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KR20180054865A - 이중특이성 항-인간 a-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체 및 사용 방법 - Google Patents

이중특이성 항-인간 a-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체 및 사용 방법 Download PDF

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KR20180054865A
KR20180054865A KR1020187012279A KR20187012279A KR20180054865A KR 20180054865 A KR20180054865 A KR 20180054865A KR 1020187012279 A KR1020187012279 A KR 1020187012279A KR 20187012279 A KR20187012279 A KR 20187012279A KR 20180054865 A KR20180054865 A KR 20180054865A
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자비네 임호프-융
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로랑 라리비에르
미카엘 몰호즈
외르크 토마스 레굴라
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Abstract

본원에 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체 및 이를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

이중특이성 항-인간 A-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체 및 사용 방법
본 발명은 인간 Α-베타 및 인간 트랜스페린(transferrin) 수용체에 대한 이중특이성 항체, 이들을 제조하는 방법, 이들 항체를 포함하는 약학 조성물, 및 이들의 용도에 관한 것이다.
모든 경우의 치매의 약 70%는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)에 기인하고, 이는 인지를 위해 중요한 신경 회로 및 뇌 영역의 선택적 손상과 연관된다. 알츠하이머병은, 특별히 해마의 피라미드 뉴런에서의 신경원섬유 매듭(neurofibrillary tangle), 및 주로 아밀로이드 침착물의 치밀한 코어(core) 및 완화된 광륜(halo)을 포함하는 다수의 아밀로이드 플라크(plaque)를 특징으로 한다.
세포외 신경반(neuritic plaque)은 "아밀로이드 β", "Α-베타", "Αβ4", "β-A4" 또는 "Αβ"로 칭해지는 주로 원섬유성의 펩티드를 다량으로 포함한다; 셀코에(Selkoe)의 문헌[Ann. Rev. Cell Biol. 10 (1994) 373-403]; 쿠(Koo)의 문헌[PNAS 96 (1999) 9989-9990]; 미국 특허 제4,666,829호; 및 글레너(Glenner)의 문헌[BBRC 12 (1984) 1131]을 참조한다. 이러한 아밀로이드는 "알츠하이머 전구체 단백질/P-아밀로이드 전구체 단백질"(APP)로부터 유래된다. APP는 내재막(integral membrane) 당 단백질이고[시소디아(Sisodia)의 문헌 "PNAS 89 (1992) 6075" 참조], 혈장 막 프로테아제(protease), α-세크레타아제(secretase)에 의하여 AP 서열내에서 내부단백질분해적으로(endoproteolytically) 분할된다[시소디아(Sisodia)의 1992년 문헌 참조, 조에(Joe) 인용]. 더욱이, 추가의 세크레타아제 활성, 특별히 β-세크레타아제 및 γ-세크레타아제 활성은 39개의 아미노산(Αβ39), 40개의 아미노산(Αβ 40), 42개의 아미노산(Αβ 42) 또는 43개의 아미노산(Αβ 43)을 포함하는 아밀로이드-β(Αβ)의 세포외 방출을 이끈다[신하(Sinha)의 문헌 "PNAS 96 (1999) 11094-1053"; 프라이스(Price)의 문헌 "Science 282 (1998) 1078-1083"; 국제 특허출원 공개공보 제WO 00/72880호 또는 하디(Hardy)의 문헌 "TINS 20 (1997) 154" 참조].
Α-베타는 몇몇의 천연 발생 형태를 갖는 것으로 주지되고, 이로써 인간 형태는 상기 언급된 바와 같이 Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 및 Αβ43으로 지칭된다. 가장 현저한 형태인 Αβ42는 다음의 아미노산 서열을 갖는다(N-말단으로부터 출발함): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(서열 번호 5). Αβ41, Αβ40, Αβ39에서, C-말단 아미노산 A, IA 및 VIA는 각각 소실된다. Αβ43-형태에서 추가적인 트레오닌 잔기는 상기 도시된 서열의 C-말단에 포함된다.
Αβ40 원섬유의 핵을 형성하기 위해 필요한 시간은 Αβ42 원섬유의 핵을 형성하기 위해 필요한 시간에 비해 상당히 더 긴 것으로 보였다[예를 들어, 란스베리(Lansbury, Jr., P. T.) 및 하퍼(Harper, J. D.)의 문헌 "Ann. Rev. Biochem. 66 (1997) 385-407" 참조]. 와그너(Wagner)의 문헌[J. Clin. Invest. 104 (1999) 1239-1332]에서 검토된 바와 같이, Αβ42는 신경반과 연관되어 더욱 빈번히 발견되고, 시험관내에서 더욱 원섬유발생성인 것으로 고려된다. 또한 Αβ42는 정렬된 비-결정질 Αβ 펩티드의 핵형성-의존성 중합화에서 "종자"로서 작용하는 것으로 제안되었다[예를 들어, 자레트(Jarrett)의 문헌 "Cell 93 (1993) 1055-1058" 참조]. 변형된 APP 과정 및/또는 단백성 침착물이 함유된 세포외 플라크의 생성은 알츠하이머의 병리학으로부터 뿐만 아니라, 기타 신경성 및/또는 신경퇴행성 질환을 앓는 환자로부터 공지되어 있다. 이들 질환은, 무엇 보다도, 다운 증후군(Down's syndrome), 네델란드형 아밀로이드증에 의한 유전적 뇌출혈, 파킨슨병(Parkinson's disease), ALS(근위축성 측삭 경화증), 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeldt Jacob disease), HIV-관련된 치매 및 운동 신경병증을 포함한다.
이제까지는, 아밀로이드-관련된 질환에 대하여 단지 제한된 의학적 개입 계획만이 기술되었다. 예를 들면, 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine) 또는 도네페질(donepezil)과 같은 콜린에스테라아제(cholinesterase) 저해제는 단지 경미하거나 중간 정도의 질환을 앓는 알츠하이머 환자에서 유리한 것으로 논의되었다. 그러나, 또한 이들 약물의 콜린성 작용에 기인하여 부작용이 보고되었다. 이들 콜린성-향상 치료가 몇몇 증후적 이점을 생산하지만, 치료학적 반응은 치료되는 대부분의 환자의 경우 만족스럽지 않다. 유의적인 인지적 개선은 치료된 환자의 단지 약 5%에서 발생한 것으로 추정되었고, 치료가 이러한 진행형 질환의 경과를 유의적으로 변경시킨다는 증거는 거의 없다.
결과적으로, 보다 효과적인 치료, 및 특별히 질환의 진행을 저지하거나 지연시킬 수 있는 치료에 대하여 임상적인 요구가 크게 남아 있다. 또한 메만틴(memantine)과 같은 NMDA-수용체 길항물질이 더욱 최근에 이용되었다.
그러나, 약리학적 활성에 기인한 부작용이 보고되었다. 추가로, 이들 NMDA-수용체 길항물질에 의한 이러한 치료는 단지 증후적 접근법이고, 질병을 고치는 것으로 고려될 수 없다.
또한 아밀로이드-관련된 질환의 치료를 위한 면역조절 접근법이 제안되었다. 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/27944호는 Α-베타 펩티드의 부분 및 담체 분자를 포함하는 컨주게이트(conjugate)를 개시하고, 여기서 이러한 담체 분자는 면역 반응을 향상시켜야 한다. 또 다른 활성 면역화 접근법은 국제 특허출원 공개공보 제WO 00/72880호에 언급되어 있고, 여기서 또한 Α-베타 단편은 면역 반응을 유도하기 위해 이용된다.
또한 일반적인 항-Α-베타 항체에 의한 수동 면역화 접근법이 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/27944호 또는 제WO 01/62801호에 제안되었고, Α-베타 부분들에 대해 유도되는 특이적인 인간화된 항체는 국제 특허출원 공개공보 제WO 02/46237호, 제WO 02/088306호 및 제WO 02/088307호에 기재되어 있다. 국제 특허출원 공개공보 제WO 00/77178호는 가수분해 동안 β-아밀로이드에 의해 채택되는 전이 상태에 결합하는 항체를 기재한다. 국제 특허출원 공개공보 제WO 03/070760호는 Α-베타 펩티드 상에서 2개의 불연속성 아미노산 서열을 인식하는 항체 분자를 개시한다.
국제 특허출원 공개공보 제WO 2014/033074호는 혈뇌 장벽 상의 수용체에 결합하는 혈뇌 장벽 셔틀(shuttle), 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다. 트랜스페린 수용체 단일클론성 항체에 의한 IgG 융합 단백질의 혈뇌 장벽 약물 전달은 파드리지(Pardridge, W.)의 문헌[Exp. Opin. Drug Deliv. 12 (2015) 207-222]에 보고되어 있다. 유(Yu, Y.J.) 등의 문헌[Sci. Translat. Med. 6 (2014) 261ra154-261ra154]에는 치료학적 이중특이성 항체가 인간 이외의 영장류에서 혈뇌 장벽을 가로지르는 것으로 보고되어 있다. 트랜스페린 수용체 및 Α-베타 아밀로이드 펩티드를 표적화하는 4가 이중특이성 항체를 매일 피하 투여 받은 알츠하이머병을 앓는 유전자도입 마우스의 뇌에서 아밀로이드 플라크가 분해됨이 숨브리아(Sumbria, R.K.) 등의 문헌[Mol. Pharm. 10 (2013) 3507-3513]에 보고되었다. 니에워흐너(Niewoehner, J.) 등의 문헌[Neuron 81 (2014) 49-609]에는 1가 분자 셔틀을 사용하는 치료학적 항체의 증가된 뇌 침투 및 효능이 보고되어 있다.
본원에
a) 각각 (전장) 항체 경쇄 및 (전장) 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 (전장) 항체(여기서 (전장) 중쇄 및 (전장) 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합함), 및
b) (전장) 항체의 중쇄중 하나의 C-말단에 융합된 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체가 보고되고,
여기서 각각의 (전장) 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고[카밧(Kabat)에 따라 번호매김],
여기서 각각의 (전장) 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 불변성 경쇄 도메인(CL) 및 불변성 중쇄 도메인 1(CH1)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버(crossover)를 포함하고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
하나의 실시태양에서, 추가적인 Fab 단편은 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 C-말단에 융합된다.
하나의 실시태양에서, Fab 단편의 중쇄 가변성 도메인의 N-말단은 (전장) 중쇄의 C-말단 또는 펩티드 연결기의 C-말단에 융합된다.
하나의 실시태양에서,
a) 추가적인 Fab 단편에 융합된 전장 중쇄는 C-말단 중쇄 아미노산 잔기로서 트리펩티드 LSP를 갖고, 여기서 이의 프롤린은 펩티드 결합을 경유하여 펩티드 연결기에 또는 추가적인 Fab 단편의 제1 아미노산 잔기에 직접적으로 융합되고,
b) 추가적인 Fab 단편에 융합되지 않은 전장 중쇄는 C-말단 중쇄 아미노산 잔기로서 트리펩티드 LSP, 또는 SPG, 또는 PGK를 갖는다.
하나의 실시태양에서, (전장) 항체는
a) 인간 아강(subclass) IgG1의 전장 항체,
b) 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
e) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
f) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
g) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, I253A, H310A 및 H435A를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
h) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T 및 T256E를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체이다.
하나의 실시태양에서, (전장) 항체는
a) 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
b) 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
e) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 i) T366W, 및 ii) S354C 또는 Y349C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 i) T366S, L368A, 및 Y407V, 및 ii) Y349C 또는 S354C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
f) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 i) T366W, 및 ii) S354C 또는 Y349C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 i) T366S, L368A, 및 Y407V, 및 ii) Y349C 또는 S354C를 갖는 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
g) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, I253A, H310A 및 H435A를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 i) T366W, 및 ii) S354C 또는 Y349C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 i) T366S, L368A, 및 Y407V, 및 ii) Y349C 또는 S354C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
h) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T 및 T256E를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 i) T366W, 및 ii) S354C 또는 Y349C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 i) T366S, L368A, 및 Y407V, 및 ii) Y349C 또는 S354C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체, 또는
i) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, H310A, H433A 및 Y436A를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 i) T366W, 및 ii) S354C 또는 Y349C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 i) T366S, L368A, 및 Y407V, 및 ii) Y349C 또는 S354C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체이다.
하나의 실시태양에서, 추가적인 Fab 단편은 돌연변이 T366W를 포함하는 중쇄의 C-말단, 또는 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하는 중쇄의 C-말단에 융합된다.
하나의 실시태양에서,
전장 항체는 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 항체이고,
추가적인 Fab 단편은 돌연변이 T366W를 포함하는 중쇄의 C-말단, 또는 돌연변이 T366S, L368A, 및 Y407V를 포함하는 중쇄의 C-말단에 융합된다.
모든 양태들의 하나의 실시태양에서, 인간 Α-베타 결합 자리는 서열 번호 18의 VH 서열(이 서열의 번역후 변형을 포함함), 및 서열 번호 19의 VL 서열(이 서열의 번역후 변형을 포함함)을 포함한다.
모든 양태들의 하나의 실시태양에서, 인간 트랜스페린 수용체 결합 자리는 서열 번호 20의 VH 서열(이 서열의 번역후 변형을 포함함), 및 서열 번호 21의 VL 서열(이 서열의 번역후 변형을 포함함)을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는
i) 서열 번호 1에 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄,
ii) 서열 번호 2에 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄,
iii) 서열 번호 3에 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및
iv) 서열 번호 4에 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 Fab 단편을 포함하고, 여기서
서열 번호 1은 아미노산 서열
Figure pct00001
를 갖고,
서열 번호 2는 아미노산 서열
Figure pct00002
를 가지며,
서열 번호 3은 아미노산 서열
Figure pct00003
를 갖고,
서열 번호 4는 아미노산 서열
Figure pct00004
를 갖는다.
본원에 보고된 하나의 양태는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 (전장) 경쇄, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 (전장) 중쇄, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 (전장) 경쇄, 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체이다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는 단일클론성이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 본원에 보고된 이중특이성 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 본원에 보고된 이중특이성 항체를 인코딩하는 본원에 보고된 핵산을 포함하는 숙주 세포이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 본원에 보고된 이중특이성 항체를 생산하는 방법이다:
a) 이중특이성 항체가 생산되도록 본원에 보고된 숙주 세포를 배양하는 단계, 및
b) 이중특이성 항체를 세포 또는 배양 배지로부터 회수하고, 이로써 본원에 보고된 이중특이성 항체를 생산하는 단계.
본원에 보고된 하나의 양태는 본원에 보고된 이중특이성 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역컨주게이트이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 본원에 보고된 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 약제로서 사용하기 위한 본원에 보고된 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 알츠하이머병을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 보고된 이중특이성 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 뇌에서 플라크의 형성을 저해/둔화시키는데 사용하기 위한 본원에 보고된 이중특이성 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는데 사용하기 위한 본원에 보고된 이중특이성 항체이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 본원에 보고된 이중특이성 항체의 약제의 제조에 있어서의 용도이다.
하나의 실시태양에서, 약제는 아밀로이드 질환의 치료를 위한 것이다.
하나의 실시태양에서, 약제는 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 하나의 실시태양에서, 질환은 치매, 알츠하이머병, 운동 신경병증, 다운 증후군, 크로이츠펠트 야콥병, 네델란드형 아밀로이드증에 의한 유전적 뇌출혈, 파킨슨병, HIV-관련된 치매, ALS 또는 노화와 관련된 신경원성 질환으로 이루어진 군에서 선택된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 약제는 알츠하이머병의 치료를 위한 것이다.
하나의 실시태양에서, 약제는 뇌에서 플라크의 형성을 저해/둔화시키기 위한 것이다. 하나의 실시태양에서, 약제는 β-아밀로이드 플라크의 붕해를 위한 것이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 앓는 개체에게 효과량의 본원에 보고된 이중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 알츠하이머병을 앓는 개체에게 효과량의 본원에 보고된 이중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병을 앓는 개체를 치료하는 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 개체에게 효과량의 본원에 보고된 이중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함하여 뇌에서 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는, 개체의 뇌에서 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는 방법이다.
본원에 보고된 하나의 양태는 개체에게 효과량의 본원에 보고된 이중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함하여 뇌에서 플라크의 형성을 저해/둔화시키는, 개체의 뇌에서 플라크의 형성을 저해/둔화시키는 방법이다.
노브 인투 홀(knob into hole) 이량체화 모듈 및 항체 조작에서의 이들의 용도는 카터(Carter P.); 리지웨이(Ridgway J.B.B.); 프레스타(Presta L.G.)의 문헌[Immunotechnology, Volume 2, Number 1 , February 1996, pp. 73-73]에 기재되어 있다. CH3 도메인에서의 추가적인 디설파이드 가교는 머찬트(Merchant, A.M.) 등의 문헌[Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681]에 보고되어 있다.
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적인 정보는 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[Sequences of 단백질s of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공된다.
본원에 사용될 경우, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변성 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 카밧(Kabat) 등의 문헌[Sequences of 단백질s of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 카밧 번호매김 시스템에 따라 번호매겨지고, 이는 본원에서 "카밧에 따른 번호매김"으로서 지칭된다. 구체적으로, 카밧(Kabat) 등의 문헌[Sequences of 단백질s of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 카밧 번호매김 시스템(제647면 내지 제660면 참조)은 카파 및 람다 이소타입(isotype)의 경쇄 불변성 도메인 CL을 위해 사용되고, 카밧 EU 지수 번호매김 시스템(제661면 내지 제723면 참조)은 불변성 중쇄 도메인을 위해 사용된다(CH1, 힌지(Hinge), CH2 및 CH3, 이는 본 경우에 "카밧 EU 지수에 따른 번호매김"으로 지칭함으로써 본원에서 더욱 명확해 진다).
I. 정의
"혈액-뇌 장벽" 또는 "BBB(blood-brain-barrier)"는 말초 순환 및 뇌와 척수 사이의 생리학적 장벽을 지칭하고, 이는 뇌 모세관 내피 혈장 막내에서 밀착 연접(tight junction)에 의해 형성되어, 분자, 심지어 매우 작은 분자, 예컨대 우레아(60 달톤)가 뇌 안으로 수송되는 것을 제한하는 밀착 장벽을 생성한다. 뇌내의 BBB, 척수내의 혈액-척수 장벽, 및 망막내의 혈액-망막 장벽은 CNS내의 인접한 모세관 장벽이고, 본원에서 총체적으로 혈액-뇌 장벽 또는 BBB로 지칭된다. BBB는 또한 혈액-CSF 장벽(맥락총)을 내포하고, 여기서 장벽은 모세관 내피 세포로 구성되기 보다는 상의(ependymal) 세포로 구성된다.
용어 "항-인간 Α-베타 항체" 및 "인간 Α-베타에 특이적으로 결합하는 항체"는 Α-베타 펩티드를 표적화하는데 있어서 항체가 진단학적 및/또는 치료학적 제제로서 유용하도록 충분한 친화도로 인간 Α-베타 펩티드에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
인간 Α-베타는 몇몇의 천연 발생 형태를 갖는 것으로 주지되고, 이로써 인간 형태는 상기 언급된 바와 같이 β39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 및 Αβ43으로 지칭된다. 가장 현저한 형태인 Αβ42는 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는다. Αβ41, Αβ40, Αβ39에서, C-말단 아미노산 A, IA 및 VIA는 각각 소실된다. Αβ43의 형태에서, 추가적인 트레오닌 잔기는 서열 번호 5의 C-말단에 포함된다. 하나의 실시태양에서, 인간 Α-베타 단백질은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 갖는다.
이와 같이, 이러한 용어는 또한 인간 Α-베타 폴리펩티드의 단축된 단편에 결합하는 항체를 내포한다.
"중추 신경계" 또는 "CNS"는 신체적 기능을 제어하고 뇌와 척수를 포함하는 신경 조직의 복합체를 지칭한다.
"혈액-뇌 장벽 수용체"(본원에서 "BBBR"로 약자화됨)는 BBB를 가로질러 분자를 수송할 수 있거나 외래성의 투여된 분자를 수송하기 위해 사용되는, 뇌 내피 세포 상에서 발현되는 세포외 막-연결된 수용체 단백질이다. 본원에서 BBBR의 예로는: 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGF-R), 저 밀도 지질단백질 수용체, 예컨대 제한없이 저 밀도 지질단백질 수용체-관련된 단백질 1(LRP1) 및 저 밀도 지질단백질 수용체-관련된 단백질 8(LRP8), 및 헤파린-결합 표피 성장 인자-유사 성장 인자(HB-EGF)가 포함된다. 하나의 바람직한 BBBR은 트랜스페린 수용체(TfR)이다.
"트랜스페린 수용체"("TfR")는 척추동물에서 철 섭취에 관여하는 2개의 디설파이드-결합된 서브유닛(각각의 겉보기 분자량은 약 90,000 Da임)으로 구성된 막간 당단백질(약 180,000 Da의 분자량을 가짐)이다. 하나의 실시태양에서, 본원에 언급된 TfR은, 예를 들면 슈나이더(Schneider) 등의 문헌[Nature 311 (1984) 675-678]에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TfR이다. 하나의 실시태양에서, 인간 트랜스페린 수용체는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 갖는다.
"다중특이성 항체"는 동일한 항원 또는 2개의 상이한 항원 상의 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 표시한다. 예시적인 다중특이성 항체는 BBBR 및 뇌 항원 둘 다에 결합한다. 다중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어 F(ab')2 이중특이성 항체) 또는 이의 조합물(예를 들어 전장 항체 + 추가적인 scFv 또는 Fab 단편)로서 제조될 수 있다. 2개, 3개 이상(예를 들어 4개)의 작용성 항원 결합 자리를 갖는 조작된 항체가 또한 보고되어 있다[예를 들어, 미국 특허출원 공개공보 제2002/0004587 A1호 참조].
본 발명의 목적을 위해 "억셉터(acceptor) 인간 골격구조"는, 아래에 정의된 바와 같이, 인간 면역글로불린 골격구조 또는 인간 컨센서스(consensus) 골격구조로부터 유래된 경쇄 가변성 도메인(VL) 골격구조 또는 중쇄 가변성 도메인(VH) 골격구조의 아미노산 서열을 포함하는 골격구조이다. 인간 면역글로불린 골격구조 또는 인간 컨센서스 골격구조"로부터 유래된" 억셉터 인간 골격구조는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이는 아미노산 서열 변화를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 몇몇 실시태양에서, VL 억셉터 인간 골격구조는 서열에 있어서 VL 인간 면역글로불린 골격구조 서열 또는 인간 컨센서스 골격구조 서열과 동일하다.
"친화도"는 분자(예를 들어 항체)의 단일 결합 자리 및 그의 결합 파트너(예를 들어 항원) 사이의 비-공유적 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용될 경우, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어 항체 및 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수(kd)에 의해 표시될 수 있다. 친화도는, 본원에 기재된 방법들을 비롯하여, 예컨대 표면 플라즈몬 공명과 같은 당분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다.
"친화도 성숙된" 항체는 하나 이상의 과가변성 영역(HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖고, 이러한 변경으로 인하여 변경되지 않는 모 항체에 비하여 항원에 대한 항체의 친화도가 개선되는 항체를 지칭한다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고 다양한 항체 구조물, 예컨대 제한되지 않지만 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체)를, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 내포한다.
용어 "항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)"은 Fc 수용체 결합에 의해 중재되는 작용이고, 효과자 세포의 존재하에 본원에 보고된 항체에 의한 표적 세포의 용해를 지칭한다. ADCC는 하나의 실시태양에서 CD19 발현 적혈구 세포(예를 들어 재조합 인간 CD19를 발현하는 K562 세포)의 제조물을 효과자 세포, 예컨대 신선하게 단리된 PBMC(말초 혈액 단핵 세포), 또는 백혈구연층(buffy coat)으로부터 정제된 효과자 세포, 예컨대 단핵구 또는 NK(천연 킬러) 세포의 존재하에 본원에 보고된 항체에 의해 처리함으로써 측정된다. 표적 세포는 51Cr에 의해 표지화되고, 후속적으로 항체와 함께 항온처리된다. 표지화된 세포는 효과자 세포와 함께 항온처리되고 상청액은 방출된 51Cr에 대해 분석된다. 대조군은 표적 내피 세포를 항체의 부재하에 효과자 세포와 함께 항온처리한 것을 포함한다. ADCC를 중재하는 초기 단계를 유도하는 항체의 능력은, Fcγ 수용체 발현 세포, 예컨대 FcγRI 및/또는 FcγRIIA를 재조합적으로 발현하는 세포 또는 NK 세포(필수적으로 FcγRIIIA 발현)에 대한 이들의 결합을 측정함으로써 조사된다. 하나의 바람직한 실시태양에서, NK 세포 상에서의 FcγR에 대한 결합이 측정된다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는, 제한되지 않지만, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체가 포함된다.
용어 "키메라성" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원 또는 종으로부터 유래되는 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 근원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "강(class)"은 그의 중쇄에 의해 소유되는 불변성 도메인 또는 불변성 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 강인 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들중 몇몇은 추가로 아강(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2으로 나눠진다. 면역글로불린의 상이한 강에 상응하는 중쇄 불변성 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ으로 지칭된다.
용어 "세포독성제"는 본원에 사용될 경우 세포 작용을 저해 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 일으키는 물질을 지칭한다. 세포독성제로는, 제한되지 않지만, 방사성 동위원소(예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물[예를 들어, 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리미신(adriamicin), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)(빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 에토포시드(etoposide)), 독소루비신(doxorubicin), 멜팔란(melphalan), 미토마이신(mitomycin) C, 클로람부실(chlorambucil), 다우노루비신(daunorubicin) 또는 다른 삽입 제제]; 성장 저해제; 효소 및 이의 단편, 예컨대 핵용해(nucleolytic) 효소; 항생제; 독소, 예컨대 소분자 독소, 또는 박테리아, 균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소(이의 단편 및/또한 변형물 포함); 및 이후 기재되는 다양한 항종양제 또는 항암제가 포함된다.
용어 "보체-의존성 세포독성(CDC)"은 보체의 존재하에 본원에 보고된 항체에 의해 유도된 세포의 용해를 지칭한다. CDC는, 하나의 실시태양에서, CD19 발현 인간 내피 세포를 본원에 보고된 항체에 의해 보체의 존재하에 처리함으로써 측정된다. 세포는 하나의 실시태양에서 칼세인(calcein)에 의해 표지화된다. CDC는, 항체가 표적 세포의 20% 이상의 용해를 30 ㎍/㎖의 농도에서 유도하는 경우 발견된다. 보체 인자 Clq로의 결합은 ELISA에서 측정될 수 있다. 이러한 검정에서 원칙적으로 ELISA 플레이트는, 정제된 인간 Clq 또는 인간 혈청이 첨가되는 항체의 농도 범위로 코팅된다. Clq 결합은, Clq에 대해 유도되는 항체에 의해, 이어서 퍼옥시다아제(peroxidase)-표지화된 컨주게이트에 의해 검출된다. 결합의 검출(최대 결합 B최대값)은, 퍼옥시다아제 기질 ABTS(등록상표)(2,2'-아지노-디-[3-에틸벤젠티아졸린-6-설포네이트(6)])에 대한 405 nm(OD405)에서의 광학 밀도로서 측정된다.
"효과자 작용"은 항체의 Fc-영역에 기여할 수 있는 이들의 생물학적 활성을 지칭하고, 이는 항체 강에 따라 달라진다. 항체 효과자 작용의 예로는: Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B-세포 수용체)의 하향-조절; 및 B-세포 활성화가 포함된다.
Fc 수용체 결합 의존성 효과자 작용은 항체의 Fc-영역과 Fc 수용체(FcR)의 상호작용에 의해 중재될 수 있고, 상기 수용체는 조혈 세포 상의 특수화된 세포 표면 수용체이다. Fc 수용체는 면역글로불린 상과(superfamily)에 속하고, 면역 복합체의 식세포작용에 의한 항체-코팅된 병원체의 제거, 및 적혈구 및 상응하는 항체로 코팅된 다양한 기타 세포 표적(예를 들어 종양 세포)의 용해 둘 다를, 항체 의존성 세포 중재된 세포독성(ADCC)을 통해 중재하는 것으로 제시되었다[예를 들어 반 데 윈켈(Van de Winkel, J.G.) 및 앤더슨(Anderson, C.L.)의 문헌 "J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524" 참조]. FcR은 면역글로불린 이소타입에 대한 이들의 특이성에 의해 정의되고: IgG 항체에 대한 Fc 수용체는 FcγR로 지칭된다. Fc 수용체 결합은, 예를 들어 라베취(Ravetch, J.V.) 및 키넷(Kinet, J.P.)의 문헌[Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]; 카펠(Capel, P.J.) 등의 문헌[Immunomethods 4 (1994) 25-34]; 드 하스(de Haas, M.) 등의 문헌[J. Lab. Clin. Med. 126 (1995) 330-341]; 및 게스너(Gessner, J.E.) 등의 문헌[Ann. Hematol. 76 (1998) 231-248]에 기재되어 있다.
IgG 항체의 Fc-영역에 대한 수용체(FcγR)의 가교-결합은 식세포작용, 항체-의존성 세포 세포독성, 및 염증성 중재자의 방출, 뿐만 아니라 면역 복합체 소거 및 항체 생산의 조절을 유도하는 매우 다양한 효과자 작용을 개시한다. 인간에서, FcγR의 3가지 강이 특징지워졌고, 이는 다음과 같다:
- FcγRI(CD64)는 단량체 IgG에 높은 친화도로 결합하고, 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구 상에서 발현된다. 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327 및 P329(카밧의 EU 지수에 따라 번호매김)중 적어도 하나에서 Fc-영역 IgG의 변형은 FcγRI로의 결합을 감소시킨다. IgG1 및 IgG4로 치환되는, 위치 233-236에서의 IgG2 잔기는 FcγRI로의 결합을 103-배 감소시켰고, 항체-감작화된 적혈구에 대한 인간 단핵구 반응을 제거하였다[아모르(Armour, K.L.) 등의 문헌 "Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2613-2624"];
- FcγRII(CD32)는 착화된 IgG에 중간 내지 낮은 친화도로 결합하고 광범위하게 발현된다. 이러한 수용체는 2가지 하위-유형, FcγRIIA 및 FcγRIIB로 나뉘어질 수 있다. FcγRIIA는 살해에 관여하는 많은 세포(예를 들어 대식세포, 단핵구, 호중구) 상에서 발견되고 살해 과정을 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. FcγRIIB는 저해 과정에서 일정한 역할을 수행하는 것으로 보이고, B-세포, 대식세포 상에서 및 비만 세포 및 호산구 상에서 발견된다. B-세포 상에서, 이는 면역글로불린 생산, 및 예를 들면, IgE 강으로의 이소타입 전환을 추가로 억제하는 작용을 하는 것으로 보인다. 대식세포 상에서, FcγRIIB는 FcγRIIA를 통해 중재되는 경우 식세포작용을 저해하는 작용을 한다. 호산구 및 비만 세포 상에서 B-형태는 그의 별도의 수용체로의 IgE 결합을 통해 이들 세포의 활성화를 억제하는 것을 도울 수 있다. FcγRIIA에 대한 감소된 결합은, 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292, 및 K414(카밧의 EU 지수에 따라 번호매김)중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체의 경우 발견된다;
- FcγRIII(CD16)은 IgG에 중간 내지 낮은 친화도로 결합하고 2개의 유형으로서 존재한다. FcγRIIIA는 NK 세포, 대식세포, 호산구 및 몇몇 단핵구, 및 T 세포 상에서 발견되고, ADCC를 중재한다. FcγRIIIB는 호중구 상에서 높게 발현된다. FcγRIIIA로의 감소된 결합은, 예를 들어 아미노산 잔기 E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, E293, Y296, V303, A327, K338 및 D376(카밧의 EU 지수에 따라 번호매김)중 적어도 하나에서 돌연변이를 갖는 IgG Fc-영역을 포함하는 항체의 경우 발견된다.
상기 언급된 돌연변이 자리, Fc 수용체에 대한 인간 IgG1 상의 결합 자리에 대한 지도작성(mapping) 및 FcγRI 및 FcγRIIA로의 결합을 측정하기 위한 방법은 쉴즈(Shields, R.L.) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604]에 기재되어 있다.
제제, 예를 들어, 약학 제형의 "효과량"은, 원하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 달성하기 위해 필요한 기간 동안 및 투여량에서의 효과적인 양을 지칭한다.
용어 "Fc 수용체"는 본원에 사용될 경우 이러한 수용체와 연관된 세포질의 ITAM 서열의 존재에 의해 특징지워지는 활성화 수용체를 지칭한다[예를 들어 라베취(Ravetch, J.V.) 및 볼란드(Bolland, S.)의 문헌 "Annu. Rev. Immunol. 19 (2001) 275-290"]. 이러한 수용체는 FcγRI, FcγRIIA 및 FcγRIIIA이다. 용어 "FcγR의 비 결합"은, 10 ㎍/㎖의 항체 농도에서 본원에 보고된 항체의 NK 세포로의 결합이 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/029879호에 보고된 바와 같은 항-OX40L 항체 LC.001에 대해 발견된 결합의 10% 이하임을 나타낸다.
IgG4는 감소된 FcR 결합을 나타내지만, 다른 IgG 아강의 항체는 강한 결합을 나타낸다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297(Fc 탄수화물의 손실), Pro329 및 234, 235, 236 및 237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 및 His435는 변경될 경우 감소된 FcR 결합을 제공하는 잔기이다[쉴즈(Shields, R.L.) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604"; 룬드(Lund, J.) 등의 문헌 "FASEB J. 9 (1995) 115-119"; 모르간(Morgan, A.) 등의 문헌 "Immunology 86 (1995) 319-324"; 및 EP 제0 307 434호]. 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 항체는 IgG1 또는 IgG2 아강의 항체이고 돌연변이 PVA236, GLPSS331, 및/또는 L234A/L235A를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본원에 보고된 항체는 IgG4 아강의 항체이고, 돌연변이 L235E를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 항체는 추가로 돌연변이 S228P를 포함한다.
용어 "Fc-영역"은 본원에서 불변성 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 이 용어는 고유의 서열 Fc-영역 및 변이체 Fc-영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc-영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 특정되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변성 영역에서 아미노산 잔기의 번호매김은, 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기재된 바와 같은, 소위 EU 지수로서 칭해지는 EU 번호매김 시스템에 따른다.
본원에 보고된 항체는 Fc-영역으로서, 하나의 실시태양에서, 인간 기원으로부터 유래된 Fc-영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, Fc-영역은 인간 불변성 영역의 모든 부분을 포함한다. 항체의 Fc-영역은 보체 활성화, Clq 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관여된다. 보체 시스템에 대한 항체의 영향이 특정 조건에 대해 의존적인 반면, Clq로의 결합은 Fc-영역에서의 규정된 결합 자리에 의해 야기된다. 이러한 결합 자리는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 루카스(Lukas, T.J.) 등의 문헌[J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560]; 브룬하우스(Brunhouse, R.) 및 세브라(Cebra, J. J.)의 문헌[Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917]; 부르톤(Burton, D.R.) 등의 문헌[Nature 288 (1980) 338-344]; 토메센(Thommesen, J.E.) 등의 문헌[Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004]; 이두소기(Idusogie, E.E.) 등의 문헌[J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]; 헤자레(Hezareh, M.) 등의 문헌[J. Virol. 75 (2001) 12161-12168]; 모르간(Morgan, A.) 등의 문헌[Immunology 86 (1995) 319-324]; 및 EP 제0 307 434호에 기재되어 있다. 이러한 결합 자리는, 예를 들어 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329이다(카밧의 EU 지수에 따라 번호매김); 본원에 달리 특정되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변성 영역에서 아미노산 잔기의 번호매김은, 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 기재된 바와 같은, 소위 EU 지수로서 칭해지는 EU 번호매김 시스템에 따른다. 아강 IgG1, IgG2 및 IgG3의 항체는 대체적으로 보체 활성화, Clq 결합 및 C3 활성화를 나타내는 반면, IgG4는 보체 시스템을 활성화시키지 않고, Clq에 결합하지 않으며, C3을 활성화시키지 않는다. "항체의 Fc-영역"은 숙련가에게 잘 공지된 용어이고, 항체의 파파인(papain) 분할에 기초하여 정의된다. 하나의 실시태양에서, Fc-영역은 인간 Fc-영역이다. 하나의 실시태양에서, Fc-영역은 돌연변이 S228P 및/또는 L235E(카밧의 EU 지수에 따라 번호매김)를 포함하는 인간 IgG4 아강의 영역이다. 하나의 실시태양에서, Fc-영역은 돌연변이 L234A 및 L235A(카밧의 EU 지수에 따라 번호매김)를 포함하는 인간 IgG1 아강의 영역이다.
"골격구조" 또는 "FR"은 과가변성 영역(HVR) 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기를 지칭한다. 가변성 도메인의 FR은 일반적으로 다음의 4가지 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환적으로 고유의 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 사용된다. "전장 항체"는 경쇄 불변성 도메인(CL) 및 중쇄 불변성 도메인, CH1, CH2 및 CH3 뿐만 아니라 경쇄 및 중쇄 항원-결합 가변성 영역(VL, VH)을 포함하는 항체이다. 불변성 도메인은 고유의 서열 불변성 도메인(예를 들어 인간 고유의 서열 불변성 도메인) 또는 이의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 더욱 상세히, 전장 항체는 2개의 항체 경쇄(각각 경쇄 가변성 도메인 및 경쇄 불변성 도메인을 포함함) 및 2개의 항체 중쇄(각각 중쇄 가변성 도메인, 힌지(hinge) 영역 및 중쇄 불변성 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함함)를 포함한다. C-말단 아미노산 잔기 K 또는 GK는 전장 항체의 2개의 항체 중쇄에서 서로 독립적으로 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 또한, 전장 항체는 도메인내의 아미노산 부가, 돌연변이 및 결실을 포함하지만, 전체 도메인의 결실을 포함하는 것은 아니다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양액"은 상호교환적으로 사용되고, 이러한 세포의 자손체를 비롯하여 외래성 핵산이 도입되어진 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환 세포"를 포함하고, 이는 계대배양의 수와 무관하게 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손체를 포함한다. 자손체는 핵산 함량에 있어서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 고유적으로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선택될 때 동일한 작용 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손체가 본원에 포함된다.
"인간 컨센서스 골격구조"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 골격구조 서열의 선택에 있어서 가장 흔히 발생되는 아미노산 잔기를 나타내는 골격구조이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변성 도메인 서열의 하위그룹으로부터 선택된다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3]에서와 같은 하위그룹이다. 하나의 실시태양에서, VL의 경우, 하위그룹은 상기 카밧(Kabat) 등의 문헌에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 하나의 실시태양에서, VH의 경우, 하위그룹은 상기 카밧(Kabat) 등의 문헌에서와 같은 하위그룹 III이다.
"인간화된" 항체는 인간 이외의 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라성 항체를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나의, 전형적으로 2개의 가변성 도메인의 실질적으로 모두를 포함하고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어, CDR)은 인간 이외의 항체의 HVR에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 FR에 상응한다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변성 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 인간 이외의 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
용어 "과가변성 영역" 또는 "HVR"은, 본원에 사용될 경우, 서열에서 과가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 한정된 루우프(loop)("과가변성 루우프")를 형성하고/하거나, 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 아미노산 잔기 연신부를 포함하는 항체 가변성 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR을 포함한다; VH에 3개(H1, H2, H3), VL에 3개(L1, L2, L3).
HVR은
(a) 아미노산 잔기 26-32(L1), 50-52(L2), 91-96(L3), 26-32(H1), 53-55(H2), 및 96-101(H3)에서 발생되는 과가변성 루우프[코티아(Chothia, C.) 및 레스크(Lesk, A.M.)의 문헌 "J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917"];
(b) 아미노산 잔기 24-34(L1), 50-56(L2), 89-97(L3), 31-35b(H1), 50-65(H2), 및 95-102(H3)에서 발생되는 CDR[카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242."];
(c) 아미노산 잔기 27c-36(L1), 46-55(L2), 89-96(L3), 30-35b(H1), 47-58(H2), 및 93-101(H3)에서 발생하는 항원 접촉부[맥칼룸(MacCallum) 등의 문헌 "J. Mol. Biol. 262 (1996) 732-745"]; 및
(d) 아미노산 잔기 46-56(L2), 47-56(L2), 48-56(L2), 49-56(L2), 26-35(H1), 26-35b(H1), 49-65(H2), 93-102(H3), 및 94-102(H3)을 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합물을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, 가변성 도메인에서 HVR 잔기 및 기타 잔기(예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 카밧(Kabat) 등의 상기 문헌에 따라 번호매겨진다.
"면역컨주게이트(immunoconjugate)"는 하나 이상의 이종성 분자(들), 제한되지 않지만, 예로서 세포독성제에 컨주게이션되는 항체이다.
"개체" 또는 "피험체"는 포유동물이다. 포유동물로는, 제한되지 않지만, 가축 동물(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 인간 이외의 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)가 포함된다. 특정 실시태양에서, 개체 또는 피험체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 자연 환경의 성분들로부터 분리된 것이다. 몇몇 실시태양에서, 항체는, 예를 들면, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF: isoelectric focusing), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정될 경우 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법을 검토하기 위해, 예를 들어, 플래트만(Flatman, S.) 등의 문헌[J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 대개는 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 이 핵산 분자는 그의 천연 염색체 자리와 상이한 염색체 자리에 또는 염색체 밖에 존재한다.
"항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은, 항체 중쇄 및 경쇄(또는 이의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하고, 단일한 벡터 또는 별도의 벡터들중의 이러한 핵산 분자(들), 및 숙주 세포에서의 하나 이상의 자리에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)를 포함한다.
용어 "단일클론성 항체"는 본원에 사용될 경우 실질적으로 동종성인 항체들의 모집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉 모집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프에 결합하지만, 예를 들어, 천연 발생 돌연변이를 포함하거나 단일클론성 항체 제제의 생산 동안 야기된 가능한 변형 항체는 제외하고, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정자(에피토프)에 대해 유도되는 상이한 항체를 포함하는 다중클론성 항체 제제와 대조적으로, 단일클론성 항체 제제의 각각의 단일클론성 항체는 항원 상의 단일한 결정자에 대해 유도된다. 이와 같이, 한정어 "단일클론성"은, 항체의 실질적으로 동종성인 모집단으로부터 수득된 항체의 특성을 지시하고, 이는 임의의 특별한 방법에 의해 항체를 생산할 필요가 있는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론성 항체는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있고, 제한되지 않지만, 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파아지-표시 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자도입 동물을 이용하는 방법이 포함되고, 이러한 방법 및 단일클론성 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법은 본원에 기재되어 있다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종성 작용부분(moiety)(예를 들어 세포독성 작용부분) 또는 방사성표지에 컨주게이션되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 약학 제형에 존재할 수 있다.
"고유의 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 고유의 IgG 항체는 디설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 3개의 불변성 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)이 수반되는, 가변성 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변성 도메인으로도 지칭되는 하나의 가변성 영역(VH)을 갖고, 여기서 제1 및 제2 불변성 도메인 사이에 힌지 영역이 위치된다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 하나의 불변성 경쇄(CL) 도메인이 수반되는, 가변성 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변성 도메인으로도 지칭되는 하나의 가변성 영역(VL)을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변성 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2가지 유형중 하나로 할당된다.
용어 "패키지 삽입물"은, 지시사항, 용법, 투여량, 투여법, 병용 요법, 사용금지사유에 관한 정보, 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고문 등을 포함하는, 치료 제품의 상업용 패키지에 관례상 포함되는 설명서를 지칭한다.
기준 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요할 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 기준 폴리펩티드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당분야의 숙련가라면, 비교되는 서열의 전장에 대하여 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성% 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인크.(Genentech, Inc.)에 의해 제조되고, 원시 코드(source code)는 사용자 기록문서와 함께 워싱턴 디.씨. 20559 소재의 미국 저작권 사무소(Copyright Office)에 보관되어 있고, 여기서 이는 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크 인크.로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 원시 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 달라지지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B로의, B와의, 또는 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성%(이는 다르게는 소정의 아미노산 서열 B로의, B와의 또는 B에 대한 특정한 아미노산 서열 동일성%을 갖거나 포함한 소정의 아미노산 서열 A로서도 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
X/Y 분율×100
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 동일 부합성으로서 획득된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성%은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성%과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 특별히 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성% 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 문단에서 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "약학 제형"은 이에 포함된 활성 구성성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여되는 피험체에게 허용되지 않도록 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용가능함 담체"는 피험체에 무독성인, 활성 구성성분 이외의 약학 제형중의 구성성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능함 담체로는, 제한되지 않지만, 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함된다.
본원에서 사용될 경우, 용어 "치료"(및 이의 문법적인 변형어, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료될 개체의 자연적 과정을 바꾸려는 시도에 있어서의 임상적인 개입을 지칭하고, 임상적 병리 과정 동안 또는 예방을 위해 수행될 수 있다. 요망되는 치료 효과로는, 제한되지 않지만, 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증후의 경감, 질병의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 억제, 및 경감 또는 개선된 예후가 포함된다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 보고된 항체는 질병의 전개를 지연시키거나 질병의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
용어 "가변성 영역" 또는 "가변성 도메인"은 항원으로의 항체의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 고유의 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변성 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격구조 영역(FR) 및 3개의 과가변성 영역(HVR)을 포함한다[예를 들어, 킨드트(Kindt, T.J.) 등의 문헌 "Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007) page 91" 참조]. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 포르토라노(Portolano, S.) 등의 문헌[J. Immunol. 150 (1993) 880-887]; 클락슨(Clackson, T.) 등의 문헌[Nature 352 (1991) 624-628]을 참조한다.
용어 "벡터"는, 본원에서 사용될 경우, 이것이 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터, 뿐만 아니라 이것이 도입되는 숙주 세포의 게놈내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 "발현 벡터"로서 본원에 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
하나의 양태에서, 본 발명은, 부분적으로, 본원에 보고된 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 개선된 특성을 갖는다는 발견에 기초한다. 특정 실시태양에서, 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 제공된다. 본원에 보고된 항체는, 예를 들어, 알츠하이머병의 진단 또는 치료를 위해 유용하다.
A. 예시적인 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체
하나의 양태에서, 본 발명은 인간 Α-베타 및 인간 트랜스페린 수용체에 결합하는 단리된 이중특이성 항체를 제공한다. 항체는 전장 코어 항체 및 융합된 Fab 단편으로 구성된 이중특이성 항체이고, 여기서 특정 도메인은 십자형으로 교환된다. 이와 같이, 생성된 이중특이성 항체는 비대칭성이다. 따라서, 이중특이성 항체는 "노브-인투-홀"로서 지칭되는 이종이량체화 기술을 사용하여 생산되는데, 이러한 기술은 소위 노브 돌연변이(HC노브)를 갖는 제1 중쇄 및 소위 홀 돌연변이(HC홀)를 갖는 제2 중쇄를 사용한다.
또한 본 발명의 양태인 항체 0012는, 서열 번호 6 내지 09의 아미노산 서열을 갖는 4개의 폴리펩티드로 구성된다.
항체 0012는
a) 각각 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체(여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합함), 및
b) 전장 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체이고,
여기서 각각의 전장 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고(카밧에 따라 번호매김),
여기서 각각의 전장 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 경쇄 가변성 도메인(VL) 및 중쇄 가변성 도메인(VH)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버를 포함하고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
또한 본 발명의 양태인 항체 0015는, 서열 번호 1 내지 03 및 서열 번호 10의 아미노산 서열을 갖는 4개의 폴리펩티드로 구성된다.
항체 0015는
a) 각각 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체(여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합함), 및
b) 전장 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체이고,
여기서 각각의 전장 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고(카밧에 따라 번호매김),
여기서 각각의 전장 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 불변성 경쇄 도메인(CL) 및 불변성 중쇄 도메인 1(CH1)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버를 포함하고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
또한 본 발명의 양태인 항체 0020은, 서열 번호 11 내지 13의 아미노산 서열을 갖는 3개의 폴리펩티드로 구성된다.
항체 0020은
a) 각각 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체(여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합함), 및
b) 전장 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체이고,
여기서 각각의 전장 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고(카밧에 따라 번호매김),
여기서 각각의 전장 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 단일 쇄 Fab 단편이고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
또한 본 발명의 양태인 항체 0024는, 서열 번호 14 내지 17의 아미노산 서열을 갖는 4개의 폴리펩티드로 구성된다.
항체 0024는,
a) 각각 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체(여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합함), 및
b) 전장 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체이고,
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 불변성 경쇄 도메인(CL) 및 불변성 중쇄 도메인 1(CH1)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버를 포함하고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
상이한 발현 플라스미드 및 생성된 플라스미드의 상이한 비율에서의 개별 폴리펩티드의 상이한 배정/조합이 이중특이성 항체의 재조합 생산을 위해 사용되었다. 결과는 하기 표에 제시된다.
Figure pct00005
이중특이성 항체는 소규모로 생산되었고, 부산물 분포는 단백질 A 친화도 크로마토그래피를 사용하는 제1 정제 단계 및 조제용 크기-배제 크로마토그래피를 사용하는 제2 정제 단계 이후 분석되었다. 결과는 하기 표에 제시된다.
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
항 Α-베타 결합 자리는 추가적인 글리코실화 자리를 포함한다. 따라서 글리코실화가 결정되었다. 결과는 하기 표에 제시된다.
Figure pct00009
단백질 A 정제 이후 3 리터 발효물에서의 비-글리코실화된 Fab의 백분율
Figure pct00010
단백질 A 정제 + SEC 정제 이후 3 리터 발효물에서의 비-글리코실화된 Fab의 백분율
Figure pct00011
이중특이성 항체의 안정성은 완충액에서 특정 pH 값에서 14 일 동안 항온처리함으로써 시험되었다. 결과는 하기 표에 제시된다.
Figure pct00012
항체 0015 및 0024의 경우 응집 온도는 대략 53 내지 55℃이고 항체 0012의 경우 대략 54 내지 56℃인 것으로 결정되었다.
비아코어(BIAcore)에 의해 결정될 경우 인간 트랜스페린 수용체로의 결합에 대한 해리-속도(kd[1/Ms])는 항체 0015 및 0024 뿐만 아니라 모 항-인간 트랜스페린 수용체 항체에 대하여 25℃, 37℃ 및 40℃에서 필적할만 하였다: 각각 1.86E-02 내지 1.97E-02, 1.98E-2 내지 2.03E-2 및 1.44E-02.
모든 항체의 Α-베타 특이적 효과자 기능은 U937-세포 검정에서 모 단일특이적 항-Α-베타 항체에 필적가능하였다. 데이터는 하기 표에 제시된다.
Figure pct00013
이중특이성 항체는 시험관내에서 호중구 활성을 전혀 나타내지 않았다.
전체적으로 항체 0015는 적합한 특성을 나타내었고, 따라서 본 발명의 바람직한 양태이다. 더욱이, 이러한 항체는 개선된 특성들을 갖고, 이는 무엇 보다도 개선된 부산물 프로파일(profile)에 있다.
본원의 하나의 양태에서
a) 각각 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체(여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합함), 및
b) 전장 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체가 제공되고,
여기서 각각의 전장 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고(카밧에 따라 번호매김),
여기서 각각의 전장 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 불변성 경쇄 도메인(CL) 및 불변성 중쇄 도메인 1(CH1)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버를 포함하고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이다.
본원에 보고된 또 다른 양태는
a) 각각 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체(여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합함), 및
b) 전장 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체이고,
여기서 각각의 전장 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고(카밧에 따라 번호매김),
여기서 각각의 전장 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 불변성 경쇄 도메인(CL) 및 불변성 중쇄 도메인 1(CH1)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버를 포함하고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이며,
여기서 인간 Α-베타 결합 자리는 서열 번호 18의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인(VH) 서열, 및 서열 번호 19의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL) 서열을 포함하고,
여기서 인간 트랜스페린 수용체 결합 자리는 서열 번호 20의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변성 도메인(VH) 서열, 및 서열 번호 21의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL) 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 이러한 서열을 포함하는 결합 자리는 그의 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 18 또는 20에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 실시태양에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역에서(즉, FR에서) 발생된다.
특정 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비하여 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 포함하지만, 이러한 서열을 포함하는 결합 자리는 그의 항원에 결합하는 능력을 보유한다. 특정 실시태양에서, 총 1 내지 10개의 아미노산은 서열 번호 19 또는 21에서 치환되고, 삽입되고/되거나 결실되었다. 특정 실시태양에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 바깥쪽 영역에서(즉, FR에서) 발생된다.
하나의 실시태양에서, 인간 Α-베타 결합 자리는 서열 번호 18의 VH 서열(이러한 서열의 번역후 변형 포함) 및 서열 번호 19의 VL 서열(이러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 인간 트랜스페린 수용체 결합 자리는 서열 번호 20의 VH 서열(이러한 서열의 번역후 변형 포함) 및 서열 번호 21의 VL 서열(이러한 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 이중특이성 항체는
i) 서열 번호 1에 대하여 70 내지 100%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄,
ii) 서열 번호 2에 대하여 70 내지 100%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄,
iii) 서열 번호 3에 대하여 70 내지 100%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄, 및
iv) 서열 번호 4에 대하여 70 내지 100%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 Fab 단편을 포함하고,
여기서
서열 번호 1은 아미노산 서열
Figure pct00014
를 갖고,
서열 번호 2는 아미노산 서열
Figure pct00015
를 가지며,
서열 번호 3은 아미노산 서열
Figure pct00016
를 갖고,
서열 번호 4는 아미노산 서열
Figure pct00017
를 갖는다.
본원에 보고된 또 다른 양태는
a) 각각 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체(여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합함), 및
b) 전장 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체이고,
여기서 각각의 전장 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고(카밧에 따라 번호매김),
여기서 각각의 전장 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 불변성 경쇄 도메인(CL) 및 불변성 중쇄 도메인 1(CH1)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버를 포함하고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이며,
여기서 인간 Α-베타 결합 자리는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변성 도메인(VH) 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL)을 포함하고,
여기서 인간 트랜스페린 수용체 결합 자리는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변성 도메인(VH) 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL)을 포함한다.
본원에 보고된 또 다른 양태는
a) 각각 전장 항체 경쇄 및 전장 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 전장 항체(여기서 전장 중쇄 및 전장 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리는 제1 항원에 특이적으로 결합하고, 여기서 전장 항체는 Fc-영역 폴리펩티드에 의해 형성되는 Fc-영역을 포함하고, 각각은 2개의 전장 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인을 포함함), 및
b) 전장 항체의 하나의 중쇄의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편(여기서 추가적인 Fab 단편의 결합 자리는 제2 항원에 특이적으로 결합함)을 포함하는 이중특이성 항체이고,
여기서 각각의 전장 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고(카밧에 따라 번호매김),
여기서 각각의 전장 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
여기서 제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 불변성 경쇄 도메인(CL) 및 불변성 중쇄 도메인 1(CH1)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버를 포함하고,
여기서 제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체이며,
여기서 인간 Α-베타 결합 자리는 서열 번호 18의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변성 도메인(VH) 및 서열 번호 19의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL)을 포함하고,
여기서 인간 트랜스페린 수용체 결합 자리는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변성 도메인(VH) 및 서열 번호 21의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변성 도메인(VL)을 포함하고,
여기서 Fc-영역 폴리펩티드는
a) 인간 아강 IgG1의 Fc-영역 폴리펩티드,
b) 인간 아강 IgG4의 Fc-영역 폴리펩티드,
c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 아강 IgG1의 Fc-영역 폴리펩티드,
d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 아강 IgG4의 Fc-영역 폴리펩티드,
e) Fc-영역 폴리펩티드 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖고, 하나의 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 Fc-영역 폴리펩티드,
f) Fc-영역 폴리펩티드 둘 다에서 돌연변이 S228P 및 P329G를 갖고, 하나의 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG4의 Fc-영역 폴리펩티드,
g) Fc-영역 폴리펩티드 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, 1253A, H310A 및 H435A를 갖고, 하나의 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 Fc-영역 폴리펩티드,
h) Fc-영역 폴리펩티드 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T 및 T256E를 갖고, 하나의 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 Fc-영역 폴리펩티드에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 Fc-영역 폴리펩티드, 또는
i) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, H310A, H433A 및 Y436A를 갖고 하나의 중쇄에서 돌연변이 i) T366W, 및 ii) S354C 또는 Y349C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 i) T366S, L368A, 및 Y407V, 및 ii) Y349C 또는 S354C를 갖는 인간 아강 IgG1의 Fc-영역 폴리펩티드이다.
추가의 양태에서, 임의의 상기 실시태양에 따른 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체는 하기 섹션 1 내지 3에 기재된 바와 같이 임의의 특징들을 단일하게 또는 조합하여 포함할 수 있다:
1. 키메라성 및 인간화된 항체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 키메라성 항체이다. 특정 키메라성 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호; 및 모리슨(Morrison, S.L.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 (1984) 6851-6855]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라성 항체는 인간 이외의 가변성 영역(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 래빗, 또는 인간 이외의 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변성 영역) 및 인간 불변성 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라성 항체는 강 또는 아강이 모 항체의 강 또는 아강에서 변경된 "강 스위칭된" 항체이다. 키메라성 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시태양에서, 키메라성 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 인간 이외의 항체는 인간에 대한 면역원성을 감소시키도록 인간화되는 반면, 인간 이외의 모 항체의 특이성 및 친화도는 보유한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상의 가변성 도메인을 포함하고, 여기서 HVR, 예를 들어, CDR(또는 이의 일부)는 인간 이외의 항체로부터 유도되고, FR(또는 이의 일부)는 인간 항체 서열로부터 유래된다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 불변성 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체에서 몇몇 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 증진시키기 위해, 인간 이외의 항체(예를 들어, HVR 잔기가 유래되어진 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 알마그로(Almagro, J.C.) 및 프란손(Fransson, J.) 등의 문헌[Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 검토되어 있고, 추가로, 예를 들어, 리에치만(Riechmann, I.) 등의 문헌[Nature 332 (1988) 323-329]; 퀸(Queen, C.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; 카쉬미리(Kashmiri, S.V.) 등의 문헌[Methods 36 (2005) 25-34](특이성 결정 영역(SDR) 그래프팅에 대해 기재); 파들란(Padlan, E.A.)의 문헌[Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재보수(resurfacing)"에 대해 기재); 달'아쿠아(Dall'Acqua, W.F.) 등의 문헌[Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링(shuffling)"에 대해 기재); 및 오스바우른(Osbourn, J.) 등의 문헌[Methods 36 (2005) 61-68] 및 클림카(Klimka, A.) 등의 문헌[Br. J. Cancer, 83 (2000) 252-260](FR 셔플링에 대한 "안내된 선택" 접근법에 대해 기재)에 기재되어 있다.
인간화를 위해 사용될 수 있는 인간 골격구조 영역으로는 제한되지 않지만: "최적-정합(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 골격구조 영역[예를 들어, 심스(Sims, M.J.) 등의 문헌 "J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308" 참조]; 경쇄 또는 중쇄 가변성 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 골격구조 영역[예를 들어, 카터(Carter, P.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289"; 및 프레스타(Presta, L.G.) 등의 문헌 "J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632" 참조]; 인간 성숙(체세포적으로 성숙된) 골격구조 영역 또는 인간 생식계열 골격구조 영역[예를 들어, 알마그로(Almagro, J.C.) 및 프란손(Fransson, J.)의 문헌 "Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633" 참조]; 및 FR 라이브러리의 스크리닝으로부터 유도된 골격구조 영역[예를 들어, 바카(Baca, M.) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684" 및 로속(Rosok, M.J.) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 271 (1996) 22611-22618" 참조]이 포함된다.
2. 인간 항체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 반 디지크(van Dijk, M.A.) 및 반 데 윈켈(van de Winkel, J.G.)의 문헌[Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374] 및 론베르그(Lonberg, N.)의 문헌[Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459]에 기재되어 있다.
인간 항체는 온전한 인간 항체, 또는 항원 챌린지(challenge)에 대한 반응으로 인간 가변성 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내생성 면역글로불린 유전자자리를 대체하거나, 염색체 밖에 존재하거나 동물의 염색체내로 무작위로 통합된 인간 면역글로불린 유전자자리의 전부 또는 일부를 포함한다. 이러한 유전자도입 마우스에서, 내생성 면역글로불린 유전자자리는 일반적으로 비활성화되었다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법을 검토하기 위해, 론베르그(Lonberg, N.)의 문헌[Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125]을 참조한다. 또한, 예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE: 상표명) 기술을 기재하는 미국 특허 제6,075,181호 및 제6,150,584호; 후맵(HUMAB: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제5,770,429호; 케이-엠 마우스(K-M MOUSE: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허 제7,041,870호, 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE: 등록상표) 기술을 기재하는 미국 특허출원 공개공보 제2007/0061900호를 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 온전한 항체로부터의 인간 가변성 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변성 영역과 조합함으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마에 기초한 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 단일클론성 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다[예를 들어, 코즈보(Kozbor, D.)의 문헌 "J. Immunol, 133 (1984) 3001-3005"; 브로더(Brodeur, B.R.) 등의 문헌 "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63"; 및 뵈르너(Boerner, P.) 등의 문헌 "J. Immunol. 147 (1991) 86-95" 참조]. 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 리(Li, J.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 (2006) 3557-3562]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제7,189,826호(하이브리도마 세포주로부터의 단일클론성 인간 IgM 항체의 생산을 기재함) 및 니(Ni, J.)의 문헌[Xiandai Mianyixue, 26 (2006) 265-268](인간-인간 하이브리도마를 기재함)에 기재된 방법을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술[트리오마(Trioma) 기술]은 또한 볼머스(Vollmers, H.P.) 및 브란드레인(Brandlein S.)의 문헌[Histology and Histopathology, 20 (2005) 927-937] 및 볼머스(Vollmers, H.P.) 및 브란드레인(Brandlein S.)의 문헌[Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27 (2005) 185-191]"에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된Fv 클론 가변성 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이어서 이러한 가변성 도메인 서열은 바람직한 인간 불변성 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기법은 아래에 기재된다.
3. 항체 변이체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 요망될 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형으로는, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터의 결실, 및/또는 서열 내로의 삽입 및/또는 서열내 잔기의 치환이 포함된다. 결실, 삽입, 및 치환의 임의의 조합이 최종 작성물에 도달되도록 이루어질 수 있지만, 단 최종 작성물은 원하는 특징, 예를 들어 항원-결합 특징을 소유해야 한다.
a) 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이생성을 위해 흥미로운 자리는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제하에 하기 표에 제시된다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 표제하에 표 1에 제공되고, 아미노산 측쇄 부류에 대해서는 하기 추가로 기재된 바와 같다. 아미노산 치환은 흥미로운 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어, 보유된/증진된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 증진된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝된다.
Figure pct00018
아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함을 수반할 것이다.
치환적 변이체의 한가지 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 과가변성 영역 잔기를 치환함을 포함한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는, 모 항체에 비하여 특정 생물학적 특성(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)에 있어서 변형(예를 들어 증진)될 수 있고/있거나, 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환적 변이체는 친화도 성숙된 항체이고, 이는 편리하게는, 예를 들어, 파아지 디스플레이(phage display)-기반의 친화도 성숙 기법, 예컨대 본원에 기재된 기법에 의해 생성될 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기는 돌연변이되고 변형 항체는 파아지 상에 디스플레이되고 특정 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경(예를 들어, 치환)은 HVR에서 이루어져서, 예를 들어, 항체 친화도를 증진시킬 수 있다. 이러한 변경은 HVR "돌연변이다발점(hotspot)", 즉 체세포 돌연변이 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기[예를 들어, 초우드허리(Chowdhury, P.S.)의 문헌 "Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196" 참조], 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 이루어질 수 있고, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 작성 및 재선택에 의한 친화도 돌연변이는, 예를 들어, 후겐붐(Hoogenboom, H.R.) 등의 문헌[Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에 기재되어 있다. 친화도 돌연변이의 몇몇 실시태양에서, 돌연변이를 위해 채택된 변형가능한 유전자내로 임의의 다양한 방법(예를 들어, 오류-발생 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도된 돌연변이생성)에 의해 다양성이 도입된다. 이어서 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서 이러한 라이브러리는 스크리닝되어 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 HVR-유도된 접근법을 포함하고, 여기서 수 개의 HVR 잔기(예를 들어, 한 시점에 4 내지 6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 HVR 잔기는, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이생성 또는 모델링(modeling)을 사용하여 특이적으로 식별될 수 있다. CDR-H3 및 CDR-L3은 특별히 종종 표적화된다.
특정 실시태양에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 발생될 수 있다. 예를 들면, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에 만들어 진다. 이러한 변경은 HVR에서 항원 접촉 잔기의 바깥쪽에 존재할 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시태양에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이생성을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는 유용한 방법은 커닝햄(Cunningham, B.C.) 및 웰스(Wells, J.A.)의 문헌[Science, 244 (1989) 1081-1085]에 기재된 바와 같은 "알라닌 스캐닝 돌연변이생성"으로 지칭된다. 이러한 방법에서, 표적 잔기들중 하나의 잔기 또는 기(예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)는, 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지의 여부를 결정하기 위해 중성의 또는 음성으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 식별되거나 대체된다. 초기 치환에 대한 작용적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에 추가의 치환이 도입될 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 항원-항체 착체의 결정 구조는 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 식별한다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체는 이들이 원하는 특성을 포함하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카복실 말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예로는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들어 ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드로의 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 항체로의 글리코실화 자리의 첨가 또는 이의 결실은 하나 이상의 글리코실화 자리가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유의 항체는 일반적으로 N-결합에 의해 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 결합된 분지화된 2촉각 올리고당을 전형적으로 포함한다. 예를 들어, 롸이트(Wright, A.) 및 모리슨(Morrison, S.L.)의 문헌[TIBTECH 15 (1997) 26-32]을 참조한다. 올리고당은 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc: N-acetyl glucosamine), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2촉각 올리고당 구조의 "줄기"에 있는 GlcNAc에 결합된 푸코스를 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 보고된 항체에서 올리고당의 변형은 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 이루어질 수 있다.
하나의 실시태양에서, Fc 영역에 결합되는(직접적으로 또는 간접적으로) 푸코스가 결핍된 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 이러한 항체중 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%이다. 푸코스의 양은 예를 들면 국제 특허출원 공개공보 제WO 2008/077546호에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정되는 경우, Asn 297에 결합된 모든 당구조물(예를 들어, 착체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대하여, Asn297에서의 당류 쇄중의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 결정된다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 297 위치(Fc 영역 잔기의 EU 번호매김)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 작은 서열 변화에 기인하여 297 위치의 약 ± 3의 아미노산 상류 또는 하류, 즉 294 내지 300 위치에 위치될 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 증진된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허출원 공개공보 제2003/0157108호; 및 제2004/0093621호를 참조한다. "푸코스제거된" 또는 "푸코스-부족" 항체 변이체에 관한 문헌의 예로는: 미국 특허출원 공개공보 제2003/0157108호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2000/61739호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2001/29246호; 미국 특허출원 공개공보 제2003/0115614호; 미국 특허출원 공개공보 제2002/0164328호; 미국 특허출원 공개공보 제2004/0093621호; 미국 특허출원 공개공보 제2004/0132140호; 미국 특허출원 공개공보 제2004/0110704호; 미국 특허출원 공개공보 제2004/0110282호; 미국 특허출원 공개공보 제2004/0109865호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/085119호; 제WO 2003/084570호; 제WO 2005/035586호; 제WO 2005/035778호; 제WO 2005/053742호; 제WO 2002/031140호; 오카자키(Okazaki, A.) 등의 문헌[J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249]; 야만-오누키(Yamane-Ohnuki, N.) 등의 문헌[Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622]이 포함된다. 푸코스제거된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포[리프카(Ripka, J.) 등의 문헌 "Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545"; 미국 특허출원 공개공보 제2003/0157108호); 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312호, 특별히 실시예 11], 및 넉아웃(knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 넉아웃 CHO 세포[예를 들어, 야만-오누키(Yamane-Ohnuki, N.) 등의 문헌 "Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622"; 칸다(Kanda, Y.) 등의 문헌 "Biotechnol. Bioeng., 94 (2006) 680-688"; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/085107호 참조]가 포함된다.
2등분된 올리고당을 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되고, 예를 들어, 여기서 항체의 Fc 영역에 결합된 2촉각 올리고당은 GlcNAc에 의해 2등분된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 증진된 ADCC 작용을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2003/011878호; 미국 특허 제6,602,684호; 및 미국 특허출원 공개공보 제2005/0123546호에 기재되어 있다. Fc 영역에 결합된 올리고당에서 적어도 하나의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 CDC 작용이 증진될 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 1997/30087호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 1998/58964호; 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 1999/22764호에 기재되어 있다.
c) Fc-영역 변이체
특정 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형은 본원에 제공된 바와 같은 항체의 Fc-영역내로 도입될 수 있고, 이로써 Fc-영역 변이체가 생성된다. Fc-영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc-영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc-영역)을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본원에서 몇몇 효과자 작용은 소유하지만 전체 효과자 작용을 소유하지는 않는 항체 변이체가 고려되고, 이는 생체내 항체의 반감기가 중요하지만 특정 효과자 작용(예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 해로운 적용분야를 위해서 이러한 변이체를 바람직한 후보자로 만든다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정은 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정은 항체가 FcγR 결합이 결핍되지만(이에 따라 ADCC 활성이 결핍되기 쉬움), FcRn 결합 능력을 보유함을 보장하기 위해 수행될 수 있다. ADCC를 중재하기 위한 1차 세포, NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 라베취(Ravetch, J.V.) 및 키네트(Kinet, J.P.)의 문헌[Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492]의 제464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적인 예는 미국 특허 제5,500,362호[예를 들면, 헬스트롬(Hellstrom I.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063" 및 헬스트롬 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502" 참조]; 미국 특허 제5,821,337호[브루그게만(Bruggemann, M.) 등의 문헌 "J Exp Med 166 (1987) 1351-1361" 참조]에 기재되어 있다. 다르게는, 비-방사성 검정 방법이 사용될 수 있다[예를 들면, 유세포분석을 위한 ACTI(등록상표) 비-방사성 세포독성 검정(셀테크놀로지 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴뷰); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 검정(프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)]. 이러한 검정에 유용한 효과자 세포로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포가 포함된다. 다르게는, 또는 추가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 생체내, 예를 들어, 동물 모델, 예컨대 클리네스(Clynes, R.) 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. Clq 결합 검정은 항체가 Clq에 결합할 수 없고 이에 따라 CDC 활성이 결핍되었는지의 여부를 확인하기 위해 실행될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/029879호 및 제WO 2005/100402호에서의 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다[예를 들면, 가자노-산토로(Gazzano-Santoro, H.) 등의 문헌 "J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171"; 크래그(Cragg, M.S.) 등의 문헌 "Blood 101 (2003) 1045-1052"; 및 크래그 및 글레니(M.J. Glennie)의 문헌 "Blood 103 (2004) 2738-2743" 참조]. FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 결정은 또한 당분야에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다[예를 들어, 페트코바(Petkova, S.B.) 등의 문헌 "Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769)" 참조].
감소된 효과자 작용을 갖는 항체는 Fc-영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329중 하나 이상의 치환을 갖는 항체를 포함한다(미국 특허 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함하고, 예로서 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체가 있다(미국 특허 제7,332,581호).
FcR로의 결합이 증진되거나 감소된 특정 항체 변이체가 기재되어 있다[예를 들어, 미국 특허 제 6,737,056호; 국제 특허출원 공개공보 제WO 2004/056312호, 및 쉴즈(Shields, R.L.) 등의 문헌 "J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604" 참조]
특정 실시태양에서, 항체 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 Fc-영역을 포함하고, 이는 ADCC, 예를 들어, Fc-영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기의 EU 번호매김)에서의 치환을 개선시킨다.
몇몇 실시태양에서, 변경은 Fc-영역에서 이루어져 변경된(즉 증진되거나 감소된) Clq 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 일으키고, 예를 들어, 미국 특허 제6,194,551호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/51642호, 및 이두소기(Idusogie, E.E.) 등의 문헌[J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184]에 기재된 바와 같다.
모 IgG의 태아로의 전달에 책임이 있는, 신생아 Fc 수용체(FcRn)[구이어(Guyer, R.L.) 등의 문헌 "J. Immunol. 117 (1976) 587-593", 및 김(Kim, J.K.) 등의 문헌 "J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434"]로의 결합이 증진되고 반감기가 증가된 항체는, 미국 특허출원 제2005/0014934호에 기재되어 있다. 이들 항체는 Fc-영역의 FcRn으로의 결합을 증진시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc-영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체로는 하나 이상의 Fc-영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434에서의 치환, 예를 들어, Fc-영역 잔기 434의 치환을 갖는 변이체가 포함된다(미국 특허 제7,371,826호).
또한 Fc-영역 변이체의 다른 예에 관한 던칸(Duncan, A.R.) 및 윈터(Winter, G.)의 문헌[Nature 322 (1988) 738-740]; 미국 특허 제5,648,260호; 미국 특허 제5,624,821호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 94/29351호를 참조한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시태양에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작된 항체, 예를 들어, "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특별한 실시태양에서, 치환된 잔기는 항체의 허용가능한 자리에서 발생된다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 항체의 허용가능한 자리에 위치되고, 다른 작용부분, 예컨대 약물 작용부분 또는 연결기-약물 작용부분에 항체를 컨주게이션하여 면역컨주게이트를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시태양에서, 하기 잔기들중 임의의 하나 이상은 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205(카밧 번호매김); 중쇄의 A118(EU 번호매김); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 번호매김). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제7,521,541호에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 항체는 당분야에 공지되고 쉽게 이용가능한 추가의 비단백질성 작용부분을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 작용부분으로는, 제한되지 않지만 수용성 중합체가 포함된다. 수용성 중합체의 비제한적인 예로는, 제한되지 않지만, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 그의 수중 안정성에 기인하여 제작시 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지되거나 분지되지 않을 수 있다. 항체에 결합된 중합체의 수는 다양할 수 있고, 하나 보다 많은 중합체가 결합된다면, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 전반적으로, 유도체화를 위해 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은, 제한되지 않지만, 개선될 항체의 특성 또는 작용, 항체 유도체가 규정된 조건하에서 치료법에 사용될 것인지의 여부 등을 비롯한 고려사항에 기초하여 결정될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 작용부분 및 항체의 컨주게이트가 제공된다. 하나의 실시태양에서, 비단백질성 작용부분은 탄소 나노튜브(nanotube)이다[캄(Kam, N.W.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605"]. 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 제한되지 않지만, 통상적인 세포에 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 작용부분에 근접한 세포가 사멸되는 온도로 비단백질성 작용부분을 가열하는 파장이 포함된다.
B. 재조합 방법 및 조성물
항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본원에 기재된 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 구성하는 아미노산 서열 및/또는 항체의 VH를 구성하는 아미노산 서열(예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 인코딩할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 실시태양에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주가 제공된다. 하나의 이러한 실시태양에서, 숙주 세포는 하기 성분을 포함한다(예를 들어, 하기 성분에 의해 형질전환됨): (1) 항체의 VL을 구성하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 하나의 실시태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포이고, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese Hamster Ovary) 세포 또는 림프성 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시태양에서, 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체를 제조하는 방법이 제공되고, 여기서 이러한 방법은, 상기 제공된 바와 같이, 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 임의적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, 항체를 인코딩하는 핵산은 단리되고, 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내로 삽입된다. 이러한 핵산은 종래의 절차를 사용하여(예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침자를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위해 적합한 숙주 세포로는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포가 포함된다. 예를 들면, 항체는, 특별히 글리코실화 및 Fc 효과자 작용이 요구되지 않는 경우, 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대하여, 예를 들어, 미국 특허 제5,648,237호, 미국 특허 제5,789,199호, 및 미국 특허 제5,840,523호를 참조한다[또한 이. 콜라이(E. coli)에서의 항체 단편의 발현에 대해 기재하는 찰턴(Charlton, K.A.)의 문헌 "In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254"를 참조한다]. 발현 이후, 항체는 가용성 분별물에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 사상균 또는 효모는 항체-인코딩 벡터를 위해 적합한 클로닝 또는 발현 숙주(예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"된 균류 및 효모 균주를 포함)여서, 부분적 또는 전체적 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산한다. 게른그로스(Gerngross, T.U.)의 문헌[Nat Biotech 22 (2004) 1409-1414], 및 리(Li, H.) 등의 문헌[Nat Biotech 24 (2006) 210-215]을 참조한다.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다. 특별히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 식별되었다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수도 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,959,177호, 제6,040,498호, 제6,420,548호, 제7,125,978호, 및 제6,417,429호[유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES: 등록상표) 기술을 기재함]를 참조한다.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예로는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주[예를 들어, 그라함(Graham F.L.) 등의 문헌 "J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74"에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포]; 베이비 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포[예를 들어, 매터(Mather, J.P.)의 문헌 "Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252"에 기재된 바와 같은 TM4 세포]; 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 뇌 암종 세포(HELA); 개과 동물 신장 세포(MDCK); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562); TRI 세포[예를 들어, 매터(Mather, J.P.) 등의 문헌 "Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68"에 기재된 바와 같음]; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 DHFR-CHO 세포[우를라우브(Urlaub, G.) 등의 문헌 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220"]; 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NSO, 및 Sp2/0이 포함된다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주를 고찰하기 위해, 예를 들어, 야자키(Yazaki, P.) 및 우(Wu, A.M.)의 문헌[Methods in Molecular Biology, Vol. 248 Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조한다.
C. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시태양에서, 본원에 제공된 임의의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체는 생물학적 샘플중의 Α-베타의 존재를 검출하기 위해 유용하다. 용어 "검출하는"은 본원에 사용될 경우 정량적 또는 정성적 검출을 내포한다. 특정 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 생물학적 샘플중의 Α-베타의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시태양에서, 이러한 방법은 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체의 Α-베타으로의 결합을 허용하는 조건하에 생물학적 샘플을 본원에 기재된 바와 같은 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체와 접촉시키는 단계, 및 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체 및 Α-베타 사이에 착체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
특정 실시태양에서, 표지화된 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 제공된다. 표지로는, 제한되지 않지만, 직접적으로 검출되는 표지 또는 작용부분(예컨대 형광 표지, 발색단 표지, 전자-밀도 표지, 화학발광 표지, 및 방사성 표지), 뿐만 아니라, 예를 들어, 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 작용부분, 예컨대 효소 또는 리간드가 포함된다. 예시적인 표지로는, 제한되지 않지만, 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인(fluorescein) 및 이의 유도체, 로다민(rhodamine) 및 이의 유도체, 단실(dansyl), 움벨리페론(umbelliferone), 루시퍼라아제(luciferases), 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라아제 및 박테리아 루시퍼라아제(미국 특허 제4,737,456호), 루시페린(luciferin), 2,3-디하이드로프탈라진디온, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP: horseradish peroxidase), 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase), β-갈락토시다아제(galactosidase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 라이소자임(lysozyme), 당질 산화효소, 예를 들어, 글루코스 산화효소, 갈락토스 산화효소, 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 헤테로환 산화효소, 예컨대 유리카아제(uricase) 및 잔틴 산화효소가 포함되고, 이들은 과산화수소를 사용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다아제, 또는 마이크로퍼옥시다아제, 비오틴(biotin)/아비딘(avidin), 스핀(spin) 표지, 박테리오파아지(bacteriophage) 표지, 안정한 유리 라디칼 등과 커플링된다.
D. 약학 제형
본원에 기재된 바와 같은 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체의 약학 제형은 원하는 순도를 갖는 이러한 이중특이성 항체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합함으로써[레밍턴(Remington)의 문헌 "Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)"], 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 제조된다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 무독성이고, 제한되지 않지만, 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리(비닐 피롤리돈); 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 일당류, 이당류, 및 기타 탄화수소, 예로서 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당류, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 담체는 본원에서 추가로 간질성(interstitial) 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제(hyaluronidase) 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rhuPH20[하이레넥스(HYLENEX: 등록상표), 박스터 인터내셔널 인크.(Baxter International Inc.)]을 포함한다. 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법(rhuPH20 포함)은 미국 특허출원 공개공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제(chondroitinase)와 조합된다.
예시적인 동결건조된 항체 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 항체 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개공보 제WO 2006/044908호에 기재된 제형을 포함하고, 후자의 제형으로는 히스티딘-아세테이트 완충액이 포함된다.
제형은 본원에서 또한 치료될 특정 증상에 필수적인 하나 보다 많은 활성 구성성분들, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 구성성분을 포함할 수 있다. 이러한 활성 구성성분들은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절히 존재한다.
활성 구성성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸 메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼(microemulsion), 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼(macroemulsion)에 포괄(entrapping)될 수 있다. 이러한 기법들은 레밍턴(Remington)의 문헌[Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지효성(sustained-release) 제제가 제조될 수 있다. 지효성 제제의 적합한 예로는 항체를 포함한 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지효성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐 알코올)), 폴리액티드(polylactide)(미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포트(LUPRON DEPOT: 상표명)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사성 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균성은, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 제형은 등장성이다.
E. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 제공된다. 추가의 양태에서, 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 예방하고/하거나 치료하는데 사용하기 위한 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 제공된다. 특정 실시태양에서, 치료 방법에서 사용하기 위한 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 제공된다. 특정 실시태양에서, 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 앓는 개체에게 효과량의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 앓는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 본원에 제공된다. 하나의 이러한 실시태양에서, 방법은 개체에게 효과량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예컨대 이후 나열된 치료제 또는 항-p타우(Tau) 또는 항-알파-시누클레인(synuclein) 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 플라크의 형성을 저해하고/하거나 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는데 사용하기 위한 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 본원에 제공된다. 특정 실시태양에서, 효과량의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 플라크의 형성을 저해하고/하거나 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는, 개체에서 플라크의 형성을 저해하고/하거나 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는 방법에서 사용하기 위한 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체가 본원에 제공된다. 상기 임의의 실시태양에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 약제의 제작 또는 제조에 있어서의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체의 용도가 본원에 제공된다. 하나의 실시태양에서, 약제는 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 약제는 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 앓는 개체에게 효과량의 약제를 투여하는 단계를 포함하는 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시태양에서, 방법은 개체에게 효과량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예컨대 이후 나열된 치료제 또는 항-p타우 또는 항-알파-시누클레인 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 약제는 플라크의 형성을 저해하고/하거나 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키기 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 약제는, 효과량의 약제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 플라크의 형성을 저해하고/하거나 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는, 개체에서 플라크의 형성을 저해하고/하거나 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 상기 임의의 실시태양에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 양태에서, 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 하나의 실시태양에서, 방법은 아밀로이드 생산 및/또는 아밀로이드-플라크 형성과 연관된 질환을 앓는 개체에게 효과량의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체를 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 이러한 실시태양에서, 방법은 개체에게 효과량의 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예컨대 이후 나열된 치료제 또는 항-p타우 또는 항-알파-시누클레인 항체를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 임의의 실시태양에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 양태에서, 개체에서 플라크의 형성을 저해하고/하거나 β-아밀로이드 플라크를 붕해시키는 방법이 본원에 제공된다. 하나의 실시태양에서, 방법은 효과량의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체를 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 플라크의 형성을 저해하고/하거나 β-아밀로이드 플라크를 붕해시킨다. 하나의 실시태양에서, "개체"는 인간이다.
추가의 양태에서, 예를 들어, 상기 임의의 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 제공된 임의의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체를 포함하는 약학 제형이 본원에 제공된다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 제형은 본원에 제공된 임의의 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체 및 적어도 하나의 추가적인 치료제, 예컨대 이후 제공된 바와 같은 치료제 또는 항-p타우 또는 항-알파-시누클레인 항체를 포함한다.
본원에 보고된 항체는 치료법에서 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 보고된 항체는 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 추가적인 치료제는 본원에 보고된 이중특이성 항체가 치료를 위해 사용되는 것과 동일하거나 상이한 신경학적 질환을 치료하는데 효과적인 치료제이다. 예시적인 추가의 치료제로는, 제한되지 않지만, 상기 기재된 다양한 신경성 약물, 콜린에스테라아제 저해제[예컨대 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine), 로바스티그민(rovastigmine), 및 타크린(tacrine)], NMDA 수용체 길항물질(예컨대 메만틴), 아밀로이드 베타 펩티드 응집 저해제, 항산화제, γ-세크레타아제 조절제, 신경 성장 인자(NGF: nerve growth factor) 모방체 또는 NGF 유전자 치료법, PPARy 작용물질, HMS-CoA 환원효소 저해제[스타틴(statin)], 암파킨(ampakine), 칼슘 채널 차단제, GABA 수용체 길항물질, 글리코겐 신타아제 키나아제(synthase kinase) 저해제, 정맥내 면역글로불린, 무스카린성(muscarinic) 수용체 작용물질, 니코틴성(nicotinic) 수용체 조절제, 능동적 또는 수동적 아밀로이드 베타 펩티드 면역화, 포스포디에스테라아제(phosphodiesterase) 저해제, 세로토닌(serotonin) 수용체 길항물질 및 항-아밀로이드 베타 펩티드 항체가 포함된다. 특정 실시태양에서, 적어도 하나의 추가적인 치료제는 신경성 약물의 하나 이상의 부작용을 완화시키는 그의 능력에 대해 선택된다.
상기 주지된 이러한 병용 요법은 병행 투여(여기서 둘 이상의 치료제는 동일한 제형 또는 별도의 제형에 포함됨), 및 별도의 투여를 내포하고, 이러한 경우, 본원에 보고된 항체의 투여는 추가적인 치료제 또는 제제의 투여 이전에, 이와 동시에, 및/또는 이후에 발생될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로의 약 1 개월, 또는 약 1 주, 2 주 또는 3 주 이내, 또는 약 1 일, 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 또는 6 일 이내에 발생될 수 있다. 본원에 보고된 항체는 기타 중재 요법, 예컨대, 제한되지 않지만, 방사선 요법, 행동 요법, 또는 당분야에 공지되고 치료되거나 예방되는 신경학적 질환에 적합한 기타 요법이 함께 사용될 수 있거나 사용된다.
본원에 보고된 항체 (및 임의의 추가적인 치료제)는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 비경구, 폐내 및 비강내 투여, 및 국소 치료가 요망된다면, 병변내 투여가 포함된다. 비경구 주입으로는, 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 투약은, 투여가 단기인지 장기인지의 여부에 부분적으로 의존하여, 임의의 경로에 의해, 예를 들어 주사에 의해, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어 질 수 있다. 다양한 투약 계획, 예컨대 제한되지 않지만, 다양한 시점에 걸친 다중 투여 또는 단일 투여, 일시정맥(bolus) 투여, 및 펄스(pulse) 주입이 본원에서 고려된다.
본원에 보고된 항체는 양호한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자로는 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 증상, 질환의 원인, 제제의 전달 자리, 투여 방법, 투여 계획, 및 의사에게 공지된 기타 인자들이 포함된다. 항체는, 필수적이지는 않지만, 임의적으로 해당 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화된다. 이러한 기타 제제의 효과량은 제형에 존재하는 항체의 양, 질환 또는 치료 유형, 및 상기 논의된 기타 인자들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 투여 경로에 의해 동일한 투여량으로, 또는 본원에 기재된 투여량의 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
BBB를 가로질러 융합 작성물 또는 화합물을 수송하는 지질-기반의 방법으로는, 제한되지 않지만, BBB의 혈관 내피 상의 수용체에 결합하는 1가 결합 실체에 커플링되는 리포솜에 융합 작성물 또는 화합물을 캡슐화시키는 방법(예를 들어, 미국 특허출원 공개공보 제2002/0025313호 참조), 및 저-밀도 지질단백질 입자(예를 들어, 미국 특허출원 공개공보 제2004/0204354호) 또는 아포지질단백질 E(예를 들어, 미국 특허출원 공개공보 제2004/0131692호)에서 1가 결합 실체를 코팅하는 방법이 포함된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본원에 보고된 항체의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 조합하여 사용될 경우)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 위중성 및 경과, 항체가 예방 목적을 위해 투여되는지 치료 목적을 위해 투여되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 좌우될 것이다. 항체는 적합하게는 환자에게 1회로 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여된다. 질환의 유형 및 위중성에 의존하여, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어 0.5 mg/kg 내지 10 mg/kg)의 항체는, 예를 들면, 1회 이상의 별도의 투여에 의해서인지, 또는 연속 주입에 의해서인지와 무관하게 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한가지 전형적인 1 일 투여량은, 상기 언급된 인자들에 의존하여, 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복된 투여의 경우, 증상에 따라서, 치료는 일반적으로 질환 증후의 바람직한 억제가 발생될 때까지 지속될 것이다. 항체의 한가지 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg의 범위일 수 있다. 이와 같이, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg의 하나 이상의 투약량(또는 이의 임의의 조합)이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투약량은 간헐적으로, 예를 들어 매 주 또는 3 주마다 투여될 수 있다(예를 들어 환자가 약 2 내지 약 20, 또는 예를 들어 약 6 회 투약량의 항체를 수여받도록). 초기에 더 높은 적재 투약량이 투여된 이후, 하나 이상의 더 낮은 투약량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 섭생이 유용할 수 있다. 이러한 치료법의 진행은 종래의 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 이중특이성 항-인간 Α-베타/인간 트랜스페린 수용체 항체 대신에 또는 이에 더하여 본원에 보고된 바와 같은 면역컨주게이트를 사용하여 실행될 수 있음을 알아야 한다.
III. 제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 포함하는 제품이 제공된다. 제품은 용기, 및 용기의 위에 또는 용기와 연결된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백(bag) 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 조성물 그 자체를, 또는 증상을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들면 용기는 피하내 주사 바늘에 의해 침투가능한 스토퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물중 적어도 하나의 활성화제는 본원에 보고된 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은, 조성물이 선택된 증상을 치료하기 위해 사용됨을 지시한다. 게다가, 제품은 (a) 조성물이 포함된 제1 용기(여기서 조성물은 본원에 보고된 항체를 포함함); 및 (b) 조성물이 포함된 제2 용기(여기서 조성물은 추가의 세포독성제 또는 달리는 치료제를 포함함)를 포함할 수 있다. 본 실시태양에서 제품은 조성물이 특정 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 추가적으로, 제품은 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 주사용 정균수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트-완충된 염수, 링거(Ringer) 용액 및 덱스트로즈 용액을 포함하는 제2(또는 제3)의 용액을 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충액, 희석제, 충전제, 바늘, 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제품은 본원에 보고된 이중특이성 항체 대신에 또는 이에 더하여 본원에 보고된 면역컨주게이트를 포함할 수 있음을 알아야 한다.
IV. 실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 기재사항이 제시되지만, 다양한 다른 실시태양이 실행될 수 있음을 알아야 한다.
재료 및 일반적 방법
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 관한 일반적 정보는 카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 제공된다. 항체 쇄의 아미노산은 카밧에 따른 번호매김 체계에 따라 번호매겨지고 지칭된다[카밧(Kabat, E.A.) 등의 문헌 "Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)"].
재조합 DNA 기법
샘브룩(Sambrook, J.) 등의 문헌[Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 DNA를 조작하기 위해 표준 방법을 사용하였다. 분자 생물 시약을 제조업체의 지시에 따라 사용하였다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절을 화학적 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 제조하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 분할 자리가 옆에 있는 긴 유전자 분절을, PCR 증폭을 비롯하여 올리고뉴클레오티드를 어닐링(annealing)하고 결찰시킴으로써 조립하고, 후속적으로 지시된 제한 자리를 통해 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 유전자 합성 단편을 진아트(Geneart)(독일 레겐스부르그)에서 제공된 사양에 따라 정렬하였다.
DNA 서열 결정
메디게노믹스 게엠베하(MediGenomix GmbH)(독일 마르틴스리드) 또는 세퀴서브(SequiServe)(독일 바터스테텐)에서 수행되는 이중 가닥 서열분석에 의해 DNA 서열을 결정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
서열 생성, 지도작성, 분석, 주석화(annotation) 및 도해를 위해 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG: Genetics Computer Group; 위스콘신주 매디슨)의 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 인포맥스(Infomax)의 벡터(Vector) NT1 어드밴스 스위트(Advance suite) 버전 8.0을 사용하였다.
발현 벡터
기재된 이중특이성 항체의 발현을 위해, CMV-인트론 A 프로모터를 이용하거나 하지 않는 cDNA 조직화 또는 CMV 프로모터를 이용하는 게놈 조직화에 기초하는 일시적 발현(예를 들어 HEK293 세포에서)을 위한 발현 플라스미드가 적용될 수 있다.
항체 발현 카세트(cassette) 이외에, 벡터는 다음을 포함한다:
- 이. 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 기원, 및
- 이. 콜라이에서 앰피실린(ampicillin) 내성을 부여하는 β-락타마아제(lactamase) 유전자.
항체 유전자의 전사 단위는 다음의 요소들로 구성된다:
- 5' 단부에서의 특유의 제한 자리(들)
- 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus)로부터의 급속 초기 인헨서(enhancer) 및 프로모터,
- cDNA 조직화의 경우에서의 인트론 A 서열,
- 인간 항체 유전자로부터 유래된 5'-미번역 영역,
- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- cDNA로서의 또는 게놈 엑손-인트론 조직화에 의한 개개의 항체 쇄 인코딩 핵산,
- 폴리아데닐화(polyadenylation) 신호 서열을 갖는 3'-미번역 영역, 및
- 3' 단부에서의 특유의 제한 자리(들).
항체 쇄를 인코딩하는 융합 유전자는 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성되고, 공지된 재조합 방법 및 기법에 의해, 예를 들어 개별 벡터에서 특유의 제한 자리를 사용하여, 부합하는 핵산 분절을 연결시킴으로써 조립된다. 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인한다. 일시적인 형질감염을 위해, 더 많은 양의 플라스미드를 형질전환된 이. 콜라이 배양물로부터의 플라스미드 제조에 의해 제조한다[뉴클레오본드(Nucleobond) AX, 마처레이-나겔(Macherey-Nagel)].
모든 작성물의 경우, 제1 CH3 도메인에서의 전형적인 노브(T366W) 치환 및 제2 CH3 도메인에서의 상응하는 홀 치환(T366S, L368A 및 Y407V)(뿐만 아니라 2개의 추가적으로 도입된 시스테인 잔기 S354C/Y349'C)(상기 설명된 개개의 상응하는 중쇄(HC) 서열에 함유됨)을 갖는 노브-인투-홀 이종이량체화 기술을 사용하였다.
세포 배양 기법
보니파시노(Bonifacino, J.S.), 다소(Dasso, M.), 하포드(Harford, J.B.), 리핀코트-슈바르츠(Lippincott-Schwartz, J.) 및 야마다(Yamada, K.M.)의 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), John Wiley & Sons, Inc.]에 기재된 바와 같은 표준 세포 배양 기법을 사용한다.
HEK293 시스템에서의 일시적 형질감염
이중특이성 항체는 일시적 발현에 의해 생산된다. 따라서, 제조업체의 지시에 따라 HEK293 시스템[인비트로겐(Invitrogen)]을 사용하여 개별 플라스미드에 의한 형질감염을 수행한다. 간단히, 진탕 플라스크 또는 교반 발효기에서 무-혈청 프리스타일(FreeStyle: 상표명) 293 발현 배지(인비트로겐)중의 현탁액에서 성장하는 HEK293 세포(인비트로겐)를 개별 발현 플라스미드 및 293펙틴(293fectin: 상표명) 또는 펙틴(인비트로겐)의 혼합물에 의해 형질감염시킨다. 2 ℓ 들이 진탕 플라스크[코닝(Corning)]의 경우, HEK293 세포를 600 ㎖중 1.0×106 세포/㎖의 밀도로 접종하고, 120 rpm 및 8% C02에서 항온처리한다. 다음 날, 세포를 대략 1.5×106 세포/㎖의 세포 밀도로 대략 42 ㎖의 A) 600 ㎍의 총 플라스미드 DNA(1 ㎍/㎖)가 포함된 20 ㎖의 옵티(Opti)-MEM 배지(인비트로겐) 및 B) 1.2 ㎖의 293펙틴 또는 펙틴(2 ㎕/㎖)이 보충된 20 ㎖의 옵티-MEM 배지의 혼합물에 의해 형질감염시킨다. 글루코스 소비에 따라서, 글루코스 용액을 발효 과정 동안 첨가한다. 분비된 항체를 함유하는 상청액을 5 내지 10 일 후 수거하고, 항체를 상청액으로부터 직접 수거하거나, 또는 상청액을 동결시키고 저장한다.
단백질 결정
페이스(Pace) 등의 문헌[Protein Science 4 (1995) 2411-1423]에 따라 아미노산 서열에 기초하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 nm에서 광학 밀도(OD)를 결정함으로써 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 결정하였다
상청액중의 항체 농도 결정
세포 배양 상청액중 항체 및 유도체의 농도를 단백질 A 아가로스-비이드(agarose-bead)[로슈 디아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임]에 의한 면역침전에 의해 추정하였다. 따라서, 60 ㎕의 단백질 A 아가로스-비이드를 TBS-NP40[150 mM NaCl 및 1% 노니데트(Nonidet)-P40에 의해 보충된, 50 mM 트리스(Tris) 완충액, pH 7.5]에서 3회 세척하였다. 후속적으로, 1 내지 15 ㎖의 세포 배양 상청액을 TBS-NP40에서 예비-평형화된 단백질 A 아가로스-비이드에 적용하였다. 실온에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 비이드를 울트라프리(Ultrafree)-MC-필터 칼럼[아미콘(Amicon)] 상에서 0.5 ㎖의 TBS-NP40에 의해 1회, 0.5 ㎖의 2x 인산염 완충된 염수(2xPBS, 로슈 디아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임)로 2회 세척하고, 0.5 ㎖의 100 mM Na-시트르산염 완충액(pH 5.0)으로 간단히 4회 세척하였다. 35 ㎕의 누파게(NuPAGE: 등록상표) LDS 샘플 완충액(인비트로겐)을 첨가하여 결합된 항체를 용출시켰다. 샘플의 절반을 누파게(NuPAGE: 등록상표) 샘플 환원제와 합치거나 또는 환원되지 않게 방치하고, 각각 10 분 동안 70℃에서 가열하였다. 결과적으로, 5 내지 30 ㎕를 4 내지 12%의 누파게(등록상표) 비스-트리스(Bis-Tris) SDS-PAGE 겔(인비트로겐)에 적용하고[비-환원된 SDS-PAGE의 경우 MOPS 완충액에 의해, 환원된 SDS-PAGE의 경우 누파게(등록상표) 산화방지제 이동 완충액 첨가제(인비트로겐)가 함유된 MES 완충액에 의해], 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색시켰다.
세포 배양 상청액중 항체의 농도를 친화도 HPLC 크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정하였다. 간단히, 단백질 A에 결합하는 항체를 함유하는 세포 배양 상청액을 200 mM KH2P04, 100 mM 시트르산 나트륨(pH 7.4)에서 어플라이드 바이오시스템스 포로스(Applied Biosystems Poros) A/20 칼럼에 적용하고, 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산(pH 2.5)에 의해 아길런트(Agilent) HPLC 1100 시스템 상에서 용출시켰다. 용출된 항체를 UV 흡광도 및 피이크 면적의 적분에 의해 정량화하였다. 정제된 표준 IgG1 항체가 표준물로서 작용하였다.
다르게는, 세포 배양 상청액중 항체 및 유도체의 농도를 샌드위치(Sandwich)-IgG-ELISA에 의해 측정하였다. 간단히, 스트렙타웰 하이 바인드 스트렙타비딘(StreptaWell High Bind Streptavidin) A-96 웰 미량정량판(로슈 디아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임)을 100 ㎕/웰의 비오틴화된 항-인간 IgG 포획 분자 F(ab')2<h-Fcγ> BI[디아노바(Dianova)]에 의해 0.1 ㎍/㎖로 1 시간 동안 실온에서, 또는 다르게는 하룻밤 4℃에서 코팅하고, 후속적으로 200 ㎕/웰의 PBS, 0.05% 트윈(Tween)[PBST, 시그마(Sigma)]으로 3회 세척하였다. 이후, 개개의 항체 함유 세포 배양 상청액의 PBS(시그마)중의 일련의 희석물 100 ㎕/웰을 웰에 첨가하고 진탕기에서 실온에서 1 내지 2 시간 동안 항온처리하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 PBST로 3회 세척하고, 결합된 항체를 검출 항체로서 100 ㎕의 F(ab')2<hFcγ>POD(디아노바)에 의해 0.1 ㎍/㎖으로 실온에서 진탕기 상에서 1 내지 2 시간 동안 항온처리함으로써 검출하였다. 결합되지 않은 검출 항체를 200 ㎕/웰의 PBST에 의해 3회 세척함으로써 제거하였다. 100 ㎕의 ABTS/웰을 첨가한 후 항온처리함으로써 결합된 검출 항체를 검출하였다. 흡광도의 결정을 테칸 플루오르 분광계(Tecan Fluor Spectrometer) 상에서 405 nm의 측정 파장(기준 파장 492 nm)에서 수행하였다.
조제용 항체 정제
항체를 표준 프로토콜에 따라 여과된 세포 배양 상청액으로부터 정제하였다. 간단히, 항체를 단백질 A 세파로스(Sepharose) 칼럼[GE 헬쓰케어(GE healthcare)] 상에 적용하고 PBS에 의해 세척하였다. 항체의 용출을 pH 2.8에서 달성한 후, 즉시 중화시켰다. 응집된 단백질을 PBS에서 또는 150 mM NaCl이 함유된 20 mM 히스티딘 완충액(pH 6.0)에서 크기 배제 크로마토그래피[수퍼덱스(Superdex) 200, GE 헬쓰케어]에 의해 단량체성 항체로부터 분리시켰다. 단량체성 항체 분별물을 모으고, (필요하다면) 예를 들어, 밀리포어 아미콘 울트라(MILLIPORE Amicon Ultra)(30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축하고, 동결시키고, -20℃ 또는 -80℃에서 저장한다. 샘플의 일부분을 제공하여, 예를 들어 SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 또는 질량분석법에 의해 후속적으로 단백질 분석 및 분석 특성규명을 수행한다.
SDS-PAGE
누파게(등록상표) 프리-캐스트(Pre-Cast) 겔 시스템(인비트로겐)을 제조업체의 지시에 따라 사용하였다. 특별히, 10% 또는 4 내지 12%의 누파게(등록상표) 노벡스(Novex: 등록상표) 비스-트리스 프리-캐스트 겔(pH 6.4) 및 누파게(등록상표) MES(누파게(등록상표) 산화방지제 이동 완충액 첨가제를 갖는 환원된 겔) 또는 MOPS(비-환원된 겔) 이동 완충액을 사용하였다.
CE-SDS
미소유체 랩칩(Labchip) 기술[퍼킨엘머(PerkinElmer), 미국]을 사용하여 CE-SDS에 의해 순도 및 항체 완전성을 분석하였다. 따라서, 제조업체의 지시에 따라 HT 단백질 발현 시약 키트를 사용하는 CE-SDS 분석을 위해 5 ㎕의 항체 용액을 제조하고, 랩칩 GXII 시스템 상에서 HT 단백질 발현 칩을 사용하여 분석하였다. 랩칩 GX 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
분석용 크기 배제 크로마토그래피
응집을 결정을 위해 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하고, 항체의 올리고머 상태를 결정하기 위해 HPLC 크로마토그래피를 수행하였다. 간단히, 단백질 A 정제된 항체를 디오넥스 얼티메이트(Dionex Ultimate: 등록상표) 시스템[써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fischer Scientific)] 상에서 300 mM NaCl, 50 mM KH2PO4/K2HPO4 완충액(pH 7.5)에서 토소(Tosoh) TSK겔 G3000SW 칼럼에 적용하거나, 또는 디오넥스 HPLC-시스템 상에서 2x PBS에서 수퍼덱스 200 칼럼(GE 헬쓰케어)에 적용하였다. 용출된 항체를 UV 흡광도 및 피이크 면적의 적분에 의해 정량화하였다. 바이오래드(BioRad) 겔 여과 표준 151-1901이 표준물로서 작용하였다.
질량 분석
본 섹션은 이중특이성 항체의 적절한 조립체에 대해 강조하면서 이들의 특징을 기재한다. 예상되는 1차 구조를, 탈글리코실화된(deglycosylated) 온전한 항체, 및 특별한 경우, 탈글리코실화/제한된 LysC 분해된 항체의 전자분무 이온화 질량 분석(ESI-MS: electrospray ionization mass spectrometry)에 의해 분석하였다.
항체를 인산염 또는 트리스 완충액에서 37℃하에 17 시간 이하 동안 1 mg/㎖의 단백질 농도로 N-글리코시다아제(Glycosidase)에 의해 탈글리코실화시켰다. 제한된 LysC(로슈 디아그노스틱스 게엠베하, 독일 만하임) 분해를 트리스 완충액(pH 8)중에서 실온에서 120 시간 동안, 또는 37℃에서 40 분 동안 각각 100 ㎍의 탈글리코실화된 항체에 의해 수행하였다. 질량 분석 이전에, 샘플을 HPLC를 통해 세파덱스 G25 칼럼(GE 헬쓰케어) 상에서 탈염시켰다. 트리베르사 나노메이트(TriVersa NanoMate) 공급원[아비온(Advion)]이 구비된 막시스(maXis) 4G UHR-QTOF MS 시스템[브루커 달토니크(Bruker Daltonik)] 상에서 ESI-MS를 통해 전체 질량을 결정하였다.
화학적 분해 시험
샘플을 3개의 분취량으로 나누고, 20 mM His/His*HCl, 140 mM NaCl(pH 6.0) 또는 PBS 내로 각각 재완충시키고, 40℃(His/NaCl) 또는 37℃(PBS)에서 저장하였다. 대조 샘플을 -80℃에서 저장하였다.
항온처리가 종료된 후, 샘플을 상대적 활성 농도[비아코어(BIAcore)], 응집(SEC) 및 단편화(모세관 전기이동 또는 SDS- PAGE)에 대해 분석하고, 미처리된 대조군과 비교하였다.
열 안정성
샘플을 20 mM 히스티딘/히스티딘 클로라이드, 140 mM NaCl(pH 6.0)중 1 mg/㎖의 농도로 제조하고, 0.4 ㎛ 필터 플레이트를 통한 원심분리에 의해 광학 384-웰 플레이트로 옮기고, 파라핀유로 덮었다. 다이나프로 플레이트 리더(DynaPro Plate Reader)[와이어트(Wyatt)] 상에서 동적 광 산란에 의해 유체역학적 반경을 반복적으로 측정하였고, 이 동안 샘플을 0.05℃/분의 속도로 25℃에서 80℃로 가열하였다.
다르게는, 샘플을 10 ㎕의 마이크로-큐벳(micro-cuvette) 어레이(array)로 옮기고, 266 nm 레이저로 여기시켰을 경우의 형광 데이터 뿐만 아니라 정적 광 산란 데이터를 옵팀(Optim)1OOO 기기[어백타 인크.(Avacta Inc.)]에 의해 기록하였고, 이 동안 이들을 0.1℃/분의 속도로 25℃에서 90℃로 가열하였다.
응집 개시 온도는 유체역학적 반경(DLS: hydrodynamic radius) 또는 산란된 광 강도(옵팀1OOO)가 증가하기 시작하는 온도로서 정의된다.
다르게는, 샘플을 9 ㎕의 멀티-큐벳 어레이로 옮겼다. 멀티-큐벳 어레이를 35℃에서 90℃로 0.1℃/분의 일정한 속도로 옵팀1OOO 기기(어백타 인크.)에서 가열하였다. 기기는 대략 0.5℃마다 데이터 포인트를 가지면서 266 nm 레이저의 산란된 광 강도를 연속적으로 기록한다. 광 산란 강도를 온도에 대하여 도표화하였다. 응집 개시 온도(T_응집)는 산란된 광 강도가 증가하기 시작하는 온도로서 정의된다.
용융 온도는 형광 강도 대 파장 그래프에서의 변곡점으로서 정의된다.
실시예 1
발현 및 정제
이중특이성 항체를 상기 일반적 재료 및 방법 섹션에서 기재된 바와 같이 생산하였다.
이중특이성 항체를 단백질 A 친화도 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피의 조합에 의해 상청액으로부터 정제하였다. 질량 분석 및 분석적 특성, 예컨대 순도(CE-SDS에 의함), 단량체 함량 및 안정성에 의해 수득된 생성물의 정체성을 특징지웠다.
예상된 1차 구조를, 일반적 방법 섹션에 기재된 바와 같이, 탈글리코실화된 온전한 항체, 및 탈글리코실화/플라스민(plasmin) 분해되거나 또는 다르게는 탈글리코실화/제한된 LysC 분해된 항체의 전자분무 이온화 질량 분석(ESI-MS)에 의해 분석하였다.
단백질 A 및 SEC 정제 이후에만 추가적인 분석 방법(예를 들어 열 안정성, 질량 분석 및 기능 평가)을 적용하였다.
실시예 2
ELISA에 의한 시험관내 Αβ1-40 섬유로의 결합에 대한 결정
원섬유성 Αβ에 대한 이중특이성 항체의 결합을 ELISA 검정에 의해 측정한다. 간단히, Αβ(1-40)를 PBS중 7 ㎍/㎖에서 37℃에서 3 일 동안 맥시소브(Maxisorb) 플레이트 상으로 코팅하여 원섬유성 A-베타를 생산하고, 이어서 3 시간 동안 실온에서 건조시킨다. PBS중 1% 크로테인(Crotein)C 및 0.1% RSA(차단 완충액)에 의해 1 시간 동안 실온에서 플레이트를 차단시키고, 이어서 세척 완충액으로 1회 세척한다. 이중특이성 항체 또는 대조군을 차단 완충액중 100 nM 이하의 농도로 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 항온처리한다. 4회의 세척 단계 이후, 차단 완충액중 1:10,000의 희석비로 항-인간-IgG-HRP[잭슨 이뮤노리써치(Jackson Immunoresearch)]를 첨가하고(1 RT), 이후에 TMB[시그마(Sigma)]에서 6회 세척하고 항온처리함으로써 작성물을 검출한다. 1 N HCl에 의해 색 진행을 중단시킨 후 450 nm에서 흡광도를 판독한다.
실시예 3
시험관내 트랜스페린 수용체로의 결합에 대한 결정
뮤린 트랜스페린 수용체로의 이중특이성 항체의 결합을 마우스 X63.AG8-563 골수종 세포 상에서의 FACS 분석에 의해 시험한다. Aβ 항체가 Ag8 세포에 비-특이적으로 결합하는 특정한 경향을 나타낸다면, 20 배 과량의 항-마우스-TfR 항체와 함께 공동-항온처리함으로써 특이적 결합을 정량화할 수 있다. 세포를 원심분리에 의해 수거하고, PBS로 1회 세척하고, 200 nM 항-마우스 Tf 항체를 첨가하거나 첨가하지 않으면서 1.5 시간 동안 얼음 상에서 100 ㎕의 RPMI/10% FCS에서 5×104 세포를 1.5 pM 내지 10 nM의 일련의 희석률의 폴리펩티드 융합물과 함께 항온처리한다. RPMI/10% FCS로 2회 세척한 후, 세포를 파이코에리트린(Phycoerythrin)(잭슨 이뮤노리서치)에 커플링된 염소-항-인간 IgG와 함께 RPMI/19% FCS중 1:600의 희석비로 1.5 시간 동안 얼음 상에서 항온처리한다. 세포를 다시 세척하고, RPMI/10% FCS에 재현탁시키고, 파이코에리트린 형광도를 FACS-어레이 기기[벡톤-딕킨슨(Becton-Dickinson)] 상에서 측정한다.
실시예 4
인간 TfR-항체 상호작용에 대한 표면 플라스몬 공명-기반의 결합 검정
판매 회사의 매뉴얼에 따라서 표준 아민 커플링 화학 절차를 사용하여, 항-인간 Fab 항체(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 28-9583-25)로 전처리된 C1 센서 칩(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 BR1005-35)이 구비된 비아코어(BIAcore) B 4000(GE 헬쓰케어) 상에서 결합 실험을 실행하였다.
동력학적 측정을 위해, 샘플 항체를 60 초의 접촉 시간 및 10 ㎕/분의 유속을 적용하여 인산염 완충 염수(pH 7.4), 0.05% 트윈 20에서 25℃하에 고정화시켰다. 재조합 His6-태깅된(tagged) 인간 트랜스페린 수용체[알앤디 시스템스(R&D systems), 카탈로그 번호 2474-TR-050]를 증가하는 농도로 적용하고, 신호를 시간에 따라 모니터링하였다. 30 ㎕/분의 유속에서 150 초의 회합 시간 및 600 초의 해리 시간의 평균 기간을 기록하였다. 1:1 결합 모델[랑뮤(Langmuir) 등온선]을 사용하여 데이터를 정합시켰다.
실시예 5
본원에 보고된 이중특이성 항체를 사용하는 간접적 면역형광법에 의한 알츠하이머병 환자의 뇌 절편으로부터의 고유의 인간 β-아밀로이드 플라크의 염색
간접적인 면역형광법을 사용하여 면역조직화학 분석에 의해 고유의 인간 β-아밀로이드 플라크를 염색하는 능력에 대하여 이중특이성 항체를 시험할 수 있다. 진성(genuine) 인간 β-아밀로이드 플라크의 특이적이고 감수성인 염색이 입증될 수 있다. 알츠하이머병에 대해 양성인 것으로 진단된 환자로부터 사후에 수득된 측두엽으로부터의 고정되지 않은 조직의 저온유지(cryostat) 절편을 간접적 면역형광법에 의해 표지화한다. 결합된 이중특이성 항체를 검출하기 위해 2-단계 항온처리를 사용하고, 이는 알렉사(Alexa) 555 염료에 컨주게이션된 친화도-정제된 염소 항-인간(GAH555) IgG(H+L)[몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)]에 의해 밝혀진다. 대조군은 관련되지 않은 인간 IgGl 항체(시그마) 및 2차 항체를 단독으로 포함할 수 있고, 이는 모두 음성 결과를 제공해야 한다.
실시예 6
알츠하이머병의 마우스 모델에서 본원에 보고된 이중특이성 항체에 의한 생체내 β-아밀로이드 플라크 장식
APP/PS2 2중 유전자도입 마우스, 즉 AD-관련된 아밀로이드증을 위한 마우스 모델[리차즈(Richards, J.)의 문헌 "Neuroscience, 23 (2003) 8989-9003"]에서 생체내에서 β-아밀로이드 플라크를 면역-장식하는 능력에 대해 이중특이성 항체를 시험할 수 있다. 이는 아밀로이드-β 플라크로의 결합 및 뇌 침투의 정도에 대해 평가할 수 있다. 융합 폴리펩티드는 네이키드 항-Αβ 단일클론성 항체와 비교하여 상이한 투여량에서 투여될 수 있고, 6 일 이후 동물을 인산염-완충된 염수에 의해 관류시키고 뇌를 드라이 아이스 상에서 동결시키고 저온절편(cryosectioning)을 위해 준비한다.
알렉사 555 염료에 컨주게이션된 염소 항-인간 IgG(H+L)(GAH555)(몰레큘라 프로브스)에 의해 15 ㎍/㎖의 농도에서 1 시간 동안 실온에서 단일-표지화된 간접적 면역형광법에 의한 고정되지 않은 저온유지 절편을 사용하여 β-아밀로이드 플라크에 결합된 항체의 존재를 평가할 수 있다. BAP-2, 알렉사 488에 컨주게이션된 Αβ에 대한 마우스 단일클론성 항체와 함께 0.5 ㎍/㎖의 농도에서 1 시간 동안 실온에서 항온처리함으로써 아밀로이드 플라크에 대한 대비염색을 수행할 수 있다. 슬라이드를 형광물질 장착 매질[S3023 다코(Dako)]로 함침시키고 공초점 레이저 현미경으로 영상화한다.
전술된 발명이 이해의 명확성을 위해 예시 및 실시예에 의해 어느 정도 상세히 기재되었지만, 상세한 설명 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 언급된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 이들 전체가 참고로 명백히 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> BISPECIFIC ANTI-HUMAN A-BETA/HUMAN TRANSFERRIN RECEPTOR ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> P33106-WO <140> PCT/EP2016/073411 <141> 2016-09-30 <150> EP 15188064.8 <151> 2015-10-02 <160> 22 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 0015-LC1 <400> 1 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 2 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 0015-HC1 <400> 2 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 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Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 660 665 670 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 675 680 685 Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 690 695 700 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 705 710 715 720 Gly Gly Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 725 730 735 Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser 740 745 750 Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 755 760 765 Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala 770 775 780 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys 785 790 795 800 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 805 810 815 Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp 820 825 830 Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 835 840 845 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 850 855 860 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 865 870 875 880 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 885 890 895 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 900 905 910 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 915 920 925 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 930 935 940 Lys Ser Cys 945 <210> 14 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 0024-LC1 <400> 14 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 15 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 0024-HC1 <400> 15 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 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Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 195 200 205 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 340 345 350 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr 355 360 365 Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 420 425 430 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly 465 470 475 480 Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val 485 490 495 Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln His 500 505 510 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser 515 520 525 Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr 530 535 540 Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr 545 550 555 560 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr 565 570 575 Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 580 585 590 Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 595 600 605 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 610 615 620 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 625 630 635 640 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 645 650 655 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 660 665 670 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 675 680 685 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 690 695 700 <210> 18 <211> 126 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110 Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 19 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro 85 90 95 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 299-023 VH humanization variant_DASG <400> 20 Gln Ser Met Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala 20 25 30 Met Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Tyr Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Ser 50 55 60 Arg Val Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Ser Leu Lys Leu Ser 65 70 75 80 Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Tyr 85 90 95 Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Tyr Gly Asp Ala Ser Gly Phe Asp Pro Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 299-009 VL humanization variant_NYA <400> 21 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Tyr Ala Ser Ser Asn 85 90 95 Val Asp Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu 1 5 10 15 Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp 20 25 30 Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala 35 40 45 Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly 50 55 60 Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly 65 70 75 80 Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr 85 90 95 Glu Cys Glu Arg Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro 100 105 110 Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys 115 120 125 Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile 130 135 140 Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln 145 150 155 160 Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val 180 185 190 Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg 195 200 205 Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys 210 215 220 Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys 225 230 235 240 Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile 245 250 255 Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu 260 265 270 Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe 275 280 285 Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly 290 295 300 Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln 305 310 315 320 Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr 325 330 335 Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp 340 345 350 Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser 355 360 365 Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile 370 375 380 Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp 385 390 395 400 His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala 405 410 415 Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met 420 425 430 Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile 435 440 445 Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr 450 455 460 Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr 465 470 475 480 Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val 485 490 495 Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn 500 505 510 Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp 515 520 525 Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe 530 535 540 Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp 545 550 555 560 Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu 565 570 575 Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu 580 585 590 Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn 595 600 605 Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp 610 615 620 Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln 625 630 635 640 Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu 645 650 655 Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys 660 665 670 Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro 675 680 685 Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser 690 695 700 Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys 705 710 715 720 Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala 725 730 735 Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp 740 745 750 Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe 755 760

Claims (17)

  1. a) 각각 항체 경쇄 및 항체 중쇄로 이루어진 2개의 쌍을 포함하는 하나의 항체로서, 중쇄 및 경쇄의 쌍 각각에 의해 형성된 결합 자리가 제1 항원에 특이적으로 결합하는, 항체, 및
    b) 항체의 중쇄중 하나의 C-말단에 융합되는 하나의 추가적인 Fab 단편으로서, 추가적인 Fab 단편의 결합 자리가 제2 항원에 특이적으로 결합하는, 단편
    을 포함하는 이중특이성 항체로서,
    각각의 항체 경쇄는 불변성 경쇄 도메인(CL)내에서 위치 123에서 아미노산 잔기 아르기닌(야생형 글루탐산 잔기 대신에; E123R 돌연변이)을, 및 위치 124에서 아미노산 잔기 라이신(야생형 글루타민 잔기 대신에; Q124K 돌연변이)을 포함하고[카밧(Kabat)에 따라 번호매김],
    각각의 항체 중쇄는 제1 불변성 중쇄 도메인(CH1)내에서 위치 147에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 잔기 대신에; K147E 돌연변이)를, 및 위치 213에서 글루탐산 잔기(야생형 라이신 아미노산 잔기 대신에; K213E 돌연변이)를 포함하며(카밧 EU 지수에 따라 번호매김),
    제2 항원에 특이적으로 결합하는 추가적인 Fab 단편은 불변성 경쇄 도메인(CL) 및 불변성 중쇄 도메인 1(CH1)이 서로 대체되도록 도메인 크로스오버(crossover)를 포함하고,
    제1 항원은 인간 Α-베타 단백질이고 제2 항원은 인간 트랜스페린 수용체인
    이중특이성 항체.
  2. 제1항에 있어서,
    추가적인 Fab 단편이 펩티드 연결기에 의해 중쇄의 C-말단에 융합되는 이중특이성 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    a) 추가적인 Fab 단편에 융합되는 중쇄가 C-말단 중쇄 아미노산 잔기로서 트리펩티드 LSP를 갖고, 이의 프롤린이 펩티드 결합을 경유하여 펩티드 연결기에 또는 추가적인 Fab 단편의 제1 아미노산 잔기에 직접적으로 융합되고,
    b) 추가적인 Fab 단편에 융합되지 않는 중쇄가 C-말단 중쇄 아미노산 잔기로서 트리펩티드 LSP, 또는 SPG, 또는 PGK를 갖는 이중특이성 항체.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    a) 인간 아강(subclass) IgG1의 전장 항체,
    b) 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
    c) 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
    d) 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
    e) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
    f) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 S228P 및 P329G를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG4의 전장 항체,
    g) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, I253A, H310A 및 H435A를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체,
    h) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, M252Y, S254T 및 T256E를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 T366W 및 S354C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 T366S, L368A, Y407V 및 Y349C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체, 또는
    i) 중쇄 둘 다에서 돌연변이 L234A, L235A, P329G, H310A, H433A 및 Y436A를 갖고, 하나의 중쇄에서 돌연변이 i) T366W, 및 ii) S354C 또는 Y349C를 가지며, 각각 나머지 중쇄에서 돌연변이 i) T366S, L368A, 및 Y407V, 및 ii) Y349C 또는 S354C를 갖는 인간 아강 IgG1의 전장 항체인 이중특이성 항체.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    i) 서열 번호 1에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄,
    ii) 서열 번호 2에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄,
    iii) 서열 번호 3에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄, 및
    iv) 서열 번호 4에 대하여 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체.
  6. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 서열 번호 3의 아미노산 서열을 갖는 경쇄, 및 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 항체 Fab 단편을 포함하는 이중특이성 항체.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
    단일클론성인 이중특이성 항체.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    인간 Α-베타 결합 자리가 서열 번호 18의 VH 서열 또는 이 서열의 번역후 변형, 및 서열 번호 19의 VL 서열 또는 이 서열의 번역후 변형을 포함하는 이중특이성 항체.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
    인간 트랜스페린 수용체 결합 자리가 서열 번호 20의 VH 서열 또는 이 서열의 번역후 변형, 및 서열 번호 21의 VL 서열 또는 이 서열의 번역후 변형을 포함하는 이중특이성 항체.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
  11. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 이중특이성 항체.
  12. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서,
    알츠하이머병을 치료하기 위한 이중특이성 항체.
  13. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체의 약제의 제조에 있어서의 용도.
  14. 제13항에 있어서,
    약제가 알츠하이머병을 치료하기 위한 것인 용도.
  15. 제13항에 있어서,
    약제가 뇌에서 플라크(plaque)의 형성을 저해/둔화시키기 위한 것인 용도.
  16. 알츠하이머병을 앓는 개체에게 효과량의 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머병을 앓는 개체를 치료하는 방법.
  17. 개체에게 효과량의 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 따른 이중특이성 항체를 투여하는 단계를 포함하여 뇌에서 플라크의 형성을 저해/둔화시키는, 개체의 뇌에서 플라크의 형성을 저해/둔화시키는 방법.
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PA0105 International application

Patent event date: 20180430

Patent event code: PA01051R01D

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Patent event date: 20210923

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Patent event date: 20240229

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Patent event code: PE07011S01D

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Patent event date: 20241024

A107 Divisional application of patent
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20250120

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PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20250122

Patent event code: PR07011E01D

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Start annual number: 1

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