DE102007005909A1

DE102007005909A1 - Verfahren zur Kontrolle eines mit Elektroden versehenen Behältnissen

Info

Publication number: DE102007005909A1
Application number: DE102007005909A
Authority: DE
Inventors: Herbert MÜLLER-HARTMANN
Original assignee: Amaxa AG
Current assignee: Lonza Cologne GmbH
Priority date: 2007-02-01
Filing date: 2007-02-01
Publication date: 2008-08-14

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle der Qualität eines mit einer Flüssigkeit befüllbaren Behältnisses, welches mindestens zwei zumindest annähernd planparallel angeordnete Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in mindestens einem Reaktionsraum des Behältnisses aufweist. Erfindungsgemäß ist dabei vorgesehen, dass der Reaktionsraum mit den Elektroden als Kondensator betrachtet wird und die Unterscheidung zwischen einem fehlerhaften und einem fehlerfreien Behältnis durch die Bestimmung der Kapazität dieses Kondensators erfolgt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kontrolle der Qualität eines mit einer Flüssigkeit befüllbaren Behältnisses, welches mindestens zwei zumindest annähernd planparallel angeordnete Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in mindestens einem Reaktionsraum des Behältnisses aufweist.
Behältnisse der eingangs genannten Art werden vor allem bei der Elektroporation oder Elektrofusion, beispielsweise in Form von Küvetten mit eingelegten Elektroden aus Metall, eingesetzt. Die für diesen Zweck verwendeten Behältnisse sind meist schmale, nach unten geschlossene und nach oben offene Gefäße, deren Innenraum aus jeweils zwei Paaren parallel und gegenüberliegend angeordneter Seitenwände gebildet wird. Der Innenraum dient dabei der Aufnahme der Zellsuspension, d. h. in der Regel einer wässrigen Pufferlösung oder eines Zellkulturmediums, in dem die zu behandelnden Zellen suspendiert sind. Für besondere Anwendungen können mehrere solcher Behältnisse auch in Form einer „multiwell"-Platte, beispielsweise einer Mikrotiterplatte mit 96 oder mehr Reaktionsräumen, miteinander zu einer Einheit verbunden sein. Zum Anlegen einer elektrischen Spannung weisen solche Behältnisse zumeist im unteren Bereich eines Paares gegenüberliegender Seitenwände ein Elektrodenpaar auf. Bei einer elektrischen Entladung fließt zwischen den beiden Elektroden ein elektrischer Strom durch die Zellsuspension, der einen Transport der Nukleinsäuren oder anderer Moleküle in die Zellen bewirkt oder je nach den gewählten Bedingungen zur Zellfusion führt. Die Elektroden können dabei aus Metall, z. B. Aluminium, Graphit oder einem leitfähigen Polymer bestehen.
Bei der Herstellung solcher Behältnissen oder einem Einzelgefäß innerhalb eines 96-well-Systems (Mikrotiterplatte) ist eine Qualitätsüberprüfung wünschenswert, die Aussagen über die Funktionalität des Reaktionsgefäßes erlaubt. Zur Qualitäts ermittlung von Reaktionsgefäßen, z. B. mit zwei Elektrodenflächen oder – bereichen, können verschiedene Methoden verwendet werden, die Aussagen über kritische Eigenschaften, wie z. B. die innere Geometrie der Elektroden oder Abweichungen hiervon, erlauben. Abweichungen in den Kontaktbereichen der Elektroden sind insbesondere kritisch, da sie die Stärke und räumliche Verteilung des elektrischen Feldes innerhalb des Reaktionsraumes beeinträchtigen können. Ferner können Sie die Gefahr von unerwünschten Blitzentladungen zwischen den Elektrodenbereichen heraufsetzen, falls z. B. der Abstand von bestimmten Bereichen der beiden Elektroden einen kritischen Wert unterschreitet. Die "klassischen" Methoden zur Qualtitätskontrolle umfassen:

1. Geometrische Messungen, z. B. mittels Messfühler oder optischem Messgerät.
2. Optische Kontrolle durch Mitarbeiter.
3. Hochspannungs-Widerstandmessung zwischen den Elektroden bei trockenem Reaktionsraum.
4. Widerstandmessung, entweder Niederspannung oder Hochspannung, bei nassem Reaktionsraum.
5. Ausführen korrekter Pulsprogramme, welche dem Verwendungsprozess selber entsprechen.

Die Methoden 1, 2, 4 und 5 wurden bereits vereinzelt eingesetzt zur Qualitätsüberprüfung von einzelnen Musterteilen. Diese Methoden lassen sich allerdings nicht in einen zuverlässigen und insbesondere Zeit sparenden Prozess implementieren, wie er z. B. bei einer 100%-igen Überprüfung von Bauteilen nötig wäre, die in einem laufenden Produktionsprozess hergestellt werden.
Aus der WO-A-2001/081533 und der WO-A-2001/080946 sowie von dem Gerät und Verfahren zu dem „Easyject"-Elektroporator der Fa. Equibio/Geneflow ist eine Messung der Impedanz (scheinbarer Wechselstromwiderstand) vor Durchführung der Elektroporation bekannt. Diese wird mit gefülltem Reaktionsgefäß durchgeführt, um insbesondere den Füllstand zu überprüfen, wobei ein Abbruch des Ver suchs möglich ist, wenn die Impedanz außerhalb von gegebenen Grenzen liegt, und die Startspannung oder die Anzahl der Impulsentladungen der elektrischen Impulsentladung entsprechend der gemessenen Impedanz anzupassen.
Die WO-A-2001/081532 beschreibt den Einsatz einer Impedanzmessung im Wechselfeld während des Vorgangs der Elektropermeabilisierung von Zellen, um dessen Amplitude zu variieren.
Die WO-A-2002/086129 , WO-A-2002/000871 und WO-A-2003/050546 beschrieben Schaltungsaufbauten und Verfahren zur Transfektion mittels elektrischem Strom, wobei eine Widerstandsmessung mittels Gleichspannung vor der Transfektion durchgeführt wird. Diese dient im Falle der WO-A-2002/000871 der Überprüfung des Füllstandes und von etwaigen Kurzschlüssen im gefüllten Zustand und unmittelbar vor Verwendung. Bei der WO-A-2003/050546 dient diese der automatischen Wahl von Impulseinstellungen, wie z. B. der für die Entladung benutzten Kapazitäten. Diese Methode lässt sich daher ebenfalls nicht von dem Vorgang der Verwendung selber trennen.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Kontrolle der Qualität von Behältnissen für die Elektroporation bereitzustellen, das unabhängig von der Verwendung des Behältnisses in ungefülltem Zustand durchgeführt werden kann.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, bei dem der Reaktionsraum mit den Elektroden als Kondensator betrachtet wird und die Unterscheidung zwischen einem fehlerhaften und einem fehlerfreien Behältnis durch die Bestimmung der Kapazität dieses Kondensators erfolgt. Im Grunde stellt die Einheit aus sich planparallel gegenüberstehenden Elektroden in einem Reaktionsraum einen elektrischen Kondensator dar, die sich in einem Verfahren zur Bestimmung der Kapazität dieses Kondensators messen lässt. Verformungen der Elektrodeninnenseite der Reaktionsgefäße haben entsprechend Einfluss auf die Messgröße der Kapazität, nach: C ≈ A/d, wobei C die Kapazität eines Plattenkondensators ist, A die Fläche der Platten und d der Abstand der Platten. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Qualität von mit Elektroden versehenen Behältnissen unabhängig von der Verwendung der Behältnisse in ungefülltem Zustand kontrolliert werden, da Fehler in oder an den Elektroden als Änderung der Kapazität auf einfache und kostengünstige Weise detektiert werden können. Das Verfahren ist dabei „nicht-invasiv", so dass die getesteten Behältnisse nach der Kontrolle noch verwendet werden können und somit eine vollständige Kontrolle anstelle einer stichprobenartigen Prüfung ermöglicht wird.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die Bestimmung der Kapazität durchgeführt wird, während der Reaktionsraum trocken ist.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die Kapazität durch die Auswertung von U/I-Profilen bei Lade-/Entladeprozessen bestimmt wird.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die Kapazität unter Verwendung bzw. als Bestandteil eines Schwingkreises bestimmt wird. Dabei kann eine Änderung der Kapazität mittels einer Verstimmung des Schwingkreises detektiert werden, wobei vorzugsweise die Verstimmung des Schwingkreises unter Anlegen eines Wechselfeldes durch das Zählen der Schwingungsdurchgänge, beispielsweise mittels eines Torzählers, ermittelt wird.
Erfindungsgemäß ist die Verwendung von Schwingkreisen oder einfache Lade-/Entladeprozesse (U/I-Profile bzw. U/I-Steigung) geeignet, um eine Kapazität zu messen. Die Integration in einen Schwingkreis (s. u.) stellt ein genaues, gebräuchliches Verfahren zur Bestimmung von C dar, das seit vielen Jahrzehnten z. B. bei der Qualitätsüberprüfung von elektrischen Kondensatoren Verwendung findet. Der hier beschriebene Einsatz zur Überprüfung von trockenen Reaktionsräumen stellt eine neue Möglichkeit dar, die Verwendbarkeit solcher Reaktionsräume losgelöst von der zweckmäßigen Verwendung zu überprüfen. Prinzipiell lässt sich diese Methode für die Überprüfung aller Reaktionsräume, Kammern oder Aufbauten mit mindestens zwei Elektroden in Plattenkondensator – ähnlicher Ausformung einsetzen.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass Elektroden aus Metall, Graphit und/oder einem leitfähigen Polymer verwendet werden. Insbesondere können Polymerelektroden verwendet werden, auf die Kontaktflächen aufgebracht wurden, beispielsweise in Form einer heißgeprägten Folie. In einem solchen Fall können durch die Bestimmung der Kapazität in besonders vorteilhafter Weise fehlerhafte Behältnisse ohne Folie auf mindestens einer Elektrode und/oder mit unzureichend aufgebrachter Folie auf mindestens einer Elektrode detektiert werden.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass durch die Bestimmung der Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden, bei denen mindestens eine Elektrode Deformationen und/oder überstehende oder zurücktretende Bereiche aufweist.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass durch die Bestimmung der Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden, bei denen mindestens eine Elektrode fehlerhaft ausgerichtet ist.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass durch die Bestimmung der Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden, bei denen mindestens zwei Elektroden gegeneinander abgewinkelt sind. Solche Fehler können insbesondere bei Metallelektroden auftreten, die in vorgefertigte Behältnisse eingesetzt werden.
In vorteilhafter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner vorgesehen, dass die Unterscheidung zwischen einem fehlerhaften und einem fehlerfreien Behältnis unabhängig bzw. losgelöst von der eigentlichen Verwendung des Behältnisses erfolgt.
Als Fehler bei mit Elektroden versehenen Behältnissen können also mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens beispielsweise erkannt werden:

a) fehlende Kontaktierung (z. B. durch fehlendes Heißprägefolienstück an einer Elektrode),
b) über die normale Fläche überstehende Folienreste,
c) ausgebeulte Elektrodeninnenseiten durch überzähliges leitfähiges Material,
d) ausgepresstes leitfähiges Elektrodenmaterial am Elektrodenspalt oder an der Außenseite des Reaktionsbehältnisses, z. B. verursacht durch das Heißprägen.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat unter anderem die folgenden Vorteile:

a) Das Verfahren wird trocken durchgeführt, d. h. es muss keine Flüssigkeit in das Behältnis bzw. den Reaktionsraum eingefüllt werden, so dass kein Waschen nötig ist, Kontaminationen vermieden werden, das Handling verbessert wird und Varianzen im Versuch vermindert werden;
b) Es kann auf hochstromige Pulsentladungen verzichtet werden, so dass die elektrischen Eigenschaften des Behältnisses und/oder die Oberflächen der Elektroden durch die Kontrolle nicht verändert werden;
c) Auch optisch schwer erkennbare Fehler im Inneren des Behältnisses bzw. Reaktionsraums können detektiert werden, so dass aufwendige geometrische Messungen vermieden werden können;

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Abbildungen und der folgenden Versuche beispielhaft näher erläutert. Es zeigt
1 schematische Darstellungen eines Kondensators und eines Querschnitts durch einen Reaktionsraum eines mit Elektroden versehenen Behältnisses,
2 eine schematische Darstellung eines Messaufbaus zur Erkennung eines mit Elektroden versehenen Behältnisses („Reaktionswell"),
3 eine schematische Darstellung einzelner Varianten von Reaktionsräumen („wells") eines mit Elektroden versehenen Behältnisses und
4 eine schematische Darstellung eines Schwingkreises zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
1 zeigt, dass eine Einheit aus sich planparallel gegenüberstehenden Elektroden in einem Reaktionsraum eines Behältnisses praktisch einen elektrischen Kondensator darstellt, so dass sich die Kapazität dieses Kondensators messen lässt. Verformungen der Elektrodeninnenseite der Behältnisse haben entsprechend Einfluss auf die Messgröße der Kapazität, nach: C ≈ A/d, wobei C die Kapazität eines Plattenkondensators ist, A die Fläche der Platten und d der Abstand der Platten.
1. Versuch zur Erkennung des Behältnisses (analog):
In dem Messaufbau gemäß 2 wurden unter Anlegen eines Wechselfeldes Verschiebeströme gemessen und folgende Messergebnisse erhalten:

Eingesetzte Wells/Kondensatoren Gemessene Verschiebeströme

1: Well 1, 2: Well 2 860–870 mV

1: Well 1, 2: 1 pF Kondensator 880–890 mV

1: Wellt, 2: leer 970–980 mV
Folglich ergibt sich durch Einsetzen eines Reaktionswells an Position 2 ein Spannungshub von ca. 100 mV gegenüber der leeren Position. An "Prüfposition" 2 verhält sich das Reaktionswell wie ein Kondensator (entspricht ungefähr 0,8 pF). Damit lässt sich ein Reaktionswell als Kondensator betrachten.
2. Versuch zur Erkennung fehlerhafter, trockener Behältnisse:

Unter Verwendung eines klassischen Schwingkreisaufbaus sollte nun ermittelt werden, ob zwischen den Kapazitäten von fehlerfreien und fehlerbehafteten Behältnissen gemäß 3 unterschieden werden kann. In dem Messaufbau gemäß 4 wurden unter Anlegen eines Wechselfeldes Frequenzzählungen mit Hilfe eines Torzählers durchgeführt. Die Anzahl gezählter Schwingungsdurchgänge pro Zeiteinheit, also eine Verstimmung des Schwingkreises durch die geänderte Kapazität, wurde dabei gemessen. Somit ist der Messaufbau geeignet, Änderungen der Kapazitäten zu detektieren. Unter Verwendung von reellen fehlerfreien und fehlerhaften Mustern von mit Elektroden versehenen Behältnissen sowie eines konstanten Kondensators von 1 F als Referenz wurden folgende Messergebnisse erhalten:

Reaktionswellmuster	Versuch	Frequenzzählungen, mit Ref.-Kap. (1 pF)	Frequenzzählungen, mit Reaktionswell
Fehlerfreies Muster	1	152	109
Fehlerfreies Muster	2	151	104
Muster mit Fehler 7 gemäß Figur 3	1	151	149
	2	149	145
	3	151	147
	4	150	146
	5	150	149
Muster mit Fehler 2 gemäß Figur 3		150	105
Keine Kontaktierung		150	180

Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl Muster mit fehlerhafter Ausprägung 7 nach 3 als auch keine erfolgreiche Kontaktierung (z. B. Ausprägung 3 nach 3) eindeutig mit dem Messaufbau erkannt werden können (durch Frequenzverstimmungen, die durch Änderung der gezählten Schwingungsdurchgänge erkannt werden können). Muster mit fehlerhaftem Aufdruck einer Folie nach 2 in 3 konnten allerdings nicht erkannt werden. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass zwar der Abstand d der Kapazität des Reaktionswells bei diesen partiellen Folienbrücken stark vermindert ist, aber der Flächenanteil an der Gesamtfläche der Elektroden nur äußerst gering ist.
Dieser Aufbau kann beispielsweise auch als Grundlage für einen produktionsbegleitenden Tester verwendet werden, um Einzelteile von Aufbauten mit Reaktionsräumen, z. B. mit mindestens zwei Elektrodenflächen oder -bereichen, wie sie z. B. in zu mehreren Reaktionsräumen zusammengefassten Bauteilen im Mikrotiterplattenformat oder auch bei Einzelküvetten vorkommen, mit den in genannten Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens einer nicht-invasiven Qualitätsüberprüfung zu unterziehen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- WO 2001/081533 A [0005]
- WO 2001/080946 A [0005]
- WO 2001/081532 A [0006]
- WO 2002/086129 A [0007]
- WO 2002/000871 A [0007, 0007]
- WO 2003/050546 A [0007, 0007]

Claims

Verfahren zur Kontrolle der Qualität eines mit einer Flüssigkeit befüllbaren Behältnisses, welches mindestens zwei zumindest annähernd planparallel angeordnete Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in mindestens einem Reaktionsraum des Behältnisses aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsraum mit den Elektroden als Kondensator betrachtet wird und die Unterscheidung zwischen einem fehlerhaften und einem fehlerfreien Behältnis durch die Bestimmung der Kapazität dieses Kondensators erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der Kapazität durchgeführt wird, während der Reaktionsraum trocken ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapazität durch die Auswertung von U/I-Profilen bei Lade-/Entladeprozessen bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapazität unter Verwendung eines Schwingkreises bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine Änderung der Kapazität mittels einer Verstimmung des Schwingkreises detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verstimmung des Schwingkreises unter Anlegen eines Wechselfeldes durch das Zählen der Schwingungsdurchgänge, vorzugsweise mittels eines Torzählers, ermittelt wird.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Elektroden aus Metall, Graphit und/oder einem leitfähigen Polymer verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass auf die Polymerelektroden Kontaktflächen aufgebracht wurden.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktflächen in Form einer heißgeprägten Folie aufgebracht wurden.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Bestimmung der Kapazität fehlerhafte Behältnisse ohne Folie auf mindestens einer Elektrode und/oder mit unzureichend aufgebrachter Folie auf mindestens einer Elektrode detektiert werden.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Bestimmung der Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden, bei denen mindestens eine Elektrode Deformationen und/oder überstehende oder zurücktretende Bereiche aufweist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Bestimmung der Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden, bei denen mindestens eine Elektrode fehlerhaft ausgerichtet ist.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Bestimmung der Kapazität fehlerhafte Behältnisse detektiert werden, bei denen mindestens zwei Elektroden gegeneinander abgewinkelt sind.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterscheidung zwischen einem fehlerhaften und einem fehlerfreien Behältnis unabhängig von der eigentlichen Verwendung des Behältnisses erfolgt.