DE102004052729A1

DE102004052729A1 - Immunkomplex-spezifsicher Antikörper zur Reduktion des Nullwerts beim Nachweis von Antigen-spezifisch gebundenen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in Array-Testformaten

Info

Publication number: DE102004052729A1
Application number: DE102004052729A
Authority: DE
Inventors: Ursula Dr. Klause; Christine Dr. Markert-Hahn; Helmut Dr. Lenz
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 2004-10-30
Filing date: 2004-10-30
Publication date: 2006-05-04
Also published as: CA2526109C; ES2366123T3; US8664007B2; JP5337101B2; EP1653233B1; CN100489529C; CN1766621A; JP2006126202A; CA2526109A1; ATE511650T1; JP2010181421A; EP1653233A1; US20060115907A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigen-spezifischen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in einer Probe mittels eines Immunassays im Arrayformat, bei dem auf einem Träger auf verschiedenen diskreten Bereichen verschiedene Bindepartner B_nx gebunden sind, wobei B_nx jeweils die verschiedenen Antigene enthalten, die mit den nachzuweisenden Antikörpern spezifisch bindefähig sind, durch Inkubation des Trägers mit der Probe und einem Bindepartner B₂, der eine Markierung trägt, und anschließendem Nachweis der Markierung auf den jeweiligen diskreten Bereichen, wobei B₂ Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Antigen-spezifischen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in einer Probe mittels eines Immunassays im Arrayformat, bei dem auf einem Träger auf verschiedenen diskreten Bereichen verschiedene Bindepartner B_nx gebunden sind, wobei B_nx jeweils die verschiedenen Antigene enthalten, die mit den nachzuweisenden Antikörpern spezifisch bindefähig sind, durch Inkubation des Trägers mit der Probe und einem Bindepartner B₂, der eine Markierung trägt und anschließendem Nachweis der Markierung auf den jeweiligen diskreten Bereichen, wobei B₂ Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine Methode zur Reduktion des Nullwerts durch unspezifisch gebundene nicht-Antigen spezifische Antikörper in Immunassays im Arrayformat zum Nachweis von Antigen-spezifischen Antikörpern.
Das Immunsystem eines Säugetierorganismus produziert als Antwort auf das Einbringen fremder Substanzen Antikörper, die auch Immunglobuline genannt werden. Sie dienen zur Abwehr der Fremdsubstanzen, die auch als Antigene bezeichnet werden. Die Immunglobuline können in fünf verschiedene Klassen eingeteilt werden. Man unterscheidet Immunglobuline der Klassen M, G, A, E und D. Diese fünf Immunglobulinklassen unterscheiden sich jeweils in der Zusammensetzung der schweren Kette, die als μ-, γ-, α-, ε- bzw. δ-Kette bezeichnet wird.
Jede Immunglobulinklasse hat im Organismus eine andere Aufgabe. Die Immunglobuline der Klasse M treten bei einem ersten Kontakt mit dem Antigen, der sogenannten Erstimmunisierung, auf. Die Konzentration dieser Immunglobuline nimmt jedoch bei fortschreitender Infektion schnell wieder ab. Die Immunglobuline der Klasse G werden bei einer ersten Immunisierung erst langsam gebildet und treten bei einer zweiten Infektion mit demselben Antigen in großen Mengen auf. Die Immunglobuline der Klasse A sind auf den Schleimhautoberflächen des Organismus anzutreffen und sind für die dortigen Abwehrvorgänge zuständig. Die Immunglobuline der Klasse E sind hauptsächlich für allergische Reaktionen verantwortlich. Die genaue Funktion der Immunglobuline der Klasse D ist bislang nicht bekannt.
Die einzelnen Immunglobulinklassen kommen im Blut in sehr unterschiedlichen Konzentrationen vor. So sind die Immunglobuline der Klasse G (IgG) in normalem menschlichen Serum mit einem Anteil von etwa 75 %, das entspricht einem Serumgehalt von 8 bis 18 mg/ml, die am stärksten vertretene Klasse. Das am zweithäufigsten auftretende Immunglobulin ist das IgA, dessen durchschnittliche Serumkonzentration 0,9 bis 4,5 mg/ml beträgt. Immunglobuline der Klasse M sind in einer Konzentration von 0,6 bis 2,8 mg/ml, Immunglobuline der Klasse D von 0,003 bis 0,4 mg/ml vorhanden. Am geringsten ist der Anteil von IgE-Antikörpern, die nur in einer Konzentration von 0,02 bis 0,05 μg/ml im Serum auftreten.
Für die differenzierte Diagnostik vieler Erkrankungen ist es wichtig, den Nachweis für Antikörper einer oder mehrerer ganz bestimmter Immunglobulinklassen, die für ein bestimmtes Antigen spezifisch sind, zu führen. Nur mittels eines klassenspezifischen Antikörper-Nachweises, bzw. durch das Ausschließen der Anwesenheit bestimmter Immunglobulinklassen (z.B. Detektion von IgG- und IgA-Antikörpern, aber keine Detektion von IgM-Antikörpern) kann eine befriedigende Diagnose bei viralen, bakteriellen und parasitären Infektionen sichergestellt werden. Dies ist besonders wichtig zur Unterscheidung frischer bzw. akuter und weiter zurückliegender Infektionen sowie zur klinischen Kontrolle des Verlaufs einer Infektion. Der klassenspezifische Nachweis von Antikörpern ist insbesondere wichtig bei HIV-, Hepatitis A-, Hepatitis B-, Toxoplasmose-, Rubella- und Chlamydia-Infektionen. Ebenso ist der klassenspezifische Nachweis von für ein bestimmtes Antigen spezifischen Antikörpern bei der Bestimmung des Titers schützender Antikörper und zur Überprüfung des Impferfolges notwendig.

Im Stand der Technik werden verschiedene Methoden zum Nachweis von für ein Antigen spezifischen Antikörpern einer bestimmten Klasse beschrieben. So wird der Nachweis von antigenspezifischen Antikörpern einer bestimmten Klasse in einer Probe häufig dadurch geführt, daß die spezifischen Antikörper an eine mit dem spezifischen Antigen beschichtete Festphase gebunden werden. Der Nachweis der für das Antigen spezifischen, nun an die Festphase gebundenen Immunglobuline (Ig) erfolgt durch die Bindung von Antikörper, die spezifisch gegen humanes Ig einer bestimmten Klasse gerichtet sind, an die nachzuweisenden Ig-Moleküle. Die gegen humanes Ig gerichteten Antikörper sind mit einer Markierung versehen, über die die Detektion stattfindet. Eine solche Testführung ist aber nur möglich, wenn vor der Reaktion mit den klassenspezifischen, gegen humanes Ig gerichteten markierten Antikörpern durch Waschung alles unspezifische, nicht gebundene Ig entfernt wird. So sind z.B. beim Nachweis spezifischer IgG-Moleküle in der Probe größere Mengen (4-20 mg/ml) unspezifischer IgGs enthalten, die probenspezifisch unterschiedlich absorbierend sein können und unspezifisch an der Festphase binden. Bei Verwendung eines Nachweisantikörpers gegen IgGs werden diese unspezifisch gebundenen Immunglobuline ebenfalls erkannt und gebunden. Dies führt zu erhöhten Hintergrundssignalen und reduzierter Sensitivität.

Eine Möglichkeit zur Verringerung dieser Hintergrundsignale besteht in der Modifikation der Festphase, um die unspezifischen Bindungen der Immunglobuline zu vermeiden und in der Verwendung spezieller Pufferzusätze, die ebenfalls die Bindung der Immunglobuline an die Festphase vermeiden soll (Beispiele: HydroGel ^TM Festphase (Perkin Elmer), Fast ^Tm Slides (Schleicher & Schüll), Detergentien, chaotrope Salze). Die Modifikationen der Festphase sind aufwändig und teuer. Des Weiteren hat es sich her ausgestellt, daß Pufferzusätze die Reaktivität einiger Antikörper senken können und damit die Signale reduziert werden. Die durch unspezifisch gebundene Immunglobuline ausgelösten Hintergrundsignale bewirken eine Erhöhung des Nullwerts, so dass besonders bei miniaturisierten Testsystemen wie Immunoassays im Arrayformat, die eine Vielzahl von spezifischen Tests mit teilweise unterschiedlichen Testformaten in einem Reaktionsgefäß beinhalten, der Nachweis spezifischer Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse erschwert ist. So kann beispielsweise ein Zusatz eines bestimmten Detergenzes die unspezifische Bindung von Antikörpern unterdrücken, dasselbe Detergenz aber in einem anderen Test auf demselben Array-System keine oder sogar eine gegenteilige Wirkung besitzen.

In EP0222146B1 wird als weitere Möglichkeit zur Reduktion von Hintergrundsignalen der Einsatz des Gerinnungsfaktor C1q, eine Untereinheit der ersten Komplementkomponente, in Immunassays offenbart. Das an einen Träger gebundene Protein C1q wird hierbei zur selektiven in vivo Entfernung von zirkulierenden Immunkomplexen aus dem Blut mittels extrakorporaler Immunadsorption eingesetzt, wobei die an das Protein C1q gebundenen Immunkomplexe aus den Körperflüssigkeiten durch Abtrennung der festen Phase separiert werden. In US5698449A1 wird ein Fragment von C1q zur selektiven Entfernung von Immunkomplexen aus dem Blut, sowie der Nachweis und die Quantifizierung der Immunkomplexe offenbart. Des Weiteren beschreibt US4062935A1 die Zugabe von Rheumafaktoren oder C1q zur Probe und die Bindung und Quantifizierung der entstandenen Immunkomplexe. Der hier beschriebene Stand der Technik zeigt jedoch keine Anwendung für Immunassays im Arrayformat.

Eine Besonderheit bei Immunassays mittels des Arrayformat ist die Festphase. In solchen Verfahren besteht die Festphase bevorzugt aus begrenzten Testflächen, die definierte, diskrete Bereiche der Festphase umfassen und vorzugsweise durch inerte Bereiche von weiteren Testflächen räumlich getrennt sind. Diese, als Spots definierten begrenzten Testflächen haben bevorzugt einen Durchmesser von 10 μm bis 1 cm und besonders bevorzugt einen Durchmesser von 100-200μm. Bevorzugt sind Festphasen mit mehreren Testflächen, die auch als Array-Systeme bezeichnet werden. Solche Array-Systeme sind z.B. bei Ekins und Chu (Clin. Chem. 37 (1995), 1955-1967) und in den US-Patenten 5,432099, 5,516,635 und 5,126,276 beschrieben. Array-Systeme haben den Vorteil, dass mehrere Analytbestimmungen gleichzeitig aus einer Probe durchgeführt werden können. Es besteht somit die Möglichkeit eine Vielzahl von Bindepartnern wie z.B. Antigen-spezifischer Antikörper auf das Testfeld aufzubringen. Die Festphase dieser Array-Systeme kann bevorzugt, wie in EP0939319 (Hornauer et al.) offenbart, mit Streptavidin oder Avidin beschichtet sein. An alle diese Festphasen können Probenbestandteile, insbesondere unspezifische IgGs binden. In diesem Fall ist es nicht oder nur unter einem sehr großen Aufwand möglich einen universellen Pufferzusatz zur Reduktion der Hintergrundsignale zu benutzen, da jeder einzelne Bindepartner jeweils einen ganz bestimmten Pufferzusatz benötigt. Pufferzusätze, die bei einem Bindepartner positive Einflüsse ausüben, können bei anderen Bindepartnern sogar negative Einflüsse ausüben. Auch eine Modifikation der Festphase ist bei einer Vielzahl unterschiedlicher Bindepartner schwer möglich. Die Optimierung des Nullwerts bei Kombination mehrerer bis vieler verschiedener Tests auf einer Array-Festphase ist daher mit den oben genannten Methoden mit praktikablem Aufwand nicht möglich.

Aufgabe war es daher ein Verfahren zur Durchführung eines Immunassays zum Nachweis antigenspezifischer Antikörper im Arrayformat zu entwickeln, bei dem die Nachteile des Standes der Technik weitgehend vermieden werden können und insbesondere die Hintergrundsignale durch unspezifisch gebundene Immnuglobuline reduziert werden.

Diese Aufgabe wird gelöst mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Antigen-spezifischen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in einer Probe mittels eines Immunassays im Arrayformat, bei dem auf einem Träger auf verschiedenen diskreten Bereichen verschiedene Bindepartner B_nx gebunden sind, wobei B_nx jeweils die verschiedenen Antigene enthalten, die mit den nachzuweisenden Antikörpern spezifisch bindefähig sind, durch Inkubation des Trägers mit der Probe und einem Bin departner B₂, der eine Markierung trägt und anschließenden Nachweis der Markierung auf den jeweiligen diskreten Bereichen, wobei B₂ Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet.

Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass der erfindungsgemäße Einsatz von B₂ eine hohe Sensitivität für Antigen-spezifische Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse im verwendeten Spot des Immunassays im Arrayformat bietet. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von B₂ werden überwiegend Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch gebunden. B₂ erkennt hierbei bevorzugt die dichter auf dem Spot gebundenen Antigen-spezifischen Antikörper des Immunassays im Arrayformat, andererseits werden unspezifisch auf der Festphase gebundene Immunglobuline nicht oder vernachlässigbar erkannt.

Das erfindungsmäße Verfahren umfaßt die Schritte:

– Bereitstellen eines Array-Testträgers, der auf verschiedenen diskreten Bereichen beschichtete Testfelder besitzt, die jeweils die verschiedenen Antigene B_nx enthalten, die mit den nachzuweisenden Antikörpern spezifisch bindefähig sind,
– Inkubation des Testfeldes mit der Probe, die den nachzuweisenden Analyten, bevorzugt einen Antigen-spezifischen Antikörper enthält,
– Entfernung überschüssiger Immunglobuline,
– Inkubation mit dem Bindepartner B₂, der eine Markierung trägt und nur Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet,
– Nachweis des an den nachzuweisenden Analyten gebundenen Bindepartner B₂.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines Bindepartners B₂, der eine Markierung trägt und Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet, in einem Immunassay zum Nachweis von Antigen-spezifischen Antikörpern im Arrayformat zur Reduktion des Nullwerts.

Bevorzugt werden Antikörper als Bindepartner B₂ im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet, die Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch binden. Der Antikörper enthält einen, bevorzugt mehrere Bindungsstellen (auch Paratope, Antigendeterminante oder combining site genannt) für den zu bestimmenden Antigen-spezifisch Antikörper, d.h. eine immunologisch spezifisch mit dem zu bestimmenden IgG-Antikörper reagierende Struktur. Dabei bindet B₂ bevorzugt aggregierte und/oder oligomerisierte spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse, die in einer hohen Dichte auf dem Spot des Immunassays im Arrayformat vorliegen. Die unspezifisch an der Festphase gebundenen Antikörper, die weitgehend singulär vorliegen und locker verteilt sind, werden von B₂ nicht oder vernachlässigbar erkannt.

Der Einsatz Immunkomplex-spezifischer Antikörper zum Nachweis von Immunglobulinen ist im Stand der Technik bereits vielfach beschrieben worden. Immunkomplexspezifische Antikörper sind Rheumafaktor-ähnliche Antikörper, die bevorzugt aggregierte oder oligomerisierte Immunglobuline, jedoch nicht singuläre Immunglobuline binden. EP1098198 (Berti et al.) betrifft eine Methode zur qualitativen und quantitativen Bestimmung humaner IgG-Antikörper in Enzym-Immunassays. Hierbei wird ein monoklonaler Antikörper eingesetzt, der spezifisch humane IgG-Antikörper bindet, die an ihr spezifisches Antigen gebunden sind. Bei Bindung des Antigens an den spezifischen Antikörper entstehen neue Epitope oder Bindungsstellen (sog. „Neo-Epitope"). Im hier beschriebenen Verfahren wird jedoch darauf hingewiesen, dass die selektive Bindung an das IgG-Molekül mit Signaleinbußen einhergeht. Es wird des Weiteren keine Anwendung für automatische Systeme gezeigt, wie sie insbesondere für Immunassays in Arrayformat benötigt wird. Eine Reduktion des Hintergrundsignals durch unspezifisch an die Festphase gebundene Antikörper ist in dieser Methode nicht beschrieben worden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden für B₂ bevorzugt Antikörper mit niedriger Affinität für die Bindung der Antigen-spezifischen Antikörper eingesetzt. Unter der Affinität des Antikörpers für das Epitop wird die Stärke aller nicht-kovalenten Interaktionen zwischen der einzelnen Antigen-Bindungsstelle auf einem Antikörper und dem einzelnem Epitop definiert. Antikörper mit niedriger Affinität binden schwach und dissoziieren rasch, während hochaffine Antikörper stärker binden und länger gebunden bleiben. Die Affinität an einer Bindungsstelle reflektiert nicht immer die wirkliche Stärke einer Antigen-Antikörper Interaktion, wie z.B. bei komplexen Antigenen mit vielen sich wiederholenden antigenen Determinanten und komplementären Antikörpern mit mehreren Bindungsstellen. Die Interaktion von Antigen und einer Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers (oder Epitopen) an einer Stelle steigert die Wahrscheinlichkeit zur Reaktion an einer zweiten Antigen-Bindungsstelle desselben Antikörpers, dadurch kann eine Vernetzung der Interaktionspartner entstehen. Die Stärke von solchen mehrfachen Interaktionen zwischen multivalentem Antikörper und Antigen wird als Avidität bezeichnet. Dabei kompensiert eine hohe Avidität eine niedrige Affinität wie z.B. beim pentameren Immunglobulin IgM. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird bevorzugt ein Antikörper mit niedriger Affinität für die Antigen-spezifischen Antikörper eingesetzt, der mehrere d.h. mindestens zwei, bevorzugt mindestens vier und besonders bevorzugt 10 und mehr Paratope besitzt wie z.B. das Immunglobulin IgM oder IgG Immunglobuline, die untereinander vernetzt sind. Ein Beispiel hierfür sind Rheumafaktoren, die zumeist aus IgM-Molekülen, seltener auch IgG-, IgA- und IgE-Molekülen bestehen können. Rheumafaktoren reagieren mit dem Fc-Teil von Antikörpern.

Werden solche niedrig affinen Antikörper des Bindeparters B₂ benutzt, so erkennt B₂ hierbei nur Antigen-spezifischen Antikörper des Immunassays im Arrayformat, die dicht auf dem Spot gebunden sind. Unspezifisch auf der Festphase gebundene Immunglobuline, die locker und ungleichmäßig verteilt sind, werden nicht oder vernachlässigbar erkannt.

Liegt der spezifisch gebundene nachzuweisende Antikörper nicht in einer bestimmten Dichte in Spot vor, da z.B. die Probe sehr verdünnt ist, so besteht die Möglichkeit für B₂ einen Antikörper einzusetzen, der spezifisch Antikörper bindet, die an ihr jeweils spezifisches Antigen gebunden sind. Bei Bindung eines Antigens an den spezifischen Antikörper entstehen offensichtlich neue Epitope oder Bindungsstellen (sog. „Neo-Epitope"). Solche Antikörper gegen Antigen-gebunden Antikörper sind beispielsweise in EP1098198 offenbart. Im erfindungsgemäßen Fall kann durch die Bindung von B₂ an den Antigen-spezifisch gebundene Antikörper ein Neo-Epitop aufgedeckt werden. Die neo-Epitop-spezifischen Bindungen entstehen nicht bei den unspezifisch an die Festphase gebundenen Antikörpern, sondern nur bei Antigen-spezifischen Antikörpern, die auf dem Spot des Immunassays im Arrayformat gebunden sind.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können für B₂ bevorzugt auch Antikörper-Fragmente für die Bindung der Antigen-spezifischen Antikörper eingesetzt werden. Die Fragmentierung der Antikörper ist dem Fachmann bekannt und erfolgt nach konventionellen Techniken. Die Selektion dieser Antikörper-Fragmente nach ihrem Nutzwert findet auf die gleiche Art und Weise statt wie es für vollständige Antikörper beschrieben ist. Antikörper-Fragmente beinhalten proteolytisch gespaltene oder rekombinant-hergestellte Anteile eines Antikörper-Moleküls, die in der Lage sind mit einem bestimmten Protein selektiv zu reagieren. Beispiele für proteolytisch gespaltene und/oder rekombinanthergestellte Fragmente beinhalten Fab, F(ab')2, Fab', Fv und Einzelstrang-Antikörper (scFv), die eine V[L] und/oder V[H] Domäne mit einem Peptid-Linker enthalten. Die scFv's können kovalent oder nicht-kovalent verbunden sein, so dass ein Antikörper mit zwei oder mehr Bindungsstellen entsteht. Die Erfindung beinhaltet weiter polyklonale, monoklonale oder andere aufgereingte Aufbereitungen von Antikörpern und rekombinant hergestellte Antikörper.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird für B₂ bevorzugt der monoklonale humane Antikörper <H-Agg.-IgG> M3.022.5-IgM-Dig eingesetzt. Dieser Antikörper der Immunklasse IgM hat die Eigenschaften der allgemeinen Klasse rheumatoider Antikörper, d.h. er bindet stark bevorzugt die Antigen-spezifisch gebundenen Antikörper der Immunglobulinklasse IgG, da er nur die dicht gepackten Antigen-spezifischen Antikörpern auf dem Spot des Immunassays im Arrayformat erkennt. Die Besonderheit des Antikörpers <H-Agg.-IgG> M3.022.5-IgM-Dig ist, dass er unspezifisch auf der Festphase des Arrays gebundene, Nullwert verursachende Immunglobuline, die nicht spezifisch für das Antigen sind, nicht oder nur vernachlässigbar erkennt. Durch die Verwendung des <H-Agg.-IgG> M3.022.5-IgM-Dig wird das Hintergrundsignal auf dem Array wesentlich gesenkt und von Probe zu Probe gleichmäßig hoch gestaltet.

Des Weiteren können für B₂ auch monoklonale Antikörper (MAK) der Immunglobulinklasse IgM oder IgG, die aus Maus, Schaf oder anderen Spezies abstammen, verwendet werden. Diese sind dem Fachmann bekannt. Auch der Einsatz polyklonaler Antikörper (PAK) aus verschiedenen Spezies ist möglich, Voraussetzung ist jedoch immer, dass nur die Antigen-spezifisch gebundenen Antikörper erkannt, die unspezifisch auf der Festphase gebundenen Antikörper nicht erkannt werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Reduktion des Nullwerts in einem Immunoassay im Arrayformat, dadurch gekennzeichnet, dass als B₂ ein Bindepartner verwendet wird, der Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet.

Durch den universellen Einsatz des Antikörpers B₂ ist es möglich mehrere bis viele verschiedener Tests auf einer Array-Festphase zu kombinieren. Ein großer Vorteil ist hierbei, daß nur eine einfache und universelle Pufferzusammensetzung benötigt wird. Im erfindungsgemäßem Beispiel 2 wurden 2 Tests im indirekten Testformat mit einem hochsensitiven Sandwichassay TSH-Test kombiniert. TSH (Thyroidea-stimulatinghormone) ist ein Hormon, das an der Steuerung der Schilddrüsenfunktion beteiligt ist. Beim Nachweis von TSH im Sandwichformat wird dabei ein gegen dieses Antigen gerichteter markierter Antikörper verwendet.

Der TSH-Test stellt höchste Anforderungen an die Sensitivität, dritt-Generationstests können Konzentrationen bis zu 10-14 M nachweisen. Diese hohe Sensitivität wird maßgeblich durch das Hintergrundsignal beeinflußt, daß möglichst niedrig, vorzugsweise bei null sein soll. Bei erhöhten Hintergrundsignalen sind niedrige Konzentrationen nicht mehr vom Hintergrund zu unterscheiden, so daß die Sensitivität verloren geht. Deshalb ist der TSH-Test eine ideale Meßgröße zur zu Optimierung der Nullwerte.

Im Testverlauf werden für den Bindepartner B₂ Antikörper gegen IgG eingesetzt wie z.B. der monoklonale Antikörper <H-IgG PAN>M-R10Z8E9-IgG-Dig. Mit diesem Antikörper wurden sowohl im TSH-Test als auch auf den Kontrollstellen des Polystyrolträgers, wo keine Spots aufgebracht sind, hohe Hintergrundsignale gemessen. Auch in den beiden indirekten Testformaten Jo-1 und Scl70 erzeugen die Negativkontrolle und die negative Störprobe mit diesem Antikörper noch hohe Hintergrundsignale.

Der Antikörper <H-IgG PAN>M-R10Z8E9-IgG-Dig ist ein Beispiel für einen handelsüblichen anti-human IgG Antikörper, der von verschiedenen Firmen erworben werden kann. Beispielsweise erkennt der MAK R10Z8E9 von der University of Birmingham alle Subklassen des anti humanen IgG. Weiterhin ist Mak <h-IgG>, der spezifisch gegen alle Subklassen aus Maus gerichtet ist, bei Pierce, Bestell Nr. 37300ZZ erhältlich, Mak<h-IgG> der die Subklassen IgG 1, 2, und 3 aus Maus erkennt, ist bei Calbiochem, Bestell Nr. 411128 erwerbbar.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass durch die Verwendung von Bindepartner B₂ beispielsweise des erfindungsgemäßen Antikörpers <H-Agg.-IgG> M3.022.5-IgM-Dig gegen aggregiertes IgG es möglich war, die unspezifischen Bindungen so weit zu senken, dass die Hintergrundsignale sowohl auf dem hochsensitiven TSH-Sandwichassay als auch in den indirekten Testformaten zufriedenstellend reduziert waren. Auch bei den Kontrollen „Background global", der Negativkontrolle und der negative Störprobe waren mit diesem Bindepartner B₂ die Hintergrundsignale deutlich reduziert bzw. nicht mehr vorhanden.

Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Vielzahl von Bindepartnern (B_nx) auf dem Immunassay im Arrayformat aufgebracht, wobei B_nx jeweils die verschiedenen Antigene enthalten, die mit den nachzuweisenden Antikörpern spezifisch bindefähig sind. Diese Verfahren wird auch indirektes Testformat oder „Antigen-down" Format genannt. Im erfindungsgemäßen Verfahren besteht der Array bevorzugt aus einem Träger aus Metall, Glas, einem Kunststoff oder Polystyrol. Im erfindungsgemäßen Verfahren werden bevorzugt Polystyrol-Träger verwendet, diese sind dem Fachmann bekannt und sind z.B. in EP0939319 (Hornauer et al.) beschrieben.

Die Bindepartner sind auf diskreten Bereichen des Trägers immobilisiert, die als räumlich voneinander getrennte Testfelder definert sind. Bevorzugt können Testfelder aus einem oder mehreren Spots mit demselben Bindepartner B_nx auf dem Träger enthalten sein, beispielsweise können Linien, die aus mehreren gleichen Spots bestehen, gebildet werden. Methoden zur Immobilisierung der Bindepartner B_nx sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise in EP0939319 (Hornauer et al.) offenbart. Die hier beschriebene Methode betrifft ein Verfahren zur Bereitstellung räumlich scharf begrenzter Testflächen für Bindungsassays. Für eine zuverlässige qualitative und quantitative Bestimmung eines Analyten, ist es notwendig, die Testflächen der Bindungsassays reproduzierbar und mit genau definierten Mengen an Rezeptormolekülen herstellen zu können. EP0939319 (Hornauer et al.) beschreibt, dass durch das Aufbringen von mehrlagigen Beschichtungen es möglich ist, räumlich scharf begrenzte Testflächen für den Bindungsassay zu erhalten. Die Beschichtungen umfassen das Aufbringen einer Vorbeschichtung auf ein Reagenzfeld des festen Trägers, das Waschen des vorbeschichteten Trägers, sowie das Aufbringen einer zweiten Beschichtung, umfassend Rezeptormoleküle, die mit der Vorbeschichtung bindefähig sind. Bevorzugt umfasst die Vorbeschichtung einen ersten Partner eines hochaffinen Bindepaares, wie z.B. Streptavidin, Avidin oder Biotin sowie Analoga, Derivate und Konjugate der vorstehenden Substanzen, oder Antikörper wie z.B. Anti-Maus-Antikörper. Es können aber auch Moleküle als Vorbeschichtung aufgebracht werden, die für eine kovalente Bindung mit der zweiten Beschichtung vorgesehen sind, etwa Moleküle, die eine Amin-, eine Sulfid- oder eine Si lylgruppe enthalten. Des Weiteren konnte in EP0939319 (Hornauer et al.) gezeigt werden, dass durch das Waschen des vorbeschichteten Trägers mit einem Puffer mit geringer Ionenstärke reproduzierbare, gleichförmige Testspots erhalten werden können. Auf die gewaschene Vorbeschichtung wird dann eine zweite Beschichtung aufgebracht, umfassend Rezeptormoleküle, die mit der Vorbeschichtung bindefähig sind, und zwar in Form von räumlich begrenzten Flächen auf dem Reagenzfeld. Die Rezeptormoleküle enthalten bevorzugt den zweiten Partner des Bindepaares, der eine hochaffine Wechselwirkung, z.B. eine immunlogische Reaktion, eine Streptavidin/Avidin-Wechselwirkung oder ähnliches oder auch eine kovalente Bindung mit dem als Vorbeschichtung aufgebrachten ersten Partner des Bindepaares eingehen kann. So kann beispielsweise als Vorbeschichtung Streptavidin oder Avidin aufgebracht werden und das Rezeptormolekül enthält einen Biotinanteil.

In dem vorliegenden, erfindungsgemäßen Verfahren wird die Summe aller Bindepartner bzw. der nachzuweisenden Antigene der gesamten Testfelder wird als B_nx (B_nx = B_n1 + B_n2 + B_n3, ... usw.) definiert. Jedes Testfeld enthält somit eine bestimmte Sorte B_nx, z.B. enthält das Testfeld 1 den Bindepartner bzw. das Antigen B_n1, das Testfeld 2 den Bindepartner bzw. das Antigen B_n2, das Testfeld 3 den Bindepartner bzw. das Antigen B_n3 usw.. In dem jeweiligen Testfeld liegt somit keine Mischung verschiedener Antigene B_nx, sondern nur eine spezifische Sorte eines Bindepartners vor. Der spezifische Bindepartner kann in mehreren Testfeldern z.B. in einer Reihe enthalten sein, so dass mehrere identische Spots vorliegen können. Falls erwünscht besteht jedoch auch die Möglichkeit gemischte Spots anzuwenden, d.h. das in einem Testfeld verschiedene Antigene enthalten sind. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet somit ein universelles Nachweisverfahren, da Antigen-spezifische-Antikörper, die mit einer Vielzahl von Bindepartnern (B_nx) spezifisch bindefähig sind, mit nur einem Bindepartner B₂ nachgewiesen werden können.

Im erfindungsgemäßen Beispiel werden beispielsweise Autoantikörper gegen die antinukleäre Antigene Jo-1 und Scl70 nachgeweisen. Der Antikörper gegen Jo-1 richten sich gegen das Enzym histidyl-tRNA Synthease, während Scl70 ist ein Marker für Sklerodermie ist.

Antinukleäre Antikörper (ANA) sind Autoantikörper, die gegen verschiedene Zellbestandteile gerichtet sind, wie z.B. der sog. LE-Faktor bei Lupus erythematodes visceralis. Die Spezifität dieser antinukleären Faktoren (ANF) ist sehr heterogen, bisher wurden über 30 mit ANF reagierende Antigene bekannt. Diese sind dem Fachmann geläufig und sind z.B. im Biotest -Lexikon der Immunologie- auf Seite 145 beschrieben. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch Autoantikörper, d.h. die typischen Autoimmun-Antikörper, aber auch anti-Schilddrüsen-Antigene, anti-Inselzell-Antigene usw. nachgewiesen werden. Das Verfahren bietet des Weiteren auch die Möglichkeit Antikörper gegen bestimmte Erreger wie Toxoplasmose-, Rubella- und Chlamydia-Infektionen zu erfassen.

Der Nachweis des Bindepartners B₂ im erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt über dem Fachmann bekannten Methoden. Hierbei wird an den Bindepartner B₂ eine die Markierung gebunden. Alle dem Fachmann geläufigen Markierungen können Verwendung finden, die eine ortsspezifische Markierung der Spots erlauben. Bevorzugt wird als Markierung eine direkt nachweisbare Substanz, beispielsweise eine chemilumineszierende, fluoreszierende oder radioaktive Substanz oder ein Metallsol-, Latex- oder Goldpartikel eingesetzt. Die Verfahren zur Markierung des Bindeparners B₂ sind dem Fachmann geläufig und bedürfen hier keiner weiteren Erklärung. Der Nachweis der Markierung erfolgt in an sich bekannter Weise direkt durch Messung der chemilumineszierenden, fluoreszierenden oder radioaktiven Substanz oder des Metallsol-, Latex- oder Goldpartikels und ist in US0017616 (Karl et al.,), 0304202 B1, EP0736176 B1 , EP0608370 B1 (Ekins et al.,), EP0939319 (Hornauer et al.) beschrieben.

Der Nachweis der Markierung kann auch auf indirekte Weise erfolgen. Dabei bindet ein weiterer Bindepartner, der selbst wiederum mit einer signalerzeugenden Gruppe gekoppelt ist, spezifisch an eine Markierung von B₂, bespielsweise ein Hapten wie Digoxigenin. Der Nachweis der signalerzeugenden Gruppe, beispielsweise eine chemilumi neszierende, fluoreszierende oder radioaktive Substanz oder ein Enzym oder Goldpartikel, erfolgt nach dem Fachmann geläufigen Methoden. Als weiterer Bindepartner kann beispielsweise ein Antikörper oder ein Antikörperfragment eingesetzt werden, der spezifisch an die Markierung von B₂ bindet, beispielsweise ein Antikörper, der gegen Digoxigenin oder gegen das Hapten gerichtet ist.

Der Bindepartner B_nx ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren an eine Festphase gebunden. Dabei kann B_nx direkt an der Festphase gebunden sein. Die direkte Bindung von B_nx an die Festphase erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden. Die Bindung von B_nx an die Festphase kann auch indirekt über ein spezifisches Bindungssystem erfolgen. In diesem Fall ist B_nx ein Konjugat, das das Antigen und einen Reaktionspartner eines spezifischen Bindungssystems enthält. Unter einem spezifischen Bindungssystem werden hier zwei Partner verstanden, die spezifisch miteinander reagieren können. Das Bindungsvermögen kann dabei auf einer immunologischen Reaktion oder auf einer anderen spezifischen Reaktion beruhen. Solche Reaktionspartner und deren Verwendung in Immunassays zur Beschichtung von Testträgern mit spezifischen Antigenen oder Antikörpern sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt wird als spezifisches Bindungssystem eine Kombination von Biotin und Avidin oder Biotin und Streptavidin verwendet. Weitere bevorzugte Kombinationen sind Biotin und Antibiotin, Hapten und Anti-Hapten, Fc-Fragment eines Antikörpers und Antikörper gegen dieses Fc-Fragment oder Kohlenhydrat und Lectin. Einer der Reaktionspartner dieses spezifisch bindefähigen Paares ist dann Teil des Konjugates, das den Bindepartner B_nx bildet. Der andere Reaktionspartner des spezifischen Bindungssystems ist an den Träger gebunden. Die Bindung des anderen Reaktionspartners des spezifischen Bindungssystems an ein Trägermaterial kann nach den üblichen, dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen werden. Hierbei ist sowohl eine kovalente als auch eine adsorptive Bindung geeignet.

Als Proben können alle dem Fachmann bekannten biologischen Flüssigkeiten verwendet werden. Bevorzugt werden als Probe Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Blutserum, Blutplasma, Urin, Speichel, Liquor etc. eingesetzt.

In den Testansätzen können neben der Probe, der Festphase und den aufgeführten Rezeptoren weitere, je nach Anwendung benötigte Zusätze wie Puffer, Salze, Detergenzien, Proteinzusätze wie beispielsweise RSA vorhanden sein. Die notwendigen Zusätze sind dem Fachmann bekannt oder können von ihm auf einfache Weise herausgefunden werden.

Weiterhin umfasst die Erfindung einen Testkit zur Bestimmung von Antigenspezifischen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in einer Probe mittels eines Immunassays im Arrayformat, enthaltend einen Träger auf dem auf verschiedenen diskreten Bereichen verschiedene Bindepartner B_nx gebunden sind, Nachweisreagenzen in getrennten Behältern, sowie den Bindepartner B₂, der eine Markierung trägt und Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet. Des Weiteren umfasst der Testkit Kontrollen und Standards, sowie Reagenzien in einer und/oder mehreren Lösungen mit den üblichen, dem Fachmann geläufigen Testzusätzen wie Puffer, Salze, Detergenzien etc..

Die Erfindung wird durch folgende Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Herstellung monoklonaler Maus-IgM-Antikörper mit Rheumafaktor-artiger Spezifität
Immunogen: H-IgG-Polymer
10 mg humanes IgG1 (Firma Sigma) werden in 0.6 ml 25 mM Bicarbonatpuffer pH 9.5 gelöst. Nach Zusatz von 3.5 μl 12.5%iger Glutardialdehydlösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird im Eisbad gekühlt, mit 50 mM Triethanolamin-Lösung pH 8.0 auf pH 8.3 eingestellt und 0.15 ml frisch bereitete Natriumborhydrid-Lösung (8 mg Borhydrid/ml Wasser) zugesetzt. Nach 2.5 Stunden bei 0°C wird der Ansatz 16 Stunden bei 4° gegen 10 mM Kaliumphosphatpuffer/0.2 M NaCl, pH 7.5 dialysiert. Das IgG Polymer enthaltende Dialysat wird in Aliquoten bei –80°C gelagert bzw. zur Immunisierung und für Spezifitätstests in Kulturüberständen von Hybridomazellen eingesetzt.
Ausgehend von humanem IgG3 (Firma Sigma) wird in analoger Weise H-IGG3-Polymer erzeugt.
Immunisierung von Mäusen
12 Wochen alte, weibliche Balb/c-Mäuse werden mit 100 μg H-IgG1 bzw. IgG3-Polymer zusammen mit dem Adjuvans CFA (Komplettes Freund'sches Adjuvans) intraperitoneal erstimmunisiert. Nach 8 Tagen folgt eine weitere Immunisierung mit 100 μg des jeweiligen IgG-Polymers in CFA. 13 Tage nach der Erstimunisierung werden 200 μg des jeweiligen Polymers intraperitoneal ohne Adjuvans verabreicht, 14 Tage und 15 Tage nach der Erstimmmunisierung je 100μg intraperitoneal und intravenös. Nach 16 Tagen erfolgte die Fusion.
Herstellung der Hybridomaklone
Fusion und Klonierung
Die Fusion von Milzzellen einer immunisierten Maus mit Myelomzellen erfolgt in Anlehnung an Galfré, Methods in Enzymology 73, 1981, 3. Dabei werden ca. 1 × 10⁸ Milzzellen der immunisierten Maus mit 2 × 10⁷ Myelomzellen (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL1580) gemischt und abzentrifugiert (10 min bei 300 g und 4°C). Die Zellen werden dann einmal mit RPMI-1640-Medium ohne fötalem Kälberserum (FKS) gewaschen und bei 400 g in einem 50 ml Spitzröhrchen erneut abzentrifugiert. 1 ml PEG (Poly ethylenglykol) (Molekulargewicht 4000, Merck, Darmstadt) dazugegeben, und durch Pipettieren gemischt. Nach 1 min im Wasserbad bei 37°C werden 5 ml RPMI 1640 ohne FKS zugetropft, durchmischt, auf 50 ml mit Medium (RPMI 1640 + 10% FKS) aufgefüllt und anschließend zentrifugiert. Die sedimentierten Zellen werden in RPMI 1640 Medium mit 10% FKS aufgenommen und in Hypoxanthin-Azaserin-Selektions-Medium (100 mmol/l Hypoxanthin, 1 μg/ml Azaserin in RPMI 1640 + 10% FKS) eingesät. Als Wachstumsfaktor wird dem Medium Interleukin 6 (100 U/ml) zugegeben. Nach ca. 10 Tagen werden die Primärkulturen auf spezifische Antikörpersynthese getestet. Primärkulturen, die mit aggregiertem, humanen IgG1 eine positive Reaktion zeigen, aber mit monomerem IgG keine Kreuzreaktion aufweisen, werden mittels fluoreszenzaktiviertem Zellsorter in 96er-Zellkulturplatten kloniert. Hierbei wird dem Medium als Wachstumszusatz Interleukin-6 (100 U/l) zugegeben.
Auf diese Weise wurden folgende Hybridoma-Klone erhalten: Tabelle 1
Screening-Test für monoklonale Antikörper mit Spezifität für aggregiertes, humanes IgG
Streptavidin-beschichtete MTP werden mit biotinyliertem humanen IgG1 bzw. IgG3 beschichtet. Danach erfolgt die Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper im Zellkulturüberstand. Anschließend werden die gebundenen Antikörper mittels eines anti-Maus-IgM-POD in üblicher Weise durch Umsetzung mit POD-Substrat nachgewiesen.
Bestimmung der Subklassen-Spezifität mit Festphasen-gebundenem humanen IgG
Um die Spezifität der Antikörper im Kulturüberstand der Hybridomzellen zu bestimmen, werden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete MTP (Firma MicroCoat, Best.-Nr. 12-K 96 N) mit 1 μg/ml biotinyliertem h-IGG (= H-IGG-Bi) der Subklasse 1 bzw. 2 bzw. 3 oder 4 in Inkubationspuffer beschichtet. Da über Biotin an Festphase gebundenes IgG sich wie aggregiertes, polymeres IgG verhält, kann dieser Versuchsansatz zur Bestimmung der Subklasse-Spezifität verwendet werden. Hierbei werden 100 μl H-IgG-Bi-Lösung pro Well 60 min bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 mal mit 0,9 % NaCl/0,05% Tween 20 gewaschen.
Im nächsten Schritt wird 100 μl der zu untersuchenden Antikörper-Lösung (Kulturüberstand) in ein beschichtetes Well gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9 % Natriumchlorid/0,05% Tween 20 wird zum Nachweis von gebundenem Antikörper aus der Probe jeweils 100 μl eines POD-markierten (Fab')2-Fragments eines polyklonalen Antikörpers aus der Ziege gegen Maus-IgM (Firma Dianova, Id.Nr. 115-036-075, eingesetzte Konzentration 0,16 μg/ml Inkubationspuffer) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 × mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween^® 20 gewaschen.
Schließlich werden jeweils 100 μl/Well ABTS^®-Substrat (Roche Diagnostics GmbH, Kat.-Nr. 1684 302) zugegeben und nach 30 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen.
Inkubationspuffer:

40 mM Na-Phosphat, pH 7.4
200 mM Na-Tartrat
0.1% Tween20
0.2% Rinderserumalbumin

Bestimmung der Reaktivität/Kreuzreaktion mit monomerem, humanen IgG1
Um die Reaktivität/Kreuzreaktion mit monomerem, nicht aggregiertem H-IgG1 zu bestimmen wird im oben beschriebenen Test der zu untersuchende monoklonale Antikörper mit monomerem, nicht aggregierten IgG1 in steigenden Konzentrationen bzw. im Überschuß vorinkubiert. Bleibt das Meßsignal unverändert hoch, liegt keine Kreuzreaktion vor, ist das Meßsignal erniedrigt, liegt eine Kreuzreaktion vor.
Dazu werden mit rekombinantem Streptavidin beschichtete Mikrotiterplatten (MTP) (Firma MicroCoat, Best.-Nr. 12-K 96 N) mit 1 μg/ml biotinyliertem H-IgG1 (= H-IgG1-Bi) in Inkubationspuffer beschichtet. Hierbei werden 100 μl der H-IgG1-Bi-Lösung pro Well eingesetzt und 60 min bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 mal mit 0,9 % NaCl/0,05% Tween 20 gewaschen.
Der auf Kreuzreaktion zu prüfende monoklonale Antikörper wird mit einer Konzentrationsreihe von bis zu 1 μg/ml monomerem, nicht aggregierten IgG1 vorinkubiert. Die Vorinkubation erfolgt in unbeschichteten 96er-MTP-Wells für 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln.
Von dieser Lösung (Antikörper + nicht aggregiertes, monomeres IgG1 im Überschuß) wird im nächsten Schritt 100 μl in ein beschichtetes Well gegeben und 1 h bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Nach 3-maligem Waschen mit 0,9 % Natriumchlorid/0,05% Tween 20 wird zum Nachweis von gebundenem Antikörper aus der Probe jeweils 100 μl eines POD-markierten (Fab')2-Fragments eines polyklonalen An tikörpers aus der Ziege gegen Maus-IgM (Firma Dianova, Id.Nr. 115-036-075, eingesetzte Konzentration 0,16 μg/ml Inkubationspuffer) zugegeben, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert und anschließend 3 mal mit 0,9% Natriumchlorid/0,05% Tween^® 20 gewaschen.
Schließlich werden jeweils 100 μl/Well ABTS^®-Substrat (Roche Diagnostics GmbH, Kat.-Nr. 1684 302) zugegeben und nach 30 min bei Raumtemperatur die Extinktion bei 405/492 nm in einem MR700 Microplate Reader der Firma Dynatech gemessen.
Die im Sinne der Erfindung tauglichen monoklonalen, Rheumafaktor-artig bindenden Antikörper erkennen alle humanen IgG-Subklassen und zeigen im Kompetitionstest weniger als 10% Kreuzreaktion zu monomerem H-IGG. Wird bei der Bestimmung der Reaktivität H-IgG1-Polymer eingesetzt, so erniedrigt sich das Mess-Signal stark. Tabelle 1 weist die wesentlichen Eigenschaften der gefundenen monoklonalen Antikörper auf.
Fermentation von Hybridoma-Klonen zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern
Die erhaltenen Hybridomzellen werden mit einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro ml in RPMI 1640-Medium mit 10% FKS eingesät und 7 Tage lang in einem Fermenter (Firma Thermodux, Wertheim/Main, Modell MCS-104XL, Best.-Nr. 144-050) vermehrt. In dem Kulturüberstand werden Konzentrationen von durchschnittlich 100 μg monoklonaler Antikörper je ml erreicht.
Isolierung von monoklonalem MAK<H-Agg.-IGG>M-...IgM
1 l Kulturüberstand mit > 50 μg/ml des fermentierten monoklonalen IgM werden bei Raumtemperatur mit 70 g feingemahlenem Polyethylenglycol 6000 (Firma Merck) versetzt. Das nach 45 Min. ausgefällte IgM wird durch Zentrifugation abgesetzt und in 50 ml TRIS-Puffer (20 mM TRIS/0.2 M NaCl/25 mM Glycin/2% Saccharose, pH 8) gelöst. Aus dieser Lösung wird das IgM ein zweites Mal mit 6.5% Polyethylenglycol 6000 gefällt und durch Zentrifugation abgesetzt. Dieser Niederschlag wird in 5 ml TRIS-Puffer gelöst und gegen denselben Puffer dialysiert.
Das Dialysat wird klar zentrifugiert und über eine Superose 6-Säule (Firma Amersham Biosciences) mit Bettvolumen 350 ml chromatographiert. Betriebspuffer ist 75 mM HEPES/0.25 M NaCl/3% Saccharose, pH 7.5. Die Fraktionen des IgM-Peaks mit Molekulargewicht 900 000 werden gepoolt und durch Ultrafiltration zu 5 mg/ml konzentriert. Die Lagerung der IgM-Lösung erfolgt in Aliquoten bei –80°C.
Herstellung von biotinyliertem H-IGG (= H-IgG-Bi)
5 mg H-IgG der Subklasse 1 bzw. 2 bzw. 3 bzw. 4 (Firma Sigma), gelöst in 2 ml 0.1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8.3, werden mit 50 μl einer 2.67 mM Lösung von Biotinylamino-3,6-dioxaoctanylaminocarbonylheptansäure-N-hydroxysuccinimidester in Dimethylsulfoxid versetzt und 60 Min. bei 25°C gerührt. Das Verhältnis von IgG zu aktiviertem Biotin beträgt 1:4. Das entstandene IgG-Bi wird dialysiert bei 4° gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer/0.1 M NaCl/3% Saccharose, pH 7.5. Das dialysierte IgG-Bi wird in Aliquoten bei –80°C gelagert.
Herstellung von MAK<H-Agg.-IgG>M-3.022.5-IGM-Digoxigenin (IgM-Dig)
5 mg MAK<H-Agg.-IgG>M-3.022.5-IgM werden mit 0.1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8.6 auf 2 ml Gesamtvolumen eingestellt. Dieser Lösung wird 50 μl einer 1.11 mM Lösung von Digoxigenin-3-O-methyi-carbonyl-ε-aminocapronsäure-N-hydroxysuccinimidester in Dimethylsulfoxid zugeben und anschließend 60 Min. bei 25°C gerührt. Das Verhältnis von IgM zu aktiviertem Digoxigenin beträgt 1:10. Das entstandene IgM-Digoxigenin wird bei 4°C gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer/0.1 M NaCl/3% Saccharose, pH 7.5 dialysiert. Das dialysierte IgM-Dig wird in Aliquoten bei -80°C gelagert.
Beispiel 2
Auf einen schwarzeingefärbten Polystyrolträger wurde auf einer Testfläche von ca. 2,5 × 6mm eine vollflächige Streptavidin Beschichtung aufgebracht. Auf der Testfläche wurden Linien gleicher Spots, ungefähr 20 pro Linie, bestehend aus biotinylierten Antigenen im Ink-Jet Verfahren aufgetragen, der Durchmesser pro Spot beträgt ca.150μm. Anschließend wurde die Probe mit dem Probenverdünnungspuffer im Verhältnis 1:10 verdünnt und 40μl der verdünnten Probe von Hand in den jeweiligen Chip pipettiert. Die übrige Assaybearbeitung fand auf einem Laborbreadboard Wascher-Inkubator statt.

Folgende testspezifische Reagenzien wurden verwendet:

Probenverdünnungspuffer:	50mM Tris, pH 7,6; 150mM NaCl; 0,1% Detergenz (Polydocanol); 0,6% RSA; 0,2% Konservierungsmittel (Oxypyrion und Methylisothiazolon-Hydrochlorid (MIT))
Waschpuffer:	10mM Tris, 0,01% Polydocanol, 0,001% Oxypyrion, 0,001% MIT
Proben:	Humanseren, die positive Proben sind kommerziell erhältlich bei den negativen Proben handelt es sich um interne Spender

Als biotinylierte Antigene wurden natives Jo1 und natives Scl70 verwendet. Der Nachweis der Autoantikörper gegen diese antinukleäre Antigene fand im indirekten Testformat statt. Es wurden je100μg/ml des jeweiligen biotinylierte Antigens in der Spotlösung eingesetzt. Zusätzlich wurde in diesem Beispiel der TSH-Test zur Überprüfung der erfindungsgemäßen Vorteile mitgeführt. Der TSH-Test stellt höchste Ansprüche and die Sensitivität eines Assaysystems und ist damit die ideale Meßgröße für die Optimierung des Nullwertes.
Beschreibung der Testführung:
Die Proben wurden 6 min bei 37°C inkubiert. Nach dem Absaugen der Probe und dem Waschen des Testfeldes mit dem Waschpuffer erfolgte die Inkubation mit dem Bindepartner B2, einem mit Digoxin markierten Antikörper, für 3 min bei 37°C mit einem anschließendem Waschschritt. Nach Inkubation mit einem Fluoreszenz-markiertem <Dig> Antikörper für 3 min. bei 37°C und anschließendem Waschen und Trockensaugen des Testfeldes wurden die Signale mittels CCD-Kamera detektiert. Die Proben wurden für die Messung 1:10 mit dem Probenverdünnungspuffer verdünnt.
Tabelle 2: Testergebnis bei Verwendung des monoklonalen humanen Antikörpers <H-IgG PAN>M-R10Z8E9-IgG-Dig:
Die in Tabelle 2 dargestellten Signale wurde bei Verwendung des monoklonale Antikörpers <H IgG PAN>M-R10Z8R9-IgG-Dig erzielt. Bei Verwendung dieses Antikörper wurden extrem hohe Hintergrundsignale sowohl im TSH-Test als auch auf den Stellen des Polystyrolträgers, wo keine Spots aufgebracht waren, festgestellt („Background global", rechte Spalte der Tabelle 2). Auch in den beiden indirekten Testformaten Jo-1 und Scl70 zeigten die Negativkontrolle und die negative Störprobe mit diesem Antikörper noch hohe Hintergrundssignale auf. Aufgrund dieser sehr hohen Hintergrundsignale ist keine Messung niedriger Konzentrationen an Analyt möglich, da niedrige Signale schwach positiver Proben im Hintergrundsignal überlagert werden. Dadurch ist die Sensitivität der Tests mit dem Anti körper <H IgG PAN>M-R10Z8R9-IgG-Dig für eine routinemäßige, Labor-diagnostische Anwendung nicht ausreichend.
Tabelle 3: Testergebnis mit dem monoklonalen humanen Antikörper <H-Agg.-IgG>M3.022.5-IgM
Die in Tabelle 3 dargestellten Signale wurden bei Verwendung des Antikörpers Maks <H-Agg.-IgG>M3.022.5-IgM erzielt. In diesem Versuch konnte das Hintergrundsignal wesentlich gesenkt und von Probe zu Probe gleichmäßig hoch gestaltet werden, die Sensitivität erreichte die gewünschten Grenzen. Auf dem Sandwich-Assay (TSH) und den indirekten Testen (Jo-1 und Scl70) sind unspezifischen Bindungen bei der Negativkontrolle und der negative Störprobe nicht mehr oder vernachlässigbar nachweisbar. Auch das Hintergrundsignal „Background global" konnten mit diesem Antikörper deutlich reduziert werden.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Antigen-spezifischen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in einer Probe mittels eines Immunassays im Arrayformat, bei dem auf einem Träger auf verschiedenen diskreten Bereichen verschiedene Bindepartner B_nx gebunden sind, wobei B_nx jeweils die verschiedenen Antigene enthalten, die mit den nachzuweisenden Antikörpern spezifisch bindefähig sind, durch Inkubation des Trägers mit der Probe und einem Bindepartner B₂, der eine Markierung trägt und anschließendem Nachweis der Markierung auf den jeweiligen diskreten Bereichen, dadurch gekennzeichnet, dass als B₂ ein Bindepartner verwendet wird, der Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass B₂ ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass B₂ ein neo-Epitopspezifischer Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass B₂ ein Antikörper mit niedriger Affinität ist, der mindestens zwei, bevorzugt mindestens vier und besonders bevorzugt 10 und mehr Paratope besitzt.
Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass das als spezifisches Bindesystem für die Bindung von B_nx an der Festphase Biotin/Streptavidin; (Biotin/Avidin, Hapten/Antihapten; Fc-Fragment eines Antikörpers/Antikörper gegen dieses Fc-Fragment; Kohlenhydrat/Lectin) verwendet wird.
Verfahren nach einem der vorgehenden Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindepartner B₂ mit einer chemilumineszierenden, fluoreszierenden oder radioaktiven Substanz markiert ist.
Verfahren zur Reduktion des Nullwerts in einem Immunoassay im Arrayformat, dadurch gekennzeichnet, dass als B₂ ein Bindeparner verwendet wird, der Antigen-spezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet.
Verwendung eines Bindepartners B₂, der eine Markierung trägt und Antigenspezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet, in einem Immunassay zum Nachweis von Antigen-spezifischen Antikörpern im Arrayformat zur Reduktion des Nullwerts.
Verwendung eines Bindepartner B2 nach Anspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass als B2 entweder ein neo-epitop-spezifischer Antikörper oder ein Antikörper mit niedriger Affinität ist, der mindestens zwei, bevorzugt mindestens vier und besonders bevorzugt 10 und mehr Paratope besitzt.
Testkit zur Bestimmung von Antigen-spezifischen Antikörpern einer bestimmten Immunglobulinklasse in einer Probe mittels eines Immunassays im Arrayformat, enthaltend einen Träger auf dem auf verschiedenen diskreten Bereichen verschiedene Bindepartner B_nx gebunden sind, Nachweisreagenzen in getrennten Behältern, sowie den Bindepartner B₂, der eine Markierung trägt und Antigenspezifisch gebundene Antikörper einer bestimmten Immunglobulinklasse spezifisch bindet.