CN104826100A

CN104826100A - 一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用

Info

Publication number: CN104826100A
Application number: CN201510187995.1A
Authority: CN
Inventors: 宣春玲; 钱泓; 吴有强; 吴素芳; 吕朋; 查银河; 张屹峰; 汪正亮
Original assignee: Oceanic Rise Bio Tech Ltd Zhejiang
Current assignee: Oceanic Rise Bio Tech Ltd Zhejiang
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2015-04-16
Publication date: 2015-08-12

Abstract

本发明公开了一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的重组亚单位疫苗制备方法通常包括以下步骤：将编码猪瘟病毒E2蛋白截短体(TE2)基因克隆到杆状病毒载体pFastBac^TM1中，通过转染昆虫细胞sf9获得能够表达TE2蛋白的重组杆状病毒。利用重组杆状病毒感染处于对数生长期的昆虫细胞high five，使TE2蛋白在细胞培养上清中大量表达。最后回收纯化培养上清从而得到大量纯度大于90％的重组蛋白TE2。使用本发明所提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，从而缩短了蛋白纯化时间，并且避免了回收细胞内蛋白所需消耗的大量时间，简化了疫苗生产步骤。在简化生产步骤的前体下，本发明提供的TE2重组蛋白具有免疫原性强、安全性高等优点，动物试验也证明该重组蛋白能够有效刺激机体产生高效的体液免疫应答。

Description

一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用，属于生物疫苗制备技术领域。

背景技术

猪瘟在欧洲称为古典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(ClassicalSwine Fever Virus，CSFV)引起猪的一种急性、热性、接触性传染病。以发病急，高热稽留和小血管壁变性引起广泛出血、梗塞和坏死等病变为特征，家养和野生猪是其唯一的天然宿主。世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。

猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属成员，为单链线状RNA病毒。该病毒与同属的牛病毒性腹泻病毒之间有共同抗原性。病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜，病毒粒子表面有脆弱的纤突结构。目前认为猪瘟病毒仍只有一种血清型，但是病毒株的毒力有强、中、弱之分。CSFV基因组长约12.5kb，仅含有1个大的开放性阅读框(ORF)，此ORF编码约4000个氨基酸残基分子量约438ku的多聚蛋白，在病毒与宿主细胞蛋白酶的作用下将其加工为12种成熟蛋白，依次为N^pro，C，E^ms，E1，E2，p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。其中C，E^ms，E1和E2为结构蛋白，其余为非结构蛋白。E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击。

疫苗免疫是控制猪瘟流行的重要手段。经过多年应用，公认安全有效的弱毒疫苗株有三种：①中国兔化弱毒疫苗；②日本GPE(-)细胞弱毒疫苗；③法国“Thiveosal”冷变异弱毒株。其中中国学者研制成功的中国系(C系)猪瘟兔化弱毒疫苗，自1957年起，除在我国广泛应用外，已推广到欧亚很多国家，并帮助这些国家控制或消灭了猪瘟。该疫苗被公认为目前世界上比较理想的猪瘟疫苗。目前我国市场上常用的猪瘟疫苗有3种，即猪瘟细胞活疫苗(细胞苗)、猪瘟乳兔组织活疫苗(组织苗)、猪瘟脾淋活疫苗(脾淋苗)。

猪瘟活疫苗(细胞源)是通过体外培养犊牛睾丸细胞增殖病毒制备而成。猪瘟活疫苗(细胞源)的优点是抗原含量相对较高(目前市场上的高效细胞苗达到7500RID/头份)；能产生较高的抗体水平；可大规模生产、质控容易、操作方便、供量充足。但是，由于在疫苗制备过程中使用了原代细胞，因此该疫苗存在诸多缺陷，如：存在批次差异；无细胞病变，不易控制病毒产量；猪瘟活疫苗(细胞源)的原辅材料涉及犊牛睾丸细胞和牛血清，导致其制备过程中存在BVDV污染的风险。BVDV感染猪能引起疑似猪瘟的症状。近几年，在我国就有报道由BVDV污染的猪瘟疫苗引起的猪病。乳兔组织苗和成兔脾淋苗的免疫原性虽然比较好，且无BVDV污染风险，但是由于在疫苗制备过程中需要使用兔子，因此这类疫苗存在以下不足，如：不容易大规模生产；不同品种、批次、环境中兔的敏感性不一；容易污染外源细菌；个别动物注射后会发生过敏反应。

发明内容

本发明CSFV E2亚单位疫苗优点：1.大规模生产、供量充足、质控容易；2.安全性高；3.批次间稳定；4.生产成本低；5.无BVDV污染风险。

本发明要解决的问题是提供一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法与应用。

一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法，包括下述步骤：

1)将猪瘟病毒E2的截短体蛋白TE2编码基因克隆到杆状病毒表达系统中得到重组杆状病毒质粒Bacmid-KSPTE2。

2)转染sf9细胞得到重组杆状病毒Bv-KSPTE2，用昆虫细胞扩大培养后回收纯化得到TE2蛋白。

3)将猪瘟病毒TE2蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到猪瘟病毒重组亚单位疫苗。

具体地，1)所述重组杆状病毒质粒Bacmid-KSPTE2的构建方法为先将Kozak序列基因和GP67信号肽基因克隆到载体pFastBac^TM1上从而得到中间质粒pFastBac1-KSP，再将TE2蛋白编码基因(含His标签)克隆到中间质粒pFastBac1-KSP中得到重组质粒pFastBac1-KSPTE2，最后将重组质粒pFastBac1-KSPTE2转化至大肠杆菌DH 10Bac感受态细胞中，利用Tn7位点特异性重组方法最终获得重组杆状病毒质粒bacmid-KSPTE2。

2)所述扩大培养为：重组杆状病毒质粒bacmid-KSPTE2转染对数期sf9细胞(细胞密度为1.5-2.5×10⁶/ml)得到P1毒；两代扩增后以P3代病毒感染对数期昆虫细胞High five进行扩大培养。

2)所述纯化回收为：离心收集2)扩大培养细胞上清，先后通过亲和层析与离子交换层析纯化得到目的蛋白。

3)所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA 201VG。

所述的TE2蛋白编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，GP67信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Kozak序列如SEQ ID NO.5所示。

所述猪瘟病毒E2截短体蛋白(TE2)应用于亚单位疫苗制备。

附图说明

图1、pFastBac^TM1质粒图谱。

图2、pFastBac1-KSPTE2双酶切鉴定结果。M：DNA Marker DL5,000；1：重组质粒pFastBac1-KSPTE2双酶切电泳结果。

图3、bacmid-KSPTE2PCR鉴定结果。M：DNA Marker DL5,000；1.M13引物PCR鉴定重组杆状病毒质粒bacmid-KSPTE2电泳结果。

图4、Western blot(anti-His)鉴定TE2蛋白表达。阳：阳性对照；M：PrestainedProtein Ladder；阴：阴性对照；TE2：TE2培养上清。

图5、镍柱亲和层析色谱图及SDS-PAGE结果。

图6、Source 15Q柱色谱图及SDS-PAGE结果。

图7、IDEXX试剂盒检测TE2免疫后抗体效价结果图。

具体实施方式

实施例1表达载体的构建

1.1猪瘟病毒RNA提取

用Trizol从猪瘟病毒培养上清中提取RNA作为反转录的模板。

1.2RNA反转录成cDNA

使用takara的Primescript RT-PCR kit进行实验。

1.3PCR扩增引物(酶切位点用下划线标出)：

上游引物：5’-CG GAATTCCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC-3’

下游引物：5’-CCC AAGCTT TTA GTGATGGTGATGGTGATGAACAAATTCTGCGAAGTAATC-3’

加样体系为(50μl)：

PCR扩增程序：

1.4胶回收DNA片段：

(1)将步骤1.3的50μl体系反应液进行1％琼脂糖凝胶电泳(98V 45min)；

(2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5ml EP管中；利用天根生物的DNA提取试剂盒回收DNA片段，具体操作步骤如下：

(3)向步骤(2)中的1.5ml EP管中加入500μl PC buffer，50℃，水浴10min；

(4)将步骤(3)中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心12,000rpm 30sec；

(5)弃废液，向吸附柱中心加入600μl PW buffer，静置3min，离心12,000rpm，30sec；

(6)重复步骤(5)；

(7)空吸附柱离心12,000rpm 1min；

(8)向吸附柱中心加入30μl ddH₂O，静置3min，离心(12,000rpm，2min)；

(9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。

1.5双酶切反应(40μl体系)：

在1.5ml EP管中按照步骤1.5进行加样、混匀，而后将这两个40μl反应液置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。

1.6胶回收双酶切产物：

同步骤1.4

1.7连接反应(10μl体系)：

在1.5ml EP管中按照上述体系进行加样、混匀，而后将连接反应液置于16℃水浴16h后取出，65℃水浴15min后进行灭活，将样品4℃保存。

1.8转化实验：

(1)取出步骤1.7的10μl连接反应液，向其中添加100μl E.coli DH5α感受态细胞，混匀；

(2)冰浴30min；

(3)42℃热激90sec；

(4)冰浴2min；

(5)向EP管中加入600μl LB液体培养基，37℃水浴1h；

(6)离心(8,000rpm，2min)，去掉600μl液体，剩余100μl LB重悬菌体；

(7)取菌液铺板于LB平板中(Amp浓度为100μg/ml)，将LB平板置于生化恒温培养箱中37℃培养12h。

1.9重组质粒提取及酶切鉴定：

(1)从转化平板中挑取单克隆菌落至3ml LB液体培养基中，37℃，260rpm摇菌过夜；

(2)取1ml菌液至1.5ml EP管中，离心(12,000rpm，2min)，弃上清；

(3)向步骤(2)中的EP管中加入250μl P1buffer，重悬菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μl P2buffer，温和混匀，静置2min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μl P3buffer，温和混匀；

(6)将步骤(5)溶液离心(12,000rpm，10min)；

(7)将步骤(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，离心(8,000g，30sec)；

(8)弃废液，向吸附柱中心加入500μl wash buffer，离心(9,000g，30sec)；

(9)重复步骤(8)；

(10)空吸附柱离心(9,000g，1min)；

(11)向吸附柱中心加入30μl Elution buffer，静置2min，离心(12,000rpm，2min)；

(12)收集步骤(11)DNA样品进行电泳；

(13)如步骤1.5所示，对提取到的质粒进行酶切鉴定，而后进行1％琼脂糖凝胶电泳。

重组质粒pFastBac1-KSPTE2酶切结果见图2。如图所示，经过BamH I与HindIII双酶切后分别得到约4,800bp左右的载体片段与1,200bp左右目的片段，与预期大小一致。

实施例2重组pFastBac1-KSPTE2质粒转化大肠杆菌DH 10Bac

(1)取100μl的DH10Bac感受态细胞置于冰上；

(2)加至少1ng重组pFastBac1-KSPTE2质粒至100μl DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min；

(3)42℃水浴热激45sec，EP管插回冰上，静置2min；

(4)在超净台内加入900μl无抗性的LB培养液；

(5)37℃220rpm震荡培养4h；

(6)4h后取10μl菌液涂KGT三抗平板(50μg/ml Kanamycin，7μg/mlGentamicin和10μg/ml Tetracycline，100μg/ml Bluo-gal，和40μg/ml IPTG)，于37℃避光培养48h；

(7)挑选白斑转接至KGT三抗平板继续37℃培养24h左右。后挑选均匀的白斑，每个单克隆加至50μl KGT三抗LB液体培养基中，37℃，220rpm震荡培养；

按照步骤1.3对培养菌液进行PCR鉴定，结果见图3。由图3可见，M13引物能够扩增出一条3,500bp的片段。由此可见，目的基因已通过Tn7转座作用成功插入到杆状病毒基因组中。

实施例3bacmid-KSPTE2提取

(1)取菌液PCR鉴定为阳性的白斑菌液转接到5ml KGT三抗的LB液体培养基中继续37℃225rpm过夜培养；

(2)取过夜培养的1ml菌液接种到于100ml KGT三抗LB液体培养基中继续37℃225rpm过夜培养，按照碱裂解法抽提Bacmid质粒；

(3)将培养的菌液分装到2个50ml的离心管中，4℃12,000rpm离心10min；

(4)弃上清，尽可能吸干培养液，回收菌体，加入10ml冰预冷溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·HCl，10mmol/L EDTA，pH 8.0，使用时加入40μg/ml RNase A)用移液器轻轻吹打，使菌体完全悬浮；

(5)加入新鲜配置的溶液II20ml(1％SDS，0.2M NaOH)，盖紧管口，轻轻颠倒离心管数次，以混合内容物，切勿用力振荡，然后将离心管置于冰上5min；

(6)加入15ml冰预冷的溶液III(5M醋酸钾，2M冰乙酸)，盖紧管口，轻轻颠倒混匀，使溶液III在黏稠的细菌裂解液中分散均匀，置于冰上5-10min，此时可观察到出现白色絮状沉淀(蛋白质和大肠杆菌基因组DNA)；

(7)4℃，12,000rpm离心30min，小心吸取上清后再离心10min，在上清中加入2/3倍体积的冷异丙醇，轻轻颠倒混匀几次，冰浴30min以上，4℃离心，12,000rpm 30min；

(8)弃掉上清后，加入10ml 75％乙醇洗涤沉淀，4℃12,000rpm离心10min，弃掉上清，将沉淀室温干燥5-10min至透明，用适量10mM Tris-HCl，pH8.0溶解沉淀并分装，即为重组Bacmid质粒，置于4℃或-20℃保存，用nano分光光度计测定bacmid样品浓度。

实施例4重组杆状病毒Bv-KSPTE2的获得

(1)准备好悬浮培养的sf9细胞，细胞处于对数生长期，密度约1.5-2.5×10⁶cell/ml，铺六孔板，每孔8-9×10⁵个细胞；

(2)在生物安全柜中，取Cellfectin II6-8μl加入到100μl unsupplementedGrace’s Medium中，轻轻混匀，静置5min；另取bacmid 1-2μg加入到100μlunsupplemented Grace’s Medium中，轻轻混匀，然后将Cellfectin II与bacmid轻轻混匀，室温孵育15-45min。

(3)孵育完成后，加入0.8ml unsupplemented Grace’s Medium，轻混后，沿板壁缓缓加入植入细胞的六孔板中，放入27℃培养箱中孵育5h。

(4)弃去六孔板中的混合液，每孔加2ml Sf-900^TM III SFM培养基，27℃培养箱中孵育72h。观察转染现象。

取培养细胞液上清与5×SDS-PAGE loading buffer混合后，煮沸10min，适当离心后即可进行聚丙烯凝胶电泳，再进行western blot检测。由图4可知，TE2在细胞培养液中大量表达，蛋白分子量与预期一致。

实施例5蛋白纯化

5.1镍柱亲和层析

收集细胞培养上清：4℃，8,000rpm离心1h，弃沉淀，上清液用0.45μm滤膜抽滤，以去掉杂质防止堵塞Histrap FF蛋白层析柱；

预装柱处理：用超纯水平衡5CV(column volume)，排出乙醇保存液；

结合(4℃操作)：使用蠕动泵，将样品泵入柱子，流速为1ml/min，收集流穿液，取20μl用于SDS-PAGE检测；

洗脱：用20CV以上体积的Binding buffer(20mM NaH₂PO₄，500mM NaCl，pH7.4)洗柱，流速为2ml/min，把未结合上柱的蛋白冲洗干净，至OD₂₈₀nm基线平稳为止，依次用1％，2％，3％，4％，20％的Elution buffer(20mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)梯度洗脱；

蛋白电泳：配制12％聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶80V恒压电泳，分离胶120V恒压电泳，SDS-PAGE结果见图5。

5.2离子交换层析

Source 15Q柱平衡：用为20CV的A buffer(10mM NaH₂PO₄，pH 8.0)平衡离子交换柱，流速2ml/min；

样品处理：用2L的A buffer透析样品液，4℃进行透析，1h/次，共透析3次，透析完成后样品液过0.45μm滤器；

上样及洗脱：上样流速为1ml/min，洗脱流速为2ml/min，用B Buffer(10mMNaH₂PO₄，500mM NaCl，pH 8.0)梯度洗脱：0-15％B，8CV洗脱；

蛋白电泳：配制12％聚丙烯酰胺凝胶，浓缩胶80V恒压电泳，分离胶120V恒压电泳，SDS-PAGE结果见图6。

5.3蛋白浓度测定：采用BCA法测定蛋白浓度；

蛋白得率为21mg/L。

实施例6疫苗制备与免疫试验

将适量TE2蛋白加入到ISA 201VG佐剂中(体积比为46∶54)，使蛋白终浓度为30μg/ml，超声乳化。

选3-4周龄长白猪进行试验，每次免疫1ml TE2蛋白疫苗(30μg/ml)，初免三周后加强免疫一次，免疫后每周取血1次，分离血清，用阻断ELISA方法测定抗体效价。

由图7结果可以看出，TE2亚单位疫苗阻断率明显高于市场上某品牌的成兔脾淋苗。在一免21天时所产生的抗体(阻断率＞70％)理论上已经足以保护猪群免受猪瘟病毒的感染。在二免7天和二免14天阻断率约为90％，已经达到试剂盒的检测上限，故没有体现效价的上升。

Claims

1.一种猪瘟病毒重组亚单位疫苗的制备方法，其基本特征包括下述步骤：

1)猪瘟病毒E2的截短体蛋白TE2其特征在于如(a)或(b)的蛋白质：

(a)由SEQ ID NO.1所示的氨基酸组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有猪瘟病毒E2蛋白抗原性的由(a)衍生的蛋白质。

2)将TE2蛋白编码基因克隆到杆状病毒表达系统中得到重组杆状病毒质粒Bacmid-KSPTE2。

3)转染sf9细胞得到重组杆状病毒Bv-KSPTE2，用昆虫细胞扩大培养后回收纯化得到TE2蛋白。

4)将TE2蛋白与药学上可接受的佐剂充分混匀后得到猪瘟病毒重组亚单位疫苗。

2.权利要求1所述的疫苗制备方法，其特征在于2)所述重组杆状病毒质粒Bacmid-KSPTE2的构建方法为先将Kozak序列基因和GP67信号肽序列基因克隆到载体pFastBac^TM1上从而得到中间质粒pFastBac1-KSP，再将TE2蛋白编码基因(含His标签)克隆到中间质粒pFastBac1-KSP中得到重组质粒pFastBac1-KSPTE2，最后将重组质粒pFastBac1-KSPTE2转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，利用Tn7位点特异性重组方法最终获得重组杆状病毒质粒bacmid-KSPTE2。

3.权利要求1所述的疫苗抗原制备方法，其特征在于3)所述扩大培养为：重组杆状病毒质粒bacmid-KSPTE2转染对数期sf9细胞(细胞密度为1.5-2.5×10⁶/rnl)得到P1毒；两代扩增后以P3代病毒感染对数期昆虫细胞High five进行扩大培养。优选地，所述杆状病毒感染复数(MOI)为0.5-10，进一步优化为1；优选地，所述培养时间为56-63h。

4.权利要求1所述的疫苗制备方法，其特征在于3)所述回收纯化为：离心收集3)扩大培养细胞上清，先后通过亲和层析与阴离子交换层析纯化得到目的蛋白。优选地但不限于，所述的亲和层析是Histrap FF层析柱；优选地但不限于，所述的阴离子交换层析是source 15Q层析柱；优选地但不限于，所述的阴离子交换层析使用的缓冲液包括：缓冲液A：10mMNaH₂PO₃，pH8.0；缓冲液B：10mM NaH₂PO₃，500mM NaCI，pH8.0；优选地但不限于，所述洗脱缓冲液的洗脱程序是以0-100％洗脱缓冲液B，5-10个柱体积进行梯度洗脱。

5.权利要求1所述的疫苗制备方法，其特征在于4)所述重组亚单位疫苗所用佐剂为ISA201VG。优选地，所述的TE2蛋白与佐剂ISA201VG按体积比46∶54混合乳化。

6.权利要求1所述的TE2蛋白编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，GP67信号肽核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Kozak序列如SEQ ID NO.5所示。

7.权利要求1所述TE2蛋白表达系统包括但不限于昆虫细胞、大肠杆菌、酵母以及哺乳动物细胞等。

8.权利要求1所述截短的猪瘟病毒E2蛋白(TE2)应用于亚单位疫苗制备。