JPS598779B2 - 抗体、抗原または抗体：抗原複合体の分析法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗体、抗原ならびに抗体：抗原複合体の存在、
その量および（または）性質を定めるために、尿や血清
のような生物学的液体の分析法に関するものである。

（簡単のために以後Ａｂ、ＡｇおよびＡｂ：Ａｇという
記号をそれぞれ抗体、抗原および抗体：抗原複合体の意
味に使う。

）よく知られているように生物学的液体のＡｂ、Ａｇお
よびＡｂ：Ａｇ複合体の分析ができることは重要である
。

例えば多くの病気はこのＡｂ：Ａｇ複合体が循環系に存
在することによづて特徴づけられている。Ａｇはバクテ
リアまたはビールスの存在によるたん白質あるいは人体
組織またはガン細胞から放出されたたん白質を含む多種
類のたん白質のどれかである。Ａｂは、もちろん特定の
Ａｇに対して特異性をもつものであり、そしてそれはり
んば系によつて合成されるＩｇＧ類の免疫グ七プリンが
大部分である。血液中のＡｂ：Ａｇ複合体を検出し、分
離しそしてその特性づけをすることは価値ある情報を提
供し、そして例えば病気の診断に使われる。Ａｇ、、Ａ
ｂおよびＡｂ：Ａｇ複合体の検出ならびに定量そし、て
特にＡｇの性質と量を決定するための公知の技術は数多
くある。

これらの定量技術は「免疫検定（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ）法」と呼ばれている。自然に生成する物質であるリ
ウマトイド因子（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄｆａｃｔｏｒ）
ＲＦは、Ａｂ：Ａｇ複合体とは結合する性質をもつてい
るが遊離のＡｇまたは遊離のＡｂと結合する性質はもた
ないということがある時代に知られた。

この性質をＡｂ■。Ａｇ複合体の検出（しかしこれは定
量法または絶体量の決定ではない）にある特殊な方法で
使うという提案（Ａｇｎｅｌｌｏ等、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅ
ｄ、、１３４、２２８、１９７１）がかつてあつたが、
Ａｂ、、ＡｇおよびＡｂ：Ａｇ複合体の分析にＲＦが有
力、有用な試薬であることは未だかつて実現されてはい
ない。本発明者は、溶解した形にあるＲＦはＡｂ，．Ａ
ｇおよび（または）Ａｂ：Ａｇ複合体を含む分析法にお
いて実際適用範囲の広い試薬となることおよびそれを使
うと例えば免疫検定手法を簡易にし、そしてより精確に
することを見出した。

ＲＦは公知の物質であり、それの製法や分離法も知られ
ている。

それは人間も含めた多くの動物種属の血液中に存在し、
あるいは現われるようにすることができる。ＲＦは標準
的にはやぎや兎の精製した免疫グロブリンを約６３℃に
１０分間加熱することによつてあらかじめ集塊としたも
のをそれらに皮下注射することによつて得られる。次い
でこれらの動物から得た血清からＲＦが分離される。そ
れには集められて塊となつた免疫グロブリンのカラムを
通すとカラム上にＲＦが保持されのである。このＲＦは
次に適当な阻または塩濃度をもつた溶液を溶離剤として
溶離することができる。
ニ本発明は、体液試料に、ＲＦの
溶液を加えて、体液中に存在するＡｂ：Ａｇ複合体と結
合させることを含む、Ａｂ，．ＡｇまたはＡｂ：Ａｇ複
合体に関して体．液試料を分析する方法に関する。すな
わち本発明は生体体液試料中に存在する抗 二体または
抗原または抗体：抗原複合体を定量分析するにあたり、
抗体または抗原とは結合せず抗体：抗原複合体には結合
する性質をもつリウマトイド因子（ＲＦ）の溶液を試料
に加えることにより、試料中に存在する抗体または抗原
から誘導されたまたは試料中に存在する抗体：抗原複合
体を凝集させ、この凝集量に直接にまたは間接に基づい
て試料中に存在する抗体または抗原または抗体：抗原複
合体の量を定める、定量分析法を提供する。本発明方法
の具体的実施態様を述べれば次のとおりである。本発明
は、広い意味で、他の試薬を加える前または後に、体液
試料に、ＲＦまたはＣｌｑの溶液を加えて、体液中に存
在するＡｂ：Ａｇ複合体と結合させることから成る、Ａ
ｂ．ＡｇまたはＡｂ：Ａｇ複合体に関して体液試料を分
析する方法を提供する。

本発明方法を行うには多くの方法があり、好ましい方法
は次のとおりである。

１）（イ）試料に、ＡｇまたはＡｂ（試料中のＡｂまた
はＡｇのそれぞれ特異的であり、Ａｂ：Ａｇ複合体を形
成する）の過剰量を加え、（ロ）前記工程（イ）で作つ
た混合物に、ＲＦの溶液を既知量（混合物中に存在する
すべてのＡｂ：Ａｇ複合体と結合するのに必要な量より
も過剰な量］｝加え、形成するＲＦ／Ａｂ：Ａｇを混合
物中で凝集させ、（ハ）前記混合物から、凝集したＲＦ
／Ａｂ：Ａｇを分離し、そして（ニ）工程（ハ）を行つ
た後に混合物中にのこつているＲＦの量を測定するか、
または工程（ハ）において混合物から分離されたＲＦの
量を測定して、次に最初の試料中に存在しているＡｂま
たはＡｇの量を求めることから成る、体液試料中のＡｂ
またはＡｇを検定する方法。

ここで、工程（ニ）は次のようにするのが好ましい。

（１）工程（ハ）の後に残つている混合物に、Ａｂｌ：
Ａｇ′複合体の既知量（混合物中のすべてのＲＦまたは
Ｃｌｑと結合するのに必要な量より過剰な量）を加え、
ここでＡｂ′：Ａｇ′複合体は、同定標識をもつており
、（１１） ＲＦと結合せずに混合物中に遊離している
Ａｂ′：Ａｇ／の量を測定する。

この工程において、同定標識は酵素または補酵素（その
活性は、Ａｂ′：Ａｇ′複合体とＲＦとの結合により阻
害される）であり、そして遊離のＡｂ／：Ａｇ′の量は
、ＲＦ／Ａｂ′：Ａｇ′またはＣｌｑ／Ａｂ′：Ａｇ′
が残つていなくても混合物の酵素または補酵素活性を測
定することにより決定される。

）．）（イ）試料に、ＲＦの溶液の既知量（試料中のす
べてのＡｂ：Ａｇ複合体と結合してＲＦ／Ａｂ：Ａｇま
たはＣｌｑ／Ａｂ：Ａｇを形成するのに必要な量よりも
過剰な量）を加え、前記ＲＦ／Ａｂ：ＡｇまたはＣｌｑ
／Ａｂ：Ａｇを混合物中で凝集させ、（ロ）混合物から
、凝集したＲＦ／Ａｂ：ＡｇまたはＣｌｑ／Ａｂ：Ａｇ
を分離し、（ハ）工程（口）の後に混合物中に残つてい
るＲＦの量を測定するか、または工程（ロ）中に混合物
から分離されたＲＦの量を測定し、そして最初の試料中
に存在するＡｂ：Ａｇの量を求めることから成る体液試
料中のＡｂ：Ａｇ複合体を検定する方法。

（３）（イ）試料に、Ａｇ′またはＡｂ′（試料中のＡ
ｂまたはＡｇのそれぞれに特異的であり、Ａｂ：Ａｇｌ
複合体またはＡｂ′：Ａｇ複合体を形成し、同定標識を
もつ）の過剰量を加え、（ロ）工程（イ）で形成した混
合物に、ＲＦ溶液を少なくとも混合物中のすべてのＡｂ
：Ａｇ′またはＡｂ′：Ａｇ複合体と結合するのに十分
な量で加え、（ハ）混合物中に遊離しているかまたはＲ
Ｆと結合しているＡｂ′またはＡｇ′の量を測定し、そ
して最初の試料中に存在するＡｂまたはＡｇの量を求め
ることから成る体液試料中のＡｂまたはＡｇを検定する
方法。

（４）（イ）試料に、Ａｂｌ：Ａｇ複合体（同定標識を
もつている）の既知量と、ＲＦ溶液の、混合物中のＡｂ
：ＡｇおよびＡｂ′：Ａｇ′複合体の総量と結合するの
に不十分な量とを加え、（ロ）混合物中の遊離のＡｂ′
：Ａｇ′の量を測定するか、またはＲＦと結合したＡｂ
′：Ａｇ′の量を測定し、次に最初の試料中に存在する
Ａｂ：Ａｇの量を求めることから成る体液試料中のＡｂ
：Ａｇ複合体を検定する方法。

（５）（イ）試料に、ＡｇまたはＡｂ（試料中のＡｂま
たはＡｇにそれぞれ特異的である）を加えて、Ａｂ：Ａ
ｇ複合体を形成させ、（ロ）工程（イ）の混合物に、Ａ
ｂまたはＡｇの既知量（その中に同定標識を含んでいる
）を加え、（ハ）工程（口）で作つた混合物に、ＲＦの
溶液を混合物中のすべてのＡｂ：Ａｇ複合体と結合する
のに少なくとも十分な量加え、（ニ）混合物中に遊離し
て残つているかまたはＲＦと結合している、標識された
ＡｂまたはＡｇの量を測定することから成る体液試料中
のＡｂまたはＡｇを検定する方法。

（６）試料に、ＲＦの溶液とＲＦと結合して凝集を起こ
す物質とを加えて、物質の凝集が起つているかどうかを
検出することから成る、体液試料中にＡｂ：Ａｇ複合体
の存在または不在を確認する方法。

（７）試料に、ＡｇまたはＡｂ（特定のＡｂまたはＡｇ
に特異的でありその存在は確認できる）を加え、存在す
る前記の特定のＡｂまたはＡｇの任意のものと一緒にＡ
ｂ：Ａｇ複合体を形成させ、そして前記（６）の方法に
よつて前記複合体の存在または不在を確認することから
成る体液試料中の特定ＡｂまたはＡｇの存在を検出する
方法。

（８）イ）試料に、酵素標識をもつているＡｂ．Ａｇま
たはＡｂ：Ａｇ複合体を加え、（ロ） ＲＦ溶液を加え
て、存在する任意のＡｂ：Ａｇ複合体と結合させ、そし
て（ハ）試料を検定するために、任意の標識されＲＦと
結合しているＡｂ：Ａｇ複合体の酵素活性に対するＲＦ
の阻害作用を利用することから成るＡｂ．Ａ４ｇまたは
Ａｂ：Ａｇ複合体のための体液試料の免疫検定法。

前記方法を行う際の一般的操作は、当該技術分野におい
ては公知であるので、詳細な記載は不必要であろう。

Ａｂ．ＡｇおよびＡｂ：Ａｇ複合体を分析するための本
発明方法（例えば前記方法（１）〜（５）および（８）
）において、ＲＦ溶液を使う。

ＲＦはＡｂ：Ａｇ複合体と結合するが、遊離Ａｂおよび
遊離Ａｇとは結合しない。こうしてＲＦはＡｂ：Ａｇ複
合体を効果的に分離するかまたは結合して、ＲＦ／Ａｇ
：Ａｂを形成する。ＲＦ／Ａｇ：ＡｂまたはＣｌｑ／Ａ
ｇ：Ａｂが形成された場合に、それらは凝集する傾向が
あり、そして凝集が起つた時に例えば遠心分離またはろ
過することによつてそれらを除去して透明な溶液を取る
ことができるということがわかつた。

この溶液はＲＦを過剰量または不足量使つたかによつて
次のいずれかを含んでいる。（ａ） ＲＦＯＡｂ：Ａｇ
複合体は不在。

（ｂ） Ａｂ：Ａｇ複合体。

ＲＦは不在。前記ＲＦ／Ａｂ：Ａｇを有効に除去できる
場合には、溶液中に残つているかまたは溶液から除去さ
れたＲＦ，．Ａｂ：Ａｇの量を測定するだけでよいので
、定量検定を容易に行うことができる。

（除去されたＲＦ／Ａｇ：Ａｂを緩衝液で処理して、Ｒ
ＦからＡｂ：Ａｇを遊離させることができる。）この方
法は、同定標識例えば放射性元素、または酵素もしくは
補酵素、またはけい光性基をもつ物質を使つて行うと最
も都合がよい。前記標識をＡｂ，．ＡｇおよびＡｂ：Ａ
ｇ複合体に使うのは公知であるけれども、標識ＲＦは、
現在まで知られていない。したがつて、他の点から見る
と、本発明の対象には、同定標識をもつている、ＲＦの
溶液をも含む。Ａｂ：Ａｇ複合体が（ＡｂまたはＡｇ上
に）酵素標識（この酵素は、非常に高分子量の基質をも
ち、例えばアミラーゼはその基質はでんぷんである）を
もつている場合に、前記複合体とＲＦが結合すると、酵
素活性が阻害されることがわかつた。

前記酵素標識は、マイルとバールによるネイチヤ一、第
２１９巻１８６頁（１９６８年）に記載のようにして、
ＡｂまたはＡｇのいずれかと結合していると思われる。
前記阻害反応が起こると、混合物全体にわたる酵素活性
は、ＲＦに結合していない標識されたＡｂまたはＡｇに
のみ左右されるので、試料混合物からＲＦ／Ａｂ：Ａｇ
を除去するという検定操作は不必要になる。このことが
、酵素を標識することを含む免疫検定において、ＲＦを
使うことによる非常に有利な点である。従来、酵素活性
を測定する前に、Ａｂ：Ａｇ複合体を試料混合物から除
去することが必要であつた。ＲＦを適当な酵素で標識し
たＡｂまたはＡｇ系と一緒に使うと、Ａｂ：Ａｇ複合体
を除去する必要はなくなる。このような処理工程の単純
化は、連続流れ分析法においては非常に役立つ。ＲＦの
溶液は、すべての型の免疫検定において有用である。

例えば、前記溶液は、すべてのＡｂまたはＡｇをＡｂ：
Ａｇ複合体に変えることから成るＡｂまたはＡｇの検定
に使うことができ、また競争結合検定に使うことができ
る。競争結合検定は、次のような方法である。試料中の
すべてのＡｂ：Ａｇ複合体および標識されているＡｂ：
Ａｇ複合体と結合させるには不十分な量のＲＦを試料混
合物中に加える。次にＲＦと結合したかまたは結合せず
に残つている標識されている複合体の量を測して、最初
の検体中のＡｂ，．ＡｇまたはＡｂ：Ａｇの量を測定す
ることができる。競争結合検定のもう１つの方法は、（
例えば）標識Ａｇおよび無標識Ａｇとの間に、限定量の
Ａｂに対して競争させ、そして形成した複合体、ＲＦお
よびＣｌｑを結合させ、未結合Ａｇから結合Ａｇを分離
させる。ＲＦ溶液は、体液試料の連続流れ分析に特に有
用であり、そしてその用途は本発明方法に含まれる。前
記方法の任意のものを、具体的記載によつてさらに詳細
に説明する。

競争結合検定 ここでは、２種のＡｂ：Ａｇ複合体間のＲＦの限定量に
対する競争を含む。

例えば、標識されているＡｂ：Ａｇ複合体の過剰量を、
ＲＦの限定量に加えた場合には、すべてのＲＦは複合体
と結合する。標識されている複合体の他に、標識されて
いないＡｂ：Ａｇ複合体を含んでいる血清試料を加えた
場合には、標識複合体と無標識複合体とが、ＲＦの限定
量に対しモル単位で競争する。平衡に達した後に、ＲＦ
をそれと結合している複合体と一緒に除去すると、残つ
ている溶液中の標識複合体の存在（または特に最小限度
の量の存在）は、血清試料がＡｂ：Ａｇ複合体を含んで
いたことを示す。この方法は、血清試料中の複合体の量
を測定するために定量的に行うことができ、そして特定
のＡｇまたはＡｂの存在を確認することによるＡｇまた
はＡｂの存在を決定するために使うことができ、また一
方、特異的なＡｇまたはＡｂを加えた後のＡｂ：Ａｇ複
合体の存在を決定するために使うことができる。前記方
法において、ＲＦと結合したＡｂ：Ａｇを、不溶性であ
るかまたは選択的に除去可能な場合には、溶液から除去
してもよい。

一方、例えば酵素標識を含みそしてＲＦとの結合によつ
て酵素活性が阻害される場合には、結合しているＡｂ：
Ａｇを除去する必要はない。抗原（Ａｇ）の検出と検定 抗原例えばモルヒネは次のようにして検出および検定す
ることができる。

モルヒネを酵素例えばアミラーゼで標識する。特異的抗
一モルヒネ抗体、Ａｂ５を作る。モルヒネについて試験
する、例えば血清または尿試料をＡｂ′と混ぜ合せる。
存在する任意のモルヒネはＡｂ′と複合体を作る。次に
酵素で標識したモルヒネを加える。この標識モルヒネは
、血清または尿中のモルヒネ濃度に準じてＡｂ′と複合
体になることができる。次にＲＦの溶液を加える。ＲＦ
は、Ａｂ５と血清中のモルヒネ（もしあれば）と標識モ
ルヒネとで形成された複合体と結合し、凝集体を形成す
る。

こうして、結合したＡｂ５：標識モルヒネ複合体はその
酵素活性を失い、そして溶液中の遊離の標識モルヒネの
酵素活性を測定することだけが必要になる。所望により
、凝集しているＲＦ／Ａｂ５：モルヒネ複合体を溶液か
ら除去することができるが、この操作は必要ではない。

これと同様な方法は、他の抗原に対して使えるし、また
必要な変更を加えて抗体に対して使つてもよい。ＲＦが
Ａｂ：Ａｇ複合体（ＡｂまたはＡｇは任意の酵素で標識
されている）に結合し、凝集が起つて酵素活性が阻害さ
れる結果を得るようなＲＦ溶液の用途において、前記方
法は非常に有用である。

一般的免疫検定法 液状試料中に存在するＡｂ．ＡｇまたはＡｂ：Ａｇ複合
体の量を測定することはしばしば望まれることであり、
そしてその測定法には公知の方法（免疫検定法）がある
。

ＲＦを免疫検定法に使うと方法が全体にわたつて簡単に
なるかまたはより確実で正確な結果が得られて有利であ
ることがわかつた。以下にＲＦ溶液を使う１つの一般例
を記載するが、ＲＦは、当業者なら明らかなように他の
免疫検定法にも有利に使うことができる。

抗原Ａｇを検定するための典型的な公知の放射免疫分析
法において、例えば、Ａｇ溶液に、同じＡｇ（しかし放
射性に標識されている、Ａｇ米）の既知量を加える。

そしてＡｇ（およびＡｇ米）に特異的な抗体すなわちＡ
ｂの特定量を加える。複合体Ａｂ：・Ａｇ（５Ａｂ：Ａ
ｇ米が形成し、これらを、Ａｇ（！１．Ａｇ米を含んで
いる液体を残して分離する。分離した複合体中または液
体中のＡｇ米の量を測定することができ、それから最初
の試料中のＡｇの量を求めることができる。前記公知方
法は効果的であるけれども、測定しようとするそれぞれ
の特定Ａｇ（またはＡｂ）に対して、放射性に標識した
Ａｇ米（またはＡｂ米）を作らなければならないので、
非常にめんどうである。

ＲＦ溶液を使うことにより、この欠点をなくすることが
できる。

例えば、試料（測定すべきＡｇを含んでいる）に、それ
に特異的な抗体Ａｂの過剰量をまず加える。Ａｂ：Ａｇ
複合体が形成する。次にＲＦ溶液の特定量（すべてのＡ
ｂ：Ａｇ複合体と結合するのに必要な量より過剰な量）
を加える。形成するＲＦ／Ａｂ：Ａｇは凝集し除去する
ことができる。こうして溶液中に過剰のＲＦ（すなわち
、最初の添加量からＡｂ：Ａｇ複合体と結合した量を減
じた量）が残る。過剰に残つているＲＦを次に測定する
ことができ、こうして最初の試料中のＡｇの量を求める
ことができる。標識ＲＦを使うか、または過剰のＲＦに
標識Ａｇ′：Ａｂ複合体〔カタラーゼ（抗原）と抗カタ
ラーゼ血清とから作る〕の既知かつ過剰な量を加えるこ
とによつて、過剰のＲＦを測定することができる。

溶液中のＲＦは標識複合体Ａｇ′：Ａｂに結合し、そし
て場合により複合体の除去後に溶液の酵素活性を測定す
ることにより、前記ＲＦの量を求めることができる。複
合体の除去は必ずしも必要ではない。というのは、酵素
カタラーゼはＡｂに大いに関係があり、Ａｂ：Ａｇ複合
体の形成によりその活性は損失をうけず、複合体がＲＦ
と結合して凝集が起つた時にその活性は失われるからで
ある。ＲＦを使う前記方法において、特異的抗体Ａｂ以
外のすべての試薬例えばＲＦおよび標識Ａｂ′：Ａｇｒ
合体は標準的なものであるということに価値を認めらえ
る。

これらの試薬は、任意のＡｇ（または必要な変更を加え
たもの）、Ａｂ、またはその複合体を定量分析するため
に使うことができる。（その複合体を分析する場合には
、抗体Ａｂを加えるという前記の第１段階は略する。）
特性指摘ＲＦ溶液を使うことを含む前記方法の多くは、
Ａｂ，．ＡｇまたはＡｂ：Ａｇ複合体の特性指摘におい
て有用な予備試験である。

ある方法では直接に、特定のＡｂまたはＡｇの同定をす
ることができ、例えば、特定のＡｂの存在が考えられる
場合に、特異的なＡｇを加えてＡｂ：Ａｇ複合体の存在
を検出することによつて確認するという方法である。Ｒ
Ｆは、前記からも明らかなように、Ａｂ．ＡｇおよびＡ
ｂ：Ａｇ複合体の特性指摘における非常に有用な試薬で
ある。

抗原の同定（すなわち特性指摘）は、一般に種種の方法
例えば、核酸の存在を確認するための分光測光、ウイル
スを同定するための電子顕微鏡、ウイルスまたは組織抗
原に対する特異的抗血清を使う免疫一けい光法によつて
行われている。

目的にあわせて、ＲＦ（可溶性または不溶化した形で）
を標識するのが都合がよい。例えば１１２５またはけい
光物質または補酵素（例えばＮＡＤＨ）で標識すること
によつて行うことができる。ＲＦの溶液は、Ａｂ：Ａｇ
複合体だけでなくまた凝集している免疫グロブリンとも
結合する。

もちろんこの事実は、前記方法を行う際に、当業者なら
明らかなように、心に留めておかねばならないことであ
る。凝集した免疫グロブリンは、例えば放射性ヨウ素ま
たはけい光で標識することができ、また例えば前記の分
析的方法において標識Ａｂ：Ａｇ複合体の代わりに、例
えば分析法において標識Ａｂ′：Ａｇ′複合体の代わり
に使うことができる。凝集反応の阻害 ＲＦはいずれも赤血球を凝集する。

また、免疫グロブリンの被覆または外表面をもつ物質例
えば免疫グロブリンで被覆したポリスチレンの凝集を起
こさせる。このような被覆は、Ａｂと膜抗原との間の免
疫反応によるかまたは物理的吸着または化学反応によつ
て、作ることができる。免疫グロブリンで被覆したポリ
スチレン粒子は市販されているがいずれにせよ簡単に作
ることができる。前記被覆粒子または赤血球をＲＦと一
緒にすると、凝集反応が始まるが、しかし溶液中にＡｂ
：Ａｇ複合体もまた存在している場合には、この複合体
はＲＦそれぞれとより速く結合し、ＲＦは溶液中でＡｂ
：Ａｇ複合体に結合してしまうので、被覆粒子（または
赤血球）の凝集は起こらない。こうして、血清中のＡｂ
：Ａｇ複合体の存在は、例えば、血清と（可溶性）ＲＦ
と免疫グロブリンで被覆した粒子を一緒にすることによ
つて検出することができる。凝集反応が見られた場合に
は、血清は任意のＡｂ：Ａｇ複合体を含んでいない。前
記方法は、非常に簡単で正確な試験であり、すべてのＡ
ｂ：Ａｇ複合体の検出に使うことができる。前記方法は
例えば次のように行う。

血清５０Ｐｔを、可溶性ＲＦの溶液５０μｔこ加える。

そしてその混合物を、免疫グロブリンで被覆したポリス
チレン粒子の懸濁液５０Ｐｔと混合する。得られる粒子
の凝集は容易に観察できる。前記試験は、血清中の特定
のＡｇまたはＡｂの存在の検出のために使うこともでき
る。例えば、特定の抗原Ａｇ′を試験するには、血清に
適当な特異的抗体Ａｂ′を加え、次にＡｂ：Ａｇ複合体
すなわちＡｂ′：Ａｇ′の存在に対する試験をする。最
初の血清が他のＡｂ：Ａｇ複合体を含んでいる場合には
、不溶化したＲＦを使つて、まずその複合体を除去しな
ければならない。本発明方法をさらによく説明するため
に、下記の実施例で具体的に説明する。

例１ チロキシン（Ｔ４）の定量 Ｔ４を含む試料１００Ｐｔに、ＲＦ６Ｏｎｇと適当に希
釈したラピッドの抗−ヒトＴ４血清１．００ｍ１とを含
む溶液１００ｍ１を加える。

この混合物を室温で一晩おき、３０００ｇで５分間遠心
分離し、上清をパスツールピペツトで取り出し、凝集し
たＩｇＧを前もつて共有結合しているアミノ化アガロー
ス（ＡＨセフアロース）２５μｔを含む試１験管に移す
。この混合物を室温で１５分間おき、遠心分離してアガ
ロース粒子を沈降させる。上清を取出し、残さを０．５
Ｎチオシアン酸アンモニウム水溶液１ＴｆＬ１と振り、
次に上清を通常の方法によりＩｇＭで定量分析する。Ｔ
４の濃度は残つているＩｇＭまたはＲＦの最終濃度に反
比例する。

例２ ＩｇＥの定量 試験試料０．１ｍ１をピペツトで５ｍ１の遠心管にとり
、ラピッドの抗−ヒトＩｇＥ抗血清（希釈度１：１２８
）１，０ｍ１と市販用１１２５１ｇＥ（６０，０００ｃ
ｐｍ）０．１ｍ１とを加える。

この混合物を３７℃で１時間おき、次にＲＦｌＯＯｎｇ
を含むＲＦ溶液０．１ｍ１を加える。更に１時間おいて
から、この混合物を５分間２０００ｒｐｍで遠心分離す
る。上清を取出し、ガンマ−カウンターで放射能を測定
する。ＧＥ濃度は放射能カウントに反比例に依存し、前
もつて作製した検量線から決定することができる。例３ ＩｇＥの定量 ＩｇＥを含む試料０．１ｍ１をピペツトで５ｍ１の試験
管にとり、ラピッドの抗人１ｇＥ抗血清（希釈度１：１
２８）１．０ｍ１を加える。

この混合物を３７：Ｃに１時間おき、ＩｇＧｌ′η／ｍ
ｌを含む生理的塩類溶液中に前もつてインキユベーシヨ
ンした直径０．８ミ・クロンのラテツクス粒子６０００
０を含む溶液１ｍ１を加える。この混合物を振り、ＲＦ
６ＯＯ，ｎｇを含む溶液０．１ｍ１を加える。この混合
物を一晩インキユベーシヨンし、次に直径が１ミクロン
より大きい粒子を除くことのできる粒子カウンターで数
える。ＧＥの濃度は、既知濃度のＩｇＥを含む溶液から
前もつて得られる粒子数−１ｇＥ濃度検量線（この例で
は反比例関係にある）から決定することができる。例
４ （参考例） α１胎生蛋白質の自動分析 試験する試料の流れ０．１ｍ１／分をラテツクス粒子６
００００／ｍｌを含む溶液の同じ流れと共に、連続流れ
型の自動分析機にポンプで送る。

このラテツクス粒子の直径は０．８ミクロンであり、こ
の溶液は生理的塩類溶液で１：６４に希釈したα，胎生
蛋白質に対する抗血清で前もつてインキユベーシヨンし
ておく。混合流は系中で空気ポンプによつて０．３２ｍ
１／分に区切る。空気を入れた後でＣｌｑ溶液の流れ０
．４ｍ１／分を入れる。区分された流れを１０分間３７
℃に加熱し、次に２分間６３℃に更に加熱してＣｌｑを
壊し、抗体抗原複合体と結合しているラテツクス粒子以
外のＣｌｑと結合しているラテツクス粒子を全て解き離
す。次にこの流れを、直径が１ミクロンより大きい粒子
を除くことのできる粒子カウンターに通す。

α１胎生蛋白質の濃度は粒子数に反比例し、既知濃度の
α１胎生蛋白質を含む溶液から得られる前もつて用意し
た検量線から決定することができる。Ｃｌｑの代わりに
ＲＦを使い、同様の分析を行なうことができる。例５ 破傷風抗毒素抗体抗原複合体の定量 ＲＦ４ＯＯｎ９を含む溶液１００Ｐｔを破傷風抗毒素抗
原を含む懸濁血清１００ｍ１に加える。

この混合物を室温で３０分間振り、次に２０００９で５
分間遠心分離する。上清を除去して、残つたＲＦは例１
に記載の様にアミノ化アガロースで定量する。例６ 標識ＲＦの製造 ＰＨ７．４の５０ｍＭりん酸緩衝液２００ｍ１をＲＦｌ
５Ｏμ９に加える。

この混合物を２０μｔずつに分割し、それぞれの区分に
１１２５１０μｃを続いてクロルアミン一Ｔ５Ｏμ９を
加える。

酸化を３０秒間行わせ、次に塩５０μ９を含むメタ重亜
硫酸ナトリウム水溶液５０μｔを加えることによりこの
反応を終らせる。前記混合物をセフアデツクスＧ２５の
カラムを通すことによつて標識ＲＦを１１２５から分離
し、前記りん酸緩衝液で所望の標識材料を溶離する。

溶離分画をγ一活性で検定し、最大活性をもつ分画を集
め、必要とするときまで栓をして凍らせておく。以上本
発明を詳細に説明したが、本発明の構成を具体的に述べ
れば次のとおりである。

（１）体液試料中の抗原（Ａｇ）、抗体（Ａｂ）または
抗原抗体（Ａｇ：Ａｂ）複合体を検出および（または）
定量するにあたり、試料中のＡｇまたはＡｂを検定する
場合は検定すべきＡｇまたはＡｂに対して免疫特異的で
あり、所望により標識されたＡｂまたはＡｇを試料に加
えてあらかじめＡｇ：Ａｂ複合体を形成させておき、試
料中のＡｇ：Ａｂ複合体と結合して凝集するＲＦの溶液
および所望により、標識されたＡｇ′：Ａｂ′複合体、
または遊離のＲＦの存在下に凝集する材料を加え、混合
物中に存在する、Ａｇ：Ａｂ複合体とＲＦとの凝集量、
遊離のＲＦの量、遊離の複合体の量、遊離のままで残つ
たあらかじめ加えたＡｂまたはＡｇの量、またはＲＦに
より起こされた前記材料の凝集の程度のいずれかを測定
し、この測定値に基づいて試料中のＡｇ．ＡｂまたはＡ
ｇ：Ａｂ複合体を検出および（または）定量する方法。

（２）体液試料中のＡｇまたはＡｂを検出および（また
は）定量するにあたり、検定すべきＡｇまたはＡｂに対
して免疫特異的であり、所望により標識されたＡｂまた
はＡｇを試料に加えてＡｇ：Ａｂ複合体をあらかじめ形
成させておき、前記Ａｇ：Ａｂ複合体と結合するＲＦの
溶液を反応混合物に加え、遊離のＲＦの量または複合体
とＲＦとの凝集量または遊離のままで残つたあらかじめ
加えたＡｂまたはＡｇの量のいずれかを測定し、この測
定値に基づいて試料中のＡｂまたはＡｇを検出および（
または）定量する前項（１）に記載の方法。

（３）体液試料中のＡｇ：Ａｂ複合体を検出および（ま
たは）定量するにあたり、試料中の複合体と結合するＲ
Ｆの溶液および所望により、標識されたＡｇ′：Ａｂ′
複合体、または遊離のＲＦの存在下に凝集する材料を加
え、混合物中の遊離のＲＦの量、または複合体とＲＦと
の凝集量、またはＲＦにより起こされた前記材料の凝集
の程度のいずれかを測定し、この測定値に基づいて試料
中のＡｇ：Ａｂ複合体を検出および（または）定量する
前項（１）に記載の方法。

（４） ＲＦでＡｇ：Ａｂ複合体を凝集させ、その凝集
塊を反応混合物から分離し、反応混合物中に残つたＲＦ
の量または凝集塊中に分離されたＲＦを定量する、前項
（１）に記載の方法。

（５）前記混合物中に残つたＲＦの量を測定するために
、ＲＦ全部と結合するよりも過剰量の標識されたＡｇ′
：Ａｂ′複合体を反応混合物に加え、次に反応混合物中
に遊離のまま残つた標識されたＡｇ′：Ａｂ′複合体を
定量する、前項（４）に記載の方法。（６）あらかじめ
加えるＡｂまたはＡｇの少なくとも一部として標識され
たＡｂ′またはＡｇ′を使い、遊離の標識されたＡｂ′
またはＡｇ′を定量する、前項（２）に記載の方法。

（７）標識されたＡｇ′：Ａｂ′複合体を加え、反応溶
液中遊離のまたはＲＦと結合した標識されたＡｇ′：Ａ
ｂ′複合体を定量する、前項（３）に記載の方法。

（８）遊離のＲＦの存在下に凝集する材料として、免疫
グロブリンで被覆された不活性粒子を加える、前項（３
）に記載の方法。

（９）標識として酵素または補酵素を使う、前項（５）
〜（７）のいずれかに記載の方法。

（代）標識として、酵素または補酵素の活性が抗体：抗
原複合体ＲＦとの結合によつて阻害されるような酵素ま
たは補酵素を使い、遊離の抗体、抗原または抗体：抗原
複合体の量は、ＲＦと結合した抗体：抗原複合体を含ま
ない混合物の酵素または補酵素の活性を測定することに
よつて決定する前項（１）に記載の方法。

（自）標識としてキヤタラーゼまたはアミラーゼを含む
前項（代）に記載の方法。

（代）前記粒子がポリスチレンから成る前項（８）に記
載の方法。

３）（ａ） ＡｂまたはＡｇに各各特異的なＡｇまたは
Ａｂの過剰量を生体体液中に加えて、試料中にＡｂ：Ａ
ｇ複合体を形成させ、（ｂ）前記工程（ａ）で形成させ
た混合物に、存在する前記全Ａｂ：Ａｇ複合体と縮合さ
せるのに必要な量より過剰にＲＦ溶液を既知量加えて混
合物中にＲＦ／Ａｂ：Ａｇを凝集させ、（ｃ）混合物か
らこの凝集したＲＦ／Ａｂ：Ａｇを分離し、（ｄ）工程
（ｃ）の後の混合物中に残つているＲＦの量または工程
（ｃ）で混合物から分離されたＲＦの量を測定し、これ
により始めの試料中に存在していたＡｂまたはＡｇの量
を計算することから成る、前記（２）に記載の方法。

４） （ａ）生体体液試料に、試料中の全Ａｂ：Ａｇ複
合体と結合してＲＦ／Ａｂ：Ａｇを形成させるのに必要
な量より過剰にＲＦ溶液を既知量加え、混合物中にＲＦ
／Ａｂ：Ａｇの凝集を作り、（ｂ）混合物から凝集した
ＲＦ／Ａｂ：Ａｇを分離し、（ｃ）前記工程（ｂ）後の
混合物中に残るかまたは工程（ｂ）中の混合物から分離
されるＲＦの量を測定し、これによつて最初の試料に存
在していたＡｂ：Ａｇ複合体の量を計算することから成
る、前記（３）に記載の方法。

１５）（ａ）生体体液試料中に、試料中のＡｂまたはＡ
ｇに各各特異的な（同定標識されている）Ａｇ′または
Ａｂ′の過剰量を加えて、Ａｂ：Ａｇ′複合体またはＡ
ｂ′：Ａｇ複合体を形成させ、（ｂ）前記工程（ａ）で
形成させた混合物に、少くとも混合物中の全Ａｂ：Ａｇ
′またはＡｂ′：Ａｇ複合体と結合させるのに充分な量
のＲＦ溶液を加え、（ｃ）混合物中の遊離のＡｂ′また
はＡｇ／の量またはＲＦと結合したＡｂ′またはＡｇ′
の量を測定し、これにより最初の試料中に存在したＡｂ
またはＡｇの量を計算することから成る、前記（２）に
記載の方法。

１６） （ａ）生体体液試料に既知量の同定標識された
Ａｂ′：Ａｇ複合体と、混合物中のＡｂ：Ａｇ１′およ
びＡｂ′：Ａｇ′複合体の全量と結合させるのに不充分
な量のＲＦ溶液を加え、（ｂ）混合物中の遊離またはＲ
Ｆと結合したＡｂ′：Ａｇ′の量を測定し、これにより
始めの試料中に存在していたＡｂ：Ａｇの量を計算する
ことから成る、前記（３）に記載の方法。

０７）（ａ）生体体液に、ＡｂまたはＡｇに各各特異的
なＡｇまたはＡｂを加えて、試料中にＡｂ：Ａｇ複合体
を形成させ、（ｂ）前記工程（ａ）で形成させた混合物
に、同定標識された定量すべき、既知量のＡｂまたはＡ
ｇを加え、 （ｃ）前記工程（ｂ）で形成させた混合物に、少くとも
混合物中の全Ａｂ：Ａｇ複合体と結合させるのに充分な
量のＲＦ溶液を加え、（ｄ）混合物中に遊離の状態で残
つているかまたはＲＦと結合した同定標識されたＡｂま
たはＡｇの量を測定することから成る、前記（２）に記
載の方法。

（自）工程（ｂ）で標識として酵素アミラーゼをもつモ
ルヒネを加え、モルヒネを分析する前項（１７）に記載
の方法。

（自）生体体液試料にＲＦ溶液と、ＲＦと接触して集塊
化を起す材料とを加え、材料の凝集が起るか否かを検査
することから成る、Ａｂ：Ａｇ複合体試料の不存在また
は存在を決定する前項（１）に記載の方法。

（イ）生体体液試料に、その存在を調べる特定のＡｂま
たはＡｇと特異的なＡｇまたはＡｂを加えて、存在する
前記特定の任意のＡｂまたはＡｇ（５Ａｂ：Ａｇ複合体
を形成させ、前項（自）に記載の方法によつて前記複合
体の存在または不存在を検査することから成る、前記試
料中に特定ＡｂまたはＡｇの存在または不存在を決定す
る前項（１）に記載の方法。

Ｃ２Ｄ（ａ）生体体液試料に、標識酵素を含むＡｂ、Ａ
ｇまたはＡｂ：Ａｇ複合体を加え、（ｂ） ＲＦまたは
Ｃｌｑ溶液を加えて、存在する任意のＡｂ：Ａｇ複合体
と結合させ、（ｃ） ＲＦまたはＣｌｑと結合している
任意の標識されたＡｂ：Ａｇ複合体の酵素活性に対する
ＲＦまたはＣｌｑの阻害効果を利用して試料を分析する
ことを含む、Ａｂ．ＡｇまたはＡｂ：Ａｇ複合体に対す
る前記（１）に記載の方法。

（２２） ＲＦが同定標識をもつＲＦ溶液。

（支）前記標識として、放射性原子、酵素、補酵素、酵
素阻害剤または螢光性基を使う前項（社）に記載の溶液
。（自）連続流れ法で行なう前項（１）に記載の方法。

（至）実質的に前記実施例１〜３および５のいずれかに
記載の前項（１）に記載の方法。（至）実質的に前記実
施例６に記載の様に標識されたＲＦ溶液。

（２′７）実質的に前記実施例４に記載の連続流れ法に
よる前項（１）に記載の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 生体体液試料中に存在する抗体または抗原または抗
   体：抗原複合体を定量分析するにあたり、抗体または抗
   原とは結合せず抗体：抗原複合体とは結合する性質をも
   つリウマトイド因子（ＲＦ）の溶液を試料に加えること
   により、試料中に存在する抗体または抗原から誘導され
   たまたは試料中に存在する抗体：抗原複合体を凝集させ
   、この凝集量に直接にまたは間接に基づいて試料中に存
   在する抗体または抗原または抗体：抗原複合体の量を定
   める、定量分析法。