem o promotor de CMV, múltiplos locais de restrição para a inserção de sequências codificantes e um terminador de hormona de crescimento humana. O plasmideo também tem uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de marcador de selecção 270 de mamífero que tem um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene de resistência a zeocina e o terminador de SV40.

Os transformantes resultantes foram sequenciados para confirmar a sequência de ADNc de OSMRbeta de ratinho. B. Construção das linhas celulares BaF3/KZ134/zcytorl7m,

BaF3/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam,_BHK/KZ13 4/zcytorl7m_e BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam

Transfectaram-se linhas celulares BaF3/KZ134 e BHK/KZ134 estáveis (Exemplo 20) com um plasmideo de expressão que codificava zcytorl7 de ratinho de comprimento completo, pZP-7P/zcytorl7m (Exemplo 38A), para criar células BaF3/KZ134/zcytorl7m e BHK/KZ134/zcytorl7m, respectivamente. O plasmideo de expressão de OSMRbeta de ratinho, pZP-5Z/OSMRbetam (Exemplo 38A), depois foi introduzido por transfecção nestas células para criar linhas celulares BaF3/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam e BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam, respectivamente. Os métodos foram como foi descrito no Exemplo 4 com a excepção de que Baf3/KZ134/zcytorl7m e BHK/KZ134/zcytorl7m foram seleccionados com, além de Geneticina, 2 ug/ml de puromicina enquanto que Baf3/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam e BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam foram seleccionados com, além de Geneticina, 2 ug/ml de puromicina e 200 ug/ml de zeocina.

Os clones foram diluídos, cultivados e seleccionados utilizando técnicas convencionais. Os clones foram rastreados por ensaio de luciferase (veja-se o Exemplo 20, anterior) utilizando o meio acondicionado de zcytorl71ig de ratinho ou proteína zcytorl71ig de ratinho purificada (Exemplo 35) como indutor. Seleccionaram-se clones com a máxima resposta de luciferase (por meio de luciferase STAT) e o menor nível de fundo. Seleccionaram-se linhas celulares transfectantes adequadas. 271 C. Zcytorl71iq de ratinho activa o receptor zcytorl7 de ratinho no ensaio de luciferase de BaF3/KZ134/zcytor!7m/OSMRbetam ou BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam

Inocularam-se em placas as linhas celulares para ensaios de luciferase como é descrito no Exemplo 20 anterior. A activação STAT das células

BaF3/KZl34/Zcytor17m, BaF3/KZ13/zcytorl7m/OSMRbetam, BHK/KZ134/zcytorl7m, ou BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam foi avaliada utilizando (1) meio acondicionado de células BHK570 transfectadas com zcytorl71ig humano (Exemplo 7), (2) meio acondicionado de células BHK570 transfectadas com o zcytorl71ig de ratinho (Exemplo 18), (3) zcytorl71ig de ratinho e humano purificado (Exemplo 35), e (4) meio sem mIL-3 para medir a resposta do controlo com meio somente. Os ensaios de luciferase realizaram-se como foi descrito no Exemplo 20.

Os resultados deste ensaio confirmam a resposta do indicador STAT das células BaF3/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam e BHK/KZ134/zcytorl7m/OSMRbetam ao zcytorl71ig de ratinho em comparação com as células BaF3/KZ134/zcytorl7m, as células BHK/KZ134/zcytorl7m ou as células de controlo BHK/KZ134 ou BaF3/KZ134 não transfectadas, e mostram que a resposta está mediada pelos receptores zcytorl7/OSMRbeta de ratinho. Os resultados também mostram que o zcytorl71ig humano não activa o ensaio de indicador STAT por meio do complexo do receptor de ratinho.

Exemplo 39

Ligação_de_zcytor 171iq_humano_a_zcytor!7_e zcytor17/OSMRbeta por citometria de fluxo A biotinilação de zcytorl7L humano realizou-se como é indicado a seguir: foram combinados 100 μΐ de zcytorl7 a 5,26 mg/ml com 30 μΐ de EZ-link Sulfo-NHS-LC-biotina a 10 mg/ml (Pierce, Rockford, IL) dissolvido em ddH20. Esta solução foi incubada num agitador durante 30 minutos a 272 temperatura ambiente. Depois da biotinilação, a solução foi dializada em PBS utilizando uma cassete de diálise Slide-A-Lyzer.

Para ensaiar as propriedades de ligação de zcytorl71ig humano a diferentes combinações de receptores, transfectaram-se células BHK e BAF3 com plasmideos de expressão utilizando técnicas convencionais bem conhecidas neste campo. Estes plasmideos foram introduzidos por transfecção nas duas linhas celulares nas seguintes combinações: zcytorl7 somente, OSMRbeta somente e tanto zcytorl7 como OSMRbeta. A transfecção realizou-se como foi detalhado anteriormente. Como controlos foram utilizadas células BHK e BAF3 não transf ectadas. As células foram coradas por FACS como é indicado a seguir: as células 2E5 foram coradas com: 2,0 μg/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1,0 ng/ml, 100 pg/ml, 10 pg/ml ou 1,0 pg/ml de zcytorl7L biotinilado ou foram deixadas sem corar durante 30 minutos em gelo em tampão FACS (PBS + BSA a 2 % + NHS a 2 % (Gemini) + NGS a 2 %). As células foram lavadas 1,5 vezes e depois foram coradas com SA-PE (Jackson Immuno Laboratories) a 1:250 durante 30 minutos em gelo. Depois, as células foram lavadas 1,5 vezes com tampão FACS e ressuspensas em tampão FACS e analisadas por FACS num BD FACSCaliber utilizando o software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA).

Tanto as células BHK como as células BAF3 mostraram que zcytorl71ig se ligava a zcytorl7 em separado e em combinação com OSMRbeta, sendo a ligação ao heterodimero zcytorl7/OSMRbeta ligeiramente mais forte. Não foi observada a ligação em linhas celulares que expressavam OSMRbeta somente. O zcytorl71ig ligou-se de uma maneira dependente da concentração. Os valores de intensidade fluorescente média (MFI) para a ligação a BHK são mostrados a seguir no Quadro 15. 273

Quadro 15 zcytorl7 μς/πιΐ 2,0 0, 10 0 0, 01 0 0, 00 1 0, 000 1 0, 000 01 0, 0000 01 O O BHK C17+OSMRbe ta 378 0 2126 328 53 17 15 14 13 BHK-C17 303 2 1600 244 39 16 15 14 15 BHK- OSMRbeta 13 X X X X X X 0 BHK-WT 15 14 13 X X X X 13 zcytorl7 μρ/πιΐ 10, 0 3,33 1, 11 0,37 0, 12 0, 04 0, 0 0 BAF3 Cl7+OSMRbeta 531 508 489 441 364 247 7 BAF3-C17 6 5 5 5 5 5 11 BAF3-WT 13 13 12 12 12 12 13 zcytorl7 ng/ml 100,0 10,0 1,0 0, 0 BAF3-C17 347 72 17 7

Exemplo 40

Análise de Matriz de Expressão Génica de Células Tratadas com Zcytorl71iq Humano

Isolou-se ARN a partir de células A549 tratadas com zcytorl71ig humano, células SK-LU-1 tratadas com zcytorl71ig e células de controlo não tratadas utilizando um kit RNeasy Midi (Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O perfil de expressão génica das células tratadas com zcytorl71ig e das células de controlo respectivas realizou-se utilizando matrizes de expressão de ADNc da série 274 GEArray Q (SuperArray Inc., Bethesda, MD) . As matrizes de expressão de ADNc da série Q contêm até 96 fragmentos de ADNc associados a uma via biológica especifica, ou genes com funções ou características estruturais similares. A comparação de matrizes de células tratadas e de controlo permite a determinação da regulação positiva e negativa de genes específicos. A marcação de sondas, a hibridação e a detecção realizaram-se de acordo com as instruções do fabricante. A detecção do sinal quimioluminescente e a adquisição de dados foram realizadas numa estação de trabalho Lumi-Imager (Roche, Indianápolis, IN). Os dados de imagens resultantes foram analisadas utilizando ImageQuant 5,2 (Amersham Biosciences, inc., Piscataway, NJ) e o software GEArray Analyzer 1,2 (SuperArray Inc., Bethesda, MD) . O análise dos resultados das matrizes HS-014N série Q de Receptor e Interleucina humana, mostrou, depois da normalização, um aumento de aproximadamente 4,7 vezes no sinal de IL13RA2 nas células SK-LU-1 humanas tratadas com zcytorl71ig e um aumento de aproximadamente 2,2 vezes do sinal de IL13RA2 nas células A549 humanas tratadas com zcytorl71ig.

Estes resultados indicam que zcytorl71ig regulava positivamente de uma forma significativa IL13RA2 nas células SK-LU-1 e A549. Estas duas linhas são linhas celulares estabelecidas derivadas de carcinomas de pulmão humano (Blobel et ai., Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol., 1984; 45(4): 407-29). Mais especificamente, A549 caracteriza-se como uma linha celular de epitélio pulmonar humano (Lin, et ai., J Pharm Pharmacol., Setembro de 2002; 54(9): 1271-8; Martínez et ai., Toxicol Sei., 2002 Out; 69(2): 409-23).

Demonstrou-se que a interleucina-13 (IL-13), uma citocina secretada por linfócitos T activados, é necessária e suficiente para a expressão da asma alérgica e para 275 utilização em modelos experimentais de asma, que incluem hiperresposta das vias respiratórias, recrutamento de eosinófilos e superprodução de muco (Wills-Karp et al., Science, 1998; 282: 2258-2261). mostrou-se que a neutralização selectiva da IL13 melhorará o fenótipo da asma (Grunig et al., Science, 1998; 282: 22bl-2263). Também foi notificado que a IL13 está implicada na regulação positiva da expressão do gene de mucina MUC8 em epitélio de pólipo nasal humano e epitélio nasal cultivado (Kimm et al. , Acta Otolaryngol., 2002; Set; 122(6): 638-643; Seong et ai., Acta Otolaryngol., 2002; Jun; 122(4): 401-407). MUC8, uma glicoproteina de mucina das vias respiratórias importante, está implicada na patogénese da hipersecreção de muco na sinusite crónica com pólipos (Seong et al., Acta Otolaryngol., 2002; Jun; 122(4): 401-407).

Funcionalmente, IL13 sinaliza através de um complexo de receptor que consiste na cadeia alfa-1 do receptor de interleucina-13 (IL13RA1) e o receptor alfa de IL-4 (IL4RA) (Daines e Hershey, J Biol Chem., 2002; 22(12): 10387-10393). Também foi mostrado que o receptor alfa-2 de interleucina-13 (IL13RA2) se liga a IL13 com alta afinidade, mas por si mesmo (Daines e Hershey, J Biol Chem., 2002; 22(12): 10387-10393). No entanto, este receptor não possui o domínio citoplasmático necessário para a sinalização e, portanto, é considerado um receptor engodo. Mostrou-se que IL13RA2 é predominantemente uma molécula intracelular que pode ser mobilizada rapidamente desde depósitos intracelulares e ser expressa na superfície depois do tratamento celular com interferão (IFN)-gama. A expressão na superfície de IL13RA2 depois do tratamento com IFN-gama não implica a síntese de proteínas e tem como resultado uma sinalização de IL13 diminuída (Daines e Hershey, J Biol Chem., 2002; 22(12): 10387-10393).

Os resultados do análise da matriz de expressão génica para zcytorl71ig indicam que a acção zcytorl71ig é nova com 276 respeito à do IFN-gama, uma vez que o tratamento com zcytorl71ig de linhas celulares derivadas de epitélio pulmonar teve como resultado um aumento significativo da expressão do gene de IL13RA2. Desta maneira, o tratamento com zcytorl71ig pode ser benéfico em casos nos quais se deseja a regulação positiva a longo prazo da expressão de IL13RA2 e a regulação negativa de IL13, tais como em casos de asma, hiperactividade das vias respiratórias (HVR) e regulação de mucina, incluindo sinusite crónica com pólipos.

Exemplo 41

Ratinho Transgénico para zcytorl71iq Murino

Para avaliar os efeitos in vivo da sobre-expressão de zcytorl71ig, geraram-se múltiplos criadores de ratinhos transgénicos que expressavam a forma murina do gene, dirigido por dois promotores diferentes: o promotor especifico de linfócitos Εμ/lck, e o promotor ubíquo EFla (Exemplo 22). Os níveis séricos de proteína variam de aproximadamente 200 a 300 ng/ml. O promotor Εμ/lck gerou ratinhos com maiores níveis de proteína em soro que aqueles observados nos ratinhos transgénicos com EFla-zcytorl71ig.

Os ratinhos transgénicos com zcytorl71ig desenvolveram um fenótipo de pele aproximadamente às 4-8 semanas de idade. O pelo dos ratinhos transgénicos "eriçava-se", mostrando uma piloerecção evidente e uma perda de pelo de leve a severa, normalmente nas suas costas, os lados do torso, e ao redor dos seus olhos. Este fenótipo encontrou-se sistematicamente em ratinhos com níveis detectáveis de proteína zcytorl71ig no seu soro. Entre os criadores, foi observado uma taxa de incidência de 100 % entre os ratinhos que expressavam o gene dirigido por Εμ/lck e uma incidência de 50 % nos ratinhos transgénicos EFla-zcytorl71ig, que se correlacionava bem com os níveis relativos de zcytorl71ig que se detectaram no seu soro. A pele transgénica parecia ter prurido, como é demonstrado pelo comportamento de 277 coçadela dos ratinhos, algumas vezes tão intenso que produzia escoriação e lesões na pele que normalmente se infectavam (com pelo menos Staphylococcus aureus). Os ratinhos foram identificados originalmente com etiquetas metálicas na orelha, mas na maioria dos casos, as etiquetas metálicas eram retiradas pela força pelos próprios ratinhos. Isto com frequência produziu lesões severas no ouvido externo. Estas orelhas feridas com frequência não se curavam apropriadamente, como é refletido pela presença de pústulas e crostas de longa duração, e uma ferida supurante em expansão que se desenvolveu em muitos dos animais, atrás e entre as suas orelhas. Alguns dos ratinhos transgénicos também desenvolveram feridas com crostas em seus ombros e pescoço. Observaram-se lesões cutâneas numa subsérie dos animais, que geralmente apareciam em áreas da pele nas quais uma perda de pelo já era aparente, e com frequência foram exacerbadas pelo comportamento de coçadela do ratinho.

Utilizou-se RT-PCR quantitativa em Tempo Real para detectar transcritos de ARN de zcytorl71ig em amostras de pele transgénicas (mas não não transgénicas), expressando a pele transgénica com Εμ/lck mais ARN de zcytorl71ig que a pele de ratinhos transgénicos EFla-zcytorl71ig. Os genes que codificavam as subunidades do receptor zcytorl7, zcytorl7 e OSM-Rbeta, foram expressos na pele de ratinhos não transgénicos e transgénicos para zcytorl71ig.

Um exame dos tecidos linfóides de uma subsérie de criadores transgénicos com Εμ/lck por citometria de fluxo revelou um aumento significativo na proporção de linfócitos T activados no baço e gânglios linfáticos destes ratinhos. Dois dos quatro ratinhos analisados tiveram gânglios linfáticos cervicais muito aumentados, possivelmente devido à presença de lesões nos seus pescoços. Foi observado um ligeiro aumento no peso do baço e um ligeiro aumento nos monócitos e neutrófilos circulantes no sangue dos ratinhos 278 transgénicos. Não houve aumento numa variedade de citocinas ensaiadas, nem houveram mudanças nos níveis de amilóide A em soro circulante nestes ratinhos. Os efeitos sobre as células imunes nos ratinhos transgénicos podem ser um resultado directo ou indirecto de zcytorl71ig, ou são efeitos secundários das lesões cutâneas.

Realizou-se histopatologia em muitos tecidos distintos de pele, incluindo fígado, timo, baço, rim e testículo, e não foram detectadas anormalidades significativas nestes órgãos. No entanto, a análise da pele transgénica revelou varias alterações que variavam em grande medida dependendo da fonte e localização da pele (por exemplo, normal, sem pelo ou lesionai). Em muitos casos, as orelhas dos ratinhos transgénicos tinham uma epiderme engrossada em comparação com os controlos não transgénicos (por exemplo, aproximadamente 4 camadas contra 2 camadas), e os tecidos subjacentes continham números de baixos a moderados de células inflamatórias, que eram principalmente mononucleares com neutrófilos ocasionais. A epiderme sobre o abdómen parecia multifocalmente ligeiramente mais grossa nos ratinhos transgénicos, mas não houve um aumento evidente de células inflamatórias na derme subjacente ou subcutis. Nas partes de pele sem pelo destes ratinhos havia folículos pilosos dilatados que continham alguns resíduos mas não talos pilosos (por exemplo, os pelos caíam-se pela raiz). Nas áreas lesionadas havia um engrossamento severo da epiderme (acantose), aumento de queratina na superfície da pele (hiperqueratose), úlceras espalhadas de tamanho variável e números significativos de células inflamatórias na derme (principalmente neutrófilos, com números variáveis de macrófagos e linfócitos). A derme também continha numerosos mastócitos que bordeavam as lesões. Alguns dos talos pilosos das áreas lesionadas da pele transgénica estavam em fase activa (anágena) , a diferença de muitos dos 279 talos pilosos em áreas "normais" que estavam na fase de involução (catágena) ou inactiva (telógena). 0 fenótipo do ratinho transgénico com zcytorl71ig parece-se muito ao de pacientes com dermatite atópica (DA) e de modelos de ratinho de DA. A DA é uma doença inflamatória crónica comum que se caracteriza por citocinas hiperactivadas da subsérie de linfócitos T auxiliares 2 (Th2). Zcytorl71ig é expresso preferentemente por células Th2 contra Thl, o qual dá mais credibilidade a esta comparação. Embora se desconheça a etiologia exacta da DA, estão envolvidos múltiplos factores incluindo respostas imunes Th2 hiperactivas, autoimunidade, infecção, alérgenos e predisposição genética. Os factores clave da doença incluem xerose (secura da pele), prurido (coceira da pele), conjuntivite, lesões cutâneas inflamatórias, infecção por Staphylococcus aureus, elevação de eosinofilia em sangue, elevação dos níveis séricos de IgE e IgGl e dermatite crónica com infiltração de linfócitos T, mastócitos, macrófagos e eosinófilos. Reconheceu-se que a colonização ou infecção com S. aureus exacerba a DA e perpetua a cronicidade desta doença cutânea. A DA encontra-se com frequência em pacientes com asma e rinite alérgica, e frequentemente é a manifestação inicial da doença alérgica. Aproximadamente 20 % da população nos países ocidentais sofre destas doenças alérgicas, e a incidência de DA em países desenvolvidos está aumentando por razões desconhecidas. A DA tipicamente começa na infância e com frequência pode persistir até a adolescência até a fase adulta. Os tratamentos actuais para a DA incluem corticosteróides tópicos, ciclosporina A oral, imunosupressores não corticosteróides tais como tacrolimus (FK506 em forma de pomada) e interferão gama. A pesar da variedade de tratamentos para a DA, muitos sintomas do paciente não melhoram ou têm reacções adversas às 280 medicações, necesitando a pesquisa de outros agentes terapêuticos mais eficazes.

As células epiteliais que expressam o receptor heterodimérico para zcytorl71ig (zcytorR17 e OSM-Rbeta) estão localizadas em locais (por exemplo, pele, intestino, pulmão, etc.) de entrada do alérgeno no corpo e interagem intimamente com as células dendriticas (células apresentadoras de antigénio profissionais) in situ. As células dendriticas desempenham um papel importante na patogénese das doenças alérgicas, e zcytorl71ig pode interagir com o seu receptor sobre células epiteliais na pele e pulmão e influir sobre respostas imunes nestes órgãos. Portanto, zcytorl71ig e seus receptores podem contribuir à patogénese de doenças alérgicas tais como AD e asma. Além disso, o fenótipo do ratinho transgénico zcytorl71ig sugere que este ligando pode desempenhar um papel na cura de feridas, uma vez que os ratinhos parecem incapazes de reparar as lesões nas suas orelhas, e com frequência têm lesões de longa duração nas suas costas e laterais, portanto, um antagonista de zcytorl71ig poderia representar uma terapêutica viável para estas e outras indicações.

Exemplo 42

Ensaio de Luciferase em Linhas de Células Epiteliais Transformadas Humanas por meio de Infecção Transitória com Gene Indicador STAT/SER Adenoviral

Semeou-se uma ampla variedade de linhas de células epiteliais transformadas humanas (veja-se o Quadro 16 mostrado a seguir) em placas de 96 poços de fundo plano a 10.000 células/poço em meio de crescimento regular como é especificado para cada tipo celular. No dia seguinte, as células foram infectadas com uma construção indicadora de adenovírus, KZ136, a uma multiplicidade de infecção de 5000. O indicador KZ136 contém os elementos STAT além de um elemento de resposta sérico. O volume total foi de 100 281 ul/poço utilizando DMEM suplementado com L-glutamina 2 mM (GibcoBRL) , Piruvato de Sódio 1 mM (GibcoBRL) e suplemento de Insulina-Transferrina-Selénio lx (GibcoBRL (denominado a seguir no presente documento meio sem soro). As células foram cultivadas durante a noite.

Ao dia seguinte retirou-se o meio e substituiu-se por 100 μΐ de meio de indução. O meio de indução era zcytorl71ig humano diluido em meio sem soro a 100 ng/ml, 50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml, 3,125 ng/ml e 1,56 ng/ml. Utilizou-se um controlo positivo de FBS a 20 % para validar o ensaio e para assegurar que a infecção pelo adenovirus era satisfatória. As células induziram-se durante 5 horas, depois do cual se aspirou o meio. As células depois foram lavadas em 50 μΐ/poço de PBS e pósteriormente lisadas em 30 μΐ/poço de tampão de lise de células IX (Promega). Depois de uma incubação de 10 minutos a temperatura ambiente, transferiram-se 25 μΐ/poço de lisado a placas brancas opacas de 96 poços. As placas depois foram lidas no Luminómetro utilizando uma integração de 5 segundos com a injecção 40 μΐ/poço de substrato de luciferase (Promega).

Os resultados revelaram a capacidade de múltiplas linhas de células epiteliais de responder a zcytorl71ig como é mostrado no Quadro 16 apresentado a seguir.

Quadro 16

Linha Celular Espécie Tecido Morfologia Doença Indução em vezes A54 9 Humana Pulmão Epitelial Carcinoma 2x Sk-Lu-1 Humana Pulmão Epitelial Adenocarcinoma 6x WI-38 Humana Pulmão Fibroblasto Negativo embrionário MRC-5 Humana Pulmão Fibroblasto Negativo DU 145 Humana Próstata Epitelial Carcinoma lOx PZ-HPV-7 Humana Próstata Epitelial Transformado 5x

com VHP 282

Linha Celular Espécie Tecido Morfologia Doença Indução em vezes PC-3 Humana Próstata Epitelial Adenocarcinoma Negativo U20S Humana Osso Epitelial Osteossarcoma 15,5x SaOS2 Humana Osso Epitelial Osteossarcoma 22x MG-6 3 Humana Osso Fibroblasto Osteossarcoma Negativo 143B Humana Osso Fibroblasto Osteossarcoma 3, 5x HOS Humana Osso Fibroblasto e Epitelial 8x TRBMeC Humana Osso, Medula óssea Epitelial 2x HT144 Humana Pele Fibroblasto Melanoma 5x C32 Humana Pele Melanoma Negativo Sk-Mel-2 Humana Pele Poligonal Melanoma 2, 7x WM-115 Humana Pele Epitelial Melanoma 2x HCT-116 Humana Cólon Epitelial Carcinoma Negativo HT-29 Humana Cólon Epitelial Carcinoma Negativo CaCo2 Humana Cólon Epitelial Adenocarcinoma 3x HBL-100 Humana Mama Epitelial 1, 5x ME-180 Humana Colo do útero Epitelial Carcinoma Negativo HeLa 299 Humana Colo do útero Epitelial Adenocarcinoma Negativo SK-N-SH Humana Cérebro Epitelial Neuroblastoma Negativo U13 8 MG Humana Cérebro Poligonal Glioblastoma Negativo HepG2 Humana Fígado Epitelial Carcinoma Negativo Fígado Chang Humana Fígado Epitelial Negativo Sk-Hep-1 Humana Fígado Epitelial Adenocarcinoma 4x Int 407 3a-Sub-E Humana Humana Intestino Placenta Epitelial Negativo Negativo

Exemplo 43 283

Produção de citocinas por linhas de células epiteliais humanas cultivadas com zcytorl71iq humano

Rastrearam-se linhas de células epiteliais com patologias humanas (A549, carcinoma de epitélio pulmonar humano; SkLul, adenocarcinoma de epitélio pulmonar humano; DU145, carcinoma epitelial de próstata humano; PZ-HPV-7, HPV epitelial de próstata humana transformada; U20S, osteossarcoma epitelial de osso humano) com respeito à produção de citocinas em resposta a zcytorl71ig in vitro. Estas linhas celulares têm zcytorl7 e OSMR-beta, identificados por RT-PCR, e respondem a zcytorl71ig humano quando se ensaiam com a construção indicadora de luciferase adenoviral KZ136 (Exemplo 42). A produção de citocinas por estas linhas celulares foi determinada em resposta a zcytorl71ig humano numa série de três experimentos. A. Produção de citocinas por linhas de células epiteliais com patologias humanas cultivadas com zcytorl71iq humano

As células foram cultivadas a uma densidade de 4,5 x 105 células por poço numa placa de 6 poços (Costar) e foram cultivadas em meio de crescimento respectivo. As células foram cultivadas com reagentes de ensaio: 100 ng/ml de zcytorl71ig, 10 ng/ml de Interferão gama (IFN gama) (R&D Systems, Mineápolis, MN), 10 ng/ml de Factor de Necrose Tumoral alfa (TNF alfa) (R&D Systems, Mineápolis, MN) , 10 ng/ml de IL-lbeta (R&D Systems, Mineápolis, MN) ou 100 ug/ml de Lipopolissacárido (LPS) (Sigma). Colheram-se os sobrenadantes às 24 e 48 horas e ensaiaram-se com respeito às citocinas; GM-CSF (Factor Estimulador de Colónias de Granulócitos-Macrófagos), IL-lb, IL-6, IL-8, MCP-1 (Proteína-1 Quimioatractivo de Macrófagos) e TNFa. Utilizaram-se kits Multiplex Antibody Bead de BioSource International (Camarillo, CA) para medir as citocinas nas amostras. Os ensaios foram lidos num instrumento Luminex-100 (Luminex, Austin, TX) e os dados analisados utilizando um software MasterPlex (MiraiBio, Alameda, CA) . A produção 284 de citocinas (pg/ml) para cada linha celular nas amostras de 24 horas é mostrada a seguir no Quadro 17.

Quadro 17 GM-CSF pg/ml A5 4 9 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 18,80 10,26 16,19 13,26 14,10 IFN-g 16, 19 13,36 11,56 16,26 11,81 IL-lb 104,60 126,44 76,77 338,25 27,32 TNFa 106,67 33,20 58,50 107,09 33,79 LPS 1764 10,62 11,81 25, 47 18,34 controlo 14,81 8,56 13,26 21,67 13,96 IL-lb pg/ml A5 4 9 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 26,90 30,17 28,77 29, 07 28,00 IFN-g 29, 07 35, 33 21, 96 26, 90 26, 73 IL-lb 1332, 88 1256, 17 979, 02 1107, 35 998, 60 TNFa 31, 11 33, 28 35, 33 31, 24 2 5,66 LPS 33, 28 28, 77 29, 07 31, 11 31,24 controlo 28, 77 28, 77 26,73 31,24 29,07 IL—6 pg/ml A54 9 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 20,09 26,89 193,05 19,37 17,30 IFN-g 17,52 33,64 217,58 27, 02 17,63 IL-lb 175,44 5920,19 2375,29 304,08 18,44 TNFa 354,16 1002,51 1612,17 103,58 18,33 LPS 18,06 35,65 162,18 22, 42 17,30 controlo 17,63 27, 80 71,23 19,32 17,19 IL—8 pg/ml 285 A5 4 9 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 86,33 150,81 150,61 45, 92 6,81 IFN-g 24,07 72, 82 163,31 81, 78 1,35 IL-lb 1726,24 4083,12 4407,79 5308,83 124,17 TNFa 3068,68 3811,75 2539,39 3324,02 6 9,65 LPS 20,28 167,13 230,39 115,08 7, 95 controlo 14, 92 109,78 107,27 93, 44 9,49 MCP-1 pg/ml A54 9 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 8, 97 187,29 26,84 105,15 7,20 IFN-g 7,30 267,99 17,05 88,68 7, 71 IL-lb 8, 11 8039,84 88,78 3723,81 4, 70 TNFa 8,50 7100,37 153,26 3826,80 2,80 LPS 9, 40 185,83 22,65 61,62 5,61 controlo 8, 16 167,93 13,68 47, 78 5,61 TNFa pg/ml A5 4 9 SkLul DU145 U20S PZ-HPV-7 zcytorl7L 16,23 17,52 16,67 15, 80 17,09 IFN-g 15, 80 17, 09 15,80 16,65 15,80 IL-lb 16,66 17, 09 15,80 17,95 16,23 TNFa 1639,92 1648,83 2975,07 1348,33 3554,82 LPS 16,87 15, 80 15,37 17, 09 17,52 controlo 16,23 15, 80 15,80 17, 09 16,66

Todas as linhas celulares ensaiadas produziram GM-CSF e IL-8 em resposta à estimulação com as citocinas de controlo IL-lb e TNFa. A maioria das linhas celulares produziu IL-6 e MCP-1 em resposta à estimulação com IL-lb e TNFa. Zcytorl71ig estimulou a produção de IL-6 na linha celular DU145 em comparação com o controlo (193 pg/ml 286 contra 71 pg/ml). Zcytorl71ig estimulou 3 de 5 linhas celulares para produzir IL-8, sendo observado o maior efeito em células A549 (5 vezes), e reduziu a produção de IL-8 em células U20S 2 vezes. Houve um ligeiro efeito sobre a produção de MCP-1 por células DU145 e U20S quando foram cultivadas com zcytorl71ig. B. Produção de citocinas por linhas de células epiteliais humanas normais cultivadas com zcytorl71ig humano

Além das linhas de células epiteliais humanas, também se ensaiaram células de epitélio bronquial humano normal (NHBE, Clonetics). As células foram cultivadas a uma densidade de 1 x 105 células por poço numa placa de 24 poços e foram cultivadas com reagentes de ensaio; 1000 ng/ml, 100 ng/ml e 10 ng/ml de zcytorl71ig (A760F), 10 ng/ml de TNFa, 10 ng/ml de OSM, 10 ng/ml de IFNa, 10 ng/ml de TGFb ou 10 ng/ml de linfotactina. Colheram-se os sobrenadantes às 24 e 48 horas e ensaiaram-se com respeito às citocinas; IL-6, IL-8, MCP-1, ΜΙΡ-a, RANTES e Eotaxina. As citocinas ensaiaram-se como foi descrito previamente. A produção de citocinas (pg/ml) para cada linha celular nas amostras de 48 horas é mostrada a seguir no Quadro 18.

Quadro 18 IL-6 pg/ml A549 DU145 SkLul U20S NHBE rl7L 1000 24,5 56,3 32,1 25, 2 64, 5 ng/ml rl7L 100 25, 0 65, 0 31,0 25, 4 50,2 ng/ml rl7L 10 24, 8 51,8 30,2 25,3 54,3 ng/ml TNFa 272, 9 355, 4 437, 5 36,1 299,3 OSM 26,4 73,5 112, 4 25, 6 80,4 IFNa 24,6 109, 3 33,7 26,4 52,4 TGFa 24, 4 102, 6 42,7 27, 8 268,9 controlo 24,5 36,3 29,9 25, 2 47, 9 287 IL —8 pg/ml A549 DU145 SkLul U20S NHBE r 17L 1000 35,0 243,3 45,6 18,6 402,0 ng/ml r 17L 100 31,0 290, 7 40,1 21,3 296,0 ng/ml r 17L 10 30,4 240, 4 33,4 18, 9 361,8 ng/ml TNFa 2809,3 2520,9 1385,2 2784,9 1486,3 OSM 37,8 60,6 68,0 22,5 494,6 IFNa 18,9 315, 3 39,5 33,1 231,6 TGFa 9, 9 77,5 19,6 88,9 246,9 controlo 10,9 238, 0 38,0 39,7 315, 8 MCP-1 pg/ml A5 49 DU145 SkLul U20S NHBE r 17L 1000 nd nd 149, 1 81, 0 nd ng/ml r 17L 100 nd nd 130,6 81, 9 nd ng/ml r 17L 10 nd nd 111,7 49, 1 nd ng/ml TNFa nd 22,1 2862,6 1104,7 nd OSM nd 17,2 448,2 85, 8 nd IFNa nd nd 131, 7 10,5 nd TGFa nd 1,7 54,5 27,6 nd controlo nd nd 113, 0 1, 7 nd nd = não detectado

As células DU145 produziram IL-6 em resposta a zcytorl71ig, repetindo os resultados anteriores no Exemplo 288 43Α. No entanto, somente A549 e U20S tiveram respostas de IL-8 similares às observadas no Exemplo 43A. Tanto as células SkLul como as células U20S produziram MCP-1 em resposta a zcytorl71ig. A produção de citocinas por células NHBE foi marginal em comparação com os controlos. C. Produção de citocinas por linhas de células epiteliais com patologias humanas co-cultivadas com zcytorl71ig humano e IFN gama

As células foram cultivadas a uma densidade de 2 x 105 por poço numa placa de 24 poços e foram co-cultivadas com 10 ng/ml de IFN gama + /- zcytorl71ig a 100 ng/ml, 10 ng/ml ou 1 ng/ml. Os sobrenadantes colheram-se às 24 e 48 horas e ensaiaram-se com respeito a IL-8 e MCP-1 como foi descrito anteriormente. A produção de citocinas (pg/ml) para cada linha celular nas amostras de 24 horas é mostrada a seguir no Quadro 19.

Quadro 19

IL-8 MCP-1 pg/ml pg/ml 10 ng/ml IFNg+100 ng/ml A549 rl7L 86, 7 nd 10 ng/ml 75, 1 nd IFNg+10 ng/ml rl7L 10 ng/ml 63,6 nd IFNg+1 n g/ml rl7L 10 ng/ml IFNg 35, 4 nd controlo 36,6 nd 10 ng/ml IFNg+100 ng/ml DU145 rl7L 102,3 nd 10 ng/ml 92,9 nd IFNg+10 ng/ml rl7L 289 10 ng/ml 79, 9 nd IFNg+1 n g/ml rl7L 10 ng/ml IFNg 70,7 nd controlo 79,4 nd 10 ng/ml IFNg+100 ng/ml SkLul rl7L 152,2 604, 9 10 ng/ml 194, 4 870,7 IFNg+10 ng/ml r 17L 10 ng/ml 138,7 585, 4 IFNg+1 n g/ml rl7L 10 ng/ml IFNg 652,6 controlo 203,0 292,3 10 ng/ml IFNg+100 ng/ml U20S r 17L 106,8 357, 0 10 ng/ml 198,2 347, 7 IFNg+10 ng/ml r 17L 10 ng/ml 109,9 293,3 IFNg+1 n g/ml rl7L 10 ng/ml IFNg 118,8 159,8 controlo 146,8 7,0

As células A549 produziram IL-8 em resposta a zcytorl71ig, no entanto não houve nenhum efeito da co-cultura das células com a adição de IFN gama. As células U20S produziram 20 vezes mais MCP-1 quando foram cultivadas com IFNg e 50 vezes mais MCP-1 quando foram cultivadas com IFN gama + zcytorl71ig.

Exemplo 44

Zcytorl71iq Afecta à Incorporação de 3H-TdR em Células de Carcinoma Epitelial de Próstata DU145 290

Semearam-se as células em grupos de tecidos de 96 poços (Falcon) a uma densidade de 25.000/poço em meio de crescimento MEM (Life Technologies) suplementado com glutamina, piruvato, aminoácidos não essenciais (Life Technologies) e soro bovino fetal a 10 % (Hyclone). Quando se alcançou a confluência (24 horas depois), as células foram mudadas a um meio de detenção do crescimento por meio da substituição do soro por BSA a 0,1 % (Life Technologies). Depois de 48 horas para conseguir a sincronização celular, o meio de detenção do crescimento foi substituído por meio novo. Depois, adicionou-se zcytorlílig recombinante humano (reagente de ensaio) a diversas concentrações (de 0,24 a 60 ng/ml) (veja-se o Quadro 16 mostrado a seguir) para ensaiar o efeito da proteína sobre a replicação do ADN basal. Alguns poços receberam FBS a 2,5 % (Hyclone) além de zcytorl71ig, para ensaiar o efeito da proteína sobre os níveis elevados da incorporação de TdR. Como controlos positivos foram utilizados FBS a 10 % e 20 ng/ml de Factor-BB de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF-BB) (R&D) .

Dezoito horas depois da adição de zcytorlílig e o resíduo dos reagentes de ensaio, as células foram submetidas a pulsos com 250 nCi/ml de [3H]-timidina (NEN) durante 4 horas. Depois do pulso de 4 horas, descartou-se o meio e adicionaram-se 100 μΐ de solução de tripsina (Life Technologies) a cada poço para separar as células. A radiactividade incorporada por DU145 foi determinada por meio da colheita das células com um colheitador de células Packard Filtermate 196 e por meio da contagem do marcador incorporado utilizando um contador de cintilação de microplacas Packard TopCount NXT.

Como pode ser visto no Quadro 20 mostrado a seguir, zcytorlílig induziu a incorporação de timidina nas células aquiescentes (em BSA a 0,1 %) de uma maneira dependente da concentração. Este efeito alcançou 2,5 vezes o do controlo 291 com BSA à maior concentração utilizada, 60 ng/ml. Além disso, este efeito de zcytorl71ig também foi detectável quando a incorporação basal se elevou pela adição de FBS a 2,5 % (nesta série um mitogénio tão potente como FBS a 10 %). Estes resultados, portanto, indicam que tanto nas condições basais como nas condições estimuladas, zcytorl71ig pode actuar como factor mitogénico para as células de carcinoma DU145. O Quadro 16 mostra os efeitos de zcytorl71ig sobre a incorporação de timidina por células DU145. Os resultados são expressos em cpm/poço e os números são a média ± desvio típico de poços por triplicado.

Quadro 20 BSA a 0,1% FBS a 1,5% Zcytorl71ig (0,24 ng/ml) 1139 ± 336 4228 ± 600 Zcytorl71ig (0,24 ng/ml) 1430 ± 136 4894 ± 1037 Zcytorl71ig (0,74 ng/ml) 1657 ± 32 5038 ± 810 Zcytorl71ig (2,22 ng/ml) 1646 ± 57 5162 ± 808 Zcytorl71ig (6,67 ng/ml) 2226 ± 189 6385 ± 1613 Zcytorl71ig (20 ng/ml) 2168 ± 108 5880 ± 1085 Zcytorl71ig (60 ng/ml) 2512 ± 111 6165 ±417 PDGF-BB (20 ng/ml) 4090 ± 202 5927 ± 360

Exemplo 45 292

Expressão de huzcytorl71iq em E. coli

A. Construção de vector de expressão pRPSOl que expressa o polipéptido de fusão huzcytorl7Liq/MBP-6H

Construiu-se um plasmídeo de expressão que continha um polinucleótido que codificava huzcytorl71ig fusionado pela extremidade C-terminal a Proteina de Ligação a Maltose (MBP) por meio de recombinação homóloga. 0 polipéptido de fusão contém uma parte de MBP de aproximadamente 388 aminoácidos N-terminal fusionada ao huzcytorl7Lig descrito no presente documento. Foi isolado um fragmento de ADNc de huzcytorl71ig utilizando o método de PCR como foi descrito no presente documento. Utilizaram-se dois iniciadores na produção do fragmento de zcytorl71ig numa reacção de PCR convencional: (1) um que contém 40 pb da sequência flanqueante do vector e 20 pb correspondentes à extremidade amino de huzcytorl71ig, e (2) outro que contém 40 pb da extremidade 3' correspondente à sequência flanqueante do vector e 20 pb correspondentes à extremidade carboxilo de huzcytorl71ig. Dois microlitros dos 100 μΐ de reacção de PCR foram processados num gel de agarose a 1,0 % com tampão TBE 1 x para a análise, e foi observado o fragmento do peso molecular esperado. O resíduo da reacção de PCR foi combinado com o segundo tubo de PCR e precipitado com 400 μΐ de etanol absoluto. O ADN precipitado utilizou-se para recombinação no vector receptor pTAP98 cortado com Smal para produzir a construção que codificava a fusão MBP-huzcytorl71ig, como é descrito a seguir. O vector pTAP98 foi construído utilizando recombinação homóloga de levedura. Cem nanogramas de pMAL-c2 cortado com EcoR foram recombinados com 1 μg de pRS316 cortado com Pvul, 1 μg de linker e 1 μg de pRS316 cortado com Scal/EcoRl numa reacção de PCR. Os produtos de PCR foram concentrados por meio de precipitação com etanol a 100 %. A estirpe de células de levedura competente (S. cerevisiae), SF838-9DOC, foi combinada com 10 μΐ de uma mistura que 293 continha aproximadamente 1 μg do produto de PCR huzcytorl71ig (anterior) e 100 ng do vector pTAP98 digerido com Smal, e submetida a electroporação a 0,75 kV, 25 μΡ e °o ohms. A mistura de reacção resultante foi inoculada em placa em placas URA-D e incubada a 30 °C.

Depois de 48 horas, colheram-se os transformantes de levedura Ura+ de uma única placa. Foi isolado o ADN e foi utilizado para transformar células E. coli electrocompetentes (por exemplo, MC1061, Casadaban et al. J. Mol. Biol. 138, 179-207). As células E. coli resultantes foram cultivadas em placas MM/CA + AMP a 100 mg/1 (Pryor e Leiting, Protein Expression and Purification 10: 309-319, 1997) utilizando métodos convencionais. Colheram-se quatro clones individuais a partir das placas e inocularam-se em MM/CA com 100 μg/ml de Ampicilina durante duas horas a 37 °C. Um mililitro de cada cultura foi induzido com IPTG 1 mM. Aproximadamente 2-4 horas depois, 250 μΐ de cada cultura induzido foram misturados com 250 μΐ de pérolas de vidro lavadas com ácido e 250 μΐ de tampão Thorner com βΜΕ a 5 % e colorante (ureia 8 M, Tris 100 mM pH 7,0, glicerol a 10 %, EDTA 2 mM, SDS a 5 %). As amostras foram submetidas a vórtex durante um minuto e aquecidas a 65 °C durante 10 minutos. Carregaram-se vinte microlitros de cada amostra por pista num gel PAGE de 4 %-12 % (NOVEX) . Os géis foram processados em tampão MES IX. Os clones positivos foram denominados pRPSOl e foram submetidos a análise de sequências.

Utilizou-se um microlitro de ADN de sequenciamento para transformar a estirpe de células E. coli electrocompetentes MC1061. As células foram submetidas a electropulsos a 2,0 kV, 25 μΕ e 400 ohms. Depois da electroporação, as células foram resgatadas em 0,6 ml de SOC e foram cultivadas em placas LB+Amp a 37 °C durante a noite, com 100 mg/1 de Ampicilina. Induziram-se quatro culturas com ITPG e rastrearam-se com respeito aos 294 positivos como foi descrito anteriormente. Os clones positivos foram expandidos para a purificação de proteínas da proteína de fusão huzcytorl71ig/MBP-6H utilizando técnicas convencionais. B. Purificação de huzcytorl7Liq/MBP-6H a partir de fermentação de E. coli A menos que se indique de outro modo, todas as operações realizaram-se a 4 °C. O seguinte método foi utilizado para purificar o polipéptido huzcytorl7Lig/MBP-6H recombinante. Construiram-se células E. coli que continham a construção pRPSOl e expressavam huzcytorl7Lig/MBP-6H utilizando métodos convencionais de biologia molecular e foram cultivadas em 50,0 g/1 de SuperBroth II (12 g/1 de Caseína, 24 g/1 de Extracto de levedura, 11,4 g/1 de fosfato de dipotássio, 1,7 g/1 de fosfato de monopotássio; Becton Dickinson, Cockeysville, MD) , 5 g/1 de glicerol e 5 ml/1 de Sulfato de Magnésio 1 M. Colheram-se vinte gramas de células e congelaram-se para a purificação de proteínas.

As células descongeladas ressuspensas em 500 ml de tampão de Equilíbrio de Amilose (Tris 20 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0). Para lisar as células utilizou-se um sistema de ruptura de células de Prensa French (Constant Systems Ltd., Warwick, RU) estabelecendo uma temperatura de -7 °C a -10 °C e foram utilizados 30K PSI para lisar as células. As células ressuspensas ensaiaram-se com respeito à ruptura por leituras de Açoo antes e depois dos ciclos através da Prensa French. A suspensão celular processada foi sedimentada a 10.000 G durante 30 minutos para retirar os detritos celulares e o sobrenadante foi colhido para a purificação de proteínas.

Deitou-se uma coluna de 25 ml de resina de Amilose (New England Biolabs, Beverly, MA) (preparada como é descrito a seguir) numa coluna de vidro H Bio-Rad, de 2,5 cm de diâmetro x 10 cm de altura. A coluna foi preenchida e equilibrada por gravidade com 10 volumes de coluna (VC) de 295 tampão de equilíbrio de Amilose. 0 sobrenadante celular processado foi carregado por lotes na resina de Amilose, durante a noite com agitação. A resina foi devolvida à coluna Bio-Rad e lavada com 10 VC de tampão de Equilíbrio de Amilose por gravidade. A coluna eluiu-se com ~2 VC de tampão de Eluição de Amilose (tampão de Equilíbrio de Amilose, Maltose 10 mM, Fluka Biochemical, Suiza) por gravidade. Colheram-se dez fracções de 5 ml ao longo do perfil de eluição e ensaiaram-se com respeito à absorvência a 280 e 320 nm. A resina de Amilose foi regenerada com 1 VC de H20 destilada, 5 VC de SDS a 0,1 % (p/v) (Sigma), 5 VC de H20 destilada, 5 VC de tampão de Equilíbrio de Amilose, e finalmente 1 VC de tampão de Armazenamento de Amilose (tampão de Equilíbrio de Amilose + Azida de Sódio a 0,02 %). A coluna regenerada foi armazenada a 4 °C.

Agruparam-se as fracções do perfil de eluição de interesse e dializaram-se numa câmara de diálise 10 K (Slide-A-Lyzer, Pierce Immunochemical) contra 4 x 4 1 de PBS pH 7,4 (Sigma) durante um período de tempo de 8 horas para retirar os contaminantes de baixo peso molecular, permuta de tampão e dessalinização. Depois da diálise, o material colhido representava o polipéptido huzcytorl7/MBP-6H purificado. O polipéptido huzcytorl7/MBP-6H purificado foi esterilizado por filtração e analisado por meio de coloração com Coomasie e SDS-PAGE para um produto com o peso molecular apropriado. A concentração do polipéptido huzcytor17/MBP-6H foi determinada por análise BCA e foi de 1,28 mg/ml.

Exemplo 46

Anticorpo Policlonal de zyctorl71iq Humano A. Preparação e Purificação

Prepararam-se anticorpos policlonais imunizando 2 coelhos brancos New Zealand fêmea com a proteína recombinante purificada huzcytorl7/MBP-6H (Exemplo 45). Cada coelho recebeu uma injecção intraperitoneal (IP) 296 inicial de 200 μg de proteína purificada em Adjuvante Completo de Freund seguido de injecções IP de reforço de 100 μg de proteína em Adjuvante Incompleto de Freund cada três semanas. De sete a dez dias depois da administração da segunda injecção de reforço (3 injecções em total), extraiu-se sangue dos animais e colheu-se o soro. Os animais depois foram submetidos a reforços e a extracções de sangue cada três semanas. O soro de coelho específico para huzcytorl7/MBP-6H foi pré-adsorvido de anticorpos anti-MBP utilizando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que foi preparada utilizando 10 mg de proteína de fusão-MBP recombinante purificada não específica por grama de CNBr-SEPHAROSE. Os anticorpos policlonais específicos para huzcytor17/ΜΒΡ-βΗ foram purificados por afinidade a partir do soro de coelho pré-adsorvido utilizando uma coluna de proteína CNBr-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) que foi preparada utilizando 10 mg da proteína recombinante purificada de antigénio específico huzcytorl7/MBP-6H. Depois da purificação, os anticorpos policlonais foram dialisados com 4 mudanças de 20 vezes o volume de anticorpo de PBS durante um período de tempo de pelo menos 8 horas. Os anticorpos específicos de ligando de hzcytorl7 foram caracterizados por ELISA utilizando 500 ng/ml das proteínas recombinantes purificadas hzcytorl7L/MBP-6H ou hzcytorl7L-CEE produzidas num sistema de expressão de baculovírus como alvos de anticorpo. O limite inferior de detecção (LID) do anticorpo de coelho anti-hzcytorl7L/MBP-6H purificado por afinidade foi 100 pg/ml sobre o seu antigénio recombinante purificado específico hzcytorl7L/MBP-6H e 500 pg/ml sobre hzcytor17L-CEE recombinante purificado produzido num sistema de expressão de baculovírus.

B. SDS-PAGE e análise de Western blotting de anticorpo de coelho anti-ZcytoR171ig humano MBP-6H 297

Ensaiou-se anticorpo de coelho anti-ZcytoR17 MBP-6H humano por SDS-PAGE (NuPage 4-12 %, Invitrogen, Carlsbad, CA) com o método de coloração com coomassie e Western blotting utilizando IgG de cabra anti-coelho-HRP. A proteína purificada (200-25 ng) zcytorl71ig de ratinho e humana foi submetida a electroporação utilizando uma mini-cell Xcell II de Novex de Invitrogen e transferida a nitrocelulose (0,2 mm; Invitrogen, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente utilizando o módulo de transferência Xcell de Novex com agitação de acordo com as instruções proporcionadas no manual do instrumento. A transferência realizou-se a 300 mA durante uma hora num tampão que continha base Tris 25 mM, glicina 200 mM, e metanol a 20 %. O filtro depois foi bloqueado com tampão A de Western (interno, Tris 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, pH 8,0, Igepal CA-630 a 0,05 %, NaCl 150 mM, e gelatina a 0,25 %) durante a noite com agitação suave a 4 °C. A nitrocelulose foi enxaguada rapidamente e depois adicionou-se o anticorpo de coelho anti-zcytoRl7 MBP-6H humano (1:1000) em tampão A de Western. A mancha de transferência foi incubada durante 1,5 horas a temperatura ambiente com agitação suave. A mancha de transferência foi enxaguada 3 vezes durante 5 minutos cada vez em Western A, e depois adicionou-se anticorpo de cabra anti-IgG de coelho-HRP (1:5000) em tampão A de Western A. A mancha de transferência foi incubada durante 1 hora a temperatura ambiente com agitação suave. A mancha de transferência foi enxaguada 3 vezes durante 5 minutos cada vez em Western A, e depois foi enxaguada rapidamente em H2O. A mancha de transferência se revelou utilizando reagentes de substratos quimioluminescentes disponíveis comercialmente (reagentes de detecção de transferência CLWestern 1 e 2 misturados 1:1; reagentes obtidos de Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Inglaterra) e a mancha de transferência foi exposta a uma película de raios X durante até 5 minutos. 298 0 zyctorl71ig humano purificado apareceu como uma banda grande a aproximadamente 30 kDa e uma banda mais pequena a aproximadamente 20 kDa em condições reduzidas. O zcytorl71ig de ratinho não foi detectado pelo anticorpo de coelho anti-zcytor171ig humano.

Exemplo 47

Efeitos de Zcytorl71iq sobre a Adesão de Monócitos U937 a uma Monocapa de Células Endoteliais de Medula Óssea Transformada (TRBMEC)

Aceleraram-se Células Endoteliais de Medula Óssea Transformadas (TRBMEC) em grupos de tecidos de 96 poços (Falcon) a uma densidade de 25.000/poço em meio M131 (Cascade Biologics) suplementado com Suplemento de Crescimento Microvascular (MVGS) (Cascade Biologics). Quando alcançaram a confluência (24 horas depois), as células foram mudadas a M199 (Gibco-Life Technologies) suplementado com Soro Bovino Fetal a 1 % (Hyclone). Adicionou-se zyctorl71ig recombinante humano (reagente de ensaio) a diversas concentrações (de 0,4 a 10 ng/ml) (veja-se o Quadro 21 proporcionado a seguir) para ensaiar o efeito da proteína sobre as interacções células imunes-células endoteliais que tinham como resultado a adesão. Alguns poços receberam 0,3 ng/ml de Factor de Necrose Tumoral (TNalfa R&D Systems), uma citocina pró-inflamatória conhecida, além de zyctorl71ig, para ensaiar o efeito da proteína sobre as células endoteliais em condições inflamatórias. Como controlo positivo foi utilizado TNFalfa a 0,3 ng/ml somente e a concentração utilizada representa aproximadamente 70 % do efeito máximo de TNFalfa neste sistema, isto é, não induz a aderência máxima das células U937 (uma linha celular similar a monócitos humanos) ao endotélio. Por esta razão, este sistema pode detectar tanto a regulação positiva como a regulação negativa dos efeitos do TNFalfa. Os níveis basais de adesão tanto com como sem 299 TNFalfa foram utilizados como valor basal para avaliar o efeito dos reagentes de ensaio.

Depois de uma incubação de uma noite das células endoteliais com os reagentes de ensaio (zcytorl71igando ± TNFalfa), as células U937 coradas com marcador fluorescente Calceina-AM 5 μΜ (Molecular Probes), as células foram suspensas em RPMI 1640 (sem rojo de fenol) suplementado com FBS a 1 % e foram cultivadas a 10 0, 00 células/poço na monocapa de TRBMEC aclarada. Mediram-se os níveis de fluorescência a comprimentos de onda de excitação/emissão de 485/538 nm (leitor de microplacas Molecular Devices, aplicação CytoFluor) 30 minutos depois, antes e depois de enxaguar os poços três vezes com RPMI 1640 quente (sem vermelho de fenol), para retirar as U937 não aderentes. Utilizaram-se os níveis de fluorescência antes do enxagúe (total) e depois do enxagúe (específico de aderência) para determinar a percentagem de aderência (aderente líquido/total líquido x 100 = % de aderência).

Como pode ser visto no Quadro 21 mostrado a seguir, quando se adicionava zyctorl71ig somente afectava à aderência basal das células U937 às monocapas endoteliais no intervalo de concentrações utilizado (aumentos menores de 2 vezes, p<0,01 por ensaio ANOVA). Por si mesmo, o controlo positivo, 0,3 ng/ml de TNFalfa, aumentava a aderência das células U937 desde um nível basal de 5,8 % a 35 % (6-vezes). Na presença de TNFalfa, zyctorl7 sinergizava com TNFalfa e aumentava adicionalmente a adesão a U937 de uma maneira dependente da concentração entre 0,4 e 10 ng/ml (p<0,01 por ensaio ANOVA). A 10 ng/ml, zyctorl71ig aumentava o efeito de TNFalfa num 62 %. Estes resultados indicam que zyctorl71ig pode ser por si mesmo um agente pró-inflamatório. Zcytorl71ig podia sinergizar com concentrações submáximas de TNFalfa para aumentar a aderência dos monócitos às células endoteliais. Estes resultados também mostram que as células endoteliais, 300 especialmente quando se expõem a citocinas pró-inflamatórias tais como TNFalfa, provavelmente são um tecido alvo da acção de zyctorl71ig. A consequência de zyctorl71igando sobre as células endoteliais pode ser elevada a adesão de monócitos ou macrófagos a um local de actividade pró-inflamatória. Os monócitos e macrófagos activados são importantes em muitas doenças inflamatórias. Portanto, a inibição das adesões de monócito/macrófagos pode proporcionar um fundamento terapêutico para os antagonistas de zyctorl71igando. Estes dados suportam a utilização de antagonistas de zcytorl71igando para o tratamento de doenças pulmonares, doenças vasculares, autoimunidade, metástase tumorais, doenças que envolvem reacções alérgicas, cura de feridas e doenças da pele incluindo dermatite de contacto, alérgicas ou não alérgicas ou psoriase e doença inflamatória do intestino. O Quadro 21 amostra os efeitos de zyctorl71ig sobre a adesão de monócitos U937 a monocapas endoteliais TRBMEC. Os resultados são expressos em percentagem de adesão e os números são a média ± desvio típico de poços por triplicado.

Quadro 21

Basal 0,3 ng/ml de TNFalfa Basal 5,8 ± 1,2 35 ± 5,5 zyctorl71ig 0,4 ng/ml 9 ± 0, 7 44,7 ± 2,5 zyctorl71ig 1, 1 ng/ml 10,4 ± 0, 8 45,2 ± 0,6 zyctorl71ig 3,3 ng/ml 7,9 ± 1,7 51,1 ± 4 zyctorl71ig 10 ng/ml 9,5 ± 0,5 56,6 ±3,9 301 LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> ZymoGenetics, Inc. <120> NOVO LIGANDO DE CITOCINA ZCYTOR17

<130> P26 813EP-D2-PCT <140> EP 08102636.1 <141> 21-01-2003 <150> US 60/350.325 <151> 18-01-2002 <150> US 60/375.323 <151> 25-04-2002 <150> US 60/435.315 <151> 19-12-2002 <160> 168 <170> FastSEQ para Windows Versão 3.0

<210> 1 <211> 904 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (28) . . . (519) <400> 1 302 ctgaagctgg ccttgctctc tctcgcc atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg 54

Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr 1 5 tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac 102 Ser Vai Leu Phe Leu Phe Cys Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His 10 15 20 25 acg ttg cçc gtc cgt tta cta cga cca agt gat gat gta cag aaa ata 150 Thr Leu Pro Vai Arg Leu Leu Arg Pro Ser Asp Asp Vai Gin Lys lie 30 35 40 gtc gag gaa tta cag tcc ctc tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtg gag 198 Vai Glu Glu Leu Gin Ser Leu Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Vai Glu 45 50 55 gaa gag aag ggc gtg ctc gtg tcc cag aat tac acg ctg ccg tgt ctc 246 Glu Glu Lys Gly Vai Leu Vai Ser Gin Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu 60 65 70 age cct gac gcc cag ccg cca aac aac ate cac age cca gcc ate cgg 294 Ser Pro Asp Ala Gin Pro Pro Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg 75 80 85 gea tat ctc aag aca ate aga cag cta gac aac aaa tct gtt att gat 342 Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg Gin Leu Asp Asn Lys Ser Vai Ile Asp 90 95 100 105 gag ate ata gag cac ctc gac aaa ctc ata ttt caa gat gea cca gaa 390 Glu Ile Ile Glu His Leu Asp Lys Leu Ile Phe Gin Asp Ala Pro Glu 110 115 120 aca aac att tct gtg cca aca gac acc cat gaa tgt aaa ege ttc ate 438 Thr Asn Ile Ser Vai Pro Thr Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile 125 130 135 ctg act att tct caa cag ttt tca gag tgc atg gac ctc gea cta aaa 486 Leu Thr Ile Ser Gin Gin Phe Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys 140 145 150 tca ttg acc tct gga gcc caa cag gcc acc act taaggccatc tcttcctttc 539 Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gin Gin Ala Thr Thr 155 160 ggattggcag gccgtgattc agtcccggga tattagtctt ccctcgtgag ttgtcaatgc tcata gaacttaagg cttaagtaca gggctgagat ggtatttatg ggtgggaggt tccctggggg agccttaaaa tttttccaat gtgaatttgt gaatgctttt ggcagctatg agcectcgga agatgaccga gaataatctc gaattaoctt cttctgcagg ttaatttatt atctatttaa cagqtaagtg agggacccct gaaaaacatt cttaagtctt gatatttatt taaattatat tgggaactct 599 catatgggct 659 aggttattgt 719 acttattata 779 gtactaagag S39 tgaatttttc 899 904 303 <210> 2 <211> 164 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Vai Leu Phe Leu Phe Cys 1 5 10 15 Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Vai Arg Leu Leu 20 25 30 Arg Pro Ser Asp Asp Vai Gin Lys Ile Vai Glu Glu Leu Gin Ser Leu 35 40 45 Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Vai Glu Glu Glu Lys Gly Vai Leu Vai 50 55 60 Ser Gin Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gin Pro Pro 65 70 75 80 Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg 85 90 95 Gin Leu Asp Asn Lys Ser Vai Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp 100 105 110 Lys Leu Ile Phe Gin Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Vai Pro Thr 115 120 125 Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr ile Ser Gin Gin Phe 130 135 140 Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gin 145 150 155 160 Gin Ala Thr Thr

<210> 3 <211> 492 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Polinucleótido degenerado de zcytorl71ig humano da SEQ ID NO: 2 <221> misc_feature <222> (1) ... (492) <223> n = A, T, C ou <400> 3 304 atggcnwsnc aywsnggncc nwsnacnwsn tggytngcnw sncayacnyt nccngtnragn athgtngarg arytncarws nytnwsnaar ggngtnytng tnwsncaraa ytayacnytn aayaayathc aywsnccngc nathmçngcn aarwsngtna thgaygarat hathgarcay garacnaaya thwsngtncc nacngayacn wsncarcart tywsngartg yatggayytn cacgcnacna cn

<210> 4 <211> 2903 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (497) ... (2482) <400> 4 gtnytnttyy tnttytgytg yytnggnggn 60 ytnytnmgne cnwsngayga ygtncaraar 120 atgytnytna argaygtnga rgargaraat 180 ccntgyytnw snccngaygc ncarccnccn 240 tayytnaara cnathmgnca rytngayaay 300 ytngayaary tnathttyca rgaygcnccn 360 caygartgya armgnttyat hytnacnath 420 gcnytnaarw snytnacnws nggngcncar 480 492 305 305 tgaaaagaca ccacctcagc gaatgtccgc ttggctcact gtagctggga cactttgact acaetcccac gtgctgtggg gaaoatcccc tgtgtgtgca gtatgaaaat tgagacagga aggcagagtg tcagcttgtt 60 tgggaatgtg catcaggcaa ctcaagtttt tcaccacggc atgtgtctgt 120 aaaacattag tttcactctt gtcgccaggt Lggaqtacaa tggcacgatc 180 gcaacctctg cctcccgggt tcaagcgatt ctcctgcctc agcctcccga 240 ttacagttaa caataatgca atecatttce cagcataagt gggtaagtgc 300 tgggctgggc ttaaaagcac aagaaaagct cgcagacaat cagagtçgaa 360 atcttagtgt ggataaatta aagtccagat tgttcttcct gtcctgactt 420 aggtggagtt gcctttgatg caaatccttt gagccagcag aacatctgtg 480 tgatac atg aag ctc tct ccc cag cct tca tgt gtt aac ctg 532 Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Vai Asn Leu 15 10 ggg atg atg tgg acc tgg Gly Met Met Trp Thr Trp 15 ttc age ctg gea gct ctg Phe Ser Leu Ala Ala Leu 30 tac tac tat agg aaa aat Tyr Tyr Tyr Arg Lys Asn 45 50 acc agt tat acc cag tac Thr Ser Tyr Thr Gin Tyr 65 aaa cat gat aat tgt aca Lys His Asp Asn Cys Thr 80 gea ctg tgg atg ctc cct Ala Leu Trp Met Leu Pro 20 cca gct aag cct gag aac Pro Ala Lys Pro Glu Asn 35 40 tta acc tgc act tgg agt Leu Thr Cys Thr Trp Ser 55 aca gtt aag aga act tac Thr Vai Lys Arg Thr Tyr 70 acc aat agt tct aca agt Thr Asn Ser Ser Thr Ser 85 tca ctc tgc aaa 580 Ser Leu Cys Lys 25 att tcc tgt gtc 628 Ile Ser Cys Vai cca gga aag gaa 676 Pro Gly Lys Glu 60 gct ttt gga gaa 724 Ala Phe Gly Glu 75 gaa aat cgt gct 772 Glu Asn Arg Ala 90 306 tcg tgc tct ttt ttc ctt cca aga ata acg ate cca gat aat tat acc 820 Ser Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr 95 100 105 att gag gtg gaa gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tct cat atg 868 Ile Glu Vai Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met 110 115 120 aca tac tgg aga tta gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att 916 Thr Tyr Trp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile 125 130 135 140 ttc cgt gtg aaa cca gtt ttg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa 964 Phe Arg Vai Lys Pro Vai Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gin lie Glu 145 150 155 tgg ata aag cct gag ttg gcg cct gtt tca tct gat tta aaa tac aca 1012 Trp Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Vai Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr 160 165 170 ctt cga ttc agg aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc 1060 Leu Arg Phe Arg Thr Vai Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe 175 180 185 gct aag aac cgt aag gat aaa aac caa acg tac aac etc acg ggg ctg 110B Ala Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu 190 195 200 cag cct ttt aca gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag 1156 Gin Pro Phe Thr Glu Tyr Vai Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu 205 210 215 220 tca aag ttc tgg agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag 1204 Ser Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu 225 230 235 gaa gaa gct cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct 1252 Glu Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala 240 245 250 çag gcg gat gga aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gea aga 1300 Glu Ala Asp Gly Arg Arg Pro Vai Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg 255 260 265 gga gcc cca gtc cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat 1348 Gly Ala Pro Vai Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr 270 275 280 cca gaa age aac act aac etc aca gaa aca atg aac act act aac cag 1396 Pro Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin 285 290 295 300 cag ctt gaa ctg cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tct atg att 1444 Gin Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile 305 310 315 tct tat aat tct ctt ggg aag tct cca gtg gcc acc ctg agg att cca 1492 Ser Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro 320 325 330 gct att caa gaa aaa tca ttt cag tgc att gag gtc atg cag gcc tgc 1540 307

Ala Ile Gin Glu Lys Ser Phe Gin Cys Ile Glu Val Met Gin Ala Cys 335 340 345 gtt gct gag gac cag cta gtg gtg aag tgg caa age tet gct cta gac 1588 Val Ala Glu Asp Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp 350 355 360 gtg aac act tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc 1636 Val Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro 365 370 375 380 acc acc ctt tcc tgg gaa tet gtg tet cag gcc acg aac tgg acg ate 1684 Thr Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr ile 385 390 395 cag caa gat aaa tta aaa cct ttc tgg tgc tat aac ate tet gtg tat 1732 Gin Gin Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr 400 405 410 cca atg ttg cat gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc ate cag gct tat 1780 Pro Met Leu Bis Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr 415 420 425 gcc aaa gaa ggc gtt cca tea gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac 1828 Ala Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn 430 435 440 att ggc gtg aag acg gtc acg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt 1876 Ile Gly Val Lys Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser 445 450 455 460 gag aga aag ggt ate ate tgc aac tac acc ate ttt tac caa gct gaa 1924 Glu Arg Lya Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gin Ala Glu 465 470 475 ggt gga aaa gga ttc tcc aag aca gtc aat tcc age ate ttg cag tac 1972 Gly Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gin Tyr 480 485 490 ggc ctg gag tcc ctg aaa cga aag acc tet tac att gtt cag gtc atg 2020 Gly Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gin Val Met 495 500 505 gcc age acc agt gct ggg gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag 2068 Ala Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys 510 515 520 aca ttg tea ttc agt gtc ttt gag att ate ctc ata act tet ctg att 2116 Thr Leu Ser Phe Ser Val Phe Glu Ile Ile Leu Ile Thr Ser Leu Ile 525 530 535 540 ggt gga ggc ctt ctt att ctc att ate ctg aca gtg gea tat ggt ctc 2164 Gly Gly Gly Leu Leu Ile Leu Ile Ile Leu Thr Val Ala Tyr Gly Leu 545 550 555 aaa aaa ccc aac aaa ttg act cat ctg tgt tgg ccc acc gtt CCC aac 2212 Lys Lys Pro Asn Lys Leu Thr His Leu Cys Trp Pro Thr Val Pro Asn 560 565 570 cct gct gaa agt agt ata gcc aca tgg cat gga gat gat ttc aag gat 2260 Pro Ala Glu Ser Ser Ile Ala Thr Trp His Gly Asp Asp Phe Lys Asp 308 308 575 580 585 aag cta âác ctg aag gag tet gat gac tet gtg aac aca gaa gac agg Lys Leu Asn Leu Lys Glu Ser Asp Asp Ser Vai Asn Thr Glu Asp Arg 590 595 600 ate tta aaa. cca tgt tcc acc ccc agt gac aag ttg gtg att gac aag Ile Leu Lys Pro Cys Ser Thr Pro Ser Asp Lys Leu Vai Ile Asp Lys 605 610 615 620 ttg gtg gtg aac ttt ggg aat gtt ctg caa gaa att ttc aca gat gaa Leu Vai Vai Asn Phe Gly Asn Vai Leu Gin Glu Ile Phe Thr Asp Glu 625 630 635 gee aga acg ggt cag gaa aac aat tta gga ggg gaa aag aat ggg act Ala Arg Thr Gly Gin Glu Asn Asn Leu Gly Gly Glu Lys Asn Gly Thr 640 645 650 aga att ctg tet tec tgc cca act tea ata taagtgtgga ctaaaatgcg Arg Ile Leu Ser Ser Cys Pro Thr Ser Ile 2308 2356 2404 2452 2502 655 660 2562 2622 2682 2742 2802 2862 2003 agaaaggtgt cctgtggtct atgcaaatta gaaaggacat gcagagtttt ccaactagga agactgaatc tgtggcccca agagaaccat ctctgaagac tgggtatgtg gtcttttcca cacatggacc acctacggat gcaatctgta atgcatgtgc atgagaagtc tgttattaag tagagtgtga aaacatggtt atggtaatag gaacagcttt taaaatgctt ttgtatttgg gcctttcata caaaaaagcc ataataccat tttcatgtaa tgctatactt ctatactatt ttcatgtaat actatacttc tatactattt tcatgtaata ctatacttct atactatttt catgtaatac tatactteta tattaaagtt ttacccactc a <210> 5 <211> 662 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 309

Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Val Asn Leu Gly Met Met Trp 1 5 10 15 Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala 20 25 30 Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 40 45 Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr 50 55 60 Gin Tyr Thr Vai Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 70 75 80 Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe 85 90 95 Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu 100 105 110 Ala Glu Asn Gly Asp Gly Vai Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg 115 120 125 Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys 130 135 140 Pro Vai Leu Gly Ile Lys Arg Met ile Gin Ile Glu Trp Ile Lys Pro 145 150 155 160 Glu Leu Ala Pro Vai Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg 165 170 175 lhe Vai Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg 180 185 190 Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe Thr 310 195 GlU Tyr 210 Vai Ile Set 225 Asp Trp Ser Cys Gly Leu Glu Arg Arg Pro Vai 260 Leu Glu Lys 275 Thr Thr Asn 290 Leu Thr His 305 Leu Gly Gly Leu Gly Lys Ser Lys Ser Phe Gin 340 Gin Leu Vai 355 Vai Met Ile 370 Glu Trp Trp 385 Gin Ser Vai Leu Lys Pro Phe Asp Lys Vai Gly 420 Vai Pro Ser 435 Glu Thr Vai 450 Thr Ile Ile 465 Ile Cys Asn Phe Ser Lys Thr Leu Lys Arg Lys 500 Ala Gly Gly 51S Thr Ser Vai 530 Phe Glu Leu 545 Ile Leu Ile Lys Leu Thr His Ser Ile Ala Thr 580 Lys Glu Ser 595 Asp Cys Ser 610 Thr Pro Fhe 625 Gly Asn Vai Gin Glu Asn Asn Ser Cys Pro Thr 660

Ala Leu Arg 200 Cys Gin Glu 215 Lys Met Leu 230 Trp Arg Vai 245 Arg Leu Leu Trp Leu Gly Tyr Asn Glu Thr Met 280 Asn Glu Ser 295 Phe Trp Pro 310 Vai Ala Thr 325 Cys Ile Glu Vai Lys Trp Gin Ser Phe Pro Asp 360 Vai Ser Gin 375 Ala Thr Trp 390 Cys Tyr Asn 405 Glu Pro Tyr Ser Gly Pro Glu Thr Thr Trp Lys 440 Glu Tyr Thr 455 Ile Phe Vai 470 Asn Ser Ser 485 Thr Ser Tyr Ile Asn Gly Thr Ser Ile Ile Leu 520 Ile Ile Leu 535 Thr Val Leu 550 Cys Trp Pro 565 Trp His Gly Asp Asp Ser Vai Asn Ser Asp Lys 600 Leu Leu Gin 615 Glu Ile Leu 630 Gly Gly Glu 645 Ser Ile

Ala Val Lys Glu 220 Gly Met Thr 235 Glu Leu Lys 250 Pro Ala Lys 265 Lys Ala Arg Ile Trp Tyr Tyr Thr Thr Asn Gin 300 Val Ser Met 315 Ile Leu Arg 330 Ile Pro Met 345 Gin Ala Cys Ser Ala Leu Asp Asp Ser Glu Pro 380 Asn Trp Thr 395 Ile Ile Ser 410 Val Tyr Ile 425 Gin Ala Tyr Lys val Glu Asn Ile Pro Lys Ser 460 Tyr Gin Ala 475 Glu Ile Leu 490 Gin Tyr Val 505 Gin Val Met Ile Asn Phe Lys Thr Ser Leu Ile 540 Ala Tyr Gly 555 Leu Thr Val 570 Pro Asn Asp 585 Phe Lys Asp Thr Glu Asp Arg Val Ile Asp Lys 620 Phe Thr Asp 635 Glu Lys Asn 650 Gly Thr 205 Ser Lys Phe Trp Glu Glu Ala Pro 240 Glu Ala Asp Gly 255 Gly Ala 270 Pro Val Pro 285 Glu Ser Asn Gin Leu Glu Leu Ser Tyr Asn Ser 320 Ala Ile Gin 335 Glu Val Ala 350 Glu Asp Val 365 Asn Thr Trp Thr Thr Leu Ser Gin Gin Asp Lys 400 Pro Met Leu 415 His Ala Lys 430 Glu Gly Ile 445 Gly Val Lys Glu Arg Lys Gly Gly Gly Lys Gly 480 Gly Leu Glu 495 Ser Ala Ser 510 Thr Ser Thr 525 Leu Ser Phe Gly Gly Gly Leu Lys Lys Pro Asn 560 Pro Ala Glu 575 Ser Lys Leu 590 Asn Leu ile 605 Leu Lys Pro Leu Val Val Asn Ala Arg Thr Gly 640 Arg Ile Leu 655 Ser 311 <210> 6 <211> 2964 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (13) . ...(2949) < 4 0 0 > 6 312 gaattcgcca cc atg gct cta ttt gca gtc ttt cag aca aca ttc ttc tta 51 Met Ala Leu Phe Ala Vai Phe Gin Thr Thr Phe Phe Leu 15 10 aca ttg ctg tcc ttg agg act tac cag agt gaa gtc ttg gct gaa cgt 99 Thr Leu Leu Ser Leu Arg Thr Tyr Gin Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg 15 20 25 tta cca ttg act cct gta tea ctt aaa gtt tcc acc aat tct acg cgt 147 Leu Pro Leu Thr Pro Val Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg 30 35 40 45 cag agt ttg cac tta caa tgg act gtc cac aac ctt cct tat cat cag 195 Gin Ser Leu His Leu Gin Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gin 50 55 60 gaa ttg aaa atg gta ttt cag ate cag ate agt agg att gaa aca tcc 243 Glu Leu Lys Met Val Phe Gin Ile Gin Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser 65 70 75 aat gtc ate tgg gtg ggg aat tac age acc act gtg aag tgg aac cag 291 Asn Val Ile Trp Val Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gin 80 85 90 gtt ctg cat tgg age tgg gaa tct gag ctc cct ttg gaa tgt çcc aca 339 Vai Leu Hls Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr 95 100 105 cac ttt gta aga ata aag agt ttg gtg gac gat gee aag ttc cct gag 387 His Phe Val Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu 110 115 120 125 cca aat ttc tgg age aac tgg agt tcc tgg gag gaa gtc agt gta caa 435 Pro Asn Phe Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gin 130 135 140 gat tct act gga cag gat ata ttg ttc gtt ttc cct aaa gat aag ctg 483 Asp Ser Thr Gly Gin Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu 145 ISO 155 gtg gaa gaa ggc acc aat gtt acc att tgt tac gtt tct agg aac att 531 vai Glu Glu Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn Ile 160 165 170 caa aat aat gta tcc tgt tat ttg gaa ggg aaa cag att cat gga gaa 579 Gin Asn Asn Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gin Ile His Gly Glu 175 180 185 caa ctt gat cca cat gta act gca ttc aac ttg aat agt gtg cct ttc 627 Gin Leu Asp Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe 190 195 200 205 313 att agg aat aaa ggg aca aat ate tat tgt gag gea agt caa gga aat 675 Ile Arg Asn Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gin Gly Asn 210 215 220 gtc agt gaa ggc atg aaa ggc ate gtt ctt ttt gtc tca aaa gta ctt 723 val Ser Glu Gly Met Lys Gly ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu 225 230 235 gag gag ccc aag gae ttt tet tgt gaa acc gag gac ttc aag act ttg 771 Glu Glu Pro Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu 240 245 250 cac tgt act tgg gat cct ggg acg gac act gee ttg ggg tgg tet aaa 819 His Cys Thr Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys 255 260 265 caa cct tcc caa age tac act tta ttt gaa tca ttt tet ggg gaa aag 867 Gin Pro Ser Gin Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys 270 275 280 285 aaa ctt tgt aca cac aaa aac tgg tgt aat tgg caa ata act caa gac 915 Lys Leu Cys Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gin lie Thr Gin A3p 290 295 300 tca caa gaa acc tat aac ttc aca ctc ata gct gaa aat tac tta agg 963 Ser Gin Glu Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg 305 310 315 aag aga agt gtc aat ate ctt ttt aac ctg act cat cga gtt tat tta 1011 Lys Arg Ser Vai Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu 320 325 330 atg aat cct ttt agt gtc aac ttt gaa aat gta aat gee aca aat gee 1059 Met Asn Pro Phe Ser Vai Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala 335 340 345 ato atg acc tgg aag gtg cac tcc ata agg aat aat ttc aca tat ttg 1107 Ile Met Thr Trp Lys Vai His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu 350 355 360 365 tgt cag att gaa ctc cat ggt gaa gga aaa atg atg caa tac aat gtt 1155 Cys Gin Ile Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gin Tyr Asn Val 370 375 380 tcc ate aag gtg aac ggt gag tac ttc tta agt gaa ctg gaa cct gee 1203 Ser Ile Lys Vai Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala 385 390 395 aca gag tac atg gcg cga gta cgg tgt gct gat gee age cac ttc tgg 1251 Thr Glu Tyr Met Ala Arg Vai Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp 400 405 410 aaa tgg agt gaa tgg agt ggt cag aac ttc acc aca ctt gaa gct gct 1299 Lys Trp Ser Glu Trp Ser Gly Gin Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala 415 420 425 ccc tca gag gee cct gat gtc tgg aga att gtg age ttg gag cca gga 1347 Pro Ser Glu Ala Pro Asp Vai Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly 430 435 440 445 314 aat cat act gtg acc tta ttc tgg aag cca tta tea aaa ctg cat gee 1395 Asn Ilis Thr Vai Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala 450 455 460 aat gga aag ate ctg ttc tat aat gta gtt gta gaa aac cta gac aaa 1443 Asn Gly Lys Ile Leu Phe Tyr Asn Vai Vai Vai Glu Asn Leu Asp Lys 465 470 475 cca tcc agt tea gag ctc cat tcc att cca gea cca gee aac age aca 1491 Pro Ser Ser Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr 480 485 490 aaa cta ate ctt gac agg tgt tcc tac caa ate tgc gtc ata gee aac 1539 Lys Leu Ile Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gin Ile Cys Val Ile Ala Asn 495 500 505 aac agt gtg ggt gct tet cct gct tet gta ata gtc ate tet gea gac 1587 Asn Ser Vai Gly Ala Ser Pro Ala Ser Vai Ile Vai Ile Ser Ala Asp 510 515 520 525 CCG gaa aac aaa gag gtt gag gaa gaa aga att gea ggc aca gag ggt 1635 Pro Glu Asn Lys Glu Vai Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly 530 535 540 gga ttc tet ctg tet tgg aaa ccc caa cct gga gat gtt ata ggc tat 1683 Gly Phe Ser Leu Ser Trp Lys Pro Gin Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr 545 550 555 gtt gtg gac tgg tgt gac cat acc cag gat gtg ctc ggt gat ttc cag 1731 Vai Vai Asp Trp Cys Asp His Thr Gin Asp Vai Leu Gly Asp Phe Gin 560 565 570 tgg aag aat gta ggt ccc aat acc aca age aca gtc att age aca gat 1779 Trp Lys Asn Vai Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val He Ser Thr Asp 575 580 585 gct ttt agg cca gga gtt cga tat gac ttc aga att tat ggg tta tet 1827 Ala Phe Arg Pro Gly Vai Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser 590 595 600 605 aca aaa agg att gct tgt tta tta gag aaa aaa aca gga tac tet cag 1875 Thr Lys Arg Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gin 610 615 620 gaa ctt gct cct tea gac aac cct cac gtg ctg gtg gat aca ttg aca 1923 Glu Leu Ala Pro Ser Asp Asn Pro His Vai Leu Val Asp Thr Leu Thr 625 630 635 tcc cac tcc ttc act ctg agt tgg aaa gat tac tet act gaa tet caa 1971 Ser His Ser Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gin 640 645 650 cct ggt ttt ata caa ggg tac cat gtc tat ctg aaa tcc aag gcg agg 2019 Pro Gly Phe Ile Gin Gly Tyr His Vai Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg 655 660 665 cag tgc cac cca cga ttt gaa aag gea gtt ctt tea gat ggt tea gaa 2067 Gin Cys His Pro Arg Phe Glu Lys Ala Vai Leu Ser Asp Gly Ser Glu 670 675 6B0 685 tgt tgc aaa tac aaa att gac aac ccg gaa gaa aag gea ttg att gtg 2115 315

Cys Cys Lys Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val 6 90 695 700 gac aac cta aag cca gaa tcc ttc tat gag ttt ttc ate act cca ttc 2163 Asp Asn Leu Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe 705 710 715 act agt gct ggt gaa ggc ccc agt gct acg ttc acg aag gtc acg act 2211 Thr Ser Ala Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr 720 725 730 ccg gat gaa cac tcc teg atg ctg att cat ate cta ctg ccc atg gtt 2259 Pro Asp Glu His Ser Ser Met Leu Ile His Ile Leu Leu Pro Met Val 135 740 745 ttc tgc gtc ttg etc ate atg gtc atg tgc tac ttg aaa agt cag tgg 2307 Phe Cys Vai Leu Leu Ile Met Vai Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gin Trp 750 755 760 765 ate aag gag acc tgt tat cct gac ate cct gac cct tac aag age age 2355 Ile Lys Glu Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser 770 775 7B0 ate ctg tea tta ata aaa ttc aag gag aac cct cac cta ata ata atg 2403 Ile Leu Ser Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met 785 790 795 aat gtc agt gac tgt ate cca gat gct att gaa gtt gta age aag cca 2451 Asn Vai Ser Asp Cys Ile Pro Asp Ala lie Glu Vai val Ser Lys Pro 800 805 810 gaa ggg aca aag ata cag ttc cta ggc act agg aag tea ctc aca gaa 2499 Glu Gly Thr Lys Ile Gin Phe Leu Gly Thr Arg Lys Ser Leu Thr Glu 815 820 825 acc gag ttg act aag cct aac tac ctt tat ctc ctt cca aca gaa aag 2547 Thr Glu Leu Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu Leu Pro Thr Glu Lys 830 835 840 845 aat cac tet ggc cct ggc ccc tgc ate tgt ttt gag aac ttg acc tat 2595 Asn His Ser Gly Pro Gly Pro Cys He Cys Phe Glu Asn Leu Thr Tyr 850 855 860 aac cag gea gct tet gac tet ggc tet tgt ggc cat gtt cca gta tcc 2643 Asn Gin Ala Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly His Val Pro Val Ser 865 870 875 cca aaa gee cca agt atg ctg gga cta atg acc tea cct gaa aat gta 2691 Pro Lys Ala Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr Ser Pro Glu Asn Val 880 885 890 cta aag gea cta gaa aaa aac tac atg aac tcc ctg gga gaa ate cca 2739 Leu Lys Ala Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser Leu Gly Glu Ile Pro 895 900 905 gct gga gaa aca agt ttg aat tat gtg tcc cag ttg gct tea ccc atg 2787 Ala Gly Glu Thr Ser Leu Asn Tyr Vai Ser Gin Leu Ala Ser Pro Met 910 915 920 925 ttt gga gac aag gac agt etc cca aca aac cca gta gag gea cca cac 2835 Phe Gly Asp Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro Val Glu Ala Pro His 316 930 935 940 tgt tca gag tat aaa atg caa atg gea gtc tcc ctg cgt ctt gee ttg Cys Ser Glu Tyr Lys Met Gin Met Ala Vai Ser Leu Arg Leu Ala Leu 945 950 955 cct ccc ccg acc gag aat age age etc tcc tca att acc ctt tta gat Pro Pro Pro Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser Ile Thr Leu Leu Asp 960 965 970 cca ggt gaa cac tac tgc taaccagcac tegag Pro Gly Glu His Tyr Cys 2363 2931 2964 975 <210> 7 <211> 979 <212> PRT <213> Homo <400> 7 317

Met Ala Leu Phe Ala Vai Phe Gin Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu 1 S 10 15 Set Leu Arg Thr Tyr Gin Ser Glu vai Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu 20 25 30 Thr Pro Vai Ser Leu Lys Vai Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gin Ser Leu 35 40 45 His Leu Gin Trp Thr Vai His Asn Leu Fro Tyr His Gin Glu Leu Lys 50 55 60 Met Vai Phe Gin Ile Gin Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 Trp Vai Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Vai Lys Trp Asn Gin Val Leu His 85 90 95 Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe val ioo 105 110 Arg Ile Lys Ser Leu Vai Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe 115 120 125 Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gin Asp Ser Thr 130 135 140 Gly Gin Asp Ile Leu Phe Vai Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu 145 150 155 160 Gly Thr Asn Vai Thr Ile Cys Tyr Vai Ser Arg Asn Ile Gin Asn Asn 165 170 175 Vai Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gin Ile His Gly Glu Gin Leu Asp 180 185 190 Pro His Vai Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn 195 200 205 Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gin Gly Asn Val Ser Glu 210 215 220 Gly Met Lys Gly Ile Vai Leu Phe Vai Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro 225 230 235 240 Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr 245 250 255 Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gin Pro Ser 260 265 270 Gin Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys 275 280 285 Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gin Ile Thr Gin Asp Ser Gin Glu 250 295 300 Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser 305 310 315 320 318

Val Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro 325 330 33S Phe Val Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala ile Met Thr 340 345 350 Trp Lys Val His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gin Ile 355 360 365 Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gin Tyr Asn Val Ser Ile Lys 370 375 380 Val Aon Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 385 390 395 400 Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser 405 410 415 Glu Trp Ser Gly Gin Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ala Pro Asp Val Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr 435 440 445 Val Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys 450 455 460 Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser 465 470 475 480 Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile 485 490 495 leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gin Ile Cys Val Ile Ala Asn Asn Ser Val 500 505 510 Gly Ala Ser Pro Ala Sef Val Ile Val Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn 515 520 525 Lys Glu Val Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phe Ser 530 535 540 Leu Ser Trp Lys Pro Gin Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp 545 550 555 560 Trp Cys Asp His Thr Gin Asp Val Leu Gly Asp Phe Gin Trp Lys Asn 565 570 575 Val Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg 580 585 590 Pro Gly Val Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg 595 600 605 Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gin Glu Leu Ala 610 615 620 Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser 625 630 635 640 Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gin Pro Gly Phe 645 650 655 Ile Gin Gly Tyr His Val Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gin Cys His 660 665 670 Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys 675 680 685 Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu 690 695 700 Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe lie Thr Pro Phe Thr Ser Ala 705 710 715 720 Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu 725 730 735 HÍS Ser Ser blet Leu lie His Ile Leu Leu Pro Met Val Phe Cys Val 740 745 750 Leu Leu Ile Met Val Met Cys Tyr Leu Lys Ser Gin Trp Ile Lys Glu 755 760 765 Thr Cys Tyr Pro Asp Ile Pro Asp Pro Tyr Lys Ser Ser lie Leu Ser 770 775 780 Leu Ile Lys Phe Lys Glu Asn Pro His Leu Ile Ile Met Asn Val Ser 785 790 7 95 800 Asp Cys Ile Pro Asp Ala Ile Glu val Val Ser Lys Pro Glu Gly Thr 319 805 Lys Ile Gin Phe Leu Gly Thr Arg 820 Thr Lys Pro Asn Tyr Leu Tyr Leu 835 840 Gly Pro Gly Pro Cys Ile Cys Phe 850 855 Ala Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly 865 870 Pro Ser Met Leu Gly Leu Met Thr 885 Leu Glu Lys Asn Tyr Met Asn Ser 900 Thr Ser Leu Asn Tyr Vai Ser Gin 915 920 Lys Asp Ser Leu Pro Thr Asn Pro 930 935 Tyr Lys Met Gin Met Ala Vai Ser 945 950 Thr Glu Asn Ser Ser Leu Ser Ser 965 His Tyr Cys 310 815

Lys Ser Leu Thr Glu Ihr Glu Leu 825 830

Leu Pro Thr Glu Lys Asn His Ser 845

Glu Asn Leu Thr Tyr Asn Gin Ala 860

His Vai Pro Vai Ser Pro Lys Ala 875 880

Ser Pro Glu Asn Vai Leu Lys Ala 890 895

Leu Gly Glu Ile Pro Ala Gly Glu 905 910

Leu Ala Ser Pro Met Phe Gly Asp 925

Vai Glu Ala Pro His Cys Ser Glu 940

Leu Arg Leu Ala Leu Pro Pro Pro 955 960

Ile Thr Leu Leu Asp Pro Gly Glu 970 975 <210> 8 <211> 2657 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (133) ...(2040 <400> 320 cggaggcggc ctgccggggt ggttcggctt cccgttgccg cctcgggcgc tgtacccaga 60 gctcgaagag gagcagcgcg gccgcgcgga cccggcaagg ctgggccgga ctcggggctc 120 ccçagggacg cc atg cgg gga ggc agg ggc gcc cct ttc tgg ctg tgg ccg 171 Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro 1 5 10 ctg ccc aag ctg gcg ctg ctg cct ctg ttg tgg gtg ctt ttc cag cgg 219 Leu Pro Lys Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Trp Vai Leu Phe Gin Arg 15 20 25 acg cgt ccc cag ggc age gcc ggg cca ctg cag tgc tac gga gtt gga 267 Thr Arg Pro Gin Gly Ser Ala Gly Pro Leu Gin Cys Tyr Gly Vai Gly 30 35 40 45 ccc ttg ggc gac ttg aac tgc teg tgg gag cct ctt ggg gac ctg gga 315 Pro Leu Gly Asp Leu Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gly 50 55 60 gcc ccc tcc gag tta cac ctc cag age caa aag tac cgt tcc aac aaa 363 Ala Pro Ser Glu Leu His Leu Gin Ser Gin Lys Tyr Arg Ser Asn Lys 65 70 75 acc cag act gtg gca gtg gca gcc gga cgg age tgg gtg gcc att cct 411 Thr Gin Thr Vai Ala Vai Ala Ala Gly Arg Ser Trp Vai Ala Ile Pro 80 85 30 321 cgg gaa cag etc acc atg tct gac aaa etc ctt gtc tgg ggc act aag 459 Arg Glu Gin Leu Thr Met Ser Asp Lys Leu Leu Val Trp Gly Thr Lys 95 100 105 gca ggc cag cct etc tgg ccc ccc gtc ttc gtg aac cta gaa acc caa 507 Ala Gly Gin Pro Leu Trp Pro Pro Val Phe Val Asn Leu Glu Thr Gin 110 115 120 125 atg aag cca aac gee ccc cgg ctg ggc cct gac gtg gac ttt tcc gag 555 Met Lys Pro Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro Asp Val Asp Phe Ser Glu 130 135 140 gat gac ccc ctg gag gee act gtc cat tgg gee cca cct aca tgg cca 603 Asp ASp Pro Leu Glu Ala Thr Val His Trp Ala Pro Pro Thr Trp Pro 145 150 155 tct cat aaa gtt ctg ate tgc cag ttc cac tac cga aga tgt cag gag 651 Ser His Lys Val Leu Ile Cys Gin Phe His Tyr Arg Arg Cys Gin Glu 160 165 170 gcg gee tgg acc ctg ctg gaa ccg gag ctg aag acc ata ccc ctg acc 699 Ala Ala Trp Thr Leu Leu Glu Pro Glu Leu Lys Thr Ile Pro Leu Thr 175 180 185 cct gtt gaç ate caa gat ttg gag cta gee act ggc tac aaa gtg tat 747 Pro Val Glu Ile Gin Asp Leu Glu Leu Ala Thr Gly Tyr Lys Val Tyr 190 195 200 205 ggc ege tgc cgg atg gag aaa gaa gag gat ttg tgg ggc gag tgg age 795 Gly Arg Cys Arg Met Glu Lys Glu Glu Asp Leu Trp Gly Glu Trp Ser Ο Λ Λ AI V )1C ΟΟίΊ í-*-W ccc att ttg tcc ttc cag aca ccg cct tct gct cca aaa gat gtg tgg 843 Pro Ile Leu Ser Phe Gin Thr Pro Pro Ser Ala Pro Lys Asp Val Trp 225 230 235 gta tea ggg aac etc tgt ggg acg cct gga gga gag gaa cct ttg ctt 891 val Ser Gly Asn Leu Cys Gly Thr Pro Gly Gly Glu Glu Pro Leu Leu 240 245 250 cta tgg aag gee cca ggg ccc tgt gtg cag gtg age tac aaa gtc tgg 939 Leu Trp Lys Ala Pro Gly Pro Cys Val Gin Val Ser Tyr Lys Val Trp 255 260 265 etc tgg gtt gga ggt cgt gag ctg agt cca gaa gga att acc tgc tgc 987 Phe Trp val Gly Gly Arg Glu Leu Ser Pro Glu Gly Ile Thr Cys Cys 270 275 280 285 tgc tcc cta att ccc agt ggg gcg gag tgg gee agg gtg tcc gct gtc 1035 Cys Ser Leu Ile Pro Ser Gly Ala Glu Trp Ala Arg Val Ser Ala val 290 295 300 aac gee aca age tgg gag cct etc acc aac etc tct ttg gtc tgc ttg 1083 Asn Ala Thr Ser Trp Glu Pro Leu Thr Asn Leu Ser Leu Val Cys Leu 305 310 315 gat tea gee tct gee ccc cgt age gtg gca gtc age age ate gct ggg 1131 Asp Ser Ala Ser Ala Pro Arg Ser Val Ala Val Ser Ser lie Ala Gly 320 32S 330 age acg gag cta ctg gtg acc tgg caa ccg ggg cct ggg gaa cca ctg 1179 322

Ser Thr Glu Leu Leu Vai Thr Trp Gin Pro Gly Pro Gly Glu Pro Leu 335 340 345 gag cat gta gtg gac tgg gct cga gat ggg gac ccc ctg gag aaa Ctc 1227 Glu His Vai Vai Asp Trp Ala Arg Asp Gly Asp Pro Leu Glu Lys Leu 350 355 360 365 aac tgg gtc cgg Ctt ccc cct ggg aac ctc agt gct ctg tta cca ggg 127 5 Asn Trp Vai Arg Leu Pro Pro Gly Asn Leu Ser Ala Leu Leu Pro Gly 370 375 380 aat ttc act gtc ggg gtc ccc tat cga ate act gtg acc gca gtc tet 1323 Asn Phe Thr Vai Gly Val Pro Tyr Arg Ile Thr Val Thr Ala Val Ser 385 390 395 gct tca ggc ttg gee tet gca tcc tcc gtc tgg ggg ttc agg gag gaa 1371 Ala Ser Gly Leu Ala Ser Ala Ser Ser Val Trp Gly Phe Arg Glu Glu 400 405 410 tta gca ccc cta gtg ggg cca acg ctt tgg cga ctc caa gat gee cct 1419 Leu Ala Pro Leu Vai Gly Pro Thr Leu Trp Arg Leu Gin Asp Ala Pro 415 420 425 cca ggg acc ccc gee ata gcg tgg gga gag gtc cca agg cac cag ctt 1467 Pro Gly Thr Pro Ala Ile Ala Trp Gly Glu Val Pro Arg His Gin Leu 430 435 440 445 cga ggc cac ctc acc cac tac acc ttg tgt gca cag agt gga acc age 1515 Arg Gly His Leu Thr His Tyr Thr Leu Cys Ala Gin Ser Gly Thr Ser 450 455 460 ccc tcc gtc tgc atg aat gtg agt ggc aac aca cag agt gtc acc ctg 1563 Pro Ser Vai Cys Met Asn Val Ser Gly Asn Thr Gin Ser Val Thr Leu 465 470 475 cct gac ctt cct tgg ggt ccc tgt gag ctg tgg gtg aca gca tet acc 1611 Pro Asp Leu Pro Trp Gly Pro Cys Glu Leu Trp val Thr Ala Sor Thr 480 485 4 90 ate gct gga cag ggc cct cct ggt ccc ate ctc cgg ctt cat cta cca 1659 Ile Ala Gly Gin Gly Pro Pro Gly Pro Ile Leu Arg Leu His Leu Pro 495 500 505 gat aac acc ctg agg tgg aaa gtt ctg cca ggc ate cta ttc ttg tgg 1707 Asp Asn Thr Leu Arg Trp Lys Val Leu Pro Gly Ile Leu Phe Leu Trp 510 515 520 525 ggc ttg ttc ctg ttg ggg tgt ggc ctg age ctg gee acc tet gga agg 1755 Gly Leu Phe Leu Leu Gly Cys Gly Leu Ser Leu Ala Thr Ser Gly Arg 530 535 540 tgc tac cac cta agg cac aaa gtg ctg ccc ege tgg gtc tgg gag aaa 1803 Cys Tyr His Leu Arg His Lys Val Leu Pro Arg Trp Val Trp Glu Lys 545 550 555 gtt cct gat cct gee aac age agt tca ggc cag ccc cac atg gag caa 1851 Vai Pro Asp Pro Ala Asn Ser Ser Ser Gly Gin Pro His Met Glu Gin 560 565 570 gta cct gag gee cag ccc ctt ggg gac ttg ccc ate ctg gaa gtg gag 1899 Vai Pro Glu Ala Gin Pro Leu Gly Asp Leu Pro Ile Leu Glu Val Glu 323 575 580 585 gag atg gag ccc ccg ccg gtt atg gag tcc tcc cag ccc gcc cag gcc 1947 Glu Met Glu Pro Pro Pro Vai Met Glu Ser Ser Gin Pro Ala Gin Ala 590 595 600 605 acc gcc ccg ctt gac tct ggg tat gag aag cac ttc ctg ccc aca cct 1995 Thr Ala Pro Leu Asp Ser Gly Tyr Glu Lys HiS Phe Leu Pro Thr Pro 610 615 620 gag gag ctg ggc ctt ctg ggg ccc ccc agg cca cag gtt ctg gcc 2040 Glu Glu Leu Gly Leu Leu Giy Pro Pro Arg Pro Gin Vai Leu Ala 625 630 635 tgaaccacac gtctggctgg gggctgccag ccaggctaga gggatgctca tgcaggttgc 2100 accccagtcc tggattagcc ctcttgatgg atgaagacac tgaggactca gagaggctga 2160 gtcacttacc tgaggacacc cagccaggca gagctgggat tgaaggaccc ctatagagaa 2220 gggcttggcc cccatgggga agacacggat ggaaggtgga gcaaaggaaa atacatgaaa 2280 ttgagagtgg cagctgcctg ccaaaatctg ttccgctgta acagaactga atttggaccc 2340 cagcacagtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggca ggccaaggtg gaaggatcac 2400 ttagagctag gagtttgaga ccagcctggg caatatagga agacccctca ctacaaaaat 2460 aaaacatcaa aaacaaaaac aattagctgg gcatgatggc acacacctgt agtccgagcc 2520 acLtgggagg ctgaggtggg aggatcggtt gagcccagga gttcgaagct gcagggacct 2580 ctgattgcac cactgcactc caggctgggt aacagaatga gaccttatct caaaaataaa 2640 caaactaata aaaagca 2657

<210> 9 <211> 636 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 324

Met Arg Gly Gly Arg Gly Ala Pro Phe Trp Leu Trp Pro Leu Pro Lys 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Trp Val Leu Phe Gin Arg Thr Arg Pro 20 25 30 Gin Gly Ser Ala Gly Pro Leu Gin Cys Tyr Gly Val Gly Pro Leu Gly 35 40 45 Asp Leu Asn Cys Ser Trp Glu Pro Leu Gly Asp Leu Gly Ala Pro Ser 50 55 60 Glu Leu Sis Leu Gin Ser Gin Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Thr Gin Thr 65 70 75 80 Vai Ala val Ala Ala Gly Arg Ser Trp Val Ala Ile Pro Arg Glu Gin 85 90 95 Leu Thr Met Ser Asp Lys Leu Leu Val Trp Gly Thr Lys Ala Gly Gin 100 105 110 Pro Leu Trp Pro Pro Val Phe Val Asn Leu Glu Thr Gin Met Lys Pro 115 120 125 Asn Ala Pro Arg Leu Gly Pro Asp Val Asp Phe Ser Glu Asp Asp Pro 130 135 140 Leu Glu Ala Thr Val His Trp Ala Pro Pro Thr Trp Pro Ser His Lys 145 150 155 160 Vai Leu Ile Cys Gin Phe His Tyr Arg Arg Cys Gin Glu Ala Ala Trp 165 170 175 Thr Leu Leu Glu Pro Glu Leu Lys Thr Ile Pro Leu Thr Pro Val Glu ISO 185 190 Ile Gin Asp Leu Glu Leu Ala Thr Gly Tyr Lys Val Tyr Gly Arg Cys 195 200 205 Arg Met Glu Lys Glu Glu Asp Leu Trp Gly Glu Trp Ser Pro Ile Leu 210 215 220 Ser Phe Gin Thr Pro Pro Ser Ala Pro Lys Asp Val Trp Val Ser Gly 325 225 230 Asn Leu Cys Gly Thr 245 Pro Gly Gly Alã Pro Gly Pro 260 Cys Vai Gin Vai Gly Gly Arg 275 Glu Leu Ser Pro Glu 280 Ile Pro 290 Ser Gly Ala Glu Trp 295 Ala Ser 305 Trp Glu Pro Leu Thr 310 Asn Leu Ser Ala Pro Arg Ser 325 Vai Ala Vai Leu Leu Vai Thr 340 Trp Gin Pro Gly Vai Asp Trp 355 Ala Arg Asp Gly Asp 360 Arg Leu 370 Pro Pro Gly Asn Leu 375 Ser Vai 385 Gly Vai Pro Tyr Arg 390 Ile Thr Leu Ala Ser Ala Ser 405 Ser Vai Trp Leu Vai Gly Pro 420 Thr Leu Trp Arg Pro Ala Ile 435 Ala Trp Gly Glu Vai 440 Leu Thr 450 His Tyr Thr Leu Cys 455 Ala Cys 465 Met Asn Vai Ser Gly 470 Asn Thr Pro Trp Gly Pro Cys 485 Glu Leu Trp Gin Gly Pro Pro 500 Gly Pro Ile Leu Leu Arg Trp 515 Lys Vai Leu Pro Gly 520 Leu Leu 530 Gly Cys Gly Leu Ser 535 Leu Leu 545 Arg His Lys Vai Leu 550 Pro Arg Pro Ala Asn Ser Ser 565 Ser Gly Gin Ala Gin Pro Leu 560 Gly Asp Leu Pro Pro Pro Pro 595 Vai Met Glu Ser Ser 600 Leu Asp 610 Ser Gly Tyr Glu Lys 615 His Gly 625 Leu Leu Gly Pro Pro 630 Arg Pro 235 240 Glu Glu Pro Leu Leu Leu Trp Lys 250 255 Ser Tyr Lys Vai Trp Phe Trp Vai 265 270 Gly Ile Thr Cys Cys Cys Ser Leu 285 Arg Vai Ser Ala Vai Asn Ala Thr 300 Ser Leu Vai Cys Leu Asp Ser Ala 315 320 Ser Ser Ile Ala Gly Ser Thr Glu 330 335 Pro Gly Glu Pro Leu Glu His Vai 345 350 Pro Leu Glu Lys Leu Asn Trp Vai 365 Ala Leu Leu Pro Gly Asn Phe Thr 380 Vai Thr Ala Vai Ser Ala Ser Gly 395 400 Gly Phe Arg Glu Glu Leu Ala Pro 410 415 Leu Gin Asp Ala Pro Pro Gly Thr 425 430 Pro Arg His Gin Leu Arg Gly His 445 Gin Ser Gly Thr Ser Pro Ser Vai 460 Gin Ser Vai Thr Leu Pro Asp Leu 475 480 Vai Thr Ala Ser Thr Ile Ala Gly 490 495 Arg Leu His Leu Pro Asp Asn Thr 505 510 I le Leu Phe Leu Trp Gly Leu Phe 525 Ala Thr Ser Gly Arg Cys Tyr His 540 Trp Vai Trp Glu Lys Vai Pro Asp 555 560 Pro His Met Glu Gin Vai Pro Glu 570 575 lie Leu Glu Vai Glu Glu Met Glu 585 590 Gin Pro Ala Gin Ala Thr Ala Pro 605 Phe Leu Pro Thr Pro Glu Glu Leu 620 Gin Vai Leu Ala

<210> 10 <211> 755 <212> ADN <213> Mus musculus 635 326 <220> <221> CDS <222> (1) ... (489) <4 Ο 0> 10 327 atg ate ttc cac aca gga aca a cg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc 48 Met lie Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu vai Leu Leu Cys 1 5 10 15 tgt ata gga acc tgg ctg gee acc tgc age ttg tcc ttc ggt gee cca 96 Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro 20 25 30 ata teg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag 144 lie Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu 35 40 45 tct cag gat ctt tat aac aac tat age ata aag cag gca tct ggg atg 192 Ser Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met 50 55 60 tca gca gac gaa tca ata cag ctg ccg tgt ttc age ctg gac cgg gaa 240 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 gca tta acc aac ate teg gtc ate ata gca cat ctg gag aaa gtc aaa 288 Ala Leu Thr Asn Ile Ser vai Ile Ile Ala His Leu Glu Lys vai Lys 85 90 95 gtg ttg age gag aac aca gta gat act tct tgg gtg ata aga tgg cta 336 Vai Leu Ser Glu Asn Thr Vai Asp Thr Ser Trp Vai Ile Arg Trp Leu 100 105 HO aca aac ate age tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tct gtg cct 384 Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Vai Pro 115 120 125 gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt 432 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Vai Phe Vai Leu Thr Vai 130 135 140 tta aag cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat 480 Leu Lys Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 act aca tgc tgagtgatgg gggggggggg ggtgeagtgt cctcagcagt 529

Thr Thr Cys gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg actgtgcggt 589 cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccaet gaaatcttgt tctgctaccc 699 tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt gttaacgctc 709 catggaggag ccttcagagt ctatttaata aattatattg acatga 755

<210> 11 <211> 163 <212> PRT <213> Mus musculus 328 <4 Ο 0> 11

Met 1 Ile Phe His Thr 5 Gly Thr Thr lys Pro 10 Thr Leu Vai Leu Leu 15 Cys Cys Ile Gly Thr 20 Trp Leu Ala Thr Cys 25 Ser Leu Ser Phe Gly 30 Ala Pro lie Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu 35 40 45 Ser Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met 50 55 60 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 Ala Leu Thr Asn Ile Ser Vai Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Vai Lys 85 90 95 Vai Leu Ser Glu Asn Thr Vai Asp Thr Ser Trp Vai Ile Arg Trp Leu 100 105 110 Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Vai Pro 115 120 125 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Vai Phe Vai Leu Thr Vai 130 135 140 Leu Lys Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 Thr Thr Cys

<210> 12 <211>489 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Polinucleótido degenerado de zcytorl71ig de ratinho de SEQ ID NO: 11 <221> misc_feature <222> (1)...(489) <223> n = A, T, C ou G <400> 12 329 329 atgathttyc tggytngcna acnathgayy gcnwsnggna gcnytnacna aayacngtng ytnaayytna gtnytnacng acnacntgy ayacnggnac nacnaarccn acnytngtny tnytntgytg yathggnacn 60 cntgywsnyt nwsnttyggn gcnecnathw snaargarga yytnmgnacn 120 tnytnaarca tgatwsncar gayytntaya ayaaytayws nathaarcar 180 tgwsngcnga ygarwsnath carytnccnt gyttywsnyt ngaymgngar 240 ayathvisngt nathathgcn cayytngara argtnaargt nytnwsngat 300 ayacnwsntg ggtnathragn tggytnacna ayathwsntg yttyaayccn 360 ayathwsngt nccnggnaay acngaygarw sntaygaytg yaargtntty 420 tnytnaarca cttywsnaay tgyatggcng arytncargc naargayaay 480 489 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucle <400> 13 ZC6673 gcgcaaggtg ccgttcacag c 21

<210> 14 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC29082 <400> 14 caatttgttg ggttttttta gcagcagtag gcccag 36

<210> 15 <211>36 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 330 <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29083 <400> 15 ctgggcctac tgctgctaaa aaaacccaac aaattg 36

<210> 16 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29145 <400> 16 gcgtctagag ggttatattg aagttgggca ggaaga 36

<210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Etiqueta de péptido Glu-Glu (CEE) modificado de Gly-Ser <400> 17

Gly Set Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5

<210> 18 <211>33 <212> ADN <213> Sequência artificial 331 <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC29359 <4 0 0> 18 gcgggatcca tgaagctctc tccccagcct tca 33

<210> 19 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC27899 <400> 19 ccagaacttt gactccttga ccg 23

<210> 20 <211>23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC27895 <400> 20 gaagtcaact tcgctaagaa ccg 23

<210> 21 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC29122 332 <4Ο0> 21 ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 34

<210> 22 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29180 <400> 22 cctggagtcc ctgaaacgaa ag 22

<210> 23 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29122 <400> 23 ccgctcgagt tatattgaag ttgggcagga agac 34

<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC9791 <400> 24 333 cgttccaaca aaacccagac 20

<210> 25 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC9793 <400> 25 tggcgttgac agcggacac 19

<210> 26 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC40109 <400> 26 ccattccagc accagccaac 20

<210> 27 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC40112 <400> 27 tacaacttca atagcatctg gg 22 334

<210> 28 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC13496 <400> 28 ccctgcagtg atcaacatgg ccaagttgac cagtgccgtt 40

<210> 29 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC13945 <400> 29 gcccatggac tagtttcgaa aggtcgagtg tcagtcctgc tcctc 45

<210> 30 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC18698 <400> 30 tttttttctc gag acttttt tttttttttt tttt 34 <210> 31 335 <220> <223> Sequência skipped <4Ο0> 31 000

<210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Etiqueta de péptido Glu-Glu (CEE) com par de residuo Gly-Ser <400> 32

Gly Ser Gly Gly Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 10

<210> 33 <211>33 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29451 <400> 33 ccggaattcc cctgatacat gaagctctct ccc 33

<210> 34 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial 336 <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29124 <400> 34 cgcggatccc tcaaagacac tgaatgacaa tgt 33

<210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Etiqueta de péptido Glu-Glu (CEE) sem par de residuos Gly-Ser <400> 35

Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5

<210>36 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de péptido FLAG C-terminal <400> 36

Asp Tyr Lyg Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

<210> 37 <211> 684 <212> ADN 337 <213> Homo sapiens <400> 37 tcagacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgaggg ggcaccgtca gtcttcctct tceccccaaa acccaaggac accetcatga tetcocggac occtgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgceaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca tcctccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgcegtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggae tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc çgtgatgcat gaggctctgc açaaççacta caçgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa

<210> 38 <211> 2295 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>

<223> Polinucleótido de fusão zcytorl7-Fc4 humano <221> CDS <222> (1)...(2295) <400> 38 338 atg aag ctc tct ccc cag cct tca tgt gtt aac ctg ggg atg atg tgg 48 Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Vai Asn Leu Gly Met Met Trp 1 5 10 15 acc tgg gca ctg tgg atg ctc cct tca ctc tgc aaa ttc age ctg gca 96 Ihr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala 20 25 30 gct ctg cca gct aag cct gag aac att tcc tgt gtc tac tac tat agg 144 Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn He Ser Cys Vai Tyr Tyr Tyr Arg 35 40 45 aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc agt tat acc 192 Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr 50 55 60 cag tac a ca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa aaa cat gat aat 240 Gin Tyr Thr Vai Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 70 75 80 339 tgt aca acc aat agt rr O rr aca agt gaa aat cgt gct teg tgc tet ttt 288 Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe 85 90 95 ttc ctt cca aga ata a cg ate cca gat aat tat acc att gag gtg gaa 336 Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile Glu Val Glu 100 105 110 gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tet cat atg aca tac tgg aga 384 Ala Glu Asn Gly Asp Gly Vai Ile Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg 115 120 125 tta gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc cgt gtg aaa 432 Leu Glu Asn lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys 130 135 140 cca gtt ttg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa tgg ata aag cct 480 Pro Vai Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gin Ile Glu Trp Ile Lys Pro 145 150 155 160 gag ttg gcg cct gtt tea tet gat tta aaa tac aca ctt cga ttc agg 523 Glu Leu Ala Pro Vai Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg 165 170 175 aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc gct aag aac cgt 576 Thr Vai Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg 180 185 190 aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag cct ttt aca 624 Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Pro Phe Thr 195 200 205 gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tea aag ttc tgg 672 Glu Tyr Vai Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp 210 215 220 agt gac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa gaa gct cca 720 Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro 225 230 235 240 tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct gag gcg gat gga 768 Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg vai Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly 245 250 255 aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gea aga gga gee cca gtc 816 Arg Arg Pro Vai Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270 cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat cca gaa age aac 864 Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn 275 280 285 act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag ctt gaa ctg 912 Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin Leu Glu Leu 290 295 300 cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tet atg att tet tat aat tet 960 His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ue Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320 ctt ggg aag tet cca gtg gee acc ctg agg att cca gct att caa gaa 1008 340 341

Leu Gly Lys Ser Pro Vai Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala Ile Gin Glu 325 330 335 aaa tea ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt gct gag gac 1056 Lys Ser Phe Gin Cys Ile Glu Vai Met Gin Ala Cys Val Ala Glu Asp 340 345 350 cag cta gtg gtg aag tgg caa age tet gct cta gac gtg aac act tgg 1104 Gin Leu Vai Vai Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp 355 360 365 atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc acc acc ctt tcc 1152 Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser 370 375 380 tgg gaa tet gtg tet cag gee acg aac tgg acg ate cag caa gat aaa 1200 Trp Glu Ser Vai Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gin Gin Asp Lys 385 390 395 400 tta aaa ccc ttc tgg tgc tat aac ate tet gtg tat cca atg ttg cat 1248 Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Met Leu His 405 410 415 gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc ate cag gct tat gee aaa gaa ggc 1296 Asp Lys Vai Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 gtt cea tea gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att ggc gtg aag 1344 Vai Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile Gly Val Lys 435 440 445 acg gtc acg ate aca tgg aaa gag att ccc aag agt gag aga aag ggt 1392 Thr Vai Thr lie Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly 450 455 460 ate ate tgc aac tac acc ate ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gga 1440 Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Gly 465 470 475 480 ttc tcc aag aca gtc aat tcc age ate ttg cag tac ggc ctg gag tcc 1488 Phe Ser Lys Thr Vai Asn Ser Ser Ile Leu Gin Tyr Gly Leu Glu Ser 485 490 495 ctg aaa cga aag acc tet tac att gtt cag gtc atg gee age acc agt 1536 Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gin Val Met Ala Ser Thr Ser 500 505 510 gct ggg gga acc aac ggg acc age ata aat ttc aag aca ttg tea ttc 1584 Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe 515 520 525 agt gtc ttt gag gag ccc aga tet tea gac aaa act cac aca tgc cca 1632 Ser Vai Phe Glu Glu Pro Arg Set Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 530 535 540 CCq tgc cca gea cct gaa gee gag ggg gea ccg tea gtc ttc etc ttc 1680 Fro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 545 550 555 560 ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tcc cgg acc cct gag gtc 1728 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 342 565 570 575 aca tgç gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac cct gag gtc aag ttc 1776 Thr Cys Vai Vai Vai Asp vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Ly3 Phe 580 585 590 aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg 1824 Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 595 600 605 cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc acc 1872 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 610 615 620 gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc 1920 vai Leu His Gin Asp Trp LôU Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys val 625 630 635 640 tcc aac «Lââ gcc ctc cea tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa gcc 1968 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala 645 650 655 aaa ggg cag ccc cg a gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg 2016 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 660 665 670 gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc 2064 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 67 5 680 685 ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag ccg 2112 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 690 695 700 gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc 2160 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 705 710 715 720 ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag cag 2208 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 725 730 735 ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg Cac aac cac 2256 Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His 740 745 750 tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ceg ggt aaa taa 2295 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys * 755 760

<210> 39 <211> 764 <212> PRT <213> Sequência artificial 343 <220> <223> Polipéptido de fusão zcytorl7-Fc4 humano <400> 39 344

Met Lys Leu Ser Pro Gin Pro Ser Cys Vai Asn Leu Gly Met Met Trp 345 1 5 10 15 Thr Trp Ala Lôu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala 20 25 30 Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr Tyr Tyr Arg 35 40 45 Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr Ser Tyr Thr 50 55 60 Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys His Asp Asn 65 70 75 80 Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser Cys Ser Phe 85 90 95 Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ue Glu Val Glu 100 105 110 Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val lie Lys Ser His Met Thr Tyr Trp Arg 115 120 125 Leu Glu Asn Ue Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe Arg Val Lys 130 135 140 Fro Vai Leu Gly Ile Lys Arg Met ile Gin Ue Glu Trp Ue Lys Pro 145 150 155 160 Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu Arg Phe Arg 165 170 175 Thr Vai Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala Lys Asn Arg 180 185 190 !/) >1 Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin Fro Phe Thr 195 200 205 Glu Tyr Vai Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser Lys Phe Trp 210 215 220 Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu Glu Ala Pro 225 230 235 240 Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu Ala Asp Gly 245 250 255 Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270 Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ue Trp Tyr Tyr Pro Glu Ser Asn 275 280 285 Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin Leu Glu Leu 290 295 300 His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ue Pro Ala Ue Gin Glu 325 330 335 Lys Ser Phe Gin Cys Ile Glu Val Met Gin Ala Cys Val Ala Glu Asp 340 345 350 Gin Leu Vai Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val Asn Thr Trp 355 360 365 Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr Thr Leu Ser 370 375 380 Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr Ue Gin Gin Asp Lys 385 390 395 400 Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ue Ser Val Tyr Pro Met Leu His 405 410 415 Asp Lys Vai Gly Glu Pro Tyr Ser Ue Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 Vai Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ue Gly Val Lys 435 440 445 Thr Vai Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ue Pro Lys Ser Glu Arg Lys Gly 450 455 460 Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Gly 455 470 475 480 Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ue Leu Gin Tyr Gly Leu Glu Ser 485 490 495 346

Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Val Gin Val Met Ala Ser Thr Ser 500 505 510 Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Phe 515 520 525 Ser Vai Phe Glu Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 530 535 540 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 545 550 555 560 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 565 570 575 Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 5Θ0 585 590 Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 595 600 605 Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 610 615 620 Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 625 630 635 640 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 645 650 655 Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 660 665 670 Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 67 5 680 685 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 690 69S 700 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 705 710 715 720 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 725 730 735 Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 740 745 750 Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 755 760

<210>40 <211> 34 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29157 <400> 40 ctagtatggc cggccatgaa gctctctccc cagc 34 <210> 41 347

<211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC29150 <400> 41 gtctgaagat ctgggctcct caaagacact gaatgacaat g 41

<210> 42 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC41458 <400>42 tggacctcgc actaaaatca t 21

<210> 43 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC41457 <400> 43 aatcacggca gagttcccac ac 22

<210> 44 <211> 100 <212> ADN 348 <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC12749 <400> 44 gtaccttccc gtaaatccct ccccttcccg gaattacacc cgcgtatttc ccagaaaagg 60 aactgtagat ttctaggaat tcaatccttg gccacgcgtc 100

<210> 45 <211> 100 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC12748 <400> 45 tcgagacgcg tggccaagga ttgaattcct agaaatctac agttcctttt ctgggaaata 60 cgcgggtgta attccgggaa ggggagggat ttacgggaag 100

<210>46 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC10651 <400>46 agcttttctg cagcagctct 20 <210> 47 <211> 23 349 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC10565 <400> 47 tttgcagaaa aggttgcaaa tgc 23 <210> 48 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC14063 <400> 48 caccagacat aatagctgac agact 25 <210> 49 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC17574 <400> 49 ggtrttgctc agcatgcaca c 21 <210> 50 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial 350 <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC17600 <400> 50 catgtaggcc atgaggtcca ccac 24

<210> 51 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC38065 <400> 51 ctttcctggg aatctgtgtc t 21

<210> 52 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC38068 <400> 52 cctccagctc tggtgctg 18

<210> 53 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 351 <223> Iniciador oligonucleotídico ZC37877 <400> 53 caaaaaaccc aacaaattga ctca 24

<210> 54 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC37876 <400> 54 catgtggcta tactactttc agcag 25

<210> 55 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223>sonda TaqMan(r) de receptor de zcytorl7 <400> 55 ctgtgttggc ccaccgttcc ca 22

<210> 56 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador directo de ARNr 352 <4Ο0> 56 cggctaccac atccaaggaa 20

<210> 57 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador reverso de ARNr <400> 57 gctggaatta ccgcggct 18

<210> 58 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda TaqMan(r) de ARNr <400> 58 tgctggcacc agacttgccc tc 22 <210> 59 <220> <223> Sequência skipped <400> 59 000 <210> 60 <211> 21 353 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41458 <400> 60 tggacctcgc actaaaatca t 21 <210> 61 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41457 <400> 61 aatcacggca gagttcccac ac 22 <210> 62 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41459 <400> 62 agaagggcgt gctcgtgtc 19 <210> 63 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial 354 <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41460 <400> 63 ccggatggct gggctgtg 18

<210> 64 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC39982 <400> 64 aatgtctgtg tagcataagg tatga 25

<210> 65 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC39983 <400> 65 cctgcctacc tgaaaaccag aa 22

<210> 66 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 355 <223> Iniciador oligonucleotidico ZC39980 <400> 66 tttgaattcg ccaccatggc tctatttgca gtcttt 36

<210> 67 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC39981 <400> 67 ctgtctcgag tgctggttag cagtgttc 28 <210> 68 <211> 2217 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D - · . . (2217) <400> 68 356 atg gct cta ttt gca gtc ttt cag aca aca ttc ttc tta aca ttg ctg 46 Met fila Leu Phe Ala Vai Phe Gin Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu 1 5 10 15 tcc ttg agg act tac cag agt gaa gtc ttg gct gaa cgt tta eca ttg 96 Ser Leu Arg Thr Tyr Gin Ser Glu Vai Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu 20 25 30 act cct gta tca ctt aaa gtt tcc acc aat tct acg cgt cag agt ttg 144 Thr Pro Vai Ser Leu Lys Vai Ser Thr fisn Ser Thr Arg Gin Ser Leu 3S 40 45 cac tta caa tgg act gtc cac aac ctt cct tat cat cag gaa ttg aaa 192 240 357 240 357 His Leu Gin Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gin Glu Leu Lys 50 55 60 atg gta ttt cag ate cag ate agt agg att gaa aca tcc aat gtc ate Met Val Phe Gin Ile Gin Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 tgg gtg ggg aat tac age acc act gtg aag tgg aac cag gtt ctg cat Trp Vai Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gin Val Leu His 85 90 95 tgg age tgg gaa tet gaç ctc cct ttg gaa tgt gee aca cac ttt gta Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe Val 100 105 110 aga ata aag agt ttg gtg gac gat gee aag ttc cct gag cea aat ttc Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe 115 120 125 tgg age aac tgg agt tcc tgg gag gaa gtc agt gta caa gat tet act Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gin Asp Ser Thr 130 135 140 gga cag gat ata ttg ttc gtt ttc cct aaa gat aag ctg gtg gaa gaa Gly Gin Asp lie Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu Val Glu Glu 145 150 155 160 ggc aec aat gtt acc att tgt tac gtt tet agg aac att caa aat aat Gly Thr Asn Val Thr Ile Cys Tyr Val Ser Arg Asn ile Gin Asn Asn 165 170 175 gta tcc tgt tat ttg gaa ggg aaa cag att cat gga gaa caa ctt gat Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gin Ile His Gly Glu Gin Leu Asp 180 185 190 coa cat gta act gea ttc aac ttg aat agt gtg cct ttc att agg aat Pro His Val Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe Ile Arg Asn 195 200 205 aaa ggg aca aat ate tat tgt gag gea agt caa gga aat gtc agt gaa Lys Gly Thr Asn ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gin Gly Asn Val Ser Glu 210 215 220 ggc atg aaa ggc ate gtt Ctt ttt gtc tea aaa gta ctt gag gag ccc Gly Met Lys Gly ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro 225 230 235 240 aag gac ttt tet tgt gaa acc gag gac ttc aag act ttg cac tgt act Lys ASp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr 245 250 255 tgg gat cct ggg a cg gac act gee ttg ggg tgg tet aaa caa cct tcc Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gin Pro Ser 260 265 270 caa age tac act tta ttt gaa tea ttt tet ggg gaa aag aaa ctt tgt Gin Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys Leu Cys 275 280 285 aca cac aaa aac tgg tgt aat tgg caa ata act caa gac tea caa gaa Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gin Ile Thr Gin Asp Ser Gin Glu 238 336 334 432 480 528 576 624 672 720 768 816 864 912 358 290 235 300 acc tat aac ttc âcâ ctc ata gct gaa aat tac tta agg aag aga agt 960 Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser 305 310 315 320 gtc aat ate cct ttt aac ctg act cat cga gtt tat tta atg aat cct 1008 Vai Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro 325 330 335 ttt agt gtc aac ttt gaa aat gta aat gcc aca aat gcc ate atg acc 1056 Phe Ser Vai Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala tle tdet Thr 340 345 350 tgg aag gtg cac tcc ata agg aat aat ttc aca tat ttg tgt cag att 1104 Trp Lys Vai His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gin Ile 355 360 365 gaa ctc cat ggt gaa uga aaa atg atg caa tac aat gtt tcc ate aag 1152 Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gin Tyr Asn Val Ser Ile Lys 370 375 380 gtg aac ggt gag tac ttc tta agt gaa ctg gaa cct gcc aca gag tac 1200 Vai Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 335 390 395 400 atg gcg cga gta cgg tgt gct gat gcc age cac ttc tgg aaa tgg agt 1248 Met Ala Arg Val Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser 4C5 410 415 gaa tgg agt ggt Cág aac ttc acc aca ctt gaa gct gct ccc tea gag 1296 Glu Trp Ser Gly Gin Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu 420 425 430 gcc cct gat gtc tgg aga att gtg age ttg gag cca gga aat cat 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gat gtt ata ggc tat gtt gtg gac Leu Ser Trp Lys Pro Gin Pro Gly Asp Val Ile Gly Tyr Val Val Asp 545 550 555 560 tgg tgt gac cat acc cag gat gtg ctc ggt gat ttc cag tgg aag aat Trp Cys Asp His Thr Gin Asp Val Leu Gly Asp Phe Gin Trp Lys Asn 565 570 57S gta ggt ccc aat acc aca age aca gtc att age aca gat gct ttt agg Vai Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Val Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg 580 585 590 cca gga gtt cga tat gac ttc aga att tat ggg tta tct aca aaa agg Pro Gly Vai Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg 595 600 605 att gct tgt tta tta gag aaa aaa aca gga tac tct cag gaa ctt gct 11= Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gin Glu Leu Ala 610 615 620 cct tca gac aac cct cac gtg ctg gtg gat aca ttg aca tcc cac tcc Pro Ser Asp Asn Pro His Val Leu Val Asp Thr Leu Thr Ser His Ser 625 630 635 640 ttc act ctg agt tgg aaa gat tac tct act gaa tct caa cct ggt ttt Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gin Pro Gly Phe 645 650 65 5 ata caa ggg tac cat gtc tat ctg aaa tcc aag gcg agg cag tgc cac Ile Gin Gly Tyr His Vai Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gin Cys His 660 665 670 cca cga ttt gaa aag gca gtt ctt tca gat ggt tca gaa tgt tgc aaa Pro Arg Phe Glu Lys Ala Val Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys 675 680 685 tac aaa att gac aac ccg gaa gaa aag gca ttg att gtg gac aac cta Tyr Lys Ile Asp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Val Asp Asn Leu 690 695 700 aag cca gaa tcc ttc tat gag ttt ttc ate act cca ttc act agt gct Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala 705 710 715 720 ggt gaa ggc ccc agt gct acg ttc acg aag gtc acg act ccg gat gaa Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Glu 725 730 735 1680 Π28 1776 1824 1872 1920 1968 2016 2064 2112 2160 2208 2217 cac tcc tcg His Ser Set

<210> 69 <211> 739 <212> PRT <213> Homo sapiens 360 <400> 69 361

Met Ala Leu ?he Ala Vai Phe Gin Thr Thr Phe Phe Leu Thr Leu Leu 362 1 5 10 15 Ser Leu Arg Thr Tyr Gin Ser Glu Val Leu Ala Glu Arg Leu Pro Leu 20 25 30 Thr Pro Vai Ser Leu Lys Val Ser Thr Asn Ser Thr Arg Gin Ser Leu 35 40 45 His Leu Gin Trp Thr Val His Asn Leu Pro Tyr His Gin Glu Leu Lys 50 55 60 Met Vai Phe Gin Ile Gin Ile Ser Arg Ile Glu Thr Ser Asn Val Ile 65 70 75 80 Trp Vai Gly Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Trp Asn Gin Val Leu His 85 90 95 Trp Ser Trp Glu Ser Glu Leu Pro Leu Glu Cys Ala Thr His Phe val 100 105 110 Arg Ile Lys Ser Leu Val Asp Asp Ala Lys Phe Pro Glu Pro Asn Phe 115 120 125 Trp Ser Asn Trp Ser Ser Trp Glu Glu Val Ser Val Gin Asp Ser Thr 130 135 140 Gly Gin Asp Ile Leu Phe Val Phe Pro Lys Asp Lys Leu val Glu Glu 145 150 155 160 Gly Thr Asn Vai Thr ile Cys Tyr val Ser Arg Asn Ile Gin Asn Asn 165 170 175 Vai Ser Cys Tyr Leu Glu Gly Lys Gin Ile His Gly Glu Gin Leu Asp 180 185 190 Pro His Vai Thr Ala Phe Asn Leu Asn Ser Val Pro Phe I le Arg Asn 195 200 205 Lys Gly Thr Asn Ile Tyr Cys Glu Ala Ser Gin Gly Asn Val Ser Glu 210 215 220 Gly Met Lys Gly Ile Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro 225 230 235 240 Lys Asp Phe Ser Cys Glu Thr Glu Asp Phe Lys Thr Leu His Cys Thr 245 250 255 Trp Asp Pro Gly Thr Asp Thr Ala Leu Gly Trp Ser Lys Gin Pro Ser 260 265 270 Gin Ser Tyr Thr Leu Phe Glu Ser Phe Ser Gly Glu Lys Lys LeU Cys 275 280 285 Thr His Lys Asn Trp Cys Asn Trp Gin Ile Thr Gin Asp Ser Gin Glu 290 295 300 Thr Tyr Asn Phe Thr Leu Ile Ala Glu Asn Tyr Leu Arg Lys Arg Ser 305 310 315 320 Vai Asn Ile Leu Phe Asn Leu Thr His Arg Val Tyr Leu Met Asn Pro 325 330 335 Phe Ser Vai Asn Phe Glu Asn Val Asn Ala Thr Asn Ala Ile Met Thr 340 345 350 Trp Lys Vai His Ser Ile Arg Asn Asn Phe Thr Tyr Leu Cys Gin Ile 355 360 365 Glu Leu His Gly Glu Gly Lys Met Met Gin Tyr Asn val Ser Ile Lys 370 375 380 Vai Asn Gly Glu Tyr Phe Leu Ser Glu Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 385 390 395 400 Met Ala Arg Vai Arg Cys Ala Asp Ala Ser His Phe Trp Lys Trp Ser 405 410 415 Glu Trp Ser Gly Gin Asn Phe Thr Thr Leu Glu Ala Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ala Pro Asp Vai Trp Arg Ile Val Ser Leu Glu Pro Gly Asn His Thr 435 440 445 Vai Thr Leu Phe Trp Lys Pro Leu Ser Lys Leu His Ala Asn Gly Lys 450 455 460 Ile Leu Phe Tyr Asn Val Val Val Glu Asn Leu Asp Lys Pro Ser Ser 465 470 475 480 Ser Glu Leu His Ser Ile Pro Ala Pro Ala Asn Ser Thr Lys Leu Ile 485 4 90 495 363

Leu Asp Arg Cys Ser Tyr Gin Ile Cys Vai Ile Ala Asn Asn Ser Val 500 505 510 Gly Ala Ser Pro Ala Ser Vai Ile Vai Ile Ser Ala Asp Pro Glu Asn 515 520 525 Lys Glu Vai Glu Glu Glu Arg Ile Ala Gly Thr Glu Gly Gly Phê Ser 530 535 540 Leu Ser Trp Lys Pro Gin Pro Gly Asp Vai Ile Gly Tyr Val Val Asp 545 550 555 560 Trp Cys Asp His Thr Gin Asp Vai Leu Gly Asp Phe Gin Trp Lys Asn 565 570 575 Vai Gly Pro Asn Thr Thr Ser Thr Vai Ile Ser Thr Asp Ala Phe Arg 580 585 590 Pro Gly Vai Arg Tyr Asp Phe Arg Ile Tyr Gly Leu Ser Thr Lys Arg 595 600 605 Ile Ala Cys Leu Leu Glu Lys Lys Thr Gly Tyr Ser Gin Glu Leu Ala 610 615 620 Pro Ser Asp Asn Pro His Vai Leu Vai Asp Thr Leu Thr Ser His Ser 625 630 635 640 Phe Thr Leu Ser Trp Lys Asp Tyr Ser Thr Glu Ser Gin Pro Gly Phe 645 650 655 Ile Gin Gly Tyr His Vai Tyr Leu Lys Ser Lys Ala Arg Gin Cys His 660 665 670 Pro Arg Phe Glu Lys Ala Vai Leu Ser Asp Gly Ser Glu Cys Cys Lys 675 680 685 Tyr Lys Ile Ásp Asn Pro Glu Glu Lys Ala Leu Ile Vai Asp Asn Leu 690 695 700 Lys Pro Glu Ser Phe Tyr Glu Phe Phe Ile Thr Pro Phe Thr Ser Ala 105 710 715 720 Gly Glu Gly Pro Ser Ala Thr Phe Thr Lys Vai Thr Thr Pro Asp Glu 725 730 735 His Ser Ser

<210> 70 <211> 1557 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (1)...(1557) <400> 70 364 atg atg tgg acc tgg gea ctg tgg atg etc ccc tea etc tgc aaa ttc 48 Met Met Trp Thr Trp Alá Leu Trp Met Leu Pro Sér LeU Cys Lyâ Phe 1 5 10 15 age ctg gea gct ctg cca gct aag cct gag aac att tcc tgt gtc tac 96 Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Vai Tyr 20 25 30 tac tat agg aaa aat tta acc tgc act tgg agt cca gga aag gaa acc 144 Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35 40 45 agt tat acc cag tac aca gtt aag aga act tac gct ttt gga gaa aaa 192 Ser Tyr Thr Gin Tyr Thr Vai Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys 50 55 60 cat gat aat tgt aca acc aat agt tet aca agt gaa aat cgt gct teg 240 288 365 288 365 His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80 tgc tct ttt ttc ctt cca aga ata acg ate cca gat aat tat acc att Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr Ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile 85 90 95 gag gtg gaa gct gaa aat gga gat ggt gta att aaa tct cat atg aca Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr 100 105 110 tac tgg aga tta gag aac ata gcg aaa act gaa cca cct aag att ttc Tyr Trp Arg Leu Glu Asn Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe 115 120 125 cgt gtg aaa cca gtt ttg ggc ate aaa cga atg att caa att gaa tgg Arg Vai Lys Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gin Ile Glu Trp 130 135 140 ata aag cct gag ttg gcg cot gtt tea tct gat tta aaa tac aca ctt Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Ly3 Tyr Thr Leu 145 150 155 160 cga ttc agg aca gtc aac agt acc age tgg atg gaa gtc aac ttc gct Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu val Asn Phe Ala 165 170 175 aag aac cgt aag gat aaa aac caa acg tac aac ctc acg ggg ctg cag Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin 180 185 190 cct ttt aca gaa tat gtc ata gct ctg cga tgt gcg gtc aag gag tea Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser 195 200 205 aag ttc tgg agt çac tgg age caa gaa aaa atg gga atg act gag gaa Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu 210 215 220 gaa gct cca tgt ggc ctg gaa ctg tgg aga gtc ctg aaa cca gct gag Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240 gcg gat gga aga agg cca gtg cgg ttg tta tgg aag aag gea aga gga Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly 245 250 255 gcc cca gtc cta gag aaa aca ctt ggc tac aac ata tgg tac tat cca Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn Ile Trp Tyr Tyr Pro 2 60 265 270 gaa age aac act aac ctc aca gaa aca atg aac act act aac cag cag Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin 275 280 285 ctt gaa ctg cat ctg gga ggc gag age ttt tgg gtg tct atg att tct Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser 290 295 300 tat aat tct ctt ggg aag tct cca gtg gcc acc ctg agg att cca gct Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala 336 384 432 480 528 576 624 672 720 768 816 864 912 960 366 305 310 315 320 att caa gaa aaa tea ttt cag tgc att gag gtc atg cag gee tgc gtt 1008 Ile Gin Glu Lys Ser Phe Gin Cys Ile Glu vai Met Gin Ala Cys Val 325 330 335 gct gag gac cag cta gtg gtg aag tgg caa age tet gct cta gac gtg 1056 Ala Glu Asp Gin Leu Vai Vai Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val 340 345 350 aac act tgg atg att gaa tgg ttt ccg gat gtg gac tea gag ccc acc 1104 Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Vai Asp Ser Glu Pro Thr 355 360 365 acc ctt tcc tgg gaa tet gtg tet cag gee acg aac tgg acg ate cag 1152 Thr Leu Ser Trp Glu Ser Vai Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gin 370 375 380 caa gat aaa tta aaa cct ttc tgg tgc tat aac ate tet gtg tat cca 1200 Gin Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro 385 390 395 400 atg ttg cat gac aaa gtt ggc gag cca tat tcc ate cag gct tat gee 1248 Met Leu His Asp Lys Vai Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr Ala 405 410 415 aaa gaa ggc gtt cca tea gaa ggt cct gag acc aag gtg gag aac att 1296 Lys Glu Gly Vai Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile 420 425 430 ggc gtg aag aeg gte acg ate aca tgg aaa gag att cee aag agt gag 1344 Gly Vai Lys Thr Vai Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu 435 440 445 aga aag ggt ate ate tgc aac tac acc ate ttt tac caa gct gaa ggt 1392 Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gin Ala Glu Gly 450 455 460 gga aaa gga ttc tcc aag aca gtc aat tcc age ate ttg cag tac ggc 1440 Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Vai Asn Ser Ser Ile Leu Gin Tyr Gly 465 470 475 480 ctg gag tcc ctg aaa cga aag acc tet tac att gtt cag gtc atg gee 1488 Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr Ile Vai Gin Val Met Ala 485 490 495 age acc agt gct ggg gga acc aac gg g acc age ata aat ttc aag aca 1536 Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr 500 505 510 ttg tea ttc agt gtc ttt gag 1557 Leu Ser Phe Ser Vai Phe Glu 515

<210> 71 <211> 519 <212> PRT 367 <213> Homo sapiens <400> 71 368

Met Met Trp Thr Trp Ala Leu Trp Met Leu Pro Ser Leu Cys Lys Phe 1 5 10 15 Ser Leu Ala Ala Leu Pro Ala Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Tyr 20 25 30 Tyr Tyr Arg Lys Asn Leu Thr Cys Thr Trp Ser Pro Gly Lys Glu Thr 35 40 45 Ser Tyr Thr Gin Tyr Thr Val Lys Arg Thr Tyr Ala Phe Gly Glu Lys 50 5S 60 His Asp Asn Cys Thr Thr Asn Ser Ser Thr Ser Glu Asn Arg Ala Ser 65 70 75 80 Cys Ser Phe Phe Leu Pro Arg Ile Thr ile Pro Asp Asn Tyr Thr Ile 85 90 95 Glu Val Glu Ala Glu Asn Gly Asp Gly Val Ile Lys Ser His Met Thr 100 105 110 Tyr Trp Arg Leu Glu Asn lie Ala Lys Thr Glu Pro Pro Lys Ile Phe 115 120 125 Arg Val Lys Pro Val Leu Gly Ile Lys Arg Met Ile Gin Ile Glu Trp 130 135 140 Ile Lys Pro Glu Leu Ala Pro Val Ser Ser Asp Leu Lys Tyr Thr Leu 145 150 155 160 Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Thr Ser Trp Met Glu Val Asn Phe Ala 165 170 175 Lys Asn Arg Lys Asp Lys Asn Gin Thr Tyr Asn Leu Thr Gly Leu Gin 180 185 190 Pro Phe Thr Glu Tyr Val Ile Ala Leu Arg Cys Ala Val Lys Glu Ser 195 200 205 Lys Phe Trp Ser Asp Trp Ser Gin Glu Lys Met Gly Met Thr Glu Glu 210 215 220 Glu Ala Pro Cys Gly Leu Glu Leu Trp Arg Val Leu Lys Pro Ala Glu 225 230 235 240 Ala Asp Gly Arg Arg Pro Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly 245 250 255 Ala Pro Val Leu Glu Lys Thr Leu Gly Tyr Asn ile Trp Tyr Tyr Pro 2 60 265 270 Glu Ser Asn Thr Asn Leu Thr Glu Thr Met Asn Thr Thr Asn Gin Gin 275 280 285 Leu Glu Leu His Leu Gly Gly Glu Ser Phe Trp Val Ser Met Ile Ser 290 295 300 Tyr Asn Ser Leu Gly Lys Ser Pro Val Ala Thr Leu Arg Ile Pro Ala 305 310 315 320 Ile Gin Glu Lys Ser Phe Gin Cys Ile Glu Val Met Gin Ala Cys Val 325 330 335 Ala Glu Asp Gin Leu Val Val Lys Trp Gin Ser Ser Ala Leu Asp Val 340 345 350 Asn Thr Trp Met Ile Glu Trp Phe Pro Asp Val Asp Ser Glu Pro Thr 355 360 365 Thr Leu Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Ala Thr Asn Trp Thr Ile Gin 370 375 380 Gin Asp Lys Leu Lys Pro Phe Trp Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro 385 390 395 400 Met Leu His Asp Lys Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr Ala 405 410 415 Lys Glu Gly Val Pro Ser Glu Gly Pro Glu Thr Lys Val Glu Asn Ile 420 425 430 Gly val Lys Thr Val Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Glu 435 440 445 Arg Lys Gly Ile Ile Cys Asn Tyr Thr Ile Phe Tyr Gin Ala Glu Gly 450 455 460 Gly Lys Gly Phe Ser Lys Thr Val Asn Ser Ser Ile Leu Gin Tyr Gly 465 470 475 430 Leu Glu Ser Leu Lys Arg Lys Thr Ser Tyr lie Val Gin Val Met Ala 369 485 490 495

Ser Thr Ser Ala Gly Gly Thr Asn Gly Thr Ser Ile Asn Phe Lys Thr 500 505 510

Leu Ser Phe Ser Vai Phe Glu 515

<210> 72 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Etiqueta de péptido His C-terminal <400>72

Gly Ser Gly Gly Hia His His His His His 15 10

<210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Espaçador Gly-Ser de 12 aminoácidos <400> 73

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu Fro Arg Ser 15 10

<210> 74 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial 370 <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41557 <400> 74 ttatagatct cgaggagtgt tcatccggag t 31

<210> 75 <211> 65 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC29232 <400> 75 cgactgactc gagtcagtga tggtgatggt gatggccacc tgatccttta cccggagaca 60 gggag 65

<210> 76 <211> 3196 <212> ADN <213> Mus musculus <400> 76 371 tgtatgtctg cacagtttgt gtatgcctgg tgcccacaga ggctcgagag tgtcagattc 60 cccccaaaac tggagttaca gttttgagec gccccatgct tgatagcaat caaacctggg 120 tcctctgaaa gagcatceag tgcatgtaac cactgaacca tctctccaaa ccatgaacat 180 cactttaatt ttttttaata gttaaaggat attttgattc taaagatgta aaagaacgtc 240 tcacctattt tgaaatttgg taataaatgt ttcttcaaag cttaaaaaaa ttagttcagg 300 tttttttttt ttttcagtca gtgatttgct aagctgccca aactggctta gaatttgtga 360 ccctcttgtc tcagcatact gagtgttaag attacaagtg caccccctac ccagttccca 420 taattaactg atccaccccc acccccatcc caccccactc ccattgcctg ggcaagtaac 480 tcttgagccc cattctggtt ctagagtctg aagtcacaaa ggtgcaggtg agaacgcaag 540 gacaagggca ggccctggag cacagatgcc ttctccttat gocttccctg tgttcactag 600 agccatcccc ctgcctccgg aattcccaca gatggatcgc tctgtggctt cttaaaactt 660 ccctgcaggg cactgaccct cagcccctct aagtcacttc ttccccagtg attgtacttt 720 tcaatcgggc ttcaaacttt cctctcatta aatcagcaag cactttccaa gaaaagagag 780 atgctcaaga tgccttcctg tgtggtatgt gtatgcgttt gtgtgtgtgc acgcatgtgt 840 gtgcatgtga ctcaatcttc tgccttgcct tgagggtaac ctcagcattt ccttccagcc 900 ctgctttccc caggccgagc cgaggctggc aaccttttga aaatgttttc tggagaaaag 960 ctgagcaatg gttttgccat gggcgggcct ttgatctgct tcctcatgac aaccctttat 1020 atattgcctg gtggccatgg cgaacacacc aggctccaga gaccacaggc aaagcgggcc 1080 ttcctcactc tcttaccgtc gccatgatct tccacacagg taccgctggc tccacacgca 1140 gctcagcatg gcttcagctc catggctctt atcatgttag gggaaggagc cgggaatggc 1200 tgcctcaggt ggttgctgga cagaggctgt tgtaactgaa gctgggatgg gcaggggcat 1260 ctgacctatc agctccatgg tatccttctt tttctccagg aacaacgaag cctaccctgg 1320 tgctgctttg ctgtatagga acctggctgg ccacctgcag cttgtccttc ggtgccccaa 1330 tatcgaagga agacttaaga actacaattg acctcttgaa acaagagtct caggatcttt 1440 ataacaacta tgtaagtgcc cttgagattg ttttttctta accatttctt taaaatgtct 1500 tattttgcta tctaagcaca gctatccttt ctcgatataa agccagctat ggaagccaga 1560 gaggcatggg gaaacattgg aattcggttg gggtgaaatg tttccaaggg ggtaaatgca 1620 ctagcagaag aggcagaggc agactggtcc agggactgaa accttggcag cttacgaaac 1680 actacaggat gtatgctccc tgaattcttt atctcaaatc cacccggctc acagtcccta 1740 ctaaacgagc attcttgctg aaagggcatc cttagagaag ggccagcttg attcaggaat 1800 cccccaagag caatgagagc cagtttcagc agccaaagat gtcctagtgg aaqcaggqtg 1860 tgaggatctt cctttgggtc tccgttgact aactaggcaa ctgtctgtgt gttcttggag 1920 catcctggag ggccctctgc ctggccagag cctggcacag gtacagcaca ggacccagaa 1980 agtgtgaata cttcatttcc ttgggaccgc ttagataact tcagttgaag caagtaacag 2040 ggaaactgat ggagacacag ataacctccc tgcccctctc acttcagtca ctgagcctcc 2100 gagaacaggt tgcagatggc taggggcagc ctcagccaga taggcggagg cagactgggt 2160 agaagcatcc ttaggaacca cggccaacct gggtgggtat gccatgtctt ctagctcata 2220 agccaactag accttcgatt cctgtagaca cagagttagt gatggcccaa gcttcagaag 2280 gttgttgtac caattagata aggtctgagg caggctagac acagaggaag ccctggaaat 2340 gagctgttct gagctgtagg gttgttacaa atgtcttcct tacaatattt caaacctcct 2400 ctttctacag agcataaagc aggcatctgg gatgtcagca gacgaatcaa tacagctgcc 2460 gtgtttcagc ctggaccggg aagcattaac caacatctcg gtcatcatag cacatctgga 2520 gaaagtcaaa gtgttgagcg agaacacagt agatacttct tgggtgataa gatggctaac 2580 aaacatcagc tgtttcaacc cactgaattt aaacatttct gtgcctggaa atactgatga 2640 atcctatgat tgtaaagtgt tcgtgcttac ggttttaaag cagttctcaa actgcatggc 2700 agaactgcag gctaaggaca atactacatg ctgagtgatg ggçggggggg ggtgcagtgt 2760 cctcagcagt gcctgtcctt cgagggctga gcttgcaacc caggacttaa ctccaaaggg 2820 actgtgcggt cattactagt catgttattt atgtttttat tttgtccact gaaatcttgt 2880 tctgctaccc tgtagggact ggaagtggca gctatattta tttatttatg tactgagttt 2940 gttaacgctc catggaggag ççttçagagt ctatttaata aattatattg acatgatcac 3000 ataatcagtt ttggaatttg tgatggggtt gaaatcaaag attaggaatg ttctggaaat 3060 agtttatgct accctctccc tccattagac agactcatga gcaaataatc ccagcagcat 3120 cacgtgcatg ataaacatct ttgttccagg tcataagtac aatcactgtc cttttggtat 3180 gtaggctgga aactaa 3196 <210> 77 <211> 24 372 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC28575 <400> 77 ccaggaaagg aaaccagtta tacc 24 <210> 78 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC21195 <400> 78 gaggagacca taacccccga cag 23 <210> 79 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC21196 <400> 79 catagctccc accacacgat ttt 23 <210> 80 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 373 <223> Iniciador oligonucleotídico ZC26358 <400> 80 aaaaccaaac gtacaacctc acggg 25 <210> 81 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC26359 <400> 81 gagcagccat acaccagagc agaca 25 <210> 82 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC29179 <400> 82 gcagggttgg gaacggtgg 19 <210> 83 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 374 <223> Iniciador oligonucleotidico ZC28917 <400> 83 tgcaagatgc tggaattgac 20

<210> 84 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC28916 <400> 84 agtcaattcc agcatcttgc 20

<210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC28918 <400> 85 tcacagagtc atcagactcc 20

<210> 86 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41498 375 <4Ο0> 86 ggctccagag accacagg 18

<210> 87 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41496 <400> 87 atgactagta atgaccgcac ag 22

<210> 88 <211> 39 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41583 <400> 88 cgtacgggcc ggccaccatg atcttccaca caggaacaa 39

<210> 89 <211>36 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41584 <400> 89 tgacgaggcg cgcctcagca tgtagtattg tcctta 36 376 <210> 90 <211> 650 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (53) . . . (542) <4 0 0> 90 58 377 ggctccagag accacaggca aagcgggcct tcctcactct cttaccgtcg cc atg ate

Met Ile 1 ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg ctt tgc tgt ata Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys Cys Ile 5 10 15 gga acc tgg ctg gee acc tgc age ttg tcc ttc ggt gee cca ata teg Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro Ile Ser 20 25 30 aag gaa gac tta aga act aca att gac etc ttg aaa caa gag tet cag Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu Ser Gin 35 40 45 50 gat ctt tat aac aac tat age ata aag cag gea tet ggg atg tea gea Asp LeU Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met Ser Ala 55 60 65 gac gaa tea ata cag ctg ccg tgt ttc age ctg gac cgg gaa gea tta Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu Ala Leu 70 75 80 acc aac ate teg gtc ate ata gea cat ctg gag aaa gtc aaa gtg ttg Thr Asn Ile Ser val ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys val Leu 85 90 95 age gag aac aca gta gat act tet tgg gtg ata aga tgg cta aca aac Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val Ile Arg Trp Leu Thr Asn 100 105 110 ate age tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tet gtg cct gga aat Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn lie Ser Val Pro Gly Asn 115 120 125 130 act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt tta aag

Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Vai Phe Vai Leu Thr vai Leu Lys 135 140 145 cag ttc tea aac tgc atg gea gaa ctg cag gct aag gac aat act aca

Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn Thr Thr 150 155 160 tgc t gagtgatggg gggggggtgc agtgtcctca gcagtgcctg tccttcgagg Cys gctgagcttg caacccagga cttaactcca aagggactgt gcggtcatta ctagtcat

<210> 91 <211>163 <212> PRT 106 154 202 250 298 346 394 442 490 538 592 650 378 <213> Mus musculus <400> 91

Met Ile Phe Hls Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Vai Leu Leu Cys 1 5 10 15 cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser phe Gly Ala Pro 20 25 30 Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu 35 40 45 Ser Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met 50 55 60 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 10 75 80 Ala Leu Thr Asn Ile Ser Vai Ile ile Ala His Leu Glu Lys Vai Lys 85 90 95 Vai Leu Ser Glu Asn Thr Vai Asp Thr Ser Trp vai lie Arg Trp Leu 100 105 110 Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Vai Pro 115 120 125 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Vai Phe Vai Leu Thr Vai 130 135 140 Leu Lys Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 Thr Thr Cys

<210> 92 <211> 511 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de ADNc murino clonado (SEQ ID NO: 90) com locais de restrição Fsel e Asei e uma sequência Kozak parcial à grelha de leitura aberta e codão de terminação <400> 92 379 ggccggccac catgatcttc cacacaggaa caacgaagcc taccctggtg ctgctttgct 60 gtataggaac ctggctggcc acctgcagct tgtccttcgg tgccccaata tcgaaggaag 120 acttaagaac tacaattgac ctcttgaaac aagagtctca ggatctttat aacaactata 180 gcataaagca ggcatctggg atgtcagcag acgaatcaat acagctgccg tgtttcagcc 240 tggaccggga agcattaacc aacatctcgg tcatcatagc acatctggag aaagtcaaag 300 tgttgagcga gaacacagta gatacttctt gggtgataag atggctaaca aacatcagct 360 gtttcaaccc actgaattta aacatttctg tgcctggaaa tactgatgaa tcctatgatt 420 gtaaagtgtt cgtgcttacg gttttaaagc agttctcaaa ctgcatggca gaactgcagg 480 ctaaggacaa tactacatgc tgaggcgcgc c 511

<210> 93 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC41438 <400> 93 gccatggcct ctcactcagg c 21

<210> 94 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC41437 <400> 94 ccagggagca ttgacaactc ttag 24

<210> 95 <211> 516 <212> ADN <213> Sequência artificial 380 <220> <223> Polinucleótido de zCytorl7Lig-CEE humano

<221> CDS <222> (1) ... (516) <400> 95

atg gcc tct cac tca ggc ccc tcg acg tct gtg ctc ttt ctg ttc tgc 48 Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Val Leu Phe Leu Phe Cys 1 5 10 15 tgc ctg gga ggc tgg ctg gcc tcc cac acg ttg ccc gtc cgt tta cta 96 Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser His Thr Leu Pro Val Arg Leu Leu 20 25 30 cga cca agt gat gat gta cag aaa ata gtc gag gaa tta cag tcc ctc 144 Arg Pro Ser Asp Asp Vai Gin Lys lie Val Glu Glu Leu Gin Ser Leu 35 40 45 tcg aag atg ctt ttg aaa gat gtç gag gaa gag aag ggc gtg ctc gtg 192 Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Val Glu Glu Glu Lys Gly Val Leu Val 50 55 60 tcc cag aat tac acg Ctg ccg tgt ctc age cct gac gcc cag ccg cca 240 Ser Gin Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gin Pro Pro 65 70 75 80 aac aac ate cac age cca gcc ate cgg gea tat ctc aag aca ate aga 288 Asn Asn lie His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr Ile Arg 85 90 95 cag cta gac aac aaa tct çtt att gat gag ate ata gag cac Ctc gac 336 Gin Leu Asp Asn Lys Ser Vai Ile Asp Glu Ile Ile Glu His Leu Asp 100 105 110 aaa ctc ata ttt caa gat gea cca gaa aca aac att tct gtg cca aca 384 Lys Leu lie Phe Gin Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Val Pro Thr 115 120 125 gac acc cat gaa tgt aaa ege ttc ate ctg act att tct caa cag ttt 432 Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gin Gin Phe 130 135 140 tca gag tgc atg gac ctc gea cta aaa tca ttg acc tct gga gcc caa 480 Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gin 145 150 155 160 cag gcc acc act gaa gaa tac atg ccg atg gaa taa 516 Gin Ala Thr Thr Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu A 165 170 <210> 96 381

<211> 171 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Polipéptido de zCytor17Lig-CEE humano <400> 96

Met Ala Ser His Ser Gly Pro Ser Thr Ser Vai Leu Phe Leu Phe Cys 1 5 10 15 Cys Leu Gly Gly Trp Leu Ala Ser his Thr Leu Pro Vai Arg Leu Leu 20 25 30 Arg Pro Ser Asp Asp Vai Gin Lys Ile Vai Glu Glu Leu Gin Ser Leu 35 40 45 Ser Lys Met Leu Leu Lys Asp Vai Glu Glu Glu Lys Gly Vai Leu Vai 50 55 60 Ser Gin Asn Tyr Thr Leu Pro Cys Leu Ser Pro Asp Ala Gin Pro Pro 65 70 75 80 Asn Asn Ile His Ser Pro Ala Ile Arg Ala Tyr Leu Lys Thr lie Arg 85 90 95 Gin Leu Asp Asn Lys Ser Vai Ile Asp Glu Ile lie Glu His Leu Asp 100 105 110 Lys Leu Ile Phe Gin Asp Ala Pro Glu Thr Asn Ile Ser Vai Pro Thr 115 120 125 Asp Thr His Glu Cys Lys Arg Phe Ile Leu Thr Ile Ser Gin Gin Phe 130 135 140 Ser Glu Cys Met Asp Leu Ala Leu Lys Ser Leu Thr Ser Gly Ala Gin 145 150 155 160 Gin Ala Thr Thr Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 165 170

<210> 97 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZCZC41607 <400> 97 tccagggaat tcatataggc cggccaccat ggcctctcac tcaggcccc 49 382

<210> 98 <211> 82 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZCZC41605 <400> 98 caaccccaga gctgttttaa ggcgcgcctc tagattatta ttccatcggc atgtaCtctt 60 cagtggtggc ctgttgggct cc 82 <210> 99 <211> 629 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (28) í . . . (528) <400> 99 383 aaccccttgg aggaccagaa cgagaca atg gtt ctt gcc age tet acc acc age 54

Met Vai Leu Ala Set Set Thr Tht Ser 1 5 ate ca c acc atg ctg etc ctg ctc ctg atg ctc ttc cac ctg gga ctc 102 Ile His Thr Met Leu Leu Leu Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly Leu 10 15 20 25 caa gct tea ate agt ggc cgg gat acc cac cgt tta acc aga acg ttg 150 Gin Ala Ser Ile Ser Gly Arg Asp Thr His Arg Leu Thr Arg Thr Leu 30 35 40 aat tgc age tet att gtc aag gag att ata ggg aag ctc cca gaa cct 198 Asn Cys Ser Set Ile Val Lys Glu lie Ile Gly Lys Leu Pro Glu Pro 45 50 55 gaa etc aaa act gat gat gaa gga ccc tet etg agg aat aag age ttt 246 Glu Leu Lys Thr Asp Asp Glu Gly Pro Ser Leu Arg Ash Lys Ser Phe 60 65 10 cgg aga gta aac ctg tcc aaa ttc gtg gaa age caa gga gaa gtg gat 294 Arg Arg Val Asn Leu Ser Lys Phe Val Glu Ser Gin Gly Glu Val Asp 15 80 85 cct gag gac aga tac gtt ate aag tcc aat ctt cag aaa ctt aac tgt 342 Pro Glu Asp Arg Tyr Val Ile Lys Ser Asn Leu Gin Lys Leu Asn Cys 90 95 100 105 tgc ctg cct aca tet gcg aat gac tet gcg ctg cca ggg gtc ttc att 390 Cys Leu Pro Thr Ser Ala Asn Asp Ser Ala Leu Pro Gly Val Phe Ile 110 115 120 cga gat ctg gat gac ttt cgg aag aaa ctg aga ttc tac atg gtc cac 438 Arg Asp Leu Asp Asp Phe Arg Lys Lys Leu Arg Phe Tyr Met Val His 125 130 135 ctt aac gat ctg gag aca gtg cta acc tet aga cca cct cag ccc gea 436 Leu Asn Asp Leu Glu Thr Val Leu Thr Ser Arg Pro Pro Gin Pro Ala 140 145 150 tet ggc tcc gtc tet cct aac cgt gga acc gtg gaa tgt taa 528 Ser Gly Ser Val Ser Pro Asn Arg Gly Thr Val Glu Cys * 155 160 165 aacagcaggc agagcaccta aagtctgaat gttcctcatg gcccatggtc aaaaggattt 588 tacattcctt tatgccatca aatgtcttat caatttatct a 629

<210> 100 <211> 166 <212> PRT <213> Mus musculus 384 <4 Ο 0> 100

Met Vai Leu Ala Ser Ser Thr Thr 1 5 Leu Leu Met Leu Phe His Leu Gly 20 Asp Thr His Arg Leu Thr Arg Thr 35 40 Glu Ile Ile Gly Lys Leu Pro Glu 50 55 Gly Pro Ser Leu Arg Asn Lys Ser 65 70 Phe Vai Glu Ser Gin Gly Glu Vai 85 Lys Ser Asn Leu Gin Lys Leu Asn 100 Asp Ser Ala Leu Pro Gly Vai Phe 115 120 Lys Lys Leu Arg Phe Tyr Met Vai 130 135 Leu Thr Ser Arg Pro Pro Gin Pro 145 150 Arg Gly Thr Vai Glu Cys 165

Ser Ile 10 His Thr Met Leu Leu 15 Leu Leu 25 Gin Ala Ser Ile Ser 30 Gly Arg Leu Asn Cys Ser Ser 45 Ile Vai Lys Pro Glu Leu Lys 60 Thr Asp Asp Glu Phe Arg Arg 75 Vai Asn Leu Ser Lys 80 Asp Pro 90 Glu Asp Arg Tyr Vai 95 lie Cys 105 Cys Leu Pro Thr Ser 110 Ala Asn lie Arg Asp Leu Asp 125 Asp Phe Arg His Leu Asn Asp 140 Leu Glu Thr Vai Ala Ser Gly 155 Ser Vai Ser Pro Asn 160 <210> 101 <211> 674 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (10) . . .. (464) <4 0 0> 101 385 gatccaaac atg age ege ctg ccc gtc ctg etc ctg etc caa etc ctg gtc 51 Met Ser Arg Leu Pro Vai Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Vai 15 10 ege ccc gga etc caa gct ccc atg acc cag aca acg tcc ttg aag aca 99

Arg Pro Gly Leu Gin Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr 15 20 25 30 age tgg gtt aac tgc tet aac atg ate gat gaa att ata aca cac tta 147 Ser Trp Vai Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu 35 40 45 aag cag çca cct ttg cct ttg ctg gac ttc aac aac ctc aat ggg gaa 195 Lys Gin Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu 50 55 60 gac caa gac att ctg atg gaa aat aac ctt cga agg cca aac ctg gag 243 Asp Gin Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu 65 70 75 gea ttc aac agg gct gtc aag agt tta cag aac gea tea gea att gag 291 Ala Phe Asn Arg Ala Vai Lys Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala Ile Glu 80 85 90 age att ctt aaa aat etc ctg cca tgt ctg ccc ctg gee acg gee gea 339 Ser Ile Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala 95 100 105 110 ccc acg cga cat cca ate cat ate aag gac ggt gac tgg aat gaa ttc 387 Pro Thr Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe 115 120 125 cgg agg aaa ctg acg ttc tat ctg aaa acc ctt gag aat gcg cag gct 435 Arg Arg Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala 130 135 140 caa cag acg act ttg age etc gcg ate tt ttagtccaac gtccagctcg 484 Gin Gin Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile 145 150 ttctctgggc cttctcacca cagcgcctcg ggacatcaaa aacagcagaa cttctgaaac 544 ctctgggtca tctctcacac attccaggac cagaagcatt tcaccttttc ctgcggcatc 604 agatgaattg ttaattatct aatttctgaa atgtgcagct cccatttggc cttgtgcggt 664 tgtgttctca 604

<210> 102 <211> 151 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 102 386

Met Ser Arg Leu Pro Vai Leu Leu Leu Leu Gin Leu Leu Vai Arg Pro 1 5 10 15 Gly Leu Gin Ala Pro Met Thr Gin Thr Thr Ser Leu Lys Thr Ser Trp 20 25 30 Vai Asn Cys Ser Asn Met Ile Asp Glu Ile Ile Thr His Leu Lys Gin 35 40 45 Pro Pro Leu Pro Leu Leu Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gly Glu Asp Gin 50 55 60 Asp Ile Leu Met Glu Asn Asn Leu Arg Arg Pro Asn Leu Glu Ala Phe 65 70 75 80 Asn Arg Ala Vai Lys Ser Leu Gin Asn Ala Ser Ala ile Glu Ser Ile 85 90 95 Leu Lys Asn Leu Leu Pro Cys Leu Pro Leu Ala Thr Ala Ala Pro Thr 100 105 110 Arg His Pro Ile His Ile Lys Asp Gly Asp Trp Asn Glu Phe Arg Arg 115 120 125

Lys Leu Thr Phe Tyr Leu Lys Thr Leu Glu Asn Ala Gin Ala Gin Gin 130 135 140

Thr Thr Leu Ser Leu Ala Ile 145 150

<210>103 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Etiqueta de péptido Glu-Glu (CEE) alternativo sem par de resíduo Gly-Ser <400> 103

Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5

<210> 104 <211> 513 <212> ADN <213> Sequência artificial 387 <220> <223> Polinucleótido de zCytorl7Lig(m)-CEE de ratinho <221> CDS <222> (1) ... (513) <400>104 388 48 atg ate ttc cac aca gga aca acg aag cct acc ctg gtg ctg Ctt tgc Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Val Leu Leu Cys 1 5 10 15 tgt ata gga acc tgg ctg gee acc tgc age ttg tcc ttc ggt gee cca Cys Ile Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro 20 25 30 ata teg aag gaa gac tta aga act aca att gac ctc ttg aaa caa gag Ile Ser Lys GIu Asp Leu Arg Thr Thr Ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu 35 40 45 tct cag gat ctt tat aac aac tat age ata aag cag gca tct ggg atg Ser Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met 50 55 60 tca gca gac gaa tca ata cag ctg ceg tgt ttc age ctg gac cgg gaa Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 gca tta acc aac ate teg gtc ate ata gca cat ctg gag aaa gtc aaa Ala Leu Thr Asn lie Ser Val Ile Ile Ala His Leu Glu Lys Val Lys 85 90 95 gtg ttg age gag aac aca gta gat att tct tgg gtg ata aga tgg cta Val Leu Ser Glu Asn Thr Val Asp Thr Ser Trp Val ile Arg Trp Leu 100 105 110 aca. aac ate age tgt ttc aac cca ctg aat tta aac att tct gtg cct

Thr Asn Ile Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Val Pro 115 120 125 gga aat act gat gaa tcc tat gat tgt aaa gtg ttc gtg ctt acg gtt Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys Val Phe Val LêU Thr val 130 135 140 tta aag cag ttc tca aac tgc atg gca gaa ctg cag gct aag gac aat Leu Lys Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 act aca tgc gaa gaa tac atg ccg atg gaa tga Thr Thr Cys Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu ★ 165 170 <210> 105 <211> 170 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 389 <223> Polinucleótido de zCytorl7Lig(m) -CEE de ratinho <400> 105

Met Ile Phe His Thr Gly Thr Thr Lys Pro Thr Leu Vai Leu Leu Cys 1 5 10 15 Cys lie Gly Thr Trp Leu Ala Thr Cys Ser Leu Ser Phe Gly Ala Pro 20 25 30 Ile Ser Lys Glu Asp Leu Arg Thr Thr ile Asp Leu Leu Lys Gin Glu 35 40 45 Ser Gin Asp Leu Tyr Asn Asn Tyr Ser Ile Lys Gin Ala Ser Gly Met 50 55 60 Ser Ala Asp Glu Ser Ile Gin Leu Pro Cys Phe Ser Leu Asp Arg Glu 65 70 75 80 Ala Leu Thr Asn Ile Ser Vai lie Ile Ala His Leu Glu Lys Vai Lys 85 90 95 Vai Leu Ser Glu Asn Thr Vai Asp Thr Ser Trp Vai Ile Arg Trp Leu 100 105 110 Thr Asn lie Ser Cys Phe Asn Pro Leu Asn Leu Asn Ile Ser Vai Pro 115 120 125 Gly Asn Thr Asp Glu Ser Tyr Asp Cys Lys vai Phe Vai Leu Thr val 130 135 140 Leu Lys Gin Phe Ser Asn Cys Met Ala Glu Leu Gin Ala Lys Asp Asn 145 150 155 160 Thr Thr Cys Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 165 170 <210> 106 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 106 tccagggaat tcatataggc cggccaccat gatcttccac acaggaaca 49 <210> 107 <211> 85 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 390 <223> Iniciador oligonucleotidico ZC41641 <400> 107 caaccccaga gctgttttaa ggcgçgcctc tagattatca ttccatcggc atgtattctt 60 cgcatgtagt attgtcctta gcctg 85 <210> 108 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC38.239 <400> 108 accaactaaa ccagaaaac 19 <210> 109 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico ZC38.245 <400> 109 ctgttgacag ttctgaaccg 20 <210> 110 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial 391 <220> <223> Iniciador oligonucleotídico ZC38.238 <4 0 0> 110 cgcggtttcc attgtatctg 20

<210> 111 <211> 2748 <212> ADN <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (237) . . . (2222) <400> 111 392 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt 60 ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180 tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggqcagg tgagctctga ggaagc atg 239

Met 1 393 ctg age age cag aag gga tcc tgc age cag gaa cca ggg gea gee cac 287 Leu Ser Ser Gin Lys Gly Ser Cys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala His 5 10 15 gtc cag cct ctg ggt gtg aac gct gga ata atg tgg acc ttg gea ctg 335 Vai Gin Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly Ile Met Trp Thr Leu Ala Leu 20 25 30 tgg gea ttc tet ttc etc tgc aaa ttc age ctg gea gtc ctg ccg act 383 Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro Thr 35 40 45 aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act 431 Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu Thr 50 55 60 65 tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc age tac att gtg 479 Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ile Val 70 75 80 act ttg act tac tcc tat gga aaa age aat tat agt gac aat gct aca 527 Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala Thr 85 90 95 gag gct tea tat tet ttt ccc cgt tcc tgt gea atg ccc cca gac ate 575 Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp Ile 100 105 110 tgc agt gtt gaa gta caa gct caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tet 623 Cys Ser Val Glu Val Gin Ala Gin Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys Ser 115 120 125 gac ate aca tat tgg cat tta ate tcc ata gea aaa acc gaa cca cct 671 Asp Ile Thr Tyr Trp Kis Leu lie Ser Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro 130 135 140 145 ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa 719 Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn Arg Met Phe Gin Ile Gin 150 155 160 tgg aaa ccg cgt gaa aag act cgt ggg ttt cct tta gta tgc atg ctt 767 Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met Leu 165 170 175 cgg ttc aga act gtc aac agt age ege tgg acg gaa gtc aat ttt gaa 815 Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe Glu ISO 185 190 aac tgt aaa cag gtc tgc aac ctc aca gga ctt cag gct ttc aca gaa Asn Cys Lys Gin Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gin Ala Phe Thr Glu 195 200 205 tat gtc ctg gct cta cga ttc agg ttc aat gac tea aga tat tgg age Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp Ser 210 215 220 225 aag tgg age aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro His 230 235 240 gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gea gac atg aac gga gac 1007 394

Val Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly Asp 245 250 255 agg aag gtg cga ttg ctg tgg aag aag gea aga gga gcc ccc gtc ttg 1055 Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu 260 265 270 gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gea gag aac age act 1103 Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gin Tyr Phe Ala Glu Asn Ser Thr 275 280 285 aac ctc aca gag ata aac aac ate acc acc cag cag tat gaa ctg ctt 1151 Asn Leu Thr Glu He Asn Asn Ile Thr Thr Gin Gin Tyr Glu Leu Leu 290 295 300 305 ctg atg age cag gea cac tet gtg tcc gtg act tet ttt aat tet ctt 1199 Leu Met Ser Gin Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser Leu 310 315 320 ggc aag tcc caa gag acc ate ctg agg ate cca gat gtc cat gag aag 1247 Gly Lys Ser Gin Glu Thr ile Leu Arg Ile Pro Asp Val His Glu Lys 325 330 335 acc ttc cag tac att aag age atg cag gcc tac ata gcc gag ccc ctg 1295 Thr Phe Gin Tyr Ile Lys Ser Met Gin Ala Tyr Ile Ala Glu Pro Leu 340 345 350 ttg gtg gtg aac tgg caa age tcc att cct gcg gtg gac act tgg ata 1343 Leu Val Val Asn Trp Gin Ser Ser Ile Pro Ala Val Asp Thr Trp Ile 355 360 365 gtg gag tgg ctc cca gaa gct gcc atg teg aag ttc cct gcc ctt tcc 1391 Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu Ser 370 375 380 385 tgg gaa tet gtg tet cag gtc acg aac tgg acc ate gag caa gat aaa 1439 Trp Glu Ser Val Ser Gin Val Thr Asn Trp Thr Ile Glu Gin Asp Lys 390 395 400 cta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tea gtg tat cca gtg ttg gga 1487 Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Val Leu Gly 405 410 415 cac cga gtt gga gag ccg tat tea ate caa gct tat gcc aaa gaa gga 1535 His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 act cca tta aaa ggt cct gag acc agg gtg gag aac ate ggt ctg agg 1583 Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ile Gly Leu Arg 435 440 445 aca gcc acg ate aca tgg aag gag att cct aag agt gct agg aat gga 1631 Ihr Ala Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn Gly 450 455 460 465 ttt ate aac aat tac act gta ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gaa 1679 Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Glu 470 475 480 ctc tcc aag act gtt aac tet cat gcc ctg cag tgt çac ctg gag tet 1727 Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu Ser 395 395 485 490 495 ctg aca cga agg acc tet tat act gtt tgg gtc atg gcc age acc aga Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Vai Trp Val Met Ala Ser Thr Arg 500 505 510 gct gga ggt acc aac ggg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tea ate Ala Gly Gly Thr Asn Gly Vai Arg ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Ile 515 520 525 agt gtg ttt gaa att gtc ctt cta aca tet cta gtt gga gga ggc ctt Ser Vai Phe Glu Ile vai Leu Leu Thr Ser Leu Val Gly Gly Gly Leu 530 535 540 545 ctt cta ctt age ate aaa aca gtg act ttt ggc ctc aga aag cca aac Leu Leu Leu Ser Ile Lys Thr Vai Thr Phe Gly Leu Arg Lys Pro Asn 550 555 560 cgg ttg act ccc ctg tgt tgt cct gat gtt ccc aac cct gct gaa agt Arg Leu Thr Pro Leu Cys Cys Pro Asp Val Pro Asn Pro Ala Glu Ser 565 570 575 agt tta gcc aca tgg ctc gga gat ggt ttc aag aag tea aat atg aag Ser Leu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Gly Phe Lys Lys Ser Asn Met Lys 580 585 590 gag act gga aac tet ggg aac aca gaa gac gtg gtc cta aaa cca tgt Glu Thr Gly Asn Ser Gly Asn Thr Glu Asp Val Val Leu Lys Pro Cys 595 600 605 ccc gtc ccc gcg gat ctc att gac aag ctg gta gtg aac ttt gag aat Pro vai Pro Ala Asp Leu ile Asp Lys Leu Val Val Asn Phe Glu Asn 610 615 620 625 ttt ctg gaa gta gtt ttg aca gag gaa gct gga aag ggt cag gcg age Phe Leu Glu Vai Vai Leu Thr Glu Glu Ala Gly Lys Gly Gin Ala Ser 630 635 640 att ttg gga gga gaa gcg aat gag tat ate tta tcc cag gaa cca age Ile Leu Gly Gly Glu Ala Asn Glu Tyr Ile Leu Ser Gin Glu Pro Ser 1775 1823 1871 1919 1967 2015 2063 2111 2159 2207 645 650 655 2262 2322 2382 2442 2502 2562 2622 2682 2742 2748 tgt cct ggc cat tgc tgaagctacc ctcagggtcc aggacagctg tcttgttggc Cys Pro Gly His Cys 660 acttgactct ggcaggaacc tgatctctac ttttcttctc cctgtctccg gacactttct ctccttcatg cagagaccag gactagagcg gattcctcat ggtttgccag gctcctcagt ccttgctcgg gctcaggatc ttcaacaatg ccctttctgg gacactccat catccactta tatttatttt ttgcaacatt gtggattgaa cccagggact tgtttatgcg cgcaacttca gtaactgtgg cagagactta ggaatggaga tctgaccctt tgcagaaggt ttctggacat ccgtccctgt gtgagcctca gacagcattg tctttacttt gaatcagctt ccaagttaat aaaagaaaaa cagagaggtg gcataacagc tcctgcttcc tgacctgctt gagttccagt tctgacttcc tttggtgatg aacagcaatg tgggaagtgt aagctgaata aaccctttcc tcccca <210> 112 396

<211> 662 <212> PRT <213> Mus musculus <4 Ο 0> 112 397

Met Leu Ser Ser Gin Lys Gly Ser Cys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala 1 5 10 15 His Vai Gin Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly Ile Met Trp Thr Leu Ala 20 25 30 Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro 35 40 45 Tht Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu 50 55 60 Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ile 65 70 75 80 Val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala 85 90 95 Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp 100 105 110 Ile Cys Ser Val Glu Val Gin Ala Gin Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys 115 120 125 Ser Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile Ala Lys Thr Glu Pro 130 135 140 Pro Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn Arg Met Phe Gin Ile 145 150 155 160 Gin Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met 165 170 175 Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe 180 185 190 Glu Asn Cys Lys Gin Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gin Ala Phe Thr 195 200 205 Glu Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp 210 215 220 Ser Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro 225 230 235 240 His Vai Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly 245 250 255 Asp Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 270 Leu Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gin Tyr Phe Ala Glu Asn Ser 275 280 285 Thr Asn Leu Thr Glu Ile Asn Asn Ile Thr Thr Gin Gin Tyr Glu Leu 290 295 300 Leu Leu Met Ser Gin Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser 305 310 315 320 Leu Gly Lys Ser Gin Glu Thr Ile Leu Arg lie Pro Asp Val His Glu 325 330 335 Lys Thr Phe Gin Tyr lie Lys Ser Met Gin Ala Tyr Ile Ala Glu Pro 340 345 350 Leu Leu Val Val Asn Trp Gin Ser Ser Ile Pro Ala Val Asp Thr Trp 355 360 365 Ile Val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu 370 375 380 Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Val Thr Asn Trp Thr Ile Glu Gin Asp 385 390 395 400 Lys Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro val Leu 405 410 415 Gly His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr Ala Lys Glu 420 425 430 Gly Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ile Gly Leu 435 440 445 Arg Thr Ala Thr Ile Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn 450 455 460 Gly Phe lie Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys 465 470 475 480 398

Glu Leu Ser Lys Thr Vai Asn Ser His Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu 485 490 495 Set Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr 500 505 510 Arg Ala Gly Gly Thr Asn Gly Vai Arg Ila Asn Phe Lys Thr Leu Ser 515 520 525 Ile Ser Vai Phe Glu Ile Val Leu Leu Thr Ser Leu Val Gly Gly Gly 530 535 540 Leu Leu Leu Leu Ser Ile Lys Thr Val Thr Phe Gly Leu Arg Lys Pro 545 550 555 560 Asn Arg Leu Thr Pro Leu Cys Cys Pro Asp Val Pro Asn Pro Ala Glu 565 570 575 Ser Ser Leu Ala Thr Trp Leu Gly Asp Gly Phe Lys Lys Ser Asn Met sao 585 590 Lys Glu Thr Gly Asn Ser Gly Asn Thr Glu Asp Val Val Leu Lys Pro 595 600 605 Cys Pro Vai Pro Ala Asp Leu Ile Asp Lys Leu Val Val Asn Phe Glu 610 615 620 Asn Phe Leu Glu Vai Vai Leu Thr Glu Glu Ala Gly Lys Gly Gin Ala 625 630 635 640 Ser Ile Leu Gly Gly Glu Ala Asn Glu Tyr Ile Leu Ser Gin Glu Pro 645 650 655 Ser Cys Pro Gly His Cys 660 <210> 113 <211> 2728 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (237)...(1877 <4 Ο 0> 113 399 gatggggccc tgaatgttga tctgacagaa ttccagacca acctggtggt tattgtcctt 60 ttcatctggt catgctgaat atactctcaa gatgtgctgg agaaggtgct gctgtccggg 120 ctctcagaga aggcagtgct ggaggcgttc ctggcccggg tctcctccta ctgttcctgg 180 tagcccagcc ttctcggggt ggaaggagaa gctggccagg tgagctctga ggaagc atg 239

Met 1 ctç age age cag aag gga tcc tgc age cag gaa cca 999 gea gee cac 287 Leu Ser Ser Gin Lys Gly Ser Cys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala His 5 10 15 gtc cag cct ctg ggt gtg aac gct gga ata atg tgg acc ttg gea ctg 335 Vai Gin Pro Leu Gly Vai Asn Ala Gly Ile Met Trp Thr Leu Ala Leu 20 25 30 tgg gea ttc tet ttc etc tgc aaa ttc age ctg gea gtc ctg ceg act 383 Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Vai Leu Pro Thr 35 40 45 aag cca gag aac att tcc tgc gtc ttt tac ttc gac aga aat ctg act 431 Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Vai Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu Thr 50 55 60 65 tgc act tgg aga cca gag aag gaa acc aat gat acc age tac att gtg 479 Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ile Vai 400 70 75 80 act ttg act tac tcc tat gga aaa age aat tat agt gac aat gct aca 527 Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala Thr 85 90 95 gag gct tea tat tet ttt ccc cgt tcc tgt gea atg ccc cca gac ate 57 5 Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp Ile 100 105 110 tgc agt gtt gaa gta caa gct caa aat gga gat ggt aaa gtt aaa tet 623 Cys Ser Vai Glu Vai Gin Ala Gin Asn Gly Asp Gly Lys Val Lys Ser 115 120 125 gac ate aca tat tgg cat tta ate tcc ata gea aaa acc gaa cca cct 671 Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile Ala Lys Thr Glu Pro Pro 130 135 140 145 ata att tta agt gtg aat cca att tgt aat aga atg ttc cag ata caa 719 Ile Ile Leu Ser Vai Asn Pro Ile Cys Asn Arg Met Phe Gin Ile Gin 150 155 160 tgg aaa ccg cgt gaa aag act cgt ggg ttt cet tta gta tgc atg ctt 7 67 Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met Leu 165 170 175 cgg ttc aga act gtc aac agt age ege tgg acg gaa gtc aat ttt gaa 815 Arg Phe Arg Thr Vai Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe Glu 180 185 190 aac tgt aaa cag gtc tgc aac ctc aca gga ctt cag gct ttc aca gaa 863 Asn Cys Lys Gin Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gin Ala Phe Thr Glu 195 200 205 tat gtc ctg gct cta cga ttc agg ttc aat gac tea aga tat tgg age 911 Tyr Vai Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp Ser 210 215 220 225 aag tgg age aaa gaa gaa acc aga gtg act atg gag gaa gtt cca cat 959 Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu Val Pro His 230 235 240 gtc ctg gac ctg tgg aga att ctg gaa cca gea gac atg aac gga gac 1007 Vai Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly Asp 245 250 255 agg aag gtg cga ttg Ctg tgg aag aag gea aga gga gee ccc gtc ttg 1055 Arg Lys Vai Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val Leu 260 265 270 gag aaa aca ttt ggc tac cac ata cag tac ttt gea gag aac age act 1103 Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gin Tyr Phe Ala Glu Asn Ser Thr 275 280 285 aac ctc aca gag ata aac aac ate acc acc cag cag tat gaa ctg ctt 1151 Asn Leu Thr Glu Ile Asn Asn Ile Thr Thr Gin Gin Tyr Glu Leu Leu 290 2 95 300 305 ctg atg age cag gea cac tet gtg tcc gtg act tet ttt aat tet ctt 1199 Leu Met Ser Gin Ala His Ser val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser Leu 310 315 320 401 ggc aag tcc caa gag acc ate ctg agg ate cca gat gtc cat gag aag 1247 Gly Lys Ser Gin Glu Thr Ile Leu Arg Ue Pro Asp Val His Glu Lys 325 330 335 acc tt C cag tac att aag age atg cag gcc tac ata gcc gag ccc ctg 1295 Thr Phe Gin Tyr Ile Lys Ser Met Gin Ala Tyr Ile Ala Glu Pro Leu 340 345 350 ttg gtg gtg aac tgg caa age tcc att cct gcg gtg gac act tgg ata 1343 Leu Val val Asn Trp Gin Ser Ser Ile Pro Ala Val Asp Thr Trp Ile 355 360 365 gtg gag tgg ctc cca gaa gct gcc atg teg aag ttc cct gcc ctt tcc 1391 Vai Glu Trp Leu Pro Glu Alá Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu Ser 370 375 380 385 tgg gaa tet gtg tet cag gtc acg aac tgg acc ate gag caa gat aaa 1439 Trp Glu Ser Val Ser Gin Val Thr Asn Trp Thr Ile Glu Gin Asp Lys 390 395 400 cta aaa cct ttc aca tgc tat aat ata tea gtg tat cca gtg ttg gga 1487 Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Ile Ser Val Tyr Pro Val Leu Gly 405 410 415 cac cga gtt gga gag ceg tat tea ate caa gct tat gcc aaa gaa gga 1535 His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr Ala Lys Glu Gly 420 425 430 act cca tta aaa 3333 « cct gs-g acc agg nf π "d 'tart •Ju3 aac ate (TiT^ 33¾ *- l— +► rt «_ agg 1583 Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn lie Gly Leu Arg 435 440 445 aca gcc acg ate aca tgg aag gag att cct aag agt gct agg aat gga 1631 Thr Ala Thr lie Thr Trp Lys Glu Ile Pro Lys Ser Ala Arg Asn Gly 450 455 460 465 ttt ate aac aat tac act gta ttt tac caa gct gaa ggt gga aaa gaa 1679 Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys Glu 470 475 480 ctc tcc aag act gtt aac tet cat gcc ctg cag tgt gac ctg gag tet 1727 Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu Ser 485 490 495 ctg aca cga agg acc tet tat act gtt tgg gtc atg gcc age acc aga 1775 Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr Arg 500 505 510 gct gga ggt acc aac ogg gtg aga ata aac ttc aag aca ttg tea ate 1823 Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg Ile Asn Phe Lys Thr Leu Ser Ue 515 520 525 agt gag tac tgg ctt cag gcc tea ttc tgg agt tta ctt cgg gtt gga 1871 Ser Glu Tyr Trp Leu Gin Ala Ser Phe Trp Ser Leu Leu Arg Val Gly 530 535 540 545 aat gtt tgacaggagc aaggagagcc agcagagggc ageagageat ggcttctcct 1927 Asn Val 402 gctctctctg gctcactcac ctcccaggag gttagaccaa caggccattt tgatccttgc aagcaagcaa catccacttc agcctcagcc ggccagttcc taaatgtcag gagttgtgca cagaggtcac tgacaaggga cttaatgtta gtttgtttgt tatgtgtatt caacttatca caaatttgtt agatatcaca tataatgtga gctgagggca tgtaatagac agagggaaaa gagttccagg acagccaggg ctacatggag tcaatcagtc aatcaatcaa aattcaagca aaccaaaaaa gtcatcttga tgtatctcag taaagtagac cgtggctctg agaaccatga acaatgcctt cttggtattc tttttgatac ataaaaatca tgttacagct a

<210> 114 <211> 547 <212> PRT <213> Mus musculus ttactgagga gctggcaaag ggagggctga 1987 tggtaagcag ccacaaataa tcttaagatg 2047 acgtcaaagg ctgttgcctg agctcacact 2107 atagaacctg ggaaggaaca actggttgat 2167 ccatctgcgg tggggctttt gtttcgtttt 2227 gcttttacgt tgaaaacatg aaaagcaaga 2287 aatataatag tttaataatt gagtaggaaa 2347 gaagaggaaa gccagtctgg tctacaaagt 2407 aaaccctgtc tcaatcaatc aatcaatcaa 2467 gcattgacaa gttttgcaat aactactata 2527 aagccccttg ttatttatgt tcctgaagac 2587 gcaagataac acgttctgtc ctgeagccta 2647 aacttctaaa ataacttttt tttaaaaaaa 2707 2728 <400> 114 403

Met leu Ser Ser Gin Lys Gly Ser Cys Ser Gin Glu Pro Gly Ala Ala 1 5 10 15 His Val Gin Pro Leu Gly Val Asn Ala Gly Ile Met Trp Thr Leu Ala 20 25 30 Leu Trp Ala Phe Ser Phe Leu Cys Lys Phe Ser Leu Ala Val Leu Pro 35 40 45 Thr Lys Pro Glu Asn Ile Ser Cys Val Phe Tyr Phe Asp Arg Asn Leu 50 55 60 Thr Cys Thr Trp Arg Pro Glu Lys Glu Thr Asn Asp Thr Ser Tyr Ile 65 90 95 80 val Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Gly Lys Ser Asn Tyr Ser Asp Asn Ala 85 90 95 Thr Glu Ala Ser Tyr Ser Phe Pro Arg Ser Cys Ala Met Pro Pro Asp 100 105 110 Ile Cys Ser Val Glu Val Gin Ala Gin Asn Gly Asp Gly Lys val Lys 115 120 125 Ser Asp Ile Thr Tyr Trp His Leu Ile Ser Ile Ala Lys Thr Glu Pro 130 135 140 Pro Ile Ile Leu Ser Val Asn Pro Ile Cys Asn Arg Met Phe Gin Ile 145 150 155 160 Gin Trp Lys Pro Arg Glu Lys Thr Arg Gly Phe Pro Leu Val Cys Met 165 190 175 Leu Arg Phe Arg Thr Val Asn Ser Ser Arg Trp Thr Glu Val Asn Phe 180 185 190 Glu Asn Cys Lys Gin Val Cys Asn Leu Thr Gly Leu Gin Ala Phe Thr 195 200 205 Glu Tyr Val Leu Ala Leu Arg Phe Arg Phe Asn Asp Ser Arg Tyr Trp 210 215 220 Ser Lys Trp Ser Lys Glu Glu Thr Arg Val Thr Met Glu Glu val Pro 225 230 235 240 His Val Leu Asp Leu Trp Arg Ile Leu Glu Pro Ala Asp Met Asn Gly 245 250 255 Asp Arg Lys Val Arg Leu Leu Trp Lys Lys Ala Arg Gly Ala Pro Val 260 265 290 Leu Glu Lys Thr Phe Gly Tyr His Ile Gin Tyr Phe Ala Glu Asn Ser 295 280 285 Thr Asn Leu Thr Glu Ile Asn Asn ile Thr Thr Gin Gin Tyr Glu Leu 290 295 300 Leu Leu Met Ser Gin Ala His Ser Val Ser Val Thr Ser Phe Asn Ser 305 310 315 320 404

Leu Gly Lys Ser Gla Glu Thr Ue Leu Arg Ile Pro Asp Val His Glu 325 330 335 Lys Thr Phe Gin Tyr Ue Lys Ser Met Gin Ala Tyr Ile Ala Glu Pro 340 345 350 Leu Leu Val Val Asn Trp Gin Ser Ser Ue Pro Ala Val Asp Thr Trp 355 360 365 Ue val Glu Trp Leu Pro Glu Ala Ala Met Ser Lys Phe Pro Ala Leu 370 375 380 Ser Trp Glu Ser Val Ser Gin Val Thr Asn Trp Thr Ue Glu Gin Asp 385 390 395 400 Lys Leu Lys Pro Phe Thr Cys Tyr Asn Ue Ser Val Tyr Pro Val Leu 405 410 415 Gly His Arg Val Gly Glu Pro Tyr Ser Ile Gin Ala Tyr Ala Lys Glu 420 425 430 Gly Thr Pro Leu Lys Gly Pro Glu Thr Arg Val Glu Asn Ue Gly Leu 435 440 445 Arg Thr Ala Thr Ue Thr Trp Lys Glu Ue Pro Lys Ser Ala Arg Asn 450 455 460 Gly Phe Ile Asn Asn Tyr Thr Val Phe Tyr Gin Ala Glu Gly Gly Lys 465 470 475 460 Glu Leu Ser Lys Thr Val Asn Ser His Ala Leu Gin Cys Asp Leu Glu 485 490 495 Ser Leu Thr Arg Arg Thr Ser Tyr Thr Val Trp Val Met Ala Ser Thr 500 505 S10 Arg Ala Gly Gly Thr Asn Gly Val Arg Ue Asn Phe Lys Thr Leu Ser 515 520 525 lie Ser Glu Tyr Trp Leu Gin Ala Ser Phe Trp Ser Leu Leu Arg Val 530 535 540 Gly Asn Val 545 <210>115 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <220>Iniciador ZC41 . . 764 <400> 115 atcgaattca gaccaatggc tttctctgtg 30 <210> 116 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 405 <223> Iniciador ZC41.598 <400> 116 acagtagtgt tctgactcag ttgg 24 <210> 117 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41.948 <400> 117 ggtactgttc tctttgtctc g 21 <210> 118 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41.766 <400> 118 atctctagat gtttactgtt caccttg 27 <210> 119 <211> 4026 <212> ADN <213> Mus musculus <220>

<221> CDS <222> (780) .. . (3692) 406 <4 0 0> 119 407 ctgtggacat tttaccatgc agccataaag agaggtcaaa aatgtctttc aagtgcccgg 60 ttagtaaaga tctgatggcg ttctaaggag agaaaggaac ttggatcttc gtggacaaag 120 aattcaggtc tgtagctgaa ggaggcgtgg ccacacaggg cgtttccagg tectgtagag 180 gaagcacagt tcatagatct otgttctaao acgtctgtct tgctctgaac gccgaaagtc 240 aactcgatca caagtttgat ccaacagttt gacatttcag gtaattttca gacggagcgc 300 tggggttgga tctcecaagc aacacaattg gctctgtgca ggacacctgg cacggggcac 360 tgggtcgcag ctcgtcccct ctccctccag gaacaacgat gctcaaggac cagcttttcc 420 tcccaggcct ctcccacttc ccttctcacc ggtgctgccc gcccggtccc gggaaccgcg 480 cccgtcgcag ggtcccgatc gttcccccta catcccttgg gaccaggagc aaattcetgt 540 gggtcccagg agtgccaaaa gtgctcagcg agacgggaaa ttgcaacagt acttggccct 600 tcggccctcc cccggcgctt tcccgtaact cccgcccctg gacacttgtc ccgtagttga 660 ttcatagctg gggcgogggg ccgcctccac acgcctggac agacgtccgc gcccgttccc 720 ctgtgaggcc gaggaccggc aaggctccgg agcaggtcgc caggcgggta atcagacca 779 atg gct ttc tct gtg gtc Ctt cat cca gee ttc ctc ctg gca gtg ctg 827 Met Ala Phe Ser Vai Vai Leu His Pro Ala Phe Leu Leu Ala Val Leu 1 5 10 15 tcc ctg agg gca tcc cga age gaa gtc ttg gag gag cct tta cca ttg 875 Ser Leu Arg Ala Ser Arg Ser Glu Val Leu Glu Glu Pro Leu Pro Leu 20 25 30 act Cct gag ata cat aaa Çftt tct ttt caa ttg aaa Ctt caa gaa gtg 923 Thr Pro Glu Ile His Lys Val Ser Phe Gin Leu Lys Leu Gin Glu Val 35 40 45 aat tta gaa tgg act gtc cca gee ctt act cat gaa gaa tta aac atg 971 Asn Leu Glu Trp Thr Val Pro Ala Leu Thr His Glu Glu Leu Asn Met 50 55 60 ata ttt cag ata gag ate agt aga ctg aac ata tcc aac acc ate tgg 1019 Ile Phe Gin Ile Glu Ile Ser Arg Leu Asn Ile Ser Asn Thr Ile Trp 65 70 75 80 gtg gag aat tat age acc act gtg aag cgt gaa gaa gct gtg cgt tgg 1067 Vai Glu Asn Tyr Ser Thr Thr Vai Lys Arg Glu Glu Ala Val Arg Trp 85 90 95 408 aac tgg acg tet gat ate cct ttg gag tgt gtc aaa cat ttc ata aga 1115 Asn Trp Thr Ser Asp Ile Pro Leu Glu Cys Val Lys His Phe Ile Arg 100 105 110 ate agg gct ctg gta gat gac acc aag tcc ctt cca cag agt tcc tgg 1163 ile Arg Ala Leu Val Asp Asp Thr Lys Ser Leu Pro Gin Ser Ser Trp 115 120 125 ggc aac tgg agt tcc tgg aaa gaa gtt aat gea aag gtt tcc gtt gaa 1211 Gly Asn Trp Ser Ser Trp Lys Glu Val Asn Ala Lys Val Ser Val Glu 130 135 140 cct gat aaa tea tta ata ttt cct aaa gac aaa gtg ttg gaa gaa ggc 1259 Pro Asp Lys Ser Leu Ile Phe Pro Lys Asp Lys Val Leu Glu Glu Gly 145 150 155 160 tcc aat gtc acc ate tgt ctg atg tat ggg cag aat gta tat aat gta 1307 Ser Asn Val Thr Ile Cys Leu Met Tyr Gly Gin Asn Val Tyr Asn Val 165 170 175 tcc tgt aag ttg caa gat gag cca ate cat gga gaa caa Ctt gat tcc 1355 Ser Cys Lys Leu Gin Asp Glu Pro Ile His Gly Glu Gin Leu Asp Ser 180 185 190 cac gtg tea tta tta aaa ttg aac aat gta gtt ttc ctt agt gac aca 1403 His Val Ser Leu Leu Lys Leu Asn Asn Val Val Phe Leu Ser Asp Thr 195 200 205 ggg a ca aac ate aat tgt caa gee acg aag ggt cct aaa aga ata ttt 1451 Giy Thr Asn lie Asn Cys Gin Ala Thr Lys Gly Pro Lys nly T 1 — uc nl.- r 210 215 220 ggt act gtt ctc ttt gtc teg aaa gtg ctc gag gaa cct aag aat gtt 1499 Gly Thr Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro Lys Asn val 225 230 235 240 tcc tgt gaa acc cga gac ttt aag act ttg gac tgt tea tgg gaa cct 1547 Ser Cys Glu Thr Arg Asp Phe Lys Thr Leu Asp Cys Ser Trp Glu Pro 245 250 255 ggg gta gat acg act ttg act tgg cgt aaa caa aga ttc caa aac tac 1595 Gly Val Asp Thr Thr Leu Thr Trp Arg Lys Gin Arg Phe Gin Asn Tyr 260 265 270 act tta tgt gaa teg ttc tet aag aga tgt gag gtt tet aac tac agg 1643 Thr Leu Cys Glu Ser Phe Ser Lys Arg Cys Glu Val Ser Asn Tyr Arg 275 280 285 aac tcc tat acc tgg caa ate act gaa ggc tea cag gaa atg tat aac 1691 Asn Ser Tyr Thr Trp Gin Ile Thr Glu Gly Ser Gin Glu Met Tyr Asn 290 295 300 ttt act ctc aca gct gaa aac caa cta agg aaa aga agt gtc aac att 1739 Phe Thr Leu Thr Ala Glu Asn Gin Leu Arg Lys Arg Ser Val Asn Ile 305 310 315 320 aat ttt aac ctg acc cat aga gtt cat cca aag gct ccg cag gac gtc 1787 Asn Phe Asn Leu Thr His Arg Val His Fro Lys Ala Pro Gin Asp Val 325 330 335 409 acc ctt aaa att ata ggt gct aca aaa gee aac atg act tgg aag gtt 1335 Thr Leu Lys Ile Ile Gly Ala Thr Lys Ala Asn Met Thr Trp Lys Val 340 345 350 cac tcc cat gga aac aac tac aca ctt ttg tgt cag gtt aaa ctc caa 1883 His Ser His Gly Asn Asn Tyr Thr Leu Leu Cys Gin Val Lys Leu Gin 355 360 365 tat gga gaa gtg att cat gag cac aat gtt tct gtc cac atg age gea 1931 Tyr Gly Glu Val Ile His Glu His Asn Val Ser Val His Met Ser Ala 370 375 380 aac tac ctc ttc agt gat ctg gat cca gac aca aag tac aag gct ttt 1979 Asn Tyr Leu Phe Ser Asp Leu Asp Pro Asp Thr Lys Tyr Lys Ala Phe 385 390 395 400 gtg cgc tgt gea agt gee aac cac ttc tgg aaa tgg age gac tgg acc 2027 Vai Arg Cys Ala Ser Ala Asn His Phe Trp Lys Trp Ser Asp Trp Thr 405 410 415 caa aaa gag ttc age aca ccc gag act gct ccc tea cag gct ctt gat 2075 Gin Lys Glu Phe Ser Thr Pro Glu Thr Ala Pro Ser Gin Ala Leu Asp 420 425 430 gta tgg aga caa gtg tgg teg gag aat gga aga cgc att gtg act tta 2123 Val Trp Arg Gin Val Trp Ser Glu Asn Gly Arg Arg lie Val Thr Leu 435 440 445 ttc tgg aag cea cta tta aaa tea cag gee aat ggc aaa ate ata tcc 2171 Phe Trp Lys Pro Leu Leu Lys Ser Gin Ala Asn Gly Lys He Ile Ser 450 455 460 tat aat ata gtt gta gaa aat gaa gee aaa cca act gag tea gaa cac 2219 Tyr Asn Ile Val Val Glu Asn Glu Ala Lys Pro Thr Glu Ser Glu HiS 465 470 475 480 tac tgt gtc tgg gea cca gee ctc age aca aac ctg age ctt gac ctg 2267 Tyr Cys Val Trp Ala Pro Ala Leu Ser Thr Asn Leu Ser Leu Asp Leu 485 490 495 caa cct tac aag att cgc ate aca gee aac aac age atg ggg gea tct 2315 Gin Pro Tyr Lys Ile Arg Ile Thr Ala Asn Asn Ser Met Gly Ala Ser 500 505 510 cct gag tcc ttg atg gtc ctt tct aat gat tct gga cac gag gtc aag 2363 Pro Glu Ser Leu Met Val Leu Ser Asn Asp Ser Gly His Glu Val Lys 518 520 525 gaa aag aca att aaa ggt ata aag gat gea ttc aat att tct tgg gag 2411 Glu Lys Thr He Lys Gly ile Lys Asp Ala Phe Asn lie Ser Trp Glu 530 535 540 ccc gta tct gga gac acg atg ggc tat gtt gtg gac tgg tgt gea cat 2459 Pro Val Ser Gly Asp Thr Met Gly Tyr Val Val Asp Trp Cys Ala His 545 550 555 560 tcc cag gac caa cgc tgt gat ttg cag tgg aag aac Ctt ggt ccc aat 2507 Ser Gin Asp Gin Arg Cys Asp Leu Gin Trp Lys Asn Leu Gly Pro Asn 565 570 575 acc aca age acc acc ate acc tea gat gat ttt aaa cca ggc gtc cgt 2555 410

Thr Thr Ser Thr Thr Ile Thr Ser Asp Asp Phe Lys Pro Gly Val Arg 580 585 590 tac aac ttc aga att ttt gaa agg tct gtg gaa cac aaa gct cgg tta 2603 Tyr Asn Phe Arg Ile Phe Glu Arg Ser Vai Glu His Lys Ala Arg Leu 595 600 605 gta gag aaa caa aga gga tac acc cag gaa ctg gct cct ttg gtg aat 2651 Vai Glu Lys Gin Arg Gly Tyr Thr Gin Glu Leu Ala Pro Leu Val Asn 610 615 620 cca aaa gtg gag att cct tac teg acc cct aac tcc ttc gtt cta aga 2699 Pro Lys vai Glu Ile Pro Tyr Ser Thr Pro Asn Ser Phe Val Leu Arg 625 630 635 640 tgg cca gat tat gac age gac ttc cag gct ggt ttt ata aaa ggg tac 2747 Trp Pro Asp Tyr Asp Ser Asp Phe Gin Ala Gly Phe Ile Lys Gly Tyr 645 650 655 ctc gtg tat gtg aaa tcc aag gag atg cag tgc aac caa ccc tgg gaa 2795 teu Vai Tyr Vai Lys Ser Lys Glu Met Gin Cys Asn Gin Pro Trp Glu 660 665 670 agg acc ctc ctt cca gat aat tca gtc ctc tgt aaa tac gac ate aat 2843 Arg Thr Leu Leu Pro Asp Asn Ser Vai Leu Cys Lys Tyr Asp Ile Asn 675 680 685 ggc tca gag aca aag aca ctc acc gtg gaa aac ctt cag cca gag tcc 2891 Gly Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Vai Glu Asn Leu Gin Pro Glu Ser 690 695 700 ctc tat gag ttt ttc gtc act ccg tac acc age gct ggc cca gga ccc 2939 Leu Tyr Glu Phe Phe Vai Thr Pro Tyr Thr Ser Ala Gly Pro Gly Pro 205 710 715 720 aat gaa acg ttc aca aag gtc aca act cca gat gea ege tcc cac atg 2987 Asn Glu Thr Phe Thr Lys vai Thr Thr Pro Asp Ala Arg Ser His Met 725 730 735 ctg ctg cag ate ata cta ccc atg acc ctc tgc gtc ttg ctc age ate 3035 Leu Leu Gin Ile Ile Leu Pro Met Thr Leu Cys Val Leu Leu Ser Ile 740 745 750 att gtc tgc tac tgg aaa agt cag tgg gtg aag gag aag tgc tac cct 3083 Ile Vai Cys Tyr Trp Lys Ser Gin Trp Val Lys Glu Lys Cys Tyr Pro 755 760 765 gac att ccc aat ccg tac aag age age att ctg tca ctc ata aaa tcc 3131 Asp Ile Pro Asn Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser Leu Ile Lys Ser 770 775 780 aag aag aat cct cac tta ata atg aat gtc aaa gac tgc att cca gat 3179 Lys Lys Asn Pro Hls Leu ile Met Asn Val Lys Asp Cys ile Pro Asp 785 790 795 800 gtc ctt gaa gtg ata aac aaa gea gaa ggc age aag aca cag tgt gta 3227 Vai Leu Glu Vai Ile Asn Lys Ala Glu Gly Ser Lys Thr Gin Cys Val 805 810 815 ggc tct ggg aaa ctt cac att gaa gat gta ccc act aag ccg cca ate 3275 Gly Ser Gly Lys Leu Hls Ile Glu Asp Val Pro Thr Lys Pro Pro Ile 411 820 825 830 gtg cca aca gaa aag gat tcc tca ggg cct gtg ccc tgc ate ttc ttt 3323 Vai Pro Thr Glu Lys Asp Ser Ser Gly Pro Vai Pro Cys lie Phe Phe 835 840 845 gag aat ttt act tac gat cag tca gct ttt gac tet ggt tcc cat ggc 3371 Glu Asn Phe Thr Tyr Asp Gin Ser Ala Phe Asp Ser Gly Ser His Gly 850 855 860 ctc att cca ggt ccc cta aaa gac aca gea cac caa ctt gga cta ttg 3419 Leu Ile Pro Gly Pro Leu Lys Asp Thr Ala flis Gin Leu Gly Leu Leu 865 870 875 880 gct cca cct aac aag ttc cag aac gta tta aaa aat gac tac atg aag 3467 Ala Pro Pro Asn Lys Phe Gin Asn Vai Leu Lys Asn Asp Tyr Met Lys 885 890 895 ccc ctg gtc gaa agt cca act gaa gaa act age ttg att tat gtg tca 3515 Pro Leu Vai Glu Ser Pro Thr Glu Glu Thr Ser Leu Ile Tyr Vai Ser 900 905 910 cag ctg gct tca ccc atg tgc gga gac aag gac acg ctt gee aca gaa 3563 Gin Leu Ala Ser Pro Met Cys Gly Asp Lys Asp Thr Leu Ala The Glu 915 920 925 cca ccc gtg cca gtg cat ggt tca gag tat aaa agg caa atg gta gtt 3611 Pro Pro Vai Pro Vai Hl s Gly Ser Glu Tyr Lys Arg Gin Met Val Val 930 935 940 ccc g «r age ctc gea tca cct tet Ctg aag gag gat aac age ttg aCC 3659 Pro Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ser Leu Lys Glu Asp Asn Ser Leu Thr 945 950 955 960 tca acg gtc ctc tta ggc caa ggt gaa cag taa acaccacgca gcacaaataa 3712 Ser Thr Vai Leu Leu Gly Gin Gly Glu Gin * 965 970 atgcactcca tgccctggtt tatcaacgat aggcgttccc gctcaccctt ctactcaaaa cacactatag ggttccaggg cactacagac tagaaatggc attgcagtag ctac gcactttggg gtgggggttg caacagactt agatccgaga cttgacatag agatgtagct aggggagact aaggaccata gcatgctgac ggtgtacacc gttaccatgc caacaccacg 3772 cattatctgc agtgctgatt 3832 taatatggtg ttcaccctga 3892 cttgctatta tttggtccag 3952 agtcatttcg cagagcctac 4012 4026 <210> 120 <211> 970 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 120 412

Met Ala Phe Ser Vai Vai Leu His 1 5 Set Leu Arg Ala Ser Arg Ser Glu 20 Thr Pro Glu Ile His Lys Vai Ser 35 40 Asn Leu Glu Trp Thr Vai Pro Ala 50 55 Ile Phe Gin Ile Glu Ile Ser Arg 65 70

Pro Ala 10 Phe Leu Leu Ala Vai 15 Leu Vai 25 Leu Glu Glu Pro Leu 30 Pro Leu Phe Gin Leu Lys Leu 45 Gin Glu Vai Leu Thr His Glu 60 Glu Leu Asn Met Leu Asn Ile 75 Ser Asn Thr Ile Trp 80 413

Val Glu Asn Tyr Ser Thr Thr Val Lys Arg Glu Glu Ala Val Arg Trp 85 90 95 As η Trp Thr Ser Asp Ile Pro Leu Glu Cys Val Lys His Phe Ile Arg 100 105 110 Ile Arg Ala Leu Val Asp Asp Thr Lys Ser Leu Pro Gin Ser Ser Trp 115 120 125 Gly Asn Trp Ser Ser Trp Lys Glu Val Asn Ala Lys Val Ser Val Glu 130 135 140 Pro Asp Lys Ser Leu Ile Phe Pro Lys Asp Lys Val Leu Glu Glu Gly 145 150 155 160 Ser Asn Val Thr Ile Cys Leu Met Tyr Gly Gin Asn Val Tyr Asn val 165 110 175 Ser Cys Lys Leu Gin Asp Glu Pro Ile His Gly Glu Gin Leu Asp Ser 180 185 190 His Val Ser Leu Leu Lys Leu Asn Asn Val Val Phe Leu Ser Asp Thr 195 200 205 Gly Thr Asn Ile Asn Cys Gin Ala Thr Lys Gly Pro Lys Arg Ile Phe 210 215 220 Gly Thr Val Leu Phe Val Ser Lys Val Leu Glu Glu Pro Lys Asn Val 225 230 235 240 Ser Cys Glu Thr Arg Asp Phe Lys Thr Leu Asp Cys Ser Trp Glu Pro 245 250 255 Gly Val Asp Thr Thr Leu Thr Trp Arg Lys Gin Arg Phe Gin Asn Tyr 260 265 270 Thr Leu Cys Glu Ser Phe Ser Lys Arg Cys Glu Val Ser Asn Tyr Arg 215 280 285 Asn Ser Tyr Thr Trp Gin Ile Thr Glu Gly Ser Gin Glu Met Tyr Asn 290 295 300 Phe Thr Leu Thr Ala Glu Asn Gin Leu Arg Lys Arg Ser Val Asn Ile 305 310 315 320 Asn Phe Asn Leu Thr His Arg Val His Pro Lys Ala Pro Gin Asp Val 325 330 335 Thr Leu Lys Ile Ile Gly Ala Thr Lys Ala Asn Met Thr Trp Lys Val 340 345 350 His Ser His Gly Asn Asn Tyr Thr Leu Leu Cys Gin Val Lys Leu Gin 355 360 365 Tyr Gly Glu Val lie His Glu His Asn Val Ser Val His Met Ser Ala 310 315 380 Asn Tyr Leu Phe Ser Asp Leu Asp Pro Asp Thr Lys Tyr Lys Ala Phe 385 390 395 400 Val Arg Cys Ala Ser Ala Asn His Phe Trp Lys Trp Ser Asp Trp Thr 405 410 415 Gin Lys Glu Phe Ser Thr Pro Glu Thr Ala Pro Ser Gin Ala Leu Asp 420 425 430 Val Trp Arg Gin Val Trp Ser Glu Asn Gly Arg Arg Ile Val Thr Leu 435 440 445 Phe Trp Lys Pro Leu Leu Lys Ser Gin Ala Asn Gly Lys Ile Ile Ser 450 455 460 Tyr Asn Ile Val Val Glu Asn Glu Ala Lys Pro Thr Glu Ser Glu His 465 410 415 480 Tyr Cys Val Trp Ala Pro Ala Leu Ser Thr Asn Leu Ser Leu Asp Leu 485 490 495 Gin Pro Tyr Lys ile Arg Ile Thr Ala Asn Asn Ser Met Gly Ala Ser 500 505 510 Pro Glu Ser Leu Met Val Leu Ser Asn Asp Ser Gly His Glu Val Lys 515 520 525 Glu Lys Thr Ile Lys Gly Ile Lys Asp Ala Phe Asn Ile Ser Trp Glu 530 535 540 Pro Val Ser Gly Asp Thr Met Gly Tyr Val Val Asp Trp Cys Ala His 545 550 555 560 Ser Gin Asp Gin Arg Cys Asp Leu Gin Trp Lys Asn LeU Gly Pro Asn 414 565 570 575 Thr Thr Ser Thr Thr lie Thr Ser Asp Asp Phe Lys Pro Gly Val Arg 580 585 590 Tyr Asn Phe Arg Ile Phe Glu Arg Ser Val Glu His Lys Ala Arg Leu 595 600 605 Vai Glu Lys Gin Arg Gly Tyr Thr Gin Glu Leu Ala Pro Leu Val Asn 610 615 620 Pro Lys Vai Glu Ile Pro Tyr Ser Thr Pro Asn Ser Phe Val Leu Arg 625 630 635 640 Trp Pro Asp Tyr Asp Ser Asp Phe Gin Ala Gly Phe Ile Lys Gly Tyr 645 650 655 Leu Vai Tyr Vai Lys Ser Lys Glu Met Gin Cys Asn Gin Pro Trp Glu 660 665 670 Arg Thr Leu Leu Pro Asp Asn Ser Val Leu Cys Lys Tyr Asp Ile Asn 675 680 685 Gly Ser Glu Thr Lys Thr Leu Thr Val Glu Asn Leu Gin Pro Glu Ser 690 695 700 Leu Tyr Glu Phe Phe Vai Thr Pro Tyr Thr Ser Ala Gly Pro Gly Pro 705 710 715 720 Asn Glu Thr Phe Thr Lys Val Thr Thr Pro Asp Ala Arg Ser His Met 725 730 735 Leu Leu Gin Ile Ile Leu Pro Met Thr Leu Cys Val Leu Leu Ser lie 740 745 750 Ile Vai Cys Tyr Trp Lys Ser Gin Trp Val Lys Glu Lys Cys Tyr Pro 755 760 765 Asp Ile Pro Asn Pro Tyr Lys Ser Ser Ile Leu Ser Leu Ile Lys Ser 770 775 780 Lys Lys Asn Pro His Leu Ile Met Asn Val Lys Asp Cys Ile Pro Asp 785 790 795 800 Vai Leu Glu Vai lie Asn Lys Ala Glu Gly Ser Lys Thr Gin Cys Val 805 810 815 Gly Ser Gly Lys Leu His Ile Glu Asp Val Pro Thr Lys Pro Pro Ile 820 825 830 Vai Pro Thr Glu Lys Asp Ser Ser Gly Pro Val Pro Cys Ile Phe Phe 835 840 845 Glu Asn Phe Thr Tyr Asp Gin Ser Ala Phe Asp Ser Gly Ser His Gly 850 855 860 Leu Ile Pro Gly Pro Leu Lys Asp Thr Ala His Gin Leu Gly Leu Leu 865 870 875 880 Ala Pro Pro Asn Lys Phe Gin Asn Val Leu Lys Asn Asp Tyr Met LyS 8B5 890 895 Pro Leu Vai Glu Ser Pro Thr Glu Glu Thr Ser Leu Ile Tyr Val Ser 900 905 910 Gin Leu Ala Ser Pro Met Cys Gly Asp Lys Asp Thr Leu Ala Thr Glu 915 920 925 Pro Pro Vai Pro Vai His Gly Ser Glu Tyr Lys Arg Gin Met Val Val 930 935 940 Pro Gly Ser Leu Ala Ser Pro Ser Leu Lys Glu Asp Asn Ser Leu Thr 945 950 955 960 Ser Thr Vai Leu Leu Gly Gin Gly Glu Gin 965 970

<210> 121 <211> 2910 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 415 <223> Polinucleótido degenerado que codifica o polipéptido da SEQ ID NO: 120. <221> misc_feature <222> (1) .. . (2910)

<223> N = A, T, G ou C <221> misc_feature <222> (1) .. . (2910)

<223> n = A, T, C ou G <400> 121 416 atggcnttyw sngtngtnyt ncaycçngcn ttyytnytng cngtnytnws nytnragngcn 60

Hsniugnwsng argtnytnga rgarccriytn ccnytnacnc cngarathca yaargtnwsn 120 ttycarytna arytncarga rgtnaayytn gartggacng tnccngcnyt tiacncaygar 180 gacytnaaya tgathttyca rathgarath wsnmgnytna ayathwsnaa yacnathtgg 240 gtngaraayt aywsnacnac ngtnaarmgn gargargcng tnmgntggaa ytggacnwsn 300 gayathccny tngartgygt naarcaytty athragnathm gngcnytngt ngaygayacn 360 aarwsnytnc cncarwsnws ntggggnaay tggwsnwsnt ggaargargt naaygcnaar 420 gtnwsngtnç arccngayaa rwsnytnath ttyccnaarg ayaargtnyt ngargarggn 480 wsnaaygtna cnathtgyyt natgtayggn caraaygtnt ayaaygtnws ntgyaarytn 540 cargaygarc cnathcaygg ngarcarytn gaywsncayg tnwsnytnyt naarytnaay 600 aaygtnçtnt tyytnwsnga yacnggnacn aayathaayt gycargcnac naarggnccn 660 aarmgnatht tyggnacngt nytattygtn wsnaatgtny tngargarcc naaraaygtn 720 wsntçygara cnmgngaytt yaaracnytn gaytgywsnt gggarccngg ngtngayacn 780 acnytnacnt ggmgnaarca rmgnttycar aaytayacny tntgygarws nttywgnaar 840 ragntgygarg tnwsnaayta ymgnaaywsn tayacntggc arathacnga rggnwsncar 900 garatgtaya ayttyacnyt nacngcngar aaycarytnm gnaarragnws ngtnaayath 960 aayttyaayy tnacncayitig ngtncayccn aargcnccnc argaygtnao nytnaarath 1020 athggngcna cnaargcnaa yatgacntgg aargtncayw sncayggnaa yaaytayacn 1080 ytnytntgyc argtnaaryt ncartayggn gargtnathc aygarcayaa ygtnwsngtn 1140 cayatgwsng cnaaytayyt nttywsngay ytngayccng ayacnaarta yaargcntty 1200 gtnmgntgyg cnwsngcnaa ycayttytgg aartggwsng aytggacnca raargartty 1260 wsnacnccng aracngcncc nwsncargcn ytngaygtnt ggmgncargt ntggwsngar 1320 aayggnmgnra gnathgtnac nytnttytgg aarccnytny tnaarwsnca rgcnaayggn 1380 aarathathw sntayaayat hgtngtngar aaygargcna arccnacnga rwgngarçay 1440 taytgygtnt gggcnccngc nytnusnacn aayytnwsny tngayytnca rccntayaar 1500 athmgnatha cngcnaayaa ywsnatgggn gcnwsnccng arwsnytnat ggtnytnwsn 1560 aaygaywsng gncaygargt naargaraar acnathaaig gnathaarga ygcnttyaay 1620 athwsntggg arccngtnws nggngayacn atgggtitayg tngtngaytg gtgygcncay 1680 wsncargayc armgntgyga yytncartgg aaraayytng gnccnaayac nacnwsnacn 1740 acnathacnw sngaygaytt yaarccnggn gtnmgn.taya ayttyrognat httygarmgn 1800 wsngtngatc ayaatgcnmg nytngtngar aarearmgng gntayacnca rgatytngen 1860 ccnytngtna ayccnaargt ngarathccn taywsnacnc cnaaywsntt ygtnytnmgn 1920 tggccngayt aygaywsnga yttycargcn ggnttyatha arggntayyt ngtntaygtn 1980 aarwanaarg aratgcartg yaaycarccn tgggarmgna cnytnytncc ngayaaywsn 2040 gtnytntgya artaygayat haayggnwsn garacnaara cnytnacngt ngaraayytn 2100 carccngarw snytntayga rttyttygtn acnccntaya cnwsngcngg nccnggnccn 2160 aaygaracat tyacnaargt nacnacnccn gaygcnmgnw sncayatgyt nytncarath 2220 athytnccna tgacnytntg ygtnytnytn wsnathathg tntgytaytg gaarwsncar 2280 tgggtnaarg araartgyta yccngayath ccnaayccnt ayaarwsnws nathytnwsn 2340 ytnathaarw snaaraaraa yccncayytn athatgaayg tnaargaytg yathccngay 2400 gtnytngarg tnathaayaa rgcngarggn wsnaaracnc artgygtngg nwsnggnaar 2460 ytncayathg argaygtncc nacnaarccn ccnathgtnc cnacngaraa rgaywsnwsn 2520 ggnccngtnc cntgyathtt yttygaraay ttyacntayg aycarwsngc nttygaywsn 2580 ggnwsncayg gnytnathcc nggnccnytn aargayacng cncaycaryt nggnytnytn 2640 gcnccnccna ayaarttyca raaygtnytn aaraaygayt ayatgaarcc nytngtngar 2700 wsnccnacng argaracnws nytnathtay gtnwsncary tngcnwsncc natgtgyggn 2760 gayaargaya cnytngcnac ngarccnccn gtnccngtnc ayggnwsnga rtayaarmgn 2820 caratggtng tnccnggnws nytngcnwsn ccnwsnytna argatgayaa ywsnytnacn 2880 wsnacngtny tnytnggnca rggngarcar 2910

<210> 122 <211>24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 417 <223> Iniciador ZC43891 <400> 122 gggcagtagg atatgaatca gcat 24 <210> 123 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43900 <400> 123 gaaggcccca gtgctacgt 19 <210> 124 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda ZC43896 de OSMRbeta <400> 124 tcatccggag tcgtgacctt cgtg 24 <210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 418 <223> Iniciador ZC43280 <4 0 0> 125 gagcacgccc ttctcttcct 20

<210> 126 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43281 <400> 126 cgttgcccgt ccgtttacta 20

<210> 127 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda ZC43275 de zcytorl71ig <400> 127 ctgtaattcc tcgactattt tctgtacatc atcacttggt 40

<210> 128 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC40574 419 <4 Ο 0> 128 ctcatttgga attttgccga tt 22 <210> 129 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC40575 <400> 129 ccgagtgaag atcccctttt ta 22

<210> 130 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda ZC43017 GUS <400> 130 tgaacagtca ccgacgagag tgctgg 26 <210> 131 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC28480 <400> 131 cgattcagga cagtcaacag tacc 24 420

<210> 132 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41653 <4 0 0> 132 ccttcgtgaa cgtagcactg g 21

<210> 133 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41655 <4 0 0> 133 19 ctgaaatcca aggcgaggc 19

<210> 134 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41703 <400> 134 20 tgaagctggc cttgctctct 20 <210> 135 421

<211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41704 <4 0 0> 135 19 gagatatgcc cggatggct 19

<210 > 136 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43272 <400> 136 24 gctggtatca ttggtttcct tctc 24

<210> 137 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43273 <400> 137 24 cattotcttt cctctgcaaa ttoa 24

<210> 138 <211> 34 <212> ADN 422 <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda ZC43478 de zcytorl7 <400> 138 tagagaaoat ttootgcgtc ttttacttcg acag 34

<210> 139 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43278 <400> 139 aaacaagagt ctcaggatct ttataacaac 30

<210> 140 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43279 <400> 140 acggcagctg tattgattcg 121

<210> 141 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial 423 <220> <223> Sonda ZC43276 de zcytorl71ig <400> 141 taaagcaggc atctgggatg tcagca 26

<210> 142 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43045 <400> 142 aaacatgata tttcagatag agatcagtag act 33

<210> 143 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43046 <400> 143 cttatgaaat gtttgacaca ctccaa 26

<210> 144 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda ZC43141 de OSMRbeta 424 <4 Ο 0> 144 ctgtgcgttg gaactggacg tctgatatc 29 <210> 145 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43004 <400> 145 gaaacccgcc gcatattact t 21 <210> 146 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43005 <400> 146 tggcgttgct cacaaaggt 19 <210> 147 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda GUS murina ZC43018 <400> 147 425 acccacacca aagccctgga cctc 24 <210> 148 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC40269 <400> 148 gccagtttca cacactcctc ttt 23 <210> 149 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC40268 <400> 149 gcagctattg cactagtcat tttctt 26 <210> 150 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sonda de receptor de transferrina ZC40298 <400> 150 cccaggtagc cactcatgaa tccaatcaa 29 426 <210> 151 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43140 <400> 151 ttcttccaca gcaatcgcac 20 <210> 152 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC43139 <400> 152 atgcatgctt cggttcagaa c 21 <210> 153 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41608 <400> 153 gcagacaatg atgctgagca agac 24 <210> 154 <211> 24 427 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41609 <400> 154 caacgctgtg atttgcagtg gaag 24 <210> 155 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41502 <400> 155 agcgggcctt cctcactc 18 <210> 156 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador ZC41500 <400> 156 ggacaaaata aaaacataaa taac 24 <210> 157 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial 428 <220> <223> Linker <4 Ο 0> 157 tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc 40 <210> 158 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Linker <400> 158 acgcgcagac taattcgagc tcccaccatc accatcacca cgcgaattcg gtaccgctgg <210> 159 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Linker <400> 159 actcactata gggcgaattg cccgggggat ccacgcggaa ccagcggtac cgaattcgcg <210> 160 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> 429 <223> Linker <4 Ο 0> 160 acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat tg 42 <210> 161 <211> 825 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (48) . . . . (518) <400> 161 430 atcactctct ttaatcacta ctcacattaa cctcaactcc tgccaca atg tac agg 56

Met Tyr Arg 1 atg caa etc ctg tet tgc att gca cta att ctt gca ctt gtc aca aac 104 Met Gin Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu ile Leu Ala Leu Val Thr Asn 5 10 15 agt gca cct act tea agt teg aca aag aaa aca aag aaa aca cag cta 152 Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Lys Lys Thr Gin Leu 20 25 30 35 caa ctg gag cat tta ctg ctg gat tta cag atg att ttg aat gga att 200 Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu Asn Gly Ile 40 45 50 aat aat tac aag aat ccc aaa ctc acc agg atg etc aca ttt aag ttt 248 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 55 60 65 tac atg ccc aag aag gee aca gaa ctg aaa cag ctt cag tgt cta gaa 296 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin Cys Leu Glu 70 75 80 gaa gaa ctc aaa cct ctg gag gaa gtg ctg aat tta gct caa age aaa 344 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu vai Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lys 85 90 95 aac ttt cac tta aga ccc agg gac tta ate age aat ate aac gta ata 392 Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val lie 100 105 110 115 gtt ctg gaa cta aag gga tet gaa aca aca ttc atg tgt gaa tat gca 440 Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 120 125 130 gat gag aca gca acc att gta gaa ttt ctg aac aga tgg att acc ttt 488 Asp Glu Thr Ala Thr Ile Vai Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe 135 140 145 tgt caa age ate ate tea aca cta act tga taattaagtg cttcccactt 538 Cys Gin Ser Ile ile Ser Thr Leu Thr * 150 155 aaaacatatc aggccttcta tttatttatt taaatattta aattttatat ttattgttga 598 atgtatggtt gctacctatt gtaactatta ttcttaatct taaaactata aatatggatc 658 ttttatgatt ctttttgtaa gccctagggg ctctaaaatg gtttacctta tttatcccaa 718 aaatatttat tattatgttg aatgttaaat atagtatcta tgtagattgg ttagtaaaac 778 tatttaataa atttgataaa tataaaaaaa aaaaacaaaa aaaaaaa 825 <210> 162 <211> 156 431

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 162

Met Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ile Leu Ala Leu 1 5 10 15 Vai Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Lys Lys 20 25 30 Thr Gin Leu Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Ile Leu 35 40 45 Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr 50 55 60 Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin 65 70 75 80 Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Vai Leu Asn Leu Ala 35 90 95 Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu ile Ser Asn Ile 100 105 110 Asn Vai Ile Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys 115 120 125 Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Vai Glu Phe Leu Asn Arg Trp 130 135 140 Ile Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 145 150 155 <210> 163 <211> 614 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (64) . . .. (525) <400> 163 432 gatcgttagc ttctcctgat aaactaattg cctcacattg tcactgcaaa tcgacaccta 60 tta atg ggt ctc acc tcc caa ctg ctt ccc cct ctg ttc ttc ctg cta 108 Met Gly Leu Thr Ser Gin Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu 1 5 10 15 gca tgt gcc ggc aac ttt gtc cac gga cac aag tgc gat ate acc tta 156 Ala Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu 20 25 30 cag gag ate ate aaa act ttg aac age ctc aca gag cag aag act ctg 204 Gin Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gin Lys Thr Leu 35 40 45 tgc acc gag ttg acc gta aca gac ate ttt gct gcc tcc aag aac aca 252 Cys Thr Glu Leu Thr Vai Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr 50 55 60 act gag aag gaa acc ttc tgc agg gct gcg act gtg ctc ccg cag ttc 300 Thr Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gin Phe 65 70 75 tac age cac cat gag aag gac act ege tgc ctg ggt gcg act gca cag 34S Tyr Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gin 80 85 90 95 cag ttc cac agg cac aag cag ctg ate cga ttc ctg aaa cgg ctc gac 396 Gin Phe His Arg His Lys Gin Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp 100 105 110 agg aac ctc tgg ggc ctg gcg ggc ttg aat tcc tgt cct gtg aag gaa 444 Arg Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro val Lys Glu 115 120 125 gcc aac cag agt acg ttg gaa aac ttc ttg gaa agg cta aag acg ate 492 Ala Asn Gin Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile 130 135 140 atg aga gag aaa tat tea aag tgt teg age tga atattttaat 1 ttatgagttt 545 Met Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser ★ 145 150 ttgatagctt tattttttaa gtatttatat atttataact catcataaaa taaagtatat 60S atagaatct 614

<210> 164 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 164 433

Met Gly Leu Thr Ser Gin Leu Leu Fro Fro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Vai His Gly His Lys Cys Asp lie Thr Leu Gin 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gin Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Vai Thr Asp lie Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Vai Leu Arg Gin Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gin Gin 85 90 95 Phe His Arg His Lys Gin Leu lie Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Vai Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gin Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150 <210> 165 <211> 756 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (9) . . . . (443) <440> 165 434 gctggagg atg tgg ctg cag age ctg ctg etc ttg ggc act gtg gee tgc 50 Met Trp Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Vai Ala Cys 15 10 age ate tet gea ccc gee ege teg ccc age ccc age acg cag ccc tgg 98 Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gin Pro Trp 15 20 25 30 gag cat gtg aat gee ate cag gag gee cgg cgt etc ctg aac ctg agt 146 Glu His Vai Asn Ala Ile Gin Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser 35 40 45 aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc ate tea gaa 194 Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Vai Glu Vai Ile Ser Glu 50 55 60 atg ttt gac etc cag gag ccg acc tgc cta cag acc ege ctg gag ctg 242 Met Phe Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu Leu 65 70 75 tac aag cag ggc ctg cgg ggc age etc acc aag etc aag ggc ccc ttg 290 Tyr Lys Gin Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu 80 85 90 acc atg atg gee age cac tac aag cag cac tgc cct cca acc ccg gaa 338 Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gin His Cys Pro Pro Thr Pro Glu 95 100 105 110 act tcc tgt gea acc cag act ate acc ttt gaa agt ttc aaa gag aac 386 Thr Ser Cys Ala Thr Gin Thr Ile Thr Phe Glu Set Phe Lys Glu Asn 115 120 125 ctg aag gac ttt ctg ctt gtc ate ccc ttt gac tgc tgg gag cca gtc 434 Leu Lys Asp Phe Leu Leu Vai Ue Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Vai 130 135 140 cag gag tga gaccggccag atgaggctgg ccaagccggg gagctgctct 483

Gin Glu * ctcatgaaac aagagetaga aactcaggat ggtcatcttg gagggaccaa ggggtgggcc 543 acagccatgg tgggagtggc ctggacctgc cctgggccac actgaccctg atacaggcat 603 ggcagaagaa tgggaatatt ttatactgac agaaatcagt aatatttata tatttatatt 663 tttaaaatat ttatttattt atttatttaa gtteatatte catatttatt caagatgttt 723 taccgtaata attattatta aaaatatgct tet 756

<210> 166 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 166 435

Met Trp Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Vai Ala Cys Ser Ile 15 10 15

Ser Ala Pro Ala Arg Ser Fro Ser Fro Ser Ihr Gin Pro Trp Glu His 20 25 30

Vai Asn Ala Ile Gin Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp 35 40 45

Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Vai Glu Vai Ile Ser Glu Met Phe 50 55 60

Asp Leu Gin Glu Pro Thr Cys Leu Gin Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys

i: 30 135 <210> 167 <211> 60 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D .. . (60) <221> Variação <222> (25) . . . (30) <223> n = A , G, C, ou T <221> misc_ feature <222> (D - - . (60) <223> n = A , T, C ou G 65 70 75 80 Gin Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met 85 90 95 Met Ala Ser His Tyr Lys Gin His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser 100 105 110 Cys Ala Thr Gin Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys 115 120 125 Asp Phe Leu Leu Vai Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Vai Gin Glu <400> 167 436 gcc aca gaa ctg aaa cag ctt cag nnn nnn gaa gaa gaa ctc aaa cct 43 Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin Xaa Xaa Glu Glu Glu Leu Lys Pro 15 10 15 ctg gag gaa gtg 60

Leu Glu Glu Vai 20

<210> 168 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> VARIAÇÃO <222> (9)...(10) <223> Qualquer aminoácido

<221> VARIAÇÃO <222> (1)...(20) <223> Xaa = Qualquer aminoácido <400> 168

Ala Thr Glu Leu Lys Gin Leu Gin Xaa Xaa Glu Glu Glu Leu Lys Pro 15 10 15

Leu Glu Glu Vai 20 437

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na wo 9717450 A [0124] wo 9717451 A [0124] wo 9802536 A [0124] wo 9802565 A [0124] wo 9824893 A [0149] us 5399346 A, Anderson [0217] us 4650764 A, Temin [0217] us 4980289 A, Temin [0217] us 5124263 A, Ternin [0217] wo 9507358 A, Dougherty [0217] JP 4244018 A [0235] us 4603044 A, Geho [ 0236] EP 08102636 A [0563] us 60350325 B [0563] us 60375323 B [0563] us 60435315 B [0563]

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Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a uma porção da SEQ ID NO: 2, em que a dita porção consiste em entre 30 e 100 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 2, e em que a dita porção contém aminoácidos seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 54 a 59 da SEQ ID NO: 2; (b) resíduos de aminoácido 129 a 134 da SEQ ID NO: 2; (c) resíduos de aminoácido 53 a 58 da SEQ ID NO: 2; (d) resíduos de aminoácido 35 a 40 da SEQ ID NO: 2; (e) resíduos de aminoácido 33 a 38 da SEQ ID NO: 2; (f) resíduos de aminoácido 114 a 119 da SEQ ID NO: 2; (g) resíduos de aminoácido 101 a 105 da SEQ ID NO: 2; (h) resíduos de aminoácido 126 a 131 da SEQ ID NO: 2; (i) resíduos de aminoácido 113 a 118 da SEQ ID NO: 2; e (j) resíduos de aminoácido 158 a 162 da SEQ ID NO: 2.

2. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a um polipéptido que consiste em resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 54 a 59 da SEQ ID NO: 2 (b) resíduos de aminoácido 129 a 134 da SEQ ID NO: 2; (c) resíduos de aminoácido 53 a 58 da SEQ ID NO: 2 ; (d) resíduos de aminoácido 35 a 40 da SEQ ID NO: 2 ; (e) resíduos de aminoácido 33 a 38 da SEQ ID NO: 2; (f) resíduos de aminoácido 114 a 119 da SEQ ID NO: 2; (g) resíduos de aminoácido 101 a 105 da SEQ ID NO: 2; (h) resíduos de aminoácido 126 a 131 da SEQ ID NO: 2; (i) resíduos de aminoácido 113 a 118 da SEQ ID NO: 2; (j) resíduos de aminoácido 158 a 162 da SEQ ID NO: 2. 2

3. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o anticorpo é seleccionado a partir do grupo de: (a) um anticorpo policlonal, (b) um anticorpo monoclonal murino, (c) um anticorpo humanizado derivado de (b) , e (d) um anticorpo monoclonal humano.

4. Um anticorpo isolado ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a um polipéptido que consiste numa porção da SEQ ID NO: 11, em que a dita porção consiste em entre 30 e 100 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 11, e em que a dita porção contém a sequência de aminoácido seleccionada a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 34 a 39 da SEQ ID NO: 11; (b) resíduos de aminoácido 46 a 51 da SEQ ID NO: 11; (c) resíduos de aminoácido 131 a 136 da SEQ ID NO: 11; (d) resíduos de aminoácido 158 a 163 da SEQ ID NO: 11; e (e) resíduos de aminoácido 157 a 162 da SEQ ID NO: 11.

5. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo que especificamente se liga a um polipéptido que consiste em resíduos de aminoácido seleccionados a partir do grupo que consiste em: (a) resíduos de aminoácido 34 a 39 da SEQ ID NO: 11; (b) resíduos de aminoácido 46 a 51 da SEQ ID NO: 11; (c) resíduos de aminoácido 131 a 136 da SEQ ID NO: 11; (d) resíduos de aminoácido 158 a 163 da SEQ ID NO: 11; e (e) resíduos de aminoácido 157 a 162 da SEQ ID NO: 11.

6. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o anticorpo é seleccionado a partir do grupo de: (a) um anticorpo policlonal, (b) um anticorpo monoclonal murino, e (c) um anticorpo monoclonal.

7. Um anticorpo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que o anticorpo compreende ainda um 3 radionuclídeo, enzima, substrato, cofactor, marcador fluorescente, marcador quimioluminescente, etiqueta de péptido, partícula magnética, fármaco, ou toxina.

8. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 para utilização na redução de inflamação induzida por um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 27 a 164 da SEQ ID NO: 2.

9. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 para utilização no tratamento de um mamífero afligido com uma doença inflamatória, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo especificamente se liga a um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 27 a 164 da SEQ ID NO: 2.

10. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 6 para utilização na redução de inflamação induzida por um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 31 a 163 da SEQ ID NO: 11.

11. Um anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 6 para utilização no tratamento de um mamífero afligido com uma doença inflamatória, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo especificamente se liga a um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 31 a 163 da SEQ ID NO: 11.

12. Um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1-7 para utilização num método de supressão de uma resposta inflamatória num mamífero com inflamação, sendo que o dito método compreende: (1) determinar o nível de uma molécula inflamatória; 4 (2) administrar o dito medicamento; (3) determinar um nível após a administração da molécula inflamatória; (4) comparar o nível da molécula inflamatória na etapa (1) com o nível da molécula inflamatória na etapa (3), em que uma falta de aumento ou uma diminuição no nível de molécula inflamatória é indicativo de supressão de uma resposta inflamatória.

13. Um anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a doença é uma doença inflamatória crónica, tal como uma doença inflamatória crónica seleccionada a partir do grupo de: (a) doença intestinal inflamatória; (b) colite ulcerativa; (c) doença de Crohn; (d) dermatite atópica; (e) eczema; e (f) psoríase.

14. Um anticorpo para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que a doença é uma doença inflamatória aguda, tal como uma doença inflamatória aguda seleccionada a partir do grupo de: (a) endotoxemia (b) septicemia; (c) síndrome do choque tóxico; e (d) doença infecciosa.

15. Um método in vitro de detecção da presença de um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 27 a 164 da SEQ ID NO: 2 numa amostra biológica, que compreende as etapas de: (a) colocar em contacto a amostra biológica com um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, de acordo com 5 qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a colocação em contacto é realizada sob condições que permitem a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo à amostra biológica, e (b) detectar qualquer dos anticorpos ligados ou fragmentos de anticorpo ligados.

16. Um método in vitro de detecção da presença de um polipéptido que compreende os resíduos de aminoácido 31 a 163 da SEQ ID NO: 11 numa amostra biológica, que compreende as etapas de: (a) colocar em contacto a amostra biológica com um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer das reivindicações 4 a 6, em que a colocação em contacto é realizada sob condições que permitem a ligação do anticorpo ou fragmento de anticorpo à amostra biológica, e (b) detectar qualquer dos anticorpos ligados ou fragmentos de anticorpo ligados.

17. Um método in vitro para detectar inflamação num paciente, que compreende: (a) incubar uma amostra de tecido ou uma amostra biológica de um paciente com um anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3 sob condições em que o anticorpo se liga ao seu polipéptido complementar na amostra de tecido ou biológica; (b) visualizar o anticorpo ligado na amostra de tecido ou biológica; e (c) comparar os níveis de anticorpo ligado na amostra de tecido ou biológica do paciente com uma amostra de tecido ou biológica normal de controlo, em que um aumento no nível de anticorpo ligado à amostra de tecido ou biológica do paciente em relação à amostra de tecido ou biológica normal de controlo é indicativo de inflamação no paciente.