JP5467365B2 - 抗原抗体複合体を分離する方法 - Google Patents

Description

本発明は、黄色ブドウ球菌由来のプロテインＡのＥドメイン遺伝子の変異体であって、抗原抗体複合体に選択的に結合する抗原抗体複合体結合蛋白質を含む、抗原抗体複合体を分離する方法に関するものである。

目的とする抗原を定量する方法として、例えば免疫反応を利用した、ＥＬＩＳＡによるサンドイッチ法や競合法などがあげられる。（特許文献１）。

特許第３９９８２４５号公報

しかし、背景技術に記載の免疫反応を利用したＥＬＩＳＡ測定法では、一次抗体の固定化、抗原抗体反応、２次抗体の固定化といったステップの合間に洗浄工程（Ｂ／Ｆ（バインディング／フリー）分離）が必須であることで測定時間がかかる、操作が煩雑になるといった問題があった。

そこで、本発明は、上記従来の問題点に鑑み、抗原抗体複合体に結合する抗原抗体複合体結合蛋白質を含み、Ｂ／Ｆ分離を省略することで測定時間を短縮することができる抗原抗体複合体を分離する方法を提供することを目的とする。

上記従来の課題を解決するために、本発明の抗原抗体複合体を分離する方法は、複数のエピトープを有する抗原と、前記抗原を認識するマウス由来の抗体と、前記抗原と前記抗体が反応することにより形成される抗原抗体複合体と結合する抗原抗体複合体認識蛋白質と、前記抗体が液体により溶出するよう塗布された基板部位ａと前記抗原抗体複合体認識蛋白質が固定化された基板部位ｂを含む基板と、前記基板部位ａおよび前記基板部位ｂを繋ぐように覆う流路を有し、前記抗原を含む溶液を前記基板部位ａへ流し込む工程Ｘと、
前記溶液により前記抗体を溶出させ前記抗原と反応させる工程Ｙと、前記溶液が流れる下流に位置する前記基板部位ｂにおいて前記抗原抗体複合体と前記抗原抗体複合体認識蛋白質を反応させる工程Ｚから構成され、抗体単体と抗原抗体複合体を分離する。

本構成によって、Ｂ／Ｆ分離を必要とせず、短時間で抗体単体と抗原抗体複合体を分離することができる。

本発明によれば、抗原抗体複合体結合蛋白質は抗原抗体複合体に対して結合し、抗原抗体複合体を分離する方法を提供することができる。

本発明の免疫測定方法における実施の形態を示す図 本発明の免疫測定方法における実施の形態を示す図 本発明の免疫測定方法における実施の形態を示す図 本発明の免疫測定方法における実施の形態を示す図 本発明の一実験例の結果を示す図 本発明の一実験例の結果を示す図 本発明の一実験例の結果を示す図 本発明の一実験例の結果を示す図 本発明の一実験例の結果を示す図

以下において、本発明の実施の形態について説明する。

ランダム変異導入遺伝子ライブラリーの作製
テンプレート遺伝子としてプロテインＡのＥドメインを使用した。

ランダム変異を導入するために、プロテインＡのＥドメイン５’側および３’側に結合する２つのプライマーと変異導入酵素（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈｏ ＩＩ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、エラープローンＰＣＲを３回行った。

上記プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子群２０３をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクター１０１（アジレント・テクノジー社）のＭＣＳ１０２に存在する制限酵素サイトＥｃｏＲＶ２０１へ導入するため、メガプライマーとしてプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子群、テンプレートとしてプロテインＡのＥドメイン遺伝子が導入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクター１０１、酵素としてＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ（タカラバイオ株式会社）を用いたＰＣＲによって行った。

図１にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクター１０１のマップを示す。

図２にＭＣＳ１０２におけるプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子群２０２の導入箇所である制限酵素サイトＥｃｏＲＶ２０１を示す。

ＰＣＲ後、テンプレートのプラスミドベクターがプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子群２０２に混入することが無いよう、酵素ＤｐｎＩにて処理を行い、テンプレートを消化した。
蛋白質発現を行う遺伝子の選択
上記ＰＣＲにより獲得したプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子群が導入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクター群から、蛋白質発現する遺伝子を選択するために、遺伝子配列を解読した。

遺伝子配列を解読するために、以下の操作を実施した。

まず、プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子ライブラリーが導入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクター群を、エレクトロポレーション法を用いて、４５ｕＬの大腸菌株ＤＨ１０ｂへ形質導入した。

導入後、ＳＯＣ培地を５００ｕＬ加えて、３０分間３７度でインキュベートした。

インキュベート後、１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢアガー培地へＳＯＣ培地を含む形質導入後の大腸菌株ＤＨ１０ｂを塗布した。

塗布した量は、
ＳＯＣ培地を含む形質導入後の大腸菌株ＤＨ１０ｂを塗布したＬＢアガー培地を、３７度下にて一晩インキュベートした。

インキュベート後、形成した大腸菌コロニーから、ブルーホワイトセレクションにより目視選別した中から２４個のコロニーをランダムに選択した。

選択した２４個のコロニーに含まれるプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子が導入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクターを増幅するため、各コロニーをそれぞれ１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地にて一晩揺動培養した。

揺動条件は、３７度２３０ｒｐｍを用いた。

揺動培養後、ミニプレップキット（キアゲン社）を用いて、各コロニーに含まれるプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子が導入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクターを抽出した。

ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクターに導入されたプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子をシークエンスし、遺伝子配列を特定した。

シークエンスには、ＧｅｎｏｍｅＬａｂ ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ およびＢＥＣＫＭＡＮ製ＣＯＵＬＴＥＲ ＡＣＥ−２０００シークエンサー（ＢＥＣＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いた。

シークエンスの際、ＰＣＲにより遺伝子を増幅するために、プライマーには、フォワードプライマおよびリバースプライマーとして、
Ｔ７ ｏｒｉｇｉｎａｌ：５’−taatacgactcactataggg−３’（配列番号：１）
および、
Ｔ３：５’−aattaaccctcactaaaggg−３’（配列番号：２）
を用いた。

ＰＣＲの条件は、９４℃１ｍｉｎを１サイクルした後， ９５℃３０ｓｅｃ、５５℃３０ｓｅｃ ６０℃１ｍｉｎを３０サイクルとした。

以上の操作により、遺伝子配列を解読した。

解読した２４種類の遺伝子配列の中から、配列が重複して存在したプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子について蛋白質発現し、評価することとした。

本プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子をクローン＃２４とした。

図３にプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の遺伝子配列を示す。
抗原抗体複合体結合蛋白質の作製
上記シークエンスにより選択したプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４を大腸菌蛋白質発現に用いられるｐＥＴ１５ｂベクター（ノヴァジェン社）へ導入した。

本ベクターは、６つヒスチジン遺伝子配列を有するため、目的遺伝子を蛋白質として発現したときに、Ｎ末端側にヒスチジンタグが融合される。

本タグを目的蛋白質が有することにより、ニッケルビーズを用いて目的蛋白質を精製することができる。

以下に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクターからプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４のみを増幅し、増幅した遺伝子をｐＥＴ１５ｂベクターに導入する操作を示す。 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクターからプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４のみを増幅するために、ＰＣＲを用いた。

プライマーには、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとして、
５’−tatGGCCCAGCCGGCCtttttttttGCGGCCGCaagcttcaaccgtaacgaatgctaag−３’
および、
５’−gatccttagcattcgttacggttgaagcttGCGGCCGCaaaaaaaaaGGCCGGCTGGGCCa−３’
を用いた。

ＰＣＲの条件は、９４℃１ｍｉｎを１サイクルした後， ９８℃１０ｓｅｃ、５５℃５ｓｅｃ ７２℃３０ｓｅｃを３０サイクルとした。

ＰＣＲ反応液から核酸電気泳動により増幅したプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４を抽出、精製した。

得られたプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４、およびｐＥＴ１５ｂベクターを２つの制限酵素、すなわちＮｄｅＩ、ＸｈｏＩを用いて消化した。

消化後、プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４とｐＥＴ１５ｂベクターのライゲーションを行った。

以上により、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ （＋）ベクターからプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４のみを増幅し、増幅した遺伝子をｐＥＴ１５ｂベクターに導入した。

プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質発現を行うために、プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４を導入したｐＥＴ１５ｂベクターをエレクトロポレーションを用いて、たんぱく質発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株（インビトロジェン社）へ形質導入した。

以下にプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質の精製方法を記す。

形質導入された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株をＬＢアガー培地上へ塗布し、３７度にて一晩培養した。

培養後、得られた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株コロニーを１つピックアップし、各々５０ｍｌの２ＹＴ培地 （アンピシリン１００μｇ／ｍｌ、クロランフェニコール２５μｇ／ｍｌ）で一晩、３７℃で振とう培養した（ｐｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅ）。

５００ｍｌの２ＹＴ培地 （アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）に１／１００量 （５ｍｌ）のｐｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅした大腸菌液を加え、３７℃で２．５時間振とう培養後、最終濃度が５００μＭになるようにＩＰＴＧを加え、さらに６時間培養した。

遠心により、培養した大腸菌を回収し、５０ｍｌの最終濃度５ｍＭイミダゾールを含む１ｘＰＢＳ （ｐＨ７．４）（ソニケーションバッファー）に再懸濁し、ソニケーションにより菌体を超音波破砕した。

遠心により破砕大腸菌を含む不溶分画を除き、上清を回収した後０．２２μｍのフィルターに通した。

フィルター後の上清を、０．５ｍｌのベットボリュームのＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムに２回通した後、カラムを１ｘＰＢＳ （ｐＨ７．４）で５回洗浄した。

カラム内に結合したプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質を溶出するために、最終濃度３００ｍＭイミダゾールを含む１ｘＰＢＳ （ｐＨ７．４）を用いて、溶出液を１ｍｌずつ４フラクション分回収した。

Ｏ．Ｄ．₂₈₀の吸光度測定により、各フラクションに含まれる溶出蛋白質量を同定した。
ＳＰＲ測定法による測定感度の評価
得られたプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質と抗原抗体複合体との相互作用を評価するために、ＳＰＲ測定を行った。

ＳＰＲ装置はＢＩＡｃｏｒｅ２０００ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いた。

ＢＩＡｃｏｒｅは、一つのセンサーチップに対して４つの測定部位を有する。

得られたプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質をセンサーチップＣＭ５ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に固定化した。

センサーチップは、金基板、デキストラン、カルボキシル基から構成され、金基板上にカルボキシル基を有するデキストランが固定化された構造を有する。

相互作用測定時のバッファーとしてＰＢＳ ０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いた。

測定後、固定化したプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質から抗原抗体複合体を洗浄するための再生液として３Ｍ Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ， １Ｍ Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｐＨ１．８を使用した。

抗原抗体複合体の抗原として（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ） ａｃｅｔｙｌ（ＮＰ）が平均１９．８個アミノカップリングされた牛血清アルブミン（ＮＰ−ＢＳＡ）を用いた。

抗体として抗ＮＰマウスＩｇＧ１（東京理科大作製）を用いた。

以下に得られたプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質をセンサーチップへ固定化する方法を記す。

プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質のセンサーチップへの固定化には、Ａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて行った。

蛋白質を固定化する際、流速は５μｌ／ｍｉｎで行い、ＢＩＡｃｏｒｅの第２番目の測定部位を用いた。

新しいセンサーチップ上へ０．１Ｍ ＮＨＳと０．４Ｍ ＥＤＣとの混合液（ＮＨＳ／ＥＤＣ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社） ３５μｌを流した後、１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ｐＨ８．５ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社） を３５μｌ流し、チップ上の電荷を中和した。

プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質を含むｐＨ４．０の１０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅを流し、センサーチップ上へ約４０００ＲＵ分固定化した。

固定化後、ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを３５μｌ流すことで蛋白質が固定化されていない活性基をブロッキングした。

蛋白質を固定化していない時のチップへの抗原抗体複合体の非特異結合を測定するため、ＢＩＡｃｏｒｅの第１番目の測定部位にＮＨＳ／ＥＤＣ ３５μｌを流した後、ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅを３５μｌ流し活性基をブロッキングした。

以上により、センサーチップ上へ蛋白質を固定化した。

次に、得られたプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質と抗原抗体複合体との相互作用のＳＰＲ測定について以下に記す。

測定時の流速は２０μｌ／ｍｉｎで行った。

抗体である抗ＮＰマウスＩｇＧ１濃度を１００ｎＭに揃え、抗原であるＮＰ−ＢＳＡの濃度を０ｎＭ、および１０倍希釈にて０．０００１−１００ｎＭの間で調整し、各抗原濃度と抗体を反応させ、抗原抗体複合体を作製した。

各濃度の抗原抗体複合体をＢＩＡｃｏｒｅの第１および２番目の測定部位へ流速５０μｌで流し、非特異結合およびプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質との相互作用を測定した。

図４に抗体濃度１００ｎＭとプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質との相互作用４０１、および抗体濃度１００ｎＭと抗原濃度２０ｎＭからなる抗原抗体複合体とプロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質との相互作用４０２を示す。

この結果から、プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質は、抗体単体に対する結合は無く、抗原抗体複合体に対して結合することが分かった。

次に、抗原抗体複合体を１８０秒間センサーチップに流し、抗原抗体複合体を流し始めてから２４０秒後の結合量を２度測定した。

抗原抗体複合体の各濃度における測定値を±２Ｓ．Ｄ．法により検出限界値を求めた。

比較対象として、ネイティブのプロテインＡのＥドメインの蛋白質を上記と同様にセンサーチップに固定化し、同様の測定を実施した。

図５に測定結果を示す。

プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質５０２は、抗原抗体複合体の濃度０．００１ｎＭと０．０００１ｎＭにおいて、結合量に差を有した。

一方、ネイティブのプロテインＡのＥドメイン５０１は、抗原抗体複合体の濃度０．００１ｎＭと０．０００１ｎＭにおいて、結合量に差を有しなかった。

このことから、ＮＰ_19.8−ＢＳＡが検出できることが確認され、ネイティブのプロテインＡのＥドメインの蛋白質に比べて約１０倍結合力が強いことが確認された。

上記の結果から、プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子クローン＃２４の蛋白質は、抗体単体とは結合せず抗原抗体複合体と結合する、ネイティブのプロテインＡ のＥドメインに比べて約１０倍結合力が強いという性質を持ち、本蛋白質が抗原抗体複合体認識蛋白質であることが確認された。
抗原抗体複合体を分離する方法
抗原抗体複合体を分離する方法について、図６から図９を用いて説明する。

図６に示すように、構成は基板６０１と抗原６０２を認識する抗体６０３と抗原抗体複合体認識蛋白質６０４と前記抗体６０３を塗布する部位６０５と前記抗原抗体複合体認識蛋白質６０４を固定化する部位６０６基板上を覆う流路６０７からなる。

図７に示すように、抗原６０２を含む溶液を、ＸからＹの方向へ流す。

基板上流の部位６０５に抗原６０２を認識する抗体６０３を風乾または凍結乾燥により塗布する。これにより、塗布された抗体６０３は、抗原６０２を含む溶液により容易に溶解する。

図８に示すように、溶液中の抗原６０２と溶解した抗体６０３が反応し抗原抗体複合体８０１が形成され、溶液と共に下流へ流れる。

図９に示すように、基板上の抗体６０３が塗布された部位６０５の下流の部位６０６に抗原抗体複合体認識蛋白質６０４を固定化する。固定化方法として、例えば、基板を金とし蛋白質中のアミノ酸システインによるＡｕ−Ｓ結合を用いる、基板をポリスチレンとし蛋白質の吸着を用いる、ということが挙げられる。

図９に示すように、溶液中の抗原抗体複合体８０１は、抗原抗体複合体認識蛋白質６０４と結合し、抗原抗体複合体認識蛋白質６０４が固定化された部位６０６に蓄積する。

一方、抗原６０２と未反応の抗体６０３は、抗原抗体複合体認識蛋白質６０６と結合せず、溶液と共にさらに下流へ流れる。

上記により、Ｂ／Ｆ分離なしで抗原抗体複合体８０１と抗原６０２と未反応の抗体６０３を分離することが可能である。

本発明の抗原抗体複合体を分離する方法を用いれば、図９に記載のようにＢ／Ｆ分離をすることなく、目的の抗原に対して特異的に結合した抗体からなる抗原抗体複合体と抗原非結合の抗体と分離することができ、抗原濃度測定時間の短縮にとって有用である。

１０２ ＭＣＳ、マルチクローニングサイト
１０３ ｌａｃＺ
１０４ ｆ１（＋） ｏｒｉｇｉｎ
１０５ Ａｍｐ
１０６ ｐＵＣ ｏｒｉ

２０１ 制限酵素サイトＥｃｏＲＶ
２０２ プロテインＡのＥドメイン変異遺伝子群

４０１ 抗体と抗原抗体複合体認識蛋白質の相互作用を示すセンサーグラム
４０２ 抗原抗体複合体と抗原抗体複合体認識蛋白質の相互作用を示すセンサーグラム

５０１ ネイティブのプロテインＡのＥドメインと抗原抗体複合体の結合量を示すグラフ
５０２ プロテインＡのＥドメイン変異体遺伝子クローン＃２４の蛋白質と抗原抗体複合体の結合量を示すグラフ

６０１ 基板
６０２ 抗原
６０３ 抗体
６０４ 抗原抗体複合体認識蛋白質
６０７ 流路

８０１ 抗原抗体複合体

Claims (1)

1. 複数のエピトープを有する抗原と、
   前記抗原を認識するマウス由来の抗体と、
   前記抗原と前記抗体が反応することにより形成される抗原抗体複合体と結合する抗原抗体複合体認識蛋白質と、
   前記抗体が液体により溶出するよう塗布された基板部位ａと前記抗原抗体複合体認識蛋白質が固定化された基板部位ｂを含む基板と、
   前記基板部位ａおよび前記基板部位ｂを繋ぐように覆う流路を有し、
   前記抗原を含む溶液を前記基板部位ａへ流し込む工程Ｘと、
   前記溶液により前記抗体を溶出させ前記抗原と反応させる工程Ｙと、
   前記溶液が流れる下流に位置する前記基板部位ｂにおいて前記抗原抗体複合体と前記抗原抗体複合体認識蛋白質を反応させる工程Ｚから構成され、
   前記抗原抗体複合体認識蛋白質の配列が以下の配列番号：５の一次構造を有する蛋白質であることを特徴とする抗原抗体複合体を分離する方法。
   配列番号５：AQHEVTQQNAFYQVLNMPNLNADQRNAFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK

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