JPH0753600A - 二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、二重特異性を有するハイブリッド
モノクローナル抗体を提供することを目的とする。 【構成】 本発明は、二重特異性を有するハイブリッド
モノクローナル抗体を、該ハイブリッドモノクローナル
抗体と二種の単一特異性抗体を約２：１：１の比率で含
む抗体混合物の１成分として、かつこれらの抗体をイオ
ン交換法で分離するのに十分な電荷量の相違があるよう
に産生するポリドーマから得られたことを特徴とする、
二重特異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体を
提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は二重特異性を有する抗体
に関する。別の点で、本発明は免疫診断法及び免疫治療
法に関する。さらに別の点で、本発明はハイブリドーマ
(hybridomas) 及び関連するモノクローナル抗体技術に
関する。

【０００２】

【従来の技術】抗原抗体反応は、さまざまな実際的応用
において日常的に利用され、まだわかっていないが、他
の利用における価値を確立すべく広く研究されている。
例えば、免疫原に対する宿主動物の免疫応答により産生
される血清抗体は、免疫原がほんの少量しか存在しない
溶液からその免疫原を分離するのにアフィニティー精製
法に使用できる。他の場合、免疫原が病気を伴う抗原で
ある場合は、患者の血清または他の体液におけるその存
在をイムノアッセイ又は免疫検定技術 (immuno metric
tech-niques) を使用して検出することができる。例え
ば、放射線免疫検定技術を使用する HBsAgの検出は、現
在におけるえり抜きの方法である。また、ニュージーラ
ンドの白ウサギから得られＩ１３１でラベルした、フェ
リチンに対する血清抗体は、肝臓腫瘍治療の見込みを示
すものとして報告されている。（オーダー(Order）ほ
か、International Journal of Radiation Oncology, B
iology and Physics, ６，７０３（１９８０）参照）。

【０００３】血清抗体は、例えばウサギ、ネズミ類、ま
たは他の哺乳類から得られた血清抗体は性質上“ポリク
ローナル”である。というのはその宿主の免疫系が刺激
されると、その宿主が応答しつつある免疫原上の異った
抗原決定基すなわちエピトープに対して特定抗体の混合
物を産生するからである。その混合物を構成する個々の
抗体はそれぞれＢ細胞クローンの生成物であり、さらに
各Ｂ細胞はただ１つの抗体種しか分泌しない。１つのク
ローンによって産生された抗体は、別のクローンによっ
て産生される同じ抗原に対する抗体とは、そのペプチド
の順序と他方の抗体のペプチドの順序の間に微妙な相違
が少なくとも存在するので異なっている。それゆえ事
実、各抗体種は別個の分子であって、異なる抗体種の間
のペプチドの順序の違いは、それらが認識する特定のエ
ピトープおよびその抗原に対するアフィニティーだけで
なく全体的な特異性にも影響する。

【０００４】あるＢ細胞が純粋な化合物として分泌する
抗体種を得るために、個々のＢ細胞を成長させること
は、現在利用できる組織培養技術を漠然と使用すること
によってはできない。比較的最近、コーラー (Kohler)
とミルスタイン (Milstein) はモノクローナル抗体を
“ハイブリドーマ”と呼ばれる融合した細胞の分泌生成
物として得るのに都合がよい方法を発見し報告した。
（Ｃ．コーラーおよびＣ．ミルスタイーン，Ｎature 、
２５６、４９５（１９７５））。基本的には、この方法
は、免疫したマウスから取った脾細胞をマウスの骨髄腫
の細胞と融合させてハイブリドーマを作ることからな
る。骨髄腫の細胞は、それ自身の免疫グロブリンまたは
その一部を産生しないかあるいは少なくとも分泌しない
ものが好ましい。単一のハイブリドーマをクローニング
することによって得られた細胞を培養すると、同一の抗
体分子が分泌され、これはその後純粋な化合物として容
易に得ることができる。これは、従来の、例えば血清か
らの抗体製造とは大変異なっている。この血清において
は、どの抗体も関連性はあるが別個の化合物のほとんど
分離不可能な抗体混合物の諸成分の１つでしかない。

【０００５】モノクローナル抗体は純粋な化合物なの
で、抗原分子の唯一の部位に対して一定の特異性を有
し、またしっかり決まっているアフィニティーを有す
る。従って、異なるハイブリドーマのクローンをスクリ
ーニングして、所定の応用に対して最も望ましい特性を
有するモノクローナル抗体を産生するものを選別するこ
とができる。ハイブリドーマの永久性は、それが分泌す
る抗体のほとんど無制限な供給を保証し、血清抗体を製
造するのに使用される動物ごとの抗体力価や全体的なア
フィニティーのバラツキに伴う問題を軽減する。ハイブ
リドーマから得られるモノクローナル抗体は例えば、診
断キットに実用的に応用されている。このようなキット
の選択は、この出願の譲受人であるハイブリテク・イン
コーポレーテッド(Hybritech. Inc.) から入手できる。
抗体分子は一般にただ１つの特異性を示すと考えられ、
その特異性は宿主の免疫系が抗体を産生することによっ
て応答した免疫原に対して示される。抗体は２つの同一
の半分から成り、その各々が重鎖と軽鎖の対を有し、そ
の各々が同じ抗原決定基を他のものとして認識する。

【０００６】

【化１】

【０００７】システイン部分の位置で２つの（Ｈ）鎖を
結合する−Ｓ−Ｓ−ジスルフィドの橋は、試験管内で穏
和な還元により選択的に開裂させることができ、その半
分の分子は次の酸性化により分離される。次いでこの半
分の分子は再び試験管内で中性 pＨにおいて再結合（再
生）することができ、この再結合は非共有結合性相互作
用によっておこる。異なる特異性の抗体を、重鎖の間の
ジスルフィド架橋の選択的開裂およびその後に設定され
た再生に至る条件に供するならば、半分子間の再結合が
不規則におこって抗体の集団が生ずることがあり、その
うちの少くともいくつかはある特異性の抗体分子の半分
が異なる特異性の抗体分子の半分と結合している点で混
成（ハイブリッド）である。例えば、ニソノフ (Nisono
ff) 外、『抗体分子』(“The Antibody Molecule”) 、
Academic Press, New York（１９７５）、２６０〜２６
１頁には、ウサギの抗卵アルブミン抗体と抗ＢＧＧ抗体
のポリクローナル抗体ハイブリッドの生体外製造が記載
されている。ハイブリッドモノクローナル抗体も類似の
方法を使用しても得られている。Ｄ．Ｍ．クランツ (Kr
anz)外、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, ７８、５８０
７（１９８１）参照。少くとも理論的には、抗体の半分
が１つの抗原決定基すなわちエピトープを認識しこれに
結合する一方、他の半分が同じ抗原または別の抗原の異
なったエピトープを認識するので二重の特性を示すこと
になる。

【０００８】ハイブリッド抗体は上述のようにして得る
ことができるが、収量が非常に低いことが多く、その製
造に用いられる反応は再現することが困難で、そのハイ
ブリッド抗体は通常顕著で不可逆的な変性をこうむって
いる。このような変性は免疫反応性を低下させることが
あり、生体内で別の新陣代謝性を示すことが予想され
る。その結果、ハイブリッド抗体は、今日大いに入手困
難な実験上の関心物のまま残っている。二重の特異性を
有する抗体は、タンパク質Ａ（スタフィロコッカス・オ
ーレウスから）、カルボジイミドおよびＮ−スクシンイ
ミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートの
ような二官能性化合物のようなさまざまのカップリング
剤または架橋剤を使用して、完全な抗体、モノクローナ
ルかそうでないもの、の対を接合することにより、抗体
対の各メンバーがその特異性を付与する二量体のあるい
はそれ以上の多量体の抗体を得ることによって製造する
こともできる。例えば、モンドシェ（Mondoche) 外が抗
体とタンパク質Ａとの一連の反応により二重特異性を有
する多価抗体の生成を報告しており、これは試験管内で
細胞の表面抗原を検出できることが示されている。J. I
mmunological Methods, ４２、３55、（１９８１）を参
照。これらの方法によると、一方の特異性の抗体が表面
抗原に結合し、他方が検出を許す部分に結合する。上述
の技術による二重特異性の抗体の合成は、複雑で、商業
的応用からかけ離れたものとなっている。

【０００９】 〔発明の詳細な説明〕まず、本発明は、二重特異性を有
するハイブリッドモノクローナル抗体を、該ハイブリッ
ドモノクローナル抗体と二種の単一特異性抗体を約２：
１：１の比率で含む抗体混合物の１成分として、かつこ
れらの抗体をイオン交換法で分離するのに十分な電荷量
の相違があるように産生するポリドーマから得られたこ
とを特徴とする、二重特異性を有するハイブリッドモノ
クローナル抗体を提供するものである。本発明は、さら
に、モノクローナルハイブリッド抗体を変性なしに高収
量で確実に得られる新規で完全に生物学的な方法を提供
する。この明細書を通じて、“ハイブリッド抗体”の用
語は２つの異なった特異性を有する単一の抗体分子を示
すものとして使用される。個々の特異性は、２つの異な
った抗原上の抗原決定基に対してでも良いしまた同じ抗
原上の異なった抗原決定基（エピトープ）に対してでも
良い。さらに、特記しない限り、“抗原”の用語にはハ
プテンも含まれる。本発明の方法によれば二重特異性を
有するハイブリッド抗体が、予め選択された抗原決定基
に対して抗体を分泌するハイブリドーマ、好ましくは選
択的に破壊可能なハイブリドーマ、と融合可能なＢ−リ
ンパ球又は第２のハイブリドーマとの融合によって第２
世代のハイブリドーマ（以下、“ポリドーマ(polydom
a)”)を形成することにより得られる。Ｂ−リンパ球即
ち第２のハイブリドーマは、異なる抗原決定基に対して
別の抗原を分泌する。本明細書で使用するように、“選
択的に破壊可能なハイブリドーマ”の用語は、そのポリ
ドーマが培養されている培地中で生存する能力を欠いて
いるか、または少くともほとんど欠いているハイブリド
ーマを意味する。私たちは予想外にも、次のことを発見
した。それが誘導されるところの親のハイブリドーマ又
はＢ−リンパ球（これはいずれも単一の特異性を有する
同一の抗原の集団を分泌する）とは違って、このポリド
ーマはさらに二重の特異性、すなわち、親の細胞により
製造された個々の抗体により認識される抗原決定基のい
ずれかとまたは両方の抗原決定基と同時に結合できる能
力を有するモノクローナルハイブリッド抗体を高いパー
センテージで分泌する。このようにして得られたモノク
ローナルハイブリッド抗体は、抗体の半分子の化学的再
結合の方法により得られるハイブリッド抗体の特徴であ
る望ましくない変性を受けていない。さらに本発明の方
法は、ハイブリッドを確実にかつ大量に得るのを可能に
する。

【００１０】本発明によると、二重特異性を有する抗体
を用いる免疫診断法および免疫治療法も提供される。一
般に、これらの方法は標的抗原に対する第一の特異性と
ある物質例えば別の抗原またはハプテンに対する第二の
特異性を有するモノクローナル抗原またはポリクローナ
ル抗原を使用する。該物質は行なおうとする標的抗原の
診断を可能にし、あるいは該物質は標的抗原もしくはそ
れが結合している組織にとって致命的である作用物質の
配達を許容するかまたはそれ自身がそのような作用物質
である。従って、親細胞の適当な選択によって、標的抗
原に対する特異性と、診断または治療上有用な部分 (mo
iety) に対する第２の特異性を有する抗体を分泌するポ
リドーマを本発明によれば得ることができる。また、抗
体の半分子は試験管内の化学的方法を使用して再結合で
き、あるいは個々の完全な単一特異性の抗体を化学的方
法によって結合すなわち架橋でき、本発明によって製造
される二重特異性を有するモノクローナルハイブリッド
抗体と同じ二重特異性を有しかつ同じまたは類似の利用
性を有する抗体の多量体( これは二量体、三量体あるい
はそれ以上の多量体）を得ることができる。

【００１１】本発明で使用するように、“抗体”の用語
は、ＦabまたはＦ(ab)₂ の断片のような免疫化学的性質
を有する抗体断片を含む。よって本発明の目的は、その
製造過程で変性されていないモノクローナルハイブリッ
ド抗体を確実にかつ高収量で得ることである。本発明の
別の目的は、モノクローナルハイブリッド抗体を得る改
良された方法を提供することである。本発明のさらに別
の目的は、二重特異性を有する抗体を使用する免疫診断
法および免疫治療法を提供することである。これらのそ
してまたその他の目的を達成できる方法は、好ましい実
施態様についての以下の記載から明らかであろう。

【００１２】好ましい実施態様の説明 上述のように、本発明によるモノクローナルハイブリッ
ド抗体を得る方法は、１つの親としてハイブリドーマ
を、好ましくは選択的に破壊可能なハイブリドーマを必
要とし、これは予め選択された抗原決定基すなわちエピ
トープに対する単一クローン抗体を分泌するものであ
る。選択的に破壊可能なハイブリドーマを親として使用
すると、選択的に破壊可能なハイブリドーマとＢ−リン
パ球すなわち第２のハイブリドーマとの融合によって得
られる細胞すなわちポリドーマが、融合過程で得られた
細胞を培養した時に、親のハイブリドーマの集団のため
に一面にはびこることになるのを防止でき、また、ポリ
ドーマ細胞を親のハイブリドーマから分離できる方法を
提供するという利点がある。私たちは、本発明で有用な
選択的に破壊可能なハイブリドーマが、古典的なコーラ
ー−ミルスタインの方法により製造される、所望の特異
性の１つを有する抗体を分泌するハイブリドーマ、すな
わち骨髄腫の細胞とマウスの脾細胞中に見い出されるも
ののようなＢ−リンパ球との融合により得られるハイブ
リドーマから得ることができることを見い出した。本発
明の１実施態様によると、このようなハイブリドーマは
選択的に破壊可能であるハイブリドーマを得るために逆
選択法（back selection process) に供される。

【００１３】一般に、選択的破壊可能性は、特に選ばれ
た培地中で生存するのに必要である遺伝要素を欠いてい
るハイブリドーマに対しての逆選択によって得ることが
でき、このとき該培地は、融合によって生産されたポリ
ドーマが選択的に破壊可能なハイブリドーマの融合相手
すなわちＢ−リンパ球つまり第二のハイブリドーマから
の遺伝的寄与によりその中で培養されることができるも
のである。現在好ましい逆選択法は、ハイブリッド抗体
に含ませるべき所望の特異性の１つを有する抗体を分泌
するハイブリドーマを８−アザグアニンを含有する成育
培地中で培養することから成る。このような培地中で、
８−アザグアニンをとり込みそれゆえ該媒体中で成長で
きる細胞はいずれも酵素ヒポキサンチン−グアニン・ホ
スホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠い
たものである。この酵素を欠いている細胞のクローンは
ヒポキサンチン・アミノプリテン・チミジン（ＨＡＴ）
を含有する培地中で成育することができない。従ってこ
れらはこの培地中で選択的に破壊される。

【００１４】逆選択のよく類似した方法は、所望の抗体
を分泌するハイブリドーマを、６−チオグアニン（ＤＮ
Ａにとり込まれたならば細胞にとって有毒であるグアニ
ンの別の類似体）を含有する培地中で成育させることか
ら成る。同様に、この培地中で成育するある細胞はＨＰ
ＲＴ酵素を欠き、これらの細胞のクローンは必然的にＨ
ＡＴ培地に対して感受性である。本発明に使用できるさ
らに別の逆選択の方法は、選択されたハイブリドーマ系
統の細胞をチミン類似体５−ブロモウラシル・デオキシ
リボース（ＢＵｄＲ）または２−アミノプリンのいずれ
かを含有する培地中で成長させることから成る。酵素チ
ミジン・キナーゼ（ＴＫ）を欠いているそれら細胞だけ
がこれら２つのインヒビターのいずれかを含有している
培地中で成育できる。酵素ＨＰＲＴを欠いている細胞の
場合のように、ＴＫを欠いている細胞はＨＡＴ培地中で
成育しない。

【００１５】選択的に破壊可能な親のハイブリドーマを
得る別の方法は、代謝インヒビターを使用する不可逆的
酵素阻害を含む。これらのインヒビターのうち、いわゆ
るＫ_cat インヒビターが好ましい。これらのインヒビタ
ーは酵素の基質の類似体であって標的酵素によって反応
性の高い分子に転化され、これが酵素とその活性点にお
いて反応し該酵素の不可逆的阻害をもたらす。例えば、
選択されたハイブリドーマをアザセリンまたは５−ジア
ゾ−５−オキサ−Ｌ−ノルロイシン（ＤＯＮ) で処理す
ると、酵素の活性点においてシステイン残基と共有結合
を形成することにより、酵素ホルミル・グリシンアミド
・リボヌクレオチド・アミドトランスフェラーザを阻害
する。この阻害は最終的には細胞の死に至る。しかし、
このハイブリドーマを、必要な酵素を供給するポリドー
マの第２の親と融合させることにより救うことができ
る。好ましい実施態様においては、選択的に破壊可能な
ハイブリドーマは、補足性のあるＢ−リンパ球、代表的
には抗原で予じめ免疫された宿主から取られた脾細胞と
して得られたものと融合される。この時抗原は担体タン
パク質に結合したハプテンでも良く、ハイブリッド抗体
中に必要な第２の特異性を有する抗体を産生する免疫応
答をその宿主が発生させるように選択されるものであ
る。宿主は通常マウスであるがウサギ、ヒトおよび他の
動物の種も種間融合が低い安定性を示すことがあるけれ
ども使用することができる。このような宿主を免疫する
方法はもちろん周知であり、その詳細をここで述べる必
要はない。

【００１６】ポリドーマを得るための選択的に破壊可能
なハイブリドーマとＢ−リンパ球との融合は、二群の細
胞を、公知の方法に従ってポリエチレングリコールまた
はセンダイ・ビールスのような細胞の融合を進めるもの
として知られる薬剤を含有する媒体中で組み合わせるこ
とにより行なうことができる。融合を行なったのち、細
胞は培養のためにＨＡＴ培地のような培地に移される。
Ｂ−リンパ球はほんの短期間しか生存せず、親のハイブ
リドーマはこの培地中で成育できない。しかし、融合の
結果として形成されたポリドーマの数は、Ｂ−リンパ球
による、例えば、ＨＰＲＴもしくはＴＫのような失われ
た酵素を作る能力の遺伝的寄与によりまたは親のハイブ
リドーマ中で阻害されていた酵素の直接的寄与による親
のハイブリドーマの補足のために、この培地中で成育さ
せることができる。個々のポリドーマのクローンは培養
され、所望の二重特異性を有する抗体を分泌するものを
選別するためにスクリーニングされる。それの抗体が所
望の二重特異性を示すポリドーマのクローンは、その第
２の特異性すなわちＢ−リンパ球から得られた特異性お
よび親和性が最も望ましいものを選別するためにさらに
スクリーニングされる。

【００１７】別の実施態様においては、ポリドーマは、
選択的に破壊可能なハイブリドーマを適当な融合物質を
使用してやはり選択的に破壊可能である第２のハイブリ
ドーマを融合することにより得られる。第２の親のハイ
ブリドーマは第１のものと同様にして得られる、すなわ
ち逆選択の方法、不可逆的酵素阻害または他のいずれか
の適当な方法により得られる。このような場合、第２の
ハイブリドーマは第１のものを補足することができなけ
ればならない。例えば、第１の選択的に破壊可能なハイ
ブリドーマが酵素ＨＰＲＴを欠いている場合は、ポリド
ーマにＨＰＲＴを出させることができる遺伝子をポリド
ーマへ与えることができなければならない。同様に、第
２の選択的に破壊可能なハイブリドーマが酵素ＴＫを欠
いている場合は、第１のものがＴＫのための遺伝子をポ
リドーマに与えなければならない。選択的破壊性を与え
るのに酵素の不可逆的阻害が行なわれる場合には、２つ
のハイブリドーマの間に同様の補足が存在しなければな
らない。一方のハイブリドーマの親として逆選択法に供
されたハイブリドーマを使用し、他方のハイブリドーマ
として酵素阻害の方法に供されたハイブリドーマを使用
することもできる。ポリドーマのための親として相補的
な選択的に破壊可能なハイブリドーマを使用すると、両
方の親をそれらが産生するモノクローナル抗体の特異性
と親和性に基づいて選択できる利点があり、一方、単一
のハイブリドーマのＢ−リンパ球との融合の場合には、
所望の特異性と親和性の抗体を産生するものを得るため
のＢ−リンパ球間の予備融合選択を行なうことができな
い。

【００１８】２つの選択的に破壊可能なハイブリドーマ
の融合は、やはり公知の方法に従って、ポリエチレング
リコールまたはその他の融合剤を使用して行なうことが
できる。融合後、細胞は２つの親が成育することはでき
ない成育培地へ移されるが、そこでは２つの親の相補的
寄与のために融合後の融合により生じたポリドーマは成
育することができる。これまで私たちは、ポリドーマを
形成するためのハイブリドーマ−ハイブリドーマの融合
における相手となるハイブリドーマの両者として使用す
るための選択的に破壊可能なハイブリドーマを得る選択
方法を論じてきた。しかし、選択的に破壊さるべき第２
のハイブリドーマの親に対する必要性は、第１のハイブ
リドーマの親に優性の遺伝標識と劣性の遺伝標識の両方
を与えることによって除くことができる。現在好ましい
方法はＨＡＴ−ウアバイン選択法である。薬剤ウアバイ
ンは原形質膜のＮa⁺ −Ｋ⁺ 活性化アデノシン三リン酸
分解酵素 (Arpase) の特異的なインヒビターである。こ
の酵素はＫ⁺ の細胞内への移入およびＮa⁺ の細胞から
の移出を司っている。選択的破壊可能性、例えばＨＡＴ
感受性を与えるように予じめ逆選択されたハイブリドー
マの細胞は、ウアバイン抵抗性の細胞を選択するために
ウアバイン培地で育てられる。これら細胞のクローンは
ＨＡＴ感受性であるがウアバイン抵抗性である。対照的
に、それと融合するために選択されるハイブリドーマ
は、ウアバイン感受性であるがＨＡＴ中で生き延び成育
できる。あるいは、ウアバイン抵抗性の選択は、初めに
親の骨髄腫系統かまたはそれから誘導されたハイブリド
ーマのいずれかに行なうことができ、ついで選択的破壊
可能性を与える逆選択または他の方法を行なうことがで
きる。

【００１９】ポリエチレングリコールまたはたの融合剤
中での２つのハイブリドーマの融合によって得られた細
胞は、第２の、ハイブリドーマの親にとって致死濃度で
ウアバインを含有するＨＡＴ培地へ移される。選択的に
破壊可能なハイブリドーマの親は、たとえウアバイン抵
抗性であったとしても例えばＨＰＲＴまたは他の酵素を
欠いているのでＨＡＴ培地中でも生存できない、しか
し、ポリドーマの細胞は酵素と生存に必要なウアバイン
抵抗性を持っているのでこの培地中で成育できる。上述
の方法には、ハイブリッド抗体に望まれる特異性の一方
を有する抗体を分泌する選択的に破壊可能なハイブリド
ーマの親を、ハイブリッド抗体に望まれるもう一方の特
異性を有する抗体を分泌する第２の既製のハイブリドー
マと直接融合させることによってポリドーマを得ること
ができること、およびその第２のハイブリドーマの親に
選択的破壊可能性を与える技術を何ら使用する必要がな
いことの利点がある。ポリドーマを得る別の技術であっ
て万能の親 (universal parent) 、すなわち正の遺伝標
識と負の遺伝標識の両方を持ちどんな既製のハイブリド
ーマとも融合させることができる親を使用する技術に
は、種々の薬剤抵抗性遺伝標識を持っている再結合性Ｄ
ＮＡ媒介動物 (Vector) の使用を含む。例えば、ネオマ
イシン抵抗性の遺伝子を持つＳＶ₄₀を使用できる。

【００２０】現在好ましい万能の親は、ＨＡＴ感受性−
ネオマイシン抵抗性のものである。選ばれた親は、ＨＡ
Ｔ感受性に逆選択されたのち、ネオマイシン抵抗性の遺
伝子を運んでいるＳＶ₄₀ベクターで感染 (transfect)さ
れる。この手順を逆にしてトランスフェクションを最初
にすることができる。生ずるハイブリドーマは、通常哺
乳動物の細胞にとって有毒であるネオマイシンの存在下
で成育することができるが、ＨＡＴの存在下では死ぬ。
しかし、既製のハイブリドーマはＨＡＴ中で成育するが
ネオマイシンの存在下では死ぬ。従ってこれら親の融合
の生成物はＨＡＴとネオマイシンの存在下で生存する。
ネオマイシンに対する抵抗性を移すのにベクターを使用
することが現に好ましいが、哺乳動物の細胞に他の薬剤
に対する抵抗性を与える遺伝子を有するベクターを使用
することもできる。現に好ましいとはいっても、親は細
胞系統の少くとも１つが選択的に破壊可能であることは
ハイブリドーマの対からポリドーマを得る本発明の方法
にとって必須ではない。そのいずれもが選択的に破壊可
能ではないがハイブリッド抗体において必要な選択性の
ひとつを有する抗体を分泌する１対のハイブリドーマを
適当な融合剤の存在下で融合させたのちに、融合されて
いない親のハイブリドーマがポリドーマを確認するため
にサブクローンをスクリーニングすることが実際的でな
い程度まで増加する前にすべての細胞のサブクローニン
グを行なうことは本発明の範囲内である。その後にサブ
クローンがスクリーニングされて、どれが二重特異性を
有する抗体を分泌するか確認する。

【００２１】この方法は、親の細胞の融合頻度が高い時
はポリドーマを得るのに最適である。とにかく、特に細
胞融合の頻度が低い時は、それのモノクローナル抗体が
種々の抗原に対するハイブリドーマの融合から得られる
細胞は、ポリドーマを確認するためにシトフルオログラ
フ (cytofluorograh) を使用してスクリーニングするこ
とができる。これを実施するために、2 つの抗原の試料
は別々の波長で蛍光を発する別々の蛍光発光部分（moie
ty) でラベルされている。例えば、一方はフルオレセイ
ンでラベルでき、他方はローダミンでラベルできる。融
合処理後の細胞はその数を増やすために一晩または他の
適当な期間培養されていることが好ましいが、それの全
体が２種のラベルされた抗原と共にインキュベートされ
る。次に細胞はシトフルオログラフを使用してスクリー
ニングされる。２つの波長のうちただ１つの波長で蛍光
を発する細胞は親のハイブリドーマの細胞系統に由来す
るものであろう。一方、両方の波長において蛍光を示す
細胞なポリドーマであり、分離することができサブクロ
ーンすることができる。

【００２２】さらに別の実施態様では、ハイブリッド抗
体で必要な特異性の一方を有するモノクローナル抗体を
分泌する第１の細胞から核を取り出し、第２の必要な特
異性を有するモノクローナル抗体を分泌する第２のハイ
ブリドーマの細胞質の中へそれを挿入することによって
ポリドーマを直接得ることができる。もちろん、この方
法に使用するためには、親のハイブリドーマのどちらも
選択的に破壊可能である必要はない。核物質の挿入後に
この細胞をクローニングしてポリドーマの集団を得る。
単一の抗体を分泌する親のハイブリドーマまたはＢ−リ
ンパ球とは違って、本発明により得られるポリドーマの
細胞は抗体の混合物を分泌すること、そしてその少くと
も１つが二重の特異性を有するハイブリッド抗体である
ことを私たちは見い出した。このポリドーマによって、
このポリドーマを得るために使用された親の細胞によっ
て産生される抗体と同じ特異性の抗体も比較的少量産生
される。単一特異性の抗体に対する混成の比は約２：
１：１のようであって、これは親のポリドーマが親の細
胞により合成されるすべての可能な（Ｈ）鎖であってポ
リドーマ自身の中で不規則に結合されるものを等しい量
で産生する場合に予測される比率である。

【００２３】ポリドーマは多量のハイブリッド抗体を得
るために生体外で培養できるしまたは遺伝的に調和性の
ある動物やヌードマウスのいずれかで生体内で育成する
ことができ、このハイブリッド抗体は公知の方法を用い
て培養培地または動物の腹水から回収される。例えば、
“Monoclonal Autibodiese”( ケネット(Knett) ほか編
集、Plenum Press, New York（１９８０）) ３６３〜４
１８頁の付随書(protcols)を参照。ポリドーマによって
産生された抗体の混合物はハイブリッド抗体を得るため
に分離することができる。例えば、最初のものとそれに
続く他の抗原であってハイブリッド抗体がそれに対して
特異的であるものとに対する連続的アフィニティークロ
マトグラフィーによって、単一特異性抗体不純物からそ
れの分離を行なうことができる。私たちは、単純なイオ
ン交換クロマトグラフィーと電気泳動技術が少くとも一
定の場合には使用できることも見い出した。必要である
ならば、イオン交換のための荷電量の相違を親の系統を
選択する際に考察される抗体の特徴の１つとすることが
できる。

【００２４】

【実施例】実施例１ Ｂ型肝炎表面抗原 (HBsAg)および前立腺酸ホスファター
ゼ（ＰＡＰ）に対する二重特異性を有するモノクローナ
ルハイブリッド抗体を本発明に従って次のように製造し
た。ＰＡＰに対するモノクローナル抗体を分泌するハイ
ブリドーマをＨＡＴ培地中で一週間成育させたのち非選
択培地に移して成育させた。非選択的条件下でさまざま
な時間の成育ののちに、細胞の２ml の分別量を１０^-4
Ｍの８−アザグアニンを含有する培地に入れた。この８
−アザグアニンは、グアニンの代わりにそれらのＤＮＡ
中に包含されることによって細胞の成育を妨げるもので
ある。ＨＰＲＴ酵素を欠いている細胞はこの培地中で生
き伸び成育したが、これらの細胞はＨＡＴの中では必ず
しも生存しなかった。８−アザグアニンを含有する培地
中で成育したクローンを、ＨＡＴに対する感受性と抗Ｐ
ＡＰ生産性について試験した。抗ＰＡＰをなお産生し４
×１０^-8未満の可逆頻度でＨＡＴ感受性を示した１つの
クローンがサブクローニングされた。すべてのサブクロ
ーンが親のクローンのように挙動した。ＨＡＴ感受性サ
ブクローンのひとつからの細胞をポリエチレングリコー
ル中で、ガーハード (Gerhard)の融合技術を使用して、
HBsAg で超免疫した Balb/c マウスから得られた脾臓の
細胞と融合させてポリドーマを得た。上掲“Monoclonal
Antibodies”、３７０頁参照。この融合によって２２０
のポリドーマが産生され、これらはスクリーニングさ
れ、分泌されたどの抗体がＰＡＰおよび HBsAgの両方に
対して特異性を示すかが決定された。２つのこのような
ポリドーマのクローンが、抗体を産生すること、その後
に両方の特異性を示す腹水を生ずることがわかった。

【００２５】両方のポリドーマのサブクローンが両方の
特異性を示す腹水を生産し、親クローンのそれらのよう
にオルスタイン−デイビス (Orstein-Davis)ＰＡＧＥで
３重バンドを生じた。両方のクローンからの腹水がラジ
オイムノアッセイで ¹²⁵I−HBsAg と¹²⁵I-PAPを結合す
ることがわかり、各々について約１０⁹ のＫの値が得ら
れた。こうして、二重特異性をもつ抗体の形成が示唆さ
れた。表Ｉのデータは、このポリドーマの１つの１クロ
ーンから得た腹水を、Ｉg Ｅ（コントロールとして使
用）、ＰＡＰおよび HBsAgに対してそれぞれモノクロー
ナル抗体を分泌するハイブリドーマ（複数）から得た腹
水と比較して用い、固定化 HBsAgを固体相として種々の
放射線ラベルした抗原を溶液相として使用するイムノア
ッセイにおいて得られた結果を示す。ポリドーマからの
腹水の試料２００μｌと、３種のハイブリドーマの各々
とを、それぞれ HBsAgを結合した１２個のポリスチレン
球とともに一夜インキュベートした。 HBsAg球はイリノ
イ州、ノース・シカゴのアボット・ラボラトリーズ(Abb
ott Laboratories) から入手した。洗浄後、三重試料
を、¹²⁵Iラベルした抗原１０0,０００cpm と４時間イン
キュベートした。二回目の洗浄後、球をカウントしてボ
ールに結合したラベル化抗原を測定した。放射線ラベル
したＰＡＰを溶液相抗原として使用する１組の試験にお
いて、抗ＰＡＰを抗原に加えた後に、それをボールとと
もにインキュベートした。この目的のために使用したＰ
ＡＰに対する抗体は、ポリドーマを作るのに使用した親
のハイブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体
であるので、ハイブリッド抗体により示されると予想さ
れるように、同じＰＡＰエピトープに対するものであ
る。

【００２６】

【表１】 表 １ ポリドーマの腹水中に二重特異性を有するハイブリッド 抗体が存在することを実証するラジオアッセイの結果 cpm 腹水の特異性 cpm cpm *PAP+ cpm *HBsAg *PAP 抗PAP *IgE 抗 IgE 15,340 2,145 2,930 3,290 抗 PAP 16,280 2,956 3,128 3,180 抗 HBsAg 73,020 2,973 2,870 3,330 78,900 82,533 2,936 3,143 * ¹²⁵Ｉ ラベル化抗原

【００２７】表Ｉのデータは、IgＥコントロールについ
てのデータと比較すると、非特異的な結合から予想され
る放射線しか抗ＰＡＰについては測定されないことを示
す。一方、HBsAg 抗体を含有する腹水は予想通りラベル
化HBsAg 抗原と結合したが、その他のラベル化抗原を試
験した時は非特異的結合を示した。しかし、ポリドーマ
のクローンからの腹水はラベル化HBsAg とラベル化ＰＡ
Ｐの両方と結合した。前者はその腹水中のHBsAg に対す
る少量の非ハイブリッド単一特異性抗体の存在に帰因し
ており、後者は球上のHBsAg と溶液中の痕跡量ラベルさ
れたＰＡＰとを結合、橋渡しできるハイブリッドに帰因
する。ラベル化ＰＡＰと親のハイブリドーマからの抗Ｐ
ＡＰの混合物を使用する実験により、ハイブリッドの抗
ＰＡＰ特異性が親により分泌される抗体と同一エピトー
プに対するものであることが確認される。というのは、
ラベル化ＰＡＰのハイブリッド抗体への結合が親の抗体
により阻害されたために、基底値放射線しか観測されな
いからである。

【００２８】比較ラジオイムノアッセイに使用したポリ
ドーマのクローンからの腹水の分析は、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）と免疫電気泳動法（Ｉ
ＥＰ）を使用して行った。両方とも少なくとも３種の抗
体種の存在を示した。分取スケールＤＥＡＥイオン交換
クロマトグラフィーにより、よく分離した３つのピーク
が得られ、そのうちの真中の１つには肩があった。ピー
クの各々はＰＡＧＥ及びＩＥＰにより分析されたように
均質であって、各々は初めの腹水におけるバンド（複
数）の１つに対応した。ＤＥＡＥのピークの各々を表す
物質の抗原結合性を放射線ラベルしたHBsAg とＰＡＰを
使用して試験した。第１のピークはHBsAg と結合したが
ＰＡＰには結合しなかった。真中のピークとその肩はHB
sAg と、ＰＡＰの両方に結合し、最後のピークはＰＡＰ
だけに結合した。したがって、真中のピークは、HBsAg
とＰＡＰに対する二重特異性を有し、少なくとも２つの
亜種からなるハイブリッド抗体である。

【００２９】ＤＥＡＥクロマトグラフィーの真中のピー
クとして得たハイブリッド抗体を¹²⁵Ｉで放射線ラベル
した。ラベル後、ラベル化抗体の８５％がＰＡＰに結合
し、８８％がHBsAg に結合する。ハイブリッドのＰＡＰ
に対する親和性は、親の系統により産生されるＰＡＰに
対するモノクローナル抗体のそれよりも若干低いことが
わかった。親和性におけるこの相違は、モノクローナル
抗体とそれのＦab断片（fragment) との間に私たちによ
って観測されたものとほぼ同じであった。ＤＥＡＥクロ
マトグラフィーは、ハイブリッド抗体がポリドーマによ
り産生される抗体を５０％超えて含み、統計的理由によ
り予想された比率２：１：１におおよそ近づくことを示
している。この２：１：１の比率は、ポリドーマが、全
ての可能な抗体重鎖、即ちＰＡＰ又はHBsAg 特異性のい
ずれかを示すものであって、細胞内で不規則に組合わさ
れてハイブリッド抗体と、これに混り伴う少量の２種の
単一特異性抗体であって親の細胞により産生される抗体
と同じ特異性を有するものとを形成した場合に、統計的
理由に基づいて予想されるものである。ハイブリッド抗
体の亜種（subspieces) の存在は、それらがその軽鎖の
組成において異なっていることを示唆している。

【００３０】実施例２ ヒトIgＤとプロラクチンに対し二重特異性を有するモノ
クローナルハイブリッド抗体を本発明にしたがって二つ
のハイブリドーマの融合によって製造した。ハイブリド
ーマの一つは２つの選択可能な遺伝標識：ＨＡＴ培地に
対する感受性とウアバインに対する抵抗性を含むように
構成されている。このような“万能の親”を利用する利
点は本明細書の他のところで説明した。この二重に標識
されたハイブリドーマ即ち所謂“万能の親”は次いでど
んな他のハイブリドーマとも融合させることができる。
生じたポリドーマはＨＡＴとウアバインの存在下で成長
するが、非融合の親細胞のいずれも死ぬ。このような万
能の親を形成するために、両方の選択可能な標識を、ハ
イブリドーマの初期形成の間に導入した。この親の細胞
系統を得るために、広く入手できるＨＡＴ−感受性マウ
ス骨髄腫Ｐ3.６５３を、１mMウアバインを成育培地へ導
入することによって、第２の遺伝標識、ウアバイン抵抗
性、のために選んだ。ほとんどの細胞が死んだが、約１
／100,000 の細胞が無秩序な突然変異によって該薬剤に
対する抵抗性を獲得し、生き残り、増殖して、ＨＡＴ−
感受性でウアバイン抵抗性である新しい骨髄腫集団を形
成した。

【００３１】このＨＡＴ−感受性、ウアバイン抵抗性の
骨髄腫を次に、先に引用したガーハードの方法を使用し
てIgＤで超免疫したＢalb/c マウスから得られた脾細胞
と融合した。ハイブリッドをＨＡＴ培地（ウアバインな
し）で選択し、クローンをIgＤに対するモノクローナル
抗体の産生のためにスクリーニングした。正のクローン
の中から、IgＤに対してIgＧを産生したものをさらに研
究するために選んだ。このクローンを、１mMのウアバイ
ンを成育培地に添加して、ウアバイン抵抗性の性質の維
持を試験した。約１／３の細胞がこの遺伝標識を維持し
ていた。この培養物がウアバイン中で指数関数的に成育
している時に、細胞はさらに分岐しサブクローンを生ん
だ。ウアバイン抵抗性サブクローンを、モノクローナル
抗IgＤ抗体の連続産生について試験した。サブクローン
の一つを例１の手順によってさらに逆選択して、ＨＡＴ
に感受性の細胞集団を得た。このサブクローンを非選択
的条件下で２週間成育させた後、６−チオグアニンを含
有する培地に入れた。上に記したように、６−チオグア
ニンの作用機構は８−アザグアニンのそれに似ている。
６−チオグアニンをグアニンの代りにそのＤＮＡの中へ
取込む細胞は成育しない。ＨＰＲＴ酵素を欠く細胞は培
地から６−チオグアニンを利用しないので、成育できる
がその結果ＨＡＴに対して感受性がある。

【００３２】この逆選択したサブクローンの集団自体を
次に、６−チオグアニンとウアバインを含有する培地中
でサブクローニングした。サブクローンを、モノクロー
ナル抗IgＤ抗体の連続産生について試験した。全ての所
望の性質−ウアバイン及び６−チオグアニン中での成育
性並びにモノクローナル抗IgＤの産生性を示した１クロ
ーンを選択して所謂“万能の親”とした。次に、この万
能の親は、他のどんなＨＡＴ−抵抗性、ウアバイン感受
性のハイブリドーマと融合させることができて、ハイブ
リッド抗体（その一特異性が抗IgＤである）を発生させ
るポリドーマを生じた。この目的のために、私達は最初
にプロラクチンに対するモノクローナル抗体を分泌する
マウスのハイブリドーマを選んだ。抗プロラクチンモノ
クローナル抗体は親系統により発生される抗−IgＤと同
じサブクラス（IgＧ₁)であり、オルンスタイン−デービ
ス・ゲル（Ornstein-Davisgels) で容易にその抗体から
分離される。このような分離は抗体に非常に異なった負
担となることを示唆する。したがってハイブリッド抗体
の分離はＤＥＡＥ−セフアデックスクロマトグラフィで
容易に行うべきである。

【００３３】ＨＡＴ感受性でウアバイン抵抗性の細胞系
統の１０⁷ 個の細胞を、ポリエチレングリコール中で、
抗プロラクチンを産生する細胞１０⁷ 個と融合させた。
融合した細胞を初めに３日間ＨＡＴ培地中で成育させた
後、ＨＡＴ＋ウアバイン培地で３日間改質し、最後に再
びＨＡＴ培地に入れた。６００を超えるクローンがこの
融合から発生した。６６のクローンを無秩序に分析用に
選んだ。これらのクローンのうち、３６が抗IgＤと抗プ
ロラクチン活性を示した。これらクローンの上清を次の
試験法によってハイブリッド抗体の存在を分析した。別
の抗プロラクチンモノクローナル抗体でコーテイングし
たポリスチレンビーズを１００ｎｇ／mlのプロラクチン
溶液２００μl と５時間インキュベートした。使用した
抗体は融合したハイブリドーマ細胞系統によって産生さ
れた抗体の部位から離れた部位にプロラクチンを結合す
る。ビーズを洗浄したのち、クローンの上清と共に一夜
インキュベートした。翌日数回の洗浄ののち、 ¹²⁵Ｉで
ラベルしたIgＤを加えた。一本の官能性の腕によってビ
ーズに結合したハイブリッド抗体は、自由な抗IgＤ官能
性を用いて放射線ラベルしたIgＤと結合できたが、親タ
イプの抗体IgＤ−IgＤ及びプロラクチン−プロラクチン
のいずれもがプロラクチンビーズと ¹²⁵Ｉ−IgＤトレー
サーの間でこの結合を形成することができなかった。ハ
イブリッド二官能性抗体を産生するクローンについての
典型的な分析結果を下の表２に示す。

【００３４】

【表２】 表 ２ IgＤとプロラクチンに対して二重特異性を有するハイブ リッド抗体が、選択されたポリドーマの上清及び腹水中 に存在していることを実証している免疫学的測定の結果 クローネート＃ cpm結合した ¹²⁵I-IgD トレーサー １ １５３３９ ２ １６３３７ ３ ２２８８６ ４ ２３３５６ ５ ２４４３４ 抗−IgＤ ９３５７ 抗−フ゜ロラクチン ８７２１

【００３５】３６クローンのうち２１がこの分析によっ
て明瞭な二官能性活性を示した。現在までに入手できる
２つのクローンから発生した腹水がこの二官能性分析に
おいて反応することが示された。これらの腹水は、オル
スタイン−デービスゲル上で３本の明確なバンドに分か
れる抗体を含有している。２本のバンドは、親のハイブ
リドーマ（抗IgＤと抗プロラクチン）によって産生され
る抗体と厳密に一致する。３番目のバンドは予想どおり
ハイブリッド抗体の親のモノクローナル抗体のバンドの
中間に移る。IgＤとプロラクチンに対するハイブリッド
モノクローナル抗体は、表２のデータを生ずるのに使用
した分析においてプロラクチンの量を変更すると、投与
量応答を示すことが、表３のデータによりわかる。表３
はクローネート（clonate)＃２の抗体および、コントロ
ールとして、親の細胞系統からの抗体（抗IgＤ及び抗プ
ロラクチン）を使用している。

【００３６】

【表３】 表 ３ ハイブリッド抗体と種々の量のプロラクチン を用いる分析の結果 プロラクチン ハイブリッド 抗IgＤ¹ 抗プロラクチン¹ ng/ ml 抗体¹ ０ ８０１０ ６８４７ ８０２０ １０ ９１６９ ７９８２ ７４０５ ５０ １３５５８ ７７８３ ８３１４ １００ １７５９９ ７６５４ ７８４４ １．結合 ¹²⁵Ｉ−IgＥのcpm

【００３７】これらのデータは、ハイブリッド抗体によ
って結合されたプロラクチンの量が、プロラクチンの量
を増加するにつれてラベルしたIgＤの結合量が増加する
ように投与量応答的であることを実証している。対照的
に、IgＤ及びプロラクチンに対する親の抗体を使用する
とこれらはビーズに結合したプロラクチンとラベルした
IgＤとの間に橋渡しを形成できないので全く投与量応答
がみられない。このように、ハイブリッド抗体はプロラ
クチン分析の成分として使用できる。特に適合するよう
に作る他のハイブリッド抗体も他の分析について同様の
機会を与える。

【００３８】実施例３ 実施例２のそれと同様の方法によって、ハプテンである
ヒ酸塩−ヒ酸塩二量体に対してのモノクローナル抗体を
分泌し、ウアバインに対し抵抗性がありかつＨＡＴに対
して感受性がある万能の親のハイブリドーマを形成し
た。このハイブリドーマを発ガン抗原（ＣＥＡ）、胚組
織及びいくつかの種類のガンのいずれからも生み出され
る抗原、に対して特異性を有するモノクローナル抗原を
分泌するハイブリドーマに融合させた。再びもう一度、
６００を超えるクローンがこの融合から生じた。ＣＡＥ
とヒ酸塩の両方に結合する能力について試験した７２ク
ローンのうち、６９のクローンが両方の結合能力を持っ
ていた。最大の結合を示すクローンを、ハイブリッド抗
体の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のために
選んだ。各分析のために、ＣＥＡ溶液（６００ng又は２
５０ng）を、プラスチックの９６ウエル・マイクロタイ
ター・プレートの各ウエルに一夜吸着させた。その翌
日、吸着されていない物質をＰＳＢ−Tween ２０でウエ
ルから洗い出した。クローンの上清を加え、３５℃で2.
５時間インキュベートさせたのちプレートから洗い落と
した。

【００３９】ＣＥＡ−ＣＥＡ及びＣＥＡ−ヒ酸塩の抗体
は吸着された抗原を介してプレートに結合したまま残
る。第２の抗原、酵素アルカリ性ホスファターゼに結合
したアルセニル酸、をウエルに３５℃で３時間加えた。
ＰＢＳ−Ｔweenでもう一度洗浄したのち、アルカリ性ホ
スファターゼに対するクロマゲン基質、パラーニトロフ
ェニルホスフエイトをウエルに加え４８時間発色させ
た。各ウエルの吸収を４１０nmで測定した。クローンの
上清中に存在する場合は、ハイブリッド抗体はプレート
上の吸着されたＣＥＡに一方の官能性によって結合し
て、他方の官能性をアルカリ性ホスファターゼに結合し
たアルセニル酸と結合するように自由のままにした。ア
ルセニル酸に結合したアルカリ性ホスファターゼが結合
していた所でだけクロマゲン基質から発色した。この分
析で、１２の上清のうち３つが表４に示すようにハイブ
リッド抗体活性を示した。

【００４０】

【表４】 表 ４ 酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA)による二重特異性 を有するハイブリッド抗体の実証 490nm での吸収 490nmでの吸収 クローン 600ng CEA/well 250ng CEA/well １ 0.087, 0.105 0.022, 0.060 ２ 0.082, 0.054 0.023, 0.033 ３ 0.011, 0.017 0.041, 0.036 抗ヒ酸塩 0.010, 0.006 0.006, 0.005

【００４１】本発明は、二重特異性を有する抗体、例え
ば、上述のようにして得られた。もしくはニソノフ（Ni
sonoff) 外の慣用の技術（上掲文献）により抗体の半分
子から得られたハイブリッド抗体、又は個々の単一特異
性抗体を結合もしくは架橋して得られた抗体多量体を使
用する免疫診断法及び免疫治療法をも提供する。好まし
くは、これらの方法に使用する二重特異性を有する抗体
は、変性を受けておらず、抗原に対して一様な特異性と
アフィニティーを有する実質的に純粋な化合物として抗
体を確実に得ることができるように、本発明にしたがっ
て製造されたハイブリッド抗体である。免疫診断への応
用の場合、二重特異性のハイブリッド抗体もしくは他の
抗体により示される二つの特異性の一方は、検出が必要
な標的抗原に対し、他方は別の抗原に対することにな
る。この別の抗原はハプテン又は他の分子種でもよく、
診断を可能にする。例えば、免疫組織学上有用な抗体は
疑わしい抗原、例えばＣＥＡ、ＰＡＰ又はフエリチンの
ようながんに伴う抗原に対する第１の特異性を有し、ま
た適当な基質の存在下で発色反応を起す酵素のような、
発色反応に関与するハプテンもしくは抗原に対する第２
の特異性を有する。この抗原の第２の特異性が向けられ
得る適当な酵素の中には、前立腺酸ホスファターゼ（Ｐ
ＡＰ）、ホースラデイッシュ・ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼがあ
る。

【００４２】組織学的検査を行うために、組織の切片を
まず二重特異性の抗体で処理する。そうする前に、ハイ
ブリッドによって汚染反応を触媒する酵素を前もって封
じておくことができる。そうでない場合は、次に適当な
インキュベーションの後にその切片を酵素を含む第２溶
液で処理し、すすぎ、次いで酵素存在下で変色する基質
で処理する。組織試料における酵素と基質によって生ず
る発色は、その組織中に標的抗原が存在することを示す
陽性の印である。この明細書に製法を記載した、HBsAg
とＰＡＰに対するハイブリッド抗体は、ｐ−ニトローフ
ェニルホスフェートを酵素基質として使用する模擬汚染
実験において試験基材（ポリスチレン・ボール）上のHB
sAg 及びＰＡＰに結合することがわかった。このハイブ
リッド抗体をＰＡＰ及びHBsAg とインキュベートした
後、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを加えた結果、ボ
ールがその特徴的な黄色から茶色へ変色した。

【００４３】実施例２で述べたように、二重特異性の抗
体もイムノアッセイ及びイムノメトリックアッセイに使
用できる。製法を上述した、HBsAg とＰＡＰに対するハ
イブリッド抗体を用いると、HBsAg についてのイムノメ
リックアッセイを、HBsAg に対する固定化モノクローナ
ル抗体を血清又は抗原を含むと疑われる他の液体試料か
らHBsAg を抽出するための固体相として使用して行うこ
とができる。試料を、表面に抗HBsAg を結合もしくはコ
ーテイングしたボール、ビーズ、試験管又は他の基材と
ともにインキュベートする。血清試料とのインキュベー
ションの次に、又は同時に、又はその前にハイブリッド
の溶液とのインキュベーションを行うことができる。い
ずれの場合も、結果は、HBsAg が試料中に存在する場合
は、固定化抗体、HBsAg （試料中に存在する場合）及び
ハイブリッド抗体のサンドイッチが形成されることにな
る。分析の一部として、ＰＡＰのハイブリッド抗体との
結合は許容される。これはサンドイッチの形成中又は成
形後になされる可能性があり、さもなくばその代りに、
抗体−ＰＡＰ複合体が予め形成される可能性がある。サ
ンドイッチの形成後に、固体相を洗浄して試料残渣と結
合していないハイブリッド抗体を除去し、次いでＰＡＰ
存在下で変色を受けるｐ−ニトロフェニルホスフェート
又はα−ナフトールホスフエートのような基質を含有す
る溶液と接触させる。変色の発生は試料中の標的抗原の
存在を確認するものである。

【００４４】このような分析において、イリノイ州ノー
ス・シカゴ所在のアポット・ラボラトリーズ（Abbott L
aboratories)により製造されているHBsAg 診断用市販キ
ット（“Aushia”の名で販売されている）のポリクロナ
ール抗HBsAg ビーズを使用して、種々の量のHBsAg を含
む試料をこのビーズとともにインキュベートした。使用
した試料は、市販キットの陽性コントロールと陰性コン
トロール、及び陽性コントロールを陰性コントロール
で、陰性コントロール１部：陽性コントロール２部又は
陰性コントロール２部：陽性コントロール１部のいずれ
かの比率で希釈して得られた２試料、であった。

【００４５】HBsAg を結合しさせるために試料をビーズ
とインキュベーションしたのち、そのビーズを洗浄し、
HBsAg とＰＡＰの両方に対し反応のあるハイブリッド抗
体とインキュベートした。これにより、固定化抗体：抗
原：及びハイブリッド抗体のサンドイッチが形成され
る。ビーズを再び洗浄し、ＰＡＰの溶液とインキュベー
トした。このインキュベーションの次にもう一度洗浄
し、ビーズを基質α−ナフトール ホスフエートとイン
キュベートした。ＰＡＰが酵素反応によりホスフエート
を除去する適当なインキュベーションののち、基質をビ
ーズから除去し、これに酵素反応の生成物の存在下で透
明から赤紫色に変色する指示薬フアースト・ガーネット
・ＧＢＣ塩を加えた。試料中にHBsAg の存在を確認する
変色が認められた。各試料について５７０nmにおける吸
収を測定し、それらのデータを下の表５に示す。

【００４６】

【表５】 表 ５ HBsAg 濃度 吸 収 陽性コントロールの％ ５７０ nm ０ ．０３１ ３４ ．１６６ ６７ ．２４３ １００ ．３７９

【００４７】これらのデータはHBsAg 濃度の変化につい
て投与量応答を示しており、これはハイブリッド抗体が
球に結合したHBsAg とＰＡＰの間に橋を形成する場合に
予測されたものである。これはさらにハイブリッド抗体
をイムノアッセイに利用できることを実証している。酵
素的に触媒された反応以外の検出手段も可能である。例
えば、二重特異性を有するハイブリッド抗体又は他の抗
体の第２の特異性を、放射線ラベルされたもしくは蛍光
発光性である、もしくは何か適当な他の手段でサンドイ
ッチ中で検出可能であるハプテンもしくは抗体に対して
向けることができる。

【００４８】二重特異性を有するハイブリッド抗体又は
他の抗体をイムノアッセイに利用する１つの好ましい方
法は蛍光消光の減少を利用するものである。このような
アッセイにおいて、抗体の１特異性は標的抗原に対して
向けられ、他方の特異性は例えば、蛍光発色団を有する
ハプテンに対して向けられる。この発色団はハプテンに
結合されているか又は適当な場合にはハプテン自身でも
よい。このアッセイは、抗体は、予じめ決めた量の消光
発色団でラベルした標的抗原が加えられている、標的抗
原を含有する疑いのある血清又は他の試料と共にインキ
ュベートすることにより行なう。標的抗原が存在する場
合には、その標的抗原に対して特異的な抗体の結合点を
目指して、試料中においてラベルした抗原は標的抗原と
競争する。このインキュベーションの前に又はその間に
又はその後に、蛍光発色団を有するハプテンの一定量が
抗体と一緒にインキュベートされ、その他の接合点で結
合する。

【００４９】２つの発色団が十分近くに一緒に位置して
いて蛍光を発する側によって出されるフォトンが消光す
る側によって補捉されうる場合に、消光する側が吸収
（消光）できる波長で他方が蛍光を発するように２つの
発色団は選択される。このためには、２つの発色団は互
いに約１００オングストローム以内、好ましくは約５０
オングストローム以内に存在するべきである。蛍光を発
する発色団が１つの抗体結合点に結合され、消光発色団
が加えられた抗体に他の結合点で結合する時にこの配置
がおこる。適当な発色団には、蛍光発色団としてのフル
オレセインと消光発色団としてのローダミンがある。測
定される蛍光は試料中の天然抗原の量に反比例して変わ
る。というのは天然抗原が存在しない場合、抗体に結合
した抗原のすべてが消光発色団でラベルされ、ハプテン
により支えられた発色団による蛍光を吸収するように位
置づけられているからである。測定した蛍光を既知量の
抗原を含有するコントロール試料の蛍光と比較すると、
試料中の抗原の存在について定性及び定量の測定ができ
る。この種のイムノアッセイは例えば厳密にモニターし
なければならないジランチンのような薬剤の血清中の濃
度を測定するのに使用できる。このようなアッセイで
は、標的抗原はもちろんジランチンである。この方法が
特に腫瘍に関連した抗原を含むその他の抗原の検出にも
同様に使用できることは当業者には明らかであろう。

【００５０】二重特異性を有するハイブリッド抗体又は
他の抗体をイムノアッセイに利用する別の好ましくい方
法は酵素反応に依存している。現在好ましい方法では、
抗体の特異性の一方はもちろん標的抗原に対して向けら
れ、他方は酵素又は酵素が結合しているハプテンに向け
られる。酵素と相互作用して検出可能な物質を生ずるか
又は何か他の方法で抗原−抗体の複合体の形成の検出を
可能にする物質を標的抗原に結合することによって標的
抗原を修飾しておく。このアッセイは、抗体を、標的抗
原を含有している疑いのある試料に修飾した標的抗原を
予じめ決めた量加えたものとインキュベートすることに
より行なわれる。検出は例えば蛍光測定、ルミネセン
ス、分光測定などによっても良い。代わりの方法におい
ては、加えられる標的抗原はそれに結合した酵素を持っ
ていても良く、その場合、酵素と相互作用する物質に対
して向けられた又はその物質が結合したハプテンに対し
て向けられた特異性のひとつを抗体が有している。酵素
と相互作用する物質はそれ自身別の酵素でも良い。その
ような場合、酵素の一方は他方によって必要とされる生
成物の生産を触媒する。すなわち、抗体が加えた標的抗
原（これには酵素の一方が結合している）と他方の酵素
の両方と結合する時、最初の酵素反応の生成物は第２の
酵素に接近して生成され、この生成物の周囲媒体中への
明瞭な拡散がおこる前に後者の酵素によって媒介される
反応を受けることができる。

【００５１】このような方法の１例は次の反応系におい
て２つの酵素ヘキソキナーゼ（ＨＫ）とグリコースー６
ーホスフエイト・デヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤＨ）
を利用する。

【００５２】この反応系を利用するために、加えられた
標的抗原はそれに結合したＨＫ又はＧ−６−ＰＤＨのい
ずれかを有し、ハイブリッド抗体は他方（又はそれを支
えるハプテン）に対して向けられた特異性のひとつを有
することになる。試料が、ハイブリッド抗体と予じめ決
められた量の酵素ラベル化抗原のほかに、グルコース、
ＡＴＰ及び補酵素ＮＡＤ⁺ をそれに加えた。ハイブリッ
ド抗体はすでにそれに結合した他方の酵素を有すること
が好ましい。あるいは、この酵素は他の試薬と共に試料
に加えることができる。このインキュベーションの間、
試料中に天然抗原が存在するならば、酵素ラベル化抗原
はハイブリッド抗体の結合点のひとつを目指して試料中
の天然抗原と競合する。他方の酵素は第２の結合点に結
合され又は結合されよう。これによって、ＨＫにより触
媒されるグルコース−６−ホスフエイトの生成がＧ−６
−ＰＤＨに近接しておこる。後者がグルコース−６−ホ
スフエイトをグルコノラクトン−６−ホスフエイトに転
化し、ＮＡＤ⁺ のＮＡＤＨへの還元が結果として伴う。
このＮＡＤＨは３４０nmで強く吸収するので分光測定に
より検出できる。生成されるＮＡＤＨの量は試料中の天
然抗原の量と反比例して変化する、すなわち、その最大
生成は標的抗原が試料中に全く検出されない時におこ
る。生成されるＮＡＤＨの量をコントロールの試料と比
較すると、試料中の抗原の存在について定性的及び定量
的測定ができる。この種のアッセイは血清中のジランチ
ン又は他の薬剤の濃度をモニターするのに使用できる。
このような場合は薬剤が標的抗原である。しかしこのよ
うなアッセイは腫瘍や他の病気に関連した抗原のような
他の血清抗原を検出するのにも使用できる。

【００５３】生体内の免疫診断をハイブリッド抗体又は
その他の二重特異性抗体を使用して行なうこともでき
る。腫瘍と関連した抗原のような標的抗原に対する第１
の特異性と、適当な放射性核種、好ましくはγ線を発す
るもの、が結合されているハプテンに対する第２の特異
性を有する抗体をまず宿主に投与する。抗体が標的部位
に局在化し、非結合抗体が宿主の健康な組織から去るの
に十分な時間経過後、放射性核種を有するハプテンが投
与され局在した抗体に結合する。結合しないハプテンを
宿主から去らせるのに適当な合い間をおいたのち、放射
線が高濃度になっている部分が存在するかどうかを測定
するために適当なカメラで宿主の精査を行なう。もし存
在すれば、標的抗原の宿主中の存在が確認され、その位
置が決定される。この方法は、放射性核種が直接結合さ
れている標的抗原に対して向けられた単一特異性抗体を
使用する方法に対しいくつかの利点を持っている。この
ような場合、放射性核種は、抗体が標的部位に実質的に
局在するのに必要な時間が経過後、十分な量残るのに十
分に長い半減期をもっていなければならない。さらに、
この過程の間抗体は肝臓又はその他の非標的組織に一定
時間保持されることがあり、これらの組織は抗体より運
ばれている放射線にあてられることになる。一方、本発
明は単一特異性の抗体と共に用いられた放射性核種より
短い半減期を有する放射性核種の使用を可能にする。比
較的小さい粒子であるので、放射性核種を担持している
ハプテンは生体内で高い移動性を有し、室主内を迅速に
移動して標的部位に局在化している抗体に結合するか又
は非標的組織内で問題にするほどの時間を費やすことな
く肉体から出ていく。この理由により短い半減期の同位
体を、事実上過剰に投与した場合であっても健康な組織
に与えるリスクが最小である量で投与することができ
る。

【００５４】好ましくは、ハプテンは放射性核種が直接
結合された又は放射性核種と複合する薬剤である。ハプ
テンに結合した放射性核種のためのキレート剤を後者の
目的のために使用しても良い。当業者は広い種々のキレ
ート剤と放射性核種がこの目的に適することを理解しよ
う。エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）がキレート剤
として結合したヒ酸フェニルは適切なハプテンである。
このハプテンと共に使用するのに適した放射性核種
は′′′Ｉ_n である。

【００５５】二重特異性の抗体は、病気に関連した抗原
に対して一方の特異性を有し、抗原又は抗原が関係し破
壊することが望まれる病気の組織にとって致命的な薬剤
であるか又は該薬剤に結合したハプテンに対して他方の
特異性を有するようにこの二重特異性抗体を構成するこ
とによって免疫治療法にも使用できる。例えば、抗体は
ＰＡＰ、発ガン抗原（ＣＥＡ）、フエリチン、又はその
他のこのような抗原のような腫瘍に関連した抗原に対し
て１つの特異性を有し、放射性核種、好ましくはα又は
β放射線を発するもの、が結合しているかあるいは、リ
チンＡ鎖もしくは他の毒素もしくは薬剤から成るハプテ
ンに対して向けられた第２の特異性を有しても良い。こ
のような薬剤には、ゲローニン（gelonin ）、α−アマ
ンチン、ジフテリア毒素Ａ、メトトレキサート、ジクロ
ロメタトレキサート、ドウノマイシン（dounomycin）及
びクロロムブシル（chlorombucil）を挙げることができ
る。もちろん、毒素又は薬剤自身がハプテンとして機能
できる場合は、それは他のどの部分にも結合する必要は
ない。

【００５６】生体内免疫診断に使用される状況における
ように放射性核種を致死剤として使用すべき場合は、ハ
プテンはそれに直接結合した放射性核種を有することが
でき、又はハプテンが放射性核種と錯体を形成するキレ
ート剤のような薬剤であるかもしくは該薬剤をそれに結
合してもつことができる。このような場合、二重特異性
のハイブリッド抗体または他の抗体は病気の宿主に投与
され、冒されている組織の部位に局在させられ、どんな
過剰分も宿主から出てゆく。次にハプテンが投与され、
それは抗体が局在しているすべての所で抗体に結合す
る。これにより、放射性核種を担持するハプテンが事実
上過剰に投与されたとしても健康な組織を害する危険性
を最小にする短い半減期の放射性核種の使用が可能とな
る。その理由は、ハプテンが比較的小さい寸法であるた
め、過剰分は迅速に肉体から出てゆき健康な組織中に実
質的な量で局在しないからである。また致死剤が標的抗
原に対して向けられた単一特異性抗体に直接結合してい
る時におこるように、循環している標的抗原が組織にと
って致命的な物質を担持している抗体と結合しこれを健
康な組織に運び届ける可能性が除かれるか減少する。放
射性核種が直接結合したハプテンの例は、“Internatio
nal Journal of Applied Radiation and Isotopes ”、
３３、７５（１９８２）に記載された６−^{21 1} Ａｔ−ア
スタト−２−メチル−1,４−ナフトキノール・ビス（２
ナトリウム・ホスフエート）である。²¹¹ Ａｔはα線の
エミッターである。当業者は、ハプテンに直接結合でき
る、又は広く様々なキレート剤のいずれかによってハプ
テンと錯体を形成できる適当な放射性核種が多数存在す
ることを理解しよう。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/531 Ａ 8310−2Ｊ 33/542 Ａ 8310−2Ｊ 33/577 Ａ 9015−2Ｊ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｈ 9284−4Ｃ 51/00 45/00 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ａ６１Ｋ 43/00 (72)発明者 デイヴィッド ギャリー エス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92307ラ ジョラ プール ストリート 9477 (72)発明者 アダムス トーマス エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92024ルーケイディア ネプチューン 860 (72)発明者 フリンケ ジェイムズ エム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92705ソラナ ビーチ シューメイカー レイン 339

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 二重特異性を有するハイブリッドモノク
   ローナル抗体を、該ハイブリッドモノクローナル抗体と
   二種の単一特異性抗体を約２：１：１の比率で含む抗体
   混合物の１成分として、かつこれらの抗体をイオン交換
   法で分離するのに十分な電荷量の相違があるように産生
   するポリドーマから得られたことを特徴とする、二重特
   異性を有するハイブリッドモノクローナル抗体。