KR100810173B1

KR100810173B1 - 전류를 이용하여 핵산 및 다른 생물학적 활성 분자를 고등 진핵 세포 내로 주입시키기 위한 회로 장치

Info

Publication number: KR100810173B1
Application number: KR1020037013815A
Authority: KR
Inventors: 헤르베르트 뮐러-하르트만; 구둘라 리멘; 키르스텐 로트만; 코리나 티엘; 루트거 알트로게; 마이케 바이겔; 라이너 크리스티네; 엘케 로르바흐; 율리아나 헬프리히; 하이케 베쎈도르프; 그레고르 지벤코텐
Original assignee: 아막사 아게
Priority date: 2001-04-23
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2008-03-06
Anticipated expiration: 2022-04-23
Also published as: EP1383901B1; IL158513A; US20090023131A1; EP1522587B1; DE50201472D1; EP1522587A2; CN1503845A; ZA200308254B; DE10119901A1; JP2004536584A; DE50212037D1; JP4694587B2; NO20034681L; EP1383901A1; US20040137603A1; NO20034681D0; ES2231709T3; ATE391185T1; IL158513A0; ES2305642T3

Abstract

본 발명은 일렉트로트랜스펙션 또는 전기융합용 신규 회로 장치에 관한 것으로, 이것은, 세포 분열과 관계없이 그리고 세포 괴사율을 줄이면서, DNA 및/또는 다른 생물학적 활성 분자들을 고등 진핵세포의 핵 또는 세포의 융합으로 전달할 수 있게 한다.

Description

전류를 이용하여 핵산 및 다른 생물학적 활성 분자를 고등 진핵 세포 내로 주입시키기 위한 회로 장치{CIRCUIT ARRANGEMENT FOR INJECTING NUCLEIC ACIDS AND OTHER BIOLOGICALLY ACTIVE MOLECULES INTO THE NUCLEUS OF HIGHER EUCARYONTIC CELLS USING ELECTRICAL CURRENT}

본 발명은 전류에 의하여 핵산, 펩티드, 단백질 및/또는 다른 생물학적 활성 분자를 진핵 세포의 세포핵 내로 도입시키기 위한 회로 장치, 또는 전류로 세포, 세포 유도체, 세포하 입자(subcellular particle) 및/또는 소포(vesicle)를 처리하기 위한 회로 장치에 관한 것으로, 이러한 회로 장치는 전하량을 위한 적어도 2개의 저장 장치와 적어도 하나의 모니터링 장치로 구성되는데, 각각의 저장 장치는 고압 전력 공급원에 의해 공급받고 저장 장치 내에 존재하는 전하량을 큐벳 내의 현탁액으로 전달하기 위한 적어도 하나의 전력 반도체를 구비하며, 모니터링 장치는 전력 반도체를 제어한다.

진핵 DNA의 작용 위치가 세포핵이기 때문에, 외부로부터 공급되는 DNA는 판독되기 위해 핵으로 들어가야 한다. 종래의 트랜스펙션 방법은 단지 DNA를 세포막을 통하여 세포질로 이동시킨다. 이는 단지 고등 진핵 세포들의 세포 분열 동안 핵막이 일시적으로 용해되기 때문에 DNA가 핵으로 수동적으로 진입하여, 이에 의해 암호화된 단백질들이 발현될 수 있다. 단지 매우 작은 DNA 분자들(올리고뉴클레오티드)이 핵막의 소공들을 통하여 자유롭게 확산될 수 있다. 따라서, 불활동성 또는 약하게 분열하는 세포들의 효과적인 트랜스펙션을 위해서, 보다 큰 DNA 분자들이 충분한 양으로 핵막을 통하여 핵으로 진입하는 결과를 갖는 조건을 창안하는 것이 필요하다.

한 동안 완충액으로부터의 DNA가 전류의 도움으로 세포들 내로 도입될 수 있다는 것이 알려져 왔다. 그러나, 지금까지 기술된 전기 천공을 위한 회로 장치는 고등 진핵 세포의 세포질 내로의 DNA의 이동을 기초로 하며, 따라서 트랜스펙션된 DNA의 발현은 세포 분열 동안의 핵막의 용해에 의존한다. 지금까지 알려진 어떠한 전기 천공용 회로 장치도 DNA를 전기적으로 특정하게 고등 진핵 세포의 핵 내로 주입하는 것에 대해서는 관심이 없었다. 따라서, 전기적 핵 수송을 위해 최적화된 일렉트로트랜스펙션용 회로 장치는 공지되지 않았다.

Bio-Rad Laboratories, Richmond, USA(1986)의 미국 특허 공보 제4,750,100호에는 커패시터 방전에 의해 최대 125 A에서 최대 3000 V를 제공할 수 있는 특정한 장치의 구조가 기재되어 있다.

미국 특허 공보 제5,869,326호(Genetronics, Inc., San Diego, USA, 1996)에는 2개, 3개 또는 다수개의 펄스가 2개의 별도 전류원을 이용하여 형성될 수 있는 특정 장치의 구조가 기재되어 있다. 그러나, 이러한 펄스들이 DNA의 세포질로의 이동시키는 것 이상의 효과를 갖는 것은 청구되거나 도시되지 않는다.

미국 특허 공보 제6,008,038호 및 유럽 공개 특허 공보 제0 866 123 A1호(Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg, 1998)에는 최대 1.5 kV이고 10-500 ㎲인 짧은 펄스들이 형성될 수 있는 장치가 기재되어 있다. 그러나 이는 역시 DNA를 핵 내로 운반할 수 있는 특정 조건을 제시하지 않는다.

지금까지 공지된 어떠한 회로도 DNA 및/또는 다른 생물학적 활성 분자들이 낮은 세포 괴사율을 가지고 세포핵 내로 효과적으로 이동될 수 있도록 최적화되지 않았다.

본 발명의 목적은 DNA 및/또는 다른 생물학적 활성 분자들이 낮은 세포 괴사율을 가지고 세포핵 내로 효과적으로 이동될 수 있도록 하는 회로 장치를 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 제1 저장 장치는 하나의 파라미터로서 소정의 전압(U₁)으로 충전되고, 제2 저장 장치는 전압 U₂=R×I₂×K₂로 충전되며, 여기서 R은 큐벳과 그 내부에 포함된 현탁액의 저항이고, I₂는 요구되는 전류이며, K₂는 큐벳의 특성을 고려한 보정값이고, 저장 장치의 커패시터 전압(U₁)을 갖는 적어도 하나의 제1 펄스가 전력 반도체를 제어함에 의해 소정의 시간(T₁) 동안 세포로 전송될 수 있다.

본 발명의 실시예에서는, 저장 장치의 커패시터 전압(U₂)을 갖는 적어도 하나의 제2 펄스가 전력 반도체를 제어함에 의해 큐벳으로 중단되지 않고 또한 인가될 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 선택가능한 시간 간격에서 운반된 전하량은 모니터링 장치에 의해 측정될 수 있고, 여기서 소정의 요구되는 전하량은 실제로 운반된 전하량과 비교되며, 요구되는 전하량에 도달되거나 또는 초과되면 전력 반도체가 차단된다.

저장 장치로부터 흐르는 전류를 이용하여 운반된 전하량을 결정하는 가능성 이외에, 대안적으로 소정의 요구되는 전하량은 시간 간격을 두고 실제로 운반된 전하량과 비교되고, 요구되는 전하량에 도달되거나 또는 초과되는 경우에 전력 반도체는 차단된다. 이 경우에, 사용된 펄스의 형상과 펄스의 수에 따라서, 결정을 위해 선택될 수 있는 시간 간격은 예를 들면 최초 또는 각각의 뒤따르는 펄스 동안 운반된 전하량을 결정하기 위해, 개별적으로 미리 결정될 수 있다. 운반된 전하량은 저장 장치들 중 적어도 하나의 최초 전하와 잔여 전하 사이의 차를 결정함에 의해 결정될 수 있다. 이 경우에, 사용된 펄스의 수에 따라서, 적어도 2개의 저장 장치 중 하나 이상이 회로 형성에 이용되고, 여기서 전하량을 세포 현탁액을 포함하는 큐벳에 전송하기 위해 각 저장 장치에는 적어도 하나의 고압 전력원, 모니터링 장치 및 전력 반도체가 할당된다. 펄스의 전송을 위해서, 제1 전력 반도체는 10 - 100 ㎲의 지속 시간과 적어도 2 A*cm^-2의 전류 밀도를 갖는 2 - 10 kV/cm의 펄스를 전송하고, 제2 전력 반도체는 2 - 14 A*cm^-2의 전류 밀도와 최대 100 ms의 지속 시간을 갖는 펄스를 중단없이 전송하도록 구성된다. 운반된 전하량을 결정하기 위한 시간 간격은 결과적으로 제1 펄스 및/또는 바람직하게는 제2 펄스 또는 각각의 추가적인 펄스의 운반으로 특정될 수 있다.

제2 펄스의 운반된 전하량은 모니터링되는 것이 바람직하며, 여기서 제2 펄스의 스위치-온 시간(T₂)은 요구되는 전하량과 측정 시간 동안 운반되는 실제 전하량을 비교함에 의해 특정될 수 있고 요구되는 전하량에 도달되면 끝나고, 여기서 1 msec의 측정 주기가 실제 전하량을 결정하는 데 제공되며, 시간(T₂) 동안 커패시터 전압은 지수적으로 감소하고, 특정된 전하의 양(Q₂)에 도달하면 전력 반도체는 차단된다.

대안적으로, 제1 펄스 및/또는 제2 펄스의 개시(triggering) 후 적어도 하나의 소정의 시간 간격 후에, 흐르는 전류가 측정되며, 이러한 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 그 이하로 떨어지는 경우에, 운반된 전하량을 일정하게 유지시키기 위해 펄스의 지속 시간이 재조절될 수 있다. 또 다른 대안으로서, 제1 펄스 및/또는 제2 펄스의 개시 후 적어도 하나의 소정의 시간 간격 후에, 흐르는 전류가 측정되며, 이러한 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 그 이하로 떨어지는 경우에, 장치의 사용자에게 경고를 주기 위해 오류 메시지가 형성될 수 있다. 또한, 제1 펄스 및/또는 제2 펄스의 개시 후 적어도 하나의 소정의 시간 간격 후에, 흐르는 전류가 측정되며, 이러한 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 그 이하로 떨어지는 경우에, 요구되는 값이 재조절될 수 있다.

특히 세포 현탁에 사용되는 큐벳의 어떤 필요한 상수들을 결정하기 위해서, 세포 현탁액을 구비하는 큐벳 저항의 예비적인 측정이 수행될 수 있다. 다른 필요한 펄스 파라미터들은 수동으로 미리 선택되는 것이 바람직하며, 또는 필요한 경우 코드(code)를 입력함에 의해 특정된다. 따라서, 카드 판독기를 통하여 검색가능한 데이타를 이용하는 것이 또한 가능하다. 카드 판독기는, 상업적으로 이용가능한 메모리 카드에서 1개 또는 다수개의 펄스 운반 프로세스의 문서화 목적을 위해, 큐벳으로 인가되는 전압의 시간 프로파일 또는 큐벳을 통하여 흐르는 전류를 저장하는 데 동시에 사용될 수 있다. 이러한 메모리 카드는 설정되는 펄스 파라미터들을 저장하는 데 동시에 사용되는 것이 바람직하다. 펄스 운반의 회로 조절로 인해, 예정된 전하량의 전송이 적어도 하나의 펄스에 대해서 신뢰할만하고 바람직한 방법으로 모니터링되고, 소정의 전하량의 제어되고 샘플 의존적인 전송뿐만 아니라 샘플 내에 위치된 세포들에 어떠한 손상도 입히지 않도록 제어된 모니터링이 수행될 수 있다. 사용자 및 사용된 샘플의 추가적인 안전을 위해서, 제1 펄스 및 각각의 뒤따르는 펄스에 대해 과전류 차단기가 제공될 수 있다. 따라서, 과전류 차단기는 소정의 한계값이 초과되는 경우에는 언제라도 고압 펄스가 중단되도록 한다.

상술된 2 - 10 kV/cm의 고압 펄스는 세포 분열과 관계없이 DNA가 세포핵으로 들어갈 수 있는 조건을 형성하는 데 적합하다. 세포 손상을 낮게 유지하기 위해서, 이러한 펄스는 10에서 최대 200 ㎲ 사이로 제한되고, 10 - 50 ㎲가 바람직하다. 이는 세포 분열에 관계없이 트랜스펙션을 수행하는 데 충분하다. 예를 들어, 이렇게 짧은 단일 고압 펄스는 인간 배꼽 정맥(umbilical vein)으로부터의 내피 세포의 트랜스펙션에 최적인 것으로 판명되었다. 중단없이 뒤따르는, 보다 낮은 장 세기 또는 보다 낮은 전류 세기 또는 전류 밀도를 갖지만 지속 시간이 보다 긴 또 다른 전류 펄스가 트랜스펙션의 효율에 영향을 미친다. 상당히 낮은 전류 밀도로 인해, 이러한 펄스는 세포 손상이 적으며, 상당히 오래 지속될 수 있다. 제2 펄스의 최적의 전류 밀도 또는 지속 시간은 세포의 유형 및 세포의 민감성에 의존하여 얻어진다. 이렇게 합성된 펄스들은 예를 들면 1차 인간 피부 섬유 아세포 또는 멜라노 세포 또는 다양한 인간 혈액 세포들에 최적인 것으로 판명되었다. 상이한 세포주들 및 발현 시스템들을 이용한 실험에 있어서, 다음과 같이 나타났다. 제2 펄스의 전류 밀도가 높아질수록, 트랜스펙션 비율, 즉 트랜스펙션된 세포들의 퍼센티지에 미치는 영향은 강해진다. 전류 밀도가 낮아질수록, 제2 펄스는 순수한 DNA가 제1 펄스에 의해 이미 트랜스펙션된 세포들 내로 더욱 많이 전송된다. 트랜스펙션된 세포들의 발현 수준은 펄스의 지속 시간의 증가에 따라 증가하지만 트랜스펙션된 세포의 분율의 증가에 따라 증가하지는 않는다. 정확한 트랜스펙션 비율의 세포 특이성 제어를 유지하기 위해서, 발현 수준 및 세포 활력도, 제2 펄스의 펄스 지속 시간 및 전류 밀도가 제어되어야 한다.

세포 현탁액으로 실제로 운반되는 펄스의 정확한 제어를 달성하기 위해서, 바람직한 실시예에 있어서, 운반된 전하량이 제어된다. 저장 유닛의 선택가능한 커패시터 전압에 의한 전류 세기 또는 전류 밀도를 제어하기 위해서, 큐벳 및 그 내부에 담겨있는 세포 현탁액의 저항이 최초에 미리 결정되어야 한다. 알루미늄 전극들을 사용하는 경우에, 큐벳들의 저항은 전기 화학적 프로세스로 인하여 펄스 중에 변화한다. 이러한 변화는 펄스 특이성인 소정의 보정값에 의해 고려된다. 따라서, 제2 펄스를 위한 정확한 펄스 형태는 전하의 제어에 의해 U₂=R×I₂×K₂를 이용하여 미리 결정될 수 있고, 여기서 U₂는 이에 의해 저장 장치가 충전되는 커패시터 전압이고, R은 큐벳과 그 내부에 포함된 세포 현탁액의 저항, I₂는 요구되는 전류 그리고 K₂는 펄스 특이성 보정값이다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 큐벳의 오옴 저항 R은 시험 전압의 인가에 의해 펄스 운반의 시작 직전에 측정될 수 있으며, 이에 따라 전압 U₂의 계산에 고려된다. 펄스 운반 전에 측정된 저항은 아마도 전기 화학적 프로세스로 인해 펄스 전달 동안의 저항보다 크게 변동되기 때문에, 파라미터로서 커패시터 전압(U₂)을 계산하기 위한 저항 R을 확고하게 미리 결정하는 것이 바람직한 것으로 판명되었다. 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 큐벳의 저항은 그가 미리 결정된 저항 윈도우 내에 놓여있는지를 결정하기 위해 펄스에 관계없이 펄스 운반의 시작 전에 측정된다. 측정된 저항이 윈도우 밖에 있는 경우에, 오류가 있는 것이고, 펄스 운반은 해제되지 않는다.

모든 세포 유형에 대해서, 트랜스펙션 비율, 트랜스펙션 세기 및 세포 활력도에 대한 최적 조건들이 설정될 수 있다. 회로 장치의 바람직한 실시예에 있어서, 제1 펄스의 장 세기 및 지속 시간과 제2 펄스의 최초 전류 세기 또는 전류 밀도 및 실험적 지속 시간이 선택될 수 있고, 코드를 통하여 다양한 세포 유형들에 대한 최적 조건들이 간단히 설정될 수 있다.

회로 장치는 불활동성 또는 분열하는 진핵 세포들의 트랜스펙션에 바람직한 방법으로 사용될 수 있다. 동일한 방법으로 회로 장치는, 인간 혈액 세포, 인간의 혈액으로부터의 고활성 전구 세포(pluripotent precursor cell), 1차 인간 섬유 아세포, 내피 세포, 근육 세포 또는 멜라노 세포들과 같은 1차 세포들의 트랜스펙션에 특히 적합하고, 진단 목적 또는 생체외 유전자 치료용 의약품의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 회로 장치는 또한 예를 들면 전기 융합(elctrofusion), 즉 전류에 의해 세포, 세포 유도체, 세포하 입자(subcellular particle) 및/또는 소포(vesicle)의 융합 방법에 적합하고, 여기서 예를 들어 세포, 세포 유도체, 세포하 입자 및/또는 소포는 최초에 수용액 내에서 적합한 밀도로 현탁되며, 현탁액은 이어서 큐벳으로 이송되고 최종적으로 전압이 큐벳의 전극에 인가되어 전류의 흐름이 현탁액을 통하여 형성된다. 대안적으로, 예를 들면 점착성 세포(adherent cells), 세포 유도체, 세포하 입자 및/또는 소포 또는 현탁된 세포, 세포 유도체, 세포하 입자 또는 소포들을 갖는 점착성 세포가 융합될 수 있다.

여기서 기술된 회로 장치는 2 내지 10 kV/cm의 매우 높은 장 세기를 형성하는데, 이는 DNA 및/또는 생물학적 활성 분자들이 세포 분열에 관계없이 핵으로 들어갈 수 있는 효과를 갖는다. 이러한 장 세기는 전기 천공에 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 높고 세포막 내에서 소공들의 효과적인 개방에 충분한 것(Lurquin, 1997, Mol. Biotechnol. 7,5 에 따르면 평균 1 kV/cm)보다 훨씬 능가하는 것이다.

따라서 본 발명의 요지는 전류를 이용하여 핵산, 펩티드, 단백질 및/또는 다른 생물학적 활성 분자들을 고등 진핵 세포의 세포핵 내로 도입하는 방법을 수행하기 위한 회로 장치로서, 여기서 핵 내로의 도입은, 세포막 내 기공의 개방에 충분한 것의 2 - 10 배의 장 세기를 가지며 적어도 10 ㎲의 지속 시간과 적어도 2 A*cm^-2의 전류 밀도를 갖는 펄스에 의해 달성된다.

핵산, 펩티드, 단백질 및/또는 다른 생물학적 활성 분자들의 세포핵 내로의 도입은 2 - 10 kV/cm, 바람직하게는 3 - 8 kV/cm의 펄스에 의해 달성될 수 있고, 여기서 펄스는 최대 200 ㎲ 동안 지속된다.

회로 장치는, 제1 펄스에 뒤이어 중단없이, 2 A*cm^-2내지 최대 14 A*cm^-2까지의, 바람직하게는 5 A*cm^-2까지의 전류 밀도를 가지며 1 ms 내지 최대 100 ms까지의, 바람직하게는 50 ms까지의 길이를 갖는 전류가 뒤따를 수 있도록 설계된다.

회로 장치는 세포 분열에 관계없이 트랜스펙션이 가능하게 하기 때문에, 분열하는 세포 이외에, 불활동성 또는 약하게 분열하는 1차 세포들 또한 트랜스펙션될 수 있다.

다른 바람직한 실시예에 있어서, 고등 진핵 세포들은 1차 인간 섬유 아세포, 내피 세포 및 멜라노 세포들을 포함한다.

본 발명에 따른 회로 장치를 이용하여 트랜스펙션된 진핵 세포들은 진단 및 생체외 유전자 치료 약품의 제조를 위한 분석 목적으로 또한 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 회로 장치는 세포 분열과 무관하게 트랜스펙션을 달성할 수 있게 하며, 따라서 트랜스펙션 실험을 상당히 가속화시킨다. 발현 벡터를 이용한 트랜스펙션 실험에서, 프로모터 및 발현된 단백질에 따른 분석은 트랜스펙션이 일어나고 단지 몇 시간 후에라도 수행될 수 있다.

"생물학적 활성 분자들" 이라는 개념은 펩티드, 단백질, 폴리사카라이드, 지질들을 의미하며, 또는 세포 내에서 생물학적 친화성을 증진시키는 한 이러한 분자들의 조합 또는 유도체들도 의미한다.

높은 이온 강도와 높은 완충 용량을 갖는 전기 천공 완충액들이 본 발명에 따른 회로 장치의 이용에 특히 적합하다.

다음의 프로토콜이 핵산을 진핵 세포의 세포핵 내로 도입시키는 데 이용될 수 있다. 1×10⁵ - 1×10⁷개의 세포들 및 10 ㎍까지의 DNA가 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳 내의 100 ㎕ 전기 천공 완충액 속에서 실온으로 10분 동안 항온처리되었고, 이어서 본 발명에 따른 조건에 따라 트랜스펙션되었다. 그 직후, 세포들은 400 ㎕의 세포 배양 배지로 큐벳으로부터 세척되었고, 이어서 37℃에서 10분 동안 항온처리되었다. 세포들은 이어서 37℃의 따뜻한 세포 배양 배지에서 평판 배양되었다.

적합한 큐벳은 예를 들면 2 mm 또는 1 mm의 전극간 갭을 갖는 상업적으로 이용가능한 원핵 생물의 전기 천공용 큐벳이다.

핵산들이 세포 분열과 무관하게 세포핵으로 들어간다는 증거는 트랜스펙션과 분석 사이에 분열되지 않는 세포들을 분석함에 의해 제공될 수 있다. 이는 한편으로 예를 들면 말초적인 인간 혈액 세포들과 같이 분열하지 않는 세포들의 트랜스펙션에 의해 달성되고, 다른 한편으로 분열하는 세포에 대해서는 트랜스펙션이 일어나고 몇 시간 후에 세포들의 최대 분율이 분열된 시간에 분석에 의해 달성된다.

도 1은 인간 혈액으로부터의 세포 독성 T 세포의 트랜스펙션,

도 2는 인간 혈액으로부터의 고활성 전구 세포의 트랜스펙션,

도 3은 인간 신생아 피부 섬유 아세포의 트랜스펙션,

도 4는 인간 신생아 피부 멜라노 세포의 트랜스펙션,

도 5는 탯줄로부터의 인간 내피 세포의 트랜스펙션,

도 6은 세포주 K562의 트랜스펙션(트랜스펙션이 일어나고 4시간 후의 분석),

도 7은 CHO 세포주를 이용한 실험에서, 전류 세기, 펄스 시간 및 전하량의 작용으로서의 트랜스펙션 효율의 조사 및 전하량의 작용으로서의 발현 세기의 조사,

도 8은 Jurkat 세포주를 이용한 실험에서, 전류 세기, 펄스 시간 및 전하량의 작용으로서의 트랜스펙션 효율의 조사 및 전하량의 작용으로서의 발현 세기의 조사,

도 9는 Jurkat 세포주 및 표면 표지 단백질 H-2K^k를 이용한 실험에서, 전류 세기, 펄스 시간 및 전하량의 작용으로서의 트랜스펙션 효율의 조사 및 전하량의 작용으로서의 발현 세기의 조사,

도 10은 전기 천공 회로의 블록 다이어그램,

도 11은 제어 패널의 회로 다이어그램,

도 12는 카드 판독기의 회로 다이어그램,

도 13은 서플라이 유닛의 회로 다이어그램,

도 14는 HV 전원의 회로 다이어그램,

도 15는 HV 스위치의 회로 다이어그램,

도 16은 전류 조절 시스템의 회로 다이어그램,

도 17은 플래시 인식 시스템의 회로 다이어그램,

도 18은 제어 시스템의 회로 다이어그램,

도 19는 펄스 운반 과정의 순서를 설명하는 흐름도를 도시한 도면이다.

일반적으로 이용되는 약어 이외에 다음 약어들이 사용된다.

FACS Fluorescence activated cell sorting

FCS Foetal calf serum

PBMC Peripheral blood mononuclear cells

PE Phycoerythrin

다음 실시예들은 본 발명을 설명하지만 제한적인 것은 아니다.

실시예 1

인간 혈액으로부터의 세포 독성 T 세포의 트랜스펙션

말초적인 인간 혈액(PBMC)으로부터의 깨끗하게 준비된 자극되지 않은(분열하지 않는) 단핵 세포들이 마우스 MHC 클래스 1 단백질 H-2K^k의 무거운 사슬을 암호화하는 벡터로 트랜스펙션되었다. 높은 완충 용량(48 mM×pH^-1) 및 높은 이온 강도(280 mM)를 갖는 완충액에서 5 ㎍의 벡터 DNA와 함께 5×10⁶개의 세포들이 실온에서 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고 100 ㎲의 지속 시간을 갖는 1000 V 펄스에 의해 트랜스펙션되었으며, 이어서 5 A*cm^-2의 전류 밀도를 가지는 40 ms 전류가 인가되었다. 그 직후, 세포들은 400 ㎕의 배양 배지를 이용하여 큐벳으로부터 세척되었고, 37℃에서 10분간 항온처리되었으며, 이어서 예열된 배지를 갖는 배양 접시로 이송되었다. 24시간 동안 항온 처리한 후, 세포들은 인간 세포 독성 T 세포를 인식하기 위해, digoxigenin-coupled anti-H-2K^k-antibody 및 Cy5-coupled anti-digoxigenin-antibody 뿐만 아니라 PerCP-coupled anti-CD8-antibody로 연속적으로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함으로써 결정되었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 74.3%의 살아있는 세포들이 매우 높은 트랜스펙션 효율에 상응하는 H-2K^k 항원을 발현시켰다.

실시예 2

인간 조혈 모세포(CD34)의 트랜스펙션

CD34-양성 세포들이 자기 세포 분류(magnetic cell sorting)에 의해 실시예 1에서와 같이 기술된 깨끗하게 준비된 PBMC로부터 미리 농축되었다. 각각 1×10⁴개의 CD34-양성 세포들이 이어서 1×10⁶개의 PBMC들과 혼합되었고, 높은 완충 용량(54 mM×pH^-1) 및 높은 이온 강도(260 mM)를 갖는 완충액에서 5 ㎍의 H-2K^k-발현 벡터 DNA와 함께 실온에서 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고 100 ㎲의 지속 시간을 갖는 1000 V 펄스에 의해 트랜스펙션되었으며, 이어서 4 A*cm^-2의 전류 밀도를 가지는 20 ms 전류가 인가되었다. 그 직후, 세포들은 400 ㎕의 배양 배지를 이용하여 큐벳으로부터 세척되었고, 37℃에서 10분간 항온 처리되었으며, 이어서 예열된 배지를 갖는 배양 접시로 이송되었다. 16시간 동안 항온 처리한 후, 세포들은, 인간의 조혈 모세포를 인식하기 위해, phycoerythrin-coupled anti-H-2K^k-antibody 및 APC-coupled anti-CD34 antibody로 연속적으로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함으로써 결정되었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 66.7%의 살아있는 세포들이 매우 높은 트랜스펙션 효율에 상응하는 H-2K^k 항원을 발현시켰다.

실시예 3

인간 신생아 피부 섬유 아세포(NHDF-Neo)의 트랜스펙션

5 ㎍의 H-2K^k-발현 벡터 DNA와 함께 인간 신생아 피부 섬유 아세포(5×10⁵ 개의 세포)들이 높은 완충 용량(67 mM×pH^-1) 및 높은 이온 강도(380 mM)를 갖는 완충액에서 실온에서 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고 100 ㎲의 지속 시간을 갖는 1000 V 펄스에 의해 트랜스펙션되었으며, 뒤이어, 6 A*cm^-2의 전류밀도를 가지며 33 ms 지속 시간을 갖는 전류가 인가되었다. 그 직후, 세포들은 400 ㎕의 배양 배지를 이용하여 큐벳으로부터 세척되었고, 37℃에서 10분간 항온 처리되었으며, 이어서 예열된 배지를 갖는 배양 접시로 이송되었다. 5시간 동안 항온 처리한 후, 세포들은 Cy5-coupled anti-H-2K^k-antibody로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함으로써 결정되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 93%의 세포들이 매우 높은 트랜스펙션 효율에 상응하는 H-2K^k 항원을 발현시켰다.

실시예 4

인간 신생아 멜라노 세포의 트랜스펙션

5 ㎍의 H-2K^k-발현 벡터 DNA와 함께 인간 신생아 멜라노 세포(2.5×10⁵개의 세포)들이 높은 완충 용량(54 mM×pH^-1) 및 높은 이온 강도(260 mM)를 갖는 완충액에서 실온에서 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고 100 ㎲의 지속 시간을 갖는 1000 V 펄스에 의해 트랜스펙션되었으며, 이어서 6 A*cm^-2의 전류 밀도를 가지며 33 ms 지속 시간을 갖는 전류가 인가되었다. 그 직후, 세포들은 400 ㎕의 배양 배지를 이용하여 큐벳으로부터 세척되었고, 37℃에서 10분간 항온 처리되었으며, 이어서 예열된 배지를 갖는 배양 접시로 이송되었다. 5시간 동안 항온 처리한 후, 세포들은 Cy5-coupled anti-H-2K^k-antibody로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함으로써 결정되었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 75.1%의 세포들이 매우 높은 트랜스펙션 효율에 상응하는 H-2K^k 항원을 발현시켰다.

실시예 5

배꼽 정맥으로부터의 인간 내피 세포(HUVEC)의 트랜스펙션

5 ㎍의 H-2K^k-발현 벡터 DNA와 함께 인간 배꼽 정맥으로부터의 내피 세포(1×10⁶ 개의 세포)들이 높은 완충 용량(67 mM×pH^-1) 및 높은 이온 강도(378 mM)를 갖는 완충액에서 실온에서 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고 100 ㎲의 지속 시간을 갖는 1000 V 펄스에 의해 트랜스펙션되었다. 그 직후, 세포들은 400 ㎕의 배양 배지를 이용하여 큐벳으로부터 세척되었고, 37℃에서 10분간 항온 처리되었으며, 이어서 예열된 배지를 갖는 배양 접시로 이송되었다. 5시간 동안 항온 처리한 후, 세포들은 Cy5-coupled anti-H-2K^k-antibody로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함으로써 결정되었다. 도 5에 도시된 바와 같이, 49.7%의 세포들이 매우 높은 트랜스펙션 효율에 상응하는 H-2K^k 항원을 발현시켰다.

실시예 6

인간 세포주 K562의 트랜스펙션

5 ㎍의 H-2K^k-발현 벡터 DNA와 함께 K562 세포(1×10⁵개의 세포)들이 높은 완충 용량(24 mM×pH^-1) 및 높은 이온 강도(254 mM)를 갖는 완충액에서 실온에서 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳에 위치되었고 100 ㎲의 지속 시간을 갖는 1000 V 펄스에 의해 트랜스펙션되었으며, 이어서 8 A*cm^-2의 전류 밀도를 가지며 10 ms 지속 시간을 갖는 전류가 인가되었다. 그 직후, 세포들은 400 ㎕의 배양 배지를 이용하여 큐벳으로부터 세척되었고, 37℃에서 10분간 항온 처리되었으며, 이어서 예열된 배지를 갖는 배양 접시로 이송되었다. 4시간 동안 항온 처리한 후, 세포들은 Cy5-coupled anti-H-2K^k-antibody로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다이드로 착색함으로써 결정되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 69.5%의 세포들이 매우 높은 트랜스펙션 효율에 상응하는 H-2K^k 항원을 발현시켰다.

실시예 7

Cycle3-GFP-transfected CHO 세포들의 트랜스펙션 효율 및 평균 형광 강도

제2 펄스에서 흐르는 전하량의 작용으로서 트랜스펙션된 세포들의 트랜스펙션 효율 및 평균 형광 강도를 조사하기 위해서, 5 ㎍의 Cycle3-GFP-벡터-DNA와 함께 각각 7×10⁵개의 CHO 세포들이 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳 내 전기 천공 완충액 속에 위치되었고, 1000 V, 10 ㎲의 펄스와, 전류의 세기 또는 전류 밀도 및 펄스 시간의 변화에 있어 다른 뒤따르는 제2 펄스에 의해 트랜스펙션되었다. 5시간 동안 배양 후, 세포들은 유속 세포 분석기를 이용하여 분석되었다. 도 7은 펄스의 시간에 걸친 전류의 총합(전하량 Q)의 작용으로서 결정된 트랜스펙션 효율을 도시하고 있다. 트랜스펙션 효율은 전류의 세기의 증가와 함께 증가될 수 있는 것으로 판명되었다(개방 원들). 한편, 동일한 전류 세기에 대해서 펄스 시간을 증가시키면 효율에 있어서 뚜렷한 증가가 나타나지 않았다(폐쇄 원들). 트랜스펙션된 세포들의 형광 광도(명도)는 전하량 Q의 증가와 함께 증가되고 높은 Q로 인해 포화에 도달한다. Q의 증가가 전류 세기의 증가(개방 원들)에 의해 달성되었는지 혹은 펄스 길이(폐쇄 원들)의 증가에 의해 달성되었는지에 대해서는 어떠한 주요 차이점도 발견되지 않았다.

실시예 8

Cycle3-GFP-transfected Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율 및 평균 형광 강도

제2 펄스에서 흐르는 전하량의 작용으로서 트랜스펙션된 세포들의 트랜스펙션 효율 및 평균 형광 강도를 조사하기 위해서, 5 ㎍의 Cycle3-GFP-벡터-DNA와 함께 각각 4×10⁵개의 Jurkat 세포들이 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳 내 전기 천공 완충액 속에 위치되었고, 1000 V, 10 ㎲의 펄스와, 전류의 세기 또는 전류 밀도 및 펄스 시간의 변화에 있어 다른 뒤따르는 제2 펄스에 의해 트랜스펙션되었다. 5시간 동안 배양 후, 세포들은 유속 세포 분석기를 이용하여 분석되었다. 도 8은 펄스의 시간에 걸친 전류의 총합(전하량 Q)의 작용으로서 결정된 트랜스펙션 효율을 도시하고 있다. CHO 세포들을 이용하는 경우와 같이, 트랜스펙션 효율은 전류의 세기의 증가와 함께 증가될 수 있는 것으로 판명되었다(개방 원들). 한편, 동일한 전류 세기에 대해서 펄스 시간을 증가시키면 효율에 있어서 뚜렷한 증가가 나타나지 않았다(폐쇄 원들). 트랜스펙션된 세포들의 형광 광도(명도)는 전하량 Q의 증가와 함께 증가되고 높은 Q로 인해 포화에 도달한다. Q의 증가가 전류 세기의 증가(개방 원들)에 의해 달성되었는지 혹은 펄스 길이(폐쇄 원들)의 증가에 의해 달성되었는지에 대해서는 어떠한 주요 차이점도 발견되지 않았다.

실시예 9

H-2K ^k -transfected Jurkat 세포들의 트랜스펙션 효율 및 평균 형광 강도

제2 펄스에서 흐르는 전하량의 작용으로서 트랜스펙션된 세포들의 트랜스펙션 효율 및 평균 형광 강도를 조사하기 위해서, 2 ㎍의 H-2K^k-발현 벡터 DNA와 함께 각각 1×10⁶개의 Jurkat 세포들이 2 mm의 전극간 갭을 갖는 큐벳 내 전기 천공 완충액 속에 위치되었고, 1000 V, 10 ㎲의 펄스와, 전류의 세기 또는 전류 밀도 및 펄스 시간의 변화에 있어 다른 뒤따르는 제2 펄스에 의해 트랜스펙션되었다. 3.5시간 동안 배양 후, 세포들은 Cy5-coupled anti-H2K^k로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기를 이용하여 분석되었다. 도 9는 펄스의 시간에 걸친 전류의 총합(전하량 Q)의 작용으로서 결정된 트랜스펙션 효율을 도시하고 있다. CHO 세포들을 이용하는 경우와 같이, 트랜스펙션 효율은 전류의 세기의 증가와 함께 증가될 수 있는 것으로 판명되었다(개방 원들). 한편, 동일한 전류 세기에 대해서 펄스 시간을 증가시키면 효율에 있어서 뚜렷한 증가가 나타나지 않았다(폐쇄 원들). 트랜스펙션된 세포들의 형광 광도(명도)는 전하량 Q의 증가와 함께 증가되고 높은 Q로 인해 포화에 도달한다. Q의 증가가 전류 세기의 증가(개방 원들)에 의해 달성되었는지 혹은 펄스 길이(폐쇄 원들)의 증가에 의해 달성되었는지에 대해서는 어떠한 주요 차이점도 발견되지 않았다.

이하 본 발명을 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명한다.

도 1은 H-2K^k-발현 벡터로 트랜스펙션된 PBMC의 유속 세포 분석을 도시하고 있다. 세포들은 인간 세포 독성 T 세포를 인식하기 위해서, digoxigenin-coupled anti-H-2K^k-antibody 및 Cy5-coupled anti-digoxigenin-antibody 뿐만 아니라 PerCP-coupled anti-CD8-antibody로 연속적으로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.(FL-2, FL-3 = fluorescence channel 2, 3; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter, PerCP = peridinin chlorophyll protein, CD = cluster of differentiation).

도 2는 H-2K^k-발현 벡터로 트랜스펙션된 PBMC로부터 농축된 CD34-양성 줄기세포의 유속 세포 분석을 도시하고 있다. 세포들은 인간의 조혈 모세포를 인식하기 위해서, phycoerythrin-coupled anti-H-2K^k-antibody 및 APC-coupled anti-CD34 antibody로 연속적으로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.(FL-1, FL-3 = fluorescence channel 1, 3; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter, PE = phycoerythrin, APC = allophycocyanin, CD = cluster of differentiation).

도 3은 인간 신생아 피부 섬유 아세포(NHDF-Neo)의 유속 세포 분석을 도시하고 있는데, 이는 H-2K^k-발현 벡터로 트랜스펙션되었다. 세포들은 Cy5-coupled anti-H-2K^k-antibody로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.(FL-1, FL-2, FL-3 = fluorescence channel 1, 2, 3; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter).

도 4는 인간 신생아 멜라노 세포(NHEM-Neo)의 유속 세포 분석을 도시하고 있는데, 이는 H-2K^k-발현 벡터로 트랜스펙션되었다. 세포들은 Cy5-coupled anti-H-2K^k-antibody로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.(FL-1, FL-2, FL-3 = fluorescence channel 1, 2, 3; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter).

도 5는 인간 탯줄로부터의 내피 세포(HUVEC)의 유속 세포 분석을 도시하고 있는데, 이는 H-2K^k-발현 벡터로 트랜스펙션되었다. 세포들은 Cy5-coupled anti-H-2K^k-antibody로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.(FL-1, FL-2, FL-3 = fluorescence channel 1, 2, 3; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter).

도 6은 H-2K^k-발현 벡터로 트랜스펙션된 인간 세포주 K562의 유속 세포 분석을 도시하고 있다. 세포들은 Cy5-coupled anti-H-2K^k-antibody로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다.(FL-1, FL-2, FL-3 = fluorescence channel 1, 2, 3; SSC = sideward scatter, FSC = forward scatter).

도 7은 흘러간 전하량 Q의 작용으로서의 CHO 세포의 트랜스펙션 효율 및 양성 세포의 평균 형광 강도(명도)의 그래프이다. CHO 세포는 Cycle3-GFP 발현 벡터로 트랜스펙션되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 5시간 후에 분석되었다. 폐쇄 원들은 동일한 전류 세기(2A) 또는 전류 밀도(4 A*cm^-2)에 대한 펄스 시간의 점진적인 증가에 상응하고, 개방 원들은 전류 세기의 증가에 상응한다.

도 8은 흘러간 전하량 Q의 작용으로서의 Jurkat 세포의 트랜스펙션 효율 및 양성 세포의 평균 형광 강도(명도)의 그래프이다. Jurkat 세포는 Cycle3-GFP 발현 벡터로 트랜스펙션되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 5시간 후에 분석되었다. 폐쇄 원들은 동일한 전류 세기(2A) 또는 전류 밀도(4 A*cm^-2)에 대한 펄스 시간의 점진적인 증가에 상응하고, 개방 원들은 전류 세기의 증가에 상응한다.

도 9는 흘러간 전하량 Q의 작용으로서의 Jurkat 세포의 트랜스펙션 효율 및 양성 세포의 평균 형광 강도(명도)의 그래프이다. Jurkat 세포는 H-2K^k 발현 벡터로 트랜스펙션되었고, 3.5시간 후에 Cy5-coupled anti-H-2K^k로 항온 처리되었고, 유속 세포 분석기(FACScalibur, Becton Dickinson)를 이용하여 분석되었다. 폐쇄 원들은 동일한 전류 세기(2A) 또는 전류 밀도(4 A*cm^-2)에 대한 펄스 시간의 점진적인 증가에 상응하고, 개방 원들은 전류 세기의 증가에 상응한다.

도 10은 필수적인 개별 요소들을 구비하는 전기 천공기(1)의 블록 다이어그램을 도시하고 있다. 이러한 요소들은 조절 유닛(2)과, 전압 공급 유닛(4)이 접속되는 제어 유닛(3) 뿐만 아니라, 적어도 2개의 HV 전압원(5,6)과 뒤따르는 저장 장치(7, 8), 그리고 펄스 운반을 위해 제공되는 2개의 전력 반도체(9, 10)를 포함한다. 전력 반도체(9, 10)는 포텐셜 분류기 스테이지(11, 12)를 통하여 제어 유닛(3)에 의해 HV 스위치(13) 및 조절 유닛(14)를 가지고 제어된다. 저장 장치(7, 8)는 전력 반도체(9, 10)의 입력측에 직접 연결되는데, 여기서 저장 장치(7, 8)는 장 세기 및 펄스의 지속 시간에 의존하는 하나 또는 다수의 커패시터로 구성될 수 있다. 전력 반도체(9)는 예를 들면 IGBT로 구성되고, 전력 반도체(10)는 MOSFET로 구성될 수 있다. 그러나, "전력 반도체" 라는 용어는, 본 발명의 범위 내에서 변환되는 전압 및 전류를 요구되는 변환 시간을 가지고 변화시킬 수 있는 모든 다른 전기적 요소들 또는 요소 어셈블리들을 포함하여야 한다. IGBT의 출력측은 큐벳 접속부(15)에 직접 연결되고, 반면에 MOSFET(10)의 출력측은 저항(16) 및 다이오드(17)를 통하여 큐벳 접속부(15)에 연결되어, 양 전력 반도체(9, 10)가 동시에 제어되는 경우 어떠한 펄스도 제2 전력 반도체(10)를 통하여 흘러 돌아오지 않게 될 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 다이오드(17)는 음극측에서 큐벳 접속부(15)에 연결된다. 제2 큐벳 접속부(18)는 저항(19)을 통하여 지면에 연결된다. 저항(19)은 전압 강하 및 스위칭 스테이지(20)로의 공급을 측정하기 위한 측정 분로(measuring shunt)를 포함한다. 과전류 스위칭 스테이지(20)는 포텐셜 분류기 스테이지(11) 및 HV 스위치(13)를 통하여 스위치(21)에 의해 펄스의 운반을 방해할 수 있는 반면에, 제2 과전류 스위칭 스테이지(22)는 스위치(23)를 통하여 MOSFET(10)을 위한 조절 유닛(14)의 제어 시스템을 방해한다. 저항(16)을 통하여 인가되는 전압은 최대 전류가 초과되는 경우 전류를 차단시키기 위해 과전류 스위칭 스테이지(22)에 공급된다. 저항(16)은 고압 회로 내에 직접적으로 위치되고, 스위치(23)는 포텐셜 분류기 스테이지(12) 뒤에 위치되어 어떠한 고압 펄스도 제어 유닛(3)으로 들어가지 못하고 작동 스태프는 위태로워지지 않는다. 과전류 스위칭 스테이지(20)의 경우에, 저-저항 측정 저항(19)은 큐벳 접속부(15,18) 뒤에 놓이고 지면에 연결되어 고압 펄스의 전달이 제거될 수 있다. 전기 천공기(1)의 의도된 이용에 의존하여, 전력 반도체(9, 10)를 제어하기 위해서, 상응하는 저장 장치(7, 8)를 갖는 하나 또는 다수의 고압 전력 공급원(5, 6)과 필수적인 포텐셜 분류 스테이지(11, 12)와 HV 스위치(13) 또는 조절 유닛(14)이 사용될 수 있다. 저장 장치(7, 8)는 요구되는 전기 용량 및 파괴 전압을 갖는 하나 또는 다수의 커패시터로 설비되어 적당히 높은 전하량이 저장되고 큐벳 접속부(15)로 전송될 수 있다.

다음 도 11 내지 도 18은 블록 다이어그램의 개별적인 요소들의 회로 다이어그램을 도시하고 있다.

도 11은 설정될 파라미터 신호들로 들어가기 위한 제어 패널의 회로 다이어그램을 도시하고 있는데, 여기서 파라미터 신호들은 푸시 버튼 스위치(30)를 통하여 미리 선택될 수 있고 디스플레이 요소(31)를 이용하여 시각적으로 체크될 수 있다. LED(32)들은 장치가 작동 준비된 때를 보여준다. 필요한 파라미터들은 회로 내에 준비되고 커넥터(33)를 통하여 도 14에 따른 제어 시스템으로 전달된다.

도 12는 카드 판독기(34)의 회로 다이어그램을 도시하고 있는데, 이를 통하여 특정 생물학적 물질들에 대해 미리 설정된 파라미터들이 판독되고 도 14에 도시된 바와 같은 제어 유닛으로 전달된다.

도 13은 공급 유닛의 회로 다이어그램을 도시하고 있는데, 이는 필요한 작업 전압을 형성하기 위해서, 대체로 150/230 볼트 변환 스위치(35), 1차측 와이어링을 갖는 변압기 스테이지(36), 전압 리드(voltage lead) 및 제2 조절 스테이지로 구성된다. 이러한 목적을 위해서, 다수의 전압 조절기(38)가 정류기(37) 뒤에 삽입된다.

도 14는 2개의 HV 전력 공급원(5, 6)의 회로 다이어그램을 도시하고 있는데, 이는 블록 다이어그램으로부터 확인될 수 있다. 양 HV 전력 공급원(5, 6)은 공급 유닛으로부터의 전압 U₁에 의해 작동되고, 여기서 각 조절 스테이지(39)는 제어 시스템으로부터의 제어신호 U3on, U5on을 받고, 인가된 전압 U₁은 변압기 스테이지(40)를 통하여 펄스로 된 모드에서 다수의 커패시터로 구성되는 저장 장치(7, 8)를 충전한다. 도달된 소정의 전압은 도 15에 도시된 바와 같은 제어 시스템의 출력신호 USsense, U5sense를 통하여 전달된다. 저장 장치(7)의 전압 U₅는 도 15에 도시된 바와 같은 HV 스위치(13)로 공급되고, 저장 장치(8)의 전압 U₃는 도 16에 도시된 바와 같은 전류 조절 스테이지로 공급된다.

도 15는 HV 스위치(13)의 회로 다이어그램을 도시하고 있다. HV 스위치(13)는 제1 전력 반도체(9)를 제어하기 위해 도 16에 도시된 바와 같은 펄스 모니터링 스테이지에 의해 형성되는 신호 HIN을 받는다. 이는 인가된 전압 U₅를 큐벳을 연결하는 HV 케이블을 위한 납땜 패드(41)로 전달하고, 큐벳은 이어서 저-저항 측정 저항을 통하여 제2 납땜 패드(42)를 통해 지면에 연결된다. 과전류 차단 스테이지(20)는 미리 설정된 최대 전류 상승이 초과되는 경우 전력 반도체(9)를 차단하기 위해 도 18에 도시된 바와 같은 제어 신호를 제어 유닛으로 운반한다. 제1 납땜 패드(41)는, 특정 양의 전하를 운반하기 위해 큐벳으로 흐르는 제어된 전류가 고압 펄스를 뒤따르게 될 수 있도록 하기 위해서, 도 12로부터의 전류 조절 스테이지의 전압 출력 U₄에 또한 연결된다. 도 16으로부터의 전류 조절 스테이지는 포텐셜 분류기 스테이지를 통하여 도 18로부터의 제어 유닛으로부터 제어 신호를 받고 저장 장치(8)에 인가된 전압 U₃를 납땜 패드(41)을 통하여 운반된 전압 U₄로 조절한다. 이 경우에, 본 발명에 따르면, Q 조절 또는 전류 조절이 사용되고 이에 따라 저장 장치(8) 내의 전하는 예를 들면 1 밀리초 동안의 미리 결정된 시간 간격으로 결정되고, 운반된 전하량은 최초 전하량을 고려하여 결정된다.

도 18은 제어 유닛(3)의 회로 다이어그램을 도시하고 있는데, 이는 미리 설정된 수동값(manual values) 또는 카드 판독기(34)를 통하여 들어간 값들을 고려하며 또 다른 모니터링 신호를 기초로 도 16에 도시된 바와 같은 전류 조절 유닛(14)을 제어한다. 그러나 도 15에 도시된 바와 같은 HV 스위치(13)는 도 17에 도시된 바와 같은 펄스 모니터링 스테이지(43)를 통하여 고압 펄스를 수동으로 시동시킨 후 제어되어 HV 펄스가 운반된 후에, 전하량이 도 16에 도시된 바와 같은 전류 조절 유닛(14)을 통해 모니터링될 수 있다.

따라서 한편으로 펄스 파라미터들은 수동으로 미리 설정될 수 있고 다른 한편으로는 카드 판독기를 통하여 설정될 수 있기 때문에 펄스가 존재하는 조절 전자 장치를 통하여 수동으로 시동되는 경우, 흐르는 전류를 모니터링하거나 모니터링 하지 않는 고압 펄스와, 필요하다면 전하량을 모니터링 하는 연속적인 전류 신호가 제2 HV 전력 공급원을 통하여 운반될 수 있다.

도 19는 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 제어 유닛(3; 도 10 참조)에 의해 제어되는 펄스 운반 과정의 작동 순서의 개략적인 흐름도를 도시하고 있다. 먼저, 요구되는 펄스 파라미터들은 수동으로 또는 메모리 카드(도시되지 않음)의 판독에 의해 미리 결정된다. 이러한 과정이 시작된 후(예를 들면, 상응하는 시동 버튼을 작동시킴에 의해), 큐벳의 오옴 저항은 큐벳 접속부(15, 18)에 낮은 전압(예를 들면 12 V)을 짧게 인가하고 단계(44)에서의 뒤따르는 전류 측정(예를 들면 2 ms 동안)에 의해 먼저 측정된다. 질문(45)으로서 이러한 저항이 미리 결정된 윈도우 내에 놓이는지 여부가 체크된다. 그렇지 않은 경우에, 뒤따르는 공정은 중단된다. 측정된 저항은 이어서 본 발명의 실시예에서 충전 전압 U₂를 계산하는 데 사용되지 않는다. 저항이 미리 결정된 윈도우 내에 놓여있는 경우에는, 저장 장치(7, 8)는 단계(46)에서 미리 결정된 U₁ 및 U₂로 충전된다. 소정의 충전 전압이 달성되는 경우에, HV 전력 공급원(5, 6)에 의한 충전은 차단된다. 다음 펄스 운반 동안에는, 저장 장치의 어떠한 재충전도 발생하지 않는다. 이어서 고압 펄스에 대한 펄스 운반은 단계(47)에서 반도체 스위치(9)를 닫음에 의해 시작된다. 결과적으로, 상대적으로 높은 전류가 세포를 통하여 흐른다. 과도하게 급격한 전류의 상승은 과전류 차단 스테이지(20)에 의해 인식되고 안전상의 이유로 스위치(9)의 즉각적인 개방으로 귀결되고 일련의 작업(routine)을 중단시킨다. 본 실시예에 있어서, 고압 펄스는 미리 결정된 수 마이크로초의 시간 후에 종결되고, 여기서 제2 펄스가 즉시 그리고 중단없이 뒤따른다. 이러한 목적을 위해서, 단계(48)에서 제2 반도체 스위치(10)는 제1 반도체 스위치(9)를 개방시키기 직전에 이미 닫혀서 2개의 펄스 간에 중단없는 전이가 존재한다. 양 고압 스위치(9, 10)가 동시에 닫히는 짧은 시간 간격에서, 다이오드(17)는 어떠한 보다 높은 전압이 저장 장치(7)로부터 저장 장치(8)로 흘러갈 수 없도록 한다. 그 다음 반도체 스위치(10)는, 미리 결정된 전하 Q가 큐벳을 통하여 흐를 때까지 개방된 채로 유지된다[최대 전류가 과전류 차단 스테이지(22)에 의해 초과되지 않는 경우]. 이러한 목적을 위해서, 단계(49)에서 큐벳을 통하여 흐르는 전류가 측정되고 미리 결정된 시간 간격(예를 들면 1 ms)에서 통합된다. 미리 결정된 전하가 도달되자마자[질문(50) 참조], 스위치(10)는 개방되고, 일련의 작업은 종결된다. 저장 장치(8)의 전기 용량은, 전압이 제2 펄스의 지속 시간 동안 점진적으로 또는 천천히 감소되도록 선택된다. 오류로 인하여, 저장 장치가 거의 완전히 방전되는 경우에도 미리 결정된 소정의 전하가 아직 도달되지 않는 경우에는, 상술한 과정들은 적합하게 선택된 시간 한계를 초과한 후에 또한 중단될 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명은 전류에 의하여 핵산, 펩티드, 단백질 및/또는 다른 생물학적 활성 분자들을 진핵 세포의 세포핵 내로 도입시키기 위한 회로 장치, 또는 전류로 세포, 세포 유도체, 세포하 입자 및/또는 소포를 처리하기 위한 회로 장치로서 이용가능하다.

Claims

전하량을 위한 2개 이상의 저장 장치(7, 8)와, 하나 이상의 제어 장치로 구성되며, 상기 저장 장치(7, 8)의 각각은 고압 전력 공급원(5, 6)에 의해 공급받고, 상기 저장 장치(7, 8)의 각각은 저장 장치(7, 8) 내에 존재하는 전하량을 큐벳 내의 현탁액으로 전달하기 위한 하나 이상의 전력 반도체(9, 10)를 구비하며, 상기 제어 장치는 전력 반도체(9, 10)를 제어하고, 제1 저장 장치(7)는 하나의 파라미터로서 소정의 전압(U₁)으로 충전되며, 제2 저장 장치(8)는 전압 U₂=R×I₂×K₂로 충전되고, 상기 R은 큐벳 및 그 내부에 포함된 현탁액의 저항이며, 상기 I₂는 요구되는 전류이고, 상기 K₂는 큐벳의 특성을 고려한 보정값이며, 상기 제어 장치는 저장 장치(7)의 커패시터 전압(U₁)을 갖는 하나 이상의 제1 펄스가 전력 반도체(9, 10)를 제어함으로써 소정의 시간(T₁) 동안 큐벳으로 전달될 수 있도록 전력 반도체(9,10)를 제어하게 구성되고, 하나 이상의 선택가능한 시간 간격에서 하나 이상의 펄스의 운반된 전하량은 모니터링 장치에 의해 측정될 수 있으며, 소정의 요구되는 전하량은 운반된 실제 전하량과 비교되고 상기 요구되는 전하량에 도달하거나 또는 초과할 때 전력 반도체(9,10)가 차단되는, 핵산, 펩티드, 단백질 및 다른 생물학적 활성 분자 중 하나 이상을 전류에 의하여 진핵 세포의 세포핵 내로 도입시키거나 전류를 세포, 세포 유도체, 세포하 입자 및 소포 중 하나 이상으로 공급하기 위한 회로 장치.
제1항에 있어서,

저장 장치(8)의 커패시터 전압(U₂)을 갖는 하나 이상의 제2 펄스가 전력 반도체(10)를 제어함으로써 큐벳으로 중단없이 또한 전달될 수 있는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

운반된 전하량은 상응하는 저장 장치(7, 8)의 최초 전하와 잔여 전하 사이의 차이로부터 결정되는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

제1 전력 반도체(9)는 10 내지 100 ㎲의 지속 시간과 2 A*cm^-2의 최소 전류 밀도를 갖는 2 내지 10 kV/cm의 펄스를 큐벳으로 전달하고, 제2 전력 반도체(10)는 2 내지 14 A*cm^-2의 전류 밀도와 100 ms의 최대 지속 시간을 갖는 펄스를 중단없이 전달하는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

운반된 전하를 결정하기 위한 시간 간격은 제1 펄스 또는 제2 펄스 또는 각각의 추가적인 펄스의 전하의 운반과 동시에 특정될 수 있는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

제2 펄스의 스위치-온 시간(T₂)은 요구되는 전하량을 측정 시간까지 운반된 실제 전하량과 비교함으로써 특정될 수 있고 상기 요구되는 전하량에 도달될 때 종결되는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

실제 전하량을 결정하기 위해서 1 msec의 측정 사이클이 제공되고, 시간(T₂) 동안 커패시터 전압은 지수적으로 감소하며, 전력 반도체(9, 19)는 특정된 전하량(Q₂)에 도달될 때 차단될 수 있는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

하나의 제1 펄스 또는 제2 펄스의 운반 후 하나 이상의 소정의 시간 간격 후에 흐르는 전류가 측정되고, 상기 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 요구되는 값 이하로 떨어질 때, 운반된 전하량을 일정하게 유지시키기 위해 펄스의 지속 시간은 재조정될 수 있는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

하나의 제1 펄스 또는 제2 펄스의 운반 후 하나 이상의 소정의 시간 간격 후에 흐르는 전류가 측정되고, 상기 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 요구되는 값 이하로 떨어질 때, 오류 메시지가 주어지는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

하나의 제1 펄스 또는 제2 펄스의 운반 후 하나 이상의 소정의 시간 간격 후에 흐르는 전류가 측정되고, 상기 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 요구되는 값 이하로 떨어질 때, 상기 요구되는 값이 재조정되는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

펄스의 미리 선택된 설정 파라미터(U₁, T₁, I₂, T₂, K₂)들은 수동으로 또는 코드의 입력에 의해 입력되는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

제1 펄스 및 제2 펄스를 위해 과전류 차단기가 제공되는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

U₂의 계산에 사용된 큐벳의 저항 R은 전력 반도체(9, 10)를 제어하기 전에 저항 측정에 의해 측정될 수 있는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

U₂의 계산에 사용된 큐벳의 저항 R은 미리 결정되는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

펄스의 미리 선택된 설정 파라미터(U₁, T₁, I₂, T₂, K₂, R)들은 메모리 카드를 통하여 판독가능한 것을 특징으로 하는 회로 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서,

큐벳에 인가된 전압 또는 큐벳을 통하여 흐르는 전류의 시간 프로파일을 측정하고 기록하기 위한 장치가 제공되고, 상기 측정된 전압 또는 전류의 시간 프로파일은 메모리 카드에 저장될 수 있는 것을 특징으로 하는 회로 장치.
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하나 이상의 전압 펄스를 세포에 공급하는 단계와, 하나 이상의 선택가능한 시간 간격에서 하나의 전압 펄스에 의해 공급된 전하량을 측정하는 단계를 포함하며, 소정의 요구되는 전하량은 공급된 실제 전하량과 비교되고 상기 요구되는 전하량에 도달하거나 또는 초과할 때 전압 펄스가 종료되는, 핵산, 펩티드, 단백질 및 다른 생물학적 활성 분자 중 하나 이상을 전류에 의하여 진핵 세포의 세포핵 내로 도입시키거나 전류를 세포, 세포 유도체, 세포하 입자 및 소포 중 하나 이상으로 공급하기 위한 방법.
제25항에 있어서,

공급된 전하량은 상응하는 저장 장치의 최초 전하와 잔여 전하 사이의 차이로부터 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항 또는 제26항에 있어서,

커패시터 전압(U₁)을 갖는 제1 펄스가 세포로 공급된 후에, 커패시터 전압(U₂)을 갖는 하나 이상의 제2 펄스가 세포로 중단없이 또한 공급되는 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서,

2 내지 10 kV/cm의 장 세기, 10 내지 100 ㎲의 지속 시간 및 2 A*cm^-2의 최소 전류 밀도를 갖는 제1 펄스가 세포에 인가된 후에, 2 내지 14 A*cm^-2의 전류 밀도 및 100 ms의 최대 지속 시간을 갖는 제2 펄스가 세포로 중단없이 또한 공급되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

공급된 전하를 결정하기 위한 시간 간격은 제1 펄스 또는 제2 펄스 또는 각각의 추가적인 펄스의 전하의 공급과 동시에 특정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서,

제2 펄스의 스위치-온 시간(T₂)은 요구되는 전하량을 측정 시간까지 공급된 실제 전하량과 비교함으로써 특정되며 상기 요구되는 전하량에 도달될 때 종료되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

실제 전하량을 결정하기 위해서 1 msec의 측정 사이클이 선택되고, 시간(T₂) 동안 커패시터 전압은 지수적으로 감소하며, 펄스는 특정된 전하량(Q₂)에 도달될 때 종료되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

하나의 제1 펄스 또는 제2 펄스의 개시 후 하나 이상의 소정의 시간 간격 후에 흐르는 전류가 측정되고, 상기 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 요구되는 값 이하로 떨어질 때, 공급된 전하량을 일정하게 유지시키기 위해 펄스의 지속 시간은 재조정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

하나의 제1 펄스 또는 제2 펄스의 개시 후 하나 이상의 소정의 시간 간격 후에 흐르는 전류가 측정되고, 상기 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 요구되는 값 이하로 떨어질 때, 오류 메시지가 주어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

하나의 제1 펄스 또는 제2 펄스의 개시 후 하나 이상의 소정의 시간 간격 후에 흐르는 전류가 측정되고, 상기 전류가 요구되는 값을 초과하거나 또는 요구되는 값 이하로 떨어질 때, 상기 요구되는 값이 재조정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

펄스의 미리 선택된 설정 파라미터(U₁, T₁, I₂, T₂, K₂)들은 수동으로 또는 코드의 입력에 의해 입력되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

제1 펄스 및 제2 펄스에 대한 과전류 차단이 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

U₂의 계산에 사용된 큐벳의 저항 R은 전력 반도체를 제어하기 전에 저항 측정에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

U₂의 계산에 사용된 큐벳의 저항 R은 미리 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서,

펄스의 미리 선택된 설정 파라미터(U₁, T₁, I₂, T₂, K₂, R)들은 메모리 카드를 통하여 판독되는 것을 특징으로 하는 방법.